Στοιχειακή ανάλυση. Ποιοτικήστοιχειακή ανάλυση: µε καύση της ένωσης παρουσία Ο 2 ανιχνεύεται το είδος των ατόµων του µορίου

Transcript

1 Στοιχειακή ανάλυση Ποιοτικήστοιχειακή ανάλυση: µε καύση της ένωσης παρουσία Ο 2 ανιχνεύεται το είδος των ατόµων του µορίου Ποσοτική στοιχειακή ανάλυση: υπολογισµός Εµπειρικού Τύπου CxHyOz Με καύση συγκεκριµένης µάζας της ένωσης παρουσία Ο 2 ανιχνεύεται η παραγόµενη ποσότητα H 2 O και CO 2 και υπολογίζεται το % ποσοστό καθώς και η ακέραια αναλογία των ατόµων στο µόριο (ΕΤ) Εµπειρικός Τύπος + Μοριακό Βάρος -> Μοριακός Τύπος ET + MB -> MT

2 Βαθµός Ακορεστότητας Για Μοριακό Τύπο Cx Hy Nz Xw ο Βαθµός Ακορεστότητας R (αριθ. δ.δ. ή/και τ.δ. ή/και δακτυλίων ) δίδεται από τον τύπο R = C x/2 + N/2-H/2 R = 1 1δ.δ. ή 1 R = 2 1δ.δ. + 1 ή 2 δ.δ. ή 2 ή 1 τ.δ. R = 4

3 ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ - Mass Spectrometry «εντάσσεται» στην Φασµατοσκοπία γίνεται µέτρηση των παραγοµένων ιόντων Tα µόρια µιας ένωσης µετατρέπονται σε ιόντα, διαχωρίζονται µε τη χρήση ηλεκτρικού ή/και µαγνητικού πεδίου και καταγράφονται µε βάση το λόγο: µάζα/φορτίο m/z z=1 e- (υπολογισµός της µάζας του µορίου και ιόντων) κυρίως ΜΒ ΘΑΛΑΜΟΣ ΙΟΝΙΣΜΟΥ: : τα µόρια της ένωσης ιονίζονται µε απώλεια ενός e- -παραγωγή ιόντων- ANΑΛΥΤΗΣ: τα ιόντα διαχωρίζονται µε βάση τη µάζα και το φορτίο -διαχωρισµός- ΑΝΙΧΝΕΥΤΗΣ: γίνεται καταµέτρηση και καταγραφή των διαχωρισµένων ιόντων -παρουσίαση δεδοµένων- Πρωτογενείς και δευτερογενείς µεταβολίτες, ολιγονουκλεοτίδια, πεπτίδια, ορµόνες, φαρµακευτικές ουσίες, φυτοφάρµακα, εντοµοκτόνα, προιόντα διατροφής κλπ

4 Σχηµατική παράσταση φασµατογράφου µάζας

5 Τα παραγόµενα ιόντα καταγράφουν κυκλική κίνηση m/z=r 2 H 2 /2V m = η µάζα του ιόντος z = το φορτίο r = η ακτίνα H = η ένταση µαγν. πεδίου V = η ένταση ηλ. πεδίου Εύρεση του Μοριακού Βάρους και εφαρµογή: - στην ταυτοποίηση γνωστής ένωσης (βάσεις δεδοµένων) - στον καθορισµό δοµής άγνωστης ένωσης

6 ΦΑΣΜΑ ΜΑΖΑΣ - Mass Spectrum Τα µόρια της υπό εξέτασην ένωσης βοµβαρδίζονται µε δέσµη e-υψηλής ενέργειας Το µόριο µπορεί να ιονισθεί ή/και να διασπασθεί σε ιονισµένα θραύσµατα Τα ιόντα καταγράφονται ως προς το λόγο µάζα/φορτίο (m/z ) Στις περισσότερες τεχνικές ιονισµού z=1e- και m/z = µάζα ιόντος Η µάζα και η σχετική αφθονία των ιόντων δίνει πληροφορίες για την δοµή του µορίου Το φάσµα καταγράφεται µε ελάχιστη ποσότητα δείγµατος εν συµβαίνει απορρόφηση ή εκποµπή ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας Είναι δυνατόν να αναλυθεί οποιοδήποτε οργανικό υλικό, οι περιορισµοί αφορούν τα ιδιαίτερα υψηλά ΜΒ

7 Στον φασµατογράφο Μάζας πραγµατοποιείται: - ιονισµός των µορίων (συνήθως θετικά ιόντα) µιας ένωσης - πιθανή θραυσµατοποίηση του µορίου και παραγωγή ιόντων - ο διαχωρισµός τους ανάλογα µε το λόγο µάζα/φορτίο (m/z) και -η καταγραφή τους Κατά κανόνα το φορτίο είναι 1 (απόσπαση ενός e-)

8 Μοριακό ιόν - Molecular Ion Peak M+. Είναι το µεγαλύτερο ως προς το λόγο m/z Βρίσκεται στην άκρη δεξιά του φάσµατος Παράγεται µε απόσπαση ενός e- Είναι ταυτόχρονα ιόν και ρίζα, φέρει 1 ασύζευκτο e- Ονοµάζεται και "odd-electron" ιόν (ΟΕ) Αντιπροσωπεύει το Μοριακό Βάρος Κανόνας του αζώτου Περιττό ΜΒ δηλώνει την παρουσία περιττού αριθµού ατόµων Ν Βασική κορυφή Βase Peak εν ταυτίζεται απαραίτητα µε το Μοριακό ιόν Παράγεται στο 100 %

9 Σχηµατική παράσταση φασµατογράφου µάζας

10 Ανίχνευση ιόντων

11 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΙΟΝΙΣΜΟΥ Βοµβαρδισµός µε ηλεκτρόνια - Electron Impact Ionization ΕΙ χρησιµοποιείται δυναµικό 70 ev H H H C C H Μοριακό ιόν M+. H H H H H H e- + H C C H H C C + H H H H H H H H C+ C H H H έσµη e- υψηλής ενέργειας προκαλεί απόσπαση 1 e- από ένα δεσµό Το παραγόµενο Μοριακό ιόν είναι ταυτόχρονα κατιόν και ρίζα (θετικά φορτισµένο ιόν µε ένα ασύζευκτο e- ), τα υπόλοιπα θραύσµατα είναι θετικά φορτισµένα ιόντα

12 Χηµικός Ιονισµός - Chemical Ionization Me τη χρήση αερίων όπως η ΝΗ3 ή το CH4παράγονται «πρωτογενή ιόντα» τα οποία συγκρούονται στη συνέχεια µε τα µόρια της υπό εξέτασην ένωσης -η µέθοδος είναι ήπια - το µόριο θραυσµατοποιείται σε µικρό βαθµό -παράγονται «ψευδοµοριακά ιόντα» που επιτρέπουν τον καθορισµό του ΜΒ Με χρήση µεθανίου CH 4 + e- -> CH e- CH CH 4 -> CH CH 3. CH > CH H. CH > CH H 2 M + CH 5 + -> MH+ + CH 4 ανιχνεύεται Μ+1 M + CH 3 + -> (M + CH 3 )+ ανιχνεύεται Μ+15 CH 5 + Πρωτογενή ιόντα σε αφθονία

13 Χηµικός Ιονισµός µε χρήση αέριας αµµωνίας NH 3 + e- -> NH e- NH NH 3 -> NH NH 2. NH 4 + Πρωτογενή ιόντα σε αφθονία M + NH 4 + -> MH+ + NH 3 ανιχνεύεται Μ+1 M + NH 4 + -> (M + NH 4 )+ ανιχνεύεται Μ+18

14 Το µαγνητικό/ηλεκτρικό πεδίο εκτρέπει µόνο τα θετικά φορτισµένα ιόντα Η ένταση του σήµατος είναι ανάλογη µε τον αριθµό των παραγοµένων ιόντων Ο διαχωρισµός γίνεται µε βάση το m/z Μεταβάλλοντας το µαγνητικό ή/και το ηλεκτρικό πεδίο όλα τα ιόντα διαχωρίζονται, συλλέγονται και καταγράφονται (φάσµα µάζας)

15 m/z = 122: C9H14 C7H10N2 C8H10O C7H6O2 Low resolution MS Γίνεται διάκριση µεταξύ ιόντων που διαφέρουν τουλάχιστον κατά 1 µονάδα µάζας Ανάλογα µε το είδος του Αναλυτή C9H C7H10N C8H10O C7H6O High resolution MS -Φάσµατα Μάζας Υψηλής Ευκρίνειας Το ΜΒ δίδεται µε ακρίβεια 4 δεκαδικών Υψηλό κόστος συσκευής Πολύ ευκρινή φάσµατα Καθορισµός Μοριακού Τύπου (για ΜΒ µικρότερα του 500)

16 IΣΟΤΟΠΙΚΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ 81 Br Στη φύση κάθε στοιχείο εµφανίζεται σαν µίγµα ισοτόπων 12 C (98.9%), 13 C (1.1%)

17 Βασίζονται στον συσχετισµό του ακριβούς ΜΒ µε τα ύψη των ισοτοπικών κορυφών, (αναλογία των φυσικών ισοτόπων) µε βάση τους τύπους % (Μ + 1) = 100 (Μ+1) / Μ = 1,1 Χ αριθ. C X αριθ. H X αριθ. N % (Μ + 2) = 100 (Μ+2) / Μ = (1,1 Χ αριθ. C)2 /200 + (0.016 X αριθ. H)2 / X αριθ. Ο Τα βαρύτερα φυσικά ισότοπα συνεισφέρουν στο Μ+1, Μ+2, Μ+4 κλπ ΠΙΝΑΚΕΣ εύρεσης ΜΒ ΜΒ < 500

18 Φάσµα µάζας υψηλής ευκρίνειας - High Resolution MS Μέτρηση µε ακρίβεια 4 δεκαδικών π.χ. ΜΒ 44 αντιστοιχεί σε C 3 H 8, C 2 H 4 O, CO 2, CN 2 H 4. ΜΒ αντιστοιχεί σε ένα µόνο προϊόν C 3 H 8 C 2 H 4 O CO 2 CN 2 H

19 ΠΙΝΑΚΕΣ BEYNON

20 Παρουσία ετεροατόµων Στα οργανικά µόρια C-13 (1.1%),Ν-15 (0.4%) (µικρή κορυφή στο M+1) O-18 (0.2% πολύ µικρή συµµετοχή στο Μ+2) Παρουσία 1 Br, M+2 ισοϋψές µε το M +. Παρουσία 1 Cl, M+2 σε ένταση 1/3 ως προς το M +. Παρουσία Ι (θραύσµα στα 127) Παρουσία S, M+2 σε ένταση 4% ως προς το M +. Παρουσία περιττού αρ. N, MΒ περιττός αριθµός Br, Cl, S έχουν σηµαντική συµµετοχή στο Μ+2

21 Nitrogen Rule - Kανόνας του αζώτου Παρουσία περιττού αριθµού N, MΒ περιττός αριθµός Μόρια που περιέχουν C, H, N και O και έχουν ΜΒ άρτιο, περιέχουν µηδενικό ή άρτιο αριθ. ατόµων Ν.

22 Συνήθη Θραύσµατα στα φάσµατα Μάζας

23 A full diagram of a mass spectrometer

24

25 GC-MS Φασµατογράφος µάζας συνδεδεµένος µε Αέριο χρωµατογραφία Μίγµα πτητικών συστατικών διαχωρισµός και καθορισµός των ΜΒ Χρησιµοποιούνται κατάλληλες βάσεις δεδοµένων Εφαρµογή της Φασµατοµετρίας Μάζας πολύ διαδεδοµένη στην έρευνα, την βιοµηχανία, τον ποιοτικό έλεγχο κ.α.

26 GC-MS Analysis

27

28 TEXNIKEΣ ΙΟΝΙΣΜΟΥ Βοµβαρδισµός µε e- Electron Impact (EI): µικρά πτητικά µόρια (1,000 Daltons) θραύσµατα Χηµικός Ιονισµός Chemical Ionization (CI): >> ήπια µέθοδος προσδιορισµού ΜΒ FAB Fast Atom Bombardment : µη πτητικά µόρια (6,000 Daltons) Ηλεκτροψεκασµός Electrospray (ESI) : µη πτητικά µόρια, ήπια µέθοδος (200,000 Daltons) πεπτίδια, πρωτεΐνες ΜALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) : ήπια µέθοδος, πολύ υψηλά ΜΒ (200,000 Daltons) πεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεοτίδια

29 Αναλυτές 1)Τετραπολικός (Quadrupole) Χαµηλή ευκρίνεια και κόστος 3)Χρόνου Πτήσης (Time-of-Flight TOF) Μελέτη υψηλών ΜΒ 2) Μαγνητικού και Ηλεκτρικού πεδίου Φάσµατα υψηλής ευκρίνειας ακριβές ΜΒ (High resolution MS), υψηλό κόστος 4)Κυκλοτρονικοί (Ion Cyclotron Resonance - ICR) Φάσµατα υψηλής ευκρίνειας

30 1) Θάλαµος Ιονισµού (διάφορες τεχνικές ιονισµού) 2) Αναλυτής (διάφοροι τύποι) 3) Ανιχνευτής

31 Orbitrap Κυκλοτρονικός αναλυτής Τετραπολικός αναλυτής

32 ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟΣ (ήπια τεχνική ιονισµού) ESI - Electrospray ionization Το δείγµα εισάγεται ως διάλυµα µέσω τριχοειδούς σωλήνα στο θάλαµο Ιονισµού, υπό υψηλό δυναµικό (2-5 kv) τα µόρια του διαλύτη φορτίζονται και απωθούνται βίαια µεταξύ τους δηµιουργούνται σταγονίδια υψηλά φορτισµένα Η εξάτµιση του διαλύτη µε θέρµανση (80 o C) προκαλεί προοδευτική συρρίκνωση των σταγονιδίων Όταν οι απωθητικές δυνάµεις Coulomb υπερβούν τις δυνάµεις συνοχής τους τα σταγονίδια διασπώνται περαιτέρω µέχρι να εξατµισθεί πλήρως ο διαλύτης και να εκκροφούνται ιόντα ηµιουργούνται ιόντα που αντιστοιχούν στο Μ+. Πολλαπλά φορτισµένο και πρωτονιωµένο (Μ+ zη) z+ Η επεξεργασία των αποτελεσµάτων µε στατιστικές µεθόδους οδηγεί στον υπολογισµό του ΜΒ πολλές κορυφές πολλαπλά φορτισµένες µετατρέπονται σε 1 µονοφορτισµένη πραγµατοποιείται µέτρηση των m/z όπου z>1 Η τεχνική ESIείναι ευαίσθητη, επιτρέπει τον καθορισµό ΜΒ της τάξης των 200 KDa, ενδείκνυται για πολικά µόρια, υψηλά ΜΒ, επιτρέπει την ανάλυση µιγµάτων

33

34

35

36

37 Ανίχνευση τετραϋδροκανναβινόλης σε βιολογικά υγρά (δείγµα ούρων)

38 Ανίχνευση κοκαΐνης σε βιολογικά υγρά (δείγµα ούρων)

39 Φάσµα µάζας του εξανίου, C6H14

40 Mass Spectrum of Hexane, C6H14 Μ-15 Μ Μ-29 Μ Μ-43 Μ Μ-57

41 Παρουσία 1 Br

42 Παρουσία 1 Cl

43 Παρουσία ενός ατόµου S

44

45

46

47

48

49 Aλκάνια

50 Aλκάνια

51

52

53

54

55 Αλκένια Μ+. = 56

56 Αλκένια m/z = 55 (M-29) Βασική κορυφή

57 Με τα φάσµα µάζας δεν διακρίνουµε τα 3 ισοµερή Α, Β, Γ

58 Με τoφάσµα µάζας δεν διακρίνουµε τα 3 ισοµερή cis, trans, geminal

59 Aλκοόλες => Απόσπαση ενός µορίου Η 2 Ο M +. συχνά δεν είναι ορατό

60

61

62 m/z 92 Μ+. toluene m/z 91 Μ -1 Tropylium cation

63 Με τoφάσµα µάζας δεν διακρίνουµε τα 3 ισοµερή ortho-, meta-, para-

64 Βασική κορυφή m/z=91 M-29 Tropylium και επί πλέον Φ CH2-CH2-CH3 -> Φ CH2 (+) + H Ενδοµοριακή µετάθεση 1 Η CH2=CH2 αποβάλλεται m/z=92 (M 28)

65 Ενδοµοριακή µετάθεση 1 Η µετάθεση τύπου Mac Lafferty

66 τροπύλιο m/z=91 µεθυλοτροπύλιο m/z=105