ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ PTEN, TOPOISOMERASE IIα ΚΑΙ HER3 ΣΤΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΛΑΡΥΓΓΑ, ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΩΝ ΙΣΤΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Γ. ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ PTEN, TOPOISOMERASE IIα ΚΑΙ HER3 ΣΤΟ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΛΑΡΥΓΓΑ, ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ ΤΩΝ ΙΣΤΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ ΔΗΜΗΤΡΗΣ Ι. ΧΑΤΖΗΜΠΟΥΓΙΑΣ ΙΑΤΡΟΣ-ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΝΗ ΝΕΝΟΠΟΥΛΟΥ, ΟΜ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ) ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΩΣΤΟΠΟΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΑΡΚΟΥ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΛΕΝΗ ΝΕΝΟΠΟΥΛΟΥ, ΟΜ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΩΣΤΟΠΟΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΑΡΚΟΥ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΛΕΝΗ ΒΡΕΤΤΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΤΣΑΛΙΓΟΠΟΥΛΟΣ ΜΙΛΤΙΑΔΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΕΜΕΛΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ, ΑΝ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». (Νόμος 5343/32, αρθρ και ν. 1268/82, αρθρ. 50 8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Κ. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ 3

4 Στην κόρη μου Άννα 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ...7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ...8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΟΡΙΣΜΟΣ - ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ανατομικές σχέσεις Ιστολογία Αιτιολογία ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΛΑΡΥΓΓΑ Μορφολογικά χαρακτηριστικά Ιστολογικοί τύποι Ανοσοφαινοτυπικά και μοριακά χαρακτηριστικά του ΚΛΠΚ ΠΡΟΓΝΩΣΗ Κλινικοί προγνωστικοί παράγοντες Ιστοπαθολογικοί και βιολογικοί προγνωστικοί παράγοντες HER PTEN TOPOISOMERASE IIa ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ...41 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Επιλογή υλικού Δημιουργία ιστικών μικροσυστοιχιών Ανοσοϊστοχημεία (ΑΙΧ-IHC) Αξιολόγηση των ανοσοχρώσεων Φθορίζων in Situ υβριδισμός (FISH) Στατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλινικοπαθολογοανατομική ανάλυση Ανάλυση της επιβίωσης Ανοσοϊστοχημικά Ευρήματα

6 8.3.1 HER PTEN Topoisomerase IIa Υπόλοιπα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα Συσχετίσεις μεταξύ των ανοσοϊστοχημικών δεικτών FISH ευρήματα Συσχέτιση της ΕΥΕ και της ΣΕ με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και τον τύπο της θεραπείας Συσχέτιση των δεικτών ΑΙΧ και FISH με την ΕΥΕ, την ΣΕ Μονοπαραγοντική ανάλυση Πολυπαραγοντική ανάλυση...72 ΕΙΚΟΝΕΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY...94 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...96 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

7 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ CEP Centromeric Enumeration Probe CGH Comparative Genomic Hybridization DFS Disease Free Survival FISH Fluorescence In Situ Hybridization HER1 Human Epidermal Receptor 1 HER2 Human Epidermal Receptor 2 HER3 Human Epidermal Receptor 3 HER4 Human Epidermal Receptor 4 HPV Human Papilloma Virus OS Overall Survival PCR Polymerase Chain Reaction ΡΙ3Κ Phosphatidylinositol-3-kinase PTEN Phosphatase and Tensin homolog Deleted in chromosome ten TMA Tissue MicroArrays TopoIIa Topoisomerase IIa ΑΙΧ ΑΚΤ ΕΥΕ ΙΒΔ ΚΛ ΚΛΠΚ ΟΛ ΣΕ ΧΜΘ Ανοσοϊστοχημεία Ακτινοθεραπεία Ελεύθερη Υποτροπής Επιβίωση Ιστολογικός Βαθμός Διαφοροποίησης Καρκίνος του Λάρυγγα Καρκίνος του Λάρυγγα από Πλακώδη Κύτταρα Ολική Λαρυγγεκτομή Συνολική Επιβίωση Χημειοθεραπεία 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο καρκίνος του λάρυγγα (ΚΛ) αποτελεί το συχνότερο νεόπλασμα της κεφαλής και τραχήλου και σχετίζεται αιτιολογικά με το κάπνισμα και την χρήση αλκοόλ και χαρακτηρίζεται από τοπική επιθετικότητα. Το 40% περίπου των ασθενών εμφανίζουν κατά την διάγνωση προχωρημένο κλινικό στάδιο και πτωχή επιβίωση. Οι σύγχρονες θεραπευτικές στρατηγικές που συνδυάζουν τη χημειοθεραπεία, την ακτινοθεραπεία και τη χειρουργική αντιμετώπιση, παρά την επιτυχία στη διατήρηση της λειτουργικότητας και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής, δεν βελτίωσαν σημαντικά τη συνολική επιβίωση των ασθενών προχωρημένου σταδίου. Με την πάροδο των χρόνων, τα θεραπευτικά σχήματα για τον καρκίνο του λάρυγγα και του υποφάρυγγα, μετατοπίστηκαν από την παραδοσιακή ριζική χειρουργική επέμβαση σε λιγότερο επεμβατικές τεχνικές. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες, η χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία έχουν ενσωματωθεί σε πρωτόκολλα θεραπείας, χωρίς όμως να εμφανίσουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα ποσοστά επιβίωσης. Η πλειονότητα των ΚΛ αφορούν καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα, τα οποία εμφανίζονται συνήθως ως τελικό στάδιο προηγηθείσας δυσπλασίας του επιθηλίου και προέρχονται από το υπάρχων πλακώδες επιθήλιο ή από το αναπνευστικού τύπου επιθήλιο, στο οποίο έχει επέλθει πλακώδης μεταπλασία. Οι νέες μοριακές (PCR, FISH, CISH, gene & protein expression arrays) και ιστικές τεχνικές (ΤΜΑ, ΙHC) έχουν συμβάλλει στην καλύτερη μελέτη και κατανόηση του βιολογικού υπόβαθρου της νεοπλασίας και αποτελούν εργαλεία για την ανακάλυψη νέων μοριακών δεικτών με προγνωστική και προβλεπτική αξία. Οι νέοι δείκτες σε συνδυασμό με κλασσικά κλινικά και παθολογοανατομικά κριτήρια (πχ στάδια ΤΝΜ και AJCC) πιστεύεται ότι πιθανότατα θα προσφέρουν αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση των ασθενών με ΚΛ. Από τη θέση αυτή νιώθω την ανάγκη να απευθύνω τις θερμές μου ευχαριστίες στην Ομότιμη Καθηγήτρια κ. Ε. Νενοπούλου, τόσο για την ανάθεση αυτής της εργασίας, όσο και για το ενδιαφέρον και την βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της πραγματοποίησής της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης τον Καθηγητή κ. Ι. Κωστόπουλο για την έμπρακτη συμβολή του στη μοριακή μελέτη των καρκινωμάτων, την συνεχή καθοδήγηση και την ουσιαστική βοήθεια στην διάρκεια της εκπόνησης του εργαστηριακού τμήματος της μελέτης. Τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Κ. Μάρκου για τις πολύτιμες κλινικές πληροφορίες και την αμέριστη βοήθεια του από την αρχή έως το τέλος της μελέτης που ήταν καθοριστικές για την εκπόνηση της διατριβής. 8

9 Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω από βάθος καρδίας τον παθολογοανατόμο κ. Μ. Μπόμπο, για την πολύπλευρη και αμέριστη βοήθειά του, που ήταν καθοριστική στην εκπόνηση της διατριβής αυτής. Eπίσης, θέλω να ευχαριστήσω θερμά τις παρασκευάστριες και τεχνολόγους του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής Α.Π.Θ, όπου εκπονήθηκε η παρούσα διατριβή, κκ. Αφροδίτη Παγώνη, Γεωργία Ιωσηφίδου και Αικατερίνη Θεολόγου, για την τεχνική βοήθεια κατά την προετοιμασία και εκτέλεση των πειραμάτων. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω από καρδίας τον κ. Ιωάννη Χατζημπούγια, που κατά την ιδιαίτερα απαιτητική χρονική περίοδο εκπόνησης της παρούσας διατριβής, στάθηκε στο πλευρό μου, όχι μόνο ως πατέρας αλλά και ως φίλος και συνεργάτης, συντελώντας καθοριστικά στην ολοκλήρωση της προσπάθειάς μου. 9

10 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΟΡΙΣΜΟΣ - ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ο λάρυγγας είναι το τμήμα της αεροφόρου οδού διαμέσου του οποίου επικοινωνεί ο φάρυγγας με τη τραχεία. Η προάσπιση της κατώτερης αεροφόρου οδού αφενός από την εισρόφηση κατά την κατάποση ή τον έμετο και αφετέρου από ξένα σώματα κατά την εισπνοή αποτελεί τη βασική λειτουργία του λάρυγγα, αν και στον άνθρωπο κύρια λειτουργία θεωρείται η φώνηση (1). Το καρκίνωμα του λάρυγγα από πλακώδη κύτταρα (ΚΛΠΚ), είναι ο συχνότερος κακοήθης όγκος του λάρυγγα, του φάρυγγα και της τραχείας. Οι εκτιμώμενες νέες περιπτώσεις ΚΛΠΚ στις Η.Π.Α. το 2012 υπολογίζονται σε και οι θάνατοι από τη νόσο σε (2). Εμφανίζεται κυρίως σε ενήλικες άνδρες που κάνουν χρήση καπνού και καταναλώνουν αλκοόλ (3). Η αναλογία ανδρών προς γυναίκες είναι 6 προς 1 για τον καρκίνο του λάρυγγα. Τις τελευταίες δύο δεκαετίες έχει παρατηρηθεί αύξηση της συχνότητας εμφάνισης του καρκινώματος του λάρυγγα στις γυναίκες, εξαιτίας της αυξημένης χρήσης καπνού, σε σχέση με το παρελθόν (4). Συχνότερα εμφανίζεται στην έκτη και έβδομη δεκαετία της ζωής, ενώ έχουν αναφερθεί λίγες περιπτώσεις που αφορούν νεότερες ηλικίες (5, 6). Παρατηρείται γεωγραφική διακύμανση της συχνότητας εμφάνισης του καρκίνου του λάρυγγα, ενώ είναι πιο συνήθης σε ασθενείς με χαμηλό κοινωνικο-οικονομικό επίπεδο. Η πλειονότητα των καρκινωμάτων του λάρυγγα αφορά την υπεργλωττιδική και γλωττιδική μοίρα του λάρυγγα. Επιδημιολογικές μελέτες υποδηλώνουν σχέση της τοπογραφικής εντόπισης του καρκινώματος και της γεωγραφικής κατανομής του πληθυσμού (3). Στην Γαλλία, Ισπανία, Ιταλία, Φινλανδία και Ολλανδία το υπεργλωττιδικό καρκίνωμα κυριαρχεί, ενώ στις Η.Π.Α, τον Καναδά, την Αγγλία και Σουηδία είναι συχνότερο το γλωττιδικό καρκίνωμα (3). 1.1 Ανατομικές σχέσεις - Ιστολογία Ο λάρυγγας βρίσκεται στον τράχηλο, ανάμεσα στα μεγάλα αγγεία του και μπροστά από τη λαρυγγική μοίρα του φάρυγγα. Καλύπτεται εμπρός από την μέση τραχηλική και την επιπολής περιτονία, την υποδόρια περιτονία και το δέρμα. Τα όριά του στον άνδρα αντιστοιχούν στην άνω επιφάνεια του τρίτου και στην κάτω επιφάνεια του έκτου αυχενικού σπονδύλου, ενώ στη γυναίκα και το παιδί βρίσκεται ελαφρώς υψηλότερα (κατά έναν σπόνδυλο περίπου) (1). Ο λάρυγγας εκτείνεται από την κορυφή της επιγλωττίδας έως το κατώτερο όριο του κρικοειδούς χόνδρου. Κατά την πρόσθια επιφάνεια, τα όρια καθορίζονται 11

12 από την γλωσσική επιγλωττίδα, την υοθυρεοειδική μεμβράνη, την πρόσθια εντομή, τον θυρεοειδή χόνδρο, την κρικοθυρεοειδική μεμβράνη και το πρόσθιο τόξο του κρικοειδούς χόνδρου. Τα οπίσθια όρια περιλαμβάνουν την οπίσθια βλεννογονική εντομή και την αρυταινοειδή περιοχή (Εικόνα 1). Ο λάρυγγας διαιρείται σε τρία διαμερίσματα, α) την υπεργλωττιδική μοίρα, β) την γλωττιδική και την γ) υπογλωττιδική μοίρα. α) Η υπεργλωττιδική μοίρα αποτελείται από την επιγλωττίδα, τις αρυταινοεπιγλωττιδικές πτυχές, τις νόθες φωνητικές χορδές και τις κοιλίες. Η κορυφή της επιγλωττίδας και οι αρυταινοεπιγλωττιδικές πτυχές αποτελούν τα άνω και πλάγια υπεργλωττιδικά όρια αντίστοιχα. Το κάτω υπεργλωττιδικό όριο αντιστοιχεί στο επίπεδο συμβολής της κοιλίας με την αληθή φωνητική χορδή. β) Η γλωττιδική μοίρα εκτείνεται από το κάτω υπεργλωττιδικό όριο έως ένα νοητό οριζόντιο επίπεδο, 10 χιλιοστά κάτωθεν των αληθών φωνητικών χορδών (7) και αποτελείται από τις αληθείς φωνητικές χορδές, συμπεριλαμβανομένων των κάτω επιφανειών αυτών και από την πρόσθια και οπίσθια εντομή. γ) Η υπογλωττιδική μοίρα εκτείνεται από το νοητό οριζόντιο επίπεδο, 10 χιλιοστά κάτωθεν των φωνητικών χορδών, έως το κατώτερο όριο του κρικοειδούς χόνδρου. Εικόνα 1. Οπίσθια, πρόσθια και δεξιά επιφάνεια του λάρυγγα. Η ανάπτυξη και ο τρόπος επέκτασης του όγκου καθορίζονται από την εντόπισή του και κυρίως από τη σχέση του με τα ανατομικά όρια μεταξύ των ανωτέρω τοπογραφικών διαμερισμάτων (8). Τα κυριότερα ανατομικά όρια θεωρούνται ο τένοντας της πρόσθιας εντομής (Broyles ligament), ο προεπιγλωττιδικός και οι παραγλωττιδικοί χώροι. 12

13 Ο τένοντας του Broyle είναι μια ινώδης ταινία πάχους 1 χιλιοστού και μήκους 10 χιλιοστών, που εκτείνεται από τον φωνητικό τένοντα ως την εσωτερική επιφάνεια του άνω θυρεοειδούς χόνδρου. Παίζει καθοριστικό ρόλο γιατί αφενός περιέχει αγγεία και λεμφαγγεία και αφετέρου στερείται περιχονδρίου στο σημείο επαφής με τον θυρεοειδή χόνδρο, αποτελώντας ιδανική δίοδο για το καρκίνωμα προς τα παρακείμενα μαλακά μόρια ή τους περιλαρυγγικούς λεμφαδένες. Οι παραγλωττιδικοί χώροι (αριστερός και δεξιός) βρίσκονται σε εν τω βάθει των κοιλιών θέσεις και αποτελούνται από λιπώδη ιστό, χαλαρό συνδετικό ιστό, αγγεία και λεμφαγγεία. Ο προεπιγλωττιδικός χώρος αποτελείται και αυτός από ινώδη και λιπώδη ιστό, αγγεία και λεμφαγγεία και έχει τριγωνικό σχήμα. Αφορίζεται κατά την πρόσθια επιφάνεια από τον θυρεοειδή χόνδρο και την θυρεοϋοειδή μεμβράνη, κατά την οπίσθια επιφάνεια από την επιγλωττίδα και τον θυρεοεπιγλωττιδικό σύνδεσμο και κατά την κάτω επιφάνεια από τον υοεπιγλωττιδικό σύνδεσμο. Οι παραγλωττιδικοί και ο προεπιγλωττιδικός χώρος δεν περιέχουν λεμφαδένες. Το καρκίνωμα μέσω των παραγλωττιδικών και προεπιγλωττιδικού χώρου μπορεί να διηθήσει τους γύρω εξωλαρυγγικούς ιστούς (1). Η υπεργλωττιδική μοίρα του λάρυγγα φέρει λεμφαγγεία τα οποία εκβάλλουν στους άνω, μέσους και κάτω τραχηλικούς λεμφαδένες. Αντίθετα, η γλωττιδική μοίρα έχει περιορισμένο λεμφαγγειακό δίκτυο, που όμως και αυτό εκβάλλει στην ίδια ομάδα λεμφαδένων. Αν ένα γλωττιδικό καρκίνωμα επεκταθεί περισσότερο του ενός εκατοστού κάτωθεν της γλωττιδικής μοίρας, τότε παρατηρείται αυξημένη πιθανότητα μετάστασης στους παρατραχειακούς λεμφαδένες και αυτό γιατί το λεμφαγγειακό δίκτυο της υπογλωττιδικής μοίρας του λάρυγγα εκβάλλει κυρίως στους παρατραχειακούς λεμφαδένες και σπανιότερα στους μέσους και κάτω τραχηλικούς λεμφαδένες. Ο λάρυγγας ενός ενήλικα καλύπτεται από πλακώδες επιθήλιο με εξαίρεση τις νόθες φωνητικές χορδές και την υπογλωττιδική μοίρα, οι οποίες καλύπτονται από αναπνευστικού τύπου επιθήλιο (3). Οι αρτηρίες που αιματώνουν τον λάρυγγα είναι η άνω λαρυγγική και η κρικοθυρεοειδής (κλάδοι της άνω θυρεοειδούς αρτηρίας) και η κάτω λαρυγγική (κλάδος της κάτω θυρεοειδούς αρτηρίας). Η άνω λαρυγγική αρτηρία αρδεύει τα πλάγια τοιχώματα του λάρυγγα, όπου εισέρχεται συνήθως από τρήμα της οπίσθιας μοίρας του υοθυρεοειδή υμένα και μερικές φορές από τρήμα του θυρεοειδή χόνδρου. Η κρικοθυρεοειδής αρτηρία χορηγεί κλάδους που τρυπούν από εμπρός τον κρικοθυρεοειδή σύνδεσμο και αιματώνουν την διαγλωττιδική μοίρα του λάρυγγα. Η κάτω λαρυγγική αρτηρία πορεύεται στο οπίσθιο τοίχωμα του λάρυγγα και χορηγεί κλαδίσκους για την αιμάτωση της υπογλωττιδικής μοίρας 13

14 του λάρυγγα. Οι φλέβες συνοδεύουν τους αντίστοιχους αρτηριακούς κλάδους και εκβάλλουν στην έσω σφαγίτιδα και στην ανώνυμη φλέβα (συνήθως στην αριστερή). Η λέμφος αποχετεύεται από τον λάρυγγα με το βλεννογόνιο και το υποβλεννογόνιο λεμφικό δίκτυο, που είναι διαχωρισμένα το ένα από το άλλο. Το βλεννογόνιο δίκτυο είναι ενιαίο για το αριστερό και το δεξιό πλάγιο, σε αντίθεση με το υποβλεννογόνιο δίκτυο, στο οποίο παρατηρείται μικρή επικοινωνία ή πλήρης έλλειψη επικοινωνίας ανάμεσα στα δίκτυα των δύο πλευρών. Εξαίρεση αποτελεί ο πρόδομος του λάρυγγα, όπου υπάρχει εκτεταμένο αναστομωτικό λεμφικό δίκτυο ανάμεσα στις δύο πλευρές. Από το λεμφικό δίκτυο της υπεργλωττιδικής μοίρας σχηματίζονται λεμφαγγεία, τα οποία συνοδεύουν την άνω θυρεοειδή αρτηρία και εκβάλλουν στα άνω εν τω βάθει τραχηλικά λεμφογάγγλια, ενώ τα λεμφαγγεία από το λεμφικό δίκτυο της υπογλωττιδικής μοίρας, αφού περάσουν από τα προλαρυγγικά και τα παρατραχειακά λεμφογάγγλια, εκβάλλουν στα κάτω εν τω βάθει τραχηλικά (υπερκλείδια) και στα άνω μεσοπνευμόνια. Το ευρύ αναστομωτικό δίκτυο μεταξύ των λεμφαγγείων του προδόμου του λάρυγγα, εξηγεί την πιθανότητα δημιουργίας αμφοτερόπλευρων μεταστάσεων από νεοπλάσματα που εντοπίζονται στην περιοχή αυτή του λάρυγγα. Η ίδια αιτία εξηγεί σε μεγάλο βαθμό και την κακή πρόγνωσή τους. Στον τρόπο αποχέτευσης της λέμφου οφείλεται και η πιθανότητα ύπαρξης μεταστάσεων, σε περιπτώσεις νεοπλασμάτων της υπεργλωττιδικής μοίρας του λάρυγγα, στα παρατραχειακά και τα προλαρυγγικά λεμφογάγγλια, χωρίς να υπάρχουν στα εν τω βάθει τραχηλικά. Ας σημειωθεί ότι στις φωνητικές χορδές το λεμφικό δίκτυο είναι εξαιρετικά φτωχό (αραιό), κάτι που εξηγεί την βραδύτητα των μεταστάσεων, σε περιπτώσεις καρκίνου των φωνητικών χορδών και αποτελεί έναν από τους λόγους της καλής πρόγνωσής του (1). Τα νεύρα που κατανέμονται στον λάρυγγα είναι νευρικές ίνες από το άνω και κάτω λαρυγγικό νεύρο καθώς και ίνες από το συμπαθητικό στέλεχος (αγγεισυσπαστικές, διαμέσου των συμπαθητικών πλεγμάτων που περιβάλλουν τα αγγεία του λάρυγγα). Το άνω λαρυγγικό νευρώνει τον κρικοθυρεοειδή μυ και χορηγεί κλωνία για τον κάτω σφιγκτήρα μυ του φάρυγγα (κυρίως για την κρικοφαρυγγική μοίρα του), ενώ ο έσω κλάδος του εισέρχεται στον λάρυγγα μαζί με την άνω λαρυγγική αρτηρία και χορηγεί αισθητικές και φυτικές ίνες για τον βλεννογόνο της υπεργλωττιδικής μοίρας και ορισμένες από τις κινητικές ίνες για τον αρυταινοεπιγλωττιδικό και τον εγκάρσιο αρυταινοειδή μυ (1). Οι αισθητικές ίνες εξυπηρετούν την κοινή αισθητικότητα, καθώς και τη γεύση από τους διάσπαρτους γευστικούς κάλυκες που υπάρχουν στον βλεννογόνο της οπίσθιας επιφάνειας της επιγλωττίδας και των αρυταινοεπιγλωττιδικών πτυχών (1). 14

15 Το κάτω λαρυγγικό ή παλίνδρομο λαρυγγικό νεύρο φέρεται μαζί με την κάτω λαρυγγική αρτηρία και νευρώνει όλους τους αυτόχθονες μυς του λάρυγγα εκτός από τον κρικοθυρεοειδή μυ. Επιπλέον των κινητικών ινών χορηγεί και αισθητικές ίνες στον βλεννογόνο της υπογλωττιδικής μοίρας μέχρι και την κάτω επιφάνεια των φωνητικών πτυχών καθώς και φυτικές ίνες για τους αδένες του βλεννογόνου (1). 1.2 Αιτιολογία Το κάπνισμα, σε συνδυασμό με αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ αποτελούν τους κυριότερους αιτιολογικούς παράγοντες (9). Μελέτες έχουν δείξει πως η κατανάλωση αλκοόλ συσχετίζεται περισσότερο με το υπεργλωττιδικό καρκίνωμα, ενώ το κάπνισμα συσχετίζεται περισσότερο με το γλωττιδικό καρκίνωμα (10). Σε καπνιστές, ο κίνδυνος της ανάπτυξης καρκίνου του λάρυγγα μειώνεται μετά την διακοπή του καπνίσματος, αλλά παραμένει σε υψηλά επίπεδα, ακόμη και χρόνια αργότερα (11). Σε έναν ασθενή ο οποίος είχε εμφανίσει ένα μονήρη καρκίνο και συνεχίζει να καπνίζει και να καταναλώνει αλκοολούχα ποτά, η πιθανότητα θεραπείας για τον αρχικό καρκίνο, είναι σημαντικά μειωμένη ενώ ο κίνδυνος της εμφάνισης δεύτερης νεοπλασίας είναι αυξημένος. Λόγω των κλινικών προβλημάτων που σχετίζονται με το κάπνισμα, πολλοί ασθενείς συχνά υποκύπτουν από τα συνοδά νοσήματα και όχι από τον πρωτογενή καρκίνο. Η έκθεση σε αρωματικούς υδρογονάνθρακες, το τσιμεντοκονίαμα σε ρινίσματα μετάλλων, οι αναθυμιάσεις πετρελαίου και τα αέρια μουστάρδας θεωρούνται επίσης παράγοντες που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του λαρυγγικού καρκινώματος (12). Η κατανάλωση ροφήματος που παρασκευάζεται κυρίως από τα φύλλα του δένδρου Ilex paraguariensis (yerba maté) και καταναλώνεται συνήθως από κατοίκους της Νότιας Αμερικής, έχει επίσης συσχετιστεί με αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του στόματος, του φάρυγγα, του οισοφάγου και του λάρυγγα (13). Ο ιός του θηλώματος του ανθρώπου, (Human Papilloma Virus, HPV), θεωρείται ότι έχει παθογενετικό ρόλο στην ανάπτυξη ορισμένων περιπτώσεων καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. Σε μελέτη αιτιοπαθολογικής συσχέτισης σε ασθενείς με καρκίνο κεφαλής και τραχήλου, με χρήση μοριακών τεχνικών (PCR και in situ υβριδισμός) ανιχνεύτηκε ο ιός HPV στο 25% των περιπτώσεων με επικρατούντα τύπο τον HPV-16 (14). Η μελέτη των Torrente και συν. ανίχνευσε στο 25% των καρκινωμάτων του λάρυγγα γονιδίωμα του ιού HPV (15). Το HPV DNA ανιχνεύθηκε στην ως άνω μελέτη σε περιπτώσεις θηλωμάτωσης, μυρμηκιώδους καρκινώματος και ΚΛΠΚ. Οι χαμηλού κινδύνου τύποι του HPV σχετίζονταν 15

16 με τη θηλωμάτωση και περιελάμβαναν τους τύπους HPV 6 και 11, ενώ οι υψηλού κινδύνου υπότυποι 16 και 18 ανερεύθησαν πιο συχνά σε κακοήθεις νεοπλασματικές αλλοιώσεις (μυρμηκιώδες και ΚΛΠΚ). Σε αντιδιαστολή με τα παραπάνω, DNA του ιού έχει ανιχνευθεί σε ποσοστό 12-25% ατόμων με φυσιολογική κλινική και ιστολογική εικόνα του λάρυγγα (16, 17). Η αυξημένη κατανάλωση φρούτων και λαχανικών φαίνεται να παίζει προστατευτικό ρόλο έναντι του καρκινώματος (18, 19). Τέλος, η γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση αποτελεί παράγοντα υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη λαρυγγικού καρκινώματος, ιδιαίτερα σε άτομα που δεν σχετίζονται με άλλους παράγοντες υψηλού κινδύνου (20, 21). 2. ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Η κλινική εικόνα εξαρτάται από την εντόπιση του καρκινώματος. Το συχνότερο σύμπτωμα του γλωττιδικού καρκινώματος είναι το βράγχος φωνής. Τα συμπτώματα του υπεργλωττιδικού καρκίνου αφορούν δυσφαγία, αλλαγή της χροιάς της φωνής, αίσθημα ξένου σώματος στον τράχηλο, τραχηλική μάζα, αιμόπτυση και οδυνοφαγία. Ο υπογλωττιδικός καρκίνος χαρακτηρίζεται κυρίως από δύσπνοια και συριγμό (22). 16

17 3. ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ ΤΟΥ ΛΑΡΥΓΓΑ 3.1 Μορφολογικά χαρακτηριστικά Ιστολογικοί τύποι Μακροσκοπικά το καρκίνωμα του λάρυγγα (ΚΛ) μπορεί να δίνει την εικόνα επίπεδης πλάκας με σαφή, επηρμένα άκρα ή πολυποειδούς εξωφυτικής βλάβης. Η επιφάνεια του όγκου μπορεί να είναι εξελκωμένη. Σε μικροσκοπικό επίπεδο τα κύρια ιστολογικά χαρακτηριστικά του ΚΛ είναι η διηθητική ανάπτυξη νεοπλασματικών κυττάρων με πλακώδη μορφολογία, με ή χωρίς κερατινοποίηση και σχηματισμό σφαιρών κερατίνης. Η διήθηση χαρακτηρίζεται από διάσπαση της βασικής μεμβράνης του πολύστιβου πλακώδους επιθηλίου και επέκταση στο υποκείμενο στρώμα. Δεν αποκλείεται η αγγειακή και περινευρική διήθηση των νεοπλασματικών κυττάρων. Ανάλογα με τον βαθμό που το νεόπλασμα προσομοιάζει στο φυσιολογικό πλακώδες επιθήλιο, το καρκίνωμα διακρίνεται σε καλής, μέτριας ή χαμηλής διαφοροποίησης. Το καλής διαφοροποίησης ΚΛΠΚ προσομοιάζει με το λαρυγγικό επιθήλιο και χαρακτηρίζεται από σημαντική κερατινοποίηση. Το μέτριας διαφοροποίησης ΚΛΠΚ εμφανίζει κύτταρα με μέτρια πυρηνική πολυμορφία και μέτρια μιτωτική δραστηριότητα, με ή χωρίς άτυπες μιτώσεις. Συνήθως η κερατινοποίηση είναι περιορισμένης ή μέτριας έκτασης. Το χαμηλής διαφοροποίησης ΚΛΠΚ αποτελείται από κύτταρα με έντονη πυρηνική πολυμορφία. Οι μιτώσεις είναι πολυάριθμες και συχνά άτυπες. Η κερατινοποίηση είναι περιορισμένη ή απουσιάζει. (3). Η πλειονότητα των γλωττιδικών καρκινωμάτων είναι καλής ή μέτριας διαφοροποίησης, ενώ μεγάλο ποσοστό των υπογλωττιδικών καρκινωμάτων είναι μέτριας ή χαμηλής διαφοροποίησης. Τα καρκινώματα που αναπτύσσονται διηθητικά αλλά περιορίζονται στις ανώτερες στοιβάδες του υποστρώματος, ακριβώς κάτωθεν της βασικής μεμβράνης του πολύστοιβου πλακώδους επιθηλίου, ονομάζονται «μικροδιηθητικά» ή «πρώιμα». Υπάρχουν περιπτώσεις όπου ο όγκος επεκτείνεται διηθητικά καταλαμβάνοντας μεγάλη έκταση της λαρυγγικής επιφάνειας, διατηρώντας όμως επιφανειακό χαρακτήρα, χωρίς δηλαδή να αυξάνεται το διηθητικό στοιχείο εις βάθος (3). Οι συχνότεροι ιστολογικοί τύποι του ΚΛΠΚ είναι οι ακόλουθοι: Ακροχορδονώδες καρκίνωμα (veruccous carcinoma ή Ackerman tumor). Έχει πολυποειδή ανάπτυξη και είναι καλής διαφοροποίησης, προσομοιάζοντας σε μεγάλο βαθμό με το φυσιολογικό πλακώδες επιθήλιο του λάρυγγα (23). Εμφανίζεται κυρίως στους άνδρες την 6 η -7 η δεκαετία (3). Χαρακτηρίζεται από τοπική διηθητική ανάπτυξη, χωρίς όμως να χορηγεί μεταστάσεις. Το υβριδικό ακροχορδονώδες καρκίνωμα εμφανίζει μεταστατικό 17

18 δυναμικό και οι ασθενείς με αυτό τον τύπο πρέπει να χειρίζονται όπως και οι ασθενείς με ΚΛΠΚ ιδίου σταδίου. Καρκίνωμα από πλακώδη κύτταρα βασικοκυτταροειδούς τύπου (basaloid squamous cell carcinoma). Είναι όγκος υψηλού κακοήθους δυναμικού που χαρακτηρίζεται από παρουσία τυπικών νεοπλασματικών κυττάρων πλακώδους τύπου, σε συνδυασμό με ομάδες μικρών συνωθούμενων κυττάρων. Τα τελευταία έχουν υπερχρωματικούς πυρήνες, ελάχιστο κυτταρόπλασμα, με παρουσία μικροεστιών νέκρωσης, στοιχεία υαλοειδοποίησης και διατάσσονται χαρακτηριστικά με τη μορφή πασσάλων στη περιφέρεια (πασσαλιδωτή διάταξη) (24, 25). Είναι συχνό σε άνδρες ετών. Σε υψηλό ποσοστό (2/3 των περιπτώσεων) ανευρίσκονται κατά την διάγνωση, επιχώριες μεταστάσεις, ενώ οι απομακρυσμένες μεταστάσεις αφορούν τους πνεύμονες, τα οστά, το δέρμα και τον εγκέφαλο (3) Θηλώδες καρκίνωμα από πλακώδη κύτταρα. Εμφανίζει χαρακτηριστική προέχουσα θηλώδη ανάπτυξη. Οι ινοαγγειακοί άξονες επαλείφονται από νεοπλασματικά, ανώριμα βασικοκυτταροειδή ή πλειόμορφα κύτταρα. Η κερατινοποίηση είναι ελάχιστη, ενώ οι νεκρώσεις και οι αιμορραγίες συχνές (3). Ατρακτοκυτταρικό καρκίνωμα. Ο εν λόγω τύπος είναι ένας διφασικός όγκος που αποτελείται από πλακώδες καρκίνωμα, in situ και/ή διηθητικό και από κακόηθες ατρακτόμορφο στοιχείο. Το ατρακτόμορφο στοιχείο, ιδίως σε ασθενείς μετά από προηγηθείσα ακτινοθεραπεία, εμφανίζει οστεοσαρκωματώδεις, ραβδομυοσαρκωματώδεις ή χονδροσαρκωματώδεις χαρακτήρες. Τα νεοπλασματικά κύτταρα εκφράζουν επιθηλιακούς και μεσεγχυματογενείς δείκτες (3). Ακανθολυτικό καρκίνωμα από πλακώδη κύτταρα. Αποτελεί ασυνήθη ιστολογικό τύπο του ΚΠΛΚ. Χαρακτηρίζεται από εστίες ακανθόλυσης που συχνά δίνουν την εντύπωση αδενικής διαφοροποίησης. Παραγωγή βλέννης δεν παρατηρείται. Αδενοπλακώδες καρκίνωμα. Είναι σπάνιος όγκος του λάρυγγα με επιθετική βιολογική συμπεριφορά που εμφανίζει στοιχείο πλακώδους καρκινώματος και αδενοκαρκινώματος. Προέρχεται από τα βασικά κύτταρα του επιθηλίου, τα οποία έχουν την δυνατότητα διττής διαφοροποίησης (3). Καρκίνωμα λεμφοεπιθηλιωματώδους τύπου (lymphoepithelioma-like carcinoma). Επιθετικός όγκος που συχνά συνοδεύεται από μετάσταση στους τραχηλικούς λεμφαδένες. Χαρακτηρίζεται από μεταλλάξεις στο γονίδιο p53, χωρίς όμως να υπάρχει συσχέτιση με τον ιό EBV (26, 27) 18

19 Γιγαντοκυτταρικό καρκίνωμα. Είναι παρόμοιο μορφολογικά με το αντίστοιχο γιγαντοκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα και χαρακτηρίζεται από πολυάριθμα πλειόμορφα, πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα (3). Μικροκυτταρικό καρκίνωμα (small cell/neuroendocrine carcinoma). Είναι σπάνιος τύπος καρκίνου στο λάρυγγα (<0.5% όλων των κακοήθων όγκων του λάρυγγα). Μικροσκοπικά προσομοιάζει με τον αντίστοιχο τύπο καρκινώματος στον πνεύμονα. Οι επιχώριες και απομακρυσμένες μεταστάσεις είναι συχνές ενώ η πρόγνωση είναι πτωχή (28). Κακοήθεις όγκοι των σιελογόνων αδένων. Αποτελούν εξαιρετικά σπάνιες νεοπλασίες του λάρυγγα και εμφανίζονται συχνότερα στην υπεργλωττιδική ή την υπογλωττιδική περιοχή (3). Οι πλειονότητα των παραπάνω όγκων αφορά βλεννοεπιδερμοειδή και αδενοκυστικά καρκινώματα. 3.2 Ανοσοφαινοτυπικά και μοριακά χαρακτηριστικά του ΚΛΠΚ Το ΚΛΠΚ εκφράζει επιθηλιακούς δείκτες όπως οι κυτοκερατίνες. Ο τρόπος έκφρασης των κυτοκερατινών εξαρτάται από τον βαθμό διαφοροποίησης, το ποσοστό κερατινοποίησης και το μεταστατικό δυναμικό του όγκου (βιολογική συμπεριφορά). Το καλής διαφοροποίησης ΚΛΠΚ, όπως και το φυσιολογικό πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο, εκφράζει τις μέσου/υψηλού μοριακού βάρους (ΜΒ) κυτοκερατίνες, αλλά όχι τις κυτοκερατίνες χαμηλού ΜΒ. Αντίθετα το χαμηλής διαφοροποίησης ΚΛΠΚ εκφράζει τις κυτοκερατίνες χαμηλού ΜΒ (29) και δύναται να εκφράζει την βιμεντίνη (30). Επίσης σημειώνεται συχνή έκφραση του υποδοχέα για τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGFR) στο ΚΛΠΚ (31), ενώ είναι σπάνια η υπερέκφραση του υποδοχέα HER2 (32). Οι συχνότερες χρωμοσωμικές ανωμαλίες έχουν ανιχνευθεί με τη μέθοδο του συγκριτικού γονιδιακού υβριδισμού (comparative genomic hybridization), που αποτελεί μοριακή-κυτταρογενετική μέθοδο για την ανάλυση των ανωμαλιών (επαυξήσεις/απώλειες) στο DNA των νεοπλασματικών και όχι μόνο κυττάρων. Οι κυριότερες χρωμοσωμικές ανωμαλίες που έχουν αναφερθεί είναι οι επαυξήσεις των χρωμοσωμικών τμημάτων +3q, +5p, +8q, +11q13, +17q και η απώλεια του -3p τμήματος (3). Επίσης, συχνές είναι οι επαυξήσεις των +1q, +18p και οι απώλειες των -4p, -5q, -11qter και -18q τμημάτων (33, 34). Υπάρχουν ευρήματα που υποδεικνύουν ότι η επαύξηση +3q21-29 αποτελεί ίσως την σημαντικότερη πρώιμη χρωμοσωμική ανωμαλία, ακολουθούμενη από την απώλεια του -3p (34). Υψηλού βαθμού ενισχύσεις έχουν αναφερθεί για το 3q24-qter και λιγότερο συχνά για 19

20 τα 11q13 (CCND1), 18p, 18q11.2, 8q23-24 και 11q14-22 τμήματα που αφορούν γονίδια ή ευρύτερες γονιδιακές περιοχές (3). Η CCND1 ενισχύεται και υπερεκφράζεται κυρίως σε διηθητικά καρκινώματα (33, 35, 36), το MYC και ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR/HER1) εμφανίζουν ενίσχυση σε ποσοστό 6-25% των περιπτώσεων, χωρίς η ενίσχυση αυτή να σχετίζεται με υπερέκφραση (35, 37, 38). Η απώλεια έκφρασης του γονιδίου του ρετινοβλαστώματος (RB1) αφορά λιγότερο από το 20% των όγκων (39, 40). Σε ένα ποσοστό 13-50% των λαρυγγικών όγκων ανευρίσκονται μεταλλάξεις του TP53 (3). Οι ανωμαλίες του TP53 γονιδίου φαίνεται ότι αποτελούν πρώιμο στάδιο στην διαδικασία της νεοπλασματικής εξαλλαγής, διότι ανευρίσκονται ακόμα και σε προκαρκινωματώδεις αλλοιώσεις (41, 42). Το TP73L γονίδιο, ομόλογο του TP53, με ογκογόνο δυναμικό που ανευρίσκεται στο 3q27-28 χρωμόσωμα, εμφανίζει συχνά επαύξηση. Στο πρωτοπαθές καρκίνωμα της κεφαλής και τραχήλου, χαμηλός βαθμός ενίσχυσης του γονιδίου TP73L έχει ανιχνευθεί με τη μέθοδο του φθορίζοντος in situ υβριδισμού (FISH) (43). Στους λαρυγγικούς όγκους με πλακώδη διαφοροποίηση ανιχνεύονται σημαντικά επίπεδα του mrna της πρωτεΐνης MMP13. Η έκφραση της MMP13 συνδυάζεται με υπερέκφραση των MMP2 και MMP14, δύο μορίων που μπορούν να ενεργοποιήσουν την MMP13. Η έκφραση της MMP13 και η υπερέκφραση της MMP14 σχετίζονται με προχωρημένη νόσο, υποδηλώνοντας επιθετικότερη συμπεριφορά (44). 20

21 4. ΠΡΟΓΝΩΣΗ 4.1 Κλινικοί προγνωστικοί παράγοντες Εντόπιση: Σημαντικό ρόλο στο προσδόκιμο επιβίωσης παίζει η εντόπιση του όγκου στον λάρυγγα (22). Το γλωττιδικό καρκίνωμα παρουσιάζει καλύτερη πρόγνωση σε αντίθεση με το υπογλωττιδικό καρκίνωμα, το οποίο σχετίζεται με χαμηλότερα ποσοστά πενταετούς επιβίωσης. Πιο συγκεκριμένα, το προσδόκιμο πενταετούς επιβίωσης στο γλωττιδικό καρκίνωμα ανέρχεται σε 80-85%, στο υπεργλωττιδικό καρκίνωμα σε 65-75%, ενώ στο υπογλωττιδικό καρκίνωμα είναι αισθητά χαμηλότερο και φθάνει το 40% (3). Ηλικία: Ο καρκίνος του λάρυγγα είναι σπάνιος σε ασθενείς ηλικίας κάτω των 40 ετών. Η συχνότητα εμφάνισης αυξάνεται με την ηλικία, με κορύφωση την όγδοη δεκαετία. Τα τρία τέταρτα όλων των διαγνώσεων αφορούν ασθενείς άνω των 60 ετών (45, 46). Η διάγνωση της νόσου σε ηλικία >80 ετών αποτελεί δυσμενή προγνωστικό δείκτη (47) Συνοδός νόσος: Τα συνοδά νοσήματα και κυρίως η σοβαρού βαθμού καρδιοαγγειακή νόσος επιβαρύνει σημαντικά την επιβίωση ασθενών με ΚΛ (48, 49). Σταδιοποίηση: Τα συστήματα σταδιοποίησης της νόσου κατά TNM και AJCC αποτελούν τους σημαντικότερους προγνωστικούς παράγοντες επιβίωσης (3). Ειδικότερα, η σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ βασίζεται στους εξής παράγοντες: α) την ανατομική εντόπιση της πρωτοπαθούς εστίας, το βάθος διήθησης ή/και το μέγεθος του όγκου, που συνδυαστικά δημιουργούν το «Τ», β) την παρουσία ή όχι λεμφαδένων, καθώς και την παρουσία ή απουσία διήθησης τους και γ) την ανεύρεση ή όχι απομακρυσμένων μεταστάσεων. Διακρίνουμε α) την κλινική σταδιοποίηση ( c ), η οποία στηρίζεται στην κλινική εξέταση, τον απεικονιστικό έλεγχο και την προεγχειρητική βιοψία, και β) την παθολογοανατομική σταδιοποίηση ( p ), η οποία βασίζεται στον συνδυασμό πληροφοριών από το χειρουργικό παρασκεύασμα, την ιστολογική εξέταση και σε ορισμένα νεοπλάσματα και από κλινικές πληροφορίες. Η σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ στον καρκίνο του λάρυγγα παρουσιάζεται αναλυτικότερα παρακάτω: Σταδιοποίηση κατά Τ: Διαχωρίζεται ανάλογα με την εντόπιση του όγκου σε: α) Υπεργλωττιδική περιοχή Η υπεργλωττιδική περιοχή χωρίζεται σε 2 υποπεριοχές: 21

22 Τον επιλάρυγγα που περιλαμβάνει τους 2 αρυταινοειδείς χόνδρους, τις αρυταινοεπιγλωττιδικές πτυχές και το τμήμα της επιγλωττίδας που ανευρίσκεται άνωθεν του υοειδούς οστού. Την υπόλοιπη υπεργλωττιδική περιοχή που αποτελείται από το τμήμα της επιγλωττίδας που ανευρίσκεται κάτωθεν του υοειδούς οστού, τις νόθες φωνητικές χορδές και τις λαρυγγικές κοιλίες. Τ1: εξεργασία που περιορίζεται σε μια υποπεριοχή με καλή κινητικότητα των φωνητικών χορδών. Τ2: εξεργασία στο βλεννογόνο περισσότερων από μια υποπεριοχών του, ή στη γλωττίδα, ή σε περιοχή εκτός του υπεργλωττιδικού χώρου (βλεννογόνος της βάσης της γλώσσας, γλωσσοεπιγλωττιδικό βοθρίο, μέσο τοίχωμα των απιοειδών κόλπων) με καλή κινητικότητα της λαρυγγικής συσκευής. Τ3: ενδολαρυγγική εξεργασία με ακίνητη φωνητική χορδή και/ή επέκταση στην οπισθοκρικοειδική περιοχή, στον προεπιγλωττιδικό χώρο, στο παραγλωττιδικό διάστημα και/ή αρχόμενη διήθηση του θυρεοειδικού χόνδρου (διάβρωση του έξω φλοιού). Τ4a: εξεργασία που διηθεί πλήρως τον χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, μπορεί να καταλαμβάνει άλλες δομές και είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη. Τ4b:= εξεργασία που διηθεί πλήρως τον χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, αλλά δεν είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη (διήθηση καρωτίδας ή επέκταση στο μεσαύλιο). β) Γλωττιδική περιοχή Η γλωττιδική περιοχή χωρίζεται σε 3 υποπεριοχές: Γνήσιες φωνητικές χορδές Πρόσθια εντομή Αρυταινοειδική ή οπίσθια εντομή Τ1a: εξεργασία εντοπισμένη σε μία γνήσια φωνητική χορδή με καλή κινητικότητα, ανεξάρτητα από το αν υπάρχει επέκταση στην πρόσθια ή την οπίσθια εντομή. Τ1b: εξεργασία εντοπισμένη και στις δύο γνήσιες φωνητικές χορδές με καλή κινητικότητα, ανεξάρτητα από το αν υπάρχει επέκταση στην πρόσθια ή την οπίσθια εντομή. Τ2: εξεργασία που διηθεί την υπεργλωττιδική και/η την υπογλωττιδική περιοχή, με ή χωρίς υποκινητικότητα της φωνητικής χορδής. 22

23 Τ3: ενδολαρυγγική εξεργασία με ακίνητη φωνητική χορδή και/ή δίηθηση του παραγλωττιδικού διαστήματος και/ή αρχόμενη διήθηση του θυρεοειδικού χόνδρου (διάβρωση έσω φλοιού). Τ4a: εξεργασία που διηθεί πλήρως τον χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, μπορεί να καταλαμβάνει άλλες δομές και είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη. Τ4b: εξεργασία που διηθεί πλήρως τον χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, αλλά δεν είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη. γ) Υπογλωττιδική περιοχή Τ1: εξεργασία που περιορίζεται στην υπογλωττιδική περιοχή. Τ2: εξεργασία που επεκτείνεται στην γλωττιδική περιοχή, με ή χωρίς υποκινητικότητα των φωνητικών χορδών. Τ3: ενδολαρυγγική εξεργασία που προκαλεί ακινησία φωνητικής χορδής. Τ4a: εξεργασία που διηθεί πλήρως τον κρικοειδή ή τον θυρεοειδικό χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, μπορεί να καταλαμβάνει άλλες δομές και είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη. Τ4b: εξεργασία που διηθεί πλήρως τον χόνδρο, επεκτείνεται εξωλαρυγγικά, αλλά δεν είναι χειρουργικά εξαιρέσιμη (διήθηση του προσπονδυλικού χώρου, περιβάλλει την καρωτίδα ή επεκτείνεται στο μεσαύλιο). Σταδιοποίηση κατά Ν: Το σύμβολο «Ν» χαρακτηρίζει την παρουσία επιχώριων λεμφαδένων. Συγκεκριμένα χαρακτηρίζεται ως: ΝΧ: μη ανίχνευση επιχώριων λεμφαδένων. Ν0: απουσία διηθημένου λεμφαδένα στην περιοχή του τραχήλου. Ν1: εντόπιση μονήρους διηθημένου λεμφαδένα στον τράχηλο, ομόπλευρα με τη βλάβη και με μέγεθος μικρότερο ή ίσο των 3 εκατοστών. Ν2a: εντόπιση μονήρους διηθημένου λεμφαδένα στον τράχηλο, ομόπλευρα με τη βλάβη και με μέγεθος μεταξύ 3 και 6 εκατοστών. Ν2b: εντόπιση πολλαπλών διηθημένων λεμφαδένων στον τράχηλο, ομόπλευρα με τη βλάβη και με μέγεθος μικρότερο των 6 εκατοστών. Ν2c: = εντόπιση πολλαπλών διηθημένων λεμφαδένων στον τράχηλο, αμφοτερόπλευρα ή στην αντίθετη ως προς την βλάβη πλευρά, με μέγεθος μικρότερο των 6 εκατοστών. Ν3: εντόπιση ενός τουλάχιστον διηθημένου λεμφαδένα στον τράχηλο, μεγέθους άνω των 6 εκατοστών, ανεξάρτητα από το σημείο εντόπισής του. 23

24 Σταδιοποίηση κατά Μ: Το σύμβολο «Μ» χαρακτηρίζει την ύπαρξη ή όχι απομακρυσμένης μετάστασης. Συγκεκριμένα χαρακτηρίζεται ως: Μ0: απουσία απομακρυσμένης μετάστασης. Μ1: εντόπιση απομακρυσμένης μετάστασης Ανάλογα με τη σταδιοποίηση του όγκου κυμαίνονται και τα ποσοστά συνολικής επιβίωσης (ΣΕ/OS). Ειδικότερα για τους ασθενείς με γλωττιδικό καρκίνωμα, που αποτελεί και τον πιο συχνό όγκο του λάρυγγα, η επιβίωση μειώνεται όσο ανεβαίνει το «Τ» και κυμαίνεται ανά στάδιο ως εξής Τ1: 79%-93%, στάδιο Τ2: 66-85%, στάδιο Τ3: 44-56% και στάδιο Τ4: 26-39% (50-52). Σε μελέτη με υπεργλωττιδικά καρκινώματα (53), που αντιμετωπίστηκαν χειρουργικά με συνοδό τραχηλικό καθαρισμό, τα ποσοστά 3ετούς επιβίωσης ήταν τα ακόλουθα: στάδιο Τ1: 83%, Τ2: 79%, Τ3: 70% και Τ4: 67%. Το υπογλωττιδικό καρκίνωμα εμφανίζει χειρότερη πρόγνωση και συχνότερες τοπικές υποτροπές και μεταστάσεις (54). To 1/3 των ασθενών εμφανίζουν απομακρυσμένες μεταστάσεις, συνήθως στα οστά ή/και τους πνεύμονες (55). Στάδιο νόσου : Ο συνδυασμός των παραπάνω χαρακτηριστικών ενός όγκου κατατάσσει τον ασθενή σε ένα από τα παρακάτω τέσσερα στάδια (I-IV), ως εξής: AΝΑΤΟΜΙΚΑ ΣΤΑΔΙΑ (TNM/AJCC) AJCC TNM ΣΤΑΔΙΟ Τ Ν Μ 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T1, T2 T3 N1 N0, N1 M0 M0 III T1, T2 T3 N0, N1 N0, N1 M0 M0 IVA T4a, T4b N0, N1 Μ0 T1-3 N2 M0 IVΒ T4b Οποιοδήποτε Ν Μ0 Οποιοδήποτε T N3 Μ0 IVΒ Οποιοδήποτε T Οποιοδήποτε Ν Μ1 24

25 4.2 Ιστοπαθολογικοί και βιολογικοί προγνωστικοί παράγοντες Διαφοροποίηση του όγκου: Ο χαμηλός ιστολογικός βαθμός διαφοροποίησης (ΙΒΔ) σχετίζεται συχνά με πτωχότερη πρόγνωση (56). Γενικά όμως δεν φαίνεται να επηρεάζει την πρόγνωση (57). Τρόπος διήθησης του όγκου: Η διηθητική ανάπτυξη του νεοπλάσματος με τη μορφή καλά αφοριζόμενων βλαστών σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση (3). Η διήθηση από μεμονωμένα κύτταρα ή δοκίδες κυττάρων καθώς και η ασάφεια του διηθητικού στοιχείου σχετίζονται με επιθετικότερη νόσο (57). Λεμφαγγειακές και περινευρικές διηθήσεις: Η διήθηση λεμφαγγείων ή και αγγείων υποδηλώνει αυξημένη πιθανότητα λεμφαδενικών ή και απομακρυσμένων μεταστάσεων. Συνήθως ανευρίσκεται σε επιθετικά ΚΛΠΚ και σχετίζεται με υποτροπή και πτωχή πρόγνωση (52, 56, 58). Ομοίως, η περινευρική διήθηση σχετίζεται με αύξηση της τοπικής υποτροπής και μετάσταση στους περιοχικούς λεμφαδένες, γεγονός που οδηγεί σε ελάττωση της επιβίωσης (59, 60). Εξωκαψική επέκταση στις λεμφαδενικές μεταστάσεις: Η λεμφαδενική διήθηση αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη στον ΚΛ (52, 56, 61). Επιπρόσθετα η διήθηση της κάψας του λεμφαδένα και η εξωλεμφαδενική επέκταση σχετίζονται με αυξημένο πσοσοστό τοπικών υποτροπών, επέκτασης στους επιχώριους λεμφαδένες και μείωση του προσδόκιμου επιβίωσης (3). Χειρουργικά όρια: Η ολική αφαίρεση του όγκου αποτελεί μια από τις σημαντικότερες αρχές στην χειρουργική ογκολογία. Αρνητικά χειρουργικά όρια, ακόμα και μερικών χιλιοστών, σχετίζονται συνήθως με ελάττωση του ποσοστού υποτροπής και μεγαλύτερο ποσοστό επιβίωσης (62-64). Στα υπεργλωττιδικά ή γλωττιδικά καρκινώματα προχωρημένου σταδίου, αρνητικά χειρουργικά όρια της τάξης των 5 χιλιοστών από τον όγκο θεωρούνται επαρκή (65). Μιτωτική δραστηριότητα: Η μιτωτική δραστηριότητα αναδεικνύεται ανοσοϊστοχημικά κυρίως με τους δείκτες Ki67/MIB-1 και PCNA (Proliferative Cell Nuclear Antigen). Ο βαθμός της μιτωτικής δραστηριότητας, με βάση την έκφραση του Ki67, έχει αναφερθεί ότι είναι σημαντικά υψηλότερος στη νεοπλασία σε σχέση με τη δυσπλασία (66), ότι σχετίζεται με τον βαθμό διαφοροποίησης του ΚΛ (67), καθώς και την παρουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων (68, 69). Παρόλα αυτά η μέτρηση της μιτωτικής δραστηριότητας με τους παραπάνω δείκτες δεν αποτελεί, στην πλειονότητα των μελετών, ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη της ΣΕ (66, 69-71). 25

26 DNA πλοειδία: Η προγνωστική σημασία της DNA πλοειδίας έχει μελετηθεί εκτενώς με αντιφατικά αποτελέσματα. Μελέτες έδειξαν πως οι ανευπλοειδικοί όγκοι σχετίζονται με υψηλότερη συχνότητα λεμφαδενικών μεταστάσεων και χαμηλά ποσοστά επιβίωσης (72-74), ενώ άλλες δεν επιβεβαίωσαν τα παραπάνω ευρήματα (75, 76). Σε ότι αφορά την σχέση της πλοειδίας και την ανταπόκριση στη θεραπεία, τα αποτελέσματα είναι επίσης αντικρουόμενα (74, 77). Bcl-2: Το πρωτο-ογκογονίδιο Bcl-2 θεωρείται ότι αναστέλλει την κυτταρική απόπτωση και ως εκ τούτου προάγει την ανθεκτικότητα των καρκινικών κυττάρων έναντι χημειοθεραπευτικών παραγόντων ή της ακτινοθεραπείας. Η χρωματοσωμιακή μετάθεση (t14:18), προκαλεί την υπερέκφραση του και προάγει έτσι την αντιαποπτωτική του δράση. Η δράση της πρωτεΐνης Βcl-2 φαίνεται να σχετίζεται με το διμερισμό της, είτε με μόρια που δρουν συνεργικά όπως το Βcl-xl, είτε με ανταγωνιστικά μόρια όπως τα Βax, Βcl-xs. Σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της απόπτωσης παίζει και η p53, η οποία αναστέλλει τη δράση της Βcl-2, είτε άμεσα, είτε έμμεσα, μέσω της αύξησης της Βax πρωτεΐνης, που αποτελεί ανταγωνιστή της Βcl-2. Οι μελέτες της Bcl-2 είναι λίγες στον ΚΛ και οι πλειονότητα τους δεν εμφανίζει συσχέτιση με την πρόγνωση (78-80). Cyclin D1: Η κυκλίνη D1 διαδραματίζει σημαντικότατο ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου μέσω της επίδρασης στην φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώματος (Rb). Η φωσφορυλιωμένη Rb (prb) μορφή δεν μπορεί να συνδεθεί με τον μεταγραφικό παράγοντα E2F-DP-1, με τελικό αποτέλεσμα την μετάβαση του κυττάρου από την φάση G1 στην φάση S του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Στο ΚΛ η Cyclin D1 έχει μελετηθεί αρκετά, κυρίως σε επίπεδο πρωτεΐνης, με διφορούμενα αποτελέσματα. Σπάνιες μελέτες έχουν δείξει ότι αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη ως προς την ΣΕ (81, 82) και την ΕΥΕ (69), ενώ η πλειονότητα απέτυχε να αναδείξει προγνωστική αξία (83-85). p53: Η πρωτεΐνη p53 αποτελεί το μόριο με την μεγαλύτερη βιβλιογραφία (>65000 αναφορές) και θεωρείται ως ο «φύλακας» του γονιδιώματος. Παίζει κεντρικότατο ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου ελέγχοντας την είσοδο των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S, ενώ επίσης συμμετέχει στη σύνθεση και επιδιόρθωση του DNA, καθώς και στην απόπτωση. Η μεταλλαγμένη p53 στερείται ογκοκατασταλτικής δράσης. Τα έως τώρα ευρήματα μελετών που αφορούν μεταλλάξεις αλλά και την υπερέκφραση του p53 μορίου στο λαρυγγικό καρκίνωμα έχουν αποτύχει να αναδείξουν την p53 ως προγνωστικό δείκτη (42, 71, 80, 86, 87). 26

27 Οικογένεια υποδοχέων HER: Η οικογένεια του ανθρώπινου υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER) αποτελείται από τέσσερεις ομόλογους υποδοχείς τύπου τυροσινικής κινάσης (RTK) και ειδικότερα τους: EGFR (HER1/ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), και HER4 (ErbB4). Οι παραπάνω υποδοχείς εμφανίζουν μια γενική κοινή δομή που αποτελείται από ένα εξωκυττάριο τμήμα (ExtraCellular Domain-ECD), μια ενδοκυτταρική περιοχή με δράση κινάσης (Kinase Domain-KD), και ένα ενδοκυτταρικό τελικό τμήμα (c-terminal). Αποτελούν δηλαδή διαμεμβρανικούς υποδοχείς και διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε ποικίλα φυσιολογικά κυτταρικά φαινόμενα, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση, αλλά και η επιβίωση και η διαφοροποίηση των κυττάρων. Η σηματοδότηση τους εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από εξωκυττάριους προσδέτες (ligands) (88). Μέχρι σήμερα έχουν περιγραφεί 12 μόρια συνδέτες για τους 4 υποτύπους του υποδοχέα. Τρείς συνδέτες για τον HER1 υποδοχέα (EGF, AR, TGF-a), κανένας για τον HER2, τρείς κοινοί συνδέτες για τους HER1 και HER4 (BTC, HB EGF, EPR), οι συνδέτες NRG1 και NRG2 είναι κοινοί για τους HER3 και HER4 και τέλος οι NRG3 και NRG4 συνδέονται μόνο με τον HER4 υποδοχέα (88). Οι συνδέτες αυτοί συντίθενται ως διαμεμβρανικές πρωτεΐνες και οι διαλυτοί αυξητικοί παράγοντες προέρχονται από την πρωτεολυτική τους διάσπαση μέσω πρωτεϊνών ADAM οι οποίες είναι μεταλλοπρωτεάσες προσκολλημένες στην κυτταρική μεμβράνη (89). Η πρόσδεση του συνδέτη με τον υποδοχέα οδηγεί σε σταθεροποίηση του ECD τμήματος που ευνοεί τον διμερισμό του με άλλο υποδοχέα της οικογένειας. Η σύνδεση αυτή προκαλεί μια μεταβολή στην τρισδιάστατη δομή του μορίου ευνοώντας το συσχετισμό με ένα δεύτερο μόριο υποδοχέα, τη γειτνίασή τους και τον επακόλουθο σχηματισμό διμερούς. Συνέπεια του διμερισμού είναι η ενεργοποίηση του ενδοκυττάριου τμήματος KD και η φωσφορυλίωση του c-τμήματος του μορίου που τελικά οδηγεί στην πρόσληψη σηματοδοτικών μορίων και την ενεργοποίηση ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, που οδηγούν στην αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και αναστολή της απόπτωσης, σε αυξημένη κυτταρική κινητικότητα και τελικά στην εμφάνιση και πρόοδο του καρκίνου. Η οικογένεια HER εμφανίζει ειδικό, μοναδικό έως τώρα, μηχανισμό με τον οποίο επάγει τον διμερισμό και την ενεργοποίηση του KD. Στις περισσότερες RTKs, ο διμερισμός οδηγεί στην φωσφορυλίωση του ενεργού κέντρου της KD και την παραγωγή μίας ενεργοποιημένης κινάσης που φωσφορυλιώνει υποστρώματα μέχρι τότε αδρανοποιημένα από φωσφατάσες. Στην οικογένεια HER, ο διμερισμός οδηγεί στην αλλοστερική ενεργοποίηση ενός KD από άλλο KD χωρίς απαίτηση για φωσφορυλίωση του ενεργού βρόχου. 27

28 Οι ErbB2-HER2, ErbB3-HER3 και ErbB4-HER4 υποδοχείς εμφανίζουν ομολογία των εξωκυττάριων αλύσων τους σε σχέση με τον EGFR κατά 44%, 36% και 48% αντίστοιχα, ενώ για την KD η ομολογία ανέρχεται στο 82%, 59% και 79 % αντίστοιχα. Οι ομολογίες για την ρυθμιστική καρβοξυτελική αλυσίδα είναι της τάξης του 32%, 24% και 28% (90). Σε γενικές γραμμές, τα ετεροδιμερή είναι πιο ενεργά σύμπλοκα σηματοδότησης και το HER2-HER3 ετεροδιμερές είναι το πιο ενεργό διμερές σηματοδότησης σε αυτή την οικογένεια (88). Αυτή η εγγενής ποικιλομορφία ζευγών διμερισμού, σε συνδυασμό με την ποικιλία των συνδετών και την ποικιλομορφία του καρβοξυτελικού (c-terminal) τμήματος, δημιουργεί μια πληθώρα πιθανών οδών σηματοδότησης. Έχουμε μόλις αρχίσει να εντοπίζουμε τα επιμέρους μοναδικά χαρακτηριστικά των μελών της οικογένειας HER και οι πληροφορίες που συσσωρεύονται μπορεί μελλοντικά να χρησιμεύσουν για την διερεύνηση των μηχανισμών δράσης τους αλλά και στη δημιουργία ειδικών αναστολέων. Το πιο ιδιαίτερο μέλος στην οικογένεια αυτή φαίνεται να είναι το HER3. Ο HER1 υποδοχέας είναι το καλύτερα μελετημένο μέλος της οικογένειας HER στον άνθρωπο με πάνω από αναφορές στο PubMed. Υπερεκφράζεται σε πληθώρα φυσιολογικών ιστών και νεοπλασιών και συχνά στον ΚΛ καθώς και στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου γενικότερα (91-93). Η υπερέκφραση στον ΚΛ συχνά οφείλεται σε επίδραση μετα-μεταφραστικών μηχανισμών και δεν έχει συσχετισθεί με γονιδιακή ενίσχυση (91, 92). Μελέτες έχουν δείξει ότι αποτελεί δείκτη επιθετικότερης βιολογικής συμπεριφοράς (93-95), μετάστασης (93), ενώ εμφανίζεται και ως δείκτης βραχύτερης ΕΥΕ και ΣΕ (80, 93, 95). Υπερέκφραση του EGFR παρατηρείται και στο φυσιολογικό λαρυγγικό επιθήλιο που γειτνιάζει με τον όγκο, ενώ σε απομακρυσμένες θέσεις με φυσιολογικό επιθήλιο εκφράζεται κυρίως στα κύτταρα της βασικής-παραβασικής στιβάδας (93). Τα ευρήματα που αφορούν την έκφραση του HER2 υποδοχέα στον ΚΛ είναι διφορούμενα. Υπάρχουν μελέτες που παρουσιάζουν υψηλή έκφραση του HER2 (96, 97), η οποία φθάνει έως το εξαιρετικά υψηλό 76% (96), ενώ άλλες εμφανίζουν χαμηλή έκφραση του παραπάνω υποδοχέα. Η γονιδιακή ενίσχυση είναι ιδιαίτερα χαμηλή και κυμαίνεται από 1-3.6% (35, 98) HER3 Ο τρίτος υποδοχέας της οικογένειας, ο HER3, έχει ελάχιστα μελετηθεί στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου, με μία μόνο μελέτη στον καρκίνο του λάρυγγα (32) και δύο συνολικά μελέτες, με πιο πρόσφατη μελέτη των Takikita και συν., στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου (99, 100). Μάλιστα την περίοδο επιλογής του θέματος, δεν υπήρχε καμία 28

29 αναφορά στην Ελληνική και Διεθνή βιβλιογραφία για τον HER3 υποδοχέα στον ΚΛ και μόνο μία για τον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου (99). Εικόνα 4.1. Σχηματική αναπαράσταση των λειτουργιών ενεργοποίησης του HER3. (Α) Όταν ενωθεί με τον συνδέτη, η εξωκυττάρια περιοχή (ECD) του HER3 υιοθετεί μια διαμόρφωση που είναι ιδιαίτερα ευνοϊκή για διμερισμό με άλλα μέλη της οικογένειας HER. Στην εικόνα παρουσιάζεται ο διμερισμός με τον HER2, αλλά λειτουργεί με παρόμοιο τρόπο με όλα τα άλλα μέλη της οικογένειας HER. Όταν διμερίζεται με τον HER2 υποδοχέα, η περιοχή KD του HER3 αλληλεπιδρά με την περιοχή KD του HER2. Αυτή η αλλοστερική αλληλεπίδραση ενεργοποιεί το HER2 KD. Το ενεργοποιημένο HER2 KD με τη σειρά του φωσφορυλιώνει το C-terminal τμήμα του HER3, το οποίο οδηγεί στην επαγωγή ενδοκυτταρικής σηματοδότησης. (Β) Σε αδρανή κατάσταση, η HER3 KD αλληλεπιδρά τόσο με το Ν-τμήμα του μορίου, όσο και με το c-terminal δημιουργώντας αλυσίδες (clusters) ανενεργών HER3 μορίων. Τροποποιημένη από Amin D et al. (88). Ο HER3, γνωστός και ως cerbb-3 ή ErbB-3 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη, μεγέθους 1342 AA και μοριακού βάρους Da. Στον άνθρωπο κωδικοποιείται από το γονίδιο ERBB3 που εδράζεται στο χρωμόσωμα 12 και ειδικότερα στη θέση 12q13. Ο HER3 στερείται καταλυτικής λειτουργίας, που αποτελεί μοναδικό χαρακτηριστικό μεταξύ των υπόλοιπων υποδοχέων της οικογένειας, δεν είναι δηλαδή σε θέση να δημιουργήσει σήμα ενεργοποίησης μέσω ομοδιμερισμού και αποτελεί υποχρεωτικό εταίρο για τον ετεροδιμερισμό με άλλα μέλη της οικογένειας HER (Εικόνα 4.1). Επιπροσθέτως, το καρβοξυλικό τελικό (c-terminal) τμήμα του μορίου είναι επίσης μοναδικό καθόσον περιέχει 14 θέσεις μορίων τυροσίνης (Εικόνα 4.2), οι οποίες όταν φωσφορυλιωθούν μπορούν δυνητικά να ενωθούν με πολλά μόρια των SH2 ή ΡΤΒ δεσμευτικών πρωτεϊνών, που με την 29

30 σειρά τους εμπλέκονται στην ενεργοποίηση πολλών ενδοκυττάριων σηματοδοτικών μονοπατιών (101). Εικόνα 4.2. Σχηματική αναπαράσταση των 14 μορίων τυροσίνης στο καρβοξυλικό (c-terminal) τμήμα του HER3. Ο ακριβής αριθμός και ποιες από τις υπάρχουσες τυροσίνες φωσφορυλιώνονται στα κύτταρα δεν έχει ακόμα επιβεβαιωθεί. Διακρίνονται οι έξι θέσεις σύνδεσης του ΡΙ3Κ μορίου, μέσω των οποίων φωσφορυλιώνονται οι τρεις λειτουργικές υπομονάδες του ΡΙ3Κ (101). Η ενεργοποίηση της PI3K έχει ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση μορίων φωσφατιδυλινοσιτόλης στην κυτταρική μεμβράνη με επακόλουθο την πρόσληψη και την ενεργοποίηση των PDK1 και Akt. Η Akt αποτελεί σημαντικότατο μόριο ενδοκυττάριας σηματοδότησης και είναι σε θέση να ελέγχει πολυάριθμες βιολογικές διεργασίες, κρίσιμες για την ογκογένεση (Εικόνα 4.3) συμπεριλαμβανομένων μεταξύ των άλλων, αυτών της μετάφρασης, της επιβίωσης, της ρύθμισης του κυτταρικού μεταβολισμού, της αναστολής της απόπτωσης και του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου (102). Ο σύνδεσμος μεταξύ HER3 και της οδού της Akt παρέχει όχι μόνο τη δυνατότητα για ογκογόνο δράση των υπόλοιπων ενεργών κινασών της οικογένειας HER, αλλά δημιουργεί και έναν σηματοδοτικό κόμβο, ο 30

31 οποίος μπορεί δυνητικά να αξιοποιηθεί και από άλλες οδούς σηματοδότησης που με τη σειρά τους ενεργοποιούν την Akt. Οι περισσότεροι όγκοι απαιτούν την PI3K/Akt σηματοδότηση για την επιβίωσή τους, και αυτό συχνά επιτυγχάνεται με την υπερδραστηριότητα του υποδοχέα τυροσίνης, με ενεργοποίηση λόγω μετάλλαξης του PI3K, ή αδρανοποίηση του PTEN. Ωστόσο, η επαγωγή έκφρασης του HER3 παρέχει επιπρόσθετα και ένα άλλο μονοπάτι προς αυτό το στόχο. Η διαπίστωση ότι η επαγωγή της έκφρασης HER3 ή ότι η σηματοδότηση σχετίζεται με την φαρμακευτική αντίσταση σε αρκετά αντικαρκινικά υποστηρίζει έναν τέτοιο ρόλο (103). Εικόνα 4.3. Παρουσίαση μέρους των οδών ενεργοποίησης της Akt, καθώς και των δράσεων της. Φαίνεται από το σχήμα η πληθώρα των μορίων που αλληλεπιδρούν με την Akt και οι πολυάριθμες κυτταρικές οδοί και μηχανισμοί που ενεργοποιούνται ή αναστέλλονται από την δράση της. Από Abcam.com (www. Abcam.com) 31

32 Μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση του HER3 σχετίζεται με την αντίσταση σε αναστολείς HER2 σε HER2-θετικούς όγκους του μαστού (103), σε αναστολείς του EGFR σε καρκίνους του πνεύμονα (104) και με αντοχή στην περτουζουμάμπη στον καρκίνο των ωοθηκών (105). Επίσης, έχει αναφερθεί και αντίσταση σε αντι-οιστρογόνο θεραπείες σε ER θετικούς καρκίνους του μαστού (106), σε αναστολείς του EGFR στον καρκίνο της κεφαλής και τραχήλου (107), με αντοχή στην ορμονοθεραπεία καρκίνων του προστάτη (108), καθώς και με τους αναστολείς IGF1R στο ηπατοκυτταρικό καρκίνο (109). Στα περισσότερα από τα παραπάνω άρθρα, γίνεται αποδεκτό το σενάριο ότι η φωσφορυλίωση του HER3 καθοδηγείται από κάποιο άλλο μέλος της οικογένειας των υποδοχέων HER. Μια άλλη υπόθεση είναι ότι ο HER3 αποτελεί και υπόστρωμα άλλων κινασών, όπως του c-μετ, ωστόσο, μένει να αποδειχθεί και σε άλλες μελέτες (104). Σε αντίθεση με τις άλλες πρωτεΐνες της οικογένειας HER, ο HER3 υποδοχέας δεν μετασχηματίζεται όταν είναι ενεργοποιημένος από τους προσδέτες ή όταν υπερεκφράζεται (110), ενώ δεν υπάρχουν έως σήμερα γνωστές μεταλλάξεις που να προσδίδουν ογκογόνο δραστηριότητα στον HER3. Τα παραπάνω ευρήματα μπορεί να οφείλονται σε μηχανισμούς που φαίνεται να λειτουργούν ως ανασταλτικοί διακόπτες της σηματοδότησης του HER3 (Εικόνα 4.4). Η έκφραση της HER3 πρωτεΐνης ρυθμίζεται τόσο από μεταγραφικούς όσο και από μετα-μεταγραφικούς μηχανισμούς (Εικόνα 4.4). Μετα-μεταγραφικά, ρυθμίζεται από την Ε3 λιγάση Nrdp1 και τον ρυθμιστή της Nrdp1, USP8 (111). Η USP8 με τη σειρά της ρυθμίζεται από την Akt, και αυτή η οδός δυνητικά συνδέει την έκφραση του HER3 με κατώτερες από την Akt ενδοκυττάριες σηματοδοτικές οδούς. Η διαμεμβρανική πρωτεΐνη LRIG1 είναι άλλος ένας αρνητικός ρυθμιστής σηματοδότησης μέσω των HER υποδοχέων. Συνεργάζεται και με τα τέσσερα μέλη της οικογένειάς HER, αν και πρόσφατες μελέτες έχουν ασχοληθεί μόνο με το ρόλο της στην ειδική ρύθμιση των EGFR και HER2 (112, 113). Η διαμεμβρανική βλεννίνη MUC4 σταματά την διακίνηση, μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, των HER2 και HER3 μορίων οδηγώντας έτσι στην σταθεροποίηση τους στην μεμβράνη, με συνέπεια την αύξηση της ενδοκυττάριας σηματοδοτικής λειτουργίας τους (114). Η μεταγραφική ρύθμιση του HER3, φαίνεται από την ανταπόκριση στη θεραπεία με αναστολείς κινάσης τυροσίνης (TKI), in vitro και in vivo σε HER2-θετικούς όγκους του μαστού (103), αλλά και σε στοιχεία που δείχνουν την ρύθμιση του από αρκετά micrornas (mirna), συμπεριλαμβανομένων των mir205, mir125a, και mir125b (114, 115). 32

33 Η υπάρχουσα βιβλιογραφία σχετικά με την έκφραση και τη σημασία του HER3 στον ανθρώπινο καρκίνο δεν είναι ευρεία. Τα δεδομένα των μελετών διαφέρουν σημαντικά ως προς την μεθοδολογία, τις τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί (Nothern Blot, Western Blot, ΙΗC, FISH, ELISA, q-pcr) και δεν μπορούν να συγκριθούν εύκολα μεταξύ τους (101). Κάποιοι μελετητές αναλύουν την έκφραση του HER3, άλλοι την υπερέκφραση σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς ή εντός του ιδίου δείγματος. Υπάρχει επίσης μεγάλη διακύμανση και στην αναφερόμενη εντόπιση του HER3 με την IHC. Παρατηρείται, στην πλειονότητα των ανοσοϊστοχημικών μελετών, κυτταροπλασμική εντόπιση του HER3, σπάνια μεμβρανική εντόπιση και σε μία μελέτη και πυρηνική έκφραση (116), εύρημα το οποίο πρέπει να ερμηνευθεί με προσοχή μέχρι να επιβεβαιωθεί από ειδικές βιοχημικές μελέτες. Εικόνα 4.4. Παρουσίαση των μηχανισμών περιορισμού της HER3 σηματοδότησης. Τροποποιημένη από Campbell Μ et al. (101). Έκφραση ή υπερέκφραση της HER3 πρωτεΐνης έχει αναφερθεί σε καρκινώματα μαστού, στομάχου, οισοφάγου, παγκρέατος, προστάτη αδένα, ωοθηκών, πνεύμονα, κεφαλής και τραχήλου, παχέος έντερου, καθώς και στο μελάνωμα δείχνοντας ότι πιθανότατα διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην διαδικασία της καρκινογένεσης ( ) 33

34 4.2.2 PTEN Το γονίδιο PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten), το οποίο στον άνθρωπο εδράζεται στο βραχύ σκέλος του χρ. 10, τμήμα q23.3, ανακαλύφθηκε το 1997 (128, 129) και έχει αναγνωρισθεί ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που πολύ συχνά εμφανίζει μεταλλάξεις στον ανθρώπινο καρκίνο. Το PTEN γονίδιο περιέχει 9 εξόνια και 1209 νουκλεοτίδια, ενώ η κωδικοποιημένη PTEN πρωτεΐνη έχει μέγεθος 403 αμινοξέων και αποτελείται από το αμινο-τελικό τμήμα (Ν-terminal domain), το δομικό τμήμα C2 (Cstructural domain) και το μοτίβο πρόσδεσης τύπου Ι ΡDΖ (PSD-95, Disks-large, ΖΟ-1) στο καρβοξυλικό άκρο (130). Το αμινο-τελικό τμήμα εμφανίζει κυρίως ενζυμική δραστηριότητα, ενώ το τμήμα C2 αποτελεί περιοχή σύνδεσης λιπιδίων. Έχει αναφερθεί ότι το τμήμα C2 διευκολύνει την αποτελεσματικότερη σύνδεση του μορίου στην κυτταρική μεμβράνη και την ενεργοποίηση της φωσφατάσης παρουσιάζοντας ένα μικρό τμήμα των αμινοξέων στο αμινοτελικό τμήμα του μορίου (131, 132). Το PDZ δεσμευτικό μοτίβο του PTEN αποτελεί μια σπονδυλωτή περιοχή η οποία αναγνωρίζει και αλληλεπιδρά με το καρβοξυλικό άκρο των πρωτεϊνών στόχων και ως εκ τούτου παίζει σημαντικό ρόλο στη στόχευση πρωτεϊνών και/ή στη δημιουργία πρωτεϊνικών σύμπλοκων σε διάφορα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης (133). Σχηματική απεικόνιση των τμημάτων του PTEN μορίου, παρουσιάζονται στην Εικόνα 4.5. Εικόνα 4.5. Παρουσίαση της δομής της PTEN πρωτεΐνης. Διακρίνονται τα τμήματα. PBM: PIP2- binding module; Τμήμα με δράση φωσφατάσης; τμήμα C2; PEST: proline, glutamate, serine, threonine; PDZ: post-synapic density protein (PSD95). Τροποποιημένη από Zhang P. et al. (134) Οι μεταλλάξεις του γονιδίου PTEN εμφανίζονται με σημαντική συχνότητα σχεδόν σε όλους τους τύπους ανθρώπινων όγκων και μεταλλάξεις τουλάχιστον σε ένα αλληλόμορφο εμφανίζονται στο 30-50% των καρκινωμάτων του μαστού, του παχέος εντέρου, και του 34

35 πνεύμονα και σε 50-80% στο καρκίνωμα του προστάτη, του ενδομητρίου και στο γλοιοβλάστωμα [(135) & Πλήρης απώλεια του PTEN παρατηρείται σε υψηλότερες συχνότητες στον καρκίνο του ενδομητρίου και στο γλοιοβλάστωμα και γενικώς σχετίζεται με προχωρημένη νόσο και μετάσταση (136). Η σημασία του PTEN ως ογκοκατασταλτικό μόριο υποστηρίζεται περαιτέρω και από την μελέτη κληρονομικών μεταλλάξεων (germline mutations) του PTEN σε ομάδα συνδρόμων που κληρονομούνται με τον αυτοσωματικό επικρατούντα χαρακτήρα και χαρακτηρίζονται από αναπτυξιακές και νευρολογικές διαταραχές, πολλαπλά αμαρτώματα, και αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του μαστού, του θυρεοειδούς, και του ενδομητρίου. Συνολικά, τα παραπάνω σύνδρομα αναφέρονται ως PTEN αμαρτωματώδη ογκογόνα σύνδρομα (PTEN hamartoma tumor syndromes/phts) και περιλαμβάνουν το σύνδρομο Cowden, τη νόσο Lhermitte-Duclos, το σύνδρομο Bannayan-Riley-Ruvalcaba, και τα Proteus και Proteus-like σύνδρομα (135). Επιπρόσθετα σε διάφορα πειραματικά μοντέλα σε ποντίκια με απώλεια του PTEN, παρατηρείται εμφάνιση πολλαπλού τύπου νεοπλασιών (137, 138). Η πρωτεΐνη PTEN δρώντας ως φωσφατάση αποφωσφορυλιώνει την 3,4,5- τριφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη (PIP3), προϊόν της φωσφοϊνοσιτίδης 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) και την μετατρέπει σε διφωσφορική φωσφατιδυλινοσιτόλη (PIP2), αναστέλλοντας έτσι την PIP3 εξαρτώμενη σηματοδότηση (139). Η παραπάνω ανακάλυψη οδήγησε στην πραγματοποίηση πλήθος μεταγενέστερων μελετών που ανέδειξαν την PTEN ως ένα ευρέως διαδεδομένο αναστολέα της PI3K-εξαρτώμενης σηματοδότησης (140). Η PI3K/PTEN οδός σηματοδότησης επηρεάζει την συμπεριφορά των κυττάρων μέσω των επιρροών που ασκεί σε πλήθος PIP3-δεσμευτικών πρωτεΐνών, με κυριότερες τις πρωτεϊνικές κινάσες Akt (141) (Εικόνα 4.3). Με αυτόν τον τρόπο, οι PI3K και PTEN πρωτεΐνες ενορχηστρώνουν την κυτταρική απάντηση σε αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, ιντεγκρίνες, άλλους ενδοκυττάριους μεσολαβητές και συμβάλλουν στην ανάπτυξη, την κινητικότητα, την επιβίωση και τον μεταβολισμό πολλών τύπων κυττάρων. Η PTEN, λόγω της ισχυρής δραστηριότητάς της ως φωσφατάσης σε in vitro μελέτες, πιστεύεται ότι παίζει και ογκοκατασταλτικό ρόλο και στον πυρήνα του κυττάρου, ρόλος ο οποίος είναι ανεξάρτητος από την μεμβρανική εντόπιση της PIP3 (142). Η απώλεια λειτουργίας του PTEN στη νεοπλασία θα πρέπει επίσης να ενταχθεί και στα πλαίσια της ευρύτερης οδού της PI3K, όπου ένα εναλλακτικό μονοπάτι της PIP3 - προερχόμενο από την επίδραση μορίων της οικογένειας της 5-φωσφατιδυλοϊνοσιτολικής φωσφατάσης και ιδίως των ενζύμων SHIP στο PI3K - το ΡΙ(3,4)Ρ2 λειτουργεί ως παράλληλο μονοπάτι ενεργοποίησης (Εικόνα 4.6). 35

36 Εικόνα 4.6. Παρουσίαση του πυρήνα της ΡΙ3-κινάσης μονοπατιού. Στο καθιερωμένο μοντέλο, η σύνθεση του PIP3 γίνεται μέσω της δράσης του ενεργοποιημένου υποδοχέα στις κατηγορίας Ι (class I) ΡΙ3-κινάσες. Μία εναλλακτική οδός μεταβολισμού του PIP3 παρέχεται από τη δράση του ενζύμου φωσφατιδυλοϊνοσιτολική 5-φωσφατάση, όπως είναι η SHIP, η οποία μετατρέπει το PIP3 σε PI(3,4)P2. Τα PIP3 και PI(3,4)P2 επηρεάζουν πολλές κυτταρικές διεργασίες μέσω επιλεκτικών λιπιδο-δεσμευτικών πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν και τις Akt-κινάσες (140). Έχει προταθεί ότι η απώλεια λειτουργίας του PTEN από διάφορους μοριακούς μηχανισμούς δύναται να δημιουργεί διαβαθμίσεις της ογκοκαταστολής. Η λειτουργία του PTEN μπορεί να μειωθεί ή απολεσθεί μέσω ομόζυγων ή ετερόζυγων γενετικών μεταλλάξεων, οι οποίες οδηγούν σε σταδιακή απώλεια της δράσης του PTEN (135). Επιγενετικοί μηχανισμοί όπως η μεθυλίωση του προαγωγέα και η ακετυλίωση ιστονών, η θετική - μέσω των Egr-1, p53, Atf2, CBP/p300- ή η αρνητική - μέσω των NF-kB, p53, Snail1, Bmi-1, C-Jun - ρύθμιση της μεταγραφής του PTEN mrna, η μετα-μεταγραφική αποσιώπηση από mirna (mir-17-92, mir-19a, mir-21, mir-26a, mir-155, mir214, mir- 216a, mir-217), η μετα-μεταφραστική τροποποίηση, και η αλληλεπίδραση με άλλα μόρια δύναται να προκαλέσουν ήπιες και/ή δραματικές απώλειες της λειτουργικότητας του (143). Οι παραπάνω συνδυασμοί επιδράσεων οδηγούν τελικά σε συνεχή δυσλειτουργία του PTEN με αποτέλεσμα την αύξηση της νοσηρότητας. Πειραματικά μοντέλα σε ποντίκια, έδειξαν ότι η διαταραχή της πλοειδίας (haploinsufficiency), σε όγκους που φθάνει έως το 50% του συνολικού PTEN είναι ανεπαρκής για την ογκοκαταστολή. Από την άλλη πλευρά, όταν τα επίπεδα του PTEN πλησιάζουν την πλήρη απώλεια της έκφρασης, τα κύτταρα με ανέπαφη 36

37 p53 σηματοδότηση δίνουν το έναυσμα για την ενεργοποίηση του προγράμματος κυτταρικής γήρανσης, λειτουργώντας έτσι ως τροχοπέδη για την εξέλιξη του όγκου (Εικόνα 4.7). Εικόνα 4.7. Συνοπτική παρουσίαση των μηχανισμών που οδηγούν σε δυσλειτουργία ή απώλεια της λειτουργικότητας του PTEN. Τροποποιημένη από Salmena L. et al. (135) και Leslie N. et al. (143). Η πρωτεΐνη PTEN εκφράζεται σχεδόν σ όλους τους ανθρώπινους ιστούς και η εντόπιση της στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα είναι στενά εξαρτημένη από την φάση του κυτταρικού κύκλου (144). Απουσία έκφρασης της PTEN έχει παρατηρηθεί πιο συχνά στον καρκίνο του ενδομητρίου (145), στο γλοιοβλάστωμα (146, 147), στο μελάνωμα (148), στον καρκίνο του προστάτη (149), του μαστού (150, 151), του παχέος εντέρου (152), των ωοθηκών (153), της ουροδόχου κύστης (154), του πνεύμονα (155) κα. Στον καρκίνο της 37

38 κεφαλής και τραχήλου τα δεδομένα σχετικά με την PTEN είναι ολιγάριθμα και φαίνεται ότι η ποσοστιαία απώλεια της PTEN πρωτεΐνης στους όγκους της περιοχής αυτής να είναι χαμηλότερη από άλλους τύπους νεοπλασμάτων ( ) TOPOISOMERASE IIa (TopoIIa) Οι DNA τοποϊσομεράσες (DNA topoisomerases), αποτελούν μία ομάδα ενζύμων, τα οποία υπάρχουν τόσο στα ευκαρυωτικά όσο και στα προκαρυωτικά κύτταρα, με κυριότερη λειτουργία την τροποποίηση και την διατήρηση της δομής και λειτουργικότητας του DNA. Έχουν εντοπισθεί πέντε τοποϊσομεράσες (I V), αλλά μόνο οι Ι και ΙΙ φαίνεται να είναι παρούσες στα θηλαστικά (159). Οι δύο τελευταίες ταξινομούνται ανάλογα με την ιδιότητα τους να δρουν στη μία ή στις δύο έλικες του DNA αντίστοιχα. Η τοποϊσομεράση Ι καταλύει τη χαλάρωση του αρνητικά ή θετικά υπερελικωμένου DNA και μειώνει των αριθμό συνδέσεων κατά μία μονάδα. Για τη δράση του ενζύμου δεν απαιτείται ενέργεια (ATP). Από την άλλη μεριά, η τοποϊσομεράση ΙΙ (TopoIIa) καταλύει την εισαγωγή αρνητικών ή θετικών υπερελικώσεων στο DNA με δαπάνη ATP (Εικόνα 4.8). Η αντίδραση αρχίζει με το τύλιγμα περίπου 200 bp DNA γύρω από το ένζυμο. Στη συνέχεια, η δέσμευση του ATP προκαλεί τη διάσπαση και των δύο αλυσίδων του DNA. Το επόμενο βήμα είναι το πέρασμα ενός τμήματος DNA διαμέσου του ανοίγματος των σταθεροποιημένων άκρων (πύλη) και το τελευταίο βήμα αφορά την επανασυγκόλληση του σπασίματος του DNA, αποκαθιστώντας έτσι τη συνέχεια και των άλλων αλυσίδων του δίκλωνου μορίου. Το ένζυμο επιτρέπει εύκολες μετακινήσεις μόνο προς την κατεύθυνση που οδηγεί σε αρνητική υπερελίκωση (Εικόνα 4.8). Η δράση αυτή της τοποϊσομεράσης ΙΙ είναι υψίστης σημασίας κατά τη φάση της μίτωσης των κυττάρων, αφού κατέχει την μοναδική ικανότητα να δημιουργεί διπλές τομές στο DNA και κατ αυτό τον τρόπο να επιτρέπει τη διέλευση της μιας έλικας μέσα από την άλλη, χαλαρώνοντας σαν αποτέλεσμα την συσσωρευμένη δυναμική ενέργεια. Εικόνα 4.8. Παρουσίαση του μηχανισμού δράσης της TopoIIa στο DNA. Τροποποιημένη από Vos SM. et al. (160). 38

39 Επιπρόσθετα, όχι μόνο απομακρύνει τις θετικές ή αρνητικές υπερέλικες του DNA, αλλά και έχει την δυνατότητα να απελευθερώνει τα περιπλεγμένα ζεύγη χρωμοσωμάτων που έχουν προκύψει από τη διάρκεια της αντιγραφής, δυνατότητα πολύ σημαντική για την οργάνωση και διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων. Λόγω των παραπάνω λειτουργιών, που είναι πολύ σημαντικές για την επιβίωση του κυττάρου οι τοποϊσομεράσες Ι και ΙΙ αποτελούν στόχο αρκετών αντικαρκινικών φαρμάκων και κυρίως των ανθρακυκλινών. Οι αναστολείς της TopoIIa παρεμβαίνουν στο ασταθές σύμπλεγμα TopoIIa-DNA και το καθιστούν σταθερό με αποτέλεσμα την μη αναδίπλωση του DNA, που οδηγεί στο σταμάτημα της μεταγραφής, δρώμενο που ενεργοποιεί την απόπτωση (161, 162). Το γονίδιο TOP2A που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 17, θέση q21.2, ~ 700 kb τελομερικά του HER2, έχει μέγεθος bp και κωδικοποιεί την TopoIIa πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 170 kda και μέγεθος 1531 αμινοξέα. Η TopoIIα πρωτεΐνη εμφανίζει τέσσερις ισομορφές ( Εκφράζεται στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα κατά την φάση S, φτάνοντας σε υψηλότερη συγκέντρωση μεταξύ των φάσεων G2- M, όπου πιστεύεται ότι αποτελεί τον πρωτογενή μεσολαβητή στη συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων και μειώνεται κατά το τέλος της μίτωσης. Αντιθέτως η TopoIIβ, εκφράζεται μόλις το κύτταρο εισέλθει στον κυτταρικό κύκλο (162, 163). Η TopoIIα ανευρίσκεται σε κύτταρα που πολλαπλασιάζονται με υψηλούς ρυθμούς, όπως τα σπερματοκύτταρα, τα κύτταρα του μυελού των οστών και των βλαστικών κέντρων των λεμφοζιδίων, ενώ δεν ανιχνεύεται σε κύτταρα σε φάση ηρεμίας, όπως τα ώριμα ουδετερόφιλα, τα κύτταρα του συνδετικού, μυϊκού και νευρικού ιστού. Επίσης ανιχνεύεται σε αυξημένα ποσοστά σε νεοπλασίες με υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού και επιθετική συμπεριφορά, όπως τα υψηλής κακοήθειας λεμφώματα, το μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα, τους βλαστικούς όγκους του όρχεως, το καρκίνωμα του προστάτη, του παγκρέατος, του παχέος εντέρου και του μαστού ( ). Πεδίο εκτεταμένης έρευνας στην TopoIIα αποτελεί ο καρκίνος του μαστού, όπου έχει μελετηθεί τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης, με ανοσοϊστοχημεία, όσο και του γονιδίου με in situ τεχνικές (FISH, CISH) (150, ). Το TOP2A γονίδιο έχει αναφερθεί ότι στον καρκίνο του μαστού συν-ενισχύεται σε 30%-40% των όγκων με ενίσχυση του γονιδίου HER2, ενώ οι απώλειες του είναι επίσης συχνές (171, 173, 176). Η TopoIIα αποτελεί στόχο των ανθρακυκλινών (177), ενώ η ενίσχυση του γονιδίου έχει συσχετισθεί με ευαισθησία στις ανθρακυκλίνες ασθενών με προχωρημένο καρκίνο του μαστού (173, 178) ή σε ασθενείς με υψηλού κινδύνου καρκίνο του μαστού που λαμβάνουν συμπληρωματική χημειοθεραπεία (176, 179, 180). Σε πρόσφατες μελέτες, η ενίσχυση του TOP2A αναδείχθηκε ως ευνοϊκός 39

40 προγνωστικός δείκτης σε HER2-θετικές ασθενείς, με μεταστατικό καρκίνο του μαστού, που είχαν λάβει θεραπεία με το μονοκλωνικό αντίσωμα τραστουζουμάμπη (171), ενώ στη μελέτη ασθενών με πρώιμο καρκίνο του μαστού υψηλού κινδύνου, η υπερέκφραση του TOP2A mrna σχετίσθηκε με δυσμενέστερη επιβίωση (172). 5. ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ Η θεραπευτική προσέγγιση ασθενή με ΚΛ είναι εξαιρετικά σύνθετη και απαιτεί την συνεργασία πολλών ιατρικών ειδικοτήτων, ώστε να καθορισθεί η βέλτιστη αντιμετώπιση. Οι οδηγίες του NCCN για την θεραπεία ασθενών με καρκίνο του λάρυγγα αφορούν τον γλωττιδικό και υπεργλωττιδικό ΚΛ (NCCN guidelines, version ). Οι ασθενείς με in situ καρκίνωμα του λάρυγγα προτείνεται να αντιμετωπίζονται με ενδοσκοπική εκτομή ή ακτινοθεραπεία. Στον αρχικού σταδίου γλωττιδικό και υπεργλωττιδικό ΚΛ η χειρουργική αντιμετώπιση (μερική λαρυγγεκτομή) και η ακτινοθεραπεία εμφανίζουν παρόμοια αποτελεσματικότητα (181). Η επιλογή της θεραπείας εξαρτάται από το αναμενόμενο λειτουργικό αποτέλεσμα, τις επιθυμίες του ασθενή, την δυνατότητα παρακολούθησης της μετεγχειρητικής πορείας και την γενική φυσική κατάσταση. Οι χειρουργικά εξαιρέσιμοι, προχωρημένου σταδίου ΚΛ (έως Τ4a) συνήθως απαιτούν συνδυασμό θεραπειών. Η ολική λαρυγγεκτομή αποτελεί την πιο συχνή επιλογή θεραπείας σε αυτό το στάδιο της νόσου, αν και σε επιλεγμένες περιπτώσεις όπου είναι επιθυμητή η διατήρηση της φωνητικής λειτουργίας δύναται να επιλεγεί συντηρητικότερος χειρουργικός χειρισμός ή ο συνδυασμός της ταυτόχρονης χημειοθεραπείας (cisplatin) και ακτινοθεραπείας (ΧΜΘ-ΑΚΤ) (182). Η ακτινοθεραπεία είναι η μόνη επιλογή για ασθενείς ακατάλληλους για χημειοθεραπεία ή για ασθενείς που αρνούνται την χημειοθεραπεία. Ο λεμφαδενικός τραχηλικός καθαρισμός προτείνεται για ασθενείς με υπολειμματική νόσο μετά την ΧΜΘ-ΑΚΤ ή την ακτινοθεραπεία ή για ασθενείς με τοπική υποτροπή. Παράγοντες που σχετίζονται με αποτυχία ελέγχου ενός ΚΛ σταδίου Τ3, μετά από ακτινοβολία, είναι η διήθηση του αρυταινοειδούς χόνδρου, η κατάληψη του παραγλωττιδικού χώρου στο επίπεδο των νόθων φωνητικών χορδών και το μεγάλο μέγεθος του όγκου (>3,5 εκ.) (183). Στον ΚΛ σταδίου Τ4a η καθιερωμένη αντιμετώπιση είναι η ολική λαρυγγεκτομή με ομόπλευρη θυρεοειδεκτομή και λεμφαδενικό καθαρισμό. Για ασθενείς που αρνούνται το χειρουργείο προτείνεται από τους ειδικούς του NCCN α) η ταυτόχρονη ΧΜΘ-ΑΚΤ, β) η 40

41 ένταξη σε κλινικές μελέτες και γ) η επαγωγική χημειοθεραπεία ακολουθούμενη από ΧΜΘ- ΑΚΤ (182). Τέλος συνιστάται η χορήγηση ακτινοβολίας να μην ξεπερνά ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, διότι έρευνες δείχνουν πως η μακροχρόνια έκθεση στην ακτινοβολία σχετίζεται με αυξημένο ποσοστό υποτροπών της νόσου (184). 6. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Οι αναφορές για τον ρόλο των μορίων HER3, PTEN και TopoIIa στον καρκίνο του λάρυγγα στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν, σε όγκους ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για εξαιρέσιμο καρκίνο του λάρυγγα, τα παραπάνω μόρια σε επίπεδο πρωτεΐνης, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και σε επίπεδο DNA με τον φθορίζοντα επιτόπιο (in situ) υβριδισμό (FISH) και να διερευνηθεί η πιθανή προγνωστική σημασία τους. Επιπρόσθετα, για την καλύτερη μελέτη της βιολογίας των νεοπλασμάτων, μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά και οι πρωτεΐνες HER1/EGFR, HER2, Ki67 και HPV. 41

42 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 42

43 7. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 7.1 Επιλογή υλικού Το προς μελέτη υλικό περιέλαβε ολικές λαρυγγεκτομές 122 ασθενών με διηθητικό καρκίνωμα λάρυγγα που επιλέχθηκαν από το αρχείο του Εργαστηρίου Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής Α.Π.Θ (ΕΓΠΠΑ) για το χρονικό διάστημα Σε συνεργασία με την Α Πανεπιστημιακή Ω.Ρ.Λ Κλινική του Α.Π.Θ, συλλέχθηκαν και αρχειοθετήθηκαν όλες οι κλινικές πληροφορίες καθώς και το ιστορικό σχετικά με την προεγχειρητική κατάσταση των ασθενών, την μετεγχειρητική πορεία, την θεραπεία και την κλινική πορεία. Ακολούθησε συσχέτιση όλων των παραπάνω παραμέτρων με τα ιστολογικά, ανοσοϊστοχημικά και μοριακά ευρήματα. Η ιστολογική διαβάθμιση του νεοπλάσματος έγινε σύμφωνα με τα προτεινόμενα κριτήρια του Π.Ο.Υ (WHO 2005) και η σταδιοποίηση χρησιμοποιώντας το σύστημα ΤΝΜ/AJCC του Αξιολογήθηκαν από όλους τους κύβους παραφίνης κάθε περιστατικού οι τομές Αιματοξυλίνης/Εωσίνης (Η/Ε), και επιλέχθηκαν οι κατάλληλοι κύβοι παραφίνης για την δημιουργία των ιστικών μικροσυστοιχιών (Tissue MicroArrays-TMA). Η επιλογή των στοιχείων του ιστού που θα εγκλειόταν στα TMA έγινε με βάση το πλακίδιο της Η/Ε. Εκεί σημειώθηκαν με μαρκαδόρο ή/και με ειδική μικροσκοπική σφραγίδα όλες οι νεοπλασματικές και μη εστίες (όπου αυτό ήταν εφικτό). Η επιλογή και η αξιολόγηση του υλικού, καθώς και η δημιουργία των ΤΜΑ έγιναν από τον υποψήφιο διδάκτορα υπό την επίβλεψη της τριμελούς επιτροπής. Όλες οι τεχνικές πραγματοποιήθηκαν σε μονιμοποιημένους σε φορμόλη ιστούς, εγκλεισθέντες σε παραφίνη από τα αντίστοιχα ιστολογικά παρασκευάσματα. Η κατασκευή των ιστικών μικροσυστοιχιών, η ανοσοϊστοχημεία (ΑΙΧ) και ο φθορίζων επιτόπιος υβριδισμός (FISH) διενεργήθηκαν στο ΕΓΠΠΑ του Α.Π.Θ Δημιουργία ιστικών μικροσυστοιχιών Για την εφαρμογή των ειδικών μεθόδων, δημιουργήθηκαν 2 κύβοι παραφίνης με μικροσυστοιχίες ιστικών κυλίνδρων. Η μέθοδος των ιστικών μικροσυστοιχιών αποτελεί ένα σύγχρονο σημαντικό εργαλείο στην έρευνα και μελέτη των νεοπλασμάτων (185, 186). Εγκλείοντας σε έναν μόνο κύβο παραφίνης πολλαπλά αντιπροσωπευτικά τεμαχίδια ιστών και στην προκειμένη περίπτωση δείγματα καρκινωμάτων λάρυγγα, καθίσταται δυνατή η συγκριτική μελέτη τους, τόσο μορφολογικά και ανοσοϊστοχημικά όσο και σε μοριακό επίπεδο. Επιπρόσθετα, επιτυγχάνεται εξοικονόμηση του ιστού, ώστε να μπορεί να 43

44 χρησιμοποιηθεί και για άλλες μελέτες, ιδιαίτερα αν αφορά μικρή εστία όγκου αλλά και ελαχιστοποίηση των δαπανών για αντιδραστήρια, αφού καταναλώνονται μικρές ποσότητες για τις ανοσοχρώσεις και για τις εξειδικευμένες τεχνικές όπως του FISH. Για την δημιουργία των κύβων παραφίνης χρησιμοποιήθηκε το ειδικό χειροκίνητο υψηλής ακρίβειας μηχάνημα (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI, U.S.A.) που διαθέτει το Εργαστήριο σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Δημιουργήθηκαν, από το εξετασθέν υλικό, δύο νέοι ιστικοί κύβοι, με παραφίνη υψηλής ποιότητας που περιείχε και πλαστικά πολυμερή (Paraplast ; McCormick, St. Louis, MO., USA), οι οποίοι περιείχαν συνολικά 680 ιστικούς κυλίνδρους. Από κάθε περίπτωση ελήφθησαν 5 ιστικοί κύλινδροι, διαμέτρου 0.6 mm, τόσο από κεντρικές θέσεις του νεοπλάσματος, όσο και από περιφερικές, διηθητικές θέσεις. Η απόσταση μεταξύ των ιστικών κυλίνδρων ήταν 1.0 mm. Στους ΤΜΑ κύβους περιελήφθησαν επίσης και ιστοί ως δείκτες αξιοπιστίας (μάρτυρες) των ειδικών τεχνικών (ΑΙΧ, FISH) καθώς και ως δείκτες προσανατολισμού και χαρτογράφησης του περιεχομένου των ΤΜΑ. Ειδικότερα, τοποθετήθηκαν ως μάρτυρες ιστικοί κύλινδροι από φυσιολογικό λαρυγγικό βλεννογόνο, από περιπτώσεις ιναδενωμάτων μαστού, καρκινωμάτων παχέος εντέρου, λεμφαδένων με αλλοιώσεις αντιδραστικής λεμφαδενίτιδας, προστάτη αδένα με αλλοιώσεις οζώδους υπερπλασίας και τέλος, αδενοκαρκινώματος του ενδομητρίου. Οι θέσεις των ιστικών κυλίνδρων στους 2 ΤΜΑ κύβους καταγράφηκαν σε αρχείο Excel (2 φύλλα εργασίας). Το παραπάνω αρχείο χρησιμοποιήθηκε ως βάση για την χαρτογράφηση και ταξινόμηση των περιπτώσεων καθώς και για την καταγραφή των αποτελεσμάτων των ανοσοχρώσεων και των in situ μεθόδων. Το ποσοστό συμφωνίας έκφρασης συγκεκριμένων ανοσοϊστοχημικών δεικτών μεταξύ των ΤΜΑ τομών και ολόκληρης της τομής είναι εξαιρετικά υψηλό. Ειδικότερα, δεδομένα από την βιβλιογραφία έχουν δείξει, στον καρκίνο του μαστού, ότι η χρήση τουλάχιστον 3 ιστικών κυλίνδρων διαμέτρου 0.6 mm, εμφανίζει συμφωνία σε >95% των περιπτώσεων για τους δείκτες ER, PgR και ΗΕR2 (187), ενώ το ποσοστό συμφωνίας ξεπερνά το 99% στην περίπτωση της τοποθέτησης 5 ιστικών κυλίνδρων (187, 188). 44

45 7.3 Ανοσοϊστοχημεία (ΑΙΧ-IHC) Διενεργήθηκε απλή ανοσοϊστοχημεία έναντι οκτώ αντιγόνων. Ειδικότερα μελετήθηκαν αντισώματα έναντι των αντιγόνων HER1, HER2, HER3, HPVc, HPV18, Ki67, PTEN και Topoisomerase IIa. Η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση εφαρμόσθηκε σε τομές πάχους 3 μm, από τους δύο ΤΜΑ κύβους παραφίνης. Οι ιστικές τομές τοποθετήθηκαν σε φορτισμένα πλακίδια και μετά σε κασετίνα στους 4 C μέχρι την χρησιμοποίηση τους, η οποία έγινε σε διάστημα κάτω των 10 ημερών. Για την διασφάλιση της αναπαραγωγιμότητας των αποτελεσμάτων οι ανοσοχρώσεις έγιναν σε διαφορετικούς κύκλους για κάθε αντίσωμα.. Η αποπαραφίνωση πραγματοποιήθηκε με επώαση στους 60 C επί 1-2 ώρες, και στη συνέχεια ακολούθησε εμβάπτιση σε διάλυμα Οttix Plus (Diapath, Martinengo, Italy) για 2 x 8 λεπτά, και ενυδάτωση στο διάλυμα Ottix Shaper (Diapath) για 2 x 5 λεπτά. Η περαιτέρω διαδικασία της ΑΙΧ πραγματοποιήθηκε στα αυτόματα μηχανήματα χρώσης Bond Max TM (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) και i6000 (Biogenex, San Ramon, CA). Ειδικότερα, η αντιγονική ανάκτηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα, στο αυτόματο μηχάνημα χρώσης Bond Max TM (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Tο σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος ήταν ορατό χρησιμοποιώντας τα συστήματα ανίχνευσης Bond Polymer Refine (Leica Biosystems, Newcastle, UK), Envision TM (Dako) και ως χρωμογόνο την 3, 3 - διαμινοβενζιδίνη (DAB). Ως αντίχρωση χρησιμοποιήθηκε η αιματοξυλίνη Mayer του συστήματος ανίχνευσης Bond Polymer Refine. 7.4 Αξιολόγηση των ανοσοχρώσεων Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των πρωτεϊνών της μελέτης έγινε χρησιμοποιώντας προτεινόμενα κριτήρια στην ιατρική Αγγλόφωνη βιβλιογραφία. Αναλυτικότερα για κάθε πρωτεΐνη εφαρμόσθηκαν τα παρακάτω πρωτόκολλα αξιολόγησης: HER1/EGFR: Η αξιολόγηση της έκφρασης του EGFR έγινε με βάση την χρωστική ένταση (ΧΕ) και το ποσοστό των θετικών κυττάρων (ΠΕ) (189). Η ένταση της χρώσης διαβαθμίστηκε σύμφωνα με το προτεινόμενο τετραβάθμιο σύστημα ως εξής: 0: απουσία χρωστικής αντίδρασης, κυτταροπλασμική ή κοκκώδης χρώση, 1+: ήπια χρωστική αντίδραση (αμυδρή μεμβρανική χρώση), 2+: μέτρια χρωστική αντίδραση (μέτριας έντασης πλήρης ή ατελής μεμβρανική χρώση), 3+: έντονη χρωστική αντίδραση (έντονος χρωματισμός του κυτταρικού περιγράμματος, ολικός ή τμηματικός). Οι περιπτώσεις με χρωστική αντίδραση 2+ και 3+ θεωρήθηκαν ότι υπερέκφραζαν τον EGFR, ενώ ως θετική θεωρήθηκε οποιαδήποτε 45

46 ανοσοϊστοχημική χρώση των κυτταρικών μεμβρανών του όγκου (πλήρης ή ατελής), που υπερβαίνει τη χρωστική ένταση του υποστρώματος, σε ποσοστό θετικών κυττάρων >1%. HER2: Η ανοσοχρώση έναντι της HER2 αξιολογήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του αποδεκτού από το FDA πρωτοκόλλου IHC HercepTest (32). Η απουσία έκφρασης ή η παρουσία μόλις υποσημαινόμενης, ήπιας μερικής μεβρανικής χρώσης σε <10% των νεοπλασματικών κυττάρων αξιολογήθηκε ως αρνητική (0), η ήπια μερική μεμβρανική χρώση (1+) σε >10% των νεοπλασματικών κυττάρων αξιολογήθηκε επίσης ως αρνητική, ενώ η ήπια έως μέτρια ολομεμβρανική χρώση σε >10% των νεοπλασματικών κυττάρων αξιολογήθηκε ως διφορούμενη-αβέβαιη (2+). Θετικές ορίσθηκαν οι περιπτώσεις με έντονη ολομεμβρανική χρώση σε >10% των νεοπλασματικών κυττάρων (3+). HER3: Η αξιολόγηση της έκφρασης του HER3 έγινε επίσης με βάση την χρωστική ένταση και το ποσοστό των κυττάρων. Το ποσοστό των θετικών νεοπλασματικών κυττάρων (ΠΚ) βαθμολογήθηκε σε κλίμακα από το 0-3 (0 = 0 έως 5%, 1 = 6 έως 25%, 2 = 26% έως 50%, 3 = 51% έως 100%), ενώ η χρωστική ένταση (ΧΕ) επίσης σε τρείς κατηγορίες από το 0-3 (0= απουσία έκφρασης, 1 = ήπια έκφραση, 2 = μέτρια έκφραση, 3 = έντονη έκφραση). Στη συνέχεια, δημιουργήθηκε ο ανοσοαντιδραστικός δείκτης (ΑΔ) με βάση το γινόμενο της χρωστικής έντασης και του ποσοστού των θετικών νεοπλασματικών κυττάρων σύμφωνα με τον παρακάτω τύπο ΑΔ = ΠΚ x ΧΕ που κυμαινόταν (ΑΔ=0-9). Ως θετικές, με υψηλή έκφραση στην πρωτεΐνη HER3, θεωρήθηκαν οι περιπτώσεις που εμφάνιζαν κυτταροπλασμική και/ή μεμβρανική εντόπιση της πρωτεΐνης και ΑΔ 4, ενώ αρνητικές ή με χαμηλή έκφραση, αυτές με ΑΔ <4 (190, 191). HPVc & HPV18: Λόγω της απουσίας έκφρασης της HPV6L1 και HPV18L1 πρωτεΐνης από κύτταρα χωρίς HPV λοίμωξη, εκτιμήθηκε ως θετική, η πυρηνική έκφραση, ακόμα και σε ελάχιστα νεοπλασματικά κύτταρα των αντί-hpvc και HPV18 αντισωμάτων (3). Ki67: Ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού αξιολογήθηκε σε ολόκληρη την νεοπλασματική επιφάνεια. Ως θετική χρώση αξιολογήθηκε η πυρηνική εντόπιση της πρωτεΐνης με χρωστική ένταση η οποία υπερέβαινε τη χρωστική ένταση του υποστρώματος. Το όριο για την εκτίμηση της πρωτεϊνικής έκφρασης του Ki67 τοποθετήθηκε στο 25% (χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης <25% και υψηλή 25%) (192). PTEN: Η PTEN πρωτεΐνη αξιολογήθηκε επίσης σύμφωνα με την χρωστική ένταση και το ποσοστό έκφρασης. Περιπτώσεις με ένταση χρώσης τουλάχιστον 1 και έκφραση σε >10% του νεοπλασματικού πληθυσμού θεωρήθηκαν θετικές (193). 46

47 Topoisomerase IΙα: Η αξιολόγηση της έκφρασης της Topoisomerase IΙα (TopoIIa) έγινε επίσης με βάση την χρωστική ένταση και το ποσοστό των κυττάρων. Το ποσοστό των θετικών νεοπλασματικών κυττάρων καταγράφηκε σε κλίμακα από το 0-100, ενώ η χρωστική ένταση σε τρείς κατηγορίες: 0= απουσία έκφρασης, 1 = ήπια έκφραση, 2 = μέτρια έκφραση, 3 = έντονη έκφραση. Περιπτώσεις με πυρηνική έκφραση της πρωτεΐνης σε >10% των νεοπλασματικών κυττάρων και χρωστική ένταση 1 θεωρήθηκαν ως θετικές [τροποποιημένη από Bhargava R. et al. (194)]. Η ανοσοϊστοχημική τεχνική, η πηγή και η αραίωση των αντισωμάτων, τα πρότυπα χρώσης, τα κριτήρια αξιολόγησης και τα όρια (cut-offs) θετικότητας για την κάθε πρωτεΐνη παρουσιάζονται στον Πίνακα 7.1 Πίνακας 7.1. Παρουσίαση των αντισωμάτων, των αραιώσεων, προμηθευτών, συνθηκών χρώσης, εντόπισης και βιβλιογραφίας. Αντίσωμα Κλώνος/ΕT ΑΑ/Τ/ΡΔ AΡ Ε ΣΑ/X/ΕΤ ΕΝΤ Β HER1 (r, mab) 31G7 (1) ENZ1/HP, 8 /PBS 1:50 20 Polymer HRP/DAB (4) Μ, Μ/Κ (189) HER2 (r, plab) pl (2) ER1/HP, 25 /PBS 1: Polymer HRP/DAB (4) Μ, Μ/Κ (32) HER3 (r, mab) SGP1 (3) ER2/HP, 20 /PBS 1: Polymer HRP/DAB (4) Κ, Κ/Μ (190, 191) HPVc (m, mab) 4C4 (4) ER2/HP, 25 /PBS 1:50 30 Polymer HRP/DAB (4) Π (3) HPV18 (m, mab) 5A3 (4) ER2/HP, 25 /PBS 1: Polymer HRP/DAB (4) Π (3) Ki67 (m, mab) MIB1 (2) ER2/HP, 15 /PBS 1:70 20 Polymer HRP/DAB (4) Π (192) PTEN (m, mab) 6H2.1 (2) ER2/HP, 20 /PBS 1: Polymer HRP/DAB (4) Κ, Π, Κ/Π (193) TopoIIa (m, mab) KiS1 (2) ER2/HP, 15 /PBS 1: Envision+ TM (2) Π, Π/Κ (194) Επεξηγήσεις: ΑΑ: Αντιγονική ανάκτηση; ΑΡ: Αραίωση; Β: Βιβλιογραφία; Ε: Επώαση; ΕΝΤ: Εντόπιση; ΕΤ: Εταιρεία; Κ: Κυτταρόπλασμα; Μ: Μεμβράνη; ΣΑ: Σύστημα ανίχνευσης; Π: Πυρήνας; ΡΔ: Ρυθμιστικό διάλυμα; Τ: Χρόνος αντιγονικής ανάκτησης; X: Χρωμογόνο; ENZ: Enzyme; ER1: citric acid ph6.0; ER2: ethylenediaminetetraacetate, ph8.8; HP: Hot plate; m: mouse; mab: monoclonal antibody; PBS: phosphate buffered saline; pl: polyclonal; r: rabitt. (1): Invitrogen, Carlsbad, CA; (2) Dako, Glostrup, DK; (3): Thermo Fisher Scientific, Fremont CA; (4): Leica Biosystems, Newcastle Upon Tyne,UK. 47

48 7.5 Φθορίζων in Situ υβριδισμός (FISH) Η μέθοδος FISH πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή των αντιδραστηρίων, με μικρές αλλαγές. Εφαρμόσθηκε σε τομές παραφίνης πάχους 5μm, οι οποίες είχαν τοποθετηθεί σε θετικά φορτισμένα αντικειμενοφόρα πλακίδια (Dako, DK). Η αξιολόγηση του υβριδισμού έγινε σε μικροσκόπιο Zeiss (Axioskop 2 plus HBO 100) το οποίο φέρει υψηλής ποιότητας αντικειμενικούς φακούς, επιλεγμένα φίλτρα για κάθε φθοριόχρωμα καθώς και ψηφιακή κάμερα. Η ανάλυση των ψηφιακών εικόνων έγινε με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος (FISH Imager TM METASYSTEMS, Germany). Στη μελέτη μας χρησιμοποιήθηκαν ιχνηθέτες DNA επαναλαμβανόμενων ακολουθιών και εξειδικευμένοι γονιδιακοί ιχνηθέτες (Πίνακας 7.2). Πίνακας 7.2. Παρουσίαση του μεγέθους των γονιδιακών ιχνηθετών, της θέσης υβριδοποίησης τους, καθώς και των κριτηρίων αξιολόγησης. Γονιδιακοί (DNA) FISH ιχνηθέτες HER2 HER3 PTEN TOP2A Μέγεθος ιχνηθέτη, kb ~600 ~1000 ~300 ~500 Θέση υβριδοποίησης 17q12 12q13 10q23 17q21-q22 Ενίσχυση 2.0* 2.0** * Απώλεια <0.8 <0.8 <0.8 <0.8 ΑEΚΚ *Ενίσχυση θεωρήθηκε επίσης και όταν ο μέσος όρος γονιδιακών σημάτων ανά κύτταρο ήταν >6 και >4**. ΑEΚΚ: Αριθμός ελάχιστων καταμετρημένων κυττάρων. SPEC HER3/CEN 12 Dual Color Probe Ο SPEC HER3/CEN 12 Dual Color Probe (Zytovision, Bremenhaven, Germany) ιχνηθέτης χρησιμοποιείται για την ανίχνευση τμήματος της χρωμοσωμικής περιοχής 12q13 όπου ανευρίσκεται το γονίδιο HER3 και του α-δορυφορικού DNA του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 12. Με πορτοκαλί φθοριόχρωμα (ZyOrange) έχει σημανθεί ο ανιχνευτής για το γονίδιο HER3 και με πράσινο φθοριόχρωμα (ZyGreen) το τμήμα α-δορυφορικού DNA στην περιοχή του κεντρομεριδίου του χρ. 12. Καταμετρήθηκαν 40 νεοπλασματικοί πυρήνες για κάθε περίπτωση και κατεγράφησαν σε αρχείο Excel τα υβριδικά σήματα ανά κύτταρο για 48

49 κάθε περίπτωση. Υπολογίσθηκε ο μέσος όρος σημάτων για το HER3 γονίδιο, το κεντρομερίδιο 12 (CEP 12) καθώς και ο λόγος HER3/CEP12. Περιπτώσεις με λόγο HER3/CEP ή μέσο όρο HER3 σημάτων 4 σε >30% των καταμετρημένων πυρήνων θεωρήθηκαν ότι εμφανίζουν γονιδιακή ενίσχυση (195), ενώ γονιδιακή απώλεια (gene deletion) ορίσθηκε, όταν ο λόγος HER3/CEN12 σημάτων ήταν <0.8 (Πίνακας 7.2). Ως επαύξηση του CEN12 θεωρήθηκε η καταγραφή σε >30% των καταμετρημένων νεοπλασματικών πυρήνων >3 πράσινων υβριδικών σημάτων (196). Α Β Εικόνα 7.1. Α. Αποτύπωση του χρ. 12, όπου απεικονίζονται οι θέσεις υβριδισμού των ιχνηθετών HER3 και CEN 12 και (Β) η θέση ανίχνευσης του γονιδίου HER3. [ SPEC PTEN/CEN 10 Dual Color Probe Με το σύμπλοκο ιχνηθετών SPEC PTEN/CEN 10 Dual Color Probe (Zytovision) είναι δυνατή η ανίχνευση του γονιδίου PTEN αλλά και του α-δορυφορικού DNA του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 10 (Εικόνα 7.2). Ειδικότερα το προϊόν περιέχει δύο ιχνηθέτες σημασμένους με διαφορετικό φθοριόχρωμα. Το σύμπλοκο ιχνηθετών περιέχει πολυνουκλεοτίδια που σημαίνονται με πράσινο φθοριόχρωμα (ZyGreen) και στοχεύουν το τμήμα 10q23 όπου εδράζεται το γονίδιο PTEN (μήκους 300 kb, γονιδιακή θέση 10q23.3) καθώς και πολυνουκλεοτίδια (ανιχνευτής D10Z1) που σημαίνονται με πορτοκαλί φθοριόχρωμα (ZyOrange) για το τμήμα του α-δορυφορικού DNA.. Στη περίπτωση φυσιολογικών κυττάρων ή κυττάρων χωρίς διαταραχή του αριθμού του χρωμοσώματος 10, παρατηρούνται 2 PTEN σήματα και 2 σήματα του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 10. Για κάθε περίπτωση καταμετρήθηκαν 60 νεοπλασματικοί πυρήνες και κατεγράφησαν σε αρχείο Excel τα υβριδικά σήματα ανά κύτταρο για κάθε περίπτωση. Υπολογίσθηκε ο μέσος όρος σημάτων για το PTEN γονίδιο, για το κεντρομερίδιο 10 (CEP 10) καθώς και ο λόγος PTEN/CEP10. Περιπτώσεις με λόγο PTEN/CEP θεωρήθηκαν ότι εμφανίζουν 49

50 γονιδιακή ενίσχυση (151), ενώ γονιδιακή απώλεια (gene deletion) ορίσθηκε, όταν ο λόγος PTEN/CEP10 σημάτων ήταν <0.8 (Πίνακας 7.2) [τροποποιημένο από (151)]. Ως επαύξηση του CEN10 θεωρήθηκε η καταγραφή σε >30% των καταμετρημένων νεοπλασματικών πυρήνων >3 πράσινων υβριδικών σημάτων. Α Β Εικόνα 7.2. Α. Αποτύπωση του χρ. 10, όπου απεικονίζονται οι θέσεις υβριδισμού του ιχνηθέτη SPEC PTEN/CEN 10 ιχνηθέτη και (Β) η θέση ανίχνευσης του γονιδίου. [ SPEC HER2/TOPO2A/CEN 17 Triple Color Probe Το σύμπλοκο ιχνηθετών SPEC HER2/TOP2A/CEN17 Triple Color Probe (Zytovision) χρησιμεύει για την ανίχνευση των ανθρώπινων γονιδίων HER2, TOP2A και του α-δορυφορικού DNA του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 17 (CEP17). Το προϊόν αποτελείται από πολυνουκλεοτίδια σημασμένα με πράσινο φθοριόχρωμα (ZyGreen), τα οποία στοχεύουν τμήμα του 17q12 όπου εδράζεται το γονίδιο HER2 και από πολυνουκλεοτίδια σημασμένα με κόκκινο φθοριόχρωμα (ZyRed) που στοχεύουν το χρωμοσωμικό τμήμα 17q21-q22, στο οποίο βρίσκεται το γονίδιο TOP2A. Τέλος με κίτρινο φθοριόχρωμα (ZyGold) σημάνθηκαν πολυνουκλεοτίδια έναντι του α-δορυφορικού DNA (D17Z1) στην περιοχή του κεντρομεριδίου του χρωμοσώματος 17 (Εικόνα 7.3). Για κάθε περίπτωση καταμετρήθηκαν τουλάχιστον 20 νεοπλασματικοί πυρήνες. Υπολογίσθηκε, για κάθε περίπτωση ο συνολικός αριθμός σημάτων για κάθε ιχνηθέτη, ο μέσος όρος σημάτων, ο λόγος HER2/CEP17, ο λόγος TOP2A/CEP17 και ο λόγος CEP17/αριθμός καταμετρημένων κυττάρων. Περιπτώσεις με λόγο HER2/CEP17 2.0, TOP2A/CEP ή μέσο όρο HER2 ή TOP2A σημάτων ανά κύτταρο >6 θεωρήθηκαν ότι εμφανίζουν γονιδιακή ενίσχυση (197). Απώλεια των HER2 και TOP2A γονιδίων θεωρήθηκε όταν ο λόγος γονίδιο/cep17 ήταν <0.8 (Πίνακας 7.2). Ως επαύξηση του CEP17 θεωρήθηκε 50

51 η καταγραφή σε >30% των καταμετρημένων νεοπλασματικών πυρήνων >3 κίτρινων υβριδικών σημάτων (196). Α Β Εικόνα 7.3. Α. Αποτύπωση του χρ. 17, όπου απεικονίζονται οι θέσεις υβριδισμού του ιχνηθέτη SPEC HER2/TOPO2A/CEN 17 και (Β) Οι θέσεις ανίχνευσης των γονιδίων HER2 και TOPO2A. [ 51

52 7.6 Στατιστική ανάλυση Στη στατιστική ανάλυση της μελέτης οι συνεχείς μεταβλητές συνοψίζονται με την διάμεση τιμή τους και το αντίστοιχο εύρος κατανομής τους, ενώ οι κατηγορικές μεταβλητές παρουσιάζονται με την συχνότητά των κατηγοριών τους και το αντίστοιχο ποσοστό. Για τη σύγκριση της κατανομής των συνεχών μεταβλητών μεταξύ ανεξάρτητων ομάδων χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία Mann-Whitney. Η συσχέτιση των εξεταζόμενων μοριακών δεικτών και των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών έγινε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher (Fisher s exact test) για πίνακες συνάφειας διάστασης 2x2 ή με την δοκιμασία χ 2 (x 2 test) για πίνακες μεγαλύτερης διάστασης. Η συνολική επιβίωση [ΣΕ, overall survival (OS)] ορίστηκε από την ημερομηνία του χειρουργείου μέχρι το θάνατο από οποιαδήποτε αιτία, ενώ η ελεύθερη υποτροπής επιβίωση [ΕΥΕ, disease-free survival (DFS)] υπολογίστηκε επίσης από την ημερομηνία του χειρουργείου έως την ημερομηνία που διαπιστώθηκε εξέλιξη της νόσου ή θάνατος χωρίς πιστοποιημένη πρόοδο νόσου. Για την εκτίμηση της ΣE και της EYE χρησιμοποιήθηκαν οι καμπύλες Kaplan-Meier και η συσχέτιση έγινε με τη χρήση του log-rank test. Για να εξεταστεί η προγνωστική αξία των κλινικοπαθολογικών παραμέτρων και των υπό μελέτη μοριακών δεικτών ως προς τη ΣΕ και την ΕΥΕ, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο αναλογικού κινδύνου κατά Cox σε επίπεδο μονομεταβλητής ανάλυσης. Για την πολυπαραγοντική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε επίσης το μοντέλο αναλογικού κινδύνου κατά Cox, στο οποίο χρησιμοποιήθηκε η προς τα πίσω διαδικασία επιλογής του τελικού μοντέλου (backward selection). Οι παράμετροι που εξετάστηκαν ήταν: η ηλικία (> 65 έναντι 65), ο ιστολογικός βαθμός διαφοροποίησης (βαθμός 1-2 έναντι 3), η πρωτοπαθή εστία, το στάδιο κατά Τ (Τ1-2 έναντι Τ3-4), η λεμφαδενική διήθηση (Ν + έναντι N0), το στάδιο της νόσου κατά AJCC (Ι-ΙΙ έναντι ΙΙΙ-ΙVΑ) και η έκφραση της γονιδιακής κατάστασης των HER3, PTEN και TopoIIa. Η συμφωνία μεταξύ των μεταβλητών (Κappa agreement) έγινε σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες των Landis και Koch (198) και ειδικότερα: κ=0, ασυμφωνία; κ >0 - <0.20, ήπια συμφωνία; κ > < 0.40, επαρκής συμφωνία; κ > <0.60, μέτρια συμφωνία; κ > <0.80, σημαντική συμφωνία και κ >0.80 έως 1.00, τέλεια συμφωνία. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPSS (SPSS για Windows, έκδοση 15.0 SPSS, Chicago, IL). 52

53 8. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8.1 Κλινικοπαθολογοανατομική ανάλυση Η μελέτη συμπεριέλαβε 122 ασθενείς εκ των οποίων 2 ήταν γυναίκες. Το εύρος των ηλικιών κυμαίνονταν από τα 38 έως τα 89 έτη με μέση ηλικία τα 65.5 έτη. Το 18.9% των ασθενών ήταν κάτω των 55 ετών, ενώ στην ηλικιακή ομάδα άνω των 65 ετών ανήκε το 50%. Στους 120 όγκους που υπήρχαν στοιχεία για το μέγεθος του όγκου, το 25.4% ξεπερνούσε τα 3 εκ.. Ενεργοί καπνιστές ήταν το 81.2% των ασθενών, ενώ ιστορικό κατάχρησης αλκοόλης αναφέρθηκε από το 77.9% του πληθυσμού. Οικογενειακό ιστορικό καρκίνου υπήρχε στο 27.9% των ασθενών. Η πλειονότητα των όγκων (98.4%) αφορούσε καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα, ενώ ανευρέθηκαν ένα αδενοπλακώδες και ένα βασικοκυτταροειδές καρκίνωμα. Η ιστολογική διαφοροποίηση των καρκινωμάτων του λάρυγγα (ΚΛ) χωρίστηκε στις 3 γνωστές διαβαθμίσεις, την καλή, την μέτρια και την χαμηλή. Το μεγαλύτερο ποσοστό (45.9%) των καρκινωμάτων ήταν μέτριας διαφοροποίησης. Δεύτερη κατηγορία σε συχνότητα (32%) ήταν τα καλής διαφοροποίησης καρκινώματα και ακολουθούσαν 21 καρκινώματα χαμηλής διαφοροποίησης (17.2%). Στο σύνολο των 116 περιστατικών με στοιχεία ως προς την διαφοροποίηση, τα 95 (81.8%) υπάγονταν στην ομάδα καλής-μέτριας διαφοροποίησης (Εικόνα 8.1). Σε 38/122 όγκους παρατηρήθηκαν εστίες νέκρωσης (30.2%). Τα χειρουργικά όρια ήταν διηθημένα σε 10/122 (8.2%) περιπτώσεις. Σε ότι αφορά την εντόπιση, το 57.4% των καρκινωμάτων εντοπίζονταν στις φωνητικές χορδές. Υπεργλωττιδική εντόπιση παρατηρήθηκε σε 48 (39.3%) περιπτώσεις και υπογλωττιδικά σε 4 (3.3%) περιπτώσεις. Η επιγλωττίδα εμφάνιζε διήθηση σε 33 περιστατικά (26.2%). Σε 54 περιστατικά που αξιολογήθηκε η διήθηση του προεπιγλωττιδικού χώρου, 11 εμφάνιζαν διήθηση. Προσβολή των παραγλωττιδικών χώρων από τον όγκο παρατηρήθηκε σε 23/56 περιπτώσεις με ίδιο ποσοστό διήθησης για αριστερό και δεξιό χώρο αντίστοιχα (11.9%). Παρατηρήθηκε διήθηση του υποκείμενου χόνδρου σε 74/122 (60.7%) περιπτώσεις, ενώ σε 29/122 (23.8%) αναγνωρίσθηκε μικροσκοπική διήθηση των μαλακών μορίων. Σε 25/122 ασθενείς όπου ανευρέθη τμήμα θυρεοειδούς αδένα, μεταστατικές εστίες ανευρέθηκαν σε 3/25 (12%) περιπτώσεις. Περίπου τα 2/3 των ασθενών (69.7%) είχαν τοπικά προχωρημένη νόσο, σταδίου T3-4. Κλινικά και ακτινολογικά θετικοί επιχώριοι λεμφαδένες ανευρέθησαν σε 13 ασθενείς (10.7%). Το 70.5% των ασθενών εμφάνιζε προχωρημένου σταδίου νόσο (III-IVΑ). Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική αφαίρεση του όγκου, με την πλειοψηφία των ασθενών 53

54 να έχουν αντιμετωπισθεί είτε με ολική λαρυγγεκτομή (87.7%), είτε με άλλες πιο συντηρητικές επεμβάσεις. Τραχηλικός λεμφαδενικός καθαρισμός διενεργήθηκε στο 16.4% των περιπτώσεων, ενώ λεμφαδενική μετάσταση ανευρέθη σε 13 περιστατικά (10.7%). Προεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία έλαβε το 23.8% των ασθενών, ενώ μετεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία 22.1% των ασθενών. Σε 2 ασθενείς χορηγήθηκε ταυτόχρονη ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Δεκαέξι ασθενείς (13.1%) εμφάνισαν χειρουργικές επιπλοκές. Τα κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών και των όγκων της μελέτης παρουσιάζονται στον Πίνακα 8.1. Πίνακας 8.1. Κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά ασθενών και όγκων της μελέτης. Ν (%) Ηλικία (Διάμεσος, εύρος) 65.5 (38-89) (50.0) >65 61 (50.0) Φύλο Άνδρες 120 (98.4) Θήλυ 2 (1.6) Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 27 (22.1) Ναι 95 (77.9) Κάπνισμα (αρ. πακέτων/έτη) Ποτέ/Πρώην καπνιστής 23 (18.9) 1-30 πακέτα/έτη 45 (36.9) >30 πακέτα/έτη 54 (44.3) Οικογενειακό ιστορικό Όχι 88 (72.1) Ναι 34 (27.9) Μέγεθος όγκου 3 εκ. 84 (68.8) >3 εκ. 30 (24.6) Χωρίς δεδομένα 8 (7.6) Τύπος νεοπλάσματος Πλακώδους τύπου 120 (98.4) Άλλο 2 (1.6) Ιστολογικός βαθμός διαφοροποίησης 1 39 (32.0) 2 56 (45.9) 3 21 (17.1) Χωρίς στοιχεία 6 (4.9) Εντόπιση Γλωττιδική 61 (50.0) Υπογλωττιδική 4 (3.3) 54

55 Πίνακας 8.1 (Συνέχεια) Ν (%) Διαγλωττιδική 9 (7.4) Υπεργλωττιδική 48 (39.3) Πρωτοπαθής όγκος (ΤΝΜ) T1 18 (14.7) T2 19 (15.6) T3 45 (36.9) T4 40 (32.8) Επιχώριοι λεμφαδένες N0 109 (89.3) N+ 13 (10.7) Στάδιο AJCC Ι 18 (14.8) ΙΙ 18 (14.8) ΙΙΙ 44 (36.1) IVA 42 (34.4) Θεραπευτική αντιμετώπιση Χειρουργική 93 (76.2) Ακτινοθεραπεία 27 (22.1) Ακτινοθεραπεία+Χημειοθεραπεία 2 (1.6) Τύπος χειρ. επέμβασης Χορδεκτομή 7 (5.7) Οριζόντια λαρυγγεκτομή 2 (1.6) Λαρυγγοσκοπική αφαίρεση 3 (2.5) Ολική λαρυγγεκτομή 107 (87.7) Κάθετη λαρυγγεκτομή 3 (2.5) Τραχηλικός λεμφαδενικός καθαρισμός Όχι 102 (83.6) Ναι 20 (16.4) Χειρουργικές επιπλοκές 16 (13.1) Χειρουργικά όρια Διηθημένα 10 (8.2) Ελεύθερα 112 (91.8) Προεγχειρητική τραχειοστομία 13 (10.7) Προεγχειρητική ακτινοβολία 29 (23.8) Υποτροπές της νόσου παρατηρήθηκαν συνολικά σε 50/122 (41%) ασθενείς, με την πλειοψηφία να αφορά τοπικές υποτροπές (86%) (Πίνακας 8.2). Συχνότερη ήταν η λαρυγγική υποτροπή (28%) και η διήθηση των μαλακών μορίων του τραχήλου (22%). Σε σπάνιες περιπτώσεις το νεόπλασμα υποτροπίασε στον φάρυγγα (6%) και σε μία μόνο περίπτωση στην βάση της γλώσσας (2%). 55

56 Πίνακας 8.2. Τοπογραφία των τοπικών και απομακρυσμένων υποτροπών. Εντόπιση N % Βάση γλώσσας Λάρυγγας Μαλακά μόρια τράχηλου Οστά Πολυοργανική Πνεύμονας Τραχειόστομα Τραχηλικοί Λεμφαδένες Φάρυγγας Σύνολο Ανάλυση της επιβίωσης Η διάμεση περίοδος παρακολούθησης ήταν 67.4 μήνες, (εύρος τιμών μήνες). Παρατηρήθηκαν 50 υποτροπές νόσου και 50 θάνατοι. Η διάμεση ελεύθερη νόσου επιβίωση (ΕΥΕ) ήταν 81 μήνες (95% CI ) και η διάμεση συνολική επιβίωση (ΣΕ) ήταν μήνες (95% CI ). Τα ποσοστά 3-ετούς ΕΥΕ και ΣΕ ήταν 58.5% και 59.8% αντίστοιχα, ενώ η 5-ετής ΕΥΕ 51.4% και η 5-ετής ΣΕ 59.8%. (Πίνακας 8.3 ). Στην Εικόνα 8.1 απεικονίζονται οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier για το σύνολο του πληθυσμού με βάση την ΕΥΕ και την ΣΕ. Πίνακας 8.3. Παρουσίαση της επιβίωσης των ασθενών. Ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (ΕΥΕ) Ν=122 Συμβάν 62 (50.8%) Υποτροπή 50 (41.0%) Διάμεση τιμή (95% CI) 81.0 ( ) Εύρος τιμών ετής ΕΥΕ (%) 58.5% 5-ετής ΕΥΕ (%) 51.4% Συνολική επιβίωση (ΣΕ) Θάνατοι 50 (41.0%) Αιτία θανάτου: Νόσος 37 (74.0) Άλλο 13 (26.0) Διάμεση τιμή (95% CI) ( ) Εύρος τιμών ετής ΣΕ (%) 67.0% 5-ετής ΣΕ (%) 59.8% Διάμεσος χρόνος παρακολούθησης (μήνες) (εύρος τιμών)

57 Πιθανότητα OS Πιθανότητα DFS 1,0 0,5 A. 0, Μήνες ,0 0,5 Β. 0, Μήνες Εικόνα 8.1. Kaplan-Meier καμπύλες για την ΕΥΕ/DFS [A] και την συνολική επιβίωση (ΣΕ/OS) [B]. 8.3 Ανοσοϊστοχημικά Ευρήματα Η ανοσοϊστοχημεία και o FISH εμφάνισαν εξαιρετικά υψηλό ποσοστό επιτυχίας (Εικόνα 8.2). Ειδικότερα, 113/122 (92.6%) περιπτώσεις είχαν τουλάχιστον ένα αποτέλεσμα στην ΑΙΧ, ενώ στο FISH το ποσοστό επιτυχίας ήταν ελαφρώς υψηλότερο και έφθασε το 95.1%. 57

58 Εικόνα 8.2. Παρουσίαση του αριθμού των περιπτώσεων που αναλύθηκαν για κάθε μοριακό δείκτη ανά μέθοδο HER3 Έκφραση της HER3 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στο 52.5% των όγκων που μελετήθηκαν (Πίνακας 8.4). Δώδεκα περιστατικά (9.8%) ανήκαν στην κλίμακα με ΑΔ 4, τριάντα οκτώ εμφάνισαν ΑΔ 6 (31.1%) και δώδεκα (9.8%) κατηγοριοποιήθηκαν στην ανώτερη κλίμακα με ΑΔ 9. Η έκφραση της HER3 ήταν κυτταροπλασμική, με ελάχιστα υποσημαινόμενη κυτταρική μεμβράνη σε σπάνια περιστατικά. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική σχέση με την ηλικία (p=0.042), με την προεγχειρητική ακτινοθεραπεία (p=0.048), (Πίνακας 8.5) και οριακά, με την διήθηση του χόνδρου (p=0.05). Αντιπροσωπευτικές εικόνες περιπτώσεων με υψηλή/θετική και αρνητική/χαμηλή έκφραση της HER3 παρουσιάζονται στην Εικόνα PTEN Το 70.8% των περιπτώσεων που εξετάσθηκαν (80/113) ήταν PTEN αρνητικές (Πίνακας 8.4) Η απουσία της PTEN εμφάνισε σημαντική συσχέτιση μόνο με την παρουσία διήθησης του αρ. παραγλωττιδικού χώρου (p=0.011). Αντιπροσωπευτικές εικόνες θετικών περιπτώσεων καθώς και με απώλεια έκφρασης της PTEN παρουσιάζονται στην Εικόνα

59 8.3.3 Topoisomerase IIa (TopoIIa) Αξιολογήθηκε η έκφραση των νεοπλασματικών κυττάρων στην TopoIIα σε 118/122 (96.7%) περιπτώσεις. Θετική έκφραση παρατηρήθηκε σε 78/118 (66.1%) όγκους (Πίνακας 8.4). Αναδείχθηκαν σημαντικές συσχετίσεις της έκφρασης της TopoIIα με την διήθηση των παραγλωττιδικών χώρων (p=0.017) και την υποτροπή της νόσου (p=0.011). Τα χαμηλής διαφοροποίησης νεοπλάσματα εξέφραζαν συχνότερα την πρωτεΐνη (p=0.069). Αναλυτικά αποτελέσματα των ανοσοχρώσεων για HER3, PTEN και TopoIIa σε συσχέτιση με κλινικούς και παθολογοανατομικούς δείκτες παρουσιάζονται στον Πίνακα 8.5. Οι συσχετίσεις των αποτελεσμάτων των υπόλοιπων ΑΙΧ χρώσεων με τους κλινικούς και παθολογοανατομικούς δείκτες παρουσιάζονται στον Πίνακα 1Π. Πίνακας 8.4. Παρουσίαση των ανοσοϊστοχημικών αποτελεσμάτων. ΑΙΧ δείκτες N (%) TopoIIa (n=118) Αρνητική 40 (33.9) Θετική 78 (66.1) PTEN (n=113) Αρνητική 80 (70.8) Θετική 33 (29.2) HER1 (n=118) Αρνητική 7 (5.9) Θετική 111 (94.1) HER2 (n=121) Αρνητική 115 (95.0) Θετική 6 (5.0) HER3 (n=118) Αρνητική/Χαμηλή έκφραση 56 (47.5) Θετική 62 (52.5) HPVt (n=114) Αρνητική 84 (73.7) Θετική 30 (26.3) Ki67 (n=113) Χαμηλή (<25%) 31 (27.4) Υψηλή ( 25%) 82 (72.6) Υπόλοιπα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα Έκφραση της HER1 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε σε 111/118 (94.1%) όγκους (Εικόνα 1Π). Υπερέκφραση της HER2 (3+) σε 6/121 (5%) περιπτώσεις και υψηλή έκφραση (>25%) της Ki67 σε 82/113 (72.6%) περιπτώσεις (Εικόνες 2Π, 3Π αντίστοιχα). Σε 30/114 (26.3%) όγκους ανευρέθη παρουσία της HPV L1 πρωτεΐνης (HPV 6, 11, 18 και HPV18) (Εικόνες 4Π, 5Π). Μόνο τα νεοπλάσματα με υψηλή έκφραση του Ki67 επεκτείνονταν στον προεπιγλωττιδικό χώρο (p=0.079), ενώ το 94.4% των όγκων που επεκτείνονταν στους παραγλωττιδικούς χώρους εμφάνιζαν επίσης υψηλή έκφραση του Ki67 (p=0.086). Το 56.7% 59

60 των νεοπλασμάτων με μέγεθος > 3εκ και το 78.5% με μέγεθος 3εκ είχαν υψηλό δείκτη Ki67 (p=0.031). Η υπερέκφραση της HER2 σχετίσθηκε στατιστικά με διήθηση του προεπιγλωττιδικού χώρου (p=0.044) και υπογλωττιδική επέκταση (p=0.036). Αναλυτικά τα αποτελέσματα των ανοσοχρώσεων παρουσιάζονται στον Πίνακα 8.4 και οι συσχετίσεις με τους κλινικούς και παθολογοανατομικούς δείκτες στον Πίνακα 1Π. Πίνακας 8.5. Συσχετίσεις των HER3, PTEN και TopoIIa με κλινικοπαθολογικούς δείκτες. HER3 PTEN TopoIIa A Θ A Θ A Θ N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P Ηλικία (60.7) 25 (40.3) 38 (47.5) 20 (60.6) 19 (47.5) 40 (51.3) >65 22 (39.3) 37 (59.7) 42 (52.5) 13 (39.4) 21 (52.5) 38 (48.7) Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 13 (23.2) 14 (22.6) 17 (21.3) 8 (24.2) 10 (25.0) 16 (20.5) Ναι 43 (76.8) 48 (77.4) 63 (78.8) 25 (75.8) 30 (75.0) 62 (79.5) Κάπνισμα (αρ. πακ./έτη) Ποτέ/ Π.καπνιστής 7 (12.5) 16 (25.8) 16 (20.0) 7 (21.2) 9 (22.5) 14 (17.9) (46.4) 17 (27.4) 31 (38.8) 9 (27.3) 15 (37.5) 28 (35.9) >30 23 (41.1) 29 (46.8) 33 (41.3) 17 (51.5) 16 (40.0) 36 (46.2) Οικογενειακό ιστορικό Όχι 38 (67.9) 49 (79.0) 63 (78.8) 20 (60.6) 30 (75.0) 56 (71.8) Ναι 18 (32.1) 13 (21.0) 17 (21.3) 13 (39.4) 10 (25.0) 22 (28.2) Μέγεθος όγκου (cm) (77.8) 42 (70.0) 57 (75.0) 23 (69.7) 27 (73.0) 57 (74.0) >3 12 (22.2) 18 (30.0) 19 (25.0) 10 (30.3) 10 (27.0) 20 (26.0) ΙΒΔ (83.0) 48 (81.4) 62 (81.6) 26 (83.9) 34 (91.9) 58 (77.3) 3 9 (17.0) 11 (18.6) 14 (18.4) 5 (16.1) 3 (8.1) 17 (22.7) Πρωτοπαθής όγκος T1+T2 18 (32.1) 18 (29.0) 23 (28.8) 11 (33.3) 10 (25.0) 27 (34.6) T3+T4a 38 (67.9) 44 (71.0) 57 (71.3) 22 (66.7) 30 (75.0) 51 (65.4) Επιχώριοι λεμφαδένες N0 49 (87.5) 56 (90.3) 71 (88.8) 29 (87.9) 37 (92.5) 68 (87.2) N+ 7 (12.5) 6 (9.7) 9 (11.3) 4 (12.1) 3 (7.5) 10 (12.8) Στάδιο (AJCC) I+II 18 (32.1) 17 (27.4) 22 (27.5) 11 (33.3) 9 (22.5) 27 (34.6) III+IVA 38 (67.9) 45 (72.6) 58 (72.5) 22 (66.7) 31 (77.5) 51 (65.4) Εντόπιση Γλωττίδα 25 (44.6) 33 (53.2) 41 (51.3) 15 (45.5) 21 (52.5) 38 (50.0) ΥΠΡΓ/ΥΠΓ/ΔΓ 31 (55.4) 29 (46.8) 39 (48.7) 18 (54.5) 19 (47.5) 40 (51.3) ΤΧΕ Άλλη 6 (10.7) 8 (12.9) 12 (15.0) 3 (9.1) 3 (7.5) 12 (15.4) Λαρυγγεκτομή 50 (89.3) 54 (87.1) 68 (85.0) 30 (90.9) 37 (92.5) 66 (84.6) Προηγηθείσα ακτινοβολία Όχι 48 (85.7) 43 (69.4) 62 (77.5) 24 (72.7) 32 (80.0) 58 (74.4) Ναι 8 (14.3) 19 (30.6) 18 (22.5) 9 (27.3) 8 (20.0) 20 (25.6) Τραχηλικός ΛΚ Όχι 50 (89.3) 48 (77.4) 67 (83.8) 26 (78.8) 35 (87.5) 63 (80.8) Ναι 6 (10.7) 14 (22.6) 13 (16.3) 7 (21.2) 5 (12.5) 15 (19.2) Α: Αρνητική; ΔΓ: Διαγλωττιδική; Θ: Θετική; ΙΒΔ: Ιστολογικός Βαθμός Διαφοροποίησης; ΛΚ: Λεμφαδενικός καθαρισμός; Π: Πρώην; ΤΧΕ: Τύπος Χειρουργικής Επέμβασης; ΥΠΡΓ: Υπεργλωττιδική; ΥΠΓ: Υπογλωττιδική. 8.4 Συσχετίσεις μεταξύ των ανοσοϊστοχημικών δεικτών Αναδείχθηκαν ελάχιστες στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των πρωτεϊνών της μελέτης. Ειδικότερα ανευρέθη θετική συσχέτιση μεταξύ των TopoIIα και Ki67 (p=0.003), και αρνητική συσχέτιση μεταξύ των HER3 και HPVt (p=0.032). Ισχυρή θετική τάση αναδείχθηκε τέλος μεταξύ των TopoIIα και PTEN (p=0.086) (Πίνακας 8.5). 60

61 Πίνακας 8.5. Παρουσίαση των συσχετίσεων μεταξύ των ανοσοϊστοχημικών δεικτών TopoIIa PTEN HER1 HER2 HER3 Ki67 A Θ A Θ A Θ A Θ A Θ Χ Υ N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P PTEN A 30 (81.1) 49 (65.3) Θ 7 (18.9) 26 (34.7) HER A 2 (5.0) 4 (5.2) 3 (3.8) 1 (3.0) Θ 38 (95.0) 73 (94.8) 75 (96.2) 32 (97.0) HER A (97.5) (93.6) (96.3) (90.9) (100,0) (94.6) Θ 1 (2.5) 5 (6.4) 3 (3.7) 3 (9.1) 0 6 (5.4) HER A 19 (47.5) 37 (48.1) 34 (43.6) 20 (60.6) 1 (14,3) 55 (49.5) 52 (46.4) 4 (66.7) Θ 21 (52.5) 40 (51.9) 44 (56.4) 13 (39.4) 6 (85,7) 56 (50.5) 60 (53.6) 2 (33.3) Ki Χ 17 (47.2) 14 (18.2) 23 (30.7) 6 (18.2) 2 (66,7) 29 (26.6) 30 (28.0) 1 (16.7) 14 (25.0) 17 (30.4) Υ 19 (52.8) 63 (81.8) 69 (69.3) 27 (81.8) 1 (33,3) 80 (73.4) 77 (72.0) 5 (83.3) 42 (75.0) 39 (69.6) HPVt A 24 (64.9) 58 (77.3) 54 (72.0) 21 (72.4) 3 (100,0) 80 (72.7) Θ (29.9) 0 30 (35.1) (22.7) (28.0) (27.3) Α: Αρνητική, Θ: Θετική, Χ: Χαμηλή έκφραση (<25%), Υ: Υψηλή έκφραση ( 25%). 81 (75.0) 27 (25.0) 3 (50.0) 3 (50.0) 35 (63.6) 20 (36.4) 48 (82.8) 10 (17.2) 19 (65.5) 10 (34.5) 62 (76.5) 19 (23.5) 61

62 8.5 FISH ευρήματα Τα αποτελέσματα της μεθόδου FISH, η συσχέτιση των γονιδίων, των κεντρομεριδίων με τα χαρακτηριστικά των ασθενών και του όγκου αποτυπώνονται στους Πίνακες Καταμετρήθηκαν σε 5/118 (4.2%) όγκους αυξημένοι αριθμοί σημάτων του γονιδίου HER3 οι οποίοι και θεωρήθηκαν ως ενίσχυση του γονιδίου και σε 74 όγκους (62.7%) χαμηλή γονιδιακή επαύξηση (Εικόνα 8.5 Β, Γ). Περιπτώσεις με λόγο HER3/CEP δεν παρατηρήθηκαν λόγω της συνοδού επαύξησης (gain) του κεντρομεριδίου χρ.12 (CEP12), η οποία ανευρέθη στο 56.7% των περιπτώσεων (Εικόνα 8.5 Β, Γ). Συχνά η χρωμοσωμική επαύξηση συνδυαζόταν από γονιδιακή επαύξηση. Στατιστικά σημαντική συσχέτιση καταδείχθηκε μεταξύ της χαμηλής έκφρασης της HER3 πρωτεΐνης και της ενίσχυσης του αντίστοιχου γονιδίου (p=0.024). Πίνακας 8.6. Παρουσίαση των αποτελεσμάτων του FISH. FISH κατηγοριοποίηση N (%) TOP2A (n=118) Φυσιολογική 116 (98.3) Ενίσχυση 2 (1.7) HER3 (n=118) Φυσιολογική 113 (95.8) Ενίσχυση 5 (4.2) HER2 (n=118) Φυσιολογική 114 (96.6) Ενίσχυση 4 (3.4) PTEN (n=116) Απώλεια 19 (16.4) Φυσιολογική 97 (83.6) CEP10 (n=118) Φυσιολογική 113 (95.8) Επαύξηση 5 (4.2) CEP12 (n=118) Φυσιολογική 51 (43.2) Χαμηλή επαύξηση 62 (52.5) Υψηλή επαύξηση 5 (4.2) CEP17 (n=118) Φυσιολογική 104 (88.1) Επαύξηση 14 (11.9) Απώλεια του γονιδίου PTEN παρατηρήθηκε σε 19/116 (16.4%) περιπτώσεις (Εικόνα 8.6Β) και επαύξηση του CEP10 καταμετρήθηκε σε 5/116 (4.2%) όγκους. Η απουσία έκφρασης της PTEN πρωτεΐνης και η γονιδιακή απώλεια, εμφάνισαν τάση συσχέτισης (p=0.097). Απώλεια του PTEN παρατηρήθηκε συχνότερα σε όγκους που εδράζονταν στις γλωττίδες και σπανιότερα στις άλλες ανατομικές εντοπίσεις (p=0.024). 62

63 Ενίσχυση του TOP2A γονιδίου ανευρέθη συνολικά στο 1.7% των όγκων. Η 1/118 (0.8%) περιπτώσεις με βάση τον λόγο (TOP2A/CEP17) και η δεύτερη περίπτωση ως υψηλή επαύξηση (Πίνακας 8.6). Η ενίσχυση ήταν με την μορφή μεμονωμένων σημάτων και σπάνια με τη μορφή μικρού μεγέθους σωρών (clusters) (Εικόνα 8.8). Παρατηρήθηκαν 23/118 περιπτώσεις με χαμηλή επαύξηση και απουσία απώλειας του TOP2A. Το HER2 γονίδιο καταμετρήθηκε με ενίσχυση σε 4/118 (3.4%) περιπτώσεις (Πίνακας 8.6) και στις 4/6 θετικές στην ΑΙΧ περιπτώσεις (p<0.001). Όπως και στο TOP2A γονίδιο παρατηρήθηκαν και στο παραπάνω γονίδιο κυρίως αυξημένοι αριθμοί μεμονωμένων σημάτων ανά κύτταρο (Εικόνα 8.8). Επαύξηση του CEP17 παρατηρήθηκε σε 14/118 (11.8%) όγκους. Οι συσχετίσεις των ευρημάτων FISH με τους κλινικοπαθολογοανατομικούς δείκτες παρουσιάζονται στους Πίνακες Πίνακας 8.7. Συσχετίσεις των CEP10, CEP12 και CEP17 με κλινικοπαθολογοανατομικούς δείκτες. CEP10 CEP12 CEP17 Φ ΕΠ Φ ΕΠ Φ ΕΠ N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P Ηλικία (50.4) 3 (60.0) 22 (43.1) 38 (56.7) 52 (50.0) 8 (57.1) >65 56 (49.6) 2 (40.0) 29 (56.9) 29 (43.3) 52 (50.0) 6 (42.9) Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 24 (21.2) 2 (40.0) 10 (19.6) 16 (23.9) 24 (23.1) 2 (14.3) Ναι 89 (78.8) 3 (60.0) 41 (80.4) 51 (76.1) 80 (76.9) 12 (85.7) Κάπνισμα (αρ. πακ./έτη) Ποτέ /Π. καπνιστής 22 (19.5) 1 (20.0) 11 (21.6) 12 (17.9) 22 (21.2) 1 (7.1) (34.5) 4 (80.0) 14 (27.4) 29 (43.3) 33 (31.7) 10 (71.4) >30 52 (46.0) 0 26 (51.0) 26 (38.8) 49 (47.1) 3 (21.4) Οικογενειακό ιστορικό Όχι 82 (72.6) 3 (60.0) 36 (70.6) 49 (73.1) 75 (72.1) 10 (71.4) Ναι 31 (27.4) 2 (40.0) 15 (29.4) 18 (26.9) 29 (27.9) 4 (28.6) Μέγεθος όγκου (cm) (73.6) 3 (75.0) 40 (78.4) 44 (69.8) 76 (75.2) 8 (61.5) >3 29 (26.4) 1 (25.0) 11 (21.6) 19 (30.2) 25 (24.8) 5 (38.5) ΙΒΔ (85.8) 4 (80.0) 43 (84.3) 58 (86.6) 90 (86.5) 11 (78.6) 3 16 (14.2) 1 (20.0) 8 (27.4) 9 (13.4) 14 (13.5) 3 (21.4) Πρωτοπαθής όγκος T1+T2 34 (30.1) 3 (60.0) 16 (31.4) 21 (31.3) 33 (31.7) 4 (28.6) T3+T4a 79 (69.9) 2 (40.0) 35 (68.6) 46 (68.7) 71 (68.3) 10 (71.4) Επιχώριοι λεμφαδένες N0 102 (90.3) 3 (60.0) 48 (94.1) 57 (85.1) 95 (91.3) 10 (71.4) N+ 11 (9.7) 2 (40.0) 3 (5.9) 10 (14.9) 9 (8.7) 4 (28.6) Στάδιο (AJCC) I+II 34 (30.1) 2 (40.0) 16 (31.4) 20 (29.9) 33 (31.7) 3 (21.4) III+IVA 79 (69.9) 3 (60.0) 35 (68.6) 47 (70.1) 71 (68.3) 11 (78.6) Εντόπιση Γλωττίδα 56 (49.6) 3 (60.0) 26 (51.0) 33 (49.3) 50 (48.1) 9 (64.3) ΥΠΡΓ/ΥΠΓ/ΔΓ 57 (50.4) 2 (40.0) 25 (49.0) 34 (50.7) 54 (51.9) 5 (35.7) ΤΧΕ Άλλη 14 (12.4) 1 (20.0) 5 (9.8) 10 (14.9) 13 (12.5) 2 (14.3) Λαρυγγεκτομή 99 (87.6) 4 (80.0) 46 (90.2) 57 (85.1) 91 (87.5) 12 (85.7) Προηγηθείσα ακτινοβολία Όχι 87 (77.0) 4 (80.0) 40 (78.4) 51 (76.1) 83 (79.8) 8 (57.1) Ναι 26 (23.0) 1 (20.0) 11 (21.6) 16 (23.9) 21 (20.2) 6 (42.9) Τραχηλικός ΛΚ Όχι 95 (84.1) 3 (60.0) 43 (84.3) 55 (82.1) 89 (85.6) 9 (64.3) Ναι 18 (15.9) 2 (40.0) 8 (15.7) 12 (17.9) 15 (14.4) 5 (35.7) ΔΓ: Διαγλωττιδική; ΕΠ: Επαύξηση; ΙΒΔ: Ιστολογικός Βαθμός Διαφοροποίησης; ΛΚ: Λεμφαδενικός καθαρισμός; Π: Πρώην; ΤΧΕ: Τύπος Χειρουργικής Επέμβασης; ΥΠΡΓ: Υπεργλωττιδική; ΥΠΓ: Υπογλωττιδική; Φ: Φυσιολογική. 63

64 Πίνακας 8.8. Συσχετίσεις των HER2, HER3, PTEN και TOP2A γονιδίων με κλινικοπαθολογοανατομικούς δείκτες HER2 HER3 PTEN TOP2A Φ Ε Φ Ε Φ AΠ Φ Ε N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P N (%) N (%) P Ηλικία (95.0) 3 (75.0) 56 (93.3) 4 (80.0) 47 (48.5) 11 (55.0) 57 (95.0) 1 (50.0) >65 57 (98.3) 1 (25.0) 57 (98.3) 1 (20.0) 50 (51.5) 8 (45.0) 57 (98.3) 1 (50.0) Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 24 (21.1) 2 (50.0) 25 (22.1) 1 (20.0) 21 (21.6) 4 (21.1) 25 (21.6) 1 (50.0) Ναι 90 (78.9) 2 (50.0) 88 (77.9) 4 (80.0) 76 (78.4) 15 (78.4) 91 (78.4) 1 (50.0) Κάπνισμα (αρ. πακ./έτη) Ποτέ / Πρ. καπνιστής 23 (20.2) 0 22 (19.5) 1 (20.0) 19 (19.6) 3 (15.8) 23 (19.8) (35.1) 3 (75.0) 41 (36.3) 2 (40.0) 34 (35.1) 9 (47.4) 42 (36.2) 1 (50.0) >30 51 (44.7) 1 (25.0) 50 (44.2) 2 (40.0) 44 (45.4) 7 (36.8) 51 (44.0) 1 (50.0) Οικογενειακό ιστορικό Όχι 81 (71.1) 4 (100.0) 82 (72.6) 3 (60.0) 70 (72.2) 13 (68.4) 84 (72.4) 1 (50.0) Ναι 33 (28.9) 0 31 (27.4) 2 (40.0) 27 (27.8) 6 (31.6) 32 (27.6) 1 (50.0) Μέγεθος όγκου (cm) (73.9) 2 (75.0) 80 (72.7) 4 (100.0) 67 (72.0) 15 (78.9) 83 (74.1) 1 (50.0) >3 29 (26.1) 1 (25.0) 30 (27.3) 0 26 (28.0) 4 (21.1) 29 (25.9) 1 (50.0) ΙΒΔ (85.1) 4 (100.0) 96 (85.0) 5 (100.0) 82 (84.5) 17 (89.5) 99 (85.3) 2 (100.0) 3 17 (14.9) 0 17 (15.0) 0 15 (15.5) 2 (10.5) 17 (14.7) 0 Πρωτοπαθής όγκος T1+T2 35 (30.7) 2 (50.0) 34 (30.1) 3 (60.0) 29 (29.9) 7 (36.8) 36 (31.0) 1 (50.0) T3+T4a 79 (69.3) 2 (50.0) 79 (69.9) 2 (40.0) 68 (70.1) 12 (63.2) 80 (69.0) 1 (50.0) Επιχώριοι λεμφαδένες N0 101 (88.6) 4 (100.0) 100 (88.5) 5 (100.0) 84 (86.6) 19 (100.0) 103 (88.8) 2 (100.0) N+ 13 (11.4) 0 13 (11.5) 0 13 (13.4) 0 13 (11.2) 0 Στάδιο (AJCC) I+II 34 (29.8) 2 (50.0) 33 (29.2) 3 (60.0) 28 (28.9) 7 (36.8) 35 (30.2) 1 (50.0) III+IVA 80 (70.2) 2 (50.0) 80 (70.8) 2 (50.0) 69 (71.1) 12 (63.2) 81 (69.8) 1 (50.0) Εντόπιση Γλωττίδα 58 (50.9) 1 (25.0) 56 (49.6) 3 (60.0) 43 (44.3) 14 (73.7) 59 (50.9) 0 ΥΠΡΓ/ΥΠΓ/ΔΓ 56 (49.1) 3 (75.0) 57 (50.4) 2 (40.0) 54 (55.7) 5 (26.3) 57 (49.1) 2 (100.0) ΤΧΕ Άλλη 14 (12.3) 1 (25.0) 13 (11.5) 2 (40.0) 12 (12.4) 3 (15.8) 15 (12.9) 0 Λαρυγγεκτομή 100 (87.7) 3 (75.0) 100 (88.5) 3 (60.0) 85 (87.6) 16 (84.2) 101 (87.1) 2 (100.0) Προηγηθείσα ακτινοβολία Όχι 88 (77.2) 3 (75.0) 86 (76.1) 5 (100.0) 73 (75.3) 16 (84.2) 90 (77.6) 1 (50.0) Ναι 26 (22.8) 1 (25.0) 27 (23.9) 0 24 (24.7) 3 (15.8) 26 (22.4) 1 (50.0) Τραχηλικός ΛΚ Όχι 94 (82.5) 4 (100.0) 93 (82.3) 5 (100.0) 81 (83.5) 15 (78.9) 96 (82.8) 2 (100.0) Ναι 20 (17.5) 0 20 (17.7) 0 16 (16.5) 4 (21.1) 20 (17.2) 0 ΑΠ: Απώλεια; ΔΓ: Διαγλωττιδική; Ε: Ενίσχυση; ΙΒΔ: Ιστολογικός Βαθμός Διαφοροποίησης; ΛΚ: Λεμφαδενικός καθαρισμός; Πρ.: Πρώην, ΤΧΕ: Τύπος Χειρουργικής Επέμβασης; ΥΠΡΓ: Υπεργλωττιδική; ΥΠΓ: Υπογλωττιδική, Φ: Φυσιολογική 64

65 8.6 Συσχέτιση της ελεύθερης υποτροπής επιβίωσης (ΕΥΕ) και της συνολικής επιβίωσης (ΣΕ) με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και τον τύπο της θεραπείας Με χρήση των καμπυλών Kaplan-Meier και της στατιστικής δοκιμασίας log-rank διαπιστώσαμε ότι η κατάχρηση αλκοόλης σχετίσθηκε με σημαντικά μειωμένο χρόνο ΕΥΕ (p=0.016), ενώ δεν σχετίσθηκε με τον χρόνο ΣΕ (Εικόνα 8.3). Όμοια ο υψηλός βαθμός ιστολογικής διαφοροποίησης του όγκου (ΙΒΔ=3) και οι όγκοι σταδίων Τ1+Τ2 σχετίζονταν με σημαντικά μειωμένο χρόνο ΕΥΕ (p=0.018 και p=0.030 αντίστοιχα), ενώ δεν σχετίζονταν με την ΣΕ (Εικόνες 8.4 και 8.5). Η λεμφαδενική διήθηση σχετίσθηκε με σημαντικά μειωμένο χρόνο ΕΥΕ αλλά και ΣΕ (p<0.001) (Εικόνα 8.6). Η ομάδα των ασθενών οι οποίοι υπεβλήθησαν σε ολική λαρυγγεκτομή καθώς και όσοι δεν έλαβαν τον συνδυασμό ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας σχετίζονταν με αυξημένο χρόνο ΕΥΕ (p=0.027 και p=0.045) (Εικόνες 8.7 και 8.8). Η διήθηση των χειρουργικών ορίων σχετίσθηκε με σημαντικά μειωμένο χρόνο ΣΕ, ενώ δεν σχετίσθηκε με τον χρόνο ΕΥΕ (Εικόνα 8.10). Τέλος τα περιστατικά με στάδιο νόσου ΙΙΙ+IVΑ σχετίζονταν οριακά με μεγαλύτερο χρόνο ΕΥΕ (p=0.054) (Εικόνα 8.9). Η ηλικία, το μέγεθος του όγκου και η χορήγηση προεγχειρητικής ακτινοθεραπείας δεν βρέθηκε να σχετίζονται με την ΕΥΕ και ΣΕ (Εικόνες 8Π-10Π). Α. Β. Εικόνα 8.3. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση την κατάχρηση αλκοόλης. 65

66 Α. Β. Εικόνα 8.4. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με τον ιστολογικό βαθμό διαφοροποίησης. Α. Β. Εικόνα 8.5. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση το Τ στάδιο (ΤΝΜ). Α. Β. Εικόνα 8.6. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση την λεμφαδενική διήθηση (στάδιο Ν κατά ΤΝΜ). 66

67 Α. Β. Εικόνα 8.7. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση την μέθοδο χειρουργικής αντιμετώπισης. Α. Β. Εικόνα 8.8. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] σε σχέση με την θεραπευτική αντιμετώπιση (μόνο χειρουργική ή συνδυασμός ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας). Α. Β. Εικόνα 8.9. Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση το στάδιο της νόσου (ΤΝΜ/AJCC). 67

68 Α. Β. Εικόνα Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] με βάση την διήθηση των χειρουργικών ορίων (Χ.Ο). Από την μονοπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών (Πίνακας 8.9) προέκυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ ΕΥΕ και της κατάχρησης αλκοόλης (p=0.020), της ιστολογικής διαφοροποίησης (p=0.021), του σταδίου του όγκου (Τ) (p=0.032), της λεμφαδενικής διήθησης (p<0.001), της ολικής λαρυγγεκτομής (p=0.030) και του τύπου της θεραπείας (p=0.048), ενώ ισχυρή τάση αναδείχθηκε με το στάδιο της νόσου (p=0.057) και τα χειρουργικά όρια (p=0.082). Η ΣΕ συσχετίσθηκε μόνο με την λεμφαδενική διήθηση (p<0.001). Ισχυρή τάση παρατηρήθηκε μεταξύ της ΣΕ, της κατάχρησης αλκοόλης (p=0.060), των χειρουργικών ορίων (p=0.082) καθώς και του ΙΒΔ (p=0.091). Πίνακας 8.9. Μονοπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών σύμφωνα με την ΕΥΕ και την ΣΕ. ΕΥΕ ΣΕ Συμβάν/N HR 95% CI P Συμβάν/N HR 95% CI P Ηλικία 65 30/ /61 1 >65 32/ / Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 8/27 1 7/27 1 Ναι 54/ / Κάπνισμα (αρ. πακέτα/έτη) Ποτέ / Πρ. 15/ / καπνιστής / / >30 23/ /

69 Πίνακας 8.9 (Συνέχεια) ΕΥΕ ΣΕ Συμβάν/N HR 95% CI P Συμβάν/N HR 95% CI P Οικογενειακό ιστορικό Όχι 45/ /88 1 Ναι 17/ / Μέγεθος όγκου (cm) 3 46/ /87 1 >3 15/ / ΙΒΔ / / / / Πρωτοπαθής όγκος T1+T2 25/ /37 1 T3+T4a 37/ / Επιχώριοι λεμφαδένες N0 51/ /109 1 N+ 11/ < / <0.001 Στάδιο (AJCC) Ι+ΙΙ 24/ /36 1 ΙΙΙ+ΙVA 38/ / Εντόπιση Γλωττίδα 37/ /61 1 ΥΠΡΓ/ΥΠΓ/ΔΓ 25/ / ΤΧΕ Άλλη 14/ /15 1 Λαρυγγεκτομή 48/ / Χ.Ο Ελεύθερα 3/57 1 3/69 1 Διηθημένα 7/ / Προηγηθείσα ακτινοβολία Όχι 48/ /93 1 Ναι 14/ / Τραχηλικός ΛΚ Όχι 50/ /102 1 Ναι 12/ / Τύπος Θεραπείας Xειρουργική 44/ /93 1 ΑΚΘ + ΧΜΘ 18/ / ΑΚΘ: Ακτινοθεραπεία; ΔΓ: Διαγλωττιδική; ΙΒΔ: Ιστολογικός Βαθμός Διαφοροποίησης; ΛΚ: Λεμφαδενικός καθαρισμός; Πρ.: Πρώην; ΤΧΕ: Τύπος Χειρουργικής Επέμβασης; ΥΠΡΓ: Υπεργλωττιδική; ΥΠΓ: Υπογλωττιδική; ΧΜΘ: Χημειοθεραπεία, Χ.Ο: Χειρουργικά όρια. 69

70 8.6 Συσχέτιση των δεικτών ΑΙΧ και FISH με την ΕΥΕ, την ΣΕ Μονοπαραγοντική ανάλυση Η μονοπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox των ΑΙΧ δεικτών σύμφωνα με την ΕΥΕ και την ΣΕ αποτυπώνεται στους Πίνακες 8.10 και 2Π, ενώ για του δείκτες FISH στον Πίνακα Από την ανάλυση προέκυψε μόνο στατιστικά σημαντική συσχέτιση της έκφρασης της TopoIIa με την EYE (p=0.020) και οριακή σχέση με την ΣΕ (p=0.066). Στην ανάλυση Kaplan-Meier οι ασθενείς στους οποίους οι όγκοι εξέφραζαν την TopoIIa εμφάνισαν μικρότερο χρόνο ΕΥΕ σε σχέση με τους αρνητικούς ασθενείς (p=0.018) (Εικόνα 8.10). Η ΣΕ ήταν επίσης μειωμένη στην ομάδα ασθενών με θετική την TopoIIa χωρίς όμως να εμφανίζει ισχυρή συσχέτιση (p=0.062), (Εικόνα 8.10). Τα ευρήματα των δεικτών HER3 και PTEN δεν εμφάνισαν στατιστική σημαντικότητα με την ΕΥΕ και τη ΣΕ (Εικόνες 11Π-12Π), όπως επίσης και των άλλων ΑΙΧ δεικτών (Εικόνες 13Π-16Π). Σημαντικότητα των δεικτών FISH δεν παρατηρήθηκε στις αναλύσεις επιβίωσης Kaplan- Meier (Εικόνες 17Π-20Π). Πίνακας Μονοπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox των HER3, PTEN και TopoIIa πρωτεϊνών σύμφωνα με την ΕΥΕ και τη ΣΕ. ΕΥΕ HR 95% CI P HR 95% CI P HER3 Αρνητική 1 1 Θετική PTEN Αρνητική 1 1 Θετική TopoIIa Αρνητική 1 1 Θετική HR: Hazard Ratio. ΣΕ 70

71 A. B. Εικόνα Καμπύλες Kaplan-Meier για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (DFS) [Α] και την συνολική επιβίωση (OS) [B] σε σχέση με την έκφραση της TopoIIa. Πίνακας Μονοπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox των γονιδίων HER2, HER3, PTEN και TOP2A καθώς και των CEP10, CEP12 και CEP17 σύμφωνα με την ΕΥΕ και τη ΣΕ. FISH κατηγοριοποίηση ΕΥΕ ΣΕ HR 95% CI P HR 95% CI P HER3 Φυσιολογική 1 1 Ενίσχυση PTEN Απώλεια 1 1 Φυσιολογική TOP2A Φυσιολογική 1 1 Ενίσχυση HER2 Φυσιολογική 1 1 Ενίσχυση CEP10 Φυσιολογική 1 1 Επαύξηση CEP12 Φυσιολογική 1 1 Επαύξηση CEP17 Φυσιολογική 1 1 Επαύξηση CEP: Centromere Enumeration Probe, HR: Hazard Ratio. 71

72 8.6.2 Πολυπαραγοντική ανάλυση Η πολυπαραγοντική ανάλυση για την ΕΥΕ και την ΣΕ παρουσιάζεται στον Πίνακα Από τα αποτελέσματα της ανάλυσης προκύπτει ότι η κατάχρηση αλκοόλης, η ύπαρξη διηθημένων λεμφαδένων (Ν+) και η έκφραση της TopoIIa αποτελούσαν αρνητικούς ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες για την ΕΥΕ και τη ΣΕ. Η μη γλωττιδική εντόπιση, σχετίσθηκε με μειωμένο κίνδυνο για την ΕΥΕ και ΣΕ, ενώ η διήθηση των χειρουργικών ορίων ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μόνο για την ΣΕ. Πίνακας Πολυπαραγοντική ανάλυση τύπου Cox για την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (ΕΥΕ) και την συνολική επιβίωση (ΣΕ). ΕΥΕ ΣΕ HR 95% CI P HR 95% CI P Κατάχρηση αλκοόλ Όχι 1 1 Ναι Χειρουργικά όρια Ελεύθερα 1 1 Διηθημένα Εντόπιση όγκου Γλωττίδα 1 1 ΥΠΡΓ/ΥΠΓ/ΔΓ Διήθηση λεμφαδένων (N) N0 1 1 N x x10-5 TopoIIa Αρνητική 1 1 Θετική ΔΓ: Διαγλωττιδική; ΥΠΡΓ: Υπεργλωττιδική; ΥΠΓ: Υπoγλωττιδική εντόπιση. HR: Hazard Ratio. 72

73 ΕΙΚΟΝΕΣ 73

74 Α. Β. Εικόνα 8.1. Α. Διηθητικό, μέτριας διαφοροποίησης, εστιακά κερατινοποιούμενο καρκίνωμα λάρυγγα από πλακώδη κύτταρα. Β. Διηθητικό κερατινοποιούμενο πλακώδες καρκίνωμα. 74

75 Α. Β. Γ. Εικόνα 8.2. Α. Περίπτωση διηθητικού ΚΛ με μέτρια έκφραση, από το σύνολο των νεοπλασματικών κυττάρων, του HER3. B. Παρόμοιας έντασης έκφραση του HER3 σε κερατινοποιούμενο ΚΛ. Γ. Απουσία έκφρασης του HER3. 75

76 Α. Β. Εικόνα 8.3. Α. Κυτταροπλασμική, μέτριας κυρίως έντασης, έκφραση της PTEN πρωτεΐνης από τα νεοπλασματικά κύτταρα του καρκινώματος. Στο στρώμα παρατηρείται έντονη έκφραση στα φλεγμονώδη, στρωματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Β. Απουσία ή ελάχιστα διακριτή έκφραση της PTEN πρωτεΐνης από τα κύτταρα του νεοπλάσματος. 76

77 Α. Β. Εικόνα 8.4. Α. Έντονη πυρηνική έκφραση της TopoIIa πρωτεΐνης από τα νεοπλασματικά κύτταρα του καρκινώματος. Β. Παρουσία θετικών πυρήνων στην TopoIIa σε <10 % των νεοπλασματικών κυττάρων, η οποία θεωρήθηκε ως αρνητική. 77

78 Α. HER3 CEP12 Β. Γ. Εικόνα 8.5. FISH με τον ZytoLight SPEC HER3/CEN12 ιχνηθέτη σε διηθητικό πλακώδες καρκίνωμα λάρυγγα. Α. Φυσιολογική κατάσταση του HER3 γονιδίου. Β-Γ Περιπτώσεις με επαύξηση του HER3 και του CEP12, οι οποίες λόγω του αυξημένου αριθμού HER3 σημάτων ανά κύτταρο, θεωρήθηκαν ως θετικές για ενίσχυση. Μεγέθυνση x

79 Α. CEP10 PTEN Β. Εικόνα 8.6. FISH με τον ZytoLight SPEC PTEN/CEN10 ιχνηθέτη σε διηθητικό πλακώδες καρκίνωμα λάρυγγα. Α. Φυσιολογική κατάσταση του PTEN γονιδίου. Β Περιπτώση με απώλεια PTEN γονιδίου. Διακρίνονται αρκετά κύτταρα με απώλεια του ενός αντιγράφου του γονιδίου (βέλη). Μεγέθυνση x

80 Α. HER2 TOP2A CEP17 Β. Γ. Εικόνα 8.7. FISH με τον ZytoLight SPEC HER2/TOP2A/CEN17 ιχνηθέτη σε διηθητικό πλακώδες καρκίνωμα λάρυγγα με φυσιολογική κατάσταση των HER2 (Α) και TOP2A (Β) γονιδίων καθώς και του CEP17 (Α-Γ). Στους νεοπλασματικούς πυρήνες παρατηρούνται από 1 έως 2 σήματα ανά κύτταρο για κάθε ιχνηθέτη. Μεγέθυνση x

81 A. HER2 TOP2A CEP17 B. Γ. Εικόνα 8.8. FISH με τον ZytoLight SPEC HER2/TOP2A/CEN17 ιχνηθέτη σε διηθητικό πλακώδες καρκίνωμα λάρυγγα. Χαμηλού βαθμού ενίσχυση των γονιδίων HER2 (Α) και TOP2A (Β) κυρίως με τη μορφή μεμονωμένων σημάτων και ολιγάριθμων, μικρού μεγέθους, σωρών (βέλη). Μεγέθυνση x

82 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η παρούσα μελέτη συμπεριέλαβε 122 ασθενείς με χειρουργήσιμο καρκίνο λάρυγγα σταδίων Ι-IVa, για την ανίχνευση βιολογικών δεικτών με ανεξάρτητο προγνωστικό ρόλο. Σε 113 περιπτώσεις ήταν επιτυχής η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση για την πρωτεΐνη PTEN και σε 118 περιπτώσεις για τις HER3 και TopoIIa πρωτεΐνες. Ο FISH για τα γονίδια των παραπάνω πρωτεϊνών επιτεύχθηκε σε 116, 118 και 118 περιπτώσεις αντίστοιχα. Παράλληλα με τις παραπάνω αναλύσεις, για πληρέστερη μελέτη της βιολογίας των όγκων, πραγματοποιήθηκε και ανοσοϊστοχημική διερεύνηση για τις πρωτεΐνες HER1, HER2, Ki67, HPV και FISH για το γονίδιο HER2. Δεδομένου ότι τα μόρια HER3, TopoIIa και PTEN, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε γονιδιακό επίπεδο, έχουν ερευνηθεί ελάχιστα στο καρκίνωμα του λάρυγγα, διερευνήθηκαν όλες οι πιθανές συσχετίσεις των βιοδεικτών αυτών μεταξύ τους. Παράλληλα διερευνήθηκαν και όλες οι πιθανές συσχετίσεις των μοριακών βιοδεικτών με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά. Η ανάλυση των σχέσεων της ηλικίας, του μεγέθους του όγκου και του οικογενειακού ιστορικού με την ΕΥΕ και ΣΕ δεν ανέδειξε σημαντικότητα τόσο στην μονοπαραγοντική, την πολυπαραγοντική ανάλυση, όσο και στις καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier, ευρήματα που είναι σε συμφωνία με ανάλογες μελέτες (54, 80, ). Η κατάχρηση αλκοόλης θεωρείται ως αιτιολογικός παράγοντας ανάπτυξης του ΚΛ, συχνά όμως δεν εμφανίζει μετεγχειρητική προγνωστική αξία (61, 80, 199). Στη μελέτη μας παρατηρήσαμε προγνωστική αξία της κατάχρησης αλκοόλης σε σχέση με την ΕΥΕ, με αυξημένη αναλογία κινδύνου (HR=2.42), σημαντικότητα η οποία παρέμεινε και στην πολυπαραγοντική ανάλυση (HR=2.14) επίσης μόνο με την ΕΥΕ. Ο παραπάνω παράγοντας συσχετίσθηκε επίσης με μείωση του διαστήματος της ΕΥΕ (p=0.016) και ήταν οριακά μη σημαντικός με τη ΣΕ (p=0.054). Η πλειονότητα των ασθενών της μελέτης μας ήταν καπνιστές (79.2%) και βαριά καπνιστές πάνω από το 1/3 (44.3%) αυτών. Το κάπνισμα θεωρείται ισχυρό καρκινογόνο για τον ΚΛ και της κεφαλής και του τραχήλου (202, 203) και ο συνδυασμός με την κατάχρηση αλκοόλης αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου της κεφαλής και του τραχήλου έως 200 φορές (204). Υπάρχει όμως και μικρή ομάδα ασθενών που εμφανίζουν κακοήθεια από 2.4 έως 4.4% - χωρίς τους παραπάνω αιτιολογικούς παράγοντες (205). Στη παρούσα μελέτη, το κάπνισμα δεν αποτέλεσε ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη, εύρημα σύμφωνο με άλλες προγενέστερες μελέτες (61, 80, 199), ενώ αναδείχθηκε ισχυρή τάση του καπνίσματος και ειδικότερα των βαριά καπνιστών - >30 πακέτων/έτος- με την ΕΥΕ (p=0.073), η οποία όμως ήταν εμφανώς ασθενέστερη στην ΣΕ (p=0.16). 82

83 Η προγνωστική αξία του ιστολογικού βαθμού διαφοροποίησης (ΙΒΔ) του ΚΛ είναι αμφιλεγόμενη (3), παρόλο που εμφανίζει προγνωστική αξία σε μονοπαραγοντική ανάλυση (51, 56) και αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη ( ) για ΕΥΕ και ΣΕ. Στη μελέτη μας δεν αναδείχθηκε προγνωστική αξία του ΙΒΔ στην μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση σε σχέση με την ΕΥΕ και ΣΕ. Η λεμφαδενική μετάσταση της νόσου επηρεάζει δυσμενώς την επιβίωση (3) και σε πολλές μελέτες ΚΛ αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη (47, 51, 52, 61, 200, 201, 208, 210, 211). Στην μελέτη μας, στο 11% των ασθενών, ανευρέθηκαν ιστολογικά λεμφαδενικές μεταστάσεις (pn) του ΚΛ. Διαπιστώθηκε, από τις στατιστικές αναλύσεις που διενεργήθηκαν, ότι η παρουσία θετικών λεμφαδένων επηρέαζε δυσμενώς την ΕΥΕ και ΣΕ, αυξάνοντας τον σχετικό κίνδυνο (HR) στην πολυπαραγοντική ανάλυση κατά 4.81 στην ΕΥΕ και 5.69 στην ΣΕ. Από τα άλλα παθολογοανατομικά χαρακτηριστικά του όγκου, μόνο η εντόπιση του νεοπλάσματος εμφάνισε ανεξάρτητη προγνωστική αξία με την ΕΥΕ και ΣΕ, ενώ η ΤΝΜ σταδιοποίηση, εμφάνισε ισχυρή τάση μόνο με την ΕΥΕ στην μονοπαραγοντική ανάλυση. Η αντιμετώπιση του προχωρημένου ΚΛ αποτελεί παράδειγμα μετατόπισης θεραπείας-γεγονός το οποίο συνέβη τις τελευταίες δύο δεκαετίες-με την αύξηση της χρήσης της χημειοακτινοθεραπείας (ΧΜΘ-ΑΚΤ) και μείωσης της πρωτογενούς χειρουργικής αντιμετώπισης (181, 201, 212, 213). Το ενδιαφέρον στη χρήση εισαγωγικής ΧΜΘ-ΑΚΤ στον καρκίνο της κεφαλής και του τραχήλου επικυρώθηκε από τη προοπτική, τυχαιοποιημένη και ελεγχόμενη κλινική δοκιμή ορόσημο «Veterans Affairs (VA) Laryngeal Cancer Study Group» το 1991, η οποία έδειξε ότι η διατήρηση του οργάνου σε ασθενείς με προχωρημένο ΚΛ, θα μπορούσε να επιτευχθεί με τη χορήγηση ΧΜΘ-ΑΚΤ, χωρίς να θέτει σε κίνδυνο την επιβίωση των ασθενών (214). Η ολοένα και ευρύτερη χρήση της εισαγωγικής ΧΜΘ-ΑΚΤ έδωσε στη συνέχεια το έναυσμα της χρήσης σχημάτων συνδυασμένης ΧΜΘ- ΑΚΤ με βάση τα αποτελέσματα της RTOG μελέτης (Radiation Therapy Oncology Group Trial 91-11), που έδειξαν μείωση των απομακρυσμένων μεταστάσεων και αύξηση της ΕΥΕ (182, 215). Τα παραπάνω κλινικά δεδομένα έχουν επηρεάσει τα τελευταία χρόνια την θεραπευτική αντιμετώπιση, οδηγώντας σε αύξηση της χρήσης της ΧΜΘ-ΑΚΤ και αντίστοιχα μείωση της ολικής λαρυγγεκτομής (ΟΛ). Στη μελέτη μας η ΟΛ ήταν η πιο συχνή θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών (87.7%) και διενεργήθηκε στην πλειονότητα των όγκων σταδίου Τ3-Τ4a (96.5%). Στους ασθενείς με όγκους T1-T2, η θεραπευτική αντιμετώπιση ήταν πιο συντηρητική, με το 67.6% αυτών να έχουν υποστεί ΟΛ (p<0.001). Η ΟΛ ήταν πιο συχνή και στους όγκους σταδίου κατά ΤΝΜ ΙΙΙ-IVa έναντι των όγκων σταδίου II-II (95.3% έναντι 69.4%, p<0.0001). Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, διαπιστώθηκε ότι οι 83

84 ασθενείς με ΟΛ εμφάνιζαν μειωμένο κατά το μισό, σε σχέση με αυτούς που αντιμετωπίσθηκαν συντηρητικότερα, σχετικό κίνδυνο υποτροπής της νόσου, ενώ η ΕΥΕ, στην ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, ήταν επίσης σημαντικά καλύτερη. Η ΟΛ δεν παρέμεινε σημαντική στην πολυπαραγοντική ανάλυση, εύρημα που είναι συχνό στην βιβλιογραφία (80). Επιπρόσθετα, οι ασθενείς που αντιμετωπίσθηκαν με ΟΛ εμφάνισαν καλύτερη ΕΥΕ από τους ασθενείς που χορηγήθηκε προεγχειρητική ΑΚΤ. Η απορρύθμιση των υποδοχέων της οικογένειας HER διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση (216) και η έρευνα στους μηχανισμούς που επιδρούν, οδήγησε στην δημιουργία ειδικών μορίων που κατευθύνονται έναντι δύο μελών της οικογένειας HER, τον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR /HER1) και τον HER2/ErbB2 και χρησιμοποιούνται τα τελευταία χρόνια στην αγωγή έναντι του καρκίνου (217, 218). Μεταλλάξεις και/ή υπερέκφραση αυτών των υποδοχέων οδηγούν στην συνεχή ενεργοποίηση μορίων, συχνά αλληλεπικαλυπτόμενων, που επιδρούν σε σημαντικές οδούς ενδοκυττάριας σηματοδότησης και κυρίως στον άξονα PI3K-Akt, με αποτέλεσμα την επιβίωση και ανάπτυξη της νεοπλασίας. Πολυάριθμες φαρμακευτικές προσεγγίσεις, που χρησιμοποιούν φάρμακα που στοχεύουν μέλη της οικογένειας HER, έχουν αναπτυχθεί για τη θεραπεία διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων και περισσότερο από δέκα φαρμακευτικοί παράγοντες είναι σε κλινικές μελέτες (219). Αντι-EGFR παράγοντες, είτε με τη μορφή αντισώματος (Cetuximab, Panitumumab) ή με τη μορφή αναστολέων τυροσινικής κινάσης του υποδοχέα (Erlotinib, Gefitinib), έχουν εγκριθεί τα τελευταία χρόνια για τη θεραπεία του καρκίνου παχέος εντέρου, του μη μικροκυτταρικού καρκινώματος του πνεύμονα, του καρκίνου κεφαλής-τραχήλου και του καρκίνου παγκρέατος είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία-ακτινοθεραπεία ( ). Λόγω του περιορισμένου κλινικού οφέλους των σημερινών αντι-egfr θεραπειών-τα ποσοστά ανταπόκρισης σε μονοθεραπεία με τους παράγοντες αυτούς κυμαίνονται στο 10%- και ως εκ τούτου η καλύτερη κατανόηση της δράσης των μελών της οικογένειας HER, είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων φαρμάκων για τους ασθενείς με καρκίνο. Σημαντικό μόριο της οικογένειας HER, αποτελεί ο HER3, η ακριβής λειτουργική σημασία του οποίου στον ανθρώπινο καρκίνο παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη έως τώρα. Υπάρχουν σαφείς μηχανιστικές και πειραματικές αποδείξεις που υποστηρίζουν τις ογκογόνες λειτουργίες του σε υποσύνολα καρκινωμάτων του μαστού και των πνευμόνων, καθώς και στοιχεία με περισσότερο υποθετικά, περιγραφικά, και μερικές φορές αντικρουόμενα ευρήματα σε άλλους τύπους καρκίνου (101). 84

85 Πειραματικές αποδείξεις έχουν καθιερώσει τον κρίσιμο ρόλο της HER3 πρωτεΐνης ως συν-υποδοχέα για την υπερέκφραση της HER2 πρωτεΐνης, που συχνά εμφανίζονται σε καρκίνους του μαστού (223), αλλά και σε άλλους τύπου όγκων (101). Παρά το γεγονός ότι ο HER3 υποδοχέας δεν έχει την δυνατότητα αυτομετασχηματισμού και ενεργοποίησης, τα ετεροδιμερή του είναι εξαιρετικά ενεργά, με χαρακτηριστικό παράδειγμα το ετεροδιμερές HER2-HER3. Έχει φανεί ότι η έκφραση του HER3 είναι ρυθμο-περιοριστική για την HER2- προκλητή ανάπτυξη του νεοπλάσματος και αν η έκφραση του HER3 αποσιωπηθεί, οι HER2- ενισχυμένοι όγκοι παύουν να αναπτύσσονται και υφίστανται απόπτωση (224, 225). Θεραπεία των HER2 ενισχυμένων καρκίνων του μαστού με αναστολείς τυροσινικής κινάσης (Tyrosine Kinase Inhibitors/ΤΚΙs) οδηγεί σε ταχεία αντισταθμιστική αύξηση της έκφρασης του HER3, του εντοπισμού, και της σηματοδοτικής δραστηριότητας του, αποκαλύπτοντας μία σημαντική αποθεματική ικανότητα που ενσωματώνεται στο σύμπλεγμα σηματοδότησης HER2-HER3 (226), γεγονός που την καθιστά ιδιαίτερα ανθεκτική στις αντικαρκινικές θεραπείες (103). Τα παραπάνω δείχνουν την σημασία της HER3 τόσο ως ενεργοποιητή της HER2 κινάσης, όσο και ως υπόστρωμα σηματοδότησης με λειτουργίες σε ανώτερο ή κατώτερο επίπεδο της HER2 και την καθιστούν σημαντικό στόχο μελλοντικών φαρμακοθεραπευτικών. Σημαντικό ρόλο φαίνεται ότι έχει ο HER3 υποδοχέας και με την δράση του EGFR σε ένα υποσύνολο των καρκίνων του πνεύμονα. Σε μελέτη σύγκρισης κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα οι οποίες ήταν ευαίσθητες ή ανθεκτικές στον EGFR TKI Gefitinib, ο καλύτερος δείκτης ευαισθησίας στο Gefitinib φαίνεται να ήταν η εξαρτώμενη από τον HER3 ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ οδού σηματοδότησης (227). Αυτή η EGFR-HER3 αλληλεξάρτηση φαίνεται σε καρκινικούς τύπους κυττάρων που εμφανίζουν μεταλλάξεις που ενεργοποιούν τον EGFR καθώς και «wild-type» EGFR, αποκαλύπτοντας ένα κεντρικό ρόλο για την EGFR- HER3 εξαρτώμενη σηματοδότηση σε αυτή τη νόσο. Η θεραπεία ασθενών με gefitinib είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική σε αυτή την ειδική ομάδα, αν και η ανάπτυξη της επίκτητης αντοχής είναι καθολική. Αν και φαρμακευτική αντίσταση αναπτύσσεται συνήθως ως αποτέλεσμα δευτερευόντων μεταλλάξεων εντός του τομέα της κινάσης του EGFR, η αντίσταση μπορεί επίσης σπάνια να αναπτυχθεί και μέσα από την υπερδραστηριότητα του πρωτο-ογκογονιδίου c-μετ και της c-μετ-εξαρτώμενης φωσφορυλίωσης του HER3, τονίζοντας έτσι περαιτέρω τον κεντρικό ρόλο της HER3 πρωτεΐνης στην παθογένεση στον καρκίνο του πνεύμονα (104). Αρκετές μελέτες που εξετάζουν την έκφραση του HER3 υποδοχέα έχουν δημοσιευθεί τα τελευταία χρόνια, δημιουργώντας πλήθος, σε μεγάλο βαθμό αντικρουόμενων και 85

86 συνολικά αμφίβολων αποτελεσμάτων [άρθρο ανασκόπηση από τον Campbell et al. (101)]. Ωστόσο, μια πρόσφατη πειραματική μελέτη σε ποντίκια, ανέδειξε, ότι η απώλεια του HER3 στο εντερικό επιθήλιο, οδηγεί στην συνακόλουθη απώλεια του HER4 και αναστολής της ογκογένεσης σε πρότυπο καρκινογένεσης ApcMin ποντικών, μέσω μείωσης της σηματοδότησης της PI3K/AKT οδού (228). Αν αυτά τα αποτελέσματα είναι αναπαραγώγιμα σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου θα δημιουργήσουν ένα νέο πεδίο έρευνας στον τύπο αυτό της νεοπλασίας. Στη μελέτη μας παρατηρήσαμε έκφραση του HER3, με κυρίως κυτταροπλασμική και σπανιότερα πυρηνική εντόπιση, στο 52.5 % των όγκων. Η ένταση της χρώσης ήταν κυρίως μέτρια και εκτεταμένη. Προγνωστική αξία του HER3 δεν ανευρέθη, ενώ αναδείχθηκε θετική συσχέτιση με την ηλικία, αρνητική με την χορήγηση προεγχειρητικής ακτινοθεραπείας, οριακά θετική συσχέτιση με την διήθηση του χόνδρου και ισχυρή θετική τάση με το κάπνισμα. Η έκφραση του HER3 ήταν λιγότερη συχνή στους HPV θετικούς όγκους (p=0.032). Μόλις δύο έως τώρα μελέτες έχουν διερευνήσει την έκφραση του HER3 στον ΚΛ (32, 100). Στην μελέτη των Wei et al. παρατηρήθηκε έκφραση του HER3 στο 67% (20/30) των όγκων που μελετήθηκαν, με κυτταροπλασμική εντόπιση και έντονη έκφραση στο 27% αυτών. Σε αντίθεση, στη μελέτη των Takikita et al., η έκφραση του HER3 ήταν σημαντικά υψηλότερη και έφθανε το 78.7 % (144/183) των περιπτώσεων ΚΛ. Αξίζει να σημειωθεί ότι στην τελευταία μελέτη, χρησιμοποιώντας διαφορετικό κλώνο από αυτόν των Wei et al., και της δικιάς μας μελέτης, παρατήρησαν και μεμβρανική έκφραση του HER3 στο 10.4% (19/183) περιπτώσεων ΚΛ. Τα αποτελέσματα μας διαφέρουν σημαντικά και από τις δύο παραπάνω αναφερόμενες μελέτες. Ανάλογα ευρήματα με τα δικά μας παρατηρούνται στην πλειονότητα των έως τώρα μελετών σε άλλους τύπους καρκίνων. Ειδικότερα, στον καρκίνο του οισοφάγου έχει αναφερθεί έκφραση του HER3 στο 50-64% των όγκων (229, 230), στον ωοθηκικό καρκίνο στο 3-53% ( ), στο 3-89% των καρκινωμάτων του παχέος εντέρου (234, 235), στον γαστρικό καρκίνο μεταξύ 14-70% (121, 127), στον καρκίνο του πνεύμονα μεταξύ 18-49% (120, 236) και στον καρκίνο του μαστού μεταξύ % (118, 119). Φαίνεται ότι το επίπεδο της φωσφορυλίωσης και η δραστικότητα της HER3 πρωτεΐνης σχετίζονται με παρουσία της HER3 στην κυτταρική μεμβράνη και τους συνδέτες όπως οι NRGs που ενδέχεται να επηρεάζουν την κατανομή της HER3, αυξάνοντας τη μεμβρανική της έκφραση (226). Κατά συνέπεια, η επιπτώσεις της HER3 στην κλινική έκβαση μπορούν να εκτιμηθούν καλύτερα, όταν λάβει κανείς υπόψη όχι μόνο την έκφραση της, αλλά και την ενδοκυττάρια κατανομή του υποδοχέα, όπως επίσης και τα επίπεδα έκφρασης των συνδετών του HER3. 86

87 Τα δεδομένα στην διεθνή βιβλιογραφία για τη μελέτη του γονιδίου HER3 είναι ελάχιστα, με δύο συνολικά μελέτες στην βιβλιογραφία, που έγιναν σε καρκίνο του μαστού (119) και σε κυτταρικές σειρές μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (237). Η μελέτη μας αποτελεί την πρώτη στην διεθνή βιβλιογραφία η οποία μελέτησε την κατάσταση του γονιδίου HER3 στον ΚΛ και σε καρκίνο της κεφαλής και τραχήλου γενικότερα. Ενίσχυση του γονιδίου HER3 ανευρέθη στο 5% των όγκων. Το αξιοσημείωτο είναι ότι σε καμία περίπτωση δεν ανευρέθησαν σωροί γονίδιων, αλλά αυξημένος αριθμός γονιδιακών αντιγράφων, τα οποία έφθαναν έως και τα επτά ανά κύτταρο, εύρημα που έχει παρατηρηθεί και στον καρκίνο του μαστού (119). Συν-ενίσχυση του HER2 ανευρέθη σε 2/5 όγκους, ενώ αυξημένη έκφραση του Ki67 σε 4/5 όγκους και της TopoIIa σε 2/5. Επιπρόσθετα, σε όλες τις περιπτώσεις με ενίσχυση του HER3 παρατηρήθηκε και επαύξηση του κεντρομεριδίου ( 3 αντίγραφα/κύτταρο). Η επαύξηση του CEP12 ήταν υψηλή - καταμετρήθηκε στο >50% των όγκων (57%) συχνότερα σε όγκους με υψηλό δείκτη Ki67 (61%) και έκφραση της TopoIIa (60%). Η επαύξηση που παρατηρήσαμε ήταν σημαντικά υψηλότερη από την μελέτη των Poetsch και συν., όπου παρατηρήθηκε με FISH στο 10% των ΚΛ (238). Όπως ήταν αναμενόμενο το HER3, λόγω του μικρού αριθμού περιστατικών με ενίσχυση, δεν συσχετίσθηκε με την πρόγνωση, αλλά και με την έκφραση του υποδοχέα. Τα ευρήματα μας δείχνουν ότι η έκφραση του υποδοχέα ήταν ανεξάρτητη της γονιδιακής κατάστασης του HER3 και ότι η ενίσχυση του, είναι πιθανότερο να οφείλεται στην συχνή ανευπλοειδία των ΚΛ. Απώλεια του γονιδίου PTEN αναδείχθηκε στο 1/5 των όγκων, κυρίως σε καλήςμέτριας ΙΒΔ, μεγέθους 3 εκ, σταδίου T3+T4a, χωρίς λεμφαδενική μετάσταση και σταδίου κατά AJCC III+IVA. Η πλειονότητα των όγκων με απώλεια του γονιδίου PTEN εντοπίζονταν στην γλωττίδα και πολύ σπάνια υπεργλωττιδικά (p=0.04). Αν και στην μονοπαραγοντική ανάλυση η απώλεια του PTEN εμφάνισε ελαφρώς αυξημένο HR, σε σχέση με την ΕΥΕ και ΣΕ (HR: 1.05 και 1.34 αντίστοιχα), δεν εμφάνισε προγνωστική αξία. Παρόμοια εικόνα παρατηρήθηκε και στην ανάλυση επιβίωσης Kaplan-Meier, όπου οι ασθενείς με απώλεια εμφάνιζαν συχνότερες υποτροπές και ελαφρώς μειωμένη επιβίωση, χωρίς όμως να παρατηρηθεί στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων (p>0.05). Το 88% των όγκων με PTEN γονιδιακή απώλεια δεν εξέφραζαν την αντίστοιχη πρωτεΐνη (p=0.097). Η απώλεια της PTEN πρωτεΐνης ήταν υψηλή στη μελέτη μας και παρατηρήθηκε στο 71% των όγκων, πιο συχνά σε όγκους καλής-μέτριας ΙΒΔ, μεγέθους 3 εκ, σταδίου T3+T4a, Ν0, και σταδίου κατά AJCC III+IVA. Ωστόσο, η απώλεια αυτή δεν 87

88 συσχετίσθηκε με την πρόγνωση, καθώς και με κάποιο άλλο κλινικοπαθολογοανατομικό δείκτη. Τα έως τώρα βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν το PTEN στον ΚΛ είναι πτωχά. Στην μελέτη των Guney et al., (239) παρατηρήθηκε στο 73% (22/30) των ΚΛ, μειωμένη έκφραση του PTEN σε σχέση με το παρακείμενο φυσιολογικό επιθήλιο, κυρίως σε όγκους με μη υπεργλωττιδική εντόπιση, όπως και στην δικιά μας μελέτη, ενώ στη μελέτη του Snietura et al., μειωμένη PTEN έκφραση στο 62.2% των ΚΛ (240). Σε αντίθεση με τα παραπάνω, στη μελέτη του Sullu et al., διαπιστώθηκε έντονη έκφραση του PTEN στο 50.7% (71/140) των ΚΛ (156). Ο Pattje et al., εμφάνισαν στη μελέτη τους, που αφορούσε καρκινώματα από πλακώδες επιθήλιο κεφαλής και τραχήλου, έκφραση του PTEN στο 31% των όγκων, η οποία συσχετίσθηκε με αύξηση των τοπικών υποτροπών (158), ενώ, έδειξαν in vitro, ότι η υπερέκφραση του PTEN στην κυτταρική σειρά Hek293, σχετίζονταν με αυξημένη αντίσταση στην ακτινοβολία, πιθανότατα μέσω υπερέκφρασης του Rad51 και ενεργοποίησης της Akt οδού σηματοδότησης. Η απώλεια του PTEN, όπως αναφέρθηκε και στο γενικό μέρος, είναι αποτέλεσμα κυρίως μεταλλάξεων, γονιδιακής απώλειας και υπερμεθυλίωσης του προαγωγέα. Η απώλεια του PTEN έχει συσχετισθεί με πτωχή επιβίωση στον καρκίνο του προστάτη (241), αντίσταση στην θεραπεία με trastuzumab στον καρκίνο του μαστού (242), ενώ στον καρκίνο του παχέος εντέρου η γονιδιακή κατάσταση του PTEN, φαίνεται να αποτελεί δείκτη ανταπόκρισης ή/και επιβίωσης σε ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με cetuximab (152, 243). Στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα η απώλεια της PTEN πρωτεΐνης έχει συσχετισθεί με αντίσταση στους αναστολείς του EGFR gefitinib και erlotinib (244, 245). Στην πρόσφατη προοπτική μελέτη του Snietura et al., αναδείχθηκε ότι οι ασθενείς με υψηλή έκφραση του PTEN, στους οποίους χορηγήθηκε εντατικοποιημένη ακτινοθεραπεία, εμφάνισαν καλύτερη πρόγνωση από αυτούς με χαμηλή έκφραση του PTEN, που αντιμετωπίσθηκαν με κλασικό ακτινοθεραπευτικό σχήμα (240). Ο μόνος βιολογικός δείκτης που εμφάνισε ανεξάρτητη προγνωστική αξία στη μελέτη μας ήταν η Topoisomerase IIa (TopoIIa). Χρησιμοποιώντας ως θετικότητα την έκφραση στο >10% του νεοπλασματικού πληθυσμού αναδείχθηκαν 78/118 (66%) θετικές περιπτώσεις ΚΛ. Η έκφραση αυτή σχετίσθηκε με αυξημένο ποσοστό διήθησης των παραγλωττιδικών χώρων και υποτροπών από τη νόσο. Θετική συσχέτιση αναδείχθηκε με τον δείκτη Ki67 (p=0.003), θετική ισχυρή τάση με τα χαμηλού ΙΒΔ νεοπλάσματα και αρνητική τάση με την PTEN πρωτεΐνη. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι εξέφραζαν την TopoIIa εμφάνισαν στην μονοπαραγοντική ανάλυση, στατιστικά σημαντικό αυξημένο σχετικό κίνδυνο (HR: 1.24, 88

89 95% CI: , p=0.020) σε σχέση με την ΕΥΕ και ισχυρή τάση με την ΣΕ (HR: 1.81, 95% CI: , p=0.066). Παρόμοια στην ανάλυση Kaplan-Meier, οι ασθενείς με θετική TopoIIa, εμφάνισαν βραχύτερη ΕΥΕ (p=0.018) και ΣΕ (p=0.062). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, παρέμεινε η προγνωστική αξία της TopoIIa, στην ΣΕ (HR: 2.05, 95% CI: , p=0.018), ενώ ήταν οριακά σημαντική και η συσχέτιση της με την ΕΥΕ (HR: 1.93, 95% CI: , p=0.049). Η έκφραση της TopoIIa, δεν σχετίσθηκε με την κατάσταση του γονιδίου, το οποίο εμφάνισε ενίσχυση σε 2/118 (1.7%) όγκους. Τα αποτελέσματα μας είναι σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη στον ΚΛ, όπου η TopoIIa αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος αρνητικός προγνωστικός δείκτης, σε σχέση με την ΕΥΕ, ενώ σχετίσθηκε επίσης και με τον χαμηλό ΙΒΔ (246). Στην μελέτη του Deng et al., η έκφραση της TopoIIa σχετίσθηκε μόνο με τον ΙΒΔ, ενώ ο λόγος TopoIIa/Ki67 με την λεμφαδενική μετάσταση (247). Τέλος, σε άλλη μελέτη, η έκφραση της TopoIIa ήταν υψηλότερη στα σταδίου Τ3 ΚΛ και σε όγκους που υποτροπίασαν, χωρίς όμως οι διαφορές αυτές να είναι στατιστικά σημαντικές (248). Η εκτεταμένη έρευνα της βιβλιογραφίας που πραγματοποιήσαμε δεν ανέδειξε μελέτη που να διερεύνησε το TOP2A γονίδιο στον ΚΛ, με αποτέλεσμα τα ευρήματα FISH της μελέτη μας να είναι τα μοναδικά έως τώρα και μη συγκρίσιμα. Διαπιστώσαμε πολύ χαμηλό ποσοστό ενίσχυσης του TOP2A στους όγκους που εξετάσαμε (1.7%), χαμηλή επαύξηση σε 23/118 (19.5%) περιπτώσεις και απουσία απώλειας. Τόσο η ενίσχυση, όσο και η επαύξηση του TOP2A γενικότερα, δεν σχετίσθηκαν με κάποιο κλινικοπαθολογοανατομικό δείκτη. Συνενίσχυση του HER2 παρατηρήθηκε και στις δύο περιπτώσεις με ενίσχυση του TOP2A, εύρημα που είναι συχνό στον καρκίνο του μαστού (172). Το γενετικό προφίλ του καρκινώματος της κεφαλής και τραχήλου από πλακώδη κύτταρα είναι εξαιρετικά σύνθετο, με αμφότερες απώλειες και επαυξήσεις του DNA σε όλο το γονιδίωμα. Ο μέσος αριθμός των ανωμαλιών που ανιχνεύονται με CGH είναι 16 στον ΚΛ, αριθμός αρκετά υψηλότερος όταν συγκριθεί με τον ορθοκολικό καρκίνο, όπου παρατηρούνται κατά μέσο όρο οκτώ και με τον καρκίνο του πνεύμονα, που παρατηρούνται 11 ανωμαλίες αντίστοιχα (249). Στον ΚΛ, η βιβλιογραφία είναι μικρή και έχουν αναφερθεί απώλειες τμημάτων των χρ.3, 9, 10 και 18, ενώ οι επαυξήσεις αφορούν συχνότερα τμήματα στα χρ.3, 8, 11, 17 και 18 (33). Η ανευπλοειδία του χρωμοσώματος 17 στον ΚΛ έχει διερευνηθεί κυρίως με την μέθοδο CGH (33, 34, 250) και FISH (251, 252) και σπανιότερα με PCR (253). Οι απώλειες αφορούν συχνά την περιοχή 17p13.1, όπου εδράζεται το TP53 γονίδιο (253), ενώ η επαύξηση του CEP17 είναι επίσης συχνή και κυμαίνεται έως και 83% (251). Στην παρούσα μελέτη ανευρέθει επαύξηση του CEP17 στο 12% των ΚΛ. Η επαύξηση 89

90 αυτή εμφάνισε θετική σχέση με το κάπνισμα, αρνητική σχέση με την λεμφαδενική μετάσταση, ενώ δεν διαπιστώθηκε προγνωστική αξία με την ΕΥΕ και ΣΕ. 90

91 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η μελέτη μας είναι η πρώτη στην ελληνική και διεθνή βιβλιογραφία που μελέτησε την σύγχρονη παρουσία των HER3, PTEN και TopoIIa, σε επίπεδο πρωτεΐνης και γονιδίου, στον ΚΛ και ανέλυσε τα ευρήματα και τη σχέση τους με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά, την ΕΥΕ, την ΣΕ, και την θεραπεία. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο ΤΜΑ, μειώνοντας σημαντικά το κόστος και χρόνο διεκπεραίωσης της. Από τις αναλύσεις των αποτελεσμάτων παρατηρήθηκαν τα εξής: 1. Δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες της ΕΥΕ στην ανάλυση Kaplan-Meier αναδείχθηκαν οι: κατάχρηση αλκοόλης, ιστολογική διαφοροποίηση, στάδιο (T) του όγκου, λεμφαδενική διήθηση και ο συνδυασμός ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας. 2. Η χειρουργική θεραπεία ήταν ευνοϊκός προγνωστικός δείκτης της ΕΥΕ σε σχέση με την ΧΜΘ-ΑΚΤ. 3. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η εντόπιση του όγκου, σχετίσθηκε με μειωμένο κίνδυνο για την ΕΥΕ και ΣΕ, ενώ η διήθηση των χειρουργικών ορίων ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μόνο για την ΣΕ 4. Η λεμφαδενική διήθηση (Ν+), ήταν ο σημαντικότερος ανεξάρτητος δυσμενής προγνωστικός δείκτης για την ΕΥΕ και ΣΕ. 5. Η έκφραση της TopoIIa αναδείχτηκε ως ανεξάρτητος δυσμενής παράγοντας με την ΕΥΕ και ΣΕ. 6. H συχνή έκφραση του HER3 υποδοχέα στη μελέτη μας, ήταν ανεξάρτητη της γονιδιακής κατάστασης του HER3 και ότι η γονιδιακή ενίσχυση που παρατηρήσαμε, είναι πιθανότερο να οφείλεται στην συχνή ανευπλοειδία των ΚΛ. 7. Η απώλεια της PTEN πρωτεΐνης είναι συχνή σε προχωρημένου ΤΝΜ και AJCC σταδίου ΚΛ και ανεξάρτητη από την απώλεια του αντίστοιχου γονιδίου. 8. Τα ΚΛ εμφανίζουν συχνά επαύξηση των CEP17 και CEP12, προφανώς στα πλαίσια της αυξημένης γονιδιακής αστάθειας που τα χαρακτηρίζει. 91

92 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ο καρκίνος του λάρυγγα (ΚΛ) αποτελεί το συχνότερο νεόπλασμα της κεφαλής και τραχήλου και χαρακτηρίζεται από τοπική επιθετικότητα. Η πλειονότητα των ΚΛ αφορούν καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα και είναι ο συχνότερος κακοήθης όγκος του λάρυγγα, του φάρυγγα και της τραχείας. Η πλειονότητα των καρκινωμάτων του λάρυγγα αφορά την υπεργλωττιδική και γλωττιδική μοίρα του λάρυγγα. Οι σημαντικότεροι αιτιολογικοί παράγοντες είναι το κάπνισμα και η κατάχρηση αλκοόλης. Η έκθεση σε αρωματικούς υδρογονάνθρακες, το τσιμεντοκονίαμα σε ρινίσματα μετάλλων, οι αναθυμιάσεις πετρελαίου, τα αέρια μουστάρδας και ο ιός του θηλώματος του ανθρώπου θεωρούνται επίσης παράγοντες που συμβάλλουν στην ανάπτυξη του λαρυγγικού καρκινώματος. Σημαντικοί προγνωστικοί παράγοντες του ΚΛ αποτελούν η χαμηλή διαφοροποίηση του όγκου, η λεμφαδενική μετάσταση, τα υγιή χειρουργικά όρια, η ΤΝΜ και AJCC σταδιοποίηση. Πολλοί βιολογικοί δείκτες έχουν μελετηθεί στον ΚΛ, χωρίς όμως ισχυρή ανεξάρτητη προγνωστική αξία. Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να μελετηθούν, σε όγκους ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για εξαιρέσιμο καρκίνο του λάρυγγα, τα μόρια HER3, PTEN και TopoIIa σε επίπεδο πρωτεΐνης, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας και σε επίπεδο DNA με τον φθορίζοντα επιτόπιο (in situ) υβριδισμό (FISH) και να διερευνηθεί η πιθανή προγνωστική σημασία τους. Επιπρόσθετα, για την καλύτερη μελέτη της βιολογίας των νεοπλασμάτων, μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά και οι πρωτεΐνες HER1/EGFR, HER2, Ki67 και HPV. Η μελέτη ανέλυσε όγκους 122 ασθενών με διηθητικό καρκίνωμα λάρυγγα. Δημιουργήθηκαν μικροσυστοιχίες ιστικών κυλίνδρων στις οποίες εφαρμόσθηκαν οι ειδικές μέθοδοι. Η μελέτη συμπεριέλαβε 122 ασθενείς εκ των οποίων 2 ήταν γυναίκες, με μέση ηλικία τα 65.5 έτη. Ενεργοί καπνιστές ήταν το 81.2% των ασθενών, ενώ ιστορικό κατάχρησης αλκοόλης αναφέρθηκε από το 77.9%. Η πλειονότητα των όγκων (98.4%) αφορούσε καρκινώματα από πλακώδη κύτταρα. Το 57.4% των καρκινωμάτων εντοπίζονταν στις φωνητικές χορδές και τα χειρουργικά όρια ήταν διηθημένα σε 10/122 (8.2%) περιπτώσεις. Κλινικά και ακτινολογικά θετικοί επιχώριοι λεμφαδένες ανευρέθησαν σε 13 ασθενείς (10.7%). Το 69.7% των ασθενών είχαν τοπικά προχωρημένη νόσο, σταδίου T3-4 ενώ το 70.5% εμφάνιζε προχωρημένο στάδιο (III-IVΑ). Η πλειοψηφία των ασθενών είχε αντιμετωπισθεί με ολική λαρυγγεκτομή (87.7%). Προεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία έλαβε το 23.8% των ασθενών, ενώ μετεγχειρητική εξωτερική ακτινοθεραπεία το 22.1% των 92

93 ασθενών. Σε 2 ασθενείς χορηγήθηκε ταυτόχρονη ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία. Δεκαέξι ασθενείς (13.1%) εμφάνισαν χειρουργικές επιπλοκές. Υποτροπές της νόσου παρατηρήθηκαν συνολικά σε 50/122 (41%) ασθενείς, με την πλειοψηφία να αφορά τοπικές υποτροπές (86%). Η μέση και η 3-ετής ελεύθερη νόσου επιβίωση (ΕΥΕ) ήταν 81 μήνες (95% CI ) και 58.5% αντίστοιχα, ενώ η 5-ετής ΕΥΕ 51.4%. Η μέση και 3-ετής συνολική επιβίωση (ΣΕ) ήταν μήνες (95% CI ) και 67% αντίστοιχα, ενώ η 5-ετής ΣΕ 59.8%. Έκφραση της HER3 πρωτεΐνης παρατηρήθηκε στο 52.5%, του PTEN στο 29.2% και της TopoIIα στο 66.1% των όγκων που μελετήθηκαν αντίστοιχα. Ενίσχυση του γονιδίου HER3 ανευρέθη στο 4.2%, του TOP2A γονιδίου στο 1.7% και απώλεια του γονιδίου PTEN στο 16.4% των μελετημένων περιπτώσεων. H συχνή έκφραση του HER3 υποδοχέα στους όγκους της μελέτη μας, ήταν ανεξάρτητη της γονιδιακής κατάστασης του HER3, εύρημα που δείχνει ότι η γονιδιακή ενίσχυση που παρατηρήσαμε, είναι πιθανότερο να οφείλεται στην συχνή ανευπλοειδία των ΚΛ. Η απώλεια της PTEN πρωτεΐνης είναι συχνή σε προχωρημένου ΤΝΜ και AJCC σταδίου ΚΛ και ανεξάρτητη από την απώλεια του αντίστοιχου γονιδίου. Οι ΚΛ εμφανίζουν συχνά επαύξηση των CEP17 και CEP12, προφανώς στα πλαίσια της αυξημένης γονιδιακής αστάθειας που τους χαρακτηρίζει. Δυσμενείς προγνωστικοί δείκτες της ΕΥΕ στην ανάλυση Kaplan-Meier αναδείχθηκαν οι: κατάχρηση αλκοόλης, ιστολογική διαφοροποίηση, στάδιο (T) του όγκου, λεμφαδενική διήθηση και ο συνδυασμός ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας, ενώ ευνοϊκοί δείκτες η ολική λαρυγγεκτομή και η χειρουργική επέμβαση. Οι όγκοι που εξέφραζαν την TopoIIa εμφάνισαν μικρότερη ΕΥΕ σε σχέση με τους αρνητικούς ασθενείς, ενώ η ΣΕ ήταν επίσης μειωμένη στην ομάδα ασθενών με θετική την TopoIIa, χωρίς όμως να εμφανίζει ισχυρή συσχέτιση. Οι υπόλοιποι ΑΙΧ και FISH δείκτες δεν εμφάνισαν στατιστική σημαντικότητα. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση προέκυψαν ότι η κατάχρηση αλκοόλης, η ύπαρξη διηθημένων λεμφαδένων (Ν+) και η έκφραση της TopoIIa αποτελούσαν αρνητικούς ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες για την ΕΥΕ και τη ΣΕ. Η μη γλωττιδική εντόπιση, σχετίσθηκε με μειωμένο κίνδυνο για την ΕΥΕ και ΣΕ, ενώ η διήθηση των χειρουργικών ορίων ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μόνο για την ΣΕ. 93

94 SUMMARY Cancer of the larynx (CL) is the most common neoplasm of the head and neck and is characterized by local aggressiveness. The majority of CL is squamous cell carcinomas and is the most common malignant tumor of larynx, pharynx and trachea. The majority of CLs is located in the glottic and superglottic region. The major causative factors are smoking and alcohol abuse. Exposure to aromatic hydrocarbons, cement, oil fumes, mustard gases and human papilloma virus are also factors contributing to the development of laryngeal carcinoma. Significant predictors of CL are the poor differentiation of the tumor, lymph node metastasis, clear surgical margins, the AJCC and TNM staging. Many biomarkers have been studied in CL, but without strong independent prognostic value in multivariate analysis. The aim of this thesis was to study, in tumors of patients who underwent surgery for resectable cancer of the larynx, the molecules HER3, PTEN and TopoIIa at the protein level by immunohistochemistry (IHC) method and at DNA level with fluorescent in situ hybridization (FISH) and to explore the possible prognostic significance. Additionally, we studied with IHC, the proteins HER1/EGFR, HER2, Ki67 and HPV. This study analyzed tumors from 122 patients with invasive CL. TMAs were created, in which were applied the specific methods. The study included 120 men and 2 women, with a mean age of 65.5 years. Active smokers were 81.2% of patients, while history of alcohol abuse was reported in 77.9%. The majority of tumors (98.4%) related to squamous cell carcinoma. The 57.4% of the tumors were located in the vocal chords and the surgical margins were invaded in 10/122 (8.2%) cases. Positive lymph nodes were found in 13 patients (10.7%). Locally advanced disease (stage T3-4) was found in 69.7% of patients, while 70.5% had advanced stage disease (III- IVA). The majority of patients were treated with total laryngectomy (87.7%). Preoperative external beam radiotherapy received 23.8% of patients, while postoperative external beam radiotherapy 22.1% of patients. Two patients received concomitant radiotherapy and chemotherapy. Sixteen patients (13.1%) had surgical complications. Relapses of the disease were observed in a total of 50/122 (41%) patients, with the majority concerning local recurrences (86%). The mean and 3-year disease-free survival (DFS) was 81 months (95% CI ) and 58.5% respectively, while the 5-year DFS was 51.4%. The median and 3- year overall survival (OS) was months (95% CI ) and 67% respectively, while the 5-year OS was 59.8%. 94

95 Expression of HER3 protein was observed in 52.5% of tumors, PTEN in 29.2% and 66.1% in TopoIIa tumors respectively. Amplification of HER3 gene was found in 4.2% of the cases, whereas 1.7%, of the cases showed TOP2A gene amplification. Finally, loss of PTEN gene was observed in 16.4% of the studied cases. The frequent expression of HER3 receptor in our cohort was independent of gene status, a finding that indicates that the observed gene amplification is likely to be due to frequent observed aneuploidy in CL. Loss of PTEN protein was common in advanced AJCC/TNM CL and independent of the corresponding gene loss. The CL often showed gains of CEP17 and CEP12, obviously as a phenomenon of increased genetic instability that characterizes these tumors. Kaplan-Meier analysis highlighted the following adverse prognostic indicators of DFS: alcohol abuse, histological differentiation, stage (T) of the tumor, lymph node metastasis and the combination of radiotherapy and chemotherapy, while favorable indicators were total laryngectomy and surgery. Patients whom tumors expressed TopoIIa, showed lower DFS compared to negative patients. The OS was also reduced in the group of patients with positive TopoIIa, but with a borderline significance. The remaining IHC and FISH markers were not significant. In the multivariate analysis independent predictors of DFS and OS were the lymphatic spread of the tumor (N+), alcohol abuse, TopoIIa expression and nonglottic tumor localization. Τhe infiltration of surgical margins showed negative predictive value only with the OS. 95

96 BΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Άγιος Ε. Αλ. Περιγραφική και εφαρμοσμένη ανατομική. 2 ος τόμος- Τα σπλάγχνα. Univeristy Studio Press, Θεσσαλονίκη, American Cancer Society.: Cancer Facts and Figures Atlanta, Ga: American Cancer Society, Available online. Last accessed September 24, Cardesa A, Gale N, Nadal A, Zidar N. World Health Organization Classification of Tumors. Head and Neck Tumors. Tumors of the Hypopharynx, Larynx and Trachea. Squamous Cell Carcinoma. IARC Press: Lyon DeRienzo DP, Greenberg SD, Fraire AE. Carcinoma of the larynx. Changing incidence in women. Archives of otolaryngology--head & neck surgery Jun;117(6): PubMed PMID: Barnes C, Sexton M, Sizeland A, Tiedemann K, Berkowitz RG, Waters K. Laryngopharyngeal carcinoma in childhood. International journal of pediatric otorhinolaryngology Oct 19;61(1):83-6. PubMed PMID: Ohlms LA, McGill T, Healy GB. Malignant laryngeal tumors in children: a 15-year experience with four patients. The Annals of otology, rhinology, and laryngology Sep;103(9): PubMed PMID: Greene FL. The American Joint Committee on Cancer: updating the strategies in cancer staging. Bulletin of the American College of Surgeons Jul;87(7):13-5. PubMed PMID: Olofsson J, Lord IJ, van Nostrand AW. Vocal cord fixation in laryngeal carcinoma. Acta oto-laryngologica Jun;75(6): PubMed PMID: Lee SS, Ro JY, Luna MA, Batsakis JG. Squamous cell carcinoma of the larynx in young adults. Seminars in diagnostic pathology May;4(2): PubMed PMID: Tuyns AJ, Esteve J, Raymond L, Berrino F, Benhamou E, Blanchet F, et al. Cancer of the larynx/hypopharynx, tobacco and alcohol: IARC international case-control study in Turin and Varese (Italy), Zaragoza and Navarra (Spain), Geneva (Switzerland) and Calvados (France). International journal of cancer Journal international du cancer Apr 15;41(4): PubMed PMID: Bosetti C, Garavello W, Gallus S, La Vecchia C. Effects of smoking cessation on the risk of laryngeal cancer: an overview of published studies. Oral oncology Oct;42(9): PubMed PMID:

97 12. Maier H, Tisch M. Epidemiology of laryngeal cancer: results of the Heidelberg casecontrol study. Acta oto-laryngologica Supplementum. 1997;527: PubMed PMID: Loria D, Barrios E, Zanetti R. Cancer and yerba mate consumption: a review of possible associations. Revista panamericana de salud publica = Pan American journal of public health Jun;25(6): PubMed PMID: Gillison ML, Koch WM, Capone RB, Spafford M, Westra WH, Wu L, et al. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. Journal of the National Cancer Institute May 3;92(9): PubMed PMID: Torrente MC, Rodrigo JP, Haigentz M, Jr., Dikkers FG, Rinaldo A, Takes RP, et al. Human papillomavirus infections in laryngeal cancer. Head & neck Apr;33(4): PubMed PMID: Nunez DA, Astley SM, Lewis FA, Wells M. Human papilloma viruses: a study of their prevalence in the normal larynx. The Journal of laryngology and otology Apr;108(4): PubMed PMID: Rihkanen H, Peltomaa J, Syrjanen S. Prevalence of human papillomavirus (HPV) DNA in vocal cords without laryngeal papillomas. Acta oto-laryngologica May;114(3): PubMed PMID: De Stefani E, Correa P, Oreggia F, Leiva J, Rivero S, Fernandez G, et al. Risk factors for laryngeal cancer. Cancer Dec 15;60(12): PubMed PMID: Bosetti C, La Vecchia C, Talamini R, Negri E, Levi F, Dal Maso L, et al. Food groups and laryngeal cancer risk: a case-control study from Italy and Switzerland. International journal of cancer Journal international du cancer Jul 20;100(3): PubMed PMID: Assimakopoulos D, Patrikakos G. The role of gastroesophageal reflux in the pathogenesis of laryngeal carcinoma. American journal of otolaryngology Nov- Dec;23(6): PubMed PMID: Freije JE, Beatty TW, Campbell BH, Woodson BT, Schultz CJ, Toohill RJ. Carcinoma of the larynx in patients with gastroesophageal reflux. American journal of otolaryngology Nov-Dec;17(6): PubMed PMID: Ferlito A, Rinaldo A. The pathology and management of subglottic cancer. European archives of oto-rhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino- Laryngological Societies. 2000;257(3): PubMed PMID:

98 23. Ferlito A, Recher G. Ackerman's tumor (verrucous carcinoma) of the larynx: a clinicopathologic study of 77 cases. Cancer Oct 1;46(7): PubMed PMID: Wain SL, Kier R, Vollmer RT, Bossen EH. Basaloid-squamous carcinoma of the tongue, hypopharynx, and larynx: report of 10 cases. Human pathology Nov;17(11): PubMed PMID: Wenig BM. Variants of squamous cell carcinoma of the upper aerodigestive tract. Anatomic pathology. 1998;3: PubMed PMID: MacMillan C, Kapadia SB, Finkelstein SD, Nalesnik MA, Barnes L. Lymphoepithelial carcinoma of the larynx and hypopharynx: study of eight cases with relationship to Epstein-Barr virus and p53 gene alterations, and review of the literature. Human pathology Nov;27(11): PubMed PMID: Tardio JC, Cristobal E, Burgos F, Menarguez J. Absence of EBV genome in lymphoepithelioma-like carcinomas of the larynx. Histopathology Feb;30(2): PubMed PMID: Mills SE, Cooper PH, Garland TA, Johns ME. Small cell undifferentiated carcinoma of the larynx. Report of two patients and review of 13 additional cases. Cancer Jan 1;51(1): PubMed PMID: Mallofre C, Cardesa A, Campo E, Condom E, Palacin A, Garin-Chesa P, et al. Expression of cytokeratins in squamous cell carcinomas of the larynx: immunohistochemical analysis and correlation with prognostic factors. Pathology, research and practice Apr;189(3): PubMed PMID: van der Velden LA, Schaafsma HE, Manni JJ, Ruiter DJ, Ramaekers FC, Kuijpers W. Cytokeratin and vimentin expression in normal epithelium and squamous cell carcinomas of the larynx. European archives of oto-rhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies. 1997;254(8): PubMed PMID: Christensen ME, Therkildsen MH, Hansen BL, Hansen GN, Bretlau P. Immunohistochemical detection of epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinomas. Acta oto-laryngologica. 1992;112(4): PubMed PMID: Wei Q, Sheng L, Shui Y, Hu Q, Nordgren H, Carlsson J. EGFR, HER2, and HER3 expression in laryngeal primary tumors and corresponding metastases. Annals of surgical oncology Apr;15(4): PubMed PMID:

99 33. Hermsen M, Guervos MA, Meijer G, Baak J, van Diest P, Marcos CA, et al. New chromosomal regions with high-level amplifications in squamous cell carcinomas of the larynx and pharynx, identified by comparative genomic hybridization. The Journal of pathology Jun;194(2): PubMed PMID: Huang Q, Yu GP, McCormick SA, Mo J, Datta B, Mahimkar M, et al. Genetic differences detected by comparative genomic hybridization in head and neck squamous cell carcinomas from different tumor sites: construction of oncogenetic trees for tumor progression. Genes, chromosomes & cancer Jun;34(2): PubMed PMID: Freier K, Joos S, Flechtenmacher C, Devens F, Benner A, Bosch FX, et al. Tissue microarray analysis reveals site-specific prevalence of oncogene amplifications in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer research Mar 15;63(6): PubMed PMID: Jares P, Fernandez PL, Campo E, Nadal A, Bosch F, Aiza G, et al. PRAD-1/cyclin D1 gene amplification correlates with messenger RNA overexpression and tumor progression in human laryngeal carcinomas. Cancer research Sep 1;54(17): PubMed PMID: Dolcetti R, Pelucchi S, Maestro R, Rizzo S, Pastore A, Boiocchi M. Proto-oncogene allelic variations in human squamous cell carcinomas of the larynx. European archives of otorhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies. 1991;248(5): PubMed PMID: Fracchiolla NS, Pignataro L, Capaccio P, Trecca D, Boletini A, Ottaviani A, et al. Multiple genetic lesions in laryngeal squamous cell carcinomas. Cancer Mar 15;75(6): PubMed PMID: Jares P, Fernandez PL, Nadal A, Cazorla M, Hernandez L, Pinyol M, et al. p16mts1/cdk4i mutations and concomitant loss of heterozygosity at 9p21-23 are frequent events in squamous cell carcinoma of the larynx. Oncogene Sep 18;15(12): PubMed PMID: Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, Wijffels K, Schuuring E, Litvinov SV, Hermans J, et al. Expression of genetic markers in lymph node metastases compared with their primary tumours in head and neck cancer. The Journal of pathology Jul;194(3): PubMed PMID: Gale N, Kambic V, Poljak M, Cor A, Velkavrh D, Mlacak B. Chromosomes 7,17 polysomies and overexpression of epidermal growth factor receptor and p53 protein in 99

100 epithelial hyperplastic laryngeal lesions. Oncology Feb;58(2): PubMed PMID: Nadal A, Campo E, Pinto J, Mallofre C, Palacin A, Arias C, et al. p53 expression in normal, dysplastic, and neoplastic laryngeal epithelium. Absence of a correlation with prognostic factors. The Journal of pathology Feb;175(2): PubMed PMID: Yamaguchi K, Wu L, Caballero OL, Hibi K, Trink B, Resto V, et al. Frequent gain of the p40/p51/p63 gene locus in primary head and neck squamous cell carcinoma. International journal of cancer Journal international du cancer Jun 1;86(5): PubMed PMID: Cazorla M, Hernandez L, Nadal A, Balbin M, Lopez JM, Vizoso F, et al. Collagenase-3 expression is associated with advanced local invasion in human squamous cell carcinomas of the larynx. The Journal of pathology Oct;186(2): PubMed PMID: Chiesa F, Mauri S, Tradati N, Calabrese L, Giugliano G, Ansarin M, et al. Surfing prognostic factors in head and neck cancer at the millennium. Oral oncology Nov;35(6): PubMed PMID: Singh B, Alfonso A, Sabin S, Poluri A, Shaha AR, Sundaram K, et al. Outcome differences in younger and older patients with laryngeal cancer: a retrospective case-control study. American journal of otolaryngology Mar-Apr;21(2):92-7. PubMed PMID: Reizenstein JA, Bergstrom SN, Holmberg L, Linder A, Ekman S, Blomquist E, et al. Impact of age at diagnosis on prognosis and treatment in laryngeal cancer. Head & neck Aug;32(8): PubMed PMID: Chen AY, Matson LK, Roberts D, Goepfert H. The significance of comorbidity in advanced laryngeal cancer. Head & neck Jul;23(7): PubMed PMID: Castro MA, Dedivitis RA, Ribeiro KC. Comorbidity measurement in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. ORL; journal for oto-rhino-laryngology and its related specialties. 2007;69(3): PubMed PMID: Leroux-Robert J. A statistical study of 620 laryngeal carcinomas of the glottic region personally operated upon more than five years ago. The Laryngoscope Sep;85(9): PubMed PMID: Karatzanis AD, Waldfahrer F, Psychogios G, Hornung J, Zenk J, Velegrakis GA, et al. Resection margins and other prognostic factors regarding surgically treated glottic 100

101 carcinomas. Journal of surgical oncology Feb 1;101(2): PubMed PMID: Ramroth H, Schoeps A, Rudolph E, Dyckhoff G, Plinkert P, Lippert B, et al. Factors predicting survival after diagnosis of laryngeal cancer. Oral oncology Dec;47(12): PubMed PMID: Pogura JH. Surgical pathology of cancer of the larnyx. The Laryngoscope Oct;65(10): PubMed PMID: Markou K, Goudakos J, Triaridis S, Konstantinidis J, Vital V, Nikolaou A. The role of tumor size and patient's age as prognostic factors in laryngeal cancer. Hippokratia Jan;15(1): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Stell PM, Tobin KE. The behavior of cancer affecting the subglottic space. Canadian journal of otolaryngology Journal canadien d'otolaryngologie. 1975;4(4): PubMed PMID: Yu Q, Zhang X, Ji C, Yang H, Gao M, Hong S, et al. Survival analysis of laryngeal carcinoma without laryngectomy, radiotherapy, or chemotherapy. European archives of otorhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Sep;269(9): PubMed PMID: Yilmaz T, Hosal AS, Gedikoglu G, Kaya S. Prognostic significance of histopathological parameters in cancer of the larynx. European archives of oto-rhinolaryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies. 1999;256(3): PubMed PMID: Yilmaz T, Hosal AS, Gedikoglu G, Onerci M, Gursel B. Prognostic significance of vascular and perineural invasion in cancer of the larynx. American journal of otolaryngology Mar-Apr;19(2):83-8. PubMed PMID: Ferlito A, Rinaldo A, Devaney KO, MacLennan K, Myers JN, Petruzzelli GJ, et al. Prognostic significance of microscopic and macroscopic extracapsular spread from metastatic tumor in the cervical lymph nodes. Oral oncology Dec;38(8): PubMed PMID: Suoglu Y, Erdamar B, Katircioglu OS, Karatay MC, Sunay T. Extracapsular spread in ipsilateral neck and contralateral neck metastases in laryngeal cancer. The Annals of otology, rhinology, and laryngology May;111(5 Pt 1): PubMed PMID: Ganly I, Patel SG, Matsuo J, Singh B, Kraus DH, Boyle J, et al. Predictors of outcome for advanced-stage supraglottic laryngeal cancer. Head & neck Nov;31(11): PubMed PMID:

102 62. Steiner W. Results of curative laser microsurgery of laryngeal carcinomas. American journal of otolaryngology Mar-Apr;14(2): PubMed PMID: Looser KG, Shah JP, Strong EW. The significance of "positive" margins in surgically resected epidermoid carcinomas. Head & neck surgery Nov-Dec;1(2): PubMed PMID: Slootweg PJ, Hordijk GJ, Schade Y, van Es RJ, Koole R. Treatment failure and margin status in head and neck cancer. A critical view on the potential value of molecular pathology. Oral oncology Jul;38(5): PubMed PMID: Futrell JW, Bennett SH, Hoye RC, Roth JA, Ketcham AS. Predicting survival in cancer of the larynx or hypopharynx. American journal of surgery Oct;122(4): PubMed PMID: Krecicki T, Jelen M, Zalesska-Krecicka M, Szkudlarek T. Ki-67 immunostaining and prognosis in laryngeal cancer. Clinical otolaryngology and allied sciences Dec;23(6): PubMed PMID: Zidar N, Gale N, Cor A, Kambic V. Expression of Ki-67 antigen and proliferative cell nuclear antigen in benign and malignant epithelial lesions of the larynx. The Journal of laryngology and otology May;110(5): PubMed PMID: Franchi A, Gallo O, Boddi V, Santucci M. Prediction of occult neck metastases in laryngeal carcinoma: role of proliferating cell nuclear antigen, MIB-1, and E-cadherin immunohistochemical determination. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Oct;2(10): PubMed PMID: Zhang YY, Xu ZN, Wang JX, Wei DM, Pan XL. G1/S-specific cyclin-d1 might be a prognostic biomarker for patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 2012;13(5): PubMed PMID: Mielcarek-Kuchta D, Olofsson J, Golusinski W. p53, Ki67 and cyclin D1 as prognosticators of lymph node metastases in laryngeal carcinoma. European archives of otorhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Nov;260(10): PubMed PMID: Rodrigues RB, Motta Rda R, Machado SM, Cambruzzi E, Zettler EW, Zettler CG, et al. Prognostic value of the immunohistochemistry correlation of Ki-67 and p53 in squamous cell carcinomas of the larynx. Brazilian journal of otorhinolaryngology Nov- Dec;74(6): PubMed PMID:

103 72. Wolf GT, Fisher SG, Truelson JM, Beals TF. DNA content and regional metastases in patients with advanced laryngeal squamous carcinoma. Department of Veterans Affairs Laryngeal Study Group. The Laryngoscope Apr;104(4): PubMed PMID: el-naggar AK, Dinh M, Tucker S, Luna MA, Goepfert H, Hsu P, et al. Genotypic analysis of primary head and neck squamous carcinoma by combined fluorescence in situ hybridization and DNA flow cytometry. American journal of clinical pathology Jan;105(1): PubMed PMID: Takes RP, Baatenburg de Jong RJ, van Blommestein R, Hermans J, van Krieken HH, Cornelisse CJ. DNA ploidy status as a prognostic marker and predictor of lymph node metastasis in laryngeal carcinoma. The Annals of otology, rhinology, and laryngology Nov;111(11): PubMed PMID: Barona de Guzman R, Martorell MA, Basterra J, Armengot M, Montoro A, Montoro J. Analysis of DNA content in supraglottic epidermoid carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Jun;108(6): PubMed PMID: Del Valle-Zapico A, Fernandez FF, Suarez AR, Angulo CM, Quintela JR. Prognostic value of histopathologic parameters and DNA flow cytometry in squamous cell carcinoma of the pyriform sinus. The Laryngoscope Feb;108(2): PubMed PMID: Ladika-Davidovic B, Coric M, Bura M, Brcic L, Kusic Z, Seiwerth S. Heterogeneity of DNA content in laryngeal squamous cell carcinoma in relation to histopathological variables. Acta oto-laryngologica Jul;129(7): PubMed PMID: Jackel MC, Dorudian MA, Marx D, Brinck U, Schauer A, Steiner W. Spontaneous apoptosis in laryngeal squamous cell carcinoma is independent of bcl-2 and bax protein expression. Cancer Feb 1;85(3): PubMed PMID: Hirvikoski P, Kumpulainen E, Virtaniemi J, Pirinen R, Salmi L, Halonen P, et al. Enhanced apoptosis correlates with poor survival in patients with laryngeal cancer but not with cell proliferation, bcl-2 or p53 expression. European journal of cancer Feb;35(2): PubMed PMID: Vlachtsis K, Nikolaou A, Markou K, Fountzilas G, Daniilidis I. Clinical and molecular prognostic factors in operable laryngeal cancer. European archives of oto-rhinolaryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Nov;262(11): PubMed PMID:

104 81. Arisi E, Pruneri G, Carboni N, Sambataro G, Pignataro L. Prognostic significance of P27 and cyclin D1 co-expression in laryngeal squamous cell carcinoma: possible target for novel therapeutic strategies. Journal of chemotherapy Nov;16 Suppl 5:3-6. PubMed PMID: Pignataro L, Sambataro G, Pagani D, Pruneri G. Clinico-prognostic value of D-type cyclins and p27 in laryngeal cancer patients: a review. Acta otorhinolaryngologica Italica : organo ufficiale della Societa italiana di otorinolaringologia e chirurgia cervico-facciale Apr;25(2): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Ioachim E, Peschos D, Goussia A, Mittari E, Charalabopoulos K, Michael M, et al. Expression patterns of cyclins D1, E in laryngeal epithelial lesions: correlation with other cell cycle regulators (p53, prb, Ki-67 and PCNA) and clinicopathological features. Journal of experimental & clinical cancer research : CR Jun;23(2): PubMed PMID: Segas JV, Lazaris AC, Nikolopoulos TP, Kavantzas NG, Lendari IE, Tzagkaroulakis AM, et al. Cyclin D1 protein tissue detection in laryngeal cancer. ORL; journal for oto-rhinolaryngology and its related specialties. 2005;67(6): PubMed PMID: Morshed K, Skomra D, Korobowicz E, Szymanski M, Polz-Dacewicz M, Golabek W. An immunohistochemical study of cyclin D1 protein expression in laryngeal squamous cell carcinoma. Acta oto-laryngologica Jul;127(7): PubMed PMID: Nylander K, Dabelsteen E, Hall PA. The p53 molecule and its prognostic role in squamous cell carcinomas of the head and neck. Journal of oral pathology & medicine : official publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology Oct;29(9): PubMed PMID: Assimakopoulos D, Kolettas E, Zagorianakou N, Evangelou A, Skevas A, Agnantis NJ. Prognostic significance of p53 in the cancer of the larynx. Anticancer research Sep- Oct;20(5B): PubMed PMID: Amin DN, Campbell MR, Moasser MM. The role of HER3, the unpretentious member of the HER family, in cancer biology and cancer therapeutics. Seminars in cell & developmental biology Dec;21(9): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Schneider MR, Wolf E. The epidermal growth factor receptor ligands at a glance. Journal of cellular physiology Mar;218(3): PubMed PMID:

105 90. Alroy I, Yarden Y. The ErbB signaling network in embryogenesis and oncogenesis: signal diversification through combinatorial ligand-receptor interactions. FEBS letters Jun 23;410(1):83-6. PubMed PMID: Murray S, Bobos M, Angouridakis N, Nikolaou A, Linardou H, Razis E, et al. Screening for EGFR Mutations in Patients with Head and Neck Cancer Treated with Gefitinib on a Compassionate-Use Program: A Hellenic Cooperative Oncology Group Study. Journal of oncology. 2010;2010: PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Fountzilas G, Kalogera-Fountzila A, Lambaki S, Wirtz RM, Nikolaou A, Karayannopoulou G, et al. MMP9 but Not EGFR, MET, ERCC1, P16, and P-53 Is Associated with Response to Concomitant Radiotherapy, Cetuximab, and Weekly Cisplatin in Patients with Locally Advanced Head and Neck Cancer. Journal of oncology. 2009;2009: PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Almadori G, Cadoni G, Galli J, Ferrandina G, Scambia G, Exarchakos G, et al. Epidermal growth factor receptor expression in primary laryngeal cancer: an independent prognostic factor of neck node relapse. International journal of cancer Journal international du cancer Apr 20;84(2): PubMed PMID: Maurizi M, Scambia G, Benedetti Panici P, Ferrandina G, Almadori G, Paludetti G, et al. EGF receptor expression in primary laryngeal cancer: correlation with clinico-pathological features and prognostic significance. International journal of cancer Journal international du cancer Dec 2;52(6): PubMed PMID: Maurizi M, Almadori G, Ferrandina G, Distefano M, Romanini ME, Cadoni G, et al. Prognostic significance of epidermal growth factor receptor in laryngeal squamous cell carcinoma. British journal of cancer Oct;74(8): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Khademi B, Shirazi FM, Vasei M, Doroudchi M, Gandomi B, Modjtahedi H, et al. The expression of p53, c-erbb-1 and c-erbb-2 molecules and their correlation with prognostic markers in patients with head and neck tumors. Cancer letters Oct 28;184(2): PubMed PMID: Kazkayasi M, Hucumenoglu S, Siriner GI, Hucumenoglu M. Over-expression of p53 and c-erbb-2 oncoproteins in laryngeal carcinoma. European archives of oto-rhinolaryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Sep;258(7): PubMed PMID:

106 98. Koynova DK, Tsenova VS, Jankova RS, Gurov PB, Toncheva DI. Tissue microarray analysis of EGFR and HER2 oncogene copy number alterations in squamous cell carcinoma of the larynx. Journal of cancer research and clinical oncology Mar;131(3): PubMed PMID: Bei R, Pompa G, Vitolo D, Moriconi E, Ciocci L, Quaranta M, et al. Co-localization of multiple ErbB receptors in stratified epithelium of oral squamous cell carcinoma. The Journal of pathology Oct;195(3): PubMed PMID: Takikita M, Xie R, Chung JY, Cho H, Ylaya K, Hong SM, et al. Membranous expression of Her3 is associated with a decreased survival in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of translational medicine. 2011;9:126. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Campbell MR, Amin D, Moasser MM. HER3 comes of age: new insights into its functions and role in signaling, tumor biology, and cancer therapy. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Mar 1;16(5): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Bellacosa A, Kumar CC, Di Cristofano A, Testa JR. Activation of AKT kinases in cancer: implications for therapeutic targeting. Advances in cancer research. 2005;94: PubMed PMID: Sergina NV, Rausch M, Wang D, Blair J, Hann B, Shokat KM, et al. Escape from HER-family tyrosine kinase inhibitor therapy by the kinase-inactive HER3. Nature Jan 25;445(7126): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T, Song Y, Hyland C, Park JO, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science May 18;316(5827): PubMed PMID: Makhija S, Amler LC, Glenn D, Ueland FR, Gold MA, Dizon DS, et al. Clinical activity of gemcitabine plus pertuzumab in platinum-resistant ovarian cancer, fallopian tube cancer, or primary peritoneal cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Mar 1;28(7): PubMed PMID: Miller TW, Perez-Torres M, Narasanna A, Guix M, Stal O, Perez-Tenorio G, et al. Loss of Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10 engages ErbB3 and insulin-like growth factor-i receptor signaling to promote antiestrogen resistance in breast cancer. Cancer research May 15;69(10): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID:

107 107. Erjala K, Sundvall M, Junttila TT, Zhang N, Savisalo M, Mali P, et al. Signaling via ErbB2 and ErbB3 associates with resistance and epidermal growth factor receptor (EGFR) amplification with sensitivity to EGFR inhibitor gefitinib in head and neck squamous cell carcinoma cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Jul 1;12(13): PubMed PMID: Zhang Y, Linn D, Liu Z, Melamed J, Tavora F, Young CY, et al. EBP1, an ErbB3- binding protein, is decreased in prostate cancer and implicated in hormone resistance. Molecular cancer therapeutics Oct;7(10): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Desbois-Mouthon C, Baron A, Blivet-Van Eggelpoel MJ, Fartoux L, Venot C, Bladt F, et al. Insulin-like growth factor-1 receptor inhibition induces a resistance mechanism via the epidermal growth factor receptor/her3/akt signaling pathway: rational basis for cotargeting insulin-like growth factor-1 receptor and epidermal growth factor receptor in hepatocellular carcinoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Sep 1;15(17): PubMed PMID: Zhang K, Sun J, Liu N, Wen D, Chang D, Thomason A, et al. Transformation of NIH 3T3 cells by HER3 or HER4 receptors requires the presence of HER1 or HER2. The Journal of biological chemistry Feb 16;271(7): PubMed PMID: Cao Z, Wu X, Yen L, Sweeney C, Carraway KL, 3rd. Neuregulin-induced ErbB3 downregulation is mediated by a protein stability cascade involving the E3 ubiquitin ligase Nrdp1. Molecular and cellular biology Mar;27(6): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Laederich MB, Funes-Duran M, Yen L, Ingalla E, Wu X, Carraway KL, 3rd, et al. The leucine-rich repeat protein LRIG1 is a negative regulator of ErbB family receptor tyrosine kinases. The Journal of biological chemistry Nov 5;279(45): PubMed PMID: Miller JK, Shattuck DL, Ingalla EQ, Yen L, Borowsky AD, Young LJ, et al. Suppression of the negative regulator LRIG1 contributes to ErbB2 overexpression in breast cancer. Cancer research Oct 15;68(20): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Funes M, Miller JK, Lai C, Carraway KL, 3rd, Sweeney C. The mucin Muc4 potentiates neuregulin signaling by increasing the cell-surface populations of ErbB2 and ErbB3. The Journal of biological chemistry Jul 14;281(28): PubMed PMID:

108 115. Scott GK, Goga A, Bhaumik D, Berger CE, Sullivan CS, Benz CC. Coordinate suppression of ERBB2 and ERBB3 by enforced expression of micro-rna mir-125a or mir- 125b. The Journal of biological chemistry Jan 12;282(2): PubMed PMID: Koumakpayi IH, Diallo JS, Le Page C, Lessard L, Gleave M, Begin LR, et al. Expression and nuclear localization of ErbB3 in prostate cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research May 1;12(9): PubMed PMID: Quinn CM, Ostrowski JL, Lane SA, Loney DP, Teasdale J, Benson FA. c-erbb-3 protein expression in human breast cancer: comparison with other tumour variables and survival. Histopathology Sep;25(3): PubMed PMID: Witton CJ, Reeves JR, Going JJ, Cooke TG, Bartlett JM. Expression of the HER1-4 family of receptor tyrosine kinases in breast cancer. The Journal of pathology Jul;200(3): PubMed PMID: Sassen A, Rochon J, Wild P, Hartmann A, Hofstaedter F, Schwarz S, et al. Cytogenetic analysis of HER1/EGFR, HER2, HER3 and HER4 in 278 breast cancer patients. Breast cancer research : BCR. 2008;10(1):R2. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Yi ES, Harclerode D, Gondo M, Stephenson M, Brown RW, Younes M, et al. High c- erbb-3 protein expression is associated with shorter survival in advanced non-small cell lung carcinomas. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc Feb;10(2): PubMed PMID: Zhang XL, Yang YS, Xu DP, Qu JH, Guo MZ, Gong Y, et al. Comparative study on overexpression of HER2/neu and HER3 in gastric cancer. World journal of surgery Oct;33(10): PubMed PMID: Kountourakis P, Pavlakis K, Psyrri A, Rontogianni D, Xiros N, Patsouris E, et al. Prognostic significance of HER3 and HER4 protein expression in colorectal adenocarcinomas. BMC cancer. 2006;6:46. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Friess H, Yamanaka Y, Kobrin MS, Do DA, Buchler MW, Korc M. Enhanced erbb-3 expression in human pancreatic cancer correlates with tumor progression. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Nov;1(11): PubMed PMID:

109 124. Reschke M, Mihic-Probst D, van der Horst EH, Knyazev P, Wild PJ, Hutterer M, et al. HER3 is a determinant for poor prognosis in melanoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Aug 15;14(16): PubMed PMID: Koumakpayi IH, Diallo JS, Le Page C, Lessard L, Filali-Mouhim A, Begin LR, et al. Low nuclear ErbB3 predicts biochemical recurrence in patients with prostate cancer. BJU international Aug;100(2): PubMed PMID: Simpson BJ, Phillips HA, Lessells AM, Langdon SP, Miller WR. c-erbb growthfactor-receptor proteins in ovarian tumours. International journal of cancer Journal international du cancer Jun 22;64(3): PubMed PMID: Rajkumar T, Gooden CS, Lemoine NR, Gullick WJ, Goden CS. Expression of the c- erbb-3 protein in gastrointestinal tract tumours determined by monoclonal antibody RTJ1. The Journal of pathology Jul;170(3): PubMed PMID: Li DM, Sun H. TEP1, encoded by a candidate tumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta. Cancer research Jun 1;57(11): PubMed PMID: Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, Yung WK, Lin H, Ligon AH, et al. Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers. Nature genetics Apr;15(4): PubMed PMID: Gericke A, Munson M, Ross AH. Regulation of the PTEN phosphatase. Gene Jun 7;374:1-9. PubMed PMID: Campbell RB, Liu F, Ross AH. Allosteric activation of PTEN phosphatase by phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry Sep 5;278(36): PubMed PMID: Redfern RE, Redfern D, Furgason ML, Munson M, Ross AH, Gericke A. PTEN phosphatase selectively binds phosphoinositides and undergoes structural changes. Biochemistry Feb 19;47(7): PubMed PMID: Tolkacheva T, Boddapati M, Sanfiz A, Tsuchida K, Kimmelman AC, Chan AM. Regulation of PTEN binding to MAGI-2 by two putative phosphorylation sites at threonine 382 and 383. Cancer research Jul 1;61(13): PubMed PMID: Zhang P, Chen JH, Guo XL. New insights into PTEN regulation mechanisms and its potential function in targeted therapies. Biomedicine & pharmacotherapy = Biomedecine & pharmacotherapie Oct;66(7): PubMed PMID:

110 135. Salmena L, Carracedo A, Pandolfi PP. Tenets of PTEN tumor suppression. Cell May 2;133(3): PubMed PMID: Ali IU, Schriml LM, Dean M. Mutational spectra of PTEN/MMAC1 gene: a tumor suppressor with lipid phosphatase activity. Journal of the National Cancer Institute Nov 17;91(22): PubMed PMID: Trotman LC, Niki M, Dotan ZA, Koutcher JA, Di Cristofano A, Xiao A, et al. Pten dose dictates cancer progression in the prostate. PLoS biology Dec;1(3):E59. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Wang S, Gao J, Lei Q, Rozengurt N, Pritchard C, Jiao J, et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer cell Sep;4(3): PubMed PMID: Maehama T, Dixon JE. The tumor suppressor, PTEN/MMAC1, dephosphorylates the lipid second messenger, phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. The Journal of biological chemistry May 29;273(22): PubMed PMID: Leslie NR, Downes CP. PTEN: The down side of PI 3-kinase signalling. Cellular signalling Apr;14(4): PubMed PMID: Hawkins PT, Anderson KE, Davidson K, Stephens LR. Signalling through Class I PI3Ks in mammalian cells. Biochemical Society transactions Nov;34(Pt 5): PubMed PMID: Baker SJ. PTEN enters the nuclear age. Cell Jan 12;128(1):25-8. PubMed PMID: Leslie NR, Foti M. Non-genomic loss of PTEN function in cancer: not in my genes. Trends in pharmacological sciences Mar;32(3): PubMed PMID: Gimm O, Perren A, Weng LP, Marsh DJ, Yeh JJ, Ziebold U, et al. Differential nuclear and cytoplasmic expression of PTEN in normal thyroid tissue, and benign and malignant epithelial thyroid tumors. The American journal of pathology May;156(5): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Risinger JI, Hayes AK, Berchuck A, Barrett JC. PTEN/MMAC1 mutations in endometrial cancers. Cancer research Nov 1;57(21): PubMed PMID: Mellinghoff IK, Wang MY, Vivanco I, Haas-Kogan DA, Zhu S, Dia EQ, et al. Molecular determinants of the response of glioblastomas to EGFR kinase inhibitors. The New England journal of medicine Nov 10;353(19): PubMed PMID:

111 147. Karavasilis V, Kotoula V, Pentheroudakis G, Televantou D, Lambaki S, Chrisafi S, et al. A phase I study of temozolomide and lapatinib combination in patients with recurrent high-grade gliomas. Journal of neurology Jan 5. PubMed PMID: Meyer S, Fuchs TJ, Bosserhoff AK, Hofstadter F, Pauer A, Roth V, et al. A sevenmarker signature and clinical outcome in malignant melanoma: a large-scale tissuemicroarray study with two independent patient cohorts. PloS one. 2012;7(6):e PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Lotan TL, Gumuskaya B, Rahimi H, Hicks JL, Iwata T, Robinson BD, et al. Cytoplasmic PTEN protein loss distinguishes intraductal carcinoma of the prostate from high-grade prostatic intraepithelial neoplasia. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc Dec 7. PubMed PMID: Christodoulou C, Kostopoulos I, Kalofonos HP, Lianos E, Bobos M, Briasoulis E, et al. Trastuzumab combined with pegylated liposomal doxorubicin in patients with metastatic breast cancer. phase II Study of the Hellenic Cooperative Oncology Group (HeCOG) with biomarker evaluation. Oncology. 2009;76(4): PubMed PMID: Razis E, Bobos M, Kotoula V, Eleftheraki AG, Kalofonos HP, Pavlakis K, et al. Evaluation of the association of PIK3CA mutations and PTEN loss with efficacy of trastuzumab therapy in metastatic breast cancer. Breast cancer research and treatment Jul;128(2): PubMed PMID: Razis E, Briasoulis E, Vrettou E, Skarlos DV, Papamichael D, Kostopoulos I, et al. Potential value of PTEN in predicting cetuximab response in colorectal cancer: an exploratory study. BMC cancer. 2008;8:234. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Tanwar PS, Kaneko-Tarui T, Lee HJ, Zhang L, Teixeira JM. PTEN loss and HOXA10 expression are associated with ovarian endometrioid adenocarcinoma differentiation and progression. Carcinogenesis Jan 18. PubMed PMID: Lee H, Choi SK, Ro JY. Overexpression of DJ-1 and HSP90alpha, and loss of PTEN associated with invasive urothelial carcinoma of urinary bladder: Possible prognostic markers. Oncology letters Mar;3(3): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Yanagawa N, Leduc C, Kohler D, Saieg MA, John T, Sykes J, et al. Loss of phosphatase and tensin homolog protein expression is an independent poor prognostic marker in lung adenocarcinoma. Journal of thoracic oncology : official publication of the 111

112 International Association for the Study of Lung Cancer Oct;7(10): PubMed PMID: Sullu Y, Gun S, Atmaca S, Karagoz F, Kandemir B. Poor prognostic clinicopathologic features correlate with VEGF expression but not with PTEN expression in squamous cell carcinoma of the larynx. Diagnostic pathology. 2010;5:35. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Lee JI, Soria JC, Hassan KA, El-Naggar AK, Tang X, Liu DD, et al. Loss of PTEN expression as a prognostic marker for tongue cancer. Archives of otolaryngology--head & neck surgery Dec;127(12): PubMed PMID: Pattje WJ, Schuuring E, Mastik MF, Slagter-Menkema L, Schrijvers ML, Alessi S, et al. The phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 mediates radiosensitivity in head and neck cancer. British journal of cancer Jun 8;102(12): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Wang JC. DNA topoisomerases: why so many? The Journal of biological chemistry Apr 15;266(11): PubMed PMID: Vos SM, Tretter EM, Schmidt BH, Berger JM. All tangled up: how cells direct, manage and exploit topoisomerase function. Nature reviews Molecular cell biology Dec;12(12): PubMed PMID: Liu LF. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual review of biochemistry. 1989;58: PubMed PMID: Mao Y, Desai SD, Ting CY, Hwang J, Liu LF. 26 S proteasome-mediated degradation of topoisomerase II cleavable complexes. The Journal of biological chemistry Nov 2;276(44): PubMed PMID: Woessner RD, Mattern MR, Mirabelli CK, Johnson RK, Drake FH. Proliferation- and cell cycle-dependent differences in expression of the 170 kilodalton and 180 kilodalton forms of topoisomerase II in NIH-3T3 cells. Cell growth & differentiation : the molecular biology journal of the American Association for Cancer Research Apr;2(4): PubMed PMID: Korkolopoulou P, Angelopoulou M, Siakantari M, Mitropoulos F, Vassilakopoulos T, Zorzos H, et al. Evaluation of DNA topoisomerase IIalpha expression provides independent prognostic information in non-hodgkin's lymphomas. Histopathology Jan;38(1): PubMed PMID: Guinee DG, Jr., Holden JA, Benfield JR, Woodward ML, Przygodzki RM, Fishback NF, et al. Comparison of DNA topoisomerase II alpha expression in small cell and nonsmall 112

113 cell carcinoma of the lung. In search of a mechanism of chemotherapeutic response. Cancer Aug 15;78(4): PubMed PMID: Dimov ND, Zynger DL, Luan C, Kozlowski JM, Yang XJ. Topoisomerase II alpha expression in testicular germ cell tumors. Urology May;69(5): PubMed PMID: Willman JH, Holden JA. Immunohistochemical staining for DNA topoisomerase IIalpha in benign, premalignant, and malignant lesions of the prostate. The Prostate Mar 1;42(4): PubMed PMID: Hansel DE, Ashfaq R, Rahman A, Wanzer D, Yeo CJ, Wilentz RE, et al. A subset of pancreatic adenocarcinomas demonstrates coamplification of topoisomerase IIalpha and HER2/neu: use of immunolabeling and multicolor FISH for potential patient screening andtreatment. American journal of clinical pathology Jan;123(1): PubMed PMID: Jarvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIalpha associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. The American journal of pathology Mar;156(3): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Tsavaris N, Lazaris A, Kosmas C, Gouveris P, Kavantzas N, Kopterides P, et al. Topoisomerase I and IIalpha protein expression in primary colorectal cancer and recurrences following 5-fluorouracil-based adjuvant chemotherapy. Cancer chemotherapy and pharmacology Jul;64(2): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Fountzilas G, Christodoulou C, Bobos M, Kotoula V, Eleftheraki AG, Xanthakis I, et al. Topoisomerase II alpha gene amplification is a favorable prognostic factor in patients with HER2-positive metastatic breast cancer treated with trastuzumab. Journal of translational medicine. 2012;10:212. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Fountzilas G, Valavanis C, Kotoula V, Eleftheraki AG, Kalogeras KT, Tzaida O, et al. HER2 and TOP2A in high-risk early breast cancer patients treated with adjuvant epirubicin-based dose-dense sequential chemotherapy. Journal of translational medicine. 2012;10:10. PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Press MF, Sauter G, Buyse M, Bernstein L, Guzman R, Santiago A, et al. Alteration of topoisomerase II-alpha gene in human breast cancer: association with responsiveness to anthracycline-based chemotherapy. Journal of clinical oncology : official journal of the 113

114 American Society of Clinical Oncology Mar 1;29(7): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Oct 20;23(30): PubMed PMID: Schindlbeck C, Mayr D, Olivier C, Rack B, Engelstaedter V, Jueckstock J, et al. Topoisomerase IIalpha expression rather than gene amplification predicts responsiveness of adjuvant anthracycline-based chemotherapy in women with primary breast cancer. Journal of cancer research and clinical oncology Jul;136(7): PubMed PMID: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research May;8(5): PubMed PMID: Capranico G, Butelli E, Zunino F. Change of the sequence specificity of daunorubicin-stimulated topoisomerase II DNA cleavage by epimerization of the amino group of the sugar moiety. Cancer research Jan 15;55(2): PubMed PMID: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and overexpression of topoisomerase IIalpha predict response to anthracycline-based therapy in locally advanced breast cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research Apr;8(4): PubMed PMID: Scandinavian Breast Group T, Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Jun 1;24(16): PubMed PMID:

115 180. O'Malley FP, Chia S, Tu D, Shepherd LE, Levine MN, Bramwell VH, et al. Topoisomerase II alpha and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. Journal of the National Cancer Institute May 6;101(9): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Silver CE, Beitler JJ, Shaha AR, Rinaldo A, Ferlito A. Current trends in initial management of laryngeal cancer: the declining use of open surgery. European archives of oto-rhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino- Laryngological Societies Sep;266(9): PubMed PMID: Forastiere AA, Goepfert H, Maor M, Pajak TF, Weber R, Morrison W, et al. Concurrent chemotherapy and radiotherapy for organ preservation in advanced laryngeal cancer. The New England journal of medicine Nov 27;349(22): PubMed PMID: Lee WR, Mancuso AA, Saleh EM, Mendenhall WM, Parsons JT, Million RR. Can pretreatment computed tomography findings predict local control in T3 squamous cell carcinoma of the glottic larynx treated with radiotherapy alone? International journal of radiation oncology, biology, physics Mar 15;25(4): PubMed PMID: Rezvani M, Fowler JF, Hopewell JW, Alcock CJ. Sensitivity of human squamous cell carcinoma of the larynx to fractionated radiotherapy. The British journal of radiology Mar;66(783): PubMed PMID: Barlund M, Forozan F, Kononen J, Bubendorf L, Chen Y, Bittner ML, et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. Journal of the National Cancer Institute Aug 2;92(15): PubMed PMID: Bowen C, Bubendorf L, Voeller HJ, Slack R, Willi N, Sauter G, et al. Loss of NKX3.1 expression in human prostate cancers correlates with tumor progression. Cancer research Nov 1;60(21): PubMed PMID: Camp RL, Charette LA, Rimm DL. Validation of tissue microarray technology in breast carcinoma. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology Dec;80(12): PubMed PMID: Skacel M, Skilton B, Pettay JD, Tubbs RR. Tissue microarrays: a powerful tool for high-throughput analysis of clinical specimens: a review of the method with validation data. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry Mar;10(1):1-6. PubMed PMID:

116 189. Hanawa M, Suzuki S, Dobashi Y, Yamane T, Kono K, Enomoto N, et al. EGFR protein overexpression and gene amplification in squamous cell carcinomas of the esophagus. International journal of cancer Journal international du cancer Mar 1;118(5): PubMed PMID: Chui X, Egami H, Yamashita J, Kurizaki T, Ohmachi H, Yamamoto S, et al. Immunohistochemical expression of the c-kit proto-oncogene product in human malignant and non-malignant breast tissues. British journal of cancer May;73(10): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Friedrichs K, Gluba S, Eidtmann H, Jonat W. Overexpression of p53 and prognosis in breast cancer. Cancer Dec 15;72(12): PubMed PMID: Myoung H, Kim MJ, Lee JH, Ok YJ, Paeng JY, Yun PY. Correlation of proliferative markers (Ki-67 and PCNA) with survival and lymph node metastasis in oral squamous cell carcinoma: a clinical and histopathological analysis of 113 patients. International journal of oral and maxillofacial surgery Nov;35(11): PubMed PMID: Sangale Z, Prass C, Carlson A, Tikishvili E, Degrado J, Lanchbury J, et al. A robust immunohistochemical assay for detecting PTEN expression in human tumors. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry Mar;19(2): PubMed PMID: Bhargava R, Lal P, Chen B. HER-2/neu and topoisomerase IIa gene amplification and protein expression in invasive breast carcinomas: chromogenic in situ hybridization and immunohistochemical analyses. American journal of clinical pathology Jun;123(6): PubMed PMID: Cappuzzo F, Toschi L, Domenichini I, Bartolini S, Ceresoli GL, Rossi E, et al. HER3 genomic gain and sensitivity to gefitinib in advanced non-small-cell lung cancer patients. British journal of cancer Dec 12;93(12): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Perez EA, Reinholz MM, Hillman DW, Tenner KS, Schroeder MJ, Davidson NE, et al. HER2 and chromosome 17 effect on patient outcome in the N9831 adjuvant trastuzumab trial. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Oct 1;28(28): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Vanden Bempt I, Van Loo P, Drijkoningen M, Neven P, Smeets A, Christiaens MR, et al. Polysomy 17 in breast cancer: clinicopathologic significance and impact on HER-2 116

117 testing. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Oct 20;26(30): PubMed PMID: Landis JR, Koch GG. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics Mar;33(1): PubMed PMID: Boffetta P, Merletti F, Faggiano F, Migliaretti G, Ferro G, Zanetti R, et al. Prognostic factors and survival of laryngeal cancer patients from Turin, Italy. A population-based study. American journal of epidemiology Jun 15;145(12): PubMed PMID: Jin YT, Kayser S, Kemp BL, Ordonez NG, Tucker SL, Clayman GL, et al. The prognostic significance of the biomarkers p21waf1/cip1, p53, and bcl-2 in laryngeal squamous cell carcinoma. Cancer Jun 1;82(11): PubMed PMID: Gourin CG, Conger BT, Sheils WC, Bilodeau PA, Coleman TA, Porubsky ES. The effect of treatment on survival in patients with advanced laryngeal carcinoma. The Laryngoscope Jul;119(7): PubMed PMID: Jaber MA, Porter SR, Gilthorpe MS, Bedi R, Scully C. Risk factors for oral epithelial dysplasia--the role of smoking and alcohol. Oral oncology Mar;35(2): PubMed PMID: Bosetti C, Gallus S, Peto R, Negri E, Talamini R, Tavani A, et al. Tobacco smoking, smoking cessation, and cumulative risk of upper aerodigestive tract cancers. American journal of epidemiology Feb 15;167(4): PubMed PMID: Andre K, Schraub S, Mercier M, Bontemps P. Role of alcohol and tobacco in the aetiology of head and neck cancer: a case-control study in the Doubs region of France. European journal of cancer Part B, Oral oncology Sep;31B(5): PubMed PMID: Farshadpour F, Hordijk GJ, Koole R, Slootweg PJ. Non-smoking and non-drinking patients with head and neck squamous cell carcinoma: a distinct population. Oral diseases Mar;13(2): PubMed PMID: Chen YF, Luo RZ, Li Y, Cui BK, Song M, Yang AK, et al. High expression levels of COX-2 and P300 are associated with unfavorable survival in laryngeal squamous cell carcinoma. European archives of oto-rhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Nov 24. PubMed PMID: Morales-Angulo C, Val-Bernal F, Buelta L, Fernandez F, Garcia-Castrillo L, Rama J. Prognostic factors in supraglottic laryngeal carcinoma. Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Nov;119(5): PubMed PMID:

118 208. Kowalski LP, Franco EL, de Andrade Sobrinho J, Oliveira BV, Pontes PL. Prognostic factors in laryngeal cancer patients submitted to surgical treatment. Journal of surgical oncology Oct;48(2): PubMed PMID: Papadas TA, Alexopoulos EC, Mallis A, Jelastopulu E, Mastronikolis NS, Goumas P. Survival after laryngectomy: a review of 133 patients with laryngeal carcinoma. European archives of oto-rhino-laryngology : official journal of the European Federation of Oto-Rhino- Laryngological Societies Jul;267(7): PubMed PMID: Rodrigo JP, Dominguez F, Alvarez C, Manrique C, Herrero A, Suarez C. Expression of E-cadherin in squamous cell carcinomas of the supraglottic larynx with correlations to clinicopathological features. European journal of cancer May;38(8): PubMed PMID: Brasilino de Carvalho M. Quantitative analysis of the extent of extracapsular invasion and its prognostic significance: a prospective study of 170 cases of carcinoma of the larynx and hypopharynx. Head & neck Jan;20(1): PubMed PMID: Chen AY, Schrag N, Hao Y, Flanders WD, Kepner J, Stewart A, et al. Changes in treatment of advanced laryngeal cancer Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Dec;135(6): PubMed PMID: Ferlito A, Silver CE, Howard DJ, Laccourreye O, Rinaldo A, Owen R. The role of partial laryngeal resection in current management of laryngeal cancer: a collective review. Acta oto-laryngologica Jun;120(4): PubMed PMID: Induction chemotherapy plus radiation compared with surgery plus radiation in patients with advanced laryngeal cancer. The Department of Veterans Affairs Laryngeal Cancer Study Group. The New England journal of medicine Jun 13;324(24): PubMed PMID: Weber RS, Berkey BA, Forastiere A, Cooper J, Maor M, Goepfert H, et al. Outcome of salvage total laryngectomy following organ preservation therapy: the Radiation Therapy Oncology Group trial Archives of otolaryngology--head & neck surgery Jan;129(1):44-9. PubMed PMID: Hynes NE, MacDonald G. ErbB receptors and signaling pathways in cancer. Current opinion in cell biology Apr;21(2): PubMed PMID: Moasser MM. Targeting the function of the HER2 oncogene in human cancer therapeutics. Oncogene Oct 11;26(46): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID:

119 218. Okamoto I. Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR-targeted anticancer therapy. The FEBS journal Jan;277(2): PubMed PMID: Vermorken JB, Specenier P. Optimal treatment for recurrent/metastatic head and neck cancer. Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO Oct;21 Suppl 7:vii PubMed PMID: Shepherd FA, Rodrigues Pereira J, Ciuleanu T, Tan EH, Hirsh V, Thongprasert S, et al. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer. The New England journal of medicine Jul 14;353(2): PubMed PMID: Moore MJ, Goldstein D, Hamm J, Figer A, Hecht JR, Gallinger S, et al. Erlotinib plus gemcitabine compared with gemcitabine alone in patients with advanced pancreatic cancer: a phase III trial of the National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology May 20;25(15): PubMed PMID: Vermorken JB, Mesia R, Rivera F, Remenar E, Kawecki A, Rottey S, et al. Platinumbased chemotherapy plus cetuximab in head and neck cancer. The New England journal of medicine Sep 11;359(11): PubMed PMID: Koutras AK, Fountzilas G, Kalogeras KT, Starakis I, Iconomou G, Kalofonos HP. The upgraded role of HER3 and HER4 receptors in breast cancer. Critical reviews in oncology/hematology May;74(2):73-8. PubMed PMID: Holbro T, Beerli RR, Maurer F, Koziczak M, Barbas CF, 3rd, Hynes NE. The ErbB2/ErbB3 heterodimer functions as an oncogenic unit: ErbB2 requires ErbB3 to drive breast tumor cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Jul 22;100(15): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Lee-Hoeflich ST, Crocker L, Yao E, Pham T, Munroe X, Hoeflich KP, et al. A central role for HER3 in HER2-amplified breast cancer: implications for targeted therapy. Cancer research Jul 15;68(14): PubMed PMID: Offterdinger M, Schofer C, Weipoltshammer K, Grunt TW. c-erbb-3: a nuclear protein in mammary epithelial cells. The Journal of cell biology Jun 10;157(6): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Engelman JA, Janne PA, Mermel C, Pearlberg J, Mukohara T, Fleet C, et al. ErbB-3 mediates phosphoinositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive non-small cell lung cancer 119

120 cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Mar 8;102(10): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: ean Federation of Oto-Rhino-Laryngological Societies Nov 24. PubMed PMID: Lee D, Yu M, Lee E, Kim H, Yang Y, Kim K, et al. Tumor-specific apoptosis caused by deletion of the ERBB3 pseudo-kinase in mouse intestinal epithelium. The Journal of clinical investigation Sep;119(9): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Wei Q, Chen L, Sheng L, Nordgren H, Wester K, Carlsson J. EGFR, HER2 and HER3 expression in esophageal primary tumours and corresponding metastases. International journal of oncology Sep;31(3): PubMed PMID: Friess H, Fukuda A, Tang WH, Eichenberger A, Furlan N, Zimmermann A, et al. Concomitant analysis of the epidermal growth factor receptor family in esophageal cancer: overexpression of epidermal growth factor receptor mrna but not of c-erbb-2 and c-erbb-3. World journal of surgery Oct;23(10): PubMed PMID: Tanner B, Hasenclever D, Stern K, Schormann W, Bezler M, Hermes M, et al. ErbB- 3 predicts survival in ovarian cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Sep 10;24(26): PubMed PMID: Leibl S, Bodo K, Gogg-Kammerer M, Hrzenjak A, Petru E, Winter R, et al. Ovarian granulosa cell tumors frequently express EGFR (Her-1), Her-3, and Her-4: An immunohistochemical study. Gynecologic oncology Apr;101(1): PubMed PMID: Lee CH, Huntsman DG, Cheang MC, Parker RL, Brown L, Hoskins P, et al. Assessment of Her-1, Her-2, And Her-3 expression and Her-2 amplification in advanced stage ovarian carcinoma. International journal of gynecological pathology : official journal of the International Society of Gynecological Pathologists Apr;24(2): PubMed PMID: Lee JC, Wang ST, Chow NH, Yang HB. Investigation of the prognostic value of coexpressed erbb family members for the survival of colorectal cancer patients after curative surgery. European journal of cancer May;38(8): PubMed PMID: Maurer CA, Friess H, Kretschmann B, Zimmermann A, Stauffer A, Baer HU, et al. Increased expression of erbb3 in colorectal cancer is associated with concomitant increase in the level of erbb2. Human pathology Aug;29(8): PubMed PMID:

121 236. Reinmuth N, Jauch A, Xu EC, Muley T, Granzow M, Hoffmann H, et al. Correlation of EGFR mutations with chromosomal alterations and expression of EGFR, ErbB3 and VEGF in tumor samples of lung adenocarcinoma patients. Lung cancer Nov;62(2): PubMed PMID: Witta SE, Dziadziuszko R, Yoshida K, Hedman K, Varella-Garcia M, Bunn PA, Jr., et al. ErbB-3 expression is associated with E-cadherin and their coexpression restores response to gefitinib in non-small-cell lung cancer (NSCLC). Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO Apr;20(4): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Poetsch M, Kleist B, Lorenz G, Herrmann FH. Different numerical chromosomal aberrations detected by FISH in oropharyngeal, hypopharyngeal and laryngeal squamous cell carcinoma. Histopathology Mar;34(3): PubMed PMID: Guney K, Ozbilim G, Derin AT, Cetin S. Expression of PTEN protein in patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Auris, nasus, larynx Dec;34(4): PubMed PMID: Snietura M, Jaworska M, Mlynarczyk-Liszka J, Goraj-Zajac A, Piglowski W, Lange D, et al. PTEN as a prognostic and predictive marker in postoperative radiotherapy for squamous cell cancer of the head and neck. PloS one. 2012;7(3):e PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Yoshimoto M, Cunha IW, Coudry RA, Fonseca FP, Torres CH, Soares FA, et al. FISH analysis of 107 prostate cancers shows that PTEN genomic deletion is associated with poor clinical outcome. British journal of cancer Sep 3;97(5): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Nagata Y, Lan KH, Zhou X, Tan M, Esteva FJ, Sahin AA, et al. PTEN activation contributes to tumor inhibition by trastuzumab, and loss of PTEN predicts trastuzumab resistance in patients. Cancer cell Aug;6(2): PubMed PMID: Laurent-Puig P, Cayre A, Manceau G, Buc E, Bachet JB, Lecomte T, et al. Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wildtype KRAS metastatic colon cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology Dec 10;27(35): PubMed PMID: Noro R, Gemma A, Miyanaga A, Kosaihira S, Minegishi Y, Nara M, et al. PTEN inactivation in lung cancer cells and the effect of its recovery on treatment with epidermal 121

122 growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors. International journal of oncology Nov;31(5): PubMed PMID: Sos ML, Koker M, Weir BA, Heynck S, Rabinovsky R, Zander T, et al. PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer by activation of Akt and EGFR. Cancer research Apr 15;69(8): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID: Shvero J, Koren R, Shvili I, Yaniv E, Sadov R, Hadar T. Expression of human DNA Topoisomerase II-alpha in squamous cell carcinoma of the larynx and its correlation with clinicopathologic variables. American journal of clinical pathology Dec;130(6): PubMed PMID: Deng G, Yang C, Chen W. [The expression of ki-67, topoiialpha in laryngeal squamous cell carcinoma]. Lin chuang er bi yan hou ke za zhi = Journal of clinical otorhinolaryngology May;19(9): PubMed PMID: Horibe Y, Murakami M, Komori K, Imaeda Y, Kasahara M. Expression of topoisomerase II alpha, Ki-67 and p53 in early stage laryngeal carcinomas not featuring vocal cord fixation. APMIS : acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica Oct;108(10): PubMed PMID: Gebhart E, Liehr T. Patterns of genomic imbalances in human solid tumors (Review). International journal of oncology Feb;16(2): PubMed PMID: Patmore HS, Ashman JN, Stafford ND, Berrieman HK, MacDonald A, Greenman J, et al. Genetic analysis of head and neck squamous cell carcinoma using comparative genomic hybridisation identifies specific aberrations associated with laryngeal origin. Cancer letters Dec 8;258(1): PubMed PMID: Kleist B, Bankau A, Lorenz G, Poetsch M. Multiple chromosomal underrepresentations detected by interphase cytogenetics - possible prognostic markers in head and neck tumors? Pathology oncology research : POR. 2001;7(1): PubMed PMID: Hardisson D, Alvarez-Marcos C, Salas-Bustamante A, Alonso-Guervos M, Sastre N, Sampedro A. Numerical aberrations of chromosomes 8, 9, 11, and 17 in squamous cell carcinoma of the pharynx and larynx: a fluorescence in situ hybridization and DNA flow cytometric analysis of 50 cases. Oral oncology Apr;40(4): PubMed PMID: Yoo WJ, Cho SH, Lee YS, Park GS, Kim MS, Kim BK, et al. Loss of heterozygosity on chromosomes 3p,8p,9p and 17p in the progression of squamous cell carcinoma of the 122

123 larynx. Journal of Korean medical science Jun;19(3): PubMed PMID: Pubmed Central PMCID:

124 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 124

125 Α. Β. Εικόνα 1Π. Α. Καρκίνωμα λάρυγγα με έντονη, κυρίως μεμβρανική, έκφραση του EGFR/HER1 B. Απουσία έκφρασης του HER1. 125

126 A. B. Εικόνα 2Π. Α. Υπερέκφραση (3+) του HER2 υποδοχέα από τα κύτταρα του όγκου. B. Απουσία έκφρασης του HER2. 126

127 Α. Β. Εικόνα 3Π. Α. Καρκίνωμα λάρυγγα με υψηλή έκφραση του Ki67 (>25%). B. Νεόπλασμα με χαμηλή έκφραση του Ki

128 Α. Β. Εικόνα4Π. Α. Πυρηνική έκφραση του αντι-hpvc αντισώματος από τα νεοπλασματικά κύτταρα, γεγονός ενδεικτικό λοίμωξης από τον ιό HPV. Β. Απουσία έκφρασης του αντι-hpvc. 128

129 Α. Β. Εικόνα 5Π. Α. Πυρηνική έκφραση του αντι-hpv18 αντισώματος από τα ολιγάριθμα κύτταρα του πλακώδους λαρυγγικού καρκινώματος γεγονός ενδεικτικό λοίμωξης από τον υπότυπο 18 του ιού HPV. Β. Απουσία έκφρασης του HPV