ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΟΜΟΡΙΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΙΟΝΤΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ(ESI-LC-MS)

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΚΡΙΣΗΣ ΣΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΟΜΟΡΙΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΕΧΝΙΚΗΣ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΙΟΝΤΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ(ESI-LC-MS) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΣ ΦΟΙΤΗΤΗΣ: ΓΙΟΥΜΟΥΞΟΥΖΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, Απρίλιος 2015

2 Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια της απόκτησης Μεταπτυχιακού Διπλώματος στην Φαρμακευτική Τεχνολογία και έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Θα ήθελα στο σημείο αυτό να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Αικατερίνη Μαρκοπούλου για την καθοδήγηση, τις υποδείξεις και την εν γένει πολύτιμη συμβολή της στην διεκπεραίωση της παρούσας μελέτης. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου προς τα δύο άλλα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον Καθηγητή Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Κοντογιάννη Χρίστο και τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής Α.Π.Θ, κ. Καχριμάνη Κυριάκο. Στο πλαίσιο αυτό, ευχαριστίες πρέπει να αποδοθούν και στους λοιπούς καθηγητές του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Α.Π.Θ. για τις πολύτιμες γνώσεις τις οποίες μου μετέδωσαν καθ όλην την διάρκεια του μεταπτυχιακού προγράμματος, καθώς και τον Ομότιμο Καθηγητή του Εργαστηρίου Φαρμακευτικής Ανάλυσης κ. Ιωάννη Κουντουρέλλη. Επιπρόσθετα, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Διδάκτορα Φαρμακευτικής κ. Μαρία Κούσκουρα για την πολύτιμη βοήθεια της σε κάθε στιγμή που παρέστη ανάγκη καθώς και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια κ. Βαρβάρα Μανδρά για την αρμονική συνύπαρξη στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Ανάλυσης κατά την διάρκεια της διεξαγωγής του πειραματικού τμήματος της παρούσας μελέτης. Οφείλω τέλος, να ευχαριστήσω τους οικείους μου, η στήριξη και η υπομονή των οποίων βοήθησαν τα μέγιστα στην πραγματοποίηση των προπτυχιακών και μεταπτυχιακών σπουδών μου.

3 Περιεχόμενα Πρόλογος... 1 Περιεχόμενα 2 1. Εισαγωγή Φασματοσκοπία μαζών Ιστορική Αναδρομή Ανακάλυψη της φασματοσκοπίας μαζών Εξέλιξη οργάνων ανάλυσης μάζας Ανακάλυψη νέων τεχνικών ιονισμού Γενικά-Ορισμοί Φασματογράφοι μαζών Πηγές Ιόντων Αναλυτές μαζών Ανιχνευτές Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Γενικά περί χρωματογραφίας Ιστορική αναδρομή Ταξινόμηση χρωματογραφικών μεθόδων Χρωματογραφικοί μηχανισμοί διαχωρισμού Οργανολογία διατάξεων HPLC 51 2

4 4. Σύζευξη φασματομετρίας μαζών-χρωματογραφίας Φυσικοχημικές ιδιότητες των μελετούμενων φαρμακομορίων Στατιστική ανάλυση πειραματικών δεδομένων Γενικά Γεωμετρική απεικόνιση των δεδομένων Ανάλυση Πρωταρχικών Συνιστωσών (Principal Component Analysis PCA) Παλινδρόμηση σε λανθάνουσες μεταβλητές: Μερικά Ελάχιστα Τετράγωνα(PLS) Πειραματικό μέρος Γενικά-Σκοπός μελέτης Πειραματικό τμήμα Οργανολογία Χρησιμοποιούμενοι διαλύτες και χημικές ουσίες Πειραματική διαδικασία Διαδικασία Μετρήσεις Δειγμάτων Μετρήσεις Μελέτη επίδρασης φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών των φαρμακομορίων στο λαμβανόμενο σήμα φασματογράφου μαζών με την χρήση χρωματογραφικής στήλης Διεξαγωγή πειράματος Επεξεργασία αποτελεσμάτων

5 8.3 Αξιολόγηση επιδρώντων παραμέτρων Μελέτη επίδρασης του όγκου εγχύσεως στο εμβαδό του λαμβανομένου σήματος Συσχέτιση φύσης κινητής φάσης και λαμβανομένου σήματος Μελέτη επίδρασης φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών φαρμακομορίων στο λαμβανόμενο σήμα φασματογράφου μαζών χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης- (Flow Injection Analysis-FIA) Διεξαγωγή πειράματος Επεξεργασία αποτελεσμάτων Αξιολόγηση επιδρώντων παραμέτρων Συμπεράσματα 106 Παράρτημα Ι-(Πίνακες).... Παράρτημα ΙΙ-(Χρησιμοποιηθέντα Φαρμακομόρια) Παράρτημα ΙΙΙ-(Φάσματα).. Βιβλιογραφία.. i-xxv Ι-XXVIII Α-L a-d 4

6 1. Εισαγωγή Η φασματοσκοπία μαζών (MS), παρότι αποτελεί τμήμα της αναλυτικής επιστήμης εδώ και πάνω από έναν αιώνα, δεν είχε εντούτοις την ευρεία χρηστικότητα την οποία παρουσίαζαν κάποιες άλλες ανιχνευτικές μέθοδοι, όπως η φασματοφωτομετρία υπεριώδους (UV). Το γεγονός αυτό οφείλονταν σε τέσσερεις κύριους παράγοντες: το υψηλό κόστος των οργάνων, την περιπλοκότητά τους, την έλλειψη εξειδικευμένων τεχνικών παραγωγής ιόντων για ανάλυση ευρέως φάσματος ουσιών και τέλος την σχετική έλλειψη μελετών οι οποίες να διευκρινίζουν πλήρως τους εμπλεκόμενους μηχανισμούς. Εν έτει 2015, τα τρία πρώτα προβλήματα έχουν εν πολλοίς εξαλειφθεί, καθώς αφενός μεν το κόστος ενός συστήματος MS βρίσκεται εντός των δυνατοτήτων ενός τυπικού ερευνητικού εργαστηρίου, αφετέρου δε οι τεχνολογικές εξελίξεις έχουν καταστήσει τέτοιες διατάξεις φιλικότερες προς τον χρήστη. Ιδιαίτερα στον χώρο της πληροφορικής παρέχουν πλήθος δυνατοτήτων συλλογής, επεξεργασίας και παρουσίασης μεγάλου εύρους δεδομένων που προκύπτουν από τα φάσματα μαζών. Επίσης, η ανακάλυψη κατά την δεκαετία του 1980 διαφόρων νέων τεχνικών παραγωγής ιόντων (ESI, MALDI, APCI, FAB, APPI), κατέστησε εφικτή την ανάλυση της συντριπτικής πλειοψηφίας των χημικών ουσιών (συμπεριλαμβανομένων και των οργανικών μεγαλομορίων) εισάγοντας έτσι την φασματοσκοπία μαζών στις βιολογικές επιστήμες. Εντούτοις, παρά το ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον που παρουσιάζει η τεχνική αυτή, η βιβλιογραφική πληροφόρηση που αναφέρεται σε ιδιαίτερους τομείς της φασματοσκοπίας μαζών είναι ακόμα περιορισμένη. Έτσι, ορισμένες θεωρητικές απόψεις ερμηνείας μηχανισμών ιονισμού μάζας αποτελούν ακόμα και σήμερα αντικείμενο διαφωνίας μεταξύ των ερευνητών. 5

7 Εξέχουσα είναι η προσπάθεια απόδοσης της δημιουργίας ιόντων αερίου φάσεως από τα φορτισμένα σωματίδια, στην τεχνική ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI). Επιπροσθέτως, οι περισσότερες μέχρι τώρα μελέτες αφορούν στην τεχνική θετικού μοριακού ιοντισμού (positive ion mode) ενώ οι αντίστοιχες για τον αρνητικό(negative ion mode) είναι λιγότερες. Η φασματοσκοπία ή φασματομετρία μάζας (MS) ανήκει στις συνδυαστικές τεχνικές και συνήθως απαντάται σε σύζευξη με χρωματογραφικές διατάξεις. Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια κερδίζει όλο και μεγαλύτερο έδαφος η σύζευξη MS με διατάξεις Υγρής Χρωματογραφίας(LC), έναντι αυτών της αερίου (GC), που χρησιμοποιούνται από την δεκαετία του Η διάταξη GC-MS έχει μελετηθεί διεξοδικά, ενώ υπάρχει πληθώρα προτύπων φασμάτων αποθηκευμένων σε βιβλιοθήκες που έχουν ενσωματωθεί (με κατάλληλα λογισμικά) στην οργανολογία της μεθόδου. Για την περίπτωση των διατάξεων LC-MS τα δεδομένα είναι σαφώς λιγότερα, καθότι η σύζευξη LC και MS άρχισε να διαδίδεται ευρέως στα τέλη της δεκαετίας του Έτσι, ζητήματα όπως η επίδραση της φύσης της κινητής φάσης, του ph των διαλυμάτων, καθώς και των φυσικοχημικών και δομικών στοιχείων των προς ανάλυση ουσιών, παραμένουν ακόμα και σήμερα όχι απόλυτα διευκρινισμένα. Από τα ανωτέρω προκύπτει η χρησιμότητα του προσδιορισμού των παραγόντων εκείνων που επηρεάζουν την λαμβανόμενη απόκριση σε συστήματα LC-MS, τα οποία χρησιμοποιούν την τεχνική ESI με αρνητικό ιονισμό (negative ionization mode). Ο προσδιορισμός των παραμέτρων αυτών θα αποτελέσει και το αντικείμενο της παρούσας μελέτης. 6

8 2.1. Ιστορική Αναδρομή 2. Φασματοσκοπία μαζών Ανακάλυψη της φασματοσκοπίας μαζών Η ιστορία της φασματοσκοπίας μαζών ξεκινά το 1897, όταν o Sir J. J. Thomson δημοσίευσε την ιστορική εργασία του με τίτλο Theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases, η οποία οδήγησε στην ανακάλυψη του ηλεκτρονίου και χάρισε στον Βρετανό φυσικό το Βραβείο Νόμπελ Φυσικής το Κατά την διάρκεια της πρώτης δεκαετίας του 20 ου αιώνα ο Thomson κατασκεύασε τον πρώτο φασματογράφο μάζας (καλούμενο παραβολικό φασματογράφο), στον οποίο τα ιόντα διαχωρίζονταν εξαιτίας των διαφορετικών παραβολικών τροχιών που ακολουθούσαν ευρισκόμενα εντός ηλεκτρομαγνητικών πεδίων και η ανίχνευση τους πραγματοποιούταν με την βοήθεια φθορίζουσας φωτογραφικής πλάκας, επάνω στην οποία προσέπιπταν τα ιόντα. Αμέσως μετά τον Πρώτο Παγκόσμιο Πόλεμο, ο Francis W. Aston (Βραβείο Νόμπελ Χημείας 1922), εφηύρε φασματογράφο μαζών με βελτιωμένη διακριτική ικανότητα (κατά μια τάξη μεγέθους) εν σχέσει με τον αντίστοιχο του Thomson, γεγονός που του επέτρεψε την μελέτη διαφόρων ισοτόπων. Κατά την ίδια περίοδο, ο A. J. Dempster του Πανεπιστημίου του Σικάγο, βελτίωσε επιπλέον την αναλυτική ικανότητα ενός φασματογράφου μαζών και ανέπτυξε την πρώτη πηγή ιόντων, η οποία λειτουργούσε με την τεχνική της πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (electron impact). Η τεχνική αυτή, στην οποία δέσμες ηλεκτρονίων ιονίζουν μόρια που βρίσκονται στην αέριο φάση, χρησιμοποιείται μέχρι και σήμερα ευρέως για την ανάλυση μικρών σε μέγεθος μορίων.[1] 7

9 2.1.2 Εξέλιξη οργάνων ανάλυσης μάζας Η ανάπτυξη διαφόρων τύπων αναλυτή μαζών για τον βέλτιστο διαχωρισμό των αναλυόμενων ιόντων αποτέλεσε έναν από τους βασικούς στόχους των ερευνητών τα χρόνια που ακολούθησαν. Έτσι, το 1953 ο Alfred O. C. Nier του Πανεπιστημίου της Μινεσότα δημοσίευσε την εργασία του, στην οποία περιέγραφε την κατασκευή αναλυτή μάζας τύπου μαγνητικού τομέα διπλής εστίασης(magnetic sector double-focusing). Λίγα χρόνια νωρίτερα, το 1946, ο William E. Stephens του Πανεπιστημίου της Πενσιλβάνια, παρουσίασε την αρχή λειτουργίας του αναλυτή μαζών TOF(Time-Of-Flight), στον οποίο ο διαχωρισμός των ιόντων επιτυγχάνεται εξαιτίας της διαφοράς των ταχυτήτων τους καθώς κινούνται κατά μήκος μιας ευθείας διαδρομής συγκεκριμένου μήκους. Το 1953 ο Wolfgang Paul κατασκεύασε στο Πανεπιστήμιο της Βόννης τον πρώτο αναλυτή μαζών τύπου τετραπόλου (Quadrupole). Οι αναλυτές αυτοί (που αργότερα αποδείχθηκαν ιδανικοί για σύζευξη με διατάξεις LC και GC), διαχωρίζουν τα ιόντα με την βοήθεια ενός ηλεκτρικού πεδίου παραγόμενου από τετράπολα και παρότι στερούνται της ακρίβειας των οργάνων μαγνητικού τομέα, χρησιμοποιήθηκαν έκτοτε ευρέως, εξαιτίας της σταθερότητας τους, του μεγάλου αναλυτικού τους εύρους και της ικανότητας τους για χρήση στην συζευγμένη φασματοσκοπία μαζών (tandem MS). Η τεχνική αυτή επιτυγχάνεται μέσω διάταξης πολλαπλών τετραπόλων τοποθετημένων εν σειρά. Οι μέχρι στιγμής βέλτιστοι αναλυτές μαζών ανήκουν στην κατηγορία των κυκλοτρονίων συντονισμού ιόντων (Ion Cyclotron Resonance-ICR). Η κατηγορία αυτή των ανιχνευτών ανακαλύφθηκε το 1949 από τον J. A. Hipple και τους συνεργάτες του και στηρίζεται στην σάρωση των σπειροειδών τροχιών των ιόντων, τα οποία τοποθετούνται ταυτόχρονα εντός μαγνητικού και ηλεκτρικού πεδίου. Το αποτέλεσμα είναι ο προσδιορισμός των ιόντων με εκπληκτική ακρίβεια και ιδιαίτερα υψηλή αναλυτική ικανότητα του οργάνου. Το 1974 οι Melvin B. Comisarow και Alan G. Marshall (University of British Columbia) βελτίωσαν τους αναλυτές ICR εισάγοντας τα κυκλοτρονία συντονισμού ιόντων που χρησιμοποιούν μετασχηματισμούς Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-FT-ICR). Οι συσκευές αυτές παρουσιάζουν ως επιπλέον πλεονέκτημα τη δυνατότητα ταυτόχρονης σάρωσης πολλών 8

10 ιόντων με ακόμη μεγαλύτερη ακρίβεια μετρήσεων, κάτι που τις καθιστά τις κορυφαίες διατάξεις ανάλυσης μαζών μέχρι και σήμερα.[1] Ανακάλυψη νέων τεχνικών ιονισμού Οι απαιτήσεις του τομέα της Βιολογίας για ανάλυση μεγαλομορίων και αποφυγή εκτεταμένης θραυσματοποίησης των αναλυόμενων μορίων, έκαναν επιτακτική την ανακάλυψη λιγότερο δραστικών μεθόδων ιονισμού. Έτσι, ο Michael Barber και οι συνεργάτες του το 1981 ανέπτυξαν την μέθοδο ιονισμού FAB(Fast Atom Bombardment), μια ήπια μέθοδο ιονισμού, η οποία χρησιμοποιεί ταχέως κινούμενα άτομα με στόχο την εκρόφηση ιόντων μορίων από μια μήτρα γλυκερόλης. Εντούτοις, οι περιορισμοί της μεθόδου FAB (δυνατότητα εφαρμογής σε μόρια με μοριακό βάρος μέχρι λίγες χιλιάδες Dalton και αδυναμία άμεσης σύζευξης με χρωματογραφικό σύστημα για την συνεχή ανάλυση των δειγμάτων), δημιούργησαν την ανάγκη για ανάπτυξη ακόμη καλύτερων μεθόδων παραγωγής ιόντων.[2] Καλύπτοντας την ανάγκη αυτή, το 1983, οι ανεξάρτητες έρευνες του Koichi Tanaka και των συνεργατών του στην εταιρία Shimadzu, καθώς και των Franz Hillenkamp και Michael Karas του Πανεπιστημίου της Φρανκφούρτης, είχαν ως αποτέλεσμα την ανακάλυψη της τεχνικής ιονισμού MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation). Με την χρήση της τεχνικής αυτής τα ανιχνευόμενα ιόντα προκύπτουν μέσω εκρόφησης των προς ανάλυση μορίων από μια στερεή ή υγρή μήτρα, στην οποία προσπίπτει ακτινοβολία laser.[1, 2] Επιπρόσθετα, η ανακάλυψη του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI) το 1968 από τον Dole και η εφαρμογή του σε βιομόρια το 1984 από τον Fenn, έδωσε την δυνατότητα πλήρους επέκτασης της φασματοσκοπίας μαζών στον χώρο των βιολογικών επιστημών. Με την χρήση της τεχνικής αυτής επιτυγχάνεται ο ιονισμός μορίων που βρίσκονται εντός διαλύτη, μέσω διασποράς του διαλύματος διάμεσου ακροφυσίου, το οποίο βρίσκεται εντός ηλεκτρικού πεδίου. Ο ιονισμός με την μέθοδο ESI κατέστησε δυνατή και την πολλαπλή φόρτιση μεγαλομορίων που διαθέτουν πολλαπλές ιονίσιμες θέσεις, καθιστώντας έτσι ευκολότερη την ανάλυση των μορίων αυτών(μέσω ελάττωσης του προκύπτοντος λόγου m/z). 9

11 Και οι δυο ανωτέρω τεχνικές ιονισμού πέτυχαν για πρώτη φόρα τον ιονισμό πολύ μεγάλων μακρομορίων(πολυσακχαριτών, νουκλεικών οξέων και πρωτεϊνών ιδιαίτερα μεγάλου μοριακού βάρους), ενώ η τεχνική ESI κατέστησε δυνατή την άμεση σύζευξη φασματογράφων μαζών και χρωματογραφικών συστημάτων, καθιστώντας την φασματοσκοπία μαζών ένα από τα σημαντικότερα εργαλεία στους αναδυόμενους τομείς της γενετικής, της πρωτεωμικής και της μεταβολομικής των οργανισμών. Για την συνεισφορά τους στην ανάπτυξη της φασματοσκοπίας μαζών, οι Fenn και Tanaka μοιράστηκαν το 2002 το Νόμπελ Χημείας.[2] 10

12 Εικ.1 Ορόσημα στην εξέλιξη της φασματομετρίας μαζών 11

13 2.2 Γενικά-Ορισμοί Με τον όρο φασματοσκοπία ή φασματομετρία μαζών(mass spectrometry or spectroscopy), εννοούμε την διαδικασία της παραγωγής ιόντων από ανόργανες ή οργανικές ενώσεις με την χρήση κατάλληλων μεθόδων, τον διαχωρισμό των ιόντων αυτών με βάση τον λόγο μάζας προς φορτίο(mass-to-charge ratio-m/z) τους και την ποσοτική και ποιοτική ανίχνευση τους με βάση την σχετική αφθονία των αντίστοιχων m/z. Τα προς ανάλυση μόρια μπορούν να προκύψουν με την χρήση θερμικών μεθόδων, ηλεκτρικών πεδίων ή μέσω της σύγκρουσης τους με (ατομικά) ιόντα, ηλεκτρόνια, φωτόνια και άτομα υψηλής κινητικής ενέργειας. Η μορφή την οποία λαμβάνουν τα δημιουργούμενα ιόντα μπορεί να περιλαμβάνει μεμονωμένα ιονισμένα άτομα, συστοιχίες ατόμων, μόρια, καθώς και θραύσματα αυτών. Ο διαχωρισμός των παραγομένων ιόντων επιτυγχάνεται μέσω της εφαρμογής δυναμικών ή στατικών ηλεκτρικών ή μαγνητικών πεδίων. Παρολαυτά, τα τελευταία χρόνια μέσω της χρήσης αναλυτών μαζών τύπου TOF(οι οποίοι περιγράφονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο), κατέστη δυνατός ο διαχωρισμός ιόντων δίχως την χρήση πεδίων, με την προϋπόθεση τα προς ανάλυση ιόντα να διαθέτουν επακριβώς προσδιορισμένη κινητική ενέργεια στην αρχή της διαδρομής τους εντός του αναλυτή μαζών.[3] Παρότι οι φασματογράφοι μαζών καταστρέφουν το αναλυόμενο δείγμα, η φασματοσκοπία μαζών μπορεί να θεωρηθεί ως μη-καταστρεπτική μέθοδος ανάλυσης, διότι οι απαιτούμενες ποσότητες δείγματος για την διενέργεια της ανάλυσης είναι της τάξης των λίγων μικρογραμμαρίων ή ακόμα και νανογραμμαρίων. Με τον όρο φάσμα μαζών(mass spectrum) εννοούμε την δισδιάστατη απεικόνιση της έντασης του σήματος(τεταγμένη) ως προς τον λόγο m/z(τετμημένη). Η ένταση μιας κορυφής(όπως ονομάζονται συνήθως τα σήματα), αντικατοπτρίζει την αφθονία των ιόντων σε μια συγκεκριμένη τιμή του λόγου m/z, η οποία δημιουργήθηκε από την αναλυόμενη ουσία εντός της πηγής ιόντων. Ο λόγος μάζας προς φορτίο(mass-to-charge ratio-m/z) είναι εξ ορισμού μέγεθος αδιάστατο, καθώς προέρχεται από την επίσης αδιάστατη ατομική μάζα(m) ενός ιόντος και του αριθμού των στοιχειωδών φορτίων του(z). Ο αριθμός των στοιχειωδών φορτίων είναι 12

14 συνήθως(αλλά όχι απαραίτητα) ίσος με την μονάδα. Στην περίπτωση αυτή (z=1), η κλίμακα m/z αντικατοπτρίζει την ατομική μάζα του ιόντος. Πάραυτα, σε ορισμένες περιπτώσεις(ειδικά στην ανάλυση μεγαλομορίων), μπορούν να παρατηρηθούν διπλά, τριπλά ή και πολλαπλά φορτισμένα ιόντα. Εικ.2 Φάσμα μαζών λαμβανόμενο από διάταξη LC-MS Συνήθως, η κορυφή με τον υψηλότερο λόγο m/z προκύπτει από την ανίχνευση του ακέραιου ιονισμένου μορίου, που ονομάζεται μοριακό ιόν(molecular ion). Η κορυφή του μοριακού ιόντος συνοδεύεται συνήθως από διάφορες κορυφές σε μικρότερα m/z, που δημιουργούνται από την θραυσματοποίηση του μοριακού ιόντος. Οι κορυφές αυτές αναφέρονται ως κορυφές ιόντων θραυσμάτων(fragment ion peaks). Η κορυφή του φάσματος με την μεγαλύτερη ένταση ονομάζεται βασική κορυφή(base peak). Οι εντάσεις των κορυφών μπορούν να προκύψουν από τον υπολογισμό του εμβαδού που βρίσκεται κάτω από κάθε κορυφή(υπολογίζοντας το ολοκλήρωμα του εμβαδού κάτω από την καμπύλη της κορυφής). Ο θόρυβος(δηλαδή το συνεχές σήμα που λαμβάνεται κάτω από μια ορισμένη τιμή έντασης σήματος), αφαιρείται από την κορυφή πριν από τον υπολογισμό του ολοκληρώματος.[3] 13

15 Ανάλογα με το είδος των πληροφοριών που θέλουμε να λάβουμε υπάρχουν δυο τεχνικές λήψης φασμάτων μαζών. Στην πρώτη, γνωστή και ως τεχνική SCAN(scan mode), λαμβάνονται μετρήσεις του πλήρους φάσματος μεταξύ δυο ορισμένων ακραίων τιμών μαζών(π.χ amu). Η τεχνική αυτή έχει το πλεονέκτημα της απόδοσης πλήρων φασμάτων μαζών(τα οποία παρουσιάζουν όλα τα ανιχνευόμενα ιόντα σε ένα εύρος τιμών m/z), παρουσιάζει εντούτοις μειωμένη ευαισθησία, ιδιαίτερα καθώς το εύρος του οριζόμενου διαστήματος μέτρησης αυξάνεται. Εάν ο στόχος είναι η μέτρηση λίγων ιόντων(συνήθως 1 έως 10) με γνωστές τιμές m/z, τότε είναι προτιμότερο να χρησιμοποιηθεί η τεχνική SIM(Single Ion Monitoring mode). Στην τεχνική αυτή επιτυγχάνεται τεραστία αύξηση της ευαισθησίας σε σχέση με τις μετρήσεις σε scan mode και συνεπώς η τεχνική SIM είναι αυτή η οποία χρησιμοποιείται σε ποσοτικούς προσδιορισμούς.[4] 2.3 Φασματογράφοι μαζών Οι φασματογράφοι μαζών αποτελούνται από τρία βασικά τμήματα: την πηγή των ιόντων, τον αναλυτή μαζών και τον ανιχνευτή Πηγές Ιόντων Εν γένει, η παραγωγή ιόντων επιτυγχάνεται μέσω του ιονισμού ενός ουδέτερου μορίου, το οποίο βρίσκεται στην αέριο φάση, διαμέσου αποβολής ηλεκτρονίων, σύλληψης ηλεκτρονίων, πρωτονίωσης, αποπρωτονίωσης, σχηματισμού προσθέτων(adducts) ή μεταφοράς φορτισμένων σωματιδίων από μια συμπυκνωμένη φάση στην αέριο φάση. Για την παραγωγή των ιόντων και των λοιπών φορτισμένων ενώσεων(π.χ. ελεύθερες ρίζες) και θραυσμάτων, χρησιμοποιούνται διαφόρων ειδών διατάξεις και τεχνικές, οι οποίες χωρίζονται σε δυο αδρές κατηγορίες(«ήπιες» και «σκληρές») με βάση το μέγεθος των δομικών μεταβολών που προκαλούν στον αναλύτη και την χρησιμοποιούμενη ενέργεια. 14

16 Οι «σκληρές» τεχνικές είναι η σύγκρουση των μορίων του αναλύτη με ηλεκτρόνια (Electron Impact-EI) και οι «ήπιες» ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionisation-ESI), ο βομβαρδισμός με ταχέως κινούμενα άτομα (Fast Atom Bombardment-FAB), ο υποβοηθούμενος ιονισμός/εκρόφηση μήτρας με την χρήση laser (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-MALDI), ο χημικός ιονισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(atmospheric Pressure Chemical Ionisation-APCI) και ο φωτοιονισμός σε ατμοσφαιρική πίεση(atmospheric Pressure Photoionization-APPI). Ο απευθείας βομβαρδισμός μορίων της προς ανάλυση ουσίας(τα οποία βρίσκονται στην αέριο φάση) με ηλεκτρόνια, ώστε να επιτευχθεί ο ιονισμός της, είναι γνωστός ως ιονισμός πρόσκρουσης ηλεκτρονίων(electron Impact ή Electron Ionisation-EI). Τα ηλεκτρόνια τα οποία χρησιμοποιούνται για τον βομβαρδισμό παράγονται από την θέρμανση ενός μεταλλικού νήματος(συνήθως κατασκευασμένου από ρήνιο). Η ενέργεια την οποία φέρουν τα ηλεκτρόνια αυτά είναι συνήθως της τάξεως των 70 ev, διότι η ενέργεια αυτή είναι ικανή να ιονίσει και να θραυσματοποιήσει την συντριπτική πλειοψηφία των μορίων. Κατά μέσο όρο ένα ιόν παράγεται για κάθε 1000 μόρια αναλύτη που εισέρχονται στην πηγή ιόντων χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια των 70 ev. Από την ενέργεια αυτή τα ev μεταφέρονται στα ιονιζόμενα μόρια. Εφόσον μόνο 10 ev απαιτούνται για τον ιονισμό των περισσοτέρων οργανικών μορίων, η περίσσεια της ενέργειας οδηγεί σε εκτεταμένη θραυσματοποίηση.[4] Κατά την πρόσκρουση ηλεκτρονίου-ουδετέρου μορίου ένα ηλεκτρόνιο αποσπάται από το ουδέτερο μόριο, με αποτέλεσμα την παράγωγη ενός θετικά φορτισμένου μοριακού ιόντος. Το μοριακό αυτό ιόν μπορεί εν συνεχεία να θραυσματοποιηθεί δίδοντας μια ελεύθερη ρίζα και ένα κατιόν. M + e M + + 2e Με την χρήση της δραστικής αυτής τεχνικής λαμβάνονται συνήθως φορτισμένα τμήματα των μελετώμενων ουσιών, εξαιτίας της εκτεταμένης θραυσματοποίησης που προκαλείται από την υψηλή ενέργεια την οποία φέρουν τα ηλεκτρόνια πρόσκρουσης. Έτσι, η τεχνική αυτή καθίσταται ιδανική για την μελέτη της δομής των χημικών ενώσεων, καθώς εάν διατηρηθούν σταθερές οι συνθήκες τα λαμβανόμενα θραύσματα είναι χαρακτηριστικά για κάθε ένωση. 15

17 Εικ.3 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης EI Η τεχνική FAB(Fast Atom Bombardment) πρωτοχρησιμοποιήθηκε από τον Barber το 1982,[5] ο οποίος χρησιμοποίησε δέσμες ταχέως κινουμένων ατόμων Ar και Xe(σήμερα χρησιμοποιούνται κυρίως ιόντα Cs + και Xe + ) με σκοπό την εκρόφηση ιόντων ουσίας περιεχομένης σε υγρή μήτρα. Οι δέσμες ατόμων Ar/Xe παράγονται από πυροβόλο παρόμοιο με αυτό της τεχνικής EI(το πυροβόλο αρχικά παράγει ιόντα των στοιχείων αυτών, τα οποία εν συνεχεία μετατρέπονται σε ουδέτερα άτομα μέσω μηχανισμού ανταλλαγής φορτίου με άλλα εισερχόμενα ουδέτερα άτομα) και επιταχύνονται από πεδίο 4-8 kv.[6] Οι δέσμες ιόντων Cs + παράγονται με εξάτμιση από επιφάνεια επικεκαλυμμένη με άλατα Cs και εν συνεχεία επιτάχυνση αυτών από πεδίο 5-25 kv (στην περίπτωση που χρησιμοποιούνται ιόντα Cs η τεχνική ονομάζεται υγρή φασματοσκοπία μαζών δευτερευόντων ιόντων-liquid secondary ion mass spectrometry(lsims)).[7] Η ταχέως κινούμενη αυτή δέσμη κατευθύνεται έπειτα προς το δείγμα το οποίο βρίσκεται διαλυμένο σε υγρή μήτρα(συνήθως ως μήτρες χρησιμοποιούνται το m-nitrobenzyl alcohol (NBA) και η γλυκερόλη) και εκεί συγκρούεται με τα μόρια του αναλύτη παράγοντας θετικά και αρνητικά ιόντα. Ο ρόλος της μήτρας είναι η υποβοήθηση της δημιουργίας των ιόντων και η απορρόφηση μέρους της ενέργειας της δέσμης, που θα οδηγούσε σε πλήρη αποικοδόμηση των μορίων του αναλύτη. 16

18 Εικ.4 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης FAB, SIMS Τα πλεονεκτήματα της τεχνικής ιονισμού FAB είναι ότι αποτελεί μια γρήγορη και σχετικά απλή μέθοδο, η οποία μπορεί να εφαρμοσθεί σε πληθώρα ενώσεων συμπεριλαμβανομένων και θερμοευαίσθητων ή ενώσεων μεγάλου μοριακού βάρους. Παρουσιάζει ωστόσο και μειονεκτήματα, όπως η μειωμένη ευαισθησία εν σχέσει με άλλες μεθόδους ιονισμού και η προϋπόθεση το προς ανάλυση συστατικό να είναι διαλυτό σε κάποια από τις μήτρες που χρησιμοποιούνται στην τεχνική αυτή.[8] Στην τεχνική ιονισμού MALDI ο αναλύτης αναμιγνύεται με μεγάλη περίσσεια(περισσότερο από 10000:1(mol/mol)) υποστρώματος(μήτρας) χαμηλού μοριακού βάρους. Οι περισσότερες μήτρες είναι οργανικές αρωματικές ενώσεις, ικανές να απορροφούν την υπεριώδη ακτινοβολία laser που εφαρμόζεται στις συσκευές MALDI. Συνήθως όταν οι αναλύτες είναι πρωτεΐνες χρησιμοποιούνται ως μήτρες παράγωγα του βενζοϊκού και του κιναμμωμικού οξέως, ενώ όταν οι αναλύτες είναι αντιβιοτικά και ενζυμα χρησιμοποιείται 3- υδροξυπικολινικό οξύ. Το μίγμα μήτρας-αναλύτη εναποτίθεται σε μεταλλική πλάκα, όπου ο διαλύτης εξατμίζεται, καταλήγοντας στην δημιουργία συγκρυστάλλου μήτρας-αναλύτη. Ο συγκρύσταλλος μεταφέρεται εντός του φασματομέτρου, όπου και εφαρμόζεται υψηλό κενό. Εν συνεχεία, ένα παλμικό laser βομβαρδίζει τον συγκρύσταλλο(με ρυθμό nsec), γεγονός που καταλήγει στην εκρόφηση(desorption) και τον ιονισμό του αναλύτη. Η περίσσεια του υλικού 17

19 της μήτρας είναι σημαντική, καθόσον η μήτρα παίζει τον ρόλο του πρωταρχικού απορροφητή της ενέργειας UV του laser και διασπάται ταχύτατα, μεταπίπτοντας στην αέριο φάση. Επιπροσθέτως, η μεγάλη ποσότητα υλικού μήτρας εν σχέση με την ποσότητα του αναλύτη μειώνει τις πιθανές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων του αναλύτη και οδηγεί στην παραγωγή πρωτονιωμένων παραγώγων δίχως ελεύθερες ρίζες, τα οποία με την σειρά τους ιονίζουν τα επιθυμητά μόρια.[9] Εικ.5 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης MALDI Στις περισσότερες των περιπτώσεων οι φορείς των φορτίων είναι πρωτόνια, κάτι που οδηγεί στον σχηματισμό ιόντων [Μ+Η] + και [Μ+Η] -. Επομένως, εν συγκρίσει με τον ESI δημιουργούνται κυρίως ιόντα με ένα φορτίο. Συνήθως οι συσκευές MALDI συζεύγνυνται με αναλυτές μαζών TOF. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου MALDI είναι η υψηλή ταχύτητα ανάλυσης, η καλή ανοχή σε παρουσία αλάτων στο δείγμα και η απλότητα των προκυπτόντων φασμάτων, γεγονός που την καθιστά ιδανική για ταυτοποίηση πρωτεϊνών στο επίπεδο των πεπτιδίων (peptide mass fingerprint analysis).[10] O χημικός ιονισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (APCI) είναι μια τεχνική ιονισμού η οποία χρησιμοποιεί αντιδράσεις ιόντων-μορίων αέριας φάσης σε ατμοσφαιρική πίεση. Είναι μέθοδος ανάλογη του χημικού ιονισμού(ci), με την διαφορά ότι τα πρωταρχικά ιόντα παράγονται από ηλεκτρικές εκκενώσεις στη στεφάνη της βελόνας ιονισμού(corona discharges), οι οποίες εφαρμόζονται σε εκνέφωμα διαλύτη. 18

20 Εικ.6 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης APCI Οι αντιδράσεις οι οποίες δύνανται να λάβουν χώρα σε συσκευές APCI ανήκουν σε μια εκ των κάτωθι παρατιθέμενων τύπων: M + [BH] + [M+H] + + B μεταφορά πρωτονίου (proton transfer) M + X + [M+X] + ηλεκτρονιόφιλη προσθήκη (electrophilic addition) M + X + [M A] + + AX απόσπαση ανιόντος (anion abstraction) M + X + M + + X ανταλλαγή φορτίου (charge exchange) [11] Παρότι η μεταφορά πρωτονίου συνήθως καταλήγει στην δημιουργία πρωτονιωμένων ιόντων [M+H] +, οι όξινες ουσίες μπορούν να δώσουν εν αφθονία αποπρωτονιωμένα ιόντα τύπου [M-H] -. Η τεχνική APCI εφαρμόζεται κυρίως σε πολικές και μετρίως πολικές ουσίες μεσαίου μοριακού βάρους(~1500) και δίνει κατά κύριο λόγο μονά φορτισμένα ιόντα. Το περιέχον τον αναλύτη διάλυμα, το οποίο προέρχεται από το έκλουσμα μιας χρωματογραφικής στήλης ή από έναν καθετήρα αμέσου εισαγωγής, εισάγεται απευθείας (με ρυθμό μεταξύ 0.2 και 2ml/min 1 ) σε έναν πνευματικό νεφελοποιητή, όπου και μετατρέπεται σε εκνέφωμα λεπτού διαμερισμού μέσω ενός ρεύματος αζώτου υψηλής ταχύτητας. Τα σταγονίδια παρασύρονται έπειτα από την ροη του αερίου εντός θερμαινόμενου σωλήνα χαλαζία που ονομάζεται θάλαμος αποδιαλυτοποίησης/εξάτμισης. Εκεί η θερμότητα εξατμίζει τον διαλύτη και τα μόρια του αναλύτη που περιέχουν τα σταγονίδια. Εν συνεχεία, το θερμό αέριο και τα (αέρια πλέον) μόρια του αναλύτη διέρχονται διαμέσω ηλεκτροδίου εκκενώσεων στεφάνης, όπου και 19

21 λαμβάνει χώρα ο ιονισμός. Η διεργασίες που επισυμβαίνουν και οδηγούν στον ιονισμό των μορίων στον APCI είναι ισοδύναμες με αυτές στον CI, με την διαφορά ότι γίνονται σε ατμοσφαιρική πίεση.[4] H τεχνική ιονισμού APPI είναι η πλέον νέα εκ των τεχνικών ιονισμού σε ατμοσφαιρική πίεση(πρωτοχρησιμοποιήθηκε σε συσκευές MS το 1984) και χρησιμοποιείται συμπληρωματικά ως προς τις τεχνικές ESI και APCI για μόρια τα οποία εμφανίζουν μικρά ποσοστά ιονισμού με την χρήση των ανωτέρω τεχνικών.[12] Τα κύρια στάδια που είναι υπεύθυνα για την ανίχνευση με την τεχνική APPI είναι: η εξαέρωση του εκλούσματος της στήλης, η παραγωγή των φωτοιόντων μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ φωτονίων που εκλύονται από μια πηγή UV και των μορίων του αναλύτη και τέλος η ανίχνευση των παραγομένων ιόντων. Ένας μεγάλος αριθμός αντιδράσεων εμπλέκονται στην διαδικασία του φωτοιονισμού: Φωτοδιέγερση: AB + hv AB* και ΜΡ + hv MP* και ακόλουθα: Φωτοδιάσπαση: AB* A + B Αποσύνθεση με εκπομπή ακτινοβολίας: AB* + AB hv Απόσβεση σύγκρουσης : AB* + MP AB + MP* Απόσβεση σύγκρουσης: AB + gas AB + gas* όπου ΑΒ τα μόρια του αναλύτη, ΜΡ τα μόρια του διαλύτη και gas οποιοδήποτε αέριο χρησιμοποιείται στην πηγή. Όταν hv IE (Ionization Energy), επισυμβαίνει μια ακόμη αντίδραση: AB* AB + + e - ενώ έπειτα μπορούν να ακολουθήσουν και άλλες, π.χ.: AB + + gas + e - AB + gas AB + +MP + e - AB + MP AB + + e - AB 20

22 Η καταλληλότερη πηγή για την παραγωγή της ακτινοβολίας ιονισμού είναι η λυχνία Kr, διότι η ενέργεια των παραγομένων από αυτή φωτονίων (10 ev), είναι χαμηλότερη της ενέργειας ιονισμού των περισσότερων συστατικών του αέρα (και άρα αποφεύγεται ο ιονισμός τους), ταυτοχρόνως όμως είναι ικανή να ιονίσει τα περισσότερα προς διερεύνηση μόρια. Επειδή πολλές φορές ο απευθείας ιονισμός των επιθυμητών ουσιών είναι αρκετά σπάνιος(κυρίως λόγω του γεγονότος ότι τα εκπεμπόμενα φωτόνια εξαντλούνται στον ιονισμό των μορίων του διαλύτη), χρησιμοποιούνται σε σχετικά μεγάλη ποσότητα(σε σχέση με την ποσότητα του αναλύτη), ουσίες υποβοηθητικές του ιονισμού(dopants), οι οποίες δρουν ως ενδιάμεσα μεταξύ των φωτονίων και των μορίων του αναλύτη[13], επάγοντας την μεταξύ τους αλληλεπίδραση, σύμφωνα με τις κάτωθι αντιδράσεις: D + hv D +, D + + AB D + AB + [14] Η συσκευή του APPI αποτελείται από τα ίδια μέρη που χρησιμοποιεί και το APCI(θερμαινόμενος νεφελοποιητής), με την διαφορά ότι στην θέση της βελόνας εκφόρτισης(discharge needle) τοποθετείται η λυχνία εκπομπής της ιονίζουσας ακτινοβολίας και τα προκύπτοντα ιόντα συνεχίζουν ευθεία την πορεία τους προς την είσοδο του αναλυτή μαζών(ευθύγραμμος πηγή ιόντων).[15] Ο νεφελοποιητής και η λυχνία μπορούν επίσης να τοποθετηθούν κάθετα ως προς την είσοδο του αναλυτή μαζών και η ανακατεύθυνση των ιόντων να γίνει με την εφαρμογή δυναμικού(ορθογώνια πηγή ιόντων).[16] 21

23 Εικ.7 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης APPI Η τεχνική APPI μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ποικίλων ουσιών όπως σύμπλοκα φαρμάκων σε βιολογικά υγρά(γλυκουρονίδια απομορφίνης, δοβουταμίνης και εντακαπόνης)[17], φλαβονοειδή[18], στεροειδείς ορμόνες[19], εντομοκτόνα και παρασιτοκτόνα[14]. Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη τεχνική για την παραγωγή ιόντων είναι ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό(electrospray Ionisation-ESI). Η τεχνική αυτή είναι η ηπιότερη διαθέσιμη σήμερα, οδηγώντας συνήθως στην παραγωγή του μοριακού ιόντος του αναλύτη(ελάχιστη θραυσματοποίηση), ειδικά όταν χρησιμοποιούνται χαμηλές τάσεις κώνου(dl Voltage 30V βλ. επόμενες παραγράφους). Στην τεχνική αυτή, τα μόρια του αναλύτη σε μορφή διαλύματος εντός πολικού πτητικού διαλύτη(συγκεντρώσεις της τάξης των ngr), διέρχονται με αργό ρυθμό(συνήθως 1-20 μl/min) διάμεσου τριχοειδούς σωλήνα από ανοξείδωτο χάλυβα(εσωτερικής διαμέτρου ~ 0,1mm) με τη βοήθεια μηχανικής αντλίας. Εξαιρετικά υψηλό πεδίο (2-6 ΚV) εφαρμόζεται στο ακροφύσιο του μεταλλικού τριχοειδούς σωλήνα, προκαλώντας την διασπορά του διαλύματος του δείγματος σε μορφή αερολύματος αποτελούμενου από υπερφορτισμένα σταγονίδια ηλεκτροψεκασμού. 22

24 Η νεφελοποίηση υποβοηθείται από αέριο(sheath gas)-συνήθως ξηρό N2, το οποίο ρέει ομοαξονικά ως προς τον τριχοειδή σωλήνα. Η ροή αυτή του αερίου βοηθά επίσης τον προσανατολισμό της δέσμης των φορτισμένων σταγονιδίων προς τον αναλυτή μαζών. Τα φορτισμένα σταγονίδια ελαττώνονται σε μέγεθος μέσω εξατμίσεως του διαλύτη με την βοήθεια ροής αζώτου, το οποίο δρα ως ξηραντικό αέριο. Η φορά της ροής του ξηραντικού αερίου είναι κάθετη στην διεύθυνση ροής των σταγονιδίων.[20] Εικ.8 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης ESI Μέχρι την δεκαετία του 1990 υπήρχε η άποψη ότι τα ανιχνευόμενα από διατάξεις ESI-MS ιόντα προϋπήρχαν εντός των αρχικών διαλυμάτων-δειγμάτων που χρησιμοποιούνταν στην ανάλυση. Απεδείχθη όμως, ότι σε πολλές περιπτώσεις ο αρχικός ιονισμός των προς ανίχνευση ουσών σε μορφή διαλύματος δεν είχε σχέση με τα ιόντα που προέκυπταν στα λαμβανόμενα φάσματα, π.χ. η μυογλοβίνη όταν ευρίσκετο εντός όξινου διαλύματος (ph=3) και άρα εμφάνιζε υψηλό βαθμό πρωτονίωσης, έδινε μοριακά ιόντα σε MS negative mode, ενώ όταν ευρίσκετο εντός βασικού διαλύματος (ph=10) και άρα εμφάνιζε υψηλό βαθμό αποπρωτονίωσης, έδινε μοριακά ιόντα σε MS positive mode.[21] Καθίσταται λοιπόν σαφής η ύπαρξη διαφορετικών μηχανισμών φόρτισης των προς ανάλυση μορίων. Για να αποσαφηνισθεί η όλη διαδικασία παραγωγής φορτισμένων αναλυτών, η πορεία του εισαγομένου στην διάταξη ESI δείγματος, που καταλήγει στην δημιουργία ιόντων αέριας φάσης, πρέπει να χωριστεί σε τρία στάδια: α.) την δημιουργία φορτισμένων σταγονιδίων από 23

25 το άκρο του τριχοειδούς σωλήνα, β.) την διαδικασία εξάτμισης του διαλύτη από τα σταγονίδια και την δημιουργία φορτισμένων αναλυτών και γ.) την μετάβαση του φορτισμένου αναλύτη στην αέριο φάση.[20] Κατά την πρώτη φάση δημιουργίας των φορτισμένων σταγονιδίων, καθώς το διάλυμα του αναλύτη διέρχεται με την βοήθεια αντλίας διαμέσω τριχοειδούς σωλήνα, παρατηρούμε την δημιουργία φορτίων εξαιτίας της οξείδωσης ή αναγωγής του διαλύτη εντός του τριχοειδούς σωλήνα στον οποίο εφαρμόζεται μεγάλη διάφορά δυναμικού(το αν θα επέλθει οξείδωση ή αναγωγή εξαρτάται από το αν η συσκευή είναι ρυθμισμένη σε positive ή negative mode, οπότε και αντιστρέφεται η πολικότητα των άκρων των ηλεκτροδίων, άρα και η ροη των ηλεκτρονίων από ή προς τον τριχοειδή μεταλλικό σωλήνα)[22-24]. Οι περισσότεροι πολικοί διαλύτες που χρησιμοποιούνται στην χρωματογραφία(ύδωρ, ακετονιτρίλιο, μεθανόλη) έχουν την δυνατότητα αυτή όταν βρεθούν υπό υψηλή ηλεκτρική τάση, υπό την προϋπόθεση απουσίας ισχυρά οξειδοαναγωγικών αναλυτών που θα παρενέβαιναν στην διαδικασία[24]. Τα δημιουργούμενα φορτία απωθούμενα από τον αντίθετα φορτισμένο τριχοειδή σωλήνα παρασύρονται προς το ακροφύσιο του, όπου και δημιουργούν έναν μηνίσκο. Ο μηνίσκος αυτός είναι ασταθής και γρήγορα μετατρέπεται σε κώνο(που ονομάζεται κώνος Taylor)[25], ο οποίος διατηρεί την σταθερότητα του όσο οι ανταγωνιστικές δυνάμεις των αμοιβαία απωθούμενων φορτίων της επιφανείας τους και της επιφανειακής τάσης του υγρού βρίσκονται σε ισορροπία. Υπό την επίδραση του ισχυρού εφαρμοζόμενου πεδίου(περίπου 10 6 V/m) εκρέει από τον κώνο Taylor μια λεπτότατη δέσμη φορτισμένου υγρού, η οποία κάτω από την επίδραση των ηλεκτροστατικών απωστικών δυνάμεων των περιεχομένων σε αυτήν φορτίων, διαχωρίζεται σε επιμέρους σταγονίδια πολύ λεπτού διαμερισμού(περίπου 1,5 μm) και στενής κατανομής μεγέθους, τα οποία περιέχουν φορτίο περίπου C(που αντιστοιχεί σε περίπου ιόντα). Τα φορτισμένα αυτά σωματίδια απωθούνται μεταξύ τους λόγω των δυνάμεων Coulomb(εφόσον διαθέτουν όμοια φορτία) και κατευθύνονται προς το ηλεκτρόδιο αντίθετης με αυτά πολικότητας, το οποίο βρίσκεται στην είσοδο του θερμαινόμενου τριχοειδούς σωλήνα(που αποτελεί την είσοδο του αναλυτή μαζών).[20] 24

26 Κατά την δεύτερη φάση, τα φορτισμένα σταγονίδια κινούνται ταχύτατα προς το αντιδιαμετρικά του τριχοειδούς σωλήνα ευρισκόμενο ηλεκτρόδιο(του οποίου η πολικότητα είναι αντίθετη του φορτίου που φέρουν). Κατά την κίνηση τους αυτή και εξαιτίας της μεγάλης τους ταχύτητας και της ροής του ξηραντικού αερίου(ν2), ο περιεχόμενος στα σταγονίδια διαλύτης εξατμίζεται σταδιακά(solvent evaporation). Τα αποτέλεσμα της εξάτμισης αυτής είναι η μείωση του όγκου του σταγονιδίου και η συνεπακόλουθη αύξηση της πυκνότητας του ηλεκτρικού φορτίου που φέρει το σταγονίδιο, εξαιτίας της μείωσης της απόστασης μεταξύ των φερομένων φορτίων[26]. Όταν η ηλεκτροστατική απώθηση των περιεχομένων φορτίων υπερκεράσει την ισχύ της επιφανειακής τάσης του σταγονιδίου(rayleigh limit)[27], επέρχεται διαχωρισμός των σταγονιδίων σε μικρότερα σταγονίδια(coulombic fission) και αυτή η διαδικασία συνεχίζεται μέχρις ότου τα τελικώς προκύπτοντα νανοσταγονίδια να διαθέτουν εξαιρετικά μεγάλη πυκνότητα φορτίου. Από τα σταγονίδια αυτά προκύπτουν τα ιόντα αέριας φάσης.[26, 28] Εικ.9 Διαδικασία δημιουργίας ιόντων αέριας φάσης από σταγονίδια ηλεκτροψεκασμού 25

27 Κατά την τρίτη φάση παράγονται τα ιόντα αέριας φάσης από τα φορτισμένα νανοσταγονίδια με έναν εκ των τριών κάτωθι προτεινόμενων μηχανισμών: 1. Ο πρώτος μηχανισμός, ο οποίος αναφέρεται ως μοντέλο υπολειπομένου φορτίου(charge residue model-crm), υποστηρίζει πως το τελικό σταγονίδιο, το οποίο προκύπτει από διαδοχικές εξατμίσεις διαλύτη και σχάσεις Coulomb, περιέχει ένα μόνο μόριο του αναλύτη. Έτσι, το εναπομείναν φορτίο του σταγονιδίου, μετά και την εξάτμιση της τελευταίας ποσότητας διαλύτη από το σταγονίδιο, ουσιαστικά «επικάθεται» πάνω στο ουδέτερο αυτό μόριο φορτίζοντας το. Το μοντέλο αυτό θεωρείται ότι βρίσκει εφαρμογή κυρίως στην περίπτωση πρωτεϊνικών μεγαλομορίων.[29] 2. Ο δεύτερος μηχανισμός, γνωστός ως μοντέλο εξάτμισης ιόντων(ion evaporation model-iem), προτείνει πως όταν η διάμετρος των φορτισμένων σταγονιδίων μικρύνει πέρα από ένα συγκεκριμένο όριο(συνήθως όταν R=10nm), οι απωστικές ηλεκτροστατικές δυνάμεις μεταξύ των φορτίων του σταγονιδίου είναι αρκετά ισχυρές ώστε να προκαλέσουν την αποβολή φορτισμένων ιόντων από το σταγονίδιο. Στο σημείο αυτό (δηλαδή όταν R<10nm) η αποβολή ιόντων υπερισχύει της σχάσης Coulomb[28]. Το μοντέλο αυτό θεωρείται ότι βρίσκει εφαρμογή κυρίως στην περίπτωση μικρών ανόργανων και οργανικών ιόντων.[30-32] Παραλλαγή του μοντέλου αυτού αποτελεί το μοντέλο αποβολής αλυσίδας(chain ejection model-cem), το οποίο βρίσκει εφαρμογή στην περίπτωση μεγαλομορίων που έχουν χάσει την τριτοταγή δομή τους και βρίσκονται υπό την μορφή αλυσίδας. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, τα πολικά τμήματα της αλυσίδας προεκβάλλουν του σταγονιδίου και εξωθούνται εκτός αυτού, συμπαρασύροντας μαζί τους και το υπόλοιπο μεγαλομόριο.[33] 3. Ο τρίτος μηχανισμός, ο οποίος ονομάζεται μοντέλο του Fenn, είναι αρκετά περιπλοκότερος των προαναφερθέντων. Στηρίζεται στην παραδοχή ότι τα μόρια του αναλύτη εντός των σταγονιδίων είναι ηλεκτρικά ουδέτερα(ακόμη και στην 26

28 περίπτωση που διαθέτουν κάποια φορτία θεωρείται ότι τα φορτία αυτά εξουδετερώνονται από φορτισμένες ομάδες γειτονικών μορίων(σχηματισμός ζεύγους ιόντων)). Τα ουδέτερα αυτά μόρια κινούνται ελεύθερα εντός του σταγονιδίου(κίνηση Brown). Όταν ένα τέτοιο μόριο διέλθει κοντά από την πλούσια σε ηλεκτρικά φορτία επιφάνεια του σταγονιδίου οι πολικές περιοχές του αλληλεπιδρούν με τα επιφανειακά φορτία και ουσιαστικά το μόριο «προσδένεται» στην επιφάνεια του σταγονιδίου. Ακολούθως, ένας συνδυασμός κινήσεων Brown, ταλαντώσεων και πολικών αλληλεπιδράσεων επιτρέπει στο(φορτισμένο πλέον, εξαιτίας της πρόσδεσης σε αυτό επιφανειακών φορτίων) μόριο, αρχικά να αναδυθεί από την επιφάνεια του σταγονιδίου και τελικά να αποσπασθεί από αυτή όσο οι διαδοχικές σχάσεις Coulomb ελαττώνουν το μέγεθος και αυξάνουν το επιφανειακό φορτίο του σταγονιδίου. Στο μοντέλο αυτό τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αναλύτη(μέγεθος, σχήμα, πολικότητα, επιφανειακή τάση) παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην συμπεριφορά του κατά την διάρκεια της διαδικασίας σχηματισμού των ιόντων αέριας φάσης.[34] Εικ.10 Μηχανισμοί δημιουργίας ιόντων αέριας φάσης(εκτός μοντέλου του Fenn) 27

29 Ορισμένοι ερευνητές θεωρούν ότι υφίσταται και μια τέταρτη φάση, η οποία περιλαμβάνει τις αντιδράσεις ανασυνδυασμού ανιόντος/κατιόντος και ιόντων/μορίων αέριας φάσης. Συγκεκριμένα, θεωρείται ότι τα αποδιαλυτωμένα ιόντα και μόρια αντιδρούν μεταξύ τους στην αέριο φάση, με βάση τις διαφορές στις μεταξύ τους ανιονικές και κατιονικές συγγένειες.[35] Τα μόρια τα οποία χρησιμοποιούνται συνήθως στην φαρμακευτική είναι πολικά μόρια, τα οποία δίνουν ιόντα στην περιοχή m/z Τα είδη των ιόντων που σχηματίζονται με την χρήση του ESI, εξαιτίας της υπερσυγκέντρωσης φορτίων στα σταγονίδια και των ηλεκτροχημικών διεργασιών στο ακροφύσιο ψεκασμού, είναι διάφορα και εξαρτώνται από την πολικότητα του μορίου, το ph του διαλύματος, την παρουσία αλάτων και την συγκέντρωση του μορίου στο ψεκαζόμενο διάλυμα. Στην περίπτωση του θετικού μοριακού ιονισμού(ειδικά όταν χρησιμοποιείται χλωριούχο αμμώνιο ως ρυθμιστικό), τα παρατηρούμενα ιόντα είναι της μορφής [M+H] +, [M+NH4] +, και [M+Na] +, καθώς και διμερισμένα μοριακά ιόντα τύπου [2M+H] +, [2M+NH4] + και [2M+Na] +. Στην περίπτωση αρνητικού μοριακού ιονισμού, πέραν των συνήθως ανιχνευόμενων μοριακών ιόντων τύπου [Μ-Η] -, παρατηρούνται επίσης και ιόντα προσθήκης(adduct ions) τύπου [M+Cl], [M+EtO] και [Μ+AcO] -. Διμερισμένα αρνητικά ιόντα τύπου [2Μ-2Η+Να] - παρατηρούνται επίσης.[3] Μακρομόρια με πληθώρα ιονισίμων θέσεων, δίδουν πολλαπλώς φορτισμένα ιόντα με την χρήση διατάξεων ESI. Εξειδικευμένο λογισμικό και αλγόριθμοι χρησιμοποιούνται εν συνεχεία για τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους το μεγαλομορίου και των θραυσμάτων του.[4] Ένα ακόμη σημαντικό χαρακτηριστικό του ESI είναι η ευαισθησία του στην συγκέντρωση και όχι στην ολική εγχυόμενη ποσότητα δείγματος στην πηγή ιόντων. Για τον λόγο αυτό το ESI μπορεί να χρησιμοποιηθεί με μεγάλη επιτυχία και σε ποσοτικούς προσδιορισμούς, καθώς μεταβολές στην ροή κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας δεν επηρεάζουν το λαμβανόμενο σήμα.[4, 36] Πρέπει να αναφερθεί επίσης ότι οι συγκεντρώσεις των προς ανάλυση ουσιών στα διαλύματα δεν πρέπει να υπερβαίνουν τα 10-4 Μ, διότι σε συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 28

30 αυτήν, τα σταγονίδια που παράγονται από το ESI εξατμίζονται προς δημιουργία υπολείμματος ξηρού άλατος, πριν οι συνθήκες ευνοήσουν την δημιουργία ιόντων αέριας φάσης.[28] Τέλος, σημαντικό είναι να αναφερθεί ότι, επειδή ο ESI είναι μια ιδιαίτερα ήπια μέθοδος ιονισμού, σε περίπτωση που θέλουμε να λάβουμε δομικά στοιχεία για μια ένωση(και συνεπώς να την θραυσματοποιήσουμε), υπάρχουν δυο τρόποι να ξεπεραστεί το πρόβλημα της απουσίας θραυσματοποίησης των παραγομένων μοριακών ιόντων. Η πρώτη λύση, είναι η χρησιμοποίηση ενός συστήματος συζευγμένης φασματοσκοπίας μαζών(tandem MS), το οποίο χρησιμοποιεί περισσότερους του ενός αναλυτές μαζών(συνήθως τετράπολα) για να προκαλέσει θραυσματοποίηση των ιόντων που παράγονται από το σύστημα ESI. Τα συστήματα αυτά διαθέτουν το πλεονέκτημα της δυνατότητας επιλογής των(παραγομένων από ένα δείγμα) ιόντων, τα οποία επιθυμούμε να θραυσματοποιήσουμε, είναι όμως σημαντικά ακριβότερα έναντι ενός συστήματος απλού MS. Η δεύτερη λύση είναι η θραυσματοποίηση των παραγομένων από το ESI ιόντων μέσω της εφαρμογής τάσης (Voltage-συνήθως 15-90V) στο διάστημα μεταξύ του στομίου(noozle) και του συλλέκτη(skimmer) των ιόντων, στην είσοδο του φασματογράφου μαζών αποκαλούμενη ως γραμμή διαλυτοποίησης (Desolvation Line) (Εικ. 11). Με την χρήση της τεχνικής αυτής, που ονομάζεται θραυσματοποίηση στην πηγή ή θραυσματοποίηση τάσης κώνου( cone-voltage or in-source fragmentation), επιτυγχάνεται η επιτάχυνση των ιόντων στην περιοχή αυτή, με αποτέλεσμα την αύξηση της πιθανότητας θραυσματοποίησης κατά τις συγκρούσεις των ιόντων αυτών με υπολείμματα μορίων αερίου, εξαιτίας της αυξημένης κινητικής ενέργειας που φέρουν. Η εφαρμογή τάσης V δεν προάγει την θραυσματοποίηση, δίδοντας συνήθως μόνον μοριακά ιόντα, ενώ η εφαρμογή τάσεων >30 V, έχει ως αποτέλεσμα την σχάση των μοριακών ιόντων προς μικρότερα θραύσματα. Η διαδικασία αυτή, αν και απλή στην εφαρμογή της, προκαλεί την σχάση όλων των μοριακών ιόντων ενός δείγματος, δυσχεραίνοντας την ερμηνεία των φασμάτων, ειδικά στην περίπτωση χρησιμοποίησης μιγμάτων.[37] 29

31 Εικ.11 Διαδρομή ιόντων παραγομένων με ESI προς τον αναλυτή μαζών Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφερθεί ότι στην περίπτωση χρησιμοποίησης μεθόδων ατμοσφαιρικού ιονισμού(esi, APPI, APCI κλπ.), πρέπει τα δημιουργούμενα ιόντα να μεταβούν από την ατμοσφαιρική πίεση σε πιέσεις της τάξης των 10-5 Torr, στις οποίες λειτουργούν οι αναλυτές μαζών. Αυτό συμβαίνει διότι τα ιόντα αέριας φάσης είναι ιδιαίτερα δραστικά και βραχύβια, συνεπώς θα πρέπει να μελετώνται υπό συνθήκες υψηλού κενού. Η μετάβαση αυτή γίνεται σε δυο στάδια, αρχικά με την εμπλοκή μιας περιστροφικής αντλίας για να ελαττωθεί η πίεση από την μια ατμόσφαιρα(1 Torr) του θαλάμου ηλεκτροψεκασμού στα Torr του χώρου αποδιαλύτωσης(μεταξύ sampling cone και skimmer) και εν συνεχεία με την εμπλοκή μιας αντλίας διάχυσης για την δημιουργία υψηλού κενού(<10-5 Torr) στον χώρο του αναλυτή μαζών(εικ. 11). Σημειώνεται πως οι αναλυτές μάζας ανάλογα με τον τύπο τους λειτουργούν με διαφορετικές πιέσεις (συγκεκριμένα αναλυτές τύπου Quadrupole απαιτούν πιέσεις της τάξης των 10-5 Torr για να λειτουργήσουν, ενώ αναλυτές τύπου FT-IR χρειάζονται κενό της τάξης των 10-8 Torr).[38] Αναλυτές μαζών Ο αναλυτής μαζών είναι η καρδιά του φασματόμετρου μαζών. Σε αυτόν τα διάφορα είδη ιόντων μιας ακτίνας ιόντων, διαχωρίζονται(σε σχέση με τον λόγο μάζας-φορτίου τους(m/z)) και εν συνεχεία προχωρούν στον ανιχνευτή. Υπάρχουν διάφοροι τύποι αναλυτών καθένας με τα δικά του χαρακτηριστικά. Οι κυριότεροι τύποι είναι πέντε: 30

32 α.) οι αναλυτές οι οποίοι χρησιμοποιούν τετράπολα(quadrupoles), β.) οι αναλυτές χρόνου πτήσης(tof-time Of Flight), γ.) οι παγίδες ιόντων(ion Trap), δ.) οι αναλυτές μαγνητικού τομέα(magnetic Sector Analyzers) ε.) οι αναλυτές που χρησιμοποιούν μετασχηματισμούς Fourier(FT-IR). Η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη κατηγορία αναλυτών μαζών σήμερα είναι οι αναλυτές που χρησιμοποιούν τετράπολα(quadrupoles-q), ειδικά σε σύζευξη με διατάξεις HPLC και GC. Ένας αναλυτής μαζών με γραμμικό τετράπολο αποτελείται από τέσσερα ραβδοειδή ηλεκτρόδια, κυλινδρικού ή υπερβολικού σχήματος, τοποθετημένα σε τετραγωνική διάταξη. Τα ζεύγη των αντιδιαμετρικώς τοποθετημένων ράβδων-ηλεκτροδίων διαρρέονται από ρεύμα ίδιου δυναμικού, που αποτελείται από μια συνιστώσα συνεχούς και μια εναλλασσομένου ρεύματος. Εικ.12 Αρχή λειτουργίας ανιχνευτή τύπου Quadrupole Όταν ένα ιόν εισάγεται εντός του τετραπόλου, μια ελκτική δύναμη εφαρμόζεται σε αυτό από μια από τις ράβδους, της οποίας το φορτίο είναι αντίθετο του φορτίου του ιόντος. Εάν η εφαρμοζόμενη τάση στις ράβδους είναι περιοδική και επίσης το πρόσημο της αλλάζει με την πάροδο του χρόνου, η έλξη και η απώθηση του ιόντος από κάθε ράβδο μεταβάλλεται με τον 31

33 χρόνο. Εάν η εφαρμοζόμενη τάση συνίσταται από μια συνιστώσα εναλλασσόμενου ρεύματος τάσης U και μια ραδιοσυχνότητα RF με τάση V και συχνότητα ω, το ολικό δυναμικό Φ0 δίδεται από την σχέση: Φ0 = U + Vcosωt Και οι εξισώσεις κίνησης των σωματιδίων εντός του πεδίου αυτού είναι: d 2 x + e dt 2 mr2 (U + Vcosωt)x = 0 0 d 2 y + e dt 2 mr2 (U + Vcosωt)y = 0 0 Στην περίπτωση ενός ανομοιογενούς πεδίου όπως ένα τετράπολο υπάρχουν περιοχές στις οποίες το ηλεκτρικό πεδίο ουσιαστικά μηδενίζεται, καθιστώντας έτσι πιθανό ένα ιόν να κινηθεί κατά μήκος των ράβδων του τετραπόλου (με μικρές μόνο αποκλίσεις στους κάθετους της τροχιάς του άξονες) χωρίς να συγκρουστεί με τις ράβδους. Σε τέτοιες συνθήκες οι εξισώσεις κίνησης μετασχηματίζονται σε διαφορικές εξισώσεις Mathieu: d 2 x dτ2 + (ax + 2qxcos2τ)x = 0 d 2 x dτ2 + (ay + 2qycos2τ)y = 0 4eU Όπου ax = -ay =, mr 2 0 ω 2 qx = -qy = 2eV mr 0 2 ω 2, τ = ωt 2 Για δεδομένες τιμές U,V και ω η κίνηση ενός ιόντος συγκεκριμένου m/z μπορεί να είναι αρκετά σταθερή ώστε να επιτρέπει στο ιόν να διέλθει διαμέσου του τετραπόλου χωρίς να προσκρούσει στις ράβδους. Για να συμβεί αυτό πρέπει η μέγιστη ταλάντωση κατά την διάρκεια της διαδρομής του να μην υπερβαίνει το διπλάσιο της απόστασης μεταξύ του νοητού κέντρου του τετραπόλου(σημείο που ισαπέχει των ράβδων) και των ράβδων-ηλεκτροδίων. Η 32

34 σταθερότητα της τροχιάς ενός συγκεκριμένου ιόντος καθορίζεται από την ισχύ της τάσης RF (V) και του λόγου U/V. Συνεπώς, ρυθμίζοντας κατάλληλα τις τιμές U και V επιτρέπεται σε ιόντα συγκεκριμένου λόγου m/z να διέλθουν διαμέσω του τετραπόλου και να φθάσουν στον ανιχνευτή, αποκλείοντας τα ιόντα με μη επιθυμητά m/z, τα οποία οδηγούνται σε πρόσκρουση με τις φορτισμένες ράβδους.[3] Οι συνήθεις τετραπολικοί αναλυτές έχουν ράβδους διαμέτρου mm και μήκους cm. Η ραδιοσυχνότητα που χρησιμοποιείται είναι της τάξης των 1-4 MHz και τα δυναμικά DC και RF της τάξης των V. Τα ιόντα τα οποία διαθέτουν κινητική ενέργεια 10 ev υφίστανται περίπου 100 ταλαντώσεις πριν εξέλθουν του τετραπόλου.[3] Τα πλεονεκτήματα των αναλυτών με τετράπολα είναι τα ακόλουθα: a) είναι ελαφροί, μικροί σε μέγεθος και σχετικά οικονομικοί, b) απαιτούν σχετικά μικρό δυναμικό επιτάχυνσης των ιόντων, c) διαθέτουν καλή απόδοση μετάδοσης σήματος, που οδηγεί σε εξαιρετική ευαισθησία του αναλυτή, d) επιτρέπουν υψηλές ταχύτητες σάρωσης εφόσον η σάρωση εξαρτάται αποκλειστικά από την εναλλαγή ηλεκτρικών δυναμικών, e) είναι ιδιαίτερα σταθεροί, επιτυγχάνοντας καλή επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων, f) μπορούν να συνδεθούν εύκολα εν σειρά με διατάξεις GC και LC g) η δυνατότητα των ανιχνευτών του τύπου αυτού να χρησιμοποιηθούν και σε συζευγμένη ανάλυση μαζών(tandem MS).[39] Oι αναλυτές χρόνου πτήσης (TOF-Time Of Flight) είναι από τους παλαιότερους τύπους αναλυτών μαζών(μέσα δεκαετίας 1950). Η αρχή λειτουργιάς τους είναι σχετικά απλή: ιόντα διαφορετικού λόγου m/z διασκορπίζονται με τη πάροδο του χρόνου κατά την πτήση τους κατά μήκος μιας ελεύθερης πεδίου διαδρομής γνωστού μήκους. Με την προϋπόθεση ότι τα ιόντα ξεκινούν το ταξίδι τους την ίδια χρονική στιγμή(ή τουλάχιστον μεταξύ της εκκίνησης καθενός 33

35 εξ αυτών παρεμβάλλεται εξαιρετικά μικρό χρονικό διάστημα), τα ελαφρύτερα ιόντα θα φθάσουν νωρίτερα στον ανιχνευτή απ ότι τα βαρύτερα. Για να επιτευχθεί η ταυτόχρονη εκκίνηση τα ιόντα πρέπει να παράγονται από παλμική πηγή ιόντων, κάτι που μπορεί να επιτευχθεί είτε με κβαντοποίηση(δημιουργία «πακέτων») ιόντων προερχομένων από συνεχή πηγή, είτε με την χρησιμοποίηση αληθούς παλμικής μεθόδου ιονισμού(π.χ. MALDI, σε σύζευξη με την οποία βρίσκονται οι περισσότεροι αναλυτές TOF). Οι γραμμικοί αναλυτές TOF τροφοδοτούνται από ιόντα τα οποία παράγονται από λεπτό στρώμα δείγματος το οποίο βομβαρδίζεται από ένα παλμικό laser(τεχνικές MALDI και LDI). Τα παραγόμενα ιόντα επιταχύνονται μέσω της εφαρμογής διαφοράς δυναμικού V μεταξύ της πηγής και ενός γειωμένου ηλεκτροδίου. Όταν αφήνουν την περιοχή επιτάχυνσης, τα ιόντα πρέπει να έχουν την ίδια κινητική ενέργεια. Εν συνεχεία παρασύρονται κατά μήκος μιας διαδρομής ελεύθερης πεδίου (περίπου 1-2m) και τέλος προσκρούουν στον ανιχνευτή, σε διαφορετικούς χρόνους ανάλογα με την μάζα τους. Εικ.13 Αρχή λειτουργίας ανιχνευτή Time-Of-Flight Ανεξαρτήτως της μεθόδου ιονισμού, το ολικό ηλεκτρικό φορτίο q ενός ιόντος μάζας m ισούται με τον ακέραιο αριθμό των μοναδιαίων φορτίων του e, άρα q=ez. Η πρόσληψη ενέργειας Eel κατά την μετακίνηση του φορτίου διαμέσου διαφοράς δυναμικού V είναι Eel=qV=ezV Επειδή η πρότερη δυναμική ενέργεια ενός φορτισμένου σωματιδίου εντός ηλεκτρικού πεδίου μετατρέπεται σε κινητική, ισχύει ότι: 34

36 Eel=ezV=1/2mv 2 =Ekin Προϋποθέτοντας την πρότερη ακινησία του ιόντος, αναδιατάσσοντας την ανωτέρω εξίσωση προκύπτει ότι: v= 2ezV m Με δεδομένο ότι t=s/v, αντικαθιστώντας το v στην ανωτέρω εξίσωση προκύπτει ότι: m z =2eVt2 s 2 και εφόσον τα V και s είναι σταθερά, προκύπτει ότι ο λόγος m/z είναι ανάλογος μόνο με τον χρόνο πτήσης των ιόντων εντός του ανιχνευτή. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα των αναλυτών TOF είναι: a) απεριόριστο εύρος m/z των διαχωριζομένων ιόντων(εκ της αρχής λειτουργίας των), b) μεγάλη ταχύτητα(από κάθε συμβάν ιονισμού, π.χ. μια μόνο ακτίνα laser σε ιονισμό τύπου MALDI, λαμβάνεται ένα πλήρες φάσμα μαζών εντός δεκάτων του msec), c) η πολύ υψηλή απόδοση της μετάδοσης σήματος, οδηγώντας σε εξαιρετική ευαισθησία του αναλυτή, d) η ευκολία κατασκευής και συνεπακόλουθα και το σχετικά χαμηλό κόστος του ανιχνευτή e) η δυνατότητα των νεότερων ανιχνευτών του τύπου αυτού να χρησιμοποιηθούν και σε συζευγμένη ανάλυση μαζών(tandem MS).[3] Μια ιδιαίτερα σημαντική κατηγορία αναλυτών μαζών αποτελούν οι τετραπολικές παγίδες ιόντων(qit-quadrupole Ion Trap), οι οποίες εφευρεθήκαν το 1953, χρειάστηκε όμως να φθάσουμε στα μέσα της δεκαετίας του 1980 ώστε να προσεγγισθεί το πλήρες αναλυτικό δυναμικό των συσκευών αυτών. 35

37 Οι παγίδες ιόντων αποτελούνται από δυο υπερβολικά ηλεκτρόδια που χρησιμεύουν ως καλύμματα και ένα δακτυλιοειδές ηλεκτρόδιο. Τα ηλεκτρόδια-καλύμματα είναι ηλεκτρικά διασυνδεδεμένα και τα δυναμικά DC και RF εφαρμόζονται μεταξύ αυτών και του δακτυλιοειδούς ηλεκτροδίου. Η αρχή λειτουργίας των QIT βασίζεται στη δημιουργία σταθερών τροχιών για ιόντα συγκεκριμένου λόγου m/z ή εύρους λόγου m/z, με την ταυτόχρονη απομάκρυνση ανεπιθύμητων ιόντων, μέσω πρόσκρουσης αυτών με τα τοιχώματα ή με την αξονική αποβολή τους από την παγίδα εξαιτίας των ασταθών τροχιών τους. Εικ.14 Αρχή λειτουργίας ανιχνευτή Ion Trap Σε μια QIT το ηλεκτρικό πεδίο θεωρείται ως τρισδιάστατο. Η εξίσωση του πεδίου στο οποίο εφαρμόζεται δυναμικό Φ0 μπορεί να περιγράφει σε κυλινδρικές συντεταγμένες από την σχέση: Φx,y,z= Φ0 2r 0 2 = (r 2 cos 2 θ+r 2 sin 2 θ-2z 2 ) Επιλύοντας τις διαφορικές εξισώσεις τύπου Mathieu που προκύπτουν από την ανωτέρω εξίσωση καταλήγουμε στις παραμέτρους βr και βz, οι οποίες σχετίζονται με το εφαρμοζόμενο δυναμικό, την βασική συχνότητα RF της παγίδας(1mhz) και τον λόγο m/z. Διατηρώντας σταθερό το δυναμικό και την συχνότητα RF, τα ιόντα συγκεκριμένου m/z παγιδεύονται εντός της QIT όταν ισχύει 0<βr,βz<1. 36

38 Η επιλογή των επιθυμητών m/z (και φυσικά και η απόρριψη των μη επιθυμητών) γίνεται μέσω της μεταβολής της ραδιοσυχνότητας RF(Mass Selective Instability Mode) ή μέσω της εφαρμογής δευτέρου πεδίου RF αντισταθμιστικού ως προς το πρωταρχικό πεδίο(resonant Ejection). Σε παλαιοτέρα συστήματα QIT το προς ανάλυση αέριο εισαγόταν εντός της παγίδας και εκεί ιονιζόταν(συνήθως με την χρήση ΕΙ), ενώ γα την επιλογή των m/z χρησιμοποιούνταν το Mass Selective Instability Mode. Σε πιο σύγχρονα συστήματα ο ιονισμός γίνεται εκτός της παγίδας(είτε με την χρήση τεχνικών ΕΙ και CI, οι οποίες είναι φθηνές και διευκολύνουν τις αναλύσεις MS/MS, είτε με την χρήση API, η οποία διαθέτει καλύτερη αναλυτική ικανότητα και εύρος μετρουμένων m/z) και τα ιόντα εισάγονται εν συνεχεία εντός της QIT, ενώ προτιμάται η Resonant Ejection. Τα πλεονεκτήματα των διατάξεων Ion Trap είναι τα ακόλουθα: a) το σχετικά μικρό τους μέγεθος(compact analyzers), b) η μεγάλη ευαισθησία τους, c) η δυνατότητα των ανιχνευτών του τύπου αυτού να χρησιμοποιηθούν εύκολα σε συζευγμένη ανάλυση μαζών(tandem MS), d) η δυνατότητα εν σειρά σύνδεσης με συστήματα LC και GC.[3] Οι αναλυτές μαγνητικού τομέα(magnetic Sector Analyzers) είναι οι πρώτες συσκευές που χρησιμοποιήθηκαν στην φασματοσκοπία μαζών κατά την δεκαετία του Είναι ιδιαίτερα ογκώδεις συσκευές και τα τελευταία χρόνια η χρήση τους περιορίζεται καθώς αντικαθίστανται από αναλυτές TOF και FT-IR. Η πιο σύγχρονη μορφή αναλυτή μαγνητικού τομέα είναι ο ηλεκτροστατικός αναλυτής(electrostatic analyzer-esa), ο οποίος χρησιμοποιεί ένα ακτινικό ηλεκτρικό πεδίο μεταξύ δυο αντίθετα φορτισμένων πλακών. Η αρχή λειτουργίας του βασίζεται στο ότι η ακτίνα της τροχιάς ενός φορτισμένου σωματιδίου που κινείται εντός ηλεκτρομαγνητικού πεδίου εξαρτάται από τον λόγο m/z του σωματιδίου. Συγκεκριμένα ισχύει ότι: 37

39 r = mv2 eze όπου r η ακτίνα της τροχιάς του σωματιδίου, m η μάζα του, z το φορτίο του, Ε η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου και v η ταχύτητα του. Προσαρμόζοντας λοιπόν την ισχύ του πεδίου μπορούμε να επιτύχουμε την επιλογή ιόντων συγκεκριμένων m/z και αποβολή των υπολοίπων, τα οποία θα λάβουν μη επιθυμητές τροχιές.[3] Η πλέον τεχνολογικά εξελιγμένη κατηγορία αναλυτών μαζών είναι τα κυκλοτρόνια συντονισμού ιόντων που χρησιμοποιούν μετασχηματισμούς Fourier(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-FT-ICR). Οι συσκευές FT-ICR είναι εξαιρετικά ακριβές, αλλά το μεγάλο τους κόστος αντισταθμίζεται από άλλα πλεονεκτήματα τους, όπως η ασύγκριτη αναλυτική τους ικανότητα και η ακρίβεια στους προσδιορισμούς των ατομικών μαζών. Ο πρώτος ο οποίος κατασκεύασε μια διάταξη κυκλότρου συντονισμού ιόντων(icr), ήταν ο J. A. Hipple και οι συνεργάτες του. Η κατασκευή της διάταξης αυτής επετεύχθη θέτοντας τα αναλυόμενα ιόντα ταυτόχρονα εντός ηλεκτρικού πεδίου συγκεκριμένης ραδιοσυχνότητας και ενός ομοιόμορφου μαγνητικού πεδίου, με αποτέλεσμα τα ιόντα να αναγκάζονται να ακολουθούν σπιράλ διαδρομή. Σαρώνοντας τις τροχιές των ιόντων, κατέστη δυνατή η διαδοχική ανίχνευση τους. Εικ.15 Αρχή λειτουργίας ανιχνευτή FT-ICR 38

40 Η λειτουργία τους βασίζεται στο γεγονός ότι ένα ιόν ταχύτητας v όταν εισέρχεται εντός ομογενούς μαγνητικού πεδίου B κάθετα στην διεύθυνση του, θα κινηθεί κυκλικά υπό την επίδραση της δύναμης Lorenz, σε τροχιά ακτίνας r, η οποία δίδεται από την εξίσωση: r = mv qb Αντικαθιστώντας στην ανωτέρω σχέση το v με v=rω, όπου ω η γωνιακή ταχύτητα και επειδή q=ez προκύπτει ότι: ω = ezb m Συνεπώς, η γωνιακή ταχύτητα ω είναι ανεξάρτητη από την αρχική ταχύτητα του ιόντος και εξαρτάται μόνο από τον λόγο m/z και το μαγνητικό πεδίο Β. Εφαρμόζοντας ένα εγκάρσιο ηλεκτρικό πεδίο εναλλασσόμενο στην συχνότητα του κυκλότρου fc (ω=2πfc), τα ιόντα επιταχύνονται. Ένα τέτοιο πεδίο μπορεί να εφαρμοσθεί από ένα ζεύγος ηλεκτροδίων RF τοποθετημένων στην αντίθετη πλευρά της τροχιάς. Όσο τα ιόντα επιταχύνονται η ακτίνα της τροχιάς τους αυξάνει, με αποτέλεσμα το ιόν να διαγράφει σπιράλ τροχιά. Όσο ελαφρύτερο είναι το ιόν, τόσο λιγότερους κύκλους χρειάζεται για να φτάσει μια τροχιά συγκεκριμένης ακτίνας. Η αρχή λειτουργίας των πρώτων συσκευών ICR βασιζόταν στην σάρωση ενεργειακών τιμών: συγκεκριμένα η τιμή m/z πρόεκυπτε από τον αριθμό των ημικυκλίων που διέγραφε το ιόν μέχρι την σύγκρουση του με την πλάκα του ανιχνευτή. Οι συσκευές ICR παρουσίαζαν ορισμένα μειονεκτήματα όπως το ότι η ακρίβεια των τιμών μάζας και η αναλυτική ικανότητα περιοριζόταν σε 1/Νc(όπου Νc = αριθμός διανυομένων ημικυκλίων) καθώς και το ότι το ηλεκτρικό σήμα για την ανίχνευση των ιόντων δεν επιδέχεται καμία ενίσχυση όπως σε άλλα είδη αναλυτών που χρησιμοποιούν ανιχνευτές πολλών ειδών, καθώς προκύπτει αποκλειστικά από εξουδετέρωση των ιόντων.[3] Τα μειονεκτήματα αυτά ξεπεράστηκαν με την χρήση συσκευών FT-ICR, οι οποίες μετρούν εντάσεις ρευμάτων που δημιουργούνται στις ανιχνευτικές πλάκες από τα κατ επανάληψιν προσπίπτοντα σε αυτές φορτία κατά τη διάρκεια των κυκλικών τους κινήσεων. H παροδική 39

41 ελεύθερη επαγόμενη απόσβεση (Free Induction Decay-FID) καταγράφεται και εν συνεχεία μετατρέπεται από το πεδίο του χρόνου στο πεδίο της συχνότητας με την χρήση μετασχηματισμών Fourier. Έτσι τα σύνθετα FID που προκύπτουν από την υπέρθεση πολλών μεμονωμένων συχνοτήτων αποσυσσωματώνονται, για να αποδώσουν τις μοναδιαίες συνιστώσες συχνότητας του σήματος και τις αντίστοιχες εντάσεις τους. Τέλος, με την βοήθεια της εξίσωσης ω = ezb/m, οι συχνότητες αυτές μετατρέπονται σε τιμές m/z, με τις εντάσεις τους να αντιστοιχούν στην αφθονία των αντιστοιχών ιόντων στο δείγμα.[3] Τα πλεονεκτήματα των αναλυτών μαζών του τύπου αυτού είναι: a) η εξαιρετική ακρίβεια μετρήσεων, b) η πολύ μεγάλη αναλυτική ικανότητα, c) η δυνατότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης πολλών ιόντων Ανιχνευτές Διάφορα είδη ανιχνευτών έχουν χρησιμοποιηθεί κατά την διάρκεια των ετών για την ανίχνευση των ιόντων που προκύπτουν από τους αναλυτές μαζών. Οι πρώτες συσκευές MS χρησιμοποιούσαν φωτογραφικές πλάκες και αργότερα κύπελλα Faraday για να ανιχνεύσουν τα παραγόμενα ιόντα. Τα κύπελλα Faraday περιλαμβάνουν μια δύνοδο(dynode) η οποία εκπέμπει ηλεκτρόνια όταν ένα ιόν προσπίπτει σε αυτή. Τα ηλεκτρόνια αυτά επάγουν την παραγωγή ρεύματος και εν συνεχεία το ρεύμα αυτό ενισχύεται και καταγράφεται. Οι διατάξεις αυτές παρότι φθηνές και απλές στην κατασκευή παρουσίαζαν σημαντικά μειονεκτήματα όπως η αργή απόκριση και η μικρή ευαισθησία και για τον λόγο αυτό έχουν αντικατασταθεί σήμερα από περισσότερο σύγχρονες ανιχνευτικές διατάξεις. 40

42 Εικ.16 Αρχή λειτουργίας κυπέλλου Faraday Οι διατάξεις αυτές είναι: a) οι δευτερεύοντες ηλεκτροπολλαπλασιαστές(secondary electron multiplier-sem), b) οι σωληνοειδείς ηλεκτροπολλαπλασιαστές (channel electron multipliers -CEM), c) τα πολυσωληνοειδή πλαίσια (multichannel plates-mcp), d) οι ανιχνευτές μετα-επιτάχυνσης(post acceleration detectors) και οι δύνοδοι μετατροπής(conversion dynodes), e) οι ανιχνευτές εστιακού επιπέδου(focal plane detectors-fpd) και f) οι μετρητές φωτονίων πολλαπλών εικονοστοιχείων(multi-pixel photon counter- MPPC). Οι ανιχνευτές SEM και CEM μοιράζονται την ίδια αρχή λειτουργίας, η οποία κατά βάση αποτελεί μια επέκταση της αρχής λειτουργίας του κυπέλλου Faraday. Στην περίπτωση των SEM χρησιμοποιούνται διαδοχικές δύνοδοι(συνήθως 15-18), κατασκευασμένες από οξείδια μετάλλων, τα οποία έχουν υψηλή ικανότητα δευτερεύουσας εκπομπής ηλεκτρονίων και οι οποίες διαθέτουν αύξοντα δυναμικά, καταλήγοντας σε διαδοχικές αυξήσεις των εκπεμπόμενων ηλεκτρονίων και εν τέλει ενίσχυση του παραγομένου σήματος[40]. Στους ανιχνευτές CEM τον ρόλο των δυνόδων παίζουν τα τοιχώματα του σωλήνα μέσω στον οποίο κινούνται τα ηλεκτρόνια. Η διαφορά δυναμικού εντός του ανιχνευτή ελαττώνεται βαθμιαία από το σημείο εισόδου προς την έξοδο των ιόντων. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της κατασκευής του σωλήνα από ύαλο περιέχουσα μεγάλη ποσότητα μολύβδου και της επικαλυψης του με οξείδιο του μολύβδου. Τα εκπεμπόμενα ηλεκτρόνια προέρχονται από την τελική επικάλυψη του σωλήνα(διοξείδιο πυριτίου). Η κυρτότητα του σωλήνα (σχήμα «δίκη κεράτου») λειτούργει ως οδηγός των παραγομένων ηλεκτρονίων και βοήθα στην καταστολή 41

43 του ηλεκτρικού θορύβου μειώνοντας την απόσταση που απαιτείται ώστε να εξέλθουν του σωλήνα τα e - [41]. Οι ανιχνευτές αυτοί είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι στην φασματοσκοπία MS, ειδικά όταν είναι επιθυμητή η ανίχνευση θετικών και αρνητικών ιόντων από την ίδια διάταξη. Εικ.17 Αρχή λειτουργίας ανιχνευτών SEM και CEM Οι ανιχνευτές MCP αποτελούν ουσιαστικά μια μικρογραφία των CEM(μέγεθος λίγων μικρομέτρων). Εκατομμύρια τέτοιοι κυρτοί μικροσωλήνες τοποθετούνται μαζί σε κοινό πλαίσιο δημιουργώντας μια συστοιχία μικροσκοπικών CEMs. Για να αυξηθεί η απόκριση των ανιχνευτικών αυτών διατάξεων συχνά τοποθετούνται δυο ή και τρεις συστοιχίες MCPs παράλληλα μεταξύ τους, με αποτέλεσμα να επιτυγχάνονται ενισχύσεις σήματος ανάλογες με αυτές των CEMs.[42] Πολλές φορές ιόντα τα οποία έχουν μεγάλη μάζα φθάνουν στον ανιχνευτή με μικρότερες ταχύτητες εν σχέσει με ελαφρύτερα ιόντα. Το γεγονός αυτό έχει αρνητική επίδραση στην ανιχνευσιμότητα των ιόντων αυτών. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιούνται μετα-επιταχυντικοί ανιχνευτές, στους οποίους εφαρμόζεται τάση kv στα ιόντα πριν αυτά προσπέσουν στην πρώτη δύνοδο, ώστε να επιταχυνθούν όλα στην ίδια ταχύτητα και να συμπεριφερθούν ομοιόμορφα εντός του ανιχνευτή. 42

44 Επίσης, σε ορισμένες περιπτώσεις(ειδικά όταν χρησιμοποιούνται τετράπολα), κάποια ιόντα που κινούνται εξαιρετικά αργά μπορεί να σταματήσουν εντελώς πριν κατορθώσουν να έλθουν σε επαφή με την πρώτη δύνοδο. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιούνται δύνοδοι μετατροπής, οι οποίοι τοποθετούνται εμπρόσθεν των ανιχνευτών SEM και CEM. Οι δύνοδοι αυτοί είναι ηλεκτρόδια υψηλής τάσης(5-20kv) και πολικότητας τέτοιας ώστε να έλκουν τα ιόντα που εξέρχονται από τον αναλυτή μαζών. Η πρόσκρουση των ιόντων σε αυτά δημιουργεί ηλεκτρόνια τα οποία ανιχνεύονται από τον κυρίως ανιχνευτή. Οι δύνοδοι μετατροπής χρησιμεύουν επίσης και για την μέτα-επιτάχυνση βραδέων ιόντων όπως περιγράφεται στην προηγούμενη παράγραφο.[41] Ένα άλλο είδος ανιχνευτή που ονομάζεται ανιχνευτής εστιακού επιπέδου(fpd) και συνήθως συζευγνύται με αναλυτές μαζών τύπου μαγνητικού τομέα, διαθέτει την ενδιαφέρουσα ιδιότητα να μπορεί να ανιχνεύει όχι μόνο μια τιμή m/z κάθε δεδομένη χρονική στιγμή, αλλά ένα μικρό εύρος τιμών m/z(2-5% της κεντρικής τιμής μάζας). Η λειτουργία τους βασίζεται στην μετατροπή των προσπιπτόντων ιόντων πάνω στην επιφάνεια μιας πλάκας Chevron σε ηλεκτρόνια, τα οποία μετατρέπονται σε φωτόνια από μια φωσφορίζουσα επιφάνεια. Έπειτα τα φωτόνια μεταφέρονται μέσω μιας οπτικής ίνας σε έναν ανιχνευτή CCD.[43, 44] Μια από τις πλέον πρόσφατες διατάξεις για την ανίχνευση ιόντων στην φασματοσκοπία μαζών είναι η MPPC(multi-pixel photon counter). Η διάταξη αυτή αποτελεί έναν νέο τύπο ημιαγωγικού αισθητήρα φωτονίων. Χαρακτηρίζεται από μεγάλη διακριτική ικανότητα, μικρό μέγεθος και καλή σχέση κόστους-απόδοσης και αναμένεται να αντικαταστήσει στο μέλλον τους ακριβούς και ογκωδέστερους ανιχνευτές των ανωτέρω κατηγοριών. Αποτελείται από μια συστοιχία εικονοστοιχίων-φωτοδιόδων, τα οποία ενεργοποιούνται από την πρόσπτωση φωτονίων. Η πρόσπτωση αυτή επάγει την παραγωγή ηλεκτρονίων τα οποία αλληλεπιδρώντας με το υπόστρωμα ενός εικονοστοιχείου, αλλάζουν την ενεργειακή του κατάσταση, ενεργοποιώντας το. Το άθροισμα των ενεργοποιημένων εικονοστοιχείων δίνει και το σύνολο των προσπιπτόντων ιόντων. [45] 43

45 3.Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης 3.1 Γενικά περί χρωματογραφίας Η χρωματογραφική ανάλυση, γνώστη και ως χρωματογραφία, περιλαμβάνει σειρά τεχνικών φυσικού διαχωρισμού και προσδιορισμού των συστατικών μείγματος ανόργανων ή οργανικών ουσιών. Ο διαχωρισμός αυτός επιτυγχάνεται μέσω κατανομής των συστατικών του μίγματος μεταξύ δυο φάσεων, μιας στατικής και μιας κινητής, οι οποίες βρίσκονται στην χρωματογραφική στήλη. Ο διαχωρισμός βασίζεται στις διαφορές που υπάρχουν σε ορισμένες ιδιότητες μεταξύ των συστατικών ενός μίγματος, όπως το σημείο ζέσεως, η πολικότητα, τα ηλεκτρικά φορτία και το μέγεθος των μορίων. Οι διαφορές αυτές διαφοροποιούν τη σχετική φυσικοχημική συγγένεια κάθε συστατικού προς τις δυο φάσεις της χρωματογραφικής στήλης. Έτσι, η κινητή φάση, διερχόμενη μέσα από την στατική, προκαλεί διαφορετική μετατόπιση των συστατικών του μίγματος εντός της στατικής φάσης. Τα συστατικά με τον τρόπο αυτό διαχωρίζονται μεταξύ τους και συνήθως εξέρχονται της στήλης σε διαφορετικές χρονικές στιγμές.[46] Η κινητή φάση(υγρό ή αέριο) ονομάζεται υγρό(ή αέριο) εκλούσεως(eluent), ενώ το διάλυμα, το οποίο εξέρχεται από την στήλη, έκλουσμα(eluate). Η διαδικασία αυτή, δηλαδή η διαβίβαση υγρού ή αερίου εκλούσεως μέσα από την χρωματογραφική στήλη, ονομάζεται έκλουση(και αν αυτή γίνεται με σταθερή παροχή τότε μιλάμε για γραμμική έκλουση). Στο τέλος της στήλης τοποθετείται συνήθως ένας ανιχνευτής, που παρακολουθεί μια αναλυτική ιδιότητα του εκλούσματος και παράγει ένα σήμα, κάθε φορά που εκλούεται ένα συστατικό(χρωματογραφική κορυφή). Το διάγραμμα αυτού του σήματος ως συνάρτηση του όγκου του υγρού(ή αερίου) εκλούσεως ονομάζεται χρωματογράφημα. Στην περίπτωση γραμμικής εκλούσεως αντί του όγκου μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο χρόνος. Τα χρωματογραφήματα εκλούσεως παρέχουν πληροφορίες χρήσιμες για την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση, διότι ο χρόνος που χρειάζεται ένα συστατικό για να εκλουσθεί είναι χαρακτηριστικός για το σύστημα αυτό, ενώ το ύψος ή η ολοκληρωμένη επιφάνεια της κορυφής του σήματος μπορεί να συσχετισθεί με την συγκέντρωση του συστατικού. 44

46 3.2 Ιστορική αναδρομή H ανακάλυψη της χρωματογραφίας αποδίδεται στο Ρώσο βοτανολόγο Μ. Tswett, ο οποίος το 1906 δημοσίευσε την εργασία του με θέμα τον διαχωρισµό φυτικών χρωστικών, µε κινητή φάση πετρελαϊκό αιθέρα και πολική στερεή φάση, εντός κατακόρυφης υάλινης στήλης, ορίζοντας παράλληλα τη χρωματογραφία ως εξής: η χρωματογραφία είναι µία μέθοδος, στην οποία τα συστατικά ενός μίγματος διαχωρίζονται σε µία στήλη προσρόφησης, που είναι μέρος ενός συστήματος ροής.[47] Το 1941 οι A. Martin και R. Synge στην προσπάθειά τους να διαχωρίσουν αμινοξέα, εισάγουν την ιδέα της υγρής-υγρής χρωµατογραφίας, δηλαδή υγρή κινητή φάση σε συνδυασμό µε υγρή στατική φάση επί στερεού υποστρώματος, η οποία βασίζεται στο μηχανισμό της κατανομής και παράλληλα εισάγουν την έννοια των θεωρητικών πλακών. Η θεωρία των θεωρητικών πλακών οδηγεί το Van Deemter το 1956 στην περιγραφή των θερµοδυναµικών και κινητικών διαδικασιών κατά τη διάρκεια ενός χρωµατογραφικού διαχωρισμού και στην εξαγωγή εξισώσεων που σχετίζουν την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης µε τον αριθμό των θεωρητικών πλακών.[48, 49] Ο όρος HPLC εισήχθη από τον καθηγητή Csaba Horvath το 1970 και αρχικά η μέθοδος αναφερόταν σαν Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης. Η υψηλή πίεση χρησιμοποιήθηκε για τη επίτευξη μεγαλύτερης ροής στις στήλες υγρής χρωματογραφίας με στόχο να μειωθεί ο χρόνος της διαδικασίας διαχωρισμού. Αρχικά, οι αντλίες είχαν ικανότητα ανάπτυξης πιέσεων μόνον μέχρι 500 psi (35 bar). Η αλματώδης όμως πρόοδος της τεχνολογίας κατά την δεκαετία του 1970 έφερε στο προσκήνιο νέα όργανα HPLC, τα οποία μπορούσαν να αναπτύξουν πιέσεις έως psi (400 bar), και είχαν ενσωματωμένα βελτιωμένα συστήματα εισαγωγής, ανιχνευτές και στήλες. Η HPLC άρχισε να κερδίζει έδαφος από τα μέσα έως τα τέλη της δεκαετίας του Με την συνεχή πρόοδο στην απόδοση κατά τη διάρκεια αυτών των ετών (μικρότερα σωματίδια, ακόμη υψηλότερη πίεση), ο όρος HPLC παρέμεινε ο ίδιος αλλά το όνομα άλλαξε σε Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography).[50] 45

47 3.3 Ταξινόμηση χρωματογραφικών μεθόδων Η βασική ταξινόμηση των χρωματογραφικών τεχνικών γίνεται με βάση την φύση της στατικής και της κινητής φάσης(υπάρχουν βέβαια και άλλα είδη ταξινομήσεων τα οποία βασίζονται στον μηχανισμό διαχωρισμού, στον τρόπο εισαγωγής και κινήσεως του δείγματος και στην φυσική μορφή της στατικής φάσεως). Διακρίνουμε έτσι την υγρή(lc) και την αέριο χρωματογραφία(gc), ανάλογα με το αν η κινητή φάση είναι υγρή ή αέρια. Οι δυο αυτές τάξεις υποδιαιρούνται περαιτέρω ανάλογα με την φύση της στατικής φάσης, η οποία μπορεί να είναι στερεή ή υγρή επάνω σε στερεό αδρανή φορέα. Προκύπτουν έτσι η υγρή-στερεή χρωματογραφία(lsc), η υγρή-υγρή χρωματογραφία(llc), η αέρια-στερεή χρωματογραφία(gsc) και η αέρια-υγρή χρωματογραφία(glc).[46] Στην υγρή χρωματογραφία στήλης(ή απλώς υγρή χρωματογραφία-lc), η στατική φάση είναι στερεό πορώδες υλικό ή υγρό καθηλωμένο σε σταθερό υπόστρωμα, το οποίο βρίσκεται συσκευασμένο σε στήλη, ενώ η κινητή φάση είναι υγρό(συνήθως ύδωρ, μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο). Η διαβίβαση της υγρής κινητής φάσης μέσα από την στατική φάση επιτυγχάνεται λόγω βαρύτητας με την χρησιμοποίηση αντλιών χαμηλής πιέσεως, όταν η στατική φάση αποτελείται από σχετικά μεγάλης διαμέτρου σωματίδια που παρουσιάζουν μικρή αντίσταση(κλασσική υγρή χρωματογραφία στήλης), είτε με την χρησιμοποίηση αντλιών υψηλής πιέσεως, όταν η στατική φάση αποτελείται από πολύ μικρής διαμέτρου, και επομένως μεγάλης αντίστασης, σωματίδια υψηλής διαχωριστικής αποδόσεως(υγρή χρωματογραφία υψηλής αποδόσεως, High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Η υγρή χρωματογραφία είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τον διαχωρισμό και την ανάλυση μιγμάτων μοριακών ή ιοντικών ενώσεων με χαμηλές τάσεις ατμών, καθώς και θερμικά ασταθών ενώσεων, οι οποίες δεν μπορούν να εξαερωθούν χωρίς να διασπαστούν και επομένως η αέριος χρωματογραφία δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση τους. Η κλασσική υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιείται κυρίως για διαχωρισμούς, ενώ η HPLC είναι η σήμερα η περισσότερο χρησιμοποιούμενη χρωματογραφική τεχνική για την ποσοτική ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων. 46

48 3.4 Χρωματογραφικοί μηχανισμοί διαχωρισμού Οι χρωματογραφικοί μηχανισμοί διαχωρισμού, που λαμβάνουν χώρα στην υγρή χρωματογραφία στήλης και με βάση τους οποίους μπορούν να ταξινομηθούν τα διάφορα είδη υγρής χρωματογραφίας είναι: a. η προσρόφηση, b. η κατανομή, c. η ιονανταλλαγή, d. ο μοριακός αποκλεισμός και e. η συγγένεια.[46] Εικ.18 Βασικοί χρωματογραφικοί μηχανισμοί διαχωρισμού 47

49 Η χρωματογραφία προσρόφησης(adsorption chromatography) βασίζεται σε διαφορές στην πολικότητα μεταξύ των διαφορετικών διαχωριζομένων συστατικών. Όσο πιο πολικό είναι ένα μόριο, τόσο ισχυρότερα προσροφάται σε μια πολική στατική φάση. Ομοίως, όσο λιγότερο πολικό είναι ένα μόριο, τόσο ισχυρότερα προσροφάται από μια μη πολική στατική φάση. Κατά την διάρκεια της διαδικασίας έκλουσης, επισυμβαίνει ανταγωνισμός για τις θέσεις προσρόφησης της στατικής φάσης, μεταξύ των προς διαχωρισμό ουσιών και των μορίων της κινητής φάσης. Τα προς διαχωρισμό μόρια με μικρή πολικότητα παραμένουν αναλογικά περισσότερο χρόνο εντός της κινητής φάσης σε σχέση με τα μεγαλύτερης πολικότητας μόρια, τα οποία κατακρατούνται για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Ως αποτέλεσμα τα συστατικά του μίγματος εκλούονται κατά σειρά αυξανόμενης πολικότητας. Η επιλογή του υλικού της στατικής φάσης πρέπει να γίνεται με γνώμονα την σύσταση του προς ανάλυση μίγματος. Τα υλικά τα οποία χρησιμοποιούνται συχνότερα ως στατικές φάσεις είναι το τριοξείδιο το αργιλίου ή alumina(al2o3) και η πηκτή διοξειδίου του πυριτίου ή silica gel(sio2). Σπανιότερα χρησιμοποιούνται ενεργός άνθρακος, οξείδιο του μαγνησίου(mgo) και κυτταρίνη. H alumina είναι πολικό προσροφητικό υλικό και προτιμάται για διαχωρισμούς ουσιών, οι οποίες είναι ασθενώς πολικές, με τις πολικότερες εξ αυτών να κατακρατούνται ισχυρότερα από την alumina και επομένως να εκλούονται αργά από την στήλη. Επιπροσθέτως, η alumina είναι βασικό προσροφητικό υλικό, και επομένως κατακρατά ισχυρότερα όξινα συστατικά. Η πηκτή διοξειδίου του πυριτίου είναι λιγότερο πολική από την alumina και είναι όξινο προσροφητικό υπόστρωμα, συνεπώς κατακρατά ισχυρότερα βασικά συστατικά. Η επιλογή της κινητής φάσης είναι εξίσου σημαντική, καθώς η πολικότητα της πρέπει να επιλέγεται σε συνάρτηση με την στατική φάση. Γενικά, καλός διαχωρισμός επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας αρκετά πολικές στατικές φάσεις σε συνδυασμό με χαμηλής πολικότητας κινητές φάσεις όπως το εξάνιο. Επίσης, η χρωματογραφία προσρόφησης προτιμάται για την περίπτωση στην οποία θέλουμε να διαχωρίσουμε τα συστατικά ενός μίγματος στην βάση της χημικής τους τάξης(π.χ. εστέρες, οξέα, αλδεΰδες, κετόνες, ολεφίνες) και όχι για τον διαχωρισμό των μελών μιας ομόλογης σειράς(όπου και προτιμάται η χρωματογραφία κατανομής). 48

50 Στην χρωματογραφίας ιονανταλλαγής(ion-exchange chromatography) η στατική φάση αποτελείται από μια αδιάλυτη πορώδη ρητίνη, η οποία περιέχει φορτισμένες ομάδες συγκεκριμένου φορτίου(αρνητικού ή θετικού). Τα μόρια των προς ανάλυση ουσιών, τα οποία περιέχουν ομάδες με αντίθετο φορτίο σε σχέση με την ρητίνη, συγκρατούνται εξαιτίας της ιονικής αλληλεπίδρασης των φορτισμένων αυτών ομάδων. Ο ρυθμός έκλουσης των διαφόρων μορίων διαμέσου μιας τέτοιας στήλης εξαρτάται από τον αριθμό των αλληλεπιδρώντων ιονικών ομάδων κάθε μορίου και από την σχετική ένταση των ιονικών αλληλεπιδράσεων(καθορίζοντας έτσι και τον βαθμό συγγένειας μεταξύ στατικής φάσηςαναλυόμενων μορίων). Το υλικό το οποίο χρησιμοποιείται συχνότερα για την κατασκευή ιονανταλλακτικών ρητινών είναι ένα συνθετικό συμπολυμερές στυρενίου και διβινυλοβενζολίου, το οποίο παράγεται σε πολύ μικρούς κόκκους με διάμετρο λίγων μικρομέτρων. Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής έχει πολλές βιομηχανικές εφαρμογές όπως την απαλλαγή ύδατος από οργανικές προσμίξεις και τον καθαρισμό βιομηχανικών λυμάτων από βαρέα μέταλλα. Είναι όμως σχετικά ακριβή μέθοδος και μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για μόρια τα οποία είναι διαλυτά στο νερό και μπορούν να ιονισθούν. Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού(molecular exclusion chromatography) ή χρωματογραφία διαπερατότητας πηκτής(gel permeation chromatography) είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα προς ανάλυση μόρια διαχωρίζονται με βάση το μέγεθος ή το μοριακό τους βάρος. Η στατική φάση αποτελείται από μια πορώδη σταυροδιασυνδεδεμένη(cross-linked) γέλη. Οι πόροι της γέλης ποικίλλουν σε μέγεθος και σχήμα, έτσι ώστε τα μεγαλύτερα σε μέγεθος μόρια να τείνουν να μην συγκρατούνται από τους μικρότερους πόρους και να παρασύρονται ευκολότερα από την κινητή φάση. Τα μικρότερα μόρια διαχέονται εντός των πόρων της γέλης και επομένως καθυστερείται η διάβαση τους από το χρωματογραφικό σύστημα. Συνεπώς, τα συστατικά ενός μίγματος εκλούονται κατά σειρά ελαττούμενου μοριακού βάρους. Οι γέλες της στατικής φάσης μπορεί να είναι είτε υδρόφιλες (για διαχωρισμούς εντός υδατικών ή πολικών διαλυτών), είτε υδρόφοβες(για διαχωρισμούς εντός μη πολικών διαλυτών). Το Sephadex, ένας πολυσακχαρίτης, διαθέσιμος σε μορφή κόκκων, χρησιμοποιείται 49

51 ευρέως στην πρώτη περίπτωση, ενώ στην δεύτερη χρησιμοποιούνται υδρόφοβες γέλες πολυστυρενίου/διβινυλοβενζολίου(παρόμοιες με αυτές της χρωματογραφίας ιονανταλλαγής, αλλά χωρίς τις ιονικές ομάδες). Το είδος της χρωματογραφίας αυτής χρησιμοποιείται ευρέως στη βιοτεχνολογία για την απομάκρυνση μικρών μορίων και ανόργανων αλάτων από πολύτιμα προϊόντα υψηλού μοριακού βάρους(πεπτίδια, ενζυμα και πρωτεΐνες).[51, 52] Τέλος, το ευρύτερα διαδεδομένο είδος υγρής χρωματογραφίας είναι η χρωματογραφία κατανομής(partition chromatography), η ανακάλυψη της οποίας χάρισε στους Martin και Synge το βραβείο Nobel το Η αρχή λειτουργιάς της μεθόδου βασίζεται στην κατανομή της αναλυόμενης ουσίας μεταξύ δυο μη αναμίξιμων υγρών(κατ αναλογία με την εκχύλιση), με την διαφορά ότι το ένα εκ των δυο υγρών(στατική φάση), βρίσκεται καθηλωμένο σε αδρανή στατικό φορέα (συνήθως αποτελούμενο από silica gel, γη διατόμων, κελουλόζη, πολύτετραφλουρο-αιθυλένιο(ptfe) ή πολυστυρένιο). Η χρωματογραφία κατανομής λειτουργεί με βάση το γεγονός ότι τα μόρια μιας προς ανάλυση ουσίας, η οποία έρχεται σε επαφή με δυο υγρά, κατανέμεται μεταξύ των δυο αυτών υγρών με βάση τον συντελεστή κατανομής της(ή συντελεστή μερισμού-(κ)). Ο συντελεστής κατανομής μιας ουσίας μεταξύ δυο υγρών ορίζεται ως ο λόγος της συγκέντρωσης της ουσίας στην στατική φάση προς την συγκέντρωση της στην κινητή φάση. Ουσίες με διαφορετικό συντελεστή κατανομής συγκρατούνται σε διαφορετικό βαθμό από την στατική φάση και άρα εκλούονται και σε διαφορετικούς χρόνους. Οι δυνάμεις οι οποίες ευθύνονται για την κατανομή μεταξύ των υγρών φάσεων είναι δυνάμεις διασποράς, δυνάμεις μεταξύ επαγομένων διπόλων και δυνάμεις Van der Waals.[53] Η χρωματογραφία κατανομής διακρίνεται σε χρωματογραφία κανονικής φάσης και χρωματογραφία αντίστροφης φάσης. Στην πρώτη περίπτωση η στατική φάση είναι υδρόφιλη και η κινητή φάση λιπόφιλη, ενώ στην δεύτερη συμβαίνει το αντίστροφο(λιπόφιλη στατική φάση και υδρόφιλη κινητή). Στην περίπτωση της χρωματογραφίας κανονικής φάσης οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενοι διαλύτες που χρησιμοποιούνται ως κινητή φάση είναι(κατά σειρά αύξουσας εκλουστικής ικανότητας) το εξάνιο, το διχλωρομεθάνιο, η ισοπροπανόλη και το ύδωρ. Στην περίπτωση της χρωματογραφίας κανονικής φάσης, οι αντίστοιχοι διαλύτες είναι το ύδωρ, η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο και το τετραυδροφουράνιο(επίσης κατ αύξουσα σειρά ισχύος). 50

52 Η πηκτή πυριτίας(silica gel) και η οκταδεκυλιωμένη(ods) πηκτή πυριτίας είναι τα πλέον χρησιμοποιούμενα πληρωτικά υλικά για στήλες οι οποίες βρίσκουν εφαρμογές σε χρωματογραφικές αναλύσεις κανονικής και αντίστροφης φάσης αντίστοιχα. Ο βαθμός συγκράτησης ενός συστατικού εξαρτάται από την υδροφιλικότητα του στην περίπτωση της πηκτής πυριτίας και την λιποφιλικότητα του στην περιπτώσει χρησιμοποίησης πληρωτικών υλικών αντίστροφης φάσης όπως η ODS πηκτή πυριτίας.[54] 3.5 Οργανολογία διατάξεων HPLC Τα βασικά τμήματα από τα οποία αποτελείται μια διάταξη HPLC είναι: 1. Το σύστημα παροχής της κινητής φάσης 2. Το σύστημα εισαγωγής του δείγματος 3. Η στήλη 4. Ο ανιχνευτής 5. Το σύστημα καταγραφής και επεξεργασίας δεδομένων Το σύστημα παροχής της κινητής φάσης αποτελείται από α.) ένα(γραμμική έκλουση) ή περισσότερα(βαθμιδωτή έκλουση) υάλινα ή χαλύβδινα δοχεία, τα οποία περιέχουν τους χρησιμοποιούμενους διαλύτες, β.) συσκευές απαέρωσης, οι οποίες έχουν σκοπό να απαλλάσσουν την κινητή φάση από μικροποσότητες αέρα που τυχόν έχουν παρεισφρήσει εντός της ροής του υγρού, γ.) αντλίες, οι οποίες πρέπει να έχουν δυνατότητα δημιουργίας πιέσεων έως και 6000 psi(ή 414 bar), να έχουν την δυνατότητα γραμμικής ή παλμικής άντλησης, να μπορούν να επιτυγχάνουν ρυθμούς ροής που κυμαίνονται από 0,1 έως και 10mL/min και τέλος, να παρουσιάζουν αντίσταση στην διάβρωση από τους περισσότερους ευρέως χρησιμοποιούμενους διαλύτες. Υπάρχουν δυο ειδών αντλίες: α.) οι παλινδρομικές, οι οποίες έχουν το μειονέκτημα ότι δημιουργούν παλμική ροή, που εμφανίζεται ως θόρυβος στην βασική γραμμή(baseline) του χρωματογραφήματος, έχουν όμως το πλεονέκτημα της επίτευξης συνεχούς ροής(ανεξάρτητης από το ιξώδες της κινητής φάσης και την αντίσταση της στήλης), και οι αντλίες εκτοπίσεως, οι οποίες, αν και φθηνότερες και απλούστερες στην κατασκευή, δεν διατηρούν απολύτως σταθερή την ροή(με αποτέλεσμα μεταβολές στους χρόνους συγκράτησης) και καθιστούν δυσχερή την εναλλαγή διαλυτών της κινητής φάσης. 51

53 Το σύστημα εισαγωγής του δείγματος αποτελείται από τους περιστροφικούς βρόγχους δειγματοληψίας(sampling loops), οι οποίοι έχουν διάφορα μεγέθη και επιτρέπουν την εισαγωγή δειγμάτων με όγκους που κυμαίνονται από 1μL έως 100μL. Οι βρόγχοι δειγματοληψίας επιτρέπουν την εισαγωγή του δείγματος χωρίς να επισυμβαίνει πτώση της πίεσης του συστήματος σε πιέσεις έως και 7000psi. Παλαιότερα, η εισαγωγή του δείγματος στον βρόγχο έπρεπε να γίνει χειροκίνητα(με την χρήση μικροσύριγγας), σήμερα όμως οι περισσότερες συσκευές είναι εφοδιασμένες με αυτόματους δειγματολήπτες(autosamplers). Οι δειγματολήπτες αυτοί αποτελούνται από έναν θερμοστατούμενο θάλαμο στον οποίο τοποθετούνται τα φιαλίδια των δειγμάτων και μια μικροσύριγγα τοποθετημένη σε περιστρεφόμενο δίσκο. Κατόπιν εντολής από την μονάδα ελέγχου ο δίσκος περιστρέφεται και όταν φθάσει επάνω από το επιθυμητό φιαλίδιο, η μικροσύριγγα κατέρχεται εντός του φιαλιδίου και λαμβάνει την προκαθορισμένη ποσότητα δείγματος τη οποία και διοχετεύει στον βρόγχο δειγματοληψίας. Η χρωματογραφική στήλη αποτελεί την «καρδιά» του συστήματος υγρής χρωματογραφίας. Συνήθως είναι κατασκευασμένη από ανοξείδωτο ατσάλι(σπανίως μπορεί να συναντηθούν και στήλες από ενισχυμένη ύαλο ή πολυμερή), έχει σχήμα κυλινδρικό και κόστος που κυμαίνεται συνήθως μεταξύ 200$και 500$. Οι περισσότερες στήλες έχουν μήκος που κυμαίνεται από 5 έως και 25cm(με συνηθέστερο αυτό των 10-15cm), εσωτερική διάμετρο 3 έως 5mm (συνήθως 4.6 mm) και μέγεθος σωματιδίων πληρώσεως 3 έως 5 μm. Συχνά χρησιμοποιούνται προστήλες(guard columns), οι οποίες είναι μικρές στήλες που περιέχουν σωματίδια πληρώσεως σχετικά μεγάλου μεγέθους και χρησιμοποιούνται για να κατακρατήσουν ακαθαρσίες, οι οποίες ενδέχεται να φράξουν την κυρίως στήλη. Επίσης, επειδή οι θερμοκρασιακές μεταβολές μπορεί να προκαλέσουν αλλοίωση της επαναληψιμότητας των χρωματογραφημάτων, συχνά η στήλη τοποθετείται εντός θερμοστατούμενου θαλάμου, ο οποίος έχει δυνατότητα προσαρμογής της θερμοκρασίας της στήλης με ακρίβεια δεκάτου του βαθμού Κελσίου. Η διαφοροποίηση αυτή στους χρόνους έκλουσης των ουσιών ως αποτέλεσμα θερμοκρασιακών μεταβολών οφείλεται κατά κύριο λόγο στην μεταβολή του ιξώδους της κινητής φάσης, γεγονός που μεταβάλει και την ταχύτατα ροής της εντός του συστήματος.[55] 52

54 Τα υλικά πληρώσεως των στηλών μπορεί να είναι πορώδη σωματίδια(μικροπορώδη ή μακροπορώδη, ανάλογα με το μέγεθος των πόρων), τα οποία είναι και τα συχνότερα χρησιμοποιούμενα, και υμενοειδή σωματίδια, τα οποία διαθέτουν έναν αδρανή πυρήνα καλυμμένο με έναν υμένα υγρής στατικής φάσης. Τα υμενοειδή σωματίδια έχουν μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα, αλλά μικρότερη χωρητικότητα από τα πορώδη και χρησιμοποιούνται μόνο σε εξειδικευμένες εφαρμογές διαχωρισμού μακρομορίων. Ένα από τα σημαντικότερα τμήματα της διάταξης υγρής χρωματογραφίας είναι ο ανιχνευτής. Γενικά, δεν υπάρχει κάποιο είδος ανιχνευτή, το οποίο να είναι κατά κοινή παραδοχή το καταλληλότερο για συστήματα LC, καθώς όλοι έχουν τα δικά τους πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Ένας ανιχνευτής για σύστημα LC θα πρέπει ιδανικά να έχει χαμηλό όριο ανίχνευσης, να μην ανιχνεύει τους χρησιμοποιούμενους διαλύτες, να έχει γραμμική απόκριση στην περιοχή αποκρίσεως των διαχωριζομένων συστατικών και να μην επηρεάζεται από μεταβολές της θερμοκρασίας και της ταχύτητας εκλούσεως. Οι συχνότερα χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι τα φασματοφωτόμετρα υπεριώδουςορατού(με πλεονεκτήματα το χαμηλό κόστος, την μεγάλη ευαισθησία και τον μη επηρεασμό από θερμοκρασιακές μεταβολές και μειονέκτημα την αδυναμία χρησιμοποίησης τους με διαλύτες που απορροφούν στο υπεριώδες), τα διαθλασίμετρα(γενικοί ανιχνευτές, με μικρή όμως ευαισθησία και αδυναμία χρήσης σε βαθμιδωτή έκλουση), τα φασματοφωτόμετρα υπέρυθρου(γενικά μικρής ευαισθησίας και εκλεκτικότητας), τα φθορισμόμετρα(πολύ μεγάλης ευαισθησίας ανιχνευτές, που μπορούν όμως να χρησιμοποιηθούν μόνο σε φθορίζουσες ουσίες), οι ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές(εξαιρετικής ευαισθησίας) και οι φασματογράφοι μαζών(ακριβές διατάξεις, εξαιρετικής ευαισθησίας, εκλεκτικότητας και αξιοπιστίας). Το σύστημα καταγραφής και επεξεργασίας δεδομένων αποτελείται από έναν υπολογιστή, ο οποίος μέσω εξειδικευμένου λογισμικού, αφενός μεν δίνει τις εντολές λειτουργίας στο σύστημα(από το λογισμικό αυτό ρυθμίζονται όλες οι παράμετροι λειτουργίας) και αφετέρου δε παραλαμβάνει τα αποτελέσματα από τον ανιχνευτή, τα οπτικοποιεί και εν συνεχεία παρέχει τις δυνατότητες επεξεργασίας τους(π.χ. ολοκλήρωση, παραγώγιση).[51] 53

55 Εικ.19 Τμήματα διάταξης HPLC 4. Σύζευξη φασματομετρίας μαζών-χρωματογραφίας Για να επιτευχθεί η ανάλυση ενός μίγματος ουσιών είναι απαραίτητο να χρησιμοποιηθεί μια τεχνική διαχωρισμού-συνήθως η αέριος χρωματογραφία(gc), η υγρή χρωματογραφία(lc) ή η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση(ce), σε συνδυασμό με τον φασματογράφο μάζας. Η διαδικασία αυτή μπορεί να γίνει με δυο τρόπους: είτε με συλλογή του εκλούσματος και εισαγωγή του σε δεύτερο χρόνο εντός του φασματογράφου, είτε με απευθείας σύνδεση της χρωματογραφικής συσκευής με τον φασματογράφο και λήψη του φάσματος μαζών ταυτόχρονα με την έκλουση. Η αέριος χρωματογραφία παρουσιάζει σημαντικά μειονεκτήματα, με κυριότερα την ανάγκη χρήσης πτητικών και μη θερμοευαίσθητων μορίων, ενώ συχνά απαιτείται η παρασκευή παραγώγων ουσιών με την προσθήκη κάποιου αντιδραστηρίου, γεγονός που αυξάνει κατακόρυφα τον χρόνο ανάλυσης. Για τον λόγο αυτό η τεχνική η οποία τα τελευταία χρόνια κερδίζει όλο και περισσότερο έδαφος στην ανάλυση ουσιών είναι η σύζευξη φασματομετρίας μαζών και υγρής χρωματογραφίας, δηλαδή διατάξεις LC-MS(η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση(ce), χρησιμοποιείται κυρίως σε σύζευξη με διατάξεις 54

56 νανοψεκασμού(nanoesi), καθώς παράγει ροές της τάξης των nl/min, οι οποίες είναι κατάλληλες για χρήση με αυτήν την τεχνική ιονισμού). Εικ.20 Εμπορική διάταξη LC-MS Ένα σημαντικό πρόβλημα το οποίο παρουσιαζόταν με την χρήση παλαιοτέρων τεχνικών ιονισμού(π.χ. FAB), είναι το γεγονός ότι η μέγιστη ροή του εκλούσματος που εισάγεται στο φασματοσκόπιο δεν έπρεπε να ξεπέρνα τα 5 μl/min. Το πρόβλημα αυτό ξεπεράστηκε με την χρήση νεώτερων τεχνικών ιονισμού όπως οι APPI, APCI και ESI. Ειδικότερα, η χρήση της τεχνολογίας ESI επέτρεψε την χρησιμοποίηση εκλουσμάτων με ταχύτητες ροής από 10 nl/min έως και 0,2 ml/min. Συνήθως πάντως, προτιμώνται χαμηλές ταχύτητες ροής εκλούσματος, καθώς, όπως προαναφέρθηκε, η απόκριση στο ESI(σε αντίθεση με τα APPI και APCI) είναι σχεδόν αποκλειστικά εξαρτώμενη από την συγκέντρωση και όχι από την ολική ποσότητα των προς ανάλυση μορίων που εισάγεται στο σύστημα. Οι χαμηλές ροές προτιμώνται διότι αυξάνουν τον λόγο σήματος-προς-θόρυβο.[4] Η χρήση πνευματικά υποβοηθούμενης νεφελοποίησης(ionspray@), καθιστά δυνατή την χρήση εκλουσμάτων με ρυθμούς ροής μέχρι και 2 ml/min, καθώς η εξάτμιση του διαλύτη που επάγεται από το ξηραντικό αέριο, ελαττώνει ταχύτατα την συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας κατά τον ηλεκτροψεκασμό.[37] Κάτι το οποίο πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψιν κατά την σύζευξη LC και MS είναι η φύση των ρυθμιστικών(buffers) που χρησιμοποιούνται. Μη πτητικά ρυθμιστικά, όπως τα φωσφορικά άλατα, πρέπει να αποφεύγονται, καθώς καταλήγουν να αποτίθενται ως 55

57 συσσωματώσεις αλάτων στο φασματοσκόπιο μαζών. Συνίσταται η χρήση φορμικού οξέως, οξικού οξέως, αμμωνίας και οξικού αμμωνίου ως ρυθμιστικών, αλλά η συγκέντρωση τους πρέπει να διατηρείται όσο το δυνατόν χαμηλότερη. Η επιλογή του διαλύτη έκλουσης μπορεί επίσης να έχει σημαντική επίδραση στο παραγόμενο σήμα. Για παράδειγμα, στην περίπτωση ανάλυσης μιας αμίνης, εάν χρησιμοποιηθεί ακετονιτρίλιο ως κινητή φάση, μπορεί να υπάρξει ανταγωνισμός για τα πρωτόνια μεταξύ αμίνης και ακετονιτριλίου. Η μεθανόλη από την άλλη, δεν είναι αρκετά βασική ώστε να διεκδικήσει τα πρωτόνια, σε περίπτωση χρησιμοποίησης της ως κινητή φάση. Συνεπώς, το δείγμα της αμίνης πρωτονιώνεται ευκολότερα παρουσία της μεθανόλης, με αποτέλεσμα να καταλήγουμε στην παραλαβή μεγαλύτερου σήματος(αυξημένη ευαισθησία, καθώς και καλύτερη γραμμικότητα), παρά το γεγονός ότι το ακετονιτρίλιο διαθέτει καλύτερη χρωματογραφική συμπεριφορά.[4] 5. Φυσικοχημικές ιδιότητες των μελετούμενων φαρμακομορίων Μια εκ των βασικότερων φυσικοχημικών ιδιοτήτων μιας ουσίας είναι η λιποφιλικότητα της. Με τον όρο λιποφιλικότητα μιας ουσίας εννοούμε την ικανότητα (και τον βαθμό στον οποίο την έχει) να αναμιγνύεται με έναν λιπόφιλο διαλύτη, σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες(πίεση και θερμοκρασία). Το αντίστροφο της λιποφιλικότητας είναι η υδροφιλικότητα, η οποία αντιστοίχως εκφράζει την ικανότητα μιας ουσίας να αναμιγνύεται με έναν πολικό διαλύτη(συνήθως το ύδωρ) σε συγκεκριμένες συνθήκες. Ουσίες οι οποίες περιέχουν μακριές υδρογονανθρακικές αλυσίδες ή δακτυλίους(αρωματικούς και μη), τείνουν να είναι εξαιρετικά λιπόφιλες, ενώ ουσίες οι οποίες περιέχουν πολικές ομάδες(όπως π.χ. OH, -COOH, -NH2, -NO2), τείνουν να είναι πολύ υδρόφιλες. Ως μέτρο της λιποφιλικότητας των ουσιών χρησιμοποιείται ο συντελεστής μερισμού οκτανόλης-νερού (water-octanol partition coefficient), ο οποίος συμβολίζεται με logp 56

58 και δίδεται από την κάτωθι σχέση, όπου στον αριθμητή του λογαρίθμου του αριστερού μέρους της σχέσης βρίσκεται η συγκέντρωση της ουσίας στην οκτανόλη και στον παρονομαστή η συγκέντρωση της μη ιονισμένης ουσίας στην υδατική φάση. Η ανωτέρω σχέση βρίσκει εφαρμογή για ουσίες που δεν ιονίζονται ή για ουσίες οι οποίες βρίσκονται σε αδιάστατη μορφή στο ph που γίνεται η μέτρηση. Για ιονιζόμενες ουσίες στο ph της μέτρησης χρησιμοποιείται συνήθως ο συντελεστής κατανομής οκτανόλης-νερού (wateroctanol distribution coefficient), ο οποίος συμβολίζεται με logd και δίδεται από την κάτωθι σχέση, όπου στον αριθμητή του λογαρίθμου του αριστερού μέρους της σχέσης βρίσκεται η συγκέντρωση της ουσίας στην οκτανόλη και στον παρονομαστή η συγκέντρωση της μη ιονισμένης, συν την συγκέντρωση της ιονισμένης ουσίας στην υδατική φάση. Η λιποφιλικότητα είναι μια εκ των βασικών ιδιοτήτων μιας ουσίας και παίζει καθοριστικό ρόλο στην συμπεριφορά της, π.χ. καθορίζει ικανότητα διάβασης βιολογικών μεμβρανών, επηρεάζει τον χρόνο κατακράτησης σε μια χρωματογραφική στήλη.[56] Μια σημαντική φυσικοχημική ιδιότητα μιας ουσίας είναι ο αριθμός των ελεύθερα περιστρεφόμενων δεσμών της (freely rotating bonds-frb). Με τον όρο ελεύθερα περιστρεφόμενοι δεσμοί εννοούμε απλούς ομοιοπολικούς δεσμούς μεταξύ δυο ατόμων άνθρακα, τα οποία έχουν την δυνατότητα να περιστρέφονται κατά 360 ο (ως προς το άλλο άτομο άνθρακα), δίχως να επηρεάζεται η στερεοχημεία του μορίου ή η ισχύς του δεσμού. Οι δεσμοί αυτοί μπορούν να αναπτυχθούν μόνο με την συμμέτοχη σ τροχιακών, επομένως οι διπλοί και τριπλοί δεσμοί(που περιέχουν π τροχιακά δεν μπορούν να περιστρέφονται ελεύθερα). Η ύπαρξη FRB s δίνει την δυνατότητα στο μόριο να λάβει ευκολότερα διαφορετικές 57

59 διαμορφώσεις στον χώρο και άρα μπορεί να θεωρηθεί ότι αυξάνει την «ευελιξία» του μορίου αυτού.[57] Εικ.21 Ελεύθερα περιστρεφόμενος απλός σ δεσμός Μια ακόμη σημαντική ιδιότητα των φαρμακομορίων είναι η πολική επιφανειακή έκταση(polar surface area-psa), οριζόμενη ως το άθροισμα των εμβαδών των επιφανειών όλων των πολικών ατόμων του μορίου(π.χ. Ν, Ο, F, Cl, I). Παρότι η τιμή της PSA φαίνεται να παρουσιάζει καλή συσχέτιση με την ικανότητα διάβασης βιολογικών μεμβρανών, εντούτοις δεν ταυτίζεται με την υδροφιλικότητα ενός μορίου(καθώς μια ουσία με πολλά πολικά μόρια και άρα μεγάλη PSA, μπορεί να διαθέτει πολύ μεγάλες λιπόφιλες περιοχές και άρα να είναι λιπόφιλη).[58] Με τον όρο πολωσιμότητα(polarizability-α) εννοούμε την σχετική τάση μιας κατανομής φορτίου, όπως το ηλεκτρονιακό νέφος ενός μορίου ή ατόμου, να υφίσταται διατάραξη του κανονικού της σχήματος υπό την επίδραση ενός εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου. Η πολωσιμότητα α, δίνεται από τον λόγο α=p/e, όπου p η επαγόμενη διπολική ροπή ενός ατόμου και Ε το ηλεκτρικό πεδίο το οποίο προκαλεί την διπολική αυτή ροπή(και άρα εκφράζεται σε C*m 2 *V -1 ).[59] Η μοριακή διαθλαστικότητα(refractivity-r) αντικατοπτρίζει την διευθέτηση των ηλεκτρονιακών νεφών των ιόντων σε ένα μόριο και είναι ένα μέτρο της πολωσιμότητας μιας ουσίας. Ο συνδυασμός των ιόντων ώστε να σχηματισθούν μόρια σε αέριο μορφή, σε έναν κρύσταλλο ή σε ένα διάλυμα, συνοδεύεται πάντα από αλλαγή στις ιδιότητες των ιόντων αυτών καθ εαυτών. Η μοριακή διαθλαστικότητα αντικατοπτρίζει τις αλλαγές στις ιδιότητες αυτές, εξαιτίας της πόλωσης ή της παραμόρφωσης των ηλεκτρονικών νεφών των ιόντων, υπό την επίδραση των ηλεκτρικών πεδίων των γειτονικών ιόντων. Δίνεται από την εξίσωση R = [(n 2-58

60 1)/(n 2 +2)]) * M/ρ, όπου n το μήκος κύματος που χρησιμοποιείται για την μέτρηση του δείκτη διάθλασης, Μ το μοριακό βάρος και ρ η πυκνότητα του μορίου. Η μοριακή διαθλαστικότητα εξαρτάται από την θερμοκρασία, την πίεση και τον δείκτη διάθλασης μιας ουσίας και σχετίζεται με την πολωσιμότητα με την σχέση: όπου ΝΑ, ο αριθμός του Avogadro(6,022 x ) και α, η πολωσιμότητα της ουσίας.[60, 61] Οι δεσμοί υδρογόνου παίζουν έναν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στις διαμοριακές και ενδομοριακές αλληλεπιδράσεις χημικών και βιολογικών συστημάτων. Η ασθενείς αυτές αλληλεπιδράσεις σχηματίζονται όταν μια ομάδα δότης(συνήθως ένα υδρογόνο συνδεδεμένο με ένα ετεροάτομο, C-H), βρίσκεται κοντά σε μια πλούσια σε ηλεκτρόνια ομάδα δέκτη(συνήθως ένα ισχυρά ηλεκτραρνητικό ετεροάτομο, όπως τα F,O,N ή την π-ηλεκτρονιακή διαμόρφωση ενός αρωματικού δακτυλίου). Ο συνολικός αριθμός ατόμων αποδεκτών δεσμών υδρογόνου(hydrogen bond acceptors-hba) και ατόμων δοτών δεσμών υδρογόνου(hydrogen bond donors-hbd) φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην συμπεριφορά ενός φαρμακομορίου, καθώς καθορίζει τον βαθμό στον οποίο το μόριο αυτό αλληλεπιδρά με τα γειτονικά του μόρια, μέσω της δημιουργίας δεσμών υδρογόνου.[62] 59

61 Εικ.22 Δότες-δέκτες δεσμών υδρογόνου Με τον όρο επιφάνεια προσβάσιμη σε διαλύτη(solvent accessible area-sae), εννοείται η επιφάνεια που ορίζεται από το κέντρο μιας σφαίρας, η οποία αντιπροσωπεύει ένα μόριο διαλύτη, καθώς κυλίεται επάνω στην επιφάνεια των ατόμων του προς εξέταση μορίου. Η παράμετρος αυτή θεωρείται ιδιαίτερης σημαντικότητας στην μελέτη της συμπεριφοράς διαφόρων ουσιών διότι καθορίζει την επιφάνεια εκείνη του μορίου, η οποία είναι διαθέσιμη για αλληλεπίδραση με τον περιβάλλοντα διαλύτη(και άρα με το εν γένει περιβάλλον του μορίου).[63, 64] 60

62 Εικ.23 Σχηματική αναπαράσταση επιφάνειας ενός μορίου προσβάσιμης σε διαλύτη Ο μοριακός όγκος(molar volume-vm) είναι μια ακόμη βασική ιδιότητα που χαρακτηρίζει ένα μόριο. Ορίζεται ως ο όγκος τον οποίο καταλαμβάνει ένα mole μιας ουσίας, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και πίεση. Ισούται με το μοριακό βάρος(m.w.) της ουσίας δια την πυκνότητα μάζας της(mass density-ρ) και οι μονάδες του στο SI είναι m 3 /mol.[65] Ο όγκος van der Waals(van der Waals volume-vw), διαφέρει από τον μοριακό όγκο που αναφέρθηκε στην ανωτέρω παράγραφο, καθώς ορίζεται ως ο χώρος τον οποίο καταλαμβάνει ένα μεμονωμένο μόριο μιας ουσίας. Είναι μια έννοια στενά συνδεδεμένη με την ακτίνα van der Waals(ακτίνα της νοητής σφαίρας, η οποία καταλαμβάνει χώρο ίσο με τον χώρο που καταλαμβάνει το μόριο-rw). Για ένα μεμονωμένο άτομο ισούται με: ενώ για τον υπολογισμό της σε περίπτωση μορίων απαιτούνται επιπλέον οι αποστάσεις και οι γωνιές μεταξύ των ατόμων του μορίου.[66] Με τον όρο μοριακό βάρος ή μοριακή μάζα(molecular mass or weight) ενός μορίου, εννοούμε την ολική μάζα των ατόμων που το αποτελούν, δηλαδή το άθροισμα των ατομικών μαζών των επιμέρους ατόμων του μορίου. Η ατομική και η μοριακή μάζα ορίζονται με βάση 61

63 την μάζα του ισότοπου του άνθρακα 12 C(η οποία συμβατικά ορίζεται ίση με 12). Μονάδα μέτρησης της είναι το Dalton, το οποίο επίσης συμβατικά ορίζεται ως το 1/12 της μάζας του ατόμου 12 C. Η μοριακή μάζα μιας ουσίας είναι μια ιδιότητα που επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την συμπεριφορά της, καθώς ουσιαστικά αντιπροσωπεύει το ποσό της ύλης που περιέχει το μόριο της ουσίας αυτής.[67] Μια εξαιρετικά σημαντική ιδιότητα κάθε ουσίας είναι η επιφανειακή της τάση. Η επιφανειακή τάση ενός υγρού (γl), δηλαδή η ελεύθερη επιφανειακή του ενέργεια ανά μονάδα επιφανείας στο κενό, ισούται με το ½ της ελεύθερης ενέργειας συνοχής(δgii), αλλά έχει αντίθετο πρόσημο, ισχύει δηλαδή η εξίσωση γl=-1/2*δgii, όπου ελεύθερη συνοχής εννοείται η ενέργεια που απαιτείται ανά μονάδα επιφανείας ενός υλικού, για τον διαχωρισμό του σε δυο όμοιες επιφάνειες. Για ένα στερεό, η ανωτέρω εξίσωση ισχύει επίσης, με την διαφορά ότι η ΔGii δεν είναι η ελεύθερη ενέργεια συνοχής όπως στα υγρά, αλλά η ελεύθερη ενέργεια που είναι διαθέσιμη για αλληλεπίδραση με κάποιο υγρό. Όπως προτάθηκε από τον Fowkes, η επιφανειακή τάση μπορεί να εκφραστεί και ως το άθροισμα όλων των διαφορετικών δυνάμεων που ενεργούν στην επιφάνεια, δηλαδή: γi=γ w i + γ d h i + γ i όπου, γ w i, γ d i, γ h i αναφέρονται σε δυνάμεις van der Waals, δυνάμεις διασποράς και δεσμούς υδρογόνου αντίστοιχα. Η ύπαρξη της επιφανειακής τάσης προκύπτει ως αποτέλεσμα του γεγονότος ότι στα μόρια ενός υλικού(υγρού ή στέρεου) ασκούνται ισοδύναμες ελκτικές δυνάμεις από όλες τις κατευθύνσεις, εάν αυτά περιβάλλονται από όμοια μόρια ή δεν βρίσκονται στην επιφάνεια. Αντίθετα, στα μόρια τα οποία βρίσκονται στην επιφάνεια του υλικού, ασκούνται δυνάμεις από τα μόρια που βρίσκονται στο εσωτερικό του υλικού. Έτσι, η συνιστάμενη των δυνάμεων που ασκούνται στα επιφανειακά μόρια έχει κατεύθυνση προς το εσωτερικό, με αποτέλεσμα μια τάση του υλικού να ελαττώσει, κατά το δυνατόν, την επιφάνεια του, καθώς και την επιφανειακή του ενέργεια. Η συνιστάμενη αυτή των δυνάμεων ονομάζεται επιφανειακή τάση. 62

64 Η σημαντικότητα της επιφανειακής τάσης ως ιδιότητας για την παρούσα εργασία προκύπτει από το γεγονός ότι καθορίζει τον τρόπο με τον οποίο συμπεριφέρονται δύο ανόμοια υλικά, τα οποία έρχονται σε επαφή, όπως επίσης και τον τρόπο με τον οποίο διαχωρίζονται οι επιφάνειες δυο διαφορετικών υλικών, διαδικασία η οποία λαμβάνει χώρα κατά την δημιουργία των ιόντων αέριας φάσης(διαχωρισμός ιόντος από τον φέροντα διαλύτη).[68, 69] Η σημαντικότερη ίσως ιδιότητα μιας ουσίας είναι το pka της. Με τον όρο pka συμβολίζουμε τον αρνητικό δεκαδικό λογάριθμο της σταθεράς διάστασης ενός οξέος(κα). Η σταθερά διάστασης Κα αποτελεί ένα μέτρο της ισχύος ενός οξέος σε ένα διάλυμα. Πιο συγκεκριμένα η εξίσωση διάστασης ενός ασθενούς οξέος HA έχει την μορφή; Στην κατάσταση ισορροπίας η σταθερά Κα ισούται με Κα = [Α ][Η + ] [ΗΑ], όπου [Α-] η συγκέντρωση του ιονισμένου οξέος, [Η+] η συγκέντρωση των πρωτονίων στο διάλυμα και [ΗΑ] η συγκέντρωση του αδιάστατου οξέος. Εφόσον όπως προαναφέρθηκε, το pka ισούται με τον αρνητικό δεκαδικό λογάριθμο της σταθεράς διάστασης ενός οξέος Κα, ισχύει ότι: Από την ανωτέρω σχέση συνάγεται ότι όσο μικρότερη είναι η τιμή του pka ενός οξέος τόσο μεγαλύτερος είναι και ο βαθμός ιονισμού του σε δεδομένο ph(όπου ως ph ορίζεται ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της συγκέντρωσης των πρωτονίων στο διάλυμα, τα οποία πρόεκυψαν από την διάσταση του οξέως, δηλ. ισχύει ότι ph = log10[h + ]). Αυτό συμβαίνει διότι, με βάση την εξίσωση Henderson-Hasselbalch, η οποία διατυπώνεται ως εξής:, 63

65 ο βαθμός διάστασης του ασθενούς οξέος [Α ] δεδομένο ph. [ΗΑ] είναι συνάρτηση μόνο του pka για Η τιμή pka μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τον χαρακτηρισμό της ισχύος των βάσεων, με την διαφορά ότι στην περίπτωση αυτή μεγάλη τιμή pka συνεπάγεται αυξημένη βασικότητα, καθώς η pka συνδέεται με την pkb, με την σχέση pkb=14-pka, όπου, κατ αντιστοιχία με την περίπτωση των οξέων ισχύει pkb = log10kb, ενώ Kb= [HB+][OH ] [B], με βάση την εξίσωση: B + H2O HB + + OH Μια ουσία δύναται να έχει περισσότερα του ενός pka, ανάλογα με τον αριθμό των ιονίσιμων ομάδων που διαθέτει το μόριο της. Οι ομάδες αυτές σε δεδομένο ph ενδέχεται να είναι ιονισμένες η όχι, συμβάλλοντας η κάθε μια στην συνολική συμπεριφορά του μορίου. Η σημαντικότητα του βαθμού ιονισμού στην εν γένει συμπεριφορά του μορίου, έγκειται στο γεγονός ότι επηρεάζει πλήθος άλλων ιδιοτήτων του συμπεριλαμβανομένης της λιποφιλικότητας, της υδατοδιαλυτότητας, της ικανότητας να σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου, καθώς επίσης και της ενδεχόμενης δυνατότητας του να σχηματίζει μοριακά ιόντα αέριας φάσης ανιχνεύσιμα από τον φασματογράφο μαζών.[70] Μια ακόμη σημαντική ιδιότητα των ουσιών είναι η διαλυτότητα τους στο ύδωρ(water solubility), η οποία μετράται σε mgr/l. Με τον όρο διαλυτότητα μιας χημικής ουσίας σε έναν διαλύτη εννοούμε την ιδιότητα που έχει η ουσία αυτή (η οποία μπορεί να βρίσκεται σε στερεή, υγρή ή αέριο φάση), να διαλύεται σε έναν υγρό ή αέριο διαλύτη προς δημιουργία διαλύματος. Η διαλυτότητα μιας ουσίας σε έναν διαλύτη καθορίζεται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες τόσο του διαλύτη, όσο και της διαλυόμενης ουσίας και εξαρτάται από την θερμοκρασία, την πίεση και το ph στο οποίο βρίσκεται το διάλυμα. Πιο συγκεκριμένα, η διαλυτότητα μιας ουσίας αυξάνεται όσο αυξάνεται η θερμοκρασία του διαλύτη και η πίεση(ειδικά για τα αέρια), ενώ η επίδραση του ph εξαρτάται από τον βαθμό ιονισμού που θα επιφέρει η μεταβολή του. Η σημαντικότητα της διαλυτότητας έγκειται στο γεγονός ότι, όσο μεγαλύτερη είναι η διαλυτότητα μιας ουσίας, τόσο μεγαλύτερη είναι και η ποσότητα της 64

66 ουσίας αυτής(για δεδομένο όγκο υγρού), η οποία έρχεται σε επαφή με τον διαλύτη και άρα δύναται να αλληλεπιδράσει με το περιβάλλον.[71] Ως ενθαλπία ή θερμότητα εξατμίσεως(enthalpy or Heat of Vaporization-ΔΗv) μιας ουσίας ορίζεται η ποσότητα ενέργειας που πρέπει να προσφερθεί σε ένα mol της ουσίας αυτής ώστε να μεταβεί από την υγρή στην αέριο φάση, σε μια συγκεκριμένη πίεση. Οι μονάδες μέτρησης της στο SI είναι kj/mol και συνήθως μετράται στο σημείο βρασμού κάθε ουσίας, καθώς έχει αποδειχθεί ότι η ενθαλπία εξατμίσεως είναι συνάρτηση της θερμοκρασίας. Η ενθαλπία εξατμίσεως μιας ουσίας ενδέχεται να είναι καθοριστική ιδιότητα κατά την διαδικασία δημιουργίας ιόντων αέριας φάσης στον φασματογράφο μαζών, καθώς κατά την δημιουργία των ιόντων αυτών, επισυμβαίνει μετάβαση της προς ανάλυση ουσίας από την υγρή στην αέριο φάση.[72] 6. Στατιστική ανάλυση πειραματικών δεδομένων 6.1 Γενικά Για την στατιστική ανάλυση των δεδομένων που πρόεκυψαν από την πειραματική διαδικασία, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Ανάλυσης Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων. Η ανάλυση αυτή πραγματοποιήθηκε με την χρήση του προγράμματος PLS, το οποίο πηρέ το όνομα του από τα αρχικά των λέξεων Partial Least Squares(Projections to Latent Structures), δηλαδή (Προβολές) Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων (σε Λανθάνουσες Δομές). Το PLS διαθέτει την δυνατότητα συσχετισμού και ανάλυσης πολυμεταβλητών συστημάτων, δηλαδή συστημάτων τα οποία διαθέτουν μεγάλο αριθμό μεταβλητών (Χ), προς συσχέτιση με συγκεκριμένες παραμέτρους ή δεδομένα (Υ). Το αποτέλεσμα αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αντικατάστασης των αρχικών μεταβλητών Χ, με λανθάνουσες(latent) μεταβλητές, οι οποίες καλούνται κύριες συνιστώσες και συνοψίζουν την πληροφορία που περιέχεται στις κύριες μεταβλητές. 65

67 Ο στόχος της χρήσης του PLS είναι όχι μόνο η κατά το δυνατόν καλύτερη συσχέτιση μεταξύ μεταβλητών Χ και τιμών Υ, αλλά και η δυνατότητα πρόβλεψης των τιμών Υ γνωρίζοντας τις τιμές των μεταβλητών Χ. 6.2 Γεωμετρική απεικόνιση των δεδομένων Για να επιτευχθούν οι ανωτέρω στόχοι, τα δεδομένα(στην προκείμενη περίπτωση τα ολοκληρώματα των σημάτων στον φασματογράφο μαζών) μετρώνται για έναν ορισμένο αριθμό αντικειμένων(στην περίπτωση μας οι ουσίες φαρμακευτικού ενδιαφέροντος) και εκφράζονται ως απόκριση για έναν συγκεκριμένο αριθμό μεταβλητών. Ο ευκολότερος τρόπος χειρισμού των δεδομένων αυτών είναι η κατασκευή ενός πίνακα δεδομένων. Κάθε σειρά του πίνακα αυτού αντιστοιχεί στις προκύπτουσες τιμές των μεταβλητών και του σήματος για ένα συγκεκριμένο αντικείμενο, ενώ κάθε στήλη του πίνακα αντιστοιχεί στις τιμές κάθε αντικειμένου για μια δεδομένη μεταβλητή. Τα δεδομένα τα οποία συγκεντρώνονται και παρουσιάζονται σε έναν πίνακα μπορούν να μελετηθούν με την χρήση γεωμετρίας πολλών διαστάσεων. Οι μεταβλητές χρησιμοποιούνται ως ορθογώνιοι άξονες στον πολυδιάστατο χώρο και τα αντικείμενα ως σημεία του χώρου αυτού(ή και αντίστροφα τα αντικείμενα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ορθογώνιοι άξονες και οι μεταβλητές ως σημεία). Οι αποστάσεις μεταξύ των σημείων και η δημιουργία συστοιχιών σημείων μπορούν να ερμηνευθούν ως ομοιότητες ή ανομοιότητες μεταξύ των αντικειμένων.[73] 6.3 Ανάλυση Πρωταρχικών Συνιστωσών (Principal Component Analysis-PCA) Η οπτικοποίηση και η επεξεργασία ενός πολυδιάστατου χώρου με περισσότερες από 3 διαστάσεις δεν είναι εύκολη. Για τον λόγο αυτό, χρησιμοποιούνται μέθοδοι προβολής, για να απεικονίσουν τον πολυδιάστατο χώρο ως μια δισδιάστατη προβολή του. Από έναν άπειρο αριθμό πιθανών προβολών, οι βέλτιστες μπορούν να επιλεχθούν με την χρήση ενός αριθμού 66

68 κριτηρίων. Η Ανάλυση Πρωταρχικών Συνιστωσών(Principal Component Analysis-PCA) βασίζεται σε μόλις ένα εξ αυτών των κριτηρίων, την μεγιστοποίηση της διακύμανσης των τιμών. Οι προβολές των αξόνων που προκύπτουν από το PCA καλούνται λανθάνουσες μεταβλητές(scores ή latent variables). Έτσι, οι προβολές όλων των δεδομένων σε ένα βέλτιστο διάγραμμα, μπορούν να επιτευχθούν μέσω της κατασκευής ενός διαγράμματος διασποράς μεταξύ δυο λανθανουσών μεταβλητών. Εικ.24 Δισδιάστατο σύστημα αξόνων αποτελούμενο από λανθάνουσες μεταβλητές(pc1,pc2), προκύπτον από τρισδιάστατο σύστημα πρωταρχικών μεταβλητών(x1,x2,x3) Η μελέτη των λανθανουσών μεταβλητών μας επιτρέπει να εντοπίσουμε συσχετίσεις μεταξύ των αντικειμένων(π.χ. ομαδοποίηση αντικειμένων). Επίσης, ορισμένα αντικείμενα μπορεί να αποτελούν ακραίες τιμές και αυτό υποδηλώνεται με την παρουσία τους στο διάγραμμα μακριά από άλλα αντικείμενα, καταλαμβάνοντας μια «μοναχική» θέση. Τα αντικείμενα αυτά συνήθως απομακρύνονται, ώστε να βελτιστοποιηθεί η ανάλυση.[73] 6.4 Παλινδρόμηση σε λανθάνουσες μεταβλητές: Μερικά Ελάχιστα Τετράγωνα(PLS) 67

69 Η παλινδρόμηση χρησιμοποιείται για την συσχέτιση δυο ομάδων μετρήσεων. Οι ομάδες αυτές συνήθως διαχωρίζονται σε δυο υποομάδες δεδομένων που καλούνται Χ και Υ. Ο στόχος είναι να δημιουργηθεί ένα συσχετισμένο μοντέλο μεταξύ των Χ και Υ, το οποίο θα έχει ικανότητα πρόβλεψης. Προβλεψιμότητα του συστήματος σημαίνει ότι σε μια μελλοντική περίσταση, μια ακριβής πρόβλεψη των Υ θα είναι δυνατή, μέσω της μέτρησης των δεδομένων Χ. Διάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για την επίτευξη της συσχέτισης αυτής με κυριότερη την Παλινδρόμηση Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων(PLS). Με τον όρο παλινδρόμηση PLS εννοούμε την παλινδρόμηση μεταξύ δυο ομάδων μεταβλητών: της ομάδας ανεξάρτητων μεταβλητών Χ και της ομάδας εξαρτημένων μεταβλητών Υ, που συνδέονται με την εξίσωση: Y=XBpls + E όπου, Χ ένας πίνακας Ν αντικειμένων και Κ μεταβλητών, Υ ένας πινάκας Ν αντικειμένων και J μεταβλητών, Ε ο υπολειπόμενος πινάκας ΝxJ και Β ένας KxJ πίνακας συντελεστών παλινδρόμησης, βασιζόμενος στην ανάλυση PLS και κατασκευασμένος από λανθάνουσες μεταβλητές των αρχικών δεδομένων.[73] Ο βαθμός συσχέτισης των δοθέντων δεδομένων εκφράζεται από την παράμετρο R 2 Y, δηλαδή από το κλάσμα του αθροίσματος των τετραγώνων(ss) όλων των τιμών Υ που μπορούν να ερμηνευθούν από την δεδομένη συνιστώσα. Όσο πλησιέστερος στην μονάδα είναι ο αριθμός αυτός τόσο καλύτερη είναι η συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων. Ο αριθμός των λανθανουσών μεταβλητών που χρησιμοποιούνται στην παλινδρόμηση PLS αποτελεί έναν κρίσιμο παράγοντα που επηρεάζει την ποιότητα των μελλοντικών προβλέψεων. Η διασταυρούμενη συσχέτιση(cross validation-cv) αποτελεί την βέλτιστη μέθοδο για την επιλογή του καλύτερου αριθμού λανθανουσών συνιστωσών, προς χρήση σε ένα μοντέλο παλινδρόμησης PLS. Κατά την διαδικασία της CV, αφαιρούνται παρατηρήσεις(αντικείμενα) από το μοντέλο και έπειτα υπολογίζονται οι αποκρίσεις Υ για τις παρατηρήσεις αυτές και συγκρίνονται με τις πραγματικές τιμές των μετρήσεων. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται πολλές φορές μέχρις ότου 68

70 κάθε παρατήρηση έχει αφαιρεθεί μια και μόνο φορά. Για να εκτιμηθεί η σημαντικότητα μιας συνιστώσας, υπολογίζεται το σφάλμα πρόβλεψης του αθροίσματος των τετραγώνων(predicted Residual Sum Of Squares-PRESS), το οποίο ορίζεται ως τα τετράγωνα των διαφορών μεταξύ των παρατηρούμενων τιμών Υ και των προβλεπόμενων τιμών μετά την αφαίρεση κάθε παρατήρησης Ŷ, δηλαδή ισχύει ότι: PRESS = i m (Yim- Ŷim) 2 Για κάθε διάσταση υπολογίζεται η ολική τιμή PRESS/SS, όπου SS το υπολειπόμενο άθροισμα τετραγώνων των Υ της προηγούμενης υπολογισθείσας διάστασης. Μια συνιστώσα θεωρείται σημαντική εάν ο λόγος PRESS/SS είναι στατιστικά μικρότερος της μονάδας. Μια άλλη παράμετρος εκτίμησης της ικανότητας πρόβλεψης ενός μοντέλου είναι και ο διασταυρούμενος συντελεστής συσχέτισης, Q 2 για τον οποίον ισχύει: Q 2 =1-PRESS/SS με το Q να είναι το κλάσμα της ολικής διακύμανσης των Υ που μπορεί να υπολογισθεί από μια συνιστώσα. Όσο πλησιέστερος στην μονάδα είναι ο αριθμός αυτός τόσο καλύτερη είναι η ικανότητα πρόβλεψης του μοντέλου. Το πρόγραμμα PLS μπορεί επίσης να υπολογίσει τον βαθμό επίδρασης κάθε μεταβλητής στο Υ, ο οποίος καλείται σημαντικότητα μεταβλητής(variable importance-vip). Η τιμή VIP είναι το άθροισμα των συνεισφορών VIN(variable influence) των μεταβλητών στο Υ σε κάθε διάσταση του μοντέλου, δηλαδή ισχύει ότι: VIP 2 k = 2 α (VIN) k όπου α μια διάσταση των k χρησιμοποιούμενων διαστάσεων του μοντέλου[74]. 69

71 7.1 Σκοπός μελέτης 7. Πειραματικό μέρος Η μελέτη των διαφόρων χημικών ενώσεων σε διατάξεις φασματομετρίας μάζας με ηλεκτροψεκασμού (ESI, LC-MS) παραμένει σήμερα, σχεδόν 25 χρόνια μετά την εισαγωγή των οργάνων αυτών στην εργαστηριακή πράξη, ένα όχι επαρκώς μελετημένο πεδίο. Οι περισσότερες μάλιστα μελέτες αναφέρονται στην συμπεριφορά μορίων με μέθοδο θετικού ιονισμού (positive ionization mode) στην οποία ο μηχανισμός δημιουργίας ιόντων αέριας φάσεως είναι κατά πάσα πιθανότητα αρκετά διαφορετικός από ότι στην αντίστοιχη με αρνητικό ιονισμό (negative ionization mode). Η σημαντική διαφορά μεταξύ των δυο τεχνικών είναι ότι η πρώτη βασίζεται στην πρωτονίωση ενώ η άλλη στην αποπρωτονίωση των μορίων καθώς επίσης και στην δημιουργία διαφορετικών ιόντων προσθήκης (adducts) [3, 75]. Έτσι, στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε να γίνει συσχέτιση των φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών διαφόρων φαρμακομορίων με την προκύπτουσα απόκριση(σήμα) στη μέθοδο αρνητικού ιονισμού (negative ionization mode). Η συσχέτιση αυτή πραγματοποιήθηκε τόσο με χρήση στήλης C18 αντιστρόφου φάσης, όσο και με απευθείας εισαγωγή δείγματος στον νεφελοποιητή method). του φασματογράφου μαζών, FIA(flow injection Επίσης, έγινε προσπάθεια να συσχετισθεί το προκύπτον σήμα των φαρμακομορίων με την φύση και το ph της χρησιμοποιούμενης κινητής φάσης και του διαλύτη στον οποίο βρίσκονται διαλυμένα τα εν λόγω φαρμακομόρια. 70

72 Τέλος, επιχειρήθηκε να αποδειχθεί η αναλογικότητα του προκύπτοντος σήματος με τον χρησιμοποιούμενο όγκο διαλύματος σταθερής συγκέντρωσης προσδιοριζόμενης ουσίας(γραμμική μεταβολή σήματος/injection volume). 7.2 Πειραματική διαδικασία Οργανολογία -Για την εκτέλεση του πειραματικού τμήματος της μελέτης χρησιμοποιήθηκε όργανο LC- MS της εταιρίας Shimadzu, μοντέλο LC-MS2020 το οποίο αποτελείται από τα εξής τμήματα: α.) δυο αντλίες τύπου LC-20AD για την παροχή των υγρών της κινητής φάσης, β.) έναν αυτόματο δειγματολήπτη(autosampler) τύπου SIL-20AC HT για την φόρτωση των δειγμάτων στο σύστημα, γ.) έναν θερμοστατούμενο θάλαμο(cto-20 AC) στον οποίο τοποθετείται η χρωματογραφική στήλη, δ.) τον αναλυτή μαζών τύπου τετραπόλου(lc-ms-2020), ε.) την συσκευή παροχής αερίου αζώτου(ν2) της εταιρίας Claind(N2 LCMS Nitrogen Generator), το οποίο χρησιμοποιείται ως φέρον και ξηραντικό αέριο στον αναλυτή μαζών και στ.) την υπολογιστική μονάδα(turbo-x με οθόνη LG), η οποία χρησιμοποιείται για την οδήγηση του συστήματος και την επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Το πρόγραμμα το οποίο χρησιμοποιεί η υπολογιστική μονάδα είναι το LabSolutions της εταιρίας Shimadzu. -Η χρωματογραφική στήλη HPLC η οποία χρησιμοποιήθηκε για την διεξαγωγή των πειραμάτων είναι της εταιρίας Supelco(μοντέλο Discovery HS C18) διαστάσεων 25cm x 4.6mm, 5μm, με δυνατότητα να πραγματοποιεί διαχωρισμούς μέσω του μηχανισμού κατανομής αντιστρόφου φάσεως. 71

73 -Για την ζύγιση των χρησιμοποιούμενων ουσιών χρησιμοποιήθηκε αναλυτικός ζυγός της εταιρίας Shimadzu(μοντέλο ΑΤΧ 124). -Για την μέτρηση του ph χρησιμοποιήθηκε συσκευή της εταιρίας Consort(μοντέλο C 931). -Για την διάλυση δυσδιάλυτων φαρμακομορίων χρησιμοποιήθηκε λουτρό υπερήχων της εταιρίας Βransonic(μοντέλο 220) Αντιδραστήρια, διαλύτες και χημικές ουσίες Οι διαλύτες οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν ως κινητές φάσεις κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας (ακετονιτρίλιο(ch3cn), ύδωρ(η2ο) και μεθανόλη(meoh)), προέρχονται από την εταιρία Panreac(Spain) και είναι υψηλού βαθμού καθαρότητας LC- MS(LC-MS grade). Οι αντίστοιχοι διαλύτες, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των διαλυμάτων των μελετούμενων ουσιών, προέρχονται από την εταιρία Carlo Erba(Italy) και είναι βαθμού καθαρότητας HPLC(HPLC grade). Το ύδωρ προήλθε από ιονανταλλακτική στήλη, ενώ το φορμικό οξύ(hcooh) % και η αμμωνία(nh3) 25%, που χρησιμοποιήθηκαν για την οξίνιση ή αλκαλοποίηση των αντίστοιχων διαλυμάτων προήλθαν από την εταιρία Merck(Germany) και ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας (analytical grade ). Οι φαρμακευτικές ουσίες (Παράρτημα ΙΙ), οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν για των διεξαγωγή των πειραμάτων προήλθαν από τις εταιρίες: i. Sigma-Aldrich (Life Science Chemilab), ii. Carlo Erba (Milan, Italy), iii. Riedel-de-Haën (Life Science Chemilab), iv. Fluka (Life Science Chemilab, authorized distributor in Greece), v. Applichem (Bioline Scientific, Athens, Greece), vi. Boehringer Ingelheim, vii. Acros-Organics (Life Science Chemilab), viii. Lavipharm (Athens,Greece) και ix. Minerva Pharmaceutical s(athens,greece) Πειραματική διαδικασία Παρασκευή διαλυμάτων 72

74 Η διαδικασία η οποία ακολουθήθηκε κατά την εκτέλεση του πειραματικού μέρους της μελέτης είναι η εξής: Κατ αρχήν ζυγίσθηκαν επακριβώς σε αναλυτικό ζυγό 10mgr από καθεμία από τις προς μελέτη φαρμακευτικές ουσίες και οι ζυγισθείσες ποσότητες τοποθετήθηκαν σε ογκομετρικές φιάλες των 25ml όπου και διαλύθηκαν με την προσθήκη MeOH. Σε ορισμένες περιπτώσεις ιδιαίτερα δυσδιάλυτων ουσιών η διάλυση υποβοηθήθηκε από υδατόλουτρο υπερήχων. Προέκυψαν έτσι διαλύματα συγκέντρωσης 400μgr/ml (διαλύματα φάσης 1), εκ των οποίων 1ml μεταφέρθηκε (με την βοήθεια σιφωνίου πληρώσεως της αυτής χωρητικότητας) σε ογκομετρικές φιάλες των 100ml. Οι φιάλες πληρώθηκαν μέχρι χαραγής με απιονισμένο ύδωρ δημιουργώντας τα διαλύματα φάσης 2 με συγκέντρωση 4μgr/ml. Τέλος, ακολούθησε μια επιπλέον αραίωση (1ml διαλύματος σε ογκομετρικές φιάλες των 10ml) με διαλύτη MeOH. Προέκυψαν έτσι τα διαλύματα φάσης 3.1 συγκεντρώσεως 0.4μg/ml (ή 400ng/ml) τα οποία και χρησιμοποιήθηκαν τόσο για τη διερεύνηση έντασης σήματος με διαφορετικές κινητές φάσεις (χωρίς στήλη) όσο και για τον έλεγχο απόκρισης σήματος ουσιών με στήλη. Για την παρασκευή των διαλυμάτων τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τις αντίστοιχες μετρήσεις δίχως χρωματογραφική στήλη, ελήφθησαν 0.5ml από τα διαλύματα φάσης 3.1 και τοποθετήθηκαν σε κωνικές φιάλες όπου προστεθήκαν 9.5ml MeOH. Έτσι μετά την ανάμιξη προέκυψαν τα διαλύματα φάσης 3.2, συγκέντρωσης 20ng/ml. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη επίδρασης της φύσης και του ph της χρησιμοποιούμενης κινητής φάσης και του διαλύτη, παρασκευαστήκαν με τον ίδιο τρόπο όπως τα διαλύματα φάσης 3.1, με την διαφορά ότι η τελική αραίωση έγινε με την εκάστοτε κινητή φάση(η2ο, υδατικό διάλυμα φορμικού οξέος με ph 2.6, υδατικό διάλυμα NH3 με ph 10, MeOH και CH3CN), καταλήγοντας έτσι στην δημιουργία μιας πεντάδας διαλυμάτων για κάθε μελετούμενη ουσία(διαλύματα φάσης 3.3). Τέλος, για την παρασκευή των διαλυμάτων τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για τις μετρήσεις αναλογικότητας του προκύπτοντος σήματος με τον χρησιμοποιούμενο όγκο διαλύματος χρησιμοποιήθηκε το μεθανολικό διάλυμα βαρφαρίνης (warfarine) το οποίο παρασκευάζεται από το διάλυμα φάσης 2 της ουσίας. Από το διάλυμα αυτό(4μgr/ml), ελήφθη 73

75 1ml και τοποθετήθηκε σε ογκομετρική φιάλη των 250ml η οποία πληρώθηκε μέχρι της χαραγής με MeOH (διάλυμα φάσης 3.4 συγκέντρωσης 16ngr/ml). Ο στόχος παρασκευής τόσο αραιού διαλύματος ήταν να αξιολογηθεί η γραμμικότητα της απόκρισης(σε σχέση με τον όγκο έγχυσης) ακόμη και σε συγκεντρώσεις κοντά στο όριο ανίχνευσης του οργάνου. Στο σημείο αυτό αξίζει να αναφερθεί ότι τα διαλύματα παρασκευάστηκαν τμηματικά ανά εξάδες και όχι όλα μαζί, με στόχο να μην μεσολαβήσει περισσότερο από ένα 24ωρο από την στιγμή της ζύγισης μέχρι και τη μέτρηση των δειγμάτων στο LC-MS. Έτσι διασφαλίστηκε ότι η τυχόν αποικοδόμηση των φαρμακευτικών ουσιών εντός των διαλυμάτων θα είναι η ελάχιστη δυνατή, ώστε να μην επηρεασθούν τα λαμβανόμενα αποτελέσματα. 74

76 Εικ.25 Διάγραμμα διαδικασίας παρασκευής διαλυμάτων 75

77 Διαδικασία Μετρήσεων Δειγμάτων ακολούθως: Αρχικά έγινε ρύθμιση των βασικών παραμέτρων του φασματογράφου μαζών ως ροή του νεφελοποιητικού αερίου(nebulizing gas) στα 1,5 L min -1. η ροή του ξηραντικού αερίου(drying gas) στα 15 L min -1, η τάση στο ακροφύσιο ηλεκτροψεκασμού (capillary or interface voltage) στα - 3,5 KV θερμοκρασία συστήματος (interface temperature) ρυθμίστηκε στους 350 ο C τάση στην κυρτή γραμμή αποδιαλύτωσης (πριν την είσοδο στον θάλαμο κενού-desolvation line(dl) voltage) στα -25 V ταχύτητα σάρωσης(scan speed) ορίστηκε σε amu/sec και ο χρόνος δειγματοληψίας(event time) σε 0,05 sec. Στο στάδιο των μετρήσεων μικρή ποσότητα(~1ml) των τελικών διαλυμάτων μεταφέρθηκε σε υάλινα φιαλίδια, τα οποία αφού κλείστηκαν με ειδικά πώματα από καουτσούκ, τοποθετήθηκαν εντός του ψυχόμενου θαλάμου δειγματοληψίας. Για τις περιπτώσεις στις οποίες χρησιμοποιήθηκε στήλη, το σύστημα αφέθηκε να ισορροπήσει για περίπου 15~20 λεπτά πριν αρχίσει η έγχυση των δειγμάτων, ενώ για τις περιπτώσεις που δεν χρησιμοποιήθηκε στήλη ο αντίστοιχος χρόνος ισορροπίας του συστήματος ήταν περίπου 5 λεπτά. Η κατάσταση ισορροπίας του συστήματος θεωρείται ότι είχε επιτευχθεί όταν η διακύμανση των αποκλίσεων των καταγραφόμενων πιέσεων στις αντλίες του χρωματογράφου δεν ξεπερνούσαν τα 10psi. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε σε όλες τις μετρήσεις ώστε η ολική ροή της κινητής φάσης να μην ξεπεράσει τα 0.5ml/min, ώστε να δοθεί ο χρόνος στο σύστημα MS να εξατμίσει (με την 76

78 βοήθεια του ξηραντικού αερίου) την περίσσεια της κινητής φάσης. Αυτό είναι απαραίτητο, καθώς μεγάλη ποσότητα εισερχομένου διαλύτη μπορεί να βλάψει τον φασματογράφο μαζών. Επιπρόσθετα, στα συστήματα ESI-MS ροές μεγαλύτερες από 1ml/min, προκαλούν ελάττωση του λόγου σήματος-προς-θόρυβο.[4] Ακολούθως διενεργήθηκαν οι μετρήσεις: I. Στην περίπτωση των μετρήσεων με την χρήση χρωματογραφικής στήλης, ως κινητή φάση επιλέχθηκε το μίγμα CH3CN:H2O σε αναλογία 80:20 v/v. Αρχικά πραγματοποιήθηκε για κάθε ουσία (διαλύματα 3.1) μια μέτρηση σε διαδικασία καταγραφής πλήρους φάσματος (SCAN mode), επιλέγοντας ως περιοχή σάρωσης τιμές ±200 amu από το μοριακό βάρος της κάθε ουσίας. Δεν θεωρήθηκε σκόπιμο να χρησιμοποιηθεί μεγαλύτερο εύρος τιμών m/z διότι έτσι θα μειωνόταν ο αριθμός των σαρώσεων/sec, σε μη αποδεκτά επίπεδα(<15000 amu/sec). Επιπροσθέτως για την καλύτερη αξιοπιστία των αποτελεσμάτων αποφεύχθηκαν μετρήσεις κάτω του 80 m/z διότι σε χαμηλότερες τιμές αυξάνει υπέρμετρα ο θόρυβος υποβάθρου [37]. Σκοπός των μετρήσεων αυτών ήταν να προσδιορισθούν τα αρνητικά ιόντα, τα οποία προέκυπταν από τον ιονισμό των ουσιών. Ακολούθως, επιλέχθηκαν τα δυο ιόντα που έδιναν το ισχυρότερο σήμα και επαναπροσδιορίστηκαν με τη μέθοδο επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων SIM (selected ion monitoring). Αφού υπολογίστηκε το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη των κορυφών των ιόντων αυτών, μέσω ολοκλήρωσης, η μέτρηση επαναλαμβανόταν εις διπλούν και ο μέσος όρος των μετρήσεων αποτελούσε την τελική λαμβανόμενη απόκριση για κάθε παρατηρούμενο ιόν. II. Για τις μετρήσεις σε διαφορετική κινητή φάση δίχως στήλη, ως κινητή φάση επιλέχθηκε η εκάστοτε φάση στην οποία είχε γίνει η τελική διάλυση της προς ανάλυση ουσίας, δηλ. για μεθανολικό διάλυμα, η κινητή φάση ήταν μεθανόλη, για υδατικό, ύδωρ, κ.ο.κ. Διενεργήθηκαν απευθείας μετρήσεις σε SIM mode(διαλύματα φάσης 3.3), στην τιμή m/z στην οποία η κάθε μετρούμενη ουσία είχε δώσει το ισχυρότερο σήμα στις μετρήσεις δίχως στήλη (σε SCAN mode). Οι 77

79 μετρήσεις επαναλήφθηκαν τρεις φορές και ο μέσος όρος των τιμών των ολοκληρωμάτων τους έδωσε την τελική απόκριση για κάθε ουσία. III. Για τις μετρήσεις αναλογικότητας του προκύπτοντος σήματος με τον όγκο διαλύματος, χρησιμοποιήθηκε διάλυμα βαρφαρίνης (Warfarine) σταθερής συγκέντρωσης (διάλυμα 3.4) και κινητή φάση μίγμα CH3CN:H2O σε αναλογία 80:20 v/v, ενώ οι μετρήσεις διενεργήθηκαν σε m/z 307(μοριακό ιόν). Για κάθε όγκο έγχυσης έγιναν 3 επαναλήψεις και ο μέσος όρος της ολοκλήρωσης των κορυφών των τριών μετρήσεων έδωσε την τελική απόκριση σήματος. IV. Στην περίπτωση των μετρήσεων χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης, ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε το μίγμα MeOH:H2O σε αναλογία 90:10 v/v. Ομοίως με την πρώτη περίπτωση, διενεργήθηκε αρχικά για κάθε ουσία(διάλυμα 3.2) μια μέτρηση σε SCAN mode, επιλέγοντας ως περιοχή σάρωσης τιμές ±200 amu από το μοριακό βάρος της κάθε ουσίας. Τα ιόντα με το ισχυρότερο σήμα μετρήθηκαν στη συνέχεια (δυο επαναλήψεις) με SIM μέθοδο και ο μέσος όρος των ολοκληρωμάτων των μετρήσεων αυτών, αποτέλεσε την τελική λαμβανόμενη απόκριση. 8. Μελέτη επίδρασης φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών φαρμακομορίων στο λαμβανόμενο σήμα φασματογράφου μαζών με την χρήση χρωματογραφικής στήλης 8.1 Διεξαγωγή πειράματος Για την διεξαγωγή του πρώτου μέρους της πειραματικής διαδικασίας 103 διαλύματα (τύπου 3.1) των προς μελέτη ουσιών εγχύθηκαν (50 μl) σε στήλη C18 όπου και υπεβλήθησαν 78

80 στην διαδικασία του χρωματογραφικού διαχωρισμού με κινητή φάση CH3CN-H2O σε αναλογία 80:20 v/v. Προέκυψαν έτσι τα χρωματογράφηματα των ουσιών, στην συντριπτική πλειοψηφία των οποίων η κορυφή που αντιστοιχεί στην προς μελέτη ουσία (SIM mode) ήταν καλά διαχωρισμένη από το μέτωπο του διαλύτη. Η ύπαρξη κορυφής της κινητής φάσης οφείλεται σε τυχόν επιμολύνσεις των διαλυτών και του περιέκτη της ή του δείγματος κατά την διαδικασία παρασκευής του. Για τις περιπτώσεις εκείνες στις οποίες η χρωματογραφική κορυφή των παραγόμενων από την μετρούμενη ουσία ιόντων δεν ήταν καλά διαχωρισμένη από αυτήν του μετώπου του διαλύτη, πραγματοποιήθηκε η εξής διαδικασία: Σε τακτά χρονικά διαστήματα (κάθε 6 δείγματα ουσιών) εγχύονταν και ένα τυφλό δείγμα το οποίο περιείχε μόνο διαλύτη. Βάση των αποτελεσμάτων ήταν δυνατόν να διευκρινισθεί ποιες τιμές m/z της χρωματογραφικής κορυφής που προέκυπτε αφορούσαν τη κινητή φάση και ποιες τα ιόντα των προς ανάλυση μορίων. Αφού λοιπόν καθορίστηκαν τα προκύπτοντα από την μετρούμενη ουσία ιόντα, επελέγησαν τα δυο εξ αυτών, τα οποία έδιναν το ισχυρότερο σήμα. Τα ιόντα αυτά ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις τα αρνητικά μοριακά ιόντα των ουσιών [Μ-Η] -, ενώ ορισμένες φορές ανιχνεύτηκαν και ιόντα προσθήκης (adducts) του τύπου [M-H+Cl] - ή [Μ-H+Ac] -. Οι χρωματογραφικές κορυφές που προέκυψαν με τη μέθοδο SIM εξομαλύνθηκαν, (Smoothed) και στη συνεχεία ολοκληρώθηκαν, ενώ η κορυφή με το ισχυρότερο σήμα (μεγαλύτερο εμβαδό) επιλέχθηκε ως η τελική απόκριση της κάθε ουσίας. Τα φάσματα 12 εκ των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν στην δοκιμασία αυτή, παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ, σελ. Α-D. 8.2 Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ακολούθως, κατασκευάσθηκε πίνακας δεδομένων ο οποίος περιέχει 49 φυσικοχημικές ιδιότητες (Πιν. 7, Παράρτημα Ι,) και δομικά χαρακτηριστικά (Πιν. 8, Παράρτημα Ι) για καθεμιά 79

81 από τις 103 ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στις μετρήσεις. ελήφθησαν: Οι φυσικοχημικές ιδιότητες a) από τον ιστότοπο ChemSpider χρησιμοποιώντας το λογισμικό ACD/Labs Percepta Platform σε PhysChem Mode, εκτός από την διαλυτότητα σε ύδωρ(water solubility), η οποία προέκυψε με την χρήση του λογισμικού EPI Suite, b) από τον ιστότοπο Chemicalize.org, από όπου ελήφθησαν και οι πληροφορίες για τα δομικά χαρακτηριστικά των ενώσεων. Εικ. 26 Ταξινόμηση φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών των ενώσεων, που χρησιμοποιήθηκαν στις μετρήσεις Το ποσοστό ιονισμού σε ph 6.5 (στο οποίο έγιναν οι μετρήσεις), υπολογίσθηκε για κάθε ουσία (Πιν. 13, Παράρτημα Ι), χρησιμοποιώντας την εξίσωση Henderson-Hasselbach, με βάση τις τιμές pka που ελήφθησαν από το Chemicalize.org. 80

82 Εν συνεχεία, οι τελικές αποκρίσεις των ουσιών (Πιν. 9, Παράρτημα Ι) ενσωματώθηκαν στον συνολικό πίνακα δεδομένων και επιχειρήθηκε να γίνει εκτίμηση της σημαντικότητας των διαφόρων δομικών και φυσικοχημικών ιδιοτήτων των προς ανάλυση φαρμακευτικών ουσιών ως προς την ένταση του σήματος κατά την ανίχνευση τους με ESI-MS. Η εκτίμηση έγινε με την βοήθεια του προγράμματος ανάλυσης πολυπαραμετρικών συστημάτων PLS. Για την αξιολόγηση της σημαντικότητας της επίδρασης των διαφόρων μεταβλητών στο λαμβανόμενο σήμα, έγινε αρχικά εισαγωγή των δεδομένων των πινάκων 7 και 8(Παράρτημα Ι) που περιέχουν τις φυσικοχημικές και δομικές ιδιότητες των μελετώμενων φαρμακομορίων(observations). Οι μεταβλητές αυτές ορίσθηκαν στο συνολικό μοντέλο ως Χ (ανεξάρτητες μεταβλητές). Επίσης, εισήχθησαν τα ολοκληρώματα των εμβαδών των σημάτων του Πιν. 9(Παράρτημα Ι) τα οποία έδωσαν οι ουσίες στον φασματογράφο μαζών, μετά την έκλουση τους από την χρωματογραφική στήλη και αποτέλεσαν την εξαρτημένη μεταβλητή Υ. Επειδή υφίσταται το ενδεχόμενο οι μεταβλητές που χρησιμοποιούνται να παίρνουν τιμές διαφορετικής τάξης μεγέθους(και άρα αυτές με τις μεγαλύτερες τιμές να έχουν μεγαλύτερη βαρύτητα στην διαμόρφωση του μοντέλου), κρίθηκε απαραίτητη η κανονικοποίηση των τιμών των μεταβλητών. Η κανονικοποίηση αυτή έγινε με την μέθοδο της διακύμανσης μονάδας(unit Variance, UV), στην οποία οι τιμές των μεταβλητών διαιρούνται με την τυπική τους απόκλιση, με αποτέλεσμα μια ισοδύναμη διακύμανση για όλες τις μεταβλητές, οι οποίες πλέον έχουν και ισοδύναμη επίδραση στο μοντέλο. Επίσης, η προεπεξεργασία των δειγμάτων περιλαμβάνει και το στάδιο του κεντραρίσματος των τιμών των παρατηρήσεων, διαδικασία που πραγματοποιείται με αφαίρεση από τον μέσο όρο, των τιμών της αντίστοιχης μεταβλητής(mean-centering). Μετά την επεξεργασία των δεδομένων από το πρόγραμμα, προέκυψαν οι συσχετίσεις για τον δεδομένο αριθμό μεταβλητών(49 Variables) και παρατηρήσεων(103 Observations). Όπως φαίνεται από την κάτωθι εικόνα (Εικ. 27), η συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων στο μοντέλο Μ2 δεν είναι ικανοποιητική (R 2 Υ=0.504) και η ικανότητα πρόβλεψης του συστήματος ανεπαρκής(q 2 =0.254). Χαρακτηριστικό είναι επίσης ότι τα αποτέλεσμα της συσχέτισης δεν βελτιώθηκαν ουσιαστικά, ακόμα και μετά την αφαίρεση σημαντικού αριθμού μεταβλητών 81

83 (μικρότερης σημαντικότητας) ή έκτοπων παρατηρήσεων(outliers), οι οποίες είχαν σημαντικά αρνητική επίδραση στην γραμμικότητα του συστήματος. Έτσι, μετά την αφαίρεση 15 παρατηρήσεων και 6 μεταβλητών οι βέλτιστες τιμές βέλτιστες τιμές που μπορούσε να αποδώσει το μοντέλο Μ8 ήταν R 2 Υ =0.728 και Q 2 = Εικ. 27 Ικανότητα συσχέτισης και προβλεψιμότητα μοντέλου, μεταβαλλόμενου του αριθμού των παρατηρήσεων και των μεταβλητών Κρίθηκε λοιπόν αναγκαία η περαιτέρω επεξεργασία των δεδομένων και η εισαγωγή τους στο μοντέλο υπό διαφορετική μορφή ώστε να προκύψει ικανοποιητικός βαθμός συσχέτισης. Επειδή σημαντικό ρόλο στην διαδικασία συσχέτισης παίζουν οι τιμές Υ, θεωρήθηκε σκόπιμο να τροποποιηθούν, σε τιμές δεκαδικού λογάριθμου(log 10 x) ή τέταρτης 4 ρίζας( x), οι ολοκληρώσεις των εμβαδών των σημάτων (Πιν. 9, Παράρτημα Ι). Τα δεδομένα αυτά επανεισήχθησαν στο πρόγραμμα PLS και ακολουθώντας την προαναφερθείσα διαδικασία υπολογίστηκαν εκ νέου οι συσχετίσεις μεταξύ των δεδομένων του συστήματος. Για την περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν οι λογάριθμοι των τιμών των σημάτων αρχικά προέκυψε το μοντέλο Μ2 (Εικ. 28)με τιμές R 2 Υ =0.521 και Q 2 = Μετά από την αφαίρεση αριθμού ακραίων τιμών(15 Observations) και μη σημαντικών μεταβλητών (5 Variables), ελήφθησαν αρκετά ικανοποιητικότερες τιμές συσχέτισης R 2 Υ=0.798 και προβλεψιμότητας Q 2 =0.62 (μοντέλο Μ9). 82

84 Εικ. 28 Ικανότητα συσχέτισης και προβλεψιμότητα μοντέλου με Υ λογαρίθμους, μεταβαλλόμενου του αριθμού των παρατηρήσεων και των μεταβλητών Για την περίπτωση που χρησιμοποιήθηκαν οι τέταρτες ρίζες των τιμών των σημάτων (Εικ.29) στο καινούργιο μοντέλο Μ2 προέκυψαν οι τιμές R 2 Υ=0.536 για την συσχέτιση και Q 2 =0.324 για την δυνατότητα πρόβλεψης. Ομοίως και εδώ, μετά την αφαίρεση παρεμφερούς αριθμού ακραίων τιμών(17 Observations) και μη σημαντικών μεταβλητών(7 Variables), προέκυψε το μοντέλο Μ10 της Εικ. 29 με πολύ ικανοποιητικές τιμές συσχέτισης και προβλεψιμότητας, ήτοι R 2 Υ=0.833 και Q 2 =0.704 [76]. Εικ. 29 Μοντέλα συσχέτισης των Χ με το σήμα απόκρισης Υ και στατιστικά χαρακτηριστικά τους 83

85 Καθίσταται λοιπόν εμφανές πως η βέλτιστη μέθοδος, για την παραγωγή μοντέλου το οποίο θα δίνει την καλύτερη συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων και την βέλτιστη ικανότητα πρόβλεψης, είναι η εισαγωγή των τιμών των σημάτων υπό μορφή τέταρτης ρίζας, όπως εμφαίνεται και στον κάτωθι πίνακα(πιν. 1). Πιν. 1. Σύνοψη βέλτιστων δεδομένων και αποτελεσμάτων στο πείραμα στο οποίο χρησιμοποιήθηκε στήλη (σήμα, τέταρτη ρίζα σήματος, δεκαδικός λογάριθμος σήματος). PLS parameters C18 column x log_10 x observations components X variables R 3 0,728 0,833 0,798 Q 3 0,374 0,704 0,62 No of variables excluded No of observations excluded Η αξιοπιστία του μοντέλου επιβεβαιώνεται και από την μικρή απόκλιση των παρατηρήσεων από την βέλτιστη ευθεία του διαγράμματος συσχέτισης προβολών των Χ ως προς το Υ (Εικ. 30). PLS with column (C18)] SD 2 SD t[1] SD 3 SD u[1] Εικ. 30 Διάγραμμα συσχέτισης μεταξύ μεταβλητών Χ και λαμβανομένου σήματος Υ 84

86 8.3 Αξιολόγηση επιδρωσών παραμέτρων Στο ραβδόγραμμα προβολής σημαντικότητας VIP (Variables Importance Projection) του διαγράμματος 1 παρουσιάζονται 42 μεταβλητές που αναφέρονται σε δομικά χαρακτηριστικά και φυσικοχημικές ιδιότητες των προσδιοριζόμενων ουσιών κατά φθίνουσα σειρά σημαντικότητας. Οι μεταβλητές με τους υψηλότερους συντελεστές (Πιν. 2) βάση του μοντέλου Μ10 συντελούν περισσότερο στη διαμόρφωση σήματος αρνητικών ιόντων με τη μέθοδο ηλεκτροψεκασμού. VIP[2] 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 pka Ionization Polar Sur SO2 oxygen ato HBA S COOH Surface Te 1LogP HBD CO, COO, logd NO2 benzene CH3 on rin NH Predicted NH2 No of side N atoms halogens CO Molar volu N tertiary FRB Polarizabi Refractivi Cl all rings F 2LogP Solvent ac arom heter cyclo_hete volume Var ID (Primary) I COO Br heterocycl M.W. Διάγραμμα 1 Ακολούθως, στο διάγραμμα 2 παρουσιάζεται η θετική ή αρνητική επίδραση κάθε μεταβλητής στο προαναφερθέν σύστημα. CoeffCS[2](4root) 0,20 CoeffCS[2](4root) 0,10 0,00-0,10-0,20 Ionization SO2 COOH S NO2 oxygen ato Polar Sur CO, COO, CH3 on rin logd HBA Surface Te NH 2LogP No of side Cl COO CO benzene M.W. halogens arom heter F 1LogP HBD cyclo_hete all rings heterocycl volume Br Refractivi Polarizabi Solvent ac Molar volu N atoms FRB NH2 N tertiary Predicted pka I Var ID (Primary) Διάγραμμα 2 85

87 Πίν. 2 Πίνακας VIP τιμών των Χ μεταβλητών Var ID (Primary) VIP[2] Var ID (Primary) VIP[2] pka halogens Ionization CO Polar Surface Area Molar volume SO N tertiary oxygen atoms FRB HBA Polarizability S Refractivity COOH Cl Surface Tension all rings LogP F HBD LogP CO, COO,COOH Solvent accessible area logd arom hetero rings NO cyclo_hetero rings Benzene rings volume CH3 on rings I NH COO Predicted water solubility Br

88 NH Heterocyclic rings No of side chains M.W N atoms Στην περίπτωση λοιπόν που μελετάμε τη διαμόρφωση σήματος με χρήση στήλης προκύπτει ότι ο σημαντικότερος παράγοντας είναι η τιμή pka(vip=2.3) των όξινων ομάδων των φαρμακευτικών ουσιών. Καθώς το pka και ο βαθμός ιονισμού (στο ph 6.5 στο οποίο έλαβε χώρα η μέτρηση) των ουσιών αυτών σχετίζονται μεταξύ τους αντίστροφα συνεπάγεται ότι και ο βαθμός ιονισμού(vip=1.9) είναι αντίστοιχα σημαντικός. Παρατηρούμε δηλαδή ότι όσο μικρότερο είναι το pka μιας ουσίας και επομένως όσο μεγαλύτερος ο βαθμός ιονισμού της σε ph 6.5, τόσο μεγαλύτερο είναι το προκύπτον σήμα. Η ερμηνεία του αποτελέσματος αυτού έγκειται στο γεγονός ότι τα προϋπάρχοντα ιόντα τα οποία βρίσκονται στην υγρή φάση του διαλύματος, σε αντίθεση με τα ουδέτερα μόρια, μετατρέπονται ευκολότερα σε ιόντα αερίου φάσεως. Επίσης, εύλογα συμπεραίνουμε ότι τα μόρια τα οποία δεν βρίσκονται σε ιονισμένη μορφή στο διάλυμα, αλλά έχουν μικρό pka, διαθέτουν θέσεις εύκολης αποπρωτονίωσης και έτσι είναι εύκολη η μετατροπή τους σε ιόντα αέριας φάσης σε συνθήκες ESI. Η πολική επιφανειακή έκταση(polar Surface Area-PSA) (VIP=1.8), οριζόμενη ως το άθροισμα των εμβαδών των επιφανειών όλων των πολικών ατόμων του μορίου, έχει σαφή αυξητική επίδραση στο λαμβανόμενο σήμα. Το γεγονός αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το ότι οι ενώσεις που περιέχουν πολικά άτομα(όπως το οξυγόνο και το άζωτο) έχουν τα άτομα αυτά ενσωματωμένα σε ομάδες που εύκολα φορτίζονται αρνητικά(-no2,-cooh,-so2,-oh) δίδοντας μοριακά ιόντα που ανιχνεύονται εύκολα σε αρνητικό ιονισμό(negative ionization mode). Μια επίσης πιθανή εξήγηση είναι ότι σύμφωνα με το μοντέλο του Fenn, ενδέχεται να υποβοηθάται η αρχική πρόσδεση των μορίων των προσδιοριζόμενων ουσιών σε μόρια του (πολικού) διαλύτη, τα οποία βρίσκονται κοντά στην επιφάνεια του σταγονιδίου, αυξάνοντας έτσι την πιθανότητα το μόριο να αποσπαστεί τελικά από το σταγονίδιο. 87

89 Σημαντικότατη είναι επίσης και η ύπαρξη ομάδων SO2 (VIP=1.7) ή ομάδων NO2(VIP=0.99), η παρουσία των οποίων οδηγεί σε παραγωγή μεγάλου σήματος. Η ισχυρή αυτή απόκριση εξηγείται λόγω ύπαρξης του ηλεκτρονιόφιλου οξυγόνου στην ομάδα SO2, η οποία βοηθά στην παραγωγή αρνητικών ιόντων. Έτσι γίνεται αντιληπτή και η προκύπτουσα, βάσει του PLS, σημαντικότητα της ύπαρξης ή ατόμων οξυγόνου(vip=1.5) ή ατόμων S(VIP=1.4) στο φαρμακομόριο (θετική επίδραση). Ιδιαίτερα σημαντική είναι και η ύπαρξη καρβοξυλικών ομάδων COOH με VIP τιμή 1.4. Η θετική επίδραση που παρατηρείται στο σήμα θεωρείται φυσιολογική, εφόσον η ύπαρξη των ομάδων αυτών καθιστά τα φαρμακομόρια οξέα, τα οποία εύκολα δίδουν αρνητικά φορτισμένα ιόντα. Οι αποδέκτες δεσμών υδρογόνου (hydrogen bond acceptors-hba) (VIP=1.4) και οι δότες δεσμών υδρογόνου (hydrogen bond donors-hbd) (VIP=1.2) φαίνεται επίσης να αυξάνουν το σήμα. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται στο ότι οι περισσότερες ομάδες οι οποίες λειτουργούν ως ΗΒA ή HBD όπως το COOH και το ΟΗ, έχουν θετική επίδραση στο λαμβανόμενο σήμα. Η αύξηση της επιφανειακής τάσης (VIP=1.3) των μελετούμενων μορίων φαίνεται να έχει επίσης ισχυρά θετική επίδραση στο προκύπτον σήμα που λαμβάνεται από τον φασματογράφο μάζας. Επειδή η ιδιότητα αυτή περιγράφει την συμπεριφορά της ουσίας όταν βρίσκεται σε στερεά κατάσταση και όχι σε μοριακή διάλυση μέσα στη σταγόνα του διαλύτη είναι πιθανό να μη σχετίζεται με το φαινόμενο. Δηλαδή όταν η εξεταζόμενη ουσία μεταβαίνει, σύμφωνα με τα διάφορα μοντέλα, από την υγρή στην αέρια φάση είναι σε μοριακή μορφή και δεν επηρεάζεται από δυνάμεις συνοχής που υφίστανται από άλλα γειτονικά ομοειδή μόρια. Άρα σε αυτή την περίπτωση δεν έχουμε επιφανειακή τάση στερεού. Από την άλλη πλευρά αν δεχτούμε ότι η ιδιότητα αυτή του στερεού επηρεάζει έμμεσα τη συμπεριφορά του διαλύματος στο οποίο βρίσκεται, τότε θα πρέπει να θεωρήσουμε ότι μια επιβράδυνση διαμοιρασμού μιας σταγόνας σε μικρότερα σταγονίδια ευνοεί, πιθανόν λόγω χρονικής καθυστέρησης, το σχηματισμό περισσότερων φορτισμένων ιόντων [68, 69]. 88

90 Η λιποφιλικότητα εκφρασμένη ως συντελεστής logd(vip=1.1), έχει σαφή θετική επίδραση στο σήμα που δίνουν τα φαρμακομόρια στον φασματογράφο. Η τάση αυτή μπορεί να ερμηνευθεί με το μοντέλο του Fenn[34], καθώς τα λιγότερο πολικά μόρια μπορούν να φύγουν ευκολότερα από το σταγονιδίου του πολικού διαλύτη λόγω διαφοράς πολικότητας. Αντίστοιχη ερμηνεία δίνεται και από το μοντέλο ΙΕΜ, σύμφωνα με το οποίο η τοποθέτηση των λιγότερο πολικών ιόντων κοντύτερα στην επιφάνεια του σταγονιδίου τα καθιστά περισσότερο επιρρεπή στην αποβολή τους από το σταγονίδιο[33]. Η θετική επίδραση της αύξησης της λιποφιλικότητας στο παραγόμενο σήμα μπορεί να εξαχθεί και από την επίδραση της τιμής logp(vιp=1.3), καθώς αυτή αποτελεί μέτρο της λιποφιλικότητας του μορίου, ανεξαρτήτως ph του διαλύματος. Η ύπαρξη βενζολικών δακτυλίων (VIP=0.97) φαίνεται επίσης να συνεισφέρει στην αύξηση του σήματος. Το γεγονός αυτό μπορεί να ερμηνευτεί από το ότι η αύξηση βενζολικών δακτυλίων σε ένα μόριο αυξάνει την λιποφιλικότητα του. Για τον ίδιο λόγο η ύπαρξη μεγάλου αριθμού υποκαταστατών CH3(VIP=0.9) στους δακτυλίους των φαρμακομορίων έχουν θετική επίδραση στο σήμα. Τέλος, η ύπαρξη ομάδων ΝΗ(VIP=0.9) φαίνεται να έχει και αυτή θετική επίδραση στο σήμα, ιδιαίτερα όταν βρεθεί κοντά σε ομάδα ή άτομο που είναι ισχυρός δέκτης ηλεκτρονίων (π.χ >C=O). Τότε η ομάδα -ΝΗ μπορεί να γίνει όξινη απελευθερώνοντας το Η και προκαλώντας την αρνητική φόρτιση του φαρμακομορίου. 89

91 9. Μελέτη επίδρασης του όγκου εγχύσεως στο εμβαδό του λαμβανομένου σήματος Για την μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε μεθανολικό διάλυμα βαρφαρίνης (Warfarin) συγκέντρωσης 16 ngr/ml (διάλυμα φάσης 3.4). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χωρίς την ύπαρξη στήλης (FIA), με κινητή φάση διάλυμα CH3CN-H2O, 80:20 v/v και με την χρήση διαφορετικών όγκων έγχυσης(injection volumes) ουσίας. Οι λαμβανόμενες κορυφές που ελήφθησαν σε m/z 307, με SIM μέθοδο και αρνητικό ιονισμό, αντιστοιχούν στο μοριακό ιόν της βαρφαρίνης (Παράρτημα ΙΙΙ, σελ. H). Οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν για κάθε όγκο έγχυσης και υπολογίστηκε ο μέσος τους. Τα ολοκληρώματα των εμβαδών των λαμβανομένων σημάτων παρουσιάζονται πίνακα 3a: Πιν. 3a Ολοκληρώματα εμβαδών σήματος βαρφαρίνης σε διαφορετικούς όγκους έγχυσης vol(μl) Πρώτη έγχυση Δεύτερη έγχυση Τρίτη έγχυση Μέσος όρος Με βάση την αρχή των ελαχίστων τετραγώνων χαράχθηκε καμπύλη αναφοράς με ικανοποιητική γραμμικότητα (R 2 = 0.998) όπως φαίνεται και στο διάγραμμα 5. Η στατιστική επεξεργασία (Πιν. 3b) των δεδομένων διενεργήθηκε με την χρήση του πακέτου Regression analysis που βρίσκεται ενσωματωμένο στο Microsoft Excel. Έτσι, από τα αποτελέσματα που παρατίθενται στον πίνακα 3b μπορούμε να συμπεράνουμε ότι υπάρχει αναλογική συσχέτιση μεταξύ του χρησιμοποιουμένου όγκου έγχυσης και του λαμβανομένου σήματος-εμβαδού. 90

92 injection volume(μl) y = x Εμβαδον Διάγραμμα 5 Πιν. 3b Στατιστικά στοιχεία της καμπύλης αναφοράς της συσχέτισης όγκου έγχυσης με εμβαδόν επιφάνειας βαρφαρίνης Στατιστικά παλινδρόμησης Πολλαπλό R R Τετράγωνο Τυπικό σφάλμα Μέγεθος 1 δείγματος ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΙΑΚΥΜΑΝΣΗΣ βαθμοί SS MS F ελευθερίας Παλινδρόμηση 4 1,63E+10 4,08E Υπόλοιπο Σύνολο 6 1,63E+10 91

93 10. Συσχέτιση φύσης κινητής φάσης και λαμβανομένου σήματος Στο επόμενο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας επιχειρήθηκε να συσχετισθεί η φύση της κινητής φάσης με το λαμβανόμενο σήμα επιλεγμένων ουσιών στο LC-MS. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν οι ουσίες warfarine, allopurinol, tolbutamide, sulphisoxazole, piroxicam, meloxicam, glipizide, theophylline, phenobarbital, chloramphenicol, thiocolchicoside για τις οποίες ως λαμβανόμενα σήματα υπολογίστηκαν τα ολοκληρώματα των εμβαδών των μοριακών τους ιόντων[m-η] -. Ιδιαίτερα για τη cimetidine, λόγω διαφορετικής συμπεριφοράς, ως λαμβανόμενο σήμα χρησιμοποιήθηκε το ολοκλήρωμα του εμβαδού του χλωριωμένου μοριακού της ιόντος[m+cl] -. Οι κινητές φάσεις οι οποίες επελέχθησαν για την διεξαγωγή των μετρήσεων ήταν Η2Ο με ph 6.5, υδατικό διάλυμα φορμικού οξέος σε ph 2.6, υδατικό διάλυμα NH3 σε ph 10, μεθανόλη(meoh) και ακετονιτρίλιο(ch3cn). Ιδιαίτερη μέριμνα ελήφθη προκειμένου ο διαλύτης των δειγμάτων να έχει την ίδια φύση με τη κινητή φάση ώστε να υπάρξουν ελάχιστες παρεμβολές από αυτόν. Έτσι χρησιμοποιήθηκαν τα μεθανολικά διαλύματα της φάσης 3.1 στην περίπτωση που κινητή φάση ήταν η μεθανόλη, ενώ για τις υπόλοιπες περιπτώσεις η τελική αραίωση (σε φιάλη των 10ml) πραγματοποιήθηκε σε διαλύτη όμοιο με την εκάστοτε χρησιμοποιούμενη κινητή φάση (διαλύματα φάσης 3.3). Τα φάσματα αυτά παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ (σελ. I-L). Για την ολοκλήρωση της μελέτης, διενεργήθηκαν τρεις μετρήσεις σε κάθε κινητή φάση (σε ορισμένες περιπτώσεις στις οποίες κρίθηκε σκόπιμο έγινε και τέταρτη μέτρηση), χρησιμοποιώντας 50μl από κάθε διάλυμα και ελήφθη ο μέσος όρος των ολοκληρωμάτων των εμβαδών (Πιν. 4). Πιν. 4 Ολοκληρώματα εμβαδών σημάτων 13 ουσιών για διαφορετικές κινητές φάσεις [M-Η] - H2O formic NH3 MeOH CH3CN warfarine

94 Μ.Ο Σχετικές εντάσεις allopurinol Μ.Ο Σχετικές εντάσεις tolbutamide Μ.Ο Σχετικές εντάσεις sulphisoxazole Μ.Ο Σχετικές εντάσεις piroxicam Μ.Ο Σχετικές εντάσεις meloxicam Μ.Ο Σχετικές εντάσεις glipizide Μ.Ο Σχετικές εντάσεις

95 theophylline Μ.Ο σχετικές εντάσεις 2 2 0, phenobarbital Μ.Ο Σχετικές εντάσεις chloramphenicol Μ.Ο σχετικές εντάσεις thiocolchicoside Μ.Ο σχετικές εντάσεις cimetidine [M+Cl] Μ.Ο σχετικές εντάσεις Στην τελευταία γραμμή των δεδομένων κάθε ουσίας, παρατίθενται οι σχετικές εντάσεις των σημάτων τους, κανονικοποιημένες ως προς την μικρότερη εκ των παρατηρουμένων εντάσεων. Κάτωθι παρατίθεται επίσης το γράφημα το οποίο συνοψίζει τα αποτελέσματα του Πιν

96 H2O formic NH3 MeOH AcCN Διάγραμμα 6 Από το διάγραμμα προκύπτει ότι για όλες τις μετρούμενες ουσίες οι σημαντικά μεγαλύτερες εντάσεις σημάτων παρατηρούνται στις περιπτώσεις που ως κινητή φάση χρησιμοποιείται η MeOH (με εξαίρεση την thiocolchicoside στην οποία ελαφρώς μεγαλύτερο σήμα δίνει το CH3CN). Διαπιστώνεται επίσης ότι η ένταση των σημάτων ελαττώνεται κατά την σειρά MeOH>CH3CN>Η2Ο. Το γεγονός αυτό είναι αναμενόμενο, αφού κατά τον ηλεκτροψεκασμό κινητές φάσεις με μικρή επιφανειακή τάση και/ή μικρό ιξώδες ευνοούν τον σχηματισμό μικρών σταγονιδίων, τα οποία διευκολύνουν τον ιονισμό των αναλυόμενων μορίων και οδηγούν στην λήψη μεγαλύτερων σημάτων. Εφόσον λοιπόν για τις επιφανειακές τάσεις και τα ιξώδη των κινητών φάσεων που χρησιμοποιούνται ισχύει ότι ξmeoh <ξch3cn <ξη2ο και γmeoh <γch3cn <γη2ο, υπάρχει απόλυτη συμφωνία των πειραματικών δεδομένων με την θεωρητική προσέγγιση[37]. Τέλος, διαπιστώνεται ότι η μεταβολή του ph επηρεάζει ελαφρώς τις εντάσεις των λαμβανομένων σημάτων των φαρμακομορίων, κατά τρόπο όμως μη προβλέψιμο. Έτσι, για τις ουσίες cimetidine, thiocolchicoside, chloramphenicol, phenobarbital, tolbutamide warfarine και allopurinol το μεγαλύτερο σήμα ελήφθη με την χρήση υδατικού διαλύματος με ph 6.5 ενώ 95

97 στις περιπτώσεις των theophylline, glipizide, meloxicam και piroxicam το μεγαλύτερο σήμα ελήφθη με την χρήση υδατικού διαλύματος φορμικού οξέος με ph 2.6. Τέλος στην περίπτωση της sulphisoxazole το μεγαλύτερο σήμα ελήφθη με την χρήση υδατικού διαλύματος NH3 με ph 10 [21]. Η (μη αναμενόμενη) ευνοϊκότερη επίδραση του όξινου περιβάλλοντος σε σχέση με το βασικό, μπορεί να εξηγηθεί με βάση το γεγονός ότι καθοριστικός παράγοντας στο ESI είναι οι χημικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα στην επιφάνεια των σταγονιδίων ηλεκτροψεκασμού και όχι στην κινητή φάση. Πιο συγκεκριμένα, σε ένα οξινισμένο διάλυμα ύδατος που υφίσταται ηλεκτροψεκασμό, το μέσο οξίνισης (π.χ. το HCOOH) υφίσταται διάσταση προς δημιουργία πρωτονίων και του αντιστοίχων ανιόντων. Η συνηθέστερη τύχη των πρωτονίων αυτών σε συνθήκες negative ESI είναι να αναχθούν προς δημιουργία αεριού Η2. Το αποτέλεσμα είναι η ύπαρξη περίσσειας ανιόντων (HCOO-), τα οποία απωθούνται από το ακροφύσιο του τριχοειδούς και διατάσσονται στην επιφάνεια των σταγονιδίων ηλεκτροψεκασμού. Τα ανιόντα αυτά αποσπούν πρωτόνια από τις όξινες ομάδες των προς ανάλυση ουσιών, που βρίσκονται μέσα στη σταγόνα, οδηγώντας στην αρνητική φόρτιση των μορίων τους(δημιουργία [Μ-Η] - ). Το μικρό μέγεθος των ανιόντων του μέσου οξίνισης συντελεί θετικά στην εμφάνιση του φαινομένου αυτού. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η αύξηση του αριθμού των δημιουργούμενων φαρμακομορίων-ανιόντων και η συνακόλουθη αύξηση του παραγόμενου σήματος[77]. 96

98 11. Μελέτη επίδρασης φυσικοχημικών και δομικών χαρακτηριστικών φαρμακομορίων στο λαμβανόμενο σήμα φασματογράφου μαζών δίχως την χρήση χρωματογραφικής στήλης-(flow Injection Analysis-FIA) 11.1 Διεξαγωγή πειράματος Για την διεξαγωγή της μελέτης, παρασκευάσθηκαν 70 διαλύματα (τύπου 3.2) των ουσιών που παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙ. Τα διαλύματα προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ως κινητή φάση μίγμα MeOH-H2O, 90:10 v/v, ενώ ανά τακτά χρονικά διαστήματα (ανά 6 δείγματα) γινόταν έγχυση τυφλού(κινητή φάση). Ο φασματογράφος μαζών ρυθμίστηκε αρχικά σε διαδικασία μέτρησης πλήρους φάσματος (SCAN mode) και η περιοχή ανίχνευσης σε ένα εύρος m/z ΜΒ ±200 amu (για την κάθε μετρούμενη ένωση). Στα διαγράμματα που προέκυψαν παρατηρήθηκε μια οξεία κορυφή η οποία εμφανίζονταν πολύ γρήγορα (συνήθως εντός μερικών δευτερολέπτων), η οποία θεωρείται φυσιολογική δεδομένης της μη ύπαρξης χρωματογραφικής στήλης. Εν συνεχεία, επιλέχθηκαν τα δυο επικρατέστερα ιόντα για κάθε ουσία (συνήθως [Μ-Η] -, και σπανιότερα adducts του τύπου [M-H+Cl] - ή [Μ-H+Ac] - ) και διενεργήθηκαν δυο μετρήσεις για καθένα από αυτά σε SIM μέθοδο. Οι κορυφές που προέκυψαν ομαλοποιήθηκαν (smoothed) και ολοκληρώθηκαν. Το ισχυρότερο σήμα (μεγαλύτερο εμβαδό) χαρακτηρίστηκε ως η τελική απόκριση της κάθε ουσίας. Τα φάσματα 12 εκ των ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν στην δοκιμασία αυτή παρουσιάζονται στο Παράρτημα ΙΙΙ (σελ. E-G). Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφερθεί πως οι αποκρίσεις οι οποίες παρατηρήθηκαν στην περίπτωση της FIA είναι σημαντικά μεγαλύτερες από αυτές οι οποίες ελήφθησαν με τη χρησιμοποίηση στήλης (πολλές φορές ακόμη και κατά μια τάξη μεγέθους). Η επίδραση αυτή 97

99 δεν είναι δυνατόν να υπολογισθεί επακριβώς, λόγω της πολυπλοκότητας των πειραμάτων και της ύπαρξης πολλών και διαφορετικών κινητών φάσεων Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ακολούθως, δημιουργήθηκε πίνακας δεδομένων ο οποίος περιέχει 49 φυσικοχημικές ιδιότητες και δομικά χαρακτηριστικά για καθεμιά από τις 70 ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στις μετρήσεις (Πιν. 10 και 11, Παράρτημα Ι). Οι τελικές αποκρίσεις των ουσιών ενσωματώθηκαν στον Πιν. 12(Παράρτημα Ι) και στη συνέχεια επιχειρήθηκε να γίνει εκτίμηση της σημαντικότητας των διαφόρων δομικών και φυσικοχημικών ιδιοτήτων τους στην ένταση απόδοσης σήματος. Η εκτίμηση έγινε με την βοήθεια του προγράμματος ανάλυσης πολυπαραμετρικών συστημάτων PLS. Για την αξιολόγηση της σημαντικότητας του συστήματος ορίσθηκαν ως ανεξάρτητες μεταβλητές(variables) Χ οι φυσικοχημικές και δομικές ιδιότητες των φαρμακομορίων. Τα ολοκληρώματα των εμβαδών των σημάτων τα οποία έδωσαν οι ουσίες(observations) στον φασματογράφο μάζας, αποτέλεσαν την εξαρτημένη μεταβλητή Υ. Ακολούθως, έγινε κανονικοποίηση των μεταβλητών με την μέθοδο διακύμανσης μονάδας(unit Variance, UV) και κεντράρισμα των τιμών των παρατηρήσεων με την μέθοδο mean-centering. Εν συνεχεία και μετά την επεξεργασία των δεδομένων από το πρόγραμμα, προέκυψαν οι συσχετίσεις για 48 μεταβλητές (η μεταβλητή που αναφέρεται στην παρουσία ατόμου ιωδίου στο μόριο αφαιρέθηκε ως μη σημαντική) και 70 παρατηρήσεων. Όπως φαίνεται στην Εικ. 31 τόσο η συσχέτιση μεταξύ των δεδομένων για το μοντέλο Μ2 (R 2 Y=0.513) όσο και η ικανότητα πρόβλεψης του συστήματος(q 2 =0.22) δεν είναι ικανοποιητικές. Για τον λόγο αυτό αφαιρέθηκαν 8 μεταβλητές (Variables) μικρής σημαντικότητας, και 8 έκτοπες παρατηρήσεις(outliers). Μετά την αναπροσαρμογή του μοντέλου, τα νέα αποτελέσματα τα οποία θεωρούνται σαφώς βελτιωμένα είναι R 2 Y=0.823 και Q 2 =0.601 (μοντέλο Μ11). 98

100 Εικ. 31 Μοντέλα συσχέτισης των Χ με το σήμα απόκρισης Υ και στατιστικά χαρακτηριστικά τους Στη συνέχεια επιχειρήθηκε, για περαιτέρω βελτίωση των μοντέλων, να αντικατασταθούν οι τιμές του Υ με τις αντίστοιχες λογαριθμικές ή τις τέταρτες ρίζες των ολοκληρωμάτων των σημάτων (Πιν. 12 του Παραρτήματος Ι). Στην περίπτωση χρήσης λογαρίθμων, το μοντέλο Μ2 (Εικ. 32) έδωσε αρκετά βελτιωμένα αποτελέσματα. Για να επιτευχθούν όμως καλύτερες συσχετίσεις και ικανότητα πρόβλεψης αφαιρέθηκαν 6 παρατηρήσεις και 6 μεταβλητές, δίνοντας το μοντέλο Μ6 (R 2 Y=0.808 και Q 2 =0.744). Οι τιμές αυτές χαρακτηρίζονται ως ικανοποιητικές, καθώς δίνουν καλή συσχέτιση μεταξύ των παρατηρήσεων και ικανότητα πρόβλεψης, με βάση το μοντέλο, της συμπεριφοράς μιας άγνωστης ένωσης [76]. 99

101 Εικ. 32 Μοντέλα συσχέτισης των Χ με το σήμα απόκρισης Υ και στατιστικά χαρακτηριστικά τους Τέλος, στην περίπτωση που ως τιμές της μεταβλητής Υ χρησιμοποιήθηκαν οι τέταρτες ρίζες των σημάτων, τα αποτελέσματα που προέκυψαν (μοντέλο Μ2, Εικ.33) ήταν: R 2 Y=0.673 για την συσχέτιση και Q 2 =0548 για την προβλεψιμότητα. Μετά την αφαίρεση 6 παρατηρήσεων, οι ανωτέρω τιμές διαμορφώθηκαν σε R 2 Y=0.829 και Q 2 =0.735 (μοντέλο Μ6). Οι τιμές αυτές είναι εξαιρετικά ικανοποιητικές και αποδεικνύουν την αξιοπιστία του μοντέλου. Εικ. 33 Μοντέλα συσχέτισης των Χ με το σήμα απόκρισης Υ και στατιστικά χαρακτηριστικά τους Από τα ανωτέρω συνεπάγεται ότι το βέλτιστο μοντέλο μεταξύ των τριών διαφορετικών Υ που χρησιμοποιήθηκαν (απόλυτη τιμή, λογάριθμος και τέταρτη ρίζα) θεωρείται αυτό της τέταρτης ρίζας, όπως εμφαίνεται και στον κάτωθι πίνακα(πιν. 5). 100

102 Πιν. 5. Σύνοψη βέλτιστων δεδομένων και αποτελεσμάτων στο πείραμα στο οποίο χρησιμοποιήθηκε στήλη (σήμα, τέταρτη ρίζα σήματος, δεκαδικός λογάριθμος σήματος). PLS parameters FIA x log_10 x observations components X variables R 2 0,823 0,829 0,808 Q 2 0,601 0,735 0,744 No of variables excluded No of observations exluded Οι ικανοποιητικές ιδιότητες του λαμβανόμενου μοντέλου αποδεικνύονται και από την μικρή απόκλιση των παρατηρήσεων από την βέλτιστη ευθεία συσχέτισης των προβολών των Χ με το Υ (Εικ. 34). PLS without column (FIA) SD 2 SD t[1] SD 3 SD u[1] Εικ. 34 Διάγραμμα συσχέτισης μεταξύ συνιστάμενης λανθανουσών συνιστωσών και λαμβανομένου σήματος 11.3 Αξιολόγηση επιδρωσών παραμέτρων Στο ραβδόγραμμα προβολής σημαντικότητας VIP (Variables Importance Projection) του διαγράμματος 3 παρουσιάζονται 48 μεταβλητές που αναφέρονται σε δομικά χαρακτηριστικά 101

103 και φυσικοχημικές ιδιότητες των προσδιοριζόμενων ουσιών κατά φθίνουσα σειρά σημαντικότητας. Οι μεταβλητές με τους υψηλότερους συντελεστές (Πιν. 6) βάσει του μοντέλου Μ6, συντελούν περισσότερο στη διαμόρφωση σήματος αρνητικού ιονισμού, με τη μέθοδο ηλεκτροψεκασμού και διαδικασία FIA. 3 2 VIP[1] pka Ionization CO, COO, Polar Sur S OR, OCH3 COOH logd SO2 FRB oxygen ato HBA OH NH CO Predicted F Surface Te NO2 C atoms on CH3 on rin Br halogens benzene arom heter NH2 condensed Cl Molar volu Solvent ac heterocycl Enthalpy o Refractivi Polarizabi all rings No of side volume 2LogP COO N tertiary N atoms M.W. 1LogP nonarom ri HBD cyclo_hete benzene li Var ID (Primary) Διάγραμμα 3 Ακολούθως, στο διάγραμμα 4 παρουσιάζεται η θετική ή αρνητική επίδραση κάθε μεταβλητής στο προαναφερθέν σύστημα. PLS root.m6 (PLS), -6obs final CoeffCS[1](4root) CoeffCS[1](4root) 0,10 0,00-0,10-0,20 Ionization CO, COO, Polar Sur S COOH logd SO2 oxygen ato HBA NH CO F Surface Te NO2 CH3 on rin halogens arom heter Cl Enthalpy o No of side 2LogP COO N atoms M.W. 1LogP benzene li cyclo_hete HBD nonarom ri N tertiary volume all rings Polarizabi Refractivi heterocycl Solvent ac Molar volu condensed NH2 benzene Br C atoms on Predicted OH FRB OR, OCH3 pka Var ID (Primary) Διάγραμμα 4 102

104 Πίν. 6 Πίνακας VIP τιμών των Χ μεταβλητών Var ID (Primary) M6.VIP[1] Var ID (Primary) M6.VIP[1] pka arom hetero rings Ionization NH CO, COO,COOH condensed rings Polar Surface Area Cl S Molar volume OR, OCH Solvent accessible area COOH Heterocyclic rings logd Enthalpy of Vaporization SO Refractivity FRB Polarizability oxygen atoms all rings HBA No of side chains OH volume NH LogP CO COO Predicted water Solubility N tertiary

105 F N atoms Surface Tension M.W NO LogP C atoms on side chains nonarom rings CH3 on rings HBD Br cyclo_hetero halogens benzene like rings benzene rings Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στον Πιν. 6 προκύπτει ότι η σειρά σημαντικότητας των παραγόντων που επηρεάζουν το σήμα είναι περίπου ίδια και στις δύο περιπτώσεις (με ή χωρίς στήλη) με κάποιες μικρές διαφορές. Το γεγονός αυτό προφανώς οφείλεται στο ότι ορισμένες φορές η καθυστερημένη έκλουση ουσιών από την χρωματογραφική στήλη (ουσίες με μεγάλες τιμές logp και logd), επηρέασαν έμμεσα το εμβαδόν σήματος της κορυφής τους. Βέβαια αν θα θέλαμε να αποδώσουμε απόλυτη συσχέτιση επιφάνειας εμβαδού σήματος και χαρακτηριστικών της προς ανάλυση ουσίας τότε η χρήση της τεχνικής FIA εμφανίζει μεγαλύτερη πιστότητα. Έτσι παράμετροι όπως το pka (Variable Importance 2.6) και αντίστοιχα ο βαθμός ιονισμού(vip=2.2) της ουσίας, η πολική επιφάνεια PSA (VIP=1.6), οι δεσμοί υδρογόνου -HBA (VIP=1.2), η ύπαρξη ατόμων θείου (VIP=1.6) ή οξυγόνου (VIP=1.2) και ομάδων SO2(VIP=1.5), ΝΟ2 (VIP=0.87), -ΝΗ (VIP=0.99) ή -COOH (VIP=1.5) στο φαρμακομόριο, λειτουργούν με τον ίδιο μηχανισμό που ισχύει και στην περίπτωση μελέτης σήματος με χρήση στήλης. Διαφορετική επίδραση στο φαινόμενο είχαν οι παράγοντες που ακολουθούν στην συνέχεια γι αυτό και ερμηνεύονται ξεχωριστά. 104

106 Η ύπαρξη πολλών ελεύθερα περιστρεφόμενων δεσμών(free rotating bonds-frb) (VIP=1.2) φαίνεται να συντελεί στην ελάττωση του σήματος. Μια πιθανή εξήγηση του φαινόμενου αυτού θα μπορούσε να είναι το γεγονός ότι ομάδες τύπου COOH, >C=O και CN, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την αύξηση του σήματος, λόγω πολλαπλότητας δεσμού δεν περιστρέφονται ελεύθερα. Οι ομάδες ΟΗ (VIP=1.1) αυξάνουν επίσης την απόκριση σήματος, καθώς στις περιπτώσεις στις οποίες η φαινολική ομάδα είναι συζευγμένη με αρωματικό δακτύλιο αποπρωτονιώνεται σχετικά εύκολα, με αποτέλεσμα να ευνοείται ο σχηματισμός αρνητικά φορτισμένων ιόντων. Αρκετά σημαντικός παράγοντας αύξησης του σήματος φαίνεται να είναι επίσης η ύπαρξη ομάδων >C=O(VIP=0.93). Η επίδραση αυτή μπορεί να δικαιολογηθεί από το γεγονός ότι όταν οι ομάδες αυτές βρίσκονται κοντά σε όξινο πρωτόνιο, προκαλούν αύξηση της τάσης απόσπασης του(αύξηση οξύτητας) καθώς μετατοπίζουν το ηλεκτρονιακό νέφος προς το μέρος τους(και συνακόλουθα μακριά από το πρωτόνιο). Έτσι το φαρμακομόριο ιονίζεται ευκολότερα και επομένως δίνει και μεγαλύτερο σήμα στον φασματογράφο μαζών (π.χ. φαινοβαρβιτάλη). Σχετικά ισχυρή αρνητική επίδραση φαίνεται να υπάρχει επίσης μεταξύ της διαλυτότητας των φαρμακομορίων σε ύδωρ(water solubility)(vip=0.9) και του σήματος. Το γεγονός αυτό μπορεί να ερμηνευθεί από το ότι τα υδατοδιαλυτά μόρια είναι πολικά και αλληλεπιδρούν έντονα με το ύδωρ αναπτύσσοντας δεσμούς υδρογόνου. Έτσι, καθίσταται δυσχερέστερη η απομάκρυνση των ιόντων τέτοιων μορίων από το σταγονίδιο του πολικού διαλύτη. [31],[33]. Τέλος, η ύπαρξη ατόμων φθορίου(f) (VIP=0.9) στα φαρμακομόρια έχει σημαντική θετική επίδραση στο λαμβανόμενο σήμα. Το φθόριο, ως ισχυρά ηλεκτραρνητικό άτομο έλκει το ηλεκτρονιακά νέφη των γειτονικών ατόμων άνθρακα προς το μέρος του καθιστώντας τα περισσότερο όξινα και διευκολύνοντας την αποπρωτονίωση τους. 105

107 12. Συμπεράσματα Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να ερμηνευτεί με τη βοήθεια του προγράμματος ανάλυσης πολυπαραμετρικών συστημάτων PLS (Partial Least Squares), ο αρνητικός ιονισμός ουσιών αέριας φάσης με τη μέθοδο ηλεκτροψεκασμού, σε μια διάταξη LC-MS. Έτσι, μετά τη διεξαγωγή μιας σειράς πειραματικών διαδικασιών προέκυψαν συμπεράσματα τα οποία αφορούν τη συσχέτιση απόκρισης σήματος ουσιών με τις φυσικοχημικές ιδιότητες και τα δομικά χαρακτηριστικά τους. Πιο συγκεκριμένα, στην περίπτωση της μέτρησης απόκρισης σήματος ουσιών με την χρησιμοποίηση χρωματογραφικής στήλης (C18), ως σημαντικότερος παράγων που το καθορίζει είναι η τιμή pka και συνεπώς ο βαθμός ιονισμού τους. Αναλυτικότερα, διαπιστώθηκε ότι όσο μικρότερο είναι το pka των όξινων ομάδων μιας ουσίας, τόσο αυξάνονται οι πιθανότητες να δίδει ισχυρό σήμα στο ESI. Αυτό συμβαίνει πιθανότατα εξαιτίας της ευκολίας ιονισμού των μορίων, τα οποία διαθέτουν ομάδες που ευνοούν (συνήθως μέσω απόσπασης πρωτονίων) την δημιουργία αρνητικού φορτίου. Σημαντικά θετική επίδραση στο σήμα παρατηρείται επίσης και με την αύξηση της λιποφιλικότητας των φαρμακομορίων εκφρασμένη ως logp και logd, καθώς και την αύξηση της πολικής επιφάνειας -PSA και της επιφανειακής τάσης. Παράλληλα διαπιστώθηκε ότι η ύπαρξη συγκεκριμένων δομικών χαρακτηριστικών μιας ένωσης επηρεάζει θετικά ή αρνητικά το λαμβανόμενο σήμα. Έτσι ομάδες όπως οι COOH, -SO2 και -NO2, προσδίδουν όξινες ιδιότητες στο μόριο (ελαττωμένο pka) και συνεπώς ενισχύουν το σήμα τους. Άλλα δομικά χαρακτηριστικά με σημαντικά θετική επίδραση στην απόκριση είναι οι βενζολικοί δακτύλιοι και οι μεθυλικοί υποκατάστατες τους. Αντίστοιχα, και στην περίπτωση της μέτρησης της απόκρισης ουσιών χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης (FIA), ο σημαντικότερος παράγοντας που την καθορίζει είναι το pka 106

108 και ο βαθμός ιονισμού τους. Θετική επίδραση έχουν παράγοντες όπως η πολική επιφάνεια, η λιποφιλικότητα και η ύπαρξη στο μόριο ομάδων COOH, -SO2 και -NO2. Ιδιαίτερα στις μετρήσεις με FIA, αναδείχτηκαν ως σημαντικά και κάποια άλλα δομικά χαρακτηριστικά και φυσικοχημικές ιδιότητες των ουσιών, η ύπαρξη των οποίων πιθανόν οφείλεται στην αλλοίωση σήματος λόγω χρωματογραφικής καθυστέρησής τους. Έτσι, ισχυρή θετική επίδραση στο σήμα σχετίζεται με την ύπαρξη ομάδων OH, -NH, >C=O και F, ενώ η ύπαρξη ελεύθερα περιστρεφόμενων δεσμών(frb) συντελεί στην ελάττωση του. Τέλος, η αύξηση της υδατοδιαλυτότητας των φαρμακομορίων βρέθηκε να επηρεάζει αρνητικά το παραγόμενο σήμα στον φασματογράφο μάζας. Σε γενικές γραμμές θα μπορούσε να ειπωθεί ότι υπάρχουν ορισμένες διαφορές μεταξύ της μεθόδου στη οποία χρησιμοποιείται χρωματογραφική στήλη και της FIA, όχι όμως ιδιαίτερα σημαντικές. Βέβαια, ως πλέον αξιόπιστες θεωρούνται οι μετρήσεις δίχως την παρεμβολή της στήλης, καθώς το σήμα στην περίπτωση αυτή είναι απαλλαγμένο από την επίδραση παραγόντων που σχετίζονται με την χρωματογραφική συμπεριφορά των ουσιών. Τέλος, μια γενική παρατήρηση σχετικά με το φαινόμενο αρνητικού ιονισμού είναι ότι η ένταση σήματος ενός ιόντος με την τεχνική ESI εξαρτάται περισσότερο από τα δομικά χαρακτηριστικά των μορίων και λιγότερο από τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες Στην μελέτη συσχέτισης διαφορετικών όγκων έγχυσης (injection volumes) με την απόκριση, παρατηρήθηκε ότι αύξηση του όγκου δείγματος προκαλεί αντίστοιχη αύξηση του λαμβανομένου σήματος. Μάλιστα, η μεταβολή αυτή φαίνεται πως είναι γραμμική, υποδηλώνοντας την αναλογικότητα μεταξύ της ποσότητας του προς μέτρηση δείγματος και της απόκρισης της διάταξης LC-MS. Για την μελέτη ανάδειξης του διαλύτη που αποδίδει το ισχυρότερο σήμα σε μια διάταξη LC-MS-ESI, διερευνήθηκε μια σειρά διαφορετικών κινητών φάσεων. Τελικά, η χρήση μεθανόλης ως μέσο διάλυσης του δείγματος και της κινητής φάσης προάγει την ενίσχυση του λαμβανομένου σήματος σε μέγιστο βαθμό. Η χρήση ακετονιτριλίου έδωσε μικρότερες αποκρίσεις, ενώ ασθενέστερα σήματα ελήφθησαν με την χρήση ύδατος. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαίωσαν την άμεση συσχέτιση της επιφανειακής τάσης και του ιξώδους των 107

109 διαλυτών της κινητής φάσης με την ένταση του παραγόμενου σήματος και βρίσκονται σε συμφωνία με τον προτεινόμενο μηχανισμό δημιουργίας σταγονιδίων κατά τον ηλεκτροψεκασμό. Στην ίδια μελέτη η χρήση υδατικών κινητών φάσεων με διαφορετικό ph (όξινο, σχεδόν ουδέτερο και βασικό), δεν δημιούργησε σημαντικές διακυμάνσεις στις εντάσεις των σημάτων που ελήφθησαν από τον φασματογράφο μαζών. Μάλιστα, οι περισσότερες ουσίες, παρότι όξινες, έδωσαν τα ελαφρώς ισχυρότερα σήματα στο σχεδόν ουδέτερο διάλυμα (ph=6.5). Το γεγονός αυτό δεικνύει την μικρή συσχέτιση μεταξύ των ιόντων υγρής φάσης, τα οποία δύναται να προϋπάρχουν σε ένα διάλυμα ουσίας ορισμένου ph και των ιόντων αέριας φάσης, τα οποία δημιουργούνται και ανιχνεύονται από διατάξεις LC-MS-ESI. Επίσης, το γεγονός ότι αρκετές ουσίες έδωσαν το (ελαφρώς) ισχυρότερο σήμα σε όξινο και όχι σε βασικό περιβάλλον, υποδηλώνει την μικρή θετική επίδραση που μπορεί να έχει στο negative-mode η χρησιμοποίηση ασθενών οξέων σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η διαδικασία σχηματισμού αρνητικού ιόντος με την τεχνική ESI στο MS είναι σύνθετη με πολλά ενδιάμεσα στάδια. Σημαντικότερο, από άποψη διεργασίας, θεωρείται αυτό του σχηματισμού της φορτισμένης σταγόνας της κινητής φάσης ενώ από άποψη απόδοσης σήματος η ποσοτική μεταφορά των παραχθέντων ιόντων στο μόριο της προς ανάλυση ουσίας. Η προσπάθεια ερμηνείας του φαινομένου, με τη βοήθεια της μοντελοποίησης δίνει μια διαφορετική διάσταση αντιμετώπισης του σύνθετου αυτού προβλήματος και το έναυσμα για καινούργιες μελλοντικές μελέτες. 108

110 Παράρτημα Ι Πίν. 7. Φυσικοχημικές ιδιότητες των ουσιών στην μελέτη με την χρήση χρωματογραφικής στήλης Name 1LogP 2LogP logd FRB Polar Sur A Refractivity Polarizability HBD HBA Solvent accessible Molar volume volume M.W. Surface Tension pka Ionization % Predicted water solubility(mg/l) Enthalpy of Vaporization (kj/mol) Sulfisoxazole 1,01 0,73 0, ,60 67,1 26, ,72 189,4 221,49 267,304 66,4 7,30 4, ,00 74,7 Nicotinic acid 0,15-0,17-1, ,19 31,3 12, ,71 95,2 105,51 123,109 58,8 2,79 99, ,00 56,2 Benzoic acid 1,89 1,63 0, ,30 33,2 13, ,65 102,0 109,73 122,121 48,7 4,08 98, ,00 51,4 2-naphthol 2,71 2,66 2, ,23 46,0 18, ,70 122,2 133,65 144,170 51,1 9,78 0, ,00 54,6 Ketoconazole 3,55 4,19 2, ,06 139,1 55, ,33 385,0 450,66 531,431 52,2 18,00 0,00 0,09 109,8 Clotrimazole 5,44 5,84 4, ,82 105,9 42, ,62 302,8 307,03 344,837 45,5 18,00 0,00 0,03 71,9 Dipyridamole -1,22 1,81-1, ,44 139,4 55, ,53 373,0 475,91 504,625 81,6 14,97 0,00 92,20 122,9 Spironolactone 3,12 3,64 3, ,74 112,7 44, ,92 335,8 391,76 416,573 50,9 18,01 0,00 28,38 88,9 Nifedipine 2,97 1,82 2, ,45 87,9 34, ,60 272,3 299,60 346,335 46,1 18,00 0,00 357,50 73,9 Reserpine 4,05 3,53 2, ,78 160,9 63, ,62 458,2 550,46 608,678 59,9 16,29 0,00 11,30 102,5 Ambroxol 2,91 2,65 0, ,28 81,3 32, ,16 221,9 258,41 378,103 63,3 15,26 0,00 90,45 77,0 Cortisone acetate 2,53 2,10 2, ,74 103,8 41, ,42 318,2 377,32 402,481 52,9 12,60 0,00 153,90 99,2 Cinchonidine 3,35 2,67 0, ,36 89,4 35, ,24 244,5 283,85 294,391 56,4 13,88 0,00 526,50 76,5 Colchicine 0,92 1,46 0, ,09 106,1 42, ,89 318,1 363,58 399,437 50,5 15,06 0,00 239,50 106,0 Haloperidol 3,01 3,66 0, ,54 101,0 40, ,57 303,3 337,79 375,864 47,9 13,96 0,00 9,34 84,6 Hydrocortisone (acetate) 1,43 1,28 1, ,83 95,6 37, ,54 281,4 347,40 362,459 58,8 12,58 0,00 38,10 99,1 Hydroxyzine (HCL) 2,03 3,41 0, ,94 105,9 42, ,64 317,1 352,76 374,904 47,8 15,12 0,00 428,00 80,8 Fludrocortisone acetate 2,32 1,76 2, ,90 105,3 41, ,67 324,0 389,97 422,487 53,3 12,57 0,00 26,08 98,9 Fluoxetine 4,09 4,17 1, ,26 79,9 31, ,65 266,7 274,24 309,326 33,0 18,00 0,00 38,35 64,5 Diethylstilbestrol 5,93 5,19 5, ,46 83,2 33, ,84 242,2 263,59 268,350 46,3 9,13 0,07 3,32 68,5 Diethylstilbestrol dipropionate 6,94 6,42 6, ,60 111,4 44, ,12 353,7 371,08 380,477 39,1 18,00 0,00 0,01 75,2

111 Deoxycorticosterone acetate 4,53 3,77 4, ,44 102,1 40, ,68 324,3 366,33 392,498 44,5 17,18 0,00 10,59 77,3 Ethisterone 3,86 3,52 3, ,30 90,2 35, ,50 274,1 315,13 312,446 48,0 17,59 0,00 74,16 81,3 17-ethynylestradiol 4,52 3,90 4, ,46 86,3 34, ,14 244,5 291,72 296,403 57, ,01 116,40 75,6 Clomiphene citrate 8,01 6,47 4, ,47 123,7 49, ,20 367,6 387,69 405,960 42,1 18,00 0,00 0,05 77,9 Antazoline phosphate 4,39 2,88 2, ,63 83,3 33, ,47 241,0 255,20 265,352 43,8 18,00 0,00 25,23 73,9 Imipramine HCL 4,80 4,28 1,76 4 6,48 88,9 35, ,92 269,2 285,74 280,407 40,1 18,00 0,00 1,00 65,4 Ketoprofen 2,81 3,61 1, ,37 71,8 28, ,77 212,2 233,79 254,281 49,8 3,88 99,25 120,40 72,4 Indomethacin 3,11 3,53 1, ,53 94,6 37, ,23 269,6 300,74 357,778 47,5 3,80 99,37 3,11 80,8 Tetracaine HCL 3,65 2,79 0, ,57 79,2 31, ,37 253,1 270,75 264,363 39,7 18,00 0,00 201,40 63,9 Lidocaine 2,36 2,84 0, ,34 72,4 28, ,96 228,3 244,84 234,337 39,1 13,78 0,00 237,70 59,5 Ranitidine 1,23 0,98-1, ,56 85,6 34, ,68 265,4 286,12 314,404 45,0 16,00 0, ,00 69,4 Thiocolchicoside -1,132-0,16-1, ,31 141,8 56, ,06 385,6 492,06 536,617 73,59 12,20 0, ,00 141,7 Trimethoprim 0,79 1,28-0, ,51 80,3 31, ,10 231,9 261,31 290,317 53,9 17,33 0, ,00 80,0 Rivoflavin -2,02-0,92-2, ,05 91,1 36, ,25 227,5 320,76 376,364 70,3 6,97 9, ,00 150,7 Metoclopramide HCL 2,22 1,40-0, ,59 82,6 32, ,36 257,8 279,55 299,796 43,8 14,49 0,00 71,25 67,2 Naphazoline HCL 3,88 2,19 1, ,39 65,5 26, ,72 181,8 197,76 210,274 44,6 18,00 0,00 38,38 67,1 Sulfasalazine 3,18 3,94 0, ,69 102,4 40, ,88 267,7 320,30 398,393 65,7 3,30 99,80 2,44 106,1 Sulfamethoxazole 0,89 0,79 0, ,60 62,5 24, ,21 173,1 204,59 253, ,66 2, ,00 74,7 Diclofenac 4,06 4,26 2, ,33 76,5 30, ,15 206,8 236,81 296,149 58,0 4,00 99,01 4,52 70,1 Mefenamic Acid 5,33 5,40 3, ,33 72,2 28, ,88 200,6 226,02 241,285 51,8 3,89 99,23 1,12 68,5 Carisoprodol 2,15 1,92 2, ,65 68,2 27, ,44 246,5 260,98 260,330 37,1 15,06 0,00 201,00 67,8 Paracetamol 0,34 0,91 0, ,33 42,4 16, ,56 120,9 138,08 151,163 52,8 9,46 0, ,00 66,2 Caffeine -0,13-0,55-0, ,44 50,4 20, ,11 133,4 164,26 194,191 55,8 18,00 0, ,00 67,0 Atenolol 0,10 0,43-2, ,58 74,3 29, ,41 236,7 261,34 266,336 45,0 14,08 0,00 685,20 81,9 Atropine 1,53 1,57-1, ,77 80,8 32, ,67 242,4 279,65 289,369 50,5 15,15 0, ,00 72,2 Propranolol 3,10 2,58 0, ,49 79,0 31, ,96 237,2 257,56 259,343 42,7 14,09 0,00 228,00 72,8 Salbutamol 0,01 0,34-3, ,72 67,8 26, ,35 207,6 239,15 239,311 49,2 10,12 0, ,00 72,7 Promethazine 4,78 4,29 1, ,78 87,8 34, ,32 251,3 270,99 284,419 44,1 18,00 0,00 0,93 65,5 Glipizide 2,01 1,43 1, ,53 115,9 46, ,17 331,9 394,49 445,535 66,8 4,32 97,95 37,17 Chloramphenicol 1,02 0,88 1, ,38 72,6 28, ,69 208,8 249,07 323,129 66,1 7,49 3,13 388,50 100,0 Cefuroxime Na 0,47-0,90-2, ,06 96,7 38, ,31 241,0 330,43 424,385 78,1 3,15 99,85 144,80 Diazepam 2,91 3,08 2, ,67 80,9 32, ,89 225,9 242,89 284,740 46,1 18,00 0,00 58,78 765,0 Lorazepam 2,47 3,53 2, ,69 81,0 32, ,92 211,2 247,55 321,158 56,0 10,61 0,00 3,67 85,2 Acetylsalicylic acid 1,10 1,24-0,8 3 63,60 44,5 17, ,24 139,6 154,76 180,157 49,9 3,41 99, ,00 59,5 ii

112 Carbamazepine 2,67 2,77 2, ,33 69,7 27, ,20 186,6 210,15 236,269 57,3 18,00 0,00 17,66 66,3 Beclomethasone dipropionate 4,59 4,43 4, ,97 133,4 52, ,07 410,3 478,71 521,042 51,6 13,58 0,00 49,39 106,9 Desipramine 4,13 3,90 1, ,27 84,2 33, ,34 254,3 268,01 266,178 40,0 18,00 0,00 0,99 65,9 Apomorphine 3,05 2,87 0, ,70 77,9 30, ,49 205,6 245,19 267,322 58,3 9,26 0,06 103,40 76,5 Diphenhydramine 3,66 3,65 0, ,47 79,6 31, ,04 249,2 260,43 255,355 38,7 18,00 0,00 363,70 58,8 Amitriptyline 4,92 4,81 1,92 3 3,24 91,5 36, ,27 257,8 282,71 277,403 47,0 18,00 0,00 0,82 64,9 Amiodarone 8,89 7,64 5, ,68 144,4 57, ,64 408,2 438,08 645,312 47,8 18,00 0,00 4,76 93,9 Amobarbital 2,05 189,00 2, ,27 58,0 23, ,05 211,5 217,14 226,272 33,1 8,48 0,33 544,00 Chlorothalidone -0,74 1,60-0, ,87 81,3 32, ,72 211,6 258,83 338,766 72,7 8,58 0, ,00 Allopurinol -1,33 0,05-3, ,69 34,7 13, ,41 80,0 104,48 136, ,4 8,47 0, ,00 70,4 Warfarine 3,42 2,74 2, ,60 84,4 33, ,91 235,8 275,66 308,323 58,7 6,33 31,86 54,27 82,9 Amoxycillin trihydrate 0,61-2,31-1, ,26 91,5 36, ,98 236,2 307,11 365,404 85,3 3,23 99, ,00 113,7 Prazepam 3,81 3,86 3, ,67 92,4 36, ,35 246,5 282,07 324,103 50,5 18,00 0,00 5,72 81,6 Ephedrine 1,05 1,32-1, ,26 50,2 19, ,42 162,7 171,06 165,115 38,1 13,89 0, ,00 52,0 Dibucaine 3,87 3,70 0, ,46 103,3 40, ,52 320,4 343,88 343,463 42,7 14,57 0,00 1,19 76,4 Nortriptylline 5,65 4,43 2, ,03 86,8 34, ,82 242,9 265,01 263,377 47,3 18,00 0,00 2,22 65,5 Naproxene 3,00 2,99 2, ,53 66,5 26, ,75 192,3 213,08 230,259 47,5 4,19 98,47 144,90 69,1 Diltiazem 3,63 2,73 0, ,38 115,2 45, ,02 327,6 378,80 414,161 56,2 12,86 0,00 12,30 88,6 Noscapine HCl 2,83 2,58 1, ,69 106,5 42, ,28 310,2 357,60 413,148 50,4 14,59 0, ,00 84,9 Metronidazole -0,01-0,45-0, ,87 41,0 16, ,75 117,8 144,17 171,154 60,5 15,44 0, ,00 69,3 Piroxicam 1,71 0,60 0, ,98 83,2 33, ,73 212,0 267,77 331,346 82,4 4,67 95,53 19,54 Norfloxacin 0,82-0,92-1, ,88 80,7 32, ,46 237,4 277,46 319,331 53,2 5,77 62, ,00 88,1 Carbidopa -0,19-1,19-2, ,81 57,5 22, ,48 159,3 202,21 226,229 74,1 3,59 99, ,00 84,6 Biperidine 4,01 3,54 0, ,47 94,1 37, ,96 281,7 317,78 311,461 46,9 13,82 0,00 25,14 76,2 Gabapentin 1,19-1,27-1, ,32 46,7 18, ,13 161,8 176,16 171,239 47,1 4,63 95, ,00 61,6 Captopril 0,27 0,73-1, ,41 54,4 21, ,38 170,7 196,60 217,285 54,3 4,02 98, ,00 74,8 Chloropheniramine 42,1 18,00 0, ,00 62,7 maleate 3,39 3,58 0, ,13 80,8 32, ,05 248,0 260,66 274,124 Cimetidine 0,26-0,11-1, ,19 70,7 28, ,53 198,2 226,86 252,339 49,6 13,38 4, ,00 75,4 Clobazam 1,69 2,55 1, ,62 79,9 31, ,53 225,2 252,59 300,74 52,6 18,00 0,00 266,90 95,0 Clonidine 1,41 2,49-0, ,42 57,3 22, ,18 153,2 177,15 230,094 50,9 18,00 0,00 795,70 60,4 Tolbutamide 2,34 2,30 1, ,65 70,8 28, ,79 228,3 244,75 270,348 42,7 4,33 97,90 182,60 Theophylline -0,17-0,77-0, ,30 43,2 17, ,19 122,9 146,70 180,164 67,6 7,82 1, ,00 71,4 Zipeprol 3,08 2,88 1, ,17 112,1 44, ,36 346,8 382,10 384,52 44,0 13,72 0, ,00 81,9 Epinephrin -0,63-0,43-3, ,72 49,3 19, ,24 142,7 170,93 183,204 59,9 9,69 0, ,00 70,2 iii

113 Isoprenalin 0,25 0,24-2, ,72 58,6 23, ,23 176,1 204,98 211,258 52,5 9,81 0, ,00 70,7 Phenylephrine -0,03-0,07-3, ,49 47,4 18, ,74 144,3 162,50 167,205 49,2 9,07 0, ,00 61,7 Terbutaline 0,48 0,44-2, ,72 63,2 25, ,66 192,3 222,28 225,284 50,1 8,86 0, ,00 70,9 Trimipramine 5,15 4,76 2,12 4 6,48 93,5 37, ,50 286,1 303,06 294,434 39,1 18,00 0,00 0,24 66,4 Triflupromazine 5,70 4,81 2, ,78 92,8 36, ,58 284,5 302,71 352,417 39,2 18,00 0,00 0,09 68,3 Flurbiprofen 4,11 3,94 2, ,30 66,6 26, ,90 203,6 219,23 244,261 44,1 4,42 97,43 17,70 65,8 Hydrochlorothiazide -0,07-0,58-0, ,12 62,7 24, ,50 175,8 209,25 297,739 62,0 9,09 0, ,00 86,4 Meloxicam 2,71 1,60 1, ,22 86,0 34, ,40 217,7 276,09 351,401 85,3 4,82 93,80 7,15 83,9 Triamterene 1,34 1,11 0, ,62 73,8 29, ,08 168,6 211,67 253, ,2 15,88 0, ,00 85,9 Ticlopidine HCl 3,77 4,20 2, ,48 74,4 29, ,00 207,1 227,70 263,786 51,5 18,00 0,00 38,61 61,4 Triprolidine 4,22 4,05 1, ,13 88,1 34, ,09 262,2 277,90 278,391 43,3 18,00 0,00 74,86 69,2 Ramipril 3,41 1,47 1, ,94 111,4 44, ,42 346,8 396,93 416,511 50,2 3,75 99,44 3,55 96,1 Lisinopril 1,19-3,10-1, ,96 107,5 42, ,11 323,9 386,10 405,488 60,4 3,17 99,85 13,00 102,9 Phenobarbital 1,67 1,41 1, ,27 59,2 23, ,36 188,2 202,96 232,235 43,3 8,14 0, ,00 Πίν. 8. Δομικά χαρακτηριστικά των ουσιών στην μελέτη με την χρήση στήλης Name Sulfisoxazole Nicotinic acid Benzoic acid 2-naphthol Ketoconazole Clotrimazole benzene benzene like arom hetero nonarom ring cyclo_hetero heterocyclic N (only) all rings OH COOH CO COO CO, COO, COOH NH2 NH N tertiary N atoms NO2 oxygen atoms halogens F Cl Br I C atoms on side chains S SO2 CH3 on rings No of side chains OR, OCH3 condensed rings iv

114 Dipyridamole Spironolactone Nifedipine Reserpine Ambroxol Cortisone acetate Cinchonidine Colchicine Haloperidol Hydrocortisone (acetate) Hydroxyzine (HCL) Fludrocortisone acetate Fluoxetine Diethylstilbestrol Diethylstilbestrol dipropionate Deoxycorticoster one acetate v

115 Ethisterone ethynylestradiol Clomiphene citrate Antazoline phosphate Imipramine HCL Ketoprofen Indomethacin Tetracaine HCL Lidocaine Ranitidine Thiocolchicoside Trimethoprim Rivoflavin Metoclopramide HCL Naphazoline HCL Sulfasalazine Sulfamethoxazole vi

116 Diclofenac Mefenamic Acid Carisoprodol Paracetamol Caffeine Atenolol Atropine Propranolol Salbutamol Promethazine Glipizide Chloramphenicol Cefuroxime Na Diazepam Lorazepam Acetylsalicylic acid Carbamazepine Beclomethasone dipropionate vii

117 Desipramine Apomorphine Diphenhydramine Amitriptyline Amiodarone Amobarbital Chlorothalidone Allopurinol Warfarine Amoxycillin trihydrate Prazepam Ephedrine Dibucaine Nortriptylline Naproxene Diltiazem Noscapine HCl Metronidazole Piroxicam viii

118 Norfloxacin Carbidopa Biperidine Gabapentin Captopril Chloropheniramin e maleate Cimetidine Clobazam Clonidine Tolbutamide Theophylline Zipeprol Epinephrin Isoprenalin Phenylephrine Terbutaline Trimipramine Triflupromazine Flurbiprofen ix

119 Hydrochlorothiazi de Meloxicam Triamterene Ticlopidine HCl Triprolidine Ramipril Lisinopril Phenobarbital Πίν. 9. Ολοκληρώματα των σημάτων των ουσιών, καθως και των τετάρτων ριζών και των λογαρίθμων των ολοκληρωμάτων αυτών, στην μελέτη με την χρήση στήλης. Name Area 4 log Ion Sulfisoxazole Nicotinic acid Benzoic acid 2-naphthol ,20 7, M.I ,42 5, Μ.Ι ,38 5, M.I ,05 6, M.I. x

120 Ketoconazole Clotrimazole Dipyridamole Spironolactone Nifedipine Reserpine Ambroxol Cortisone acetate Cinchonidine Colchicine Haloperidol Hydrocortisone (acetate) Hydroxyzine (HCL) Fludrocortisone acetate Fluoxetine Diethylstilbestrol Diethylstilbestrol dipropionate Deoxycorticosterone acetate Ethisterone 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,50 7, M.I ,61 5, M.I. 0 0,00 0, ,20 6, AC 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,07 6, CL 0 0,00 0, ,11 6, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 xi

121 17-ethynylestradiol Clomiphene citrate Antazoline phosphate Imipramine HCL Ketoprofen Indomethacin Tetracaine HCL Lidocaine Ranitidine Thiocolchicoside Trimethoprim Rivoflavin Metoclopramide HCL Naphazoline HCL Sulfasalazine Sulfamethoxazole Diclofenac Mefenamic Acid Carisoprodol 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,25 6, B. 0 0,00 0, ,97 6, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,86 6, CL 0 0,00 0, ,98 6, CL 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,20 7, M.I ,89 6, M.I ,00 6, B ,61 6, M.I. 0 0,00 0,00 xii

122 Paracetamol Caffeine Atenolol Atropine Propranolol Salbutamol Promethazine Glipizide Chloramphenicol Cefuroxime Na Diazepam Lorazepam Acetylsalicylic acid Carbamazepine Beclomethasone dipropionate Desipramine Apomorphine Diphenhydramine Amitriptyline 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,35 5, M.I. 0 0,00 0, ,82 6, M.I ,53 6, M.I ,11 5, M.I. 0 0,00 0, ,49 0, M.I ,76 6, B 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 xiii

123 Amiodarone Amobarbital Chlorothalidone Allopurinol Warfarine Amoxycillin trihydrate Prazepam Ephedrine Dibucaine Nortriptylline Naproxene Diltiazem Noscapine HCl Metronidazole Piroxicam Norfloxacin Carbidopa Biperidine Gabapentin 0 0,00 0, ,73 6, M.I ,75 6, M.I ,38 5, M.I ,41 7, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,59 5, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,29 6, M.I ,66 7, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,06 5, M.I. xiv

124 Captopril Chloropheniramine maleate Cimetidine Clobazam Clonidine Tolbutamide Theophylline Zipeprol Epinephrin Isoprenalin Phenylephrine Terbutaline Trimipramine Triflupromazine Flurbiprofen Hydrochlorothiazide Meloxicam Triamterene Ticlopidine HCl 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,92 6, CL 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,95 6, M.I ,01 6, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 0 0,00 0, ,52 6, B ,90 7, M.I ,00 7, M.I. 0 0,00 0,00 0 0,00 0,00 xv

125 Triprolidine Ramipril Lisinopril Phenobarbital 0 0,00 0, ,53 6, M.I ,72 5, M.I ,02 6, M.I. Όπου Μ.Ι.= Μοριακό Ιόν, +Cl= [M+Cl-H] -, +Ac= [M+Ac-H] -, B.= Θραύσμα αναφερόμενο σε βιβλιογραφία,?=μη προσδιορίσιμο θραύσμα Πίν. 10. Φυσικοχημικές ιδιότητες των επιπρόσθετων 7 ουσιών στην μελέτη χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης (οι άλλες 60 ουσίες είναι κοινές με την μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε στήλη) Name 1LogP 2LogP logd FRB Polar Sur Area Refractivity Polarizability HBD HBA Solvent accessible Molar volume volume M.W. Surface Tension pka Ionization % Predicted water solubility(mg/l) Enthalpy of Vaporization (kj/mol) Acetazolamide -0,26-1,04-0, ,66 46,000 18, ,2 127, ,21 222,245 97,90 6,93 10, ,00 Carbocysteine 0,32-3,3-3, ,92 39,800 15, ,3 118, ,48 179,194 78,00 1,84 99, ,00 58,70 Flufenamic acid 5,62 5,25 3,8 3 49,33 67,500 26, ,7 201, ,84 281,230 44,30 3,88 99,24 0,52 65,50 Glibenclamide 3,75 3,79 2, ,98 126,900 50, ,2 362, ,20 494,000 61,30 4,32 97, Nalidixic acid 1,19 1,01 0, ,5 60,100 23, ,9 174, ,58 232,235 59,30 5,95 52, ,00 70,20 Niflumic acid 4,94 3,12 2, ,22 65,600 26, ,7 194, ,70 282,218 48,60 1,88 99,99 2,56 66,00 Nifuroxazide 0,59 1,75 0, ,65 67,600 26, ,1 184, ,65 275,217 64,60 8,33 0, ,00 xvi

126 Πίν. 11. Δομικά χαρακτηριστικά των επιπρόσθετων 7 ουσιών στην μελέτη χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης (οι άλλες 60 ουσίες είναι κοινές με την μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε στήλη) Name benzene benzene like arom hetero nonarom ring cyclo_hetero heterocyclic N (only) all rings OH COOH CO COO CO, COO, COOH NH2 NH N tertiary N atoms NO2 oxygen atoms halogens F Cl Br I C atoms on side chains S SO2 CH3 on rings No of side chains OR, OCH3 condensed rings Acetazolamide Carbocysteine Flufenamic acid Glibenclamide Nalidixic acid Niflumic acid Nifuroxazide Πίν. 12. Ολοκληρώματα των σημάτων των ουσιών, καθώς και των τετάρτων ριζών και των λογαρίθμων των ολοκληρωμάτων αυτών, στην μελέτη χωρίς την χρήση στήλης. Name 2-naphthol Acetazolamide Area 1 Area 2 Average Area 4 log Ion ,22 6, M.I ,39 6, M.I. xvii

127 Acetylsalicylic acid Allopurinol Amobarbital Benzoic acid Captopril Carbidopa Carbocysteine Cefuroxime Na Chloramphenicol Chlorothalidone Cimetidine Cortisone acetate Diclofenac Diethylstilbestrol Fludrocortisone acetate Flufenamic acid Flurbiprofen Gabapentin Glibenclamide ,63 6, B ,22 6, M.I ,63 7, M.I ,67 6, M.I ,31 6, M.I ,70 7,09 296? ,88 6, M.I ,21 6, M.I ,31 7, M.I ,25 6, M.I ,85 6, M.I ,99 6, AC ,45 6, B ,88 7, M.I ,72 6, AC ,80 7, M.I ,00 6, B ,30 6, M.I ,57 7, M.I. xviii

128 Glipizide Hydrochlorothiazide Indomethacin Ketoprofen Lisinopril Lorazepam Mefenamic Acid Meloxicam Metronidazole Nalidixic acid Naproxene Nicotinic acid Nifedipine Niflumic acid Nifuroxazide Phenobarbital Piroxicam Ramipril Ranitidine ,06 7, M.I ,28 6, M.I ,47 6, M.I ,75 6, B ,70 6, M.I ,54 7, M.I ,94 7, M.I ,96 7, M.I ,04 6, CL ,55 5, M.I ,54 6, M.I ,37 6, M.I ,33 7, M.I ,88 7, M.I ,24 6, M.I ,38 6, M.I ,43 7, M.I ,35 7, M.I ,68 6, M.I. xix

129 Reserpine Rivoflavin Salbutamol Sulfamethoxazole Sulfasalazine Sulfisoxazole Theophylline Thiocolchicoside Tolbutamide Warfarine Ambroxol Lidocaine Metoclopramide HCL Atenolol Atropine Propranolol Apomorphine Noscapine HCl Ephedrine ,74 6, M.I ,35 5, CL ,88 6, M.I ,11 6, M.I ,75 7, M.I ,92 7, M.I ,40 6, M.I ,53 5, CL ,34 7, M.I ,16 7, M.I ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0,00 xx

130 Dibucaine Epinephrin Isoprenalin Phenylephrine Terbutaline Triamterene Biperidine Diltiazem Zipeprol Trimethoprim Hydroxyzine ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0, ,00 0,00 Όπου Μ.Ι.= Μοριακό Ιόν, +Cl= [M+Cl-H] -, +Ac= [M+Ac-H] -, B.= Θραύσμα αναφερόμενο σε βιβλιογραφία,?=μη προσδιορίσιμο θραύσμα Πίν. 13. pka και βαθμός ιονισμού ουσιών σε δυο διαφορετικές τιμές ph(2,6 και 6) Name of compound pka (acidic group) ph % ionization ph 2,6 % ionization ph 6 1 phenobarbital 8,14 2,6 6 0, , phenobarbital 11,8 2,6 6 6,30957E-08 0, lisinopril 3,17 2,6 6 21, , lisinopril 3,85 2,6 6 5, , ramipril 3,75 2,6 6 6, , xxi

131 1 meloxicam 4,82 2,6 6 0, , meloxicam 7,87 2,6 6 0, , hydrochlorothiazide 9,09 2,6 6 3,23594E-05 0, hydrochlorothiazide 9,83 2,6 6 5,88844E-06 0, hydrochlorothiazide 11,31 2,6 6 1,94984E-07 0, flurbiprofen 4,42 2,6 6 1, , tebutaline 8,86 2,6 6 5,49541E-05 0, tebutaline 10,64 2,6 6 9,12011E-07 0, tebutaline 14,35 2,6 6 1,77828E-10 4,46684E-07 1 phenylephrine 9,07 2,6 6 3,38844E-05 0, phenylephrine 14,24 2,6 6 2,29087E-10 5,7544E-07 1 isoprenaline 9,81 2,6 6 6,16595E-06 0, isoprenaline 12,65 2,6 6 8,91251E-09 2,23872E-05 3 isoprenaline 14,38 2,6 6 1,65959E-10 4,16869E-07 1 epinephrine 9,69 2,6 6 8,1283E-06 0, epinephrine 12,65 2,6 6 8,91251E-09 2,23872E-05 3 epinephrine 14,38 2,6 6 1,65959E-10 4,16869E-07 zipeprol 13,72 2,6 6 7,58578E-10 1,90546E-06 theophylline 7,82 2,6 6 0, , tolbutamide 4,33 2,6 6 1, , cimetidine 13,38 2,6 6 1,65959E-09 4,16869E-06 1 captopril 4,02 2,6 6 3, , captopril 10,1 2,6 6 3,16228E-06 0, gabapentin 4,63 2,6 6 0, , biperiden 13,82 2,6 6 6,0256E-10 1,51356E-06 1 carbidopa 3,59 2,6 6 9, , carbidopa 9,29 2,6 6 2,04174E-05 0, carbidopa 12,74 2,6 6 7,24436E-09 1,8197E-05 norfloxacin 5,77 2,6 6 0, , piroxicam 4,67 2,6 6 0, , piroxicam 11,73 2,6 6 7,4131E-08 0, diltiazem 12,86 2,6 6 5,49541E-09 1,38038E-05 naproxene 4,19 2,6 6 2, , dibucaine 14,57 2,6 6 1,07152E-10 2,69153E-07 ephedrine 13,89 2,6 6 5,12861E-10 1,28825E-06 xxii

132 1 amoxycillin 3,23 2,6 6 18, , amoxycillin 9,48 2,6 6 1,31826E-05 0, amoxycillin 12,03 2,6 6 3,71535E-08 9,33253E-05 warfarin 6,33 2,6 6 0, , allopurinol 8,47 2,6 6 0, , allopurinol 13,71 2,6 6 7,76247E-10 1,94984E-06 1 chlorothalidone 8,58 2,6 6 0, , chlorothalidone 9,22 2,6 6 2,39883E-05 0, chlorothalidone 11,23 2,6 6 2,34423E-07 0, amobarbital 8,48 2,6 6 0, , amobarbital 12,15 2,6 6 2,81838E-08 7,07945E-05 1 apomorphine 9,26 2,6 6 2,18776E-05 0, apomorphine 12,68 2,6 6 8,31764E-09 2,0893E-05 beclomethazone dipropionate 13,85 2,6 6 5,62341E-10 1,41254E-06 carbamazepine oxi 2, acetylsalicylic acid 3,41 2,6 6 13, , lorazepam 10,61 2,6 6 9,77237E-07 0, lorazepam 12,46 2,6 6 1,38038E-08 3,46737E-05 1 cefuroxime 3,15 2,6 6 21, , cefuroxime 10,98 2,6 6 4,16869E-07 0, cefuroxime 11,59 2,6 6 1,02329E-07 0, cefuroxime 14,78 2,6 6 6,60693E-11 1,65959E-07 1 chloramphenicol 7,49 2,6 6 0, , chloramphenicol 13,59 2,6 6 1,02329E-09 2,5704E-06 1 glipizide 4,32 2,6 6 1, , glipizide 13,87 2,6 6 5,37032E-10 1,34896E-06 niflumic acid 1,88 2,6 6 83, , nalidixic acid 5,95 2,6 6 0, , flufenamic acid 3,88 2,6 6 4, , carbocysteine 1,84 2,6 6 85, , carbocysteine 4,05 2,6 6 3, , acetazolamide 6,93 2,6 6 0, , acetazolamide 10,35 2,6 6 1,77828E-06 0, glibenclamide 4,32 2,6 6 1, , xxiii

133 2 glibenclamide 13,72 2,6 6 7,58578E-10 1,90546E-06 1 nifuroxazide 8,33 2,6 6 0, , nifuroxazide 13,04 2,6 6 3,63078E-09 9,12011E-06 1 salbutamol 10,12 2,6 6 3,01995E-06 0, salbutamol 14,18 2,6 6 2,63027E-10 6,60693E-07 3 salbutamol 15,15 2,6 6 2,81838E-11 7,07946E-08 propranolol 14,09 2,6 6 3,23594E-10 8,12831E-07 atropine 15,15 2,6 6 2,81838E-11 7,07946E-08 atenolol 14,08 2,6 6 3,31131E-10 8,31764E-07 1 paracetamol 9,46 2,6 6 1,38038E-05 0, paracetamol 16,65 2,6 6 8,91251E-13 2,23872E-09 1 carisoprodol 15,06 2,6 6 3,46737E-11 8,70964E-08 2 carisoprodol 15,56 2,6 6 1,09648E-11 2,75423E-08 mefenamic acid 3,89 2,6 6 4, , diclofenac 4 2,6 6 3, , sulfamethoxazole 7,66 2,6 6 0, , sulfasalazine 3,3 2,6 6 16, , sulfasalazine 6,75 2,6 6 0, , sulfasalazine 11,78 2,6 6 6,60693E-08 0, metoclopramide 14,49 2,6 6 1,28825E-10 3,23594E-07 1 riboflavin 6,97 2,6 6 0, , riboflavin 12,85 2,6 6 5,62341E-09 1,41254E-05 3 riboflavin 13,96 2,6 6 4,36516E-10 1,09648E-06 4 riboflavin 14,94 2,6 6 4,57088E-11 1,14815E-07 5 riboflavin 15,84 2,6 6 5,7544E-12 1,44544E-08 1 thiocolchicoside 12,2 2,6 6 2,51189E-08 6,30957E-05 2 thiocolchicoside 13,19 2,6 6 2,5704E-09 6,45654E-06 3 thiocolchicoside 14,31 2,6 6 1,94984E-10 4,89779E-07 4 thiocolchicoside 14,79 2,6 6 6,45654E-11 1,62181E-07 lidocaine 13,78 2,6 6 6,60693E-10 1,65959E-06 indomethacin 3,8 2,6 6 5, , ketoprofen 3,88 2,6 6 4, , ethisterone 17,59 2,6 6 1,02329E-13 2,5704E-10 deoxycorticosterone acetate 17,18 2,6 6 2,63027E-13 6,60693E-10 xxiv

134 1-17-ethinylestradiol 10,33 2,6 6 1,86209E-06 0, ethinylestradiol 17,59 2,6 6 1,02329E-13 2,5704E-10 1 diethylstilbestrol 9,13 2,6 6 2,95121E-05 0, diethylstilbestrol 9,73 2,6 6 7,4131E-06 0, fludrocortisone acetate 12,57 2,6 6 1,07152E-08 2,69153E-05 2 fludrocortisone acetate 13,69 2,6 6 8,12831E-10 2,04174E-06 hydroxyzine 15,12 2,6 6 3,01995E-11 7,58578E-08 1 hydrocortisone 12,58 2,6 6 1,04713E-08 2,63027E-05 2 hydrocortisone 13,87 2,6 6 5,37032E-10 1,34896E-06 3 hydrocortisone 14,94 2,6 6 4,57088E-11 1,14815E-07 haloperidol 13,96 2,6 6 4,36516E-10 1,09648E-06 colchicine 15,06 2,6 6 3,46737E-11 8,70964E-08 cinchonidine 13,88 2,6 6 5,24807E-10 1,31826E-06 cortisone acetate 12,6 2,6 6 1E-08 2,51189E-05 ambroxol 15,26 2,6 6 2,18776E-11 5,49541E-08 reserpine 16,29 2,6 6 2,04174E-12 5,12861E-09 1 dipyridamole 14,97 2,6 6 4,2658E-11 1,07152E-07 2 dipyridamole 15,4 2,6 6 1,58489E-11 3,98107E-08 3 dipyridamole 15,75 2,6 6 7,07946E-12 1,77828E-08 4 dipyridamole 16,18 2,6 6 2,63027E-12 6,60693E-09 2-naphthol 9,78 2,6 6 6,60693E-06 0, benzoic acid 4,08 2,6 6 3, , nicotinic acid 2,79 2,6 6 39, , sulfisoxazole 7,3 2,6 6 0, , xxv

135 Παράρτημα ΙΙ Κάτωθι παρουσιάζονται τα φαρμακομόρια τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή της μελέτης, συνοδευόμενα από ορισμένα στοιχεία που αφορούν στην φαρμακολογική τους χρήση και οι εταιρίες από τις οποίες τα προμηθεύτηκε το εργαστήριο. 1 Σουλφισοξαζόλη Sulfisoxazole Sigma-Aldrich Αντιμικροβιακό φάρμακο, που ανήκει στην οικογένεια των σουλφοναμίδων. Περιορισμένη χρήση λόγω γενικευμένης μικροβιακής αντίστασης. 2 Νικοτινικό οξύ Nicotinic acid Sigma-Aldrich Ανήκει στην κατηγορία των βιταμινών του συμπλέγματος Β. Αποτελεί πρόδρομη ουσία του NADP. 3 Βενζοϊκό οξύ Benzoic acid Sigma-Aldrich Χρησιμοποιείται ως λοσιόν εναντίον μυκητιάσεων. Επίσης ως συντηρητικό. 4 2-ναφθόλη 2-naphthol Fluka Πρόδρομη ουσία πολλών φαρμακευτικών ενώσεων.

136 5 Κετοκοναζόλη Ketoconazole Pierce Chemicals Αντιμυκητιασικό φάρμακο, χρησιμοποιείται τοπικά και συστηματικά κυρίως έναντι καντιντιάσεων. 6 Διπυριδαμόλη Dipyridamole Sigma-Aldrich Αντιθρομβωτικό φάρμακο, δίνεται per os, παρεμποδίζει την συγκόλληση των αιμοπεταλίων. 7 Κλοτριμαζόλη Clotrimazole Sigma-Aldrich Αντιμυκητιασικό φάρμακο της οικογένειας των ιμιδαζολίων. Χρησιμοποιείται τοπικά και συστηματικά κυρίως έναντι καντιντιάσεων και δερματόφυτων. 8 Σπειρονολακτόνη Spironolactone Sigma-Aldrich Καλιοσυντηρητικό διουρητικό, ανταγωνιστής της αλδοστερόνης. Χρησιμοποιείται σε κιρρωτικά οιδήματα και περιπτώσεις καρδιακής ανεπάρκειας. II

137 9 Νιφεδιπίνη Nifedipine Sigma-Aldrich Ανταγωνιστής διαύλων ασβεστίου. Χρησιμοποιείται ως αντιυπερτασικό καθώς διαστέλλει τα περιφερικά και στεφανιαία αγγεία και επιβραδύνει τον καρδιακό ρυθμό. 10 Ρεζερπίνη Reserpine Sigma-Aldrich Εκ των πρώτων αντιψυχωσικών φαρμάκων. Δεν χρησιμοποιείται πλέον λόγω σοβαρών παρενεργειών. 11 Αμβροξόλη Ambroxol Sigma-Aldrich Βλεννολυτικό φάρμακο(βοηθά στην απόχρεμψη μειώνοντας το ιξώδες των βρογχικών εκκρίσεων). 12 Κορτιζόνη οξική Cortisone acetate Sigma-Aldrich Κορτικοστεροειδές(δρα μεταβολιζόμενο σε υδροκορτιζόνη). Κατάλληλη για βραχεία χορήγηση. III

138 13 Κιγχονιδίνη Cinchonidine Sigma-Aldrich Αλκαλοειδές, συγγενές της κινίνης(με την οποία έχουν παρεμφερή ανθελονοσιακή δράση), το οποίο όμως δεν χρησιμοποιείται στην θεραπευτική. 14 Κολχικίνη Colchicine Sigma-Aldrich Αλκαλοειδές, φάρμακο εκλογής κατά της οξείας ουρικής αρθρίτιδας. 15 Αλοπεριδόλη Haloperidol Sigma-Aldrich Πρώτης γενιάς αντιψυχωσικό φάρμακο. Ανήκει στην οικογένεια των βουτυροφαινονών. 16 Υδροκορτιζόνη οξική Hydrocortisone acetate Sigma-Aldrich Βραχείας δράσης κορτικοστεροειδές. Χρησιμοποιείται σε οξεία και χρόνια επινεφριδική ανεπάρκεια, αλδοστερονισμό και αγγειοοιδήματα. IV

139 17 Υδροξυζίνη Hydroxyzine (HCL) Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό φάρμακο με ήπιες ηρεμιστικές ιδιότητες. Χρησιμοποιείται σε χρόνια κνίδωση, ατοπική δερματίτιδα και ως ήπιο αγχολυτικό. 18 Φλουδροκορτιζόνη Fludrocortisone acetate Sigma-Aldrich Κορτικοστεροειδές με ισχυρή αλατοκορτικοειδή δράση. Χρησιμοποιείται κυρίως στη νόσο του Addison. 19 Φλουοξετίνη Fluoxetine Sigma-Aldrich Αντικαταθλιπτικό φάρμακο, χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις ιδεοψυχαναγκαστικής διαταραχής και διαταραχής πανικού. 20 Διαιθυλστιλβοιστρόλη Diethylstilbestrol Sigma-Aldrich Συνθετικό οιστρογόνο με χρήση εναντίον του καρκίνου του προστάτη. V

140 21 Διαιθυλστιλβοιστρόλη διπροπιονική Diethylstilbestrol dipropionate Sigma-Aldrich Συνθετικό οιστρογόνο με χρήση εναντίον του καρκίνου του προστάτη. 22 Δεοξυκορτικοστερόνη οξική Deoxycorticosterone acetate Sigma-Aldrich Ακετυλιωμένο ανάλογο της δεοξυκορτικοστερόνης με βραχύτερη δράση. Χρησιμοποιείται για την θεραπεία πρωτοπαθούς επινεφριδιακής ανεπάρκειας ή μεμονωμένου υποαλδοστερονισμού. 23 Αιθιστερόνη Ethisterone Sigma-Aldrich Ανάλογο της τεστοστερόνης, το οποίο χρησιμοποιείται ως νορεθιστερόνη. Βρίσκει εφαρμογή σε περιπτώσεις δυσμηνόρροιας, σε ορμονική θεραπείας υποκατάστασης και ως αντισυλληπτικό αιθυνυλοοιστραδιόλη 17-ethynylestradiol Sigma-Aldrich Συνθετικό οιστρογόνο, χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις έλλειψης οιστρογόνων και ως δεύτερης γραμμής θεραπεία για την προφύλαξη από οστεοπόρωση. VI

141 25 Κλομιφαίνη Clomiphene citrate Pierce Chemicals Αντιοιστρογόνο, το οποίο χρησιμοποιείται για την θεραπεία της γυναικείας υπογονιμότητας. 26 Ανταζολίνη Antazoline phosphate Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό, χρησιμοποιούμενο κυρίως σε τοπικά σκευάσματα, εναντίον της αλλεργικής ρινίτιδας. 27 Ιμιπραμίνη Imipramine HCL Fluka 28 Κετοπροφαίνη Ketoprofen Sigma-Aldrich Τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό (συχνότερα χρησιμοποιούμενο ως χλωριμιπραμίνη) για την θεραπεία της κατάθλιψης και της παιδικής νυκτερινής ενούρησης. Εκ των ισχυρότερων Μη Στεροειδών Αντιφλεγμονωδών Φαρμάκων. Έχει αρκετές παρενέργειες, κυρίως στο γαστρεντερικό σύστημα και είναι παράγωγο του προπιονικού οξέος. VII

142 29 Ινδομεθακίνη Indomethacin Sigma-Aldrich Παράγωγο του προπιονικού οξέος. Αρκετά ισχυρό Μη Στεροειδές Αντιφλεγμονώδες Φάρμακο, με αρκετές παρενέργειες(κυρίως στο γαστρεντερικό και το νευρικό σύστημα). 30 Τετρακαίνη Tetracaine HCL Sigma-Aldrich Τοπικό αναισθητικό, παράγωγο του ΡΑΒΑ, χρησιμοποιείται για επαγωγή τοπικής αναισθησίας βραχείας δράσης προ απλών χειρουργικών επεμβάσεων. 31 Λιδοκαίνη Lidocaine Sigma-Aldrich Τοπικό αναισθητικό, παράγωγο του ΡΑΒΑ, χρησιμοποιείται για επαγωγή τοπικής αναισθησίας βραχείας δράσης προ οδοντιατρικών και οφθαλμικών χειρουργικών επεμβάσεων. 32 Ρανιτιδίνη Ranitidine Sigma-Aldrich Ανταγωνιστής των υποδοχέων της ισταμίνης(η2) στο γαστρεντερικό σύστημα. Η μη έκλυση ισταμίνης συνεπάγεται την μειωμένη παραγωγή γαστρικού υγρού και έτσι η ρανιτιδίνη χρησιμοποιείται ως αντιελκωτικό φάρμακο. VIII

143 33 Θειοκολχικοσίδη Thiocolchicoside Fluka Μυοχαλαρωτικό φάρμακο κεντρικής δράσης. Χρησιμοποιείται για την συμπτωματική ανακούφιση επώδυνων μυϊκών σπασμών. 34 Τριμεθοπρίμη Trimethoprim Sigma-Aldrich Αντιμικροβιακό φάρμακο, χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την σουλφαμεθοξαζόλη σε περιπτώσεις ουρολοιμώξεων. 35 Ριβοφλαβίνη Rivoflavin Sigma-Aldrich Γνωστή και ως βιταμίνη Β2, συμμετέχει σε πλήθος σημαντικών ενζυμικών διεργασιών του οργανισμού. 36 Μετοκλοπραμίδη Metoclopramide HCL Sigma-Aldrich Ανταγωνιστής των ντοπαμινεργικών υποδοχέων, προάγει την γαστρεντερική κινητικότητα και βοηθά στην αντιμετώπιση ναυτίας και εμέτων. IX

144 37 Ναφαζολίνη Naphazoline HCL Sigma-Aldrich Αδρενεργικός αγωνιστής, που χρησιμοποιείται σε τοπικά σκευάσματα για την ανακούφιση τοπικών οφθαλμικών ερεθισμών. 38 Σουλαφασαλαζίνη Sulfasalazine Sigma-Aldrich Φάρμακο το οποίο χρησιμοποιείται εναντίον της ρευματοειδούς και ψωριασικής αρθρίτιδας και εναντίον φλεγμονωδών ιδιοπαθών νόσων του εντέρου. 39 Σουλαφαμεθοξαζόλη Sulfamethoxazole Sigma-Aldrich Σουλφοναμίδη, που χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με την τριμεθοπρίμη για την θεραπεία ουρολοιμώξεων. 40 Δικλοφαινάκη Diclofenac Sigma-Aldrich ΜΣΑΦ παράγωγο του οξικού οξέος. Χρησιμοποιείται κυρίως έναντι μυοσκελετικών πόνων. X

145 41 Μεφαιναμικό οξύ Mefenamic Acid Sigma-Aldrich ΜΣΑΦ παράγωγο του ανθρανιλικού οξέος. Χρησιμοποιείται κυρίως έναντι χρονίων φλεγμονωδών αρθροπαθειών και πρωτοπαθούς δυσμηνόρροιας. 42 Καρισοπροδόλη Carisoprodol Sigma-Aldrich 43 Ακεταμινοφαίνη Paracetamol Acros-Organics Μυοχαλαρωτικό φάρμακο κεντρικής δράσης. Χρησιμοποιείται για την συμπτωματική ανακούφιση επώδυνων μυϊκών σπασμών. Ανήκει στην κατηγορία των ναρκωτικών φαρμάκων, καθώς μπορεί να προκαλέσει εθισμό. Αναλγητικό και αντιπυρετικό φάρμακο(δεν έχει αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες) ευρείας χρήσης. Αντενδείκνυται σε άτομα με ηπατικά προβλήματα. 44 Καφείνη Caffeine Acros-Organics Παράγωγο της ξανθίνης, χρησιμοποιείται ως αναληπτικό και σε ορισμένα αναλγητικά σκευάσματα για να ενισχύσει την παυσίπονη δράση. XI

146 45 Ατενολόλη Atenolol SigmaAldrich β2-αδρενεργικος ανταγωνιστής, χρησιμοποιείται ως αντιαρρυθμικό, αντιυπερτασικό και αντιστηθαγχικό φάρμακο. 46 Ατροπίνη Atropine Fluka Αντιχολινεργικό, χρησιμοποιείται για την ανάταξη σπαστικών καταστάσεων του εντέρου και περιπτώσεων βραδυκαρδίας και στην οφθαλμιατρική ως μυδριατικό,. 47 Προπρανολόλη Propranolol SigmaAldrich β2-αδρενεργικός ανταγωνιστής, χρησιμοποιείται ως αντιαρρυθμικό, αντιυπερτασικό και αντιστηθαγχικό φάρμακο. 48 Σαλβουταμόλη Salbutamol SigmaAldrich Εκλεκτικός β2-αδρενεργικός ανταγωνιστής βραχείας δράσης, χρησιμοποιείται σε αερολύματα ως αντιασθματικό φάρμακο. XII

147 49 Προμεθαζίνη Promethazine Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό της ομάδας των φαινοθειαζιδινών. Έχει έντονη κατασταλτική και αντιχολινεργική δράση, ενώ χρησιμοποιείται και ως αντιεμετικό. 50 Γλιπιζίδη Glipizide Carlo Erba Σουλφονυλουρία δεύτερης γενιάς χρησιμοποιείται για την θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη. 51 Χλωραμφαινικόλη Chloramphenicol Sigma-Aldrich Μικροβιοστατικό, χρησιμοποιείται κυρίως τοπικά σε οφθαλμικές και δερματικές λοιμώξεις(κυρίως από στελέχη Haemophilus). 52 Κεφουροξίμη Cefuroxime Na Sigma-Aldrich Αντιμικροβιακή κεφαλοσπορίνη β' γενιάς, χρησιμοποιείται κυρίως για λοιμώξεις από gram(-) μικροοργανισμούς. XIII

148 53 Διαζεπάμη Diazepam Sigma-Aldrich Ήπιο κατασταλτικό του ΚΝΣ και αγχολυτικό, μακράς διάρκειας δράσης. Χρησιμοποιείται επίσης στην αναισθησιολογία, στην θεραπεία του status epilepticus και της αϋπνίας. 54 Λοραζεπάμη Lorazepam Sigma-Aldrich Ήπιο κατασταλτικό του ΚΝΣ και αγχολυτικό. Χρησιμοποιείται επίσης στην αναισθησιολογία, στην θεραπεία του status epilepticus και της αϋπνίας. Έχει πολύ βραχύτερη δράση της διαζεπάμης. 55 Ακετυλοσαλικυλικό οξύ Αντιπυρετικό, αναλγητικό Acetylsalicylic acid Sigma-Aldrich και αντιφλεγμονώδες, ιδιαίτερα αποτελεσματικό έναντι ρευματικών παθήσεων. Διαθέτει αντιθρομβωτικές ιδιότητες, λόγω της αντιαιμοπεταλιακης της δράσης και χρησιμοποιείται για την προφύλαξη εγκεφαλικών επεισοδίων και καρδιακών συμβαμάτων. 56 Καρβαμαζεπίνη Carbamazepine Sigma-Aldrich Αντιεπιληπτικό το οποίο χρησιμοποιείται έναντι όλων των μορφών εστιακής επιληψίας. Χρήσιμο επίσης έναντι νευραλγιών(όπως η νευραλγία τριδύμου). XIV

149 57 Βεκλομεθαζόνη διπροπιονική Beclomethasone dipropionate Sigma-Aldrich Κορτικοστεροειδές μακράς δράσης, χρήσιμο έναντι του βρογχικού άσθματος και της αλλεργικής ρινίτιδας. 58 Απομορφίνη Apomorphine Fluka Ισχυρός αγωνιστής των ντοπαμινεργικών υποδοχέων που χρησιμοποιείται για την συμπτωματική θεραπεία της νόσου Parkinson. Χρησιμοποιείται επίσης στην κτηνιατρική ως εμετικό σε περίπτωση δηλητηριάσεων. 59 Δεσιπραμίνη Desipramine Sigma-Aldrich Τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό παλαιότερης γενιάς. Έχει αντικατασταθεί από εκλεκτικούς αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης. 60 Διφαινυλυδραμίνη Diphenhydramine Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό της οικογένειας των αιθανολαμινών. Δεν χρησιμοποιείται ευρέως λόγω των ισχυρών κατασταλτικών και αντιχολινεργικών ιδιοτήτων της. XV

150 61 Αμιτριπτυλίνη Amitriptyline Sigma-Aldrich Τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό που εμφανίζει και ισχυρή αντιχολινεργική δράση. 62 Αμιωδαρόνη Amiodarone Sigma-Aldrich Ισχυρό αντιαρρυθμικό, με χρήση σε υπερκοιλιακές και κοιλιακές αρρυθμίες. 63 Αμοβαρβιτάλη Amobarbital Boehringer Ingelheim Μέσης διάρκειας δράσης βαρβιτουρικό, το οποίο χρησιμοποιείται σήμερα μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις μη ανατάξιμης αμνησίας. 64 Χλωροθαλιδόνη Chlorothalidone Sigma-Aldrich Διουρητικό μέτριας ισχύος, το οποίο δρα στην αγκύλη του Henle, με χρήση σε υπέρταση, οιδήματα και άποιο διαβήτη. XVI

151 65 Αλλοπουρινόλη Allopurinol Sigma-Aldrich Αναστολέας της οξειδάσης της ξανθίνης, χρησιμοποιείται προφυλακτικά έναντι της πρωτοπαθούς ή δευτεροπαθούς ουρικής αρθρίτιδας. 66 Βαρφαρίνη Warfarine Sigma-Aldrich Αντιπηκτικό, ανταγωνιστής της βιταμίνης Κ. Χρησιμοποιείται έναντι θρόμβωσης των εν τω βάθει φλεβών και έναντι πνευμονικής εμβολής. 67 Αμοξυκιλλίνη τριυδρική Amoxycillin trihydrate Sigma-Aldrich Από του στόματος χορηγούμενο αντιβιοτικό ευρείας χρήσης. Χορηγείται συνήθως σε συνδυασμό με κλαβουλανικό οξύ. 68 Πραζεπάμη Prazepam Sigma-Aldrich Ήπιο κατασταλτικό του ΚΝΣ και αγχολυτικό, ιδιαίτερα μακράς διάρκειας δράσης. XVII

152 69 Εφεδρίνη Ephedrine SigmaAldrich Αδρενεργικός διεγέρτης. Χρησιμοποιείται τοπικά ως αποσυμφορητικό του ρινικού βλεννογόνου. 70 Διβουκαίνη Dibucaine SigmaAldrich Τοπικό αναισθητικό, με χρήση στην προετοιμασία χειρουργικών επεμβάσεων. 71 Νορτριπτυλλίνη Nortriptylline Sigma-Aldrich Τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό που εμφανίζει και μέτρια αντιχολινεργική δράση. 72 Ναπροξένη Naproxene Minerva Pharmaceuticals Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες, παράγωγο του προπιονικού οξέος. Ενδείκνυται σε πρωτοπαθή δυσμηνόρροια και επώδυνα μυοσκελετικά σύνδρομα. XVIII

153 73 Διλτιαζέμη Diltiazem Sigma-Aldrich Ανταγωνιστής διαύλων ασβεστίου, χρησιμοποιείται ωα αντιστηθαγχικό σε στηθάγχη τύπου Prinzmetal και ως αντιυπερτασικό σε ελαφράς εως μέτριας βαρύτητας υπέρταση. 74 Νοσκαπίνη Noscapine HCl Sigma-Aldrich Αλκαλοειδές, περιεχόμενο στο όπιο. Έχει αντιβηχικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται κατά του ξηρού βήχα. Δεν προκαλεί ευφορία. 75 Μετρονιδαζόλη Metronidazole Sigma-Aldrich Αντιμικροβιακό φάρμακο της τάξης των ιμιδαζολίων. Δραστικό κυρίως έναντι αναερόβιων μικροοργανισμών. 76 Πιροξικάμη Piroxicam Sigma-Aldrich Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες της τάξης των οξικαμών. Χρήση έναντι πρωτοπαθούς δυσμηνόρροιας, επώδυνων μυοσκελετικών συνδρόμων και οξείας ουρικής αρθρίτιδας XIX

154 77 Νορφλοξασίνη Norfloxacin Sigma-Aldrich Κινολόνη β' γενεάς, ευρέως αντιμικροβιακού φάσματος, με χρήση κυρίως έναντι ουρολοιμώξεων. 78 Καρβιντόπα Carbidopa Sigma-Aldrich 79 Βιπεριδίνη Biperidine Sigma-Aldrich Αναστολέας της αποκαρβοξυλάσης της λεβοντόπα. Χορηγείται για την θεραπεία του Parkinson σε συνδυασμό με την λεβοντόπα, ώστε να μειώσει την περιφερική μετατροπή της λεβοντόπα σε ντοπαμίνη, περιορίζοντας έτσι τις παρενέργειες της. Αντιχολινεργικό, με χρήση έναντι του πρωτοπαθούς και δευτεροπαθούς παρκινσονισμού. 80 Γκαμπαπεντίνη Gabapentin Sigma-Aldrich Αντιεπιληπτικό, αγωνιστής των GABA υποδοχέων, χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με άλλα αντιεπιληπτικά φάρμακα. Βρίσκει επίσης εφαρμογή στην αντιμετώπιση του νευροπαθητικού πόνου. XX

155 81 Καπτοπρίλη Captopril Sigma-Aldrich Αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης. Ενδείκνυται σε θεραπεία αρτηριακής υπέρτασης και συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας. 82 Χλωροφαινυραμίνη Chloropheniramine Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό της οικογενείας των αλκυλαμινών. Έχει ασθενή δράση, λίγες παρενέργειες και χρησιμοποιείται έναντι αλλεργικών καταστάσεων. 83 Σιμετιδίνη Ανταγωνιστής των Cimetidine υποδοχέων της Sigma-Aldrich ισταμίνης(η2) στο γαστρεντερικό σύστημα. Η μη έκλυση ισταμίνης συνεπάγεται την μειωμένη παραγωγή γαστρικού υγρού και έτσι η σιμετιδίνη χρησιμοποιείται ως αντιελκωτικό φάρμακο. 84 Κλοβαζάμη Clobazam Sigma-Aldrich Βενζοδιαζεπίνη μέσης διάρκειας δράσης, η οποία εκτός από την θεραπεία αγχωδών διαταραχών, χρησιμοποιείται ως συμπληρωματική θεραπεία της επιληψίας. XXI

156 85 Κλονιδίνη Clonidine SigmaAldrich α-αδρενεργικός αγωνιστής, ο οποίος χρησιμοποιείται ως αντιυπερτασικό σε όλες τις μορφές υπέρτασης. 86 Τολβουταμίδη Tolbutamide SigmaAldrich Σουλφονυλουρία πρώτης γενιάς, βραχείας δράσης. Χρησιμοποιείται έναντι του σακχαρώδους διαβήτη(σήμερα έχει αντικατασταθεί από νεώτερες σουλφονυλουρίες). 87 Θεοφυλλίνη Theophylline Lavipharm Παράγωγο ξανθίνης, χρησιμοποιείται ως βρογχοδιασταλτικό για την αντιμετώπιση κρίσεων βρογχικού άσθματος και χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας. 88 Ζιπεπρόλη Zipeprol SigmaAldrich Αντιβηχικό κεντρικής δράσης, δρα και ως βρογχοδιασταλτικό. Μπορεί να προκαλέσει εξάρτηση και ανήκει στην κατηγορία των ναρκωτικών φαρμάκων. XXII

157 89 Επινεφρίνη Epinephrin Sigma-Aldrich Ισχυρός αδρενεργικός διεγέρτης, χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις καρδιακής ανακοπής. 90 Ισοπρεναλίνη Isoprenalin Evans Medical Ισχυρός αδρενεργικός διεγέρτης, χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις κολποκοιλιακού αποκλεισμού ή καρδιακής ανακοπής. 91 Φαινυλεφρίνη Phenylephrine PierceChemicals α- αδρενεργικός διεγέρτης, χρησιμοποιείται τοπικά στην οφθαλμιατρική ως μυδριατικό. 92 Τερβουταλίνη Terbutaline Sigma-Aldrich β-αδρενεργικός υποδοχέας βραχείας δράσης με χρήση στην θεραπεία του βρογχικού άσθματος. XXIII

158 93 Τριμιπραμίνη Trimipramine Sigma-Aldrich Τρικυκλικό αντικαταθλιπτικό παλαιότερης γενιάς. Έχει αντικατασταθεί από εκλεκτικούς αναστολείς επαναπρόσληψης σεροτονίνης. 94 Τριφλουπρομαζίνη Triflupromazine Sigma-Aldrich Αντιψυχωσικό, χρησιμοποιείται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που παρατηρείται έντονη ψυχοκινητική διέγερση. 95 Φλουρμπιπροφαίνη Flurbiprofen Pierce Chemicals Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες παράγωγο του προπιονικού οξέος. Χρήση έναντι επώδυνων μυοσκελετικών συνδρόμων και οξείας ουρικής αρθρίτιδας. 96 Υδροχλωροθειαζίδη Hydrochlorothiazide Sigma-Aldrich Θειαζιδικό διουρητικό, χρησιμοποιείται έναντι υπέρτασης και οιδημάτων καρδιακής ανεπάρκειας. XXIV

159 97 Μελοξικάμη Meloxicam Sigma-Aldrich Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες, το οποίο χρησιμοποιείται κυρίως έναντι ρευματικών και εκφυλιστικών αρθροπαθειών. 98 Τριαμτερένη Triamterene Sigma-Aldrich Καλιοσυντηρητικό διουρητικό, χρησιμοποιείται εναντίον της υπέρτασης. 99 Τικλοπιδίνη Ticlopidine HCl Sigma-Aldrich Αντιθρομβωτικό, χρησιμοποιείται για την πρόληψη εγκεφαλικών επεισοδίων και καρδιακών συμβαμάτων, εξαιτίας της αντιαιμοπεταλιακής της δράσης. 100 Τριπρολιδίνη Triprolidine Sigma-Aldrich Αντιισταμινικό παλαιότερης γενιάς, έχει αντικατασταθεί από νεότερα φάρμακα. XXV

160 101 Ραμιπρίλη Ramipril SigmaAldrich Αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης. Ενδείκνυται σε θεραπεία αρτηριακής υπέρτασης. 102 Λισινοπρίλη Lisinopril SigmaAldrich Αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης. Ενδείκνυται σε θεραπεία αρτηριακής υπέρτασης. 103 Φαινοβαρβιτάλη Phenobarbital Boehringer Ingelheim Βαρβιτουρικό μακράς διάρκειας δράσης, χρησιμοποιείται στην θεραπεία της επιληψίας. XXVI

161 104 Ακεταζολαμίδη Acetazolamide Sigma-Aldrich Αναστολέας της καρβονικής ανυδράσης, χρησιμοποιείται κυρίως στην θεραπεία του γλαυκώματος διότι χρησιμοποιείται για να ελαττώσει την ενδοφθάλμια πίεση. 105 Καρβοκυστείνη Carbocysteine Sigma-Aldrich Βλεννολυτικό, χρησιμοποιείται για την ρευστοποίηση των βρογχικών εκκρίσεων. 106 Φλουφεναμικό οξύ Flufenamic acid Sigma-Aldrich ΜΣΑΦ παράγωγο του ανθρανιλικού οξέος. Χρησιμοποιείται κυρίως έναντι χρονίων φλεγμονωδών αρθροπαθειών και πρωτοπαθούς δυσμηνόρροιας. 107 Γλιβενκλαμίδη Glibenclamide Sigma-Aldrich Σουλφονυλουρία μακράς διάρκειας δράσης, η οποία χρησιμοποιείται για την θεραπεία του σακχαρώδους διαβήτη. XXVII

162 108 Ναλιδιξικό οξύ Nalidixic acid Sigma-Aldrich Πρώτης γενιάς κινολόνη, χρησιμοποιήθηκε παλαιότερα για την θεραπεία λοιμώξεων του κατώτερου ουροποιητικού συστήματος. Έχει αντικατασταθεί από νεώτερες κινολόνες. 109 Νιφλουμικό οξύ Niflumic acid Sigma-Aldrich ΜΣΑΦ παράγωγο του νικοτινικού οξέος. Χρησιμοποιείται έναντι φλεγμονωδών και εκφυλιστικών παθήσεων των αρθρώσεων. 110 Νιφουροξαζίδη Nifuroxazide Lavipharm Αντιδιαρροϊκό, χρησιμοποιούμενο σε διάρροιες οφειλόμενες σε λοιμώξεις. XXVIII

163 Παράρτημα ΙΙΙ Φάσματα 12 χαρακτηριστικών φαρμακομορίων στην μελέτη με την χρήση χρωματογραφικής στήλης 1. Meloxicam 2. Reserpine 3. Glipizide

164 4. Cefuroxime 5. Phenobarbital 6. Cimetidine B

165 7. Chloramphenicol 8. Amobarbital 9. Metronidazole C

166 10. Tolbutamide 11. Hydrochlorothiazide 12. Salbutamol D

167 Φάσματα 12 χαρακτηριστικών φαρμακομορίων στην μελέτη χωρίς την χρήση χρωματογραφικής στήλης-(fia) 1. Amobarbital 2. Carbidopa 3. Chloramphenicol 4. Flufenamic acid E

168 5. Glipizide 6. Meloxicam 7. Niflumic acid 8. Piroxicam F

169 9. Ramipril 10. Sulphasalazine 11. Tolbutamide 12. Warfarine G

170 Φάσματα της δοκιμασίας με την χρήση 5 διαφορετικών όγκων εγχύσεως Όγκος εγχύσεως 5 μl Όγκος εγχύσεως 10 μl Όγκος εγχύσεως 20 μl Όγκος εγχύσεως 30 μl Όγκος εγχύσεως 50 μl H

171 Φάσματα μαζών 4 ενδεικτικών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της επίδρασης 5 διαφορετικών κινητών φάσεων(ch 3CN, Η 2O/formic acid, H 2O, MeOH, H 2O/NH 3) στο λαμβανόμενο σήμα. 2,0 Inten. (x1,000) 266 1,0 0,0 265,0 265,1 265,2 265,3 265,4 265,5 265,6 265,7 265,8 265,9 266,0 266,1 266,2 266,3 266,4 266,5 266,6 266,7 266,8 266,9 m/z Sulphisoxazole sim Sulphisoxazole sim CH 3CN Sulphisoxazole sim formic Sulphisoxazole sim H 2O Sulphisoxazole sim MeOH Sulphisoxazole sim NH 3 I

172 2,0 Inten. (x1,000) 179 1,0 0,0 178,0 178,1 178,2 178,3 178,4 178,5 178,6 178,7 178,8 178,9 179,0 179,1 179,2 179,3 179,4 179,5 179,6 179,7 179,8 179,9 m/z Theophylline sim Theophylline sim CH 3CN Theophylline sim formic Theophylline sim H 2O Theophylline sim MeOH Theophylline sim NH 3 J

173 2,0 Inten. (x1,000) 598 1,5 1,0 0,5 0,0 597,0 597,1 597,2 597,3 597,4 597,5 597,6 597,7 597,8 597,9 598,0 598,1 598,2 598,3 598,4 598,5 598,6 598,7 598,8 598,9 m/z Thiocolchicoside sim Thiocolchicoside sim CH 3CN Thiocolchicoside sim formic Thiocolchicoside sim H 2O Thiocolchicoside sim MeOH Thiocolchicoside sim NH 3 K

174 2,0 Inten. (x1,000) 269 1,5 1,0 0,5 0,0 268,0 268,1 268,2 268,3 268,4 268,5 268,6 268,7 268,8 268,9 269,0 269,1 269,2 269,3 269,4 269,5 269,6 269,7 269,8 269,9 m/z Tolbutamide sim Tolbutamide sim CH 3CN Tolbutamide sim formic Tolbutamide sim H 2O Tolbutamide sim MeOH Tolbutamide sim NH 3 L