ΑΝΤΩΝΙΟΥ ΔΡΑΚΟΥ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΛΕΥΚΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΑΥΓΟΥ ΣΕ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΑ ΤΥΠΟΥ ΕΜΒΑΜΜΑΤΟΣ ΣΑΛΑΤΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΦΟΙΤΗΤΗ ΑΝΤΩΝΙΟΥ ΔΡΑΚΟΥ ΜΕ ΤΙΤΛΟ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΛΕΥΚΩΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΑΥΓΟΥ ΣΕ ΓΑΛΑΚΤΩΜΑΤΑ ΤΥΠΟΥ ΕΜΒΑΜΜΑΤΟΣ ΣΑΛΑΤΑΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Β. ΚΙΟΣΕΟΓΛΟΥ (Αναπλ.καθ.) (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) Μ. ΤΣΙΜΙΔΟΥ (Αναπλ.καθ.) Α. ΠΑΡΑΣΚΕΥΟΠΟΥΛΟΥ (Λεκτ.) ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2006

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετώνται οι λειτουργικές ιδιότητες γαλακτωμάτων τύπου εμβάμματος σαλάτας τα οποία έχουν παρασκευαστεί με πρωτεΐνες του λευκώματος του αυγού καθώς και η επίδραση της προσθήκης του λευκώματος στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων του κρόκου. Η εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Χημείας και Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. στα πλαίσια του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών υπό την καθοδήγηση του Αναπληρωτή Καθηγητή Β. Κιοσέογλου τον οποίο και ευχαριστώ θερμά για την αμέριστη επιστημονική και ηθική υποστήριξή του, καθώς και την άριστη συνεργασία μας κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μ. Τσιμίδου και τη Λεκτόρισσα Α. Παρασκευοπούλου, μέλη της τριμελούς επιτροπής, για τις πολύτιμες συμβουλές και υποδείξεις τους. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσους εργάστηκαν στον ίδιο χώρο για την άψογη συνεργασία τους. Τις θερμές μου ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην οικογένειά μου για την ηθική και υλική υποστήριξη κατά τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Τέλος αισθάνομαι την ανάγκη να αφιερώσω την εργασία αυτή στη μνήμη του αείμνηστου Αν. Καθηγητή Γ. Δοξαστάκη που τόσο αναπάντεχα έφυγε από κοντά μας. Αντώνιος Δράκος Θεσσαλονίκη 2006

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εισαγωγή Γαλακτώματα Μορφές αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων Αποκορύφωση Συσσωμάτωση Ο ρόλος των πρωτεϊνών στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Σύσταση και λειτουργικές ιδιότητες του αυγού Λεύκωμα του αυγού Κρόκος του αυγού ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά Αντιδραστήρια Συσκευές Όργανα Μέθοδοι Πειραματικές διαδικασίες Παρασκευή γαλακτωμάτων ελαίου-νερού (Ε/Ν) Προσδιορισμός του μεγέθους των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων Εκτίμηση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων Μέτρηση του ιξώδους των γαλακτωμάτων Παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο Ηλεκτροφόρηση του μίγματος των πρωτεϊνών που προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων Στατιστική ανάλυση των πειραματικών αποτελεσμάτων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μελέτη της σταθερότητας γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με λεύκωμα του αυγού Επίδραση της προσθήκης λευκώματος του αυγού στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων κρόκου ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΡΟΤΑΣΕΙΣ ΓΙΑ ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...56

4 1. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της εργασίας ήταν η μελέτη των γαλακτωματοποιητικών και σταθεροποιητικών ιδιοτήτων του λευκώματος του αυγού σε συστήματα τύπου εμβάμματος σαλάτας. Για το σκοπό αυτό, παρασκευάστηκαν γαλακτώματα με αφυδατωμένο λεύκωμα του αυγού στα οποία προστέθηκε ξανθάνη, σε διάφορες συγκεντρώσεις. Τα γαλακτώματα μελετήθηκαν ως προς τις ρεολογικές τους ιδιότητες και τον ρυθμό αποκορύφωσής τους και παρατηρήθηκαν με τη βοήθεια μικροσκοπίου για να διαπιστωθεί εάν και σε ποιο βαθμό η προσθήκη της ξανθάνης επηρέασε τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες. Η παρουσία ξανθάνης σε μικρές συγκεντρώσεις είχε ως αποτέλεσμα τη δημιουργία συσσωματωμάτων ανάμεσα στα σταγονίδια πιθανόν λόγω οσμωτικής συσσωμάτωσης που οδήγησε σε μείωση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων. Αντίθετα, σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ξανθάνης δεν παρατηρήθηκαν ισχυρές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα σταγονίδια, κυρίως λόγω της ανάπτυξης στο σύστημα περιοχών που ήταν πλούσιες σε ξανθάνη, με αποτέλεσμα να μην επιτρέπεται η ελεύθερη κίνηση των σταγονιδίων κάτι που είναι πολύ πιθανό να συνέβαλε στην ενίσχυση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων ως προς την αποκορύφωση. Σε δεύτερη φάση μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης αφυδατωμένου λευκώματος στη σταθερότητα γαλακτωμάτων τύπου εμβάμματος σαλάτας που παρασκευάστηκαν με κρόκο του αυγού, με σκοπό να διερευνηθεί ο ρόλος των πρωτεϊνών του λευκώματος στη φυσικοχημική σταθερότητα γαλακτωμάτων που περιέχουν πλήρες αυγό. Απο τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE στο κλάσμα των πρωτεϊνών που προσροφήθηκαν στην επιφάνεια των σταγονιδίων, προέκυψε ότι οι πρωτεΐνες του λευκώματος προσροφώνται σε πολύ περιορισμένη έκταση παρουσία των λιποπρωτεϊνών του κρόκου. Η παρατήρηση στο μικροσκόπιο και η μελέτη των ρεολογικών ιδιοτήτων των γαλακτωμάτων επιβεβαίωσαν την υπόθεση ότι η συσσωμάτωση λόγω οσμωτικών φαινομένων που προκλήθηκε από την παρουσία του λευκώματος του αυγού στη συνεχή φάση, οδήγησε σε αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων και στην εμφάνιση ορού κατά την αποθήκευσή τους. 1

5 2. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Εισαγωγή Τα περισσότερα τρόφιμα αποτελούν πολύπλοκα συστήματα, ο σχηματισμός και η φυσικοχημική σταθερότητα των οποίων βασίζεται κυρίως στην παρουσία στα συστήματα αυτά βιοπολυμερών, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες, που εμφανίζουν αξιόλογες λειτουργικές ιδιότητες. Οι λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών, δηλαδή οι φυσικοχημικές τους ιδιότητες που επηρεάζουν τη συμπεριφορά τους στα συστήματα τροφίμων, διαμορφώνονται ανάλογα με τη δομή του μορίου τους, τις αλληλεπιδράσεις τους με τα άλλα συστατικά του συστήματος, την τιμή του ph και την παρουσία αλάτων και πολυσακχαριτών. Επιπρόσθετα, στις λειτουργικές ιδιότητες των πρωτεϊνών περιλαμβάνονται και εκείνες που οφείλονται στις αλληλεπιδράσεις τους με το νερό (π.χ. διαλυτότητα), στην προσρόφηση σε διεπιφάνειες (αφροί, γαλακτώματα), και στη δημιουργία πλέγματος (πηκτές). Στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών οφείλεται η χαρακτηριστική υφή και οι ρεολογικές ιδιότητες που παρουσιάζει ένας μεγάλος αριθμός προϊόντων. Ειδικότερα, η παρασκευή, η φυσικοχημική σταθερότητα και οι ρεολογικές ιδιότητες προϊόντων όπως είναι τα εμβάμματα σαλάτας (κρέμες, μαγιονέζες) βασίζεται στη λειτουργικότητα των πρωτεϊνών του αυγού και κυρίως αυτών του κρόκου. Η ικανότητα των συστατικών του αυγού να συμβάλλουν στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση πολλών τροφίμων καθιστά το αυγό την κυριώτερη πρώτη ύλη για την παρασκευή τους. Ανάλογα με το είδος του τελικού προϊόντος και τις επιθυμητές ιδιότητες που αυτό πρέπει τελικά να εμφανίζει, χρησιμοποιείται είτε πλήρες αυγό είτε κλάσματά του (λεύκωμα, κρόκος). Για παράδειγμα, σε προϊόντα που βασίζονται στην εισαγωγή αέρα, όπως κέικ, μαρέγκα κ.α. χρησιμοποιείται μόνο λεύκωμα αυγού οι πρωτεΐνες του οποίου εμφανίζουν έντονη αφριστική δράση. Αντίθετα, σε προϊόντα όπως τα εμβάμματα σαλάτας (salad dressings), συνήθως χρησιμοποιείται μόνο κρόκος οι πρωτεΐνες του οποίου συνεισφέρουν σημαντικά στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση των συστημάτων αυτών λόγω της αξιόλογης προσροφητικής τους ικανότητας στις διεπιφάνειες ελαίου-νερού. Σημαντικό κριτήριο για την αποδοχή ενός προϊόντος από τον καταναλωτή αποτελεί η φυσικοχημική του σταθερότητα. Τα εμβάμματα σαλάτας, όπως και όλα τα γαλακτώματα γενικότερα, είναι από φυσικοχημική άποψη ασταθή συστήματα και η 2

6 αστάθειά τους συνδέεται με επιμέρους φαινόμενα όπως η αποκορύφωση, η συσσωμάτωση και η συγχώνευση των σταγονιδίων τους. Για τη σταθεροποίηση των συστημάτων αυτών χρησιμοποιούνται οι γαλακτωματοποιητές (πρωτεΐνες του κρόκου) οι οποίοι αυξάνουν τη σταθερότητα εξαιτίας της ικανότητας τους να προσροφώνται σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού. Παράλληλα, σημαντική επίδραση στη σταθεροποίηση των συστημάτων αυτών και ιδιαίτερα αυτών με σχετικά χαμηλή περιεκτικότητα σε έλαιο, έχει και η χρήση παχυρευστοποιητών (κυρίως πολυσακχαριτών όπως η ξανθάνη, το κόμμι guar, το αραβικό κόμμι, οι καραγεννάνες, οι πηκτίνες). Συνήθως η παρουσία των πολυσακχαριτών ενισχύει τη σταθερότητα των προϊόντων αυτών λόγω της αύξησης που επιφέρει στο ιξώδες της συνεχούς φάσης. Υπάρχουν όμως και περιπτώσεις όπου η παρουσία των πολυσακχαριτών είναι δυνατό να οδηγήσει σε αποσταθεροποίηση του συστήματος, δηλαδή σε συσσωμάτωση των σταγονιδίων και αποκορύφωση [1,2] Γαλακτώματα Ένας μεγάλος αριθμός τροφίμων όπως είναι τα εμβάμματα σαλάτας, οι σάλτσες, η κρέμα γάλακτος, τα αλλαντικά κ.α. οφείλουν την εμφάνιση και τα χαρακτηριστικά τους στην ενσωμάτωση ελαίου με τη μορφή σταγονιδίων στο σύστημα με τη βοήθεια των γαλακτωματοποιητών. Γαλακτωματοποιητές είναι ουσίες που παίζουν καθοριστικό ρόλο τόσο στο σχηματισμό όσο και στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων. Οι πρωτεΐνες λόγω της αμφιφιλικότητάς τους παρουσιάζουν έντονη γαλακτωματοποιητική δράση διότι προσροφώνται στη διεπιφάνεια ελαίουνερού μειώνοντας έτσι τη διεπιφανειακή τάση. Επιπλέον, δημιουργούν μια προστατευτική ιξωδοελαστική μεμβράνη γύρω από τα σταγονίδια της εν διασπορά φάσης, εμποδίζοντας την επαφή και τη συγχώνευση των σταγονιδίων [3]. Ως γαλάκτωμα ορίζεται το κολλοειδές σύστημα διασποράς με τη μορφή σταγονιδίων ενός υγρού (ασυνεχής φάση ή φάση σε διασπορά) σε μια άλλη υγρή φάση [4]. Ανάλογα με την κατανομή της λιπαρής και της υδατικής φάσης, τα γαλακτώματα διακρίνονται σε γαλακτώματα ελαίου σε νερό (o/w) όπως εμβάμματα σαλάτας, μαγιονέζες, γάλα, όπου τα σταγονίδια του ελαίου διασπείρονται στην υδατική φάση, και σε γαλακτώματα νερού σε έλαιο (w/o) όπως μαργαρίνη, βούτυρο, όπου τα σταγονίδια του νερού διασπείρονται στη φάση του ελαίου (Σχήμα 2.1.). Η 3

7 συγκέντρωση των σταγονιδίων σε ένα γαλάκτωμα ονομάζεται κλάσμα όγκου φάσης σε διασπορά, συμβολίζεται με φ και ισχύει: φ = V D / V E όπου V D και V E ο όγκος των σταγονιδίων και ο συνολικός όγκος του γαλακτώματος, αντίστοιχα. Είναι, επίσης, δυνατό να παρασκευαστούν γαλακτώματα τύπου ελαίου σε νερό σε έλαιο (o/w/o) ή νερού σε έλαιο σε νερό (w/o/w) [5]. (α) (β) (γ) (δ) Σχήμα 2.1. Τύποι γαλακτωμάτων. (α) έλαιο σε νερό, (β) νερό σε έλαιο, (γ) νερό σε έλαιο σε νερό και (δ) έλαιο σε νερό σε έλαιο. Η παρασκευή ενός γαλακτώματος πραγματοποιείται με τη διαδικασία της ομογενοποίησης. Κατά την ομογενοποίηση τα δυο υγρά αναμιγνύονται, ελαττώνεται το μέγεθος των σταγονιδίων καθώς αυτά διασπώνται βίαια και τελικά προκύπτει το γαλάκτωμα. Μετά το σχηματισμό του γαλακτώματος τα σταγονίδια βρίσκονται σε συνεχή κίνηση με αποτέλεσμα να συγκρούονται μεταξύ τους λόγω της κίνησης Brown. Τα γαλακτώματα είναι από φυσικοχημική άποψη ασταθή συστήματα. Η κινητική σταθερότητα για ορισμένο χρονικό διάστημα είναι δυνατό να επιτευχθεί με την προσθήκη σταθεροποιητών που μπορεί να είναι γαλακτωματοποιητές ή/και παχυρευστοποιητές. Οι γαλακτωματοποιητές, όπως έχει αναφερθεί, είναι τασενεργές ουσίες (ενώσεις που περιέχουν πολικές και μη πολικές περιοχές) που προσροφώνται στη διεπιφάνεια των σταγονιδίων, μειώνουν την ελεύθερη ενέργεια και σχηματίζουν ένα προστατευτικό υμένιο στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση του γαλακτώματος. Οι παχυρευστοποιητές είναι συστατικά που ενισχύουν τη σταθερότητα του γαλακτώματος αυξάνοντας το ιξώδες της συνεχούς φάσης με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η κίνηση των σταγονιδίων. Οι πιο κοινοί γαλακτωματοποιητές είναι οι πρωτεΐνες, φυτικής ή ζωικής προέλευσης, όπως αυτές των οσπρίων, του κρόκου του αυγού, του ορού του γάλακτος κ.α., ενώ ως 4

8 παχυρευστοποιητές χρησιμοποιούνται κυρίως πολυσακχαρίτες όπως ξανθάνη, κόμμι guar, καραγεννάνες, πηκτίνες κ.α. Αντίθετα, σε γαλακτώματα νερού σε έλαιο χρησιμοποιούνται ως γαλακτωματοποιητές κυρίως τα μόνο- και τα διγλυκερίδια, και φωσφολιπίδια όπως η λεκιθίνη [6]. Τα γαλακτώματα ανάλογα με τη χρήση τους μπορούν να διακριθούν σε τρεις κατηγορίες. Καταρχήν, τα γαλακτώματα μπορεί να αποτελούν ως έχουν, τελικά προϊόντα. Τα ποτά με κρέμα (cream liqueurs) και οι κρέμες για καφέ (coffee creamers) αποτελούν σχετικά απλά συστήματα όπου η μόνη απαίτηση από τους καταναλωτές είναι να παραμένουν σταθερά κατά την αποθήκευσή τους μέχρι την κατανάλωση. Αντίθετα, ορισμένα γαλακτώματα μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως συστατικά για την ανάπτυξη συγκεκριμένης δομής σε ορισμένα σύνθετα προϊόντα όπως η γιαούρτη όπου τα σταγονίδια αλληλεπιδρούν με άλλα συστατικά χωρίς το γαλάκτωμα να αποσταθεροποιείται κατά τη διαδικασία αυτή. Τέλος, τα σταγονίδια ενός γαλακτώματος μπορεί να συμβάλουν στη διαμόρφωση νέων δομών όπως στο παγωτό, όπου το γαλάκτωμα αποσταθεροποιείται για να σχηματιστεί η νέα δομή του προϊόντος [7] Μορφές αποσταθεροποίησης γαλακτωμάτων Τα γαλακτώματα είναι από φυσικοχημική άποψη ασταθή συστήματα. Η αστάθειά τους οφείλεται σε μια σειρά από φυσικούς μηχανισμούς όπως είναι η αποκορύφωση, η συσσωμάτωση και η συγχώνευση των σταγονιδίων τους με πιο συνήθεις μεταβολές αυτές της αποκορύφωσης και της συσσωμάτωσης Αποκορύφωση Τα σταγονίδια ενός γαλακτώματος έχουν διαφορετική πυκνότητα από αυτή της συνεχούς φάσης. Αν τα σταγονίδια έχουν μικρότερη πυκνότητα από την υδατική φάση, έχουν την τάση να κινούνται ανοδικά χωρίς να παρατηρείται κάποια μεταβολή στο μέγεθός τους. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται αποκορύφωση του γαλακτώματος (creaming). Αντίθετα, καθίζηση είναι η καθοδική πορεία των σταγονιδίων λόγω μεγαλύτερης πυκνότητας από τη συνεχή φάση. Κατά την αποκορύφωση, με την πάροδο του χρόνου διακρίνονται δυο ξεχωριστές στοιβάδες, μια υδατική και μια εμπλουτισμένη σε σταγονίδια ελαίου (κρέμα). Οι δυνάμεις που αναπτύσσονται στη 5

9 κρέμα συμβάλουν στο σχηματισμό ενός δικτυώματος το οποίο συμπιέζεται μέχρι να γίνει αρκετά συμπαγές σε βαθμό που να μην είναι εφικτή η περαιτέρω συμπίεση και τελικά να σταματήσει και η διαδικασία της αποκορύφωσης. Το φαινόμενο αυτό είναι αντιστρεπτό, δηλαδή με απλή ανακίνηση επιτυγχάνεται ομοιόμορφη κατανομή των σταγονιδίων σε όλη την έκταση του γαλακτώματος. Σημαντικό ρόλο στην ταχύτητα της αποκορύφωσης ενός γαλακτώματος διαδραματίζουν τόσο το μέγεθος όσο και ο βαθμός συσσωμάτωσης των σταγονιδίων του ελαίου. Σταγονίδια μεγάλου μεγέθους κινούνται ταχύτερα με αποτέλεσμα να συμπαρασύρουν τα μικρότερα σταγονίδια αυξάνοντας έτσι την ταχύτητα της αποκορύφωσης [8]. Η σταθερότητα αυτών των γαλακτωμάτων μπορεί να αυξηθεί με μείωση του μεγέθους των σταγονιδίων. Η ομογενοποίηση οδηγεί σε γαλακτώματα με διάφορα μεγέθη από τα οποία μόνο ένα μικρό ποσοστό θα πρέπει να είναι πάνω από μια κρίσιμη διάμετρο σταγονιδίων. Για παράδειγμα, στα ποτά με κρέμα, σταγονίδια με μέγεθος μεγαλύτερο από 0,4 μm θα πρέπει να βρίσκονται σε ποσοστό μικρότερο του 3% για να προκύψει ένα σταθερό προϊόν [4]. Το φαινόμενο αυτό παρατηρείται και σε γαλάκτώματα που περιέχουν συσσωματωμένα σταγονίδια τα οποία συμπεριφέρονται ως σταγονίδια μεγάλης διαμέτρου και κινούνται ταχύτερα από τα μεμονωμένα σταγονίδια. Δύο παράγοντες που επηρεάζουν τη σταθερότητα ενός γαλακτώματος έναντι της αποκορύφωσης είναι η παρουσία ενός βιοπολυμερούς και το κλάσμα όγκου της εν διασπορά φάσης. Η προσθήκη ενός βιοπολυμερούς το οποίο όμως δεν προσροφάται στη διεπιφάνεια, όπως η ξανθάνη, έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός τρισδιάστατου δικτυώματος από συσσωματωμένα σταγονίδια τα οποία εγκλωβίζουν τα μεμονωμένα σταγονίδια χωρίς αυτά τελικά να μπορούν να κινηθούν και να επιταχύνουν την αποκορύφωση. Παράλληλα, η αύξηση της συγκέντρωσης των σταγονιδίων τα εμποδίζει να κινηθούν καθώς βρίσκονται πολύ κοντά μεταξύ τους με αποτέλεσμα να μην υπάρχει ελεύθερος χώρος για να κινηθούν ανοδικά. Για παράδειγμα, οι μαγιονέζες που έχουν υψηλό κλάσμα όγκου της εν διασπορά φάσης είναι πιο σταθερές από τα εμβάμματα σαλάτας τα οποία έχουν μικρότερη περιεκτικότητα σε έλαιο [9]. Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων ως προς την αποκορύφωση σχετίζεται άμεσα με το ιξώδες του γαλακτώματος. Το ιξώδες του γαλακτώματος με τη σειρά του καθορίζεται από το ιξώδες της συνεχούς φάσης και οποιαδήποτε μεταβολή στις ρεολογικές ιδιότητες της συνεχούς φάσης επιφέρει μεταβολές σε ολόκληρο το 6

10 γαλάκτωμα. Με την προσθήκη βιοπολυμερών όπως τα κόμμεα αυξάνεται το ιξώδες της συνεχούς φάσης. Η αύξηση του ιξώδους του υγρού που βρίσκεται γύρω από το σταγονίδιο προκαλεί μείωση της ταχύτητας με την οποία μπορεί αυτό μπορεί να κινηθεί. Έτσι, καθυστερεί σε μεγάλο βαθμό η αποκορύφωση του γαλακτώματος με αποτέλεσμα να αυξάνεται η σταθερότητά του [9] Συσσωμάτωση Συσσωμάτωση είναι η διαδικασία κατά την οποία δυο ή περισσότερα σταγονίδια συνενώνονται αλλά κάθε σταγονίδιο στο συσωμάτωμα διατηρεί το αρχικό σχήμα και μέγεθός του. Με αλλαγή των συνθηκών pη ή της ιονικής ισχύος είναι δυνατό να εξουδετερωθούν τα φορτία που είναι υπεύθυνα για την ηλεκτροστατική άπωση των σταγονιδίων με συνέπεια τη συσσωμάτωση και τελικά την αποσταθεροποίηση του γαλακτώματος. Σε τιμές pη πάνω ή κάτω από το ισοηλεκτρικό σημείο της πρωτεΐνης που χρησιμοποιείται ως γαλακτωματοποιητής το φορτίο των σταγονιδίων είναι αρκετά ισχυρό ώστε να αποτρέψει τη συσσωμάτωσή τους λόγω των ηλεκτροστατικών απώσεων. Αντίθετα, σε τιμές ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο το φορτίο είναι χαμηλό και οι ηλεκτροστατικές απώσεις δεν είναι αρκετά ισχυρές ώστε να αποτρέψουν τη συσσωμάτωση [10]. Η παρουσία ενός πολυσθενούς ιόντος στη συνεχή φάση ενός γαλακτώματος παίζει σημαντικό ρόλο στη συσσωμάτωση των σταγονιδίων για δύο λόγους. Πρώτον, επηρεάζει σημαντικά τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των σταγονιδίων και παράλληλα είναι ικανό να σχηματίσει γέφυρες ηλεκτροστατικής φύσεως μεταξύ δυο σταγονιδίων όμοια φορτισμένων. Η προσθήκη ιόντων ασβεστίου Ca 2+ σε ένα πρωτεϊνικό γαλάκτωμα το οποίο περιέχει αρνητικά φορτισμένα σταγονίδια μπορεί να προκαλέσει συσσωμάτωση των σταγονιδίων διότι δημιουργούνται δεσμοί πρωτεΐνης ασβεστίου πρωτεΐνης [4,11]. Εκτός από τις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, πολλοί γαλακτωματοποιητές εμποδίζουν τη συσσωμάτωση των σταγονιδίων μέσω πολυμερικών απώσεων που αναπτύσσονται μεταξύ τους. Τα γαλακτώματα αυτού του είδους είναι λιγότερο ευαίσθητα σε μεταβολές του ph και την ιονικής ισχύος αλλά επηρεάζονται σημαντικά από τη θερμοκρασία. Σε ένα γαλάκτωμα που σταθεροποιείται μέσω στερεοχημικών απώσεων μπορεί να προκληθεί συσσωμάτωση των σταγονιδίων με 7

11 αύξηση της θερμοκρασίας λόγω προοδευτικής αφυδάτωσης του γαλακτωματοποιητή [12]. Γαλακτώματα που τα σταγονίδιά τους έχουν ορισμένες μη πολικές περιοχές του γαλακτωματοποιητή οι οποίες είναι εκτεθειμένες στην υδατική φάση εμφανίζουν αλληλεπιδράσεις υδρόφοβου τύπου ανάμεσα στα σταγονίδια. Χαρακτηριστικό παράδειγμα εμφάνισης υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων αποτελούν συστήματα που σταθεροποιούνται με σφαιροπρωτεΐνες και υφίστανται θερμική επεξεργασία. Για παράδειγμα, γαλακτώματα που σταθεροποιούνται με πρωτεΐνες του ορού στη θερμοκρασία περιβάλλοντος είναι σταθερά και δεν εμφανίζουν συσσωμάτωση. Με αύξηση της θερμοκρασίας (~70 ο C) οι σφαιρικές πρωτεΐνες που είναι προσροφημένες στην επιφάνεια των σταγονιδίων ξεδιπλώνονται με αποτέλεσμα να δημιουργούνται υδρόφοβες ελκτικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ μη πολικών αμινοξέων τα οποία απαντούν στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων που οδηγούν στη συσσωμάτωση και τελικά στην αποσταθεροποίηση των γαλακτωμάτων [10,13]. Η παρουσία μη προσροφημένων κολλοειδών σωματιδίων, όπως βιοπολυμερικών μορίων ή μικκυλίων τασενεργών ουσιών στη συνεχή φάση ενός γαλακτώματος, προκαλεί ενίσχυση των ελκτικών δυνάμεων μεταξύ των σταγονιδίων λόγω οσμωτικών φαινομένων [14]. Υπάρχει μια μικρή περιοχή γύρω από τα σταγονίδια του ελαίου στην οποία η συγκέντρωση των μη προσροφημένων κολλοειδών είναι μηδενική σε αντίθεση με τη υπόλοιπη συνεχή φάση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία διαφοράς οσμωτικής πίεσης. Για να επέλθει η ισορροπία, ο διαλύτης από την περιοχή κοντά στα σταγονίδια κινείται προς τη συνεχή φάση με σκοπό να αραιώσει το διάλυμα του κολλοειδούς, με αποτέλεσμα τα σταγονίδια να πλησιάσουν μεταξύ τους και να συσσωματώθούν. Το φαινόμενο αυτό καλείται οσμωτική συσσωμάτωση [15]. Πολλοί πολυσακχαρίτες όπως η ξανθάνη, η δεξτράνη κ.α. δρουν σε υψηλές συγκεντρώσεις ως σταθεροποιητές γαλακτωμάτων ελαίου/νερού λόγω της αύξησης που επιφέρουν στο ιξώδες της συνεχούς φάσης. Ωστόσο, όταν η συγκέντρωσή τους είναι σχετικά χαμηλή, παραμένουν στη συνεχή φάση χωρίς να προσροφώνται στη διεπιφάνεια και αποσταθεροποιούν τα γαλακτώματα προκαλώντας συσσωμάτωση λόγω οσμωτικών φαινομένων. Η ελάχιστη συγκέντρωση βιοπολυμερούς που απαιτείται για να προκαλέσει οσμωτική συσσωμάτωση ονομάζεται κρίσιμη συγκέντρωση συσσωμάτωσης και εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μέγεθος των σταγονιδίων. Η τιμή της κρίσιμης συγκέντρωσης μειώνεται με την αύξηση του 8

12 μεγέθους των σταγονιδίων [16]. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, παρόλο που οι ελκτικές δυνάμεις μεταξύ των σταγονιδίων διατηρούν την ισχύ τους, η αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης προκαλεί μια μείωση της κινητικότητάς τους με αποτέλεσμα να αποτρέπεται η συσσωμάτωσή και να προκύπτει ένα σταθερό ως προς τη συσσωμάτωση γαλάκτωμα [17]. Ένας άλλος μηχανισμός συσσωμάτωσης είναι η συσσωμάτωση λόγω γεφύρωσης (bridging flocculation). Ορισμένα βιοπολυμερή προκαλούν συσσωμάτωση δημιουργώντας γέφυρες μεταξύ δυο ή περισσοτέρων σταγονιδίων [18]. Τα βιοπολυμερή προσροφώνται είτε στην επιφάνεια των σταγονιδίων είτε στην ήδη προσροφημένη στοιβάδα του γαλακτωματοποιητή. Οι σημαντικότερες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των βιοπολυμερών και των σταγονιδίων είναι υδρόφοβες και ηλεκτροστατικές. Ο σχηματισμός γεφυρών συμβαίνει σε δυο κυρίως περιπτώσεις: α) όταν η συγκέντρωση του γαλακτωματοποιητή δεν επαρκεί για να καλύψει τη διεπιφάνεια μετά την ομογενοποίηση και β) όταν το βιοπολυμερές στη συνεχή φάση (π.χ. ένας πολυσακχαρίτης) έχει αντίθετο ηλεκτρικό φορτίο από το φορτίο των μορίων που είναι προσροφημένα στα σταγονίδια [19]. Όλες οι παραπάνω μορφές συσσωμάτωσης των σταγονιδίων έχουν άμεση επίδραση στις ρεολογικές ιδιότητες των γαλακτωμάτων. Ένα γαλάκτωμα με συσσωματωμένα σταγονίδια παρουσιάζει υψηλότερο ιξώδες από ένα γαλάκτωμα που περιέχει τον ίδιο αριθμό σταγονιδίων αλλά σε μεμονωμένη μορφή. Αυτό παρατηρείται διότι στα συσσωματώματα εγκλωβίζεται ορισμένη ποσότητα συνεχούς φάσης που έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του λειτουργικού κλάσματος όγκου (effective volume fraction). Το ίδιο φαινόμενο παρατηρείται και σε συσσωματώματα που παρουσιάζουν ανοιχτή δομή (υψηλό ιξώδες) σε αντίθεση με αυτά με πιο κλειστή δομή (χαμηλό ιξώδες). Στα γαλακτώματα αυτά το ιξώδες μειώνεται με την αύξηση του ρυθμού διάτμησης κυρίως της διάσπασης των συσσωματωμάτων (Διάγραμμα 2.1) [20-22]. 9

13 Ιξώδες Ρυθμός διάτμησης Διάγραμμα 2.1. Μεταβολή του φαινομενικού ιξώδους γαλακτώματος σε σχέση με το ρυθμό διάτμησης κατά τη διάσπαση των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων Ο ρόλος των πρωτεϊνών στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Οι πρωτεΐνες, όπως έχει αναφερθεί, είναι οι πλέον διαδεδομένοι γαλακτωματοποιητές των τροφίμων διότι συμβάλλουν τόσο στο σχηματισμό όσο και στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων. Κατά το σχηματισμό του γαλακτώματος τα μόρια των πρωτεϊνών προσροφώνται στη διεπιφάνεια ανάμεσα στη λιπαρή φάση και την υδατική φάση. Τα προσροφημένα μόρια στη συνέχεια ξεδιπλώνονται και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου, δεσμούς van der Waals, καθώς και μέσω υδρόφοβοβων αλληλεπιδράσεων με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός ιξωδοελαστικού υμενίου. Στο υμένιο αυτό, μόνο ένα κλάσμα των τμημάτων του προσροφημένου πρωτεϊνικού μορίου βρίσκεται σε άμεση επαφή με τη διεπιφάνεια, ενώ τα υπόλοιπα τμήματα εκτείνονται προς την υδατική φάση του συστήματος. Η σταθερότητα ενός γαλακτώματος εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό και από τη μηχανική αντοχή του υμενίου [4]. Η δομή του μορίου της πρωτεΐνης που χρησιμοποιείται ως γαλακτωματοποιητής επηρεάζει και τον τρόπο προσρόφησής του στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού (Σχήμα 2.2.). 10

14 Νερό (α) (β) (γ) Διεπιφάνεια Έλαιο Σχήμα 2.2. Προσανατολισμός των μορίων γαλακτωματοποιητών στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού : (α) μόριο μικρού μεγέθους, (β) ευέλικτο μακρομόριο και (γ) σφαιροπρωτεΐνη. Οι μικρού μεγέθους γαλακτωματοποιητές (Σχήμα 2.2.α) προσανατολίζονται με τέτοιο τρόπο ώστε το υδρόφιλο τμήμα των μορίων να προεκτείνεται προς στην υδατική φάση και το υδρόφοβο προς τη φάση του ελαίου. Η διάταξη μιας πρωτεΐνης με ευέλικτη δομή, όπως η β-καζεϊνη, στη διεπιφάνεια περιλαμβάνει τους συρμούς (trains), που αποτελούν το τμήμα του μορίου το οποίο είναι σε επαφή με τη διεπιφάνεια, καθώς και τους βρόγχους (loops) και τα ελεύθερα άκρα (tails) που εκτείνονται προς την υδατική φάση (Σχήμα 2.2.β). Όσον αφορά τις σφαιροπρωτεΐνες (Σχήμα 2.2.γ),τα μόριά τους προσανατολίζονται με τέτοιο τρόπο ώστε η επιφάνεια επαφής του υδρόφοβου τμήματος της πρωτεΐνης με τη διεπιφάνεια να είναι η μεγαλύτερη δυνατή [23]. Οι σφαιροπρωτεΐνες, όπως η β-λακτογλοβουλίνη, χρησιμοποιούνται συχνά ως γαλακτωματοποιητές λόγω της ικανότητάς τους να συμβάλουν στην παρασκευή και να βελτιώνουν τη σταθερότητα γαλακτωμάτων ελαίου σε νερό [24,25]. Οι πρωτεΐνες αυτές, λόγω του μικρού μεγέθους τους προσροφώνται ταχύτατα στην επιφάνεια του σταγονιδίου μειώνοντας αρχικά τη διεπιφανειακή τάση ενώ στη συνέχεια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και σχηματίζουν ένα πρωτεϊνικό φιλμ το οποίο αποτρέπει τη συσσωμάτωση και τη συγχώνευση των σταγονιδίων [26]. Τα μόρια των σφαιροπρωτεϊνών έχουν την τάση να υφίστανται αλλαγές στη διαμόρφωσή τους μετά από την προσρόφησή τους στην επιφάνεια των σταγονιδίων του ελαίου με αποτέλεσμα να μειώνεται η σταθερότητα του γαλακτώματος. Σε ένα υδατικό διάλυμα οι σφαιροπρωτεΐνες οι οποίες δεν είναι προσροφημένες, έρχονται σε επαφή εξ ολοκλήρου με τα μόρια του νερού. Στη διεπιφάνεια ελαίου-νερού ενός γαλακτώματος όμως, ένα μέρος της προσροφημένης πρωτεΐνης έρχεται σε επαφή με το νερό και το υπόλοιπο με το έλαιο [27]. Αυτή η 11

15 διαφοροποίηση είναι ικανή να προκαλέσει τη μετουσίωση στην επιφάνεια των σταγονιδίων [28]. Λίγες ώρες μετά από την παρασκευή του γαλακτώματος τα μόρια της πρωτεΐνης υφίστανται αλλαγές στη δομή της ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι μη επιθυμητές μοριακές αλληλεπιδράσεις και να προκύψει ένα σταθερό γαλάκτωμα [29,30]. Η προσρόφηση πρωτεϊνών με ευέλικτη δομή ευνοείται έναντι αυτής των σφαιροπρωτεϊνών. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του αυγού, οι πρωτεΐνες του λευκώματος και οι λιβετίνες του κρόκου λόγω της σχετικά συμπαγούς δομής, δεν προσροφώνται τόσο αποτελεσματικά όσο οι λιποπρωτεΐνες του κρόκου [31]. Επίσης, η β-λακτογλοβουλίνη εκτοπίζεται ανταγωνιστικά από λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL) λόγω της μεγαλύτερης ικανότητας διείσδυσης των λιποπρωτεϊνικών μορίων στην επιφάνεια των σταγονιδίων [32]. Η πρωτεΐνες, εκτός από την ικανότητά τους να συμβάλουν στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση ενός γαλακτώματος, σε ορισμένες περιπτώσεις είναι δυνατό να οδηγήσουν και σε αποσταθεροποίηση του προκαλώντας συσσωμάτωση των σταγονιδίων. Για παράδειγμα, όταν προσροφηθεί η απαιτούμενη ποσότητα καζεΐνης στην επιφάνεια των σταγονιδίων, η περίσσεια της μη- προσροφημένης πρωτεΐνης που βρίσκεται στην υδατική φάση μπορεί να προκαλέσει οσμωτική συσσωμάτωση των σταγονιδίων του γαλακτώματος και αποσταθεροποίηση [1,33]. Επίσης, η παρουσία μη προσροφημένων κόκκων του κρόκου (granules) μπορούν να αποσταθεροποιήσουν ένα γαλάκτωμα λόγω συσσωμάτωσης των σταγονιδίων της συνεχούς φάσης μέσω οσμωτικών φαινομένων [34] Ο ρόλος των πολυσακχαριτών στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Οι πολυσακχαρίτες όπως και οι πρωτεΐνες συμβάλουν στην ανάπτυξη της δομής και κατ επέκταση στον καθορισμό των μηχανικών, φυσικοχημικών και οργανοληπτικών ιδιοτήτων των τροφίμων. Λειτουργούν ως παχυρευστοποιητές, σταθεροποιητές, πηκτωματοποιητές, γαλακτωματοποιητές, κατακρατητές υγρασίας κ.ά.. Οι ιδιότητες αλλά και ο ακριβής μηχανισμός αλληλεπίδρασης ενός πολυσακχαρίτη με τα άλλα συστατικά του συστήματος, συνδέονται άμεσα με τη μοριακή δομή του [35]. 12

16 Η λειτουργική συμπεριφορά ενός πολυσακχαρίτη σε ένα γαλάκτωμα ποικίλει ανάλογα με τη σύσταση και τη δομή του. Ένας μικρός αριθμός πολυσακχαριτών που απαντούν στη φύση, όπως το αραβικό κόμμι το οποίο περιέχει στο μόριό του ένα μικρό πρωτεϊνικό τμήμα ή ορισμένα χημικώς τροποποιημένα άμυλα τα οποία έχουν τροποποιηθεί ώστε να περιέχουν μη πολικές ομάδες, μπορούν να δράσουν ως γαλακτωματοποιητές και να προσροφηθούν στην επιφάνεια των σταγονιδίων ενός γαλακτώματος [36]. Οι περισσότεροι πολυσακχαρίτες, όμως, περιέχουν μόνο υδρόφιλο τμήμα στο μόριό τους και επομένως δεν εμφανίζουν επιφανειοδραστικότητα και δεν μπορούν να δράσουν ως γαλακτωματοποιητές. Οι πρωτεΐνες και οι πολυσακχαρίτες πολλές φορές συνυπάρχουν στα γαλακτώματα των τροφίμων. Ανάλογα με τη φύση και τη συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη, η παρουσία του είναι δυνατό να επηρεάσει με διαφορετικό τρόπο τη σταθερότητα αλλά και τις ρεολογικές ιδιότητες των γαλακτωμάτων [37]. Χαμηλές συγκεντρώσεις πολυσακχαριτών στα συστήματα των γαλακτωμάτων οδηγούν συνήθως σε οσμωτική συσσωμάτωση και στην αποσταθεροποίησή τους [2]. Συνήθως, όμως, οι πολυσακχαρίτες προστίθενται στα γαλακτώματα σε σχετικά υψηλότερες συγκεντρώσεις με σκοπό την αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης. Στις συγκεντρώσεις αυτές δημιουργείται ένα τρισδιάστατο δικτύωμα το οποίο εγκλωβίζει τα σταγονίδια του ελαίου με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η κίνησή τους και να αυξάνεται με αυτόν τον τρόπο η σταθερότητα των γαλακτωμάτων έναντι της αποκορύφωσης [1]. Χαρακτηριστικό παράδειγμα πολυσακχαρίτη ο οποίος χρησιμοποιείται ευρύτατα στα γαλακτώματα των τροφίμων αποτελεί η ξανθάνη. Η ξανθάνη είναι ένας εξωκυτταρικός ανιονικός βακτηριακός πολυσακχαρίτης που παράγεται βιοτεχνολογικά από τον αερόβιο μικροοργανισμό Xanthomonas campestris σε διάφορα υποστρώματα [38]. Η προσθήκη ξανθάνης στα γαλακτώματα σε χαμηλή σχετικά συγκέντρωση αυξάνει την ταχύτητα αποκορύφωσης, γεγονός που οφείλεται σε συσσωμάτωση των σταγονιδίων λόγω οσμωτικών φαινομένων [33]. Συχνότερα όμως, η ξανθάνη χρησιμοποιείται σε μεγάλη σχετικά συγκέντρωση για τη σταθεροποίηση εμβαμμάτων σαλάτας και τη βελτίωση των ρεολογικών τους ιδιοτήτων [39]. 13

17 2.3. Σύσταση και λειτουργικές ιδιότητες του αυγού Το αυγό, όπως και το γάλα, θεωρείται ένα πλήρες από διατροφική άποψη τρόφιμο και αποτελεί μια σπουδαία πηγή θρεπτικών συστατικών. Το σχετικά χαμηλό θερμιδικό του περιεχόμενο και η υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες, λιπίδια και βιταμίνες, η ελκυστική του γεύση, η εύκολη προετοιμασία και το σχετικά χαμηλό του κόστος το καθιστούν ένα από τα πλέον δημοφιλή τρόφιμα σε όλες τις χώρες του κόσμου. Καταναλώνεται είτε ως έχει, είτε έμμεσα, ως πρώτη ύλη τροφίμων όπως τα κέικ, τις κρέμες, τα ζυμαρικά, τα εμβάμματα σαλάτας, κ.α. Οι αξιόλογες λειτουργικές ιδιότητες ορισμένων συστατικών του αυγού (πρωτεΐνες, φωσφολιπίδια), όπως είναι η πηκτωματοποιητική, η αφριστική και η γαλακτωματοποιητική τους ικανότητα, είναι απαραίτητες για την παρασκευή των προϊόντων αυτών και τη φυσικοχημική τους σταθερότητα κατά την αποθήκευση [40-42]. Ένα αυγό ζυγίζει κατά μέσο όρο 58 g και αποτελείται από το φλοιό ή κέλυφος (8-11%), το λεύκωμα ή αλβουμίνη (56-61%) και τον κρόκο (27-32%). Το λεύκωμα χωρίζεται από τον κρόκο με μια μεμβράνη πρωτεϊνικής φύσης που ονομάζεται βιτελλινική μεμβράνη. Τα κυριότερα συστατικά του αυγού είναι το νερό (74%), οι πρωτεΐνες (12%) και τα λιπίδια (11%) [43] Λεύκωμα του αυγού Το λεύκωμα περιβάλει τον κρόκο με τη μορφή τεσσάρων στοιβάδων: την εξωτερική λεπτόρευστη στοιβάδα, την ενδιάμεση παχύρευστη στοιβάδα, την εσωτερική λεπτόρευστη στοιβάδα και τη στοιβάδα της χάλαζας [44]. Το νερό αποτελεί το κυριότερο συστατικό του λευκώματος και απαντά σε ποσοστό το οποίο κυμαίνεται από 87 έως 89%, ανάλογα με το είδος και την παλαιότητα του αυγού. Οι πρωτεΐνες είναι τα κυριότερα στερεά συστατικά του. Οι υδατάνθρακες, όπως η γλυκόζη, η μαννόζη, η γαλακτόζη, η αραβινόζη, η ξυλόζη, η ριβόζη και δεοξυριβόζη απαντούν είτε με τη μορφή ενώσεων με πρωτεΐνες είτε σε ελεύθερη μορφή. Σε αντίθεση με τον κρόκο, το ποσοστό των λιπιδίων του λευκώματος είναι αμελητέο (Πίνακας 2.1.) 14

18 Πίνακας 2.1. Σύσταση του λευκώματος, του κρόκου και του πλήρους αυγού. Μέρος του αυγού Πρωτεΐνες (%) Λιπίδια (%) Υδατάνθρακες (%) Τέφρα (%) Λεύκωμα 9,7-10,6 0,03 0,4-0,9 0,5-0,6 Κρόκος 5,7-16,6 31,8-35,5 0,2-1,0 1,1 Πλήρες αυγό 12,8-13,4 10,5-11,8 0,3-0,1 0,8-1,0 Στο λεύκωμα απαντά ένας μεγάλος αριθμός ανόργανων στοιχείων όπως το θείο, το κάλιο, το νάτριο, ο φωσφόρος, το ασβέστιο, το μαγνήσιο και ο σίδηρος, με τα πρώτα τρία στοιχεία να υπερτερούν σε σχέση με τα υπόλοιπα. Η τιμή pη του λευκώματος των νωπών αυγών κυμαίνεται από 7,6 έως 7,9. Κατά την αποθήκευση όμως των αυγών η ενεργός οξύτητα μπορεί να προσεγγίσει την τιμή 9,7, λόγω της απώλειας του διοξειδίου του άνθρακα μέσω των πόρων του φλοιού [44]. Στο λεύκωμα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 40 πρωτεΐνες οι κυριότερες από τις οποίες παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.2 [45-47]. Το λεύκωμα του αυγού είναι ένα μίγμα διαλυτών σφαιροπρωτεϊνών, εκτός από την ωομυκίνη, η οποία είναι αδιάλυτη και τείνει να σχηματίζει ασθενείς δικτυωτές δομές που είναι υπεύθυνες για την βλεννώδη υφή του [48]. Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνικών κλασμάτων πραγματοποιείται με προσθήκη θειϊκού αμμωνίου. Το ίζημα που παραλαμβάνεται περιέχει γλοβουλίνες, λυσοζύμη και ωομυκίνη ενώ στο διάλυμα παραμένουν η ωοαλβουμίνη, η κοναλβουμίνη και το ωομυκοειδές. Περαιτέρω διαχωρισμός επιτυγχάνεται με εφαρμογή της χρωματογραφίας ιοντοανταλλαγής [46,49]. 15

19 Πίνακας 2.2. Οι κυριότερες πρωτεΐνες του λευκώματος του αυγού. Πρωτεΐνη % (w/w) pi Mw (kda) Ωοαλβουμίνη 54 4,5-4,9 45 Κοναλβουμίνη ,0-6,1 77,7 Ωομυκοειδές 11 4,1 28 Ωομυκίνη 1,5-3,5 4,5-5,0 5,5-8,3 x 10 3 Λυσοζύμη 3,4-3,5 10,7 14,3-14,6 G2 ωογλοβουλίνη 1,0 4,9-5, G3 ωογλοβουλίνη 1,0 4,8. 5, Ωοφλαβοπρωτεΐνη 0,8 4, , 80 Ωοστατίνη 0,5 4,5-4, Κυστατίνη 0,05 5,1 12 Αβιδίνη 0,05 10, ,3 Η ωοαλβουμίνη αποτελεί την κυριότερη πρωτεΐνη του λευκώματος. Είναι μια φωσφογλυκοπρωτεΐνη με πολυπεπτιδική αλυσίδα που περιέχει 385 αμινοξέα, τέσσερις σουλφυδριλικές ομάδες (μονάδες κυστεΐνης) και μια δισουλφιδική γέφυρα. Η ωοαλβουμίνη είναι μια αρκετά σταθερή στη θέρμανση πρωτεΐνη η οποία όταν μετουσιωθεί δίνει μια μηχανικά σταθερή πηκτή ο σχηματισμός της οποίας οφείλεται στην ανάπτυξη διαμοριακών δισουλφιδικών δεσμών. [50]. Η κοναλβουμίνη ή ωοτρανσφερίνη αποτελεί τη δεύτερη σημαντικότερη από την άποψη της συγκέντρωσης πρωτεΐνη του λευκώματος. Σε αντίθεση με την ωοαλβουμίνη, η κοναλβουμίνη δεν περιέχει φωσφορικές και σουλφυδριλικές ομάδες ενώ παράλληλα μετουσιώνεται σχετικά εύκολα με τη θέρμανση. Χαρακτηριστική της ιδιότητα είναι η δέσμευση μεταλλικών ιόντων, κυρίως του σιδήρου, του χαλκού και του μαγγανίου σε τιμή ph ίση με 6 ή μικρότερη, γεγονός που εξηγεί την εμφάνιση ερυθρού χρώματος κατά την επεξεργασία προϊόντων που έχουν παρασκευαστεί με το λεύκωμα του αυγού. Η εμφάνιση του ερυθρού χρώματος αποδίδεται στο σχηματισμό έγχρωμου συμπλόκου κοναλβουμίνης-σιδήρου. Η λυσοζύμη αποτελείται από 129 αμινοξέα και περιέχει τέσσερις δισουλφιδικούς δεσμούς ενώ δεν περιέχει καθόλου ελεύθερες σουλφυδριλικές ομάδες. Το ισοηλεκτρικό σημείο (10,7) είναι το υψηλότερο σε σχέση με αυτό των υπόλοιπων πρωτεϊνών του λευκώματος, ενώ το μοριακό βάρος είναι αρκετά 16

20 μικρότερο (Πίνακας 2.2.). Η θερμοκρασία μετουσίωσης (70-75 ο C), εξαρτάται από την τιμή του pη και τις συνθήκες διαλύματος. Η λυσοζύμη εμφανίζει ενζυμική δράση και λειτουργεί ως προστατευτικό συστατικό του αυγού έναντι της προσβολής από μικροοργανισμούς [51]. Το ωομυκοειδές είναι μια γλυκοπρωτεΐνη (20-25% υδατάνθρακες) που αποτελείται από 3 διαφορετικά τμήματα (domains). Η παρουσία εννέα δισουλφιδικών δεσμών καθιστά την πρωτεΐνη πολύ ανθεκτική στη θέρμανση. Η ωομυκίνη είναι, επίσης, μια γλυκοπρωτεΐνη, αδιάλυτη στο νερό αλλά διαλυτή σε διαλύματα αλάτων και σε ph μεγαλύτερο του 7. Με βάση την περιεκτικότητά σε υδατάνθρακες διακρίνεται στην α-ωομυκίνη και την β-ωομυκίνη. Το κλάσμα των υδατανθράκων αποτελείται κυρίως από εξόζες, εξοζαμίνες και σιαλικό οξύ σε ποσοστά 15, και 3-8%, αντίστοιχα. Στην παχύρευστη στοιβάδα του λευκώματος η αναλογία α- και β-ωομυκίνης είναι 84:20, ενώ στη λεπτόρευστη στοιβάδα η αναλογία είναι 40:3. Το λεύκωμα του αυγού σύμφωνα με τη βιβλιογραφία χρησιμοποιείται κυρίως σε προϊόντα όπου είναι απαραίτητος ο αφρισμός του αρχικού μίγματος.ο αφρισμός συνδέεται άμεσα με την προσρόφηση των πρωτεϊνών του λευκώματος του αυγού στη διεπιφάνεια αέρα-νερού. Οι Lechevalier et al. [52] σε πρόσφατη μελέτη τους ερεύνησαν τις αλλαγές στη διαμόρφωση των μορίων των πρωτεϊνών του λευκώματος κατά την προσρόφησή τους στη διεπιφάνεια αέρα-νερού και παρατήρησαν μεγαλύτερες μεταβολές στη δομή των μορίων της ωοαλβουμίνης, της ωοτρανσφερίνης και της λυσοζύμης όταν οι πρωτεΐνες συνυπάρχουν σε μίγματα σε σχέση με συστήματα που περιέχουν την κάθε πρωτεΐνη ξεχωριστά. Εκτός από τις αφριστικές ιδιότητες, το λεύκωμα του αυγού παρουσιάζει και πολύ καλές πηκτωματοποιητικές ιδιότητες. Ο μηχανισμός του σχηματισμού πηκτής με θέρμανση από τις πρωτεΐνες του λευκώματος περιλαμβάνει αρχικά τη θερμική μετουσίωση που στη συνέχεια οδηγεί σε συσσωμάτωση των μορίων και τη δημιουργία ενός τρισδιάστατου πλέγματος. Με τη θερμική μετουσίωση επηρεάζεται η διαμόρφωση των πρωτεϊνικών μορίων με αποτέλεσμα οι σουλφυδρυλικές ομάδες (- SH) που υπάρχουν στο εσωτερικό τους να εκτίθενται στην επιφάνεια και να σχηματίζουν διαμοριακούς δισουλφιδικούς δεσμούς (-S-S-) που δρουν ως σταυροδεσμοί και ενισχύουν τη δομή του πλέγματος [53,54]. 17

21 Κρόκος του αυγού Ο κρόκος είναι ένα πολύπλοκο φυσικοχημικό σύστημα που αποτελεί το 27-32% του αυγού. Η περιεκτικότητά του σε συνολικά στερεά είναι περίπου 50% και μπορεί να μειωθεί κατά την αποθήκευση του αυγού λόγω της μετανάστευσης του νερού από το λεύκωμα. Τα κυριότερα στερεά συστατικά του κρόκου είναι τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες σε αναλογία περίπου 2:1. Τα λιπίδια του κρόκου είναι κυρίως τριγλυκερίδια (65,5%), φωσφολιπίδια (28,3%) και χοληστερόλη (5,2%). Στον κρόκο επίσης υπάρχουν υδατάνθρακες σε ποσοστό περίπου 1%, ανόργανα στοιχεία όπως ο φωσφόρος, το ασβέστιο και το κάλιο καθώς επίσης και βιταμίνες. Ο διαχωρισμός των επιμέρους συστατικών του κρόκου μπορεί να γίνει με φυγοκέντρηση. Τα στερεά που παραλαμβάνονται ονομάζονται κόκκοι (granules) ενώ το υπερκείμενο διαυγές κίτρινο υγρό που αποτελεί το 35% ονομάζεται πλάσμα (plasma) [44] Οι κόκκοι του κρόκου αποτελούνται από λιπίδια (34%), πρωτεΐνες (60%) και τέφρα (6%). Η διάσπαση των κόκκων παρουσία 0,6 Μ ΝaCl προκαλεί την απελευθέρωση των α- και β-λιποβιτελλινών (70%), της φωσβιτίνης (16%) και των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας (LDL) (12%). Οι α- και β-λιποβιτελλίνες έχουν μοριακό βάρος 400kDa, εμφανίζουν σταθερότητα κατά τη θέρμανση και διαφέρουν ως προς την περιεκτικότητά τους σε φωσφόρο (0,39 και 0,19%, αντίστοιχα). Η φωσβιτίνη περιέχει αρκετά υψηλή περιεκτικότητα σε φωσφόρο (10%) που αντιπροσωπεύει το 80% περίπου του φωσφόρου του κρόκου και έχει την ιδιότητα να δεσμεύει ισχυρά πολυσθενή κατιόντα όπως ο τρισθενής σίδηρος [55]. Το πλάσμα αποτελείται από χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL, 85%) και λιβετίνες α, β, γ (15%), ενώ σε μικρότερο ποσοστό περιλαμβάνει συστατικά με ιδιότητες που παρουσιάζουν βιολογικό ενδιαφέρον, όπως πρωτεΐνες που ενώνονται με τη ριβοφλαβίνη και τη βιοτίνη. Τα LDL μικκύλια αποτελούνται από έναν πυρήνα ουδέτερων λιπιδίων, που περιβάλλεται από φωσφολιπίδια και πρωτεΐνες, με τις υδρόφοβες ομάδες των φωσφολιπιδίων να προσανατολίζονται προς το εσωτερικό και τις υδρόφιλες προς το εξωτερικό του μικκυλίου. Αυτό καθιστά το μικκύλιο πολύ διαλυτό στο νερό και αδιάλυτο στους οργανικούς διαλύτες [55] Μια σημαντική ιδιότητα του κρόκου του αυγού είναι η ικανότητά του να σχηματίζει πηκτές κατά τη θέρμανση. Ο σχηματισμός πηκτής αρχίζει γύρω στους 18

22 70 ο C και οφείλεται στο σχηματισμό ενός τρισδιάστατου πρωτεϊνικού πλέγματος με σκληρή, συνεκτική και κομμιώδη υφή [56]. Η παρουσία των λιποπρωτεϊνών στον κρόκο τον καθιστά απαραίτητο συστατικό για την παρασκευή και τη σταθεροποίηση προϊόντων όπως τα κέικ, οι μαγιονέζες, τα εμβάμματα σαλάτας κ.α. Οι λιποπρωτεΐνες που βρίσκονται τόσο στα μικκύλια όσο και στους κόκκους είναι εξαιρετικοί γαλακτωματοποιητές και συμβάλλουν στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση γαλακτωμάτων όπως τα εμβάμματα σαλάτας όπου η χρησιμοποίηση άλλων γαλακτωματοποιητών δεν έχει τα ίδια επιθυμητά αποτελέσματα. Η αποτελεσματικότητα των λιποπρωτεϊνών οφείλεται στην ευελιξία και διεισδυτικότητα των πρωτεϊνικών μορίων τα οποία προσροφώνται και αναδιατάσονται ταχύτατα σε διεπιφάνειες ελαίου-νερού σχηματίζοντας ένα ιξωδοελαστικό υμένιο το οποίο συμβάλλει στη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων [57]. 19

23 3. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Τα εμβάμματα σαλάτας (salad dressings) είναι γαλακτώματα που περιέχουν έλαιο σε ποσοστό 20-85%, έχουν σχετικά υψηλή περιεκτικότητα σε NaCl και χαμηλή τιμή ph [58]. Όπως και όλα τα γαλακτώματα, τα εμβάμματα σαλάτας είναι από φυσικοχημική άποψη ασταθή συστήματα. Έτσι, μετά από ορισμένο χρονικό διάστημα αποθήκευσης στα συστήματα είναι δυνατό να προκύψει διαχωρισμός φάσεων αλλά και συγχώνευση σταγονιδίων. Για το σκοπό αυτό προστίθενται στα γαλακτώματα αυτά πολυσακχαρίτες όπως η ξανθάνη. Εξαίρεση αποτελούν τα γαλακτώματα τύπου μαγιονέζας τα οποία λόγω της υψηλής περιεκτικότητας τους σε έλαιο (60-85%), εμφανίζονται σταθερότερα σε σχέση με τα υπόλοιπα συστήματα. Για την παρασκευή των εμβαμμάτων σαλάτας χρησιμοποιείται συνήθως κρόκος του αυγού, ή ορισμένες φορές πλήρες αυγό. Επίσης κυκλοφορούν στην αγορά και ελεύθερα χοληστερόλης γαλακτώματα τύπου εμβάμματος σαλάτας που παρασκευάζονται αποκλειστικά και μόνο με λεύκωμα του αυγού. Οι πρωτεΐνες του λευκώματος είναι περισσότερο γνωστές για την αφριστική και την πηκτωματοποιητική τους ικανότητα ενώ θεωρούνται υποδεέστερες ως γαλακτωματοποιητές σε σχέση με τις λιποπρωτεΐνες του κρόκου. Οι γαλακτωματοποιητικές τους ιδιότητες δεν έχουν μέχρι σήμερα μελετηθεί, ειδικά σε συστήματα τύπου εμβάμματος σαλάτας όπου λόγω των συνθηκών που επικρατούν (σχετικά χαμηλό ph, παρουσία NaCl) η λειτουργική δράση των σφαιροπρωτεϊνών αναμένεται να είναι μάλλον περιορισμένη, με δεδομένο ότι το ισοηλεκτρικό σημείο της κυριότερης πρωτεΐνης του λευκώματος, της ωοαλβουμίνης (pi 4,5), βρίσκεται πολύ κοντά στο ph των εμβαμμάτων σαλάτας (περίπου 3,8). Ένας πρώτος στόχος, επομένως, της εργασίας ήταν να μελετηθεί η γαλακτωματοποιητική και η σταθεροποιητική δράση της πρωτεΐνης του λευκώματος στα συστήματα αυτά και να συγκριθεί με αυτήν του κρόκου. Ένας δεύτερος στόχος ήταν η μελέτη της δράσης των πρωτεϊνών αυτών σε γαλακτώματα τύπου εμβάμματος σαλάτας τα οποία παρασκευάζονται με κρόκο. Λόγω της σφικτής σφαιρικής δομής των περισσότερων πρωτεϊνών του λευκώματος η προσροφητική ικανότητά τους παρουσία πρωτεϊνών του κρόκου αναμένεται, όπως εξάλλου αναφέρεται στη βιβλιογραφία [31], να είναι πολύ περιορισμένη. Η παρουσία τους, επομένως, στη συνεχή φάση των γαλακτωμάτων μπορεί να οδηγήσει σε φαινόμενα οσμωτικής 20

24 συσσωμάτωσης και αποσταθεροποίησης συστημάτων που παρασκευάζονται με πλήρες αυγό [59]. 21

25 4. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4.1. Υλικά Αντιδραστήρια Για την παρασκευή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκαν αυγά από την τοπική αγορά, αφυδατωμένο λεύκωμα αυγού (ΑΛΑ) Grade II (85% πρωτεΐνη σε g/100g) και ξανθάνη εμπορίου G Batch#023K0185 (Sigma, St. Louis). Το έλαιο που χρησιμοποιήθηκε ήταν εξευγενισμένο αραβοσιτέλαιο (Φλώρα, ΕΛΑΪΣ). Το ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε για τη ρύθμιση της ενεργού οξύτητας της συνεχούς φάσης των γαλακτωμάτων παρασκευάστηκε με όξινο κιτρικό νάτριο και χλωριούχο νάτριο (Riedel-de Haen, Seelze, Germany). Σε όλα τα γαλακτώματα προστέθηκε νατραζίδιο ως συντηρητικό (Sigma, St. Louis). Για τη ρύθμιση της ενεργού οξύτητας των γαλακτωμάτων και του ρυθμιστικού διαλύματος χρησιμοποιήθηκαν καυστικό νάτριο και υδροχλωρικό οξύ (Merck, Darmstadt, Germany). Για τον χρωματομετρικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης με τη μέθοδο Lowry χρησιμοποιήθηκαν καυστικό νάτριο, τρυγικό οξύ και ένυδρος θειικός χαλκός (Merck, Darmstadt, Germany), ανθρακικό νάτριο (Riedel-de Haen, Seelze, Germany) και αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu (Fluka AG, Buchs). Για την ηλεκτροφόρησητων πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν ακρυλαμίδιο, τρις- (υδροξυμεθυλο)αμινομεθάνιο, δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (SDS), ΝΝ -μεθυλενο-διςακρυλαμίδιο, γλυκίνη, υπερθειικό αμμώνιο, τετραμεθυλενο-αιθυλενοδιαμίνη (TEMED), 2-μερκαπτοαιθανόλη, κυανούν του Coomasie (Brilliant Blue G-250) και κυανούν της βρωμοφαινόλης (Sigma, St. Louis), τριχλωροξικό οξύ (Riedel-de Haen, Seelze, Germany), οξικό οξύ και μεθανόλη (Merck, Darmstadt, Germany) και γλυκερόλη εμπορίου Συσκευές Όργανα Για την παρασκευή των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκε μηχανικός αναδευτήρας RW 20.n με προπέλα R 1342 (IKA Labortechnik, Germany) και η ρύθμιση της ενεργού οξύτητας των διαλυμάτων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια ψηφιακού πεχαμέτρου MP 220 (Mettler Toledo, Germany). 22

26 Για την παρασκευή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκε ομογενοποιητής Ultra Turrax T25 (IKA Labortechnik, Germany) με στέλεχος S25KG-25F. Ο προσδιορισμός του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων πραγματοποιήθηκε με τον αναλυτή μεγέθους σταγονιδίων Mastersizer 2000, (Malvern Instruments, UK) και το ιξώδες των γαλακτωμάτων μετρήθηκε με τη βοήθεια ιξωδομέτρου Model DVII Brookfield (Engineering Laboratories Inc., U.S.A.) που έφερε στέλεχος SC4-18/13R. Για την προετοιμασία των δειγμάτων για την ηλεκτροφόρηση, τα δείγματα αρχικά φυγοκεντρήθηκαν με φυγόκεντρο SV11 (Firlabo, France) για το διαχωρισμό της κρέμας από την υδατική φάση. Η θέρμανση που ακολούθησε πραγματοποιήθηκε σε υδρόλουτρο Bioline Scientific model WB Για την αφυδάτωση των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε συσκευή λυοφιλίωσης Alpha 1-2(Martin Christ, UK). Η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών έγινε με συσκευή ηλεκτροφόρησης V2-II-20 (Scie-Plas, England) με τροφοδοτικό ηλεκτροφόρησης ST 1006T 998Volts, 600mA, 250Watts (Apelex, France). Οι πηκτές φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή κάμερα Kodak DC3400 (U.S.A.) σε θάλαμο φωτογράφησης πηκτών ηλεκτροφόρησης Reprostar 3 (Camag, Switzerland). Για την εκτίμηση του ποσοστού των πρωτεΐνικών ζωνών, οι πηκτές αναλύθηκαν με το λογισμικό ανάλυσης ηλεκτροφόρησης Gel Pro Analyzer (Version 3, Media Cybermetics ). Η παρατήρηση των γαλακτωμάτων πραγματοποιήθηκε σε μικροσκόπιο Axiolab A με φακούς Carl Zeiss ενώ οι φωτογραφίες αποτυπώθηκαν με τη βοήθεια ψηφιακής κάμερας Canon, Power Shot G2. Για τη μέτρηση της απορρόφησης των διαλυμάτων κατά το χρωματομετρικό προσδιορισμό της πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο Helios, (Thermospectronic, U.S.A.). Τέλος, όλες οι ζυγίσεις κατά τη διάρκεια των πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν με ζυγό ακριβείας τρίτου δεκαδικού ψηφίου (EORV70 Explorer, Ohaus, Switzerland). 23

27 4.3. Μέθοδοι Πειραματικές διαδικασίες Παρασκευή γαλακτωμάτων ελαίου-νερού (Ε/Ν) Για την παρασκευή των γαλακτωμάτων με λεύκωμα αυγού ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία. Αρχικά παρασκευάστηκε διάλυμα πρωτεΐνης, με διαλυτοποίηση ορισμένης ποσότητας ΑΛΑ σε ρυθμιστικό διάλυμα όξινου κιτρικού νατρίου 0,02Μ (ph=3,8) και NaCl 0,15M. Η πρωτεΐνη διαλυτοποιήθηκε με έντονη ανάδευση για 60 min με τη βοήθεια μηχανικού αναδευτήρα. Στη συνέχεια προστέθηκε στάγδην και υπό συνεχή ανάδευση αραβοσιτέλαιο και η ανάδευση συνεχίστηκε για 30 min. Το γαλάκτωμα που προέκυψε ομογενοποιήθηκε για 1 min με ομογενοποιητή Ultra Turrax T25 S25KG-25F με ταχύτητα rpm. Το αρχικό αυτό γαλάκτωμα περιείχε 5% (w/v) πρωτεΐνη του λευκώματος και 60% (v/v) έλαιο (φ=0,60). Στη συνέχεια παρασκευάσθηκε διάλυμα ξανθάνης 1% (w/v) στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα όξινου κιτρικού νατρίου με NaCl. Το αρχικό γαλάκτωμα αραιώθηκε κατάλληλα με το διάλυμα της ξανθάνης έτσι ώστε να προκύψουν τελικά γαλακτώματα με περιεκτικότητα 2,5% (w/v) σε πρωτεΐνη, 30% (v/v) σε έλαιο (φ=0,30) και 0, 0,05, 0,1, 0,2 και 0,4% (w/v) σε ξανθάνη. Για την παρασκευή των γαλακτωμάτων του κρόκου, αρχικά παραλήφθηκε υγρός κρόκος με θραύση των αυγών, διαχωρισμό του λευκώματος από τον κρόκο με τη βοήθεια απορροφητικού χαρτιού και διάτρηση του βιτελλινικού υμένα. Ακολούθησε διασπορά του υγρού κρόκου σε ρυθμιστικό διάλυμα όξινου κιτρικού νατρίου 0,02Μ (ph=3,8) και 0,15M NaCl έτσι ώστε να προκύψει ένα αιώρημα 10% (w/v) σε υγρό κρόκο. Στη συνέχεια, προστέθηκε στάγδην και υπό συνεχή ανάδευση αραβοσιτέλαιο και ακολούθησε ομογενοποίηση για 1 min. Το αρχικό αυτό γαλάκτωμα περιείχε 5% (w/v) υγρό κρόκο και 60% (v/v) έλαιο (φ=0,60). Στη συνέχεια παρασκευάσθηκε διάλυμα ΑΛΑ 8% (w/v) στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα όξινου κιτρικού νατρίου. Το αρχικό γαλάκτωμα του κρόκου αραιώθηκε κατάλληλα με το ρυθμιστικό διάλυμα και με το διάλυμα του ΑΛΑ ώστε να προκύψουν τελικά γαλακτώματα με περιεκτικότητα σε 2,5% (w/v) σε υγρό κρόκο, 30% (v/v) σε έλαιο (φ=0,30) και 0, 0,5, 1,0, 1,5, 2,5 και 4,0% (w/v) σε ΑΛΑ. 24

28 Σε όλα τα γαλακτώματα προστέθηκε μικρή ποσότητα νατραζιδίου (0,01% (w/v)) για την αποφυγή μικροβιακής ανάπτυξης και τα γαλακτώματα αποθηκεύτηκαν στους 25 ο C για περαιτέρω μελέτη Μέτρηση του μεγέθους των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων Η κατανομή του μεγέθους των σταγονιδίων του ελαίου στα γαλακτώματα προσδιορίστηκε με τη βοήθεια του μετρητή μεγέθους σταγονιδίων Malvern Mastersizer Το γαλάκτωμα θερμοστατήθηκε σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατόπιν, 1 ml δείγματος αραιώθηκε με δεκαπλάσιο όγκο διαλύματος 2% (w/v) SDS προκειμένου να επέλθει πλήρης διάσπαση των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων, και στη συνέχεια αποχύθηκε στο δοχείο μέτρησης του οργάνου που περιείχε 600 ml αποσταγμένου νερού. Ακολούθησε ανάδευση και μέτρηση της κατανομής του μεγέθους σταγονιδίων, η οποία βασίζεται στο σκεδασμό μονοχρωματικής ακτίνας laser μήκους κύματος λ=632,8 nm από τα σταγονίδια του ελαίου του γαλακτώματος. Οι παράμετροι των μετρήσεων ήταν: δείκτης διάθλασης της συνεχούς φάσης και του ελαίου: 1,33 και 1,4673, αντίστοιχα, απορρόφηση της συνεχούς φάσης: 0,002. Το όργανο είναι συνδεδεμένο με ηλεκτρονικό υπολογιστή ο οποίος επεξεργάζεται τα δεδομένα και υπολογίζει την κατανομή μεγέθους σταγονιδίων. Με βάση την κατανομή αυτή υπολογίζεται το μέσο μέγεθος των σταγονιδίων σύμφωνα με τους τύπους: d 3,2 Σn d i = Σn d i i i 3 2 και όπου: d 3,2 = η μέση διάμετρος όγκου- επιφάνειας των σταγονιδίων d 4,3 = η μέση διάμετρος μέσου όγκου των σταγονιδίων n i = ο αριθμός των σταγονιδίων με διάμετρο d i d 4,3 = Σn d i Σn d i i i

29 Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε και με την απ ευθείας προσθήκη 1ml γαλακτώματος στο δοχείο του οργάνου (χωρίς την προσθήκη SDS) προκειμένου να μετρηθεί η κατανομή του μεγέθους των συσσωματωμάτων των σταγονιδίων στο γαλάκτωμα. Κάθε δείγμα μετρήθηκε τρεις φορές και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με τους μέσους όρους αυτών των μετρήσεων Εκτίμηση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων ως προς την αποκορύφωση εκτιμήθηκε με παρατήρηση της μεταβολής του ύψους της διεπιφάνειας ανάμεσα στην υδατική στοιβάδα και την κρέμα, με το χρόνο αποθήκευσης. Συγκεκριμένος όγκος γαλακτώματος μεταφέρθηκε με απόχυση σε γυάλινα κυλινδρικά φιαλίδια με πώμα, διαστάσεων 1cm (διαμετρος) x 6cm (ύψος) και καταγράφηκε το αρχικό ύψος Η 0. Αρχικά (t=0), το γαλάκτωμα ήταν ομογενές. Η χρονική στιγμή που οι δυο στοιβάδες διαχωρίστηκαν για πρώτη φορά καταγράφηκε και στη συνέχεια, μετρήθηκε το ύψος της υδατικής στοιβάδας ανά τακτά χρονικά διαστήματα ώστε να προκύψουν διαγράμματα ύψους-χρόνου. Η σταθερότητα του γαλακτώματος ως προς την αποκορύφωση δίνεται από τον τύπο: Η% = Η Η t όπου: Η 0 = το αρχικό ύψος του γαλακτώματος για t=0 και Η t = το ύψος της υδατικής φάσης τη χρονική στιγμή t. Για την εκτίμηση της σταθερότητας των γαλακτωμάτων ως προς τη συγχώνευση έγιναν μετρήσεις της μέσης διαμέτρου των σταγονιδίων για διάφορους χρόνους αποθήκευσης. 26

30 Μέτρηση του ιξώδους των γαλακτωμάτων Για τη μέτρηση του συντελεστή ιξώδους των γαλακτωμάτων, ποσότητα δείγματος ίση με 10 ml, τοποθετήθηκε σε σύστημα ομόκεντρων κυλίνδρων του ιξωδομέτρου και αφέθηκε να θερμοστατηθεί για 15 λεπτά στους 25 o C. Κάθε δείγμα μετρήθηκε τρεις φορές και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με τους μέσους όρους αυτών των μετρήσεων Παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο Τα γαλακτώματα τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρο πλάκα και παρατηρήθηκαν με τη βοήθεια μικροσκοπίου που έφερε φακό Carl Zeiss (40/0,65). Η παρατήρηση των γαλακτωμάτων έγινε είτε απ ευθείας είτε μετά από αραίωσή τους με την αντίστοιχη συνεχή φάση έτσι ώστε να προκύψει περιεκτικότητα σε έλαιο ίση με 1%. Σε κάθε περίπτωση οι παρατηρούμενες εικόνες αποτυπώθηκαν με τη βοήθεια ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής Canon, Power Shot G Ηλεκτροφόρηση του μίγματος των πρωτεϊνών που προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων Τα γαλακτώματα μετά την παρασκευή τους παρέμειναν για 24 ώρες στους 25 ο C για να αποκατασταθεί η ισορροπία. Μετά την πάροδο των 24 ωρών ακολούθησε παραλαβή του κλάσματος των πρωτεϊνών που προσροφήθηκαν στην επιφάνεια των σταγονιδίων σύμφωνα με την εξής διαδικασία: 15 ml γαλακτώματος αραιώθηκαν με 45 ml ρυθμιστικού διαλύματος και το αραιωμένο γαλάκτωμα φυγοκεντρήθηκε στα 3500g για 30 min. Παραλήφθηκε η κρέμα στην οποία προστέθηκαν πάλι 45 ml ρυθμιστικού διαλύματος και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις ίδιες συνθήκες. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε μέχρι να απομακρυνθεί πλήρως η μη προσροφημένη πρωτεΐνη του υποκείμενου υγρού. Η διαπίστωση της απουσίας πρωτεΐνης στο υποκείμενο υγρό έγινε με τη βοήθεια της μεθόδου Lowry [60]. Στη συνέχεια η κρέμα αποθηκεύτηκε στους -20 ο C για 24 ώρες, ακολούθησε θέρμανση στους 50 ο C για 20 min και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στα 4500g για 30 min. Η διαδικασία αυτή κατάψυξης θέρμανσης φυγοκέντρησης επαναλήφθηκε μέχρι την πλήρη απομάκρυνση του ελαίου ενώ το υπόλοιπο δείγμα λυοφιλιώθηκε για την απομάκρυνση της υγρασίας. Η λυοφιλιωμένη πρωτεΐνη αναλύθηκε με την SDS- 27

31 PAGE ηλεκτροφόρηση σύμφωνα με τη μέθοδο Laemmli [61]. Το σύστημα αποτελούνταν από την πηκτή διαχωρισμού (separating gel), όπου γίνεται ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών, με περιεκτικότητα 10% σε ακρυλαμίδιο και την πηκτή επιστοίβαξης (stacking gel), όπου συγκεντρώνονται οι πρωτεΐνες πριν διαχωριστούν, με περιεκτικότητα 3% σε ακρυλαμίδιο. Η σύσταση όλων των διαλυμάτων που χρησιμοποιήθηκαν δίνεται στον Πίνακα 4.1. Πίνακας 4.1. Σύσταση διαλυμάτων που χρησιμοποιούνται στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Tris-glycine ρυθμιστικό διάλυμα δοχείου ηλεκτροφόρησης (0,025 Μ Tris, 0,192 Μ Γλυκίνη), 3,5 lt Tris stock διάλυμα, ph=6,8 (0,625 Μ Tris), 100 ml Tris stock διάλυμα, ph=8,9 (1,875 Μ Tris), 100 ml Διάλυμα SDS, 100 ml Ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (0,625 Μ Tris), 1 lt Διάλυμα ακρυλαμιδίου stock, 100 ml Διάλυμα Υπερθειικού αμμωνίου, 100 ml Διάλυμα πηκτής διαχωρισμού (Separating gel) Διάλυμα πηκτής επιστοίβαξης (Stacking gel) 10,60 g Tris 50,4 g Γλυκίνη 3,5 g SDS ph=8,3 7,56 g Tris 22,7 g Tris 10 g SDS 39,4 g Tris 2 g SDS 10 ml Γλυκερόλη 5 ml 2-Μερκαπτοαιθανόλη 0,1 ml κυανού της βρωμοφαινόλης (1%) 29 g Ακρυλαμιδίου 1 g NN -μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο 0,1 g Υπερθειικό αμμώνιο 19,8 ml διαλύματος ακρυλαμιδίου stock 12 ml Τρις διάλυμα, ph 8,9 0,6 ml διαλύματος SDS 27 ml αποσταγμένο νερό 0,06 g Υπερθειικού αμμωνίου 90 μl ΤΕΜΕD 2,4 ml διαλύματος ακρυλαμιδίου stock 4 ml Τρις διάλυμα, ph 6,8 0,2 ml διαλύματος SDS 13,2 ml αποσταγμένο νερό 0,02 g Υπερθειικού αμμωνίου 48 μl ΤΕΜΕD Διάλυμα χρωματισμού, 1 lt 1 g Coomasie Blue G ml οξικό οξύ 500 ml μεθανόλη Διάλυμα αποχρωματισμού Διάλυμα οξικού οξέος 7% 28

32 Στατιστική ανάλυση των πειραματικών αποτελεσμάτων Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν στατιστικώς με τη χρήση του προγράμματος One- Way ANOVA που περιλαμβάνεται στο πρόγραμμα λογισμικού SPSS v.8.0. Το επίπεδο εμπιστοσύνης ήταν 95%. Οι στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των μέσων όρων διαπιστώθηκαν με τη μέθοδο LSD. 29

33 5. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5.1. Μελέτη της σταθερότητας γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με λεύκωμα του αυγού Η επίδραση της συγκέντρωσης της ξανθάνης στο ρυθμό αποκορύφωσης των γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με λεύκωμα του αυγού φαίνεται στο Σχήμα 5.1(α). Τα γαλακτώματα παρουσία ξανθάνης εμφάνισαν μεγαλύτερη σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση σε σχέση με το γαλάκτωμα χωρίς ξανθάνη. Επιπλέον, ενώ στα γαλακτώματα με συγκέντρωση ξανθάνης 0,05 και 0,1% παρατηρήθηκε έναρξη του διαχωρισμού των φάσεων μετά από 3 και 34 ημέρες αποθήκευσης, αντίστοιχα, όταν η συγκέντρωση της ξανθάνης στο σύστημα αυξήθηκε στο 0,2% δεν παρατηρήθηκε κανένας διαχωρισμός ακόμα και μετά από αποθήκευση για 100 ημέρες. Η σταθερότητα των γαλακτωμάτων με χαμηλή συγκέντρωση ξανθάνης είναι πολύ πιθανό να συνδέεται με το σχηματισμό, αρχικά, ενός δικτυώματος σταγονιδίων η δομή του οποίου μεταβάλεται σταδιακά με το χρόνο αποθήκευσης προς μια δομή λιγότερο εκτεταμένη λόγω της αναδιάταξης των σταγονιδίων στο χώρο [62]. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ξανθάνης, προκαλείται προφανώς μια αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης με αποτέλεσμα τα σταγονίδια να κινούνται με μεγάλύτερη δυσκολία και τα γαλακτώματα να εμφανίζουν μεγάλη σταθερότητα ως προς την αποκορύφωση. Στο Σχήμα 5.1(β). παρουσιάζεται η αποκορύφωση με το χρόνο αποθήκευσης των γαλακτωμάτων που παρασκευάζονται με κρόκο. Όπως γίνεται αντιληπτό, τα γαλακτώματα αυτά για σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ξανθάνης, ήταν λιγότερο σταθερά από τα αντίστοιχα του λευκώματος αφού ο διαχωρισμός των φάσεων στα γαλακτώματα του κρόκου παρατηρήθηκε μετά από αποθήκευση για μικρότερο χρονικό διάστημα. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ξανθάνης, η αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης οδήγησε σε ενίσχυση της σταθερότητας και τα γαλακτώματα του κρόκου εμφάνισαν σταθερότητα παρόμοια με αυτήν των γαλακτωμάτων του λευκώματος. 30

34 50 40 α 30 H% Χρόνος (h) 50 β H% Χρόνος (h) Σχήμα 5.1. Επίδραση της συγκέντρωσης της ξανθάνης στο ρυθμό αποκορύφωσης γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ (α) και με κρόκο του αυγού(β): ( ) 0, ( ) 0,05, ( ) 0,1, ( ) 0,2 και ( ) 0,4% ξανθάνη. 31

35 Από τις τιμές του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων (d 4,3 ) συμπεραίνεται ότι απουσία ξανθάνης, τα γαλακτώματα που είχαν παρασκευαστεί με λεύκωμα του αυγού ήταν συσσωματωμένα σε μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση με αυτά του κρόκου (Σχήμα 5.2.). Η εκτεταμένη συσσωμάτωση των σταγονιδίων στα γαλακτώματα αυτά προφανώς συνδέεται με το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες του λευκώματος ως σφαιροπρωτεΐνες, όταν προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων υφίστανται επιφανειακή μετουσίωση με άμεσο αποτέλεσμα τη εμφάνιση υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα πρωτεϊνικά μόρια που είναι προσροφημένα στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων. Παράλληλα, λόγω της υψηλής σχετικά συγκέντρωσης των θειούχων αμινοξέων στα μόρια των σφαιροπρωτεϊνών του λευκώματος, είναι δυνατό να αναπτυχθούν και δισουλφιδικοί δεσμοί ανάμεσα στις πρωτεινικές μεμβράνες των γειτονικών σταγονιδίων με αποτέλεσμα να ενισχυθούν ακόμα περισσότερο οι δυνάμεις που συμβάλουν στη συγκράτηση των σταγονιδίων εντός των συσσωματωμάτων, όπως αναφέρθηκε και για γαλακτώματα της β- γαλακτογλοβουλίνης [28]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.2, τα συσσωματώματα των γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με λεύκωμα διασπάστηκαν πλήρως μόνο μετά από κατεργασία με SDS και DTT, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία υδρόφοβων αλλά και δισουλφιδικών δεσμών ανάμεσα στα σταγονίδια. Αντίθετα, επεξεργασία με SDS μόνο επαρκούσε για την πλήρη διάσπαση των συσσωματωμάτων των γαλακτωμάτων του κρόκου. 32

36 d 4,3 (μm) ,1 0,2 0,3 0,4 Συγκέντρωση ξανθάνης (%) Σχήμα 5.2. Επίδραση της συγκέντρωσης της ξανθάνης στο μέσο μέγεθος σταγονιδίων d 4,3, γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ ( ) και με κρόκο του αυγού( ).Η μέτρηση έγινε μετά από διασπορά των γαλακτωμάτων σε νερό, μετά απο κατεργασία με SDS ( και, αντίστοιχα) ή μετά από κατεργασία του γαλακτώματος του λευκώματος με SDS και DTT ( ). Όπως είναι γνωστό, η προσθήκη ξανθάνης σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε γαλακτώματα ελαίου-νερού μπορεί να προκαλέσει συσσωμάτωση των σταγονιδίων μέσω οσμωτικών φαινομένων [2]. Οι υψηλές τιμές d 4,3 στα γαλακτώματα με συγκεντρώσεις ξανθάνης 0,05 και 0,1% μαρτυρούν την ύπαρξη συσσωματωμάτων. Επειδή, όμως, η μέτρηση του μέσου μεγέθους των σταγονιδίων έγινε αφού προηγήθηκε αραίωση του γαλακτώματος με νερό, τα φαινόμενα οσμωτικής συσσωμάτωσης θα έπρεπε να είχαν παύσει να ισχύουν στο αραιωμένο σύστημα και τα συσσωματώματα των σταγονιδίων να είχαν διασπαστεί πλήρως. Όπως, όμως, παρατηρήθηκε η τιμή της μέσης διαμέτρου των σταγονιδίων ήταν αρκετά υψηλή κάτι που υποδηλώνει ότι τα σταγονίδια των συσσωματωμάτων είναι πολύ πιθανό να συγκρατούνται ισχυρά λόγω του σχηματισμού γεφυρών στις οποίες συμμετέχουν οι πρωτεϊνικές μεμβράνες των σταγονιδίων και οι οποίες δεν διασπώνται κατά την αραίωση με το νερό που προηγείται της μέτρησης. Με βάση τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης, η ωοαλβουμίνη φαίνεται να είναι η πρωτεΐνη που απαντά προσροφημένη σε μεγαλύτερη έκταση στην επιφάνεια 33

37 των σταγονιδίων του γαλακτώματος σε σχέση με τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του λευκώματος (Σχήμα 5.3.). Η εκατοστιαία σχετική περιεκτικότητα του λευκώματος σε ωοτρανσφερίνη, ωοαλβουμίνη, ωομυκοειδές και λυσοζύμη ήταν 8,6, 74,6, 10,2 και 6,6%, αντίστοιχα, Τα αντίστοιχα ποσοστά για τις τρεις πρώτες πρωτεΐνες που βρέθηκαν στο προσροφημένο κλάσμα του λευκώματος στα γαλακτώματα ήταν 6,7, 86,8 και 6,5% αντίστοιχα, ενώ από την επιφάνεια των σταγονιδίων απουσίαζε εντελώς η λυσοζύμη, ενδεχομένως λόγω ανταγωνιστικής εκτόπισής της από τα υπόλοιπα πρωτεϊνικά συστατικά του λευκώματος. Όπως είναι γνωστό, η ωοαλβουμίνη έχει στο μόριό της τέσσερις σουλφυδριλικές ομάδες και μια δισουλφιδική γέφυρα. Μετά την προσρόφηση στη διεπιφάνεια αέρα-νερού, τα μόρια της ωοαλβουμίνης μετουσιώνονται μερικώς με αποτέλεσμα να αποκαλύπτονται υδρόφοβα και θειούχα αμινοξέα από το εσωτερικό τους. Με αυτόν τον τρόπο είναι εφικτή η δημιουργία υδρόφοβων και δισουλφιδικών γεφυρών μεταξύ των προσροφημένων μορίων με αποτέλεσμα το σχηματισμό στη διεπιφάνεια μιας μηχανικά ανθεκτικής μεμβράνης [48]. Στην περίπτωση των γαλακτωμάτων και κάτω από ορισμένες συνθήκες (τιμή ph κοντά στο ισοηλεκτρικό σημείο της ωοαλβουμίνης και υψηλή τιμή ιονικής ισχύος) τα σταγονίδια είναι δυνατό να πλησιάσουν αρκετά μεταξύ τους λόγω της απουσίας ισχυρών απωστικών δυνάμεων με αποτέλεσμα την εμφάνιση υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων και τη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών μεταξύ των προσροφημένων σε γειτονικά σταγονίδια πρωτεϊνών, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό συσσωματωμάτων. 34

38 MW (kda) 97.2 Ovtf Ovlb Ovmd Lys Σχήμα 5.3. Ηλεκτροφόρημα SDS-PAGE, πρωτεΐνης του ΑΛΑ (b) και του πρωτεϊνικού κλάσματος που προσροφήθηκε στην επιφάνεια των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με το ΑΛΑ (c). Η διαδρομή (a) αντιστοιχεί στο μάρτυρα. Στη περίπτωση των γαλακτωμάτων του κρόκου, οι πρωτεΐνες που κυρίως συμβάλουν στο σχηματισμό και τη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων είναι οι λιποπρωτεΐνες. Λόγω της ευέλικτης δομής τους, οι πρωτεΐνες αυτές προσροφώνται ταχύτητα στην επιφάνεια των σταγονιδίων, ενώ οι υδρόφοβες ομάδες τους, σε αντίθεση με τις σφαιροπρωτεΐνες του λευκώματος, προσανατολίζονται αποτελεσματικότερα προς τη φάση του ελαίου με αποτέλεσμα η έκταση των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα πρωτεϊνικά μόρια που απαντούν προσροφημένα στην επιφάνεια γειτονικών σταγονιδίων να είναι σχετικά περιορισμένη, ενώ δεν φαίνεται να ευνοείται και η ανάπτυξη δισουλφιδικών δεσμών. Οι διαφορές αυτές ανάμεσα στην ισχύ και την έκταση των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια των δυο τύπων γαλακτωμάτων, δηλαδή του λευκώματος και του κρόκου αποτυπώνονται και στις διαφορές που παρατηρούνται ανάμεσα στις ρεολογικές τους ιδιότητες (Σχήμα 5.4.). Όπως προκύπτει, για την ίδια περιεκτικότητα σε ξανθάνη, τα γαλακτώματα του λευκώματος εμφανίζουν υψηλότερο ιξώδες από τα 35

39 αντίστοιχα γαλακτώματα του κρόκου, γεγονός που φανερώνει την ύπαρξη ισχυρότερων αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια των συσσωματωμάτων στην περίπτωση των γαλακτωμάτων του λευκώματος. Η αύξηση της τιμής του ιξώδους των γαλακτωμάτων τόσο του λευκώματος όσο και του κρόκου λόγω της προσθήκης ξανθάνης θα πρέπει να αποδοθεί στην ενίσχυση των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια που επιφέρει η παρουσία της ξανθάνης και όχι στην αύξηση του ιξώδους της συνεχούς φάσης του γαλακτώματος, αφού όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.4., οι τιμές ιξώδους των διαλυμάτων ξανθάνης είναι πολύ μικρότερες σε σχέση με αυτές των γαλακτωμάτων Ιξώδες (Pa.s) ,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 Συγκέντρωση ξανθάνης (%) Σχήμα 5.4. Επίδραση της συγκέντρωσης της ξανθάνης στο φαινομενικό ιξώδες γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ (, ) και με κρόκο του αυγού (, ), σε ρυθμό διάτμησης 1,98 (, ) και 7,92 s -1 (, ). Η καμπύλη με το σύμβολο ( ) αντιστοιχεί σε διάλυμα ξανθάνης. Από την παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο προέκυψε ότι απουσία ξανθάνης αλλά και σε χαμηλή συγκέντρώση του πολυσακχαρίτη (0,1% (w/v)) τα σταγονίδια των γαλακτωμάτων ήταν έντονα συσσωματωμένα. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ξανθάνης δεν εντοπίστηκε η ύπαρξη μεμονωμένων συσσωματωμάτων και τα σταγονίδια του γαλακτώματος παρέμειναν ομοιόμορφα κατανεμημένα στη συνεχή φαση του συστήματος (Σχήμα 5.5.). 36

40 Σχήμα 5.5. Εικόνα γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ και περιείχαν 0 (A), 0,1 (B) και 0,4% (C) ξανθάνη. Το μήκος της μπάρας αντιστοιχεί σε 30μm. 37

41 Μετά από αραίωση με διάλυμα ξανθάνης η συγκέντρωση του οποίου ήταν παρόμοια με τη συγκέντρωση του πολυσακχαρίτη στη συνεχή φάση κάθε γαλακτώματος, παρατηρήθηκε ότι τα συσσωματώματα των σταγονιδίων του γαλακτώματος που δεν περιείχαν ξανθάνη διασκορπίστηκαν πλήρως σε μεμονωμένα σταγονίδια (Σχήμα 5.6.). Αυτό σημαίνει ότι τα σταγονίδια του γαλακτώματος ήταν χαλαρά ενωμένα πιθανόν μέσω ασθενών δυνάμεων van der Waals και υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων η ισχύς των οποίων όμως δεν επαρκούσε για να συγκρατηθούν τα σταγονίδια στα συσσωματώματα κατά την αραίωση του γαλακτώματος και την ήπια ανάδευση που ακολούθησε. Αντίθετα, ένας μεγάλος αριθμός συσσωματωμένων σταγονιδίων παρέμεινε στα γαλακτώματα με περιεκτικότητα ξανθάνης 0,05 και 0,1% (w/v) μετά την αραίωση, προφανώς επειδή ενισχύθηκαν οι ελκτικές δυνάμεις που συγκρατούσαν τα σταγονίδια μεταξύ τους λόγω της δράσης και των οσμωτικών φαινομένων. Η αύξηση της περιεκτικότητας σε ξανθάνη όμως, έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός δικτύου ασθενούς πηκτής, με αποτέλεσμα να παρεμποδίζεται η κίνηση των σταγονιδίων και να αποτρέπεται η συσσωμάτωσή τους [2,33]. Παρόμοια συμπεριφορά παρατηρήθηκε και στα γαλακτώματα του καζεϊνικού νατρίου που περιείχαν ξανθάνη ως σταθεροποιητή [1]. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις ξανθάνης (<0,02%) τα γαλακτώματα δεν εμφάνισαν συσσωματώματα ενώ με αύξηση της συγκέντρωσης της ξανθάνης (0,03-0,05%) παρατηρήθηκε συσσωμάτωση λόγω οσμωτικών φαινομένων. 38

42 Σχήμα 5.6. Εικόνα γαλακτωμάτων, μετά από αραίωση με διάλυμα ξανθάνης συγκέντρωσης αντίστοιχης με αυτήν της συνεχούς φάσης κάθε γαλακτώματος, που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ και περιείχαν 0 (A), 0,05 (B), 0,1 (C), 0,2 (D) και 0,4% (Ε) ξανθάνη. Το μήκος της μπάρας αντιστοιχεί σε 30μm. Τα γαλακτώματα παρατηρήθηκαν με τη βοήθεια του μικροσκοπίου και μετά από 50 και 100 ημέρες αποθήκευσης. Μετά από την πάροδο των 50 ημερών το γαλάκτωμα χωρίς ξανθάνη και το γαλάκτωμα με 0,2% ξανθάνη είχαν συσσωματωθεί 39

43 ενώ στα υπόλοιπα γαλακτώματα δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή ως προς την έκταση της συσσωμάτωσή τους. Ο σχηματισμός συσσωματωμάτων στο γαλάκτωμα με 0,4% ξανθάνη παρατηρήθηκε μόνο μετά την πάροδο 100 ημερών (Σχήμα 5.7.). Σχήμα 5.7. Εικόνα γαλακτωμάτων, μετά από αραίωση με διάλυμα ξανθάνης συγκέντρωσης αντίστοιχης με αυτήν της συνεχούς φάσης κάθε γαλακτώματος, που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ και περιείχαν 0 (A), 0,05 (B) και 0,4% (C) ξανθάνη, μετά από αποθήκευση 0 (0), 50 (1) και 100 (2) ημερών. Το μήκος της μπάρας αντιστοιχεί σε 30μm. Όπως προκύπτει από την παρατήρηση των κατανομών μεγέθους των σωματιδίων η προκατεργασία με SDS των γαλακτωμάτων τόσο μετά από αποθήκευση 50 όσο και 100 ημερών δεν επανέφερε τα γαλακτώματα στην αρχική τους κατάσταση (Σχήμα 5.8.). Επομένως τα σταγονίδια στα συσσωματώματα δεν συγκρατούνται αποκλειστικά και μόνο με υδρόφοβους δεσμούς. Η προκατεργασία με DTT παρουσία SDS όμως, είχε ως αποτέλεσμα τη διάσπαση των συσσωματωμάτων 40

44 και το γαλάκτωμα επανήλθε στην αρχική του κατάσταση, αφού όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.8. οι κατανομές των σωματιδίων σχεδόν συμπίπτουν, γεγονός που επιβεβαιώνει τον ρόλο των δισουλφιδικών γεφυρών στη συσσωμάτωση των σταγονιδίων. Ένα πολύ σημαντικό συμπέρασμα που επίσης εξάγεται από τα αποτελέσματα των πειραμάτων αυτών είναι ότι τα γαλακτώματα του λευκώματος ήταν ιδιαίτερα σταθερά ως προς την συσσωμάτωση αφού δεν παρατηρήθηκε κάποια αύξηση στη μέση διάμετρο των σταγονιδίων με το χρόνο αποθήκευσης. Όγκος (%) , Μέγεθος σταγονιδίων (μm) Σχήμα 5.8. Κατανομή μεγέθους σταγονιδίων γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ μετά από αποθήκευση για 0 ( ) και 100 ( ) ημέρες και μετρήθηκαν μετά από κατεργασία με SDS και DTT, και μετά από χρόνο αποθήκευσης για 50 ( ) και 100 ( ) ημέρες και μέτρηση μετά από κατεργασία με SDS. Η ενίσχυση των φαινομένων συσσωμάτωσης και η δημιουργία ενός ισχυρού δικτυώματος, λόγω αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια κατά την αποθήκευση των γαλακτωμάτων, αποτυπώνεται και στην αύξηση της τιμής του ιξώδους τους. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.9., οι αλληλεπιδράσεις των σταγονιδίων με την πάροδο 41

45 των 100 ημερών είχαν ως αποτέλεσμα την αύξηση στη τιμή του ιξώδους σε όλα τα γαλακτώματα Ιξώδες (Pa.s) ,05 0,1 0,2 0,4 Συγκέντρωση ξανθάνης (%) Σχήμα 5.9. Επίδραση της συγκέντρωσης της ξανθάνης στο φαινομενικό ιξώδες γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ μετά από χρόνο αποθήκευσης για 0 ( ) και 100 ( ) ημέρες Επίδραση της προσθήκης λευκώματος του αυγού στη σταθερότητα των γαλακτωμάτων κρόκου. Η επίδραση της προσθήκης αφυδατωμένου λευκώματος στην ταχύτητα αποκορύφωσης των γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με κρόκο παρουσιάζεται στο Σχήμα Όπως γίνεται αντιληπτό, ο χρόνος έναρξης της αποκορύφωσης καθώς και ο ρυθμός διαχωρισμού των φάσεων εξαρτάται από τη συγκέντρωση του αφυδατωμένου λευκώματος. Απουσία ή σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις λευκώματος (έως και 1,0% (w/v)), τα γαλακτώματα ήταν σταθερότερα σε σχέση με τα γαλακτώματα με υψηλότερη συγκέντρωση λευκώματος. Πιο συγκεκριμένα, στον μάρτυρα και στα γαλακτώματα που περιείχαν λεύκωμα σε ποσοστό 0,5 και 1,0% παρατηρήθηκε έναρξη του διαχωρισμού φάσεων μετά από 60 min αποθήκευσης, στο γαλάκτωμα με 1,5% μετά από 40 min, ενώ σε αυτά με συγκεντρώσεις 2,5 και 4,0% παρατηρήθηκε διαχωρισμός εντός 2 min (Σχήμα 5.11). 42

46 H% Χρόνος (min) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του ΑΛΑ στο ρυθμό αποκορύφωσης γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με κρόκο του αυγού: ( ) 0, ( ) 0,5, ( ) 1,0, ( ) 1,5, ( ) 2,5 και ( ) 4% ΑΛΑ a a a Χρόνος (min) b c c 0 0,5 1 1,5 2,5 4 Συγκέντρωση AΛA (%) Σχήμα Επίδραση της συγκέντρωσης του ΑΛΑ στο χρόνο έναρξης του διαχωρισμού φάσεων κατά την αποθήκευση των γαλακτωμάτων του κρόκου. a-c: Διαφορετικά γράμματα δηλώνουν στατιστικώς σημαντική διαφορά σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. 43

47 Η υδατική στοιβάδα που διαχωρίστηκε κατά την αποθήκευση των γαλακτωμάτων με χαμηλή συγκέντρωση αφυδατωμένου λευκώματος ήταν λιγότερο διαυγής σε σχέση με αυτήν που προέκυψε κατά την αποθήκευση των γαλακτωμάτων με μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε λεύκωμα, γεγονός που υποδηλώνει την παρουσία στο θολό ορρό μεμονωμένων σταγονιδίων ή πολύ μικρού μεγέθους συσσωματωμάτων τα οποία αποκορυφώνονται με πιο αργό ρυθμό σε σχέση με τα μεγαλύτερου μεγέθους σταγονίδια και συσσωματώματα. Επομένως, ο σχετικά μικρός χρόνος που μεσολάβησε για την έναρξη του διαχωρισμού των φάσεων στα γαλακτώματα με υψηλή περιεκτικότητα σε λεύκωμα, καθώς και η διαυγής εμφάνιση της υδατικής στοιβάδας που διαχωρίστηκε κατά την αποθήκευση, μαρτυρούν την πιθανή ύπαρξη συσσωμάτωσης λόγω οσμωτικών φαινομένων. Όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία [34], η σταθερότητα ως προς τη συσσωμάτωση και την αποκορύφωση γαλακτωμάτων που έχουν παρασκευαστεί με κρόκο, εξαρτάται από τη φύση και την ισχύ των ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα σταγονίδια και οι οποίες με τη σειρά τους εξαρτώνται από τις συνθήκες του συστήματος (ph και συγκέντρωση NaCl). Ενώ στο ουδέτερο ph οι αλληλεπιδράσεις αυτές είναι ισχυρές, σε ph 3,8 και ειδικά παρουσία NaCl αναμένεται ότι θα είναι πολύ μικρής ισχύος και το σύστημα αναμένεται να συσσωματωθεί εξαιτίας ενός συνδυασμού ελκτικών αλληλεπιδράσεων, δηλαδή οσμωτικών αλληλεπιδράσεων και αλληλεπιδράσεων τύπου van der Waals και γεφύρωσης.τα φαινόμενα οσμωτικής συσσωμάτωσης αλλά και συσσωμάτωσης λόγω γεφύρωσης, πιθανόν να οφείλονται στην ύπαρξη των μικροσωματιδίων του κρόκου, τους κόκκους, (granules), οι οποίοι είτε προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων και προκαλούν συσσωμάτωση λόγω γεφύρωσης είτε παραμένουν στη συνεχή φάση και προκαλούν αύξηση της οσμωτικής πίεσης με τελικό αποτέλεσμα τη συσσωμάτωση των σταγονιδίων. Τα φαινόμενα συσσωμάτωσης γίνονται περισσότερο εμφανή κατά την παρατήρηση των γαλακτωμάτων στο μικροσκόπιο (Σχήμα 5.12). Το γαλάκτωμα στο οποίο δεν προστέθηκε αφυδατωμένο λεύκωμα (Σχήμα 5.12Α) ήταν περισσότερο ομοιογενές σε σχέση με αυτά που το περιείχαν σε ποσοστό 1,5 και 4% (Σχήμα 5.12Β και 5.12C, αντίστοιχα). Απουσία των πρωτεϊνών του λευκώματος, το γαλάκτωμα του κρόκου αποτελούνταν απο μεμονωμένα σταγονίδια τα οποία ήταν ομοιόμορφα κατανεμημένα. Με βάση αυτή την παρατήρηση μπορεί να εξηγηθεί γιατί η σταθερότητα των γαλακτωμάτων έναντι της αποκορύφωσης, απουσία ή παρουσία αφυδατωμένου λευκώματος σε χαμηλή συγκέντρωση (< 1,5%), ήταν μεγαλύτερη. 44

48 Αντίθετα, η προσθήκη αφυδατωμένου λευκώματος σε συγκέντρωση 1,5% προκάλεσε συσσωμάτωση των σταγονιδίων και διαχωρισμό φάσεων, φαινόμενα τα οποία έγιναν ακόμη πιο έντονα όταν η συγκέντρωση του λευκώματος αυξήθηκε στο 4%. Τα σταγονίδια σε αυτή την περίπτωση σχημάτισαν μεγάλα συσσωματώματα ενωμένα σε ένα δικτύωμα πηκτής με αποτέλεσμα το διαχωρισμό του συστήματος σε περιοχές πλούσιες σε σταγονίδια και περιοχές πλούσιες σε ορρό (Σχήμα 5.12C). Ο σχηματισμός του δικτυώματος των συσσωματωμάτων προφανώς οδήγησε σε επιτάχυνση των φαινομένων της αποκορύφωσης των γαλακτωμάτων και στην εμφάνιση μιας διαυγούς υδατικής στοιβάδας στον πυθμένα του περιέκτη. Σχήμα Εικόνες γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με κρόκο του αυγού και περιέχουν 0 (A), 1,5 (B) και 4,0% (C) ΑΛΑ. Το μήκος της μπάρας αντιστοιχεί σε 30μm. 45

49 Όλα τα γαλακτώματα, ανεξάρτητα με την περιεκτικότητα τους σε λεύκωμα εμφάνισαν μη Νευτώνεια συμπεριφορά (Σχήμα 5.13) Η αύξηση του ρυθμού διάτμησης επέφερε διάσπαση των συσσωματωμάτων, απελευθέρωση της συνεχούς φάσης που είχε εγκλωβιστεί στο εσωτερικό των συσσωματωμάτων και, επομένως, μείωση του φαινόμενου κλάσματος όγκου. Όλα αυτά τα φαινόμενα οδήγησαν σε μείωση του ιξώδους των γαλακτωμάτων [58,63]. Παρόμοια συμπεριφορά, δηλαδή σχηματισμό συσσωματωμάτων και διάσπαση τους κατά τη διάτμηση με αποτέλεσμα τη μείωση του ιξώδους, εμφανίζουν γαλακτώματα που σταθεροποιούνται και με άλλες πρωτεΐνες [62,64].Η προσθήκη αφυδατωμένου λευκώματος σε χαμηλές συγκεντρώσεις (έως 1%) δεν προκάλεσε κάποια σημαντική μεταβολή στην τιμή του ιξώδους των γαλακτωμάτων του κρόκου για χαμηλές τιμές ρυθμού διάτμησης. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις του λευκώματος παρατηρήθηκε μια σταδιακή αύξηση της τιμής του ιξώδους, προφανώς λόγω της δημιουργίας των συσσωματωμάτων. Όταν η μέτρηση έγινε σε υψηλές τιμές διάτμησης, οι διαφορές στις μεταβολές της τιμής του ιξώδους σε σχέση με τη συγκέντρωση του λευκώματος ήταν λιγότερο εμφανείς, πιθανόν λόγω της διάσπασης των συσσωματωμάτων που επήλθε σε αυτές τις συνθήκες Ιξώδες (mpa.s) ,5 1 1,5 2,5 4 Συγκέντρωση AΛA (%) Σχήμα Επίδραση της προσθήκης ΑΛΑ στο φαινομενικό ιξώδες γαλακτωμάτων που παρασκευάστηκαν με κρόκο για ρυθμούς διάτμησης 3,96 ( ) και 79,2 s -1 ( ). 46

50 Η εμφάνιση συσσωματωμάτων λόγω της παρουσίας των πρωτεϊνών του λευκώματος είναι δυνατό να αποδοθεί είτε σε φαινόμενα γεφύρωσης ανάμεσα στα σταγονίδια, είτε σε φαινόμενα οσμωτικής συσωμάτωσης, είτε σε συνδυασμό των δυο. Όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, η γεφύρωση προκαλείται όταν μόρια πρωτεΐνης προσροφούνται ταυτόχρονα σε γειτονικά σταγονίδια σχηματίζοντας μια γέφυρα ανάμεσα στα σταγονίδια. Το φαινόμενο αυτό συνήθως παρατηρείται όταν στο γαλάκτωμα υπάρχει ένας μικρότερος αριθμός μορίων πρωτεΐνης σε σχέση με αυτόν που απαιτείται για την πλήρη κάλυψη της επιφάνειας των σταγονιδίων [17]. Αντίθετα, συσσωμάτωση λόγω οσμωτικών φαινομένων είναι δυνατό να παρατηρηθεί λόγω περίσσειας πρωτεϊνικών μορίων τα οποία παραμένουν στην συνεχή φάση του γαλακτώματος [1,33]. Στο Σχήμα 5.14 παρουσιάζονται τα ηλεκτροφορήματα των πρωτεϊνών που προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων γαλακτωμάτων τα οποία περιείχαν κρόκο και λεύκωμα του αυγού. Όπως προκύπτει, οι πρωτεΐνες του λευκώματος προσροφήθηκαν σε κάποιο βαθμό στην επιφάνεια των σταγονιδίων, είτε όταν τα γαλακτώματα παρασκευάσθηκαν με τη βοήθεια μίγματος κρόκου και λευκώματος (διαδρομή 5) είτε όταν έγινε παρασκευή του γαλακτώματος με κρόκο και ακολούθησε η προσθήκη του λευκώματος (διαδρομές 3 και 4). Μετά από την επεξεργασία των ηλεκτροφορημάτων βρέθηκε πως οι πρωτεΐνες του λευκώματος αντιπροσώπευαν μόνο το 6 και 2%, αντίστοιχα, των συνολικών πρωτεϊνών που προσροφούνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι μόνο το 25-30% των πρωτεϊνών του κρόκου προσροφώνται στην επιφάνεια των σταγονιδίων [65], συμπεραίνεται ότι όλη σχεδόν η ποσότητα των πρωτεϊνικών μορίων του λευκώματος που υπήρχαν στα γαλακτώματα (περίπου 99%) παρέμεινε στη συνεχή φάση. Επομένως, είναι μάλλον απίθανο το 1% των πρωτεϊνών του λευκώματος που ήταν προσροφημένες στα σταγονίδια να επαρκούσε για να προκαλέσει γεφύρωση ανάμεσα στα σταγονίδια και επομένως, συσσωμάτωσή τους. Αντίθετα, στα γαλακτώματα που παρασκευάστηκαν μόνο με τη βοήθεια λευκώματος και στα οποία στη συνέχεια προστέθηκε κρόκος, παρατηρήθηκε ότι οι πρωτεΐνες του κρόκου αντιπροσώπευαν το 40% περίπου των συνολικών πρωτεϊνών (κρόκου και λευκώματος) που προσροφήθηκαν στην επιφάνεια των σταγονιδίων (Σχήμα 5.15). Τα αποτελέσματα αυτά, προφανώς σχετίζονται με την πολύ μεγαλύτερη ευελιξία των μορίων των πρωτεϊνών του κρόκου που τα επιτρέπουν να προσροφώνται πιο ανταγωνιστικά στην επιφάνεια των σταγονιδίων σε σχέση με τις πρωτεΐνες του λευκώματος οι οποίες ως σφαιροπρωτεΐνες είναι λιγότερο ευέλικτες. 47

51 Ovtf Ovlb Ovmd Lys Σχήμα Ηλεκτροφόρημα SDS-PAGE του πρωτεϊνικού κλάσματος που προσροφήθηκε στην επιφάνεια των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων τα οποία παρασκευάστηκαν με κρόκο του αυγού και περιείχαν ΑΛΑ το οποίο προστέθηκε μετά την παρασκευή του γαλακτώματος σε συγκέντρωση 2,5 (διαδρομή 3) και 1,5% (διαδρομή 4) ή ΑΛΑ το οποίο προστέθηκε ταυτόχρονα με τον κρόκο σε συγκέντρωση 1,5% (διαδρομή 5). Οι διαδρομές 1 και 2 αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες του λευκώματος και του κρόκου, αντίστοιχα. 48

52 1 2 3 Σχήμα Ηλεκτροφόρημα SDS-PAGE πρωτεϊνικού κλάσματος που προσροφήθηκε στην επιφάνεια των σταγονιδίων των γαλακτωμάτων τα οποία παρασκευάστηκαν με ΑΛΑ και περιείχαν κρόκο ο οποίος προστέθηκε μετά την παρασκευή του γαλακτώματος σε συγκέντρωση 2,5% (διαδρομή 3). Οι διαδρομές 1 και 2 αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες του λευκώματος και του κρόκου, αντίστοιχα. Όπως γίνεται αντιληπτό, η συσσωμάτωση που προκλήθηκε μετά την προσθήκη του λευκώματος στα γαλακτώματα του κρόκου ήταν το αποτέλεσμα της διαφοράς στην οσμωτική πίεση ανάμεσα στη συνεχή φάση η οποία ήταν εμπλουτισμένη σε πρωτείνες του λευκώματος και σε περιοχές της συνεχούς φάσης κοντά στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Η παρατήρηση ενός διαλύματος ΑΛΑ στο μικροσκόπιο (Σχήμα 5.16) αποκαλύπτει έναν αριθμό νηματοειδών δομών τα οποία πιθανώς αποτελούνται από εν διασπορά τμήματα του δικτύου της αδιάλυτης ωομυκίνης που όπως είναι γνωστό, είναι υπεύθυνη για την βλεννώδη υφή του λευκώματος του αυγού [45]. Τα φαινόμενα της οσμωτικής συσσωμάτωσης που προκαλούνται στα γαλακτώματα του κρόκου εξαιτίας της παρουσίας των πρωτεϊνών του λευκώματος, είναι πιθανό να σχετίζονται άμεσα με την παρουσία των μορίων της ωομυκίνης. Η ωομυκίνη με μοριακό βάρος , αποτελεί περίπου το 3,5% των 49

53 πρωτεϊνών του λευκώματος (Πίνακας 2.2). Η περιεκτικότητά της στη συνεχή φάση των γαλακτωμάτων του κρόκου με 2,5 ή 4% ΑΛΑ υπολογίζεται ότι είναι περίπου 0,07 και 0,13%, αντίστοιχα. Λόγω του υψηλού μοριακού βάρους και της συγκέντρωσης τους στη συνεχή φάση, τα νηματοειδή συσσωματώματα που σχηματίζουν τα μόρια της ωομυκίνης μπορούν, σε ορισμένο βαθμό, να προκαλέσουν οσμωτική συσσωμάτωση στο γαλάκτωμα. Παράλληλα, η περιεκτικότητα της ωοαλβουμίνης, της κύριας πρωτεΐνης του άσπρου, στη συνεχή φάση των γαλακτωμάτων που περιέχουν 4% λέυκωμα είναι περίπου 3%. Επομένως, η σχετικά υψηλή περιεκτικότητα της ωοαλβουμίνης στη συνεχή φάση μπορεί επίσης να συμβάλει στη συσσωμάτωση των σταγονιδίων λόγω οσμωτικών φαινομένων. Σχήμα Εικόνα διαλύματος ΑΛΑ σε μικροσκόπιο. Ο σχηματισμός των συσσωματωμάτων ανάμεσα στα σταγονίδια των γαλακτωμάτων λόγω της παρουσίας των μορίων της ωομυκίνης ή της ωοαλβουμίνης, ή και των δυο στη συνεχή φάση, θα πρέπει να είναι μια αντιστρεπτή διαδικασία, αν η συσσωμάτωση οφείλεται αποκλειστικά και μόνο σε οσμωτικά φαινόμενα, και η αραίωση των γαλακτωμάτων με νερό θα πρέπει να προκαλεί διάσπαση των συσσωματωμάτων. Όπως φαίνεται, όμως, από τις κατανομές του μεγέθους των σωματιδίων (Σχήμα 5.17), οι οποίες προέκυψαν μετά από μέτρηση του αραιωμένου με νερό γαλακτώματος, η προσθήκη του αφυδατωμένου λευκώματος στα γαλακτώματα του κρόκου οδήγησε σε μετατόπιση των καμπυλών κατανομής μεγέθους προς τα δεξιά και η μετατόπιση ήταν ανάλογη της συγκέντρωσης του λευκώματος στο γαλάκτωμα. Από αυτό συμπεραίνεται ότι στα συσσωματώματα του 50