ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ. MASS SPECTROMETRY (μέρος 2)

Transcript

1 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ MASS SPECTRMETRY (μέρος 2) Πηγές Ιόντων Σύστημα Εισαγωγής δείγματος Στερεά ή Υγρά με ESI, APCI, AP-MALDI Αέρια ή πτητικά υγρά με EI, CI, ή FI Πηγή Ιόντων Στερεά με MALDI ή LSIMS ιόντα 10-3 έως Torr Αναλυτής m/z Κενό ιόντα Ανιχνευτής Computer / υπολογιστικό σύστημα Στο τμήμα αυτό λαμβάνει χώρα ο ιοντισμός του δείγματος 1

2 Πηγές Ιόντων Πηγές Αέριας Φάσης: Το δείγμα πρώτα εξαερώνεται και μετά ιοντίζεται Πρόσκρουσης ηλεκτρονίων (Electron Impact, EI) Χημικού ιοντισμού (Chemical Ionization, CI) Πηγές εκρόφησης: Το δείγμα, σε υγρή ή στερεά κατάσταση, μετατρέπεται σε αεριώδη ιόντα Βομβαρδισμού με άτομα μεγάλης ταχύτητας (Fast Atom Bombardment, FAB) Ιοντισμός εκρόφησης με τη βοήθεια υλικού μήτρας (Matrix Assisted Desorption Ionization, MALDI) Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων - ΕΙ - Τα e - παράγονται από ένα θερμαινόμενο νήμα (W ή Re) και επιταχύνονται με μια τάση 70 V (σταθερή ενέργεια επιτάχυνσης): M e - M 2e - M M 2

3 Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων - ΕΙ - Ιοντισμός : Θραυσματοποίηση : Μ e - M 2e - M ΜΟΡΙΑΚΟ ΙΟΝ EE EVE I ΟE DD I R ΡΙΖΑ ΜΟΡΙΟ Θυγατρικά ιόντα: EE : ιόν με άρτιο αριθμό e E : ιόν με περιττό αριθμό e Φάσματα ΕΙ - MS Mass Spectrometry of Inorganic and rganometallic Compounds W. HEDERS AD J. S. McIDE Wiley,

4 Ιοντισμός με πρόσκρουση ηλεκτρονίων - ΕΙ - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Καθιερωμένη και επαρκώς μελετημένη τεχνική Μπορεί να εφαρμοστεί πρακτικά σε όλα τα πτητικά μόρια Επαναλήψιμο φάσμα μαζών Η θραυσματοποίηση χρησιμοποιείται για ταυτοποίηση δομής Αποτελεί τη βάση για την ανάπτυξη βιβλιοθηκών φασμάτων μαζών που περιέχουν το «αποτύπωμα» κάθε ένωσης ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικό Το μοριακό ιόν μπορεί να απουσιάζειήανέχειχαμηλήαφθονία ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Η πλέον χρησιμοποιούμενη πηγή ιόντων στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (< 1000 Da). Χημικός Ιοντισμός - CΙ - Βομβαρδισμός αέριου αντιδραστηρίου (συχνά CH 4, ΝΗ 3 ήν 2 ) με e - υψηλής ενέργειας με αποτέλεσμα το σχηματισμό ιόντων του αντιδραστηρίου. Τα αέρια μόρια (Μ) του δείγματος συγκρούονται με τα ιόντα του αντιδραστηρίου και τα ιοντίζουν με αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίων ή φορτίου, προσθήκης, ακόμα και πυρηνόφιλης υποκατάστασης. Προϋπόθεση: ο λόγος [αντιδραστηρίου]/[δείγματος]= CI Χαμηλής πίεσης: Torr, ιδανική για GC-MS CI Ατμοσφαιρικής πίεσης: APCI, ιδανική για LC-MS 4

5 Χημικός Ιοντισμός - CΙ - CH 4 e- CH 4 2e- CH 2 H 2 and CH 3 H CH 4 CH 4 CH 5 CH3 Ισχυρός πρωτονιοδότης CH 3 CH 4 C 2 H 5 H2 CH 2 2CH 4 C 3 H 5 2H 2 H Ιοντίζουν μέσω συγκρούσεων και παραγωγής συμπλόκων Interpretation of Mass Spectra. D. SPARKMA AD J. T. WATS Copyright USA ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΦΟΡΤΙΟΥ Τύποι Χημικού Ιοντισμού CH 4 RH RH CH 4 M ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΟΝΙΟΥ RH RH 2 CH 4 [M 1] C 2 H 5 RH RH 2 C 2 H 4 CH 5 ΑΠΟΣΠΑΣΗ ΥΔΡΙΔΙΟΥ RH R CF 3 H [M 1] C 2 H 5 RH R C 2 H 6 CF 3 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΙΟΝΤΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΣΥΓΚΡΟΥΣΗ C 2 H 5 RH (C 2 H 5 :RH) [M 29] C 3 H 5 RH (C 3 H 5 :RH) [M 41] Interpretation of Mass Spectra. D. SPARKMA AD J. T. WATS Copyright USA 5

6 CH C H 2 H 3 C C C 2 H HC C H CH 2 CH 3 H CH C H C H 3 C C CH 3 HC C 2-3 C H Pentobarbital 2 CH 2 CH 3 H 2 C CH 3 MM 200 Da Σκληρή Πηγή EI o Visible Peak at m/z (Text File) EI Spectrum of Malomamide Μαλακή Πηγή MH 201 Methane CI Ammonia CI MH (Text File) Metane CI of Malomamide 149 [MC 2 H 5 ] 229 [MC 3 H 5 ] 241 Interpretation of Mass Spectra. D. SPARKMA AD J. T. WATS Copyright USA (Text File) H3 CI Malomamide Χημικός Ιοντισμός - CΙ - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης, παράγοντας συνήθως τα ψευδομοριακά ιόντα [Μ1] ή [Μ-1] Απλό φάσμα μαζών χωρίς ιδιαίτερη θραυσματοποίηση ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Το δείγμα πρέπει να είναι θερμικά σταθερό και επαρκώς πτητικό Η ελλιπής θραυσματοποίηση δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ταυτοποίηση ένωσης μέσω έρευνας σε βιβλιοθήκες MS Τα αποτελέσματα εξαρτώνται από τον τύπο του αερίου, την πίεση ή τον χρόνο αντίδρασης και τη φύση του δείγματος ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Χρησιμοποιείται στην τεχνική GC-MS (Q ή IT) για τον προσδιορισμό μη πολικών μορίων χαμηλής μοριακής μάζας (< 1000 Da). 6

7 Ακτίνες παλμικού laser Ιοντισμός με εκρόφηση: (A) ΜALDI Πριν την εκρόφηση με laser Μετά την εκρόφηση με laser Mass Spectrometry of Inorganic and rganometallic Compounds W. HEDERS AD J. S. McIDE Wiley, ΜALDI - Συχνότερα χρησιμοποιούμενες μήτρες για MALDI 7

8 - ΜALDI - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Δίνει πληροφορία για το ΜΒ της ένωσης, παράγοντας συνήθως τα μονοφορτισμένα μοριακά ιόντα [Μ1] Απλό φάσμα μαζών χωρίς θόρυβο υποβάθρου και θραύσματα Εξαιρετικά διαδεδομένη τεχνική στην ανάλυση πρωτεϊνών ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Χαμηλή επαναληψιμότητα Ο αναλύτης δεν πρέπει να απορροφά την ακτινοβολία λέιζερ Απαιτεί παλμικό αναλυτή μαζών (TF, IT) ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Χρησιμοποιείται στην τεχνική TF-MS για τον προσδιορισμό πολικών βιομορίων μεγάλης μοριακής μάζας (> Da). Ιοντισμός με εκρόφηση: (Β) FAB (Xe ή Cs) Mass Spectrometry of Inorganic and rganometallic Compounds W. HEDERS AD J. S. McIDE Wiley,

9 - FAB - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Γρήγορη και απλή τεχνική Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων Οι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτη θερμικά ασταθών μορίων Απλά φάσματα, με μοριακά ιόντα και ισχυρά ιοντικά ρεύματα, οπότε είναι κατάλληλη για μετρήσεις MS υψηλής διακριτικής ικανότητας ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Υψηλός χημικός θόρυβος υποβάθρου Ο αναλύτης πρέπει να είναι διαλυτός και σταθερός σε υγρή μήτρα Προβληματική λειτουργία σε χαμηλά m/z (<200 Da) ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Χρησιμοποιείται με όργανα MS μαγνητικού τομέα για τον προσδιορισμό πολικών οργανικών (βιο)μορίων σχετικά μεγάλης μοριακής μάζας (>200 Da), καθώς και τη μελέτη υλικών (SIMS). Ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση - ΑΡΙ - Ιοντισμός με Ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) Tο υγρό δείγμα ψεκάζεται μέσα από τριχοειδή σωλήνα στον οποίο εφαρμόζεται υψηλή τάση (3-4 kv) και σχηματίζεται αερόλυμα φορτισμένων σταγονιδίων Χημικός ιοντισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure CI, APCI) Το υγρό δείγμα διέρχεται μέσα από ένα θερμαινόμενο τριχοειδή σωλήνα (450 C) και εξατμίζεται, παράγοντας αεριώδη μόρια. Πλησίον της εξόδου του σωλήνα, υπάρχει μια ακίδα σε υψηλή τάση που ιοντίζει τον αέριο διαλύτη ή το 2 ( 2 ), το οποίο με τη σειρά του ιοντίζει τα μόρια του αναλύτη στην αέρια φάση (μεταφορά φορτίου) 9

10 Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό - ESΙ - ESI Ιοντισμός με ηλεκτροψεκασμό - ESΙ - 10

11 - ESI - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Τεχνική προσδιορισμού ΜΒ χωρίς περιορισμούς στη μάζα Καλή τεχνική ιοντισμού για ποικιλία μορίων (μετρίως πολικών και πολικών) Οι σχετικά χαμηλές θερμοκρασίες ιοντισμού επιτρέπουν τη μελέτη θερμικά ασταθών μορίων Καλή ευαισθησία, εύκολη ποσοτικοποίηση Συνδυάζεται με LC και τριχοειδή ηλεκτροφόρηση ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Απαραίτητα χαμηλή ροή κινητής φάσης Τα ιόντα του αναλύτη δημιουργούνται στην υγρή φάση Απόσβεση σήματος σε διαλύματα με άλατα και ανταγωνιστική μήτρα Σχηματισμός ιόντων προσθήκης (adduct ions) ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Χρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μορίων μεγάλου εύρους μαζών (από μικρά πολικά μόρια έως μεγάλα βιομόρια) Χημικός Ιοντισμός σε Α.Π. - APCΙ - H 2 e - H 2 2e - H 2 H 2 H 3 H Θετικός : H 3 M [MH] H 2 Αρνητικός: H M [M-H] - H 2 APCI 11

12 - APCI - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Σχηματισμός μοριακού ιόντος (πληροφορία για το MB) Εύκολη στη χρήση, με πολύ καλή επαναληψιμότητα Καλή ευαισθησία (συχνά καλύτερη του ESI) Μεγάλο εύρος στη ροή της κινητής φάσης (0,2 2 ml/min) Συνδυάζεται με LC και με συστήματα ESI ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ: Ακατάλληλη για ενώσεις με ΜΒ>2000. Δεν σχηματίζει σειρές πολλαπλών φορτίων και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμούς μεγάλων βιομορίων Οι σχετικά υψηλές θερμοκρασίες δεν επιτρέπουν τη μελέτη θερμικά ασταθών μορίων (θερμοδιάσπαση ευπαθών μορίων) Αυξημένος θόρυβος σε χαμηλές τιμές m/z Απαραίτητη η χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων ΕΦΑΡΜΟΓΗ: Χρησιμοποιείται με όργανα LC-MS για τον προσδιορισμό μετρίως πολικών μορίων μικρών μοριακών μαζών Σύγκριση ESI APCΙ 100,000 Μοριακή μάζα 1000 ESI και HESI APPI APCI Μη-Πολικά Πολικά 12

13 Σύγκριση ESI APCΙ Ιοντισμός: Δυναμικό: Θραυσματοποίηση: Αναλύτες: Ιόντα: Ροή κινητής φάσης APCI Στην αέρια φάση Εφαρμόζεται στη ακίδα Πιο «σκληρή» τεχνική, περισσότερα θραύσματα ΜΒ<1000 Μέτριας πολικότητας Μονοφορτισμένα 0,2-2 ml/min ESI Στο διάλυμα Εφαρμόζεται στον τριχοειδή σωλήνα «Μαλακός» ιοντισμός, λιγότερα θραύσματα Μικρά και μεγάλα μόρια, κυρίως πολικά Μονοφορτισμένα και πολλαπλών φορτίων 0,001 1 ml/min (κυρίως <0,4 ml/min) Σύζευξη HPLC με MS Συζευγμένη τεχνική Χρησιμοποιείται στον: 1. Προσδιορισμό μη πτητικών ενώσεων (αποφυγή παραγωγοποιήσης και χρήσης GC) 2. Προσδιορισμό θερμοευαίσθητων ενώσεων που δεν μπορούν να προσδιοριστούν με GC-MS 3. Προσδιορισμό της καθαρότητας χρωματογραφικής κορυφής και την ταυτοποίηση δομής άγνωστων ενώσεων (πχ μεταβολιτών φαρμάκων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών κ.ά.) 13

14 Σύζευξη HPLC με MS Προβλήματα Σύζευξης 1. Ασυμβατότητα μεταξύ των σχετικά μεγάλων όγκων διαλυτών της HPLC και του κενού που απαιτείται από το MS 2. Ασυμβατότητα με τα μη πτητικά ρυθμιστικά διαλύματα της κινητής φάσης της HPLC 3. Προβληματικός ιοντισμός μη πτητικών και θερμοευαίσθητων ενώσεων Σύζευξη HPLC με MS Επίλυση προβλημάτων σύζευξης 1. Χρήση στηλών μικρής διαμέτρου και μήκους (με ταυτόχρονη μείωση του μεγέθους των σωματιδίων του πληρωτικού υλικού) και ελαχιστοποίηση του νεκρού όγκου 2. Διαχωρισμόςροήςκινητήςφάσης, ώστε ένα μόνο μικρό κλάσμα να εισάγεται στην πηγή ιόντων 3. Χρήση πτητικών ρυθμιστικών διαλυμάτων (HCH/HCH 4 ) και ρυθμιστών ph της κινητής φάσης της HPLC (HCH, CH 3 CH, τριαιθυλαμίνη) 4. Χρήση νέων τεχνικών ιοντισμού: ESI, APCI, MALDI 14

15 LC MS Θετικός ιοντισμός Βάσεις (-ΝΗ 2 ): [ΜΗ] M1 [MH 4 ] H M18 [Ma] CH 3 M23 Cl H 3 C [MK] M39 Cl Linuron [MMeHH] M32 [MCH 3 CH] M42 Ιόντα προσθήκης (Adducts) Αρνητικός ιοντισμός Οξέα (-CH, -H): [M-H] - M-1 CH 3 [MCH 3 CH-H] - M59 CH 3 [MHCH-H] - M45 H 3 C H Ibuprofen Διαδοχική Φασματομετρία Μαζών Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) 1. Το μητρικό ή πρόδρομο ιόν (parent or precursor ion) παράγεται στην πηγή ιοντισμού και επιλέγεται από το 1 ο τετράπολο (MS1) 2. Οδηγείται στο 2 ο τετράπολο (κυψελίδα συγκρούσεων) όπου συγκρούεται με περίσσεια ενός αδρανούς αερίου (Ar ή He), παράγοντας θυγατρικά ιόντα (daughter or product ions) 3. Ο διαχωρισμός και μέτρηση των θυγατρικών ιόντων γίνεται στο 3 ο τετράπολο (MS2) Τριπλό Τετράπολο MS1 Κυψελίδα Συγκρούσεων (Collision Cell) MS2 15

16 Θραυσματοποίηση μέσω συγκρούσεων Collision Induced Dissociation (CID) ή Collision Activated Dissociation (CAD) Ar Ar Ar Ar Φασματομετρία Μαζών Πλήρους Σάρωσης Full-Scan Mass Spectrometry Σάρωση Διέλευση Διέλευση (RF only) Πλεονέκτημα: Πληροφορία για το ΜΒ Μειονεκτήματα: - Αργή σάρωση - Όχι ποσοτικοποίηση 16

17 Full-Scan MS της Buspirone 100 [ΜΗ] 386 Relative Abundance Buspirone C 21 H MW = [Μa] m/z Παρακολούθηση επιλεγμένου ιόντος Single Ion Monitoring (SIM) Επιλεγμένο m/z Διέλευση Διέλευση Πλεονεκτήματα: Παρακολούθηση συγκεκριμένου αναλύτη Γρήγορη σάρωση Απλότητα Μειονεκτήματα: Παρεμποδίσεις Όχι τόσο ευαίσθητο όσο η SRM λειτουργία 17

18 MS/MS θυγατρικών ιόντων Product Ion Scanning Επιλεγμένο m/z Θραυσματοποίηση Σάρωση Φάσμα θυγατρικών ιόντων Πλεονέκτημα: Παρέχει πληροφορίες για τη δομή Μειονέκτημα: Αργή σάρωση Όχι ποσοτικοποίηση Φάσμα θυγατρικών ιόντων της Buspirone H (MH) 386 H 75 Relative Abundance 50 H m/z 18

19 ΜS/MS επιλεγμένου μητρικού ιόντος Precursor Ion Scanning Σάρωση Θραυσματοποίηση Επιλεγμένο m/z Φάσμα μητρικών ιόντων Πλεονέκτημα: Ταυτοποίηση ενώσεων που δίνουν ένα συγκεκριμένο θυγατρικό ιόν (π.χ., P 3 τα φωσφοπεπτίδια) Μειονέκτημα: Αργή σάρωση MS/MS μητρικών ιόντων των μεταβολιτών της Buspirone H 75 Relative Abundance Relative Abundance Time (min) m/z Precursor Ion Scan: Το Q3 παρακολουθεί μόνο το m/z

20 Παρακολούθησης επιλεγμένης αντίδρασης Selected Reaction Monitoring (SRM) Επιλεγμένο m/z Θραυσματοποίηση Επιλεγμένο m/z Μετάπτωση ή «αντίδραση» : m 1 /z m 2 /z Πλεονεκτήματα: Παρακολούθηση επιλεγμένου αναλύτη Γρήγορη σάρωση Ταυτόχρονη παρακολούθηση πολλών μεταπτώσεων (MRM) Μειονέκτημα: Οι πληροφορίες για τη δομή της ένωσης είναι περιορισμένες Εκλεκτικότητα MS/MS σε δείγματα με πολύπλοκη μήτρα 20

21 Χρήσιμοι ιστότοποι για MS American Society for Mass Spectrometry (ASMS) Γενική εισαγωγή στην τεχνική MS: Εκπαιδευτικές πηγές: University of Arizona Dept. of Chemistry: Michigan State University - Dept. of Chemistry: Isotope Pattern Calculator: Συγγράμματα D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. ieman «Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης», Μτφ. Μ.Ι. Καραγιάννης, Κ.Η. Ευσταθίου, Ν. Χανιωτάκης, Eκδόσεις Kωσταράκη, Αθήνα, 2002: Κεφ. 20, 27Δ-3 και 28Γ-6 (σελ.859) J. Throck Watson and. David Sparkman Introduction to Mass Spectrometry: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation 4th Edition, John Wiley & Sons, 2007 Ε. De Hoffmann and V. Stroobant Mass Spectrometry, Principles and Applications 3 rd Edition, John Wiley & Sons, 2007 Κ. Downard Mass Spectrometry A Foundation Course 2 nd Edition, RSC,

22 Σχήματα Τα σχήματα της παρουσίασης ήταν από τις παρακάτω πηγές: Ευγενική παραχώρηση σχημάτων από τον Prof.. David Sparkman (από το βιβλίο του J. Throck Watson and. David Sparkman Introduction to Mass Spectrometry, 4th Edition: Instrumentation, Applications, and Strategies for Data Interpretation John Wiley & Sons, 2007) D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. ieman «Αρχές της Ενόργανης Ανάλυσης», Eκδόσεις Kωσταράκη, Αθήνα, 2002: Κεφ. 11 και 20 W. Henderson, J. S. McIndoe, Mass Spectrometry of Inorganic and rganometallic Compounds Wiley, 2005 Thermo Quantum TSQ Training course,