ΜΕΛΕΤΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ -ΚΑΡΒΟΞΥΜΕΘΥΛΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ (CMC) ΣΕ Υ ΑΤΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ Ε/N

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΜΕ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗ ΣΤΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΦΟΙΤΗΤΗ ΘΩΜΑ ΚΟΥΠΑΝΤΣΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΛΛΗΛΕΠΙ ΡΑΣΕΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΟΡΟΥ ΓΑΛΑΚΤΟΣ -ΚΑΡΒΟΞΥΜΕΘΥΛΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ (CMC) ΣΕ Υ ΑΤΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ. ΕΠΙ ΡΑΣΗ ΣΤΗ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΩΝ Ε/N ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Β. ΚΙΟΣΕΟΓΛΟΥ (Αναπλ. Καθ.) (ΕΠΙΒΛΕΠΟΝ) Μ.ΤΣΙΜΙ ΟΥ (Αναπλ. Καθ.) Γ. ΜΠΛΕΚΑΣ (Επικ. Καθ.) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα εργασία πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Χηµείας και Τεχνολογίας Τροφίµων του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ. στα πλαίσια του Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών υπό την καθοδήγηση του Αναπληρωτή Καθηγητή Β. Κιοσέογλου τον οποίο και ευχαριστώ θερµά για την επιστηµονική και ηθική του υποστήριξη, καθώς και την άριστη συνεργασία κατά την διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μ. Τσιµίδου και τον Επίκουρο Καθηγητή Γ. Μπλέκα, µέλη της τριµελούς επιτροπής, για τις πολύτιµες συµβουλές και υποδείξεις τους. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους εργάστηκαν στον ίδιο χώρο για την άψογη συνεργασία τους. Θωµάς Κουπάντσης Θεσσαλονίκη

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ...4 Β. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...5 Β.1 Εισαγωγή...5 Β.2. Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε συστήµατα τροφίµων...6 Β.2.1 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε υδατικά διαλύµατα...6 Β Σύστηµα µιας φάσης σε συνδυασµό µε το σχηµατισµό διαλυτού συµπλόκου...8 Β Σύστηµα µιας φάσης και αποκλεισµός του ενός βιοπολυµερούς από την περιοχή του άλλου...8 Β Σύστηµα δυο φάσεων µε παράλληλο σχηµατισµό συµπλόκου...9 Β Συστήµατα δυο φάσεων και διαχωρισµός των βιοπολυµερικών µορίων...13 Β.2.2 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε γαλακτώµατα...14 Β.3 Οι πρωτεΐνες του ορού του γάλακτος και οι ιδιότητές τους...16 Β.4 Τεχνικές παραλαβής των πρωτεϊνών του ορού...18 Β.4.1 Θερµική µετουσίωση...19 Β.4.2 Υπερδιήθηση...20 Β.4.3 Χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής...20 Β.4.4 Χρήση υδροκολλοειδών για την καταβύθιση των πρωτεϊνών...21 Β.5 Αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών του ορού µε πολυσακχαρίτες σε υδατικά διαλύµατα και σε γαλακτώµατα...23 Γ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Αντιδραστήρια - Υλικά Συσκευές Μέθοδοι Παραλαβή του πρωτεϊνικού συµπυκνώµατος (ΠΣΟ) από τον ορό του γάλακτος Προσδιορισµός της περιεκτικότητας του ΠΣΟ σε υγρασία, πρωτεΐνη, τέφρα και CMC Παρασκευή γαλακτωµάτων και µέτρηση του µεγέθους των σταγονιδίων Κατασκευή διαγράµµατος φυσικοχηµικής κατάστασης µίγµατος διαλυµάτων WPI και CMC Μελέτη αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης - πολυσακχαρίτη στα µίγµατα διαλυµάτων WPI - CMC Εκτίµηση του υδρόφοβου χαρακτήρα της επιφάνειας των πρωτεϊνικών µορίων και των σταγονιδίων του γαλακτώµατος Μέτρηση του ιξώδους των διαλυµάτων και γαλακτωµάτων Μέτρηση του ζ-δυναµικού στα διαλύµατα και τα γαλακτώµατα Εκτίµηση της σταθερότητας των γαλακτωµάτων Στατιστική επεξεργασία δεδοµένων...37 Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ...38 Ε1. Αλληλεπιδράσεις σε υδατικά διαλύµατα...38 Ε2. Αλληλεπιδράσεις σε γαλακτώµατα και η σταθερότητα τους...47 ΣΤ. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ...62 Ζ. ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ...63 Η. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

4 Α. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία έγινε χρήση καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης (CMC) µε σκοπό την παραλαβή της πρωτεΐνης από τον ορό του γάλακτος. Το πρωτεϊνικό συµπύκνωµα (ΠΣΟ) που προέκυψε µελετήθηκε ως προς την ικανότητά του να συµβάλει στη σταθεροποίηση γαλακτωµάτων ελαίου σε νερό κατά την αποθήκευσή τους ή σε συνδυασµό µε επεξεργασίες όπως είναι η θέρµανση και η κατάψυξη. Προκειµένου να αξιολογηθεί η σηµασία της παρουσίας καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης, στο πρωτεϊνικό συµπύκνωµα, σε υψηλή σχετικά συγκέντρωση (~24%) τα γαλακτώµατα συγκρίθηκαν µε αντίστοιχα γαλακτώµατα που παρασκευάστηκαν µε εµπορικό υπερσυµπύκνωµα πρωτεΐνης του ορού (WPI). Η σταθερότητα των γαλακτωµάτων του ΠΣΟ ως προς τη συσσωµάτωση και την αποκορύφωση των σταγονιδίων, και σε ένα µικρότερο βαθµό ως προς τη συγχώνευσή τους, φαίνεται ότι εξαρτάται από την παρουσία των µορίων του πολυσακχαρίτη στο σύστηµα καθώς επίσης και από την έκταση των αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια του πολυσακχαρίτη και της πρωτεΐνης και, έµµεσα, από την τιµή ph της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος. Οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στις πρωτεΐνες του ορού και την CMC, τόσο στα διαλύµατα όσο και στα γαλακτώµατα, µελετήθηκαν µε την βοήθεια µετρήσεων του ζ-δυναµικού και του ιξώδους. Τα δεδοµένα που προέκυψαν από τις µετρήσεις αυτές συνδυάστηκαν στην περίπτωση των υδατικών διαλυµάτων µιγµάτων WPI/CMC, µε δεδοµένα της υδροφοβικότητας της επιφάνειας των πρωτεϊνικών µορίων καθώς και µε µετρήσεις αλληλεπίδρασης του πολυσακχαρίτη µε κυανό του µεθυλενίου. Το συµπέρασµα που προέκυψε ήταν ότι οι πρωτεΐνες του ορού µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε τα µόρια της CMC όχι µόνο σε διαλύµατα µε τιµές ph µικρότερες από το ισοηλεκτρικό σηµείο της πρωτεΐνης, κάτι που ήταν αναµενόµενο, αλλά και σε τιµές ph κοντά στο ουδέτερο σηµείο και να προκύψουν, αντίστοιχα, αδιάλυτα ή διαλυτά σύµπλοκα πρωτεΐνης-πολυσακχαρίτη. Στην περίπτωση όµως των γαλακτωµάτων ο σχηµατισµός συµπλόκου περιορίστηκε µόνο σε χαµηλές τιµές ph πιθανόν λόγω της προσρόφησης των πρωτεϊνών στην διεπιφάνεια των σταγονιδίων και της µετουσίωσης που υπέστησαν, κάτι που δεν φαίνεται ότι ευνοεί την αλληλεπίδρασή τους µε τα µόρια του πολυσακχαρίτη της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος

5 Β. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β.1 Εισαγωγή Οι πρωτεΐνες και οι υδατάνθρακες αποτελούν µαζί µε τα λιπίδια τις τρεις κύριες κατηγορίες συστατικών των τροφίµων. Η θρεπτική αξία των συστατικών αυτών είναι µεγάλη και για το λόγο αυτό είναι απαραίτητα για την ανθρώπινη διατροφή. Επίσης, τα συστατικά αυτά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην παρασκευή και την επεξεργασία είτε των παραδοσιακών είτε των νέων προϊόντων που εµφανίστηκαν στην αγορά τα τελευταία χρόνια µε την ανάπτυξη της βιοµηχανίας τροφίµων, λόγω των αξιόλογων φυσικοχηµικών ιδιοτήτων τους. Ο όρος υδροκολλοειδή (Dickinson, 2003) αναφέρεται στα µεγάλου µοριακού βάρους υδρόφιλα βιοπολυµερή που χρησιµοποιούνται από τη βιοµηχανία για την τροποποίηση της µικροδοµής και της υφής των τροφίµων και για την επιµήκυνση του εµπορικού ορίου ζωής τους. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλοι οι πολυσακχαρίτες που παραλαµβάνονται από φυτικούς ιστούς ή από σπόρους. Γνωστά παραδείγµατα αποτελούν τα φυτικά κόµµεα και η κυτταρίνη καθώς, επίσης, και τα προϊόντα της χηµικής και ενζυµικής τροποποίησής τους, όπως είναι, για παράδειγµα, τα τροποποιηµένα άµυλα και η καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη. Τα κύρια χαρακτηριστικά των πολυσακχαριτών είναι ότι είναι υδρόφιλα µόρια, δεν είναι ιδιαίτερα δραστικά από χηµική άποψη, το µόριό τους µπορεί να είναι µια γραµµική ή διακλαδισµένη πολυµερική αλυσίδα, δεν εµφανίζουν κατά κανόνα τασενεργότητα και µπορεί να είναι ηλεκτρικώς ουδέτερα ή να φέρουν φορτίο. Στα τρόφιµα, η κύρια λειτουργική τους ιδιότητα είναι η παχυρευστοποίηση του συστήµατος και η πηκτωµατοποιητική δράση, σε συνδυασµό µε την ακινητοποίηση του νερού. Παραδείγµατα τέτοιων πολυσακχαριτών είναι το κόµµι guar, το κόµµι χαρουπιού και οι πηκτίνες (Dickinson, 2003). Ορισµένα παρουσίαζαν και µικρή γαλακτωµατοποιητική δράση όπως είναι κόµµι guar (Gardi & Reichman, 1993; 1994; 1999) και οι πηκτίνες (Dea & Madden 1986). Οι πρωτεΐνες είναι όλα τα µακροπεπτίδια µε µεγάλο µοριακό βάρος. Οι κύριες πηγές των πρωτεϊνών είναι τα τρόφιµα ζωικής προέλευσης και, δευτερευόντως, τα τρόφιµα φυτικής προέλευσης. Εµφανίζουν ένα µεγάλο εύρος δοµών, είναι ιδιαίτερα δραστικές, µε µοριακή αλυσίδα που παρουσιάζει σχετική ευελιξία, µε µικρότερο κατά - 5 -

6 κανόνα µοριακό βάρος και αρκετά µικρότερο µοριακό όγκο σε σχέση µε τους πολυσακχαρίτες, περιέχουν στο µόριο τους υδρόφοβα και υδρόφιλα τµήµατα, είναι πολυηλεκτρολύτες και εµφανίζουν µεγάλη ευαισθησία στην θέρµανση. Στα τρόφιµα η κυριότερες λειτουργικές δράσεις τους είναι η γαλακτωµατοποιητική και η αφριστική δράση (Rodriguez Patino, Sanchez & Rodriguez Nino, 1999; Song & Damodaran, 1987; Waniska & Kinsella, 1985), η σταθεροποίηση των συστηµάτων διασποράς και η παρασκευή πηκτών (Rosa, Sala, van Vliet & van de Velde, 2006). Σε αρκετά συστήµατα τροφίµων, και ειδικά σε αυτά που εµφανίζονται µε τη µορφή γαλακτώµατος, αφρού ή πηκτής, είναι δυνατό να συνυπάρχουν οι πρωτεΐνες µε τους πολυσακχαρίτες µε αποτέλεσµα να επηρεάζονται οι λειτουργικές ιδιότητες των πρώτων λόγω των αλληλεπιδράσεών τους µε τα µόρια του πολυσακχαρίτη. Η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων αυτών είναι η βάση για την εξήγηση της δοµής και των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων αρκετών τροφίµων. Φυσικά, η παρουσία και άλλων συστατικών πλην των πρωτεϊνών και των πολυσακχαριτών, όπως του λίπους, µπορεί να διαφοροποιήσει σηµαντικά τις ιδιότητες ενός τελικού προϊόντος σε σχέση µε ένα απλούστερο σύστηµα που περιέχει µόνο τα δυο αυτά συστατικά. Για το λόγο αυτό θεωρείται σκόπιµο να γίνει αρχικά αναφορά στις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνώνπολυσακχαριτών σε υδατικά διαλύµατα και ακολούθως σε πολυπλοκότερα συστήµατα που περιέχουν και άλλα συστατικά, όπως λιπαρή ύλη µε τη µορφή σταγονιδίων γαλακτώµατος. Β.2 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών Β.2.1 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε υδατικά διαλύµατα Οι αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνικών µορίων µε τα µόρια των πολυσακχαριτών στα συστήµατα των τροφίµων παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη της δοµής τους καθώς επίσης και στη φυσικοχηµική τους σταθερότητά. Για το λόγο αυτό η κατανόηση και ο έλεγχος των αλληλεπιδράσεων αυτών είναι το κλειδί για την παρασκευή τροφίµων µε επιθυµητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά και µεγάλη διάρκεια εµπορικής ζωής (Damodaran & Paraf, 1997). Οι λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών, όπως είναι η διαλυτότητα, η επιφανειοδραστικότητα και οι γαλακτωµατοποιητικές και αφριστικές ιδιότητες, - 6 -

7 επηρεάζονται άµεσα από της αλληλεπιδράσεις αυτές οι οποίες διακρίνονται σε ελκτικές και σε απωστικές. Οι ελκτικές αλληλεπιδράσεις οδηγούν στο σχηµατισµό συµπλόκων ανάµεσα στις πρωτεΐνες και τους πολυσακχαρίτες ενώ οι απωστικές αλληλεπιδράσεις σε µη αναµιξιµότητα των βιοπολυµερών και την εµφάνιση φαινοµένων διαχωρισµού φάσεων. Οι παράγοντες που επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις αυτές είναι η τιµή ph και η ιοντική ισχύς, η διαµόρφωση του µορίου των πολυµερών, η πυκνότητα του φορτίου και η συγκέντρωση. Για την καλύτερη κατανόηση των συστηµάτων στα οποία συνυπάρχουν οι πρωτεΐνες µε τους πολυσακχαρίτες, αυτά κατηγοριοποιούνται σε τέσσερις οµάδες, ανάλογα µε τον αριθµό των φάσεων που απαντώνται στο τελικό σύστηµα και τον σχηµατισµό ή µη συµπλόκου (Damodaran & Paraf 1997; Hettiarachchy & Ziegler, 1994). Τα συστήµατα αυτά είναι (Σχήµα 1): Σχήµα 1: Πιθανά συστήµατα φυσικοχηµικών καταστάσεων που προκύπτουν κατά την ανάµιξη διαλυµάτων πρωτεΐνης και πολυσακχαρίτη (Benichou, Aserin, Lutz, Garti, 2007). 1. Σύστηµα µιας φάσης σε συνδυασµό µε το σχηµατισµό διαλυτού συµπλόκου ανάµεσα στα µόρια των βιοπολυµερών (θερµοδυναµική συµβατότητα). 2. Σύστηµα µιας φάσης και αποκλεισµός του ενός βιοπολυµερούς από την περιοχή του άλλου (θερµοδυναµική ασυµβατότητα). 3. Σύστηµα δυο φάσεων µε παράλληλο σχηµατισµό συµπλόκου (θερµοδυναµική συµβατότητα). 4. Σύστηµα δυο φάσεων όπου κάθε βιοπολυµερές απαντάται σε διαφορετική φάση (θερµοδυναµική ασυµβατότητα)

8 Β Σύστηµα µιας φάσης σε συνδυασµό µε το σχηµατισµό διαλυτού συµπλόκου. Στην περίπτωση αυτή το σύστηµα χαρακτηρίζεται από θερµοδυναµική συµβατότητα των βιοπολυµερών και την εµφάνιση ελκτικών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόριά τους. Η εµφάνιση ελκτικών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια των δύο βιοπολυµερών οφείλεται στο αντίθετο φορτίο που φέρουν. Αυτό συµβαίνει κατά κανόνα σε τιµές pη χαµηλότερες από το ισοηλεκτρικό σηµείο της πρωτεΐνης όπου τα µόρια φέρουν συνολικά θετικό φορτίο ενώ αυτά του πολυσακχαρίτη αρνητικό. Η εµφάνιση ιοντικών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στις πρωτεΐνες και τους πολυσακχαρίτες προϋποθέτει τιµές ιοντικής ισχύος µικρότερες από 0,3, αφού υψηλή συγκέντρωση σε κατιόντα µετάλλων αναµένεται να οδηγήσει σε εξουδετέρωση των φορτίων µε αποτέλεσµα την απουσία ελκτικών δυνάµεων ανάµεσα στα δύο βιοπολυµερή. Η κύρια διαφορά µεταξύ της περίπτωσης του συστήµατος 1 και της περίπτωσης του συστήµατος 3, όπου έχουµε την καταβύθιση συµπλόκου (Β.2.1.3), είναι ότι το σύµπλοκο στην πρώτη περίπτωση παραµένει σε διασπορά και το σύστηµα, µακροσκοπικά, είναι οµοιογενές. Όταν η ολική συγκέντρωση των βιοπολυµερών αυξηθεί πάνω από ένα όριο ή µεταβληθεί (όπως θα περιγραφεί παρακάτω) η αναλογία πρωτεΐνης και πολυσακχαρίτη στο σύµπλοκο, το µείγµα των βιοπολυµερών από την κατάσταση του συστήµατος 1 µεταπίπτει σε αυτή του συστήµατος 3. Β Σύστηµα µιας φάσης και αποκλεισµός του ενός βιοπολυµερούς από την περιοχή του άλλου. Η δεύτερη περίπτωση εµφανίζεται όταν τα δυο βιοπολυµερή είναι θερµοδυναµικά ασύµβατα µεταξύ τους, όταν δηλαδή ισχύει G>0. Αυτό που συµβαίνει είναι ότι τα µόρια του κάθε βιοπολυµερούς καταλαµβάνουν τις δικές τους περιοχές µέσα στο διάλυµα αποκλείοντας από αυτές τα µόρια του άλλου. Αρχικά, λόγω της µικρής συγκέντρωσης των βιοπολυµερών το σύστηµα είναι µακροσκοπικά οµοιογενές, ενώ, σταδιακά, όταν η συγκέντρωση αυξηθεί πάνω από ένα όριο συγκέντρωσης («κατώφλι» συγκέντρωσης) το σύστηµα διαχωρίζεται σε δυο φάσεις και µεταπίπτει στο σύστηµα 4. Η ολική συγκέντρωση των δυο βιοπολυµερών στην - 8 -

9 οποία παρατηρείται διαχωρισµός φάσεων εξαρτάται από το είδος των βιοπολυµερών και µπορεί να κυµαίνεται από 2 έως 20%. Β Σύστηµα δυο φάσεων µε παράλληλο σχηµατισµό συµπλόκου. Στην τρίτη περίπτωση, όπως έχει ήδη αναφερθεί, το σύστηµα χαρακτηρίζεται από συµβατότητα λόγω των ελκτικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ των µορίων των βιοπολυµερών. Μακροσκοπικά, υπάρχουν δυο φάσεις. Η µια φάση είναι αυτή στην οποία απαντά το σύµπλοκο, όπου συνυπάρχουν και τα δυο πολυµερή, ενώ η δεύτερη είναι η φάση του διαλύτη όπου η συγκέντρωση των βιοπολυµερών είναι πολύ χαµηλή. Οι αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στο σχηµατισµό συµπλόκου πρωτεΐνηςπολυσακχαρίτη µπορεί να είναι δύο τύπων: α) αλληλεπιδράσεις µεταξύ αντίθετα φορτισµένων οµάδων που απαντούν στα µόρια των βιοπολυµερών, και β) αλληλεπιδράσεις µεταξύ άλλων διαθέσιµων οµάδων, υδρόφιλων ή υδρόφοβων. Η σταδιακή σύνδεση των βιοπολυµερών και η εξουδετέρωση των ηλεκτρικών τους φορτίων έχει ως αποτέλεσµα την ελάττωση του υδρόφιλου χαρακτήρα και της διαλυτότητας του τελικού συµπλόκου. Ακολούθως, τα, αρχικά, εν διασπορά αδιάλυτα σύµπλοκα συσσωµατώνονται και καταβυθίζονται. Αυτή είναι και η κύρια διαφορά ανάµεσα στο σύστηµα 1 και το σύστηµα 3. Η συσσωµάτωση ευνοείται από τον σχηµατισµό δεσµών υδρογόνου και την εµφάνιση υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων, αλληλεπιδράσεων διπόλου-διπόλου και αλληλεπιδράσεων φορτισµένων οµάδωνδιπόλου. Η σύσταση του ιοντικού συµπλόκου εξαρτάται εκτός των άλλων και από τον τρόπο της παρασκευής του. Όπως φαίνεται στο σχήµα 2, όταν η ρύθµιση της τιµής του pη γίνει ξεχωριστά στα δυο διαλύµατα των βιοπολυµερών και ακολουθήσει η ανάµιξη τους (σηµείο Α) προκύπτει εµφάνιση συµπλόκου µε ταυτόχρονη αύξηση της θολερότητας του συστήµατος. Με σταδιακή αύξηση της τιµής του pη πάνω από το ισοηλεκτρικό σηµείο της πρωτεΐνης (από το σηµείο Α στο Β) προκύπτει µείωση της θολερότητας επειδή το σύµπλοκο διασπάται στα συστατικά του. Αντίθετα, όταν προηγηθεί η ανάµιξη των δυο διαλυµάτων και ακολουθήσει σταδιακή µείωση της τιµής του pη (από το Β στο Γ) δεν παρατηρείται αύξηση της θολερότητας. Αυτό δεν σηµαίνει ότι δεν εµφανίζονται αλληλεπιδράσεις που οδηγούν στο σχηµατισµό συµπλόκου αλλά ότι το σύµπλοκο στο σηµείο Γ είναι διαφορετικής δοµής από αυτό - 9 -

10 του Α (Mitchell & Ledward, 1986). Το σύµπλοκο στο σηµείο Α ονοµάζεται Μ- σύµπλοκο (Mixing Complex) και είναι αδιάλυτο µε αποτέλεσµα το διαχωρισµό φάσεων. Σχήµα 2: Μεταβολή της θολερότητας ως συνάρτηση της τιµής του pη σε διάλυµα µίγµατος πρωτεΐνης-πολυσακχαρίτη (Tolstoguzov, 2002) Το σύµπλοκο στο σηµείο Γ ονοµάζεται Τ-σύµπλοκο (Titration Complex) και είναι διαλυτό στο νερό (Damodaran et al, 1997). Το Μ-σύµπλοκο σχηµατίζεται λόγω ισχυρών ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων (Σχήµα 3Α) σε χαµηλές τιµές ph που οδηγούν στη εµφάνιση σταυροδεσµών ανάµεσα στα µόρια των πρωτεϊνών και του πολυσακχαρίτη µε τελικό αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός τρισδιάστατου πλέγµατος. Το σύστηµα αυτό δεν βρίσκεται σε κατάσταση ισορροπίας. Όταν η τιµή του pη αυξηθεί πέραν της τιµής του ισοηλεκτρικού σηµείου της πρωτεΐνης (σηµείο Β του Σχήµατος 2), το πλέγµα διασπάται λόγω της απουσίας ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια των δύο βιοπολυµερών. Όταν ακολουθήσει, στη συνέχεια, σταδιακή ρύθµιση της τιµής pη προς την όξινη περιοχή, έχουµε την εµφάνιση αλληλεπιδράσεων και σχηµατισµό ενός διαλυτού συµπλόκου τύπου Τ (σηµείο Γ του Σχήµατος 2). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές δεν είναι όµως ιδιαίτερα ισχυρές ενώ, παράλληλα, το σύστηµα βρίσκεται σε κατάσταση ισορροπίας (Σχήµα 3Β)

11 Σχήµα 3: Σχηµατισµός του Μ-συµπλόκου (Α) και του Τ-συµπλόκου (Β) σε διάλυµα µίγµατος πρωτεΐνης - πολυσακχαρίτη. (Damodaran et al, 1997). Γενικά, η στοιχειοµετρία του συµπλόκου εξαρτάται από την πυκνότητα του φορτίου των πολυηλεκτρολυτών (de Kruif, Weinbreck & de Vries, 2004). Έτσι, για ένα πολυ-οξύ και µια σφαιροπρωτεΐνη ο λόγος της αναλογίας πρωτεΐνης/πολυ-οξέος µειώνεται µε τη µείωση της τιµής ph (Weinbreck & Wientjes, 2004). Σε τιµές pη χαµηλότερες από 2, λόγω της εξουδετέρωσης του φορτίου του πολυ-οξέος µε την πρωτονίωση των καρβοξυλοµάδων, δεν σχηµατίζεται σύµπλοκο της πρωτεΐνης µε το πολυ-οξύ, όπως φαίνεται και στο σχήµα 4. Το σχήµα αυτό αναφέρεται σε έναν ασθενή πολυ-ηλεκτρολύτη και µια πρωτεΐνη µε ισοηλεκτρικό σηµείο κοντά στην τιµή pη 5. Όπως φαίνεται, σε τιµές pη µικρότερες από 5 έχουµε το σχηµατισµό ενός αρχικά διαλυτού συµπλόκου ενώ σε τιµές pη κάτω από ένα όριο (pη Φ1 ) το σύµπλοκο αδιαλυτοποιείται και καταβυθίζεται οπότε προκύπτει ένα σύστηµα δυο φάσεων. Κάτω από το όριο pη Φ2 έχουµε εξουδετέρωση των φορτίων του πολυ-ηλεκτρολύτη µε αποτέλεσµα να µην αλληλεπιδρά ο πολυσακχαρίτης µε τα πρωτεϊνικά µόρια. Επίσης, σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων η περιοχή σχηµατισµού του συµπλόκου στενεύει γιατί έχουµε µερική εξουδετέρωση των φορτίων των βιοπολυµερών από τα ιόντα του διαλύµατος

12 Σχήµα 4: ιάγραµµα καταστάσεων µίγµατος ενός ασθενούς πολυ-ηλεκτρολύτη και µιας σφαιροπρωτεΐνης ως συνάρτηση της τιµής του pη και της συγκέντρωσης άλατος (de Kruif et al, 2004). Οι λειτουργικές ιδιότητες των µιγµάτων των πρωτεϊνών και των πολυσακχαριτών σε συστήµατα, στα οποία λαµβάνει χώρα σχηµατισµός συµπλόκου είναι δυνατό να τροποποιηθούν σηµαντικά σε σχέση µε τα απλά διαλύµατά τους, σε βαθµό που να γίνεται αναφορά πλέον σε ένα διαφορετικό σύστηµα (Tolstoguzov, Grinberg & Gurov, 1985). Η διαλυτότητα των πρωτεϊνών ανάλογα µε την τιµή ph µπορεί να αυξάνεται ή να µειώνεται, λόγω της δηµιουργίας του ηλεκτροστατικού συµπλόκου. Για παράδειγµα, ο σχηµατισµός του Τ-συµπλόκου είναι υπεύθυνος για την αύξηση της διαλυτότητας των πρωτεϊνών στο ισοηλεκτρικό σηµείο. Ο βαθµός του υδρόφιλου και υδρόφοβου χαρακτήρα του συµπλόκου καθορίζεται από την αναλογία πρωτεΐνης πολυσακχαρίτη στις ζώνες συµβολής (junction zones). Η αύξηση του µεγέθους των ζωνών οδηγεί στην καταβύθιση των πρωτεϊνών σε τιµές ph µικρότερες από το ισοηλεκτρικό τους σηµείο, γεγονός που αξιοποιείται στην παραλαβή τους από αραιά διαλύµατα. Ακόµη, κατά την παρασκευή ενός γαλακτώµατος ο σχηµατισµός του υµενίου στην επιφάνεια των σταγονιδίων πραγµατοποιείται µε την προσρόφηση των πρωτεϊνών ενώ οι πολυσακχαρίτες είναι δυνατό να συµβάλουν στη σταθεροποίηση του γαλακτώµατος λόγω του σχηµατισµού συµπλόκου µε τα µόρια της πρωτεΐνης που βρίσκονται στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού και την έµµεση προσρόφηση στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Τέλος, και οι ρεολογικές ιδιότητες του συστήµατος επηρεάζονται άµεσα από την ανάπτυξη των

13 ηλεκτροστατικών δυνάµεων των βιοπολυµερών. Για παράδειγµα, σε πηκτές µίγµατος καραγενάνης-πρωτεΐνης ορού παρατηρήθηκε µια ενίσχυση των ρεολογικών τους χαρακτηριστικών σε σχέση µε τα απλά συστήµατα η οποία αποδόθηκε στο σχηµατισµό συµπλόκου ανάµεσα στα µόρια των δύο βιοπολυµερών (Eleya & Turgeon 2000a; 2000b). Επίσης, σε διάλυµα µίγµατος πρωτεΐνης ορού-αραβικού κόµµεος ο σχηµατισµός συµπλόκου είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση του ιξώδους σε τιµή pη 4,0, όπου ευνοείται η µέγιστος βαθµός αλληλεπίδρασης ανάµεσα στα βιοπολυµερή (de Kruif et al, 2004). Β Συστήµατα δυο φάσεων και διαχωρισµός των βιοπολυµερικών µορίων. Στην περίπτωση των συστηµάτων αυτών υπάρχει θερµοδυναµική ασυµβατότητα αφού οι κυρίαρχες δυνάµεις πού αναπτύσσονται ανάµεσα στα µόρια των βιοπολυµερών είναι απωστικές. Η ασυµβατότητα οφείλεται στην ανταγωνιστική δράση που παρουσιάζουν τα βιοπολυµερή για την κατοχή του χώρου στο διάλυµα. Η περιεκτικότητα του νερού είναι µεγαλύτερη στην φάση του βιοπολυµερούς που είναι περισσότερο υδρόφιλο. Το σύστηµα αυτό προκύπτει όταν η συνολική συγκέντρωση των βιοπολυµερών ξεπεράσει ένα όριο µε αποτέλεσµα, ενώ σε σχετικά χαµηλή συγκέντρωση, παρά την ύπαρξη ασυµβατότητας ανάµεσα στα δύο βιοπολυµερή, να συνυπάρχουν τα µόρια σε µία φάση (Σύστηµα 2), όταν ξεπεραστεί το όριο να προκύπτει διαχωρισµός φάσεων (de Kruif & Tuinier, 2001). Ο κυρίαρχος θερµοδυναµικός όρος είναι ο εντροπικός που καθορίζει και την τύχη του συστήµατος. Το «κατώφλι» της ολικής συγκέντρωσης για το διαχωρισµό των φάσεων µπορεί να κυµαίνεται από 2 έως 20% και η τιµή αυτή εξαρτάται από το µέγεθος και τη δοµή των µορίων των βιοπολυµερών. Για παράδειγµα, για σύστηµα καζεΐνης-κόµµεος guar είναι 3,6% (Neirynck, Lent, Dewettinck & van der Meeren, 2006), ενώ για µίγµατα σφαιροπρωτεϊνών µε πολυσακχαρίτες η τιµή του είναι περίπου λίγο υψηλότερη από το 4%. Πιο συγκεκριµένα, για συστήµατα πρωτεΐνης ορού-πηκτίνης η τιµή αυτή βρέθηκε ότι είναι 5,2% (Ercelebri et al, 2006). Όταν, όµως, οι πρωτεΐνες του ορού µετουσιωθούν µε θερµική επεξεργασία το όριο αυτό µειώνεται στο ~1,5% (Kim, Decker & McClements, 2006)

14 Β.2.2 Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε γαλακτώµατα Τα γαλακτώµατα είναι συστήµατα θερµοδυναµικώς ασταθή αφού ο βαθµός της αναµιξιµότητας του νερού µε το έλαιο είναι πρακτικά µηδενικός. Όλες οι ενέργειες που γίνονται αποσκοπούν στην κινητική σταθεροποίηση τους και στην επιµήκυνση του χρόνου µέσα στον οποίο θα προκύψει διαχωρισµός των δυο φάσεων ώστε να αυξηθεί το όριο ζωής του τροφίµου. Οι διαδικασίες µε τις οποίες συνδέεται η κινητική σταθερότητα των γαλακτωµάτων είναι ο διαχωρισµός των σταγονιδίων /αποκορύφωση (creaming), η συσσωµάτωση / κροκίδωση (aggregation / flocculation) και η συγχώνευση (coalescence). Οι παράγοντες που εµπλέκονται στις διαδικασίες αυτές και τις καθορίζουν είναι οι αλληλεπιδράσεις των σταγονιδίων (Πίνακας 1) οι οποίες στα συστήµατα που συνυπάρχουν οι πρωτεΐνες και οι πολυσακχαρίτες συνδέονται µε τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα µόρια των δυο βιοπολυµερών. Πίνακας 1: Αλληλεπιδράσεις σταγονιδίων γαλακτώµατος και τα αποτελέσµατά τους Είδος αλληλεπίδρασης Ηλεκτροστατικές Πολυµερικές (Steric interaction) Πολυµερική γεφύρωση (Bridging flocculation) Υδρόφοβες Οσµωτική συσσωµάτωση (Depletion flocculation) Αποτέλεσµα Απώσεις Απώσεις Έλξεις Έλξεις Έλξεις Με βάση τα όσα προαναφέρθηκαν παραπάνω σχετικά µε τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών-πολυσακχαριτών σε διαλύµατα, στην περίπτωση πολυπλοκότερων συστηµάτων, όπως τα γαλακτώµατα, στα οποία συνυπάρχουν πρωτεΐνες µε πολυσακχαρίτες, µπορεί να εµφανιστούν φαινόµενα συµβατότητας και σταθεροποίηση του συστήµατος ή φαινόµενα ασυµβατότητας και διαχωρισµός φάσεων (de Kruif et al, 2001; Dickinson, 2003) Η µερική µετουσίωση που υφίστανται οι πρωτεΐνες και ειδικά οι σφαιροπρωτεΐνες κατά την προσρόφησή τους στην επιφάνεια των σταγονιδίων ενός γαλακτώµατος έχει ως αποτέλεσµα την αποδιάταξη του µορίου τους και την εµφάνιση υδρόφιλων και ιονισµένων οµάδων στην εξωτερική επιφάνεια των

15 σταγονιδίων ενώ αντίθετα οι περισσότερο υδρόφοβες οµάδες διεισδύουν («αγκυρώνονται») βαθύτερα στην λιπαρή φάση. Η παρουσία του πολυσακχαρίτη που είναι συµβατός µε την προσροφηµένη πρωτεΐνη έχει ως αποτέλεσµα την ανάπτυξη αλληλεπιδράσεων που µπορούν ευκολότερα να σταθεροποιήσουν το σύστηµα, όπως παρατηρήθηκε για παράδειγµα, σε γαλακτώµατα που περιείχαν µίγµα πρωτεΐνης ορού-χιτοζάνης (Speiciene, Guilmineau, Kulozik & Leskauskaite, 2007). Σε ορισµένες περιπτώσεις, οι αλληλεπιδράσεις αυτές µπορούν να αποσταθεροποιήσουν το γαλάκτωµα, όπως για παράδειγµα στο σύστηµα αλβουµίνης ορού κ-καραγενάνης (Dickinson, & Pawlowsky, 1998) και β-λακτογλοβουλίνης καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης (Blijdnstein 2004). Έτσι λοιπόν οι ισχυρές ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των βιοπολυµερών οδηγούν στον σχηµατισµό µιας δεύτερης στιβάδας από τον προσροφηµένο πολυσακχαρίτη, στην διεπιφάνεια των σταγονιδίων τους, όπως φαίνεται στο Σχήµα 5α. Η στοιβάδα του πολυσακχαρίτη σταθεροποιεί το σύστηµα από την συγχώνευση λόγω των πολυµερικών παρεµποδίσεων που δεν επιτρέπουν την προσέγγιση των σταγονιδίων. Για να µπορέσει να υπάρξει επαφή και ακολούθως συγχώνευση απαιτείται ενέργεια ώστε να ξεπεραστεί το ενεργειακό φράγµα της κάµψης του ελεύθερου άκρου των αλυσίδων του πολυσακχαρίτη. Σχήµα 5: Στερεοχηµικές αλληλεπιδράσεις και πολυµερική γεφύρωση σε γαλάκτωµα (Dickinson, 2003) Όπως φαίνεται στο Σχήµα 5β, όταν η συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη στο σύστηµα αυξηθεί, µειώνεται η κινητικότητα των σταγονιδίων και αυξάνεται η σταθερότητα του γαλακτώµατος, ενώ µια πολύ µεγάλη αύξηση της συγκέντρωσης του

16 πολυσακχαρίτη µπορεί να οδηγήσει στο σχηµατισµό πηκτής (Σχήµα 5β) και σε πλήρη ακινητοποίηση των σταγονιδίων. Αντίθετα, όταν η συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη είναι µικρή (Σχήµα 5γ) το σύστηµα είναι δυνατό να αποσταθεροποιηθεί, πρώτον λόγω µείωσης της ηλεκτρικής άπωσης ανάµεσα στα σταγονίδια, εξαιτίας της µερικής εξουδετέρωσης των φορτίων της προσροφηµένης πρωτεΐνης από τα φορτία του πολυσακχαρίτη, και δεύτερον λόγω του φαινόµενου της πολυµερικής γεφύρωσης, δηλαδή της σύνδεσης δυο σταγονιδίων µε την αλυσίδα του πολυσακχαρίτη. Όταν ανάµεσα στα µόρια της πρωτεΐνης και του πολυσακχαρίτη δεν υπάρχουν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις γιατί ο πολυσακχαρίτης δεν φέρει φορτία, όπως για παράδειγµα το κόµµι guar (Neirynck et al, 2006) ή η χιτοζάνη (Speiciene et al, 2007), τότε υπάρχει ασυµβατότητα και ευνοείται η συσσωµάτωση λόγω οσµωτικών φαινοµένων (Σχήµα 6). Σχήµα 6: Οσµωτική συσσωµάτωση (Τα βέλη δείχνουν την κίνηση των µορίων του πολυσακχαρίτη) Β.3 Οι πρωτεΐνες του ορού του γάλακτος και οι ιδιότητές τους Ο ορός του γάλακτος είναι το προϊόν που προκύπτει µετά την καταβύθιση και αποµάκρυνση των καζεϊνών. Η σύσταση και η λειτουργικότητα του ορού µπορεί να ποικίλει ανάλογα µε την διαδικασία παραλαβής και τις εποχικές διακυµάνσεις της σύστασης του γάλακτος (Zadow, 1986; Hettiarachchy & Ziegler, 1994). Ο ορός µπορεί να προκύψει µετά από ενζυµική καταβύθιση των καζεϊνών του γάλακτος µε τη βοήθεια του ενζύµου χυµοσίνη της ρενίνης. Στην περίπτωση αυτή ο ορός

17 χαρακτηρίζεται ουδέτερος και έχει τιµή pη περίπου 6,6. Ο δεύτερος τρόπος είναι µε θρόµβωση των καζεϊνών µε την χρήση οξέος, όπως για παράδειγµα υδροχλωρικού ή οξικού οξέος, οπότε ο ορός χαρακτηρίζεται όξινος (Fennema 1996). Οι πρωτεΐνες του ορού αποτελούν περίπου 20% των συνολικών πρωτεϊνικών συστατικών του γάλακτος. Η συγκέντρωση τους στο γάλα είναι περίπου 0,5% g/l και η επιµέρους σύσταση τους φαίνεται στο παρακάτω σχήµα. Oι κυριότερες πρωτεΐνες του ορού είναι η α-λακταλβουµίνη (α-lac), η β-λακτογλοβουλίνη (β-lg) και η αλβουµίνη του ορού (BSA). β- Λακτογλοβουλίνη 49%(2,0-4,0) Λακτοφερρίνη 3%(0,2) Αλβουµίνη ορού 5%(0,4) Ανοσοσφαιρίνες 13%(0,4-1,0) Άλλα αζωτούχα συστατικά 11%(0,9) α-λακταλβουµίνη 19%(1,0-1,5) Σχήµα 7: Σύσταση των πρωτεϊνών του ορού(g/l) (Damodaran et al, 1997) Η πρωτεΐνη που απαντά στον ορό σε µεγαλύτερη συγκέντρωση είναι η β- λακτογλοβουλίνη (β-lg) (Damodaran et al, 1997; Fennema 1996; Belitz 2004). Το µονοµερές της έχει µοριακό βάρος 18,3 kda, αποτελείται από 162 αµινοξέα και χαρακτηρίζεται ως σφαιροπρωτεϊνη. Παρουσιάζει µια αρκετά οργανωµένη δοµή µε το 43-50% των αµινοξέων να είναι οργανωµένα σε δοµή β-πτυχωτού φύλλου και το 10-15% σε δοµή α-έλικας. Η α-λακταλβουµίνη (α-lac) είναι µια πρωτεΐνη µε µοριακό βάρος περίπου 14,2 kda και αποτελείται από 123 αµινοξέα. Έχει µια λιγότερο οργανωµένη δοµή από αυτή της β-λακτογλοβουλίνης, µε το 9% των αµινοξέων να είναι οργανωµένα σε δοµή β-πτυχωτού φύλλου και το 30% σε α-έλικα. Η δοµή της πρωτεΐνης σταθεροποιείται από τέσσερις δισουλφιδικούς δεσµούς που σχηµατίζουν 8 µόρια κυστεΐνης που υπάρχουν στο µόριο της. Η α-λακταλβουµίνη µετουσιώνεται σε χαµηλότερες θερµοκρασίες σε σχέση µε την β-λακτογλοβουλίνη ενώ είναι περισσότερο υδρόφιλη από αυτήν

18 Η αλβουµίνη του ορού (BSA) είναι µια πρωτεΐνη µε µεγάλο µοριακό βάρος, περίπου 66,3 kda. Το µόριο αποτελείται από 582 αµινοξέα και περιέχει 17 δισουλφιδικούς δεσµούς. Μετουσιώνεται µε προσθήκη οξέος ή βάσης και µε θέρµανση στους C. Οι ιδιότητες των πρωτεϊνών του ορού εξαρτώνται από παράγοντες, όπως η τιµή pη, η παρουσία αλάτων και άλλων πρωτεϊνών, καθώς, και από την επεξεργασία στην οποία υποβάλλεται το γάλα, αλλά και από τον τρόπο παραλαβής τους από τον ορό (Hettiarachchy & Ziegler, 1994). Η διαλυτότητα των πρωτεϊνών του ορού σε τιµές pη µακριά από το ισοηλεκτρικό τους σηµείο είναι µεγάλη λόγω του µικρού µεγέθους των µορίων τους, του µεγάλου αριθµού των υδρόφιλων οµάδων που είναι εκτεθειµένες στην επιφάνεια τους και, τέλος, του οµόσηµου φορτίου που φέρουν τα µόρια. Επίσης, η διαλυτότητα τους δεν επηρεάζεται πολύ από την παρουσία αλάτων. Αντίθετα, σε τιµές pη κοντά στο ισοηλεκτρικό τους σηµείο, τα φορτία αλληλοεξουδετερώνονται µε αποτέλεσµα να µειώνεται η ένταση των απωστικών δυνάµεων που λειτουργούν ανάµεσα στα µόρια και να ελαττώνεται η διαλυτότητα (Burgess & Kelly 1979). Η αντοχή στη θερµική µετουσίωση (Fennema, 1996; Law & Leaver, 1999) των πρωτεϊνών του ορού ακολουθεί την σειρά: α-λακταλβουµίνη < β- λακτογλοβουλίνη < αλβουµίνη < ανοσοσφαιρίνες. Επειδή, όµως, η µετουσίωση της α-λακταλβουµίνης είναι αντιστρεπτή, η πρωτεΐνη αυτή χαρακτηρίζεται από πολλούς ως η πλέον θερµοάντοχη. Η κατάταξη αυτή αναφέρεται για έκθεση σε θερµοκρασίες µικρότερες από 70 0 C που αντιστοιχούν στις θερµοκρασίες των περισσότερων θερµικών επεξεργασιών στις οποίες υποβάλλεται το γάλα, αφού σε υψηλότερες θερµοκρασίες η µετουσίωση είναι πλήρης και για τις τέσσερις πρωτεΐνες του ορού. Β.4 Τεχνικές παραλαβής των πρωτεϊνών του ορού Ένα πρόβληµα της βιοµηχανίας τροφίµων που σχετίζεται µε την επεξεργασία των πρώτων υλών για την παραγωγή των τελικών προϊόντων, είναι η παραγωγή µεγάλων όγκων αποβλήτων. Τα απόβλητα αυτά µπορούν να αξιοποιηθούν µε δυο τρόπους (Knorr, 1983). Πρώτον, µε την ανάκτηση των συστατικών τους µε χηµικά ή φυσικά µέσα και, δεύτερον, µε βιοτεχνολογική µετατροπή τους σε άλλα προϊόντα. Γενικά, τα συστατικά που µπορούν να αποµονωθούν από τα απόβλητα της

19 βιοµηχανίας των τροφίµων είναι οι πρωτεΐνες, οι υδατάνθρακες, τα λιπίδια, τα οργανικά οξέα, τα ανόργανα άλατα, οι βιταµίνες, οι χρωστικές και οι πτητικές ενώσεις. Στην περίπτωση της γαλακτοβιοµηχανίας το κύριο υποπροϊόν είναι ο ορός του γάλακτος. Με την εκµετάλλευση του παραγόµενου ορού αποτρέπεται η ρύπανση, αφού αυτός είναι πλούσιος σε οργανικό φορτίο ενώ, παράλληλα, γίνεται παραλαβή πολύτιµων συστατικών, όπως είναι η λακτόζη και οι πρωτεΐνες του ορού µε απώτερο σκοπό τη χρήση τους στα τρόφιµα ή ως θρεπτικό υπόστρωµα σε καλλιέργειες µικροοργανισµών για την παραγωγή προϊόντον για φαρµακευτική χρήση (Guerra, Bernardez & Castro, 2007), για την παραγωγή βιοαιθανόλης (Staniszewski, Kujawski & Lewandowska, 2007) και βιοκαυσίµων (Gelegenis, Georgakakis, Angelidaki, & Mavris, 2007). Οι διαδικασίες που θα πρέπει να εφαρµοσθούν σε βιοµηχανική κλίµακα για την παραλαβή των πρωτεϊνών του ορού θα πρέπει να συνδυάζουν το χαµηλό κόστος, την απλότητα της εφαρµογής και την προσαρµοστικότητα στις µεταβολές της σύστασης του προϊόντος τροφοδοσίας. Ανάλογα µε την περιεκτικότητά τους σε πρωτεΐνη τα παρασκευάσµατα που παραλαµβάνονται από τον ορό διακρίνονται σε τρεις κύριες κατηγορίες, τον αφυδατωµένο ορό µε περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη κοντά στο 12%, τα πρωτεϊνικά συµπυκνώµατα (WPC Whey Protein Concentrates) που περιέχουν πρωτεΐνη 35-80% και τα πρωτεϊνικά υπερσυµπυκνώµατα (WPI Whey Protein Isolates) µε περιεκτικότητα πρωτεΐνης υψηλότερη από 80% (Morr, 1984). Ο αφυδατωµένος ορός προκύπτει µε συµπύκνωση του ορού και αφυδάτωση. Σε κάποιες περιπτώσεις, πριν την ξήρανση, αποµακρύνεται η λακτόζη µε υπερδιήθηση και τα άλατα µε ηλεκτροδιάλυση µε σκοπό να αυξηθεί το ποσοστό των πρωτεϊνών στο 30% (Morr, 1984). Εκτός από τον αφυδατωµένο ορό, παρασκευάσµατα πλουσιότερα σε πρωτεΐνη είναι δυνατό να παραληφθούν µε τις ακόλουθες τεχνικές. Β.4.1 Θερµική µετουσίωση. Οι συνθήκες που χρησιµοποιούνται στην τεχνική αυτή είναι θερµοκρασίες >90 0 C και τιµές pη<6, µε αποτέλεσµα οι πρωτεΐνες να µετουσιώνονται και να καθιζάνουν. Το τελικό προϊόν παραλαµβάνεται µε φυγοκέντρηση και ξήρανση. Το µεγαλύτερο µειονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι οι έντονες συνθήκες που

20 εφαρµόζονται οδηγούν σε ένα τελικό προϊόν µε περιορισµένη διαλυτότητα, αφού η µετουσίωση των πρωτεϊνικών µορίων είναι µη αναστρέψιµη, ενώ το προϊόν µπορεί επίσης να εµφανίζει µια δυσάρεστη οσµή. Η εφαρµογή της τεχνικής αυτής περιορίζεται στην παρασκευή συγκεκριµένων τύπων τυριών (π.χ. µυζήθρα) και όχι στην αποµόνωση πρωτεϊνών για την επαναχρησιµοποίηση τους σε άλλα συστήµατα τροφίµων, λόγω µειωµένης λειτουργικότητας. Β.4.2 Υπερδιήθηση Στην τεχνική αυτή χρησιµοποιούνται µεµβράνες µε σκοπό την αποµάκρυνση από τον ορό των µικρού µοριακού βάρους συστατικών, όπως των αλάτων, της λακτόζης και του νερού. Οι συνθήκες λειτουργίας της υπερδιήθησης είναι ήπιες µε θερµοκρασίες µεταξύ 10 0 C και 50 0 C και τιµές pη µεταξύ 4,5 και 6,5 µε αποτέλεσµα την υψηλή λειτουργικότητα των πρωτεϊνών που παραλαµβάνονται. Η τεχνική αυτή µπορεί να συνδυαστεί µε την τεχνική της αντίστροφης όσµωσης µε σκοπό την αρχική συµπύκνωση του ορού. Ακολούθως, το συµπυκνωµένο προϊόν υποβάλλεται σε υπερδιήθηση µε αποτέλεσµα η περιεκτικότητά του σε πρωτεΐνη να ανέλθει στο 18-22%. Με τη διαδικασία αυτή προκύπτουν πρωτεϊνικά συµπυκνώµατα (WPC) µε περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη έως και 80%. Τα πλεονεκτήµατα της τεχνικής αυτής είναι ο εύκολος σχεδιασµός και η απλή λειτουργία που την καθιστούν ιδανική για βιοµηχανικές εφαρµογές και την παραγωγή µεγάλων ποσοτήτων πρωτεϊνών ορού (Morr, 1984). Β.4.3 Χρωµατογραφία ιονανταλλαγής Με την τεχνική αυτή παραλαµβάνονται υπερσυµπυκνώµατα µε περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη υψηλότερη από 90% που εµφανίζουν πολύ καλές λειτουργικές ιδιότητες. Ένα ακόµη πλεονέκτηµα της τεχνικής αυτής, έναντι των προηγούµενων, είναι ότι το πρωτεϊνικό παρασκεύασµα έχει χαµηλή περιεκτικότητα σε λιπίδια. Τα συστατικά αυτά είναι ανεπιθύµητα γιατί επηρεάζουν αρνητικά τις αφριστικές και τις πηκτωµατοποιητικές ιδιότητες των πρωτεϊνών του ορού καθώς επίσης και για την ανάπτυξη δυσάρεστης οσµής κατά την αποθήκευση (Burgess & Kelly 1979). Ένα από τα σηµαντικότερα µειονεκτήµατα της τεχνικής αυτής είναι το υψηλό λειτουργικό της κόστος (Morr, 1984)

21 Β.4.4 Χρήση υδροκολλοειδών για την καταβύθιση των πρωτεϊνών Η τεχνική αυτή αποσκοπεί στην καταβύθιση των πρωτεϊνών από τον ορό µε τη βοήθεια ανιοντικών πολυσακχαριτών, όπως είναι το αλγινικό νάτριο, η θειϊκή δεξτράνη και η καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη (Hansen, Hidalgo & Gould, 1971; Smith, Nash, Eldridge & Wolk, 1962). Η καταβύθιση των πρωτεϊνών του ορού µε ρύθµιση της τιµής pη κάτω από το ισοηλεκτρικό τους σηµείο, που κυµαίνεται από 4,8 έως 5,5, όπως γίνεται στην περίπτωση των καζεϊνών, δεν είναι εφικτή εξαιτίας της πολύ χαµηλής τους συγκέντρωσης στον ορό και της σχετικά µεγάλης διαλυτότητάς τους. Η προσθήκη του πολυσακχαρίτη αποσκοπεί στο σχηµατισµό σταθερού συµπλόκου µε τα µόρια των πρωτεϊνών, που οφείλεται στην ανάπτυξη ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων µεταξύ των θετικά φορτισµένων πρωτεϊνικών µορίων και των αρνητικά φορτισµένων µορίων του πολυσακχαρίτη. Η συγκεκριµένη διαδικασία έχει χρησιµοποιηθεί για την ανάκτηση πρωτεϊνών και από άλλα είδη υγρών αποβλήτων της βιοµηχανίας τροφίµων, όπως είναι τα απόβλητα της βιοµηχανίας επεξεργασίας της πατάτας Οι πρωτεΐνες που παραλήφθηκαν µετά από συµπλοκοποίηση τους µε καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη παρουσίαζαν καλές λειτουργικές ιδιότητες (Partsia & Kiosseoglou, 2001). Η χρήση καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης για την ανάκτηση των πρωτεϊνών από τον ορό αναφέρεται σε µία σειρά εργασιών (Zadow & Hill, 1974, Hill & Zadow, 1974; Hansen et al, 1971) οι οποίες είχαν ως στόχο την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών για την παραλαβή τους. Από τις εργασίες αυτές προκύπτει ότι: α. Η απόδοση της µεθόδου παραλαβής εξαρτάται από την αναλογία βαρών CMC /πρωτεΐνης και εµφανίζει µέγιστες τιµές σε όταν η αναλογία βάρους είναι 1:3 ή 1:4. Όταν η αναλογία βάρους είναι µεγαλύτερη µειώνεται η απόδοση λόγω επαναδιαλυτοποίησης του συµπλόκου. Η αναλογία αυτή εξαρτάται από τον βαθµό υποκατάστασης του CMC και αυξάνεται όσο αυξάνεται και αυτός (Zadow et al, 1974). β. Η βέλτιστη τιµή pη για την παραλαβή της πρωτεΐνης ανέρχεται 3,2 και µειώνεται µε αύξηση του βαθµού υποκατάστασης της καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης. γ. Ο βαθµός υποκατάστασης επηρεάζει την απόδοση της καταβύθισης, ενώ όσο αυξάνεται αυτός τόσο αυξάνεται και η απόδοση

22 δ. Η ιοντική ισχύς (Zadow et al, 1974; Hill et al, 1974) είναι ένας σηµαντικός παράγοντας που επηρεάζει το σχηµατισµό του συµπλόκου µεταξύ πρωτεΐνης και πολυσακχαρίτη και η τιµή της θα πρέπει να είναι µικρότερη από 0,1 γιατί, διαφορετικά, παρατηρείται επαναδιαλυτοποίηση του συµπλόκου. Το τελικό προϊόν που παραλαµβάνεται κατά την εφαρµογή της διαδικασίας αυτής (Σχήµα 8) είναι ένα µίγµα πρωτεϊνών µε καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη, σε αναλογία περίπου 2:1, το οποίο µπορεί να χαρακτηρισθεί ως πρωτεϊνικό συµπύκνωµα (περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη περίπου 65%) (Hill et al, 1974). Παρόλο που η αποδιάταξη του συµπλόκου και ο διαχωρισµός των συστατικών του στο διάλυµα είναι εφικτός µε την ρύθµιση της τιµής pη, της ιοντικής ισχύoς ή και των δύο, η αποµόνωση των επιµέρους συστατικών του συµπυκνώµατος και η παραλαβή πρωτεΐνης του ορού απαλλαγµένης από πολυσακχαρίτη δεν είναι εύκολο να γίνει. Σχήµα 8: ιάγραµµα ροής για την καταβύθιση της πρωτεΐνης του ορού µε CMC (Hill et al, 1974) Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητο να µελετηθούν οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα δυο βιοπολυµερή επειδή τα µόριά τους θα συνυπάρξουν αναγκαστικά

23 στα διαλύµατα και η παρουσία των µορίων του CMC είναι πιθανό να επηρεάσει τις λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών του ορού σε συστήµατα τροφίµων που εµφανίζονται µε τη µορφή γαλακτώµατος ή πηκτής. Β.5 Αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών του ορού µε πολυσακχαρίτες σε υδατικά διαλύµατα και σε γαλακτώµατα Στη βιβλιογραφία υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός εργασιών που αναφέρονται στις αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών του ορού µε πολυσακχαρίτες σε υδατικά διαλύµατα καθώς επίσης και στη σηµασία των αλληλεπιδράσεων αυτών στις λειτουργικές ιδιότητες των επιµέρους βιοπολυµερών. Η πλέον συνηθισµένη προσέγγιση για τη µελέτη αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η κατασκευή διαγραµµάτων φάσεων για διαλύµατα µιγµάτων των δύο βιοπολυµερών σε συνάρτηση µε τη συγκέντρωση και τις συνθήκες. Σύµφωνα µε τους Speiciene et al (2007) σε σύστηµα µίγµατος πρωτεΐνης ορού-χιτοζάνης και για συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και χιτοζάνης 5% και 0.7%, αντίστοιχα, παρατηρείται ασυµβατότητα ανάµεσα στα δύο βιοπολυµερή και διαχωρισµός φάσεων. Σε µίγµατα µε µικρότερη συγκέντρωση, η ασυµβατότητα δεν οδηγεί σε διαχωρισµό φάσεων έχει όµως αποτέλεσµα τη µεταβολή της συµπεριφοράς των πρωτεϊνικών µορίων στο διάλυµα λόγω της αύξησης της «λειτουργικής» τους συγκέντρωσης. Για παράδειγµα, τα πρωτεϊνικά µόρια ωθούνται να προσροφηθούν σε µεγαλύτερη έκταση στην διεπιφάνεια νερού-ελαίου, δηλαδή να αυξηθεί η τασιενεργότητα της πρωτεΐνης, όπως προκύπτει από µετρήσεις της µεταβολή της τιµής της διεπιφανειακής τάσης σε συνάρτηση µε τον χρόνο. Επίσης, η συνύπαρξη των µορίων της πρωτεΐνης µε αυτά του πολυσακχαρίτη οδηγεί σε αύξηση του ιξώδους, κάτι που εξηγείται µε την ενίσχυση των αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια του κάθε βιοπολυµερούς, λόγω της ασυµβατότητας. Ένα άλλο σύστηµα στο οποίο παρατηρείται ασυµβατότητα είναι το µίγµα διαλύµατος πρωτεΐνης ορού και κόµµεος guar (Ercelebi & Ibanoglu, 2007). Λόγω της µεγάλης ασυµβατότητας ο διαχωρισµός των φάσεων παρατηρείται σε σχετικά µικρές συγκεντρώσεις που είναι 2% για τις πρωτεΐνες και 0,2% για το κόµµι guar. Σε αντίθεση µε το µίγµα πρωτεΐνης ορού-κόµµεος guar, το µίγµα της πρωτεΐνης µε πηκτίνη διαχωρίζεται σε σχετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις βιοπολυµερούς, οι

24 οποίες είναι 4% για την πρωτεΐνη και 1,2% για την πηκτίνη (Ercelebi et al, 2007). Η αύξηση αυτή αποδίδεται στη µεγαλύτερη χηµική συγγένεια που υπάρχει ανάµεσα στα µόρια των πρωτεϊνών του ορού και αυτών της πηκτίνης, η οποία σε αντίθεση µε το κόµµι guar φέρει ηλεκτρικό φορτίο. Επίσης, ο µικρότερος όγκος των µορίων της πηκτίνης έχει ως αποτέλεσµα τον πιο περιορισµένο µοριακό αποκλεισµό στο σύστηµα WPI-πηκτίνη ενώ, αντίθετα, τα µεγαλύτερα µόρια του κόµµεος guar απαιτούν µεγαλύτερο χώρο στο διάλυµα και εισάγουν εντονότερο µοριακό αποκλεισµό (Bourriot, Garnier & Doublier, 1999). Το φαινόµενο που οδηγεί στο διαχωρισµό των φάσεων στα συστήµατα WPI-πηκτίνη και WPI-κόµµι guar είναι η οσµωτική συσσωµάτωση ή η θερµοδυναµική ασυµβατότητα (Hemar, Tamehana, Munro & Singh 2001). Σε αντίθεση µε τα προηγούµενα συστήµατα, στο µίγµα πρωτεΐνης ορού και ι- καραγενάνης (Ercelebi et al, 2007) δεν παρατηρήθηκε διαχωρισµός φάσεων, κάτι που αποδίδεται σε αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα µόρια των βιοπολυµερών που οδηγεί τον σχηµατισµό πηκτής. Παρόµοια συµπεριφορά παρατηρήθηκε όταν στη θέση της ι- χρησιµοποιήθηκε η κ-καραγενάνη (Hemar, Hall, Munro & Singh, 2002). Ανάλογη συµβατότητα και απουσία διαχωρισµού παρατηρήθηκε σε σύστηµα µίγµατος β- λακτογλοβουλίνης και κ-καραγενάνης (Croguennoc, Durand, Nicolai & Clark, 2001a). Αντίθετα, στο ίδιο σύστηµα όταν η πρωτεΐνη θερµάνθηκε και µετουσιώθηκε παρατηρήθηκε ενίσχυση της ασυµβατότητας και διαχωρισµός φάσεων (Croguennoc, Nicolai, Durand & Clark, 2001b). Στα παραπάνω συστήµατα η µείωση της τιµής ph από το ουδέτερο προς το όξινο οδηγεί κατά κανόνα σε διαχωρισµό φάσεων και καταβύθιση του συµπλόκου πρωτεΐνης-πολυσακχαρίτη (Complex coacervation) (Σχήµα 1). Η διαδικασία σχηµατισµού του συµπλόκου περιλαµβάνει τα εξής στάδια: α) σχηµατισµός, αρχικά, ενός πρόδροµου διαλυτού συµπλόκου στην κρίσιµη τιµή pη, β) ολοκλήρωση του σχηµατισµού του συµπλόκου, γ) έναρξη της συσσωµάτωσης και δ) έναρξη της καταβύθισης και του διαχωρισµού σε µια στερεή φάση πλούσια και στα δυο βιοπολυµερή και σε µια υδατική φάση φτωχή σε πολυµερή (Cooper, Dubin, Kayitmazer & Turksen 2005; de Kruif et al, 2004; Turgeon, Beaulieu, Schmitt & Sanchez, 2003). Ένα σύστηµα όπου έχει µελετηθεί το φαινόµενο του διαχωρισµού φάσεων λόγω σχηµατισµού συµπλόκου από τα βιοπολυµερή είναι αυτό του µίγµατος της β-λακτογλοβουλίνης και του κόµµεος της ακακίας (Schmitt, Sanchez, Thomas & Hardy, 1999) όπως επίσης και του µίγµατος πρωτεϊνών ορού-κόµµεος ακακίας

25 (Weinbreck et al, 2003). Στα συστήµατα αυτά η µέγιστη καταβύθιση της πρωτεΐνης παρατηρείται σε τιµές pη κοντά στο 4, λόγω των ισχυρότερων αλληλεπιδράσεων µεταξύ των βιοπολυµερικών µορίων. Αν και η ύπαρξη αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα µόρια των πρωτεϊνών του ορού και των πολυσακχαριτών που φέρουν αντίθετο φορτίο, σε περιοχές τιµών pη κάτω από το ισοηλεκτρικό σηµείο των πρωτεϊνών είναι δεδοµένη, στη βιβλιογραφία αναφέρονται και περιπτώσεις όπου η αλληλεπίδραση αυτή είναι δυνατό να λάβει χώρα σε τιµές pη κοντά στο ουδέτερο όπου και τα δύο πολυµερή φέρουν οµώνυµο συνολικό φορτίο µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός διαλυτού συµπλόκου. (de Vries, Weinbreck & de Kruif, 2003; de Vries, 2004 ; Hattori, Kimura, Seyrek & Dubin 2001 ; Weinbreck, de Vries, Shrooyen & de Kruif, 2003) Όπως υποστηρίζεται από τους συγγραφείς των παραπάνω εργασιών οι αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα µόρια της πρωτεΐνης και του πολυσακχαρίτη σε τιµές ph υψηλότερες του ισοηλεκτρικού σηµείου της πρωτεΐνης οφείλονται στην ύπαρξη θετικά και αρνητικά φορτισµένων περιοχών στο πρωτεϊνικό µόριο και στην ανοµοιόµορφη κατανοµή των φορτίων αυτών (Σχήµα 9). Σχήµα 9: Κατανοµή του φορτίου στην επιφάνεια του µορίου της αλβουµίνης του ορού γάλακτος (BSA) από τρεις διαφορετικές διευθύνσεις (α, β και γ) σε pη=7 (Hattori et al, 2001) Αυτή η ανοµοιόµορφη κατανοµή έχει ως αποτέλεσµα οι περιοχές της επιφάνειας του µορίου της πρωτεΐνης που φέρουν τα θετικά φορτία ακόµα και σε σχετικά υψηλές τιµές ph να συµπλέκονται µε τις αρνητικά φορτισµένες οµάδες του πολυσακχαρίτη. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των µορίων της πρωτεΐνης του ορού και ενός πολυσακχαρίτη λαµβάνουν χώρα και στα γαλακτώµατα µε αποτέλεσµα την τροποποίηση των φυσικοχηµικών ιδιοτήτων του συστήµατος. Τα φαινόµενα που

26 µπορεί να παρατηρηθούν µε την ταυτόχρονη παρουσία πρωτεΐνης ορού και ενός πολυσακχαρίτη σε ένα γαλάκτωµα εξαρτώνται από τα µοριακά χαρακτηριστικά του πολυσακχαρίτη (Dickinson, 2003) και τις συνθήκες της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος ή τις συνθήκες στις οποίες υποβάλλεται αυτό (McClements, 2004). Τέτοια φαινόµενα είναι η οσµωτική συσσωµάτωση (Blijdenstein, van Vliet, van der Linden & van Aken, 2003; Blijdenstein, Winden, van Vliet, van der Linden & van Aken, 2004) και η συσσωµάτωση µε πολυµερική γεφύρωση (Dickinson, 2003; Gu, Decker & McClements, 2004) και µπορεί να οδηγήσουν σε αποσταθεροποίηση του συστήµατος ή σε ενίσχυση της σταθερότητάς του ανάλογα µε την έκταση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πολυσακχαρίτη στην επιφάνεια των σταγονιδίων του γαλακτώµατος και την τροποποίηση των ρεολογικών χαρακτηριστικών της συνεχούς φάσης του γαλακτώµατος, λόγω της παρουσίας του πολυσακχαρίτη. Κατά κανόνα, η απουσία αλληλεπίδρασης ανάµεσα στα µόρια της προσροφηµένης πρωτεΐνης και του πολυσακχαρίτη οδηγεί σε φαινόµενα οσµωτικής συσσωµάτωσης και αποσταθεροποίηση του συστήµατος (Blijdenstein et al 2003; Blijdenstein et al 2004). Όταν τα µόρια του πολυσακχαρίτη αλληλεπιδρούν µε τα µόρια της πρωτεΐνης που βρίσκονται προσροφηµένα στη διεπιφάνεια τα χαρακτηριστικά του συστήµατος και η σταθερότητα του γαλακτώµατος είναι δυνατό να επηρεαστούν µε θετικό ή αρνητικό τρόπο (Dickinson & Pawlowsky 1997; Moreau, Kim, Decker & McClements, 2003). Η παρουσία, για παράδειγµα, καραγενάνης σε γαλάκτωµα που παρασκευάζεται µε β- λακτογλοβουλίνη µπορεί να οδηγήσει το σύστηµα σε συσσωµάτωση και αποσταθεροποίηση σε τιµές ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σηµείο της πρωτεΐνης λόγω εκτεταµένης πολυµερικής γεφύρωσης, ενώ αντίθετα σε τιµές ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σηµείο η περιορισµένη αλληλεπίδραση προσροφηµένης πρωτεΐνηςπολυσακχαρίτη συµβάλει στη σταθεροποίηση του συστήµατος (Dickinson & Pawlowsky 1997). Οι Damianou and Kiosseoglou (2006) ανέφεραν ότι η απουσία αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης ορού-καρβοξυµεθυλοκυτταρίνης σε γαλακτώµατα µε τιµή ph 6,8 είχε ως αποτέλεσµα την έντονη αποκορύφωση των σταγονιδίων του ελαίου, λόγω φαινοµένων οσµωτικής συσσωµάτωσης. Σε τιµές ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σηµείο της πρωτεΐνης, η περιορισµένη αλληλεπίδραση πρωτεΐνηςπολυσακχαρίτη οδήγησε στο σχηµατισµό ενός δικτυώµατος σταγονιδίων µε βελτιωµένα ρεολογικά χαρακτηριστικά και σε περιορισµό των φαινοµένων αποκορύφωσης, κάτι το οποίο όµως δεν παρατηρήθηκε σε περισσότερο όξινα περιβάλλοντα όπου η εντονότερη και τυχαία συσσωµάτωση των σταγονιδίων είχε ως

27 αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός µη οµοιογενούς δικτυώµατος σταγονιδίων και την ταχεία αποκορύφωση. Εκτός, όµως, από την αποκορύφωση η οποία είναι µια αντιστρεπτή µεταβολή και το γαλάκτωµα επανέρχεται στην αρχική του κατάσταση µε απλή ανάµιξη, άλλες µη αντιστρεπτές µεταβολές είναι δυνατό να οδηγήσουν σε υποβάθµιση της ποιότητας ενός γαλακτώµατος. Οι µεταβολές αυτές σχετίζονται µε φαινόµενα έντονης συσσωµάτωσης και συγχώνευσης των σταγονιδίων του γαλακτώµατος που µπορούν να προκύψουν κατά την αποθήκευση για µεγάλο χρονικό διάστηµα ή κατά την υποβολή του σε επεξεργασίες όπως η θέρµανση κατά την αποστείρωση ή την αφυδάτωση και την κατάψυξη. Ειδικά η θερµική επεξεργασία (Kim, Decker & McClements 2002b; Sliwinski, Roubos, Zoet, Boekel & Wouters, 2003) ή η αποθήκευση ενός γαλακτώµατος σε συνθήκες κατάψυξης (Cramp, Docking, Ghosh & Couplant, 2004; Mun 2008; Gu, Decker & McClements, 2007) είναι δυνατό να ενισχύσει τις αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στα σταγονίδια και να επιφέρει σηµαντικές και ανεπιθύµητες µεταβολές στη σταθερότητα ενός γαλακτώµατος που παρασκευάζεται µε πρωτεΐνη ορού. Η παρουσία ενός πολυσακχαρίτη στο σύστηµα µπορεί να επιτείνει τα φαινόµενα αποσταθεροποίησης του γαλακτώµατος κατά τη θέρµανση όταν, λόγω της απουσίας αλληλεπιδράσεων ανάµεσα στα προσροφηµένα µόρια της πρωτεΐνης και αυτά του πολυσακχαρίτη, τα σταγονίδια συσσωµατώνονται πιο έντονα και το σύστηµα αποσταθεροποιείται ταχύτερα (Euston, Finnigan & Hirst, 2002). Αντίθετα ο σχηµατισµός ενός προϊόντος σύζευξης πρωτεΐνης ορούκαρβοξυµεθυλοκυτταρίνης µπορεί να αποτρέψει τη θερµική αποσταθεροποίηση ενός γαλακτώµατος, λόγω περιορισµού των φαινοµένων οσµωτικής συσσωµάτωσης και ενίσχυσης, αντίθετα, της πολυµερικής σταθεροποίησης των σταγονιδίων εξαιτίας της παρουσίας στη επιφάνεια των σταγονιδίων των µορίων του πολυσακχαρίτη (Kika, Korlos & Kiosseoglou, 2007)

28 Γ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Ο σκοπός της εργασίας αυτής ήταν: 1. Η µελέτη των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης του ορού γάλακτος µε την καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη (CMC) σε υδατικά διαλύµατα. Με δεδοµένο ότι τα δύο αυτά βιοπολυµερή συνυπάρχουν στο πρωτεϊνικό συµπύκνωµα (ΠΣΟ) που προκύπτει κατά την παραλαβή της πρωτεΐνης από τον ορό µε τη βοήθεια του πολυσακχαρίτη αλλά και επειδή ο συνδυασµός πρωτεϊνικών υπερσυµπυκνωµάτων ορού µε καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη είναι δυνατό να συµβάλει στη βελτίωση των λειτουργικών ιδιοτήτων της πρωτεΐνης, η κατανόηση των αλληλεπιδράσεων αυτών θεωρείται απαραίτητη για την καλύτερη αξιοποίηση των πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων του ορού σε συστήµατα όπως οι πηκτές και τα διαλύµατα µε υψηλό ιξώδες. 2. Η µελέτη της σταθερότητας γαλακτωµάτων, που παρασκευάζονται µε τη βοήθεια του πρωτεϊνικού συµπυκνώµατος ορού (ΠΣΟ) σε σύγκριση µε αυτήν ενός εµπορικού υπερσυµπυκνώµατος (WPI), προκειµένου να διευκρινιστεί ο ρόλος του πολυσακχαρίτη στη σταθεροποίηση των γαλακτωµάτων κατά την αποθήκευση για µεγάλο χρονικό διάστηµα και κατά την υποβολή τους σε θερµική επεξεργασία ή την διατήρησή τους σε κατάψυξη

29 . ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ.1 Υλικά - Αντιδραστήρια Για την παραλαβή της πρωτεΐνης από τον ορό του γάλακτος (ΠΣΟ) χρησιµοποιήθηκαν αποβουτυρωµένο, παστεριωµένο και οµογενοποιηµένο γάλα του εµπορίου (ΑΓΝΟ), καρβοξυµεθυλοκυτταρίνη (CMC) µε µέτριο ιξώδες ( mpa s) και βαθµό υποκατάστασης της Fluka και νατραζίδιο (ΝαΝ 3 ) της Riedel-de-Haën ως συντηρητικό. Για τη ρύθµιση της τιµής της ενεργού οξύτητας σε γαλακτώµατα και διαλύµατα χρησιµοποιήθηκαν καυστικό νάτριο (ΝαΟΗ) της Merck και υδροχλωρικό οξύ (HCl) της Riedel-de-Haën. Για την παρασκευή των γαλακτωµάτων χρησιµοποιήθηκαν το ΠΣΟ ή πρωτεϊνικό υπερσυµπύκνωµα σε σκόνη (WPI) της DAVISCO, αραβοσιτέλαιο εµπορίου «Φλώρα» της Ελαϊς Α.Ε. και νατραζίδιο (ΝαΝ 3 ) της Riedel-de-Haën ως συντηρητικό. Για τον προσδιορισµό της πρωτεΐνης στο ΠΣΟ µε την µέθοδο Κjehldahl χρησιµοποιήθηκαν ένυδρος θειικός χαλκός CuSO 4 5H 2 O της Duchefa, θειικό κάλιο K 2 SO 4 της Merck και πυκνό διάλυµα θειϊκού οξέος H 2 SO 4 (96%) της Merck για την πέψη, καυστικό νατρίου (ΝαΟΗ) της Merck για την απόσταξη και για την τιτλοµέτριση καυστικό νατρίου (ΝαΟΗ) της Merck, θειικό οξύ H 2 SO 4 της Merck και δείκτη ερυθρό του µεθυλίου. Για τη διάσπαση των συσσωµατωµάτων και τις µετρήσεις µεγέθους σταγονιδίων χρησιµοποιήθηκε δωδέκυλσουλφονικού νατρίου (SDS) της Fluka και DL-Dithiothreitol της Sigma (ή αντί του τελευταίου 2-Μερκαπτοαιθανόλη της Fluka). Για τον υπολογισµό της υδροφοβικότητας στα γαλακτώµατα και τα διαλύµατα των πρωτεϊνών χρησιµοποιήθηκαν δωδέκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS) της Fluka. Για την παρασκευή ρυθµιστικών διαλυµάτων µονόξινο φωσφορικό νάτριο (Na 2 HPO 4 ) της Duchefa, δισόξινο φωσφορικό κάλιο (KH 2 PO 4 ) της Duchefa και κιτρικό οξύ της Merck. Μεµβράνη διαπίδυσης κυτταρίνης 40mm x 20mm τύπου high retention της Sigma-Aldrich.Για τις εκχυλίσεις χλωροφόρµιο (CHCl 3 ) της Merck και για την µέτρηση της απορρόφησης δείκτη κυανό του µεθυλίου (Methyleblau) της Riedel-de-Haën. Για την µελέτη των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών ορού και CMC (Μέθοδος χρήσης του δείκτη κυανού του µεθυλίου) χρησιµοποιήθηκαν ο δείκτης κυανού του