Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο. Βιοφυσική. Ενότητα 7. Μαρκοπούλου Μυρσίνη Γεωργακίλας Αλέξανδρος

Transcript

1 Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο Βιοφυσική Ενότητα 7 Μαρκοπούλου Μυρσίνη Γεωργακίλας Αλέξανδρος

2 Άδεια Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειτα σε άδειες χρήσης Crea%ve Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άδεια χρήσης άλλου τύπου, αυτή πρέπει να αναγράφεται ρητώς.

3 Η παρουσίαση αυτή χωρίζεται στα παρακάτω τμήματα: 1. Εισαγωγή στην έννοια των βλαβών DNA, μελέτες σε ανθρώπινα κύτταρα, τεχνικές. 2. Μηχανισμοί επιδιόρθωσης (DNA repair). 3. Βιολογική σημασία (μεταλλάξεις- χρωμοσωμική αστάθεια)

4 Ιονίζουσες ακτινοβολίες Με τον όρο ιονίζουσες ακτινοβολίες χαρακτηρίζουμε τις ακτινοβολίες εκείνες που μεταφέρουν ικανή ενέργεια ώστε κατά την αλληλεπίδραση τους με την ύλη να προκαλέσουν ιονισμό των ατόμων της. Στις ιονίζουσες ακτινοβολίες κατατάσσονται οι ηλεκτρομαγνητικές ακτινοβολίες όπως η γ- και η Χ- (ουδέτερα κβάντα ενέργειας χωρίς μάζα) και οι σωματιδιακές όπως οι α- (πυρήνες He), β- (πρωτόνια και ποζιτρόνια), τα νετρόνια και κάποια σωματίδια που παράγονται τεχνητά ή αποτελούν συνιστώσες της κοσμικής ακτινοβολίας

5 Απορρόφηση ακτινοβολίας Η απορρόφηση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας από τα βιολογικά υλικά δημιουργεί ιοντισμούς και διεγέρσεις με αποτέλεσμα τη δημιουργία ορισμένων σχηματισμών σμώ που ονομάζονται ελεύθερες ρίζες. Οι ελεύθερες ρίζες είναι άτομα ή μόρια ηλεκτρικά ουδέτερα, με ίσους αριθμούς πρωτονίων και ηλεκτρονίων, αλλά ένα ηλεκτρόνιο της εξωτερικής στιβάδας δεν σχηματίζει ζεύγος (ασύζευκτο ηλεκτρόνιο), με αποτέλεσμα οι ελεύθερες ρίζες να είναι εξαιρετικά χημικώς δραστικές. Επειδή το μόριο που κυριαρχεί ποσοτικά στα βιολογικά υλικά είναι αυτό του ύδατος, είναι αυτό που κυρίως δέχεται την επίδραση της ακτινοβολίας.

6 Μονάδες δόσης Ενεργειακή δόση ακτινοβολίας ορίζεται ως η ενέργεια ιονίζουσας ακτινοβολίας W D που απορροφάται από όγκο ύλης V και πυκνότητας ρ. D=dW D /ρdv Μονάδα μέτρησης της δόσης είναι: 1 rad = 100 erg/gr gr= 10-2 J/kg SI: 1 Gy = 1 J/Kg 1 Gy = 100 rad

7 Στάδια αλληλεπίδρασης ακτινοβολίας Φυσικό στάδιο και βιολογικής ύλης > Αυτή ημεταφορά ενέργειας πραγματοποιείται σε χρόνο μικρότερο των s αλλά η κατανομή ααομή της στον σο χώρο εξαρτάται α από το είδος και την ενέργεια της ιοντίζουσας ακτινοβολίας. > Αν η τιμή της LET (Linear Energy Transfer-LET = de/dx) είναι χαμηλή τότε η ακτινοβολία (π.χχ φωτόνια ή ηλεκτρόνια) προκαλεί μικρό αριθμό ιοντισμών και διεγέρσεων ανά μm διαδρομής. Αντιθέτως για ακτινοβολίες με υψηλή LET (σωματίδια α, πρωτόνια ή βαρέα ιόντα) ) παρατηρούνται πυκνοί ιοντισμοί ανά μm διαδρομής. Ηενέργεια που μεταφέρεται σε ένα μικρού όγκου βιολογικό υλικό, δεν είναι ηίδια για όλους τους στόχους και τα μόρια που το αποτελούν. Η μέση τιμή της ενέργειας που μεταφέρεται στο βιολογικό υλικό είναι η απορροφούμενη δόση.

8 Συνέχεια σταδίων... Χημικό στάδιο > Στο στάδιο αυτό που ακολουθεί το φυσικό, κατά το οποίο τα άτομα του βιολογικού υλικού ακτινοβολήθηκαν, τα συστατικά των κυττάρων αντιδρούν με ταχείες χημικές αντιδράσεις. > Η απορρόφηση της ιοντίζουσας ακτινοβολίας από τα βιολογικά υλικά δημιουργεί ιοντισμούς και διεγέρσεις με αποτέλεσμα τη δημιουργία ορισμένων σχηματισμών που ονομάζονται ελεύθερες ρίζες. > Οι ελεύθερες ρίζες είναι άτομα ή μόρια ηλεκτρικά ουδέτερα, με ίσους αριθμούς πρωτονίων και ηλεκτρονίων, αλλά ένα ηλεκτρόνιο της εξωτερικής στιβάδας δεν σχηματίζει ζεύγος (ασύζευκτο ηλεκτρόνιο), με αποτέλεσμα οι ελεύθερες ρίζες να είναι εξαιρετικά χημικώς δραστικές. Επειδή το μόριο που κυριαρχεί ποσοτικά στα βιολογικά υλικά είναι αυτό του ύδατος, είναι αυτό που κυρίως δέχεται την επίδραση της ακτινοβολίας.

9 Αλληλεπίδραση ακτινοβολίας- Βιολογικών υλικών Συνοπτικά, η ραδιόλυση του ύδατος περιγράφεται από την εξίσωση: Η Ο -> e(aq) + OH ο + Η ο 2 + Η 2 + Η 2Ο 2 Οι ελεύθερες ρίζες ΟΗ,, είναι ασταθείς και εξαιρετικά δραστικές, γι' αυτό και η εμβέλεια τους είναι μικρότερη από 100 Angstrom. Εάν ένα οργανικό μόριο, RH (π.χ. χ DNA), βρεθεί μέσα στην τροχιά των ελευθέρων ριζών, θα συμβούν αντιδράσεις της μορφής: RH + ΟΗ R ο + Η 2 Ο θα παραχθούν δηλαδή οργανικές ρίζες R, που ως ασταθείς και με υψηλό ενεργειακό περιεχόμενο, θα μετασχηματιστούν γρήγορα προκαλώντας μεταβολή- βλάβη στη δομή του οργανικού μορίου.

10 Βιολογικό στάδιο 3ο...ΕΠΙ ΙΟΡΘΩΣΗ DNA > Αμέσως μετά το χημικό στάδιο αρχίζει ηεμφάνιση ενζυμικών μηχανισμών που δρουν επιδιορθωτικά στους μοριακούς σχηματισμούς που υπέστησαν βλάβη. Η διαδικασία της επιδιόρθωσης διαρκεί κατά το κύριο μέρος της από 15min-3h και ολοκληρώνεται σε περίπου ώρες. Στην περίπτωση όπου ηβλάβη είναι αδύνατον να επιδιορθωθεί, τα κύτταρα οδηγούνται σε είτε στη δημιουργία μεταλλάξεων η /και / κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης (apoptosis) apoptosis).

11 Βλάβες DNA Επιδιόρθωση Χρωμοσωμικές αλλοιώσεις Μεταλλάξεις

12 Βλάβες DNA ιαχωρισμός στοχευμένων (targeted effects) και μη στοχευμένων επιπτώσεων (non-targeted effects) της ακτινοβολίας W.F. Morgan, M.B. Sowa, Non-targeted bystander effects induced by ionizing radiation, Mutat. Res. 616 (2007) Στοχευμένες: Αμεση και απ ευθείας έκθεση κυττάρων στην ακτινοβολία Μη στοχευμένες: Εμμεση μέσω διαφόρων παραγόντων που παράγονται/εκλύονται από τα κύτταρα

13 Τί είναι το DNA; Γραμμική Μεταβίβαση Ενέργειας (linear energy transfer; LET = dε/ Ε/dΧ Η δομή του DNA. εξιά: οι 2 συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA, όπου διακρίνονται τα ζεύγη βάσεων ΑΤ και GC, καθώς και η αντιπαράλληλη κατεύθυνση των αλυσίδων. Αριστερά: το πρότυπο της διπλής έλικας του DNA των Watson και Crick. Οι οριζόντιες γραμμές συμβολίζουν τις συμπληρωματικές βάσεις υδρογονικούς δεσμούς. The LET of diagnostic x-rays is about 3 kev/μm, whereas the LET of 5 MeV alpha particles is 100 kev/μm.

14 Ρόλος LET στην επίδραση στα κύτταρα Comparison of particle tracks in nuclear emulsions and human cells. Three nuclei of human fibroblasts exposed to (A) γ-rays, (B) silicon ions, or (C) iron ions; and immunostained for detection of γ-h2ax. Every green focus corresponds to a DNA double-strand break. (D) Tracks of different ions, from protons to iron, in nuclear emulsions show increasing ionisation density (LET= E/ x) as charge, Z, increases. Biological effects increases with increasing atomic number. Cuccinota and Durante, The Lancet Oncology, 7, 2006

15 Βλάβες DNA Κάθε αλλαγή στην δομή του DNA και επομένως στο γενετικό κώδικα μπορεί να ερμηνεύσει ποιοτικά τη βιολογική επίδραση των ακτινοβολιών. Οι πιθανές βλάβες β του DNΑ που προέρχονται ρχ από ακτινοβόληση η με ιοντίζουσα ακτινοβολία παρατίθενται πάρα κάτω: 1. Σπάσιμο ενός κλώνου της αλυσίδας (Single Strand Break-SSB) 2. ιπλό σπάσιμο της αλυσίδας (σπάσιμο και των δύο κλώνων; Double Strand Break-DSB DSB). Εάν η ακτινοβολία προσβάλει και τους δύο κλώνους ταυτόχρονα και μάλιστα στην ίδια θέση τότε οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης του κυττάρου δεν μπορούν να λειτουργήσουν με ακρίβεια. Τέτοιου είδους θραύσεις και ακολουθούμενες με λανθασμένη αντικατάσταση βάσεων μπορούν να οδηγήσουν σε μεταλλαγές που μεταφέρονται στους απογόνους (αν γίνονται σε γενετικά κύτταρα) ) ή προκαλούν καρκινογένεση στο ίδιο το άτομο (αν γίνονται σε σωματικά κύτταρα). 3. Αλλοίωση μιας βάσης (οξειδώσεις, μεθυλιώσεις, αποπουρινώσεις, απαμινώσεις) α 4. Απώλεια μιας βάσης (αβασικά σημεία-ap sites) 5. Σπάσιμο δεσμού υδρογόνου μεταξύ των δύο αλυσίδων 6. Εγκάρσιες συνδέσεις μεταξύ των ελικών (διαδεσμοί διαδεσμοί-crosslinks)

16 Εκθεση DNA σε ιονίζουσα ακτινοβολία Μόριο DNA Αλληλεπίδρασηλ με ακτινοβολία/χημικά / Ομαδοποιημένες βλάβες DNA (damage μ ημ ς β β ς ( g clusters: Ward, 1981)

17 Επιδιορθωτικοί Μηχανσιμοί DNA Mismatch Repair (MMR) > ιορθώνει τα λεγόμενα λάθη τοποθέτησης ενός νουκλεοτιδίου ή «τυπογραφικά λάθη» που εμφανίζονται κατά την αντιγραφή του DNA (προσθήκη 1-4 βάσεων/ απάλειψη 1-4 βάσεων/ εισδοχή μη συμπληρωματικής βάσης) Nucleotide Excision Repair (NER) > ιορθώνει βλάβες οι οποίες παραμορφώνουν (bulk lesions) το σχήμα της διπλής έλικος του DNA, όπως σχηματισμός διμερών πυριμιδινών (pyrimidine dimers) και ομοιοπολική πρόσδεση ογκωδών χημικών ομάδων (συμμετοχή των XP proteins) Base excision repair (BER) > ιορθώνει κυρίως αλλοιώσεις μίας μόνο βάσης νουκλεοτιδίου (οξείδωση, μεθυλίωση, αποπουρίνωση ή απαμίνωση) και μονόκλωνες θραύσεις (SSBs; single strand breaks). Κύριος μηχανισμός για ιονίζουσες ακτινοβολίες και ειδικά χαμηλές δόσεις (<1 Gy) Nucleotide excision repair (NER) > ιορθώνει αλλοιώσεις που εκτείνονται συνήθως σε δύο ή περισσότερα νουκλεοτίδια (για παράδειγμα διμερή θυμίνης) και την προσθήκη ογκωδών μορίων (UV ακτινοβολίες)

18 Βλάβες DNA μετά από έκθεση σε ακτινοβολία low LET Τύπος της βλάβης Αριθμός ανά Gy Ρήξη διπλής αλυσίδας (Double strand break, DSB) 50 Ρήξη μονής αλυσίδας (Single strand break, SSB) Καταστροφή βάσης Καταστροφή σακχάρου Διασταυρούμενη σύνδεση D.N.A.-D.N.A. 30 Διασταυρούμενη σύνδεση D.N.A.- πρωτεΐνες 150

19 DNA ΚΑΙ ΙΟΝΙΖΟΥΣΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ Αμεση εναπόθεση ενέργειας Εμμεση εναπόθεση ενέργειας ιονισμοί βάσεων DNA Ραδιόλυση νερού, ΟΗ. (Σωματιδιακή ακτινοβολία) Σωμάτια-α (Ηλεκτρ/γνητική ακτινοβολία) Ακτίνες-γ, Χ υψηλές δόσεις χαμηλές δόσεις Θραύσεις κλώνων DNA μονόκλωνες (SSBs) ή/και δίκλωνες (DSBs) Αλλοιώσεις κλώνων (nicks): 1. Αλλοίωση ή/και απώλεια αζωτούχου βάσης ή/και σακχάρεος. 2 Αλκαλικώς ευαίσθητα σημεία ή/και 2. Αλκαλικώς ευαίσθητα σημεία ή/και θερμικώς ευαίσθητα σημεία.

20 ΤΕΧΝΙΚΕΣ Ηλεκτροφόρεση ρ αγαρόζης σταθερού και παλμικού πεδίου PFGE (CHEF DRII, Biorad) Ηλεκτροφόρεση απομονωμένων κυττάρων σε πήκτωμα αγαρόζης (SCGE or Comet Assay) Ενζυματικούς ανιχνευτές βλαβών

21 Περιγραφή των αρχών μεθόδου Ενδονουκλεάσης - PUTR για ανθρώπινα κύτταρα: -rays Προετοιμασία για ηλεκτροφορεση παλμικού πεδίου (CHEF) Λύσις των κυττάρων εντός μικροπηκτωμάτων αγαρόζης. Χρησιμοποίηση ενδονουκλεάσης, 37 o C, 1 hr. Control 37 o C, 1 hr. Χρησιμοποίηση PUTR, 37 o C, 1 hr.

22 Κίνηση η DNA σε πήκτωμα γέλη αγαρόζης +

23 Intensity Irradiated Migration

24 Pulsed Field Gel Electrophoresis

25 Measurement of OCDL in Human DNA Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Number Average Length Analysis (NALA) - + Radiation Size (Mbp) Endogenous E(+) R(+) E(+) J. Sutherland et al NALA 1. Calculate number average length (Ln) for each lane: Ln (-) and Ln (+) 2. DSBs = 1/Ln R R (+) - 1/Ln (-) 3. OCDL = 1/Ln E (+) -1/Ln E (-) Radiation (measure DSBs) Enzyme (OCDL)

26 Ανίχνευση διπλόκλωνων θραύσεων DSBs και ομαδοποιημένων βλαβών β σε καρκινικά κύτταρα MCF-7 ύστερα από έκθεση σε ακτινοβολία γ ( 5 Gy). Χρησιμοποιήθηκε η γλυκοσυλάση από βακτήριο E. coli Fpg. Το συγκεκριμένο ένζυμο αναγνωρίζει κυρίως οξειδωμένες πουρίνες (8- oxodg και άλλες) Francisco et al. (2008) Free Radic. Biol. Med.

27 Single Cell Gel Electrophoresis Comet Assay Tail Moment=(TAIL LENGTH) X Tail%DNA/100

28 Τεχνική της φοσφωρυλιωμένης ιστονικής πρωτείνης Η2Α ( -H2AX) Ιστόνη H2AX (14 kda) είναι ένα πανταχού παρόν μέλος της Η2Α οικογένεια ιστονών Στα θηλαστικά η Η2ΑΧ αντιπροσωπεύει το 10% της Η2Α Η φωσφορυλίωση πού γίνεται από κινάσες, όπως ATM και ATR, του 139 σερίνης εντός της SQ μοτίβο δίδει ένα μορφή γνωστή ως γ-h2ax σε απόκριση προς διπλής έλικος βλάβης DSBs του DNA και την απόπτωση. Rogakou, Bonner et al. J. Biol. Chem. 1998

29 Αρχές της τεχνικής Comet Assay Cells and agarose mixture Microscope slide cell lysis Electrophoresis (Alkaline or neutral conditions) Cells : Control Radiation or enzyme treatment Radiation DNA migration Ανίχνευση SSBs, DSBs and OCDL + Radiation + enzymatic probe Fluorescence labeling of DNA prior to analysis

30 Eίδος βλαβών που ανιχνεύονται με το Comet Assay Αλκαλικές λ συνθήκες: Μονόκλωνες θραύσεις και αλκαλικώς ευαίσθητα σημεία (SSBs and alkali labile sites). Ουδέτερες συνθήκες: ιπλόκλωνες λ θραύσεις (Double strand breaks, DSBs) Με τη χρήση επιδιορθωτικών ενζύμων: διαφορετικούς τύπους OCDL (abasic clusters, oxidized base clusters)

31 Ανίχνευση βλαβών DNA σε κύτταρα Acute Lymphoblastic Leukemia (NALM-6) μετά από έκθεση σε ακτινοβολία γ (4 Gy) με την τεχνική του Comet assay σε συνθήκες ουδέτερες (μη αλκαλικές) 5Gy 5Gy+Fpg 0Gy 10Gy 1. Holt, S. M. & Georgakilas, A. G. (2007) Radiat. Res. 168, Holt, S. M., Scemama, J. L., Panayiotidis, M. I. & Georgakilas, A. G. (2009) Mutat. Res. 674,

32 Ανίχνευση Χρωμοσωμικών Αλλοιώσεων με τις τεχνικές m-fish και m-band Κύτταρα MCF-7 Complex exchange Simple exchange Σε συνεργασία με την Dr. Hada, NASA/Johnson Center, TX, USA

33 Πιθανοί μηχανισμοί αντιμετώπισης των αβασικών δίκλωνων ομαδοποιημένων βλαβών: hape1 AP site Sequential Repair SSB DSB Διπλασιασμός hape1 Πιθανή δημιουργία μεταλλάξεων Επιδιόρθωση Κυτταρικός Κυτταρικός θάνατος

34 Μελλοντικές κατευθύνσεις: Πως επιδιορθώνουν τις συγκεκριμένες βλάβες κύτταρα με ελαττωματικούς μηχανισμούς μ επιδιόρθωσης? Α) Καρκίνος-Συμβολή των συγκεκριμένων βλαβώνβώ στη δημιουργία κυττάρων με υψηλό αριθμό μεταλλάξεων Καρκινογένεση. Β) Ανίχνευση προ-καρκινικών μορφών χρησιμοποιώντας τις ομαδοποιημένες βλάβες ως βιο-δείκτες (biomarkers).

35 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικόυ έργου του διδάσκοντα Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα Ε.Μ.Π.» έχει χρηματοδοτήσει μόνο την αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικού πόρους.