ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΓΕΩΡΓΙΟΥ Ι. ΦΛΩΡΟΥ Πτυχιούχου Κτηνίατρου Υπότροφου Ι.Κ.Υ. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΛΑΚΤΟΒΑΚΙΛΛΩΝ ΑΠΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΑ ΤΥΡΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπων Καθηγητής: Νικόλαος Τζανετάκης ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 ΓΕΩΡΓΙΟΥ Ι. ΦΛΩΡΟΥ Πτυχιούχου Κτηνίατρου Υπότροφου Ι.Κ.Υ. ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΛΑΚΤΟΒΑΚΙΛΛΩΝ ΑΠΟ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΑ ΤΥΡΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στο Τμήμα Γεωπονίας Τομέας Επιστήμης και Τεχνολόγίας Τροφίμων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 29 Οκτωβρίου 2010 Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής: Νικόλαος Τζανετάκης (επιβλέπων καθηγητής) Καθηγήτρια: Ευανθία Λιτοπούλου - Τζανετάκη Αναπλ. Καθηγητής: Μηνάς Γιάγκου 1

3 Γεώργιος Ι. Φλώρος Α.Π.Θ. Τίτλος Μεταπτυχιακής Διατριβής ISBN Η έγκριση της παρούσης Μεταπτυχιακής Διατριβής από την Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ.2) 2

4 Στους γονείς μου και στη σύζυγό μου 3

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Δεκαεννιά απομονώσεις προαιρετικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων από φέτα, γραβιέρα και κασέρι ταυτοποιήθηκαν με την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου ως Lb. paracasei subsp. paracasei (12 στελέχη) και Lb. plantarum (7 στελέχη) και διαφοροποιήθηκαν σε επίπεδο στελέχους με την RAPD-PCR. Επίσης, μελετήθηκαν οι τεχνολογικές ιδιότητες, όπως η ικανότητα οξίνισης, η πρωτεολυτική και η ενζυμική δραστηριότητα. Τα εξεταζόμενα στελέχη εμφάνισαν μικρή ικανότητα οξίνισης με σημαντικές διαφορές (P<0,05) μεταξύ των στελεχών μετά από ανάπτυξη σε γάλα για 24 ώρες. Επίσης, εμφάνισαν διαφορετική ικανότητα καζεϊνολυτικής δραστηριότητας με το 50% των στελεχών να παράγουν αμινοξέα σε μικρές ποσότητες στο γάλα. Οι απομονώσεις των λακτοβακίλλων εμφάνισαν διαφορετικό ενζυμικό προφίλ, όπου η β-γαλακτοσιδάση έχει την μεγαλύτερη καταγεγραμμένη δραστηριότητα. Οι προβιοτικές ιδιότητες μελετήθηκαν in vitro ως προς την αντοχή σε χαμηλό ph, χολικά άλατα και παγκρεατίνη. Οι απομονώσεις της φέτας εμφάνισαν καλύτερη (P<0,05) επιβίωση από τα στελέχη που προέρχονται από το κασέρι και την γραβιέρα σε χαμηλό ph, όπου ζωντανά κύτταρα βρέθηκαν ακόμα και μετά από 3 ώρες σε ph 2,0. Όλες οι απομονώσεις επιβίωσαν σε 0,3% χολικά άλατα και παρουσία παγκρεατίνης 0,1%. Τέλος, καταγράφηκαν διαφορετικά προφίλ αντιβακτηριακής δράσης. Τα στελέχη αναχαίτησαν επιλεκτικά άλλα γαλακτικά βακτήρια και κάποια ακόμα και κλωστρίδια, E. coli και B. cereus. Τα στελέχη που ξεχώρισαν (Κ32, Γ16, Ε22, Κ31, 682 και Θ27) είναι υποψήφια για μελλοντική χρήση ως πρόσθετες καλλιέργειες και θα ήταν χρήσιμο να ερευνηθούν περαιτέρω. 4

6 ABSTRACT Nineteen isolates of facultatively heterofermentative lactobacilli from Feta, Graviera, and Kaseri cheeses were identified by SDS-PAGE of whole-cell proteins as Lb. paracasei subsp. paracasei (12 strains) and Lb. plantarum (7 strains) and differentiated at strain level by RAPD-PCR. Properties of technological interest, such as acidification ability, proteolytic activity and enzyme activities were also studied. The test strains exhibited a low acidification activity, with significant (P<0,05) interstain differences after growth in milk for 24h. They were also characterized by different casein breakdown ability, with around 50% of them accumulating amino acids at low amounts in the milk. Lactobacilli isolates differed in respect of enzyme activities, with β-galactosidase being the strongest activity found. Their probiotic potential was evaluated with in vitro studies on the resistance to low ph, bile salts and pancreatin. The isolates from Feta showed a better (P<0,05) survival than those from Kaseri and Graviera at low ph and viable cells were detected even after 3h at ph 2,0. All strains tolerated bile salts at 0,3% and retained viability in the presence of pancreatin at 0,1%. Different patterns of antimicrobial activities were recorded. The strains inhibited preferentially other LAB and some of them Clostridia, E. coli and B. cereus. Distinguished strains (K32, G16, E22, K31, 682 and H27) are promising candidates as adjuncts and deserve further studies. 5

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Δεν βρίσκω λόγια να εκφράσω την βαθύτατη ευγνωμοσύνη μου στους καθηγητές μου κα. Ευανθία Λιτοπούλου-Τζανετάκη και κ. Νικόλαο Τζανετάκη, ο οποίος ήταν και ο επιβλέπων καθηγητής. Υπήρξαν αυτοί που είχα ως στήριγμα και μου έδιναν απλόχερα την βοήθειά τους κάθε στιγμή που την χρειαζόμουν. Τους ευχαριστώ από τα βάθη της ψυχής μου για την επιστημονική τους καθοδήγηση, τις συμβουλές και πάνω απ όλα τους ευχαριστώ που με δεχτήκαν τόσο πρόθυμα με αγάπη. Επίσης, ευχαριστώ πολύ τον κ. Μηνά Γιάγκου, αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Βιολογίας, Α.Π.Θ. για την αποδοχή του ως μέλος της εξεταστικής μου επιτροπής. Ευχαριστώ πολύ τη Μάγδα Χατζηκαμάρη μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ για την πολύτιμη και ουσιαστική βοήθειά της στην διεξαγωγή της SDS-PAGE, για τις γνώσεις της και τις επιστημονικές μας συζητήσεις. Επίσης ευχαριστώ πολύ την Ευγενία Χαριτωνίδου, μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την προθυμία της, την αμέριστη βοήθειά της και για την ευγένιά της. Ευχαριστώ πολύ τους συμφοιτητές και συνεργάτες μου, Μποζούδη Δέσποινα, Παυλίδου Σοφία και Παπανικολάου Ζαχαρία για την αλληλοστήριξη, την βοήθειά τους και την ευχάριστη παρέα τους. Ευχαριστώ τους γονείς μου, Ιωάννη και Μαρία Φλώρου γιατί σε αυτούς χρωστάω τα πάντα! Η απεριόριστη αγάπη τους και η υποστήριξη που μου προσφέρουν μου δίνει δύναμη να συνεχίζω να αγωνίζομαι. Άφησα για το τέλος τον άνθρωπο που δίνει νόημα στη ζωή μου, που με στηρίζει σε κάθε στιγμή και που είναι τα πάντα για μένα! Ένα τεράστιο ευχαριστώ στη σύζυγό μου Αγγελική Μαλογιάννη για την υπομονή και την κατανόησή της! Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου προς το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) για την οικονομική ενίσχυση κατά την διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. 6

8 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ Παραδοσιακά Ελληνικά τυριά Γαλακτικά βακτήρια που δεν ανήκουν στην καλλιέργεια εκκίνησης (NSLAB) Εισαγωγή Γαλακτικά βακτήρια Μικροοργανισμοί που απαντώνται φυσιολογικά στα τυριά Πηγή NSLAB Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη και επιβίωση των NSLAB Συνθήκες περιβάλλοντος Διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών Αλληλεπιδράσεις Επίδραση των NSLAB στην ποιότητα του τυριού κατά την διάρκεια της ωρίμανσης Πρωτεολυτικό σύστημα NSLAB Πρωτεϊνάσες Πεπτιδάσες Προσθετικές καλλιέργειες NSLAB (adjunct cultures) Κριτήρια επιλογής στελεχών NSLAB ως προσθετικές καλλιέργειες Διαδικασία επιλογής στελεχών NSLAB ως προσθετικές καλλιέργειες Απομόνωση και ταυτοποίηση των δυνητικά προσθετικών καλλιεργειών NSLAB Χαρακτηρισμός των προσθετικών καλλιεργειών NSLAB Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Εισαγωγή Γενικά Ορισμοί Ταξινόμηση και ταυτοποίηση προβιοτικών μικροργανισμών Γαστρεντερικό σύστημα Γενικά Εντερική μικροχλωρίδα Φυσιολογικός ρόλος εντερικής μικροχλωρίδας Φυσιολογική δράση προβιοτικών Μηχανισμοί δράσης Φυσιολογικές επιδράσεις στον άνθρωπο Προϋποθέσεις δράσης Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Διαδικασία επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών - κριτήρια Ασφάλεια προβιοτικών μικροοργανισμών

9 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στελέχη βακτηρίων και συνθήκες ανάπτυξης Ταυτοποίηση των απομονώσεων Φαινοτυπικές ιδιότητες Χρώση Gram Έλεγχος ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες Έλεγχος ανάπτυξης σε διάφορες συγκεντρώσεις NaCl Παραγωγή CΟ 2 από γλυκόζη Υδρόλυση αισκουλίνης Παραγωγή αμμωνίας από αργινίνη Ζύμωση σακχάρων Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με SDS-PAGΕ των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους με RAPD-PCR Εξαγωγή του DNA Ποσοτικοποίηση του DNA Έλεγχος καθαρότητας του DNA Αραίωση του DNA Αντίδραση RAPD-PCR Τεχνολογικές ιδιότητες Ικανότητα οξινίσεως Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Δοκιμή αφομοίωσης κιτρικών Δοκιμές πρωτεολυτικής δράσης Δοκιμή API ZYM Προβιοτικές ιδιότητες Αντοχή σε χαμηλό ph Αντοχή στα χολικά οξέα Αντοχή στο παγκρεατικό υγρό Αντιβακτηριακή δράση Δοκιμή υδρόλυσης χολικών αλάτων Αντοχή σε αντιβιοτικά Δοκιμές παθογένειας Δοκιμή αιμόλυσης Δοκιμή αναγωγής νιτρικών Δοκιμή παραγωγής DNAσης Δοκιμή υδρόλυσης ζελατίνης Στατιστική επεξεργασία

10 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Tαυτοποίηση Ταυτοποίηση των απομονώσεων με βάση τις φαινοτυπικές ιδιότητες Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους με την RAPD-PCR Τεχνολογικές ιδιότητες Ικανότητα οξινίσεως Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Δοκιμή αφομοίωσης κιτρικών Δοκιμή πρωτεολυτικής δράσης Δοκιμή API ZYM Προβιοτικές ιδιότητες Επίδραση χαμηλού ph Αντοχή στα χολικά οξέα Αντοχή στο παγκρεατικό υγρό Αντιβακτηριακή δράση Δοκιμή υδρόλυσης χολικών αλάτων Αντοχή σε αντιβιοτικά Δοκιμές παθογένειας...92 Παραγωγή αιμολυσίνης, Δοκιμή αναγωγής νιτρικών, Δοκιμή παραγωγής DNAσης, Δοκιμή υδρόλυσης ζελατίνης 5.5 Επιλογή στελεχών ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για την εμπορική χρήση στελεχών λακτοβακίλλων που έχουν απομονωθεί από παραδοσιακά γαλακτοκομικά προϊόντα, που ωριμάζουν με φυσικό τρόπο και έχουν θετικές επιδράσεις στην υγεία του καταναλωτή. Για να διατηρηθούν όμως οι ιδιότητες αυτές, πρέπει οι μικροοργανισμοί να επιβιώνουν σε ικανοποιητικό βαθμό μέχρι τη στιγμή της κατανάλωσής τους (Kalavrouziofi et al., 2005) και να ξεπερνούν φυσικούς και χημικούς φραγμούς στο γαστρεντερικό σωλήνα και ιδιαίτερα το χαμηλό οξύ του στομάχου και τα χολικά άλατα του ήπατος που εκκρίνονται στο λεπτό έντερο μετά την πρόσληψη της τροφής (Del Piano et al., 2006). Σχετικά με της θετικές επιδράσεις των λακτοβακίλλων στην υγεία του καταναλωτή, αυτές περιλαμβάνουν την διατήρηση του πληθυσμού της ενδογενούς μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου, την προστασία έναντι μικροβιακής μόλυνσης, την ανακούφιση από τα συμπτώματα της δυσανεξίας της γλυκόζης, την αύξηση της θρεπτικής αξίας των τροφών, την μείωση της χοληστερόλης στον ορό του αίματος και την μη ειδική ανοσοενίσχυση (Gaudana et al., 2010). Πολλές έρευνες είχαν ως στόχο την μελέτη των λειτουργικών ιδιοτήτων των αυτόχθονων λακτοβακίλλων και πρόσφατες μελέτες εστίασαν στις αντιμεταλλαξιογόνες ιδιότητές τους (Vizoso Pinto et al., 2006). Επίσης, ολοένα και περισσότερο αναγνωρίζεται η ικανότητα του Lactobacillus plantarum να προστατεύει από το κοκκίωμα των επιθηλιακών κυττάρων (Epitheloid Cell Granulomas, EPCG), το οποίο προκαλεί βλάβη στη λειτουργία του φραγμού της μονοστοιβάδας των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου. Βασικό κριτήριο επιλογής στελεχών ως πρόσθετα τροφίμων αποτελούν σημαντικές ιδιότητες, όπως αντοχή σε χαμηλό ph και χολικά άλατα, που επιτρέπουν τον μικροοργανισμό να επιβιώσει και να αναπτυχθεί στο γαστρεντερικό σύστημα (FAO/WHO, 2002). Επίσης, ανάμεσα στις επιθυμητές ιδιότητες είναι και η ικανότητά τους να παράγουν αντιμικροβιακές ουσίες, ο ανταγωνισμός για θρεπτικές ουσίες, ο αποκλεισμός των παθογόνων και η διαμόρφωση του ανοσοποιητικού συστήματος (Parvez et al., 2006). Τα έτοιμα κιτ ζύμωσης σακχάρων API 50CH χρησιμοποιούνται ευρέως για την ταυτοποίηση των λακτοβακίλλων (Boyd et al., 2005, Bringel et al., 2005, De Bruyne et al., 2009). Η τεχνική αυτή όμως, δεν μπορεί να διαχωρίσει στενά συγγενικά είδη, όπως μεταξύ των ομάδων του Lb. casei και του Lb. plantarum (Johansson et al., 10

12 1995), γι αυτό και χρησιμοποιούνται πλεόν οι μοριακές τεχνικές (Xanthopoulos et al., 2000, Kwon et al., 2004, Furet et al., 2004, Chien-Hsun et al., 2010), όπως επίσης και η SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου (Durlu-Ozlaya et al., 2001, Pot et al., 1994). Η ταυτοποίηση μεταξύ των ειδών σε επίπεδο στελέχους με την RAPD-PCR αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο, το οποίο παρέχει περισσότερες πληροφορίες για τα στελέχη και την βιοπαραλλακτικότητά τους (Psoni et al., 2006, DeAngelis et al., 2001, Weinrichter et al., 2001, Franciosi et al., 2009). Σύμφωνα με την τωρινή ταξινόμηση, η ομάδα του Lb. plantarum περιλαμβάνει πέντε (5) στενά συγγενικά είδη: Lb. plantarum subsp. plantarum, Lb. plantarum subsp. argentoratensis, Lb. paraplantarum, Lb. pentosus και Lb. fabrifermentans (DeBruyne et al., 2009). Τα είδη Lb. plantarum, Lb. paraplantarum και Lb. pentosus βρίσκονται συχνότερα από τα υπόλοιπα σε Ελληνικά παραδοσιακά τυριά (Psoni et al., 2009). Τα είδη Lb. plantarum και Lb. pentosus έχουν αποδειχτεί ότι έχουν προβιοτικές ιδιότητες και χρησιμοποιούνται ευρέως στα τρόφιμα και στη βιομηχανία τροφίμων (Casey et al., 2007, Holzapfel et al., 2001, Ruizbarba et al., 1994). Επίσης, ο Lb. plantarum subsp. plantarum βρέθηκε να έχει ευεργετικές επιδράσεις στο ανοσοποιητικό σύστημα (Bujalance et al., 2007). Στην παρούσα μελέτη, μελετήθηκαν στελέχη απομονώσεων προαιρετικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων από φέτα (Vassiliadis et al., 2009), κασέρι (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα) και γραβιέρα (μη δημοσιευμένα αποτελέσματα), που σύμφωνα με τα φαινοτυπικά τους χαρακτηριστικά είναι αμφίβολης ταξινόμησης. Συγκεκριμένα, εξετάστηκε μία σειρά από κριτήρια, που υιοθετήθηκαν από τον FAO/WHO (2002), με βάση τα οποία χαρακτηρίζεται ένα στέλεχος ως προβιοτικό ή όχι. Τα στελέχη, επίσης, ταυτοποιήθηκαν με φαινοτυπικά κριτήρια, με SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου (σε επίπεδο είδους) καθώς και με RAPD-PCR (σε επίπεδο στελέχους). Ο σκοπός ήταν να επιλεγούν υποψήφια προβιοτικά στελέχη κατάλληλα για να χρησιμοποιηθούν ως πρόσθετα κατά την παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων. 11

13 2. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 2.1 Παραδοσιακά Ελληνικά τυριά Η Ελλάδα είναι χώρα με πολύ μεγάλη ιστορία αλλά και παραδόσεις που χάνονται στα βάθη των αιώνων. Μερικές απ αυτές αναφέρονται στο γάλα και στα προϊόντα του. Για παράδειγμα για τους αρχαίους Έλληνες το γάλα εθεωρείτο ιερή τροφή γιατί ο Δίας, ο αρχηγός των θεών του Ολύμπου, ανατράφηκε με το γάλα της νύμφης Αμάλθειας, ενώ σύμφωνα με την ελληνική μυθολογία η τέχνη της τυροκομίας δόθηκε ως δώρο στους κοινούς θνητούς από τους θεούς του Ολύμπου. Η χώρα μας συγκαταλέγεται στη λίστα των δέκα πρώτων χωρών του κόσμου στην τυροπαραγωγή, ενώ όπως είναι γνωστό οι Έλληνες φτιάχνουν το τυρί "φέτα" επί έξι χιλιάδες χρόνια. Στην Ελλάδα έχουμε έναν πολύ μεγάλο αριθμό διαφορετικών τυριών, καθώς η γεωγραφική διαμόρφωση της πατρίδας μας, με τους ορεινούς όγκους και ο μεγάλος αριθμός των νησιών μας επέτρεψε την διαμόρφωση μίας πολύ μεγάλης ποικιλίας διαφορετικών και σημαντικών τυριών. Εκείνο που χαρακτηρίζει τα παραδοσιακά τυριά της Ελλάδος είναι η υψηλή τους ποιότητα και τα πρωτότυπα χαρακτηριστικά τους, στα οποία οφείλουν και την καλή τους φήμη. Για την παρασκευή των τυριών αυτών χρησιμοποιείται, σχεδόν αποκλειστικά, πρόβειο και γίδινο γάλα, τα οποία διαφέρουν σημαντικά στη σύσταση και στα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά από το αγελαδινό. Αναμενόμενο είναι και τα τυριά που παρασκευάζονται από τα γάλατα αυτά να είναι διαφορετικά. Πέραν αυτού, οι ιδιαίτερες εδαφοκλιματικές συνθήκες της χώρας, οι εκτρεφόμενες φυλές αιγοπροβάτων, η μεγάλη ποικιλία της χλωρίδας της, οι συνθήκες παραγωγής και επεξεργασίας του γάλακτος σε συνδυασμό με την μακρόχρονη εμπειρία των Ελλήνων τυροκόμων στην αξιοποίηση αιγοπρόβειου γάλακτος είναι παράγοντες που επηρεάζουν και διαμορφώνουν τα πρωτότυπα χαρακτηριστικά τους. Η μελέτη της αυτόχθονης οξυγαλακτικής μικροχλωρίδας των παραδοσιακών τυριών της Ελλάδος αποτελεί αντικείμενο έρευνας με σκοπό τη βελτίωση της μικροβιολογικής κατάστασης των τυριών. Η οξυγαλακτική μικροχλωρίδα που επικρατεί συμβάλλει στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών τους χαρακτηριστικών με τις βιοχημικές τους δράσεις. 12

14 2.2 Γαλακτικά βακτήρια που δεν ανήκουν στην καλλιέργεια εκκίνησης (NSLAB) Εισαγωγή Η συντήρηση των τροφίμων με την βοήθεια της διαδικασίας της ζύμωσης είναι μία από τις παλαιότερες μεθόδους που χρησιμοποιούσε ο άνθρωπος. Ένα τυπικό παράδειγμα αποτελεί η γαλακτική ζύμωση, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως κατά την παραγωγή ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων, όπως για παράδειγμα το τυρί, το γιαούρτι το ξυνόγαλα κ.α. Η μετατροπή του γάλακτος σε τυρί είναι, κατά πάσα πιθανότητα, ο πλέον αποτελεσματικός τρόπος να αποθηκευτεί το γάλα σε μία πρακτική και εύγευστη μορφή. Η ζύμωση αυτή αποτελεί συνέπεια της παρουσίας μικροοργανισμών (βακτήρια, ζύμες, μύκητες) καθώς και των ενζύμων τους στο γάλα (Tamime, 1990). Η μικροβιακή χλωρίδα συνεισφέρει τόσο στην συντήρηση όσο και την ανάπτυξη των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τυριών. Επιπλέον, ορισμένα βακτήρια φαίνεται να συμβάλλουν θετικά στην υγεία των καταναλωτών (Cogan et al., 2007). Κατά συνέπεια, η μελέτη της μικροβιακής ποικιλότητας και της λειτουργικότητας των οικοσυστημάτων τους θα μπορούσε να βοηθήσει στον καλύτερο έλεγχο της ποιότητας και ασφάλειας των τυριών (Irlinger and Mounier, 2009) Γαλακτικά βακτήρια Τα γαλακτικά βακτήρια αποτελούν μία ετερογενή ομάδα μικροοργανισμών, τα οποία διαθέτουν ορισμένες κοινές φυσιολογικές ιδιότητες. Το κύριο χαρακτηριστικό τους γνώρισμα, είναι ότι ζυμώνουν την λακτόζη σε γαλακτικό οξύ μέσω ομο- ή ετερο- ζυμωτικής οδού (Salminen and non Wright, 1998). Τα γαλακτικά βακτήρια είναι Gram θετικά, καταλάση αρνητικά, μη σπορογόνα, με χαμηλή αναλογία G + C (γουανίνης + κυτοσίνης) και προαιρετικά αναερόβια (Kandler and Weiss, 1986, Holzapfel et al., 2001). Η ετερογένεια της ομάδας εμφανίζεται στα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους, καθώς εμφανίζονται ως ραβδία ή κόκκοι, μόνα τους ή σε συσσωματώματα, σε κοντές ή μακριές αλυσίδες. Το περιβάλλον του τυριού κατά το στάδιο της ωρίμανσης, αποτελεί ένα εχθρικό περιβάλλον για τους μικροοργανισμούς, καθώς χαρακτηρίζεται, σε γενικές γραμμές, από την παρουσία άλατος σε υψηλά επίπεδα (4,0-6,0%), χαμηλής υγρασίας και θερμοκρασίας, σχετικά αναερόβιες συνθήκες, τιμή ph 4,9-5,3 και ανεπάρκεια θρεπτικών ουσιών (Turner et al., 1986, Fox et al., 1996, Stanton et al., 1998). Οι 13

15 συνθήκες αυτές είναι ικανές να αναχαιτίσουν την ανάπτυξη πολλών ομάδων μικροοργανισμών, εκτός από ορισμένα είδη γαλακτικών βακτηρίων, τα οποία αντέχουν σε αυτές τις συνθήκες και αναπτύσσουν ενδιαφέρουσες ιδιότητες (Peterson and Marshall, 1990) Μικροοργανισμοί που απαντώνται φυσιολογικά στα τυριά Οι μικροοργανισμοί που απαντώνται φυσιολογικά στα τυριά ποικίλουν σε μεγάλο βαθμό. Θα μπορούσαν πρακτικά να χωριστούν σε δύο κύριες κατηγορίες: γαλακτικά βακτήρια εκκινητές (Starter Lactic Acid Bacteria, SLAB) και δευτερεύουσα μικροχλωρίδα. Στην πρώτη κατηγορία ανήκει ουσιαστικά η καλλιέγεια εκκίνησης που προστίθεται αρχικά στο γάλα για να ξεκινήσει η ζύμωση. Διακρίνονται δύο υποκατηγορίες η πρωτεύουσα και η δευτερεύουσα καλλιέργεια εκκίνησης. Η πρώτη αποτελείται από γαλακτικά βακτήρια, που έχουν επιλεγεί με προσοχή και προστίθενται στο γάλα, όπου «εκκινούν», ξεκινούν δηλαδή την παραγωγή γαλακτικού οξέος από την λακτόζη, με την διαδικασία της ζύμωσης, κατά τα αρχικά στάδια της παραγωγής του τυριού. Σύμφωνα με εμπειρικό κανόνα, πρέπει οι μικροοργανισμοί αυτοί να μειώνουν την τιμή του ph του γάλακτος κάτω από 5,3 μέσα σε 6 ώρες στους o C. Τα γαλακτικά βακτήρια που συνήθως απαντώνται είναι μεσόφιλα ή θερμόφιλα. Η δευτερεύουσα καλλιέργεια εκκίνησης προστίθεται σκοπίμως για να υποβοηθήσει την διαδικασία της ωρίμανσης, χωρίς να λαμβάνει μέρος στην οξίνιση κατά το αρχικό στάδιο παρασκευής του τυριού. Εδώ ανήκουν μύκητες, ζύμες κ.α., τα οποία αναπτύσσονται ως επί το πλείστον στην επιφάνεια του τυριού. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκει η ομάδα των μη εκκινητών γαλακτικών βακτηρίων (non starter lactic acid bacteria, NSLAB), τα οποία απομονώθηκαν για πρώτη φορά από τυρί το 1912 (Cogan et al., 2007). Τα βακτήρια αυτά δεν προστίθενται σκοπίμως ως μέρος της καλλιέργειας εκκίνησης, αλλά βρίσκονται τυχαία στο γάλα, όπου αναπτύσσονται κατά την ωρίμανση του τυριού. Ο αριθμός τους στο τυρί, εξαρτάται από τον αρχικό πληθυσμό τους στο γάλα, και την μόλυνση του γάλακτος μετά την παστερίωση (Peterson and Marshall, 1990). Ο κύριος ρόλος τους δεν είναι η παραγωγή οξέος από την λακτόζη κατά την παραγωγή του τυριού, αλλά η άμεση επίδραση στην ανάπτυξη των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του τυριού κατά την ωρίμανσή του. Οι βασικές ομάδες βακτηρίων της κατηγορίας αυτής, 14

16 είναι οι μη εκκινητές λακτοβάκιλλοι (π.χ. Lactobacillus paracasei susbsp. paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei), leuconostocs (Leuconostoc lactis), πεδιόκοκκοι (Pediococcus acidilactici) και εντερόκοκκοι (π.χ. Enterococcus faecalis). Οι προαιρετικά ετεροζυμωτικοί μη εκκινητές μεσόφιλοι λακτοβάκιλλοι αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των NSLAB στα περισσότερα τυριά κατά την διαδικασία της ωρίμανσης (Manolopoulou et al., 2003, Beresford and Williams, 2004, Casey et al., 2006, Gobbetti et al., 2007). Ειδικότερα, στο τυρί φέτα, λόγω της υψηλής συγκέντρωσης σε αλάτι, επιβιώνουν είδη, όπως: Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus paracasei susbsp. paracasei, Lactobacillus paracasei susbsp. tolerans (Vassiliadis et al., 2009). Οι Williams και Banks (1997) όταν μελέτησαν το τυρί Cheddar παρατήρησαν ότι η πλειοψηφία των NSLAB αποτελούν τα στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei και Lb. plantarum. Σε γενικές γραμμές φαίνεται ο πληθυσμός των NSLAB να ποικίλει ανάλογα με την ποικιλία του τυριού, την διαδικασία παρασκευής καθώς και την χρονική περίοδο ωρίμανσης του τυριού (Casey et al., 2006) Πηγή NSLAB Τα NSLAB είναι παρόντα σε τυριά τόσο από νωπό γάλα, όσο και από γάλα επεξεργασμένο θερμικά. Η ποικιλομορφία του πληθυσμού όμως δεν είναι ίδια, καθώς στο τελευταίο είναι σημαντικά χαμηλότερη συγκριτικά με το τυρί από νωπό γάλα. Έρευνες έχουν δείξει πως τόσο το νωπό, όσο και το παστεριωμένο γάλα αποτελούν σημαντική πηγή NSLAB (Jordan and Cogan, 1999, Berthier et al., 2001, Casey et al., 2006). Στο παστεριωμένο γάλα τα NSLAB μπορεί να βρεθούν είτε από μόλυνση μετά την παστερίωση, ή από την παρουσία αυτόχθονων NSLAB, που προϋπήρχαν στο νωπό γάλα και επιβίωσαν της παστερίωσης (Fitzsimons et al., 1999, Turner, Lawrence and Levriere, 1986, Gobbetti et al., 1999, Casey et al., 2006). Ακόμη, τα NSLAB προέρχονται και από το περιβάλλον καθώς και από τον εξοπλισμό του τυροκομείου, όπως δεξαμενές, σωληνώσεις, δοχεία κ.α. (Lane and Fox, 1996, Somers et al., 2001, Casey et al., 2006). Τα είδη που κυριαρχούν είναι λακτόκοκκοι και μεσόφιλοι λακτοβάκιλλοι (Soldatou et al., 2006). 15

17 2.2.5 Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη και επιβίωση των NSLAB Συνθήκες περιβάλλοντος Τα NSLAB δεν επηρεάζονται σημαντικά από τις συνθήκες που επικρατούν στο τυρί και είναι ικανά να αναπτυχθούν κατά την διάρκεια παρασκευής και, ιδιαίτερα, κατά την διάρκεια ωρίμανσης του τυριού. Οι Lane et al. (1997) αναφέρουν ότι λακτοβάκιλλοι και εντερόκοκκοι που απομονώθηκαν από τυρί Cheddar δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από διακυμάνσεις του ph, του NaCl και της υγρασίας κατά την παρασκευή του τυριού Διαθεσιμότητα θρεπτικών ουσιών Τα NSLAB, όπως κάθε ζωντανός μικροοργανισμός, χρειάζονται πηγή ενέργειας για να αναπτυχθούν. Οι πιθανές πηγές ενέργειας περιλαμβάνουν συστατικά του γάλακτος, προϊόντα μεταβολισμού και προϊόντα λύσης βακτηρίων. Η διαθεσιμότητα, όμως, των θρεπτικών συστατικών στο τυρόπηγμα αλλάζει με την πάροδο της ωρίμανσης, με αποτέλεσμα να επηρεάζεται η ετερογένεια του πληθυσμού των NSLAB (Williams et al., 2000). Το επίπεδο της υπολειμματικής λακτόζης μπορεί να είναι χαμηλό, αλλά συνήθως υπάρχει κάποια ποσότητα όταν αρχίζουν τα NSLAB να αναπτύσσονται. Υπάρχει όμως η πιθανότητα, η ανάπτυξη να λάβει χώρα αφού όλη η ποσότητα της λακτόζης έχει χρησιμοποιηθεί, γεγονός που υποδεικνύει ότι δεν αποτελεί την μοναδική πηγή ενέργειας (Tuner and Thomas, 1980). Ο Waldron (1997) έδειξε ότι η ανάπτυξη των NSLAB ήταν ανεξάρτητη από την παρουσία λακτόζης. Ο Thomas (1987) υποστήριξε ότι το γαλακτικό οξύ που παράγεται με την ζύμωση της λακτόζης από την καλλιέργεια εκκίνησης, είναι δυνατό να αποτελεί πηγή ενέργειας για τα NSLAB. Ακόμη, προϊόντα όπως σάκχαρα και νουκλεϊκό οξύ που απελευθερώνονται κατά την αυτόλυση βακτηρίων, που ανήκουν στην καλλιέργεια εκκίνησης από τα υδρολυτικά τους ένζυμα, φαίνεται να μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα από τα NSLAB για την ανάπτυξή τους (Thomas, 1987, Olson et al., 1990, Adamberg et al., 2005). Η αυτόλυση των SLAB φαίνεται να επηρεάζει και έμμεσα την ανάπτυξη των NSLAB με την απελευθέρωση εσωκυτταρικών πεπτιδασών, οι οποίες παρέχουν τα απαραίτητα αμινοξέα από τον καταβολισμό των πεπτιδίων, τα οποία προέρχονται από την δράση της πρωτεϊνάσης του γάλακτος και της πυτιάς (Fox, 1989, Lane and Fox, 1996). Τέλος, ορισμένα NSLAB έχουν αυξημένη δραστηριότητα πρωτεϊνάσης, η οποία υδρολύει της καζεΐνες του γάλακτος (Cogan et al., 2007). Ειδικότερα, οι λακτοβάκιλλοι διαθέτουν πρωτεάσες και πεπτιδάσες, με τη 16

18 δράση των οποίων μπορούν να απελευθερώνουν τα απαραίτητα γι αυτούς αμινοξέα (Peterson and Marshall, 1990). Αξίζει να τονιστεί ότι, καθώς παρατηρούνται διαφορές, μεταξύ των στελεχών NSLAB, ως προς την ικανότητα μεταβολισμού θρεπτικών ουσιών, αναμένεται να σημειωθούν διαφορές και ως προς την σύσταση του πληθυσμού των NSLAB κατά την πορεία της ζύμωσης, με την επικράτηση των κατάλληλων στελεχών, καθε φορά, να χρησιμοποιούν τα εκάστοτε θρεπτικά συστατικά (Williams et al., 2000) Αλληλεπιδράσεις Η μικροβιακή χλωρίδα του τυριού είναι περίπλοκη, με συνέπεια οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μικροοργανισμών ίδιου είδους, αλλά και μεταξύ των ειδών να είναι αναμενόμενες. Πειράματα σε τυριά έδειξαν ότι μια σειρά από αλληλεπιδράσεις λαμβάνουν χώρα μεταξύ προκαθορισμένων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων καλλιέργειας εκκίνησης και αυτόχθονων NSLAB (Martley and Crow, 1993, Manolopoulou et al., 2002). Επίσης, αρκετά NSLAB είναι ικανά να παράγουν βακτηριοσίνες με ευρύ ή στενό φάσμα δράσης (Stiles, 1994, Ouwehand, 1998, Franz et al., 1999) Επίδραση των NSLAB στην ποιότητα του τυριού κατά την διάρκεια της ωρίμανσης Με την ολοκλήρωση του αρχικού σταδίου παραγωγής τυριού, όπου περιλαμβάνονται η προσθήκη πυτιάς, καλλιέργειας εκκίνησης, διαίρεση τυροπήγματος-στράγγιση και αλάτισμα, το τυρί ωριμάζει σε περίοδο που κυμαίνεται από 3 εβδομάδες έως 2 χρόνια, ανάλογα το τυρί. Στο σχήμα 2.1 φαίνονται οι μικροβιακές ομάδες και ο ρόλος τους κατά τα βασικά στάδια παραγωγής του τυριού. Κατά την διάρκεια της ωρίμανσης, η υπολειμματική λακτόζη, οι πρωτεΐνες και το λίπος του τυροπήγματος αποικοδομούνται από διάφορα ένζυμα για να δώσουν στο τελικό προϊόν τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά (γεύση, άρωμα, υφή) της κάθε ξεχωριστής ποικιλίας τυριού (McSweeney and Sousa, 2000). Στα περισσότερα τυριά η πρωτεόλυση είναι η κυρίαρχη διαδικασία, η οποία συμβάλλει καθοριστικά στην διαμόρφωση της γεύσης, αρώματος και υφής στο προϊόν. Τα παραγόμενα αμινοξέα επιδρούν τόσο άμεσα στην ανάπτυξη των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, όσο και έμμεσα καθώς αποτελούν πρόδρομες ενώσεις για άλλες ουσίες που εμπλουτίζουν το άρωμα και τη γεύση του τελικού προϊόντος (Williams et al., 1998). Τα ένζυμα που 17

19 συμμετέχουν στην παραπάνω διαδικασία προέρχονται από το γάλα (αυτόχθονα ένζυμα), την πυτιά και κυρίως, από βακτήρια της καλλιέργειας εκκίνησης, από τα NSLAB και από δευτερεύουσες καλλιέργειες που προστίθενται στο γάλα (Fox, 1989, Peterson and Marshall, 1990). Οι καζεΐνες, με την βοήθεια των ενζύμων, υδρολύονται σε πεπτίδια και αμινοξέα, τα οποία καθορίζουν την βασική γεύση του τυριού (Broome, 2007). Επιπλέον καταβολισμός από τα ένζυμα ή μετασχηματισμός των αμινοξέων, αποδίδει προϊόντα που συνεισφέρουν στην δημιουργία του τυπικού αρώματος του κάθε τυριού (Yvon and Rijnen, 2001). Μικροχλωρίδα επιφανειακής ωρίμανσης (ζύμες, μύκητες) Ενδογενής μικροχλωρίδα περιβάλλοντος (ζύμες, μύκητες, NSLAB) Ρόλος: Αξιοποίηση υπολλειματικής λακτόζης και γαλακτικού οξέος, παραγωγή NH 3, πρωτεόλυση, λιπόλυση, ανάπτυξη αρώματος και χρώματος Αύξηση ph Μικροχλωρίδα επιφανειακής ωρίμανσης (μικρόκοκκοι, σταφυλόκοκκοι) Ενδογενής μικροχλωρίδα περιβάλλοντος (μικρόκοκκοι, σταφυλόκοκκοι, HALAB, HGP) Ρόλος: Αξιοποίηση γαλακτικού οξέος και αμινοξέων, πρωτεόλυση, λιπόλυση, ανάπτυξη αρώματος και χρώματος ΣΤΡΑΓΓΙΣΗ ΠΗΞΗ ΣΥΝΑΙΡΕΣΗ ΠΗΓΜΑΤΟΣ ΑΛΑΤΙΣΗ ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΟΞΙΝΙΣΗ Ρόλος LAB starters: παραγωγή γαλακτικού οξέος πρωτεόλυση λιπόλυση ανάπτυξη αρώματος ΠΑΣΤΕΡΙΩΣΗ ΩΡΙΜΟ ΤΥΡΙ ΓΑΛΑ Σχήμα 2.1 Σχηματική απεικόνιση των μικροβιακών ομάδων και ο ρόλος τους κατά τα βασικά στάδια παραγωγής του τυριού (Irlinger and Mounier, 2009) Αποτελεί γενική παραδοχή το γεγονός ότι τα τυριά από παστεριωμένο γάλα υστερούν σε γεύση και άρωμα από τα τυριά από το νωπό γάλα, πράγμα που υποδηλώνει ότι η μικροχλωρίδα του νωπού γάλακτος (συμπεριλαμβανομένων και των NSLAB) και ίσως θερμοευαίσθητα ένζυμα ευθύνονται για την δημιουργία των 18

20 χαρακτηριστικών οργανοληπτικών ιδιοτήτων του τυριού (Lynch et al., 1996, Stanton et al., 1998, Gogan et al., 2007). Επίσης, τα τυριά από νωπό γάλα έχουν την τάση να ωριμάζουν πιο γρήγορα από τυριά από παστεριωμένο γάλα (Lynch et al., 1996, Broome, 2007). Σε γενικές γραμμές η εξέλιξη της καλλιέργειας εκκίνησης (SLAB) και των NSLAB ακολουθεί μία συγκεκριμένη δυναμική (διάγραμμα 2.1). Αρχικά, τα SLAB βρίσκονται σε υψηλούς αριθμούς (περίπου cfu/g) και όσο προχωράει η ωρίμανση μειώνονται, ενώ ο αριθμός των NSLAB ξεκινά από χαμηλά και φτάνει σε υψηλά επίπεδα προς το τέλος της ωρίμανσης (Stanton et al., 1998, Gobbetti et al., 1999, Williams et al., 2000, Beuvier and Buchin, 2004, Adamberg et al., 2005). Διάγραμμα 2.1 Επιβίωση καλλιέργειας εκκίνησης (starter) και NSLAB σε τυρί Cheddar κατά την ωρίμανση (Stanton et al., 1998) 19

21 Καθώς τα NSLAB αναπτύσσονται σε μεγάλους αριθμούς και πολλά τυριά ωριμάζουν για αρκετά μεγάλα χρονικά διαστήματα, η επίδραση που έχουν στην δημιουργία των οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τυριών έχει αποτελέσει αντικείμενο μελέτης σε πολλές έρευνες (Cogan et al., 2007). Γενικά, όσο αυξάνεται η χρονική περίοδος ωρίμανσης και ο αρχικός πληθυσμός NSLAB, τόσο αυξάνεται η επίδραση των NSLAB στα χαρακτηριστικά του τυριού (Crow et al., 2001). Ολοένα αυξανόμενος αριθμός ερευνών δείχνουν ότι επιλεγμένα στελέχη λακτοβακίλλων (NSLAB), που προστίθενται κατα την διαδικασία παρασκευής του τυριού, έχουν θετική επίδραση στην ποιότητα του τελικού προϊόντος (Fox et al., 1998, πίνακας 2.1). Η επίδραση των NSLAB στην ποιότητα του τυριού καθορίζεται από την έκταση και το βαθμό των μεταβολικών δράσεων του κάθε στελέχους χωριστά (Williams et al., 2000). Τα NSLAB κατέχουν ένα μεγάλο εύρος υδρολυτικών ενζύμων και για το λόγο αυτό έχουν την δυνατότητα να συμβάλλουν στην ωρίμανση του τυριού (Williams and Banks, 1997, Williams et al., 1998). Η αυτόλυση των βακτηρίων που ανήκουν στην καλλιέργεια εκκίνησης από τα υδρολυτικά τους ένζυμα (π.χ. υδρολάση της πεπτιδογλυκάνης) με την επακόλουθη απελευθέρωση εσωκυτταρικών ενζύμων, θεωρείται σημαντική στην ανάπτυξη της γεύσης και του αρώματος στο τυρί (Cibik and Chapot-Chartier, 2004). Σχετικά με την αυτόλυση των NSLAB, πιστεύεται ότι συμβαίνει εν μέρει λύση των κυττάρων των NSLAB (Fox et al., 2000, Crow et al., 1995). Ο Kang et al. (1998) διαπίστωσε πως σε κύτταρα του Lb. casei, in vitro, η αυτόλυση λαμβάνει χώρα περισσότερο κατά την εκθετική φάση της ανάπτυξης. Ο ρόλος των βακτηριοσινών στην λύση των κυττάρων των NSLAB μελετήθηκε από τους Ryan et al. (1996), όπου και διαπιστώθηκε ότι η χρήση καλλιέργειας εκκίνησης με στελέχη που παράγουν βακτηριοσίνες, είχε ως αποτέλεσμα τον περιορισμό της ανάπτυξης των NSLAB στο τυρί Πρωτεολυτικό σύστημα NSLAB Οι Williams και Banks (1997) εντόπισαν πρωτεολυτική δραστηριότητα σε όλες τις απομονώσεις NSLAB από τυρί Cheddar Πρωτεϊνάσες Έρευνες έδειξαν ότι οι λακτοβάκιλλοι διαθέτουν πρωτεϊνάσες, οι οποίες συνδέονται με το κυτταρικό τοίχωμα (cell-wall associated proteinases). Το σύστημα 20

22 των πρωτεϊνασών του Lb. casei έχει μελετηθεί εκτενώς (Pritchard and Coolbear, 1993). Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις για την ύπαρξη εσωκυτταρικών πρωτεϊνασών σε ορισμένους λακτοβάκιλλους. Οι περισσότερες ήταν δραστικές σε ουδέτερο ph απέναντι στην αs 1 - και β- καζεΐνη στους o C. Παρατηρήθηκε, ωστόσο, αξιοσημείωτη παραλλακτικότητα μεταξύ των στελεχών (Peterson and Marshall, 1990). Στελέχη Lb. casei και Lb. plantarum βρέθηκαν να έχουν πρωτεϊνάσες, ικανές να υδρολύουν την as 1 - και β- καζεΐνη (El Soda et al., 1986) Πεπτιδάσες Οι πεπτιδάσες αποτελούν τα σπουδαιότερα ένζυμα των NSLAB για την ωρίμανση του τυριού, μια και είναι υπεύθυνα για τη παραγωγή ελέυθερων αμινοξέων και ολιγοπεπτιδίων, τα οποία με τη σειρά τους μετατρέπονται σε ουσίες που συμβάλλουν στη διαμόρφωση του αρώματος και της γεύσης του προϊόντος (Fox et al., 1998). Έχει βρεθεί ότι οι λακτοβάκιλλοι διαθέτουν μία σειρά από πεπτιδάσες, όπως τριπεπτιδάση, διπεπτιδάση και αμινοπεπτιδάσες (Peterson and Marshall, 1990, Pritchard and Coolbear, 1993) Προσθετικές καλλιέργειες NSLAB (adjunct cultures) Σε γενικές γραμμές, οι προσθετικές καλλιέργειες αποτελούνται από μικροοργανισμούς, που προστίθενται στο τυρί στα αρχικά στάδια παρασκευής του μαζί με την καλλιέργεια εκκίνησης, με σκοπό να επιταχύνουν την διαδικασία της ωρίμανσης και να βοηθήσουν στην διαμόρφωση των χαρακτηριστικών και σταθερών οργανοληπτικών ιδιοτήτων του τελικού προϊόντος. Ως συνέπεια, ο τυροκόμος οφελείται οικονομικά με την μείωση του χρονικού διαστήματος από την ζύμωση του γάλακτος μέχρι την πώληση του τελικού προϊόντος (Peterson and Marshall, 1990), αλλά και ο καταναλωτής απολαμβάνει ένα προϊόν ασφαλές, με την χρήση παστεριωμένου γάλακτος αλλά με το άρωμα και την γεύση του παραδοσιακού προϊόντος που παρασκευάζεται από νωπό γάλα. Υπάρχει ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για την χρήση των NSLAB ως προσθετικές καλλιέργειες, τόσο γιατί οι πληθυσμοί τους φτάνουν σε υψηλούς αριθμούς, όσο και γιατί υπάρχουν ενδείξεις για συσχέτιση των NSLAB με την ανάπτυξη των οργανοληπτικών ιδιοτήτων του τυριού (Broome, 2007). Πολλές ερευνητικές ομάδες έχουν μελετήσει διάφορα στελέχη NSLAB είτε μόνα τους, είτε σε συνδυασμό με SLAB, με σκοπό να εμπλουτιστεί η γεύση και το 21

23 άρωμα των τυριών. Οι Poveda et al. (2004) διαπίστωσαν ότι η προσθήκη Lb. plantarum στην καλλιέργεια εκκίνησης του τυριού Manchego, είχε ως αποτέλεσμα το τυρί αυτό να έχει πλουσιότερη γεύση και άρωμα, με υψηλότερες τιμές ελεύθερων αμινοξέων (FAA) σε σχέση με το τυρί που παρασκευάζεται μόνο με την καλλιέργεια εκκίνησης. Στελέχη NSLAB, είτε μόνα τους (Lb. paracasei) ή σε συνδυασμό με άλλα στελέχη (Lb. paracasei + Lb. plantarum) έχει αποδειχθεί ότι έχουν συνεργική δράση μαζί με τους λακτόκοκκους (Ortrigosa et al., 2006). Πρέπει, όμως, να σημειωθεί ότι οι ιδιότητες ενός στελέχους NSLAB μπορεί να ποικίλουν ανάλογα με τον τύπο της καλλιέργειας που χρησιμοποιείται (Skeie et al., 2008). Πράγματι, η προσθήκη μικροοργανισμών που εκφράζουν μία συγκεκριμένη ιδιότητα σε καθαρή καλλιέργεια, δεν εκφράζεται απαραίτητα παρόμοιος φαινότυπος σε ένα σύνθετο πληθυσμό μικροοργανισμών. Αυτό δείχνει την αδυναμία και τα όρια που έχει μία τέτοια στρατηγική, που βασίζεται στην προσθήκη ενός στελέχους στη μικροχλωρίδα του τυριού (Irlinger and Mounier, 2009). Επίσης, ορισμένα στελέχη NSLAB διαθέτουν προστατευτικές ιδιότητες για το ίδιο το τρόφιμο, γι αυτό και χρησιμοποιούνται ως προστατευτικές καλλιέργειες. Πιο συγκεκριμένα, προσφέρουν μικροβιολογική σταθερότητα, μειώνοντας με τον τρόπο αυτό, τον κίνδυνο επιβίωσης και ανάπτυξης παθογόνων και αλλοιογόνων μικροβίων στο τρόφιμο (Holzapfel et al., 1995). Ο τρόπος, που το πετυχαίνουν αυτό τα NSLAB, είναι κυρίως με την παραγωγή βακτηριοσινών, πεπτιδίων και/ή μικρού μοριακού βάρους μη πρωτεϊνικών ουσιών (οργανικά οξέα, λιπαρά οξέα, H 2 O 2 ), γεγονός το οποίο είναι σημαντικό σε στρατηγικές βιολογικής συντήρησης των τροφίμων, στην παράταση, δηλαδή, της εμπορικής ζωής του τροφίμου στο ράφι με την χρήση μικροοργανισμών και/ή των μεταβολιτών του (Ross et al., 2002, Irlinger and Mounier, 2009). Η ποικιλομορφία των αυτόχθονων NSLAB κατά το στάδιο της ωρίμανσης, η οποία δεν μπορεί να ελεγχθεί και να ρυθμιστεί εύκολα, έχει ως συνέπεια πολλές παρτίδες να διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τα χαρακτηριστικά τους (Franciosi et al., 2008). Διαφορές παρατηρούνται τόσο μεταξύ των τυροκομείων για το ίδιο τυρί (Antonsson et al., 2003, De Angelis et al., 2001), όσο και μεταξύ των παρτίδων του ίδιου τυροκομείου διαφορετικής ημέρας παραγωγής αλλά και παρτίδων από διαφορετικές δεξαμενές της ίδιας ημέρας παραγωγής (Williams and Banks, 1997, Fitzsimons et al., 1999, Williams et al., 2002). Για τους παραπάνω λόγους, είναι 22

24 σημαντική η επικράτηση επιθυμητών στελεχών NSLAB, ώστε να περιοριστεί η μικροβιακή ποικιλότητα κατά την διάρκεια της ωρίμανσης των τυριών Κριτήρια επιλογής στελεχών NSLAB ως προσθετικές καλλιέργειες Η επιλογή των στελεχών συνήθως γίνεται τυχαία από το τελικό προϊόν, χωρίς να βασίζεται σε κάποιες βιοχημικές ιδιότητες, με συνέπεια οι επιδράσεις των προσθετικών NSLAB στη διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του τυριού να ποικίλουν (Williams et al., 2000). Η ιδανική προσθετική καλλιέργεια NSLAB θα πρέπει να πληρεί δύο βασικές προϋποθέσεις: αρχικά τα επιλεγμένα στελέχη θα πρέπει να αποδίδουν μία ισορροπημένη ευεργετική δράση κατά την πορεία ωρίμανσης του τυριού. Πρακτικά, επιλέγονται στελέχη, που έχουν θετική επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος, χωρίς να παρουσιάζουν κάποιο ελάττωμα. Το δεύτερο κριτήριο επιλογής είναι η δυνατότητα των στελεχών να είναι ανταγωνιστικά έναντι των αυτόχθονων NSLAB, να έχουν υψηλό ρυθμό ανάπτυξης, να φτάνουν γρήγορα σε υψηλές συγκεντρώσεις, καθώς και να παραμένουν τα κυρίαρχα NSLAB κατά το στάδιο της ωρίμανσης, ώστε να εκφράσουν τις θετικές επιδράσεις τους στο τυρί. Σε πολλές περιπτώσεις αυτό το χαρακτηριστικό διασφαλίζεται με την επιλογή στελεχών απομονώσεων NSLAB από καλής ποιότητας τυρί. Κατά την προσθήκη καλλιέργειας NSLAB στο τυρί Cheddar, πάνω από το 90% του πληθυσμού NSLAB προερχόταν από την προσθετική καλλιέργεια καθ όλη την περίοδο ωρίμανσης (Crow et al., 2001). Η επιλογή ενός στελέχους, που να πληρεί τα βασικά κριτήρια που έχουν αναφερθεί παραπάνω σε ικανοποιητικό βαθμό, είναι δύσκολη. Για τον λόγο αυτό, προτείνεται η επιλογή δύο έως τεσσάρων στελεχών, ώστε να επιτυγχάνεται τόσο η θετική επίδραση στις οργανοληπτικές ιδιότητες του προϊόντος, όσο και η επικράτησή τους καθ όλη την διάρκεια της ωρίμανσης (Crow et al., 2001). Καθώς υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός στελεχών NSLAB στα ώριμα τυριά και άπειροι δυνατοί συνδυασμοί, κάθε προσπάθεια που βασίζεται στη δοκιμαστική παραγωγή τυριών, θα ήταν πολυδάπανη, εκτός και αν προηγηθεί κάποιας μορφής διαδικασία εκλογής. Μία τέτοια διαδικασία θα μπορούσε να αποκλείσει τους μικροοργανισμούς, που δεν συνεισφέρουν θετικά στην ανάπτυξη των οργανοληπτικών ιδιοτήτων, ή/και που προκαλούν διάφορα ελαττώματα στα τυριά (Broome, 2007). 23

25 Διαδικασία επιλογής στελεχών NSLAB ως προσθετικές καλλιέργειες Η διαδικασία επιλογής αποτελείται από δύο βασικά στάδια (Broome, 2007): Απομόνωση και ταυτοποίηση των δυνητικά προσθετικών καλλιεργειών NSLAB. Η πηγή των στελεχών NSLAB συνήθως είναι το ώριμο τυρί καλής ποιότητας για να επιλαγούν τα υποψήφια στελέχη που θα χρησιμοποιηθούν ως προσθετικές καλλιέργειες. Η απομόνωση γίνεται κυρίως σε MRS άγαρ ή σε LBS (Lactobacillus selective άγαρ) (Cogan et al., 2007). Στη συνέχεια, οι απομονώσεις ταυτοποιούνται σε επίπεδο γένους και είδους με τις κλασσικές μεθόδους ταυτοποίησης, που περιλαμβάνουν μικροσκοπία για την αναγνώριση της μορφολογίας των κυττάρων, δοκιμή ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες, δοκιμή καταλάσης, ζύμωση σακχάρων, δοκιμή SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου κ.α. Επίσης, υπάρχουν διαθέσιμα έτοιμα προς χρήση κιτ για την ζύμωση των σακχάρων, όπως το σύστημα API 50 CH. Καθώς η φαινοτυπική ταυτοποίηση με την βοήθεια εμπορικών κιτ χρησιμοποιείται συχνά για πολλά είδη γαλακτικών βακτηρίων, η αξιοπιστία τους τίθεται υπό αμφισβήτηση. Υπάρχουν πολλές περιπτώσεις που το αποτέλεσμα της φαινοτυπικής ταυτοποίησης με τα έτοιμα κιτ ήταν είτε αμφισβητήσημο, ή λάθος, όπως αποδείχτηκε εκ των υστέρων. Οι Andrighetto et al. (1998) κατά την προσπάθεια ταυτοποίησης 25 λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από γιαούρτια και τυριά με την βοήθεια του API 50 CH, δεν επιβεβαίωσαν την ταυτοποίηση 16 απομονώσεων. Στο ίδιο μήκος κύματος κυμαίνεται έρευνα που ανέδειξε την δυσκολία ταυτοποίησης λακτοβακίλλων στενά συγγενικών ειδών (Tynkkynen et al., 1999). Ο Nigatu (2000), αφού μελέτησε την αξιοπιστία του API 50 CH κιτ σε σύγκριση με μοριακές μεθόδους, χρησιμοποιώντας 30 στελέχη λακτοβακίλλων, βρήκε ανακριβή αποτελέσματα, καταλήγοντας στο ότι η ταυτοποίηση με βάση και μόνο τον μεταβολισμό των σακχάρων δεν μπορεί να είναι αξιόπιστη. Η ταυτοποίηση μικροοργανισμών με βάση τις φυσιολογικές και βιοχημικές ιδιότητές τους, πολλές φορές αποδεικνύεται ανεπαρκής, κυρίως κατά των διαχωρισμό ειδών με παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (Golombo et al., 2009). Τον ισχυρισμό αυτό έρχεται να επιβεβαιώσει έρευνα από τους Williams et al. (2000), οι οποίοι βρήκαν διαφορετικά προφίλ ζύμωσης μεταξύ απομονώσεων τόσο του Lb. paracasei, όσο και του Lb. plantarum. Για την αποφυγή λανθασμένων ταυτοποιήσεων προτείνεται ο συνδυασμός της φαινοτυπικής με γενοτυπικές μεθόδους, όπως polymerase chain reaction (PCR), pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), ribotyping κ.α. (Marilley and Casey, 2004). 24

26 Χαρακτηρισμός των προσθετικών καλλιεργειών NSLAB. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν μία σειρά από δοκιμές (φυσιολογικές, βιοχημικές, τεχνολογικές), με σκοπό να γίνει πιο εύκολα η επιλογή των κατάλληλων στελεχών. Οι δοκιμές αυτές περιλαμβάνουν την αφομοίωση κιτρικών, την παραγωγή βιογενών αμινών, την δυνατότητα αυτόλυσης, λιπολυτικής δράσης κ.α. Ιδιαίτερη βαρύτητα δίνεται στην ενδεχόμενη ικανότητα πρωτεολυτικής δράσης. Τα NSLAB, ως επί το πλείστον, δεν έχουν ισχυρή πρωτεολυτική δράση. Το πρωτεολυτικό τους σύστημα είναι αρκετά πολύπλοκο και αποτελείται από εσωκυτταρικά ένζυμα που συμμετέχουν στην υδρόλυση των πεπτιδίων και, κατά συνέπεια, στην παραγωγή ελεύθερων αμινοξέων (Williams et al., 1998). Οι συνήθεις μέθοδοι που χρησιμοποιούνται είναι η o-pa (Church et al., 1983) και η ουρία-page (Andrews, 1983). 2.3 Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Εισαγωγή Γενικά Η έννοια των λειτουργικών τροφίμων αναπτύχθηκε, καθώς ο ρόλος των τροφίμων άρχισε να μην περιορίζεται στα στενά όρια της παροχής των απαραίτητων θρεπτικών συστατικών, αλλά επιπλέον και στη διατήρηση της υγείας και ευεξίας, όπως και στην πρόληψη ασθενειών (Shortt et al., 2004). Η ιδέα γεννήθηκε στην Ιαπωνία όταν τα ολοένα και αυξανόμενα έξοδα νοσηλείας, εξαιτίας του ηλικιωμένου πληθυσμού, οδήγησε το υπουργείο υγείας και κοινωνικής πρόνοιας να θεσπίσει νόμο που να επιτρέπει την παραγωγή και διακίνηση λειτουργικών τροφίμων (Swinbanks and O Brien, 1993). Τα τρόφιμα αυτά αναγνωρίζονται επισήμως ως FOSHU (Food for Specified Health Use). Πριν ένα αιώνα περίπου, το 1907 ο Metchnikoff είχε γράψει στο βιβλίο του, The Prolongation of Life, ότι η κατανάλωση ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων από γαλακτικά βακτήρια (LAB), είχε ως αποτέλεσμα την βελτίωση της υγείας και την αύξηση του προσδόκιμου ορίου ζωής του καταναλωτή. Ο Kurmann (1993) παρουσίασε την πορεία εξέλιξης των καλλιεργειών κατά την πορεία των αιώνων, όπως δείχνει ο πίνακας 2.1. Σήμερα, ολοένα και αυξάνεται ο αριθμός των λειτουργικών τροφίμων, που στηρίζονται στα οφέλη της υγείας, λόγω των προβιοτικών ιδιοτήτων των παραπάνω βακτηρίων (Cogan et al., 2007). 25

27 Ορισμοί Ένα τρόφιμο μπορεί να χαρακτηριστεί ως λειτουργικό εάν αποδειχθεί ικανοποιητικά ότι επηρεάζει θετικά μία ή περισσότερες λειτουργίες του οργανισμού, πέρα από τα διατροφικά οφέλη, βελτιώνοντας την υγεία και αποτρέποντας τον κίνδυνο να νοσήσει ο καταναλωτής. Επιπλέον, τα λειτουργικά τρόφιμα πρέπει να παραμένουν τρόφιμα και να εκδηλώνουν τις ιδιότητές τους στα πλαίσια μίας ισορροπημένης διατροφής, χωρίς να μεταχειρίζονται ως φάρμακα (Bellisle et al., 1998, Stanton et al., 1998, Von Wright, 2007). Πίνακας 2.1 Οι γενιές των καλλιεργειών και ζυμωμένων προϊόντων γάλακτος σε σχέση με τις προβιοτικές ιδιότητες (Kurmann, 1993) Μικροβιολογικά Ευεργετικά Γενιές των ζυμωμένων χαρακτηριστικά των χαρακτηριστικά προϊόντων γάλακτος καλλιεργειών των προϊόντων 1 η γενιά από το 8000 π.χ. Εμπειρικές καλλιέργειες Μη προσδιορισμένη μικροχλωρίδα Μη προσδιορισμένη δράση Εμπειρικές ευεργετικές δράσεις 2 η γενιά από το 1903 Τεχνητές καλλιέργειες Προσδιορισμένη μικροχλωρίδα Προσδιορισμένη δράση 3 η γενιά από το 1921 Προβιοτικές καλλιέργειες εντερικά βακτήρια επιλεγμένα άλλοι μικροοργανισμοί 4 η γενιά από το 2000 Προβιοτικές και θεραπευτικές καλλιέργειες με επιλογή στελεχών και εφαρμογή γενετικής Θεωρία του Metchnikoff Συγκεκριμένες ευεργετικές δράσεις Προτεραιότητα στις ζυμωτεχνικές ιδιότητες Προβιοτικές πολλαπλές δράσεις Τελειοποιημένα προβιοτικά ενισχυμένες ιδιότητες χημική σύνθεση προϊόντων για τελειοποίηση 26

28 Η λέξη προβιοτικό επινοήθηκε αρχικά από τους Lilly και Stillwell το Πρόκειται για έναν σύνθετο όρο, που προέρχεται από τις λέξεις προ- και βίος-, που σημαίνει για την ζωή, κάτι δηλαδή που χρησιμεύει προς όφελος της ζωής, σε αντίθεση με την λέξη αντιβιοτικό, το οποίο προορίζεται για την «εξόντωση» ανεπιθύμητων μικροοργανισμών (Conway, 1996). Χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει καλλιέργειες ζωντανών μικροργανισμών, οι οποίες, όταν χορηγούνται στον άνθρωπο ή σε ζώο, έχουν ευεργετική επίδραση βελτιώνοντας τις ιδιότητες της αυτόχθονης μικροχλωρίδας (Huis in t Veld and Havenaar, 1991). Σύμφωνα με πιο πρόσφατο ορισμό από το FAO/WHO, προβιοτικοί ονομάζονται οι ζωντανοί μικροοργανισμοί, οι οποίοι, όταν χορηγηθούν σε επαρκή επίπεδα, επιδρούν θετικά στην υγεία του καταναλωτή (Stanton et al., 1998, Von Wright, 2007) Ταξινόμηση και ταυτοποίηση προβιοτικών μικροργανισμών Η σπουδαιότητα των λειτουργικών τροφίμων, που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς και συμβάλλουν θετικά στην υγεία και ευεξία του καταναλωτή, αρχίζει να γίνεται ο καθοριστικός παράγοντας που επηρεάζει την γνώμη του σύγχρονου καταναλωτή, με συνέπεια την ραγδαία ανάπτυξη και διεύρυνση της αγοράς τέτοιων ειδών, ταυτόχρονα με το ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον των διαφημίσεων που εκμεταλλεύονται τις ευεργετικές τους ιδιότητες (Stanton et al., 1998). Η συστηματική χρήση προβιοτικών στη διατροφή ξεκίνησε στον τομέα της ζωικής παραγωγής με στόχο την αυξημένη απόδοση των παραγωγικών ζώων (κρεοπαραγωγών και γαλακτοπαραγωγών φυλών), αλλά και την αυξημένη αντίσταση απέναντι σε ασθένειες (λοιμώξεις, διάρροιες κ.α.) (Fuller, 1989). Σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως τα προβιοτικά για την βελτίωση της ποιότητας των ζωοτροφών που προορίζονται για την διατροφή των ζώων (Huis in t Veld et al., 1994). Τα αποτελέσματα της αποτελεσματικής χορήγησης των προβιοτικών μικροοργανισμών στα μεγάλα μηρυκαστικά, στους χοίρους και στα ορνίθια (κρεοπαραγωγών και οωπαραγωγών φυλών) είναι εμφανή με την βελτίωση της υγείας τους, τον αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης και την βελτίωση της απόδοσης σε γάλα, κρέας και αυγά (Berg, 1998). Τα ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα έχουν μελετηθεί εκτενώς ως λειτουργικά τρόφιμα, στα οποία γίνεται προσθήκη προβιοτικών βακτηρίων (Saxelin 27

29 et al., 2005). Μεταξύ αυτών, το τυρί έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί ένα ιδανικό μέσο για να φιλοξενεί προβιοτικούς μικροοργανισμούς. Στον πίνακα 2.2 παρουσιάζονται οι μικροοργανισμοί που ανήκουν στην ομάδα των προβιοτικών. Σήμερα, τα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium χρησιμοποιούνται ευρέως ως κύριοι προβιοτικοί μικροοργανισμοί σε ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα (Cogan et al., 2007). Οι λακτοβάκιλλοι που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά, χαρακτηρίζονται ως GRAS (Generally Recocnised As Safe), επειδή απομονώνονται συνήθως από παραδοσιακά γαλακτοκομικά προϊόντα (Colombo et al., 2009). Πρόσφατα, πολλοί ερευνητές εστιάζουν την προσοχή τους στον Lb. paracasei, καθώς πολλά στελέχη δείχνουν να κατέχουν σημαντικές προβιοτικές και αντιβακτηριακές ιδιότητες, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παραγωγή λειτουργικών τροφίμων ή απλά ως προστατευτικές καλλιέργειες (Lozo et al., 2004, Bergamini et al., 2006). Επιπλέον, υπάρχει ένα ολοένα και αυξανόμενο ενδιαφέρον για την χρήση μικροοργανισμών ως προβιοτικά εκτός των γαλακτικών βακτηρίων, όπως για παράδειγμα ο Saccharomyces boulardii, μη παθογόνα στελέχη Escherichia coli και ο Bacillus cereus (Conway, 1996). 28

30 Πίνακας 2.2 Μικροοργανισμοί που θεωρούνται ως προβιοτικοί (Holzapfel et al., 2001) Lactobacillus species Bifidobacterium species Other lactic acid bacteria Lb. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis 1 Lb. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Non lactic acid bacteria Bacillus cereus var. toyoi 1 Escherichia coli strain nissle Lb. casei B. bifidum Lactococcus lactis Propionibacterium freudenreichii 1 Lb. crispatus B. breve Leuconstoc mesenteroides Saccharomyces cerevisiae Lb. delbrueckii B. infantis Pediococcus Saccharomyces boulardii subsp. bulgaricus acidilactici Lb. gallinarum 1 B. lactis Sporolactobacillus inulinus 1 Lb. gasseri B. longum Streptococcus thermophilus Lb. johnsonii Lb. paracasei Lb. plantarum Lb. reuteri Lb. rhamnosus 1 Χρησιμοποιούνται κυρίως στη ζωική παραγωγή Στις αρχές του 20ου αιώνα, ο Orla-Jensen (1919) υποδιαίρεσε τα γαλακτικά βακτήρια στα γένη Betabacterium, Thermobacterium, Streptococcus, Betacoccus, Tetracoccus και Microbacterium, βάσει των μορφολογικών και φαινοτυπικών ιδιοτήτων τους (πίνακας 2.3). Σήμερα, τα γένη Enterococcus, Vagococcus και Lactococcus έχουν διαχωριστεί από το αρχικό γένος Streptococcus ( Schleifer and Kilpper-Balz, 1984, Collins et al., 1989). Με την πάροδο του χρόνου η αρχική ταξινόμηση του Orla-Jensen έχει αλλάξει, όπως φαίνεται στον πίνακα

31 Πίνακας 2.3 Σύγκριση ταξινομήσης γαλακτικών βακτηρίων κατά Orla-Jensen με την τωρινή ταξινόμηση (Holzapfel et al., 2001) Lactobacillus species Other lactic acid bacteria Bifidobacterium species Non lactic acid bacteria Betabacterium Lactobacillus Weissela Thermobacterium Lactobacillus Streptobacterium Lactobacillus Carnobacterium Streptococcus Streptococcus Enterococcus Lactococcus Vagococcus Betacoccus Leuconostoc Oenococcus Weisella Microbacterium Brochothrix Tetracoccus Pediococcus Tetragenococcus Σύμφωνα με τον Woese (1987), η σύγκριση της ακολουθίας του rrna, αποτελεί την πλέον ασφαλή και αξιόπιστη μέθοδο καθορισμού του βαθμού φυλογενετικής σχέσης μεταξύ των μικροοργανισμών. Η φυλογενετική σχέση των διαφορετικών γενών των γαλακτικών βακτηρίων εμφανίζεται στο σχήμα 2.2 και είναι βασισμένη στη σύγκριση των ακολουθιών 16S rrna. Τα γένη Streptococcus και 30

32 Lactococcus εμφανίζουν υψηλή ομολογία μεταξύ τους και εντάσσονται στον ίδιο κλάδο, ενώ το γένος Lactobacillus αποκλίνει φυλογενετικά (Holzapfel et al., 2001). Σχήμα 2.2 Δενδρόγραμμα κύριων φυλογενετικών ομάδων γαλακτικών βακτηρίων, βασισμένο στην σύγκριση των ακολουθιών 16S rrna (Holzapfel et al., 2001) Παραδοσιακά, τα γαλακτικά βακτήρια ταξινομούνταν βάσει των φαινοτυπικών τους ιδιοτήτων, π.χ., μορφολογία, τρόπος ζύμωσης της γλυκόζης, ανάπτυξη σε διάφορες θερμοκρασίες, παραγόμενο ισομερές γαλακτικού οξέος και ζύμωση σακχάρων. Μελέτες βασισμένες σε σύγκριση αναλύσεων αλληλουχίας 16S ριβοσωμικού RNA, έδειξαν ότι μερικές ομάδες ταξινόμησης που σχηματίζονταν βάσει των φαινοτυπικών τους χαρακτηριστικών, δεν αντιστοιχούσαν στις προτεινόμενες φυλογενετικές ομάδες, ενώ αρκετά είδη δεν ήταν δυνατό να ταξινομηθούν μόνο με βάση τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (Holzapfel et al., 2001). 31

33 Οι σύγχρονες μοριακές τεχνικές, συμπεριλαμβανομένης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και άλλων γενοτυπικών μεθόδων είναι εξαιρετικά πολύτιμες για τον προσδιορισμό ειδών ή για τη διαφοροποίηση των προβιοτικών στελεχών. Η ταξινόμηση και ο προσδιορισμός ενός προβιοτικού στελέχους μπορεί να παρέχει ενδείξεις για τον βιότυπο και την προέλευσή του, καθώς και στοιχεία για την ασφάλεια και την τεχνολογική σημασία του. Οι σύγχρονες μέθοδοι ταξινόμησης βασίζονται λιγότερο στα φυσιολογικά κριτήρια (π.χ. ανάπτυξη σε ορισμένες θερμοκρασίες, αντιδράσεις ζύμωσης κ.α.) και περισσότερο σε μεθόδους μοριακής βιολογίας, που αφορούν φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (ανάλυση κυτταρικού τοιχώματος, ανάλυση πρωτεϊνών) και γνωρίσματα του γονιδιώματος (% αναλογία G+C στο μόριο του DNA, ηλεκτροφορητικές ιδιότητες προϊόντων του γονιδιώματος, ομολογία DNA, υβριδισμός ολιγονουκλεοτιδίων με νουκλεϊκά οξέα) Γαστρεντερικό σύστημα Γενικά Το πεπτικό σύστημα του ανθρώπου μπορεί να θεωρηθεί ως μία σειρά από σωληνωτά όργανα που διαπερνούν το σώμα από το στόμα μέχρι την έδρα. Το φαγητό εισάγεται από το στόμα και, μέσω του οισοφάγου, καταλήγει στο στομάχι και από εκεί στο λεπτό και παχύ έντερο, όπου και συμπληρώνεται η πέψη (εικόνα 2.1). 32

34 Εικόνα 2.1 Το πεπτικό σύστημα του ανθρώπου Το μήκος του εντέρου είναι περίπου 8,5-9,5 μ. και έχει τη μορφή ελίκων ενός συνεχιζόμενου σωλήνα μέσα στην κοιλιακή κοιλότητα. Διακρίνεται σε λεπτό και σε παχύ έντερο. Το λεπτό εκτείνεται από το στομάχι μέχρι τη βαλβίδα του παχέος εντέρου και έχει μήκος 6-6,5 μ. Το παχύ έντερο έχει μήκος 1,5-2 μ. και είναι ευρύτερο από ό,τι το λεπτό έντερο, με πλάτος 6,5 εκ. Το λεπτό έντερο αποτελείται από το δωδεκαδάκτυλο, στον οποίο εκβάλλουν ο χοληδόχος και ο παγκρεατικός πόρος και το ελικώδες έντερο που υποδιαιρείται στη νήστιδα και τον ειλεό. Το έντερο αποτελεί μια εξαιρετικά μεγαλύτερη επιφάνεια επαφής με το περιβάλλον, καθώς η επιφάνεια του βλεννογόνου του αυξάνεται ποικιλοτρόπως με τον σχηματισμό πτυχώσεων, από πτυχώσεις του επιθηλίου (εντερικές λάχνες) και από το σχηματισμό μικρολαχνών της ελεύθερης επιφάνειας των απορροφητικών κυττάρων του εντερικού επιθηλίου. Η συνολική επιφάνεια του γαστρεντερικού συστήματος υπολογίζεται σε m 2, παρέχοντας την απαραίτητη περιοχή για αλληλεπιδράσεις κατά την πέψη και απορρόφηση, για προσκόλληση στο βλεννογόνο χιτώνα και για αποίκιση μικροοργανισμών στη συνέχεια. 33

35 Η κύρια λειτουργία του πεπτικού συστήματος είναι η πέψη της τροφής και η απορρόφηση των θρεπτικών συστατικών. Ταυτόχρονα, αποτελεί σπουδαίο ανοσοποιητικό σύστημα, εφόσον σε αυτό παράγονται τα περισσότερα αντισώματα από οποιοδήποτε άλλο μέρος του σώματος Εντερική μικροχλωρίδα Στα θηλαστικά η εντερική μικροχλωρίδα φτάνει σε πυκνότητα περίπου τα βακτήρια ανά γραμμάριο κοπράνων (Neish, 2002) και αποτελείται από περισσότερα από 500 βακτηριακά είδη, ο συνολικός αριθμός των οποίων αποτελεί το 95% περίπου των συνολικών κυττάρων (Dunne et al., 2001). Τα βακτήρια αυτά χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: την αυτόχθονη, σταθερή και μακροχρόνια μικροχλωρίδα, καθώς και την προσωρινή (αλλόχθονη). Η πλειοψηφία της εντερικής μικροχλωρίδας μπορεί να μην έχει ταυτοποιηθεί πλήρως, σίγουρα όμως η ποικιλία που παρουσιάζει αποτελεί εξαιρετικό ενδιαφέρον. Έρευνες έδειξαν ότι όχι μόνο διαφορετικοί οργανισμοί αποικίζονται από διαφορετικά βακτήρια, αλλά και σε ένα είδος οργανισμού παρατηρούνται διαφορές της εντερικής μικροχλωρίδας (Tanock, 2002). Υπολογίζεται ότι τα γένη που απαντώνται συχνότερα στην εντερική μικροχλωρίδα του ανθρώπου είναι τα Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium και Peptococcus. Λιγότερο συχνά βρίσκονται τα: Escherichia, Enterobacter, Enterococcus, Klebsiella, Lactobacillus και Proteus. Σύμφωνα με έρευνες, οι λακτοβακίλλοι που σχετίζονται με την ανθρώπινη εντερική χλωρίδα (πίνακας 2.4), αποτελούνται κυρίως από ομοζυμωτικούς λακτοβακίλλους, οι οποίοι αντιπροσωπεύονται από τρείς ομάδες: 1) την ομάδα Lb. acidophilus, 2) την ομάδα Lb. salivarius και 3) την ομάδα Lb. casei. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν μερικοί ετεροζυμωτικοί λακτοβάκιλλοι ως τμήμα της κανονικής εντερικής μικροχλωρίδας του ανθρώπου, με κύριο αντιπρόσωπο το είδος Lb. reuteri. 34

36 Πίνακας 2.4 Αυτόχθονοι λακτοβάκιλλοι που σχετίζονται με την ανθρώπινη εντερική χλωρίδα (Holzapfel et al., 2001) Ομοζυμωτικοί Ετεροζυμωτικοί Lactobacillus acidophilus Lactobacillus reuteri Lactobacillus acidophilus Lactobacillus oris sensu stricto Lactobacillus vaginalis Lactobacillus gasseri Lactobacillus crispatus Lactobacillus johnsonii Lactobacillus salivarius subsp. salivarius subsp. salicinius Lactobacillus casei subsp. casei subsp. tolerans Lactobacillus rhamnosus Φυσιολογικός ρόλος εντερικής μικροχλωρίδας Μεταξύ των θηλαστικών και της εντερικής μικροχλωρίδας επικρατεί μία συμβιωτική σχέση, η οποία βρίσκεται σε ισορροπία, υπό φυσιολογικές συνθήκες (Lukewille and Uhlig, 2007). Ο οργανισμός προσφέρει ένα σταθερό θερμοκρασιακά περιβάλλον με πλούσια θρεπτικά συστατικά για τα βακτήρια, ενώ η μικροχλωρίδα έχει θετική επίδραση σε σχέση με τον έλεγχο ενδεχόμενης μόλυνσης και τον μεταβολισμό (Hooper and Gordon, 2001, Stappenbeck et al., 2002). Σε οποιαδήποτε διαταραχή αυτής της ισορροπίας, εκδηλώνονται ασθένειες στον οργανισμό. Ανάμεσα στις θετικές επιδράσεις της εντερικής μικροχλωρίδας, συγκαταλέγονται η αποικοδόμηση, η μεταφορά και η απορρόφηση ορισμένων συστατικών των τροφών, η παραγωγή βιταμινών του συμπλέγματος Β και η διέγερση της κινητικότητας του εντέρου. Επιπλέον, μειώνει τον κίνδυνο αποικισμού του εντέρου με παθογόνα βακτήρια και διατηρεί σε υψηλά επίπεδα την άμυνα του οργανισμού (ανοσοενίσχυση) για να πολεμήσει σε ενδεχόμενες μολύνσεις. Οι συνολικές επιδράσεις (θετικές και αρνητικές) της εντερικής μικροχλωρίδας 35

37 συνοψίζονται στον πινακα 2.5. Οι παράμετροι αυτοί μπορούν να επηρεαστούν από την πρόσληψη προβιοτικών μικροοργανισμών. Πίνακας 2.5 Επιδράσεις εντερικής μικροχλωρίδας στον άνθρωπο (Conway, 1996) Ευεργετικές επιδράσεις Αντιβακτηριακή δράση έναντι παθογόνων Διέγερση ανοσοποιητικού συστήματος Σύνθεση βιταμινών Υποβοήθηση της πέψης Διατήρηση της ισορροπίας του οικοσυστήματος Μεταβολισμός φαρμάκων Αρνητικές επιδράσεις Δυσκοιλιότητα Διάρροια Μολύνσεις Φούσκωμα Καρκίνος Φυσιολογική δράση προβιοτικών Μηχανισμοί δράσης Ως κύριος μηχανισμός δράσης των προβιοτικών θεωρείται από πολλούς η ρύθμιση της εντερικής χλωρίδας. Πιο αναλυτικά, η αποίκιση των προβιοτικών μικροοργανισμών στο έντερο, έχει ως συνέπεια την αλλαγή της σύστασης της εντερικής χλωρίδας ευνοώντας την επικράτηση των ευεργετικών μικροοργανισμών (lactobacilli, bifidobacteria) έναντι των επιβλαβών (coliforms, clostridia), ιδιαίτερα όταν οι αρχικοί πληθυσμοί των πρώτων είναι χαμηλοί. Τα επίπεδα των επιβλαβών βακτηρίων μειώνονται είτε με την κατάληψη περιοχών προσκόλησης στον εντερικό βλεννογόνο από τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς, είτε λόγω του ανταγωνισμού για θρεπτικά συστατικά, ή λόγω της παραγωγής αντιμικροβιακών ουσιών (π.χ. οργανικά οξέα, βακτηριοσίνες) από τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς. Ένας άλλος σημαντικός μηχανισμός θεωρείται η διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος. Ο εντερικός βλεννογόνος αποτελεί την κύρια διασύνδεση μεταξύ του εξωτερικού περιβάλλοντος και του ανοσοποιητικού 36

38 συστήματος. Η εντερική χλωρίδα είναι ένα σημαντικό τμήμα του αμυντικού μηχανισμού του εντέρου. Επηρεάζοντας την ανάπτυξη του λεμφοειδούς ιστού του εντέρου, η εντερική χλωρίδα συμμετέχει στη ρύθμιση της συστημικής και τοπικής ανοσοαπόκρισης, συμπεριλαμβανομένης και της υπεραπόκρισης σε αντιγόνα που προέρχονται από μικροοργανισμούς και τρόφιμα. Ο αποικισμός του εντέρου σε ανθρώπινα βρέφη σχετίζεται άμεσα με την ωρίμανση των χυμικών ανοσοποιητικών μηχανισμών, και συγκεκριμένα της κυκλοφορίας των κυττάρων που εκκρίνουν IgΑ και IgΜ (Gr önlund et al., 2000). Σε περιπτώσεις φλεγμονής του εντέρου οι αλληλεπιδράσεις ξενιστή μικροοργανισμών διαταράσσονται και η φλεγμονή συνοδεύεται από διατάραξη της ισορροπίας της εντερικής χλωρίδας, με αποτέλεσμα οι ενδογενείς μικροοργανισμοί του εντέρου να επάγουν ανοσοαπόκριση (Isolauri, 1999). Η θεραπεία με προβιοτικά στηρίζεται στην αποκατάσταση της μικροοικολογίας και της διαπερατότητας του εντέρου, στη βελτίωση της αμυντικής του λειτουργίας και στην εξάλειψη της φλεγμονώδους απόκρισης (Isolauri et al. 2001) Φυσιολογικές επιδράσεις στον άνθρωπο Οι κύριες ευεργετικές επιδράσεις συνοψίζονται στα εξής (Conway, 1996): Αύξηση της αντίστασης έναντι των παθογόνων μικροοργανισμών Διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος Αντιμετώπιση της δυσανεξίας της λακτόζης Αντιμετώπιση της δυσκοιλιότητας Πρόληψη της διάρροιας Μείωση του κινδύνου του καρκίνου του εντέρου Αντιμετώπιση του συνδρόμου του ευερέθιστου εντέρου Μείωση της χοληστερόλης Σε ορισμένες περιπτώσεις οι ίδιοι προβιοτικοί μικροοργανισμοί δρουν ευεργετικά για τον άνθρωπο, όπως οι αντιμικροβιακοί μηχανισμοί, ενώ σε άλλες περιπτώσεις διεγείρουν την ενδογενή μικροχλωρίδα ή τους φυσιολογικούς μηχανισμούς για να προκαλέσουν μία ευεργετική δράση. Οι θετικές επιδράσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω, μπορούν να συνοψιστούν ως εξής: 1. Αντιμικροβιακές 2. Βιοχημικές 3. Φυσιολογικές και ανοσολογικές 37

39 Ο αντιμικροβιακός μηχανισμός των προβιοτικών συντελεί στην αυξημένη αντίσταση έναντι των παθογόνων μικροβίων, καθώς και στην πρόληψη της διάρροιας (Fernandes et al., 1987). Έχει αναφερθεί η θετική επίδραση των προβιοτικών σε περιπτώσεις, όπως η παιδική διάρροια (Saarela et al., 2002), η οξεία γαστρεντερίτιδα, ειδικά η ιογενής από ροταϊό (Τσακαλίδου, 2003), η διάρροια από αντιβιοτικά (Souza et al., 2002), η διάρροια των ταξιδιωτών και το σύνδρομο του ευερέθιστου εντέρου (Saarela et al., 2002). Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα περιλαμβάνουν την ανταγωνιστική αποίκιση του εντέρου και την αντιβακτηριακή δράση. Η ανταγωνιστική αποίκιση έχει να κάνει με το γεγονός ότι το προβιοτικό στέλεχος έχει την δυνατότητα να συναγωνιστεί το παθογόνο μικρόβιο είτε για θρεπτικά συστατικά, ή για μία περιοχή του εντερικού βλεννογόνου (Chaia et al., 1999). Κατά συνέπεια, δημιουργείται ένα δυσμενές περιβάλλον, όπου το παθογόνο θα πρέπει να ανταγωνιστεί για να βρει κατ αρχήν το μέρος να αποικίσει και στη συνέχεια να βρει τα απαραίτητα για την ανάπτυξή του θρεπτικά συστατικά. Επιπλέον, κατά την ανάπτυξη των προβιοτικών στελεχών στον εντερικό βλεννογόνο, παράγονται διάφορες ουσίες, οι οποίες έχουν αποδειχθεί ότι δρουν ανασταλτικά στην ανάπτυξη των παθογόνων μικροοργανισμών (Fernandes et al., 1987). Πρόκειται για οργανικά οξέα, όπως γαλακτικό και οξικό οξύ, καθώς και βακτηριοσίνες. Τα οργανικά οξέα μειώνουν το ph και, συνεπώς, μπορούν έμμεσα να επιδράσουν ανασταλτικά στην ανάπτυξη των παθογόνων, αλλά και άμεσα επειδή είναι τοξικά για πολλά μικρόβια. Οι λακτοβάκιλλοι φαίνεται να παράγουν αρκετές βακτηριοσίνες, από τις οποίες κάποιες έχουν ευρύ φάσμα δράσης, ενώ άλλες εμφανίζονται να αναστέλλουν ορισμένα μόνο, στενά συγγενικά, στελέχη. Τα τελευταία χρόνια, έχουν γίνει προσπάθειες για την εκμετάλλευση των ανταγωνιστικών ιδιοτήτων των μικροοργανισμών στο τυρί (Irlinger and Mounier, 2009). Για παράδειγμα, καλλιέργειες LAB έχουν χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη και τον έλεγχο της Listeria monocytogenes, καθώς και αλλοιωγόνων μικροοργανισμών, όπως του Clostridium tyrobutyricum, μέσα στο πλαίσιο της τεχνολογίας των εμποδίων (π.χ. παστερίωση γάλακτος και χρήση συγκεκριμένης καλλιέργειας εκκίνησης και ωρίμανσης) (O Sullivan et al., 2006). Οι βιοχημικές επιδράσεις των προβιοτικών στελεχών περιλαμβάνουν, την αντιμετώπιση της δυσανεξίας της λακτόζης, την μείωση της χοληστερόλης καθώς και την μείωση των εντερικών ενζύμων, τα οποία είναι υπεύθυνα για την μετατροπή των προκαρκινικών κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα. 38

40 Η δυσανεξία της λακτόζης συμβαίνει όταν παρατηρείται έλλειψη ενός ενζύμου, της λακτάσης (β-γαλακτοσιδάση). Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν κοιλιακό άλγος, φούσκωμα και διάρροια, λόγω όσμωσης, και εμφανίζονται μετά την κατανάλωση τροφών πλουσίων σε λακτόζη, η οποία δεν αποικοδομείται για να απορροφηθεί, αλλά παραμένει στον εντερικό αυλό αποτελώντας τροφή για την αυτόχθονη μικροχλωρίδα (Holzapfel et al., 2001). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αερίων (CO 2, H 2, CH 4 ) και οργανικών οξέων, με άμεση συνέπεια την εμφάνιση των συμπτωμάτων της δυσανεξίας της λακτόζης. Η κατανάλωση προβιοτικών στελεχών, που περιέχουν και παράγουν το ένζυμο β-γαλακτοσιδάση, έχει ως αποτέλεσμα την δραστική μείωση της λακτόζης προτού φτάσει στην ενδογενή μικροχλωρίδα του εντέρου. Επίσης, έχει αναφερθεί ότι οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί, όπως οι λακτοβάκιλλοι έχουν την δυνατότητα να αφομοιώνουν την χοληστερόλη (Gilliland and Walker, 1990). Σύμφωνα με τους Lin et al. (1989) τα ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα μειώνουν τα επίπεδα της χοληστερόλης στο αίμα είτε αναστέλοντας την σύνθεσή της στο ήπαρ, ή περιορίζοντας την απορρόφησή της στο έντερο. Τέλος, έχει παρατηρηθεί ότι η κατανάλωση λακτοβακίλλων, έχει ως αποτέλεσμα την σημαντική μείωση εντερικών ενζύμων, όπως η β-glucuronidase, η azoreductase και η nitroreductase (Goldin and Gorbach, 1984). Ο πιθανός μηχανισμός δράσης είναι μέσω της μείωσης του αριθμού των εντερικών βακτηρίων, που παράγουν τα παραπάνω ένζυμα. Σχετικά με τους φυσιολογικούς μηχανισμούς των προβιοτικών, αυτοί περιλαμβάνουν την διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος, καθώς και την μείωση της πιθανότητας εμφάνισης καρκίνου του παχέως εντέρου. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα σύστημα οργάνων υπεύθυνο για την άμυνα του οργανισμού και αποτελείται από πολλά διαφορετικά όργανα και ιστούς. Τα σημαντικότερα από αυτά είναι ο μυελός των οστών, και ο θύμος αδένας. Σε αυτά δημιουργούνται και αναπτύσσονται τα ειδικά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Δευτερεύοντα όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι οι αμυγδαλές, ο σπλήνας, τα λεμφογάγγλια και οι πλάκες Peyer. Οι μηχανισμοί άμυνας του οργανισμού χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Στους μη ειδικούς μηχανισμούς και στους ειδικούς μηχανισμούς. Στους μη ειδικούς μηχανισμούς έχουμε την βασική αντίδραση του οργανισμού σε κάθε είδους 39

41 λοιμώξεις. Ο μηχανισμός αυτός αποτελείται από τέσσερις τύπους αμυντικών φραγμών: 1) Ανατομικοί φραγμοί (δέρμα, βλεννώδεις μεμβράνες) 2) Φυσιολογικοί φραγμοί (θερμοκρασία, ph) 3) Μηχανισμοί ενδοκυττάρωσης και κυτταροφαγίας 4) Φλεγμονώδης αντίδραση (διαστολή αγγείων, αύξηση διαπερατότητας των τριχοειδών αγγείων του ιστού) Ο ειδικός μηχανισμός χαρακτηρίζεται από μνήμη και δυνατότητα αναγνώρισης των αβλαβών κυττάρων από τα κατεστραμμένα ή μεταλλαγμένα κύτταρα. Διακρίνεται στην κυτταρική (Τ λεμφοκύτταρα-φονείς) και χυμική ανοσία (Β λεμφοκύτταρα-παραγωγή αντισωμάτων). Το ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται κυρίως από δύο ομάδες κυττάρων, τα λεμφοκύτταρα και τα κύτταρα παρουσίασης αντιγόνων. Τα λεμφοκύτταρα παράγονται στον μυελό των οστών και είναι δύο ειδών, Τ - λεμφοκύτταρα και Β-λεμφοκύτταρα (εικόνα 2.2). Τα Β-λεμφοκύτταρα διαθέτουν στην μεμβράνη τους ένα μόριο αντισώματος. Τα Τ-λεμφοκύτταρα διαθέτουν στην μεμβράνη τους έναν υποδοχέα δέσμευσης αντιγόνου. Όταν ένα Β κύτταρο συναντήσει ένα αντιγόνο διαιρείται γρήγορα και διαφοροποιείται σε Β-κύτταρο μνήμης και Β-κύτταρο τελεστή ή πλασματοκύτταρο. Τα πλασμοκύτταρα παράγουν μεγάλη ποσότητα αντισωμάτων που δρουν πάνω στο αντιγόνο και το καταστρέφουν. Τα κύτταρα Τ όταν συναντήσουν αντιγόνο εκκρίνουν τους αυξητικούς παράγοντες κυτοκίνες. Οι παράγοντες αυτοί ενεργοποιούν τα Β-κύτταρα καθώς και τα Tc-κύτταρα, τα οποία καταστρέφουν τα κύτταρα του ίδιου του οργανισμού που έχουν υποστεί αλλοιώσεις. 40

42 Εικόνα 2.2 Κύτταρα ανοσοποιητικού συστήματος (πηγή: Τα κύτταρα παρουσίασης αντιγόνων βοηθούν τα υπόλοιπα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος να αναγνωρίσουν διάφορα αντιγόνα. Η λειτουργία αυτών των κυττάρων συνίσταται στο να προσλαμβάνουν το εξωγενές αντιγόνο είτε με κυτταροφαγία είτε με ενδοκυττάρωση και στην συνέχεια να επανεκφράζουν τμήμα του στην μεμβράνη μαζί με ειδικά αναγνωριστικά μόρια που ονομάζονται MHC II (εικόνα 2.3). Τα προβιοτικά, διεγείρουν το ανοσοποιητικό σύστημα με διάφορους τρόπους, όπως με την ενίσχυση του μη ειδικού αμυντικού μηχανισμού έναντι των μολύνσεων, με την αύξηση της φαγοκυτταρικής ικανότητας των λευκοκυττάρων, με την αύξηση της παραγωγής αντισωμάτων IgA, με τον πολλαπλασιασμό των ενδοεπιθηλιακών λεμφοκυττάρων (πλάκες Peyer) και με την υποβοήθηση του ειδικού αμυντικού μηχανισμού, που εξειδικεύεται ανάλογα με το αντιγόνο. Η δράση των προβιοτικών στο ανοσοποιητικό σύστημα ποικίλει ανάλογα το στέλεχος (Cogan et al., 2007). Τόσο τα συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος, όσο και το κυτταροπλασματικό υλικό είναι δυνατό να διεγείρουν το ανοσοποιητικό σύστημα (Chen et al., 1999, Pessi et al., 41

43 1999). Με τον τρόπο αυτό τόσο τα ζωντανά, όσο και τα νεκρά προβιοτικά βακτήρια είναι σε θέση να ενεργοποιούν το ανοσοποιητικό σύστημα, χωρίς να έχει γίνει αναφορά σε αλλεργικές αντιδράσεις (O Brien et al., 1999). Τ βοηθητικά κύτταρα Β κύτταρα Τ βοηθητικά κύτταρα Τ βοηθητικά κύτταρα Αντισώματα Μακροφάγα Αντιγόνο Τ κύτταρα φονείς Εικόνα 2.3 Μηχανισμός δράσης παρουσία αντιγόνου (πηγή: Η αιτιολογία του καρκίνου του εντέρου ποικίλει, αλλά φαίνεται ότι η δίαιτα παίζει ένα πολύ σημαντικό ρόλο. Δίαιτες πλούσιες σε κρέας και λιπαρά και φτωχές σε φυτικές ίνες ενοχοποιούνται για την αλλαγή της σύστασης της εντερικής χλωρίδας. Η συμβολή των προβιοτικών στην προστασία από τον καρκίνο αποτελεί σημαντικό πεδίο έρευνας. Επιδημιολογικές μελέτες υποδεικνύουν ότι η κατανάλωση γαλακτοκομικών προϊόντων ζύμωσης σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του εντέρου (Τσακαλίδου, 2003). Οι μηχανισμοί δράσης που προτείνονται είναι κυρίως δύο ειδών. Πρώτον, οι καρκινογόνες ή προκαρκινογόνες ουσίες συνδέονται με τα κύτταρα των προβιοτικών βακτηρίων, καθίστανται ανενεργές και απομακρύνονται. 42

44 Για παράδειγμα, ετεροκυκλικές αρωματικές αμίνες, που σχηματίζονται κατά το μαγείρεμα κρέατος, μπορούν να δεσμευτούν από το κυτταρικό τοίχωμα γαλακτικών βακτηρίων (Zabala et al., 2001, Heyman and Menard, 2002). Δεύτερον, τα προβιοτικά, αναχαιτίζουν βακτήρια (Bacteroides, Clostridium) που σχετίζονται με τη μετατροπή προκαρκινογόνων σε καρκινογόνες ουσίες. Οι μετατροπές αυτές σχετίζονται με την αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας, όπως της β-γλυκουρονιδάσης, της αζωρεδουκτάσης, της ουρεάσης και της νιτρορεδουκτάσης (Zabala et al., 2001). Σύμφωνα με τους Holzapfel et al. (2001) ορισμένα στελέχη φαίνεται να μειώνουν τα παραπάνω ένζυμα, τα οποία σχετίζονται άμεσα με τον καρκίνο του παχέως εντέρου Προϋποθέσεις δράσης Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί παραμένουν στο γαστρεντερικό σύστημα για ποικίλο χρονικό διάστημα και πιστεύεται ότι η προβιοτική τους δράση εκδηλώνεται πιο εύκολα, όταν οι μικροοργανισμοί αυτοί παραμένουν όσο το δυνατόν περισσότερο ζωντανοί σε υψηλούς αριθμούς. Για να επιτευχθεί αυτό, πρέπει να λαμβάνονται επανειλημμένα σε επαρκείς ποσότητες (Cogan et al., 2007). Ο De Vuyst (2000) ανέφερε ότι, για να είναι ικανοί οι προβιοτικοί μικροργανισμοί να δράσουν ευεργετικά στον άνθρωπο, πρέπει η συγκέντρωσή τους να μην είναι μικρότερη από 10 7 cfu/g ή ml τροφίμου, την στιγμή της κατανάλωσης. Η σύγχρονη τάση όμως για την δοσολογία των προβιοτικών είναι να γίνεται αναφορά στην μερίδα του τροφίμου, που πρόκειται να καταναλωθεί και που περιέχει τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς: μία μερίδα καθορισμένου μεγέθους τροφίμου πρέπει να περιέχει το λιγότερο 1, cfu του επιθυμητού μικροοργανισμού (Health Canada, 2009) Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Διαδικασία επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών - κριτήρια Οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί επιλέγονται, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πρόσθετα στα τρόφιμα, βάσει ορισμένων φυσιολογικών και λειτουργικών ιδιοτήτων τους, κάποιες από τις οποίες μπορούν να μελετηθούν in vitro (Holzapfel et al., 2001). Για τον σκοπό αυτό, έχουν θεσπιστεί μία σειρά από κριτήρια, όπως να είναι ανθρώπινης προέλευσης, να έχουν ταυτοποιηθεί πλήρως, να είναι σε θέση να επιβιώσουν τις αντίξοες συνθήκες του γαστρεντερικού σωλήνα (χαμηλό ph, χολικά άλατα) και να τον αποικίζουν, ώστε να ασκούν της ευεργετική τους δράση, 43

45 παραμένοντας σε σταθερή κατάσταση και σε υψηλές συγκεντρώσεις καθ όλη την διάρκεια εμπορικής ζωής του προϊόντος (Stanton et al., 1998). Στον πίνακα 2.6 παρουσιάζονται τα κριτήρια επιλογής προβιοτικών. Συχνά, μελέτες in vitro συνδυάζονται με μελέτες in vivo, αλλά και με κλινικές δοκιμές, ώστε να ερευνηθούν οι παραπάνω παράμετροι όσο το δυνατόν πιο αξιόπιστα (Conway, 1996). Πίνακας 2.6 Κριτήρια επιλογής προβιοτικών (Τζανετάκης, 2003) Για διατροφικά πρόσθετα 1. Να είναι ανθρώπινης προέλευσης 2. Να είναι αποδεκτά ως ασφαλή (GRAS) 3. Να αντέχουν σε χαμηλό ph 4. Να αντέχουν στα χολικά άλατα και στο παγκρεατικό υγρό 5. Να προσκολλώνται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου 6. Να αποικίζουν το έντερο του ανθρώπου 7. Να έχουν ευεργετικές ιδιότητες (αντιμικροβιακές, βιοχημικές, φυσιολογικές) 8. Να γίνεται επιβεβαίωση με κλινικές μελέτες Σταθερότητα και βιοτεχνικές ιδιότητες 1. Να είναι ζωτικά σε όλη τη διάρκεια της ζωής του προϊόντος 2. Να προσδίδουν απαλή οξύτητα 3. Να διατηρούν καλό άρωμα μετά τη ζύμωση 4. Να έχουν καλή διατήρηση-σταθερότητα στα ζυμωμένα προϊόντα (όχι μεγάλη μετοξίνιση) 5. Να έχουν σταθερότητα στην κατάψυξη και ξήρανση 6. Να γίνεται σωστή ταυτοποίηση του είδους και του στελέχους με φαινοτυπικές και γενοτυπικές μεθόδους Η λογική της επιλογής στελεχών με ανθρώπινη προέλευση στηρίζεται στο γεγονός ότι έρευνες έχουν δείξει πως στελέχη που απομονώνονται από το γαστρεντερικό σύστημα ενός οργανισμού, δεν μπορούν να αποικίσουν το έντερο οργανισμού διαφορετικού είδους. Ως συνέπεια, στελέχη που προέρχονται από το γαστερντερικό σύστημα του ανθρώπου, εξετάζονται για τυχόν προβιοτικές ιδιότητες 44

46 (Johansson et al., 1993). Εάν ένα στέλεχος έχει την δυνατότητα να αποικίζει το έντερο, αυτό σημαίνει ότι παραμένει εκεί για περισσότερο χρονικό διάστημα, ώστε να μπορεί να δράσει. Είναι επίσης γνωστό, ότι οι ευεργετικές ιδιότητες των προβιοτικών μικροοργανισμών εξαρτώνται από το κάθε στέλεχος χωριστά, χωρίς να είναι απαραίτητο να αποτελούν κοινό γνώρισμα για όλα τα στελέχη που ανήκουν στο ίδιο είδος. Για τον λόγο αυτό, η ακριβής ταυτοποίηση σε επίπεδο στελέχους καθίσταται κάτι παραπάνω από απαραίτητη. Βασική προϋπόθεση για να χρησιμοποιηθεί ένα στέλεχος ως προβιοτικό είναι να έχει την δυνατότητα να επιβιώσει κατά το πέρασμά του από το στομάχι, ώστε να φτάσει στο έντερο (Henriksson et al., 1999). Η έκκριση του γαστρικού οξέος από τον βλεννογόνο του στομάχου, αποτελεί ένα σημαντικό εμπόδιο για την αναχαίτηση των δυνητικά παθογόνων μικροοργανισμών, που εισέρχονται στον οργανισμό με την τροφή (Dunne et al., 2001). Για τον λόγο αυτό, σε ασθενείς που λαμβάνουν φάρμακα, τα οποία εμποδίζουν την έκκριση του οξέος (π.χ. παρεμποδιστές αντλίας πρωτονίων), είναι πιο εύκολο να περάσουν μικροοργανισμοί και να αποικίσουν το έντερο (Marteau et al., 1993). Το ph στο άδειο στομάχι είναι συνήθως 1,5 (Draser et al., 1969), όμως μετά την κατανάλωση τροφής ανεβαίνει στο 3 και διατηρείται σε αυτά τα επίπεδα για 2-4 ώρες. Εξίσου σημαντικό για ένα υποψήφιο προβιοτικό στέλεχος, είναι να εμφανίζει αντοχή στα χολικά άλατα (Lee and Salminen, 1995). Τα χολικά άλατα συνθέτονται στο ήπαρ από την χοληστερόλη, συγκεντρώνονται στην χοληδόχο κύστη, απ όπου και εκκρίνονται στο δωδεκαδάκτυλο (Hoffman et al., 1983). Στη συνέχεια, μεταβάλλονται χημικά σε διάφορα στάδια, λόγω της μικροβιακής δραστηριότητας (Hill and Draser, 1968, Shimada et al., 1969, Hylemon and Glass, 1983). Τα χολικά άλατα γενικά, ασκούν αντιμικροβιακή δράση σε πληθώρα μικροοργανισμών, με τα gram θετικά να είναι πιο ευαίσθητα από τα gram αρνητικά (Floch et al., 1972). Η σταθερότητα της βιωσιμότητας των προβιοτικών μικροοργανισμών κατά την προετοιμασία και την αποθήκευση, αποτελεί σημαντική παράμετρο και είναι κάτι που ελέγχεται εύκολα. Έχει αποδειχθεί ότι, πολλοί μικροοργανισμοί χάνουν κάποιες ιδιότητες όταν διατηρούνται σε συνθήκες εργαστηρίου. Για παράδειγμα, ορισμένα στελέχη που προέρχονται από το γαστρεντερικό σύστημα του ανθρώπου χάνουν σχετικά γρήγορα την ικανότητα να προσκολλούν στο επιθήλιο του βλεννογόνου, ενώ άλλα διατηρούν αυτήν την ικανότητα κατά την διάρκεια πολλών ανακαλλιεργειών 45

47 στο εργαστήριο (Conway, 1989). Είναι, λοιπόν, σημαντικό να διασφαλιστεί ότι το υποψήφιο προβιοτικό στέλεχος μπορεί να διατηρήσει τα επιθυμητά του χαρακτηριστικά τόσο στο εργαστήριο όσο και κατά την παραγωγή, διακίνηση και αποθήκευση των τροφίμων, μέσα στα οποία περιέχονται (Conway, 1996). Οι δοκιμές in vitro των υποψήφιων προβιοτικών στελεχών, δίνουν κατ αρχήν πληροφορίες για την ασφάλεια των στελεχών αυτών για τους καταναλωτές. Επιπλέον, δίνουν στοιχεία για τα ίδια στελέχη και για τους μηχανισμούς που αυτοί δρουν. Από ερευνητές προτείνεται η χρήση δοκιμών που στοχεύουν σε εξειδικευμένο στόχο (target-specific tests), οι οποίες να συνδυάζονται με δοκιμές in vivo. Οι δοκιμές που χρησιμοποιούνται κυρίως, παρουσιάζονται στον πίνακα 2.7. Πίνακας 2.7 Κύριες in vitro δοκιμές που χρησιμοποιούνται για την μελέτη προβιοτικών ιδιοτήτων στελεχών (FAO/WHO, 2002) 1. Αντοχή στην οξύτητα του στομάχου 2. Αντοχή σε χολικά άλατα 3. Προσκόλληση στον εντερικό βλεννογόνο και στα επιθηλιακά κύτταρα 4. Αντιμικροβιακή δράση έναντι δυνητικών παθογόνων μικροοργανισμών 5. Δυνατότητα μείωσης της προσκόλλησης παθογόνων από τον εντερικό βλεννογόνο 6. Υδρόλυση χολικών αλάτων Πρέπει όμως να τονιστεί, ότι οι δοκιμές αυτές δεν επαρκούν πλήρως για να προβλέπουν την λειτουργικότητά τους στο ανθρώπινο σώμα. Για τον λόγο αυτό, οι δοκιμές στο εργαστήριο δεν μπορούν από μόνες τους να χαρακτηρίσουν ένα στέλεχος ως προβιοτικό. Έτσι, καθίσταται αναγκαία η επιβεβαίωση μέσα από κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους (FAO/WHO, 2002). Οι δοκιμές αυτές (in vivo) στοχεύουν στην επιβεβαίωση των ευεργετικών ιδιοτήτων των προβιοτικών στελεχών, όπως η βελτίωση της υγείας του καταναλωτή, των συμπτωμάτων κάποιας ασθένειας και γενικότερα, της ποιότητας της ζωής του. Η κλινική εκτίμηση ενός προβιοτικού αποτελείται από 4 στάδια. Κατά το πρώτο στάδιο, εξετάζεται η ασφάλεια των προβιοτικών, στο 2 ο η δραστικότητα των στελεχών μαζί με τυχόν παρενέργειες, στο 3 ο η αποτελεσματικότητά τους και κατά το τελευταίο στάδιο γίνεται η παρακολούθηση, με βάση τα επιδημιολογικά στοιχεία (FAO/WHO, 2002). Ο 46

48 FAO/WHO προτείνει ένα συγκεκριμένο οδηγό για την εκτίμηση υποψήφιων προβιοτικών στελεχών (σχήμα 2.3) Ταυτοποίηση του στελέχους με φαινοτυπικές και γενοτυπικές μεθόδους. Γένος, είδος, στέλεχος Καταχώρηση του στελέχους στη διεθνή συλλογή Εκτίμηση ασφάλειας: In vitro και/ή σε ζώα 1η φάση: μελέτη σε ανθρώπους Χαρακτηρισμός λειτουργικών ιδιοτήτων: In vitro δοκιμές Μελέτες σε ζώα 2 η φάση ανθρώπινης δοκιμής, με διπλά τυφλά, τυχαία και με χρήση εικονικού φαρμάκου ή άλλο κατάλληλο σχέδιο πειράματος σε δείγμα πληθυσμού για εξαγωγή συμπερασμάτων για την δραστικότητα του στελέχους Δεύτερη ανεξάρτητη μελέτη ανάλογη της 2 ης φάσης για επαλήθευση των αποτελεσμάτων Προβιοτικό τρόφιμο 3 η φάση: Η δοκιμή αποτελεσματικότητας είναι χρήσιμη για την σύγκριση των προβιοτικών με την κλασική αντιμετώπιση μιας συγκεκριμένης κατάστασης Ετικετάρισμα Συστατικά - γένος, είδος, στέλεχος Ελάχιστος αριθμός ζώντων βακτηρίων κατά την ημερομηνία λήξης του προϊόντος Κατάλληλες συνθήκες αποθήκευσης Ενσωματωμένα στοιχεία επικοινωνίας για ενημέρωση του καταναλωτή Σχήμα 2.3 Οδηγός για την εκτίμηση προβιοτικών στελεχών (FAO/WHO, 2002) 47

49 Ασφάλεια προβιοτικών μικροοργανισμών Ιστορικά, οι λακτοβάκιλλοι και τα bifidobacteria, που σχετίζονται με τα τρόφιμα θεωρούνται ασφαλή (Adams and Marteau, 1995). Τον ισχυρισμό αυτό έρχεται να επιβεβαιώσει το γεγονός ότι αποτελούν μέρος της φυσιολογικής μικροχλωρίδας των θηλαστικών και ότι χρησιμοποιούνται με επιτυχία σε μία πληθώρα τροφίμων και προσθέτων τροφίμων παγκοσμίως. Παρ όλα αυτά, ορισμένα προβιοτικά πιθανώς να ενοχοποιούνται για την πρόκληση μερικών διαταραχών, όπως: Γενικευμένες μολύνσεις Επιβλαβείς μεταβολικές δραστηριότητες Υπερβολική διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος Μεταφορά γονιδίων Αναγνωρίζοντας την σημασία της διασφάλισης της ασφάλειας, ακόμα και σε βακτήρια που αναγνωρίζονται ως GRAS (Generally Recocnised As Safe), ο FAO/WHO συνιστά να εξετάζονται τα υποψήφια προβιοτικά στελέχη με μιά σειρά από δοκιμές, όπως τα παρακάτω: 1) Προσδιορισμός της αντοχής σε αντιβιοτικά 2) Καθορισμός των μεταβολικών δραστηριοτήτων (π.χ. παραγωγή λακτάσης) 3) Εξακρίβωση παρενεργειών κατά τις κλινικές δοκιμές 4) Επιδημιολογική παρακολούθηση περιστατικών διαταραχών της υγείας του καταναλωτή 5) Εάν το στέλεχος ανήκει σε τοξινογόνο είδος, πρέπει να ερευνηθεί η πιθανότητα παραγωγής τοξίνης από το ίδιο το στέλεχος 6) Εάν το στέλεχος ανήκει σε αιμολυτικό είδος, πρέπει να ερευνηθεί η πιθανότητα αιμολυτικής δράσης από το ίδιο το στέλεχος 48

50 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Μελετήθηκαν 19 στελέχη απομονώσεων προαιρετικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων από φέτα, κασέρι και γραβιέρα. Τα στελέχη, αφού ταυτοποιήθηκαν με την SDS-PAGE και την RAPD-PCR, στη συνέχεια μελετήθηκαν οι τεχνολογικές τους ιδιότητες, όπως επίσης εξετάστηκε μία σειρά από κριτήρια, με βάση τα οποία χαρακτηρίζεται ένα στέλεχος ως προβιοτικό ή όχι. Ο σκοπός ήταν να επιλεγούν υποψήφια προβιοτικά στελέχη κατάλληλα για να χρησιμοποιηθούν ως δευτερεύουσες καλλιέργειες για την παρασκευή γαλακτοκομικών προϊόντων. 49

51 4. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Στελέχη βακτηρίων και συνθήκες ανάπτυξης Μελετήθηκαν δεκαεννιά (19) απομονώσεις από τυρί φέτα (10 στελέχη), κασέρι (4 στελέχη) και γραβιέρα (5 στελέχη), για τα οποία διαπιστώθηκε αμφίβολη φαινοτυπική ταξινόμηση. Για την ταυτοποίηση χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα στελέχη αναφοράς: Lb. plantarum ATCC (ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.), Lb. pentosus NCFB 363 (NCFB, National Collection of Food Bacteria, England), Lb. paracasei subsp. paracasei NCDO 151 (NCDO, National Collection of Dairy Organisms, England), Lb. paracasei subsp. tolerans NCFB 2742, Lb. paraplantarum LMG (BCCM/LMG Bacteria Collection, Laboratory of Microbiology, University of Gent, Gent, Belgium). Τα παθογόνα στελέχη που προκαλόυν τροφογενείς λοιμώξεις και χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο αντιμικροβιακής δράσης, ήταν τα εξής: Escherichia coli O:44 NCTC 9702 (NCTC, National Collection of Type Cultures, England), Staphylococcus aureus NCTC 9751, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica O:9/4360 (Pasteur Institute, Paris), Listeria monocytogenes SCOT A και Bacillus cereus DSM 231 (DSM, German Collection of Microorganisms, Brawnschweig, Germany). Από τα αλλοιωγόνα στελέχη που είναι ευαίσθητα σε βακτηριοσίνες χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα: Lactobacillus casei ATCC 344, Lactobacillus reuteri DSM 20016, Lactobacillus helveticus ATCC 15009, Lactococcus lactis subsp. lactis LMG 6890, Clostridium tyrobutyricum NCDO 1754, Clostridium sporogenes C22/10, Listeria innocua BL86/20, Pediococcus pentosaseus SFBB63, Enterococcus faecalis Ef1, Streptococcus thermophilus ST112 (από τη συλλογή του Εργαστηρίου Τεχνολογίας Γάλακτος του Τμήματος Επιστήμης και Tεχνολογίας Τροφίμων, του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών), C. albicans, S. cerevisiue και D. hansenii (από τη συλλογή του εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων, Τ.Ε.Τ.Τ., Γεωπονική σχολή, Α.Π.Θ.). Τα στελέχη του γένους Lactobacillus διατηρήθηκαν σε ΜRS broth με γλυκερόλη (70:30) στους -80 ο C και προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στις διάφορες δοκιμές, δραστηριοποιούνταν έπειτα από δύο διαδοχικές ανακαλλιέργειες σε ΜRS broth. Τα παθογόνα στελέχη-δείκτες διατηρήθηκαν σε Brain Heart broth με γλυκερόλη (70:30) στους -80 ο C, και δραστηριοποιούνταν σε Brain Heart broth δύο 50

52 φορές πριν τη χρήση τους. Ο Lactococcus lactis subsp. lactis και ο Streptococcus thermophilus διατηρούνταν και αναπτύσσονταν σε Μ17 broth. Όλα τα υλικά προέρχονται από τη Merck (Darmstadt, Germany). 4.2 Ταυτοποίηση των απομονώσεων Φαινοτυπικές ιδιότητες Χρώση Gram Λαμβάνονταν μια κρικιά δραστηριοποιημένης καλλιέργειας (24 ωρών) από MRS broth (Merck, Darmstadt, Germany) και αφού επιστρωνόταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα, αφηνόταν να στεγνώσει σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούσε μονιμοποίηση με πέρασμα της αντικειμενοφόρου 3 φορές πάνω από φλόγα. Η βαφή γινόταν με διάλυμα Crystal Violet για 2-3 λεπτά και έπειτα ξεπλενόταν με Lugol, που αφηνόταν για άλλα 2 λεπτά. Τέλος, ακολουθούσε το στάδιο του αποχρωματισμού, όπου η αντικειμενοφόρος πλάκα ξεπλενόταν με ακετόνη και νερό. Μετά, η πλάκα βαφόταν με διάλυμα φουξίνης 10% για 30 δευτερόλεπτα και η χρώση ολοκληρωνόταν με πλύσιμο της πλάκας με νερό και στέγνωμα με διηθητικό χαρτί. Ακολουθούσε παρατήρηση στο μικροσκόπιο με καταδυτικό φακό, αφού είχε προστεθεί 1 σταγόνα κεδρελαίου Έλεγχος ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες Ελέγχθηκε η ικανότητα της ανάπτυξης των στελέχων σε 15, 37 και 45 C. Τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν 2 φορές σε MRS broth και στη συνέχεια εμβολιάζονταν σε 10 ml ζωμό MRS (εμβόλιο 1%, v/v), επωάζονταν στις κατάλληλες θερμοκρασίες σε κλίβανο (15 C για μία εβδομάδα, 37 C και 45 C για 48 ώρες) και ελέγχονταν για ανάπτυξη. Σε θετική δοκιμή παρατηρούνταν ανάπτυξη (θόλωμα, ίζημα στον πυθμένα) στον δοκιμαστικό σωλήνα ενώ σε αρνητική όχι. Αν τα στελέχη έδιναν φτωχή ανάπτυξη, τότε γινόταν μέτρηση του ph του υποστρώματος και του μάρτυρα. Αν το ph είχε πέσει πάνω από 0,2 μονάδες σε σχέση με τον μάρτυρα, τότε η δοκιμή λαμβάνονταν ως θετική, ενώ σε αντίθετη περίπτωση αρνητική. 51

53 Έλεγχος ανάπτυξης σε διάφορες συγκεντρώσεις NaCl Ελέγχθηκε η ικανότητα της ανάπτυξης των στελέχων σε MRS broth με 3,5%, 6,5%, 8% και 12% NaCl (Sigma-Aldrich, GmbH, Germany). Τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν 2 φορές σε MRS broth και στη συνέχεια εμβολιάζονταν σε 10 ml ζωμό NaCl (εμβόλιο 1%, v/v), επωάζονταν στους 30 C για 72 ώρες και ελέγχονταν για ανάπτυξη. Σε θετική δοκιμή παρατηρούνταν ανάπτυξη (θόλωμα, ίζημα στον πυθμένα) στον δοκιμαστικό σωλήνα ενώ σε αρνητική όχι. Αν τα στελέχη έδιναν φτωχή ανάπτυξη, τότε γινόταν μέτρηση του ph του υποστρώματος και του μάρτυρα. Αν το ph είχε πέσει πάνω από 0,2 μονάδες σε σχέση με τον μάρτυρα τότε η δοκιμή λαμβάνονταν ως θετική, ενώ σε αντίθετη περίπτωση αρνητική Παραγωγή CΟ 2 από γλυκόζη Στη δοκιμή αυτή χρησιμοποιήθηκε υπόστρωμα MRS agar το οποίο περιέχει 5% γλυκόζη (παράρτημα ). Πριν τον εμβολιασμό, είχε προηγηθεί βρασμός για 30 λεπτά προκειμένου να λιώσει το άγαρ, αλλά και για να γίνει η απαέρωση του υποστρώματος. Τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν 2 φορές σε MRS broth και στη συνέχεια εμβολιάζονταν στο υπόστρωμα τοποθετώντας την πιπέτα στον πυθμένα του δοκιμαστικού σωλήνα και αφήνοντας το εμβόλιο (0,5ml) να τρέξει ανεβάζοντας την πιπέτα μέχρι λίγο πριν την επιφάνεια του υποστρώματος. Στη συνέχεια, πωματίζονταν με στρώμα άγαρ 2%, περίπου 2cm ύψους, και επωάζοταν στους 30 C για ημέρες. Οι καλλιέργειες ελεγχόταν καθημερινά για την παραγωγή αερίου. Σε θετική δοκιμή το πώμα ανασηκώνονταν υπό την πίεση του παραγόμενου CO 2, ενώ σε αρνητική δοκιμή όχι Υδρόλυση αισκουλίνης Τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν 2 φορές σε MRS broth και στη συνέχεια εμβολιάζονταν (εμβόλιο 1%, v/v) σε δοκιμαστικούς σωλήνες με υπόστρωμα με αισκουλίνη (παράρτημα ) και επωάζονταν στους 30 C για μία εβδομάδα. Οι καλλιέργειες ελέγχονταν καθημερινά για την αλλαγή χρώματος που σήμαινε την υδρόλυση της αισκουλίνης. Σε θετική δοκιμή το χρώμα από καστανοκόκκινο γινόταν καφέ πολύ σκούρο, ενώ σε αρνητική δοκιμή δεν εμφανιζόταν καμία αλλαγή. 52

54 Παραγωγή αμμωνίας από αργινίνη Εμβολιάζονταν 24 ωρών καλλιέργειες (εμβόλιο 1%, v/v) σε 5ml υπόστρωμα Arginine broth (παράρτημα ) και επωάζονταν στους 30 C για 48 ώρες (Niven et al., 1942). Μετά την επώαση, προσθέτονταν 5 σταγόνες αντιδραστηρίου Nessler (αναμιγνύονταν ίσες ποσότητες αντιδραστηρίων Α και Β λίγο πριν την χρήση, παράρτημα ) και ελεγχόταν η αλλαγή χρώματος. Σε θετική δοκιμή παρατηρούνταν καφέ-πορτοκαλί ίζημα, ενώ σε αρνητική όχι Ζύμωση σακχάρων Η ζύμωση σακχάρων μελετήθηκε με τη χρήση αποστειρωμένων πλακετών με βοθρία (Greiner Labor technik, Frickenhausen, Germany), σύμφωνα με την μεθοδολογία που προτείνεται από την API (Biomerieux SA, Marcy-l -Etole, France). Έπειτα από δεύτερη ανακαλλιέργεια των στελεχών σε MRS broth, λαμβανόταν κρικιά και επιστρωνόταν σε πλάγιο MRS agar με 0,5% γλυκόζη και επωάζονταν στους 30 C για 24 ώρες. Την επόμενη μέρα ξεπλένονταν το πλάγιο MRS agar με αποστειρωμένο φυσιολογικό ορό (0,85% NaCl) μέχρι να επιτευχθεί θολερότητα επιπέδου 4 κλίμακας McFarland. Ακολουθούσε εμβολιασμός (50 μl) του εναιωρήματος του κάθε στελέχους σε αποστειρωμένη πλακέτα με βοθρία, στα οποία τοποθετούνταν τροποποιημένο MRS broth (βασικό υπόστρωμα σακχάρων, παράρτημα ) 200μl καθώς και το διάλυμα του σακχάρου 50 μl (υδατικό διάλυμα 10% w/v, που αποστειρώνονταν με διήθηση). Τα σάκχαρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: ραμνόζη, κελλοβιόζη, μελιβιόζη, μανιτόλη, ριβόζη, ραφφινόζη, μαννόζη και γλυκόζη (Fitzsimons et al., 1999). Η τοποθέτηση στην πλακέτα γινόταν με μικροπιπέτες. Τέλος, προσθέτονταν επιφανειακά 2 σταγόνες αποστειρωμένου παραφινέλαιου για να δημιουργηθεί αναερόβιο περιβάλλον. Έπειτα ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 72 ώρες. Σε θετική δοκιμή το χρώμα του δείκτη από κόκκινο γινόταν κίτρινο, λόγω παραγωγής οξέος και πτώσης του ph, ενώ σε αρνητική δοκιμή δεν παρουσιαζόταν καμία αλλαγή Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Η μέθοδος SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου εφαρμόστηκε με σκοπό την ταυτοποίηση των απομονώσεων των λακτοβακίλλων. Οι απομονώσεις 53

55 αφού δραστηριοποιήθηκαν δύο φορές σε MRS broth στους 30 C, στη συνέχεια εμβολιάστηκαν (1% εμβόλιο) σε σωληνάκια των 20ml σε MRS broth και επωάστηκαν στους 30 C για 24 ώρες. Τα κύτταρα των λακτοβακίλλων συλλέχθηκαν μέσω φυγοκέντρησης (4.000 rpm για 10 min στους 4 C για παραλαβή βιομάζας, Sigma 3K centrifuge, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO). Μετά τη φυγοκέντρηση απορρίφθηκε το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα που σχημάτιζαν τα κύτταρα ξεπλύθηκε με 5ml διαλύματος KH 2 PO 4 (0,01M, ph=7,0). Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rpm x 10 min, απόρριψη υπερκείμενου και ακόμη ένα ξέπλυμα με 5ml διαλύματος KH 2 PO 4. Στην τελική βιομάζα προστέθηκε 1ml διαλύματος KH 2 PO 4 και ακολούθησε καλή ανατάραξη σε κυκλομείκτη (vortex). Τα κύτταρα με το υγρό μεταφέρθηκαν σε eppedorf του 1,5 ml. Στη συνέχεια, η φυγοκέντρηση διεξήχθη σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις rpm x 10 min στους 4 C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε από το eppedorf. Στο ίδιο eppedorf με τη βιομάζα προστέθηκε άμμος (glass beads) διαμέτρου 0,1mm ποσότητας 150 mg και 1 ml buffer με 2 mμ PMSF (αναστολέας πρωτεάσης) και ακολούθησε μηχανικό σπάσιμο στην ειδική συσκευή τύπου κυκλομείκτη (Vortex-Genie 2T, Scientific Industries, Inc., NY, USA) στη μέγιστη ταχύτητα για 4min. Έπειτα, ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις rpm x 10 min στους 4 C. Το υπερκείμενο κυτταρικό εκχύλισμα συλλέχθηκε προσεκτικά σε καθαρό eppedorf και διατηρήθηκε στην κατάψυξη μέχρι να αναλυθεί. Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τους Lowry et al. (1951). Για το σκοπό αυτό, το eppedorf με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα αναδεύεται σε vortex και στη συνέχεια μεταφέρονται 0,5ml δείγματος σε σωλήνα με πορτοκαλί βιδωτό πώμα, όπου προστίθενται 0,7ml διαλύματος Lowry (παράρτημα 4.2.2). Το σωληνάκι αναδεύεται πολύ λίγο σε χαμηλή ταχύτητα και παραμένει σε ηρεμία για 20min σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Τα τελευταία 2 λεπτά παρασκευάζεται το διάλυμα Folin (παράρτημα 4.2.8) και προστίθεται στα σωληνάκια ποσότητα 0,1ml. Ακολουθεί ανάδευση σε υψηλή ταχύτητα σε vortex και παραμονή σε ηρεμία για μισή ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά το πέρας της μισής ώρας το μίγμα αναδεύεται για λίγο στο vortex, μεταφέρεται σε κυβέτα του 1ml και μετράται η απορρόφηση στα 500nm σε φασματοφωτόμετρο (JenWay 6305 UV/Vis Spectrophotometer, Bibby Scientific Limited, Staffordshire, U.K.). 54

56 Αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών το κυττάρου του μικροοργανισμού, προσδιορίζεται η κατάλληλη ποσότητα εμβολίου και ακολουθεί η ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE με διαστάσεις 141x160x1,5mm (Laemmli, 1970). Αφού στηθεί προσεκτικά η συσκευή της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί έλεγχος με προσθήκη απεσταγμένου νερού ανάμεσα στις πλάκες για τυχόν διαρροές. Έπειτα απομακρύνεται το νερό, σκουπίζονται οι πλάκες με διηθητικό χαρτί και στη συνέχεια προετοιμάζεται η πηκτή διαχωρισμού. Για την παρασκευή των δύο πηκτών διαχωρισμού (12% Τ, 2,67% C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 26,8ml δις απεσταγμένο νερό, 20ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού (Tris-HCl 1,5Μ, ph 8,8), 32ml monomer solution, 0,8ml υδατικό διάλυμα (10%) SDS, 280μl APS, 40μl TEMED, αναδεύονται ήπια και προστίθενται αμέσως 25ml του διαλύματος ανάμεσα στις πλάκες, ώστε να φτάσει το ύψος της στάθμης από τη βάση των πλακών στα 12,5cm. Στη συνέχεια, επιστρώνεται πάνω από το διάλυμα της πηκτής ορισμένη ποσότητα ισοπροπανόλης (2ml), ώστε να επιτευχθεί επίπεδη επιφάνεια και αναερόβιες συνθήκες, σκεπάζεται το επάνω μέρος των πλακών με παραφίλμ για την αποφυγή εισόδου του αέρα και εξάτμισης της ισοπροπανόλης και παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 90 λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Μετά το πέρας του απαιτούμενου χρόνου, απορρίπτεται η ισοπροπανόλη, ξεπλένεται η πηκτή με απεσταγμένο νερό τρεις φορές και επιστρώνεται με 1,6ml αραιωμένου στο ¼ ρυθμιστικού διαλύματος πηκτής διαχωρισμού το οποίο περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού, 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Ακολουθεί παραμονή της πηκτής σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 18 ώρες. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό και ξεπλένεται η πηκτή δύο φορές με απεσταγμένο νερό. Οι πλάκες αναστρέφονται σε διηθητικό χαρτί ώστε να στεγνώσουν. Έπειτα, προετοιμάζεται η πηκτή συσσώρευσης. Για την παρασκευή δύο πηκτών συσσώρευσης (πηκτή συσσώρευσης, 5% Τ, 2,67% C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 17,1ml δις απεσταγμένο νερό, 7,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 5,1ml monomer solution, 0,3ml υδατικό διάλυμα SDS, 150μl APS, 37,5μl TEMED και αναδεύονται ήπια. Έπειτα, προστίθεται αμέσως ανάμεσα στις πλάκες, αφού προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί τα χτένια (πάχους 1,5mm, 20 θέσεων), τόση ποσότητα ώστε η στάθμη να φτάσει το πάνω όριο των τζαμιών. Ακολουθεί παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 30 λεπτά ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Ακολούθως, απομακρύνονται με προσοχή τα 55

57 χτένια και οι «τσέπες» που σχηματίζονται γεμίζονται με ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης αραιωμένου στο ¼, το οποίο περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Πριν τον εμβολιασμό των πηκτών με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα, το υγρό απομακρύνεται από τις τσέπες, ξεπλένονται δύο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής και τελικά πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής. Η προετοιμασία των δειγμάτων περιλαμβάνει την ανάμιξη σε eppendorf ίσων όγκων (200 μl : 200 μl) κυτταρικού εκχυλίσματος με sample treatment buffer (STB), που περιέχει 2% SDS και χρωστική βρωμοφαινόλης. Ακολουθεί θέρμανση των δειγμάτων στους ο C για 10 λεπτά και στη συνέχεια διατηρούνται τα δείγματα στην κατάψυξη (<-18 ο C) μέχρι τη χρήση τους. Tο STB περιέχει: α) SDS, το οποίο φορτίζει αρνητικά όλες τις πρωτείνες, το φορτίο τους πλέον θεωρείται ίσο, οπότε αυτές κινούνται και διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους βάρος. Απαιτούνται περίπου 1,4g SDS ανά 1g πρωτείνης, β) 2-μερκαπτοαιθανόλη, η οποία σπάει τους δισουλφιδικούς δεσμούς των πρωτεϊνών και γ) sucrose, που όπως και η γλυκερόλη, επιβραδύνει τη μετακίνηση των πρωτεϊνών, περιορίζοντας έτσι το φαινόμενο της διάχυσης. Πριν τον εμβολιασμό, φυγοκεντρούνται τα δείγματα στις rpm για 3min. Στη συνέχεια με τη βοήθεια μικροσύριγγας εμβολιάζεται ο κάθε υποδοχέας με την κατάλληλη ποσότητα εμβολίου, η οποία κυμαίνεται από 10-20μl και εξαρτάται από τη συγκέντρωση σε πρωτεΐνες του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Το εμβόλιο περιέχει πρωτεϊνικό εκχύλισμα και ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος σε ίσο όγκο, (STB, 2% SDS, 0,001% μπλε βρωμοφαινόλης) (παράρτημα 4.2.2). Η συγκέντρωση πρωτεϊνών στο δείγμα πρέπει να είναι 1-2μg/μl κυτταρικού εκχυλίσματος. Ο υπολογισμός στηρίζεται στη μέθοδο Lowry. Οι ακριανοί υποδοχείς δεν εμβολιάζονται, παραμένουν κενοί ή πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Ανά 4 υποδοχείς εμβολιάζεται το πρότυπο στέλεχος (Psychrobacter immobilis LMG 1125) για τη σύγκριση των πηκτών. Το Psychrobacter immobilis χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επαναληψιμότητας των συνθηκών της ηλεκτροφόρησης, χρησιμοποιείται όμως παράλληλα και ως στέλεχος αναφοράς για την απαιτούμενη ευθυγράμμιση των ζωνών των πηκτών κατά την επεξεργασία τους στο λογισμικό πρόγραμμα Gel Compar. Αμέσως μετά τον εμβολιασμό, πληρώνεται η κάτω δεξαμενή με το ρυθμιστικό διάλυμα και η συσκευή με τις στερεωμένες πηκτές βυθίζεται στην δεξαμενή. 56

58 Γεμίζεται αργά η πάνω δεξαμενή με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και συνδέεται η μονάδα της ηλεκτροφόρησης με την ψύξη και το ρευματοδότη. Η ένταση του ηλεκτρικού ρεύματος είναι σταθερή στα 12mA και η τάση ελεύθερη. Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί περίπου 18 ώρες και το μέτωπό της διανύει απόσταση περίπου 9,5cm από την πηκτή διαχωρισμού. Μόλις ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση ακολουθεί στερέωση των πρωτεϊνών σε διάλυμα TCA 10% για περίπου 1 ώρα. Οι πηκτές ανακινούνται σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το διάλυμα TCA και προστίθεται το διάλυμα χρώσης και οι πηκτές χρωματίζονται για 2 ώρες υπό ανακίνηση σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Έπειτα, απομακρύνεται η χρωστική και οι πηκτές αποχρωματίζονται σε πρόσφατα παρασκευασμένο διάλυμα αποχρωματισμού με ανακίνηση για 40 λεπτά. Ακολουθεί αλλαγή του διαλύματος αποχρωματισμού και επανάληψη της διαδικασίας αποχρωματισμού για άλλες δύο φορές. Μετά τον αποχρωματισμό οι πηκτές φωτογραφίζονται και μπορούν να διατηρηθούν σε διάλυμα οξικού οξέος 7%. Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας των ηλεκτροφορητογραφημμάτων των πρωτεϊνικών προφίλ, διεξήχθη μέσω του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.6 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Ο συντελεστής συσχέτισης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο Pearson product moment correlation coefficient (r) και η ομαδοποίηση των στελεχών σε δενδρογράμματα έγινε με βάση τον αριθμητικό αλγόριθμο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Average linkages). Η ταυτοποίηση των απομονώσεων διεξήχθη συγκρίνοντας το πρωτεϊνικό τους προφίλ με το πρωτεϊνικό προφίλ του στελέχους αναφοράς Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους με RAPD-PCR Εξαγωγή του DNA Η εξαγωγή του DNA έγινε με τη μέθοδο των Querol et al, (1992). Τα στάδια που ακολουθήθηκαν ήταν αναλυτικά τα εξής: 1. Ανακαλλιέργεια σε MRS broth (δύο φορές) 2. Μεταφορά 1,5 ml σε αποστειρωμένο eppendorf (2 για κάθε στέλεχος) 3. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 5-7 λεπτά στους 4 C 4. Ξέπλυμα της βιομάζας δύο φορές με ΤΕ buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, ph 7,5) 57

59 5. Προσθήκη 100 μl διαλύματος ΤΕ (ph 7,4) με 50 mg/ml λυσοζύμη και καλή ανάδευση. Επώαση για 1 ώρα στους 37 ο C με ανάδευση στην μισή ώρα (λύση των κυττάρων) 6. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 10 λεπτά στους 4 C 7. Απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 500 μl διαλύματος 50mM Tris, 20 mm EDTA (ph 7,4) και καλή ανάμιξη 8. Προσθήκη 50 μl 10% SDS, απαλή ανάμιξη και επώαση στους 65 ο C για 30 λεπτά (διαύγαση του μείγματος, λόγω της δράσης του SDS και της θερμότητας πάνω στις πρωτεΐνες και το κυτταρικό τοίχωμα του βακτηριακού κυττάρου) 9. Προσθήκη αμέσως 200 μl κρύου αποστειρωμένου potassium acetate (5Μ), απαλή ανακίνηση και τοποθέτηση σε πάγο για 30 λεπτά (καθίζηση των πρωτεϊνών) 10. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 20 λεπτά στους 4 C 11. Προσεκτική μεταφορά της υπερκείμενης φάσης σε καινούργιο αποστειρωμένο eppedorf που περιέχει το DNA 12. Προσθήκη 600 μl κρύας (-20 ο C) ισοπροπανόλης και απαλή ανακίνηση (καθίζηση του DNA, εμφάνιση νηματίων DNA) 13. Παραμονή 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 14. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 15 λεπτά στους 4 C 15. Προσεκτική απομάκρυνση της ισοπροπανόλης και προσθήκη (500 μl) κρύας αιθανόλης 70% στο ίζημα και επαναδιάλυση του ιζήματος 16. Φυγοκέντρηση στις στροφές για 5 λεπτά στους 4 C 17. Πολύ καλή απομάκρυνση της αιθανόλης και ξήρανση του ιζήματος στο laminar 18. Ενυδάτωση του DNA με 100 μl ΤΕ διαλύματος στους 4 C μέχρι την επόμενη ημέρα 19. Συντήρηση στους -20 ο C μέχρι την ημέρα της ανάλυσης Ποσοτικοποίηση του DNA Λαμβάνονταν 10 μl δείγματος και αραιώνονταν 70 φορές με 690 μl αποστειρωμένο νερό υψηλής καθαρότητας. Η αραίωση γινόταν σε 2 eppedorf, ώστε να μετρηθεί η απορρόφηση στα 260nm και 280nm σε φασματοφωτόμετρο. Η τιμή της απορρόφησης στα 260nm χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του DNA με βάση τον τύπο: 1OD 260nm =50ng/μl. Η τιμή που προέκυπτε πολλαπλασιαζόταν με το 70 για να βρεθεί η πραγματική συγκέντρωση. 58

60 Έλεγχος καθαρότητας του DNA Ο λόγος της απορρόφησης 260/280 nm χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της καθαρότητας του DNA. Συγκεκριμένα, εάν ο λόγος είναι 1,8 με 2, τότε το DNA είναι καθαρό. Εάν είναι μικρότερος του 1,8 σημαίνει ότι οι πρωτεΐνες είναι σε αυξημένα επίπεδα και μπορεί να δημιουργήσει πρόβλημα, ενώ εάν είναι μεγαλύτερος από 2-3, τότε σημαίνει ότι το RNA είναι σε αυξημένα επίπεδα, χωρίς ωστόσο να μπορεί να δημιουργήσει κάποιο πρόβλημα. Επίσης, η καθαρότητα και η ποιότητα του DNA ελέγχθηκε και με οριζόντια ηλεκτροφόρηση με αγαρόζη (0.8%) σε 0,5x TBE (50 ml). Το buffer της ηλεκτροφόρησης είναι και αυτό 50 ml 0,5x TBE. Σε λωρίδα parafilm γινόταν ανάμιξη 2 μl χρωστικής με 8 μl DNA και εμβολιαζόταν η πηκτή. Στη συνέχεια ρυθμιζόταν η τάση στα 80 volt με ελέυθερη την ένταση και έτρεχε η ηλεκτροφόρηση για περίπου 20 λεπτά. Έπειτα από χρωματισμό για 10 λεπτά σε διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου γινόταν σκανάρισμα της πηκτής Αραίωση του DNA Στην αντίδραση της PCR πρέπει όλα τα στελέχη να έχουν συγκέντρωση DNA 80 ng/μl. Για το κάθε στέλεχος ισχύει: 5μl + xh 2 O = 80 ng/μl. Δηλαδή 5 μl από το κάθε στέλεχος αραιώνεται με την κατάλληλη ποσότητα νερού, ώστε να έχει τελική συγκέντρωση 80 ng/μl και να χρησιμοποιηθεί 1 μl από το καθένα για την αντίδραση. Για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε ο εξής τύπος: { (Συγκέντρωση DNA του δείγματος/80) x 5 } 5 = x, όπου x είναι η ποσότητα αποστειρωμένου υπερκάθαρου νερού που πρέπει να προστεθεί σε 5 μl κάθε δείγματος για να γίνει η συγκέντρωση 80 ngμl Αντίδραση RAPD-PCR Η αντίδραση της RAPD-PCR έγινε σύμφωνα με τους Torriani et al. (2001), Cocconcelli et al. (1995), Zapparoli et al. (1998) και Zapparoli et al. (2000). Χρησιμοποιήθηκαν δύο εκκινητές (primers), ο Μ14 (5 GAGGGTGGGGCCGTT 3 ) και ο COC (5 AGCAGCGTGG 3 ). Οι συνθήκες για τον Μ14 ήταν οι εξής: το πρώτο στάδιο στους 94 ο C για 1 λεπτό, 40 κύκλοι με 1 λεπτό στους 94 ο C, 20 δευτερόλεπτα στους 45 ο C και τέλος 2 λεπτά στους 72 ο C. Ακολουθούσε το τελικό 59

61 στάδιο στους 72 ο C για 2 λεπτά. Οι συνθήκες για τον COC ήταν: το πρώτο στάδιο στους 94 ο C για ένα λεπτό και έπειτα 40 κύκλοι με 1 λεπτό στους 94 ο C, ένα λεπτό στους 29 ο C και δύο λεπτά στους 72 ο C με ρυθμό αύξησης θερμοκρασίας 0,6 ο C ανά δευτερόλεπτο και τέλος δύο λεπτά στους 72 ο C. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: 1μΜ εκκινητή COC, 4μM εκκινητή Μ14, 200μΜ βάσεις δεοξυριβονουκλεοτιδίων, 1x ρυθμιστικού διαλύματος της Taq πολυμεράσης και 2 μονάδες ενζύμου Taq πολυμεράση. Παρασκευάζονταν ένα μείγμα από τα παραπάνω συστατικά της αντίδρασης (master mix) και διανέμονταν σε αποστειρωμένα μικρά eppendorf, 24 μl σε κάθε eppendorf. Έπειτα προσθέτονταν 1 μl από το αραιωμένο DNA του κάθε δείγματος, συγκέντρωσης 80 ng/μl και σφραγίζονταν με σταγόνα αποστειρωμένου παραφινέλαιου. Η πολλαπλή αντιγραφή του DNA πραγματοποιήθηκε σε συσκευή PTC-100 Thermo Cycler (MJ Research Inc. Massachussets 02451, USA). Τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1.5%) σε 0.5x TBE buffer. Σε κάθε τσέπη φορτώνονταν 10 μl προϊόν της RAPD-PCR με 5 μl χρωστικής. Σε τρεις διαφορετικές θέσεις της πηκτής φορτώνονταν και ένα πρότυπο μοριακών βαρών (DNA ladder 100 bp). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούνταν σε σταθερή τάση 100 Volt και ελεύθερη ένταση και σταματούσε όταν το μέτωπο διήνυε 9 εκατοστά. Οι πηκτές εμβαπτίζονταν σε διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου για περίπου 30 λεπτά για χρωματισμό. Οι φωτογραφίες των πηκτών σαρώνονταν με τη βοήθεια ενός οπτικού σαρωτή και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια ενός λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.6 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). Ο συντελεστής συσχέτισης που χρησιμοποιήθηκε ήταν ο Pearson coefficient και η ομαδοποίηση των στελεχών σε δενδρογράμματα έγινε με βάση τον αριθμητικό αλγόριθμο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Average linkages). 4.3 Τεχνολογικές ιδιότητες Ικανότητα οξινίσεως Τα στελέχη έπειτα από την δεύτερη ανακαλλιέργεια, εμβολιάζονταν (1% εμβόλιο v/v) σε 10 ml αποστειρωμένης, αποβουτυρωμένης και ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος και την επόμενη ημέρα εμβόλιο 1% v/v από το γάλα αυτό εμβολιάζονταν εκ νέου σε 60 ml αποστειρωμένης, αποβουτυρωμένης και ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος. Η τιμή του ph μετρήθηκε από πεχάμετρο (γυάλινο 60

62 ηλεκτρόδιο, HANNA Instruments, Padova, Italy) στις 0, 6, 16 και 24 ώρες ύστερα από επώαση στους 30 C. Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε σε 2 επαναλήψεις Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Για την παραγωγή εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών (παραγωγή δεξτράνης από σακχαρόζη), χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή του Hitchener et al. (1982). Έπειτα από την δεύτερη ανακαλλιέργεια, λαμβάνονταν μία κρικιά και επιστρωνόνταν σε τρυβλίο με τροποποιημένο MRS agar με 5% σακχαρόζη και ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 48 ώρες. Σε θετική δοκιμή σχηματίζεται πολυσακχαρίτης (slime) Δοκιμή αφομοίωσης κιτρικών Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, μία κρικιά επιστρωνόταν σε πλάγιο MRS agar και επωάζονταν στους 30 C για 24 ώρες. Την επόμενη μέρα λαμβάνονταν μία κρικιά και επιστρωνόνταν σε πλάγιο Simmons Citrate agar (Oxoid, Hampshire, England). Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 30 ημέρες. Σε θετική δοκιμή το υπόστρωμα από πράσινο γινόταν μπλε (Harrigan, 1998) Δοκιμές πρωτεολυτικής δράσης Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβάνονταν μία κρικιά και τοποθετούνταν σε τρυβλίο με PCA (Plate Count Agar, Biokar Ddiagnostics, Beauvair, France) + 10% γάλα. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για ώρες. Σε θετική δοκιμή σχηματιζόταν διαυγή ζώνη γύρω από τις αποικίες. Εάν εμφανιστεί η ζώνη, τότε προσθέτεται πάνω από τις αποικίες διάλυμα γαλακτικού οξέος 10% και παρατηρείται και πάλι εάν υπάρχει διαυγής ζώνη, οπότε θεωρείται η δοκιμή θετική (Harrigan, 1998). Ακόμη, ανιχνεύθηκε η ποσότητα των ελεύθερων αμινοξέων, εκφρασμένη σε ισοδύναμα L-γλυκίνης, από τα στελέχη που αναπτύσσονται σε γάλα μετά από 1, 4 και 7 ημέρες με τη μέθοδο της ο-ρα (o-φθαλδιαλδεΰδη) σύμφωνα με τους Church et al. (1983). Η αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο γεγονός ότι η ο-φθαλδιαδεΰδη αντιδρά με τη β-μερκαπτοαιθανόλη και τις πρωτοταγείς αμίνες, που απελευθερώνονται κατά την υδρόλυση των πρωτεϊνών και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο (1-αλκυλθειο-2- αλκυλισοϊνδόλη), που φθορίζει αλλά και απορροφά έντονα στα 340nm. Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth και μία φορά σε 10 ml (εμβόλιο 61

63 1%) αποστειρωμένης αποβουτυρωμένης και ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος, γινόταν ο τελικός εμβολιασμός σε 60 ml (εμβόλιο 1%) αποστειρωμένης, αποβουτυρωμένης και ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος και ακολουθούσε επώαση στους 30 o C. Στη συνέχεια λαμβανόταν 5 ml δείγμα την 1 η, 4 η και 7 η ημέρα από την τελική ανάπτυξη σε μεγάλους δοκιμαστικούς σωλήνες με βιδωτό πώμα και συμπληρωνόταν με 10 ml 18% τριχλωροξικού οξέως (TCA), ώστε η τελική του συγκέντρωση στο δείγμα να είναι 12% και ακολουθούσε ισχυρή ανάδευση σε κυκλομείκτη. Έπειτα, τα δείγματα αφήνονταν σε ηρεμία για 15 λεπτά και ακολουθούσε δεύτερη ισχυρή ανάδευση. Στη συνέχεια, 1 gr δείγματος ζυγίζοταν σε σωλήνες τύπου eppendorf και ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές στους 10 ο C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, το υπερκείμενο υγρό μεταφερόταν σε άλλο καθαρό eppendorf. Ακολουθούσε μεταφορά 150 μl από το υγρό σε κυβέτα, όπου προσθέτονταν 3 ml πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος o-pa (παράρτημα 4.3.4) και ακολουθούσε ανάδευση. Έπειτα από 2 λεπτά παραμονής σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, προσδιοριζόταν η οπτική πυκνότητα στα 340nm σε φασματοφωτόμετρο. Από την μετρούμενη τιμή αφαιρούνταν το τυφλό. Ως τυφλό δείγμα χρησιμοποιήθηκε ανεμβολίαστο, αποστειρωμένο γάλα, επεξεργασμένο υπό τις ίδιες συνθήκες. Η συγκέντρωση αμινοξέων εκφραζόταν ως mg γλυκίνης ανά gr δείγματος (ppm L-glycine) σύμφωνα με πρότυπη καμπύλη που κατασκευάστηκε με γνωστές συγκεντρώσεις γλυκίνης. Πραγματοποιήθηκαν 2 επαναλήψεις για κάθε δείγμα. Τέλος, μελετήθηκε η καζεϊνολυτική δραστηριότητα των στελεχών με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης με ουρία PAGE σύμφωνα με τον Andrews (1983). Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών γίνεται με τη βοήθεια της ουρίας και της γουανιδίνης, οι οποίες διασπούν τους δεσμούς υδρογόνου, μετουσιώνουν τις πρωτεΐνες και βοηθούν στη διαλυτοποίησή τους. Η δράση τους συμπληρώνεται και από τη 2- μερκαπτοαιθανόλη, η οποία διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς. Λαμβανόταν δείγμα 0,5 ml από εμβολιασμένη, αποστειρωμένη, αποβουτυρωμένη και ανασυσταμένη σκόνη γάλακτος όπως και για την μέθοδο o-pa την 1 η, 4 η και 7 η ημέρα επώασης στους 30 C. Ακολουθούσε προσθήκη στο δείγμα 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος STB (0,062 M Tris, 6 M Ουρία και 0,1 Μ 2-μερκαπτοαιθανόλη) και γινόταν πολύ καλή ανάδευση. Από το διάλυμα αυτό 1 ml μεταφερόταν σε σωλήνα eppendorf, όπου προστίθετο 20 μl χρωστικής κυανούν της βρωμοφαινόλης. 62

64 Παράλληλα με τα δείγματα, προετοιμάζονταν και τα τυφλά (ανεμβολίαστο αποστειρωμένο γάλα επεξεργασμένο υπό τις ίδιες συνθήκες) με τον ίδιο τρόπο. Την ημέρα της ανάλυσης, παρασκευαζόταν (παράρτημα 4.3.4) η πηκτή συσσώρευσης (Τ = 4%, Cbis = 5%) και η πηκτή διαχωρισμού (T = 9%, Cbis = 5%) και τα δείγματα υποβάλλονταν σε ηλεκτροφόρηση ουρίας-page σε κάθετη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2001, LKB, Bromma, Sweden) με πλάκες διαστάσεων 140x160x1,5 mm και ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής με την εξής σύνθεση: Tris 0,025 M, Γλυκίνη 0,193 Μ και ph = 8,3. Ο διαχωρισμός των προϊόντων πραγματοποιούνταν υπό σταθερή ένταση 60 ma ενώ η τάση αφηνόταν ελεύθερη μέχρι τη μέγιστη τιμή της 500mA, έτσι ώστε το μέτωπο να διανύσει απόσταση περίπου 10 cm από την επιφάνεια επαφής των δύο πηκτών. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, ακολουθούσε η χρώση των πηκτών με χρωστική Coomasie Blue G- 250 και ο αποχρωματισμός τους σε απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν με τη βοήθεια ενός οπτικού σαρωτή (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.6 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) Δοκιμή API ZYM Το ενζυμικό προφίλ των στελεχών μελετήθηκε με τη μέθοδο της ταχείας ανίχνευσης API ZYM (API Products, Biomerieux, Mercy I Etoile, France), που δίνει την δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού 19 ενζύμων. Το σύστημα αποτελείται από πλακέτα με 20 βοθρία στον πυθμένα των οποίων υπάρχει το αφυδατωμένο ενζυμικό υπόστρωμα αναφοράς (β-ναφθολοπαράγωγα). Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβάνονταν μία κρικιά και επιστρωνόταν σε πλάγιο MRS agar και επωάζονταν στους 30 C για 24 ώρες. Τη επόμενη μέρα τα κύτταρα συλλέγονταν σε 2 ml αποστειρωμένο και απεσταγμένο νερό, ώστε να δημιουργηθεί εναιώρημα κυττάρων θολερότητας 5 της κλίμακας MacFarland. Ποσότητα 65 μl εμβολιάζονταν σε κάθε βοθρίο και στη συνέχεια η πλακέτα κλεινόταν στις ειδικές πλαστικές θήκες, αφού πρώτα γεμίζονταν οι θήκες που υπήρχαν στη βάση τους με νερό, ώστε να διατηρείται η υγρασία σε υψηλά επίπεδα. Η προσθήκη του υδατικού εναιωρήματος του στελέχους ενυδατώνει το υπόστρωμα και ενεργοποιεί την αντίδραση. Ακολουθούσε επώαση στους 37 C για 4 ώρες. Στη συνέχεια προστίθετο από 1 σταγόνα από το αντιδραστήριο ZYM A (που περιέχει sodium lauryl sulfate) και 63

65 1 σταγόνα ZYM B (που περιέχει fast Blue BB) και μετά από 5 λεπτά σχηματιζόταν χρώμα χαρακτηριστικό για το κάθε ένζυμο, η ένταση του οποίου μετριόταν σύμφωνα με πρότυπη κλίμακα από 0 έως 5 του κατασκευαστή, όπου κάθε βαθμός αντιστοιχούσε σε ορισμένα nanomoles καθενός ενζύμου (το 1 σε 5 nmoles, το 2 σε 10 το 3 σε 20, το 4 σε 30 και το 5 σε 40 ή περισσότερα nmoles). Η δημιουργία του χρώματος οφείλεται στην ανίχνευση από τα αντιδραστήρια Α και Β της β-ναφθόλης, η οποία παράγεται από την υδρόλυση του ενζυμικού υποστρώματος. 4.4 Προβιοτικές ιδιότητες Αντοχή σε χαμηλό ph Η δοκιμή περιλαμβάνει την αντοχή σε MRS broth ρυθμισμένο με 37% HCl σε 4 διαφορετικές τιμές ph (6, 4, 3 και 2, η ρύθμιση του ph έγινε με 37% HCL). Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, εμβολιάζονταν (εμβόλιο 10% v/v) σε MRS broth με τις 4 διαφορετικές τιμές ph. Στη συνέχεια, λαμβανόταν δείγμα (1 ml) την 0 η, 1 η και 3 η ώρα παραμονής σε υδατόλουτρο στους 37 o C και αφού γίνονταν οι κατάλληλες αραιώσεις εμβολιάζονταν σε MRS agar. Ακολουθούσε επώαση στους 30 o C για 48 ώρες και καταμέτρηση των αποικιών (Clark et al., 1993, Ronka et al., 2003). Το ποσοστό επιβίωσης στην 1 η και 3 η ώρα υπολογίστηκε από τον λόγο του λογαρίθμου των κυττάρων που επιβίωσαν (cfu/ml) στην 1 η και 3 η ώρα, αντίστοιχα, προς τον λογάριθμο των αρχικών κυττάρων (cfu/ml) στην 0 ώρα επί 100 (Kumar Reddy et al., 2009). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε με δύο επαναλήψεις Αντοχή στα χολικά οξέα Η δοκιμή περιλαμβάνει την αντοχή σε MRS broth που περιέχει 0,3% χολικά οξέα (BBL oxgall, Becton Dickinson, U.S.A.). Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, εμβολιάζονταν (εμβόλιο 1% v/v) σε MRS broth με 0,3% χολικά οξέα.. Στη συνέχεια, λαμβανόταν δείγμα (1 ml) την 0 η και 4 η ώρα παραμονής (Gotcheva et al., 2002) σε υδατόλουτρο στους 37 o C και αφού γίνονταν οι κατάλληλες αραιώσεις εμβολιάζονταν σε MRS agar. Ακολουθούσε επώαση στους 30 o C για 48 ώρες και καταμέτρηση των αποικιών (Gilliland et al., 1984, Ronka et al., 2003). Το ποσοστό επιβίωσης στην 4 η ώρα υπολογίστηκε από τον λόγο του λογαρίθμου των κυττάρων που επιβίωσαν (cfu/ml) στην 4 η ώρα προς τον λογάριθμο των αρχικών 64

66 κυττάρων (cfu/ml) στην 0 ώρα επί 100 (Kumar Reddy et al., 2009). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε με δύο επαναλήψεις Αντοχή στο παγκρεατικό υγρό Η δοκιμή περιλαμβάνει την αντοχή σε MRS broth που περιέχει 0,5% (w/v) NaCl και 0,1% (w/v) pancreatin (Sigma-Aldrich, U.S.A.). Tο ph ρυθμίστηκε στο 8 με 0,1mol l -1 NaOH (Charteris et al., 1998). Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, εμβολιάζονταν (εμβόλιο 10% v/v) σε MRS broth με 0,5% NaCl και 0,1% pancreatin. Στη συνέχεια, λαμβανόταν δείγμα (1 ml) την 0 η και 3 η ώρα παραμονής σε υδατόλουτρο στους 37 o C και αφού γίνονταν οι κατάλληλες αραιώσεις εμβολιάζονταν σε MRS agar. Ακολουθούσε επώαση στους 30 o C για 48 ώρες και καταμέτρηση των αποικιών (Ronka et al., 2003). Το ποσοστό επιβίωσης στην 3 η ώρα υπολογίστηκε από τον λόγο του λογαρίθμου των κυττάρων που επιβίωσαν (cfu/ml) στην 3 η ώρα προς τον λογάριθμο των αρχικών κυττάρων (cfu/ml) στην 0 ώρα επί 100 (Kumar Reddy et al., 2009). Η δοκιμή πραγματοποιήθηκε με δύο επαναλήψεις Αντιβακτηριακή δράση Η μελέτη της αντιβακτηριακής δράσης των στελεχών βασίστηκε στην μέθοδο των Kekessy και Piquet (1970), κατά την οποία ανιχνεύονται βακτηριοσίνες. Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth στους 30 o C, εμβολιάζονταν σε ΜRS άγαρ με κρίκο και επωάζονταν στους 30 o C για 48 ώρες. Παράλληλα, κάθε ένα από τα στελέχη δείκτες αναπτύχθηκε στο κατάλληλο θρεπτικό ζωμό (2 ανακαλλιέργειες) και στο τέλος στο αντίστοιχο μαλακό άγαρ (πίνακας 4.1). Ύστερα από την επώαση, με τη βοήθεια μιας αποστειρωμένης σπάτουλας, γινόταν αναστροφή του άγαρ με την καλλιέργεια μέσα στο τρυβλίο. Μια νέα αποστειρωμένη επιφάνεια του άγαρ δημιουργούνταν, πάνω στην οποία επιστρωνόταν το εναιώρημα του μαλακού άγαρ με το στέλεχος δείκτη (λίγο πριν την επίστρωση εμβολιαζόταν 80 μl από την 2 η ανακαλλιέργεια του στελέχους δείκτη σε 5ml μαλακό άγαρ). Έπειτα από επώαση στους 30 o C για 48 ώρες, τα τρυβλία ελέγχθηκαν για την ύπαρξη ζωνών αναχαίτισης της ανάπτυξης του στελέχους δείκτη. Η εκτίμηση της αντιβακτηριακής δράσης προσδιοριζόταν με μέτρηση της διαμέτρου της ζώνης αναχαίτησης. 65

67 Πίνακας 4.1 Στελέχη δείκτες (παθογόνα και αλλοιωγόνα) με τα κατάλληλα υποστρώματα και θερμοκρασίες ανάπτυξης Στελέχη Δείκτες Υπόστρωμα Θερμοκρασία E. coli O:44 NCTC 9702 St. aureus NCTC 9751 Y. enterocolitica O: 9/4360 L. monocytogenes SCOT A B. cereus DSM 231 L. innocua BL 86/20 Lb. casei ATCC 344 Brain Heart broth/agar MRS broth/agar 37 o C Lb. reuteri DSM P. pentosaceus SFBB63 Ent. faecalis Ef1 Cl. tyrobutyricum NCDO 1754 Cl. sporogenes C22/10 Lb. helveticus ATCC MRS broth/agar 30 o C 37 o C Lc. lactis subsp. lactis LMG 6890 M17 broth/agar 30 o C Str. thermophilus ST 112 M17 broth/agar 37 o C C. albicans S. cerevisiue Sabouraoud broth/agar 25 o C D. hanseniu 66

68 4.4.5 Δοκιμή υδρόλυσης χολικών αλάτων Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβάνονταν μία κρικιά και επιστρωνόταν σε πλάγιο MRS agar και επωάζονταν στους 30 C για 24 ώρες. Τη επόμενη μέρα λαμβάνονταν μία κρικιά από το πλάγιο MRS agar και τοποθετείτο σε τρυβλίο με MRS agar + 5g/l sodium taurodesoxycholate. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 1 εβδομάδα. Σε θετική δοκιμή παρατηρείται θολή άλως γύρω από την αποικία, ένδειξη υδρόλυσης των χολικών αλάτων από τα στελέχη, ενώ σε αρνητική δοκιμή όχι (Cosson και Deschamps, 1994) Αντοχή σε αντιβιοτικά Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, επιστρωνόταν σε τρυβλίο με MRS agar με τη βοήθεια αποστειρωμένου swab. Αμέσως μετά τοποθετούνταν σε κάθε τρυβλίο μέχρι 4 δισκία με 4 διαφορετικά αντιβιοτικά (BBL Sensi-Disc, Beeton Dickinson and Company, U.S.A.), με αποστειρωμένη λαβίδα, έτσι ώστε να εμποτιστεί το κάθε δισκίο με το υπόστρωμα του στελέχους. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 48 ώρες και έπειτα καταγράφονταν τα στελέχη που εμφάνισαν διαυγή άλω, καθώς και η διάμετρος της άλου που μετριόταν (Bauer et al., 1966). Συνολικά εξετάστηκαν 13 αντιβιοτικά με τις εξής περιεκτικότητες ανά δισκίο: αμπικιλλίνη (10μg), βανκομυκίνη (30μg), γενταμυκίνη (10μg), ερυθρομυκίνη (15μg), καναμυκίνη (30μg), ναλιδιξικό οξύ (30μg), νεομυκίνη (30μg), νοβοβιοκίνη (5μg), πενικιλλίνη (10 IU/IE/UI), πολυμυξίνη B (300 IU/IE/UI), τετρακυκλίνη (30μg), φουσιδικό οξύ (10μg) και χλωραμφαινικόλη (30μg). 4.5 Δοκιμές παθογένειας Δοκιμή αιμόλυσης Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβανόταν μία κρικιά και τοποθετείτο σε τρυβλίο με Blood agar (Lazos Biolabs, Greece). Τα τρυβλία επωάζονταν στους 30 C για 5 ημέρες (Harrigan, 1998). Η δημιουργία διαυγούς ζώνης γύρω από τις αποικίες (πλήρη λύση των ερυθρών κυττάρων) δείχνει αιμολυτική αντίδραση τύπου β, η ύπαρξη πράσινης ζώνης αιμόλυση τύπου α και τύπου γ, όταν δεν παρατηρείται καμία αντίδραση (αρνητική δοκιμή). 67

69 4.5.2 Δοκιμή αναγωγής νιτρικών Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβανόταν 0,2ml και εμβολιάζονταν σε δοκιμαστικούς σωλήνες με Nitrate Peptone Water (παράρτημα 4.5.2). Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 3 ημέρες. Σε 1ml καλλιέργειας προστίθεται 1 σταγόνα α ναφθυλαμίνη (0,1g) με οξικό οξύ (10% 150ml) και 1 σταγόνα θειανυλικό οξύ (0,5g) με οξικό οξύ (10% 150ml) και ακολουθεί ανάδευση. Εμφάνιση ροζ χρώματος σημαίνει ότι η δοκιμή ήταν θετική. Αν δεν παρουσιαστεί ροζ χρώμα, ακολουθεί προσθήκη μικρής ποσότητας ψευδαργύρου και στη συνέχεια και πάλι ανάδευση. Αν εκεί που έχει πέσει ψευδάργυρος εμφανιστεί ροζ χρώμα, η δοκιμή είναι αρνητική. Αν το υλικό δεν αλλάξει χρώμα, τότε τα νιτρικά έχουν αναχθεί σε αέριο άζωτο και η δοκιμή λαμβάνεται ως θετική (Harrigan, 1998) Δοκιμή παραγωγής DNAσης Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, λαμβανόταν μία κρικιά και εμβολιαζόταν σε τρυβλίο με DNAse agar. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 24 ώρες και έπειτα προστίθετο λίγες σταγόνες 1Ν HCL, πάνω στην αποικία. Εμφάνιση διαυγούς ζώνης σήμαινε θετική δοκιμή, ενώ σε αντίθετη περίπτωση αρνητική (Jeffries et al., 1957) Δοκιμή υδρόλυσης ζελατίνης Τα στελέχη, αφού ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε ΜRS broth, εμβολιάζονταν (εμβόλιο 1%) σε δοκιμαστικούς σωλήνες με υπόστρωμα ζελατίνης. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C για 2 εβδομάδες. Μετά την επώαση έμεναν τα σωληνάκια στο ψυγείο για 30 λεπτά. Σε θετική δοκιμή το υπόστρωμα παρέμενε ρευστό, ενώ σε αρνητική δοκιμή έπηζε. 4.6 Στατιστική επεξεργασία Οι στατιστικά σημαντικές διαφορές (P<0,05) μεταξύ των απομονώσεων, ως προς τις τεχνολογικές και προβιοτικές ιδιότητες, καθορίστηκαν με την μέθοδο one way ANOVA. Οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν με το λογισμικό SPSS ver Το επίπεδο σημαντικότητας των ελέγχων προκαθορίστηκε σε α=0,05. 68

70 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 5.1 Tαυτοποίηση Ταυτοποίηση των απομονώσεων με βάση τις φαινοτυπικές ιδιότητες Τα αποτελέσματα των βασικών δοκιμών φαινοτυπικών ιδιοτήτων (ανάπτυξη στους 15 C και 45 C, ανάπτυξη σε 3,5%, 6,5%, 8% και 12% NaCl, παραγωγή CO 2 από γλυκόζη, αμμωνίας από αργινίνη, υδρόλυσης αισκουλίνης καθώς και της ζύμωσης σακχάρων) παρουσιάζονται στον πίνακα 5.1. Όλες οι απομονώσεις αναπτύσσονται στους 15 C και 45 C, σε NaCl από 3,5% - 8% (εκτός από ένα στέλεχος στο 8% NaCl) και υδρολύουν την αισκουλίνη, ενώ κανένα στέλεχος δεν παράγει CO 2 από γλυκόζη. Έξι απομονώσεις από φέτα και 3 από γραβιέρα παρήγαγαν ΝΗ 3 από αργινίνη. Σχετικά με την δοκιμή ζύμωσης σακχάρων, το σύνολο των στελεχών παρήγαγε οξύ από γλυκόζη, μανιτόλη και μανόζη, η ριβόζη δεν ζυμώθηκε από μία απομόνωση (ΚΗ17), η κελλοβιόζη από 3 απομονώσεις (Κ31, Κ32 και ΚΗ2) και η μελιβιόζη από 5 απομονώσεις (ΚΗ2, ΚΗ17, ΠΒ2.2, 682 και 716), ενώ κανένα δεν ζύμωσε την ραφφινόζη. Δύο στελέχη παρήγαν οξύ από την ραμνόζη (Ε35 και Ζ26). 69

71 Πίνακας 5.1 Φαινοτυπικά χαρακτηριστικά προαιρετικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων από τυριά Επιβίωση σε Οξύ από 15 C 45 C 3,5% NaCl 6,5% NaCl 8% NaCl 12% NaCl CO 2 από γλυκόζη ΝΗ 3 από αργινίνη υδρόλυση αισκουλίνης Κελλοβιόζη Γλυκόζη Μαννιτόλη Μαννόζη Μελιβιόζη Ραφφινόζη Ραμνόζη Ριβόζη Φέτα Β Γ Γ Ε Ε Ζ Θ Θ w Κ Κ Κασέρι ΚΗ ΚΗ ΠΗ ΠΒ w Γραβιέρα w w : θετική δοκιμή, -: αρνητική δοκιμή, w: ασθενώς θετική δοκιμή 70

72 5.1.2 Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο είδους με την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Οι ηλεκτροφορήσεις που λήφθηκαν από την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου από τις 19 απομονώσεις συγκρίθηκαν με το πρωτεϊνικό προφίλ των προτύπων στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των απομονώσεων με την βοήθεια του λογισμικού Gel Compar (εικόνα 5.1). Η επαναληψιμότητα ήταν πάνω από 80%. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της SDS-PAGE, οι λακτοβάκιλλοι ταξινομήθηκαν ξεκάθαρα, σε αντίθεση με τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Όλες οι απομονώσεις βρέθηκαν να ομαδοποιούνται σύμφωνα με δύο πρότυπα στελέχη, τον Lb. paracasei subsp. paracasei (r=0,70 12 απομονώσεις) και Lb. plantarum (r=0,76 7 απομονώσεις). Η ομάδα του Lb. paracasei subsp. paracasei περιλαμβάνει πέντε από τις δέκα απομονώσεις από την φέτα (Γ22, Ε35, Ζ26, Κ31, Κ32), τρεις από τις τέσσερις απομονώσεις απο το κασέρι (ΚΗ2, ΚΗ17, ΠΒ2.2) και τέσσερις από τις πέντε απομονώσεις από την γραβιέρα (507, 682, 716, 804). Η ομάδα του Lb. plantarum περιλαμβάνει τις υπόλοιπες 5/10 απομονώσεις από την φέτα (Β1, Γ16, Ε22, Θ27, Θ30), την 1/4 από το κασέρι (ΠΗ4) και την 1/5 από την γραβιέρα (631). 71

73 Pearson correlation [0.0%-100.0%] sds page new sds page new Lb. tolerans Lb. paraplantarum LMG E35 Z G K31 K KH2 KH PB Lb. paracasei NCDO H27 H30 B G PH4 E22 Lb. plantarum ATCC Lb. pentosus NCFB 363 Εικόνα 5.1 Δενδρόγραμμα απομονώσεων λακτοβακίλλων σύμφωνα με την SDS- PAGE Ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους με την RAPD-PCR Η τεχνική πολυμερισμού RAPD-PCR, η οποία αναπτύχθηκε από τους Cocconcelli et al. (1995) για την ταυτοποίηση λακτοβακίλλων, εντεροκόκκων και του S. thermophilus, καθώς και για την διαφοροποίηση στενά συγγενικά μεταξύ τους ειδών λακτοβακίλλων από τους Zapparolli et al. (1998), χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση υποχρεωτικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων, που απομονώθηκαν από 72

74 τρία διαφορετικά τυριά. Το DNA από τις 19 συνολικά απομονώσεις υποβλήθηκε στην διαδικασία πολυμερισμού με τη βοήθεια δύο εκκινητών (primers), του COC (Cocconcelli et al., 1995) και του M14 (Zapparroli et al., 1998). Το ποσοστό επαναληψιμότητας της μεθόδου, αλλά και των συνθηκών πολυμερισμού καθορίστηκε με την ανάλυση δύο ίδιων δειγμάτων DNA από μία απομόνωση που επιλέχθηκε τυχαία και ήταν 87%. Η ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων της RAPD-PCR, καθώς και το δενδρόγραμμα που προέκυψε, φαίνεται στην εικόνα 5.2. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων ομαδοποίησε τις απομονώσεις σε δύο διακριτές ομάδες (Ι, ΙΙ) με ποσοστό ομοιότητας 55,9% και 73,3% αντίστοιχα. Η ομαδοποίηση των στελεχών ήταν σχεδόν παρόμοια με τα αποτελέσματα της SDS- PAGE, πλην ενός στελέχους από την φέτα (Ε35). Πιο συγκεκριμένα, η ομάδα Ι αποτελείται από 11 απομονώσεις, οι οποίες ανήκουν στο είδος του Lb. paracasei subsp. paracasei, ενώ η ομάδα ΙΙ περιλαμβάνει 8 στελέχη, από τα οποία 7 ταυτοποιήθηκαν ως Lb. plantarum και ένα στέλεχος (Ε35) που ανήκει στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei. Καθώς το ποσοστό επαναληψιμότητας ήταν 87%, πρακτικά σημαίνει ότι όσες ομάδες σχηματίστηκαν με ποσοστό ομοιότητας μεγαλύτερο από 87%, οι απομονώσεις που τα απαρτίζουν ανήκουν στο ίδιο στέλεχος. Έτσι, διακρίνονται τρεις υποομάδες (α, β και γ), 2 για την ομάδα Ι και 1 για την ΙΙ. Στην υποομάδα α ανήκουν οι απομονώσεις ΚΗ2, ΚΗ17, ΠΒ2.2 από το κασέρι και 507, 716, 804 από την γραβιέρα, με ποσοστό ομοιότητας 89,1%, ενώ στην υποομάδα β ανήκουν τα στελέχη Κ31, Κ32 από την φέτα, γεγονός που σημαίνει ότι τα στελέχη της υποομάδας α, ανήκουν στο ίδιο στέλεχος του Lb. paracasei subsp. paracasei. Το ίδιο ισχύει και για την υποομάδα β. Στην υποομάδα γ ανήκουν οι απομονώσεις (Β1, Γ16, Ε22, Ε35, Θ27, Θ30 από την φέτα) με ποσοστό ομοιότητας 88,5%. 73

75 COC+M14 combination M14 COC Lb. paracasei subsp. tolerans NCFB 2742 Lb. plantarum ATCC KH2 Υποομάδα α KH17 PB Z26 Ομάδα I 55.9 G K31 K32 Υποομάδα β G16 E22 E35 B1 H27 H30 Υποομάδα γ Ομάδα II PH Lb. paracasei subsp. paracasei NCDO 1. Lb. pentosus NCFB 363 Lb. paraplantarum LMG Εικόνα 5.2 Δενδρόγραμμα απομονώσεων λακτοβακίλλων σύμφωνα με την RAPD- PCR 5.2 Τεχνολογικές ιδιότητες Ικανότητα οξινίσεως Το ΔpH του γάλακτος καθώς και οι τιμές του ph του γάλακτος μετά από 6, 16 και 24 ώρες επώασης των στελεχών παρουσιάζονται στον πίνακα 5.2. Οι τιμές του ph των 24 ωρών, καθώς και το ΔpH των 24 ωρών διέφεραν μεταξύ τους σημαντικά (P<0,05). Το αρχικό ph στο γάλα ήταν 6,6. Το ΔpH στις 6ώρες κυμαινόταν από 0,14 έως 0,20 μονάδες ph με το εύρος να αυξάνεται στις 0,22-0,64 μονάδες ph μετά από 16 ώρες. Σημαντικές διαφορές (P<0,05) μεταξύ των στελεχών παρατηρήθηκαν μόνο στις 24 ώρες, όπου όλα τα στελέχη, πλην του Ε35 από την φέτα και 507 και 804 από την γραβιέρα είχαν ΔpH 24 ωρών μικρότερο της μονάδας. To ph στις 24 ώρες κυμαινόταν από 5,25 έως 6,17. 74

76 Πίνακας 5.2 Αποτελέσματα ικανότητας οξίνισης στελεχών. Μέσος όρος δύο επαναλήψεων (x ± s.d.) ΔpH ph 6 h 16 h 24 h 6 h 24 h Φέτα Β1 0,17 ± 0,16 0,44 ± 0,26 0,81 ± 0,08 d-f 6,37 ± 0,11 5,72 ± 0,03 b-f Γ16 0,18 ± 0,15 0,45 ± 0,24 0,81 ± 0,08 d-f 6,39 ± 0,11 5,76 ± 0,04 c-g Γ22 0,18 ± 0,13 0,42 ± 0,17 0,84 ± 0,11 d-f 6,35 ± 0,08 5,69 ± 0,16 b-e Ε22 0,17 ± 0,13 0,40 ± 0,16 0,74 ± 0,06 de 6,37 ± 0,07 5,80 ± 0,13 c-g Ε35 0,17 ± 0,15 0,51 ± 0,16 1,08 ± 0,11 g 6,36 ± 0,08 5,45 ± 0,17 ab Ζ26 0,16 ± 0,16 0,42 ± 0,16 0,98 ± 0,08 fg 6,37 ± 0,08 5,54 ± 0,17 b-d Θ27 0,17 ± 0,13 0,39 ± 0,16 0,71 ± 0,06 c-e 6,37 ± 0,08 5,83 ± 0,11 d-h Θ30 0,17 ± 0,15 0,41 ± 0,18 0,76 ± 0,11 de 6,34 ± 0,06 5,74 ± 0,20 b-g Κ31 0,14 ± 0,15 0,22 ± 0,14 0,38 ± 0,02 a 6,41 ± 0,09 6,17 ± 0,04 i Κ32 0,14 ± 0,16 0,23 ± 0,17 0,38 ± 0,04 a 6,37 ± 0,13 6,13 ± 0,01 i Κασέρι ΚΗ2 0,16 ± 0,14 0,36 ± 0,16 0,82 ± 0,04 d-f 6,37 ± 0,07 5,71 ± 0,11 b-f ΚΗ17 0,19 ± 0,15 0,44 ± 0,18 0,90 ± 0,05 e-g 6,35 ± 0,11 5,63 ± 0,08 b-e ΠΗ4 0,15 ± 0,15 0,29 ± 0,16 0,51 ± 0,02 ab 6,39 ± 0,13 6,03 ± 0,01 g-i ΠΒ2.2 0,17 ± 0,16 0,30 ± 0,16 0,69 ± 0,13 b-d 6,36 ± 0,09 5,83 ± 0,20 d-h Γραβιέρα 507 0,20 ± 0,16 0,64 ± 0,25 1,26 ± 0,04 h 6,31 ± 0,08 5,25 ± 0,11 a 631 0,17 ± 0,11 0,40 ± 0,13 0,67 ± 0,18 b-d 6,39 ± 0,09 5,89 ± 0,20 e-i 682 0,16 ± 0,15 0,24 ± 0,14 0,36 ± 0,02 a 6,37 ± 0,10 6,17 ± 0,07 i 716 0,17 ± 0,15 0,28 ± 0,18 0,53 ± 0,03 a-c 6,36 ± 0,13 5,99 ± 0,01 f-i 804 0,19 ± 0,13 0,51 ± 0,15 1,04 ± 0,13 g 6,35 ± 0,07 5,50 ± 0,18 a-c Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P<0,05) 75

77 5.2.2 Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Τα στελέχη δεν σχηματίζουν εξωπολυσακχαρίτες Δοκιμή αφομοίωσης κιτρικών Κανένα από τα στελέχη δε ζύμωσε τα κιτρικά όταν αναπτύχθηκε σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιείχε πλάγιο Simmons Citrate agar Δοκιμή πρωτεολυτικής δράσης Το σύνολο των στελεχών έδωσε θετική την δοκιμή της πρωτεολυτικής δράσης σε τρυβλίο με PCA + 10% γάλα. Η ποσότητα των ελεύθερων αμινοξέων, εκφρασμένη σε ισοδύναμα L- γλυκίνης, που παρήχθηκε από τα στελέχη μετά από 1, 4 και 7 ημέρες παρουσιάζεται στον πίνακα 5.3. Οι διαφορές στις τιμές των ελεύθερων αμινοξέων μεταξύ των στελεχών ήταν στατιστικώς σημαντικές (P<0,05) την 4 η και 7 η μέρα μέτρησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, κανένα από τα στελέχη δεν σχημάτισε αμινοξέα μετά από επώαση στο γάλα την 1 η μέρα, ενώ μόλις 9 απομονώσεις (47,4% του συνόλου) παρήγαγαν ανιχνεύσιμες ποσότητες αμινοξέων μετά από επώαση στο γάλα για 4 ημέρες, εκ των οποίων οι 4 προέρχονταν από την γραβιέρα. Κατά την έβδομη μέρα της επώασης στο γάλα καταγράφεται αύξηση των ανιχνεύσιμων αμινοξέων στα 6 στελέχη και μείωση στα υπόλοιπα. Τονίζεται ότι το σύνολο των στελεχών που παρουσίασαν κάποια πρωτεολυτική δραστηριότητα άνηκαν αποκλειστικά στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei και προέρχονται και από τα τρία είδη τυριών (φέτα, γραβιέρα, κασέρι). Τέλος, αξίζει να σημειωθεί πως καταγράφηκε πρωτεολυτική δραστηριότητα μεγαλύτερη από 100 ppm ισοδύναμα L-γλυκίνης την 7 η μέρα για δύο απομονώσεις του Lb. paracasei subsp. paracasei (Ε35 από την φέτα και ΠΒ2.2 από το κασέρι). 76

78 Πίνακας 5.3 Αποτελέσματα δοκιμής o-pa. Ισοδύναμα ppm L-γλυκίνης (μέσος όρος δύο επαναλήψεων) 24 ωρών 4 ημερών 7 ημερών Φέτα Β1 0 0 a 0 a Γ a 0 a Γ a-b 1 a-b Ε a 0 a Ε d 167 d Ζ a-b 36 b Θ a 0 a Θ a 0 a Κ a 0 a Κ a 0 a Κασέρι ΚΗ2 0 0 a 0 a ΚΗ a-b 0 a ΠΗ4 0 0 a 0 a ΠΒ c 106 c Γραβιέρα c 96 c a 0 a b 37 b a-b 14 a-b c 88 c Οι τιμές στην ίδια στήλη με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P<0,05) 77

79 Τα αποτελέσματα της καζεϊνολυτικής δραστηριότητας, παρουσιάζονται στον πίνακα 5.4, ενώ στην εικόνα 5.3 παρουσιάζεται το καζεϊνικό προφίλ, όπως αυτό εμφανίζεται κατα την ηλεκτροφόρηση UREA-PAGE. Αξίζει να σημειωθεί ότι στις 4 απομονώσεις από το κασέρι (3 Lb. paracasei: ΚΗ2, ΚΗ17, ΠΒ2.2 και 1 Lb. plantarum: ΠΗ4) και σε 3 από τις 5 απομονώσεις από την γραβιέρα (Lb. paracasei: 682, 716, 804) παρουσιάστηκε, γενικά, μεγαλύτερη καζεϊνολυτική δραστηριότητα προς την β-καζεΐνη σε σχέση με τις απομονώσεις της φέτας, κατά την διάρκεια επώασης για 7 ημέρες στο γάλα, με το υψηλότερο ποσοστό μείωσης καζεϊνών να καταγράφεται από το στέλεχος 804 από την γραβιέρα. Σε δύο απομονώσεις, μία από την φέτα (Ζ26) και μία από την γραβιέρα (507), παρατηρήθηκε ιδιαίτερα αδύναμη καζεϊνολυτική δραστηριότητα, σε σχέση με τα υπόλοιπα στελέχη. Η πλειοψηφία των στελεχών υδρολύουν σε μεγαλύτερο ποσοστό την αs- από την β- καζεΐνη, με εξαίρεση το στέλεχος Κ31 από την φέτα, το οποίο φαίνεται να αποικοδομεί με ταχύτερο ρυθμό την β-καζεΐνη μέχρι την 4 η μέρα και το 507 από την γραβιέρα, το οποίο δείχνει ισχυρότερη πρωτεολυτική δραστηριότητα έναντι της β-καζεΐνης. Σε γενικές γραμμές, από την σύγκριση των μέσων όρων του ποσοστού μείωσης των καζεϊνών για κάθε τυρί προκύπτει ότι τα στελέχη που προέρχονται από το κασέρι εμφάνισαν την μεγαλύτερη καζεϊνολυτική δραστηριότητα την 7 η μέρα (56,58% για την αs- και 36,57% για την β- καζεΐνη), ακολουθούμενα από τα στελέχη της γραβιέρας (41,46% και 31,78% αντίστοιχα) και τέλος, την μικρότερη δραστηριότητα εμφάνισαν συνολικά, οι απομονώσεις της φέτας (32,46% και 19,42% αντίστοιχα). 78

80 β-καζεΐνη αs-καζεΐνη 1 η 4 η 7 η ημέρα επωάσεως Εικόνα 5.3 Πηκτή ηλεκτροφόρησης UREA-PAGE με την καζεϊνολυτική δράση προαιρετικά ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από τυριά, μετά από επώαση 1, 4 και 7 ημερών σε γάλα. 79