ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ. ΖΑΧΑΡΙΑΣ Ν. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΖΑΧΑΡΙΑΣ Ν. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Μελέτη της μικροχλωρίδας του παραδοσιακού τυριού Μελίχλωρο ή Μελίπαστο με ειδική αναφορά στα γαλακτικά βακτήρια που δεν προέρχονται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια (NSLAB Non Starter Lactic Acid Bacteria) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 2

3 ΖΑΧΑΡΙΑΣ Ν. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΑΟΥ Πτυχιούχος Γεωπόνος Μελέτη της μικροχλωρίδας του παραδοσιακού τυριού Μελίχλωρο ή Μελίπαστο με ειδική αναφορά στα γαλακτικά βακτήρια που δεν προέρχονται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια (NSLAB Non Starter Lactic Acid Bacteria) ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Εξεταστική Επιτροπή Ν. Τζανετάκης, Καθηγητής Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων, Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολής Γεωπονίας Α.Π.Θ. (επιβλέπων) Ε. Λιτοπούλου-Τζανετάκη, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων, Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολής Γεωπονίας, Α.Π.Θ., (μέλος τριμελούς εξεταστικής επιτροπής) Θ. Μοσχάκης, Λέκτορας, Τεχνολογίας Γάλακτος, Τομέας Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων, Σχολής Γεωπονίας, Α.Π.Θ., (μέλος τριμελούς εξεταστικής επιτροπής) 3

4 4

5 Μελέτη της μικροχλωρίδας του παραδοσιακού τυριού Μελίχλωρο ή Μελίπαστο με ειδική αναφορά στα γαλακτικά βακτήρια που δεν προέρχονται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια (NSLAB Non Starter Lactic Acid Bacteria) Υποβλήθηκε στη Γεωπονική Σχολή Τομέας: Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 29 Οκτωβρίου 2010 ΖΑΧΑΡΙΑΣ Ν. ΠΑΠΑΝΙΚΟΛΟΥ Α.Π.Θ «Η έγκριση της παρούσας Μεταπτυχιακής ιατριβής από τη Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν.5343/1932, άρθρο 202, παρ.2) 5

6 6

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή εκπονήθηκε στο εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων της Γεωπονική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης τη χρονική περίοδο Μαΐου Ιούνιου 2010 στα πλαίσια απονομής Μεταπτυχιακού Διπλώματος. Ολοκληρώνοντας τη συγγραφή της παρούσας διατριβής έχω την υποχρέωση να ευχαριστήσω θερμά τους ανθρώπους που συνέβαλαν στην εκπόνησή της. Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδίας τους καθηγητές μου, Νίκο Τζανετάκη και Ευανθια Λιτοπούλου-Τζανετάκη για την εμπιστοσύνη που μου δείξανε, για την καθοδήγηση, τις προτροπές και τις συμβουλές τους. Καθώς και για τις ευκαιρίες που μου δώσανε κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Ευχαριστώ θερμά τον αναπληρωτή καθηγητή του τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ. κ. Μηνά Γιάγκου, για το χρόνο, το ενδιαφέρον και την προθυμία που έδειξε για την διεκπεραίωση ενός μέρους της διατριβής. Ευχαριστώ πολύ τον κ. Θωμά Μοσχάκη λέκτορα του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ που δέχτηκε να αποτελέσει μέλος της εξεταστικής μου επιτροπής. 7

8 Ευχαριστώ, την Μάγδα Χατζηκαμάρη, μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την επιστημονική βοήθεια της όποτε την χρειάστηκα. Επίσης, ευχαριστώ την Ευγενία Χαριτωνίδου, μέλος ΕΕΔΙΠ του τομέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την προθυμία της, την αμέριστη βοήθεια της. Ευχαριστώ πολύ τους συμφοιτητές και συνεργάτες μου, Μποζούδη Δέσποινα, Παυλίδου Σοφία και Φλώρο Γεώργιο για τη βοήθειά τους, την καλή συνεργασία και την ευχάριστη παρέα τους. Δεν θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω τους γονείς μου και τους ανθρώπους που ήταν δίπλα μου και με στηρίξανε σε αυτή τη προσπάθεια. 20/10/2010, Παπανικολάου Ζαχαρίας 8

9 ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ 1. Παπανικολάου, Ζ., Μήττα, Κ., Λιτοπούλου-Τζανετάκη Ε. και Τζανετάκης Ν.(2010). Προβιοτικές ιδιότητες των NSLAB που απομονώθηκαν από το παραδοσιακό τυρί Μελίχλωρο ή Μελίπαστο Λήμνου, 6 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας. Αθήνα, Απρ Παπανικολάου, Ζ., Μήττα, Κ., Λιτοπούλου-Τζανετάκη, Ε. και Τζανετάκης Ν. (2010). Μικροβιακή χλωρίδα με ειδική αναφορά στα γαλακτικά βακτήρια του τυριού Μελίχλωρο Λήμνου, 25 ο Βορειοελλαδικό ιατρικό συνέδριο. Θεσσαλονίκη, Μαρτ Παπανικολάου Ζ., Φλώρος Γ., Γεωργακόπουλος Π., και Τζανετάκης Ν (2010). Ευαισθησία σε αντιβιοτικά λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από Ελληνικά παραδοσιακά τυριά, 23 ο Ιατρικό συνέδριο ενόπλων δυνάμεων. Θεσσαλονίκη, 4-7 Νοεμβρίου Παπανικολάου Ζ., Γιάγκου Μ., Λιτοπούλου-Τζανετάκη Ε. και Τζανετάκης Ν.(2010). Αφομοίωση χοληστερόλης από Lactobacillus που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου, 23 ο Ιατρικό συνέδριο ενόπλων δυνάμεων. Θεσσαλονίκη, 4-7 Νοεμβρίου

10 5. Papanikolaou Ζ., Litopoulou-Tzanetaki Ε.and Tzanetakis Ν. Probiotic characterictics of ΝSLAB which were isolated from the traditional cheese Melichloro Lemnos 1st International Conference on Advances Industrial Microbial Biotechnology (AIMB 2010) Thessaloniki, Greece, 2-5 November

11 «Μελέτη της μικροχλωρίδας του παραδοσιακού τυριού Μελίχλωρο ή Μελίπαστο με ειδική αναφορά στα γαλακτικά βακτήρια που δεν προέρχονται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια (NSLAB Non Starter Lactic Acid Bacteria)» Περίληψη Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται έντονο ενδιαφέρον για τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς από την επιστημονική κοινότητα λόγω των ισχυρισμών για ωφέλειες στην υγεία του ξενιστή. Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η μικροχλωρίδα του παραδοσιακού τυριού Μελίχλωρο ή Μελίπαστο και ιδιαίτερα τα γαλακτικά βακτήρια που δεν προέρχονται από την οξυγαλακτική καλλιέργεια. Συνολικά απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν πενήντα γαλακτικά βακτήρια. Η ταυτοποίηση των βακτηρίων έγινε με την SDS-PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου. Συνολικά ταυτοποιήθηκαν 47 εκ των 50 στελεχών και ομαδοποιήθηκαν σε δύο είδη, 29 στελέχη Lb. paraplantarum και 18 Lb. paracasei subs. paracasei. O χαρακτηρισμός των απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους έγινε με βάσει της γενοτυπικής μεθόδου RAPD-PCR. Επίσης, μελετήθηκε η ικανότητα οξίνισης, η πρωτεολυτική δραστηριότητα, η ενζυμική δραστηριότητα καθώς έγινε και διερεύνηση in vitro προβιοτικών ιδιοτήτων όπως η ανάπτυξη σε όξινο περιβάλλον (ph 2,5), σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων (oxgall 0,3%) καθώς και σε παγκρεατικό υγρό. Επίσης η ικανότητά τους να μειώνουν τα επίπεδα χοληστερόλης, η πιθανή αντιβακτηριακή τους δράση και η αντοχή τους σε επιλεγμένα 11

12 αντιβιοτικά. Μελετήθηκε επίσης το πλασμιδιακό προφίλ των στελεχών Lb. paraplantarum. Σύμφωνα με τη RAPD-PCR, σημειώθηκε μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των στελεχών, καθώς και ομαδοποίηση των απομονώσεων σύμφωνα με την πηγή προέλευσης (τυροκομείο). Οι τεχνολογικές ιδιότητες των στελεχών εμφάνισαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0,05), ενώ τα στελέχη εμφάνισαν ενδιαφέρουσες προβιοτικές ιδιότητες. Το 86% του συνόλου των στελεχών έδειξαν ανάπτυξη σε όξινο περιβάλλον (ph 2,5, ph 3) και το 90% σε παγκρεατικό υγρό, ενώ η ανάπτυξη των στελεχών σε περιβάλλον με χολικά άλατα 0,3% ήταν θετική για το σύνολο των στελεχών εκτός από το Γ10 Lb. paracasei subsp. paracasei. Επίσης στελέχη Lb.paraplanatrum έδειξαν να μειώνουν τα επίπεδα χοληστερόλης μέχρι 86,16%, ενώ στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei μέχρι 33,08%. Επίσης ανιχνεύθηκαν μεγάλος αριθμός πλασμιδίων στα στελέχη Lb. paraplantarum. Επιλεγμένες απομονώσεις θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως δευτερεύουσα καλλιέργεια εκκίνησης καθώς και αρκετά στελέχη θα μπορούσαν να χαρακτηριστούν ως υποψήφια προβιοτικά και να χρησιμοποιηθούν ως προβιοτικά που μειώνουν τα επίπεδα χοληστερόλης. 12

13 «Microbiological study of Melichloro or Melipasto,a traditional Greek cheese with especially reference to Non Starter Lactic Acid Bacteria (NSLAB)» Abstract In recent years there has been a great interest in probiotic microorganisms from the scientific community, because of claims for health benefits in the host. In this paper the microflora of traditional cheeses Melichloro or Melipasto and especially non starter lactic bacteria were studied. Fifty strains were isolated and identified. The identification of the bacteria was conducted done by SDS-PAGE of whole cell proteins. Fourty seven out of fifty strains were grouped into two species, Lb. paraplantarum (29 isolates) and Lb. paracasei subsp. paracasei (18 isolates). The characterization of the isolates at species level was based on the genotypic method of RAPD-PCR. The acidification ability, the proteolytic activity, and enzymatic activity,as well as in vitro probiotic characteristics, such as growth in an acidic environment (ph 2,5), in the presence of bile salts (oxgall 0,3%) and in pancreatic fluid were also studied. Their ability to reduce cholesterol levels, the antibacterial activity and their resistance to selected antibiotics were studied too, as well as the plasmid profiles of strains Lb. paraplantarum. According to RAPD-PCR, there was great variability between strains, as well as grouping of the isolations according to the source of isolates. 13

14 Technological characteristics of strains showed statistically significant differences (P < 0,05), while the strains showed interesting probiotic characteristics. 86% of the isolates grew at ph 2,5 and 90% of them at pancreatic fluid, while the growth of the strains in environments with bile salts 0.3% was positive for all the strains except for Γ10 Lb. paracasei subsp. paracasei. Also Lb.paraplanatrum strains seemed to decrease cholesterol levels by 86.16%, while Lb. paracasei subsp. paracasei strains up to 33.08%.Also, a large number of plasmids were detected in strains of Lb. paraplantarum. Selected isolations could be used as a secondary starter culture, as well as some strains could be classified as candidate probiotic and be used as probiotics to reduce cholesterol levels. 14

15 Συντμήσεις ADV ANOVA ADA APS bis ΕΜΡ GRAS LAB Lb. Lc. Leu. RAPD-PCR SDS-PAGE SDS TEMED T-RFLP α s -CN β-cn κ-cn NaCl NSLAB WHO Acid Degree Value Analysis of Variance American Dietetic Association Υπερθειϊκό αμμώνιο N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο Embeden-Meyerhof-Parnas (Γλυκόλυση) Generaly recognized as safe Lactic Acid Bacteria Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Randomly Amplified Polymorphic DNA PCR Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis Δωδεκυλοξυθειικό νάτριο Ν,Ν, Ν, Ν-τετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη Terminal restriction fragment length polymorphism α s -καζεΐνη β-καζεΐνη κ-καζεΐνη Χλωριούχο Νάτριο Non Starter Lactic Acid Bacteria World and Health Organization 15

16 16

17 Ευρετήριο πινάκων σελ. Πίνακας Προβιοτικοί μικροοργανισμοί (Holzapfel και συν. 1998).. 45 Πίνακας Μικροοργανισμοί με ευεργετικές προβιοτικές και διαιτητικές ιδιότητες στα ζυμούμενα γάλατα (Fonden και συν. 2000). 48 Πίνακας Προβιοτικά γαλακτοκομικά προϊόντα που κυκλοφορούν όλο τον κόσμο 49 (Granado 2010) Πίνακας Παραδείγματα μικροβιακής λοίμωξης και οι αντίστοιχες δράσεις των προβιοτικών.. 62 Πίνακας Ταξινόμηση των Γαλακτικών βακτηρίων σύμφωνα με τον Orla- Jensen (1919). 72 Πίνακας Επαναπροσδιορισμός των λακτοβακίλλων με βάση τα φυσιολογικά τους χαρακτηριστικά (Vandamme και συν. 1996).. 76 Πίνακας Φυλογενετικές ομάδες σύμφωνα με τους Hammes και Hertel (2003), Dellaglio και Felis (2005), Felis και Dellaglio (2007).. 83 Πίνακας Πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων

18 Πίνακας Βακτηριακές ομάδες που καταμετρήθηκαν, τα αντίστοιχα υποστρώματα και οι ανάλογες θερμοκρασίες και οι χρόνοι 99 επώασης... Πίνακας Ένζυμα και τα αντίστοιχα υποστρώματα της μεθόδου API- ZYM (API Products, Bio-Merieux, Mercy l Etoile, Γαλλία) Πίνακας Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g, x sd) α των δέκα βακτηριακών ομάδων που μελετήθηκαν σε ώριμο Μελίχλωρο Πίνακας Xημικές αναλύσεις (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) στα πέντε δείγματα ώριμου Μελίχλωρου Λήμνου Πίνακας Ταυτοποίηση των στελεχών με βάση φυσιολογικούς και βιοχημικούς χαρακτήρες σύμφωνα με τους Fitzsimons και συν. (1999) 154 Πίνακας Φυσιολογικοί και βιοχημικοί χαρακτήρες στελεχών που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Πίνακας Ταξινόμηση των απομονώσεων από Μελίχλωρο, σύμφωνα την SDS PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου

19 Πίνακας Αποτελέσματα προβιοτικών ιδιοτήτων των Lb. paraplantarum. 166 Πίνακας Αποτελέσματα προβιοτικών ιδιοτήτων των Lb. paracasei Πίνακας Αποτελέσματα επιβίωσης στελεχών που δεν έδειξαν ανάπτυξη σε ph 2,5, ph 3, bile 0,3%, 1% και σε παγκρεατικό υγρό. 167 Πίνακας Επιβίωση στελεχών λακτοβακίλλων σε ρυθμιστικό αλατούχο φωσφορικό διάλυμα ph 3,0 και 2,5 όπως προσδιορίζεται από τη μέτρηση αριθμού ζωντανών κυττάρων σε τρυβλία Πίνακας %Μείωση συγκέντρωσης χοληστερόλης από λακτοβακίλλους που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου μετά από 24ωρη και 48ωρη ανάπτυξη στους 37 C Πίνακας Αντοχή σε αντιβιοτικά στελεχών Lactobacillus paraplantarum που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Πίνακας Αντoχή σε αντιβιοτικά στελεχών Lactobacillus paraplantarum που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου

20 Πίνακας Αντιβακτηριακή δράση των Lactobacillus έναντι παθογόνων, αλλοιογόνων και γαλακτικών βακτηρίων Πίνακας Ικανότητα οξίνισης των πενήντα στελεχών Λακτοβακίλλων απομονωμένων από το τυρί Μελίχλωρο Λήμνου. 185 Πίνακας Πρωτεολυτική δραστηριότητα π (μέσος όρος ± S.D.) των 50 στελεχών γαλακτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Πίνακας Υδρόλυση της αs- και β-καζεΐνης των στελεχών Λακτοβακίλλων. O βαθμός της υδρόλυσης (% μείωση) υπολογίστηκε με τη βοήθεια της αναλογίας της έντασης των αντίστοιχων ζωνών στις 24 ώρες, 4 και 7 μέρες ως προς τις αρχικές Πίνακας Μέσος όρος ενζυμικής δραστηριότητας στελεχών Lb.paraplanatrum και Lb. paracasei subsp. paracasei με τη χρήση της μεθόδου API ZYM 198 Πίνακας Αποτελέσματα δοκιμών παθογένειας 210 Πίνακας Αποτελέσματα βιοχημικών δοκιμών

21 Ευρετήριο σχημάτων σελ. Σχήμα Φυσιολογικά και λειτουργικά οφέλη των προβιοτικών στον ανθρώπινο οργανισμό 47 Σχήμα Μοντέλο πάχους εντέρου (Vankerckhoven και συν. 2008) Σχήμα Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών (Klaenhammer και Kullen 1999, Gasser 1994, Donohue 1993, 55 Salminen 1996)... Σχήμα Oι τρεις κύριοι μηχανισμοί δράσεις των προβιοτικών Σχήμα Γενεαλογικό δέντρο τροποποιημένο από τους Schleifer και Ludwig, (1995), βασισμένο σε τεχνικές 16S rrna. Η γραμμή υποδεικνύει 10% αναμενόμενη 75 γραμμική απόκλιση (Stiles και Holzapfel1 997).. Σχήμα Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) οδός. 80 Σχήμα Φυλογενετικό δέντρο που βασίζονται στη 16S rrna γονιδιακή ανάλυση γαλληλουχίας και απεικονίζει τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των ειδών των γενώνlactobacillus, Pediococcus και 81 Paralactobacillus.. Σχήμα Εξέλιξη των SLAB (κενές στήλες) και NSLAB (μαύρες στήλες) κατά τη διάρκεια 87 της ωρίμανσης του τυριού.. 21

22 Σχήμα Πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις γλυκίνης εκφρασμένη σε ppm L-γλυκίνης... Σχήμα Μέθοδος διάχυσης δίσκων αντιβιοτικών σε άγαρ (Μέθοδος Kirby-Bauer, 1966). Σχήμα Χρωματικός χάρτης για ανάγνωση των αποτελεσμάτων των ενζυμικών αντιδράσεων (API Products, Bio-Merieux, Mercy l Etoile, Γαλλία). Σχήμα Μεταβολές στις λογαριθμικές τιμές (x ± SD) των βακτηριακών ομάδων του τυριού Μελίχλωρο Σχήμα ενδρόγραμμα των πρωτεϊνικών αποτυπωμάτων των λακτοβακίλλων, μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) του συνόλου του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των απομονώσεων από το Μελίχλωρο. Χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson correlation coefficient (r) και η ομαδοποίηση έγινε βάσει της μεθόδου UPGMA... Σχήμα ενδρόγραμμα των προϊόντων της RAPD- PCR των λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο, χρησιμοποιώντας δύο εκκινητές M14 και COC

23 Σχήμα Αποτελέσματα ευαισθησίας στελεχών λακτοβακίλλων σε αντιβιοτικά (πενικιλίνη, ερυθρομυκίνη, τετρακυκλίνη, χλωραμφενικόλη, αμπικιλίνη και νοβομπιοσίνη) που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου. Σχήμα Πρωτεολυτική δράση στελεχών Lactobacillus paraplantarum εκφρασμένη σε ισοδύναμα mmol L- Glyicine L-1.. Σχήμα Πρωτεολυτική δράση στελεχών Lactobacillus paracasei εκφρασμένη σε ισοδύναμα mmol L- Glyicine L -1.. Σχήμα ενδρόγραμμα 45 στελεχών λακτοβακίλλων σύμφωνα με την μέθοδο Aνάλυσης της Ομοιμορφίας των Ομάδων (cluster analysis), που εφαρμόσθηκε σε αποτελέσματα ενζυμικής δραστηριότητας (ΑPI ZYM). Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraxasei subs. paracasei με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: χυμοτρυψινη, όξινη φωσφατάση, β- φωσφουδρολάση, α-γαλακτοσιδάση, β- γαλακτοσιδάση, α-γλυκοσιδάση, β- γλυκοσιδάση, Ν-ακέτυλο-γλυκοζαμινάση

24 Σχήμα Σχήμα Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: αλκαλική φωσφατάση, λιπάση (C14), εστεράση (C4), εστεράση λιπάση (C8). Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: αμινοπεπτιδάση λευκίνης, αμινοπεπτιδάση βαλίνης, αμινοπεπτιδάση κυστίνης και όξινη φωσφατάση. Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: β-φωσφουδρολάση, α-γαλακτοσιδάση, β-γαλακτοσιδάση, α- γλυκοσιδάση

25 Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: β-γλυκοσιδάση, β- γλυκοζαμινάση, α-μαννοσιδάση, α- φουκοσιδάση... Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: β-γλυκοσιδάση, β- γλυκοζαμινάση, α-μαννοσιδάση, α- φουκοσιδάση Σχήμα Μέσος όρος ενζυμικής δραστηριότητας των Lb.paraplanatrum και Lb. paracasei subs. paracasei Σχήμα Πλασμιδιακά προφίλ των: 1) Hind ΙΙΙ, 2)B1, 3)B2, 4)B3, 5) 3, 6)Γ7, 7)Α1, 8)Α2, 9)Α3. Σχήμα Αποτελέσματα από την εφαρμογή της στατιστικής μεθόδου ανάλυσης σε κύριες συνιστώσες στις τεχνολογικές και προβιοτικές ιδιότητες των στελεχών

26 26

27 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ 1.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΡΙΣΜΟΙ-ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η ΑΓΟΡΑ ΤΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ 2.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΠΙΛΟΓΗΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Εισαγωγή Ασφάλεια προβιοτικών Αντοχή των γαλακτικών βακτηρίων στα αντιβιοτικα Μοντέλο του παχέους εντέρου ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΗ ΡΑΣΗ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ Εισαγωγή Αντιμετώπιση εντερικών λοιμώξεων και διαταραχών υσανεξία στη λακτόζη Υποχοληστεριναιμική δράση Αντιμετώπιση λοιμώξεων στο στομάχι ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΡΑΣΕΩΣ ΤΩΝ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΩΝ

28 3. ΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ 3.1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟ ΓΕΝΟΣ LACTOBACILLUS Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ LAB ΣΤΗΝ ΤΥΡΟΚΟΜΙΑ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΩΝ NSLAB ΣΤΗΝ ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΤΟΥ ΤΥΡΙΟΥ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΣ ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 5.1. ΠΗΓΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ ΓΑΛΑΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΚΑΙ ΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Μικροβιολογικές αναλύσεις Χημικές αναλύσεις Μέτρηση του ph των τυριών Προσδιορισμός της υγρασίας των τυριών Προσδιορισμός ΝaCl Προσδιορισμός λίπους Προσδιορισμός ολικού αζώτου Προσδιορισμός λιπόλυσης (ADV) Πρωτεολυτική δραστηριότητα

29 5.3. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΓΑΛΑΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΜΕ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ Απομόνωση και διατήρηση στελεχών Ταυτοποίηση των απομονώσεων με φυσιολογικές και βιοχημικές δοκιμές Χρώση Gram οκιμή παραγωγής καταλάσης οκιμή ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες οκιμή παραγωγής CO 2 από γλυκόζη οκιμή παραγωγής αμμωνίας από αργινίνη Υδρόλυση εσκουλίνης Έλεγχος ανάπτυξης σε 2%,4% και 6,5% NaCl Παραγωγή οξέος από ζάχαρα ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΕΩΝ ΜΕ SDS-PAGE ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΕΣΩΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΟΛΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣΕ ΕΠΙΠΕ Ο ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ ΜΕ ΤΗ RAPD-PCR ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΕΩΝ ΩΣ ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ ιερεύνηση προβιοτικών ιδιοτήτων Ανάπτυξη σε χαμηλό ph Αντοχή σε χαμηλό ph Ανάπτυξη σε χολικά άλατα Ανάπτυξη σε παγκρεατικό υγρό Υδρόλυση χολικών αλάτων In vitro μείωση των επιπέδων χοληστερόλης Αντοχή σε αντιβιοτικά Αντιβακτηριακή δραστηριότητα ιερεύνηση των τεχνολογικών ιδιοτήτων

30 Έλεγχος της παραγωγής οξέος σε γάλα Πρωτεολυτική δραστηριότητα Ενζυμικό σύστημα (ΑPI-ZYM) Έλεγχος πιθανής παθογόνου δράσης των στελεχών Έλεγχος τύπου αιμόλυσης οκιμή υδρόλυσης ζελατίνης οκιμή παραγωγής DNAάσης ιερεύνηση των βιοχημικών ιδιοτήτων Αφομοίωση κιτρικών Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Παραγωγή διακετυλίου ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ ΠΡΟΤΥΠΟΥ Απομόνωση πλασμιδιακού περιεχομένου Ηλεκτροφόρηση ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 6. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 6.1. ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΧΗΜΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΑ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΣΥΜΦΩΝΑ ΜΕ ΤΗΝ SDS-PAGE ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΟΛΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΕΩΝ ΣΕ ΕΠΙΠΕ Ο ΣΤΕΛΕΧΟΥΣ ΜΕ ΤΗΝ RAPD-PCR ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ

31 Ανάπτυξη σε όξινο περιβάλλον, σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων και σε παγκρεατικό υγρό Επιβίωση σε ph 2,5 και Μείωση των επιπέδων χοληστερόλης Αντοχή σε αντιβιοτικά ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ υνατότητα οξίνησης σε γάλα Πρωτεολυτική δραστηριότητα ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΛΑΣΜΙ ΙΑΚΟΥ ΠΡΟΦΙΛ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ Ι ΙΟΤΗΤΕΣ ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΙΘΑΝΗΣ ΠΑΘΟΓΟΝΟΥ ΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΜΕΘΟ ΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΕ ΚΥΡΙΕΣ ΣΥΝΙΣΤΩΣΕΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 7.1. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

32 32

33 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 33

34 1. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΑ ΤΡΟΦΙΜΑ 1.1 Εισαγωγή Ο πρωταρχικός ρόλος της διατροφής είναι να προσφέρει επαρκή θρεπτικά συστατικά και να καλύψει βασικές μεταβολικές ανάγκες, ενώ παράλληλα να δώσει στον καταναλωτή την αίσθηση της ικανοποίησης και της ευημερίας. Πρόσφατες έρευνες ωστόσο, υποστηρίζουν την υπόθεση ότι, πέρα των διατροφικών αναγκών, η διατροφή μπορεί να ρυθμίσει διάφορες φυσιολογικές λειτουργίες και να δώσει επιβλαβή ή ευεργετικά αποτελέσματα σε ορισμένες ασθένειες (Granato και συν. 2010, Koletzko και συν. 1998). Ιστορικά, η διατροφική κατάσταση των πληθυσμών πλήττετε κυρίως από υψηλή πρόσληψη σακχάρων, κορεσμένων και transλιπαρών οξέων, χαμηλή πρόσληψη διαιτητικών ινών, βιταμινών και βασικών μετάλλων. Αυτή η παγκόσμια επικρατούσα κατάσταση η οποία προέκυψε από τις κακιές συνήθειες των καταναλωτών είναι το κύριο πρόβλημα για τις μη μεταδιδόμενες χρόνιες εκφυλιστικές ασθένειες. Για την μείωση των κινδύνων των παραπάνω ασθενειών έχει προταθεί η ανάπτυξη νέων προϊόντων που περιέχουν βιολειτουργικά συστατικά (Roberfroid 2002). Ο όρος των λειτουργικών τροφίμων ορίστηκε αρχικά στην Ιαπωνία κατά τη διάρκεια της δεκαετίας του 1980 ως τρόφιμα για συγκεκριμένη χρήση για την υγεία [FOSHU (Foods for Specified Health Use)]. Το ενδιαφέρον για τα λειτουργικά τρόφιμα αυξήθηκε σημαντικά κατά τη δεκαετία του 1990 λόγω της μεγάλης ευαισθητοποίησης του πληθυσμού για θέματα υγείας. Οι καταναλωτές άρχισαν να βλέπουν τη διατροφή τους σαν ένα μέσο 34

35 όχι μόνο για να καλύψουν τις ανάγκες για θρεπτικά συστατικά αλλά και σαν μέσο για την πρόληψη από χρόνιες ασθένειες (Hasler 2000). Με την αύξηση του προσδόκιμου ζωής καθώς και τη εκθετική αύξηση των δαπανών για υγειονομική περίθαλψη η παγκόσμια κοινωνία χρειάζεται να εκμεταλλευτεί τις νέες προκλήσεις μέσω της ανάπτυξης νέων τεχνολογιών που οδηγούν σε σημαντικές τροποποιήσεις στη ζωή των ανθρώπων. Αυτή η τάση και η πρόοδος της επιστήμη των τροφίμων έχει σαν αποτέλεσμα τη βελτίωση της δομής και της σύνθεσης των προϊόντων διατροφής, δημιουργώντας τρόφιμα που παρέχουν χαρακτηριστικά πέρα των θρεπτικών ιδιοτήτων τους (Kwak και Jukes 2001, Behrens και συν. 2001). Η ιδέα για τρόφιμα με σκοπό την «προφύλαξη ή προστασία» της υγείας δεν είναι καινούργια. Από πολύ παλιά ο άνθρωπος έκανε προσπάθειες για πρόληψη ή θεραπεία ασθενειών με τη βοήθεια φυσιολογικά ενεργών συστατικών και τροφίμων. Τα λειτουργικά τρόφιμα περιέχουν ή εμπλουτίζονται με συστατικά που προέρχονται από φυσικά υλικά ή που έχουν τροποποιηθεί με τεχνολογικά ή βιοτεχνολογικά μέσα. Κάποια τέτοια τρόφιμα μπορεί να αποτελούν μέρος της καθημερινής διατροφής έχοντας θετική επίδραση σε ειδικές λειτουργίες του οργανισμού, για παράδειγμα στο πεπτικό σύστημα. Η θετική τους επίδραση στον οργανισμό οφείλεται σε βιολογικά ενεργά συστατικά, τα οποία έχουν ευεργετική δράση στην υγεία όπως την παρεμπόδιση ή/και τη θεραπεία ασθενειών (No-Seong Kwak και Jukes 1999). Τα τελευταία χρόνια αυξάνεται συνεχώς η αποδοχή και η αγοραστική τους δύναμη στις προηγμένες χώρες. Κατ' αυτόν τον 35

36 τρόπο ικανοποιούνται οι απαιτήσεις των καταναλωτών για νέα τρόφιμα που προάγουν την υγεία. Η επίδραση ορισμένων συστατικών στην υγεία έχει ήδη αποδειχθεί από ερευνητικές μελέτες. Τα κλασικά τροφοθεραπευτικά συστατικά των λειτουργικών τροφίμων είναι: οι βιταμίνες (A, C, Ε), τα αντιοξειδωτικά (λυκοπένιο), τα ιχνοστοιχεία μετάλλων, τα πολυακόρεστα λιπαρά, οι πρωτεΐνες, τα πεπτίδια, τα αμινοξέα και οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί (Dillard 2000) Ορισμοί-κατηγορίες λειτουργικών τροφίμων Λειτουργικά τρόφιμα είναι εκείνα που περιέχουν ένα ή περισσότερα συστατικά τα οποία βοηθούν στην ευεξία του οργανισμού και πιθανών μειώνουν των κινδύνων για αρτηριακή υπέρταση, διαβήτη, καρκίνο, οστεοπόρωση και καρδιαγγειακές ασθένειες (Arihara και συν. 2004). Αυτά τα τρόφιμα πιθανών να βοηθούν στην ευεξία του οργανισμού μέσω της βελτιστοποίησης των φυσιολογικών λειτουργιών του οργανισμού (Sanders 1998, Roberfroid 2000). Τα τρόφιμα αυτά γενικά περιέχουν ένα ή περισσότερα ευεργετικά συστατικά όπως πρεβιοτικές ενώσεις, προβιοτικούς μικροοργανισμούς, αντιοξειδωτικά, πολυφαινόλες και στερόλες, καροτενοειδή κ.α. (Shah 2001, Andlauer και Furst 2002, Granato και συν.2010α). Ωστόσο, σύμφωνα με τον παγκόσμιο αποδεκτό ορισμό: «λειτουργικά τρόφιμα, είναι τρόφιμα ή θρεπτικά συστατικά τα οποία δίδουν σημαντικές φυσιολογικές αλλαγές στον καταναλωτή και η δράση τους είναι ξεχωριστή και 36

37 διακριτή από τον ρόλο τους ως θρεπτικά συστατικά (FDA 2004)». Όλα τα τρόφιμα είναι λειτουργικά σε κάποιο φυσιολογικό επίπεδο, επειδή παρέχουν θρεπτικές ή άλλες ουσίες που δίνουν ενέργεια και διατηρούν την ανάπτυξη ή επιδιόρθωση των ζωτικών διεργασιών. Ωστόσο, τα λειτουργικά τρόφιμα πέρα αυτών των αναγκών παρέχουν πρόσθετα οφέλη στην υγεία που μπορούν να μειώσουν τον κίνδυνο ασθενειών και να βελτιώσουν την υγεία του καταναλωτή. Στα λειτουργικά τρόφιμα περιλαμβάνονται τα συμβατικά τρόφιμα, τα τροποποιημένα τρόφιμα (εμπλουτισμένα ή ενισχυμένα), τα ιατρικά τρόφιμα (medical foods) και τα τρόφιμα για ειδική διαιτητική χρήση (ADA 2009). Σύμφωνα με τους κανονισμούς του ADA (2009) υπάρχει κατηγοριοποίηση των λειτουργικών τροφίμων σύμφωνα με τις ιδιότητές του. Συμβατικά τρόφιμα, είναι αυτά τα οποία δεν έχουν υποστεί καμία τροποποίηση ή κάθε είδους επεξεργασία, όπως τα φρούτα και λαχανικά τα οποία αντιπροσωπεύουν την πιο απλή μορφή ενός λειτουργικού τροφίμου. Για παράδειγμα οι ντομάτες, το λάχανο, το μπρόκολο θεωρούνται λειτουργικά τρόφιμα, επειδή είναι πλούσια σε βιοενεργά συστατικά, όπως το λυκοπένιο και η λουτεΐνη. Τροποποιημένα τρόφιμα είναι αυτά τα οποία έχουν υποστεί κάποιου είδους επεξεργασία και εμπλουτίσθηκαν ή ενισχύθηκαν με κάποιο βιονεργό συστατικό. Όπως χυμός πορτοκαλιού εμπλουτισμένος με ασβέστιο, ψωμί εμπλουτισμένο με φυλλικό οξύ, μαργαρίνες που περιέχουν φυτοστανόλη ή εστέρες της στερόλης (για μείωση της υψηλής χοληστερόλης) και πολλά άλλα. 37

38 Τα ιατρικά τρόφιμα (medical foods) χρησιμοποιούνται στις Η.Π.Α. και είναι τρόφιμα με επιβεβαιωμένη κλινική δράση στη θεραπεία συγκεκριμένης ασθένειας, τα οποία χορηγούνται κατόπιν ιατρικής συνταγής. Παραδείγματα τέτοιων ιατρικών σκευασμάτων είναι συμπληρώματα διατροφής για διατροφική διαχείριση της φαινυλκετονουρίας, του διαβητική και των νεφρών. Τέλος, τα τρόφιμα για ειδικές διαιτητικές χρήσεις είναι τρόφιμα κατάλληλα για ειδική διατροφή. Παραδείγματα τέτοιων τροφίμων είναι οι παιδικές τροφές, υποαλλεργικά τρόφιμα, όπως τα τρόφιμα χωρίς γλουτένη και χωρίς λακτόζη καθώς και τρόφιμα που προσφέρονται για μείωση βάρους. Σύμφωνα με τους Hamilton-Miller και συν. (1999), η βιομηχανία τροφίμων πρέπει να ικανοποιήσει τα αιτήματα και τις επιθυμίες των καταναλωτών για την προώθηση και την παραγωγή λειτουργικών προβιοτικών προϊόντων. Οι Viana και συν. (2008) διεξήγαγαν μία εργασία στην οποία μελετούσαν την τάση και την γνώση που είχαν οι καταναλωτές απέναντι στα προβιοτικά τρόφιμα στην πόλη του Ρίο ντε Τζανέιρο της Βραζιλίας. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι οι καταναλωτές ήταν σε σύγχυση σε σχέση με τα προβιοτικά τρόφιμα και τα οφέλη που προκύπτουν από την κατανάλωσή τους. Ως εκ τούτου, ο κλάδος των τροφίμων θα πρέπει να επικεντρωθεί σε ένα στοιχειώδες και εύκολο εκπαιδευτικό πρόγραμμα, χρησιμοποιώντας κατανοητή γλώσσα για την αύξηση της ευαισθητοποίησης που σχετίζονται με αυτά τα προϊόντα και τα οφέλη υγείας που έχουν εάν καταναλωθούν μαζί με μια ισορροπημένη διατροφή. 38

39 1.3. Η αγορά των λειτουργικών τροφίμων Τα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι τα κυριότερα παραδείγματα λειτουργικών τροφίμων, η κατανάλωση των οποίων έχει αποδειχθεί ότι προάγει την υγεία και την ευεξία του ανθρώπου. Κάποιες από τις θετικές τους επιδράσεις στον ανθρώπινο οργανισμό είναι: η βελτίωση της πέψης της λακτόζης, ο έλεγχος παθογόνων μικροοργανισμών στο έντερο, η μείωση της χοληστερόλης, ο καθορισμός ανοσοποιητικού συστήματος, η παραγωγή βιταμινών Β, η θεραπεία δυσκοιλιότητας, η απενεργοποίηση τοξικών ουσιών. Σύμφωνα με την τάση που καταγράφεται στην αγορά, φαίνεται ότι τα λειτουργικά τρόφιμα συνιστούν ένα νέο τμήμα της αγοράς τροφίμων σε διεθνές επίπεδο και προβλέπεται ότι μελλοντικά θα αποτελέσουν ένα δυναμικό κλάδο. Μεγάλες εταιρίες τροφίμων, έχουν δημιουργήσει ολόκληρες βιομηχανικές μονάδες για την ανάπτυξη λειτουργικών τροφίμων και τροφοθεραπευτικών. Η Ιαπωνία είναι πρωτοπόρος στην αγορά των λειτουργικών τροφίμων, καθώς θεωρούνται κατάλληλα για υγιεινή διατροφή. Τα λειτουργικά τρόφιμα εκεί κατέχουν το 5% της αγοράς των επεξεργασμένων τροφίμων, και εκτιμάται ότι το ποσοστό αυτό θα αυξάνεται κατά 8,5% κάθε έτος. Υπάρχουν αρκετές εταιρίες που τα παράγουν. Το 70% περίπου της παραγωγής είναι ποτά, ενώ το υπόλοιπο είναι τρόφιμα: με ίνες 40%, ασβέστιο 20%, 39

40 ολιγοσακχαρίτες μικρής αλυσίδας-πρεβιοτικά 20%, βακτήρια γαλακτικού οξέος 10% και διάφορα άλλα 10%. (Goldberg και συν. 1999, Diplock και συν. 1999) Στην Ευρώπη οι καταναλωτές προτιμούν τρόφιμα φυσικής προέλευσης (γαλακτοκομικά προϊόντα με προβιοτικές καλλιέργειες) και γενικά υπάρχει αβεβαιότητα για τα επεξεργασμένα προϊόντα, γεγονός που έχει επίπτωση στην ανάπτυξη της αγοράς των λειτουργικών τροφίμων. Παράγονται κυρίως χυμοί φρούτων με ίνες, προϊόντα ζαχαροπλαστικής εμπλουτισμένα με βιταμίνες, μαργαρίνες χαμηλής χοληστερόλης, ζυμωμένα γαλακτοκομικά που περιέχουν προβιοτικές καλλιέργειες, τρόφιμα ενισχυμένα με θρεπτικά όπως ψωμί ενισχυμένο με φολικό οξύ. Στην ευρωπαϊκή ένωση γίνεται έρευνα για τη βελτίωση της υγείας και τη μείωση του κινδύνου από διάφορες ασθένειες, μέσω κατανάλωσης λειτουργικών τροφίμων, καθώς και για την ανάπτυξη της αντίστοιχης βιομηχανίας τροφίμων και ποτών. (Diplock και συν. 1999) Στις ΗΠΑ υπάρχει αυξημένο ενδιαφέρον για τα λειτουργικά τρόφιμα, τόσο από τους καταναλωτές, όσο και από τη βιομηχανία, αλλά ίσως η νομοθεσία αποτελεί εμπόδιο στην ανάπτυξη αυτών των προϊόντων. Ωστόσο, οι εταιρίες τροφίμων έχουν εισέλθει στην αγορά των λειτουργικών τροφίμων με κυριότερα είδη τα γαλακτοκομικά προϊόντα, τα ποτά με ασβέστιο και τα ενισχυμένα με αντιοξειδωτικά προϊόντα. Οι κυριότερες προϋπόθεσης που πρέπει να τηρούνται για την αγορά των λειτουργικών τροφίμων είναι η αξιόπιστη επιστημονική τεκμηρίωση για τα πλεονεκτήματα που προσφέρει στην υγεία και η ασφάλεια του κατά τη χρήση. Τρόφιμα, των οποίων η λειτουργικότητα και η ασφάλεία δεν αποδεικνύονται, δεν 40

41 γίνονται αποδεκτά από την επιστημονική κοινότητα και τις αρμόδιες αρχές (No-Seong Kwak και Jukes 1999). 41

42 2. ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΟΙ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΟΙ 2.1 Εισαγωγή Από την κατηγορία των λειτουργικών τροφίμων αυτή η οποία ξεχωρίζει τα τελευταία χρόνια και από την προβολή τους από τα μέσα αλλά και από το ενδιαφέρον που έδειξαν οι μελετητές είναι η κατηγορία των προβιοτικών προϊόντων (Lourens-Hattingh και Viljoen 2001). Ο τομέας της γαλακτοκομίας είναι αυτός ο οποίος συνδέεται πιο στενά με τα προβιοτικά τρόφιμα και καλύπτει σχεδόν το 33% της αγοράς των λειτουργικών τροφίμων σε αντίθεση με τα προϊόντα δημητριακών που μόλις καλύπτουν το 22% (Leatherhead Food International 2006). Επιπλέον, τα τελευταία χρόνια η κατά κεφαλήν κατανάλωση γιαουρτιού αυξήθηκε θεαματικά επειδή πολλοί καταναλωτές συνδέουν την κατανάλωση γιαουρτιού με θετικά αποτελέσματα στην υγεία (Hekmat και Reid 2006). Παρά το γεγονός ότι η έννοια των προβιοτικών εισήχθη στις αρχές της δεκαετίας 20ού αιώνα, ο όρος αυτός δεν είχε επινοηθεί μέχρι τη δεκαετία του Ο ορισμός του όρου έχει εξελιχθεί με τα χρόνια. Σύμφωνα με τους Fooks και συν. (1999), η λέξη προβιοτικό προέρχεται από δύο Ελληνικές λέξεις που σημαίνουν για τη ζωή. Ο όρος αυτός χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να περιγράψει τις μικροβιακές ουσίες που βελτίωναν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών (Lilley και Stillwell 1965), αλλά δεν έλαβε τη γενική αποδοχή των επιστημόνων. Ο Parker (1974) ήταν ο πρώτος που χρησιμοποίησε τη λέξη προβιοτικό σε μικροοργανισμούς και ουσίες που συνέβαλαν στην εξισορρόπηση της εντερικής χλωρίδας. Ο Fuller (1989) αργότερα όρισε τα προβιοτικά ως συμπληρώματα διατροφής που περιέχουν 42

43 ζωντανούς μικροοργανισμούς που επηρεάζουν την εξισορρόπηση της εντερικής χλωρίδας. Πολλοί άλλοι ορισμοί της έννοιας των προβιοτικών έχουν δημοσιευθεί αργότερα (Sanders 2003), ωστόσο, ο πιο ευρέως αποδεκτός ορισμός είναι ότι τα «προβιοτικά είναι ζωντανοί μικροοργανισμοί, που όταν καταναλωθούν σε κατάλληλες ποσότητες ασκούν ευεργετική δράση στο ξενιστή (FAO / WHO 2001)» Προβιοτικοί μικροοργανισμοί Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούνται ως προβιοτικοί ανήκουν στα βακτήρια και τις ζύμες. Η έμφαση στα γαλακτικά βακτήρια από πολλούς μελετητές αποδίδεται στο ότι αποτελούν σημαντικό μέρος της εντερικής μικροχλωρίδας. Παρά το γεγονός ότι πολλά γαλακτικά βακτήρια έχουν περιγραφεί ως προβιοτικά, σχετικά λίγα είναι τα στελέχη τα οποία ανταποκρίνονται στα πρότυπα της επιστημονικής κοινότητας και έχουν κλινικά αποδειχθεί. Πολλά γαλακτικά βακτήρια είναι πολύ ευαίσθητα στην έντονη οξύτητα και στην παρουσία των χολικών αλάτων στο ανθρώπινο γαστρεντερικό σωλήνα, έτσι ώστε να μην επιβιώνουν καθ 'οδών προς το έντερο (Hekmat και Reid 2006). Η πλειοψηφία των προβιοτικών προϊόντων που είναι διαθέσιμα στην αγορά περιέχουν είδη Lactobacillus και Bifidobacterium, που αποτελούν την κύρια γένη των Gram-θετικών βακτηρίων που έχουν χαρακτηριστεί ως προβιοτικά (FAO / WHO 2001). ιάφορα είδη προβιοτικών μικροοργανισμών έχουν χρησιμοποιηθεί στη βιομηχανία τροφίμων, όπως: Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. johnsonii, L. rhamnosus, L. thermophilus, L. reuteri, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum, Β. longum, Β. brevis, Β. Infantis, και B. 43

44 animalis (Knorr 1998). Στελέχη Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus και Streptococcus thermophilus έχουν βρεθεί σε πληθώρα γαλακτοκομικών προϊόντων όπως παραδοσιακά γιαούρτια, επιδόρπια κ.α. (Senok 2009). Σύμφωνα με τους Holzapfel και Schillinger (2002), άλλα γαλακτικά βακτήρια με προβιοτικές ιδιότητες είναι: Enterococcus faecalis, E. faecium, Sporolactobacillus inulinus, ενώ οι μικροοργανισμοί Propionibacterium freudenreichii και Saccharomyces cerevisiae δεν ανήκουν στα γαλακτικά βακτήρια αλλά σχετίζονται με προβιοτικές ιδιότητες και χρησιμοποιούνται ευρέως στη φαρμακοβιομηχανία και στα ζωικά προϊόντα. Είναι σημαντικό να τονισθεί ότι και άλλα βακτήρια έχουν μελετηθεί για πιθανές προβιοτικές ιδιότητες όπως ο Lactococcus lactis. cremoris, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, Lactococcus lactis ssp. lactis, Saccharomyces boulardii, και Pediococcus acidilactici. Όσο αφορά την ασφάλεια αυτών των μικροοργανισμών υπάρχουν ανησυχίες σχετικά με άλλα γένη εκτός των γαλακτικών, όπως η Escherichia και η Enterococci, τα οποία έχουν διατεθεί στην αγορά ως προβιοτικά (Eaton και Gasson 2001, Ishibashi και Yamazaki 2001, Senok και συν. 2005). 44

45 Πίνακας Προβιοτικοί μικροοργανισμοί (Holzapfel και συν. 1998) Είδη Lactobacillus Είδη Bifidobacterium Άλλα γαλακτικά βακτήρια Άλλοι μικροοργανισμοί L. acidophilus B. adolescentis Enterococcus faecalis 1 Bacillus cereus (toyoi) 1,2 L. amylovorus B. animalis Enterococcus faecium Escherichia colistrain Nissle 1917 L. brevis B. bifidum Lactococcus lactis4 L. casei B. breve Leuconstoc mesenteroides Propionibacterium freudenreichii 1,2 L. crispatus B. infantis Pediococcus acidilactici 4 L. delbrueckii subsp. bugaricus 4 B. lactis 3 Sporolactobacillus inulinus 1 Saccharomyces cerevisiae 2 L. gallinarum 1 B. longum Streptococcus thermophilus 4 L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus 1 Εφαρμογή σε ζώα, 2 Εφαρμογή κυρίως υπό μορφή σκευασμάτων 3 Β. Animalis, 4 περιορισμένη γνώση για προβιοτικές δράσεις Υπάρχει γενικότερα η ανησυχία ότι ορισμένα μη γαλακτοκομικά προϊόντα που περιέχουν Enterococcus μπορεί να αποτελέσουν σημαντική αιτία για ανθεκτικούς οργανισμούς σε αντιβιοτικά. Ωστόσο, τα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium είναι αυτά τα οποία παρουσιάζουν τα πιο ενδιαφέρουσα δεδομένα σχετικά με τους μηχανισμούς δράση τους και την αποτελεσματικότητά τους in vivo, in vitro, σε κλινικές μελέτες, και στις δοκιμές με αρουραίους (Reid 1999). Υπάρχουν κάποιες ιδιότητες των προβιοτικών στελεχών που επωφελούν την ανθρώπινη υγεία και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην βιομηχανία για την παραγωγή προβιοτικών προϊόντων. 45

46 Αυτές περιλαμβάνουν την αντοχή τους σε όξινο και με χολικά άλατα περιβάλλον, προσήλωση στα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου, αποικισμό στο ανθρώπινο έντερο, παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών, συμπεριλαμβανομένης και βακτηριοσινών καλά χαρακτηριστικά ανάπτυξης και ευεργετικά αποτελέσματα στην ανθρώπινη υγεία. Ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά ενός προβιοτικό στελέχους είναι ότι πρέπει να μην προκαλεί παθογένεια και να θεωρείται γενικά ως ασφαλείς (GRAS). Τα προβιοτικά στελέχη πρέπει επίσης να παρουσιάζουν κάποια επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως η διατήρηση της βιωσιμότητας τους κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας και την αποθήκευση, την ευκολία εφαρμογής τους στα προϊόντα, και την αντοχή τους στις φυσικοχημικές επεξεργασίες του τροφίμου (Prado και συν. 2008). Αυτά τα βακτήρια δεν θα πρέπει να είναι παθογόνα, τοξικά, μεταλλαξιογόνα, καρκινογόνα στον ξενιστή, αλλά πρέπει να είναι ανταγωνιστικά σε παθογόνους οργανισμούς και να είναι γενετικά σταθερά χωρίς να έχουν πλασμιδιακό μηχανισμό μεταφοράς, ειδικά όσον αφορά την αντοχή τους στα αντιβιοτικά, πρέπει να επιβιώσουν κατά τη διάρκεια της πέψης και να έχουν τη δυνατότητα να προσχωρήσουν και να αποικίσουν στο βλεννογόνο του εντέρου (Saarela και συν. 2000). 46

47 Βελτιώσει της απορρόφησης του Fe, Ca και Μείωση χοληστερόλης Παραγωγή Βιταμίνης Β Ανοσοδιέγερση ΠΡΟΒΙΟΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Αύξηση της βιοδιαθεσιμότητας των θρεπτικών συστατικών Αύξηση της ανοχής στη λακτόζη Μείωση των εντερικών παθογόνων Θεραπεία της διάρροιας Σχήμα Φυσιολογικά και λειτουργικά οφέλη των προβιοτικών στον ανθρώπινο οργανισμό. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι τα εν λόγω βακτήρια πρέπει να βρίσκονται σε γαλακτοκομικά τρόφιμα στο ελάχιστο επίπεδο των 10 7 cfu / g ή η ημερήσια πρόσληψη θα πρέπει να είναι περίπου 10 8 CFU/g, με στόχο να αντισταθμίσουν την ενδεχόμενη μείωση τους κατά τη διέλευση μέσω του εντέρου (Shah 2007). 47

48 Πίνακας Μικροοργανισμοί με ευεργετικές προβιοτικές και διαιτητικές ιδιότητες στα ζυμούμενα γάλατα (Fonden και συν. 2000). Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum Bifidobacterium animalis (Bifidobacterium lactis) Enterococcus faecium Lactobacillus acidophilus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus paracasei Lactobacillus plantarum Lactobacillus reuteri Lactobacillus rhamnosus Pediococcus adicilactice Propionibacterium freudenreichii 48

49 Πίνακας Προβιοτικά γαλακτοκομικά προϊόντα που κυκλοφορούν σε όλο τον κόσμο (Granado 2010). Γαλακτοκομικά προϊόντα Αναφορές Acidophilus milk drink Itsaranuwat και συν. (2003) Synbiotic acidophilus milk Amiri και συν. (2008) Regular full-fat yogurts Aryana και Mcgrew (2007) Low-fat yogurts Penna και συν. (2007) Acidophilus sweet drink Speck (1978) Stirred fruit yogurts Kailasapathy και συν. (2008) Dairy fermented beverage Almeida και συν. (2000) Whey-protein-based drinks Lucas και συν. (2004); Dalev και συν.(2006) Biogarde, mil-mil, and acidophilus milk with yeasts Gomes και Malcata (1999) Cheddar cheese Ong και Shah (2009) Minas fresco cheese Souza και Saad (2009) Feta cheese Kailasapathy και Masondole, 2005 Cheese from caprine milk Kalavrouzioti και συν. (2005) Kazar cheese Ozer και συν.(2008) Semi-hard reduced-fat cheese Thage και συν. (2005) White-brined cheese Yilmaztekin και συν.(2004) Cottage cheese Blanchette και συν. (1996) Canestrato pugliese hard cheese Corbo και συν. (2001) Argentine fresco cheese Vinderola και συν. (2000b) Goat semi-solid cheese Gomes και Malcata (1999) Petit-Suisse cheese supplemented with inulin and/or oligofructose Cardarelli και συν. (2008) Crescenza cheese Gobbetti και συν. (1997) Manufacture of Turkish Beyaz cheese Kilic και συν. (2009) Synbiotic ice cream Homayouni και συν.(2008) Kailasapathy και Sultana (2003), Akin και συν. Probiotic ice cream (2007) Haynes και Playne (2002), Akalin και Erisir Low-fat ice cream (2008) Acidophilus milk-based ice cream Andrighetto και Gomes (2003) Dahi Yaday και συν.(2007) Nonfermented goat s milk beverage Neves (2000) Fermented goat s milk Mart ın-diana και συν. (2003) Acidophilus butter and progurt Gomes και Malcata (1999) Peanut milk yogurt Isanga και Zhang (2009) Frozen yogurt Davidson και συν. (2000) Mango soy fortified probiotic yogurt Kaur και συν. (2009) Fermented lactic beverages supplemented with oligofructose and cheese whey Castro και συν. (2009) Traditional Greek yogurt Maragkoudakisa και συν Corn milk yogurt Supavititpatana και συν Banana-based yogurt Sousa και συν. (2007) High pressure-homogenized probiotic fermented milk Patrignani και συν. (2009) Graviola and cupuassu-based yogurts Silveira και συν. (2007) Frozen synbiotic dessert Saad και συν. (2008a) Guava-based mousse Saad και συν. (2007) Coconut flan Saad και συν. (2008b) Acai yogurt Almeida και συν. (2008) 49

50 2.3. Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών Εισαγωγή Τα προβιοτικά βακτήρια δεν αποικίζουν μόνιμα στο γαστρεντερικό σωλήνα επομένως είναι αναγκαία η τακτική πρόσληψή τους προκειμένου να ασκήσουν τις ευεργετικές τους δράσεις. Θα πρέπει να έχουν την ικανότητα να επιβιώνουν και να διατηρούν την δραστικότητά τους τόσο κατά την συντήρηση και επεξεργασία του προϊόντος όσο και κατά τη δίοδό τους από τον πεπτικό σωλήνα, όπου υπάρχουν ιδιαίτερα αντίξοες συνθήκες (όξινο ph στο στομάχι, υδρολυτικά ένζυμα και χολικά άλατα στο λεπτό έντερο). Για τους παραπάνω λόγους, είναι απαραίτητο τα προβιοτικά προϊόντα να έχουν μία ελάχιστη συγκέντρωση προβιοτικών κυττάρων της τάξεως κύτταρα/ml (Vinderola και Reinheimer 2000, Kurmann και Rasic 1991, Tamime και συν. 1995, Rybka και Kailasapathy 1995). Στο σχήμα παρουσιάζονται τα βασικά κριτήρια για την επιλογή των προβιοτικών μικροοργανισμών Ασφάλεια προβιοτικών Τα πιο συχνά απατώμενα στελέχη με προβιοτικές ιδιότητες όπως έχει είδη προαναφερθεί ανήκουν στα γένη Lactobacillus και Bifidobacterium, αλλά και από τα γένη Lactococcus και Enterococcus μερικά στελέχη έχουν αποδειχθεί να έχουν προβιοτικές ιδιότητες (Mercenier 2003, Pavan και Pot 2003). Η μεγάλη πλειοψηφία των στελεχών από το γένος Lactobacillus έχουν χαρακτηρισθεί ως GRAS (Borriello και συν. 2003). Παρ' όλα 50

51 αυτά, κατά καιρούς η ασφάλεια τους αμφισβητείτε, ειδικότερα σε ορισμένα στελέχη εντερόκοκκων τα οποία βρίσκονται στη δεύτερη από τις τρεις θέσεις τον πιο συχνών νοσοκομειακών λοιμώξεων. Έχουν απομονωθεί από βακτηραιμία, από λοιμώξεις ενδοκαρδίτιδας, από τραύματα ιστών και άλλων λοιμωδών νόσων (Kayser 2003, Koch και συν. 2004, Koch και συν. 2005). Σε αντίθεση με στελέχη Lactobacillus που σπάνια έχουν ανιχνευθεί σε περιπτώσεις λοιμώξεων αλλά έχουν βρεθεί σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (Cannon και συν. 2005, Husni και συν. 1997, Salminen και συν. 2006). Επιπλέον, είναι γνωστό ότι υπάρχει ο κίνδυνος μεταφοράς γνωρισμάτων όπως η μικροβιακή αντοχή καθώς και η αντοχή σε αντιβιοτικά, στην αύτοχθονη μικροχλωρίδα του εντέρου (Danielsen και Wind 2003, Teuber και συν. 1999). Πολλοί ερευνητές έχουν δημοσιεύσει εργασίες και έχουν κάνει συστάσεις για θέματα όπως η μεταβίβαση της ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά που θα πρέπει να αντιμετωπιστεί για να θεωρηθεί ένα προβιοτικό ασφαλές (AFSSA 2003, Agostoni και συν. 2004, BgVV 1999, EC 2003, FAO και WHO 2001, 2002). Στην Ευρώπη, η EFSA έχει προτείνει ένα πρότυπο για την αξιολόγηση της ασφάλειας των μικροοργανισμών στη τροφική αλυσίδα, παρόμοιο με εκείνο των γενικώς αναγνώρισαν ως ασφαλείς (GRAS). Σύμφωνα με τους Salminen και συν. (1998c) τα κριτήρια για να θεωρηθεί ένας προβιοτικός μικροοργανισμός ασφαλές είναι τα εξής: προϊόντα που περιέχουν στελέχη με μακρύ ιστορικό ασφαλούς χρήσης ή προέρχονται από είδος με μακρύ 51

52 ιστορικό ασφάλειας, από το οποίο σχεδόν δεν υπάρχουν κλινικές απομονώσεις, θεωρούνται ασφαλή. προϊόντα που περιέχουν στελέχη που προέρχονται από είδος με περιορισμένο ιστορικό ασφάλειας ή με διαπιστωμένες κλινικές απομονώσεις, θεωρούνται νεοφανή και πρέπει να υπόκεινται στη σχετική διαδικασία έγκρισης που προβλέπεται από την Ε.Ε Αντοχή των γαλακτικών βακτηρίων στα αντιβιοτικα Όπως έχει αναφερθεί ένα από τα χαρακτηριστικά των λακτοβακίλλων είναι και η αντοχή τους στα αντιβιοτικά ένα τέτοιο γνώρισμα δεν είναι επιθυμητό όμως για τους πιθανούς προβιοτικούς μικροοργανισμούς διότι πιθανόν είναι μεταβιβάσιμο στην αυτόχθονη μικροχλωρίδα του εντέρου. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία οι Εντερόκοκκοι είναι ανθεκτικοί στη κεφαλοσπορίνη και σε χαμηλό επίπεδο στη γλυκοσίδάση και κλινδαμυκίνη (Teuber και συν. 1999, Knudtson και Hartman 1993). Οι λακτοβάκιλλοι, οι πεδιόκοκκοι και τα Leuconostoc έχουν αναφερθεί ότι παρουσιάζουν υψηλή φυσική ανθεκτικότητα στη βανκομυκίνη, μια ιδιότητα που είναι χρήσιμη στη διάκρισή τους από τα άλλα Gram-θετικά βακτήρια (Hamilton- Miller και Shah 1998, Simpson και συν. 1988). Ορισμένοι λακτοβάκιλλοι έχουν υψηλή φυσική αντοχή στη βασιτρασίνη, κεφοξιτίνη, σιπροφλοξασίνη, φουσιδικό οξύ, καναμυκίνη, γενταμυκίνη, μετρονιδαζόλη, νορφλοξασίνη, στρεπτομυκίνη, και βανκομυκίνη (Danielsen και Wind, 2003). Σε μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε από τους Temmerman και συν. (2002), σε σύνολο 55 προβιοτικών προϊόντων αξιολογήθηκαν τα αντιβιοτικά που ανακτώνται από 52

53 αυτά τα προϊόντα με τη μέθοδο της διάχυσης δίσκου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στο σύνολο των 187 στελεχών, το 79% έδειξε αντοχή στη καναμυκίνη, το 65% στη βανκομυκίνη, το 26% στη τετρακυκλίνη, το 23% στη πενικιλλίνη G, 16% στη ερυθρομυκίνη (16%) και το 11% στη χλωραμφενικόλη. Συνολικά 68,4% των προβιοτικών στελεχών έδειξε αντίσταση σε πάνω από ένα αντιβιοτικό. Ο πιο πιθανός δρόμος μεταφοράς της αντοχής των αντιβιοτικών από τα LAB είναι μέσω τον γονιδίων που βρίσκονται στο πλασμιδιακό DNA. Τα πλασμίδια των LAB, είναι διαφόρων μεγεθών και λειτουργιών (Davidson και συν. 1996, Wang και Lee 1997). Γενικότερα οι ιδιότητες οι οποίες ευθύνονται τα γονίδια των πλασμιδίων είναι οι εξής: υδρόλυση των πρωτεϊνών, μεταβολισμό των υδατανθράκων και των αμινοξέων παραγωγή των βακτηριοσινών και εξωπολυσακχαριτών και η αντίσταση στα αντιβιοτικά. Τουλάχιστον 25 είδη γαλακτοβάκιλλων περιέχουν από την φύση τους πλασμίδια (Wang και Lee, 1997), και συχνά φαίνεται να περιέχουν πολλά (από 1 έως 16) και διαφορετικά. Ωστόσο, η αντοχή των γαλακτικών βακτηρίων στα αντιβιοτικά σπάνια είναι πλασμιδιακά ελεγχόμενη και άρα εύκολα μεταβιβάσιμη ιδιότητα (Tynkkynen και συν. 1998) Μοντέλο του παχέους εντέρου Το μοντέλο του παχέους εντέρου είναι ένα ελεγχόμενο υπολογιστικό δυναμικό μοντέλο, το οποίο μιμείται τη φυσιολογία του παχέους εντέρου του ανθρώπου (Σχήμα ) (Minekus και συν. 1999). Το μοντέλο βρέθηκε να είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για τις προβιοτικές μελέτες όσο αφορά την επιβίωση (R. Wind, αδημοσίευτα στοιχεία). Μελέτες έδειξαν ότι υπήρχαν σημαντικές 53

54 διαφορές στην επιβίωση των προβιοτικών στελεχών του είδους L. rhamnosus σε σύγκριση με την κλινική απομόνωση του ίδιου είδους, αλλά δεν έχει προσδιοριστεί ακόμα ο λόγος για αυτό. Το μοντέλο αυτό είναι χρήσιμο για έρευνα όσο αφορά την μεταφορά του γνωρίσματος της αντιστάσεις στα αντιβιοτικά των πιθανών προβιοτικών μικροοργανισμών. Σχήμα Μοντέλο παχέος εντέρου (Vankerckhoven και συν. 2008). 54

55 Ασφάλεια του στελέχους Γενική αποδοχή Χαρακτηρισμός στελέχους Βιωσιμότητα στο προϊόν, προσκόλληση Σταθερότητα και ασφάλεια Αντίσταση σε όξινο χαμηλό ph, χολικά άλατα, γαστρικό υγρό, παγκρεατικό υγρό/ επιβίωση in vivo Προσκόλληση στα επιθηλιακά κύτταρα/ ιστούς Αντιμικροβιακή δράση / ανταγωνισμός με τα παθογόνα Λειτουργικές και φυσιολογικές ιδιότητες Διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος Επιλεκτική διέγερση των ωφέλιμων βακτηρίων και καταστολή των επιβλαβών Κλινικές μελέτες σε εθελοντές/ ασθενείς Σχήμα Κριτήρια επιλογής προβιοτικών μικροοργανισμών (Klaenhammer και Kullen 1999, Gasser 1994, Donohue 1993, Salminen 1996) 55

56 2.4. Φυσιολογική δράση προβιοτικών Εισαγωγή Όσο αφορά τη μικροβιακή χλωρίδα σ ένα ενήλικο άτομο, υπάρχουν τεράστιες διαφορές στον αριθμό και στη σύνθεση της μεταξύ στομάχου λεπτού και παχέος εντέρου (Gibson και συν. 1999). Το έντερο ενός ενήλικου ατόμου αντιπροσωπεύει ένα πολύπλοκο οικοσύστημα το οποίο περιλαμβάνει το εντερικό βλεννογόνο και πάνω από 400 είδη βακτηριδίων τα οποία είναι ανεξάρτητα μεταξύ τους. Στον άνθρωπο η εντερική χλωρίδα τυπικά περιέχει δέκα φορές περισσότερα κύτταρα απ ότι το σύνολο των κυττάρων στο ανθρώπινο σώμα (10 14 έναντι ). Τα εντερικά αυτά βακτηρίδια επιτελούν πολλές λειτουργίες μέσα σε αυτή τη κατηγορία συμπεριλαμβάνονται και οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί. Η απόδειξη ότι η μικροβιακή χλωρίδα του εντέρου είναι ένας σπουδαίος παράγοντας που προάγει τον εντερικό αμυντικό φραγμό, έχει εγείρει τόσο το επιστημονικό όσο και το εμπορικό ενδιαφέρον για τη θεραπευτική χρησιμοποίηση των προβιοτικών. Κατά την τελευταία δεκαετία το ενδιαφέρον για τους προβιοτικούς μικροοργανισμούς έχει αυξηθεί. Πλήθος εργασιών έχουν δημοσιευτεί και αποδεικνύουν την δυνατότητα χρήσης των προβιοτικών ως θεραπευτικό μέσο για την αντιμετώπιση γαστρεντερικών νοσημάτων και όχι μόνο. 56

57 Αντιμετώπιση εντερικών λοιμώξεων και διαταραχών Πολλοί ερευνητές αναφέρουν ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου βρίσκεται συνεχώς σε μία παθολογική κατάσταση όπως η δυσανεξία στη λακτόζη, χρόνιες παθήσεις όπως η νόσος του Crohn, η ελκώδης κολίτιδα, οξεία γαστρεντερίτιδα και ο καρκίνος του παχέος εντέρου (Gibson και Roberfroid 1999). Κατά κύριο λόγο, οι ασθένειες αυτές θεωρούνται ότι προκύπτουν από την έλλειψη μικροβιακής ισορροπίας του παχέος εντέρου. Αυτός θα λέγαμε ότι είναι ο λόγος της σημασίας της μικροβιακής θεραπείας, δηλαδή της χρήσης των προβιοτικών, ως μέσο ελέγχου των λοιμώξεων. Σε πλήθος κλινικών μελετών έχουν χρησιμοποιηθεί προβιοτικά προϊόντα ως διαιτητικά συμπληρώματα για την πρόληψη και τη θεραπεία γαστρεντερικών λοιμώξεις, όπως παιδική διάρροια, διάρροια των ταξιδιωτών, διάρροια που σχετίζεται με αντιβιοτικά (AAD) και τροφογενή διάρροια. Βρεφική διάρροια: Ο ρετροϊός (rotavirus) είναι ο κύριος ιός που αποτέλεσε αντικείμενο μελέτης σε πολλές εργασίες με προβιοτικά. Ο ιός προκαλεί γαστρεντερίτιδα η οποία χαρακτηρίζεται από έντονη διάρροια και εμετό. Η γαστρεντερίτιδα αποτελεί την κύρια αιτία θανάτου σε βρεφικούς και παιδικούς πληθυσμούς σε όλο τον κόσμο. Υπάρχουν άφθονα δεδομένα που αποδεικνύουν ότι τα προβιοτικά μειώνουν την διάρκεια και την σοβαρότητα της διάρροιας που προκαλείται από τον ρετροϊό. Η κατανάλωση Lactobacillus GG μείωσε την διαρροϊκή φάση κατά μέσο όρο από 3.5 έως 2.5 μέρες σε νοσηλευόμενα παιδιά (Fuller 1993, Pant και συν. 1996) ή σε παιδιά που νοσηλεύτηκαν στο σπίτι (Guarino και συν. 1997). 57

58 Τα επίπεδα στον ορό του αίματος των IgA αντισωμάτων αυξήθηκαν σημαντικά στα παιδιά της ομάδας μελέτης που τους χορηγήθηκε συμπλήρωμα προβιοτικών συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου (Kaila και συν. 1995, Majamaa και συν ), κάτι το οποίο και να δείχνει την αιτία θεραπείας. Η αρχική μελέτη των Isolauri και συν. (1991) επιβεβαιώθηκε από την μελέτη του Guandalini (1998) στην οποία σε παιδιά με γαστρεντερίτιδα σε όλη την Ευρώπη χορηγήθηκε συμπλήρωμα με Lactobacillus GG. Τα θετικά αποτελέσματα ήταν εντυπωσιακά στην ομάδα των παιδιών που τους χορηγήθηκε το συμπλήρωμα Lactobacillus GG. Οι Isolauri και συν. (1995) έδειξαν ότι η ανοσολογική αντίδραση με εμβολιασμό από το στόμα με ζωντανό στέλεχος ρετροϊού ήταν καλύτερη σε παιδιά που πήραν συμπλήρωμα Lactobacillus GG συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. (Πίνακας 4). ιάρροια που σχετίζεται με αντιβιοτικά [antibiotc associated dioarrhoe (AAD)]: Η διάρροια που προκαλείται από την ανάπτυξη παθογόνων μικροοργανισμών είναι η πιο κοινή παρενέργεια της χρήσης των αντιβιοτικών. Τα προβιοτικά μπορεί να σταματούν την ανάπτυξη αυτών των παθογόνων μικροοργανισμών απελευθερώνοντας ανασταλτικά συστατικά όπως έχει αποδειχτεί για κάποια στελέχη. Το Clostridium difficile πιστεύεται ότι είναι το κύριο αίτιο της ψευδομεμβρανώδους κολίτιδας και η πιο κοινή αιτία της AAD. Ο αποικισμός του C. difficile έχει σαν αποτέλεσμα την διατάραξη της μικροβιακής χλωρίδας του εντέρου όπου και παράγει τουλάχιστον δύο τύπου τοξίνες (Salminen et al. 1998). Προβιοτικά βακτηρία έχουν βρεθεί να έχουν ευεργετικά αποτελέσματα τόσο στην πρόληψη αλλά και στην θεραπεία του AAD (πίνακας ). O Β. longum και o Lactobacillus rhamnosus έχουν δείξει σε μελέτες ότι μειώνουν τη δράση της ερυθρομυκίνης 58

59 που προκαλεί διάρροια. Μελέτες επίσης έχουν διαπιστώσει ότι θεραπεία με Saccharomyces boulardii μειώνει σημαντικά τη συχνότητα εμφάνισης AAD (Surawicz και συν.1989, McFarland και συν. 1994, 1995). Υπερανάπτυξη της Candida στο έντερο είναι επίσης αίτια διάρροιας λόγω της θεραπείας με αντιβιοτικά. Μελέτες σε χάμστερ έχουν δείξει ότι η μικροχλωρίδα του εντέρου εμπλέκεται στη καταστολή της Candida albicans (Kennedy και Volt, 1985). Σύμφωνα με τους Tomoda και συν. (1983) η χορήγηση γάλακτος που περιέχει L. acidophilus και ένα είδος Bifidobacterium ήταν αποτελεσματική στη μείωση του αριθμού της Candida στα κόπρανα σε ασθενείς που υποβάλλονταν σε χημειοθεραπεία για λευχαιμία. Τα συμπεράσματα από όλες τις μελέτες δείχνουν μία θετική δράση των προβιοτικών αλλά απαιτούνται περαιτέρω μελέτες με μεγαλύτερα δείγματα πληθυσμού. ιάρροια των ταξιδιωτών: Το πιο κοινό αίτιο της διάρροια των ταξιδιωτών είναι η εντεροτοξίνη της Ε. coli. Εμφανίζεται σε κατοίκους βιομηχανοποιημένων χωρών που ταξιδεύουν σε αναπτυσσόμενες ή τροπικές χώρες. ιαρκεί ώρες και επηρεάζει το 20-50% των ταξιδιωτών (DuPont και συν. 1993). Η προφύλαξη με την χρήση προβιοτικών αποτελεί μία ασφαλή εναλλακτική λύση στα αντιβακτηριδιακά φάρμακα. ύο μελέτες που πραγματοποιήθηκαν ερεύνησαν το κατά πόσο ο Lactobacillus GG μπορεί να αποτρέψει την διάρροια των ταξιδιωτών. Σε ομάδα 820 ταξιδιωτών στην Τουρκία σε 2 ξεχωριστά παραθεριστικά κέντρα εμφανίστηκε διάρροια στο 43% του δείγματος αναφοράς και στο 38% της ομάδας που τους χορηγήθηκε συμπλήρωμα προβιοτικών. 59

60 Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαίτερα εντυπωσιακά στο ένα από τα δύο κέντρα με ποσοστά εμφάνισης διάρροιας 40% στο δείγμα αναφοράς και 24% στο πειραματικό (Oksanen και συν. 1990). Αντίθετα δεν μπόρεσαν να καταγραφούν σαφείς θετικές επιδράσεις των L. acidophilus και Lactobacillus fermentum σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε 282 στρατιώτες που υπηρέτησαν στο εξωτερικό. Θα πρέπει να τονιστεί ότι απαιτούνται περισσότερες μελέτες που θα λαμβάνουν υπόψη τους την υποδομή του τόπου προορισμού αλλά και την προγενέστερη κατάσταση υγείας των εθελοντών. Πολλές μελέτες έχουν αξιολογήσει τη δυνατότητα των προβιοτικών στελεχών στην πρόληψη αυτής της μορφή διάρροιας με τη χρησιμοποίηση διαφορετικών προβιοτικών και δοσολογιών (Black και συν. 1989, Oksanen και συν. 1990). (Πίνακας ). Τροφογενής διάρροια: ιαταραχή της κανονικής ισορροπίας της εντερικής μικροχλωρίδας μπορεί να δημιουργήσει κατάλληλο περιβάλλον για την ανάπτυξη εντεροπαθογόνων όπως η Salmonella, Campylobacter, E. coli, Listeria και Shigella spp. Με μελέτες που έχουν γίνει σε ζώα έχει διαπιστωθεί η ικανότητα ορισμένων προβιοτικών να παρεμπόδιζουν της ανάπτυξης παθογόνων (Πίνακας ) υσανεξία στη λακτόζη Ανεπάρκεια σε λακτάση (β-γαλακτοσιδάση) σημαίνει μειωμένη συγκέντρωση του ενζύμου στο βλεννογόνο του λεπτού εντέρου. Η υπολακτασία προκαλεί ανεπαρκή πέψη της λακτόζης, και αυτό το φαινόμενο καλείται δυσπεψία λακτόζης (lactose maldigestion). Η δυσπεψία στη λακτόζη συνήθως προσδιορίζεται με μέτρηση του εκλυόμενου στην αναπνοή H2 (Levitt και 60

61 Donaldson 1970), που αποτελεί μέτρο των ζυμώσεων στον εντερικό σωλήνα και ορίζεται από συγκέντρωσης Η2>20 ppm (de Vrese και συν. 2001). H δυσανεξία στη λακτόζη είναι ένα πρόβλημα για το 70% περίπου του παγκόσμιου πληθυσμού. Η λακτόζη σ αυτές τις περιπτώσεις δεν υδρολύεται και δεν απορροφάται οπότε δρα ωσμωτικά. Ωστόσο, όταν η λακτόζη προσλαμβάνεται μαζί με μικροοργανισμούς που παράγουν λακτάση (όπως ο Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, Steptococcus thermophilus κ.α.) τότε η διάσπαση της λακτόζης διευκολύνεται και η απορρόφηση της προάγεται με επακόλουθη ελάττωση των συμπτωμάτων της δυσανεξίας και επιβράδυνση της διέλευσης των τροφών. 61

62 Πίνακας Παραδείγματα μικροβιακής λοίμωξης και οι αντίστοιχες δράσεις των προβιοτικών. Τύπος διάρροιας Μελέτη σε: Προβιοτικό Δράση Αναφορές Βρεφική διάρροια άνθρωπο Lactobacillus GG Μείωση της διάρκειας της διάρροιας Isolauri και συν. (1991) Isolauri και συν. (1994) Kaila και συν. (1992) Pant και συν.(1996) άνθρωπο Lactobacillus reuteri Μείωση της διάρκειας της διάρροιας Shornikova και συν. (1997) άνθρωπο B. bifidum & S. thermophilus Προστασία από το ροταϊο Saavedra και συν. (1994) άνθρωπο B. breve Εμπόδιση διάρροιας Hotta και συν. (1987) Διάρροια που σχετίζεται με αντιβιοτικά άνθρωπο B. longum Μείωση της δράσης της ερυθρομυκίνης για διάρροια Colombel και συν. (1987) [antibiotc associated dioarrhoe (AAD)] άνθρωπο Lactobacillus GG Μείωση της δράσης της ερυθρομυκίνης για διάρροια Siitonen και συν. (1990) και άλλες επιδράσεις της άνθρωπο Streptococcus faecium Μείωση της διάρκειας της διάρροιας Borgia και συν. (1982) άνθρωπο S. boulardii Μείωση της διάρκειας της διάρροιας Surawicz και συν. (1989) McFarland και συν. (1995) Elmer και συν. (1996) Διάρροια από άνθρωπο Lactobacillus GG Βελτίωση της κολίτιδας Gorbach και συν. (1987) C. difficile Bartlett και συν. (1987) άνθρωπο Lactobacillus GG Σταμάτημα της διάρροιας Bennet και συν. (1990) Biller και συν. (1995) Διάρροια των ταξιδιωτών άνθρωπο L. acidophilus & B. bifidum Μείωση της συχνότητας της διάρροιας Black και συν. (1989) άνθρωπο Lactobacillus GG Μείωση της συχνότητας της διάρροιας Oksanen και συν. (1990) Hilton και συν.(1996) Τροφογενής διάρροια ποντίκια L. casei Shirota Αύξηση της αντίστασης σε θανάσιμες λοιμώξεις Nomoto και συν. (1989) ποντικια από Salmonella, E. coli και L. monocytogenes ποντικια Yoghurt bacteria Αύξηση της αντίστασης σε Σαλμονελώσεις Hitchins και συν. (1986) Bovee-Oudenhoven και συν. (1996) In vitro L. acidophilus & L. GG Παρεμπόδιση της ανάπτυξης της Salmonella Brassart και συν. (1995) 62

63 Υποχοληστεριναιμική δράση Το μεγαλύτερο μέρος της χοληστερόλης συντίθεται στον οργανισμό, κυρίως στο ήπαρ και δευτερευόντως στον εντερικό σωλήνα, ενώ ο ρυθμός σύνθεσής της επηρεάζεται άμεσα από την τροφή. Τα ζυμωμένα γαλακτοκομικά προϊόντα είναι δυνατό να επιφέρουν μείωση της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο αίμα είτε αναστέλλοντας την σύνθεσή της στο ήπαρ είτε περιορίζοντας την απορρόφησή της από το έντερο (Jaspers και συν. 1984, Lin και συν.1989). Εργαστηριακές μελέτες έχουν δείξει ότι τα προβιοτικά βακτήρια μειώνουν το ποσοστό της χοληστερόλης μέσα στο μέσο το οποίο καλλιεργούνται (Gilliland και συν. 1985, 1989). Τα αποτελέσματα των μελετών είναι όμως αντιφατικά. Η κατανάλωση γάλακτος εμπλουτισμένο με προβιοτική καλλιέργεια δεν μείωσε την συγκέντρωση χοληστερίνης στο αίμα σε μελέτη που έγινε σε ασθενείς (Marteau 1995). Οι Lin και συν. (1989) πραγματοποίησαν μία πιλοτική μελέτη σε 23 άτομα που πήραν προβιοτικό συμπλήρωμα (L. acidophilus) και 15 άτομα που δεν πήραν προβιοτικό συμπλήρωμα σαν ομάδα αναφοράς. Σε 7 εβδομάδες η συγκέντρωση της χοληστερίνης είχε μειωθεί στην πειραματική ομάδα από 5,5 σε 5,3 mmol/l ενώ στη ομάδα αναφοράς είχε παραμείνει σταθερή στα 4.9 mmol/l. Σε 16 εβδομάδες η συγκέντρωση της χοληστερίνης ήταν 5.4 mmol/l (Tahri 1995). Σε μελέτη στην Ινδία σε ομάδα ατόμων που κατανάλωσε βουβαλίσιο γάλα με προβιοτική καλλιέργεια L. acidophilus 63

64 καταγράφηκε μείωση των επιπέδων της χοληστερίνης κατά 12-20%, μετά από 1 μήνα (Khedkar 1993). ύο μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για να μελετηθεί η επίδραση του E. faecium στα επίπεδα χοληστερίνης στο αίμα. Στην πρώτη μελέτη σε 29 άντρες δόθηκε γάλα με προβιοτική καλλιέργεια E. faecium ( CFU/L) με δύο στελέχη S. thermophilus και σε 28 άτομα δόθηκε τεχνητά ξινισμένο γάλα. (Pool-Zobel 1996). Η κατανάλωση γάλακτος με προβιοτική καλλιέργεια προκάλεσε μεταβολή των επιπέδων της χοληστερίνης στο αίμα κατά 0.37 ± 0.41 mmol/l στο τέλος της 6 ης εβδομάδας, ενώ στην ομάδα αναφοράς δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή (Richelsen 1996). Η μελέτη επαναλήφθηκε σε 67 άτομα και η μείωση της LDL που παρατηρήθηκε στο αίμα ήταν ιδιαίτερα μεγάλη την 4η και την 12η εβδομάδα Αντιμετώπιση λοιμώξεων στο στομάχι Η μακρόχρονη παρουσία του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού (ΕΠ) συνδέεται άμεσα με την εμφάνιση χρόνιας γαστρίτιδας, πεπτικού έλκους και γαστρικού καρκίνου και συνδυάζεται με μείωση του αριθμού λακτοβακίλλων και bifidobacteria στο στομάχι. Oι μηχανισμοί δράσης των προβιοτικών, έναντι του ΕΠ βρίσκονται υπό διερεύνηση και διακρίνονται σε μη ανοσολογικούς και ανοσολογικούς μηχανισμούς. (Boirivant και συν. 2007) Μη ανοσολογικοί μηχανισμοί Η γαστρική οξύτητα και ο γαστρικός βλεννογονικός φραγμός αποτελούν την α γραμμή άμυνας στα παθογόνα βακτήρια. 64

65 Θεωρείται ότι η χρήση των προβιοτικών ενδυναμώνει το φραγμό αυτό: α) με την παραγωγή βακτηριοσινών με αντιμικροβιακές ιδιότητες έναντι του ΕΠ και των τελικών προϊόντων της αποδόμησης του γαλακτικού οξέος, β) με τον ανταγωνισμό τους σε σχέση με το ΕΠ στους υποδοχείς προσκόλλησης, γ) με τη διέγερση της έκκρισης βλέννης και δ) σταθεροποιώντας το γαστρικό βλεννογονικό φραγμό. (Τζουβαλά 2009) Ανοσολογικοί μηχανισμοί Η ανοσολογική απόκριση της λοίμωξης από το ΕΠ χαρακτηρίζεται από την απελευθέρωση διαφόρων χημοκινών και κυτταροκινών. Τα προβιοτικά ενδεχομένως τροποποιούν την ανοσολογική απάντηση του ξενιστή μεταβάλλοντας την έκκριση αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών από τα επιθηλιακά κύτταρα, με αποτέλεσμα την ελάττωση της φλεγμονώδους διεργασίας (Gill 2003). In vitro μελέτες έδειξαν ότι ο L. salivarius αναστέλλει του ΕΠ προερχόμενη έκκριση IL-8 από τα επιθηλιακά κύτταρα. Μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η προβιοτική δράση των οξυγαλακτικών βακτηρίων δρομολογείται μέσα από την ισορροπία μεταξύ φλεγμονωδών και αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών. Η ελάττωση των IGg αντισωμάτων έναντι του ΕΠ μετά τη λήψη προβιοτικών, συνοδεύει την ελάττωση της γαστρικής φλεγμονώδους αντίδρασης. 65

66 Τέλος έχει επίσης δειχθεί ότι τα προβιοτικά ενδυναμώνουν το βλεννογονικό φραγμό διεγείροντας τις τοπικές IgA αντιδράσεις, με αποτέλεσμα τη σταθερότητα του βλεννογόνου. Εντούτοις, η δράση των προβιοτικών στην ανοσιακή απόκριση δεν μπορεί να γενικευτεί για όλα τα προβιοτικά. ιαφορετικά στελέχη μπορεί να διεγείρουν ετερογενείς ανοσολογικές απαντήσεις, οι οποίες εξαρτώνται επίσης από την ανοσιακή κατάσταση του ξενιστή (Τζουβαλά, 2009) Κλινικές μελέτες Πολλές κλινικές μελέτες έχουν διεξαχθεί τα τελευταία χρόνια με στόχο την παρατήρηση της δράσεις των προβιοτικών σε ασθενείς, χαρακτηριστικά θα αναφέρουμε κάποιες από αυτές. Οι Van Niel και συν. (2002) παρατήρησαν μείωση της διάρκειας της διάρροιας κατά 0,7 μέρες σε παιδιά που τους χορηγήθηκαν ως προβιοτικά στελέχη Lactobacillus rhamnosus. Οι Agarwal και Bhasin (2002) ανέφεραν σημαντική μείωση κατά 25% της διάρκειας διάρροιας σε μια ομάδα 175 παιδιών, σε αυτή τη μελέτη οι έλεγχοι που λάμβαναν χώρα ήταν σε δύο ομάδες παιδιών, στην μία χορηγούνταν γάλα που είχε υποστεί ζύμωση χωρίς Lactobacillus casei και στην άλλη γάλα που έχει υποστεί ζύμωση με προβιοτικό στέλεχος (L. casei DN ). Οι Canani και συν. (2007) συνέκριναν την επίδραση της πρόσληψης πέντε διαφορετικών προβιοτικών ή συνδυασμούς προβιοτικών κατά τη διάρκεια της οξείας διάρροιας σε παιδιά τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντικό βελτίωσης της κατάστασης των παιδιών όταν τους χορηγήθηκε ζυμούμενο γάλα από L. rhamnosus και συνδυασμός Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus, Streptococcus 66

67 thermophilus και Bifidobacterium bifidum. Η εν λόγω μελέτη επιβεβαίωσε ότι όλα τα προβιοτικά δεν συμπεριφέρονται κατά παρόμοιο τρόπο. Σύμφωνα με τους Cremonini και συν. (2002) σε μελέτη που έκαναν σε ενήλικες παρατήρησαν σημαντική μείωση της διάρροιας με χορήγηση S. boulardii και είδη Lactobasillus σε μια μετανάλυση που περιλάμβανε 881 άτομα. Ο McFarland (2006) επιβεβαίωσε τη σημαντική μείωση του κινδύνου του C. difficile, που συνδέονται με τη διάρροια με την χορήγηση προβιοτικού στελέχους S. boulardii. Όπως είδαμε υπάρχουν αρκετές πειστικές αναφορές σχετικά με την αποτελεσματικότητα των προβιοτικών στη βελτίωση της άμυνας του οργανισμού Μηχανισμοί δράσεως των προβιοτικών Οι πιθανοί μηχανισμοί δράσεις των προβιοτικών που επηρεάζουν την υγεία του ανθρώπου περιλαμβάνουν τη προαγωγή του εντερικού αμυντικού φραγμού με αποκατάσταση στο φυσιολογικό την αυξημένη εντερική διαπερατότητα και τη ισορροπίας της εντερικής χλωρίδας, τη προαγωγή της δραστηριότητας των μακροφάγων, την αύξηση της φαγοκυττάρωσης και τη διέγερση της χημικής ανοσολογικής απάντησης και τη βελτίωση της εντερικής φλεγμονής όπως υποδεικνύεται από τις ελαττωμένες κυτοκίνες στο βλεννογόνου του εντέρου, Υπάρχει επίσης η ένδειξη ότι τα προβιοτικά διεγείρουν την έκφραση του γονιδίου MUC3 το οποίο παράγει βλεννίνη, μια ευμεγέθη γλυκοπρωτεΐνη, που απεκκρίνεται από τα επηθηλιακά κύτταρα στο γαστρεντερικό σύστημα. Έτσι διέγερση της έκκρισης 67

68 της βλεννίνης από προβιοτικά θα μπορούσε να ενίσχυση την προστασία του γαστρεντερικού από ιούς και μικρόβια. Οι Mack και συν. (1999) έχουν δείξει ότι ο Lactobacillus GG και ο Lactobacillus plantarum 299v αναστέλλουν την σύνδεση παθογόνων στελεχών της E.coli με τα επιθηλιακά κύτταρα σε κυταροκαλλιέργειες. Η αναστολή αυτή της σύνθεσης αποδόθηκε στη διέγερση από τα προβιοτικά του γονιδίου MUC3 των επιθηλιακών κυττάρων και στην απέκκριση αυξημένης ποσότητας βλεννίνης από τα επιθηλιακά αυτά κύτταρα. Οι ερευνητές υποθέτουν ότι με την διέγερση απέκκρισης της βλεννίνης τα προβιοτικά μπορεί να ελαχιστοποιήσουν την αντίδραση του βλεννογόνου και να μειώσουν την εντερική φλεγμονή. 68

69 1) 3) 2) Σχήμα Oι τρεις κύριοι μηχανισμοί δράσεις των προβιοτικών είναι: 1) Τα προβιοτικά βακτήρια μπορούν να εκτοπίσουν βλαβερά βακτήρια μέσω του μικροβιακού ανταγωνισμού με μείωση της διαθεσιμότητας θρεπτικών συστατικών ή μέσω της αναχαίτισης τους με την παραγωγή αντιβακτηριακών ουσιών και τη μείωση του ph, 2) ανοσοτροποιητική δράση, μέσω της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτοκινών και δεσμεύση τοξίνών που παράγονται στο έντερο και 3) επηρεάζουν την ακεραιότητα του επιθηλίου, ενισχύουν τον σχηματισμό βλέννας και αποτρέπουν την μετακίνηση παθογόνων μικροοργανισμών μέσου αυτού. (Vanderpool κ.α 2008). 69

70 3. Γαλακτικά βακτήρια 3.1 Εισαγωγή Η έννοια των γαλακτικών βακτηρίων (LAB), ως μια ομάδα οργανισμών αναπτύχθηκε κατά την έναρξη του Οι αλληλεπιδράσεις και η σχέση των LAB με τα τρόφιμα μελετήθηκε για πρώτη φορά από τον Pasteur το 1857 με τη μελέτη της ζύμωσης του γαλακτικού οξέος και ακολούθησε η πρώτη απομόνωση μιας καθαρής καλλιέργειας του Bacterium lactis αργότερα το 1873 από το Lister. H χρησιμοποίηση καλλιέργειας εκκίνησης στο τυρί, εισήγαγε για πρώτη φορά ο Weigrnann το 1890 στη Κοπεγχάγη. Αυτός άνοιξε το δρόμο για τη βιομηχανοποίηση της ζυμώσεις των τροφίμων. Τα LAB βρίσκονται σε μεγάλο αριθμό σε ζυμούμενα τρόφιμα καθώς επίσης είναι στενά συνδεδεμένα με το ανθρώπινο περιβάλλον. Αναφορές για ζυμούμενα γαλακτοκομικά προϊόντα (τυρί, γιαούρτι, βούτυρο) είναι καταγεγραμμένα σε αρχαϊκά κείμενα από τον Uruk / Warka (Ιράκ) γύρω στο 3200 π.χ. (Nissen και συν. 1991). Μπύρα παραγόμενη από τους Βαβυλώνιους που εξάγονταν στην Αίγυπτο γύρω στο 3000 π.χ. ήταν πιθανότατα το προϊόν τόσο αλκοολικής όσο και γαλακτικής ζύμωσης. Αρκετές από αυτές τις «εμπειρικές» βιοτεχνολογικές διαδικασίες είναι ακόμη σε χρήση, αλλά σε βιομηχανική κλίμακα έχουν εφαρμοστεί κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες, π.χ. λάχανο τουρσί και ζυμώσεις αγγούρι. Ορισμένοι παρασκευαστές/βιοτέχνες εξακολουθούν να βασίζονται στις παραδοσιακές τεχνολογίες για την επεξεργασία του τυριού και 70

71 άλλων προϊόντων ζύμωσης, χωρίς τη χρήση καλλιέργειες εκκίνησης. Ένας αρχικός ορισμός της ομάδας των LAB ήταν με βάση της δυνατότητας να ζυμώσουν και να πήζουν το γάλα, ο οποίος ορισμός όμως περιλάμβανε και τα κολοβακτηρίδια και τα γαλακτικά. H περιγραφή των Lactobacillus έγινε το 1901 από τον Beijerinck ο οποίος τα χαρακτήρισε gram-θετικά βακτηρίδια και διαχωρίστηκαν πλέον τα κολοβακτηρίδια από το LAB. Σύμφωνα με τον Orla-Jensen (1919) τα «πραγματικά βακτήρια του γαλακτικού οξέος» αποτελούν μια ομάδα gramθετικών, μη σπορογόνων,σε σχήμα ράβδου και κόκκου που ζυμώνουν τους υδατάνθρακες και τις ανώτερες αλκοόλες κυρίως σε γαλακτικό οξύ. Όπως φαίνεται και στον πίνακα από τους επιστήμονας προτάθηκαν επτά γένη. Το ενδιαφέρον των λακτοβακίλλων στη διατροφή του ανθρώπου ήταν σε άνοδο τον 20ο αιώνα, όταν ο Elie Metchnikoff στο Ινστιτούτο Pasteur στο Παρίσι προώθησε τη χρήση τους στη διατροφή για βελτίωση της υγείας του ανθρώπου μέσω της προφύλαξης που ασκούν στον ανθρώπινο οργανισμό (Bibel 1988), αλλά η θεωρία του για όφελος προς την υγεία και την μακροζωία έπεσε στο κενό λόγω τον ελλείπων επιστημονικών στοιχείων που είχε. Οι ισχυρισμοί ότι τα LAB είναι σημαντικά στην υγεία των ανθρώπων και των ζώων ήρθαν ξανά στο προσκήνιο όταν ο Fuller (1989) ισχυρίστηκε ότι ευνοούν την υγεία (προβιοτικά) και έχουν θετική επίδραση στο γαστρεντερικό σύστημα. 71

72 Πίνακας Ταξινόμηση των Γαλακτικών βακτηρίων σύμφωνα με τον Orla-Jensen (1919) Γένος α Σχήμα Καταλάση Μείωση νιτρωδών Ζύμωση Τρέχων γένος Betabacterium ράβδος - - Ετεροζυμωτικά Lactobacillus Weissella Thermobacterium ράβδος - - Ομοζυμωτικά Lactobacillus Streptobacterium ράβδος - - Ομοζυμωτικά Lactobacillus Carnobacterium Sreptococcus κόκκος - - Ομοζυμωτικά Streptococcus Enterococcus Lactococcus Vagococcus Batacocus κόκκος - - Ετεροζυμωτικά Leuconostoc Oenociccus Weissella Microbacterium ράβδος + + Ομοζυμωτικά Brochothrix Tetracoccus κόκκος + β + Ομοζυμωτικά Pediococcus Tetragenococcus α Σύμμφωνα με τον Orla-Jensen (1919 β Γενικά οι Pediococci έχουν καταλάση αρνητική αλλά μερικά στελέχη παράγουν ψευδοκαταλάση Σε μια μονογραφία του Orla-Jensen (1919) με εκτενή αναφορά στα LAB υπογράμμισε τη σημασία των στρεπτοκόκκων στο γάλα και τα γαλακτοκομικά προϊόντα. Αργότερα το 1937 ο Sherman έκανα την πρώτη ταξινόμηση των στρεπτοκόκκων αποκλείοντας από αυτή τα αυστηρά αναερόβια βακτήρια και τους pneumococcs λόγω της ευαισθησία τους στα χολικά άλατα. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτά τα βασικά φυσιολογικά χαρακτηριστικά δικαιολογούν την ομαδοποίηση τους που σε μεγάλο βαθμό επιβεβαιώθηκε από τους Schleifer και Kilpper-Balz (1984) και Schleifer και Kilpper-Balz (1987), όταν πρότειναν για πρώτη φόρα δυο νέα γένη τους Lactococcus και Enterococcus με βάση τα μοριακά τους χαρακτηριστικά. Ο Lancefield (1933) είχε προτείνει νωρίτερα την διαφοροποίηση των στρεπτοκόκκων με βάση όπως την αναφέρει τη «C ουσία». Επιβεβαίωση των ομάδων του Lancefield με φυσιολογικές και βιοχημικές εξετάσεις έγινε αργότερα από τον Sherman (1937). 72

73 Η κλασική προσέγγιση της ταξινόμησης των βακτηρίων βασίστηκε σε μορφολογικά και φυσιολογικά χαρακτηριστικά. Αυτό αργότερα επεκτάθηκε ώστε να περιλαμβάνει και τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, τα λιπαρά οξέα του κυττάρου και άλλα χαρακτηριστικά των κυττάρων. Τα μοριακά χαρακτηριστικά είναι επίσης σημαντικά ταξινομικά εργαλεία, όπως τα mol% G + C, ηλεκτροφορητικές ιδιότητες των γονιδιακών προϊόντων, DNA: DNA μελέτες υβριδισμού και οι δομή και η αλληλουχία του ριβοσωμικού RNA (rrna). Αυτό οδήγησε αργότερα σε σημαντικές αλλαγές στην ταξινόμηση των LAB (Schleifer και συν. 1987). Η κατάταξη των LAB παραμένει ακόμα όμως ευμετάβλητη και αυτό αποτελεί το επίκεντρο της έντονης ταξινομικής μελέτη πολλών ερευνητών που θεωρούν πλέων αναγκαία την πολυφασική προσέγγιση με τη συμμετοχή τόσο φαινοτυπικών αλλά και φυλογενετικών χαρακτηριστικών των βακτηρίων (Vandamme και συν.1996). Σύμφωνα με τους Aguirre και Collins (1993) και Gasser (1994) τα LAB έχουν βρεθεί να είναι τα αίτια ανθρώπινων ασθενειών. Οι Aguirre και Collins (1993) στις μελέτες τους εστίασαν την προσοχή τους στους εντερόκοκκους και την άμεση σχέση αυτών με τις κλινικές λοιμώξεις. Ωστόσο, πολλές εργασίες αναφερόμενες στους Lactobacillus (Sussman και συν. 1986) και στα Leuconostocs (Handwerger και συν. 1990) κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ορισμένα από αυτά τα βακτήρια θα πρέπει να θεωρούνται πιθανών ως παθογόνοι παράγοντες. Στη μεγάλη πλειοψηφία αυτών των κλινικών περιπτώσεων που τα βακτήρια είχαν παθογόνο δράση οι ασθενείς είτε είχαν ιστορικό κάποιας νόσου ή ήταν ανοσοκατεσταλμένοι. Αυτό οδήγησε τους Aguirre και Collins στο συμπέρασμα ότι αυτά τα βακτήρια εμπίπτουν στην 73

74 κατηγορία των ευκαιριακά παθογόνων. Σαφώς οι επιστήμονες τροφίμων θα πρέπει να λαμβάνουν υπόψη ότι τα LAB συνδέονται με κλινικές λοιμώξεις κάτω από ορισμένες καταστάσεις του ασθενεί, αλλά μέχρι τώρα δεν υπάρχουν αποδείξεις ότι τα ζυμούμενα τρόφιμα προερχόμενα από αυτά τα βακτήρια επηρεάζουν και την διατροφή. Φυλογενετικά τα LAB ανήκουν στο παρακλάδι των κλωστηριδίων των gram-θετικών βακτηρίων, τα οποία έχουν αρνητική δοκιμή καταλάσης, είναι μη σπορογόνα σε σχήμα κόκκου, κοκκοβάκιλου ή ραβδιού και έχουν λιγότερο από 55% mol% G + C στο DNA τους. Αυτή η αποστασιοποίηση των «παραδοσιακά» γαλακτικών (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc και Pediociccus) από τα bifidobacteria που είναι μεγαλύτερη από 55 mol% G + C στο DNA και συνεπώς πρέπει να περιλαμβάνονται στο παρακλάδι των «Actinomyces» (Σχήμα ) (Schleifer και Ludwig, 1995). Τα LAB τα οποία αφορούν τα τρόφιμα ανήκουν στην γένη: Curnohctcteriun, Enterococcus, LuctobacilIus, Luctococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vugococcus και Weissella (Vandamme και συν. 1996). Τα στοιχεία από το 16s rrna στα LAB υποδηλώνουν νέες ομάδες στην ταξινόμηση. Τα Lactobacillus και τα Leuconostocs αναταξινομήθηκαν σε τρεις μεγάλες ομάδες (Collins και συν.1993b, Schleifer και Ludwig, 1995, Vandamme και συν. 1996) την ομάδα των Leuconostoc, Lb. delbrueckii και Lb. casei- Pediococcus (Πίνακας ). Tα νεοσυσταθείσα γένη των Curnobacterium (ευαίσθητα σε όξινο περιβάλλον λακτοβάκιλλοι), Tetragenococcus και 74

75 Vagococcus (πρώην στρεπτόκοκκοι) αποτελούν μια φυλογενετική oμάδα με το γένος Erterococcus. Flexistipes Fibrobacter Planctomycetes Chlamydia Spirochetes Cyanobacteria Cytophaga/ Flavobacterium /Bacteroides Gram-positive bacteria low DNA Fusobacterium Green sulfur bacteria Gram-positive bacteria low DNA Proteobacteria Nitrospira Arhaea 10% Deinococci Green nonsuflur bacteria Aquifex Thermotogales Σχήμα Γενεαλογικό δέντρο τροποποιημένο από τους Schleifer και Ludwig, (1995), βασισμένο σε τεχνικές 16S rrna. Η γραμμή υποδεικνύει 10% αναμενόμενη γραμμική απόκλιση (Stiles και Holzapfel 1997). 75

76 Πίνακας Επαναπροσδιορισμός των λακτοβακίλλων με βάση τα φυσιολογικά τους χαρακτηριστικά (Vandamme και συν. 1996) Φυλογενετική ομάδα Ομάδα 1 Ομάδα 2 Ομάδα 3 Υποχρεωτικά ομοζυμωτικά Προαιρετικά ομοζυμωτικά Υποχρεωτικά ετεροζυμωτικά Delbrueckii Lb. acidophilus, Lb. amyiophilus, Lb. Lb. acetotolerans, Lb. hamsteri amylovorus, Lb.crispatus, Lb.delbrueckii subsp. delbrueckii, bulgaricus και lactis, Lb. gallinarum, Lb. gasseri, Lb. helveticus, Lb. jensenii, Lb. johnsonii, Lb. kefiranofaciens, Lb. kefirgranwm Lb. casei - Pediococcus Lb. aviarius subsp. araffinosus και avarius Lb. agilis, Lb. alimentarius, Lb. Pediococcus pentosaceus, Lb. Lb. farciminis, Lb mali, Lb. ruminis, bifermentans, Lb. casei, Lb. coryniformis brevis, Lb.buchneri, Lb. collinoides, subsp. salicinus και salivarius, subsp. coryniformis και torquens, Lb. Lb. fermentum, Lb. fructicorans, Lb. Lb, sharpae, Lb. salicarius curvatus, Lb. graminis, Lb. homohiochii, hilgardii, Lb. kefir, Lb.malefermentans Pediococcus parculus, Pediococcus Lb. intestinalis, Lb. murinus, Lb. Lb. oris, Lb. parabuchneri. Lb. panis damnosus, Pediococcus dextranicum, paraplantarum, Lb. rhamnosus, Lb. sake Lb. parakefir, Lb. pantis, Lb. reuteri, Lb. (Lb. bavaricus), Pediococcus acidilactici sanfancisco, Lb. suebicus, Lb. varinalis Lb. Vaccimostercus Leuconostoc Lb. fructosus, W. confusa (Lb. confusus), W. (Lb.) ciridescens, W.(Lb.) halotolerans, W. (Lb.) hilgardii, W. (Lb.) kandleri,w. (Lb.) minor, W. hellenica, W.(Leuc.) paramesenteroides, Leuc. amelibiosum, Leuc. argentimum Leuc. lactis, Leuc. mesenteroides Leuc. peudomesenteroides Leuc. Carnosum, Leuc. Gelidum Leuc. fallax 76

77 3.2. Το γένος Lactobacillus Οι λακτοβάκιλλοι είναι Gram θετικά, μη σπορογόνα βακτήρια και αν λάβουμε υπόψη και το σχήμα, μπορούν να εμφανιστούν ως ραβδία ή ως κοκκοβάκιλοι. Είναι ζυμωτικά, μικροαερόφιλα και χημειοργανοτροφικά, έχουν καταλάση αρνητική, ακόμη και αν υπάρχει δραστηριότητα ψευδοκαταλάσης σε ορισμένα στελέχη. Λαμβάνοντας υπόψη τη σύνθεση βάσεων του γονιδιώματος τους, έχουν περιεκτικότητα σε GC χαμηλότερη από 54 mol%. Βρίσκονται σχεδόν παντού: στο περιβάλλον όπου έχει διαθέσιμους υδατάνθρακες όπως για παράδειγμα στα τρόφιμα (γαλακτοκομικά προϊόντα, ζυμούμενα κρέατα, λαχανικά, φρούτα, ποτά), στο αναπνευστικό, στο γαστρεντερικό και στα φυτά. Σύμφωνα με το Taxonomic Outline of the Procaryotes (Garrity και συν. 2004), το γένος Lactobacillus ανήκει στο φυλή Firmicutes, στη κατηγορία των βακίλων, στην τάξη Lactobacillales και στην οικογένεια Lactobacillaceae και τα πλησιέστερα συγγενή γένει είναι τα Paralactobacillus και τα Pediococcus. ( Felis και Dellaglio 2007) Η φυλογενετικά πλησιέστερη οικογένεια φαίνεται να είναι η οικογένεια Leuconostocaceae, η οποία περιλαμβάνει τα γένη Leuconostoc, Oenococcus και Weissella (Hammes και Hertel, 2003). Το γένος Lactobacillus περιλαμβάνει 106 είδη και είναι το πολυπληθέστερο γένος της τάξης Lactobacillales. Επιπλέον, 1 είδος έχει περιγραφεί αλλά δεν έχει εγκριθεί ακόμη (Lactobacillus 77

78 tucceti, Chenoll και συν. 2006). Επτά είδη του γένους Lactobacillus περιλαμβάνουν 2 υποείδοι ή περισσότερα: 1. Lactobacillus aviarius (L. aviarius subsp. aviarius και L. aviarius subsp. araffinosus), 2. Lactobacillus coryniformis (L. subsp coryniformis. coryniformis και L. subsp coryniformis. torquens), 3. Lactobacillus delbrueckii (L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. indicus, και L. delbrueckii subsp. lactis), 4. Lactobacillus kefiranofaciens (L. subsp. kefiranofaciens. kefiranofaciens και L. subsp. kefiranofaciens. kefirgranum), 5. Lactobacillus paracasei (L. paracasei subsp. paracasei και L. paracasei subsp. tolerans), 6. Lactobacillus plantarum (L. plantarum subsp. plantarum και L. subsp plantarum. argentoratensis), και 7. Lactobacillus sakei (L. sakei subsp. sakei και L. sakei subsp. carnosus). Η φυλογενετική δομή της οικογένειας Lactobacillaceae φαίνεται στο σχήμα Τα είδη Lactobacillus catenaformis και Lactobacillus vitulinus δεν περιλαμβάνονται, διότι είναι γνωστό μόνο ελάχιστα στελέχη σχετίζονται με του γένος Lactobacillus (Pot και συν.1994, Hammes και Vogel, 1995, Hammes και Hertel, 2003) και σύμφωνα με τους συγγραφείς φαίνεται να είναι φυλογενετικά συγγενείς πιο κοντά με τα Catenibacterium (Kageyama και Benno 2000a) και Coprobacillus (Kageyama και Benno 2000b). Η πρώτη φυλογενετική ανάλυση των λακτοβακίλλων έγινε το 1991 από τους Collins και συν. όπως έχει 78

79 ήδη προαναφερθεί, αργότερα οι Schleifer και Ludwig (1995) επιβεβαίωσαν τα συμπεράσματα του Collins και μετονόμασαν τον L. delbrueckii του σε L. acidophilus. Επιπλέον, οι συγγραφείς σημειώνουν ότι η ομάδα L. casei-pediococcus (πίνακας ) θα μπορούσε να χωρίζεται σε επιπλέον τέσσερις υποομάδες. Η περιγραφή μεγάλου αριθμού ειδών τα τελευταία χρόνια και η μετάφυλογενετική επανεξέταση τους τα διαχωρίζει σε μικρότερες ομάδες. Αυτή η ομαδοποίηση των βακτηρίων έχει υιοθετηθεί από τους Hammes και Hertel (2003) και Dellaglio και Felis (2005) και συνοψίζονται στον πίνακα Η κύρια διαφορά στην ταξινόμηση του γένους Lactobacillus είναι η μη αντιστοιχία μεταξύ της φυλογενετικής τοποθέτηση και των μεταβολικών ιδιοτήτων τους. Σύμφωνα με τον Pot και συν. (1994) το γένος Lactobacillus χωρίζεται σε τρεις ομάδες με βάση την μορφή ζύμωσης σε «ομοζυμωτικούς», «ετεροζυμωτικούς», «υποχρεωτικά ομοζυμωτικούς», «προαιρετικά ετεροζυμωτικους» και «υποχρεωτικά ετεροζυμωτικούς». Οι αποδεκτή ορισμοί των παραπάνω δόθηκαν αργότερα από τους Hammes και Vogel (1995): υποχρεωτικά ομοζυμωτικοί λακτοβάκιλλοι, είναι αυτοί που ζυμώνουν σχεδόν αποκλειστικά τις εξόζες σε γαλακτικό οξέος από την Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) οδό. (Σχήμα 7) προαιρετικά ετεροζυμωτικοί γαλακτοβάκιλλοι, είναι αυτοί οι οποίοι οξειδώνουν την γλυκόζη προς 6- φωσφό-γλυκονικό οξυ, ακολουθούμενο από μία αποκαρβοξλίωση. Η πεντόζη στη συνέχεια διασπάται 79

80 σε 3-φωσφο-γλυκεριναλδεύδη και ακέτυλο- φωσφοτικό οξύ με τη δράση μιας φωσφοκετολάσης. υποχρεωτικά ετεροζυμωτικοι γαλακτοβάκιλλοι είναι αυτοί οι οποίοι ζυμώνουν την γλυκόζη σε γαλακτικό οξύ, αιθανόλη ή οξικό οξύ και διοξείδιο του άνθρακα. ( Felis και Dellaglio 2007) Σχήμα Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) οδός. 80

81 Σχήμα Φυλογενετικό δέντρο που βασίζονται στη 16S rrna γονιδιακή ανάλυση γαλληλουχίας και απεικονίζει τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των ειδών των γενώνlactobacillus, Pediococcus και Paralactobacillus. Σε αυτή την αναπαράσταση, η φυλογενετική απόσταση μεταξύ των ταξινομικών κατηγοριών δίνεται από το άθροισμα των οριζοντίων διακλαδώσεων (μήκη). ( Felis και Dellaglio 2007). 81

82 Σχήμα (Συνέχεια) Φυλογενετικό δέντρο που βασίζονται στη 16S rrna γονιδιακή ανάλυση αλληλουχίας και απεικονίζει τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των ειδών των γενών Lactobacillus, Pediococcus και Paralactobacillus. Σε αυτή την αναπαράσταση, η φυλογενετική απόσταση μεταξύ των ταξινομικών κατηγοριών δίνεται από το άθροισμα των οριζοντίων διακλαδώσεων (μήκη). ( Felis και Dellaglio 2008). 82

83 Πίνακας Φυλογενετικές ομάδες σύμφωνα με τους Hammes και Hertel (2003), Dellaglio και Felis (2005), Felis και Dellaglio (2007) Ομάδες Hammes & Hertel (2003) Dellaglio & Felis (2005) Felis & Dellaglio (2007) L. delbrueckii L. acetotolerans, L. acidophilus, L. L. acetotolerans, L. acidophilus, L. amylolyticus, L. acetotolerans, L. acidophilus, L. amylolyticus, amylolyticus, L. amylophilus, L. amylovorus, L. amylophilus, L. amylovorus, L. L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. crispatus, L. delbrueckii, crispatus, L. delbrueckii, L. fornicalis, L. L. amylovorus, L. crispatus, L. delbrueckii, L. fornicalis, L. gallinarum, L. gasseri, gallinarum, L. gasseri, L. hamsteri, L. helveticus, L. fornicalis, L. gallinarum, L. gasseri, L. L. hamsteri, L. helveticus, L. iners, L. L. iners, L. intestinalis, L. jensenii, hamsteri, L. helveticus, L. iners, L. intestinalis, intestinalis, L. jensenii, L. johnsonii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. jensenii, L. johnsonii, L. kalixensis, L. kefiranofaciens, L. kefirgranum, L. kefirgranum L. kitasatonis, L. psittaci, L. kefiranofaciens, L. kitasatonis, L. psittaci, L. psittaci L. suntoryeus, L. ultunensis L. sobrius, L. ultunensis L. salivarius L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus, L. L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus, L. animalis, L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus*, L. animalis, L. aviarius, L. cypricasei, L. L. aviarius, L. cypricasei, L. equi, L. animalis, L. apodemi, L. aviarius, L. equi, equi, L. mali, L. murinus, L. nagelii, L. mali, L. murinus, L. nagelii, L. ruminis, L. L. mali, L. murinus, L. nageli, L. ruminis, L. ruminis, L. salivarius saerimneri, L. salivarius, L. satsumensis saerimneri, L. salivarius, L. satsumensis, L. vini L. reuteri group L. coleohominis, L. durianis, L. fermentum, L. antri, L. coleohominis, L. fermentum, L. antri, L. coleohominis, L. fermentum, L. frumenti, L. ingluviei, L. L. frumenti, L. gastricus, L. ingluviei, L. L. frumenti, L. gastricus, L. ingluviei, L. mucosae, L. oris, L. panis, L. pontis, mucosae, L. oris, L. panis, L. pontis, L. mucosae, L. oris, L. panis, L. pontis, L. L. reuteri, L. suebicus, L. thermotolerans, reuteri, L. thermotolerans, L. vaginalis (L. reuteri, L. secaliphilus, L. vaginalis L. vaccinostercus, L. vaginalis reuteri group-a) associated with L. durianis, L. vaccinostercus, L. suebicus, L. rossii (L. reuteri group-b) 83

84 Πίνακας (Συνέχεια) Φυλογενετικές ομάδες σύμφωνα με τους Hammes και Hertel (2003), Dellaglio και Felis (2005), Felis και Dellaglio (2007). Ομάδες Hammes & Hertel (2003) Dellaglio & Felis (2005) Felis & Dellaglio (2007) L. buchneri L. buchneri, L. diolivorans, L. ferintoshensis, L. buchneri, L. diolivorans, L. ferintoshensis, L. buchneri, L. diolivorans, L. farraginis, L. fructivorans, L. hilgardii, L. hilgardii, L. kefiri, L. parabuchneri, L. hilgardii, L. kefiri, L. parabuchneri, L. L. homohiochii, L. kefiri, L. kunkeei, L. parakefiri (L. buchneri group-a) parafarraginis, L. parakefiri L. lindneri, L. parabuchneri, L. parakefiri, associated with associated with L. sanfranciscensis L. fructivorans, L. homohiochii, L. lindneri, L. acidifarinae, L. namurensis, L. spicheri, L. sanfranciscensis (L. buchneri group-b) and L. zymae (which form a robust group) L. alimentarius, L. farciminis, L. L. alimentarius-l. farciminis kimchii, L. mindensis, L. nantensis, L. paralimentarius, L. tucceti, L. versmoldensis L. casei group (cas) L. casei, L. manihotivorans, L. pantheris, L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus, L. L. paracasei, L. rhamnosus, L. zeae (L. casei group-a) zeae sharpeae, L. zeae L. manihotivorans, L. pantheris, L. sharpeae (L. casei group-b) L. sakei group (sakei) L. curvatus, L. fuchuensis, L. L. curvatus, L. fuchuensis, L. graminis, graminis, L. sakei L. sakei sakei L. plantarum L. alimentarius, L. arizonensis, L. L. arizonensis, L. collinoides, L. paraplantarum, (plan) collinoides, L. farciminis, L. kimchii, L. pentosus, L. plantarum (L. L. malefermentans, L. mindensis, L. plantarum group-a) paralimentarius, L. paraplantarum, L. associated with L. alimentarius, L. pentosus, L. plantarum, L. versmoldensis farciminis, L. kimchii, L. mindensis, L. paralimentarius, L. versmoldensis (L. plantarum group-b) L. curvatus, L. fuchuensis, L. graminis, L. L. plantarum, L. paraplantarum, L. pentosus 84

85 3.3. Ο ρόλος των LAB στην τυροκομία Το γάλα είναι ένα πλούσιο θρεπτικά μέσο όπου περιλαμβάνει πολλές μικροβιακές ομάδες πολλά από αυτά μπορεί να είναι παθογόνα, αλλοιογόνα αλλά και χρήσιμα βακτήρια για τον άνθρωπο και τα τρόφιμα. Στα χρήσιμα βακτήρια συγκαταλέγονται και τα LAB τα οποία και απομονώνονται συνήθως σε σημαντικές συγκεντρώσεις από τα τρόφιμα (Franciosi και συν. 2009α). Είναι φυσικό συστατικό του γάλακτος θα μπορούσαμε να πούμε, διότι βρίσκονται παντού καθ όλη τη διαδικασία συλλογής του γάλακτος καθώς και στο μαστό του ζώου (Eneroth και συν. 1998, Mc Phee και Griffiths 2002). Πολλά είδη που ανήκουν στα γένη Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus και Streptococcus συχνά απομονώνονται από νωπό γάλα (Franciosi και συν α, Wouters και συν. 2002). Τα LAB μπορεί να παίζουν διαφορετικούς ρόλους στην τυροκομία: μερικά είδη συμμετέχουν στη διαδικασία της ζύμωσης, ενώ κάποια άλλα εμπλέκονται στη διαδικασία της ωρίμανσης του τυριού. Στην πρώτη περίπτωση, τα LAB ζυμώνουν γρήγορα τη λακτόζης και παράγουν υψηλές ποσότητες γαλακτικού οξέος, τα στελέχη αυτά ορίζονται ως starter LAB (SLAB), ενώ τα LAB που είναι υπεύθυνα για τη διαδικασία της ωρίμανσης αναφέρονται ως μη-εκκινητές LAB (NSLAB). Η ομάδα των SLAB περιλαμβάνει κυρίως στελέχη Lactococcus lactis και Leuconostoc spp., καθώς και Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii και helveticus Lactobacillus (Fox και συν. 2004). Η ομάδα των NSLAB είναι ιδιαίτερα ετερογενείς μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται τα εξής στελέχη:

86 Lactobacillus farciminis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus parabuchneri Lactobacillus brevis (Gobbetti και συν. 2002, Coeuret και συν και συν. Svec και συν. 2005). Τα είδη που δεν ανήκουν στο γένος Lactobacillus στα NSLAB απομονώνονται συνήθως κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης στο τυρί και είναι τα εξής στελέχη: Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium και επίσης Leuconostocs με την ίδια στελέχη να ενεργούν και ως καλλιέργειες εκκίνησης (Chamba και Irlinger, 2004). Η εξέλιξη των SLΑB και NSLAB σε τυρί από νωπό γάλα φαίνεται στο σχήμα Τα SLAB είναι σε υψηλό αριθμό (περίπου cfu / g) κατά την έναρξη της ωρίμανσης και μειώνεται κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης μέχρι δύο λογαριθμικούς κύκλους (Beuvier και Buchin, 2004, Franciosi και συν. 2008). Αντίθετα τα NSLAB είναι παρόντα σε χαμηλά επίπεδα κατά της πρώτες μέρες της ωρίμανσης αλλά αυξάνονται κατά τη διάρκεια αυτής (Fox και συν. 2004)

87 Σχήμα Εξέλιξη των SLAB (κενές στήλες) και NSLAB (μαύρες στήλες) κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης του τυριού Puzzone di Moenaί. ( Franciosi και συν. 2008). Η παρουσία των NSLAB εισάγει μεταβλητότητα στη διαδικασία της ωρίμανσης που δεν μπορεί να ελεγχθεί εύκολα από τον τυροκόμο, έτσι, πολλά τυριά μπορούν να υπόκεινται σε διακυμάνσεις στα τελικά τους χαρακτηριστικά (Franciosi και συν. 2008): μεταξύ του εργοστασίου διαφορές (Antonsson και συν. 2003, De Angelis και συν. 2001), διαφορές μεταξύ των τυριών που παράγονται στο ίδιο εργοστάσιο, με διαφορετικές ημέρες και μεταξύ των τυριών από διάφορες δεξαμενές των ίδιων ημερών (Fitzsimons και συν. 1999, Williams και συν. 2002). Για όλους αυτούς τους λόγους τα NSLAB είναι ζωτικής σημασίας για την ελαχιστοποίηση της διακύμανσης των χαρακτηριστικών του τυριού κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Τα NSLAB είναι αυτά τα οποία καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό τα

88 οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τελικού προϊόντος (Beresford και Williams, 2004) Η συμβολή των NSLAB στην ωρίμανση του τυριού Βασικό ρόλο στην ωρίμανση του τυριού παίζουν τα ένζυμα που απελευθερώνονται από τα SLΑB και NSLAB ή / και άλλων μικροοργανισμών που υπάρχουν εκ φύσεως στο γάλα (McSweeney, 2004 α, Upadhyay και συν. 2004) ή στο περιβάλλοντα χώρο του τυροκομείου. Για το λόγο αυτό, είναι δυνατόν να τροποποιηθεί ή να επιταχυνθεί η διαδικασία της ωρίμανσης του τυριού από την αύξηση του επιπέδου αυτών των ενζύμων (Upadhyay και συν. 2007). Η πρωτεόλυση στο τυρί είναι ύψιστης σημασίας για την τελική υφή και γεύση του προϊόντος καθώς και για τα οργανοληπτικά του χαρακτηριστικά. Εκτός από την εναπομένουσα λακτόζη, που περιέχεται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, τα NSLAB χρησιμοποιούν υδατάνθρακες προερχόμενα από τα γλυκομακροπεπτιδία των καζεΐνων και των γλυκοπρωτεϊνών που βρίσκονται στις μεμβράνες των λιπιδίων και τα ετεροζυμωτικά NSLAB μπορούν να ζυμώσουν και τις πεντόζες. Γενικότερα μπορούμε να πούμε ότι τα πεπτίδια και τα αμινοξέα αποτελούν τις κύριες διατροφικές ενώσεις για τα NSLAB (Fox και συν. 2004). Η τελική γεύση στο τυρί είναι αποτέλεσμα της δράσης πολλών ενζύμων. Σε γενικές γραμμές, τα LAB διαθέτουν ένα πολύπλοκο πρωτεολυτικό ενζυμικό σύστημα, λόγω των αναγκών τους σε αμινοξέα (McSweeney, 2004β). ιαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στην αποικοδόμηση των καζεΐνων και των πεπτιδίων, που οδηγεί στην παραγωγή των ελεύθερων αμινοξέων

89 (FAA). Τα παραγόμενα αμινοξέα έτσι συμβάλλουν άμεσα στη βασική γεύση του τυριού, δεδομένου ότι είναι πρόδρομες ουσίες και για άλλες καταβολικές αντιδράσεις, που έχουν σαν αποτέλεσμα την παραγωγή πτητικών ενώσεων που συμβάλουν στο τελικό άρωμα του τυριού. Από αυτές τις αντιδράσεις παράγονται κετοξέα, αμμωνία, αμίνες, αλδεϋδες, οξέα και αλκοόλες, οι οποίες είναι βασικοί παράγοντες για τη γεύση και το άρωμα του τυριού (Hemme και συν. 1981). Τα NSLAB διαθέτουν ένα μεγάλο αριθμό υδρολυτικών ένζυμών και ως εκ τούτου έχουν τη δυνατότητα να συνεισφέρουν στην ωρίμανση του τυριού (Williams και Banks 1997). Αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν αξιολογήσει διάφορα στελέχη NSLAB μόνα τους ή σε συνδυασμό με SLAB, για την επίδραση που έχουν στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού. Σύμφωνα με τους Awad και συν. (2007) σε πείραμα που έγινε σε αιγυπτιακό γαλακτοκομικό προϊόν, δοκιμάσθηκε η παραγωγή του με την προσθήκη SLAB και συνδυασμό starter και NSLAB. Η υψηλότερη συνολική βαθμολογία στην ένταση της γεύσης, την υφή και την συνολική αποδοχής του τυριού έλαβαν τα δείγματα στα οποία είχε προστεθεί NSLAB (Lb. helveticus, Lb. paracasei subsp. paracasei, Lb. delbrueckii subsp. lactis και E. Faecium). Τα συγκεκριμένα στελέχη έπαιξαν καθοριστικό ρόλο στη παραγωγή ελεύθερων αμινοξέων (FAA) και ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFA), που αμφότερα συμβάλλουν άμεσα ή έμμεσα στην γεύση του τυριού. Η προσθήκη του Lb. plantarum σε καλλιέργεια εκκίνησης έδειξε να έχει τα ίδια αποτελέσματα στο τυρί Manchego, (Poveda και συν. 2004), ενώ ο Lactobacillus reuteri βοήθησε μόνο στη παραγωγή πτητικών ελεύθερων λιπαρών οξέων παραγωγής

90 στο τυρί Edam (Tungjaroenchai και συν. 2004). Στελέχη Lb. casei subsp. rhamnosus, μαζί με Lc. Lactis επίσης ενίσχυσαν την πρωτεόλυση κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης σε χαμηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά Κεφαλογραβιέρα (Michaelidou και συν. 2003). Ωστόσο, μπορούμε να πούμε ότι το αποτέλεσμα μιας δεδομένων NSLAB μπορεί να είναι μεταβλητά ανάλογα με το είδος της SLAB που χρησιμοποιείται (Skeie και συν. 2008) Προβιοτικές καλλιέργειες Τα τελευταία χρόνια, οι καταναλωτές στρέφονται προς την κατεύθυνση των τροφών που περιέχουν προβιοτικούς μικροοργανισμούς (Playne και συν. 2003). Σύμφωνα με το De Vuyst (2000) η ελάχιστη συγκέντρωση προβιοτικού πρέπει να είναι 10 7 cfu /g ή ml για να εξασφαλιστούν οι ευνοϊκές επιπτώσεις στην υγεία των καταναλωτών. Τα ζυμούμενα γαλακτοκομικά προϊόντα έχουν μελετηθεί εκτενώς ως λειτουργικά τρόφιμα (Saxelin και συν. 2005). Μεταξύ αυτών, το τυρί έχει αποδειχθεί ότι είναι το βέλτιστο προϊόν για να μεταφέρει ζωντανούς προβιοτικούς μικροοργανισμούς στον ανθρώπινο οργανισμό. Το τυρί χαρακτηρίζεται από ένα στερεό σώμα, υψηλό ph, ρυθμιστική ικανότητα και περιέχει και σημαντική ποσότητα λίπους, τα οποία προστατεύουν τα βακτήρια πιο αποτελεσματικά στο να φτάσουν στο σημείο που θα δράσουν περνώντας από το γαστρεντερικό σύστημα του ανθρώπου (Ross και συν. 2002b). Σύμφωνα με τους da Cruz και συν. (2009) και Grattepanche και συν. (2008) που στις εργασίες τους ασχολούνται με τα NSLAB και επικεντρώνονται κυρίως στους

91 Lactobacillus και Enterococcus αναφέρουν ότι είναι σημαντικό τα προβιοτικά να διατηρούν τη βιωσιμότητά τους κατά τη διάρκεια της παρασκευής και αποθήκευσης του προϊόντος. Σύμφωνα με πειράματα που έγιναν από τους Aljewicz και συν. (2009) για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας του Lb. paracasei LPC-37 σε ελβετικού τύπου τυριά, διαπίστωσαν το βακτήριο έδειξε έντονη ανάπτυξη τις πρώτες δύο εβδομάδες κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης. Η θερμοκρασία αποθήκευσης είναι μια βασική μεταβλητή για τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού. Οι Vinderola και συν. (2009) αναφέρουν επιπλέον ότι τα προβιοτικά δεν επηρέαζαν αρνητικά τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά σε τυριά προερχόμενα από την Αργεντινή, όταν διατηρούνται στους 5 ο C, αλλά αν τα τυριά αποθηκεύονταν σε υψηλότερες θερμοκρασίες, οι προβιοτικοί μικροοργανισμοί θα επηρέαζαν ανεπιθύμητα τη γεύση του τυριού

92 4. Σκοπός της μελέτης Πειραματικός σχεδιασμός 4.1. Σκοπός της μελέτης Τα προβιοτικά βακτήρια και ιδιαίτερα τα στελέχη που ανήκουν στο γένος Lactobacillus έχουν συσχετισθεί με πληθώρα ευεργετικών επιδράσεων στην υγεία του ανθρώπου. Οι μικροοργανισμοί αυτοί αποτελούν μέρος της μικροχλωρίδας πολλών παραδοσιακών γαλακτοκομικών. Πολλές μελέτες έχουν διεξαχθεί για τα ελληνικά παραδοσιακά τυριά στο εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής Τροφίμων της Γεωπονικής Σχολής (Tzanetakis και Litopoulou- Tzanetaki 1992, Tzanetakis και συν. 1996, Hatzikamari και συν. 1998, Samolada και συν. 1998, Xanthopoulos και συν. 1998, 1999, Xanthopoulos και συν. 2000, Prodromou και συν. 2001, Psomas και συν. 2001, Mama και συν. 2002, Psoni και συν. 2006, 2007, Siafaras και συν. 2008), με αποτέλεσμα την απομόνωση και ταυτοποίηση πλήθος γαλακτικών βακτηρίων πολλά από τα οποία βρέθηκε να διαθέτουν και in vitro προβιοτικές ιδιότητες (Xanthopoulos και συν. 1998, 2000, Psomas και συν. 2001, Kourelis και συν. 2009). Σκοπός την παρούσα διατριβής ήταν η απομόνωση και ταυτοποίηση Lactobacillus από το Ελληνικό παραδοσιακό τυρί Μελίχλωρο και η μελέτη τεχνολογικών και προβιοτικών ιδιοτήτων των στελεχών. Για το σκοπό αυτό έγινε μία σειρά πειραμάτων για το χαρακτηρισμό: i. Ικανότητας οξινίσεως, ενζυμικής και πρωτεολυτικής δραστηριότητας

93 ii. Αντοχής in vitro σε χαμηλό ph, σε χολικά άλατα, σε παγκρεατικό υγρό καθώς και οι αντιμικροβιακές τους ιδιότητες, η πιθανή υποχοληστεριναιμική δράση το πλασμιδιακό τους προφίλ και η αντοχή τους στα αντιβιοτικά

94 4.2. Πειραματικός σχεδιασμός Συνολικά απομονώθηκαν, ταυτοποιήθηκαν και μελετήθηκαν 50 στελέχη γαλακτικών βακτηρίων από ώριμο Μελίχλωρο. Οι απομονώσεις των γαλακτικών βακτηρίων, ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους με φαινοτυπικές/βιοχημικές δοκιμές και με την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου και σε επίπεδο στελέχους με τον τυχαίο πολλαπλασιασμό πολυμορφισμό DNA με τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RAPD-PCR). Στη συνέχεια, τα ταυτοποιημένα στελέχη αξιολογήθηκαν ως προς μια σειρά προβιοτικών (αντοχή σε χαμηλό ph, σε χολικά άλατα, σε παγκρεατικό υγρό, αντιβακτηριακή δράση, αντοχή σε αντιβιοτικά και πιθανή υποχοληστεριναιμική δράση) και τεχνολογικών ιδιοτήτων (ικανότητα οξινίσεως, ενζυμική δραστηριότητα και πρωτεολυτική δράση). Έγινε επίσης και μελέτη του πλασμιδιακού προφίλ επιλεγμένων στελεχών. Για όλες τις δοκιμές πραγματοποιήθηκαν δύο επαναλήψεις, εκτός περιπτώσεων που πραγματοποιήθηκε μόνο μία

95 - 95 -

96 Πειραματικό μέρος

97 - 97 -

98 5. Υλικά και μέθοδοι 5.1. Πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων Για την εκπλήρωση του αντικειμενικού σκοπού της εργασίας εξετάσθηκαν συνολικά πέντε ώριμα τυριά από δύο διαφορετικά τυροκομεία και από διαφορετικές τυροκομήσεις το καθένα (Πίνακας ). Τα δείγματα αγοράσθηκαν από την αγορά της Θεσσαλονίκης. Πίνακας Πηγές απομόνωσης γαλακτικών βακτηρίων Τυροκομείο Δείγμα Χρόνος ωρίμανσης (μήνες) Ι Α 5 Ι Β 5 Ι Ι Γ 3 Ι Ι Δ 3 Ι Ι Ε Μικροβιολογικές και χημικές και αναλύσεις Μικροβιολογικές αναλύσεις Με ασηπτικό τρόπο ζυγίζονταν 20 γραμμάρια δείγματος τυριού μέσα σε τρυβλίο και προσθέτονταν σε 180 ml αποστειρωμένου διαλύματος κιτρικού νατρίου 2% όπου και ομογενοποιούνταν σε συσκευή Stomacher 400 (Lab-Blender, Seward, London, UK) για δύο λεπτά. Στο ομογενοποιημένο δείγμα γίνονταν οι κατάλληλες δεκαδικές αραιώσεις σε αποστειρωμένο διάλυμα κιτρικού νατρίου 2% και εμβολιάζονταν στη συνέχεια σε τρυβλία με τα κατάλληλα θρεπτικά υποστρώματα

99 Στο πίνακα δίνονται οι ομάδες βακτηρίων που καταμετρήθηκαν, τα ανάλογα υποστρώματα και οι συνθήκες επώασης. Πίνακας Βακτηριακές ομάδες που καταμετρήθηκαν, τα αντίστοιχα υποστρώματα και οι ανάλογες θερμοκρασίες και οι χρόνοι επώασης. Θερμοκρασία Χρόνος Βακτηριακές ομάδες Υποστρώματα ( 0 C) (d,h) 1. Ολική μεσόφιλη χλωρίδα Plate Count Άγαρ (PCA) 30 0 C, 72h 2. Εντεροβακτηριοειδή Violet Red Bile Glucose Άγαρ 37 0 C, 24h (VRGBA) 3. Κολοβακτηριοειδή Violet Red Bile Άγαρ (VRBA) 30 0 C, 24h 4. Ζύμες, PotatoDextrose Άγαρ (PDA) 25 0 C, 5d με 10% ταρταρικό οξύ 5. Σταφυλόκοκκοι Baird Parker egg yolk (BP) 37 0 C, 48h 6. Συνολικός αριθμός γαλακτικών βακτηρίων (LAB) MRS άγαρ 30 0 C 5d 7. Λακτοβακίλλους Acetate Agar (AcA) 37 0 C 5d 8. Gram - κόκκους Nutrient Agar Crystal Violet 25 0 C 5d (NACV) 9. Εντερόκοκκοι Kanamicin, 37 0 C 72h 10. Gram + και καταλάση - κόκκους M17 agar 30 0 C 48h Στα υποστρώματα MRS και Μ17 άγαρ προστέθηκε ναταμικίνη σε συγκέντρωση 100 mgl -1 για την αποφυγή ανάπτυξης ζυμών. Μετά την επώαση των τρυβλίων στις κατάλληλες θερμοκρασίες ανάπτυξης, γινόταν καταμέτρηση των αποικιών (log 10 cfu/gr) και ο υπολογισμός του μέσου όρου των τιμών και από τα πέντε δείγματα του Μελίχλωρο για κάθε υπόστρωμα. Όλα τα θρεπτικά υποστρώματα ήταν των εταιριών Merck και Oxoid και βρίσκονται στο Παράρτημα

100 Χημικές αναλύσεις Μέτρηση του ph των τυριών. Για την μέτρηση του ρη ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: δέκα γραμμάρια δείγματος τυριού ζυγίζονταν σε ποτήρι ζέσεως και ομογενοποιούνταν με 50 ml αποσταγμένο νερό θερμοκρασίας 45 C με τη βοήθεια υάλινης ράβδου σε κωνική φιάλη, όπου και συμπληρώνονταν με νερό μέχρι τα 100ml. Ακολουθούσε μέτρηση του ph με εμβάπτιση του ηλεκτροδίου στο διάλυμα του τυριού με τη βοήθεια ηλεκτρονικού πεχάμετρου (Hanna instruments, Padova, Italy) Προσδιορισμός της υγρασίας των τυριών. Για τον προσδιορισμό της υγρασίας των τυριών ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία: τοποθετούνταν σε πορσελάνινη κάψα γυάλινη ράβδος και περίπου 10 gr άμμος και ακολουθούσε ξήρανση σε κλίβανο στους C για περίπου 30min, εν συνεχεία ακολουθούσε ψύξη της κάψας σε ξηραντήρα, ζύγιση και καταγραφή του βάρους του (Α). Ακολούθως ζυγίζονταν 1 gr λειοτριβιμένου δείγματος μέσα στην κάψα (Β) και ακολουθούσε προσθήκη 3 σταγόνων οξικού οξέος πάνω από το δείγμα. Η κάψα με το δείγμα μεταφέρονταν σε κλίβανο C όπου αφήνονταν για 24 ώρες. Μετά την ξήρανση η κάψα αφήνονταν να κρυώσει σε ξηραντήριο για περίπου 20-30min. Έπειτα η κάψα με το περιεχόμενο ζυγίζονταν (Γ). Η υγρασία του δείγματος του τυριού υπολογίζονταν από τον τύπο:

101 Στερεό υπόλειμμα Υγρασία 1 - {(Β - Γ)/(Β - Α)} 1 - Στερεό Υπόλειμμα Προσδιορισμός ΝaCl Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας του τυριού σε NaCl ακολουθήθηκε η μέθοδος του Cornel. Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζονταν 10 g δείγματος και με την βοήθεια μίξερ ομογενοποιούνταν καλά με 50 ml νερό θερμοκρασίας 60 0 C. Το μίγμα μεταφέρονταν σε ογκομετρικό κύλινδρο και συμπληρώνονταν με ζεστό νερό ως τα 250 ml,ανακινούνταν και αφήνονταν σε ηρεμία για 30 λεπτά. Εν συνεχεία λαμβάνονταν 25 ml του υπερκείμενου υγρού και τοποθετούνταν σε κωνική φιάλη όπου προστίθετο 2 ml δείκτη χρωμικού καλίου 2%. Ακολουθούσε ογκομέτρηση με διάλυμα νιτρικού αργύρου (0,171N) ως ότου ο καστανός χρωματισμός να παραμείνει για τουλάχιστον 10 sec. 1ml δια/τος AgNO 3 (0,171N) 1% αλάτι στο δείγμα Προσδιορισμός λίπους Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας του τυριού σε λίπος ακολουθήθηκε η ογκομετρική μέθοδος του Gerber van Gulik (ISO, 1975). Η μέθοδος στηρίζεται στη μη διαλυτοποίηση του λίπους με την προσθήκη θειικού οξέος. Με την προσθήκη θειικού οξέος ορισμένης πυκνότητας στο δείγμα, διαλύονται όλα τα συστατικά του εκτός από το λίπος. Η θερμότητα που εκλύεται κατά την

102 ανάμιξη, ρευστοποιεί το λίπος το οποίο διαχωρίζεται σε ανώτερη στοιβάδα μέσα στο οξύ μετά από φυγοκέντρηση με αμυλική αλκοόλη. Τρία γραμμάρια δείγματος θερμοκρασίας 20 0 C ζυγίζονταν σε βουτυρόμετρο με δύο ανοίγματα, τοποθετούνταν ο υποδοχέας του βουτυρόμετρου και από το μικρό άνοιγμα προστίθετο θειικό οξύ (d = 1,53), όσο χρειάζονταν για να σκεπαστεί το τυρί. Το βουτυρόμετρο κλείνονταν με λαστιχένιο πώμα και θερμαίνονταν σε υδατόλουτρο στους 65 0 C με ελαφριά ανακίνηση, μέχρι να διαλυθούν τελείως οι πρωτεΐνες του δείγματος (t = 30 min, απόκτηση χρώματος μωβ). Ακολουθούσε αλαφρά ανακίνιση με την προσθήκη 1 ml αμυλικής αλκοόλης (d = 0,815) και εν συνεχεία προσθήκη τόσο θειικού οξέος (d = 1,53) μέχρι τα ¾ του λαιμού του βουτυρόμετρου. Το βουτυρόμετρο πωματίζονταν, ανακατεύονταν καλά και τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο στους 65 0 C για περίπου 10 min, ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 10 min σε θερμαινόμενη φυγόκεντρο ( rpm), και επανατοποθέτηση σε υδατόλουτρο για 10 min. Τέλος είχαμε την ανάγνωση των αποτελεσμάτων εκφρασμένη σε g λίπους /100 g τυριού Προσδιορισμός ολικού αζώτου Για το προσδιορισμό του ολικού αζώτου εφαρμόσθηκε η μέθοδος Kjeldahl. (Kjeldahl, 1883 ) Αρχή μεθόδου: Η μέθοδος βασίζεται στην αποσύνθεση των οργανικών ουσιών με θειικό οξύ και βρασμό. Οι αρχικές μορφές αζώτου μετατρέπονται εξ ολοκλήρου σε αμμωνιακό άζωτο. Οι μη αζωτούχες οργανικές ενώσεις οξειδώνονται σε CO 2 και H 2 O. Οι

103 αζωτούχες οργανικές ενώσεις ανάγονται σε NH 3, σχηματίζοντας ακολούθως (NH 4 ) 2 SO 4, που είναι σταθερό σε υψηλές θερμοκρασίες. Κατά την απόσταξη, η NH 3 απελευθερώνεται σε αλκαλικό περιβάλλον και παγιδεύεται σε διάλυμα οξέος γνωστής συγκέντρωσης (0,1Ν). Μετά το πέρας της απόσταξης, το οξύ που δεν έχει εξουδετερωθεί από την NH 3, τιτλοδοτείται με διάλυμα αλκάλεως γνωστής συγκέντρωσης (0,1Ν). Ο CuSO 4 προστίθεται ως καταλύτης, ενώ το Κ 2 SO 4 αυξάνει το σημείο βρασμού και έτσι επιταχύνεται η αντίδραση.(όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.2) Τεχνική: 1. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΟΣ: Σε κύλινδρο Kjeldahl που περιείχε 1,56 g CuSO 4 *5 H 2 O και 12 g Κ 2 SO 4, 20 ml H 2 SO 4 και μπίλιες γυάλινες μεταφέρθηκε 1g δείγματος ζυγισμένο σε ηθμό. Για το πρότυπο δείγμα χρησιμοποιήθηκε 0,2 g L- τρυπτοφάνης και για το τυφλό προσδιορισμό χρησιμοποιήθηκε ίση ποσότητα με το δείγμα αποσταγμένου νερού. 2. ΚΑΥΣΗ ΨΥΞΗ: Σταδιακή θέρμανση του μίγματος σε τμήμα καύσης Kjeldahl, ξεκινώντας από C ως C, μέχρι τo χρώμα να γίνει διαυγές τυρκουάζ, λόγω περίσσειας CuSO 4. Σε ζωηρό βρασμό αφήνεται για περίπου 50 min. Ακολουθεί ψύξη σε θερμοκρία περιβάλλοντος για περίπου 60 min. 3. ΑΠΟΣΤΑΞΗ: Η απόσταξη του μίγματος γίνεται με την προσθήκη 60 ml H 2 O και 130 ml νατρόρρυμα (NaOH 30%), εν συνεχεία το απόσταγμα (100 ml) συγκεντρώνεται σε κωνική φιάλη 250 ml, που περιέχει 50 ml H 2 SO 4 (0,1N) και 4 σταγόνες δείκτη Tachiro, ή ερυθρό μεθυλίου (0,5%)

104 4. ΤΙΤΛΟ ΟΤΗΣΗ: Η τιτλοδότηση του όξινου αποστάγματος έγινε με διάλυμα NaOH (0,1N) (Το διάλυμα γένεται άχρωμο). Ο υπολογισμός του ολικού αζώτου (ΤΝ) δίνεται από τον τύπο: ΤΝ = [(ml H 2 SO 4 - ml NaOH) δείγμα (ml H 2 SO 4 - ml NaOH) τυφλό ] x0,0014/g => TN = [(50- ml NaOH) δείγμα (50- ml NaOH) τυφλό ] x 0,0014/2 => TN % ξ.ο τυριού = [(50- ml NaOH) x 0,14] / [200/(100 + Y)] Για το πρότυπο δείγμα Try = 13,55% ± 0,15% Y = υγρασία τυριού, g = βάρος δείγματος τυριού Και ο υπολογισμός της πρωτεΐνης δίνεται από τον τύπο ( οι πρωτεΐνες του γάλακτος περιέχουν κατά μέσο όρο 15,5 % Ν): ΠΡΩΤΕΙΝΗ = 6,38 x TN Προσδιορισμός λιπόλυσης (ADV) Ως Acid Degree Value (ADV) ορίζεται ο αριθμός των mg ΚΟΗ που απαιτούνται για την εξουδετέρωση 1g λίπους. Για τον προσδιορισμό της λιπόλυσης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Deeth και Fitz-Gerald (1976). Τεχνική: Σε ποτήρι ζέσεως ζυγίζονταν 10g τυριού, προσθέτονταν 32,5ml διαλύματος κιτρικού*3να 2% για την γαλακτωματοποίηση του δείγματος και τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο 60 0 C. Εν συνεχεία μεταφέρονταν 33,5ml γαλακτωματοποιημένου δείγματος σε φιάλη Badcock και αναμιγνύονταν με 10ml διαλύματος Triton + Calgon. Η ανάμιξη

105 γινόταν με απαλές κυκλικές κινήσεις της φιάλης (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.3). Η φιάλη θερμαίνονταν σε υδατόλουτρο 95 0 C με ταυτόχρονη ανάδευση για περίπου 10 min και έπειτα 10 min σε ηρεμία μέσα στο υδατόλουτρο. (Η στάθμη του νερού στο υδατόλουτρο έπρεπε να καλύπτει τη στήλη του βουτυρόμετρου). Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 2 λεπτά και τοποθέτηση σε υδατόλουτρο στους 60 0 C. Μετά από 5 λεπτά προστίθετο 50% διάλυμα μεθανόλης μέχρι το λίπος να ανέβει στο λαιμό της φιάλης. Ακολουθούσε πάλι φυγοκέντρηση για 3 λεπτά και τοποθέτηση σε υδατόλουτρο για 5 λεπτά στους 60 0 C. Εάν το λίπος ήταν σε γαλακτώδη μορφή, τότε η δοκιμή απορρίπτονταν. Ζυγίζονταν 0,2g λίπους σε μικρή κωνική φιάλη. Προσθέτονταν 5,5ml διαλύτη λίπους και 5 σταγόνες δείκτη φαινολοφθαλεΐνης 1%. Παράλληλα χρησιμοποιούνταν και τυφλό με εφαρμογή μόνο διαλύτη λίπους, η ογκομετρούμενη ποσότητα του οποίου αφαιρούνταν από κάθε δείγμα. Τέλος, το δείγμα τιτλοδοτούνταν με διάλυμα ΚΟΗ 0,0179Ν μέχρι την εμφανή αλλαγή του χρώματος σε ιώδες. Παράλληλα προσδιορίζονταν μάρτυρας με εφαρμογή μόνο διαλύτη λίπους. Το αποτέλεσμα εκφραζόταν ως Acid Degree Value. Υπολογισμοί: ADV = Ν α / Ν θ x [ml διαλύματος ΚΟΗ ml τυφλού] / βάρος λίπους (gr) Ν α = ακριβής κανονικότητα του διαλύματος ΚΟΗ, Ν θ = θεωρητική κανονικότητα διαλύματος ΚΟΗ (0.0179Ν)

106 Για τον προσδιορισμό της ακριβούς κανονικότητας του διαλύματος ΚΟΗ, ποσότητα περίπου 0,5gr όξινου φθαλικού καλίου (C 8 H 5 KO 4 potassium hydrogen phthalate PHPh) ξηραίνεται στους C για 2h. Ποσότητες 0,03g ζυγίζονται εις τριπλούν και διαλύονται η κάθε μία σε 5ml νερό. Τα κανονικά αυτά διαλύματα τιτλοδοτούνται με διάλυμα ΚΟΗ (0,0179Ν), χρησιμοποιώντας 5 σταγόνες δείκτη φαινολοφθαλεϊνης 1%. Η ακριβής κανονικότητα του αλκάλεως [Ν(ΚΟΗ)] υπολογίζονταν από τον τύπο: Ν = (βάρος PHPh) / (ml ΚΟΗ x 0,20323) Πρωτεολυτική δραστηριότητα. Από τις διεργασίες ωρίμανσης των τυριών η πιο πολύπλοκη, μακρόχρονη και εκτεταμένη είναι η πρωτεόλυση, μια σύνθετη ενζυμική διαδικασία, η οποία αρχίζει με την προσθήκη της πυτιάς και των καλλιεργειών εκκίνησης στο προς τυροκόμηση γάλα. Κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης οι καζεΐνες υδρολύονται με την συνδυασμένη δράση της χυμοσίνης, των ενζύμων των καλλιεργειών και των ενδογενών ενζύμων του γάλακτος, σε μικρομοριακά υδατοδιαλυτά πεπτίδια και αμινοξέα. Η πρωτεολυτική δραστηριότητα στα δείγματα των τυριών εκτιμήθηκε με την φασματοφωτομετρική μέθοδο της ο- φθαλδιαλδεΰδης (ο-ρα) σύμφωνα με τους Church και συν. (1983). Η ο-φθαλδιαλδεΰδη (ο-ρα) αντιδρά με τη β-μερκαπτοαιθανόλη και τις πρωτοταγείς αμίνες που απελευθερώνονται κατά την

107 υδρόλυση των πρωτεϊνών και σχηματίζουν ένα σύμπλοκο (1- αλκυλθείο-2-αλκυλισοϊνδόλη), που απορροφά έντονα στα 340nm. Τεχνική: Ζυγίζονταν 5g τυριού και μεταφέρονταν σε δοκιμαστικό σωλήνα. Ως τυφλό, χρησιμοποιούνταν 5g παστεριωμένου πλήρους γάλακτος. Εφόσον η συγκέντρωση της γλυκίνης στο δείγμα ήταν >1150 (όριο γραμμικότητας), το δείγμα αραιώνονταν σε βαθμό που εξαρτάται από το βαθμό πρωτεόλυσης του εξεταζόμενου τυριού. Στον υπολογισμό της συγκέντρωσης γλυκίνης λαμβάνονταν υπόψη η αραίωση. Στο δείγμα, προσθέτονταν 10ml τριχλωροξικού οξέος (TCA) 18%, ώστε η τελική του συγκέντρωση στο δείγμα να είναι 12% και ακολουθούσε ισχυρή ανάδευση σε vortex. Έπειτα τα δείγματα αφήνονταν σε ηρεμία για 15min και ακολουθούσε και πάλι ισχυρή ανάδευση. Στη συνέχεια 1ml δείγματος μεταφέρονταν σε σωλήνες τύπου eppendorf και ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 5min στις στροφές στους 4 0 C. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, το υπερκείμενο υγρό (όπου υπάρχουν τα ελεύθερα αμινοξέα) μεταφέρονταν σε άλλο καθαρό σωλήνα eppendorf. Σ αυτό το σημείο η μέθοδος μπορεί να διακοπεί και τα δείγματα να διατηρηθούν στην κατάψυξη (-18 0 C) μέχρι την ημέρα της ανάλυσης. Κατά την ανάλυση, παραλαμβάνονταν 150μl του υπερκείμενου υγρού (κάτω όμως από την επιφανειακή στοιβάδα λίπους που πιθανώς να εμφανιστεί), προσθέτονταν 3ml πρόσφατα παρασκευασμένου διαλύματος ο-ρα και ακολουθούσε καλή ανάδευση σε vortex. Έπειτα από ακριβώς 2min παραμονής σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, προσδιορίζονταν η οπτική πυκνότητα (OD 340 ) του δείγματος στα 340nm σε

108 φασματοφωτόμετρο (Shimadzu UV , Shimadzu Biotech Corporation, Newcastle, UK). Από την οπτική πυκνότητα του δείγματος αφαιρούνταν εκείνη του τυφλού (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.4.) Πρότυπη καμπύλη: Η συγκέντρωση των αμινοξέων εκφραζόταν ως μg γλυκίνης ανά g δείγματος (ppm L-glycine) σύμφωνα με πρότυπη καμπύλη (σχήμα ) που κατασκευάστηκε με γνωστές συγκεντρώσεις γλυκίνης και δίνεται από τον τύπο: Gly (ppm) = 210,49 (A 340nm ) 310,2. Πραγματοποιήθηκαν 2 επαναλήψεις για κάθε δείγμα. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης, εφαρμόστηκε ακριβώς η ίδια μέθοδος για μια σειρά πρότυπων διαλυμάτων γλυκίνης με συγκεντρώσεις 0, 40, 120, 160, 250 και 500 μl σε 4 g γάλακτος. Οι συγκεντρώσεις εκφράστηκαν σε ισοδύναμα γλυκίνης. Η πρότυπη καμπύλη σχεδιάστηκε με τη βοήθεια του προγράμματος Microbial Origin 6.0 (1999). Πραγματοποιήθηκαν 3 επαναλήψεις για κάθε συγκέντρωση γλυκίνης. Συγκέντρωση πρότυπου διαλύματος γλυκίνης (ppm) y = 210,49x - 310, Ποσότητα μητρικού διαλύματος γλυκίνης (μl) Σχήμα Πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις γλυκίνης εκφρασμένη σε ppm L-γλυκίνης

109 5.3. Απομόνωση και ταυτοποίηση γαλακτικών βακτηρίων με βιοχημικές μεθόδους Απομόνωση και διατήρηση στελεχών Η απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων γινόταν από τρυβλία με AcΑ, απ όπου παίρνονταν με κρίκο δέκα απομονώσεις από κάθε δείγμα. Η διαδικασία η οποία ακολουθήθηκε ήταν η μεταφορά των μεμονωμένων αποικιών από κάθε τρυβλίο σε MRS ζωμό και η επώαση τους για μία ημέρα στους 30 C. Έπειτα, γινόταν καθαρισμός των αποικιών με streak σε MRS άγαρ με επίστρωση σε κάθετες γραμμές και επώαση στους 30 C. Την επόμενη ημέρα, μεμονωμένες αποικίες μεταφέρονταν σε MRS ζωμό και επωάζονταν στους 30 C για 24 ώρες. Οι καθαρές απομονώσεις Gram θετικών και αρνητικών στην καταλάση ραβδιών και κόκκων, διατηρούνταν σε MRS ζωμό με γλυκερόλη (70:30) στους 80 C (παράρτημα 10.5.). Για τη δραστηριοποίησή τους πραγματοποιούνταν δύο διαδοχικές ανακαλλιέργειες σε κατάλληλο ζωμό πριν από κάθε δοκιμή. Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε όλη τη διάρκεια της έρευνας προέρχονταν από την εταιρία Oxoid (Oxoid Ltd., Hampshire, Αγγλία) και Merck (Darmstadt, Germany) εκτός ορισμένων περιπτώσεων που αναφέρονται διαφορετικά. Τα στελέχη αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη ανήκουν στις παρακάτω διεθνείς συλλογές μικροοργανισμών: ATCC: American Type Culture Collection. Rockville, Maryland (ΗΠΑ)

110 LMG: Laboratorium voor Microbiologie Gent, Culture Collection. Gent (Βέλγιο) NCFB (πρώην NCDO): National Collection of Food Bacteria. AFRC Institute of Food Research, Reading, Berkshire (Αγγλία)

111 Ταυτοποίηση των απομονώσεων με φυσιολογικές και βιοχημικές δοκιμές Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν σύμφωνα με τις μεθόδους και τα κριτήρια των Fintzmons και συν. (1999), Bergey's Manual (2010), Curk και συν. (1996) Χρώση Gram Ο μορφολογικός διαχωρισμός των απομονώσεων γινόταν με χρώση Gram. Τεχνική: Μια σταγόνα απιονισμένου νερού τοποθετούνταν σε αντικειμενοφόρο πλάκα και από το θρεπτικό ζωμό που ήταν ανεπτυγμένο το στέλεχος λαμβανόταν ασηπτικά κύτταρα βακτηρίων με βακτηριολογικό κρίκο και δημιουργούνταν κατά το δυνατόν ένα ομοιογενές γαλάκτωμα Στη συνέχεια η σταγόνα εξαπλώνεται στην κεντρική περιοχή της αντικειμενοφόρου πλάκας με τη βοήθεια του βακτηριολογικού κρίκου. Το παρασκεύασμα ξηραίνονταν και έπειτα μονιμοποιούνταν περνώντας την αντικειμενοφόρο πλάκα πάνω από τη φλόγα λύχνου, χωρίς όμως να υπερθερμανθεί. Η μονιμοποίηση ολοκληρώνεται όταν το παρασκεύασμα στεγνώσει. Επί του παρασκευάσματος προστίθενται μερικές σταγόνες Crystal Violet και η χρωστική αφήνεται να δράσει για 1 min. Το κρυσταλλικό ιώδες χρωματίζει βαθύ κυανό χρώμα όλα ανεξαιρέτως τα βακτηριακά κύτταρα. Στη συνέχεια απομακρύνεται η περίσσεια της χρωστικής με νερό και το παρασκεύασμα καλυπτυονταν για 1 min με διάλυμα Lugol. Το παρασκεύασμα ξεπλένεται με αλκοόλη και στη συνέχεια με άφθονο νερό. Στο στάδιο αυτό τα θετικά κατά Gram κύτταρα διατηρούν το κυανό

112 χρώμα, τα υπόλοιπα αποχρωματίζονται. Μετά η πλάκα βαφόταν με διάλυμα Carbol Fuchsin 10% για 30 δευτερόλεπτα και η χρώση ολοκληρώνονταν με πλύσιμο της πλάκας με νερό και στέγνωμα με διηθητικό χαρτί. Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση σε μεγέθυνση Χ100 (με ελαιοκατάδυση). Τα θετικά κατά Gram φαίνονται στο οπτικό πεδίο χρωματισμένα μπλε, ενώ τα αρνητικά κατά Gram φαίνονται ροζ (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.6.) οκιμή παραγωγής καταλάσης Σκοπός της δοκιμής είναι να ελεγχθεί εάν το βακτήριο διαθέτει ή όχι το ένζυμο καταλάση. Η καταλάση είναι υπεύθυνη για την διάσπαση του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) σε οξυγόνο και νερό. Τεχνική: Τα στελέχη αναπτύσσονταν σε πλάγιο MRS άγαρ με 0,5% γλυκόζη σε 30 C για 24 ώρες. Μικρή ποσότητα καλλιέργειας μεταφερόταν με τη βοήθεια κρίκου σε αντικειμενοφόρο πλάκα και αναμιγνυόταν με μία σταγόνα διαλύματος Η 2 Ο 2 (3% β/ο). Έκλυση φυσαλίδων οξυγόνου δήλωνε θετική δοκιμή (τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.7.) οκιμή ανάπτυξης σε διάφορες θερμοκρασίες Ελέγχθηκε η ικανότητα της ανάπτυξης των στελεχών στους, 15 C και 45 C. Εμβολιαζόταν καλλιέργεια 24 ωρών σε 10 ml ζωμό MRS (εμβόλιο 1% β/ο), επωαζόταν στις κατάλληλες θερμοκρασίες σε κλίβανο (15 C για μια εβδομάδα και 45 C για

113 ημέρες) και ελεγχόταν για ανάπτυξη, χρησιμοποιώντας πάντα τυφλό (Schillinger και Lucke 1987) οκιμή παραγωγής CO 2 από γλυκόζη Μερικά βακτήρια έχουν την ικανότητα να ζυμώνουν τη γλυκόζη και να παράγουν CO 2. ραστηριοποιημένη καλλιέργεια των στελεχών εμβολιαζόταν σε σωλήνες που περιείχαν λιωμένο MRS άγαρ και εμπλουτισμένο με 5% γλυκόζη. Μετά τον εμβολιασμό, προστίθετο σε κάθε σωλήνα άγαρ 2%, σε ύψος 2 εκατοστών περίπου, για δημιουργία αναερόβιων συνθηκών. Ακολουθούσε επώαση στους 30 C μέχρι και 15 ημέρες. Παραγωγή CO 2 από γλυκόζη ανασήκωνε το άγαρ που προστέθηκε μετά τον εμβολιασμό (Schillinger και Lucke 1987) οκιμή παραγωγής αμμωνίας από αργινίνη 5ml υποστρώματος Niven εμβολιάζονταν (1%) με δραστική καλλιέργεια του στελέχους και επωάζονταν στην άριστη θερμοκρασία για 48 ώρες. Μετά το τέλος της επώασης προσθέτονταν το αντιδραστήριο Nessler (Merck). Η εμφάνιση καφέ χρωματισμού δήλωνε την παραγωγή αμμωνίας. (Schillinger και Lucke 1987) (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα 10.8.) Υδρόλυση εσκουλίνης Εμβολιάζονταν καλλιέργειες 24 ωρών σε δοκιμαστικούς με υπόστρωμα εσκουλίνης (εμβόλιο 1%, β/ο) και επωαζόταν στους 30 C για μία εβδομάδα. Οι καλλιέργειες ελεγχόταν καθημερινά για την αλλαγή χρώματος που σήμαινε την υδρόλυση της εσκουλίνης

114 Σκούρο χρώμα έδειχνε ότι η δοκιμή ήταν θετική. (Παράρτημα 10.9.) Έλεγχος ανάπτυξης σε 2%,4% και 6,5% NaCl ραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (1% εμβόλιο) σε ζωμό MRS που περιείχε την αντίστοιχη συγκέντρωση NaCl και επωάζονταν σε κλίβανο 30 C για 3 ημέρες (Schillinger και Lucke 1987) Παραγωγή οξέος από ζάχαρα. Η ταξινόμηση σε είδος πραγματοποιήθηκε με τη ζύμωση σακχάρων. Για τα στελέχη που προσδιορίστηκαν ότι ανήκουν στο γένος Lactobacillus, ελέγχθηκε η παραγωγή οξέως από διάφορα σάκχαρα όπως: ραμνόζη, κελοβιόζη, μελιβιόζη, μαννιτόλη, ραφινόζη και ριβόζη, μαννόζη και γλυκόζη. Τεχνική: Η ζύμωση των σακχάρων πραγματοποιήθηκε σε αποστειρωμένα τρυβλία με πολλαπλά βοθρία (multiwell plates; Greiner Labor Technik, Frickenhausen, Germany), σύμφωνα με τη μεθοδολογία API (BioMerieux, Montalieu-Vercieu, France) η οποία περιγράφεται παρακάτω. Τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε MRS ζωμό (30 0 C για 24h) και έπειτα εμβολιάζονταν σε πλάγιο MRS agar με 0,5% γλυκόζη (30 0 C για 24h). Την ημέρα του εμβολιασμού δημιουργούνταν εναιώρημα κυττάρων με 3 ml απεσταγμένου νερού ισοδύναμο με την κλίμακα Mac Farland No 4. Ταυτόχρονα, γεμίζονταν οι πλάκες με 200μl βασικό υπόστρωμα σακχάρων (παράρτημα ) και 50μl διάλυμα σακχάρου 10%. Από το εναιώρημα κυττάρων εμβολιάζονταν 50μl από το κάθε στέλεχος

115 για κάθε σάκχαρο και από πάνω καλύπτονταν με μία σταγόνα αποστειρωμένου παραφινέλαιου. Ακολουθούσε επώαση στους 30 0 C για 24 και 72h. Σε θετική δοκιμή το υπόστρωμα από μωβ γινόταν κίτρινο, ένδειξη ότι ο μικροοργανισμός παράγει οξύ από το σάκχαρο, ενώ σε αρνητική δοκιμή παρέμενε μωβ. Τα σάκχαρα τα οποία εξετάσθηκαν ήταν τα εξής: ραμνόζη, κελοβιόζη, μελιβιόζη, μαννιτόλη, ριβόζη, ραφφινόζη, μαννόζη, γλυκόζη, μελεζιτόζη και λακτόζη επίσης σε δύο από τις πενήντα απομονώσεις εξετάσθηκαν και η αραβινόζη, η ξυλόζη, η μαλτόζη, η γαλακτόζη και η τρεχαλόζη

116 5.4. Ταυτοποίηση των απομονώσεων με SDS-PAGE των πρωτεϊνών του εσωκυτταρικού εκχυλίσματος του όλου κυττάρου Είναι η πιο αξιόπιστη μέθοδος για το διαχωρισμό και ανάλυση πρωτεϊνικών δειγμάτων. Αρχή μεθόδου: Η βασική αρχή στηρίζεται στο φαινόμενο κατά το οποίο φορτισμένα μόρια και σωματίδια, μέσα σε υδάτινα διαλύματα και κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου, κινούνται προς την κατεύθυνση του ηλεκτροδίου με το αντίθετο φορτίο. Λόγω των διαφορετικών φορτίων και μαζών, τα διάφορα μόρια θα κινηθούν με διαφορετικές ταχύτητες (κινητικότητα). Η κινητικότητα αυτή εξαρτάται από την σταθερά pk και το μοριακό βάρος του φορτισμένου σωματιδίου ενώ άλλοι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την κινητικότητα είναι το ph και η συγκέντρωση του ρυθμιστικού διαλύματος (buffer), η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, η θερμοκρασία καθώς και η φύση του υλικού μέσα στο οποίο γίνεται η ηλεκτροφόρηση. Τεχνική: Η SDS-ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιούταν σύμφωνα με τη μέθοδο του Laemmli (1970), τροποποιημένη από τους Kiredjian και συν. (1986), με σκοπό την ταξινόμηση των 50 απομονώσεων των λακτοκτοβακίλλων σε επίπεδο είδους. Οι απομονώσεις ανακαλλιεργήθηκαν σε MRS ζωμό στους 30 C για 24 ώρες. Στη συνέχεια εμβολιάστηκαν (1% εμβόλιο) σε σωληνάκια των 20 ml σε MRS ζωμό και επωάστηκαν στους 30 C για 24 ώρες. Τα κύτταρα των λακτοβακίλλων συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση (4,000 g, 10 min, 4 C). Μετά τη φυγοκέντρηση απορρίφθηκε το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα που

117 σχημάτιζαν τα κύτταρα ξεπλύθηκε με 10ml διαλύματος KH 2 PO 4 (0,01M ph=7,0). Ακολούθησε φυγοκέντρηση ξανά στις 4000 στροφές/λεπτό για 10 λεπτά, απόρριψη υπερκείμενου και ακόμη ένα ξέπλυμα με 10ml διαλύματος KH 2 PO 4. Το τελικό ξέπλυμα των κυττάρων έγινε με 5ml διαλύματος KH 2 PO 4, φυγοκέντρηση στις 4000 στροφές/λεπτό για 10 λεπτά και απόρριψη υπερκείμενου. Έπειτα, στην τελική βιομάζα προστέθηκε 1 ml διαλύματος KH 2 PO 4 και ακολούθησε καλή ανατάραξη σε vortex στην υψηλότερη ταχύτητα. Τα κύτταρα με το υγρό μεταφέρθηκαν σε eppedorf των 1,5ml. Στη συνέχεια η φυγοκέντρηση διεξήχθη σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις στροφές/λεπτό για 10 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο υγρό απορρίφθηκε από το eppedorf. Στο ίδιο eppedorf με τη βιομάζα (~0,150 g ξηρό βάρος) προσθέτονται σφαιρίδια διαμέτρου 0,1mm ποσότητας 0,150g και ακολουθεί μηχανικό σπάσιμο στην ειδική συσκευή τύπου vortex (Vortex-Genie 2T, Scientific Industries, Inc., NY, USA) σε υψηλή ταχύτητα (6-7) για 4 λεπτά. Έπειτα προστίθεται 1ml διαλύματος KH 2 PO 4 και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο στις στροφές/λεπτό για 10 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο κυτταρικό εκχύλισμα συλλέγεται προσεκτικά σε καθαρό eppedorf και διατηρείται στην κατάψυξη μέχρι να αναλυθεί. Το πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κυτταρικών εκχυλισμάτων προσδιορίστηκε σύμφωνα με τους Lowry και συν. (1951), όπως ακολουθεί:

118 1. Το eppedorf με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα αναδεύεται σε vortex 2. 0,5ml δείγματος μεταφέρεται σε σωλήνα με πορτοκαλί βιδωτό πώμα 3. Προστίθενται 0,7ml διαλύματος Lowry (παράρτημα 4.6) 4. Το σωληνάκι αναδεύεται πολύ λίγο σε χαμηλή ταχύτητα 5. Παραμονή σε ηρεμία για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι 6. Τα τελευταία 2 λεπτά παρασκευάζεται το διάλυμα Folin (παράρτημα 4.6) 7. Προστίθεται στα σωληνάκια 0,1ml διαλύματος Folin 8. Αναδεύονται γρήγορα σε υψηλή ταχύτητα σε vortex 9. Παραμονή σε ηρεμία για μισή ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι 10. Μετά το πέρας της μισής ώρας αναδεύονται για λίγο στο vortex 11. Το δείγμα μεταφέρεται σε κυβέτα του 1ml και μετράται η απορρόφηση στα 500nm. Αφού προσδιοριστεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών του κυττάρου του μικροοργανισμού, προσδιορίζεται η κατάλληλη ποσότητα εμβολίου και οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται με θέρμανση, μερκαπτοαιθανόλη και δωδεκυλοξυθεϊικό νάτριο (SDS) και ακολουθεί η ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE με διαστάσεις πηκτής 141x160x1.5mm. Η μερκαπτοαιθανόλη σε υψηλές θερμοκρασίες διασπά τους δισουλφιδικούς δεσμούς της πρωτεΐνης, το SDS προσδίδει ανά δύο υπολείμματα αμινοξέων αρνητικό φορτίο

119 Συνεπώς, οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται μόνο με βάση το μέγεθός τους καθώς περνούν από τους πόρους της πηκτής. Για την παρασκευή δυο πηκτών διαχωρισμού (12%Τ, 2,67%C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 26,8ml δις απεσταγμένο νερό, 20ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού, 32ml διάλυμα μονομερών ακρυλαμιδίου και δις-ακρυλαμιδίου (monomer solution), 0,8ml υδατικό διάλυμα SDS, 280μl υπερθειϊκό αμμώνιο APS, και 40μl TEMED. Το ακρυλαμίδιο πολυμερίζεται παρουσία N,N-μεθυλενο-δις-ακρυλαμιδίου (bis) με το οποίο σχηματίζει πλέγμα. Ως καταλύτης πολυμερισμού χρησιμοποιείται το υπερθειϊκό αμμώνιο σε συνδυασμό με Ν,Ν, Ν, Ντετραμεθυλαιθυλενοδιαμίνη (TEMED). Τα παραπάνω υλικά αναδεύονται ήπια και προστίθενται αμέσως και μονομιάς 25ml του διαλύματος ανάμεσα στις πλάκες, ώστε να φτάσει το ύψος της πηκτής από τη βάση των πλακών στα 12,6cm. Στη συνέχεια, επιστρώνεται πάνω από το διάλυμα της πηκτής ορισμένη ποσότητα ισοπροπανόλης (2ml), ώστε να επιτευχθεί επίπεδη επιφάνεια και αναερόβιες συνθήκες. Η παρουσία περίσσειας οξυγόνου εμποδίζει τον πολυμερισμό. Το επάνω μέρος των πλακών καλύπτεται με παραφίλμ για την αποφυγή εισόδου του αέρα και εξάτμισης της ισοπροπανόλης και οι πηκτές παραμένουν σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου μια ώρα, ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Μετά το πέρας του απαιτούμενου χρόνου, απορρίπτεται η ισοπροπανόλη, ξεπλένεται η πηκτή με απεσταγμένο νερό τρεις φορές και επιστρώνεται με 1,6ml αραιωμένου στο ¼ ρυθμιστικού διαλύματος πηκτής διαχωρισμού το οποίο περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής διαχωρισμού,

120 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Παραμονή της πηκτής σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 18 ώρες. Στη συνέχεια απομακρύνεται το υπερκείμενο υγρό και ξεπλένεται η πηκτή δύο φορές με απεσταγμένο νερό. Οι πλάκες αναστρέφονται σε διηθητικό χαρτί ώστε να στεγνώσουν. Έπειτα προετοιμάζεται η πηκτή συσσώρευσης. Για την παρασκευή δυο πηκτών συσσώρευσης (πηκτή συσσώρευσης, 5%Τ, 2,67%C bis ) αναμιγνύονται με τη σειρά, 11,3ml δις απεσταγμένο νερό, 5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 3,4ml monomer solution, 0,2ml υδατικό διάλυμα SDS, 100μl APS, 25μl TEMED και αναδεύονται ήπια. Έπειτα, προστίθεται αμέσως ανάμεσα στις πλάκες, αφού προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί τα χτένια (πάχους 1,5mm 20 θέσεων), τόση ποσότητα ώστε η στάθμη να φτάσει το πάνω όριο των τζαμιών. Παραμονή σε θερμοκρασία δωματίου για περίπου 30 λεπτά ώστε να ολοκληρωθεί ο πολυμερισμός. Ακολούθως, απομακρύνονται με προσοχή τα χτένια και οι «τσέπες» που σχηματίζονται, γεμίζονται με αραιωμένο στο ¼ ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, το οποίο περιέχει 2,5ml ρυθμιστικό διάλυμα πηκτής συσσώρευσης, 0,1ml SDS και 7,4ml απεσταγμένο νερό. Πριν από τον εμβολιασμό των πηκτών με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα, το υγρό απομακρύνεται από τις τσέπες που ξεπλένονται δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής και τελικά πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής. Με τη βοήθεια μικροσύριγγας, εμβολιάζεται ο κάθε υποδοχέας (τσέπη) με την κατάλληλη ποσότητα εμβολίου, η οποία κυμαίνεται από 10-20μl και εξαρτάται από τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο εκχύλισμα. Το εμβόλιο περιέχει πρωτεϊνικό

121 εκχύλισμα και ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος σε ίσο όγκο, (STB, 2% SDS, 0,001% μπλε βρωμοφαινόλης). Οι ακριανοί υποδοχείς δεν εμβολιάζονται, παραμένουν κενοί ή πληρώνονται με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος. Ανά 4 υποδοχείς εμβολιάζεται το εκχύλισμα πρότυπου στελέχους (Psychrobacter immobilis LMG 1125). Το Psychrobacter immobilis χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της επαναληψιμότητας των συνθηκών της ηλεκτροφόρησης έχει όμως και ένα δεύτερο σημαντικό λειτουργικό ρόλο, χρησιμοποιείται παράλληλα ως στέλεχος αναφοράς για την απαιτούμενη ευθυγράμμιση των ζωνών των πηκτών κατά την επεξεργασία τους στο λογισμικό πρόγραμμα Gel Compar. Αμέσως μετά τον εμβολιασμό, πληρώνεται η κάτω δεξαμενή με το ρυθμιστικό διάλυμα και η συσκευή με τις στερεωμένες πηκτές βυθίζεται στην δεξαμενή. Γεμίζεται αργά η πάνω δεξαμενή με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα και συνδέεται η μονάδα της ηλεκτροφόρησης με την ψύξη και το ρευματοδότη. Η ένταση του ηλεκτρικού ρεύματος είναι σταθερή στα 12mA (6mA/πηκτή) και η τάση ελεύθερη. Η ηλεκτροφόρηση διαρκεί περίπου 18 ώρες (παραμονή όλο το βράδυ) και το μέτωπό της διανύει απόσταση περίπου 9,5cm από την πηκτή διαχωρισμού. Μόλις ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση, ακολουθεί στερέωση των πρωτεϊνών σε διάλυμα TCA 10% για περίπου 2 ώρες. Οι πηκτές ανακινούνται σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το διάλυμα TCA και προστίθεται το διάλυμα χρώσης (0,25% Coomasie Blue R-250 σε 50% v/v μεθανόλη και 10v/v οξικό οξύ) και οι πηκτές χρωματίζονται για 12 ώρες υπό ανακίνηση σε μηχανή γραμμικής ανάδευσης. Έπειτα, απομακρύνεται η χρωστική και οι πηκτές αποχρωματίζονται σε

122 διάλυμα 25%(v/v) μεθανόλης και 10% (v/v) οξικού οξέως για 3 ώρες. Μετά τον αποχρωματισμό, οι πηκτές φωτογραφίζονται και μπορούν να διατηρηθούν σε διάλυμα οξικού οξέος 10% (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα ) Η ψηφιακή καταγραφή, η διευθέτηση των πρωτεϊνικών προφίλ και η ομαδοποίηση τους κατά συστάδες έγινε με τη μέθοδο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages), χρησιμοποιώντας τον συντελεστή συσχέτισης (r) του Pearson, όπως περιγράφεται από τους Pot και συν. (1993), με την εφαρμογή του λογισμικού προγράμματος GEL COMPAR (ver. 4.0, Applied Maths, Βέλγιο) (Vauterin και Vauterin 1992) Ταυτοποίηση σε επίπεδο στελέχους με τη RAPD-PCR Η μέθοδος RAPD-PCR περιγράφεται αρχικά από τους Williams και συν., (1990) και αποτελεί μία από τις μεθόδους μοριακής τυποποίησης, η οποία θεωρητικά δύναται να εφαρμοστεί σε οποιονδήποτε οργανισμό. Η εφαρμογή της αφορά την ανίχνευση πολυμορφισμών στο γενετικό υλικό ως αποτέλεσμα ενίσχυσης τυχαίων τμημάτων DNA (Perez και συν. 1998). Βασίζεται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χωρίς όμως να είναι απαραίτητη η γνώση αλληλουχίας τμήματος του υπό ανάλυση DNA (Power 1996). Αρχή μεθόδου: Η αρχή της βασίζεται στη χρήση τυχαίων εκκινητών (primers), οι οποίοι αποτελούνται από μικρό αριθμό νουκλεοτιδίων (συνήθως 9 10 βάσεις). Οι εκκινητές τυχαίας αλληλουχίας υβριδίζονται με τα αντίστοιχα τμήματα του χρωμοσωμικού DNA σε χαμηλή θερμοκρασία επανασύνδεσης

123 εδομένων των πολυμορφισμών του γενετικού υλικού ανάλογα με το είδος του οργανισμού, ενισχύονται κάθε φορά διαφορετικά τμήματα DNA με αποτέλεσμα ανάλογα με τις συνθήκες αντίδρασης και την αλληλουχία του εκκινητή να λαμβάνεται ποικίλο αποτύπωμα ζωνών, διακριτό για κάθε οργανισμό (Olive και Bean 1999). Τεχνική: 1. Η εξαγωγή του DNA έγινε με τη μέθοδο του Querol et al, (1992). 1. Ανακαλλιέργεια σε MRS ζωμό (δύο φορές) 2. Μεταφορά 1,5 ml σε αποστειρωμένο eppendorf (2 για κάθε στέλεχος) 3. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 5-7 λεπτά Ένωση των δύο eppendorf. 4. Προσθήκη 100 μl διαλύματος ΤΕ (ph 7,4) με 50 mg ml -1 λυσοζύμη και καλή ανάδευση. Επώαση για 1 ώρα στους 37 ο C με ανάδευση στην μισή ώρα (λύση των κυττάρων) 5. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 8 λεπτά 6. Επαναδιάλυση του ιζήματος σε 500 μl διαλύματος 50mM Tris, 20 mm EDTA (ph 7.4) και καλή ανάμιξη 7. Προσθήκη 50 μl 10%SDS και επώαση στους 65 ο C για 30 λεπτά (διάυγαση του μείγματος λόγω της δράσης του SDS και της θερμότητας πάνω στις πρωτεΐνες και το κυτταρικό τοίχωμα του βακτηριακού κυττάρου) 8. Προσθήκη αμέσως 200 μl 5 Μ potassium acetate (καθίζηση των παραπάνω) Τοποθέτηση σε πάγο για 30 λεπτά 9. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 20 λεπτά

124 10. Προσεκτική μεταφορά της υπερκείμενης φάσης που περιέχει το DNA σε νέο αποστειρωμένο eppendorf 11. Προσθήκη ίσης ποσότητα κρύας (-20 ο C) ισοπροπανόλης και απαλή ανακίνηση (καθίζηση του DNA) Παραμονή 5 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 12. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 15 λεπτά 13. Απομάκρυνση της ισοπροπανόλης και προσθήκη κρύας αιθανόλης 70% στο ίζημα και επαναδιάλυση του 14. Φυγοκέντρηση σε στροφές για 5 λεπτά Καλή απομάκρυνση της αιθανόλης 15. Ενυδάτωση του DNA σε 100 μl ΤΕ διαλύματος 16. Συντήρηση στους -20 ο C μέχρι την ημέρα της ανάλυσης 2. Ποσοτικοποίηση και έλεγχος καθαρότητας του DNA Λαμβάνονταν 10 μl δείγματος και αραιώνονταν 70 φορές με 690 μl αποστειρωμένο νερό υψηλής καθαρότητας. Μετριόταν η απορρόφηση στα 260nm και 280nm σε φασματοφωτόμετρο. Η τιμή της απορρόφησης στα 260nm χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του DNA με βάση τον τύπο: 1OD 260nm =50mg/μl. Η τιμή που προέκυπτε πολλαπλασιαζόταν με το 70 για να βρεθεί η πραγματική συγκέντρωση. Ο λόγος της απορρόφησης 260/280 nm χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο της καθαρότητας του DNA. Επίσης, η καθαρότητα και η ποιότητα του DNA ελέγχθηκε και με ηλεκτροφόρηση οριζόντια με αγαρόζη (0.8%)

125 3. Αντίδραση RAPD-PCR Η αντίδραση της RAPD-PCR έγινε σύμφωνα με τους Andrighetto και συν. (2001b). Χρησιμοποιήθηκαν δύο εκκινητές, ο Μ14 (5 GAGGGTGGGGCCGTT 3 ) και ο Coc (5 AGCAGCGTGG 3 ). Οι συνθήκες για τον Μ14 ήταν οι εξής: 35 κύκλοι με 1 λεπτό στους 94 ο C, 20 δευτερόλεπτα στους 40 ο C και τέλος 2 λεπτά στους 72 ο C με ρυθμό αύξησης θερμοκρασίας 0.6 ο C ανά δευτερόλεπτο (Zapparoli και συν. 2000). Οι συνθήκες για τον Coc ήταν: 40 κύκλοι με ένα λεπτό στους 90 ο C και έπειτα ένα λεπτό στους 29 ο Cκαι δύο λεπτά στους 72 ο C (Cocconselli και συν. 1995). Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι εξής: 1μΜ εκκινητή, 200μΜ βάσεις δεοξυριβονουκλεοτιδίων, 1x ρυθμιστικού διαλύματος της Taq Πολυμεράσης και 2 μονάδες ενζύμου Taq Πολυμεράση. Παρασκευάζονταν ένα μείγμα από τα παραπάνω συστατικά της αντίδρασης (master mix) και διανέμονταν σε αποστειρωμένα μικρά eppendorf, 24 μl σε κάθε eppendorf. Έπειτα προσθέτονταν 1 μl από το DNA του κάθε δείγματος, συγκέντρωσης 80 ngμl -1 και σφραγίζονταν με σταγόνα αποστειρωμένου παραφινέλαιου. Η πολλαπλή αντιγραφή του DNA πραγματοποιήθηκε σε συσκευή PTC-100 Thermo Cycler (MJ Research Inc. Massachussets 02451, USA). Τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1,5%) σε 0,5x TBE buffer. Σε κάθε τσέπη φορτώνονονταν 10 μl προϊόν της RAPD-PCR με 5 μl χρωστικής. Σε τρεις διαφορετικές θέσεις φορτώνονταν και ένα πρότυπο μοριακών βαρών (DNA ladder 100 bp). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούταν σε σταθερή τάση 100 Volt και

126 ελεύθερη ένταση και σταματούσε όταν το μέτωπο διάνυε 10 εκατοστά. Οι πηκτές εμβαπτίζονταν σε διάλυμα βρωμιούχου εθιδίου για περίπου 30 λεπτά για χρωματισμό (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα ). Οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) υπό UV ακτινοβολία και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια ενός λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.0 (Applied Maths, Belgium). Ο υπολογισμός της ομοιότητας των προφίλ των προϊόντων της αντίδρασης RAPD-PCR και η ομαδοποίησή των στελεχών σε δενδρογράμματα, στηρίχθηκε στο συντελεστή συσχέτισης Pearson product moment correlation coefficient (r) και στον αριθμητικό αλγόριθμο UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Average linkages), Για να καθοριστεί το ποσοστό επαναληψιμότητας της μεθόδου, επιλέγεται τυχαία ένα στέλεχος, το DNA του οποίου απομονώνεται σε διαφορετικές παρτίδες και το επεξεργαζόμαστε (αντίδραση της RAPD-PCR και επεξεργασία των προϊόντων της αντίδρασης στο Gel compar) ως δύο διαφορετικά στελέχη. Παράλληλα όμως ελέγχονται και οι συνθήκες ηλεκτροφόρησης και η επαναληψιμότητά της, μέσω τυποποιημένου-προτύπου DNA (ladder), το οποίο ηλεκτροφορείται δίπλα στα προϊοντα της RAPD- PCR.To ladder χρησιμεύει για την επεξεργασία της εικόνας των προφίλ των στελεχών με το λογισμικό Gel Compar v

127 5.6. Αξιολόγηση των απομονώσεων ως προβιοτικά ιερεύνηση προβιοτικών ιδιοτήτων Ανάπτυξη σε χαμηλό ph. Για τον έλεγχο αντοχής σε χαμηλό ph των απομονώσεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Schillinger και Lucke (1987). ραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (2% β/ο) σε MRS ζωμό με ph 2,5, 3 και 6. Η ρύθμιση του ph του υποστρώματος γίνονταν μετά την αποστείρωση με 1N HCl. Οι απομονώσεις επωάζονταν στους 30 0 C για 48 h. Σε θετική δοκιμή παρατηρείται θόλωμα στο δοκιμαστικό σωλήνα που υποδηλώνει ανάπτυξη των στελεχών άρα αντοχή σε χαμηλό ph Αντοχή σε χαμηλό ph ραστηριοποιημένες καλλιέργειες (30 ml) φυγοκεντρούνταν (3000xg, 10 λεπτά, 4 C) και τα κύτταρα πλένονταν με αποστειρωμένο αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS, NaCl 0,8%; 0,1M; ph 7,2) και ακολούθως επαναιωρούνταν σε όγκο ίσο με το 1/10 της αρχικής καλλιέργειας (Conway και συν. 1987). Από το εναιώρημα, 0,3 ml εμβολιάζονταν σε 6 ml αποστειρωμένου αλατούχο φωσφορικού διαλύματος σε ph 3,0 (ρύθμιση με HCl) και ακολουθούσε αναερόβια επώαση σε 37 C. Τα ζωντανά κύτταρα αριθμούνταν μετά από 0, 1 και 2 ώρες. Η αρίθμηση των κυττάρων, γινόταν σε τρυβλία με ΜRS άγαρ στους 37 C, για 48 h

128 Ανάπτυξη σε χολικά άλατα. Για τον έλεγχο αντοχής σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων των απομονώσεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Johnson και συν ραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (1% β/ο) σε MRS ζωμό παρουσία oxgall (Ox-bile, Oxoid), σε συγκεντρώσεις 0,3 και 1%. Οι απομονώσεις επωάζονταν στους 30 0 C για 48 h. Σε θετική δοκιμή παρατηρείται θόλωμα στο δοκιμαστικό σωλήνα που υποδηλώνει ανάπτυξη των στελεχών άρα αντοχή σε χολικά άλατα Ανάπτυξη σε παγκρεατικό υγρό Για τον έλεγχο αντοχής σε περιβάλλον παρουσία παγκρεατικού υγρού των απομονώσεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Charteris και συν. (1998) ραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν (2% β/ο) σε φυσιολογικό ορό 0,5% παρουσία παγκρεατίνης 1. Οι απομονώσεις επωάζονταν στους 30 0 C για 48 h. Σε θετική δοκιμή παρατηρείται θόλωμα στο δοκιμαστικό σωλήνα που υποδηλώνει ανάπτυξη των στελεχών άρα αντοχή σε παγκρατικό υγρό Υδρόλυση χολικών αλάτων Για τον έλεγχο της υδρόλυσης των χολικών αλάτων των απομονώσεων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Cosson και Deschamps (1994). Από δραστηριοποιημένη καλλιέργεια λαμβάνονταν μία κρικιά και επιστρώνονταν σε πλάγιο MRS άγαρ και έπειτα επωάζονταν στους 30 0 C για 24 h. Από το πλάγιο MRS άγαρ λαμβάνονταν τμήμα της καλλιέργειας και τοποθετούνταν σε τρυβλίο με MRS άγαρ και 5 g/l taurodesoxycholate de

129 sodium. Ακολουθεί επώαση στους 30 0 C για 1 εβδομάδα. Σε θετική δοκιμή παρατηρείται θολή άλως γύρω από την αποικία, ένδειξη υδρόλυσης των χολικών αλάτων από τις απομονώσεις In vitro μείωση των επιπέδων χοληστερόλης Για τον προσδιορισμό της μείωσης των επιπέδων χοληστερόλης χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Pereira και Gibson (2002) με τροποποιήσεις (Kourelis και συν. 2010). Οι λακτοβάκιλλοι αναπτύχθηκαν σε MRS ζωμό που περιείχε 0,3% Oxgall και 400μg/ml υδατοδιαλυτής χοληστερόλης (Sigma) για 48h στους 30 0 C. Ανά 24 h γίνονταν λήψη 500 μl δείγματος καλλιέργειας στα οποία γίνονταν φυγοκέντρηση στις xg για 15 min ώστε να απομακρυνθούν τα κύτταρα των μικροβίων. Στο υπερκείμενο έγινε μέτρηση των επιπέδων χοληστερόλης με το εμπορικό σκεύασμα μέτρησης χοληστερόλης (Rndox Laboratories, UK), αναμιγνύοντας 100μl δείγματος και 900μl αντιδραστηρίου. Τα δείγματα επωάστηκαν για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου και η συγκέντρωση της χοληστερόλης προσδιορίστηκε με φωτομέτρηση στα 500nm. Ως τυφλός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό που περιείχε μόνο 0,3% Oxgall. Επίσης, θρεπτικό με 0,3% Oxgall και 400μg.ml χοληστερόλη επωάστηκε χωρίς μικροοργανισμό για τον έλεγχο αυθόρμητης διάσπασης της χοληστερόλης λόγω των συνθηκών ανάπτυξης. Ως θετικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε διάλυμα καθαρής χοληστερόλης της Randox

130 Αντοχή σε αντιβιοτικά Ο έλεγχος της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά έγινε με την μέθοδο της διάχυσης των αντιβιοτικών ουσιών στο υπόστρωμα (disc diffusion method),όπως περιγράφεται από τους Bauer κ.ά (1966). Αρχή μεθόδου. Η συγκέντρωση του αντιβιοτικού μειώνεται όσο η απόσταση από το δισκίο αυξάνεται. Μέθοδος: ραστηριοποιημένες καλλιέργειες αναπτύσσονταν σε πλάγιο άγαρ και τα κύτταρα απομακρύνονταν από την επιφάνεια με φυσιολογικό ορό (0,85% κ.β. ΝaCl). Εναιώρημα κυττάρων (0,5 κλίμακας McFarland) χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό, με επίστρωση, τρυβλίων με MRS άγαρ (Bauer και συν. 1966). Σε κάθε τρυβλίο τοποθετούνταν έως 4 δισκία (A/S Rosco, ανία), αντιβιοτικών: πενικιλλίνη, βανκομυκίνη, νεομυκίνη, αμπικιλίνη, ερυθρομυκίνη, καναμυκίνη, τετρακυκλίνη, ναλιδιξικό οξύ, χλωραμφενικόλη, γκεταμυκίνη, πολυμιξίνη Β, φουσιδικό οξύ και νοβομπιοσίνη. Aκολουθούσε επώαση των τρυβλίων σε 30 C για 24 ώρες και μέτρηση της διαμέτρου της ζώνης αναστολής γύρω από τα δισκία. Το διαφορετικό για κάθε αντιβιοτικό μέγεθος της ζώνης αναστολής που χρησιμοποιείται για να διακριθούν τα ανθεκτικά από τα ευαίσθητα στελέχη οφείλεται στη διαφορετική συγκέντρωση τού κάθε αντιβιοτικού και τον συντελεστή διάχυσής του στο άγαρ

131 Δραστηριοποιημένη καλλιέργεια Παρασκευή μικροβιακού εναιωρήματος 0.5 McF Επίστρωση 5-15min Μέτρηση διαμέτρων 30 C 15 min Σχήμα Μέθοδος διάχυσης δίσκων αντιβιοτικών σε άγαρ (Μέθοδος Kirby- Bauer, 1966) Αντιβακτηριακή δραστηριότητα Η αντιβακτηριακή δράση των στελεχών μελετήθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Kekessy και Piquet (1970). ραστηριοποιημένες καλλιέργειες εμβολιάζονταν σε ΜRS άγαρ με κρίκο (4 στελέχη σε κάθε τρυβλίο). Τα στελέχη δείκτες επωάζονταν στον κατάλληλο θρεπτικό ζωμό για 24 ώρες. Ύστερα από επώαση των εξεταζόμενων στελεχών λακτοβακίλλων στους 30 o C για 48 ώρες σε ΜRS άγαρ, με τη βοήθεια μιας αποστειρωμένης σπάτουλας, γινόταν αναστροφή του άγαρ μέσα στο τρυβλίο. Μια νέα αποστειρωμένη επιφάνεια άγαρ δημιουργούταν πάνω στην οποία επιστρωνόταν το στέλεχος δείκτης (1% εμβόλιο σε 5ml μαλακό άγαρ). Έπειτα από επώαση, τα τρυβλία ελέγχθηκαν για την ύπαρξη ζωνών αναχαίτισης της ανάπτυξης του στελέχους δείκτη. Η εκτίμηση της αντιβακτηριακής

132 δράσης προσδιοριζόταν με μέτρηση της διαμέτρου της ζώνης αναχαίτησης. Τα στελέχη δείκτες τα οποία εξετάσθηκαν ήταν τα εξής: B.cereus, S.aureus, Y.enterocolita, E. coli, Cl. Sporogenes, Cl. tyrobutyricum, Salmonella typhimurium, Lb. helveticus, S. thermophillus, Pediococcus pentosaceus, Candida albicaus (kk2.2), Candida alicaus (kk 2.5), Debazyomyces hansenii ιερεύνηση των τεχνολογικών ιδιοτήτων Έλεγχος της παραγωγής οξέος σε γάλα Μελετήθηκε η ικανότητα οξίνισης των λακτοβακίλλων σε γάλα. ραστηριοποιημένα στελέχη εμβολιάζονταν (1% εμβόλιο) σε 100 ml άπαχο αποστειρωμένο (121 ο C για 5 λεπτά) γάλα (παράρτημα ). Ο έλεγχος της παραγωγής οξέως γινόταν με την μέτρηση της τιμής του ph (πεχάμετρο: HANNA Instruments, Padova, Italy) μετά από 6, 16 και 24h στους 30 ο C Πρωτεολυτική δραστηριότητα Η πρωτεολυτική δραστηριότητα των στελεχών μελετήθηκε με τη μέθοδο της ο-ρα (o-φθαλδιαλδεΰδη) σύμφωνα με τους Church και συν. (1983). Τα στελέχη ανακαλλιεργήθηκαν δύο φορές σε άπαχο αποστειρωμένο (121 ο C για 5 λεπτά) γάλα (εμβόλιο 1%) και η τελική τους ανάπτυξη έγινε σε 50 ml άπαχο αποστειρωμένο (121 ο C για 5 λεπτά) γάλα (εμβόλιο 1%) και επώαση για 24 ώρες, 4 και 7 ημέρες στους 30 o C. H τεχνική της μεθόδου αναφέρεται στο υποκεφάλαιο

133 Η καζεϊνολυτική δραστηριότητα των στελεχών εκτιμήθηκε μετά από ανάπτυξη στο γάλα για 24 ώρες, 4 και 7 ημέρες σύμφωνα με τη μεθόδου UREA-PAGE (Andrews 1983). Μέθοδος: Τα στελέχη δραστηριοποιήθηκαν και εμβολιάστηκαν σε 50 ml αποστειρωμένης αποβουτυρωμένης ανασυσταμένης σκόνης γάλακτος και επωάστηκαν για 24 ώρες, 4 και 7 ημέρες στους 30 o C. Σε 0,5 ml από την τελική καλλιέργεια του δείγματος προσθέτονταν 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος 0,062 M Tris, 6M ουρία και 0,1Μ 2-μερκαπτοαιθανόλη και ακολουθούσε πολύ καλή ανάδευση. Από το διάλυμα αυτό 1ml μεταφέρθηκε σε σωλήνα eppendorf και προστέθηκαν 200 μl της χρωστικής δείκτη κυανούν της βρωμοφαινόλης. Τα δείγματα μπορούν να συντηρηθούν στην κατάψυξη μέχρι την ημέρα ανάλυσης. Παράλληλα με τα δείγματα, προετοιμάζονταν και τα δείγματα αναφοράς με τον ίδιο τρόπο (ανεμβολιάστη αποστειρωμένη αποβουτυρωμένη ανασυσταμένη σκόνη γάλακτος). Την ημέρα της ανάλυσης, παρασκευαζόταν η πηκτή συσσώρευσης (Τ = 4%, Cbis = 5%) και η πηκτή διαχωρισμού (T = 9%, Cbis = 5%,)και τα δείγματα υποβάλλονταν σε ηλεκτροφόρηση UREA-PAGE σε κάθετη συσκευή ηλεκτροφόρησης (2001, LKB, Bromma, Sweden) με πλάκες διαστάσεων 140x160x1.5 mm και ρυθμιστικό διάλυμα συσκευής με την εξής σύνθεση: Tris 0,025 M, Γλυκίνη 0,193 Μ και ph =8,3 (όλα τα αντιδραστήρια βρίσκονται στο παράρτημα ). Ο διαχωρισμός των προϊόντων πραγματοποιούνταν υπό σταθερή ένταση 60 ma ενώ η τάση αφηνόταν ελεύθερη μέχρι τη μέγιστη τιμή της, 500mA, έτσι ώστε το μέτωπο να διανύσει απόσταση περίπου 10 cm από την επιφάνεια επαφής των δύο πηκτών. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης,

134 ακολουθούσε η χρώση των πηκτών με χρωστική Coomasie Blue G-250 και ο αποχρωματισμός τους σε απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) και η επεξεργασία της εικόνας γινόταν με τη βοήθεια του λογισμικού προγράμματος Gel Compar v. 4.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium) Ενζυμικό σύστημα (ΑPI-ZYM) Tο ενζυμικό προφίλ των στελεχών μελετήθηκε με το σύστημα ΑΡI-ΖΥΜ (API Products, Bio-Merieux, Mercy l Etoile, Γαλλία), που επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό 19 ενζυμικών αντιδράσεων χρησιμοποιώντας μικρές ποσότητες δείγματος. Τα ένζυμα τα οποία εξετάσθηκαν καθώς και τα αντίστοιχα υποστρώματά τους παρουσιάζονται στο πίνακα Το σύστημα αποτελείται από πλακέτα με 20 μικροσωληνίσκους, στη βάση των οποίων περιέχεται το αφυδατωμένο ενζυμικό υπόστρωμα και ρυθμιστικό διάλυμα, τα αντιδραστήριο ΖΥΜ Α (25 g τρι-υδροξυλ-αμινομεθάνιο, 11 ml υδροχλωρικό οξύ 37%, 10 g θειϊκό λαυρύλιο, 100 ml αποσταγμένο νερό) και ΖΥΜ Β (0,35 g FastBlue BB, 100 ml 2- μεθοξυαιθανόλη) και χρωματικό χάρτη για την ανάγνωση των αποτελεσμάτων. Για την πραγματοποίηση της δοκιμής τα στελέχη ανακαλλιεργούνταν δύο φορές σε MRS ζωμό, σε άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης (30) για 24 ώρες και κατόπιν σε αντίστοιχο πλάγιο άγαρ για 24 ώρες. Τα κύτταρα συλλέγονταν σε 2 ml αποσταγμένο νερό για τη δημιουργία εναιωρήματος κυττάρων, θολερότητας 0,5 κλίμακας ΜcFarland. Ποσότητα 65 μl εναιωρήματος εμβολιαζόταν σε κάθε μικροσωληνίσκο και ακολουθούσε επώαση σε άριστη

135 θερμοκρασία ανάπτυξης για 4 ώρες, σε συνθήκες υψηλής υγρασίας. Υδρολυτική δράση των ενζύμων στα αντίστοιχα νάφθυλοπαράγωγα του υποστρώματος απελευθέρωνε β-ναφθόλη, η οποία ανιχνευόταν με την προσθήκη των ΖΥΜ Α και Β μετά το τέλος της επώασης (Arora και συν. 1990). Το χρώμα που αναπτυσσόταν μετά από 5 λεπτά συγκρινόταν με το χρωματικό χάρτη (σχήμα ) σύμφωνα με τις οδηγίες. Η ένταση του χρώματος βαθμολογούνταν από 0-5 και κάθε βαθμός αντιστοιχούσε σε ορισμένα nanomoles ενζύμου (το 1 σε 5 nmoles, το 2 σε 10, το 3 σε 20, το 4 σε 30 και το 5 σε 40 ή περισσότερα nmoles). Πίνακας Ένζυμα και τα αντίστοιχα υποστρώματα της μεθόδου API-ZYM (API Products, Bio-Merieux, Mercy l Etoile, Γαλλία) ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΕΝΖΥΜΟ 2-napthyl phosphate 2-napthyl butyrate 2-napthyl caprylate 2-napthyl myristate L-leucyl-2 napthylamide L-valyn - 2 napthylamide L-cystyl-2 napthylamide N-benzoyl-DL-arginine-2 napthylamide 2-napthyl phosphate 2-napthyl phosphate Naphtol-AS-BI-phosphate 6-Br-2-napthyl-aD-galactopyranoside 2-napthyl-βD-galactopyranoside Naphtol-AS-BI-glucoronide 2-napthyl-Αd-glucopyranoside 6-Br-2-napthyl-βD-glycopυranoside 1-napthyl-N-acetyl-βD-glucosaminide 6-Br-2-napthyl-αD-mannopυranoside 2-napthyl-αL-fucopyranoside Αλκαλική φωσφατάση Εστεράση(C4) Εστεράση/Λιπάση (C8) Λιπάση (C14) Αμινοπεπτιδάση λευκίνης Αμινοπεπτιδάση βαλίνης Αμινοπεπτιδάση κυστίνης Τρυψίνη Χυμοτρυψίνη Όξινη φωσφατάση Ναφθόλη-AS-BI-φωσφοϋδραλάση α-γαλακτοσιδάση β-γαλακτοσιδάση β-γλυκουρονιδάση α-γλυκοσιδάση β-γλυκοσιδάση Ν-ακέτυλο-β-γλυκοζαμινιδάση α-μαννοσιδάση α-φουκοσιδάση

136 Σχήμα Χρωματικός χάρτης για ανάγνωση των αποτελεσμάτων των ενζυμικών αντιδράσεων (API Products, Bio-Merieux, Mercy l Etoile, Γαλλία)

137 Έλεγχος πιθανής παθογόνου δράσης των στελεχών Έλεγχος τύπου αιμόλυσης Αιμόλυση είναι η λύση των ερυθροκυττάρων του αίματος από την πρωτεΐνη αιμολυσίνη που οδηγεί στην απελευθέρωση της αιμοσφαιρίνης από τα ερυθροκύτταρα. Μέθοδος: ραστηριοποιημένη καλλιέργεια εμβολιαζόταν με κρίκο σε Blood Agar Base, εμπλουτισμένο με αίμα ανθρώπου (10%). Ακολουθούσε επώαση σε 30 C για 48 ώρες. Παρατηρούνταν η ανάπτυξη στα τρυβλία και διακρίνονταν οι εξής τύποι αιμόλυσης (Brown 1919): - α-αιμόλυση, όταν η ανάπτυξη παρουσιάζει πρασινωπή απόχρωση, από την κυτταρική παραγωγή Η2Ο2 (Leveau και Bouix 1980). - β-αιμόλυση, όταν εμφανίζεται καθαρή ζώνη αιμόλυσης γύρω από την ανάπτυξη. - γ-αιμόλυση (αρνητική δοκιμή), όταν δεν παρατηρείται καμία δράση οκιμή υδρόλυσης ζελατίνης ραστηριοποιημένη καλλιέργεια εμβολιαζόταν με κρίκο σε τρυβλία που περιείχαν υπόστρωμα ζελατίνης (παράρτημα ). Γινόταν επώαση στους 30 0 C για 1 εβδομάδα. Έπειτα προστίθεντο πάνω στις καλλιέργειες το αντιδραστήριο Frazier. Σε θετική δοκιμή παρατηρούνταν καφέ διαυγής ζώνη γύρω από την αποικία, ενώ σε αρνητική δοκιμή όχι

138 οκιμή παραγωγής DNAάσης Η DNA-νουκλεάση υδρολύει το DNA του ξενιστή αυξάνοντας έτσι την παθογένεια του μικροοργανισμού. Ο έλεγχος DNAνουκλεάσων έγινε σύμφωνα με τη μέθοδο των Jeffries και συν. (1957). Μέθοδος: ραστηριοποιημένη καλλιέργεια εμβολιαζόταν με κρίκο σε τρυβλία που περιείχαν υπόστρωμα DNAάση άγαρ (παράρτημα ). Ακολουθούσε επώαση στους 37 0 C για 24-48h. Έπειτα προστίθεντο διάλυμα 1Ν HCl οξέος πάνω στις αποικίες. Σε θετική δοκιμή παρατηρούνταν διαυγής ζώνη γύρω από την αποικία, ενώ σε αντίθετη περίπτωση η δοκιμή λαμβανόταν ως αρνητική ιερεύνηση των βιοχημικών ιδιοτήτων Αφομοίωση κιτρικών Από δραστηριοποιημένη καλλιέργεια σε MRS ζωμό λαμβάνονταν κρικιά και επιστρώνονταν σε MRS άγαρ και επωάζονταν στους 30 0 C για 24 h. Λαμβάνονταν τμήμα της καλλιέργειας και επιστρώνονταν σε πλάγιο Simmons Citrate agar. Τα στελέχη επωάζονταν στους 30 0 C για 30 μέρες. Σε θετική δοκιμή το υπόστρωμα από πράσινο γίνονταν μπλε (Harrigan 1998) Παραγωγή εξωπολυσακχαριτών Για την παραγωγή εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Abdelhalim και συν. (2009)

139 Από δραστηριοποιημένη καλλιέργεια λαμβάνονταν κρικιά και τοποθετούνταν σε τρυβλία με τροποποιημένο MRS άγαρ με 5% σακχαρόζη. Τα στελέχη ελέγχονταν καθημερινά για παραγωγή slime στην επιφάνεια του υποστρώματος Παραγωγή διακετυλίου Για την παραγωγή διακετυλίου χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος των Sellars και Babel (1970). ραστηριοποιημένη καλλιέργεια εμβολιάζονταν σε αποστειρωμένο γάλα (1% β/ο). Από την δεύτερη ανακαλλιέργεια σε γάλα λαμβάνονταν 2 ml και αναμιγνύονταν με 1ml ΚΟΗ (30% διάλυμα) και 1ml διαλύματος που περοείχε 1 g κρεατίνη, 4g α- ναφθόλη, 10g αμυλική αλκοόλη και 50ml αιθυλική αλκοόλη. Μετά από έντονη ανακίνηση σε vortex τοποθετούνταν σε υδατόλουτρο στους 30 0 C για μισή ώρα όπου και ανακινούνατν για 5 λεπτά. Σε θετική δοκιμή το χρώμα του διαλύματος γίνονταν ροζκόκκινο ενώ σε αρνητική παραμένει ως έχει. Σημαντικό είναι οι δοκιμαστικοί σωλήνες που χρησιμοποιούνται να μην είναι κλειστοί από πάνω καθώς η παραγωγή διακετυλίου είναι χημική αποκαρβοξυλίωση η οποία ευνοείται από την ύπαρξη οξυγόνου. Άρα όσο μεγαλύτερη η επιφάνεια τόσο πιο έντονα θα γίνει η αντίδραση

140 5.7. Ανάλυση πλασμιδιακού προτύπου Απομόνωση πλασμιδιακού περιεχομένου Η απομόνωση του πλασμιδιακού περιεχομένου των απομονώσεων έγινε με τη μέθοδο των Anderson και McKay (1983) με τροποποιήσεις. Μέθοδος: 1. Ανακαλλιέργεια σε MRS ζωμό στους 30 ο C για 24 ώρες (δύο φορές) 2. Μεταφορά 1,5ml σε eppendorf (2 για κάθε στέλεχος) και φυγοκέντρηση ( στροφές, 4 ο C, 5 λεπτά) 3. Πολύ καλή απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού 4. Προσθήκη 379μl διαλύματος 6,7% σακχαρόζης, 50mM Tris, 1mM EDTA και ήπια ανακίνηση 5. Προσθήκη 95,5μl φρέσκου διαλύματος 20 mg ml -1 λυσοζύμης και επώαση για 2 ώρα στους 37 ο C. 6. Προσθήκη 50 μl διαλύματος ΤΕ (0.25Μ EDTA, 50mΜ Tris, ph=8) και 28 μl διαλύματος 20% SDS, 20 mm EDTA και 50mM Tris και ισχυρή ανακίνηση 7. Επώαση στους 37 ο C για περίπου μία ώρα. 8.Ένωση των δύο eppendorf σε ένα 9. Προσθήκη 28 μl φρέσκου διαλύματος 3Μ NaOH και ήπια ανακίνηση για 10 λεπτά. 10. Προσθήκη 50 μl 2 Μ Tris και απαλή ανακίνηση 11. Προσθήκη 71,7 μl 5 Μ NaCl και ήπια ανακίνηση (καθίζηση των πρωτεϊνών)

141 12. Προσθήκη 600 μl διαλύματος φαινόλης κορεσμένης σε 3% NaCl και ήπια ανακίνηση (με αναστροφή). Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές 13. Προσεκτική μεταφορά της επάνω φάσης σε νέο eppendorf. Επανάληψη 3 φορές (τουλάχιστον). 14. Προσθήκη 1 ml διαλύματος χλωροφορμίου με ισοαμυλική αλκοόλη (24:1) (απομάκρυνση της φαινόλης). Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές 15. Μεταφορά της επάνω φάσης σε καινούριο eppendorf 16. Προσθήκη 1 ml κρύας (-20 ο C) ισοπροπανόλης και τοποθέτηση των eppendorf στους -20 ο C για 1 ώρα. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές 17. Καλή απομάκρυνση υπερκείμενου υγρού και προσθήκη 700 μl 70% κρύας (-20 ο C) αιθανόλης. Ξέπλυμα του ιζήματος με μικροπιπέττα και φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στις στροφές 18. Καλή απομάκρυνση της αιθανόλης (τοποθέτηση σε κλίβανο 60 ο C για περίπου 1 ώρα) 19. Προσθήκη 20 μl διαλύματος ΤΕ (ενυδάτωση) 20. Προσθήκη 3 μl RNAσης και επώαση στους 37 ο C για 10 λεπτά 21. Αποθήκευση στους -20 ο C μέχρι την ημέρα της ανάλυσης Ηλεκτροφόρηση Ο διαχωρισμός του πλασμιδιακού DNA γινόταν με οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0,6 %. Στο κάθε δείγμα προσθέτονταν 5 μl χρωστικής κυανούν της βρωμοφαινόλης (tracking dye) και όλη η ποσότητα φορτωνόταν στις τσέπες της

142 πηκτής. Σε τρεις διαφορετικές θέσεις φορτώνονταν 5μl από ένα πρότυπο μοριακών βαρών (λdna/hind III Fragments, Gibco BRL). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιούταν με σταθερή τάση 170 Volt και έντασης ελεύθερη. Η διάρκεια της ήταν περίπου 2 ώρες μέχρι δηλαδή το μέτωπο να διανύσει 10 cm. Οι πηκτές σαρώνονταν (MiniBIS Pro, DNR Bio-Imaging Systems, Jerusalem, Israel) υπό UV ακτινοβολία Στατιστική επεξεργασία Τα αποτελέσματα των τεχνολογικών και προβιοτικών ιδιοτήτων επεξεργαστήκανε με το πρόγραμμα Minitab 15.0 και εφαρμόστηκε μονής κατεύθυνσης ανάλυση δεδομένων one-way ANOVA. Το επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε στο 5% ως η ελάχιστη διαφορά για να θεωρηθούν δύο τιμές ότι διαφέρουν στατιστικώς σημαντικά (LSD). Επίσης εφαρμόσθηκε πολυπαραγοντική ανάλυση σε κύριες συνιστώσες στις τεχνολογικές και προβιοτικές ιδιότητες

143

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

145

146 6. Αποτελέσματα 6.1. Μικροβιολογικές αναλύσεις Τα δείγματα των πέντε ώριμων τυριών Μελίχλωρου δέχονταν τις κατάλληλες αραιώσεις και εμβολιάζονταν, σε εκλεκτικά θρεπτικά υποστρώματα όπου γινόταν καταμέτρηση των αποικιών έτσι ώστε να καταγραφεί η ποικιλομορφία της υπάρχουσας μικροχλωρίδας αλλά και ο πληθυσμός της κάθε ομάδας. Στο τέλος υπολογίζονταν ο μέσος όρος των πέντε για κάθε υπόστρωμα. Όσο αφορά το συνολικό πληθυσμό της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας, αυτή ανέρχονταν σε 7,03 ± 0,74 log cfu/g. Σε παρόμοια επίπεδα βρέθηκε και ο πληθυσμός των λακτοκόκκων και των λακτοβακίλλων από M17 και AcA άγαρ αντίστοιχα (7,11 ± 0,96 log cfu/g και 6,97 ± 0,78 log cfu/g αντίστοιχα). Σε αντίθεση σε χαμηλά επίπεδα βρέθηκε ο πληθυσμός των Enterobacteriaceae, κολοβακτηριοειδών και σταφυλοκόκκων που δεν ξεπερνούσαν τους τρεις λογάριθμους (2,82 ± 0,52 log cfu/g, 1,63 ± 1,53 log cfu/g και 1,97 ± 1,86 log cfu/g αντίστοιχα), ενώ στους πέντε περίπου λογάριθμους καταγράφηκε ο πληθυσμός των εντεροκόκκων και των ζυμών (5,68 ± 0,82 log cfu/g και 5,05 ± 0,71 log cfu/g αντίστοιχα). Ο συνολικός πληθυσμός των Gram - βακτηρίων ανέρχονταν σε 3,81 ± 0,90 log cfu/g. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο πίνακα και σχήμα

147 Πίνακας Μεταβολή της μικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) α βακτηριακών ομάδων που μελετήθηκαν σε ώριμο Μελίχλωρο. των δέκα ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ Βακτηριακές ομάδες Πληθυσμός (log 10 cfu/g) ΟΜΧ 7,03 ± 0,74 Enterobacteriaceae 2,82 ± 0,52 Coliform 1,63 ± 1,53 Sraphylococci 1,97 ± 1,86 LAB σε MRS agar 6,82 ± 0,91 LAB σε MI7 agar 7,11 ± 0,96 Lactobacilli 6,97 ± 0,78 Enterococci 5,68 ± 0,82 Ζύμες 5,05 ± 0,71 Gram -ve 3,81 ± 0,90 α Μέσος όρος πέντε ώριμων τυριών log cfu/ml Συνολικά αερόβια Enterobactiriaceae Κολοβακτηριοειδών Σταφυλοκόκκων LAB σε MRS agar LAB σε MI7 agar Λακτοβακίλλων Βακτηριακές ομάδες Εντεροκόκκων Ζύμες Gram -ve Σχήμα Μεταβολές στις λογαριθμικές τιμές (x ± SD) των βακτηριακών ομάδων του τυριού Μελίχλωρο

148 6.2. Χημικές αναλύσεις Τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τα οποία διερευνήθηκαν στα δείγματα των τυριών είναι τα εξής: ph, υγρασία %, συντελεστής άλατος %, λιπολυτική και πρωτεολυτική δραστηριότητα. Για κάθε δοκιμή υπολογίζονταν ο μέσος όρος των πέντε δειγμάτων Μελίχλωρου και τα αποτελέσματα των οποίων συνοψίζονται στο πίνακα

149 Πίνακας Xημικές αναλύσεις (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) στα πέντε δείγματα ώριμου Μελίχλωρου Λήμνου. Χρόνος ωρίμανσης Πρωτεΐνη Τυροκομείο Τυρί (μήνες) ph Υγρασία% %S/M α Ολική d % Λίπος % Λιπόλυση b Πρωτεόλυση c Ι Α 5 4, ,06 22,50 37,50 0,04 13,17 Ι Β 5 4, ,38 26,10 39,00 0,04 10,96 Ι Ι Γ 3 4, ,34 23,90 37,50 0,03 10,85 Ι Ι Δ 3 4, ,00 25,70 37,50 0,04 11,54 Ι Ι Ε 11 4, ,16 22,80 38,00 0,16 12,28 Μ.Ο.± SD 4,49±0,21 31,4±1,51 6,18±2,4 24,2±1,64 37,9±0,65 0,06±0,04 11,76±0,86 α S/M (συντελεστής άλατος) = 100*(x g αλατιού/100 g τυριού/(x g υγρασίας/100 g τυριού). b Με με την μέθοδο Αcid Degree Value (ADV). C Με τη μέθοδο της ο-φθαλδιαλδεΰδης (ο-ρα) και εκφρασμένη σε mmol Gly L-1. d πρωτεΐνη = (ολικό Ν) x 6,

150 6.3 Ταυτοποίηση των στελεχών με βάση τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά Η απομόνωση των γαλακτικών βακτηρίων γινόταν μετά το τέλος της επώασης από τρυβλία με AcA άγαρ. Συνολικά απομονώθηκαν πενήντα στελέχη, δέκα από κάθε δείγμα τυριού. Όπως βλέπουμε στο πίνακα η ταυτοποίηση των γαλακτικών βακτηρίων γίνονταν με βάση τα φυσιολογικά και βιοχημικά τους χαρακτηριστικά (χρώση Gram, παραγωγή CO 2, παραγωγή αμμωνίας από αργινίνη, υδρόλυση εσκουλίνης, ανάπτυξη σε διάφορες θερμοκρασίες, ανάπτυξη σε διάφορες συγκεντρώσεις NaCl και ζύμωση σακχάρων). Τα σάκχαρα τα οποία εξετάσθηκαν ήταν τα εξής: ραμνόζη, κελοβιόζη, μελιβιόζη, μαννιτόλη, ριβόζη, ραφφινόζη, μαννόζη, γλυκόζη, μελεζιτόζη και λακτόζη επίσης σε δύο από τις πενήντα απομονώσεις εξετάσθηκαν και η αραβινόζη, η ξυλόζη, η μαλτόζη, η γαλακτόζη και η τρεχαλόζη. Όλα τα στελέχη έδωσαν αρνητική δοκιμή καταλάσης και παραγωγή αμμωνίας από αργινίνη εκτός από τέσσερα (Γ6, 2, 9, Ε9). Το σύνολο των απομονώσεων αναπτύχθηκε στους 15 O C ενώ στους 45 O C δεν αναπτύχθηκαν δώδεκα στελέχη (Α9, Α10, Β5, Γ4, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, και Ε1). Όλα τα στελέχη παρουσίασαν θετική δοκιμή υδρόλυσης εσκουλίνης ενώ μόνο δύο στελέχη παρήγαγαν CO 2 από γλυκόζη ( Γ4 και 2). Το σύνολο των απομονώσεων αναπτύσσονταν σε περιβάλλον με NaCl μέχρι 6,5% εκτός από πέντε απομονώσεις (Γ6, 2, Ε2, Ε4 και Ε9) που αναπτύχθηκαν σε περιβάλλον με NaCl μέχρι 4%

151 Όσο αφορά τη ζύμωση των σακχάρων το 56% των στελεχών (28/50) ζύμωναν την κελλοβιόζη, την μελιβιόζη, την μαννιτόλη, τη ριβόζη, την ραφφινόζη, την μαννόζη, την γλυκόζη, την μελεζιτόζη, την λακτόζη και την ξυλόζη, και σύμφωνα με τα κριτήρια των Fitzsimons και συν. (1999) ταυτοποιήθηκαν ως Lactobacillus plantarum. Από την άλλη πλευρά όμως τα στελέχη αυτά θα μπορούσαν να ταυτοποιηθούν και ως Lactobacillus paraplantarum σύμφωνα με το Bergey s Μnual (2010), διότι ο Lactobacillus paraplantarum παρουσιάζει ραφιννόζη d (+/-). To 34% των στελεχών (17/50) ζύμωναν την κελλοβιόζη, την μαννιτόλη, τη ριβόζη, την μαννόζη, την γλυκόζη, την μελεζιτόζη και την λακτόζη, και ταυτοποιήθηκαν ως Lactobacillus paracasei subsp. paracasei (Fintzmons και συν. (1999), Bergey's Manual (2010), Curk και συν. (1996). Ενώ δύο από τις απομονώσεις που παρουσίασαν θετική την δοκιμή CO 2 από γλυκόζη καθώς και ζύμωναν σχεδόν και τα δεκαοχτώ σάκχαρα (Γ4 και 2) ταυτοποιήθηκαν ως Leuc. pseudomesenterroides και Leuc. mecenteroides supsp. dextranicum (Bergey s Μnual 2010). Tα αποτελέσματα συνοψίζονται στο πίνακα

152 Πίνακας Φυσιολογικοί και βιοχημικοί χαρακτήρες στελεχών που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Στελέχη Χαρακτήρες Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Γ5 Ζύμωση σακχάρων Ανάπτυξη σε15 0 C Ανάπτυξη σε 45 0 C ΝΗ 3 από αργινινη καταλάση CO 2 από γλυκόζη Υδρόλυση εσκουλίνης NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6,50% Rhamnose (-) Cellobiose Melibiose Mannitol (-) Ribose Raffinnose (-) Mannose Glucose Melezitoze Lactose Xylose Arabinose + Dextrin + Maltoze + Ribose + Galactoze + Trexalose + + θετική δοκιμή, - αρνητική δοκιμή

153 Πίνακας (Συνέχεια) Φυσιολογικοί και βιοχημικοί χαρακτήρες στελεχών που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Στελέχη Χαρακτήρες Γ6 Γ7 Γ8 Γ9 Γ10 Δ1 Δ2 Δ3 Δ4 Δ5 Δ6 Δ7 Δ8 Δ9 Δ10 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ε9 Ε10 Ζύμωση σακχάρων Ανάπτυξη σε15 0 C Ανάπτυξη σε 45 0 C ΝΗ 3 αργινινη καταλάση CO 2 από γλυκόζη Υδρόλυση εσκουλίνης NaCl 2% NaCl 4% NaCl 6,50% Rhamnose (-) Cellobiose Melibiose (+) (-) - Mannitol (+) (+) + Ribose + + (+) Raffinnose (+) (+) (+) (+) (-) + Mannose Glucose Melezitoze Lactose Xylose Arabinose - Dextrin + Maltoze + Ribose + Galactoze + Trexalose + + θετική δοκιμή, - αρνητική δοκιμή

154 Πίνακας Ταυτοποίηση των στελεχών με βάση φυσιολογικούς και βιοχημικούς χαρακτήρες σύμφωνα με τους Fitzsimons και συν. (1999), Bergey's Manual (2010) και Curk και συν. (1996). Στελέχη Είδος Στελέχη Είδος Α1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Γ6 Lb. paracasei Α2 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Γ7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Α3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Γ8 Lb. paracasei Α4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Γ9 Lb. paracasei Α5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Γ10 Lb. paracasei Α6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Α7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ2 Leuc. mecenteroides supsp. dextranicum Α8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Α9 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Α10 Lb. paracasei Δ5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum B1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum B2 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum B3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum B4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ9 Lb. curvatus B5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Δ10 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum B6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Ε1 Lb. paracasei B7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Ε2 Lb. paracasei B8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Ε3 Lb. paracasei B9 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Ε4 Lb. paracasei B10 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Ε5 Lb. paracasei Γ1 Lb. curvatus Ε6 Lb. paracasei Γ2 Lb. paracasei Ε7 Lb. paracasei Γ3 Lb. paracasei Ε8 Lb. paracasei Γ4 Leuc. pseudomesenterroides Ε9 Lb.curvatus Γ5 Lb. paracasei Ε10 Lb. paracasei 154

155 6.4. Ταυτοποίηση σύμφωνα με την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου. Με τη χρήση του λογισμικού πακέτου Gel Compar 4.0, έγινε σύγκριση του συνολικό πρωτεϊνικού περιεχόμενου των κυττάρων των 50 λακτοβακίλλων με τα αντίστοιχα προφίλ πρότυπων στελεχών (Σχήμα 6.4.1). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της SDS-PAGE, 29 στελέχη (Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β8, Β9, Β10, Γ7, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 και 10) ομαδοποιήθηκαν με το πρότυπο στέλεχος Lb. paraplantarum LMG με ποσοστό ομοιότητας 67,9%. Τα συγκεκριμένα στελέχη ταυτοποιούνται ως Lb. paraplantarum. Αξίζει να σημειωθεί ότι εντός της ομάδας των Lb. paraplantarum διακρίνονται τέσσερις υποομάδες με υψηλά ποσοστά ομοιότητας. I. Στην υποομάδα 1 ανήκουν τα στελέχη Α6, Α7, Β6, 5, Β8, Β5 και 10 τα οποία παρουσιάζουν ποσοστό ομοιότητας 86,1%. II. Στην υποομάδα 2 ανήκουν τα στελέχη Α5, Α1, 3, Α8, 4, Α4, 7, Β1, 1 και Α10 τα οποία παρουσιάζουν ποσοστό ομοιότητας 88,7%. III. Στην υποομάδα 3 ανήκουν τα στελέχη Β9, Β10, Α2, Α3, Β7, Β2 και 6 τα οποία παρουσιάζουν ποσοστό ομοιότητας 85,2%. IV. Στην υποομάδα 4 ανήκουν τα στελέχη Β3, Α9, Β4, 8, και Γ7 τα οποία παρουσιάζουν ποσοστό ομοιότητας 94,2%. Σημειώνεται επίσης εντός των υποομάδων έχουμε στελέχη τα οποία παρουσιάζουν ποσοστά ομοιότητας πάνω από 95%. Τα στελέχη αυτά είναι τα εξής: 155

156 i. Α6 και Α7 (96,3% ομοιότητα) ii. Β6 και 5 (98% ομοιότητα) iii. Α5, Α1 και 3 (98,3% ομοιότητα) iv. Α8, 4 και Α4 (98,7% ομοιότητα) v. Β1, 1 και Α10 (99,1% ομοιότητα) vi. Β9 και Β10 (95,1% ομοιότητα) vii. Α2 και Α3 (97,3% ομοιότητα) viii. Β7 και Β2 (95,4% ομοιότητα) ix. Β3, Α9 και Β4 (97,4% ομοιότητα) x. 8 και Γ7 (98,2%) Τα συγκεκριμένα στελέχη πιθανόν να είναι και απομονώσεις του ίδιου στελέχους. Επίσης, διαπιστώνεται ότι πολλά από τα στελέχη μεταξύ αυτών των ομάδων με υψηλά ποσοστά ομοιότητας έχουν απομονωθεί από το ίδιο τυροκομείο και από την ίδια τυροκόμηση (Α6 και Α7, Α5 και Α1, Α8 και Α4, Β9 και Β10, Α2 και Α3, Β7 και Β2, Β3 και Β4). Αξίζει να σημειωθεί ότι βρέθηκαν στελέχη τα οποία έχουν απομονώθεί και από τα δύο τυροκομεία με υψηλά ποσοστά ομοιότητας ( υποομάδες ii, iii, iv, v) Στη δεύτερη μεγάλη ομάδα ανήκουν 18 στελέχη ( 9, Γ1, Γ2, Γ3, Γ6, Γ8, Γ9, Γ10, Ε1, Ε2, Ε3, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8, Ε9 και Ε10 ) τα οποία ομαδοποιούνται και ταυτοποιούνται με το πρότυπο στέλεχος Lb. paracasei subsp. paracasei NCDO 151 με ποσοστό ομοιότητας 57,7%. Επίσης, στην ομάδα αυτή παρουσιάσθηκε ετερογένεια των στελεχών και υποδιαίρεσή της σε τρεις υποομάδες με υψηλά ποσοστά ομοιότητας. I. Ε9, Ε10, Ε2, 9 και Γ2 (77,8% ομοιότητα) II. Ε3, Ε4, Ε1, Ε5, Ε7, Ε8 και Ε6 (87,9% ομοιότητα) III. Γ9, Γ10, Γ8, Γ3, Γ6 και Γ1(82,1% ομοιότητα) 156

157 Αν λάβουμε υπόψη ότι η επαναληψιμότητα μεταξύ των ηλεκτροφορήσεων ήταν 90%, μεταξύ των στελεχών Lb. paracasei subsp. paracasei όμοια πρωτεϊνικά προφίλ έχουν τα στελέχη: i. Ε9 και Ε2 (91,8% ομοιότητα) ii. E1, E3, E4 και E5 ( 90,5% ομοιότητα) iii. Γ9, Γ10, Γ8, Γ3 και Γ6 (91,3% ομοιότητα) Το ενδιαφέρον στην ομάδα των Lb. paracasei είναι ότι τα στελέχη της υποομάδας Ι και της υποομάδας Ι Ι είναι απομονώσεις που προέρχονται από την ίδια τυροκόμηση. Επίσης, τα στελέχη που παρουσιάζουν όμοιο πρωτεϊνικό προφίλ προέρχονται από το ίδιο τυροκομείο και την ίδια τυροκόμηση. Η ταξινομική κατάταξη των στελεχών 2 και Γ4 δεν αποσαφηνίσθηκε ούτε με την SDS-PAGE. Επίσης, το πρωτεϊνικό προφίλ του στελέχους Γ5 φαίνεται να μοιάζει με το πρότυπο στέλεχος Lb. rhamnosus χωρίς όμως να έχει μεγάλο ποσοστό ομοιότητας. Συμπερασματικά, με την SDS-PAGE αποσαφηνίστηκε η ταξινομική θέση 29 στελεχών που ταυτοποιήθηκαν ως Lb. paraplantarum, το σύνολο των οποίων με εξαίρεση το στέλεχος Α10 είχαν ταυτοποιηθεί με βιοχημικές μεθόδους ως Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum με βάση τη ζύμωση της ραφινόζης. Σε αντίθεση από τα 18 στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei που ταυτοποιήθηκαν με την SDS-PAGE επιβεβαιώθηκε το 83,3% των στελεχών και με τις βιοχημικές δοκιμές. (Πίνακας ) 157

158 Πίνακας Ταξινόμηση των απομονώσεων από Μελίχλωρο, σύμφωνα την SDS PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Ταυτοποίηση με βιοχημικά Ταυτοποίηση με Ταυτοποίηση με βιοχημικά Ταυτοποίηση με Aπομονώσεις χαρακτηριστικά την SDS-PAGE Aπομονώσεις χαρακτηριστικά την SDS-PAGE Α1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Γ6 Lb. paracasei Lb. paracasei Α2 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Γ7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Α3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Γ8 Lb. paracasei Lb. paracasei Α4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Γ9 Lb. paracasei Lb. paracasei Α5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Γ10 Lb. paracasei Lb. paracasei Α6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Α7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ2 Leuc. mecenteroides - supsp. Dextranicum Α8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Α9 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Α10 Lb. paracasei Lb.paraplantarum Δ5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum B1 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum B2 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum B3 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum B4 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ9 Lb. curvatus Lb. paracasei B5 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Δ10 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum B6 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Ε1 Lb. paracasei Lb. paracasei B7 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Ε2 Lb. paracasei Lb. paracasei B8 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Ε3 Lb. paracasei Lb. paracasei B9 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Ε4 Lb. paracasei Lb. paracasei B10 Lb. plantarum ή Lb. paraplantarum Lb.paraplantarum Ε5 Lb. paracasei Lb. paracasei Γ1 Lb. curvatus Lb. paracasei Ε6 Lb. paracasei Lb. paracasei Γ2 Lb. paracasei Lb. paracasei Ε7 Lb. paracasei Lb. paracasei Γ3 Lb. paracasei Lb. paracasei Ε8 Lb. paracasei Lb. paracasei Γ4 Leuc. pseudomesenterroides - Ε9 Lb.curvatus Lb. paracasei Γ5 Lb. paracasei - Ε10 Lb. paracasei Lb. paracasei :Επιβεβαίωση ταυτοποίησης 158

159 GelCompar GelCompar Leuc. pseudomonas Lb. corynif Lb. plantarum Lb. pentosus Lb. rhamnosus G5 Leuc. mesenteroides A6 A7 B6 D5 B8 B5 D A5 A1 D3 A8 D4 A4 D7 Lb. paraplantarum B1 D1 A10 L.par. LMG B9 B10 A2 A3 B7 B2 D6 B3 A9 B4 D8 G7 D2 G E9 E10 E D9 L. pa. NCDO 151 G2 E3 E4 E1 E5 E7 E8 E6 G9 G10 G8 G3 G6 G1 Lb. paracasei Σχήμα Δενδρόγραμμα των πρωτεϊνικών αποτυπωμάτων των λακτοβακίλλων, μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) του συνόλου του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των απομονώσεων από το Μελίχλωρο. Χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson correlation coefficient (r) και η ομαδοποίηση έγινε βάσει της μεθόδου UPGMA. 159

160 6.5 Ταυτοποίηση απομονώσεων σε επίπεδο στελέχους με την RAPD-PCR Τα αποτελέσματα της RAPD-PCR παρουσιάζονται στο σχήμα στο οποίο παρατηρούμε τα προϊόντα αντιγραφής του DNA από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Το δενδρόγραμμα βασίζεται στην ανάλυση των χαρακτηριστικών που προέκυψαν από την αντιγραφή της αλληλουχίας του DNA με τους πριμοδότες Μ14 και COC. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου ήταν 83% συνεπώς, ομάδες λακτοβακίλλων με ποσοστά ομοιότητας μεγαλύτερα θεωρούνται απομονώσεις του ίδιου στελέχους. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της RAPD-PCR δε είχαμε ταυτοποίηση των στελεχών σε επίπεδο είδους λόγο των χαμηλών ποσοστών ομοιότητας τους με τα πρότυπα στελέχη. Όμως, υπάρχουν ενδιαφέροντα συμπεράσματα τα οποία πρέπει να τονίσουμε. Παρατηρώντας το δενδρόγραμμα βλέπουμε τη μεγάλη ετερογένεια μεταξύ των στελεχών τα οποία στο σύνολό τους μοιάζουν μόλις 11,3%. Τα στελέχη μας χωρίζονται σε δυο μεγάλες ομάδες: 1. Γ1, Γ2, Γ3, Γ6, Γ8, Γ9, Γ10, 9, Ε1, Ε2, Ε3, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8, Ε9 και Ε10 (ποσοστό ομοιότητας 11, 8%) 2. Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β, Β9, Β10, Γ7, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 και 10 (ποσοστό ομοιότητας 16,5) Στην πρώτη ομάδα ανήκουν όλα τα στελέχη Lb. pararacasei subsp. paracasei. H ομάδα αυτή υποδιαιρείται σε τέσσερις υποομάδες από τις οποίες η στη πρώτη ανήκουν στελέχη που 160

161 έχουν απομονωθεί από την ίδια τυροκόμηση και από το ίδιο τυροκομείο. Στις τέσσερις υποομάδες ανήκουν τα στελέχη: α. Ε9, Ε10, Ε2, Ε3 και Ε1 (31,6 % ομοιότητα) β. Γ1, Γ6, Γ8, Ε5 και Ε7 (37,7 % ομοιότητα) γ. Ε4 και 9 (30,8 % ομοιότητα) δ. Ε8, Γ3, Γ2 και Γ10 (21,8 % ομοιότητα) Επίσης τα στελέχη Ε2 και Ε3 τα οποία ανήκουν στην πρώτη υποομάδα εμφανίζουν ομοιότητα 88,6 %, επομένως έχουν το ίδιο γενότυπο. Επομένως από τα 18 ταυτοποιημένα στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei έχουμε 17 διαφορετικούς γενότυπους. Όσο αφορά τη δεύτερη ομάδα ανήκουν όλα τα στελέχη Lb. paraplantarum. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπάρχει διαχωρισμός στελεχών Lb. paraplantarum μεταξύ τυροκομείων με εξαίρεση το στέλεχος 10. Τα στελέχη Α και Β προέρχονται από δείγματα τυριού του ίδιου τυροκομείου, διαφορετικού από τα στελέχη και Γ. Τα στελέχη της ομάδας αυτής υποδιαιρόυνται σε τέσσερις υποομάδες στις οποίες ανήκουν στελέχη από το ίδιο τυροκομείο. Στις υποομάδες ανήκουν τα στελέχη: ε. A1, A2, A3, B1, A4, A5, B2, A6 και A7 (56,5% ομοίοτητα) ζ. Α10, Β3, Β4, Α8 και Α9 (58,1 % ομοιότητα) η. Β7, Β8, Β9, Β5, Β6 και Β10(62,7 % ομοιότητα) θ. 1, 3, 4, 6, 7 και 5 (75,7 % ομοιότητα) Υπογραμίζεται ότι στις υποομάδες η και θ ανήκουν εξολοκλήρου στελέχη από την ίδια τυροόμηση και τυροκομείο. Επίσης τον ίδιο γενότυπο έχουν τα στελέχη: i. Α1 και Α2 (84,1 % ομοιότητα) ii. Α3 και Β1 (84,1 % ομοιότητα) iii. Α4 και Α5 (84,1 % ομοιότητα) 161

162 iv. 1 και 3 (84,1 % ομοιότητα) v. 6, 7 και 5 (84,1 % ομοιότητα) Γενικά, μπορούμε να πούμε ότι τα 29 στελέχη Lb. paraplantarum ομαδοποιήθηκαν σε 22 διαφορετικούς γενότυπους. Συμπερασματικά, οι 47 απομονώσεις λακτοβακίλλων από το Μελίχλωρο, οι οποίες ταυτοποιήθηκαν ως Lb. paraplantarum και Lb. paracasei subsp. paracasei σύμφωνα με την SDS-PAGE διακρίθηκαν σε 39 διαφορετικούς γενότυπους. 162

163 M 14+COC PCR M 14 COC E9 E10 E2 E3 α E1 E6 G1 G6 G8 E5 E7 E4 D9 β γ ΟΜΑΔΑ G E8 G3 G2 G10 δ Lb. paracasei NCFB A1 A2 A3 B1 A4 A5 ε 56.5 B A6 A7 D A10 B3 B4 A8 A9 ζ ΟΜΑΔΑ B7 B8 B9 η 62.7 B B6 B D1 D3 D4 D6 D7 D5 θ 16.5 D8 G7 Lb. paraplantarum LMG Σχήμα Δενδρόγραμμα των προϊόντων της RAPD-PCR των λακτοβακίλλων που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο, χρησιμοποιώντας δύο εκκινητές M14 και COC. Χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson correlation coefficient (r) και η ομαδοποίηση έγινε βάσει της μεθόδου UPGMA. 163

164 6.6. Προβιοτικές ιδιότητες των στελεχών Ανάπτυξη σε όξινο περιβάλλον, σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων και σε παγκρεατικό υγρό. Τα αποτελέσματα των προβιοτικών δοκιμών που αφορούν την ανάπτυξη των στελεχών σε όξινο περιβάλλον (ph 2,5, ph 3), σε περιβάλλον παρουσία χολικών αλάτων (oxgal 0,3% και 1%) καθώς και σε παγκρεατρικό υγρό σινοψίζονται στο πίνακα Επιπρόσθετα έγινε δοκιμή αντοχής των κυττάρων που έδειξαν αδυναμία ανάπτυξης σε χαμηλό ph, χολικά άλατα, παγκρεατίνη μα ανακαλλιέργεια σε MRS ζωμό (ph 6,4) και τα αποτελέσματα παρατίθενται στο πίνακα Όσο αφορά την ανάπτυξη των στελεχών σε όξινο περιβάλλον (ph 2,5, ph 3) τα αποτελέσματα ήταν θετικά για το 86% του συνόλου των στελεχών, εκ των οποίων το 86,6% ανήκουν στο είδος Lb. paraplantarum (25 από τα 29 στελέχη, Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β8, Β9, Β10, Γ7, 1, 5, 6, 7) και το 83,3% στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei (15 από τα 18 στελέχη, Γ1, Γ2, Γ3, Γ6, Γ8, Γ9, Γ10, Ε1, Ε2, Ε3, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8), Αξίζει να σημειωθεί ότι στελεχη που δεν έδειξαν ανάπτυξη επιβίωσαν σε αυτές της συνθήκες ( 3, 4, 10, Ε10). Τα στελέχη τα οποία δεν επιβίωσαν ήταν το 8 Lb. paraplantarum και τα 9, Ε9 Lb. paracasei subsp. paracasei. Η ανάπτυξη των στελεχών σε περιβάλλον με χολικά άλατα 0,3% ήταν θετική για το σύνολο των στελεχών εκτός από το Γ10 Lb. paracasei subsp. paracasei. Σε αντίθεση, παρουσία χολικών 164

165 αλάτων 1% μόνο το 76% του συνόλου των στελεχών αναπτύχθηκε, εκ των οποίων το 82,8% ανήκουν στο είδος Lb. paraplantarum (24 από τα 29 στελέχη, Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β8, Β9, Β10, Γ7, 1, 3, 10 ) και το 66,7% στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei (12 από τα 18 στελέχη, Γ1, Γ3, Γ9, Γ10, Ε1, Ε2, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8, Ε10). Το σύνολο των στελεχών που δεν αναπτύχθηκαν ( 4, 5, 6, 7, 8 Lb. paraplantarum, Γ2, Γ6, Γ8, 9, Ε3, Ε9 Lb. paracasei subsp. paracasei και το αταυτοποιήτο 2 στέλεχος) επιβίωσαν στο συγκεκριμένο περιβάλλον, με εξαίρεση το 4 Lb. paraplantarum. 165

166 Πίνακας Αποτελέσματα προβιοτικών ιδιοτήτων των Lb. paraplantarum. Ανάπτυξη σε: Παγκρεατικό Στελέχη ρη 2,5 ρη 3 ρη 6 bile 0,3% bile 1% Υγρό Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Α Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Γ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ θετική δοκιμή, - αρνητική δοκιμή 166

167 Πίνακας Αποτελέσματα προβιοτικών ιδιοτήτων των Lb. paracasei. Ανάπτυξη σε: Παγκρεατικό Στελέχη ρη 2,6 ρη 9 ρη 12 bil 0,3% bile 1% Υγρό Lb. paracasei Δ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε θετική δοκιμή, - αρνητική δοκιμή Πίνακας Αποτελέσματα επιβίωσης στελεχών που δεν έδειξαν ανάπτυξη σε ph 2,5, ph 3, bile 0,3%, 1% και σε παγκρεατικό υγρό. Παγκρεατικό ρη 2,5 ρη 3 bile 0,3% bile 1% υγρό Στελέχη Ανάπτυξη Αντοχή Ανάπτυξη Αντοχή Ανάπτυξη Αντοχή Ανάπτυξη Αντοχή Ανάπτυξη Αντοχή Lb. paraplantarum Β8 - + Lb. paraplantarum Β9 - + Lb. paraplantarum Β Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ5 - + Lb. paraplantarum Δ6 - + Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb. paraplantarum Δ Lb.paracasei Δ Lb.paracasei Γ6 - + Lb.paracasei Γ8 - + Lb.paracasei Γ Lb.paracasei Ε3 - + Lb.paracasei Ε Θετική δοκιμή, - Αρνητική δοκιμή 167

168 Τέλος η ανάπτυξη των στελεχών σε παγκρεατικό υγρό ήταν θετική για το 90% του συνόλου των στελεχών. Αρνητική δοκιμή παρουσίασαν πέντε στελέχη (Β8, Β9, 7, 10 Lb.paraplanatrum και το Ε9 Lb. paracasei subsp. paracasei).θα πρέπει όμως να τονίσουμε ότι και τα πέντε στελέχη είχαν επιβίωση σε περιβάλλον παγκρεατικού υγρού Επιβίωση σε ph 2,5 και 3 Η δοκιμή επιβίωσης ζώντων κυττάρων σε PBS-pH 2,5 και 3,0 στους 37 C σε 0, 1 και 2 h έγινε στα στελέχη τα οποία δεν έδειξαν ανάπτυξη στα αντίστοιχα ph ( 3, 4, 8, 10, Lb.paraplanatrum και 9, Ε9, Ε10 Lb. paracasei subsp. paracasei). Στο στέλεχος Ε10 Lb. paracasei subsp. paracasei δεν έγινε η δοκιμή. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο πίνακα Σε PBS-pH 2,5 στους 37 C, ο πληθυσμός των στελεχών Lb.paraplanatrum ( 3, 4, 8, 10) έδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές κατά την πρώτη και δεύτερη ώρα μέτρησης (P< 0,05). Τα στελέχη 3, 4 και 10 μείωσαν τον αρχικό πληθυσμό τους κατά 1,51 ±1,01 log 10 cfu/ml, 1,43±0,63 log 10 cfu/ml και 2,46±0,44 log 10 cfu/ml, ενώ το στέλεχος 8 που παρουσίασε την μεγαλύτερη μείωση (3,41±1,2 log 10 cfu/ml). Κατά την δεύτερη ώρα ο ρυθμός μείωσης των ζωντανών κυττάρων θα λέγαμε παραμένει σταθερός για το στέλεχος 10 με ρυθμό μείωσης περίπου 2,5 log cfu/ml/h [ log(1h)2,46±0,44 και log(2h) 4,5±1,28] σε αντίθεση με τα στελέχη 3, 4 και 8 που ο πληθυσμός τους

169 από 40,02±0,2 %, 17,07±0,38 % και 15,94±0,22% αντίστοιχα μειώθηκε στο 100% τη δεύτερη ώρα. Σε PBS-pH 3,0 στους 37 C, τα στελέχη Lb.paraplanatrum ( 3, 4, 8, 10) έδειξε στατιστικώς σημαντικές διαφορές μόνο για το στέλεχος 8 (P = 0,051). Τα στελέχη 4 και 8 βρέθηκε να μειώνουν τον αρχικό πληθυσμό τους κατά 0,58±0,57 log 10 cfu/ml και 0,21±0,17 log 10 cfu/ml αντίστοιχα (% μείωση 6,3±3,02 και 2,43±1,43), σε αντίθεση με τα στελέχη 3 και 10 που ο αριθμός ζωντανών κυττάρων μειώθηκε κατά 2 λογαρίθμους περίπου (2,66±1,74 log 10 cfu/ml, 1,65±0,59 log 10 cfu/ml αντίστοιχα) και ο ρυθμός μείωσης παρέμεινε περίπου σταθερός και την δεύτερη ώρα [ log(1h) 2,66±1,74 και log(2h) 3,53±1,63 για το στέλεχος 3 και log(1h) 1,65±0,59 και log(2h) 3,09±1,20 για το στέλεχος 10]. Αξίζει να υπογραμμίσουμε ότι αν και ο ρυθμός μείωσης στα τέσσερα στελέχη ήταν διαφορετικός από της 0h στης 2h, το τελικό ποσοστό μείωσης των ζωντανών κυττάρων κυμάνθηκε στα ίδια όρια (37,88±14,71% για το 3, 31,32±18,65% για το 4, 38,36±13,62% για το 8 και 34,62±13,62% για το 10) καθώς και ότι δεν υπήρχαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών και στις 3 ώρες μέτρησης (0, 1 και 2 h)

170 Πίνακας Επιβίωση στελεχών λακτοβακίλλων σε ρυθμιστικό αλατούχο φωσφορικό διάλυμα ph 3,0 και 2,5 όπως προσδιορίζεται από τη μέτρηση αριθμού ζωντανών κυττάρων σε τρυβλία. Αριθμός ζωντανών κυττάρων (log10 cfu/ml) ph 2,5 Μεταβολή (2h) Δlog10(1h) Δlog10(2h) % Μείωση ΣΤΕΛΕΧΗ 0h 1h 2h P-value ph 2,5 ph 2,5 1h 2h Lb, paraplantarum* Δ3 Δ4 Δ8 Δ10 Lb. paracasei subsp. paracasei* Ε9 Δ9 A 8,51±0,81 A 8,85 ±0,26 A 7,96 ±0,29 A 8,75 ±0,07 A 8,59 b ±0,58 A 8,95 ±0,54 B 5,11 a ±0,39 B 7,34 b ±0,75 B 5,5 a ±0,15 B 6,66 ab ±0 B 7,55±0,75 B 7,52 b ±1,16 C 0,48±0,39 a 0,001 3,41±1,2 8,51 a ±0,82 40,02±0,2 99,95 a C 0,20±0 a 0,001 1,51±1,01 8,85 a ±0,27 17,07±0,38 99,98 a C 0,3±0,22 a <0,001 1,43±0,63 7,96 a ±0,30 15,94±0,22 99,97 a C 4,25b±1,13 <0,001 2,46±0,44 4,5 b ±1,28 30,87±0,11 51,45 b ±12,51 B 0,3±0,2 a 0,001 1,04±1,33 8,59 a ±0,59 12,06±6,32 99,97 a B 3,69b±0,44 0,016 2,09±0,07 5,26 b ±0,98 23,85±0,14 58,8 b ±7,28 P-value 0,461 0,034 <0,001 0,237 0,003 0,302 <0,001 Lb. paraplantarum* Δ3 9,31±0,68 6,65±1,07 5,78±0,95 0,061 2,66±1,74 3,53±1,63 28,54±16,61 37,88±14,71 Δ4 9,21±0,19 8,63±0,39 6,33±1,6 0,105 0,58±0,57 2,89±1,79 6,3±3,02 31,32±18,65 Δ8 A 8,94±0,08 AB 7,3±0,66 ph 3 B 5,51±1,18 0,051 0,21±0,17 3,43±1,26 2,43±1,43 38,36±13,62 Δ10 8,93±0,08 7,9±0,85 5,84±1,27 0,083 1,65±0,59 3,09±1,20 18,41±6,72 34,62±13,62 Lb. paracasei subsp. paracasei* Ε9 8,15±1,34 6,28±1,2 5,11±0,44 0,137 1,87±0,15 3,04±0,92 22,96±2,06 37,32±5,06 Δ9 8,66±0,03 8,87±0,32 6,81±2,3 0,369 1±0,76 1,85±2,33 11,1±8,66 21,37±26,75 P-value 0,522 0,086 0,856 0,176 0,903 0,244 0,901 * Τα συγκεκριμένα στελέχη δεν έδειξαν ανάπτυξη σε ζωμό σε ph 2,5 και 3. a-c Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) Τα δύο στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei (Ε9 και 9) PBS-pH 2,5 στους 37 C, έδειξαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P<0,005) κατά το πέρας της πρώτης ώρας μειώνοντας τον πληθυσμό τους κατά 12,06±6,32% και 23,85±0,14% αντίστοιχα

171 Ο ρυθμός μείωσης των ζώντων κυττάρου ανά ώρα του στελέχους 9 παρέμεινε περίπου σταθερός και ίσος περίπου με 2 log cfu/ml/h [ log(1h) 2,09±0,07 και log(2h) 5,26 b ±0,98], ενώ στο στέλεχος Ε9 παρατηρήθηκε μείωση της τάξης του 12,06±6,32% και στη δεύτερη ώρα δεν επέζησε κανένα κύτταρο. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι δεν υπήρχαν στατιστικώς σημαντικές (P>0,005) διαφορές μεταξύ των στελεχών 9 Lb. paracasei subsp. paracasei το οποίο συμπεριφέρθηκε όπως και το 10 Lb.paraplanatrum όσο αφορά το ποσοστό μείωσης του πληθυσμού κατά το πέρας των δύο ωρών (51,45 b ±12,51% και 58,8 b ±7,28% αντίστοιχα). Σε PBS-pH 3,0 στα στελέχη Ε9 και 9 δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P>0,005) όσο αφορά τον ρυθμό μείωσης του πληθυσμού τους. Αυτό που αξίζει να αναφέρουμε είναι ότι το στέλεχος Ε9 είχε μεγαλύτερο ρυθμό μείωσης (22,96±2,06%) σε σχέση με το 9 (11,1±8,66%). Συμπερασματικά από τα αποτελέσματα σε PBS-pH 3,0 μπορούμε να πούμε ότι όλα τα στελέχη συμπεριλαμβανομένου και τα είδη Lb.paraplanatrum δεν εμφάνισαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P>0,05) στο πληθυσμό τους κατά την πορεία των δύο ωρών, σε αντίθεση σε PBS-pH 2,5 είχαμε δύο διαφορετικές ομάδες βακτηρίων αυτή που τα στελέχη απεβίωναν κατά το πέρας των δύο ωρών ( 3, 4, 8 Lb.paraplanatrum και Ε9 Lb. paracasei subsp. paracasei) και τα στελέχη που παρουσίασαν μείωση του πληθυσμού τους κατά 50% περίπου ( 9 Lb. paracasei subsp. paracasei και 10 Lb.paraplanatrum)

172 Μείωση των επιπέδων χοληστερόλης Τα αποτελέσματα που αφορούν τη μείωση της συγκέντρωσης χοληστερόλης από τα στελέχη λακτοβακίλλων παρουσιάζονται στο πίνακα Σημειώνεται ότι δεν προσδιορίσθηκε η χοληστερόλη που ενδεχομένως να είχε αφομοιωθεί από τα κύτταρα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε μεταξύ όλων των στελεχών (πίνακας ) καθώς και ξεχωριστά μεταξύ του κάθε είδους για να δούμε την πιθανή παραλλακτικότητα τους (παράρτημα πίνακες και ). Λαμβάνοντας υπόψη τη μείωση των επιπέδων χοληστερόλης στης 24h, ξεχωρίζουν τρεις ομάδες με μεγάλη διαφοροποίηση μεταξύ τους. Στη πρώτη ομάδα ανήκουν τα στελέχη με ποσοστό μείωσης χοληστερόλης μέχρι 5%, στη δεύτερη με ποσοστό μείωσης μέχρι 25% και στη τρίτη >25%. Στη πρώτη ομάδα ανήκουν τα στελέχη Γ1, Γ6, Γ8, Ε1, Ε2, Ε3, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8 και Ε10 με μέγιστο ποσοστό μείωσης 4,04%.Τα συγκεκριμένα στελέχη χαρακτηρίζονται ως χαμηλής ικανότητας μείωσης της χοληστερόλης. Αξίζει να υπογραμμίσουμε ότι τα στελέχη αυτά ανήκουν όλα στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei (το 66,7% των Lb. paracasei subsp. paracasei). Στη δεύτερη ομάδα ανήκουν τα στελέχη Ε9, Γ10, Γ2, Γ3, 3, 4, 1, Γ7, Β6, Β2 και Α10 με μέγιστο ποσοστό μείωσης 24,2%. Τα στελέχη αυτά έχουν μέση ικανότητα μείωσης της χοληστερόλης. Στην ομάδα αυτή το 36,6% ανήκουν στο είδος Lb. paracasei subsp. paracasei (Ε9, Γ10, Γ2, Γ3 ) και το 64,4% είναι

173 Lb.paraplanatrum ( 3, 4, 1, Γ7, Β6, Β2, και Α10 το 24,14% του συνόλου των Lb.paraplanatrum έχει μέση ικανότητα μείωσης των επιπέδων της χοληστερόλης). Στη τρίτη διακριτή ομάδα συμπεριλαμβάνονται τα στελέχη τα οποία έχουν ικανότητα μεγαλύτερη από 25%. Στη κατηγορία αυτή ανήκουν τα στελέχη Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Β1, Β3, Β4, Β5, Β7, Β8, Β9, Β10, 5, 6, 7, 8, 10 και 9. Το εύρος του ποσοστού μείωσης κυμαίνεται μεταξύ 25% ( 9) έως 74,2% (Β5). Αξίζει να σημειωθεί ότι το μικρότερο ποσοστό μείωσης σε αυτή την κατηγορία έχει το ένα και μοναδικό στέλεχος Lb. paracasei subsp. paracasei σε αντίθεση με τα υπόλοιπα τα οποία ανήκουν στο είδος Lb.paraplanatrum (συνολικά το 75,9% των Lb.paraplanatrum έχει μεγάλη ικανότητα μείωσης της χοληστερόλης). Όσο αφορά τα αποτελέσματα στις 48 h διαφοροποίηση των στελεχών είναι πιο διακριτή. Ξεχωρίζουν δυο ομάδες. Στη πρώτη ομάδα ανήκουν όλα τα στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei ( Γ1, Γ2, Γ3, Γ6, Γ8, Γ9, Γ10, Ε1, Ε2, Ε3, Ε4, Ε5, Ε6, Ε7, Ε8, Ε9, Ε10 ) με ποσοστό μείωσης να κυμαίνεται μεταξύ 6,16% - 24,62% με εξαίρεση το στέλεχος 9 που παρουσιάζει μείωση της τάξης του 33,08%

174 Πίνακας %Μείωση συγκέντρωσης χοληστερόλης από λακτοβακίλλους που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου μετά από 24ωρη και 48ωρη ανάπτυξη στους 37 C. ΟΜΑΔΑ II % Μείωση συγκέντρωσης χοληστερόλης Στελέχη 24h 48h Lactobacillus paraplantarum Α1 40,33 e-i ±2,29 86,16 f ±20,53 Lactobacillus paraplantarum Α2 45,97 e-j ±5,71 73,85 ef ±4,57 Lactobacillus paraplantarum Α3 45,97 e-j ±1,15 79,24 ef ±1,15 Lactobacillus paraplantarum Α4 37,1 b-i ±9,13 76,16 ef ±7,99 Lactobacillus paraplantarum Α5 49,2 e-j ±7,99 75,39 ef ±6,85 Lactobacillus paraplantarum Α6 55,65 g-j ± 1,15 73,08 ef ±5,71 Lactobacillus paraplantarum Α7 38,71 b-i ±2,29 66,16 de ±9,13 Lactobacillus paraplantarum Α8 44,36 e-i ±1,15 56,93 de ±22,81 Lactobacillus paraplantarum Α9 29,04 a-h ±0 61,54 d-e ±9,13 Lactobacillus paraplantarum Α10 24,2 a-f ±0 27,7 a-c ±13,69 Lactobacillus paraplantarum Β1 58,07 h-j ±4,57 63,08 de ±11,41 Lactobacillus paraplantarum Β2 10,49 a-d ±14,83 43,85 cd ±14,83 Lactobacillus paraplantarum Β3 51,62 f-j ±13,69 65,39 de ±1,15 Lactobacillus paraplantarum Β4 37,91 b-i ±30,8 56,93 de ±2,29 Lactobacillus paraplantarum Β5 74,2 j ±13,69 81,54 ef ±4,57 Lactobacillus paraplantarum Β6 16,94 ab ±1,15 59,24 de ±30,8 Lactobacillus paraplantarum Β7 27,42 a ±11,41 62,31 de ±17,11 Lactobacillus paraplantarum Β8 58,07 h-j ±9,13 68,47 ef ±12,55 Lactobacillus paraplantarum Β9 37,1 b-i ±6,85 61,54 d-e ±9,13 Lactobacillus paraplantarum Β10 25,81 a-f ±10,53 77,7 ef ±5,71 Lactobacillus paraplantarum Γ7 20,97 a ±10,53 70 a-c ±5,71 Lactobacillus paraplantarum Δ1 24,2 a-f ±8,25 75,39 a ±2,29 Lactobacillus paraplantarum Δ3 24,2 a-f ±7,38 57,7 de ±3,43 Lactobacillus paraplantarum Δ4 20,17 a-e ±3,96 77,7 a ±5,71 Lactobacillus paraplantarum Δ5 28,23 a-g ±3,43 60 de ±0 Lactobacillus paraplantarum Δ6 39,52 d-i ±2,67 76,16 a ±5,71 Lactobacillus paraplantarum Δ7 51,62 f-j ±2,29 61,54 de ±0 Lactobacillus paraplantarum Δ8 37,91 b-i ±7,99 73,85 a ±4,57 Lactobacillus paraplantarum Δ10 58,88 i-j ±5,36 69,24 a ±11,41 Lactobacillus paracasei Δ9 25 a-f ±10,27 33,08 bc ±6,24 P-value <0,001 <0,001 a-jστατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των στελεχών (P<0,05)

175 Πίνακας (Συνέχεια) % Μείωση συγκέντρωσης χοληστερόλης από λακτοβακίλλους που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου μετά από 24ωρη και 48ωρη ανάπτυξη στους 37 C. ΟΜΑΔΑ I ΥΠΟΟΜΑΔΑ I % Μείωση συγκέντρωσης χοληστερόλης Στελέχη 24h 48h Lactobacillus paracasei Γ1 2,42 a ±1,15 6,93 a ±1,15 Lactobacillus paracasei Γ6 4,04 a ±1,14 24,62 a-c ±9,13 Lactobacillus paracasei Γ8 0,81 a ±1,15 24,62 a-c ±9,13 Lactobacillus paracasei Ε1 0,81 a ±1,15 8,47 a ±1,15 Lactobacillus paracasei Ε2 1,62 a ±2,29 6,16 a ±2,29 Lactobacillus paracasei Ε3 2,42 a ±1,15 6,93 a ±1,15 Lactobacillus paracasei Ε4 4,04 a ±1,15 9,24 ab ±2,29 Lactobacillus paracasei Ε5 3,23 a ±4,57 8,47 a ±5,71 Lactobacillus paracasei Ε6 4,04 a ±1,15 9,24 ab ±2,29 Lactobacillus paracasei Ε7 4,04 a ±3,43 8,47 a ±1,15 Lactobacillus paracasei Ε8 3,23 a ±4,57 7,7 a ±0 Lactobacillus paracasei Ε10 4,04 a ±5,7 6,93 a ±1,15 ΥΠΟΟΜΑΔΑ II Lactobacillus paracasei Ε9 8,88 ab ±5,71 10,77 ab ±6,85 Lactobacillus paracasei Γ9 1,62 a-e ±0,29 22,31a -c ±17,11 Lactobacillus paracasei Γ10 24,2 a-f ±11,41 23,85 a-c ±1,67 Lactobacillus paracasei Γ2 10,49 a-d ±1,27 8,47 a ±1,15 Lactobacillus paracasei Γ3 9,68 a-c ±3,13 8,47 a ±1,15 Γ5 ND ND - Γ4 ND ND Δ2 ND ND P-value <0,001 <0,001 a-e Στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των στελεχών (P<0,05) ND δεν προσδιορίστηκε η μείωση της χοληστερόλης. Σε αντίθεση στη δεύτερη ομάδα ανήκουν όλα τα στελέχη Lb.paraplanatrum και το στέλεχος 9 Lb. paracasei subsp. paracasei με ποσοστά μείωσης των επιπέδων χοληστερόλης μεταξύ 27,7% - 86,16%. Σημειώνετε ότι το στέλεχος 9 έχει το δεύτερο μικρότερο ποσοστό μείωσης

176 Αντοχή σε αντιβιοτικά Τα στελέχη που εξετάσθηκαν σε αυτήν την εργασία αξιολογήθηκαν σύμφωνα με την κλίμακα Kirby-Bauer (Bauer και συν. 1966) ως προς την ευαισθησία τους στα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιβιοτικά. Το σύνολο των εξεταζόμενων στελεχών παρουσίασε ευαισθησία σε έξι (πενικιλίνη, ερυθρομυκίνη, τετρακυκλίνη, χλωραμφενικόλη, αμπικιλίνη και νοβομπιοσίνη) από τα δεκατρία εξεταζόμενα αντιβιοτικά. Και τα 47 εξεταζόμενα στελέχη (29 στελέχη Lactobacillus paraplantarum και 18 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) παρουσίασα το ίδιο προφίλ ως προς την ευαισθησία τους στα αντιβιοτικά. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στους πίνακες και

177 Πίνακας Αντοχή σε αντιβιοτικά στελεχών Lactobacillus paracasei που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου. Στελέχη Αναστολείς σύνθεσης κυτταρικού τοιχώματος Πενικιλίνη (10 IU/IE/UI) Βανκομυσίνη (30 μg) Αναστολείς σύνθεσης πρωτεϊνών Ερυθρομυκίνη (15 μg) Γ1 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ2 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ3 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ6 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ8 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ9 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Γ10 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Δ9 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε1 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε2 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε3 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε4 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε5 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε6 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε7 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε8 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε9 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S Ε10 Lb. paracasei S R S S S R S R R R R R S **R αντοχη *S ευαισθησία Τετρακυκλίνη (30 μg) Χλωραμφενικόλη (30 μg) Νεομυκίνη (30 μg) Αμπικιλίνη(10 μg) Καναμυκίνη (30 μg) Ναλιδικό οξύ(30 μg) Γκεταμυκίνη (10 μg) Πολυμιξίνη (30 μg) Φουσιδικό οξύ (10 μg) Νοβομπιοσίνη (5 μg)

178 Πίνακας Αντoχή σε αντιβιοτικά στελεχών Lactobacillus paraplantarum που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου. Αναστολείς σύνθεσης κυτταρικού τοιχώματος Αναστολείς σύνθεσης πρωτεϊνών Στελέχη Πενικιλλίνη (10 IU/IE/UI) Βαγκομυκίνη (30 μg) Ερυθρομυκίνη (15 μg) Τετρακυκλίνη (30 μg) Α1 Lb. paraplantarum S* R** S S S R S R R R R R S Α2 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α3 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α4 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α5 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α6 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α7 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α8 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α9 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Α10 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β1 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β2 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β3 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β4 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β5 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β6 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β7 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β8 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β9 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Β10 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Γ7 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ1 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ3 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ4 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ5 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ6 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ7 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ8 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Δ10 Lb. paraplantarum S R S S S R S R R R R R S Χλωραφενικόλη (30 μg) Νεομυκίνη (30 μg) Αμπικιλίνη(10 μg) Καναμυκίνη (30 μg) Ναλιδικό οξύ(30 μg) Γκεταμυκίνη (10 μg) Πολυμιξίνη (30 μg) Φουσιδικό οξύ (10 μg) Νο βομπιοσίνη (5 μg) **R αντοχη *S ευαισθησία

179 Σχήμα Αποτελέσματα ευαισθησίας στελεχών λακτοβακίλλων σε αντιβιοτικά (πενικιλίνη, ερυθρομυκίνη, τετρακυκλίνη, χλωραμφενικόλη, αμπικιλίνη και νοβομπιοσίνη) που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου Αντιβακτηριακή δραστηριότητα Η αντιβακτηριακή δραστηριότητα εξετάσθηκε έναντι: παθογόνων (B.cereus, S.aureus, Y.enterocolita, E. coli, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Candida albicaus (kk2.2 και kk 2.5), αλλοιογόνων ( Cl. tyrobutyricum, Cl. Sporogenes, Debazyomyces hansenii) και γαλακτικών βακτηρίων ( Lb. helveticus, S. thermophillus, Pediococcus pentosaceus). Κανένα στέλεχος δε βρέθηκε να αναχαιτίζει την ανάπτυξη του B.cereus, του S.aureus, της Y.enterocolita, της E. coli, της Listeria monocytogenes, του Pediococcus pentosaceus και της Candida albicaus (kk2.2). Το 16% των απομονώσεων αναχαίτισαν το Cl. Sporogenes (το 13,8% των Lactobacillus paraplantarum και το 22,2% των Lactobacillus paracasei subsp. paracasei), το 32% το Cl. tyrobutyricum (το 20,7 % των Lactobacillus paraplantarum και το 50% των Lactobacillus paracasei subsp. paracasei) και το 18% τη Salmonella typhimurium ( εκ των οποίων και τα 9 στελέχη που την αναχαίτησαν ήταν Lb. paraplantarum και κανένα Lb. paracasei subsp. paracasei)

180 Όσο αφορά την αναχαίτιση των γαλακτικών βακτηρίων το 26% των απομονώσεων αναχαίτισαν το Lb. helveticus και 10 % τον S. thermophillus (και στις δύο περιπτώσεις η αναχαίτηση έγινε από στελέχη Lb. paraplantarum, 13 και 10 στελέχη αντίστοιχα). Τέλος δεν παρατηρήθηκε σημαντική αναχαίτιση των μυκήτων εκτός δύο περιπτώσεων του στελέχουν Γ10 και 10 ενάντια της Candida alicaus (kk 2.5), και του Debazyomyces hansenii. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο πίνακα

181 Πίνακας Αντιβακτηριακή δράση των λακτοβακίλων έναντι παθογόνων, αλλοιογόνων και γαλακτικών βακτηρίων. B.cereus S.aureus Y.enterocolita Παθογόνα Αλλοιογόνα Γαλακτικά E.coli L.monosytogenes Στελέχη Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A w Lb. paraplanatrum A w Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum A Lb. paraplanatrum B Lb. paraplanatrum B Lb. paraplanatrum B w - Lb. paraplanatrum B w Lb. paraplanatrum B Lb. paraplanatrum B w - Lb. paraplanatrum B w - Lb. paraplanatrum B w w - Lb. paraplanatrum B w - Lb. paraplanatrum B w - Lb. paraplanatrum Γ Lb. paraplanatrum Δ Lb. paraplanatrum Δ Lb. paraplanatrum Δ Lb. paraplanatrum Δ Lb. paraplanatrum Δ Lb. paraplanatrum Δ w - Lb. paraplanatrum Δ w - Lb. paraplanatrum Δ w : αναχαίτηση, w : ασθενής αναχαίτηση, - : αρνητική δοκιμή Salmoinella typhimiurium Candida albicaus (kk 2.2.) Candida albicaus (kk 2.5.) Cl.sporogenes Cl.tyrobutyricum Debazyomyces hansenii Pediococcus pentosaceus Lb.helveticus S. thermophillus 181

182 Πίνακας (Συνέχεια) Αντιβακτηριακή δράση των λακτοβακίλλων έναντι παθογόνων, αλλοιoγόνων και γαλακτικών βακτηρίων. B.cereus S.aureus Y.enterocolita E.coli L.monosytogenes Παθογόνα Αλλοιογόνα Γαλακτικά Στελέχη Lb. paracasei Γ Salmoinella typhimiurium Candida albicaus (kk 2.2.) Candida albicaus (kk 2.5.) Debazyomyces hansenii Cl.sporogenes Cl.tyrobutyricum Pediococcus pentosaceus Lb.helveticus S. thermophillus Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ w - - w - Lb. paracasei Γ w Lb. paracasei Γ Lb. paracasei Γ w Lb. paracasei Δ Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Lb. paracasei Ε Δ Γ Γ : αναχαίτηση, w : ασθενής αναχαίτηση, - : αρνητική δοκιμή 182

183 6.7. Τεχνολογικές ιδιότητες των στελεχών υνατότητα οξίνησης σε γάλα Τα αποτελέσματα της μείωσεις του ph του γάλακτος μετά από ανάπτυξη των λακτοβακίλλων για 6, 16 και 24 ώρες παρουσιάζονται στον πίνακα Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε και μεταξύ όλων των στελεχών κάθε χρονική στιγμή καθώς και του κάθε στελέχους στις 6, 16 και 24 ώρες. Επίσης η ίδια στατιστική ανάλυση εφαρμόσθηκε και μεταξύ του κάθε είδους ξεχωριστά για τειχόν παραλλακτικότητα των στελεχών (παράρτημα, πίνακες , ). Η πορεία της εξέλιξης του ph μετά από 6 και 16 ώρες δεν δείχνει κάποιες σημαντικές διαφοροποιήσεις των στελεχών. Λαμβάνοντας υπόψη την ένταση της οξίνισης δηλαδή την ικανότητα του στελέχους να μειώνει την τιμή του ph του γάλακτος ύστερα από 24 ώρες έχουμε δύο διακριτές ομάδες όσο αφορά τα στελέχη Lb. paraplanatrum. Στην ομάδα Ι ανήκουν τα στελέχη τα οποία έχουν την ικανότητα να μειώνουν το ph μετά από 24 ώρες μέχρι μισή μονάδα, τα στελέχη αυτά έχουν χαμηλή ικανότητα οξίνησης (Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β2, Β3, Β4, Β6, Β7, Β8, Β9, Β10). Ενώ στην ομάδα μέσης έντασης οξίνισης ( ph 24 ωρών >0,5 μονάδες ph) ανήκουν δέκα στελέχη (Β5, Γ7, 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10) με μέγιστη ένταση οξίνισης 0,71 μονάδες ph (Γ7). Στα στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei παρουσιάσθηκε περίπου ο ίδιος ρυθμός μείωσης του ph κατά το πέρας των 24 ωρών με εξαίρεση το στέλεχος Ε9 που εμφάνισε χαμηλή ένταση οξίνισης (0,27 μονάδες ph). 183

184 Αξίζει να σημειώσουμε ότι μεταξύ όλων των στελεχών είχαμε στατιστικώς σημαντικές διαφορές (P< 0,005), σε αντίθεση μεταξύ των ειδών ξεχωριστά δεν υπήρχαν (πίνακες 6.7.2, 6.7.3). 184

185 Πίνακας Ικανότητα οξίνισης των πενήντα στελεχών Λακτοβακίλλων απομονωμένων από το τυρί Μελίχλωρο Λήμνου. ρη ΔρΗ Στελέχη 6h 16h 24h P-value 6h 16h 24h P-value ΟΜΑ Α 1 a-j Lactobacillus paraplantarum Α1 6,14±0,21 6,02±0,22 5,96±0,17 0,691 0,22±0,13 0,35±0,13 0,4 a-d ±0,08 0,407 Lactobacillus paraplantarum Α2 6,17±0,17 6,06±0,18 6,02±0,18 0,688 0,19±0,08 0,3±0,09 0,35 ab ±0,09 0,335 Lactobacillus paraplantarum Α3 6,12±0,16 6,01±0,09 5,96±0,15 0,561 0,25±0,08 0,36±0,01 0,4 a-d ±0,06 0,144 Lactobacillus paraplantarum Α4 6,11±0,18 6,01±0,12 5,97±0,12 0,641 0,25±0,09 0,36±0,04 0,4 a-d ± 0,04 0,203 Lactobacillus paraplantarum Α5 6,1±0,25 6,02±0,18 5,96±0,21 0,818 0,27±0,16 0,34±0,1 0,41 a-d ±0,12 0,612 Lactobacillus paraplantarum Α6 6,13±0,18 6,03±0,16 5,98±0,16 0,681 0,23±0,1 0,33±0,07 0,39 abc ±0,08 0,31 Lactobacillus paraplantarum Α7 6,12±0,17 6,06±0,13 5,99±0,16 0,71 0,24±0,08 0,3±0,04 0,38 abc ± 0,08 0,303 Lactobacillus paraplantarum Α8 6,09±0,18 6,04±0,13 5,97±0,16 0,76 0,27±0,1 0,33±0,05 0,4 a-d ±0,08 0,395 Lactobacillus paraplantarum Α9 6,14±0,2 6,06±0,18 5,97±0,16 0,671 0,22±0,11 0,3±0,09 0,39 a-d ±0,07 0,328 Lactobacillus paraplantarum Α10 6,19±0,16 6,04±0,19 5,96±0,26 0,597 0,18±0,08 0,33±0,11 0,4 a-d ±0,17 0,32 Lactobacillus paraplantarum B1 6,1±0,24 6,01±0,19 6±0,18 0,859 0,26±0,16 0,36±0,11 0,37 abc ±0,09 0,67 Lactobacillus paraplantarum B2 6,12±0,248 6,04±0,13 5,98±0,18 0,797 0,25±0,16 0,33±0,05 0,38 abc ±0,1 0,557 Lactobacillus paraplantarum B3 6,12±0,27 6,01±0,22 5,97±0,21 0,801 0,24±0,18 0,36±0,13 0,4 a-d ±0,12 0,61 Lactobacillus paraplantarum B4 6,12±0,25 6,02±0,18 5,93±0,15 0,668 0,25±0,16 0,34±0,1 0,44 a-g ±0,06 0,383 Lactobacillus paraplantarum B6 6,12±0,27 6,01±0,13 5,93±0,11 0,631 0,24±0,18 0,35±0,04 0,43 a-f ±0,03 0,354 Lactobacillus paraplantarum B7 6,24±0,19 5,98±0,24 5,92±0,17 0,379 0,13±0,11 0,38±0,16 0,44 a-h ±0,08 0,145 Lactobacillus paraplantarum B8 6,17±0,22 6,03±0,21 6±0,19 0,716 0,2±0,13 0,33±0,13 0,37 abc ±0,11 0,448 Lactobacillus paraplantarum B9 6,14 ±0,19 5,98±0,14 5,95±0,11 0,492 0,23±0,11 0,38±0,06 0,42 a-e ±0,02 0,138 Lactobacillus paraplantarum B10 6,17 ±0,28 6,01±0,13 5,95±0,16 0,584 0,2±0,19 0,35±0,04 0,42 a-e ±0,08 0,316 P-value 1 1 0, ,943 <0,001 Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) 185

186 Πίνακας (Συνέχεια). Ικανότητα οξίνισης των πενήντα στελεχών Λακτοβακίλλων απομονωμένων από το τυρί Μελίχλωρο Λήμνου. ρη ΔρΗ Στελέχη 6h 16h 24h P-value 6h 16h 24h P-value ΟΜΑ Α 2 Lactobacillus paraplantarum B5 6,15±0,25 6,03±0,17 5,85±0,11 0,38 0,22±0,16 0,33±0,1 0,52 a-i ±0,02 0,141 Lactobacillus paraplantarum Γ7 6,15±0,26 5,95±0,28 5,66±0,35 1,377 0,22±0,18 0,42±0,19 0,71 b-j ±0,26 0,215 Lactobacillus paraplantarum Δ1 6,16±0,2 6,03±0,17 5,82±0,17 0,303 0,2±0,11 0,33±0,08 0,54 a-i ±0,08 0,081 Lactobacillus paraplantarum Δ3 6,16±0,18 5,99±0,16 5,66±0,41 0,319 0,2 ±0,1 0,37±0,07 0, 7 b-j ±0,33 0,179 Lactobacillus paraplantarum Δ4 6,16±0,19 6,04±0,11 5,74±0,26 0,237 0,21±0,11 0,33±0,02 0,63 a-j ±0,18 0,081 Lactobacillus paraplantarum Δ5 6,16±0,23 6,06±0,23 5,78±0,28 0,397 0,2±0,14 0,3±0,14 0,58 a-j ±0,2 0,196 Lactobacillus paraplantarum Δ6 6,15±0,27 6,03±0,21 5,84±0,26 0,521 0,21±0,18 0,33±0,13 0,53 a-i ±0,18 0,297 Lactobacillus paraplantarum Δ7 6,11±0,23 5,97±0,23 5,72±0,16 0,312 0,26±0,15 0,39±0,14 0,64 b-j ±0,07 0,114 Lactobacillus paraplantarum Δ8 6,13±0,23 5,96±0,13 5,73±0,22 0,221 A 0,23±0,08 AB 0,41±0,05 B 0,64 b-j ±0,13 0,054 5,78 Lactobacillus paraplantarum Δ10 6,17±0,2 6,01±0,11 ±0,25 0,267 0,19±0,11 0,36±0,02 0,59 a-j ±0,16 0,09 Lactobacillus paracasei Γ1 6,15 ±0,19 5,91±0,09 5,75±0,05 0,105 Lactobacillus paracasei Γ2 6,12 ±0,19 5,87±0,03 5,63 c ±0,2 0,121 Lactobacillus paracaseiγ3 6,14 ±0,16 5,99±0,19 5,57±0,17 0,093 A 0,22±0,11 A 0,25±0,11 A 0,22±0,07 B 0,45±0 AB 0,49±0,06 A 0,38±0,11 B 0,62 a-j ±0,04 0,019 B 0,73 c-j ±0,11 0,033 B 0,79 f-j ±0,08 0,016 Lactobacillus paracaseiγ6 6,13±0,22 6,02±0,15 5,85±0,04 0,337 0,24±0,13 0,35±0,06 0,51 a-i ±0,04 0,116 Lactobacillus paracasei Γ8 6,16±0,18 5,94±0,23 5,61±0,30 0,218 0,2±0,1 0,42±0,14 0,76 d-j ±0,22 0,089 P-value 1 1 0, ,943 <0,001 a-j Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) 186

187 Πίνακας (Συνέχεια). Ικανότητα οξίνισης των πενήντα στελεχών λακτοβακίλλων απομονωμένων από το τυρί Μελίχλωρο. ρη ΔρΗ Στελέχη 6h 16h 24h P-value 6h 16h 24h P-value Lactobacillus paracasei Γ9 6,12±0,23 5,94±0,26 5,65±0,34 0,375 0,25±0,15 0,43±0,18 0,71± b-j 0,25 0,207 Lactobacillus paracasei Γ10 6,16±0,25 5,95±0,21 5,64±0,62 0,239 0,21±0,16 0,42±0,12 0,73 c-j ±0,18 0,095 Lactobacillus paracasei Δ9 6,13±0,16 5,85±0,09 5,46±0,30 0,103 A 0,24±0,08 AB 0,52±0,01 B 0,91 j ±0,22 0,035 Lactobacillus paracasei Ε1 6,12±0,24 5,96±0,19 5,53±0,43 0,278 0,24±0,16 0,41±0,11 0,84 ij ±0,35 0,158 Lactobacillus paracasei Ε2 6,14±0,2 6,01±0,11 5,67±0,21 0,149 A 0,22±0,11 A 0,35±0,03 B 0,7 b-j ±0,12 0,034 Lactobacillus paracasei Ε3 6,11±0,27 5,97±0,18 5,69±0,26 0,334 0,25±0,18 0,39±0,1 0,68 b-j ±0,18 0,152 Lactobacillus paracasei Ε4 6,15±0,2 6,03±0,16 5,73±0,15 0,177 A 0,21±0,11 A 0,34±0,08 B 0,64± b-j 0,06 0,035 Lactobacillus paracasei Ε5 6,17±0,30 6,02±0,2 5,79±0,32 0,48 0,2±0,22 0,34±0,11 0,58 a-j ±0,23 0,0291 Lactobacillus paracasei Ε6 6,16±0,3 6,01±0,23 5,58±0,24 0,213 0,2 ±0,21 0,36±0,15 0,78 e-j ±0,16 0,091 Lactobacillus paracasei Ε7 6,17±0,23 6,06±0,2 5,66±0,28 0,234 0,2 ±0,15 0,3±0,11 0,7 b-j ±0,2 0,094 Lactobacillus paracasei Ε8 6,21±0,16 5,99±0,26 5,56±0,28 0,147 0,15±0,07 0,37±0,17 0,8 g-j ±0,2 0,05 Lactobacillus paracasei Ε9 6,29±0,02 6,21±0,08 6,1±0,08 0,06 0,08±0,06 AB 0,16±0,08 B 0,27 a ±0,16 0,035 Lactobacillus paracasei Ε10 6,22±0,23 6,02±0,28 5,64±0,23 0,204 0,15±0,15 0,34±0,19 0,72 c-j ±0,14 0,08 Γ5 6,15±0,21 5,90±0,23 C 5,43±0,20 0,089 A 0,21±0,13 A 0,46±0,15 B 0,94 j ±0,10 0,024 Γ4 6,16±0,18 5,95±0,28 5,56±0,13 0,124 A 0,2±0,1 AB 0,42±0,19 A 0,78 h-j ±0,09 0,038 Δ2 6,18±0,13 5,85±0,16 5,65±0,19 0,079 A 0,19±0,05 B 0,51±0,07 C 0,57 c-j ±0,06 0,008 P-value 1 1 0, ,943 <0,001 a-j Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) 187

188 Πρωτεολυτική δραστηριότητα Η ποσότητα των ελεύθερων αμινοξέων, εκφρασμένη σε ισοδύναμα mmol L-γλυκίνης, που παράχθηκε από τα στελέχη μετά από 24 ώρες, 4 και 7 μέρες παρουσιάζεται στο πίνακα Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε μεταξύ όλων των στελεχών κάθε χρονική στιγμή καθώς και του κάθε στελέχους στις 24 ώρες, 4 και 7 μέρες. Επίσης η ίδια στατιστική ανάλυση εφαρμόσθηκε και μεταξύ του κάθε είδους ξεχωριστά για τειχόν παραλλακτικότητα των στελεχών (παράρτημα, πίνακες , ). Οι τιμές της ποσότητας των ελεύθερων αμινοξέων εκφρασμένες σε mmol L-γλυκίνης κυμαίνονταν από 0,00 μέχρι 0,63 (B10) στις 24 ώρες επώασης σε γάλα. Tη μεγαλύτερη διακύμανση τιμών παρουσίασαν τα στελέχη Lb. paraplantarum με εύρος από 0 έως 0,63 mmol L-γλυκίνης (Α1 0,02 mmol Gly L -1, Α2 0,09 mmol Gly L -1, Α5 0,08 mmol Gly L -1, Α6 0,26 mmol Gly L -1, Β3 0,11 mmol Gly L -1, Β5 0,3 mmol Gly L -1, Β8, 0,55 mmol Gly L -1, Β10 0,63 mmol Gly L -1 ) ενώ μόλις δύο στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei είχαν τιμές >0 (Γ1 0,18 mmol Gly L -1 και Ε6 0,32 mmol Gly L -1 ). Η παραγωγή ελεύθερων αμινοξέων μετά από 4 και 7 μέρες από τα στελέχη παρουσίασε στατιστικώς σημαντικές διαφορές από το σύνολο των στελεχών με εξαίρεση τα στελέχη Α3, Β3, Β8 και Γ7 που ανήκουν στο είδος Lb. paraplantarum. Επιπρόσθετα, καταγράφηκε υψηλή δραστηριότητα (>1,33 mmol Gly L -1 ) σε 23 στελέχη εκ των οποίων το 57,17% ανήκουν στο είδος Lb. paraplantarum και το 42,83 στο είδος στελέχη Lb. paracasei 188

189 subsp. paracasei. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι μεταξύ των στελεχών στην ομάδα του Lb. paraplantarum υπάρχουν τρεις διακριτές ομάδες. Στη πρώτη ομάδα ανήκουν τα στελέχη με δραστηριότητα <1,33 mmol Gly L -1 μετά από τέσσερις μέρες επώασης σε γάλα (Α1, Α3, Α4, Α6, Α7, Α8, Α9, Α10, Β1, Β3, Β4, Β6, Β7, Β8, Β9, Γ7 και 3), στη δεύτερη με δραστηριότητα >1,33 mmol Gly L -1 και <2,5 mmol Gly L -1 (Α2, Α5,Β2, Β5, Β10 και 1) και στην τρίτη τα στελέχη με δραστηριότητα >2,5 mmol Gly L -1 ( 4, 5, 6, 7, 8, 10). Σε αντίθεση τα στελέχη Lb. paracasei subsp. paracasei η δραστηριότητά τους είναι πιο μεγάλη. Το 55,5 % των στελεχών παρουσιάζει δραστηριότητα > 1,5 mmol Gly L -1 και μόλις ένα στέλεχος έχει δραστηριότητα κάτω από 1 mmol Gly L -1 (Ε7). 189

190 Πίνακας Πρωτεολυτική δραστηριότητα π (μέσος όρος ± S.D.) των 50 στελεχών γαλακτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου. ΟΜΑ Α II ΟΜΑ Α I υποομάδα i υποομάδα ii υποομάδα iii π a-t Πρωτεολυτική δραστηριότητα (mmol Gly L -1 ) Στελέχη 24h 4d 7d P-value Lactobacillus paraplantarum Α1 A 0,02 a ±0,01 Lactobacillus paraplantarum Α3 0 Lactobacillus paraplantarum Α4 0 Lactobacillus paraplantarum Α6 A 0,26 c-e ±0,2 Lactobacillus paraplantarum Α7 0 Lactobacillus paraplantarum Α8 0 Lactobacillus paraplantarum Α9 0 Lactobacillus paraplantarum Α10 0 Lactobacillus paraplantarum Β1 0 Lactobacillus paraplantarum Β3 A 0,11 ab ±0,1 Lactobacillus paraplantarum Β4 0 Lactobacillus paraplantarum Β6 0 Lactobacillus paraplantarum Β7 0 B 0,56 c-e ±0,07 B 0,71 d-g ±0,05 B 0,51 cd ±0,06 B 1,31 i-n ±0,13 A 0,08 ab ±0,01 B 0,72 d-g ±0,06 B 0,58 c-e ±0,04 B 0,96 e-i ±0,12 B 1,08 f-k ±0,05 A 0,2 a-c ±0,01 C 1,74 c-f ±0,18 0,001 C 1,28 a-d ±0,06 <0,001 C 1,05 a-c ±0,15 0,003 C 1,93 d-h ±0,06 0,001 B 2,91 j-n ±0,16 <0,001 C 1,46 b-e ±0,08 <0,001 C 1,8 d-g ±0,09 <0,001 C 2,04 d-h ±0,03 <0,001 C 1,49 b-e ±0,11 <0,001 B 1,8 d-g ±0,01 <0,001 A 0 a B 0,88 ab ±0,1 0,001 B 0,42 b-d ±0,11 B 0,59 c-e ±0,03 C 1,77 c-f ±0,01 <0,001 C 2,33 f-k ±0,12 <0,001 Lactobacillus paraplantarum Β8 0,55 de ±0,02 1,1 f-k ±0,1 1,54 b-e ±0,7 0,194 Lactobacillus paraplantarum Β9 0 Lactobacillus paraplantarum Γ7 0 Lactobacillus paraplantarum Δ3 0 Lactobacillus paraplantarum Α2 Lactobacillus paraplantarum Α5 A 0,09 ab ±0,03 A 0,08 ab ±0,05 Lactobacillus paraplantarum Β2 0 Lactobacillus paraplantarum Β5 Lactobacillus paraplantarum Β10 A 0,3 bc ±0,09 A 0,63 e ±0,02 Lactobacillus paraplantarum Δ1 0 Lactobacillus paraplantarum Δ4 0 Lactobacillus paraplantarum Δ5 0 Lactobacillus paraplantarum Δ6 0 Lactobacillus paraplantarum Δ7 0 Lactobacillus paraplantarum Δ8 0 Lactobacillus paraplantarum Δ10 0 B 0,71 d-g ±0,05 A 0,65 d-f ±0,02 B 1,21 h-m ±0,07 B 1,79 o-q ±0,4 B 1,58 l-p ±0,03 B 1,65 m-p ±0,09 B 1,43 j-o ±0,09 B 1,47 k-o ±0,11 B 1,7 n-q ±0,02 B 2,67 s ±0,03 B 2,62 s ±0,06 B 2,63 s ±0,03 B 2,62 s ±0,06 B 2,63 s ±0,04 B 2,62 s ±0,05 B 0,7 a ±0,04 <0,001 A 1,69 c-f ±0,39 0,011 C 2,76 i-m ±0,05 <0,001 B 1,83 d-g ±0,02 <0,001 C 3,22 l-q ±0,08 <0,001 B 1,77 c-f ±0,07 <0,001 B 1,51 b-e ±0,14 0,005 C 2,47 g-l ±0,11 <0,001 C 3,12 l-p ±0,2 <0,001 C 4,61 s ±0,0B9 <0,001 C 2,96 k-o ±0,08 <0,001 C 3,05 k-p ±0,24 <0,001 C 2,63 h-m ±0,1 <0,001 C 2,66 h- m ±0,12 <0,001 B 2,66 h- P-value <0,001 <0,001 <0,001 Πρωτεολυτική δραστηριότητα εκφρασμένη σε mmol Gly L -1. m ±0,09 <0,001 Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) 190

191 Πίνακας (συνέχεια). Πρωτεολυτική δραστηριότητα π (μέσος όρος ± S.D.) των 50 στελεχών γαλακτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από το Μελίχλωρο Λήμνου. Πρωτεολυτική δραστηριότητα (mmol Gly L -1 ) Στελέχη 24h 4d 7d P-value Lactobacillus paracasei Γ1 A 0,18 ab ±0,01 B 1,27 i-n ±0,02 C 2,58 h-l ±0,12 <0,001 Lactobacillus paracasei Γ2 0 B 1,14 g-l ±0,18 C 2,98 k-p ±0,07 <0,001 Lactobacillus paracasei Γ3 0 B 1,5 k-p ±0,17 C 2,73 i-m ±0,1 <0,001 Lactobacillus paracasei Γ6 0 B 4,23 t ±0,26 B 4,61 s ±0,06 <0,001 Lactobacillus paracasei Γ8 0 B 2,39 rs ±0,06 B 2,45 f-l ±0,06 <0,001 Lactobacillus paracasei Γ9 0 B 1,28 i-n ±0,09 C 1,94 d-h ±0,14 0,001 Lactobacillus paracasei Γ10 0 B 1,22 h-m ±0,09 C 2,66 h-m ±0,15 <0,001 Lactobacillus paracasei Δ9 0 B 2,08 qr ±0,13 C 3,65 o-q ±0,12 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε1 0 B 1 e-j ±0,18 C 3,71 pq ±0,22 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε2 0 B 1,6 m-p ±0,04 C 4,5 rs ±0,15 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε3 0 B 1,23 h-m ±0,05 C 3,35 m-q ±0,01 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε4 0 B 1,94 pq ±0,11 C 3,52 n-q ±0,09 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε5 0 B 1,56 l-p ±0,09 C 3,66 o-q ±0,03 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε6 A 0,32 b-d ±0,04 B 1,08 f-k ±0,08 C 2,95 k-o ±0,13 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε7 0 B 0,82 d-h ±0,01 C 2,83 j-n ±0,35 0,002 Lactobacillus paracasei Ε8 0 B 1,5 k-p ±0,08 C 2,74 i-m ±0,14 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε9 0 B 1,56 l-p ±0,09 C 1,8 d-g ±0,07 <0,001 Lactobacillus paracasei Ε10 0 B 1,5 k-p ±0,1 C 3,88 qr ±0,06 <0,001 Γ5 A 0,01 a ±0,01 B 1,28 i-n ±0,32 B 2,16 e-g ±0,57 0,025 Δ2 0 1,82 o-q ±0,3 2,79 i-n ±1,81 0,16 Γ4 0,53 c-e ±0,45 0,78 d-h ±1,11 2,81 j-n ±0,31 0,11 P-value <0,001 <0,001 <0,001 π a-t Πρωτεολυτική δραστηριότητα εκφρασμένη σε mmol Gly L -1. Στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών για κάθε μέτρηση (P<0,05) A-C Στατιστικώς σημαντικές διαφορές του ίδιου στελέχους σε τρεις διαφορετικές χρονικές περιόδους (P<0,05) Στην έβδομη μέρα η παραγωγή ελεύθερων αμινοξέων ήταν ισχυρή για το σύνολο των στελεχών με εξαίρεση τα στελέχη Α3, Α4, Β4, και Β9 Lb. paraplantarum. Σημειώνεται, ότι το 77,8% των Lb. paracasei subsp. paracasei παρουσίασε δραστηριότητα >2,5mmol Gly L

192 Στο πίνακα περιγράφεται ο βαθμός διάσπασης της αsκαι β-καζεΐνης από τα στελέχη που αναπτύσσονται σε γάλα μετά από 24 ώρες, 4 και 7 ημέρες και στα σχήματα και φαίνετε η ικανότητα του κάθε είδους να υδρολύουν τις καζεΐνης. Τα στελέχη των Lb. paraplantarum αποικοδομούσαν κατά προτίμηση την αs-καζεΐνη στις 24 ώρες (41,4% των στελεχών αποικοδομούσαν την αs-καζεΐνη πάνω από 10%) το ίδιο και τα Lb. paracasei subsp. paracasei αλλά σε μεγαλύτερο βαθμό (66,7% των στελεχών αποικοδομούσαν την αs-καζεΐνη πάνω από 10% εκ των οποίων το 67% είχαν ικανότητα υδρόλυσης πάνω από 20%). Στις 4 ημέρες ο βαθμός υδρόλυσης της β-καζεΐνης είχε μέγιστη τιμή 22,13% από το 4 Lb. paraplantarum ενώ το 38,9% των Lb. paracasei subsp. paracasei είχαν ικανότητα υδρόλυσης πάνω από 22% (Γ1, Γ2, Γ3, Γ6, Γ8, Γ9, Γ10 και Ε5). Θα πρέπει να τονίσουμε ότι ο βαθμός αποικοδόμησης της αs-καζεΐνη στις 4 ημέρες ξεπερνούσε το 20% από το 20,7% των Lb. paraplantarum σε αντίθεση με τα Lb. paracasei subsp. paracasei που την υδρόλυσαν το 61,11% (εκ των οποίων το 54,4% είχαν βαθμό υδρόλυσης πάνω από 30%). Στην έβδομη μέρα το 77,8% των στελεχών των Lb. paracasei subsp. paracasei αποικοδόμησαν πάνω από το 25% την αs-καζεΐνη ενώ στα Lb. paraplantarum μόλις το 44,8%. Συμπερασματικά, η πρωτεολυτική δραστηριότητα των Lb. paracasei subsp. paracasei είναι εντονότερη όσο αφορά την παραγωγή ελεύθερων αμινοξέων καθώς στο βαθμό υδρόλυσης των αs- και β-καζεΐνών. 192

193 Πίνακας Υδρόλυση της αs- και β-καζεΐνης των στελεχών Λακτοβακίλλων. O βαθμός της υδρόλυσης (% μείωση) υπολογίστηκε με τη βοήθεια της αναλογίας της έντασης των αντίστοιχων ζωνών στις 24 ώρες, 4 και 7 μέρες ως προς τις αρχικές. 24h 4d 7d Στελέχη β-cn αs-cn β-cn αs-cn β-cn αs-cn Lb. paraplantarum A1 0,42 10,76 10,04 16,92 12,06 20,75 Lb. paraplantarum A2 4,58 12,23 15,76 15,25 17,5 17,76 Lb. paraplantarum A3 8,26 6,71 16,55 23,14 20,73 29,81 Lb. paraplantarum A4 1,59 9,49 6,08 15,66 14,6 26,43 Lb. paraplantarum A5 2,51 9,81 7,56 11,21 11,1 15,43 Lb. paraplantarum A6 1,73 9,81 2,78 10,51 7,96 25,1 Lb. paraplantarum A7 7,22 2,68 12,29 6,02 16,77 12,62 Lb. paraplantarum A8 3,8 10,31 4,2 11,39 6,86 16,77 Lb. paraplantarum A9 3,22 12,88 7,99 23,82 14,48 24,68 Lb. paraplantarum A10 6,59 3,62 7,8 5,7 14,86 10,59 Lb. paraplantarum Β1 9,51 2,24 16,63 18,69 17,17 21,25 Lb. paraplantarum Β2 8,64 2,98 8,92 5,57 26,09 26,92 Lb. paraplantarum Β3 16,38 7,32 19,57 11,51 24,22 11,8 Lb. paraplantarum Β4 18,42 18,23 21,63 24,98 26,66 26,26 Lb. paraplantarum Β5 1,83 10,05 15,78 15,03 31,4 39,48 Lb. paraplantarum Β6 7,92 27,27 13,44 33,54 17,82 34,82 Lb. paraplantarum Β7 4,88 8,81 10,27 18,29 11,08 21,66 Lb. paraplantarum Β8 4,32 4,44 4,65 9,21 9,01 26,27 Lb. paraplantarum Β9 13,64 27,37 15,56 30,19 18,16 37,16 Lb. paraplantarum Β10 9,87 27,36 20,46 27,51 28,31 31,12 Lb. paraplantarum Γ7 12,45 25,48 20,68 35,31 42,81 47,19 Lb. paraplantarum Δ1 4,78 13,48 5,9 15,21 28,1 22,4 Lb. paraplantarum Δ3 2,15 2,48 4,3 6,66 36,47 28,76 Lb. paraplantarum Δ4 10,5 10,48 22,13 23,73 29,89 31,19 Lb. paraplantarum Δ5 2,34 8,48 13,43 11,96 14,59 18,41 Lb. paraplantarum Δ6 4,06 5,48 8,31 8,09 23,8 25,74 Lb. paraplantarum Δ7 5,28 1,48 13,06 1,95 14,04 10,45 Lb. paraplantarum Δ8 9,14 5,48 17,69 16,15 17,94 30,6 Lb. paraplantarum Δ10 8,29 8,48 16,39 13,46 24,29 15,67 193

194 Πίνακας (Συνέχεια) Υδρόλυση της αs- και β-καζεΐνης των στελεχών Λακτοβακίλλων. O βαθμός της υδρόλυσης (% μείωση) υπολογίστηκε με τη βοήθεια της αναλογίας της έντασης των αντίστοιχων ζωνών στις 24 ώρες, 4 και 7 μέρες ως προς τις αρχικές. 24h 4d 7d Στελέχη β-cn αs-cn β-cn αs-cn β-cn αs-cn Lb. paracasei Γ1 37,01 35,48 43,27 35,52 45,62 35,66 Lb. paracasei Γ2 23,06 36,11 27,91 37,24 35,1 41,7 Lb. paracasei Γ3 27,19 32,87 31,22 41,10 36,91 45,42 Lb. paracasei Γ6 10,29 24,82 21,29 34,85 43,91 35,1 Lb. paracasei Γ8 21,4 28,18 29,87 28,28 30,83 41,24 Lb. paracasei Γ9 23,78 13,63 35,75 32,86 38,64 34,8 Lb. paracasei Γ10 16,87 7,42 27,84 14,75 42,82 39,84 Lb. paracasei Δ9 9,54 11,91 15,62 21,63 31,54 27,25 Lb. paracasei Ε1 4,34 5,39 4,58 12,28 16,7 26,69 Lb. paracasei Ε2 5,65 9,4 15,47 17,58 35,02 19,32 Lb. paracasei Ε3 1,73 7,78 8,17 13,04 9,71 19,57 Lb. paracasei Ε4 0,79 5,58 1,15 10,66 10,43 14,95 Lb. paracasei Ε5 3,77 15,62 23,21 31,42 26,16 38,81 Lb. paracasei Ε6 7,38 5,27 8,17 10,64 11,25 20,61 Lb. paracasei Ε7 2 4,42 5,86 5,31 16,46 11,98 Lb. paracasei Ε8 6,34 2,88 14,04 12,38 27,35 39,07 Lb. paracasei Ε9 7,72 1,97 17,14 14,61 32,26 22,21 Lb. paracasei Ε10 4,22 16,88 5,12 26,68 9,71 27,98 - Γ4 11,82 35,48 13,38 15,2 32,27 24,45 - Γ5 9,07 35,48 20,49 23,15 23,21 28,59 - Δ2 6,41 35,48 17,41 24,88 26,54 26,7 194

195 Lb. paracasei Ε10 Lb. paracasei Ε9 Lb. paracasei Ε8 Lb. paracasei Ε7 7d mmol L- Glyicine L-1 4d mmol L- Glyicine L-1 24 h mmol L- Glyicine L-1 Lb. paracasei Ε6 Lb. paracasei Ε5 Lb. paracasei Ε4 Lb. paracasei Ε3 Στελέχη Lb. paracasei Ε2 Lb. paracasei Ε1 Lb. paracasei 9 Lb. paracasei Γ10 Lb. paracasei Γ9 Lb. paracasei Γ8 Lb. paracasei Γ6 Lb. paracasei Γ3 Lb. paracasei Γ2 Lb. paracasei Γ mmol L- Glyicine/L Σχήμα Πρωτεολυτική δράση στελεχών Lactobacillus paracasei εκφρασμένη σε ισοδύναμα mmol L- Glyicine L

196 Lb. paraplantarum 9 Lb. paraplantarum 8 Lb. paraplantarum 7 Lb. paraplantarum 6 Lb. paraplantarum 5 Lb. paraplantarum 4 Lb. paraplantarum 3 Lb. paraplantarum 1 Lb. paraplantarum Γ7 Lb. paraplantarum Β10 Lb. paraplantarum Β9 Lb. paraplantarum Β8 Lb. paraplantarum Β7 Στελέχη Lb. paraplantarum Β6 Lb. paraplantarum Β5 Lb. paraplantarum Β4 Lb. paraplantarum Β3 Lb. paraplantarum Β2 Lb. paraplantarum Β1 Lb. paraplantarum Α10 Lb. paraplantarum Α9 Lb. paraplantarum Α8 Lb. paraplantarum Α7 Lb. paraplantarum Α6 Lb. paraplantarum Α5 Lb. paraplantarum Α4 Lb. paraplantarum Α3 Lb. paraplantarum Α2 Lb. paraplantarum Α1 7d mmol L- Glyicine L-1 4d mmol L- Glyicine L-1 24 h mmol L- Glyicine L mmol L- Glyicine/L Σχήμα Πρωτεολυτική δράση στελεχών Lactobacillus paraplantarum εκφρασμένη σε ισοδύναμα mmol L- Glyicine L

197 Ενζυμική δραστηριότητα Η ενζυμική δραστηριότητα των στελεχών Lb. paraplantarum και Lb. paracasei subsp. paracasei μελετήθηκε με τη μέθοδο API ZYM τα αποτελέσματα της οποίας συνοψίζονται στο πίνακα καθώς και αναλυτικά για το κάθε είδος στα σχήματα Στο σύνολο των στελεχών Lb. paraplantarum ανιχνεύθηκε δραστηριότητα αμινοπεπτιδάσης λευκίνης, όξινης φωσφατάσης, β- γαλακτοσιδάσης, α-γλυκοσιδάσης, β-γλυκοσιδάσης και Ν-ακέτυλο-βγλυκοζαμινάσης ενώ σε χαμηλό ποσοστό των στελεχών ανιχνεύθηκαν η τρυψίνη και η β-γλυκουρονιδάση (6,9% των στελεχών Lb. paraplantarum). Σε αντίθεση στα Lb. paracasei subsp. paracasei στο σύνολο των στελεχών είχαμε δραστηριότητα αμινοπεπτιδάσης βαλίνης, αμινοπεπτιδάσης λευκίνης, αμινοπεπτιδάσης κυστίνης και β-γαλακτοσιδάσης ενώ υπήρχε απουσία δραστηριότητας της α-μαννοσιδάσης και β-φουκοσιδάσης. Θα πρέπει να τονίσουμε ότι αν και υπήρχε χαμηλή συχνότητα εμφάνισης της τρυψίνης (6,9% και 12,5% αντίστοιχα) και χυμοτρυψίνης 10,34% και 31,25% αντίστοιχα, ωστόσο η δραστηριότητα ήταν έντονη (>40 nanomoles υδρολυμένου υποστρώματος) και στα δύο είδη. Επίσης η δραστηριότητα της β-γλυκουρονιδάσης ανιχνεύθηκε μόνο σε δύο στελέχη Lb. paraplantarum (Α9 και 6) και σ ένα στέλεχος Lb. paracasei (Γ2) ωστόσο ήταν έντονη και στις τρεις περιπτώσεις. Όσο αφορά τη δραστηριότητα των λιπολυτικών ενζύμων υπήρχε σημαντική διαφοροποιήση στη δραστηριότητα της εστεράσης (C4) (4,57 μέσος όρος υδρολυμένου υποστρώματος και 2,7 για Lb. paraplantarum και Lb. paracasei αντίστοιχα) καθώς και στην συχνότητα εμφάνισης της εστεράσης /λιπασης (C8) (55,17% και 93,75, αντίστοιχα). Η δραστηριότητα των πρωτεολυτικών ενζύμων ήταν περίπου παρόμοια και στα δύο είδη με εξαίρεση τη δραστηριότητα της β- φωσφουδρολάσηs (2,81 μέσος όρος υδρολυμένου υποστρώματος και 4,33 αντίστοιχα) καθώς και στη συχνότητα εμφάνισης της αλκαλικής φωσφατάσης (96,55% και 62,5%, αντίστοιχα). Θα πρέπει να υπογραμμιστεί ωστόσο ότι τα 197

198 Lb. paracasei subsp. paracasei παρουσίασαν εντονότερη δραστηριότητα πρωτεολυτικών ενζύμων. Πίνακας Μέσος όρος ενζυμικής δραστηριότητας στελεχών Lb.paraplanatrum και Lb. paracasei subsp. paracasei με τη χρήση της μεθόδου API ZYM. Lb.paraplanatrum Lb. paracasei subsp. paracasei Συχνότητα Μέσος όρος Συχνότητα Μέσος όρος Εμφάνισης Δραστηριότητας εμφάνισης δραστηριότητας % στελεχών % στελεχών Λιπολυτικά Εστεράση(C4) 72,41 4,57 62,50 2,70 Εστεράση/Λιπάση (C8) 55,17 4,63 93,75 3,93 Λιπάση (C14) 37,93 5,00 6,25 5,00 Πρωτεολυτικά Γλυκοσιδάσες Αμινοπεπτιδάση Λευκίνης 100,00 2,93 100,00 3,81 Αμινοπεπτιδάση βαλίνης 72,41 4,14 100,00 3,69 Αμινοπεπτιδάση κυστίνης 79,31 3,78 100,00 3,19 Τρυψίνη 6,90 5,00 12,50 5,00 Χυμοτρυψίνη 10,34 5,00 31,25 4,60 Αλκαλική φωσφατάση 96,55 2,93 62,50 3,60 Όξινη φωσφατάση 100,00 2,93 93,75 3,73 Ναφθόλη-AS-BI-φωσφοϋδραλάση 93,10 2,81 93,75 4,33 α-γαλακτοσιδάση 37,93 5,00 12,50 3,50 β-γαλακτοσιδάση 100,00 3,07 100,00 3,56 β-γλυκουρονιδάση 6,90 4,00 6,25 5,00 α-γλυκοσιδάση 100,00 3,34 93,75 4,13 β-γλυκοσιδάση 100,00 3,10 56,25 3,11 Ν-ακέτυλο-β-γλυκοζαμινάση 100,00 3,14 31,25 5,00 α-μαννοσιδάση 27,59 5,00 0,00 0,00 α-φουκοσιδάση 31,03 5,00 0,00 0,00 Στα αποτελέσματα ενζυμικής δραστηριότητας των στελεχών με το σύστημα ΑΡΙ-ΖΥΜ εφαρμόσθηκε η πολυπαραμετρικη 198

199 μέθοδος Aνάλυσης της Ομοιομορφίας των Ομάδων (cluster analysis). Η Aνάλυσης της Ομοιομορφίας των Ομάδων (cluster analysis) είναι μία μέθοδος με την οποία επιτυγχάνεται ομαδοποίηση των παρατηρήσεων σε ομάδες (cluster) έτσι ώστε οι παρατηρήσεις σε κάθε ομάδα να είναι σχετικά όμοιες σε σχέση με τις μεταβλητές που χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό των ομάδων ενώ οι παρατηρήσεις μεταξύ των ομάδων να διαφέρουν όσο το δυνατό περισσότερο σε σχέση πάντα με τις μεταβλητές ομαδοποίησης. Η μέθοδος ομαδοποίησης στην Aνάλυσης της Ομοιομορφίας των Ομάδων (cluster analysis) οδηγεί στη δημιουργία ενός δενδρογράμματος, όπως φαίνεται στο σχήμα Αρχικά υπολογίζονται οι αποστάσεις κάθε παρατηρήσεις από τα όλα τα άλλα αντικείμενα. Στη συνέχεια σχηματίζονται ομάδες με μία διαδικασία συνάθροισης (agglomeration). Κατά την διαδικασία συνάθροισης όλα τα στελέχη ξεκινούν από ομάδες τους ενός δηλαδή κάθε στέλεχος είναι και μία ομάδα. Οι ομάδες που βρίσκονται πιο κοντά σε σχέση με τις άλλες ομάδες σταδιακά ομογενοποιούνται (merged) έτσι ώστε τελικά όλα τα στελέχη να σχηματίζουν μία ομάδα. Στη παρούσα μελέτη, η εφαρμογή της πολυπαραμετρικης μεθόδου Aνάλυσης της Ομοιμορφίας των Ομάδων (cluster analysis) ανέδειξε δύο διακριτές ομάδες. Στην ομάδα I ανήκουν όλα τα στελέχη Lb. paraplantarum με εξαίρεση το στέλεχος Β9. Στην ομάδα αυτή έχουμε πέντε υποομάδες με ποσοστό ομοιότητας >90%. Στις υποομάδες αυτές ανήκουν τα στελέχη: 199

200 1. Α1, Α4 και 5 2. A2, A7, B4, A6, A10, B2, A3, A5 και B3 3. B1 και Γ7 4. A9, 7, 8, 10, B6, 1, 3 και 4 5. B5 και Β8 Στην ομάδα II ανήκουν όλα τα στελέχη Lb. paracasei με εξαίρεση το στέλεχος Ε4. Επίσης, στην ομάδα αυτή διακρίνονται δύο υποομάδες: 1. Γ1, Γ10, Γ3, Γ8, Γ9, Γ2 και Ε3 2. Γ6, 9, Ε2, Ε5, Ε6, Ε8 και Ε1 Αξίζει να τονιστεί ότι τα στελέχη 1 και 3 που ανήκουν στην τέταρτη υποομάδα των Lb paraplantarum είναι απομονώσεις του ίδιου στελέχους σύμφωνα με την RAPD-PCR ( 86,7 % ομοιότητας). Συμπερασματικά, με την εφαρμογή της μεθόδου API ZYM και με την μέθοδο Aνάλυσης της Ομοιομορφίας των Ομάδων (cluster analysis), έχουμε επιβεβαίωση της ομαδοποίησης των στελεχών που έγινε με την SDS-PAGE με εξαίρεση τα στελέχη Β9 και Ε4. 200

201 68,16 % ομοιότητα 78,77 89, ,00 A1 A4 5 A2 A7 B4 A6 A10 B2 A3 A5 B3 B1 Γ7 A B A8 B7 B5 B8 Στελέχη B10 6 B9 Γ4 Ε4 2 Γ1 Γ10 Γ3 Γ8 Γ9 Γ2 Ε3 E7 Γ6 9 Ε2 Ε5 Ε6 Ε8 Ε1 Γ5 ΟΜΑΔΑ I Lb. paraplantarum ΟΜΑΔΑ II Lb. paracasei Σχήμα Δενδρόγραμμα 45 στελεχών λακτοβακίλλων σύμφωνα με την μέθοδο Aνάλυσης της Ομοιμορφίας των Ομάδων (cluster analysis), που εφαρμόσθηκε σε αποτελέσματα ενζυμικής δραστηριότητας (ΑPI ZYM). 201

202 Αλκαλική φωσφατάση Εστεράση(C4) Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Εστεράση/Λιπάση (C8) Λιπάση (C14) Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Αμινοπεπτιδάση Λευκίνης Αμινοπεπτιδάση βαλίνης Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Αμινοπεπτιδάση κυστίνης Τρυψίνη Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraxasei subsp. paracasei με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: αλκαλική φωσφατάση, λιπάση (C14), εστεράση (C4), εστεράση λιπάση (C8), αμινοπεπτιδάση λευκίνης, αμινοπεπτιδάση βαλίνης, αμινοπεπτιδάση κυστίνης και τρυψίνη. 202

203 Χυμοτρυψίνη Όξινη φωσφατάση Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Στελέχη Ναφθόλη-AS-BI-φωσφοϋδραλάση α-γαλακτοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Στελέχη β-γαλακτοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα α-γλυκοσιδάση Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα β-γλυκοσιδάση Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Ενζυμική δραστηριότητα Ν-ακέτυλο-β-γλυκοζαμινιδάση Γ1 Γ2 Γ3 Γ6 Γ8 Γ9 Γ10 9 Ε1 Ε2 Ε3 Ε4 Ε5 Ε6 Ε7 Ε8 Στελέχη Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraxasei subsp. paracasei με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: χυμοτρυψινη, όξινη φωσφατάση, β-φωσφουδρολάση, α-γαλακτοσιδάση, β- γαλακτοσιδάση, α-γλυκοσιδάση, β-γλυκοσιδάση, Ν-ακέτυλο-γλυκοζαμινάση 203

204 Ενζυμική δραστηριότητα Αλκαλική φωσφατάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Εστεράση(C4) Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Εστεράση/Λιπάση (C8) Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Λιπάση (C14) Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: αλκαλική φωσφατάση, λιπάση (C14), εστεράση (C4), εστεράση λιπάση (C8), 204

205 Ενζυμική δραστηριότητα Αμινοπεπτιδάση Λευκίνης Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Αμινοπεπτιδάση βαλίνης Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Αμινοπεπτιδάση κυστίνης Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Όξινη φωσφατάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: αμινοπεπτιδάση λευκίνης, αμινοπεπτιδάση βαλίνης, αμινοπεπτιδάση κυστίνης και όξινη φωσφατάση 205

206 Ενζυμική δραστηριότητα Ναφθόλη-AS-BI-φωσφοϋδραλάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη α-γαλακτοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα α-γλυκοσιδάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: β- φωσφουδρολάση, α-γαλακτοσιδάση, β-γαλακτοσιδάση, α-γλυκοσιδάση. 206

207 β-γλυκοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Ενζυμική δραστηριότητα Ν-ακέτυλο-β-γλυκοζαμινιδάση Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη α-μαννοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη α-φουκοσιδάση Ενζυμική δραστηριότητα Α1 Α2 Α3 Α4 Α5 Α6 Α7 Α8 Α9 Α10Β1 Β2 Β3 Β4 Β5 Β6 Β7 Β8 Β9 Β10Γ Στελέχη Σχήμα Ενζυμική δραστηριότητα: 0 (0 nanomole), 1(5 nanomoles), 2 (10 nanomoles), 3(20 nanomoles), 4(30 nanomoles), 5(>40 nanomoles), στελεχών Lb. paraplantarum με τη χρήση μεθόδου API ZYM που αφορά τα ακόλουθα ένζυμα: β- γλυκοσιδάση, β-γλυκοζαμινάση, α-μαννοσιδάση, α-φουκοσιδάση. 207

208 α-φουκοσιδάση α-μαννοσιδάση Ν-ακέτυλο-β-γλυκοζαμινάση β-γλυκοσιδάση α-γλυκοσιδάση β-γλυκουρονιδάση β-γαλακτοσιδάση α-γαλακτοσιδάση Ένζυμα Ναφθόλη-AS-BI-φωσφοϋδραλάση Όξινη φωσφατάση Αλκαλική φωσφατάση Lb. paraplantarum Lb. paracasei Χυμοτρυψίνη Τρυψίνη Αμινοπεπτιδάση κυστίνης Αμινοπεπτιδάση βαλίνης Αμινοπεπτιδάση Λευκίνης Λιπάση (C14) Εστεράση/Λιπάση (C8) Εστεράση(C4) Ενζυμική δραστηριότητα Σχήμα Μέσος όρος ενζυμικής δραστηριότητας των Lb.paraplanatrum και Lb. paracasei subsp. paracasei. 208

209 6.8. Ανάλυση πλασμιδιακού προφίλ Το πλασμιδιακό προφίλ ελέγχθηκε μόνα στα 29 στελέχη Lb.paraplanatrum, αντιπροσωπευτικά από τα προφίλ των στελεχών φαίνονται στο σχήμα Στο σύνολο των στελεχών ανιχνεύθηκαν πλασμίδια χωρίς όμως σημαντική ετερογένεια. Σημαντική διαφοροποίηση υπήρχε μεταξύ στελεχών που απομονώθηκαν από διαφορετική τυροκόμηση και τυροκομείο. Τα στελέχη Α1, Α2, Α3, Α4, Α5, Α6, Α7, Α8, Α9 και Α10 παρουσίασαν το ίδιο πλασμιδιακό προφίλ από τα οποία τα Α1 και Α2 καθώς και τα Α4 και Α5 είναι απομονώσεις του ίδιου στελέχους σύμφωνα με την RAPD-PCR (βλ. σχήμα 6.5.1) Τα στελέχη Β1, Β2, Β3, Β4, Β5, Β6, Β7, Β8 και Β9 παρουσίασαν παρόμοιο πλασμιδιακό προφίλ. Από τα συγκεκριμένα στελέχη τα Β7, Β8, Β9, Β6, Β10 και Β5 ανήκουν και στην ίδια υποομάδα σύμφωνα με την RAPD-PCR. Το ίδιο παρατηρείται και για τα στελέχη 1, 3, 4, 5, 6, 7 και 10 από τα οποία τα 1, 3, 4, 5, 6 και 7 ανήκουν και στην ίδια υποομάδα σύμφωνα με την RAPD-PCR (βλ. σχήμα ) εκ των οποίων τα 1, 3, 7 και 4 εμφανίζουν και παρόμοια ενζυμική δραστηριότητα (βλ. σχήμα ) Σχήμα Πλασμιδιακά προφίλ των:1) Hind ΙΙΙ, 2)B1, 3)B2, 4)B3, 5)Δ3, 6)Γ7, 7)Α1, 8)Α2, 9)Α3 209