HOLOTYPE HLA 24/7 ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗ A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ

Transcript

1 HOLOTYPE HLA 24/7 ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗ A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΕΚΔΟΣΗΣ /05/02 Για in vitro διαγνωστική χρήση 0086 Προετοιμάζει DNA για ανάλυση αλληλούχισης στο Illumina MiSeq

2 Πίνακας περιεχομένων ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ... 8 ΥΠΟΜΝΗΜΑ ΣΥΜΒΟΛΩΝ... 8 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΚΙΤ HOLOTYPE HLA-24/7 ΔΙΑΜΟΡΦΩΣΗ A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE... 9 ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ ΕΚΚΙΝΗΤΗ... 9 ΣΥΣΚΕΥΑΣΙΑ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΠΛΑΚΑ ΠΡΟΣΑΡΜΟΣΤΩΝ 96 ΠΗΓΑΔΙΩΝ ΒΙΒΛΙΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ EXCEL ΛΟΓΙΣΜΙΚΟ OMIXON HLA TWIN ΑΠΟΣΤΟΛΗ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΝΩΣΤΟΙ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΕΧΝΙΚΗ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ, ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΚΑΙ ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΤΟΝ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟ ΣΥΣΤΑΣΕΙΣ ΣΧΕΤΙΚΑ ΜΕ ΑΝΤΙΣΤΟΙΧΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Ικανότητα κιτ αντιδραστηρίων MiSeq ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΗ ΝΟΜΙΚΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΟΥ ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ ΣΗΜΑΝΤΙΚΗ ΣΗΜΕΙΩΣΗ ΠΡΙΝ ΑΠΟ ΤΗΝ ΕΝΑΡΞΗ ΣΥΝΙΣΤΩΜΕΝΗ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΟΥ DNA ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΥΝΟΨΗ ΤΩΝ ΒΗΜΑΤΩΝ ΓΛΩΣΣΑΡΙ/ΟΡΙΣΜΟΙ ΒΗΜΑ 1 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΥΡΙΟΥ ΜΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ HLA ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Κύριο μείγμα: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1, και DQA Κύριο μείγμα: HLA-DQB1 Σετ ΒΗΜΑ 2 ΕΝΙΣΧΥΣΗ HLA ΤΑΞΗΣ I ΚΑΙ II ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Κύριο μείγμα με Taq πολυμεράση: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1, και DQA Κύριο μείγμα με Taq πολυμεράση: HLA-DQB1 σετ Ενίσχυση Τάξης I (HLA-A, B και C) Ενίσχυση Τάξης II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 και DQB1) Αναμενόμενα μεγέθη αμπλικονίων Σελίδα 2 51

3 ΒΗΜΑ 3 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΚΑΝΟΝΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ (ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΩΝΤΑΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΟ ΠΛΑΚΑΣ) ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Ομαδοποίηση αμπλικονίων Καθαρισμός PCR ExoSAP-IT Express ΒΗΜΑ 4 ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Κύριο μείγμα κατακερματισμού Πρόγραμμα κατακερματισμού Κύριο μείγμα επιδιόρθωσης άκρων Πρόγραμμα επιδιόρθωσης άκρων Κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση Πρόγραμμα σύνδεσης με λιγάση Ομαδοποίηση και καθαρισμός βιβλιοθήκης ΒΗΜΑ 5 ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΒΗΜΑ 6 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΜΕ ΤΟ ΟΡΓΑΝΟ QPCR ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Μείγμα εκκινητή qpcr Κύριο μείγμα qpcr ΒΗΜΑ 7 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΣΤΟ ILLUMINA MISEQ ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Ικανότητα κιτ αντιδραστηρίων MiSeq ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΒΗΜΑ 8 ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ HLA ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Ρύθμιση και διαμόρφωση IT Πρωτόκολλο ανά ανάλυση ΜΗ ΑΥΤΟΜΑΤΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΔΙΑΚΟΜΙΣΤΗ Ρύθμιση και διαμόρφωση IT Πρωτόκολλο ανά ανάλυση ΜΗ ΑΥΤΟΜΑΤΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΗ Ρύθμιση και διαμόρφωση IT Πρωτόκολλο ανά ανάλυση ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΕΣ ΕΙΚΟΝΕΣ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΠΛΑΚΑΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΛΑΚΑ ΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ, ΠΛΑΚΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ, ΠΛΑΚΑ ΑΡΑΙΩΣΗΣ, ΠΛΑΚΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ (ΓΙΑ ΕΝΑ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΤΟΠΟ) ΚΑΙ ΠΛΑΚΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΠΛΑΚΑΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΠΡΟΤΥΠΩΝ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ ΠΛΑΚΑΣ QPCR ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ KAPA ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: PIPPIN PREP ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ PIPPIN PREP Σελίδα 3 51

4 ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΤΟΥ PIPPIN PREP ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2: ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ ΜΕ ΤΟ ΟΡΓΑΝΟ QPCR ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 3: ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΠΑΡΕΜΒΑΛΛΟΜΕΝΗΣ ΦΘΟΡΙΖΟΥΣΑΣ ΧΡΩΣΤΙΚΗΣ DSDNA ΛΙΣΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ Σελίδα 4 51

5 Ιστορικό εγγράφου Σημαντικές σημειώσεις και ενημερώσεις Έκδοση Ημερομηνία Συντάκτης Σύνοψη αλλαγών Εγκρίθηκε από Hμερομηνία έκδοσης V1 05/12/2015 Robert Pollock V2 18/01/2016 Robert Pollock V3 10/02/2016 Robert Pollock V4 26/02/2016 Robert Pollock V5 05/04/2016 Robert Pollock V6 09/04/2016 Έφη Μελίστα V7 23/04/2016 Έφη Μελίστα V8 30/05/2016 Gergely Tölgyesi Προσχέδιο πρώτης έκδοσης Gergely Tölgyesi 05/12/2015 Δεύτερο προσχέδιο, μικρές διορθώσεις Τρίτο προσχέδιο, ενημέρωση επεξήγησης συμβόλων, ενημέρωση σύστασης σχετικά με τον κύκλο ψύξης/απόψυξης, ενημέρωση προβλεπόμενης χρήσης Τέταρτο προσχέδιο, ενημερώσεις ενότητας πληροφοριών ασφαλείας Πέμπτη έκδοση, εναλλακτική σύσταση για ποσοτικό προσδιορισμό αμπλικονίων Μικρή αλλαγή στη διατύπωση από «ένζυμο PCR μεγάλου εύρους» σε «Taq πολυμεράση», με βάση την αλλαγή στην τεκμηρίωση της Qiagen Ενημέρωση δήλωσης DQB1 σετ 1 και σετ 2 Ενημέρωση μετρικών απόδοσης, Ενημέρωση όγκων αντιδραστηρίων προετοιμασίας βιβλιοθήκης, Ενημέρωση διαμορφώσεων προϊόντος για τις πλάκες προσαρμοστών με δείκτες A2/A3/A4 Gergely Tölgyesi 18/01/2016 Gergely Tölgyesi 10/02/2016 Gergely Tölgyesi 26/02/2016 Έφη Μελίστα 05/04/2016 Gergely Tölgyesi 09/04/2016 Gergely Tölgyesi 23/04/2016 Έφη Μελίστα 30/05/2016 Σελίδα 5 51

6 V9 29/11/2017 Tünde Vágó Αφαίρεση του «DQB» από τους Ενισχυτές DQB, η επαλήθευση πηκτώματος μετά από PCR μεγάλου εύρους έγινε προαιρετική, απλοποίηση του ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων, αλλαγή του όγκου ομαδοποίησης ανά δείγμα στα κιτ 11 γενετικών τόπων, αντικατάσταση του ExoSAP-IT με το ExoSAP-IT Express, χρήση του Qubit για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιβλιοθηκών, το μείγμα εκκινητή DQB1 σετ 1 και σετ 2 αντικαταστάθηκε από το DQB1 σετ 3, μείωση χρόνου αντίδρασης επιδιόρθωσης άκρων, μείωση χρόνου αντίδρασης σύνδεσης με λιγάση, ενημέρωση μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού βιβλιοθηκών, το φύλλο δείγματος αφαιρέθηκε από τα Παραρτήματα Efi Melista 02/05/2018 Σελίδα 6 51

7 Δήλωση αποποίησης ευθυνών Η Omixon έχει καταβάλλει κάθε προσπάθεια, ώστε οι παρούσες Οδηγίες χρήσης να είναι ακριβείς. Η Omixon δεν φέρει καμία ευθύνη για τυχόν ανακρίβειες ή παραλείψεις που ενδεχομένως έχουν προκύψει. Οι πληροφορίες στις παρούσες Οδηγίες χρήσης υπόκεινται σε αλλαγή χωρίς προειδοποίηση. Η Omixon δεν αναλαμβάνει καμία ευθύνη για τυχόν ανακρίβειες που ενδέχεται να περιλαμβάνονται στις παρούσες Οδηγίες χρήσης. Η Omixon διατηρεί το δικαίωμα να βελτιώνει τις παρούσες Οδηγίες χρήσης ή/και τα προϊόντα που περιγράφονται σε αυτές, ανά πάσα στιγμή, χωρίς προειδοποίηση. Σε περίπτωση που εντοπίσετε πληροφορίες στο παρόν εγχειρίδιο που είναι εσφαλμένες, παραπλανητικές ή ελλιπείς, θα εκτιμούσαμε τα σχόλια και τις προτάσεις σας. Μπορείτε να τις στείλετε στη διεύθυνση Σελίδα 7 51

8 Πληροφορίες κατασκευαστή Όνομα εταιρείας: Omixon Biocomputing Ltd Διεύθυνση επίσκεψης: Fehérvári út 50-52/6 Πόλη: Βουδαπέστη Τ.Κ.: H-1117 Χώρα: Ουγγαρία Υπόμνημα συμβόλων Αριθμός παρτίδας Αριθμός αναφοράς/καταλόγου Συμβουλευτείτε τις Οδηγίες χρήσης Περιέχει αντιδραστήριο για Ν αριθμό εξετάσεων Νόμιμος κατασκευαστής. Η ημερομηνία σε συνδυασμό με αυτό το σύμβολο αναφέρεται στην ημερομηνία κατασκευής Συνιστώμενη θερμοκρασία φύλαξης Ημερομηνία λήξης In vitro διαγνωστική ιατροτεχνολογική συσκευή Ανταλλακτικό Περιέχει ανταλλακτικό Σελίδα 8 51

9 Περιεχόμενα του κιτ Holotype HLA-24/7 Διαμόρφωση A1 & CE/A2 & CE/A3 & CE/A4 & CE Η ενότητα αυτή περιγράφει τα περιεχόμενα των διάφορων διαθέσιμων διαμορφώσεων του προϊόντος Holotype HLA 24/7 ως εξής: Τύπος προϊόντος ΑΡ. ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A1 & CE Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A2 & CE Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A3 & CE Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A4 & CE H52 24 H56 24 H59 24 H53 24 Λάβετε υπόψη ότι η συσκευασία Στοιχείου εκκινητή και η συσκευασία Στοιχείου αντιδραστηρίων προετοιμασίας βιβλιοθήκης είναι ίδιες σε κάθε διαμόρφωση προϊόντος. Το στοιχείο Πλάκας προσαρμοστών 96 πηγαδιών με δείκτες διαφέρει ως προς το επίπεδο αλληλουχίας δείκτη σε κάθε διαμόρφωση. Ανατρέξτε στην Ενότητα «Πλάκα προσαρμοστών 96 πηγαδιών» παρακάτω για περισσότερες πληροφορίες. Συσκευασία στοιχείου εκκινητή Η συσκευασία στοιχείου εκκινητή παρέχει συγκεκριμένα, έτοιμα για χρήση, διαλύματα εκκινητή για στοχευμένη ενίσχυση PCR μεγάλου εύρους των γονιδίων HLA A, B, C, DPB1, DQA1, DQB1 και DRB1. Επιπλέον, περιέχει δύο τύπους πρόσθετων PCR (Ενισχυτή 1 και Ενισχυτή 2). Μείγμα εκκινητή ΑΡ. ΑΝΑΦ. Αντιδρά σεις Όγκος/ σωληνάριο Αρ. σωληναρίων Χρωματικός κώδικας HLA-A P μl 1 Κίτρινο HLA-B P μl 1 Κόκκινο HLA-C P μl 1 Πορτοκαλί HLA-DRB1 P μl 1 Πράσινο HLA-DQB1 (Σετ 3) P μl 1 Μπλε HLA-DQA1 P μl 1 Καφέ HLA-DPB1 P μl 1 Μοβ Ενισχυτής 1 E μl 1 Διαφανές Ενισχυτής 2 E μl 1 Διαφανές Σελίδα 9 51

10 Συσκευασία στοιχείου αντιδραστηρίων προετοιμασίας βιβλιοθήκης Η συσκευασία στοιχείου προετοιμασίας βιβλιοθήκης περιέχει αντιδραστήρια για την προετοιμασία βιβλιοθήκης (κατακερματισμός, άμβλυνση και αδενυλίωση των άκρων των αμπλικονίων και σύνδεση με λιγάση των αλληλουχιών προσαρμοστών με δείκτες σε αυτά) από αμπλικόνια HLA. Αντιδραστήριο ΑΡ. ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Όγκος/ σωληνάριο Αρ. σωληναρίων Χρωματικός κώδικας Ένζυμο κατακερματισμού (Α) R μl 1 Κίτρινο Ρυθμιστικό διάλυμα κατακερματισμού (Β) R μl 1 Κόκκινο Ένζυμο επιδιόρθωσης άκρων (Γ) R μl 1 Πράσινο Ρυθμιστικό διάλυμα επιδιόρθωσης άκρων (Δ) R μl 1 Πορτοκαλί Ένζυμο σύνδεσης με λιγάση (Ε) R μl 1 Μπλε Ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης με λιγάση (ΣΤ) Πλάκα προσαρμοστών 96 πηγαδιών R μl 2 Μαύρο Το στοιχείο της πλάκας προσαρμοστών 96 πηγαδιών με δείκτες περιέχει έτοιμους για χρήση προσαρμοστές NGS με δείκτες (ολιγονουκλεοτίδια DNA διπλής έλικας) σε διάλυμα 5 μl για τη δημιουργία μεμονωμένων βιβλιοθηκών NGS. Η πλάκα προσαρμοστών 96 πηγαδιών με δείκτες περιέχει επαρκείς προσαρμοστές με δείκτες για τη δημιουργία 24 μεμονωμένων βιβλιοθηκών NGS και για αναγνώριση δείγματος καθοδικά. Τύπος προϊόντος Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A1 & CE (ΑΝΑΦ: H52) Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A2 & CE (ΑΝΑΦ:H56) Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A3 & CE (ΑΝΑΦ:H59) Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A4 & CE (ΑΝΑΦ:H53) Αντίστοιχο αντιδραστήριο ΑΡ. ΑΝΑΦ. Αντιδράσεις Όγκος/ πηγάδι Αρ. πλακών Πλάκα προσαρμοστών Α1 (i1-24) N μl 1 Πλάκα προσαρμοστών Α2 (i25-48) N μl 1 Πλάκα προσαρμοστών Α3 (i49-72) N μl 1 Πλάκα προσαρμοστών Α4 (i73-96) N μl 1 Βιβλίο εργασίας Excel Διατίθεται ένα βιβλίο εργασίας Excel για την υποστήριξη του πρωτοκόλλου Holotype HLA 24/7, με υπολογισμούς, διατάξεις πλακών, καταγραφή στοιχείων, δημιουργία φύλλου δείγματος Σελίδα 10 51

11 MiSeq και πολλά άλλα. Εφόσον επιθυμείτε ένα αντίγραφο, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση Λογισμικό Omixon HLA Twin Επικοινωνήστε με τη διεύθυνση για τις πιστωτικές μονάδες του Omixon HLA Twin που αντιστοιχούν στην αγορά του κιτ Holotype HLA 24/7. Σημαντική σημείωση: Χρησιμοποιείτε και τα τρία στοιχεία του κιτ Omixon Holotype HLA 24/7 και το λογισμικό Omixon HLA Twin στην ίδια ροή εργασιών με σκοπό τη δημιουργία μιας ροής εργασιών για in vitro διαγνωστική χρήση. Ανατρέξτε στην Ενότητα «Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις» για τους περιορισμούς χρήσης του προϊόντος. Ανταλλακτικά διατίθενται έπειτα από ειδική αίτηση του χρήστη. Λάβετε υπόψη ότι η Omixon παρέχει ανταλλακτικά για τις συσκευασίες των στοιχείων, όχι για μεμονωμένα φιαλίδια. Επικοινωνήστε με τη διεύθυνση για περισσότερες πληροφορίες. Αποστολή και φύλαξη Αποστέλλονται πάνω σε συσκευασίες ξηρού πάγου, σε κουτί μεταφοράς από Styrofoam, ενώ πρέπει να αποθηκεύονται στους -20 C κατά την άφιξη. Επικυρώστε τη διαδικασία ελέγχου και παρακολούθησης της θερμοκρασίας των καταψυκτών σας και εκτελείτε τη συντήρησή τους τακτικά. Τα ακέραια κιτ διατηρούνται σταθερά έως την ημερομηνία λήξης του κιτ (αναγράφεται στην ετικέτα του κιτ), εφόσον αποθηκεύονται στους -20 C. Μετά το άνοιγμα του προϊόντος, συνιστώνται έως και τέσσερις (4) κύκλοι ψύξης/απόψυξης για τη διασφάλιση της σταθερότητας του προϊόντος. Τα ανοιγμένα κιτ διατηρούνται σταθερά έως και για 3 μήνες, εφόσον αποθηκεύονται στους -20 C. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Περιορισμοί χρήσης προϊόντος Για βέλτιστη απόδοση, χρησιμοποιείτε τη ροή εργασιών του κιτ Holotype HLA 24/7 και του λογισμικού Omixon HLA Twin για την τυποποίηση HLA με NGS, με τα υλικά, τα αντιδραστήρια και τον εξοπλισμό που συνιστάται στην ενότητα «Εξοπλισμός και αντιδραστήρια». Η χρήση διαφορετικών υλικών από εκείνα που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός και αντιδραστήρια» πρέπει να επαληθευτεί και να επικυρωθεί από τον χρήστη. Μην ανασυστήνετε ή αραιώνετε τα αντιδραστήρια σε διαφορετικούς όγκους από εκείνους που περιγράφονται στις παρούσες Οδηγίες χρήσης. Μη χρησιμοποιείτε μικρότερο όγκο αντιδραστηρίων από εκείνον που καθορίζεται στις παρούσες Οδηγίες χρήσης. Οι ενέργειες αυτές μπορούν να οδηγήσουν σε σφάλματα απόδοσης. Σελίδα 11 51

12 Η Omixon δεν μπορεί να παράσχει υποστήριξη για ενδεχόμενα προβλήματα, τα οποία προκύπτουν από τη μη τήρηση των βημάτων του πρωτοκόλλου που περιγράφεται στις παρούσες Οδηγίες χρήσης. Μη χρησιμοποιήσετε το προϊόν σε περίπτωση που εντοπιστεί ζημιά σε στοιχεία (σπασμένα φιαλίδια, πλάκα, ξεβιδωμένα πώματα, κτλ.) Γνωστοί περιορισμοί του προϊόντος Ανατρέξτε στο έγγραφο Product Known Limitations Guide (Οδηγός γνωστών περιορισμών προϊόντος) για τις γνωστές ασάφειες και τους γνωστούς περιορισμούς λογισμικού του προϊόντος Holotype HLA. Ο Οδηγός παρέχεται με τις Οδηγίες χρήσης, ωστόσο διατίθεται και στο δικτυακό τόπο της Omixon, στην ενότητα MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, ή μπορείτε να τον ζητήσετε στη διεύθυνση Πληροφορίες ασφαλείας Προτού ξεκινήσετε, διαβάστε τις ενότητες «Πληροφορίες ασφαλείας» και «Σημαντικές σημειώσεις» των αντιδραστηρίων ή κιτ που καθορίζονται στην Ενότητα «Εξοπλισμός, αντιδραστήρια και αναλώσιμα». Κατά την εργασία με χημικά, φοράτε πάντα κατάλληλη ρόμπα εργαστηρίου, γάντια μιας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά. Για περισσότερες πληροφορίες, συμβουλευτείτε τα κατάλληλα Δελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS) που διατίθενται από τον αντίστοιχο προμηθευτή του προϊόντος. Μια επισκόπηση των χημικών συστατικών των αντιδραστηρίων του προϊόντος διατίθεται στα Δελτία δεδομένων ασφαλείας (SDS) του κιτ Holotype HLA 24/7 και παρέχεται κατόπιν αιτήματος. Απορρίπτετε τα στοιχεία του προϊόντος ως γενικά ιατρικά απόβλητα. Παράμετροι απόδοσης Τεκμηριωμένες κύριες παράμετροι απόδοσης, σύμφωνα με την επικύρωση του προϊόντος. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Ευαισθησία 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Ειδικότητα 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775% Ακρίβεια 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Ορθότητα 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572% Αναπαραγωγιμότητα 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% Επαναληψιμότητα 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Σελίδα 12 51

13 Τεχνική υποστήριξη Για γενική υποστήριξη, όσον αφορά στο παρόν πρωτόκολλο, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση Τηλεφωνική εξυπηρέτηση: Ηνωμένες Πολιτείες +1 (617) Ευρώπη Υπόλοιπος κόσμος +1 (617) Σελίδα 13 51

14 Εξοπλισμός, αντιδραστήρια και αναλώσιμα Τεχνικές συστάσεις και συστάσεις σχετικά με τον εξοπλισμό Θερμικός κυκλοποιητής με μορφή 96 πηγαδιών Φθορισμόμετρο πλάκας (ή οποιοδήποτε όργανο με δυνατότητα ανίχνευσης φθορισμού σε μορφή πλάκας 96 πηγαδιών, για χρήση με το Σύστημα Promega QuantiFluor dsdna) Σύστημα Pippin Prep (Αρ. κατ. PIP0001) ή Blue Pippin (Αρ. κατ. BLU0001) της SAGE Science Όργανο qpcr με μορφή πλάκας 96 ή 384 πηγαδιών Φθορισμόμετρο Qubit (Αρ. κατ. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (προαιρετικό) Illumina MiSeq (Αρ. κατ. SY ) Υπολογιστής 64-bit με τουλάχιστον 4 πυρήνες και 16 GB RAM Χώρος μακροπρόθεσμης αποθήκευσης δεδομένων (περίπου 2 TB δεδομένων ανά MiSeq ετησίως) Συστάσεις σχετικά με αντίστοιχα αντιδραστήρια Κιτ LongRange PCR της Qiagen (Αρ. κατ , ή ) Κάθε δείγμα απαιτεί 3,2 μl Taq πολυμεράσης Το κιτ LongRange PCR, Αρ. κατ , (20) περιέχει 8 μl Taq πολυμεράσης Το κιτ LongRange PCR, Αρ. κατ , (100) περιέχει 40 μl Taq πολυμεράσης Το κιτ LongRange PCR, Αρ. κατ , (250) περιέχει 100 μl Taq πολυμεράσης ExoSAP-IT της Affymetrix (Αρ. κατ , ML, X-1ML ή ML) Κάθε ομαδοποιημένο δείγμα απαιτεί 4 μl ενζύμου ExoSAP-IT Το προϊόν με Αρ. κατ περιέχει 200 μl ενζύμου ExoSAP-IT Express Το προϊόν με Αρ. κατ ML περιέχει 1 ml ενζύμου ExoSAP-IT Express Το προϊόν με Αρ. κατ X-1ML περιέχει 4 ml ενζύμου ExoSAP-IT Express Το προϊόν με Αρ. κατ ML περιέχει 10 ml ενζύμου ExoSAP-IT Express Κιτ ποσοτικοποίησης βιβλιοθήκης Illumina/Universal της KAPA Biosystems (Αρ. κατ. KK4824) Κιτ ανάλυσης Qubit dsdna BR (Αρ. κατ. Q32850 ή Q32853) (προαιρετικό) Το προϊόν με Αρ. κατ. Q32850 περιέχει 100 αναλύσεις Το προϊόν με Αρ. κατ. Q32853 περιέχει 500 αναλύσεις Σύστημα QuantiFluor dsdna της Promega (Αρ. κατ. E2670) Σφαιρίδια Agencourt AMPure XP της Beckman Coulter (Αρ. κατ. A63880, A63881 ή A63882) Κάθε εκτέλεση Holotype HLA απαιτεί το μέγιστο 900 μl σφαιριδίων AMpure XP Το Αρ. κατ. A63880 περιέχει 5 ml σφαιριδίων AMPure XP Το Αρ. κατ. A63881 περιέχει 60 ml σφαιριδίων AMPure XP Το Αρ. κατ. A63882 περιέχει 450 ml σφαιριδίων AMPure XP Κασέτα πηκτώματος, 1,5% αγαρόζης, χωρίς χρωστική με εσωτερικό πρότυπο (Δείκτης K/R2) για το Pippin Prep/Blue Pippin (Αρ. κατ. CDF1510 για το Pippin Prep και BDF1510 για το Blue Pippin) Αιθανόλη υψηλής καθαρότητας, κατάλληλη για εφαρμογές μοριακής βιολογίας (άνυδρη αλκοόλη) Σελίδα 14 51

15 Νερό υψηλής καθαρότητας, κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας (χωρίς DNase και RNase) Υδροξείδιο του νατρίου Ρυθμιστικό διάλυμα TE 1 (ph 8,0) Κιτ αντιδραστηρίων MiSeq της Illumina Ικανότητα κιτ αντιδραστηρίων MiSeq Κιτ αντιδραστηρίων Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) Χρόνος Ώρες 24/7 δείγματα ~39 24 ~24 24 ~19 24 ~28 12 ~17 6 Συνιστώμενα αναλώσιμα Σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 1,5 ml Σωληνάρια μικροφυγόκεντρου χαμηλής πρόσδεσης 1,5 ml Σωληνάρια μικροφυγόκεντρου χαμηλής πρόσδεσης 2,0 ml (συνιστάται το Eppendorf DNA LoBind Αρ. κατ ) Σωληνάρια λεπτού τοιχώματος 0,5 ml για το όργανο Qubit (συνιστώνται τα σωληνάρια ανάλυσης Qubit Αρ. κατ. Q32856) Πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου (χωρητικότητα 1, μl) Πιπέτες ρυθμιζόμενου όγκου 8 καναλιών (χωρητικότητα 1,0 100 μl) Πλάκες 96 πηγαδιών συμβατές με το θερμικό κυκλοποιητή Οπτικές πλάκες 96 πηγαδιών συμβατές με το φθορισμόμετρο πλάκας Πλάκες 96 πηγαδιών συμβατές με το όργανο qpcr Φύλλα σφράγισης πλακών για γενική χρήση Φύλλα σφράγισης πλακών συμβατά με θερμικούς κυκλοποιητές (δοκιμασμένες για PCR μεγάλου εύρους) Φύλλα σφράγισης οπτικών πλακών συμβατά με το όργανο qpcr (προαιρετικά) Μαγνητική βάση συμβατή με σωληνάρια μικροφυγόκεντρου 2 ml Στατώ ψύξης 96 πηγαδιών (2 τεμάχια) Κωνικά σωληνάρια 50 ml Δοχεία 50 ml Σελίδα 15 51

16 Ανακοίνωση νομικού περιεχομένου Οι Οδηγίες χρήσης του Holotype HLA 24/7 και όλα τους τα περιεχόμενα είναι αποκλειστικής κυριότητας της Omixon Biocomputing Limited («Omixon») και προορίζονται αποκλειστικά για τη συμβατική χρήση από τον πελάτη, όσον αφορά στο προϊόν (ή στα προϊόντα) που περιγράφονται σε αυτές και δεν προορίζονται για κανέναν άλλο σκοπό. Απαγορεύεται η χρήση ή διανομή για οποιονδήποτε άλλο σκοπό ή/και η επικοινωνία, αποκάλυψη ή αναπαραγωγή με οποιονδήποτε τρόπο του παρόντος εγγράφου και των περιεχομένων του, χωρίς την προηγούμενη γραπτή συγκατάθεση της Omixon. Η Omixon δεν παραχωρεί καμία άδεια ευρεσιτεχνίας, εμπορικού σήματος, πνευματικών δικαιωμάτων ή δικαιωμάτων κοινού δικαίου ή παρόμοιων δικαιωμάτων, τα οποία ανήκουν στην κυριότητά της, σε τρίτα μέρη μέσω του παρόντος εγγράφου. Η άδεια χρήσης του Omixon HLA Twin («Λογισμικό») παραχωρείται στον πελάτη, σύμφωνα με τους όρους και τις προϋποθέσεις της Άδειας χρήσης τελικού χρήστη του Omixon HLA Twin ( Στην περίπτωση που δεν συμφωνείτε με τους όρους και τις προϋποθέσεις που περιλαμβάνονται σε αυτήν, η Omixon δεν σας εκχωρεί άδεια χρήσης του Λογισμικού και δεν πρέπει να το χρησιμοποιήσετε ή να το εγκαταστήσετε. Οι οδηγίες του παρόντος εγγράφου πρέπει να τηρούνται αυστηρά και ρητά από ειδικευμένο και κατάλληλα εκπαιδευμένο προσωπικό, προκειμένου να διασφαλιστεί η ορθή και ασφαλής χρήση του προϊόντος (ή των προϊόντων) που περιγράφεται σε αυτό. Διαβάστε και κατανοήστε πλήρως όλα τα περιεχόμενα του παρόντος εγγράφου, πριν από τη χρήση του προϊόντος (ή των προϊόντων). ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΠΟΥ ΔΕΝ ΔΙΑΒΑΣΤΟΥΝ ΠΛΗΡΩΣ ΚΑΙ ΔΕΝ ΤΗΡΗΘΟΥΝ ΡΗΤΑ ΟΛΕΣ ΟΙ ΟΔΗΓΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΑΡΟΝ, ΕΝΔΕΧΕΤΑΙ ΝΑ ΠΡΟΚΛΗΘΕΙ ΥΛΙΚΗ ΖΗΜΙΑ ΣΤΟ ΠΡΟΪΟΝ (Ή ΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ), ΤΡΑΥΜΑΤΙΣΜΟΣ, ΤΟΣΟ ΤΟΥ ΧΡΗΣΤΗ ΟΣΟ ΚΑΙ ΤΡΙΤΩΝ, ΚΑΙ ΥΛΙΚΕΣ ΖΗΜΙΣ ΣΕ ΑΛΛΗ ΠΕΡΙΟΥΣΙΑ. Η OMIXON ΔΕΝ ΑΝΑΛΑΜΒΑΝΕΙ ΚΑΜΙΑ ΕΥΘΥΝΗ ΠΟΥ ΝΑ ΠΡΟΚΥΠΤΕΙ ΑΠΟ ΛΑΝΘΑΣΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ (Ή ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ) ΠΟΥ ΠΕΡΙΓΡΑΦΟΝΤΑΙ ΣΤΟ ΠΑΡΟΝ (ΣΥΜΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΜΕ- ΝΩΝ ΜΕΡΩΝ ΑΥΤΩΝ Ή ΛΟΓΙΣΜΙΚΟΥ) Ή ΑΠΟ ΟΠΟΙΑΔΗΠΟΤΕ ΑΛΛΗ ΧΡΗΣΗ ΤΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΥΤΩΝ, Η ΟΠΟΙΑ ΔΕΝ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΕΤΑΙ ΣΤΟ ΠΕΔΙΟ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΤΩΝ ΡΗΤΩΝ, ΕΓΓΡΑΦΩΝ ΑΔΕΙΩΝ ΧΡΗΣΗΣ Ή ΔΙΚΑΙΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΑΡΑΧΩΡΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ OMIXON, ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗΝ ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΤΕΤΟΙΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΕΛΑΤΗ. ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος. Προβλεπόμενη χρήση Το προϊόν Holotype HLA 24/7 Διαμόρφωση A1 & CE /A2 & CE /A3 & CE/ A4 & CE (αναφέρεται ως «Holotype HLA») είναι ένας συνδυασμός αντιδραστηρίων ανάλυσης για διάγνωση in vitro και λογισμικού ανάλυσης δεδομένων (Omixon HLA Twin ), που προορίζεται για την αναγνώριση και τον ορισμό ανθρωπίνων λευκοκυτταρικών αντιγόνων (HLA) τάξεως I και II και για χρήση στην Σελίδα 16 51

17 τυποποίηση HLA, χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα αλληλούχισης επόμενης γενιάς Illumina MiSeq. Το Holotype HLA παρέχει πληροφορίες ανθρώπινης ιστοσυμβατότητας των γενετικών τόπων HLA Τάξης I (A, B και C) και Τάξης II (DPB1, DQA1, DQB1 και DRB1), χρησιμοποιώντας ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA. Το λογισμικό Omixon HLA Twin, το οποίο περιλαμβάνεται στο προϊόν Holotype HLA, προορίζεται για την ερμηνεία και αντιστοίχιση δεδομένων αλληλούχισης, προερχόμενων από το σύστημα Illumina MiSeq, με αποτέλεσμα την υψηλής ακρίβειας, μονής διέλευσης, τυποποίηση HLA επίπεδου αλληλίων με πολύ χαμηλό ποσοστό ασαφειών στο επίπεδο πεδίου 2. Το προϊόν Holotype HLA προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση από επαγγελματικό προσωπικό υγειονομικής περίθαλψης, όπως τεχνολόγους εργαστηρίων και ιατρούς, που έχουν εκπαιδευτεί στην τυποποίηση HLA σε διαγνωστικά εργαστήρια με πιστοποίηση EFI ή ASHI ή που μπορούν να εργάζονται σύμφωνα με τις προδιαγραφές EFI ή ASHI. Σημαντική σημείωση πριν από την έναρξη Συνιστώμενη απομόνωση γονιδιωματικού DNA Το ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA πρέπει να προετοιμάζεται, χρησιμοποιώντας καλά δοκιμασμένα, εμπορικά διαθέσιμα κιτ προετοιμασίας DNA, για την εξασφάλιση της συνέπειας στην προετοιμασία. Ανεξάρτητα από την προσέγγιση, απαιτείται ακριβής προσδιορισμός της συγκέντρωσης και καθαρότητας για τη σωστή απόδοση της ανάλυσης. Το DNA δεν θα πρέπει να έχει μολυσματικές ουσίες που μπορεί να επηρεάσουν αργότερα την ενίσχυση, την προετοιμασία βιβλιοθήκης και τα βήματα αλληλούχισης (π.χ. αλκοόλη, άλατα, απορρυπαντικά, φορμαλδεΰδη και ηπαρίνη). Το αίμα δεν πρέπει να συλλέγεται σε ηπαρινισμένα σωληνάρια και δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα αίματος από ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με ηπαρίνη και λιπαιμικά ή αιμολυμένα δείγματα. Το προετοιμασμένο γονιδιωματικό DNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί αμέσως, εάν έχει προετοιμαστεί σε νερό χωρίς νουκλεάση ή εάν έχει αποθηκευτεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα στους -20 C ή χαμηλότερα. Συνιστάται η χρήση νερού για την προετοιμασία gdna, καθώς το EDTA στο ρυθμιστικό διάλυμα TE μπορεί να καταστείλει τις αντιδράσεις PCR μεγάλου εύρους. Η επαναλαμβανόμενη ψύξη απόψυξη θα πρέπει να αποφεύγεται, καθώς μπορεί να οδηγήσει σε αποδόμηση. Συνιστάται συγκέντρωση DNA ng/μl για την παροχή ng γονιδιωματικού DNA εισόδου ανά ενίσχυση PCR. Συνιστάται θερμά η χρήση μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού με βάση τον φθορισμό για τον καθορισμό της συγκέντρωσης gdna. Συνιστάται θερμά λόγος απορρόφησης 1,7 2 για τιμές 260 nm/280 nm και 260 nm/230 nm. Για την ενίσχυση των HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 και HLA-DQB1, απαιτούνται 0,8-1,2 µg gdna. Σελίδα 17 51

18 Αρχή της μεθόδου Εδώ και πολλά χρόνια, η κοινότητα HLA εργάζεται για την ανάπτυξη μιας μεθόδου που θα αναγνωρίζει με ακρίβεια τον εκτενή πολυμορφισμό των γονιδίων HLA και των γονιδιακών προϊόντων τους. Η έλευση της PCR, σε συνδυασμό με άλλες τεχνολογίες (αλληλούχιση κατά Sanger, SSOP, SSP, Luminex), παρείχαν έναν τρόπο για τη σημαντική βελτίωση της ανίχνευσης των πολυμορφισμών των HLA, αν και με αρκετούς περιορισμούς, οι οποίοι εξακολουθούν να δυσχεραίνουν την ικανότητά μας να χαρακτηρίσουμε συνολικά τα γονίδια HLA. Οι τεχνολογίες που έχουν αναπτυχθεί τα τελευταία χρόνια, που ονομάζονται συνολικά αλληλούχιση επόμενης γενιάς (Next Generation Sequencing NGS), έχουν παράσχει νέες ευκαιρίες, οι οποίες επιτρέπουν τον πλήρη χαρακτηρισμό των γονιδίων HLA με απλοειδή τρόπο. Η τεχνολογία NGS έχει δύο ξεχωριστά χαρακτηριστικά, 1) κλωνική αλληλούχιση των θραυσμάτων DNA και 2) εξαιρετικά υψηλή κλίμακα. Η τεχνολογία NGS παρέχει τη δυνατότητα σταδιακής εισαγωγής των πολυμορφισμών, εξαλείφοντας με αυτόν τον τρόπο κάθε ασάφεια, ενώ παρέχει τυποποίηση HLA στο επίπεδο πεδίου τρία έως τέσσερα, χωρίς την αυτόματη εκτέλεση πρόσθετων εξετάσεων, παρουσιάζοντας, έτσι, μια δυνητικά συνολική λύση στο πρόβλημα τυποποίησης HLA. Το πρωτόκολλο που περιγράφεται εδώ αξιοποιεί αυτήν την τεχνολογία και συνδυάζει την ενίσχυση PCR μεγάλου εύρους των γονιδίων HLA με αλληλούχιση στην πλατφόρμα Illumina MiSeq. Πιο συγκεκριμένα, τα γονίδια HLA A, B, C, DQA1 και DQB1 ενισχύονται για ολόκληρο το μήκος κωδικοποίησής τους, συμπεριλαμβάνοντας στοιχεία από τις 5 και 3 αμετάφραστες περιοχές, ενώ το DRB1 ενισχύεται από το εσώνιο 1 έως το εσώνιο 4 και το DPB1 ενισχύεται από το εσώνιο 1 έως τη 3' αμετάφραστη περιοχή. Στη συνέχεια, τα αμπλικόνια υποβάλλονται σε επεξεργασία, μέσα από μια σειρά βημάτων που: 1. Κατακερματίζουν τα αμπλικόνια σε μέγεθος κατάλληλο για την αλληλούχιση στην πλατφόρμα Illumina, 2. Πραγματοποιούν άμβλυνση και αδενυλίωση των άκρων των κατακερματισμένων αμπλικονίων 3. Συνδέουν με λιγάση τις αλληλουχίες προσαρμοστών που χρησιμοποιούνται καθ' όλη τη διαδικασία στο MiSeq για την καταγραφή, την ενίσχυση και την αλληλούχιση του DNA. Οι προσαρμοστές περιλαμβάνουν, επίσης, ένα δείκτη που είναι μια μικρή αλληλουχία, μοναδική για κάθε προσαρμοστή, που προσδιορίζει την προέλευση της βιβλιοθήκης (δείγμα/τόπος). Μετά από τη συγκέντρωση των βιβλιοθηκών με δείκτες, την επιλογή μεγέθους και την ποσοτικοποίηση, το δείγμα τοποθετείται στο MiSeq για αλληλούχιση. Ολόκληρη η διαδικασία διαρκεί 3-5 ημέρες, ανάλογα με την επιλογή κυψελίδας ροής στην πλατφόρμα Illumina. Η σύνοψη των βημάτων του πρωτοκόλλου παρουσιάζεται στην παρακάτω εικόνα: Σελίδα 18 51

19 Σύνοψη των βημάτων ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ GDNA ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΥΡΙΟΥ ΜΕΙΓΜΑΤΟΣ ΕΝΙΣΧΥΣΗ HLA ΤΑΞΗΣ I ΚΑΙ ΤΑΞΗΣ II ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 45, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 0H 45 ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 45, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 6H 45 ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΚΑΝΟΝΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΑΜΠΛΙΚΟΝΙΩΝ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 35, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 0H 35 ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 55, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 3H ΕΠΙΛΟΓΗ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗΣ ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 15, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 1H ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 15, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 1H 15 ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΣΤΟ ILLUMINA MISEQ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗΣ HLA ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 20, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 23H ΧΡΟΝΟΣ ΑΠΑΣΧΟΛΗΣΗΣ: 0H 0, ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΧΡΟΝΟΣ: 6H Σελίδα 19 51

20 Γλωσσάρι/ορισμοί Πλάκα αμπλικονίων Εναλλακτικό όνομα για μια πλάκα ενίσχυσης Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με το φθορισμόμετρο πλάκας, όπου πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός των αραιωμένων αμπλικονίων Πλάκα ενίσχυσης Πλάκα PCR 96 πηγαδιών που χρησιμοποιείται για την ενίσχυση των γενετικών τόπων HLA Τελική βιβλιοθήκη Βιβλιοθήκη που περιλαμβάνει όλες τις Βιβλιοθήκες δείγματος που είναι έτοιμες να αλληλουχιστούν σε μία ανάλυση MiSeq Πλάκα αντίδρασης Πλάκα όπου πραγματοποιούνται οι διαδοχικές αντιδράσεις που κατακερματίζουν, επιδιορθώνουν τα άκρα και συνδέουν με λιγάση τους προσαρμοστές με δείκτες στις Βιβλιοθήκες δείγματος Πλάκα αντιδραστηρίων Πλάκα που χρησιμοποιείται για τη διανομή κλασμάτων των διάφορων αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την προετοιμασία των βιβλιοθηκών Βιβλιοθήκη δείγματος Βιβλιοθήκη που παρασκευάζεται από τον συνδυασμό (ομαδοποίηση) όλων των γενετικών τόπων HLA για δεδομένο δείγμα Πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων Πλάκα που περιέχει μια βιβλιοθήκη δείγματος (συνδυασμός όλων των γενετικών τόπων) ανά πηγάδι Πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων Πλάκα 96 πηγαδιών συμβατή με το φθορισμόμετρο πλάκας, όπου τοποθετούνται πρότυπα DNA για τον ποσοτικό προσδιορισμό αμπλικονίων Σελίδα 20 51

21 Βήμα 1 Προετοιμασία κύριου μείγματος ενίσχυσης HLA Διάρκεια: ~45 λεπτά Ο σκοπός αυτού του βήματος είναι η παρασκευή των κυρίων μειγμάτων που αφορούν σε συγκεκριμένους γενετικούς τόπους, προκειμένου να ενισχυθεί μεμονωμένα κάθε στοχευμένος γενετικός τόπος HLA. Οι γενετικοί τόποι που ενισχύονται από αυτό το πρωτόκολλο είναι: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 και HLA-DQB1. Σημείωση: Τα κύρια μείγματα που παρασκευάζονται σε αυτό το βήμα περιλαμβάνουν όλα τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για την ενίσχυση, εκτός από την Taq πολυμεράση. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Μείγμα εκκινητή HLA-A -20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-B -20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-C -20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-DRB1-20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-DPB1-20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-DQA1-20 C Omixon Μείγμα εκκινητή HLA-DQB1 Σετ 3-20 C Omixon Ενισχυτής 1-20 C Omixon Ενισχυτής 2-20 C Omixon LongRange PCR Buffer (10 ) -20 C Qiagen dntps (10 mm το καθένα) -20 C Qiagen H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Πρωτόκολλο -20 C Qiagen 1.1. Αφαιρέστε όλα τα μείγματα εκκινητή, τον ενισχυτή 1 και 2, το dntps και το ρυθμιστικό διάλυμα PCR μεγάλου εύρους (10 ) από τη φύλαξη και αποψύξτε σε θερμοκρασία δωματίου Παρασκευάστε τον συνδυασμένο ενισχυτή: προσθέστε 132 μl ενισχυτή 2 στο σωληνάριο του ενισχυτή 1. Αλλάξτε την ετικέτα του σωληναρίου του ενισχυτή 1 σε συνδυασμένο ενισχυτή Παρασκευάστε ένα κύριο μείγμα για κάθε μείγμα εκκινητή, σύμφωνα με τους παρακάτω πίνακες: Σελίδα 21 51

22 Κύριο μείγμα: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1, και DQA1 Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/ γενετικός τόπος Όγκος/24 δείγματα/ γενετικός τόπος Μείγμα εκκινητή 2 μl 51 μl LongRange PCR Buffer (10 ) 2,5 μl 63,8 μl Μείγμα dntps (10 mm το καθένα) 1,25 μl 31,9 μl H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας 13,85 μl 353,2 μl Συνολικός όγκος 19,6 μl 499,9 μl Κύριο μείγμα: HLA-DQB1 Σετ 3 Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/ γενετικός τόπος Όγκος/24 δείγματα/ γενετικός τόπος Μείγμα εκκινητή 2 μl 51 μl LongRange PCR Buffer (10 ) 2,5 μl 63,8 μl Μείγμα dntps (10 mm το καθένα) 1,25 μl 31,9 μl Συνδυασμένος ενισχυτής 5,6 μl 142,8 μl H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας 7,85 μl 200,2 μl Συνολικός όγκος 19,2 μl 489,7 μl 1.4. Υποβάλετε το κάθε κύριο μείγμα σε περιδίνηση και, στη συνέχεια, σε σύντομη φυγοκέντριση για 1 δευτερόλεπτο. Τοποθετήστε τα κύρια μείγματα σε πάγο Αραιώστε όλα τα gdna σε συγκέντρωση μεταξύ ng/μl (ο ελάχιστος όγκος είναι 45 μl). Σημείωση: Το Holotype HLA περιέχει επαρκή αντιδραστήρια για 24 αντιδράσεις, καθώς και πρόσθετο όγκο για απώλειες κατά τη διανομή με πιπέτα και αποτυχημένη ενίσχυση. Σελίδα 22 51

23 Βήμα 2 Ενίσχυση HLA Τάξης I και II Διάρκεια: ~6 ώρες 45 λεπτά Ο σκοπός του βήματος 2 είναι η ενίσχυση των γενετικών τόπων HLA. Οι ενισχύσεις HLA Τάξης I και Τάξης II έχουν βελτιστοποιηθεί, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά σύνολα συνθηκών PCR. Αφού ολοκληρωθούν οι αντιδράσεις PCR, η ενίσχυση επαληθεύεται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης (προαιρετικά). Γρήγορη συμβουλή Αν και προτείνεται η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου Holotype HLA. Όταν πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός των αμπλικονίων (Βήμα 3), οποιαδήποτε συγκέντρωση άνω των 50 ng/μl θεωρείται επιτυχής ενίσχυση. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης αποτελεί ένα σημαντικό βήμα ποιοτικού ελέγχου και δεν πρέπει να παραλείπεται, όταν δεν υπάρχει επαρκής εμπειρία με το πλήρες πρωτόκολλο Holotype HLA. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Κύριο μείγμα HLA-A -20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-B -20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-C -20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-DRB1-20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-DPB1-20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-DQA1-20 C Βήμα 1 Κύριο μείγμα HLA-DQB1 Σετ 3-20 C Βήμα 1 Taq πολυμεράση -20 C Qiagen gdna 4 C Χρήστης H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Πρωτόκολλο 20 C Χρήστης 2.1 Αφαιρέστε την Taq πολυμεράση από τη φύλαξη, φυγοκεντρίστε σύντομα και προσθέστε την σε κάθε κύριο μείγμα, σύμφωνα με τους παρακάτω πίνακες, ξεπλένοντας σχολαστικά τα ρύγχη των πιπετών με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση: Σελίδα 23 51

24 Κύριο μείγμα με Taq πολυμεράση: HLA-A, B, C, DRB1, DPB1, και DQA1 Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/γενετικός τόπος Όγκος/24 δείγματα/ γενετικός τόπος Κύριο μείγμα από το βήμα 1 19,6 μl 499,9 μl Taq πολυμεράση 0,4 μl 10,2 μl Σύνολο 20 μl 510,1 μl Κύριο μείγμα με Taq πολυμεράση: HLA-DQB1 σετ 3 Αντιδραστήριο Όγκος/δείγμα/γενετικός τόπος Όγκος/24 δείγματα/ γενετικός τόπος Κύριο μείγμα από το βήμα 1 19,2 μl 489,7 μl Taq πολυμεράση 0,8 μl 20,4 μl Σύνολο 20 μl 510,1 μl 2.2 Υποβάλετε σε περιδίνηση και σε σύντομη φυγοκέντριση όλα τα κύρια μείγματα με Taq πολυμεράση. Διανείμετε 20 μl κάθε κύριου μείγματος με Taq πολυμεράση σε ξεχωριστά πηγάδια των πλακών PCR 96 πηγαδιών. Σημείωση: Η ενίσχυση Τάξης I και Τάξης II έχει βελτιστοποιηθεί, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές συνθήκες PCR, επομένως τα κύρια μείγματα Τάξης I και Τάξης II δεν πρέπει να βρίσκονται στην ίδια πλάκα. 2.3 Προσθέστε 5 μl κάθε αραιωμένου gdna στο κατάλληλο πηγάδι των πλακών που προετοιμάστηκαν στο προηγούμενο βήμα. Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. Σφραγίστε τις με θερμικό φύλλο σφράγισης και επιθεωρήστε οπτικά το κάθε πηγάδι. Υποβάλετε όλες τις πλάκες ενίσχυσης σε σύντομη φυγοκέντριση. 2.4 Τοποθετήστε τις πλάκες ενίσχυσης σε θερμικούς κυκλοποιητές και εκτελέστε τα προγράμματα για την ενίσχυση Τάξης I και Τάξης II, σύμφωνα με τους παρακάτω πίνακες: Ενίσχυση Τάξης I (HLA-A, B και C) Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 95 C 3 λεπτά 95 C 15 δευτερόλεπτα C 30 δευτερόλεπτα 68 C 5 λεπτά 1 68 C 10 λεπτά 1 4 C Σελίδα 24 51

25 Ενίσχυση Τάξης II (HLA-DRB1, DPB1, DQA1 και DQB1) Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 95 C 3 λεπτά 93 C 15 δευτερόλεπτα C 30 δευτερόλεπτα 68 C 9 λεπτά 1 68 C 10 λεπτά 1 4 C Σημείωση: Η επιτυχία της ενίσχυσης μπορεί να επαληθευτεί, προσθέτοντας 2 μl από κάθε αμπλικόνιο σε τυπικό πήκτωμα αγαρόζης 2% στα 250 V για 30 λεπτά. (Προαιρετικά) Αναμενόμενα μεγέθη αμπλικονίων Γενετικός τόπος HLA Αναμενόμενο μέγεθος αμπλικονίων (kb) HLA-A, B και C ~3 HLA-DRB1 ~4,3 HLA-DPB1 ~6,6 HLA-DQA1 ~5,5 HLA-DQB1 (Σετ 3) ~6,5 Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Τα αμπλικόνια μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Σελίδα 25 51

26 Βήμα 3 Ποσοτικός προσδιορισμός και κανονικοποίηση αμπλικονίων (χρησιμοποιώντας φθορισμόμετρο πλάκας) Διάρκεια: ~35 λεπτά Ο ποσοτικός προσδιορισμός και η κανονικοποίηση αμπλικονίων συνιστάται για την εξασφάλιση εισόδου ακριβείας στο βήμα προετοιμασίας βιβλιοθήκης (προαιρετικό). Η συγκέντρωση αμπλικονίων μετριέται, χρησιμοποιώντας το Σύστημα QuantiFluor dsdna που περιέχει μια φθορίζουσα χρωστική που δεσμεύει DNA και ένα πρότυπο DNA για τον ευαίσθητο ποσοτικό προσδιορισμό μικρών ποσοτήτων DNA διπλής έλικας (dsdna). Ανατρέξτε στο Παράρτημα 2 για οδηγίες σχετικά με τον ποσοτικό προσδιορισμό αμπλικονίων, χρησιμοποιώντας όργανο qpcr. Γρήγορη συμβουλή Αν και προτείνεται ο ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίων, δεν απαιτείται για την επιτυχή ολοκλήρωση του πρωτοκόλλου Holotype HLA. Η κανονικοποίηση αμπλικονίων δεν απαιτεί ακριβή μέτρηση της συγκέντρωσης των αμπλικονίων. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια εκτίμηση των συγκεντρώσεων αμπλικονίων με βάση την εμπειρία ή την ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Ο ποσοτικός προσδιορισμός αμπλικονίων δεν πρέπει να παραλείπεται χωρίς συνεχή εμπειρία με το πλήρες πρωτόκολλο Holotype HLA. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Πλάκα ενίσχυσης Τάξης I 4 C Βήμα 2 Πλάκα ενίσχυσης Τάξης II 4 C Βήμα 2 Lambda DNA Standard (100 ng/μl) 4 C Promega QuantiFluor dsdna Dye (200 ) 4 C Promega Ρυθμιστικό διάλυμα TE 20 (ph 7,5) 4 C Promega H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας 20 C έως 25 C Χρήστης ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Σελίδα 26 51

27 Πρωτόκολλο 3.1 Παρασκευάστε πρότυπα DNA μέσω διαδοχικών αραιώσεων του προτύπου DNA Λάμδα (100 ng/μl) που παρέχεται στο κιτ QuantiFluor, σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα αραίωσης: Ετικέτα στο σωληνάριο DNA εισόδου Όγκος DNA (μl) Όγκος 1x TE (μl) Τελική συγκ. (ng/μl) Πρότυπο 1 DNA Λάμδα 7,5 μl 492,5 μl 1,5 ng/μl Πρότυπο 2 Πρότυπο μl 250 μl 0,75 ng/μl Πρότυπο 3 Πρότυπο μl 250 μl 0,38 ng/μl Πρότυπο 4 Πρότυπο μl 250 μl 0,19 ng/μl Πρότυπο 5 Πρότυπο μl 250 μl 0,09 ng/μl Πρότυπο 6 Πρότυπο μl 250 μl 0,05 ng/μl Τυφλό Τυφλό 0 μl 250 μl 0 ng/μl 3.2 Προετοιμάστε τις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων (βλ. συμπληρωματικές εικόνες). Διανείμετε 99 μl ρυθμιστικού διαλύματος TE 1x στα πηγάδια μιας οπτικής πλάκας 96 πηγαδιών για τον συνολικό αριθμό των αμπλικονίων για τα οποία πραγματοποιείται ποσοτικός προσδιορισμός. 3.3 Προσθέστε 1 μl αμπλικονίων από τα αντίστοιχα πηγάδια των πλακών αμπλικονίων σε μεμονωμένα πηγάδια των πλακών ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων. Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 3.4 Παρασκευάστε διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1, χρησιμοποιώντας τον παρακάτω τύπο: 0,5 μl χρωστικής QuantiFluor (200X) + 99,5 μl ρυθμιστικό διάλυμα TE 1. Παρασκευάστε επαρκές διάλυμα εργασίας χρωστικής QuantiFluor 1, ώστε κάθε δείγμα (σύνολο δειγμάτων στις πλάκες αμπλικονίων) και πρότυπο (14 συνολικά) να λάβει γνωστό κλάσμα 100 μl. 3.5 Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων και πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων. Διανείμετε 100 μl διαλύματος εργασίας της χρωστικής QuantiFluor 1 στα πηγάδια της οπτικής πλάκας 96 πηγαδιών, που θα αποτελέσει την πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων, και στις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων από το Βήμα Χρησιμοποιώντας τα πρότυπα που παρασκευάστηκαν παραπάνω, προσθέστε 100 μl από κάθε πρότυπο, εις διπλούν, σε μεμονωμένα πηγάδια στην πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων (14 πηγάδια συνολικά). Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 3.7 Αναμίξτε, υποβάλλοντας σε περιδίνηση και σε σύντομη φυγοκέντριση. 3.8 Αναλύστε την πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων στο φθορισμόμετρο πλάκας και έπειτα τις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων. Σελίδα 27 51

28 3.9 Υπολογίστε τη συγκέντρωση DNA στις πλάκες ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων, χρησιμοποιώντας δεδομένα RFU που δημιουργήθηκαν από το φθορισμόμετρο πλάκας. Ανατρέξτε στην καρτέλα Αραίωση, στο παρεχόμενο βιβλίο εργασίας, για βοήθεια με τους υπολογισμούς Αραιώστε DNA στις πλάκες αμπλικονίων με H 2 O υψηλής καθαρότητας και κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας, ώστε η τελική συγκέντρωση DNA να είναι περίπου 67 ng/μl. Εάν η συγκέντρωση DNA είναι 150 ng/μl ή μεγαλύτερη: προσθέστε 25 μl H 2 O Εάν η συγκέντρωση DNA είναι ng/μl: προσθέστε 10 μl H 2 O Εάν η συγκέντρωση DNA είναι μικρότερη από 100 ng/μl: μην προσθέσετε H 2 O Ομαδοποίηση αμπλικονίων 3.11 Ομαδοποιήστε όλους τους γενετικούς τόπους κάθε δείγματος σε μία πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων. Συνδυάστε τους όγκους που παρατίθενται για κάθε γενετικό τόπο στον παρακάτω πίνακα, για να λάβετε τελικό όγκο 35 μl: Γενετικός τόπος HLA A B C DRB1 DPB1 DQA1 DQB1 σετ 3 Ομαδοποιημένος όγκος 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 5 μl 3.12 Προσθέστε 4 μl ExoSAP-IT Express σε κάθε βιβλιοθήκη δείγματος. Εκπλύνετε τα ρύγχη των πιπετών με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση. Σφραγίστε την πλάκα με θερμικό φύλλο σφράγισης και υποβάλετε σε σύντομη φυγοκέντριση Τοποθετήστε την πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων στο θερμικό κυκλοποιητή και εκτελέστε το παρακάτω πρόγραμμα: Καθαρισμός PCR ExoSAP-IT Express Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 37 C 4 λεπτά 1 80 C 1 λεπτό 1 4 C Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Τα αμπλικόνια μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Σελίδα 28 51

29 Βήμα 4 Προετοιμασία βιβλιοθήκης Διάρκεια: ~3 ώρες Κατά τη διάρκεια αυτού του βήματος, τα ομαδοποιημένα αμπλικόνια προετοιμάζονται για αλληλούχιση στο Illumina MiSeq. Πραγματοποιείται ενζυμικός κατακερματισμός των αμπλικονίων, επιδιόρθωση και αδενυλίωση των άκρων και σύνδεση με λιγάση των προσαρμοστών με δείκτες στα άκρα. Στη συνέχεια, οι βιβλιοθήκες ομαδοποιούνται με ένα βήμα καθαρισμού και συγκέντρωσης που εκτελείται χρησιμοποιώντας σφαιρίδια AMPure XP. Σημείωση: Η Omixon συνιστά όγκους μεγαλύτερους από τους απαιτούμενους για 24 δείγματα, καθώς πολλά από τα ένζυμα και τα ρυθμιστικά διαλύματα είναι ιξώδη, με αποτέλεσμα πρόσθετες απώλειες κατά τη διανομή με πιπέτα. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων 4 C Βήμα 3 Ένζυμο κατακερματισμού (Α) -20 C Omixon Ρυθμιστικό διάλυμα κατακερματισμού (Β) -20 C Omixon Ένζυμο επιδιόρθωσης άκρων (Γ) -20 C Omixon Ρυθμιστικό διάλυμα επιδιόρθωσης άκρων (Δ) -20 C Omixon Ένζυμο σύνδεσης με λιγάση (Ε) -20 C Omixon Ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης με λιγάση (ΣΤ) -20 C Omixon Πλάκα προσαρμοστών -20 C Omixon Σφαιρίδια AMPure XP 4 C Beckman Coulter Αιθανόλη 80% (πρόσφατα παρασκευασμένη) 20 C έως 25 C Χρήστης H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Πρωτόκολλο 20 C έως 25 C Χρήστης 4.1 Ενεργοποιήστε τον θερμικό κυκλοποιητή. Επιβεβαιώστε ότι το θερμαινόμενο καπάκι θερμαίνεται. Σημείωση: Υποβάλετε σε περιδίνηση το ένζυμο κατακερματισμού (Α) πριν από τη χρήση. 4.2 Παρασκευάστε το κύριο μείγμα κατακερματισμού, σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Σελίδα 29 51

30 Κύριο μείγμα κατακερματισμού Αντιδραστήριο Όγκος ανά βιβλιοθήκη (μl) Συνιστώμενοι όγκοι για 24 βιβλιοθήκες (μl) Χρωματικός κώδικας Ένζυμο κατακερματισμού (Α) 2 μl 55,2 μl Κίτρινο Ρυθμιστικό διάλυμα κατακερματισμού (Β) 2 μl 55,2 μl Κόκκινο Συνολικός όγκος 4 μl 110,4 μl 4.3 Προετοιμάστε μια πλάκα αντιδραστηρίων: τοποθετήστε μια νέα πλάκα PCR 96 πηγαδιών σε ένα στατώ ψύξης και διανείμετε ίση ποσότητα του κύριου μείγματος κατακερματισμού σε κάθε πηγάδι μίας στήλης. Σημείωση: Η αντίδραση κατακερματισμού έχει σχεδιαστεί ώστε να παρέχει το ιδανικό μέγεθος DNA για αλληλούχιση στο Illumina MiSeq. Είναι σημαντικό, τα αντιδραστήρια να διατηρηθούν σε χαμηλή θερμοκρασία μέχρι να ξεκινήσει η αντίδραση στο θερμικό κυκλοποιητή, προκειμένου να αποφευχθεί ο υπερβολικός κατακερματισμός. Συνιστάται η χρήση πιπετών πολλών καναλιών για την ελαχιστοποίηση της πιθανότητας υπερβολικού κατακερματισμού. 4.4 Φυγοκεντρίστε την πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων για 10 δευτερόλεπτα και τοποθετήστε την σε πάγο ή ψυχρό μπλοκ. 4.5 Προετοιμάστε μια πλάκα αντίδρασης: τοποθετήστε μια νέα πλάκα PCR 96 πηγαδιών πάνω σε ένα μπλοκ ψύξης PCR. 4.6 Προσθέστε 4 μl κύριου μείγματος κατακερματισμού από την πλάκα αντιδραστηρίων στα πηγάδια της πλάκας αντίδρασης, που αντιστοιχούν σε δείγματα στην πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων. Συνιστάται η χρήση πιπέτας πολλών καναλιών. 4.7 Μεταφέρετε 16 μl κάθε αμπλικονίου από την πλάκα ομαδοποιημένων αμπλικονίων στο αντίστοιχο πηγάδι της πλάκας αντίδρασης, χρησιμοποιώντας πιπέτα πολλών καναλιών. Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα. 4.8 Καλύψτε την πλάκα αντίδρασης με θερμικό φύλλο σφράγισης και φυγοκεντρίστε για 10 δευτερόλεπτα. 4.9 Επωάστε την πλάκα αντίδρασης σε θερμικό κυκλοποιητή με το παρακάτω πρόγραμμα: Πρόγραμμα κατακερματισμού Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 37 C 10 λεπτά 1 70 C 15 λεπτά 1 4 C Σελίδα 30 51

31 Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα Παρασκευάστε το κύριο μείγμα επιδιόρθωσης άκρων, σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Κύριο μείγμα επιδιόρθωσης άκρων Αντιδραστήριο H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Όγκος ανά βιβλιοθήκη (μl) Συνιστώμενοι όγκοι για 24 βιβλιοθήκες (μl) 1,25 μl 34,8 μl Χρωματικός κώδικας Ένζυμο επιδιόρθωσης άκρων (Γ) 1,25 μl 34,8 μl Πράσινο Ρυθμιστικό διάλυμα επιδιόρθωσης άκρων (Δ) 2,5 μl 69,6 μl Πορτοκαλί Συνολικός όγκος 5 μl 139,2 μl 4.11 Διανείμετε ίση ποσότητα κύριου μείγματος επιδιόρθωσης άκρων σε μία στήλη της πλάκας αντιδραστηρίων που δε χρησιμοποιείται Φυγοκεντρίστε την πλάκα αντίδρασης (που περιέχει τα κατακερματισμένα δείγματα) για 10 δευτερόλεπτα. Προσθέστε 5 μl κύριου μείγματος επιδιόρθωσης άκρων από την πλάκα αντιδραστηρίων σε κάθε πηγάδι της πλάκας αντίδρασης. Συνιστάται η χρήση πιπέτας πολλών καναλιών. Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα Καλύψτε την πλάκα αντίδρασης με θερμικό φύλλο σφράγισης και φυγοκεντρίστε για 10 δευτερόλεπτα Επωάστε την πλάκα αντίδρασης σε θερμικό κυκλοποιητή με το παρακάτω πρόγραμμα: Πρόγραμμα επιδιόρθωσης άκρων Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 20 C 30 λεπτά 1 70 C 5 λεπτά 1 4 C Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα Βγάλτε την πλάκα προσαρμοστών με δείκτες από τη φύλαξη και αποψύξτε σε θερμοκρασία δωματίου, μετά την εκκίνηση του προγράμματος επιδιόρθωσης άκρων στον θερμικό κυκλοποιητή. Μόλις η πλάκα προσαρμοστών μεταβεί σε θερμοκρασία δωματίου, φυγοκεντρίστε για 3 λεπτά στις στροφές ανά λεπτό. Σελίδα 31 51

32 4.16 Αφαιρέστε προσεκτικά το φύλλο σφράγισης από την πλάκα προσαρμοστών. Μην ανακινήσετε την πλάκα προσαρμοστών αφού αφαιρεθεί το φύλλο σφράγισης, προκειμένου να αποφευχθεί η διασταυρούμενη μόλυνση Μεταφέρετε όλο τον όγκο κάθε πηγαδιού από την πλάκα αντίδρασης (25 μl) στο αντίστοιχο πηγάδι της πλάκας προσαρμοστών. Σημείωση: Εφόσον ΔΕΝ πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ολόκληρη η πλάκα προσαρμοστών, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μόνο τον απαραίτητο αριθμό προσαρμοστών. Κόψτε το φύλλο σφράγισης μεταξύ των πηγαδιών που θα χρησιμοποιηθούν και των πηγαδιών που θα διατηρηθούν. Αφαιρέστε προσεκτικά το φύλλο σφράγισης από την πλάκα προσαρμοστών, αφήνοντάς το στη θέση του πάνω από τα πηγάδια που θα διατηρηθούν. α. Μεταφέρετε 25 μl από κάθε δείγμα με επιδιορθωμένα άκρα από την πλάκα αντίδρασης σε ένα πηγάδι στην Πλάκα προσαρμοστών, αναμιγνύοντας καλά με την πιπέτα, με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση. β. Μεταφέρετε όλο τον όγκο κάθε δείγματος από την πλάκα προσαρμοστών στο αρχικό πηγάδι της πλάκας αντίδρασης. γ. Σφραγίστε πάλι την πλάκα προσαρμοστών και επαναφέρετέ την στους -20 C. Χρησιμοποιήστε την πλάκα αντίδρασης αντί για την πλάκα προσαρμοστών για τα υπόλοιπα βήματα του εγχειριδίου Παρασκευάστε το κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση. Παρασκευάστε επαρκές κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση για το κάθε δείγμα. Κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση Αντιδραστήριο Όγκος (μl) Συνιστώμενοι όγκοι για 24 βιβλιοθήκες (μl) Χρωματικός κώδικας Ένζυμο σύνδεσης με λιγάση (Ε) 2,5 μl 63,2 μl Μπλε Ρυθμιστικό διάλυμα σύνδεσης με λιγάση (ΣΤ) 30 μl 757,5 μl Μαύρο Συνολικός όγκος 32,5 820,7 μl 4.19 Διανείμετε το κύριο μείγμα σύνδεσης με λιγάση σε μια στήλη της πλάκας αντιδραστηρίων που δε χρησιμοποιείται. Συνιστάται η χρήση πιπέτας πολλών καναλιών Προσθέστε 32,5 μl κύριου μείγματος σύνδεσης με λιγάση σε κάθε πηγάδι της πλάκας αντίδρασης. Συνιστάται η χρήση πιπέτας πολλών καναλιών. Αναμείξτε με επανειλημμένη αναρρόφηση και έγχυση με την πιπέτα Καλύψτε την πλάκα αντίδρασης με θερμικό φύλλο σφράγισης και φυγοκεντρίστε για 10 δευτερόλεπτα Επωάστε την πλάκα αντίδρασης στο θερμικό κυκλοποιητή με το παρακάτω πρόγραμμα: Σελίδα 32 51

33 Πρόγραμμα σύνδεσης με λιγάση Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 25 C 10 λεπτά 1 70 C 10 λεπτά 1 4 C Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C κατά τη διάρκεια της νύχτας ή στους -20 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Ομαδοποίηση και καθαρισμός βιβλιοθήκης 4.23 Αφήστε τα σφαιρίδια AMPure XP να μεταβούν σε θερμοκρασία δωματίου. Βεβαιωθείτε ότι είναι ομοιογενή (δεν υπάρχουν συσσωματώματα ή ιζήματα). Προετοιμάστε 5 ml πρόσφατα παρασκευασμένης αιθανόλης 80% (4 ml EtOH + 1 ml H 2 O) Δημιουργήστε τη Βιβλιοθήκη, συνδυάζοντας το γνωστό κλάσμα από κάθε ομαδοποιημένο αμπλικόνιο, τώρα πλέον μια βιβλιοθήκη συγκεκριμένου δείγματος, σε ένα σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 2,0 ml. I. Για 16 ή περισσότερα δείγματα Υπολογίστε την ποσότητα κάθε βιβλιοθήκης δείγματος για ομαδοποίηση σε μία Βιβλιοθήκη συνολικού όγκου 900 μl. Διαιρέστε τα 900 μl με τον αριθμό των βιβλιοθηκών δείγματος. Αυτός είναι ο όγκος γνωστού κλάσματος που πρέπει να ληφθεί από κάθε βιβλιοθήκη δείγματος και να προστεθεί με πιπέτα στη Βιβλιοθήκη. II. Για λιγότερα από 16 δείγματα Μεταφέρετε 60 μl κάθε βιβλιοθήκης δείγματος σε μια Βιβλιοθήκη Προσθέστε 900 μl σφαιριδίων AMPure XP στο σωληνάριο Βιβλιοθήκης, αλλά μην ακουμπήσετε τη Βιβλιοθήκη με το ρύγχος της πιπέτας. Αναμίξτε σχολαστικά με σύντομη περιδίνηση και φυγοκέντριση. Μην επιτρέψετε το διαχωρισμό των σφαιριδίων. Επωάστε τη βιβλιοθήκη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Σημείωση: Εφόσον υπάρχουν λιγότερα από 900 μl βιβλιοθήκης στην τελική ομαδοποιημένη βιβλιοθήκη, προσθέστε ισοδύναμη ποσότητα σφαιριδίων AMPure XP. Θα πρέπει να υπάρχει αναλογία 1:1 της τελικής ομαδοποιημένης βιβλιοθήκης και των σφαιριδίων AMPure XP Τοποθετήστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης σε μια μαγνητική βάση και επωάστε για 10 λεπτά Κρατώντας το σωληνάριο πάνω στη μαγνητική βάση, αφαιρέστε και απορρίψτε προσεκτικά το υπερκείμενο από το σωληνάριο Βιβλιοθήκης, χωρίς να αγγίξετε τα σφαιρίδια. Σελίδα 33 51

34 4.28 Κρατώντας το σωληνάριο πάνω στη μαγνητική βάση, προσθέστε ~1,5 2 ml πρόσφατα παρασκευασμένης αιθανόλης 80% στο σωληνάριο Βιβλιοθήκης. Ο όγκος της αιθανόλης που προστίθεται πρέπει να επαρκεί για να καλύψει τα σφαιρίδια. Σημείωση: Εφαρμόστε την αιθανόλη στο τοίχωμα του σωληναρίου χωρίς σφαιρίδια Επωάστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης σε θερμοκρασία δωματίου για 30 δευτερόλεπτα και, στη συνέχεια, αφαιρέστε και απορρίψτε προσεκτικά το υπερκείμενο Επαναλάβετε τα βήματα 4.28 και Υποβάλετε γρήγορα σε σύντομη φυγοκέντριση το σωληνάριο Βιβλιοθήκης και τοποθετήστε το ξανά στη μαγνητική βάση με το καπάκι ανοικτό. Αφαιρέστε την υπολειπόμενη αιθανόλη με μια πιπέτα. Μην ακουμπήσετε τα σφαιρίδια. Σημείωση: Βεβαιωθείτε ότι το ίζημα σφαιριδίων δεν περιέχει υπολειπόμενη αιθανόλη. Ενδεχομένως να απαιτηθεί η περιστροφή του σωληναρίου στη μαγνητική βάση για την απομάκρυνση της αιθανόλης, χωρίς να διαταραχθεί το ίζημα σφαιριδίων Αφήστε τα σφαιρίδια να στεγνώσουν στον αέρα για 5-8 λεπτά στη μαγνητική βάση, μέχρι να στεγνώσει το ίζημα σφαιριδίων Αφαιρέστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης από τη μαγνητική βάση και διενεργήστε έκλουση της Βιβλιοθήκης με 31 μl νερού υψηλής καθαρότητας, κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας. Μην επιτρέψετε στο ρύγχος της πιπέτας να ακουμπήσει τα σφαιρίδια, διότι θα κολλήσουν επάνω σε αυτό Υποβάλετε σε περιδίνηση τη Βιβλιοθήκη, ώστε να επανεναιωρηθούν τα σφαιρίδια. Φυγοκεντρίστε σύντομα, εφόσον στα πλαϊνά τοιχώματα παραμένουν σταγονίδια. Βεβαιωθείτε ότι τα σφαιρίδια παραμένουν σε εναιώρημα Επωάστε τη Βιβλιοθήκη σε θερμοκρασία δωματίου για 2 λεπτά Τοποθετήστε το σωληνάριο Βιβλιοθήκης στη μαγνητική βάση για 2 λεπτά Συλλέξτε τη Βιβλιοθήκη: Διατηρώντας το σωληνάριο τελικής βιβλιοθήκης στη μαγνητική βάση, συλλέξτε 31 μl του υπερκείμενου σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 ml. Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Σελίδα 34 51

35 Βήμα 5 Βιβλιοθήκη επιλεγμένου μεγέθους Διάρκεια: ~1 ώρα Το βήμα 5 παίρνει τη Βιβλιοθήκη από το βήμα 4 και διενεργεί επιλογή μεγέθους, χρησιμοποιώντας το Pippin Prep. Το Pippin Prep μπορεί να επιλέξει αυτόματα ένα εύρος μεγεθών θραυσμάτων DNA και να διενεργήσει έκλουση σε ένα θάλαμο συλλογής. Σημείωση: Το Blue Pippin μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί για το Pippin Prep. Ανατρέξτε στο Παράρτημα 1 για τις Οδηγίες χρήσης του Pippin Prep. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Κασέτα πηκτώματος αγαρόζης 1,5%, χωρίς χρωστική Μείγμα διαλύματος φόρτωσης/δείκτη Pippin (δείκτης Κ) 20 C έως 25 C Sage Science 4 C Sage Science Ομαδοποιημένη βιβλιοθήκη 4 C Βήμα 4 Σημείωση: Ο Δείκτης Κ χρησιμοποιείται, συνήθως, με το Pippin Prep. Το Blue Pippin χρησιμοποιεί το Δείκτη R2. Πρωτόκολλο 5.1 Φέρτε το διάλυμα φόρτωσης Δείκτη Κ σε θερμοκρασία δωματίου. 5.2 Συνδυάστε 31 μl της ομαδοποιημένης βιβλιοθήκης με 10 μl διαλύματος φόρτωσης Δείκτη Κ. 5.3 Αναμίξτε, υποβάλλοντας σε περιδίνηση και σε σύντομη φυγοκέντριση. 5.4 Διαμορφώστε το Pippin Prep, έτσι ώστε να συλλέξει θραύσματα DNA μεγέθους μεταξύ 650 και 1300 bps. Φορτώστε το δείγμα 40 μl στη θύρα δείγματος και αναλύστε. Ο χρόνος ανάλυσης είναι λεπτά. 5.5 Συλλέξτε όλο το περιεχόμενο (περίπου 40 μl) από τη θύρα έκλουσης του Pippin Prep και μεταφέρετέ το σε ένα νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 ml. Αυτή είναι η βιβλιοθήκη επιλεγμένου μεγέθους. Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Σελίδα 35 51

36 Βήμα 6 Ποσοτικός προσδιορισμός βιβλιοθήκης με το όργανο qpcr Διάρκεια: ~1 ώρα 15 λεπτά Η ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους είναι απαραίτητη για τη βέλτιστη χρήση της εξόδου της συσκευής αλληλούχισης Illumina MiSeq. Η συγκέντρωση της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους μπορεί να μετρηθεί με ακρίβεια μέσω qpcr. Προαιρετικά, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το κιτ Qubit dsdna BR και μια συσκευή Qubit για τη μέτρηση συγκέντρωσης της βιβλιοθήκης. Για αυτό το πρωτόκολλο, βλ. Παράρτημα 3. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την 10 Illumina Primer Premix -20 C KAPA Biosystems 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix -20 C KAPA Biosystems Std 1 (20.00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2.00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0.20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0.02 pm) -20 C KAPA Biosystems Illumina DNA Standards -20 C KAPA Biosystems H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας 20 C έως 25 C Χρήστης Ρυθμιστικό διάλυμα TE 1 (ph 8,0) 20 C έως 25 C Χρήστης Βιβλιοθήκη επιλεγμένου μεγέθους 4 C Βήμα 5 Πρωτόκολλο 1 Παρασκευάστε το μείγμα εκκινητή qpcr, χρησιμοποιώντας το 10 Illumina Primer Premix και το 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix: Σημείωση: Τα αντιδραστήρια του κιτ KAPA SYBR FAST qpcr (κύριο μείγμα qpcr, προμείγμα εκκινητή και διαλύματα ROX) συνδυάζονται κατά την πρώτη χρήση του κιτ. Αυτό το συνδυασμένο διάλυμα διατηρείται σταθερό για τουλάχιστον 30 κύκλους ψύξης/απόψυξης. Ακολουθήστε την τεκμηρίωση της KAPA για να προσδιορίσετε αν τα ROX συνιστώνται για το όργανο qpcr σας. Μείγμα εκκινητή qpcr Αντιδραστήριο Όγκος (ml) 10 Illumina Primer Premix 1 ml 2 KAPA SYBR FAST qpcr Master Mix 5 ml Συνολικός όγκος 6 ml Σελίδα 36 51

37 2 Παρασκευάστε το κύριο μείγμα qpcr. Κύριο μείγμα qpcr Αντιδραστήριο Μείγμα εκκινητή qpcr H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Συνολικός όγκος Όγκος (μl) 228 μl 76 μl 304 μl 3 Προετοιμάστε διαδοχική αραίωση της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους. α. Παρασκευάστε διάλυμα 1:1000, προσθέτοντας 1 μl της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους σε 999 μl ρυθμιστικού διαλύματος TE 1 (ph 8,0), ξεπλένοντας σχολαστικά το ρύγχος της πιπέτας. Υποβάλετε σε περιδίνηση και σύντομη φυγοκέντριση. β. Παρασκευάστε διάλυμα 1:2000, προσθέτοντας 100 μl του διαλύματος 1:1000 σε 100 μl του ρυθμιστικού διαλύματος TE 1 (ph 8,0). Υποβάλετε σε περιδίνηση και σύντομη φυγοκέντριση. 4 Προετοιμάστε μια πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qpcr σε μια νέα πλάκα PCR συμβατή με το σύστημα qpcr σας. 5 Διανείμετε 16 μl του κύριου μείγματος qpcr εις τριπλούν για τα πρότυπα 1-4, το διάλυμα 1:1000 και το διάλυμα 1:2000 (βλ. συμπληρωματικές εικόνες). 6 Διανείμετε 4 μl των προτύπων 1-4, του διαλύματος 1:1000 και του διαλύματος 1:2000 στα αντίστοιχα πηγάδια. 7 Σφραγίστε την πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού qpcr και φυγοκεντρίστε την για 10 δευτερόλεπτα. Σημείωση: Αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων στα πηγάδια της πλάκας ποσοτικού προσδιορισμού qpcr. Φυγοκεντρίστε, εφόσον απαιτηθεί για την εξάλειψη των φυσαλίδων. 8 Ορίστε τα τριπλότυπα 1:1000 και 1:2000 ως στοχευμένα δείγματα και ορίστε τα πρότυπα (σημεία: 4, συγκέντρωση έναρξης: 20 pm, αραίωση: 1:10). Εκτελέστε το παρακάτω πρόγραμμα στο όργανο qpcr, προκειμένου να προσδιορίσετε τη συγκέντρωση DNA στη βιβλιοθήκη επιλεγμένου μεγέθους: Αριθμός κύκλων Θερμοκρασία Χρόνος 1 95 C 5 λεπτά 25 (χωρίς καμπύλη τήξης) 95 C 30 δευτερόλεπτα 60 C 90 δευτερόλεπτα (λήψη δεδομένων) 9 Για τη μετατροπή του αποτελέσματος qpcr από συγκέντρωση pm σε nm, καταχωρίστε τα αποτελέσματα «Quantity mean» (Μέση ποσότητα) των δύο αντιγράφων βιβλιοθήκης στην καρτέλα «Library Quantitation» (Ποσοτικός προσδιορισμός βιβλιοθήκης) του Βιβλίου εργασίας Omixon. Σελίδα 37 51

38 10 Χρησιμοποιώντας τους όγκους από το βιβλίο εργασίας, αραιώστε 10 μl της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους, σε συγκέντρωση 2 nm, με αποστειρωμένο H 2 O σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 ml. Φυλάξτε την υπόλοιπη βιβλιοθήκη επιλεγμένου μεγέθους στους -20 C. Ασφαλές σημείο διακοπής της διαδικασίας. Οι βιβλιοθήκες μπορούν να αποθηκευτούν στους -20 C για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Σε περίπτωση μακρόχρονης φύλαξης, συνιστάται ιδιαίτερα η εκ νέου ποσοτικοποίηση της βιβλιοθήκης πριν από την ανάλυση στο MiSeq. Σελίδα 38 51

39 Βήμα 7 Αλληλούχιση στο Illumina MiSeq Διάρκεια: ~24 ώρες Το Illumina MiSeq αποτελεί ένα αυτοματοποιημένο όργανο NGS που μπορεί να διενεργήσει αλληλούχιση της βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους που παρασκευάστηκε στα προηγούμενα βήματα. Η διαίρεση των δειγμάτων με δείκτες σε ξεχωριστά αρχεία για κάθε δείκτη/δείγμα (demultiplexing) πραγματοποιείται αυτόματα, κατόπιν ολοκλήρωσης της εκτέλεσης της αλληλούχισης. Γρήγορη συμβουλή Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα πρόσθετο (spike-in) 1% PhiX ως επιπλέον μάρτυρα για την παρακολούθηση της αντίδρασης αλληλούχισης. Ανατρέξτε στην τεκμηρίωση του Illumina για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το μάρτυρα PhiX. Λίστα αντιδραστηρίων Στοιχείο Φύλαξη Παρέχεται από την Φύσιγγα αντιδραστηρίου -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina Κυψελίδα ροής MiSeq 4 C Illumina Βιβλιοθήκη στα 2nM 4 C Βήμα 6 NaOH 1 N ή 2 N 20 C έως 25 C Χρήστης H 2 O υψηλής καθαρότητας κατάλληλο για εφαρμογές μοριακής βιολογίας Ικανότητα κιτ αντιδραστηρίων MiSeq 20 C έως 25 C Χρήστης Κιτ αντιδραστηρίων Illumina MiSeq Std 500 Cycle (MS ) Std 300 Cycle (MS ) Micro 300 Cycle (MS ) Nano 500 Cycle (MS ) Nano 300 Cycle (MS ) Χρόνος Ώρες 24/7 δείγματα ~39 24 ~24 24 ~19 24 ~28 12 ~17 6 Σελίδα 39 51

40 Πρωτόκολλο 7.1 Προετοιμάστε το MiSeq σύμφωνα με τα τυπικά πρωτόκολλα Illumina. 7.2 Παρασκευάστε μια αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 1 nm: Συνδυάστε 10 μl πρόσφατα παρασκευασμένου 0,2 N NaOH και 10 μl της αραιωμένης βιβλιοθήκης επιλεγμένου μεγέθους 2 nm σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 ml. Υποβάλετε σε περιδίνηση και σύντομη φυγοκέντριση. Επωάστε αυτή την αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 1 nm σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. 7.3 Παρασκευάστε μια αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 20 pm: Προσθέστε 980 μl ψυχρού HT1 στα 20 μl της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 1 nm. Υποβάλετε σε περιδίνηση και σύντομη φυγοκέντριση. 7.4 Παρασκευάστε μια αποδιαταγμένη βιβλιοθήκη 9 pm: Προσθέστε 550 μl ψυχρού HT1 και 450 μl της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 20 pm σε νέο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου χαμηλής δέσμευσης 1,5 ml. Υποβάλετε σε περιδίνηση και σύντομη φυγοκέντριση. 7.5 Μεταφέρετε 600 μl της αποδιαταγμένης βιβλιοθήκης 9 pm στο δοχείο φόρτωσης δειγμάτων της φύσιγγας αντιδραστηρίου του MiSeq. Γρήγορη συμβουλή Συνιστάται η χρήση του παρεχόμενου βιβλίου εργασίας για τη δημιουργία του φύλλου δείγματος που απαιτείται από το Miseq. Σελίδα 40 51

41 Βήμα 8 Ανάλυση των δεδομένων αλληλούχισης HLA Το Illumina MiSeq θα υποβάλλει σε επεξεργασία την ομαδοποιημένη βιβλιοθήκη 9 pm και θα δημιουργήσει δεδομένα αλληλούχισης ως αρχεία fastq. Ανατρέξτε στο εγχειρίδιο του HLA Twin για βοήθεια, όσον αφορά στη σωστή εγκατάσταση του HLA Twin, όπως και για πληροφορίες σχετικά με την ερμηνεία της ανάλυσης προσδιορισμού γονοτύπου των δεδομένων αλληλούχισης. Για την εφαρμογή του αυτοματοποιημένου πρωτοκόλλου και των θεμάτων που σχετίζονται με την εγκατάσταση ή ανάλυση δεδομένων, επικοινωνήστε με τη διεύθυνση support@omixon.com. Αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο Ρύθμιση και διαμόρφωση IT 1. Εγκαταστήστε το HLA Twin Server στο Διακομιστή. Εγκαταστήστε το HLA Twin Client σε υπολογιστή-πελάτη. Στο διακομιστή μπορούν να συνδεθούν περισσότερα από ένα HLA Twin Client. Επικοινωνήστε με την Υποστήριξη της Omixon (support@omixon.com) για εξατομικευμένες οδηγίες εγκατάστασης για αυτοματοποίηση. Πρωτόκολλο ανά ανάλυση 1. Εκκινήστε το HLA Twin Client και συνδεθείτε. 2. Τα δεδομένα έχουν ήδη υποβληθεί ή υποβάλλονται σε επεξεργασία. Ελέγξτε τα αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα φωτεινών σηματοδοτών στο HLA Twin. 3. Εξαγάγετε τα αποτελέσματα προσδιορισμού γονοτύπου ή/και τις συναινετικές αλληλουχίες ανάλογα με τις απαιτήσεις. Μη αυτόματο πρωτόκολλο διακομιστή Ρύθμιση και διαμόρφωση IT Εγκαταστήστε το HLA Twin Server στο Διακομιστή. Εγκαταστήστε το HLA Twin Client σε υπολογιστή-πελάτη. Πρωτόκολλο ανά ανάλυση Εκκινήστε το HLA Twin Client και συνδεθείτε. Επιλέξτε τα δεδομένα MiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίηση Holotype HLA. Μόλις ολοκληρωθεί η τυποποίηση Holotype HLA, ελέγξτε τα αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα φωτεινών σηματοδοτών στο HLA Twin. Εξαγάγετε τα αποτελέσματα προσδιορισμού γονοτύπου ή/και τις συναινετικές αλληλουχίες ανάλογα με τις απαιτήσεις. Σελίδα 41 51

42 Μη αυτόματο πρωτόκολλο υπολογιστή Ρύθμιση και διαμόρφωση IT Εγκαταστήστε το HLA Twin Desktop. Πρωτόκολλο ανά ανάλυση 6 Εκκινήστε το HLA Twin και συνδεθείτε. 7 Επιλέξτε τα δεδομένα MiSeq σε μορφή fastq ή fastq.gz και ξεκινήστε την τυποποίηση Holotype HLA. 8 Μόλις ολοκληρωθεί η τυποποίηση Holotype HLA, ελέγξτε τα αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας το σύστημα φωτεινών σηματοδοτών στο HLA Twin. 9 Εξαγάγετε τα αποτελέσματα προσδιορισμού γονοτύπου ή/και τις συναινετικές αλληλουχίες ανάλογα με τις απαιτήσεις. Σελίδα 42 51

43 Συμπληρωματικές εικόνες Παράδειγμα πλάκας για την πλάκα αμπλικονίων, πλάκα ενίσχυσης, πλάκα αραίωσης, πλάκα ποσοτικού προσδιορισμού αμπλικονίων (για ένα γενετικό τόπο) και πλάκα αντίδρασης Παράδειγμαπλάκας ποσοτικού προσδιορισμού προτύπων Σελίδα 43 51

44 Παράδειγμα πλάκας qpcr ποσοτικού προσδιορισμού βιβλιοθήκης KAPA Σελίδα 44 51