Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας Τµήµα Ιατρικής Πρόγραµµα µεταπτυχιακών σπουδών «Κλινικές εφαρµογές Μοριακής Ιατρικής»

Transcript

1 Πανεπιστήµιο Θεσσαλίας Τµήµα Ιατρικής Πρόγραµµα µεταπτυχιακών σπουδών «Κλινικές εφαρµογές Μοριακής Ιατρικής» ΧΥΜΙΚΗ ΑΝΟΣΙΑ ΕΝΑΝΤΙ ΤΩΝ ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΚΝΣ ΣΤΗΝ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΑΥΤΟΑΝΟΣΗ ΕΓΚΕΦΑΛΟΜΥΕΛΙΤΙ Α ιπλωµατική εργασία της φοιτήτριας Κεσίδου Ευαγγελίας Τριµελής Επιτροπή: Νικόλαος Γρηγοριάδης, Αναπληρωτής Καθηγητής Νευρολογίας, ΑΠΘ Γεώργιος Χατζηγεωργίου, Αναπληρωτής Καθηγητής Νευρολογίας,ΠΘ Αναστάσιος Γερµενής, Καθηγητής Ανοσολογίας, ΠΘ ΛΑΡΙΣΑ

2 Η παρούσα διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε στο εργαστήριο Πειραµατικής Νευρολογίας και Νευροανοσολογίας της Β Νευρολογικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κατά τη διάρκεια του ακαδηµαϊκού έτους Επιθυµώ να ευχαριστήσω θερµά τον κύριο Γρηγοριάδη, Αναπληρωτή Καθηγητή Νευρολογίας ΑΠΘ, καταρχάς διότι µου προσέφερε τη δυνατότητα να εκπονήσω αυτήν την εργασία, καθώς και για την αµέριστη εµπιστοσύνη, καθοδήγηση και βοήθεια που µου προσέφερε κατά τη διάρκεια παραµονής µου στο εργαστήριο. Επίσης, ευχαριστώ ιδιαιτέρως τον κύριο Χατζηγεωργίου, Αναπληρωτή Καθηγητή Νευρολογίας ΠΘ, για τη βοήθεια και την εµπιστοσύνη που µου έδειξε για την ανάθεση της διπλωµατικής εργασίας, καθώς και τον κύριο Γερµενή, Καθηγητή Ανοσολογίας ΠΘ. Ευχαριστίες θα ήθελα επίσης να αποδώσω στον κύριο Σίµο, Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχηµείας και τον κύριο Μυλωνή, Λέκτορα Βιοχηµείας ΠΘ για τις πολύτιµες συµβουλές και παρατηρήσεις στο πειραµατικό σκέλος της εργασίας. Θερµές ευχαριστίες θέλω να απευθύνω σε όλα τα µέλη του εργαστηρίου Πειραµατικής Νευρολογίας και Νευροανοσολογίας. Πιο συγκεκριµένα ευχαριστώ την Όλγα Τουλούµη, Τεχνολόγο Ιατρικών Εργαστηρίων και την Κυριακή Νεφέλη Πουλατσίδου, Μοριακή Βιολόγο και υποψήφια ιδάκτωρα του ΠΘ που µε συµβούλευαν, καθοδηγούσαν και συνέβαλαν αµέριστα στην ολοκλήρωση του πειράµατος. Επίσης, τη βιολόγο και διδάκτωρ Ρόζα Λαγουδάκη, τους διδάκτορες ιατρούς Αθανάσιο Λουρµπόπουλο και Ελένη Πολυζωίδου, το Βιοχηµικό και υποψήφιο ιδάκτωρα ΑΠΘ Πασχάλη Θεοτόκη, και την Τεχνολόγο Ιατρικών Εργαστηρίων Ευαγγελία Νουσιοπούλου, τη Βιοτεχνολόγο και υποψήφια ιδάκτωρα του Π.Ι. Ευαγγελία Κωφίδου, την υποψήφια ιδάκτωρα ιατρό Μαρίνα Μποζίκη και το συνεργάτη του εργαστηρίου ηµήτριο Μυστρίδη που µου προσέφεραν την ηθική και επιστηµονική συµπαράστασή τους καθόλη τη διάρκεια αυτή. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω τους φίλους µου, τον ιατρό Χαρίλαο Ταλουµτζή, τη βιολόγο και µεταπτυχιακή φοιτήτρια Σοφία Καρατασάκη και τη µαθηµατικό Ευαγγελία Τσιαµούρα για όλη τη συµπαράσταση τους και τις διορθώσεις τους στη συγγραφή της εργασίας. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη 5 Summary 6 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. οµή του Νευρικού Συστήµατος 9 1α. Κυτταρική οργάνωση του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος Αποµυελινωτικές παθήσεις του ΚΝΣ 14 2α. Πολλαπλή Σκλήρυνση 15 Επιδηµιολογία Γενετικοί παράγοντες Ταξινόµηση- Κλινική Εικόνα Παθοφυσιολογία 3. Πειραµατικά Μοντέλα Πολλαπλής Σκλήρυνσης 21 3α. Πειραµατική Αυτοάνοση Εγκεφαλοµυελίτιδα (ΠΑΕ) 22 Ταξινόµηση Κλινική Εικόνα Παθοφυσιολογία 4. Νευρογένεση και Γλοιογένεση του ΚΝΣ στα σπονδυλωτά 26 Στελεχιαία Προγονικά Κύτταρα (ΣΠΚ) του ΚΝΣ Υποκοιλιακή Ζώνη (ΥΚΖ) 5. Ολιγοδενδροκύτταρα και Μυελίνη Ο ρόλος των ΣΠΚ στην ΠΑΕ και την ΠΣ Σκοπός εργασίας 38 3

4 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8. Πειραµατόζωα Σχεδιασµός Πειραµατικού Πρωτοκόλλου 40 9α. Επαγωγή Πειραµατικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλοµυελίτιδας 41 9β. Κλινική παρακολούθηση των πειραµατοζώων 42 9γ. Θυσίες πειραµατοζώων 44 9γ1. Θυσία µε διακαρδιακή διήθηση Σκήνωση και µικροτόµηση ιστών Ανοσοϊστοχηµικές χρώσεις ιπλός Ανοσοφθορισµός Μικροσκοπική παρατήρηση Καλλιέργεια Στελεχιαίων Προγονικών Κυττάρων του ΚΝΣ από µύες Στύπωµα κατά Western (Western blotting) Στατιστική Ανάλυση Αποτελέσµατα Αποτελέσµατα Στυπώµατος κατά Western Παθολογοανατοµικά αποτελέσµατα αΑποτελέσµατα Ανοσοϊστοχηµείας και Μετρήσεις β Αποτελέσµατα Ανοσοφθορισµού Συζήτηση 69 Βιβλιογραφία 74 4

5 Περίληψη H Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) είναι µια χρόνια, φλεγµονώδης, αποµυελινωτική νόσος του ΚΝΣ µε αυτοάνοσο χαρακτήρα. Παρόλο που είναι ευρέως γνωστά πολλά στοιχεία της παθοφυσιολογίας της, παραµένει ακόµα αγνώστου αιτιολογίας νόσος. Υπάρχουν συγκεκριµένα πειραµατικά µοντέλα που προσοµοιάζουν τη ΠΣ. Μεταξύ αυτών που ανταποκρίνονται στην αυτοάνοση παθογένεια της νόσου είναι εκείνο της Πειραµατικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλοµυελίτιδας (ΠΑΕ). Η ΠΣ θεωρείται κυρίως διαµεσολαβούµενη από τα Τ-λεµφοκύτταρα νόσος, αλλά από νεότερα δεδοµένα έχει βρεθεί ότι Β κύτταρα και αυτοαντισώµατα συµβάλλουν στην παθογένειά της. Αυτή η ανοσιακή απάντηση στοχεύει διάφορα αντιγόνα, όπως πρωτεΐνες που εκφράζουν τα ολιγοδενδροκύτταρα ή πρωτεΐνες που συνθέτουν το έλυτρο µυελίνης. Η γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOG) αποτελεί έναν σηµαντικό στόχο καθώς βρίσκεται στην εξωτερική επιφάνεια του ελύτρου µυελίνης και διαθέτει ισχυρούς αντιγονικούς επιτόπους ικανούς να διεγείρουν ανοσιακή απάντηση, στοιχείο που επαληθεύεται και από την MOG-επαγόµενη ΠΑΕ. Στην παρούσα εργασία µελετήθηκε η χυµική ανοσία στην ΠΑΕ όπως η ενδεχόµενη παρουσία κυκλοφορούντων αυτοαντισωµάτων τα οποία επάγονται από την ανοσιακή απάντηση έναντι της MOG. Πιο ειδικά, εξετάσθηκε το ενδεχόµενο τα αντισώµατα που ανιχνεύονται στον ορό των πειραµατοζώων µε MOG-επαγόµενη ΠΑΕ, να δείχνουν κάποια συγγένεια προς στελεχιαία προγονικά κύτταρα (ΣΠΚ) του ΚΝΣ, στην υποκοιλιακή περιοχή. Η πρώτη ένδειξη για την παρουσία αντισωµάτων στον ορό των πειραµατοζώων µε ΠΑΕ διαπιστώθηκε µε ανάλυση κατά Western σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα ΣΠΚ του ΚΝΣ και φυσιολογικού νωτιαίου µυελού. Για την εντόπιση των θέσεων του ΚΝΣ στις οποίες τα κυκλοφορούντα αντισώµατα στον ορό ΠΑΕ µπορεί να εµφανίζουν συγγένεια, πραγµατοποιήθηκε χρώση ανοσοϊστοχηµείας φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου ποντικών, τριών διαφορετικών ηλικιών (νεογνά, ενδιάµεσης ηλικίας, ενήλικα). Ως πρώτα αντισώµατα χρησιµοποιήθηκαν πολυκλωνικοί αντιοροί από τρεις οµάδες 5

6 πειραµατοζώων (φυσιολογικοί µάρτυρες, ανοσοποιηµένα ποντίκια µε CFA,και ποντίκια µε MOG-ΠΑΕ). Ο πολυκλωνικός αντιορός ΜOG έδειξε συγγένεια σε δοµές του εγκεφάλου στα ενήλικα πειραµατόζωα µε στατιστικά σηµαντική διαφορά σε σχέση µε τα νεογνά και ενδιάµεσης ηλικίας ζώα. Αναφορικά µε την εκλεκτικότητα σύνδεσής τους µε τα ΣΠΚ, διενεργήθη διπλός ανοσοφθορισµός τοµών υποκοιλιακής ζώνης µε αντιορό ΜOG και µε anti-brdu που κατέδειξε τη σύνδεσή τους στα κύτταρα αυτά και χρησιµοποιήθηκε κεκαθαρµένο αντίσωµα anti-mog (R&D) ως µάρτυρας. Το ενδιαφέρον εύρηµα της παρούσας µελέτης είναι ότι η ενεργοποίηση του ανοσιακού συστήµατος έναντι της MOG προκαλεί την παραγωγή αντισωµάτων επιπλέον των σχετιζόµενων άµεσα µε το συγκεκριµένο αντιγόνο. Τα αντισώµατα αυτά φαίνεται να αναγνωρίζουν επιτόπους οι οποίοι εκφράζονται στα ΣΠΚ και που είναι άλλοι από την MOG καθώς η τελευταία δεν εκφράζεται στα συγκεκριµένα κύτταρα. Ο ρόλος των αυτοαντισωµάτων στην ΠΑΕ, όπως άλλωστε και η σηµασία τους στην ΠΣ, είναι αµφιλεγόµενος και χρήζει περαιτέρω έρευνας. Summary Multiple sclerosis (MS) is a chronic, inflammatory, demyelinating disease of the CNS with an autoimmune character. Although many aspects of the pathophysiology are widely known, the main cause remains unexplained. Specific experimental models may simulate MS, with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) being the most successful. MS is considered a T-cell mediated disease, but recent data point that B cells and autoantibodies may contribute to the pathogenesis of the disease. This immune response targets against various antigens, like proteins expressed by oligodendrocytes or proteins that consist the myelin sheath. The myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a key target, as it is located on the outer surface of the myelin sheath and has strong antigenic epitopes able to stimulate immune response, as verified by the MOG-induced EAE model. In this study we examined the humoral immunity in EAE (autoantibodies against MOG) and their potential to target CNS progenitor cells (NPCs) in the 6

7 subventricular zone. We therefore performed Western blotting using polyclonal antisera collected from three groups of animals (NAIVE, CFA, MOG + CFA- EAE) as primary antibodies and total protein extract from NPCs and normal spinal cord as substrates. Our analysis indicated specific binding sites. In order to identify serum Ab specific binding site(s) in the CNS, immunohistochemistry where the same polyclonal antisera were used as primary antibodies for staining sections of normal mouse brain of three different ages (neonates, postnates, adults). Commercially available Αnti-MOG (R & D) was used as control. Τhe polyclonal MOG-EAE-induced antiserum exhibited specific binding sites in adult CNS with statistically significant difference compared to neonates and postnates. Double immunofluorescence with MOG- EAE antiserum and anti-brdu was performed and indicated affinity to NPCs. Interestingly enough, the same BrdU positive NPCs did not exhibit any affinity for commercially available anti-mog (R&D), thus indicating that as expected, these cells did not express MOG antigen. Consequently, in the sera of MOG induced EAE animals ab(s) specific for NPC antigens are also present. The role of autoantibodies both in EAE and in MS, remains controversial and requires further research. 7

8 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 8

9 1. οµή του Νευρικού Συστήµατος Η εξέλιξη των ειδών χάρισε στον άνθρωπο το πιο πολύπλοκο και µυστηριώδες νευρικό σύστηµα στη φύση. Αυτό διακρίνεται στο Κεντρικό Νευρικό Σύστηµα (ΚΝΣ) και στο Περιφερικό Νευρικό Σύστηµα (ΠΝΣ). Το κεντρικό νευρικό σύστηµα, το οποίο είναι αµφίπλευρο και συµµετρικό, υποδιαιρείται στον εγκέφαλο και στον νωτιαίο µυελό. Ο εγκέφαλος εντοπίζεται µέσα στην κρανιακή κοιλότητα και αποτελεί το σπουδαιότερο και καλύτερα προστατευµένο όργανο του ανθρωπίνου σώµατος. ιακρίνεται στον α)πρόσθιο εγκέφαλο, που αποτελείται από το διάµεσο (θάλαµος και υποθάλαµος) και τον τελικό εγκέφαλο, ο οποίος σχηµατίζει τα δύο εγκεφαλικά ηµισφαίρια, β) τον µέσο εγκέφαλο και γ) τον ροµβοειδή εγκέφαλο, που τον απαρτίζουν ο προµήκης µυελός, η γέφυρα και η παρεγκεφαλίδα (Εικόνα 1) [1]. Το κατώτερο τµήµα του κεντρικού νευρικού συστήµατος, ο νωτιαίος µυελός, αποτελεί τη θέση των απλών αντανακλαστικών και ελέγχει τις κινήσεις των άκρων και του κορµού. Βρίσκεται µέσα στο σπονδυλικό σωλήνα, περιβαλλόµενος από εγκεφαλονωτιαίο υγρό. ιακρίνεται σε αυχενική, θωρακική, οσφυϊκή και ιερή µοίρα και συνεχίζεται προς τα άνω στον προµήκη µυελό (Εικόνα 1). Σε διατοµές εγκεφάλου φαίνεται κεντρικά η λευκή ουσία και εξωτερικά η φαιά, σε αντίθεση µε το νωτιαίο µυελό όπου η φαιά ουσία ανιχνεύεται κεντρικά και περιβάλλεται από τη λευκή. Η φαιά ουσία αποτελείται από συναθροίσεις νευρικών κυττάρων, ενώ η λευκή ουσία συνίσταται από νευρικές ίνες, δηλαδή αποφυάδες των νευρικών κυττάρων, οι οποίες φαίνονται υπόλευκες καθώς περιβάλλονται από µυέλινα έλυτρα. Το περιφερικό νευρικό σύστηµα παρέχει ένα σηµείο επαφής µεταξύ του κεντρικού νευρικού συστήµατος και του περιβάλλοντος. Αποτελείται από νεύρα και γάγγλια, που βρίσκονται εκτός του εγκεφάλου και νωτιαίου µυελού. Περιλαµβάνει το αισθητικό µέρος, που αποτελείται από αισθητικά υποδεκτικά όργανα και πρωτοταγείς προσαγωγούς νευρώνες, το κινητικό µέρος, που περιλαµβάνει σωµατικές κινητικές ίνες και αυτόνοµες κινητικές ίνες. Οι αυτόνοµοι νευρώνες διακρίνονται σε συµπαθητικούς, παρασυµπαθητικούς και εντερικούς νευρώνες. 9

10 Εικόνα 1. Ανατοµικές περιοχές εγκεφάλου και µοίρες του νωτιαίου µυελού. Netter. Atlas of Human Anatomy 1 α. Κυτταρική οργάνωση του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος Το Νευρικό Σύστηµα είναι ένα δίκτυο επικοινωνίας που δίνει τη δυνατότητα σε κάθε οργανισµό να αλληλεπιδρά µε το περιβάλλον του. Αυτό το δίκτυο επικοινωνίας αποτελείται από εξειδικευµένα νευρικά κύτταρα, τους νευρώνες, που αποτελούν τη βασική λειτουργική µονάδα του νευρικού συστήµατος. Επίσης, υπάρχει και µια ακόµη κατηγορία κυττάρων, τα νευρογλοιακά κύτταρα (νευρογλοία), που εξασφαλίζουν την επιβίωση των νευρώνων. Στον ανθρώπινο εγκέφαλο υπάρχουν δέκα φορές περισσότερα νευρογλοιακά κύτταρα σε σχέση µε τους νευρώνες. Αξίζει να αναφερθεί ότι τα κύτταρα του νευρικού συστήµατος εµφανίζουν τη µεγαλύτερη ποικιλοµορφία από οποιαδήποτε κύτταρα απαντούν σε άλλο µέρος του σώµατος. Ο νευρώνας αποτελείται από τρεις διακριτές περιοχές, το κυτταρικό σώµα, τους δενδρίτες και τον νευράξονα (Εικόνα 2). Το κυτταρικό σώµα είναι το 10

11 τροφικό κέντρο του κυττάρου και οι αποφυάδες που αποκόπτονται από αυτό εκφυλίζονται. ιαθέτει πυρήνα, πυρηνίσκο και βιοσυνθετικό εξοπλισµό για την παραγωγή εξειδικευµένων ουσιών. Προεκτάσεις του κυτταρικού σώµατος είναι οι δενδρίτες και ο νευράξονας. Οι δενδρίτες µε τις διακλαδώσεις τους επαυξάνουν την εξωτερική επιφάνεια του κυττάρου και αποτελούν θέσεις υποδοχής σηµάτων και από άλλα νευρικά κύτταρα. Ο νευρίτης ή νευράξονας εµφανίζει στο αρχικό του τµήµα τον εκφυτικό κώνο, µια περιοχή του κυτταρικού σώµατος. Μπορεί να περιβάλλεται από έλυτρο µυελίνης ή να είναι γυµνός. Στο κεντρικό νευρικό σύστηµα οι εµµύελοι νευράξονες περιβάλλονται από έλυτρο ολιγοδενδροκυττάρων, ενώ κάποιοι νευράξονες είναι αµύελοι. Στο περιφερικό νευρικό σύστηµα οι νευράξονες περιβάλλονται από κύτταρα Schwann. Έχουν ποικίλο µήκος από 1mm έως και 1 m και διάµετρο µεταξύ 0,2 και 20 µm. Κύριος ρόλος τους είναι η µεταβίβαση του ερεθίσµατος σε άλλα κύτταρα (µυϊκά ή νευρικά). Τα νευρογλοιακά κύτταρα (ή γλοιακά κύτταρα) επιτελούν διάφορες λειτουργίες, όπως η παροχή στήριξης στους νευρώνες, συµµετοχή στη δηµιουργία του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού, παραγωγή του µονωτικού ελύτρου µυελίνης. Γενικότερα παρουσιάζει όλες τις λειτουργίες του συνδετικού ιστού. ιακρίνονται δύο διαφορετικοί τύποι νευρογλοίας, η µακρογλοία και η µικρογλοία. Στην µακρογλοία του ΚΝΣ ανήκουν τα αστροκύτταρα, τα ολιγοδενδροκύτταρα, τα επενδυµατικά κύτταρα και η ακτινωτή γλοία, ενώ στη µακρογλοία του ΠΝΣ ανήκουν τα δορυφόρα κύτταρα, τα κύτταρα Schwann, και κύτταρα γλοίας του εντέρου. Τα αστροκύτταρα (αστρογλοία) έχουν ένα µεγάλο ωχρό πυρήνα και πολλές αποφυάδες (ποδίσκοι) που παίρνουν χαρακτηριστική αστεροειδή διάταξη γύρω από το κύτταρο. Οι αποφυάδες εφάπτονται των τριχοειδών αγγείων και του συνδετικού ιστού στην επιφάνεια του ΚΝΣ. Έχουν διττό ρόλο καθώς παρέχουν µηχανική στήριξη και θρεπτική λειτουργία στους νευρώνες. Παρόµοιο ρόλο εµφανίζουν τα δορυφόρα κύτταρα στο ΠΝΣ, καθώς περιβάλλουν τους νευρώνες σε συµπαθητικά και παρασυµπαθητικά γάγγλια και ρυθµίζουν το µικροπεριβάλλον τους. Τα ολιγοδενδροκύτταρα (ολιγοδενδρογλοία) έχουν µικρότερο και σκοτεινότερο πυρήνα και λίγες αναπόσχιστες αποφυάδες. Τα κύτταρα Schwann 11

12 και τα ολιγοδενδροκύτταρα επιτελούν τη σπουδαία λειτουργία της µόνωσης νευραξόνων σχηµατίζοντας το έλυτρο µυελίνης. Η µυελίνη αποτελείται από λιποπρωτεϊνικές κυτταρικές µεµβράνες των κυττάρων Schwann και της ολιγοδενδρογλοίας. Το καθαρό της βάρος είναι περίπου 80% λιπίδια και 20-30% πρωτεΐνες. Οι πιο βασικές πρωτεΐνες που την απαρτίζουν είναι η βασική πρωτεΐνη της µυελίνης (ΜΒΡ), η γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOG) και η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της µυελίνης (PLP). Εκτός από τη µονωτική προστασία, εξυπηρετεί την ταχεία αγωγή των πληροφοριών µέσω νευρικών ώσεων. Η µυελίνη µεταβάλλει τις ηλεκτρικές ιδιότητες της νευρική ίνας και αυξάνει εντυπωσιακά την ταχύτητα αγωγής της. Το έλυτρο της µυελίνης περιοδικά διακόπτεται, αφήνοντας κενά διαστήµατα, γνωστά ως κόµβοι Ranvier. Στα σηµεία αυτά µπορούν µόνο να αναγεννώνται τα δυναµικά ενεργείας. Αξίζει να σηµειωθεί ότι τα ολιγοδενδροκύτταρα µπορούν να περιβάλλουν αρκετούς νευράξονες, ενώ τα κύτταρα Schwann περιβάλλουν µόνο ένα νευράξονα. Τα επενδυµατικά κύτταρα σχηµατίζουν ένα επιθήλιο που διαχωρίζει το ΚΝΣ από τις κοιλίες. Στις κοιλότητες αυτές κυκλοφορεί εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ). Αυτό εκκρίνεται από ειδικά επενδυµατικά κύτταρα των χοριοειδών πλεγµάτων, που βρίσκονται µέσα στις κοιλίες. Επίσης φαίνεται να δρουν ως στελεχιαία κύτταρα. Η ακτινωτή γλοία λειτουργεί ως πρόδροµα νευρωνικά κύτταρα και ως σκαλωσιά πάνω στην οποία µεταναστεύουν νέοι νευρώνες. Η εντερική γλοία εντοπίζεται στα γάγγλια του πεπτικού συστήµατος. Έχει διάφορες λειτουργίες, κάποιες κυρίως σχετίζονται µε τη διατήρηση της οµοιόστασης. Στη δεύτερη κατηγορία της νευρογλοίας, στη µικρογλοία ανήκουν κύτταρα µε ωοειδή πυρήνα και παχιές, βραχείες και πολύκλαδες αποφυάδες. Είναι εξειδικευµένα µακροφάγα µε ικανότητα φαγοκυττάρωσης, που αποµακρύνουν προιόντα κυτταρικής βλάβης από το ΚΝΣ. Προέρχονται από πρόδροµα αιµοποιητικά κύτταρα και έχει βρεθεί ότι εµφανίζουν και αντιγονοπαρουσιαστικό ρόλο [2]. (Merritt's Textbook of Neurology) 12

13 Εικόνα 2. οµή νευρώνα του ΚΝΣ. National Institute of Neurological Disorders and Stroke,

14 2. Αποµυελινωτικές παθήσεις του ΚΝΣ Οι παθήσεις που αφορούν τη µυελίνη του κεντρικού νευρικού συστήµατος κατηγοριοποιούνται σε αποµυελινωτικές (επίκτητες, φλεγµονώδεις) και δυσµυελινωτικές (παθολογικός σχηµατισµός µυελίνης, συνήθως γενετικής αιτιολογίας) παθήσεις (Πίνακας 1). Η πιο συχνή αποµυελινωτική νόσος είναι η Πολλαπλή Σκλήρυνση (ΠΣ) ή Σκλήρυνση κατά Πλάκας. Αποµυελινωτικές Παθήσεις Αυτοάνοσες Πολλαπλή Σκλήρυνση Οξεία ιάχυτη Εγκεφαλοµυελίτιδα Οξεία Αιµορραγική Λευκοεγκεφαλοπάθεια Λοιµώδεις Προοδευτική Πολυεστιακή Λευκοεγκεφαλοπάθεια Τοξικές/Μεταβολικές υσµυελινωτικές Παθήσεις Αδρενολευκοδυστροφία Μεταχρωµατική Λευκοδυστροφία Ν. Krabbe Ν. Alexander Ν. Canavan van Bogaert Ν. Pelizaeus-Merzbacher Φαινυλκετονουρία Μονοξείδιο του Άνθρακα Ανεπάρκεια Βιταµίνης Β12 ηλητηρίαση από Υδράργυρο Ν. Minamata Αµβλυοπία από Αλκοόλ/ Κάπνισµα Κεντρική γεφυρική µυελινόλυση (Οσµωτικό αποµυελινωτικό σύνδροµο) Σ. Marchiafava-Bignami Ν. Binswanger Υποξία, Ακτινοβόληση Αγγειακές Παθήσεις Πίνακας 1. Αποµυελινωτικές και υσµυελινωτικές παθήσεις του ΚΝΣ, UpToDate

15 2α. Πολλαπλή Σκλήρυνση Το 1868 ο Jean-Martin Charcot, γάλλος νευρολόγος, περιέγραψε την Πολλαπλή Σκλήρυνση ως µια ξεχωριστή ασθένεια, ονοµάζοντάς την Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (sclerose en plaques). Η Πολλαπλή Σκλήρυνση αποτελεί µία ετερογενή διαταραχή µε ποικίλα κλινικά και παθολογοανατοµικά γνωρίσµατα. Η φλεγµονή, η αποµυελίνωση και η αξονική εκφύλιση είναι τα κύρια γνωρίσµατα της νόσου [3]. Η αιτιολογία της παραµένει άγνωστη και η πιο ευρέως αποδεκτή θεωρία είναι ότι η νόσος ξεκινάει ως φλεγµονώδης αυτοάνοση διαταραχή, διαµεσολαβούµενη από αυτοαντιδρώντα λεµφοκύτταρα (κυρίως CD4+ Τ- λεµφοκύτταρα) [4]. Αργότερα, στην πορεία της νόσου κυριαρχεί η ενεργοποίηση της µικρογλοίας και επέρχεται χρόνια νευροεκφύλιση. Επιδηµιολογία Η νόσος εµφανίζεται περισσότερο στις γυναίκες µε αναλογία γυναίκες/άνδρες 2,3 [5]. Η µέση ηλικία εµφάνισης είναι µεταξύ 23 και 30 ετών, µε µικρότερη ηλικία εµφάνισης στις γυναίκες. Η επίπτωση και ο επιπολασµός της νόσου ποικίλει γεωγραφικά [6]. Περιοχές υψηλού επιπολασµού (>60 ασθενείς/ πληθυσµού) είναι η Ευρώπη, νότιος Καναδάς, βόρειες Πολιτείες της ΗΠΑ, Νέα Ζηλανδία και Αυστραλία (περιοχές όπου επικρατεί η λευκή φυλή). Σε περιοχές µε µεγαλύτερη ηλιοφάνεια ο επιπολασµός της ΠΣ είναι µικρότερος. Μία προτεινόµενη εξήγηση αφορά την προστατευτική δράση της ηλιακής ακτινοβολίας µέσω της ενεργοποίησης της βιταµίνης D [7]. Αυτό υποστηρίζεται και από παρατηρήσεις όπου η χορήγηση βιταµίνης D σε γυναίκες έδρασε προστατευτικά και ελάττωσε την επίπτωση της ΠΣ. Γενετικοί παράγοντες Στην παθογένεια της ΠΣ συµβάλλουν και γενετικοί παράγοντες. Η νόσος έχει συσχετιστεί µε αλληλόµορφα ΜΗC τάξης ΙΙ και πιο συγκεκριµένα µε τα αλληλόµορφο HLA-DRB1 [8]. Σε µελέτη γενετικής συσχέτισης της νόσου βρέθηκαν πολυµορφισµοί σε 2 γονίδια που κωδικοποιούν τις αλυσίδες IL2Rα και IL7Rα. Η πρώτη αλυσίδα έχει συσχετιστεί επίσης µε την παθογένεια του 15

16 τύπου Ι Σακχαρώδη ιαβήτη και της νόσου του Graves (αυτοάνοσες παθήσεις), γεγονός που ενισχύει την άποψη ότι αυτοάνοσοι µηχανισµοί εµπλέκονται στην παθογένεια της ΠΣ [9,10]. Ακόµα, σε µελέτες διζυγωτικών διδύµων, η πιθανότητα της εµφάνισης της νόσου είναι 3-5% (το ίδιο ποσοστό που ισχύει και για αδέρφια), ενώ σε µονοζυγωτικούς διδύµους το ποσοστό εµφάνισης της αυξάνεται στο 20-39% [11]. Ταξινόµηση- Κλινική Εικόνα Η Πολλαπλή Σκλήρυνση διακρίνεται στις εξής µορφές: 1. Υποτροπιάζουσα διαλείπουσα µορφή (RRMS), στην οποία ανήκει το 85-90% των περιπτώσεων. Χαρακτηρίζεται από υποτροπές και υφέσεις µε πιθανή εµφάνιση νευρολογικών επιπλοκών. ε σηµειώνεται πρόοδος της νόσου µεταξύ των υποτροπών, αλλά οι περισσότεροι ασθενείς µεταπίπτουν στη δεύτερη µορφή. 2. ευτεροπαθώς προϊούσα µορφή (SPMS), µε χαρακτηριστικό την πρόοδο της νόσου µετά από περίοδο µε εξάρσεις και υφέσεις. 3. Πρωτοπαθώς προϊούσα µορφή (PPMS), 10% των ασθενών κατά την οποία η νόσος είναι προοδευτική, χωρίς µεγάλες εξάρσεις και πρόσκαιρες περιόδους ελάχιστης βελτίωσης 4. Υποτροπιάζουσα προϊούσα µορφή (PRMS), όπου η νόσος είναι προοδευτική µε υποτροπές που συνοδεύονται από υφέσεις, αλλά µε πρόοδο της νόσου στα µεσοδιαστήµατα. Όσον αφορά την κλινική εικόνα ασθενών µε ΠΣ, δεν υπάρχει κάποιο χαρακτηριστικό που αποτελεί παθογνωµονικό στοιχείο. Οι ασθενείς εµφανίζουν βλάβες στο ΚΝΣ, µε χαρακτηριστικές αλλοιώσεις που απεικονίζονται στη µαγνητική τοµογραφία (MRI) εγκεφάλου ως εστίες αποµυελίνωσης (Eικόνα 4). Η εµφάνιση των βλαβών συνοδεύεται από συµπτώµατα που περιλαµβάνονται στον ακόλουθο πίνακα (Πίνακας 2) [12]: 16

17 Συµπτώµατα Γυναίκες(%) Άνδρες (%) Σύνολο(%) Αισθητικότητα άκρων Απώλεια όρασης Κινητικά Συµπτώµατα (υποξεία) ιπλωπία ιαταραχές Βάδισης Κινητικά Συµπτώµατα (οξεία) Προβλήµατα Ισορροπίας Αισθητικότητα Προσώπου Σηµείο Lhermitte Ίλιγγος Αταξία υσλειτουργία Κύστεως Οξεία εγκάρσια Μυελίτιδα Άλγος Άλλα Πίνακας 2. Συµπτωµατολογία ασθενών µε Πολλαπλή Σκλήρυνση. UpToDate

18 Παθοφυσιολογία H ΠΣ χαρακτηρίζεται από διαταραγµένες ανοσιακές αποκρίσεις έναντι αντιγόνων της µυελίνης και των ολιγοδενδροκυττάρων του ΚΝΣ, διαταραχή του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού (ΑΕΦ) και µετανάστευση ενεργοποιηµένων λεµφοκυττάρων, χυµοκινών και κυτοκινών από την περιφέρεια στο ΚΝΣ µε τελικό αποτέλεσµα την εµφάνιση αποµυελινωτικών πλακών και νευρολογικών συµπτωµάτων της νόσου. Πιο συγκεκριµένα έχει παρατηρηθεί ότι αυτοαντιδρώντα Τ λεµφοκύτταρα (CD4+ ή CD8+) παίζουν σηµαντικό ρόλο στην εξέλιξη των αποµυελινωτικών βλαβών, στρεφόµενα εναντίον αντιγόνων όπως η βασική πρωτεΐνη της µυελίνης, η γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων και η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της µυελίνης. Αυτοαντιδρώντα Τ-κύτταρα και µονοκύτταρα διέρχονται µέσω του ενδοθηλίου των εγκεφαλικών αγγείων (διαταραχή ΑΕΦ) και δρουν στο παρέγχυµα του ΚΝΣ [13]. Εκεί εκκρίνονται από Τh1-λεµφοκύτταρα προφλεγµονώδεις κυτοκίνες ( IFN-γ, TNF-α, IL-2, -15, -17 και -23) και εκφράζονται υποδοχείς χυµοκινών (CCR5 και CXCR3). Ιδιαιτέρως στην παθογένεια της ΠΣ έχει ενοχοποιηθεί ο ρόλος των ιντερλευκινών -12, -17 και -23. Η ιντερλευκίνη 12 δίνει το έναυσµα για διαφοροποίηση των Τ-κυττάρων προς Th1 µε έκφραση του µεταγραφικού παράγοντα Τ-bet, ενώ παρουσία ιντερλευκίνης 4 τα Τ-λεµφοκύτταρα διαφοροποιούνται προς Th2 και εκφράζουν το µεταγραφικό παράγοντα GATA-3 [14]. Επίσης, η ιντερλευκίνη 17 που παράγεται από τα Th17 κύτταρα, έναν υποπληθυσµό των CD4+ κυττάρων, προάγει τη φλεγµονή µέσω διαταραχής του ΑΕΦ και ενισχύοντας τη µετανάστευση CD4+ Τ-κυττάρων µέσω του ενδοθηλίου (Εικόνα 3) [15]. H ιντερλευκίνη 6 και ο TGF-β προάγουν τη διαφοροποίηση των CD4+ προς Th17 κύτταρα, ενόσω η ιντερλευκίνη 23 διατηρεί αυτόν τον υποπληθυσµό. Αντιθέτως η ιντερλευκίνη 4 και η ιντερφερόνη β καταστέλλουν την παραγωγή της ιντερλευκίνης 17 [16]. Τα Th1 κύτταρα ενεργοποιούνται περαιτέρω µε κατάλληλη σύνδεσή του υποδοχέα τους µε αντιγόνα της επιφάνειας αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (αστροκύτταρα, µικρογλοία, µακροφάγα) καθώς και µε µόρια του Μείζονος Συµπλέγµατος Ιστοσυµβατότητας MHC τάξης ΙΙ. Εκκρίνουν εκ νέου προφλεγµονώδεις κυτοκίνες (IFN-γ και TNF-α) Th1 απάντηση ή εκκρίνουν 18

19 αντιφλεγµονώδεις κυτοκίνες (TGF-β, IL-4, IL-10)- Th2 απάντηση. Οι Τh1 κυτοκίνες µαζί µε τα κυτταροτοξικά CD8+ Τ-κύτταρα, ενεργοποιούν τη µικρογλοία/µακροφάγα προς καταστροφή του συµπλέγµατος ολιγοδενδροκυττάρων/µυελίνης. Εικόνα 3. Προτεινόµενος µηχανισµός αποµυελίνωσης µέσω ενεργοποίησης περιφερειακών Τ λεµφοκυττάρων έναντι της µυελίνης. Η ενεργοποιηµένη µικρογλοία συνεισφέρει στην καταστροφή του ιστού, Medscape, Neurology reviews and issues, Τα Β κύτταρα διαδραµατίζουν και αυτά σηµαντικό ρόλο στην παθογένεια και εξέλιξη της νόσου. Φυσιολογικά αυτά δε µπορούν να διαπεράσουν τον ΑΕΦ, καθώς όµως στην ΠΣ παρατηρείται διαταραχή αυτού, τα Β-κύτταρα µαζί µε άλλα αντισώµατα και παράγοντες του συµπληρώµατος εισβάλουν στο ΚΝΣ. ιαφοροποιούνται από ενεργοποιηµένα Τ- κύτταρα εναντίον αντιγόνων µυελίνης και παράγουν αντισώµατα έναντι των αντιγόνων αυτών. Παρατηρείται αυξηµένη σύνθεση ολιγοκλωνικών ανοσοσφαιρινών ΙgM και IgG στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ), απόδειξη ύπαρξης ενεργοποιηµένων κλώνων Β- λεµφοκυττάρων στο ΕΝΥ [17]. Η παθολογοανατοµική εικόνα της νόσου χαρακτηρίζεται από εστιακή αποµυελίνωση, παρουσία γλοιακής ουλής (αστροκυτταρική ουλή) και καταστροφή νευραξόνων [18]. Οι χαρακτηριστικές πλάκες αποµυελίνωσης (Εικόνα 4) δηµιουργούνται οπουδήποτε µέσα στη λευκή ουσία του ΚΝΣ, αλλά οι 19

20 πιο συχνά προσβαλλόµενες περιοχές είναι τα οπτικά νεύρα, το εγκεφαλικό στέλεχος, η παρεγκεφαλίδα και ο νωτιαίος µυελός. Σε αυτές παρατηρούνται φλεγµονώδεις διηθήσεις, κυρίως από µικρογλοία/µακροφάγα και λεµφοκύτταρα. Η βαρύτητα της αποµυελίνωσης εκτιµάται από τη σχετική διατήρηση (δυνατότητα επαναµυελίνωσης) ή την καταστροφή των ολιγοδενδροκυττάρων (αδυναµία επαναµυελίνωσης). Εικόνα 4. Αριστερά: Παθολογοανατοµική απεικόνιση (LFB) πλάκας στο εγκεφαλικό παρέγχυµα ασθενούς µε ΠΣ(Μπλε χρώµα µυελίνη, Κόκκινο χρώµα πυρήνες). εξιά: MRI απεικόνιση πλάκας στον εγκέφαλο ασθενούς µε ΠΣ. Εργαστήριο Νευροπαθολογίας και Νευροανοσολογίας Β Νευρολογικής κλινικής, ΑΧΕΠΑ. Η παθολογοανατοµική εικόνα της νόσου διακρίθηκε σε 4 πρότυπα µε βάση ένα ευρύ φάσµα ανοσολογικών και νευροβιολογικών δεικτών, που είναι οι εξής:α) βαθµός απώλειας µυελίνης, β) κατανοµή και έκταση των πλακών, γ) καταστροφή ολιγοδενδροκυττάρων και δ) βαθµός ενεργοποίησης συµπληρώµατος. Τα πρότυπα Ι και ΙΙ εκδηλώνουν οµοιότητες µε αυτοάνοση εγκεφαλοµυελίτιδα: διαµεσολαβούµενη από Τ-κύτταρα (πρότυπο Ι) και διαµεσολαβούµενη από Τ- κύτταρα και αντισώµατα (πρότυπο ΙΙ). Τα άλλα δύο πρότυπα ΙΙΙ και ΙV, είναι ενδεικτικά πρωταρχικής δυστροφίας των ολιγοδενδροκυττάρων, οµοιάζουσα µε αποµυελίνωση επαγόµενη από ιούς ή τοξίνες και όχι αυτοάνοση. Αυτή η παθολογοανατοµική ετερογένεια των πλακών µπορεί να έχει ουσιώδη σηµασία για τη διάγνωση και θεραπεία της νόσου [19]. 20

21 3. Πειραµατικά Μοντέλα Πολλαπλής Σκλήρυνσης Η ακριβής προσοµοίωση της Πολλαπλής Σκλήρυνσης σε πειραµατικό µοντέλο δεν έχει επιτευχθεί, ωστόσο υπάρχουν διάφορα πειραµατικά µοντέλα που µιµούνται χαρακτηριστικά της. Τα πειραµατικά µοντέλα αποµυελίνωσης στο ΚΝΣ επάγονται µε την χορήγηση τοξικών ουσιών, ανοσολογικών στοιχείων και στελέχη ιών και έτσι µπορούν να διακριθούν σε τρεις γενικές κατηγορίες: α) προκαλούµενη από τη χορήγηση µυελινοτοξικών ουσιών (cuprizone, ethidium bromide, lysolecithin), β) προκαλούµενη από αντιγόνα µυελίνης (ΜBP,MOG,PLP),πειραµατική αυτοάνοση εγκεφαλοµυελίτιδα (ΠΑΕ) και γ)προκαλούµενη από ιογενή λοίµωξη (ιός corona και στελέχη του ιού Theiler) [20] (Πίνακας 3). Το µοντέλο της Πειραµατικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλοµυελίτιδας (ΠΑΕ) αποτελεί ίσως το πιο αντιπροσωπευτικό και αξιόπιστο εργαλείο µελέτης των φλεγµονωδών αποµυελινωτικών παθήσεων του ΚΝΣ [21]. Πίνακας 3. Τα πιο πρόσφατα διαδεδοµένα µοντέλα ΠΑΕ (CFA:Complete Freund s Adjuvant, IFA:Incomplete Freund s Adjuvant, PT:Pertussis Toxin) Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, Robert Weissert. 21

22 3α. Πειραµατική Αυτοάνοση Εγκεφαλοµυελίτιδα (ΠΑΕ) Η ΠΑΕ εµφανίζεται µε εξάρσεις και υφέσεις, η καταστροφή του ελύτρου µυελίνης µεσολαβείται από Τ-λεµφοκύτταρα και µακροφάγα και παρατηρείται απώλεια της αγωγιµότητας των αξόνων µε εγκατάσταση νευρολογικών ελλειµµάτων και παράλυση [22]. Είναι τεχνητά προκαλούµενη σε διάφορα είδη πειραµατοζώων (Mus musculus, Rattus norvegicus, Callithrix jacchus, Cavia porcellus) και µπορεί να αναπαράγει πολλά κλινικά, παθολογικά και ανοσολογικά χαρακτηριστικά της ΠΣ. Ταξινόµηση Η ΠΑΕ διακρίνεται βάση της κλινικής πορείας και νευροπαθολογίας σε δύο κύριους κλινικούς τύπους (οξεία και χρόνια ΠΑΕ) καθώς και σε δύο τύπους ανάλογα µε τον τρόπο επαγωγής (Ενεργητική και Παθητική ή Εκ Μεταφοράς). Η οξεία ΠΑΕ είναι µονοφασική νόσος που προσοµοιάζει µε την οξεία διάσπαρτη εγκεφαλοµυελίτιδα στον άνθρωπο. Η κορύφωση της νόσου εµφανίζεται σε διάστηµα 5 ηµερών (Παθητική ΠΑΕ) ή 10 ηµερών (Ενεργητική ΠΑΕ) και συνήθως ακολουθείται από αυτόµατη ανάρρωση, αλλά ενδέχεται να ακολουθήσει βαριά πορεία µε επακόλουθο θάνατο του πειραµατοζώου [23]. Η χρόνια ΠΑΕ εκδηλώνεται είτε µε µία χρόνια προϊούσα/σταθερή πορεία είτε ως υποτροπιάζουσα νόσος µε εξάρσεις και υφέσεις και οµοιάζει µε την ανθρώπινη νόσο της ΠΣ. Το µοντέλο της MOG-επαγόµενης ΠΑΕ (παρουσία του πεπτιδίου της MOG,MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK, το οποίο έχει αποδεχθεί να επιφέρει την υψηλότερη εγκεφαλιτιδογονικότητα,) αποτελεί βασικό µοντέλο χρόνιας ΠΑΕ στους µύες [24]. Η Ενεργητική ΠΑΕ συνίσταται στη χορήγηση µε εµβολιασµό µιας πρωτεΐνης της µυελίνης διαλυµένη σε γαλάκτωµα ανοσοενισχυτικής ουσίας σε συνδυασµό µε τοξίνη (pertussis) που αυξάνει τη διαπερατότητα του ΑΕΦ. Τα πειραµατόζωα παράγουν εαυτά ενεργά Τ-λεµφοκύτταρα έναντι του αντιγόνου (πρωτεΐνη µυελίνης) και µέσα σε χρονικό διάστηµα ηµερών εµφανίζουν τα πρώτα κλινικά συµπτώµατα. Η Παθητική ή Εκ Μεταφοράς ΠΑΕ προκαλείται µε την χορήγηση ήδη ενεργοποιηµένων έναντι της µυελίνης Τ-λεµφοκυττάρων που έχουν αποµονωθεί από ξεχωριστή οµάδα πειραµατοζώων (εµβολιασµένα µε µια 22

23 πρωτεΐνη της µυελίνης διαλυµένη σε γαλάκτωµα ανοσοενισχυτικής ουσίας) [25]. Τα πρωτόκολλα επαγωγής της νόσου διαφέρουν κυρίως στο αντιγόνο που χρησιµοποιείται (MOG ή πεπτίδιά της, MBP ή πεπτίδιά της, PLP ή οµογενοποίηµα ιστού από το ΚΝΣ), στον χρησιµοποιούµενο φορέα του αντιγόνου ή περιέκτη του (adjuvant), στις ποσότητες του αντιγόνο-περιέκτη που χρησιµοποιείται, στο χρονοδιάγραµµα εµβολιασµού και στην περιοχή ενοφθαλµισµού (πέλµα ή βάση ουράς). Κλινική Εικόνα Μετά από µία λανθάνουσα περίοδο που ακολουθεί την ενεργή ή παθητική ανοσοποίηση, τα πειραµατόζωα χάνουν βάρος και εµφανίζουν νευρολογικά σηµεία. Η απώλεια του βάρους συµβαίνει χαρακτηριστικά 1-2 ηµέρες προ της εµφάνισης των πρώτων κλινικών σηµείων της νόσου και αποτελεί ασφαλή ένδειξη επικείµενης έναρξης της ΠΑΕ. Η µέγιστη κλινική εικόνα αναπτύσσεται 3-4 ηµέρες µετά την έναρξη της νόσου και ανάλογα µε το µοντέλο µπορεί να ακολουθηθεί είτε από πλήρη ύφεση και ίαση των πειραµατοζώων (οξεία ΠΑΕ) είτε από µερική ύφεση και νέα έξαρση ή από σταθερή κλινική πορεία (χρόνια ΠΑΕ) [26]. Η κλινική εικόνα σε όλα τα µοντέλα τρωκτικών (µύες ή επίµυες) εκτιµάται και ποσοτικοποιείται µε βάση µία κλίµακα βαθµολόγησης από το «0» έως το «6» της κινητικότητας του πειραµατοζώου. Το «0» αντιστοιχεί σε φυσιολογικό πειραµατόζωο και το µέγιστο «6» σε θάνατο του πειραµατοζώου από τη νόσο [27]. Κλινική πορεία πειραµατοζώων µε ΠΑΕ µετά από επαγωγή µε a) MBP, b) PLP, c) και d) MOG. Grigoriadis et al Animal models of central nervous system immune-mediated diseases therapeutic interventions with bioactive peptides and mimetics. Curr Med Chem. 2005;12(13):

24 Παθοφυσιολογία Η ενεργοποίηση ανοσολογικών µηχανισµών που περιλαµβάνουν Τ- λεµφοκύτταρα και αυτοαντισώµατα προκαλούν φλεγµονή και αποµυελίνωση. Η ΠΑΕ αποτελεί σηµαντικό εργαλείο µελέτης της παθοφυσιολογίας µιας αυτοάνοσης φλεγµονώδους διαδικασίας που στοχεύει το ΚΝΣ. Η χορήγηση αντιγόνων, πρωτεΐνες της µυελίνης (ΜΟG,ΜΒΡ,PLP) στα πειραµατόζωα διακρίνεται σε δύο φάσεις: τη φάση επαγωγής και τη φάση ανοσιακής απάντησης[28]. Κατά την πρώτη φάση ο αντιγονικός επίτοπος της µυελινικής πρωτεΐνης παρουσιάζεται από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APCs) µέσω έκφρασης MHC II στα δευτερογενή λεµφοειδή κύτταρα. Με αυτό τον τρόπο ενεργοποιούνται CD4+ Τ-λεµφοκύτταρα ειδικά για τον αντιγονικό επίτοπο που εµβολιάστηκε (συγχορήγηση µε Complete Freund s Adjuvant- CFA). Για την ολοκλήρωση της δεύτερης φάσης απαιτείται η διαταραχή του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού που επιτυγχάνεται µε χορήγηση pertussis toxin. Αυτή µεταβάλει την διαπερατότητα του αιµατοεγκεφαλικού φραγµού, µέσω της αύξησης της έκφρασης της επαγόµενης ισοµορφής της συνθετάσης του NO (inos), προάγει την έκφραση των προφλεγµονωδών κυτταροκινών (TNF-α, INF-γ, IL-12), καταστέλλει την αντιφλεγµονώδη κυτταροκίνη IL-10, αυξάνει την απόκριση των Τ λεµφοκυττάρων στους λεµφαδένες, χωρίς να προκαλεί µεταβολή της φλεγµονώδους απάντησης [29]. Αρχικά τα ενεργοποιηµένα Τ λεµφοκύτταρα µεταναστεύουν από την περιφέρεια στο ΚΝΣ, διερχόµενα µέσω της διαταραγµένης λειτουργίας του ΑΕΦ. Εκεί έρχονται σε επαφή µε επιτόπους του ελύτρου της µυελίνης, ενεργοποιούνται και διαφοροποιούνται σε Τh1,Τh2 και Th17. Η διαφοροποίηση αυτή ρυθµίζεται από συγκεκριµένες κυτοκίνες (η IL12 προάγει τον Τh1 τύπο, η IL-4 τον Τh2 τύπο και η IL23 τον Τh17 τύπο), τη δοσολογία του χορηγούµενου αντιγόνου και από τον τύπο του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου. Τα Τh1 εκκρίνουν προφλεγµονώδεις κυτοκίνες (ΙFN-γ, TNFa), τα Τh2 αντιφλεγµονώδεις κυτοκίνες (IL-4,IL-5,IL-10) και τα Th17 εκκρίνουν την κυτοκίνη ιντερλευκίνη 17(IL17). Οι εκκρινόµενες κυτοκίνες και χηµειοκίνες προκαλούν ενεργοποίηση περιφερικών µονοπύρηνων και µικρογλοίας στο παρέγχυµα του ΚΝΣ. Αυτά εµφανίζουν φαγοκυτταρική δραστηριότητα και µαζί µε τις φλεγµονώδεις και κυτταροτοξικές επιδράσεις των κυτοκινών στοχεύουν τη µυελίνη και τα ολιγοδενδροκύτταρα και οδηγούν στην 24

25 αποµυελίνωση των νευραξόνων του ΚΝΣ. Πιο συγκεκριµένα, τα Τh1 εµπλέκονται στην αυτοανοσία και παθογένεια της ΠΣ [30], ενώ τα Τh2 µπορούν εν µέρει να καταστείλουν την ΠΑΕ [31]. Τα Th17 φαίνεται ότι διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο καθώς η αυξηµένη παρουσία τους στο ΚΝΣ συµβαδίζει µε τις υποτροπές στην ΠΑΕ. Πιθανολογείται ότι ο λόγος των Τh17 προς τα Τ- ρυθµιστικά κύτταρα (Τ-regulatory cells) καθορίζει τη χρονιότητα ή όχι της φλεγµονής. Τα Τ-ρυθµιστικά κύτταρα, χαρακτηρίζονται ως CD4+CD25+, και εµπλέκονται στην ΠΑΕ. Ο ρόλος τους φαίνεται να είναι η καταστολή της φλεγµονής και η έκφρασή τους ρυθµίζεται µέσω του µεταγραφικού παράγοντα FoxP3 και TGF-β [32]. ιαφορετικά επίπεδα έκφραση CD25 (IL2R-a) σε περιαγγειακές φλεγµονώδεις διηθήσεις στην ΠΑΕ. Grigoriadis et al [32]. Τελικό αποτέλεσµα της αυτοάνοσης αντίδρασης είναι η αποµυελίνωση και η αξονική εκφύλιση κατά το πρότυπο που αυτή παρατηρείται και στους εγκεφάλους ασθενών πασχόντων από ΠΣ. Αξονική εκφύλιση στην ΠΑΕ Grigoriadis et al. [32]. 25

26 Τα συµπεράσµατα από τη συστηµατική µελέτη της ΠΑΕ µπορούν να βοηθήσουν στην κατανόηση της παθογένειας της ΠΣ, καθώς εµφανίζουν αρκετές οµοιότητες. 4. Νευρογένεση και Γλοιογένεση του ΚΝΣ στα σπονδυλωτά Στο έµβρυο αναπτύσσονται τρία βλαστικά δέρµατα, το εξώδερµα, το µεσόδερµα και το ενδόδερµα και έπειτα σχηµατίζεται επιµήκης πάχυνση του εξωδέρµατος που οδηγεί στο σχηµατισµό της νευρικής πλάκας. Κατά µήκος της δηµιουργείται κοίλανση (νευρικά αύλακα) και σταδιακά τα χείλη της νευρικής αύλακας ενώνονται και σχηµατίζουν το νευρικό σωλήνα. Αυτός µαζί µε τα παρακείµενα κύτταρα των νευρικών ακρολοφιών αποµονώνονται από το λοιπό εξώδερµα, βυθίζονται µέσα στο µεσόδερµα και αποτελούν το νευροεξώδερµα. Από το νευροεξώδερµα θα σχηµατιστεί ολόκληρο το ΚΝΣ των σπονδυλωτών. Από το πρόσθιο τµήµα του νευρικού σωλήνα θα σχηµατιστεί ο εγκέφαλος και από το οπίσθιο τµήµα του ο νωτιαίος µυελός. Ό,τι αποµείνει από την κοιλότητα του νευρικού σωλήνα θα σχηµατίσει τις κοιλίες του εγκεφάλου και τον κεντρικό νευρικό σωλήνα του νωτιαίου µυελού. Τα στελεχιαία νευρικά κύτταρα του νευροεξωδέρµατος δίνουν γένεση σε όλα τα κύτταρα του ΚΝΣ. Η διαφοροποίησή τους δεν εξαρτάται αποκλειστικά από την κυτταρική γενεαλογική σειρά, αλλά από εξωκυττάρια σήµατα του περιβάλλοντος που τα κατευθύνουν στο να διαφοροποιηθούν είτε σε νευρώνες είτε σε γλοία. Γενικότερα, η γλοιογένεση έπεται της νευρογένεσης και η δηµιουργία ώριµων νευρώνων δεν ολοκληρώνεται πλήρως κατά την εµβρυϊκή ηλικία, αλλά συνεχίζει να λαµβάνει χώρα µετά τη γέννηση. 26

27 Στελεχιαία Προγονικά Κύτταρα (ΣΠΚ) του ΚΝΣ Ο γενικός ορισµός των στελεχιαίων κυττάρων (ΣΚ, Stem Cells) αναγνωρίζει στα κύτταρα αυτά τις εξής ιδιότητες: 1) Ικανότητα πολλαπλασιασµού και αυτοανανέωσης 2) Αδιαφοροποίητα κύτταρα 3) Ικανότητα διαφοροποίησης σε πολλές κυτταρικές σειρές (Πολυδύναµα) 4) Ικανότητα να επιδιορθώνουν ιστούς Με την ικανότητα διαφοροποίησής τους, τα κύτταρα διακρίνονται σε: α) Ολοδύναµα (Totipotent) δηλαδή το ζυγωτό, που µπορεί να δώσει γένεση σε όλες τις κυτταρικές σειρές. β) Πλειοδύναµα (Pluripotent), δηλαδή τα εµβρυονικά στελεχιαία κύτταρα (Stem Cells), που µπορούν να διαφοροποιηθούν προς κάθε κύτταρο του οργανισµού, αλλά όχι την τροφοβλάστη και τον πλακούντα γ) Πολυδύναµα (Multipotent), τα οποία εντοπίζονται σε διάφορα όργανα του ώριµου οργανισµού δ) Προγονικά κύτταρα (Ρrogenitors), τα οποία προέρχονται από τα πολυδύναµα και έχουν έχουν περιορισµένο δυναµικό διαφοροποίησης ε) εσµευµένα προγονικά κύτταρα (Committed Progenitors), που προέρχονται από τα προγονικά και µπορούν να διαφοροποιηθούν προς µία κυτταρική σειρά [33] (Εικόνα 5). Εικόνα 5. Τα στάδια της νευρωνικής και γλοιϊκής γενεαλογίας. Medscape, Neurology reviews and issues,

28 Τα ΣΠΚ του ΚΝΣ φαίνεται να εµφανίζουν κάποιες ιδιότητες των ΣΚ, δηλαδή την ικανότητα αυτοανανέωσης και πολυδυναµίας. Μπορούν να καλλιεργηθούν in vitro σχηµατίζοντας νευροσφαιρίδια (neurospheres) και να διαφοροποιηθούν προς αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και νευρώνες (Εικόνα 6). Τα νευροσφαιρίδια είναι σφαιρικές δοµές που περιβάλλονται από εξωκυττάριο στρώµα (extracellular matrix), αποτελούµενες από συναθροίσεις κύτταρων και προκύπτουν µετά από καλλιέργειά ΣΠΚ σε συγκεκριµένο θρεπτικό µέσο µε αυξητικούς παράγοντες (EGF και bfgf). Τα ΣΠΚ στο ενήλικο ΚΝΣ ανευρίσκονται στην υποκοιλιακή ζώνη των πλάγιων κοιλιών (subventricular zone, SVZ), στην υποκοκκώδη ζώνη της οδοντωτής έλικας (dentate gyrous subgranular zone, SGZ), στην περικοιλιακή χώρα της τρίτης και τέταρτης κοιλίας του εγκεφάλου και στο επένδυµα του νωτιαίου µυελού [34,35]. Για τη διατήρηση της ικανότητας αυτοανέωσης, πολλαπλασιασµού και διαφοροποίησης των ΣΠΚ συµµετέχουν ενδογενή και εξωγενή σήµατα. Βασικά ενδογενή µονοπάτια είναι το Notch, το Wnt και το Sonic Hedgehog [36,37]. Ρόλο διαδραµατίζουν και άλλα σηµατοδοτικά µόρια όπως οι µορφογενετικές πρωτεΐνες των οστών (BMPs) και η πρωτεΐνη Noggin [38]. Εκτός από τους ενδογενείς παράγοντες του µικροπεριβάλλοντος σηµαντικό ρόλο παίζουν και εξωγενή µόρια όπως τροφικοί παράγοντες, κυτταροκίνες και ορισµένοι νευροδιαβιβαστές. Οι πιο σηµαντικοί τροφικοί παράγοντες είναι ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (FGF), ο επιδερµικός αυξητικός παράγοντας (EGF), ο αυξητικός παράγοντας των αιµοπεταλίων (PDGF), ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF) και ο παράγοντας προερχόµενος από το χρωσµένο επιθήλιο (PEDF) [36,39,40]. Οι κυτταροκίνες της οικογένειας της ιντερλευκίνης 6, η IL-1b, ο TGFβ, η INF-γ3 είναι ορισµένες από τις φλεγµονώδεις κυτταροκίνες που φαίνονται ικανές να ρυθµίσουν ποικιλοτρόπως την λειτουργία των ΣΠΚ [41,42]. Επίσης, οι νευροδιαβιβαστές όπως το GABA και η ντοπαµίνη επηρεάζουν τον πολλαπλασιασµό των ΣΠΚ. εν έχουν βρεθεί ειδικοί αντιγονικοί δείκτες των ΣΠΚ, αλλά ορισµένες πρωτεΐνες φαίνεται να έχουν αυξηµένη ειδικότητα γι αυτόν τον τύπο κυττάρων. Σηµαντικότερες είναι η νεστίνη (nestin), µια ενδιάµεση πρωτεΐνη των ινιδίων τάξης IV, το PSA-NCAM που αποτελεί την πολυσιαλυλιωµένη µορφή του µορίου 28

29 συνάφειας NCAM των νευρικών κυττάρων, ο υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα των αιµοπεταλίων PDGFR-α, η ενδιάµεση πρωτεΐνη των ινιδίων βιµεντίνη (vimentin), ο µεταγραφικός παράγοντας musashi 1, o αντιγονικός δείκτης CD133 των αιµοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων [43,44,45]. Εικόνα 6. ιαφοροποίηση των ΣΠΚ σε Ολιγοδενδροκύτταρα, Αστροκύτταρα και Νευρώνες, Medscape, Neurology reviews and issues, Υποκοιλιακή ζώνη (ΥΚΖ) Τα πρόδροµα νευρικά κύτταρα µπορούν και µεταναστεύουν από την κοιλιακή ζώνη του νευροεπιθηλίου προς περιοχές που ονοµάζονται δευτερογενείς βλαστικές ζώνες. Μία από αυτές είναι η Υποκοιλιακή Ζώνη (ΥΚΖ), η οποία αποτελεί το υπόλειµµα της εκτεταµένης περικοιλιακής βλαστικής περιοχής που απαντάται κατά την περιγεννητική περίοδο. Κατά την διάρκεια της ανάπτυξης, η βλαστική αυτή περιοχή συρρικνώνεται και καταλαµβάνει το περισσότερο πρόσθιο τµήµα της πλάγιας κοιλίας. Η ΥΚΖ αποτελείται από τέσσερα διαφορετικά στρώµατα κυττάρων και δίνει γένεση σε όλους τους κυτταρικούς τύπους του ΚΝΣ (Εικόνα 7). Το πρώτο (εσωτερικό) στρώµα περιλαµβάνει µια µονή στιβάδα επενδυµατικών κυττάρων (ependymal cells) που έρχονται σε επαφή µε το ΕΝΥ της πλάγιας κοιλίας. Το 29

30 δεύτερο στρώµα δεν περιέχει σώµατα κυττάρων αλλά περιέχει αστροκυτταρικές προσεκβολές (GFAP processes gap), που σχηµατίζουν ένα δίκτυο που πιθανόν δρα ρυθµίζοντας την οµοιόσταση και τον πολλαπλασιασµό των προγονικών κυττάρων. Το τρίτο στρώµα περιλαµβάνει σώµατα αστροκυττάρων, κάποια από τα οποία είναι ικανά να πολλαπλασιάζονται in vivo ή να δίνουν πολυδύναµα νευροσφαιρίδια in vitro. Επίσης ανευρίσκεται και µικρός αριθµός επενδυµατικών κυττάρων και ολιγοδενδροκυττάρων. Το τέταρτο στρώµα αποτελεί µεταβατική περιοχή προς το εγκεφαλικό παρέγχυµα και περιέχει αστροκύτταρα και αυξηµένη παρουσία µυελίνης. Εικόνα 7. ΣΠΚ και οι απόγονοί τους στον αναπτυσσόµενο πρόσθιο εγκέφαλο θηλαστικών,florian T Merkle and Arturo Alvarez-Buylla,

31 Οι διαφορετικοί τύποι κυττάρων είναι τέσσερις: 1) Κροσσωτά Επενδυµατικά Κύτταρα (Tύπος E) βρίσκονται σε επαφή µε τον αυλό της κοιλίας και συµµετέχουν στην κυκλοφορία του ΕΝΥ, 2) Μεταναστευτικοί πρόδροµοι νευρώνες ή νευροβλάστες (Tύπος A) που εκφράζουν PSA-NCAM, Tuj1 και Hu, και µεταναστεύουν µέσω του πρόσθιου µεταναστευτικού τόξου (rostral migratory stream-rms) προς τον οσφρητικό βολβό, 3) Βραδέως διαιρούµενα κύτταρα (Τύπος B) µε ιδιότητες ΣΠΚ και χαρακτηριστικά αστροκυττάρων. Εκφράζουν Nestin και GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein) και δίνουν γένεση στους Νευροβλάστες (Tύπος A) ή διαφοροποιούνται στα πρόδροµα κύτταρα (Τύπος C) και 4) Ταχέως διαιρούµενα πρόδροµα κύτταρα (Type C) που εκφράζουν Nestin και αποτελούν τα προγονικά ΣΠΚ της ζώνης [46,47] (Εικόνα 8). Η ΥΚΖ θεωρείται οργανωµένη σε ένα κυτταρικό πρότυπο πολλαπλασιασµού και διαφοροποίησης που ακολουθεί την σειρά Τύπος B προς Τύπο C και αυτά προς Τύπο A, τα οποία και µεταναστεύουν προς τον οσφρητικό βολβό, µέσω του µονοπατιού RMS, όπου θα διαφοροποιηθούν σε διάµεσους νευρώνες [46,48]. Εικόνα 8. ΣΠΚ στις περικοιλιακές περιοχές των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων µεταναστεύουν µέσω του πρόσθιου µεταναστευτικού τόξου (RMS) προς τον ΟΒ, Neuro-science, Adult Neurogenesis,

32 5. Ολιγοδενδροκύτταρα και Μυελίνη Η υποκοιλιακή ζώνη (SVZ), η οποία είναι παρούσα στο τέλος της κύησης και την πρώιµη µεταγεννητική περίοδο στον εγκέφαλο των θηλαστικών αποτελεί όπως προαναφέρθηκε σηµαντική πηγή αστροκυττάρων και ολιγοδενδροκυττάρων (κύτταρα γλοίας). Συγκεκριµένα τα κύτταρα της SVZ κατά τις τελευταίες εµβρυϊκές ηµέρες (Ε19 στον αρουραίο) αρχίζουν να παράγουν τα αστροκύτταρα του φλοιού. Η πλήρης ωρίµανσή τους στο ΚΝΣ των θηλαστικών λαµβάνει χώρα σε µεγάλο βαθµό στην πρώιµη µεταγεννητική περίοδο της ζωής τους. Η ωρίµανση των αστροκυττάρων κορυφώνεται κατά τη µεταγεννητική ηµέρα Ρ0 έως Ρ2, ενώ τα ώριµα ολιγοδενδροκύτταρα εµφανίζονται αργότερα, κατά τη µεταγεννητική ηµέρα Ρ14 [49,50] (Εικόνα 9). Συνεπώς η γένεση ολιγοδενδροκυττάρων έπεται από αυτή των αστροκυττάρων. Εικόνα 9. Μετανάστευση και διαφοροποίηση αστροκυττάρων και ολιγοδενδροκυττάρων στην περιοχή fimbria µεταξύ ηλικιών Ε15- P60. (Kάτω επιφάνεια: Επένδυµα, Άνω επιφάνεια: Χοριοειδής µήνιγγα, Μεγάλοι άσπροι κύκλοι: Αστροκύτταρα, Μικροί µαύροι κύκλοι: Ολιγοδενδροκύτταρα,Suzuki and Raisman,

33 Έχουν προταθεί δύο θεωρίες για την προέλευση των ολιγοδενδροκυττάρων. Στην πρώτη, οι κινητικοί νευρώνες και τα ολιγοδενδροκύτταρα µοιράζονται κοινό πρόγονο (καθοριστική η Sonic Hedgehog πρωτεΐνη). Σύµφωνα µε αυτήν τα Πρόδροµα Ολιγοδενδροκύτταρα (ΠΟ) αρχίζουν να δηµιουργούνται µετά την παραγωγή κινητικών νευρώνων [51,52]. Στη δεύτερη θεωρία προτείνει ότι τα νευρωνικά και τα Πρόδροµα Ολιγοδενδροκύτταρα παράγονται ταυτόχρονα στην Κοιλιακή Ζώνη, από διαφορετικές υποπεριοχές [52]. Τα Πρόδροµα Ολιγοδενδροκύτταρα µεταναστεύουν σε µεγάλες αποστάσεις µακριά από τις ζώνες αυτές για να σχηµατίσουν στον αναπτυσσόµενο εγκέφαλο τη λευκή ουσία [53]. Επειδή τα Ώριµα Ολιγοδενδροκύτταρα δεν µπορούν να µεταναστεύσουν, είναι σηµαντικό για τα ΠΟ να µη διαφοροποιηθούν πριν την ολοκλήρωση της µετανάστευσης. Υπάρχουν αντιγονικοί δείκτες οι οποίοι εκφράζονται στην επιφάνεια του ολιγοδενδροκυττάρου σε κάθε στάδιο ωρίµανσης, από ΣΠΚ προς ώριµο (Εικόνα 10). Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 4) παραθέτονται οι κυριότεροι: Τύπος Κυττάρου Στελεχιαίο Προγονικό Κύτταρο Προγονικό Νευρικό Κύτταρο Πρόδροµο Ολιγοδενδροκύτταρο Αντιγονικοί είκτες PSA-NCAM,Nestin,PDGFRα,DM- 20,CNP Α2B5,GD3,NG2,PDGFRα,DM-20,CNP Α2B5,GD3,NG2,O4,PDGFRα, DM-20,CNP Ανώριµο Ολιγοδενδροκύτταρο Μη µυελινωτικό ώριµο Ολιγοδενδροκύτταρο O4,RIP,GalC,CNP,DM-20 O4,RIP,GalC,CNP,MBP, PLP/DM-20, MAG Ώριµο Ολιγοδενδροκύτταρο Μυελινωτικό O4,RIP,GalC,CNP,MBP, PLP/DM-20, MAG, MOG Πίνακας 4. Αντιγονικοί δείκτες ολιγοδενδροκυττάρων στο κάθε στάδιο ανάπτυξης. 33

34 Εικόνα 10. Σχηµατική απεικόνιση των αναπτυξιακών σταδίων των ολιγοδενδροκυττάρων. Μορφολογική διαφοροποίησή τους από ΣΠΚ έως Ώριµα Μυελινωτικά Ολιγοδενδροκύτταρα και οι αντιγονικοί δείκτες που εκφράζουν σε κάθε επιµέρους στάδιο, Lubetzki et al., Médecine/Sciences,1997. Όπως προαναφέρθηκε η κύρια λειτουργία των ολιγοδενδροκυττάρων είναι ο σχηµατισµός του ελύτρου µυελίνης που περιβάλλει τους περισσότερους άξονες του ΚΝΣ. Η πολυπλοκότητα του ΝΣ των σπονδυλωτών οφείλεται στην ύπαρξη της µυελίνης, ενώ τα ασπόνδυλα εµφανίζουν µια παρόµοια, αλλά λιγότερο εξελιγµένη δοµή,που περιβάλλει τους άξονες [54]. Η µυελίνη είναι µία σπειροειδής δοµή που προκύπτει από τις αναδιπλώσεις της πλασµατικής µεµβράνης των ολιγοδενδροκυττάρων στο ΚΝΣ και των κυττάρων Schwann στο ΠΝΣ (Εικόνα 11). 34

35 Εικόνα 11. Μυελινωτικά κύτταρα γλοίας, δοµή και σύνθεση µυελίνης στο ΠΝΣ και ΚΝΣ. PHAM-DINH D. Physiologie du Neurone, Η λευκή ουσία του εγκεφάλου αποτελείται κατά 40-45% από µυελίνη. Η µυελίνη περιέχει 40% νερό ( σε αντίθεση µε τη φαιά ουσία που περιέχει 80%) και το υπόλοιπο 60% δοµείται από 70-75% λιπίδια και 25-30% πρωτεΐνες. Περίπου το 25% των λιπιδίων είναι χοληστερόλη και το 40-45% είναι φωσφολιπίδια, ενώ το υπόλοιπο 25-30% είναι γαλακτολιπίδια. Οι γαλακτοκερεβροζίτες (GalactoCerebrosides, GalC) είναι τα κύρια γλυκολιπίδια της µυελίνης. Οι κύριες πρωτεΐνες της µυελίνης είναι η βασική πρωτεΐνη της µυελίνης (ΜΒΡ) και η πρωτεολιπιδική πρωτεΐνη της µυελίνης (PLP) και αποτελούν το 80%. Επίσης, υπάρχουν και γλυκοπρωτεΐνες, όπως η γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOG) και η πρωτεΐνη συσχετιζόµενη µε την µυελίνη (MAG). 35

36 H γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων (MOG) έχει µοριακό βάρος 25 kda µερικώς γλυκοζυλιωµένη, αγγίζοντας τα kda και έχει τη δυνατότητα να σχηµατίζει διµερή kda [55]. Η MOG είναι διατηρηµένη κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και εκφράζεται µόνο στα θηλαστικά. Στους ανθρώπους εκφράζει τον επίτοπο L2/HNK1 [56] και το γονίδιο της βρίσκεται στο χρωµόσωµα 6 (6p21.3-p22) στον άνθρωπο και στο χρωµόσωµα 17 στο µυ, µε µέγεθος 12.5 και 19 kb αντίστοιχα [57,58]. Το γονίδιό της αποτελείται από 8 εξώνια και βρίσκεται στο άπω άκρο της περιοχής MHC τάξης Ib [59]. Η MOG εντοπίζεται στο εξωτερικό στρώµα του ελύτρου µυελίνης και στις αποφυάδες των ολιγοδενδροκυττάρων. Αποτελεί δείκτη των ώριµων ολιγοδενδροκυττάρων και η έκφρασή της συµβαδίζει µε τα τελευταία στάδια ωρίµανσής τους. Είναι η µόνη πρωτεΐνη του ΚΝΣ που µπορεί να προκαλέσει Τ- λεµφοκυτταρική διαµεσολαβούµενη φλεγµονώδη ανοσιακή απάντηση και διαµεσολαβούµενη από αντισώµατα αποµυελινωτική ανοσιακή απάντηση σε πειραµατικό µοντέλο (ΠΑΕ). Ο σχηµατισµός της µυελίνης συµβαίνει ουραιοκεφαλικά στον εγκέφαλο και κεφαλοουραία στο νωτιαίο µυελό. Στους µύες, ξεκινάει µε τη γέννηση στο νωτιαίο µυελό και ολοκληρώνεται στον εγκέφαλο σχεδόν σε όλες τις περιοχές µέρες µετά τη γέννηση. Στους ανθρώπους ξεκινάει µετά τη µέση της εµβρυικής ζωής στο νωτιαίο µυελό και η κορύφωση του σχηµατισµού της µυελίνης συµβαίνει κατά τη διάρκεια του πρώτου έτους. Μπορεί να συνεχιστεί µέχρι και την ηλικία των 20 ετών (σε φλοιϊκούς νευρώνες) [60]. 6. Ο ρόλος των ΣΠΚ στην ΠΑΕ και την ΠΣ Η φλεγµονώδης αποµυελίνωση, κυρίαρχο στοιχείο στην ΠΑΕ και στην ΠΣ, είναι ικανή να προκαλέσει πολλαπλασιασµό και κινητοποίηση των ΣΠΚ της ΥΚΖ προς περιοχές του ΚΝΣ, όπως ο οσφρητικός βολβός, αλλά και προς οποιαδήποτε εστία αποµυελίνωσης [61]. Αυτό συµβαίνει ως αντισταθµιστική απάντηση για την επιδιόρθωση των κατεστραµµένων δοµών και θεωρείται ότι ο τύπος διαφοροποίησης των ΣΠΚ (νευρώνες, ολιγοδενδροκύτταρα 36

37 αστροκύτταρα) εξαρτάται από το είδος της βλάβης που καλούνται να αποκαταστήσουν. Εν προκειµένω στην ΠΑΕ και στην ΠΣ τα ενδογενή ΣΠΚ διαφοροποιούνται κυρίως προς κύτταρα της γλοίας, ιδιαιτέρως προς πρόδροµα ολιγοδενδροκύτταρα και ενισχύεται η µετανάστευσή τους στις αποµυελινωτικές περιοχές της λευκής ουσίας [62]. Το φλεγµονώδες µικροπεριβάλλον που επικρατεί δυσχεραίνει αυτή τη διαφοροποίηση και ωρίµανση των ενδογενών ΣΠΚ µε απότελεσµα ελαττωµατική και κατά τόπους επαναµυελίνωση. Οι κυτταροκίνες, οι αυξητικοί παράγοντες και γενικότερα οι µηχανισµοί που εµπλέκονται είναι αντικείµενο εκτενών µελετών. Ως εναλλακτική προσέγγιση για την αποκατάσταση της αποµυελίνωσης έχει προταθεί και εφαρµοστεί µεταµόσχευση εξωγενών ΣΠΚ για ενίσχυση της διαδικασίας. Η ΠΣ και η ΠΑΕ είναι κατάλληλες για θεραπεία µε κυτταρική µεταµόσχευση διότι τα µεταµοσχευµένα ΣΠΚ δε χρειάζεται να δηµιουργήσουν πολύπλοκες νευρικές συνδέσεις, αλλά αρκεί να διαφοροποιηθούν προς ολιγοδενδροκυτταρική σειρά και να επαναµυελινώσουν τους άξονες [63]. Η δράση τους µπορεί να είναι υποβοηθητική στην ήδη υπάρχουσα επαναµυελίνωση και δεδοµένα από πειράµατα χορήγησης εξωγενών ΣΠΚ σε πειραµατόζωα µε ΠΑΕ έδειξαν θετικά αποτελέσµατα. Ωστόσο, ο έλεγχος της διαφοροποίησης είναι δυσχερής καθώς εξαρτάται από το µικροπεριβάλλον της περιοχής. Τα χορηγούµενα ΣΠΚ µολονότι έχουν χηµειοτακτισµό προς τις εστίες αποµυελίνωσης, αδυνατούν να µεταναστεύσουν σε πολλαπλές διάσπαρτες εστίες. Επίσης χρειάζεται να λαµβάνεται υπόψη το αναπτυξιακό τους δυναµικό, ώστε να αποφευχθεί η πιθανότητα δηµιουργίας όγκου [64]. Ένας ακόµη πιθανός τρόπος δράσης των ΣΠΚ θεωρείται η ανοσορυθµιστική τους δυνατότητα καθώς φαίνεται ότι συντελούν σε καταστολή της φλεγµονής, µετά τη χορήγησή τους [65]. Σε µια πολυεστιακή ασθένεια όπως η ΠΣ, πολύ σηµαντικό είναι να βρεθεί η κατάλληλη οδός και ο τρόπος χορήγησης ΣΠΚ, καθώς και η καταλληλότερη χρονική στιγµή αναλόγως της φάσης και του τύπου της νόσου. 37

38 7. Σκοπός εργασίας H παθογένεια της ΠΣ είναι πολυπαραγοντική και συνδυάζει χαρακτηριστικά κυτταρικής και χυµικής ανοσίας. Η µελέτη αυτών των µηχανισµών σε µικροσκοπικό επίπεδο είναι πολύ δύσκολο να γίνει στον άνθρωπο. Για αυτό το λόγο έχουν προταθεί διάφορα πειραµατικά µοντέλα (ΠΑΕ) που προσοµοιάζουν την ΠΣ και επιτρέπουν πιο ενδελεχή µελέτη των µηχανισµών σε µεγάλο αριθµό πειραµατόζωων. Ο σκοπός της παρούσης εργασίας είναι η µελέτη των αυτοαντισωµάτων έναντι της πρωτεΐνης ΜOG (αντιορός ΜOG), που παράγονται στην ΠΑΕ και συγκεκριµένα εάν στρέφονται έναντι στελεχιαίων προγονικών κυττάρων (ΣΠΚ) του ΚΝΣ, στην υποκοιλιακή περιοχή. Γι αυτό το λόγο παρελήφθησαν πολυκλωνικοί αντιοροί από τρεις οµάδες πειραµατοζώων (Φυσιολογικοί µάρτυρες,cfa,mog+cfa-παε). Αυτοί χρησιµοποιήθηκαν σε παθολογοανατοµικές τεχνικές, ανοσοϊστοχηµείας και ανοσοφθορισµού, για χρώση φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου ποντικών, τριών διαφορετικών ηλικιών (νεογνά 3 ηµερών, ενδιάµεσης ηλικίας- 16 ηµερών, ενήλικα 3 µηνών). Για τη µελέτη της χυµικής ανοσίας έναντι των ΣΠΚ, έγινε διπλός ανοσοφθορισµός µε τον αντιορό ΜOG και µε anti-brdu, που σηµαίνει τα ΣΠΚ στον εγκέφαλο και ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα έναντι της MOG (R&D). Επίσης, καλλιεργήθηκαν στελεχιαία προγονικά κύτταρα από τα οποία αποµονώθηκε ολική πρωτεΐνη και διενεργήθη στύπωµα κατά Western σε αυτά (µε τους προαναφερθέντες ορούς), καθώς και σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα φυσιολογικού νωτιαίου µυελού. 38

39 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 39

40 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 8. Πειραµατόζωα Για την πραγµατοποίηση του πειράµατος χρησιµοποιήθηκαν θήλεις µύες της φυλής C57BL/6, ηλικίας 6-8 εβδοµάδων. Τα πειραµατόζωα προήλθαν από το Ινστιτούτο Παστέρ της Αθήνας και διατηρήθηκαν σε ειδικές εγκαταστάσεις ασφάλειας επιπέδου 3 (animal care house, P3) της Β Πανεπιστηµιακής Νευρολογικής Κλινικής του Γ.Π.Ν.Θ. ΑΧΕΠΑ (εργαστήριο Πειραµατικής Νευρολογίας και Νευροανοσολογίας). Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν φυσιολογικά πειραµατόζωα τριών διαφορετικών ηλικιών (3 ηµερών, 16 ηµερών και 3 µηνών), καθώς και νεογνά 1-3 ηµερών για τις καλλιέργειες των ΣΠΚ. Στο χώρο αυτό επικρατούσε εναλλαγή ηµέρας- νύχτας ανά 12 ώρες και οι µύες διατηρήθηκαν σε κλουβιά, στα οποία είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό. 9. Σχεδιασµός Πειραµατικού Πρωτοκόλλου Η πειραµατική διαδικασία περιλαµβάνει την επαγωγή της πειραµατικής αυτοάνοσης εγκεφαλοµυελίτιδας σε ενήλικες µύες, τη χορήγηση Βρωµοδεοξυουριδίνης (5-βρωµο-2'-δεοξυουριδίνη, BrdU) σε φυσιολογικούς µύες ηλικίας 3 ηµερών (νεογνά), 16 ηµερών (ενδιάµεσης ηλικίας) και 3 µηνών (ενήλικα) και την καλλιέργεια στελεχιαίων προγονικών κυττάρων του ΚΝΣ από νεογνά της φυλής C57BL/6. Το πείραµα περιελάµβανε 3 οµάδες πειραµατοζώων, µύες της φυλής C57BL/6. Η πρώτη οµάδα αποτελούνταν από 10 πειραµατόζωα στα οποία έγινε επαγωγή της ΠΑΕ µε χορήγηση MOG (γλυκοπρωτεΐνη της µυελίνης των ολιγοδενδροκυττάρων) µε CFA (ανοσοενισχυτικό), η δεύτερη οµάδα αποτελούνταν από 7 πειραµατόζωα, τα οποία έλαβαν χορήγηση µόνο CFA και η τρίτη οµάδα αποτελούνταν από 7 µύες που χρησιµοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί µάρτυρες (naive), (Πίνακας 5). 40

41 Οµάδα 1 η MOG+CFA N=10 Οµάδα 2 η CFA N= 7 Οµάδα 3 η Naive N=7 Πίνακας 5. Οµάδες πειραµατοζώων. Ως ηµέρα µηδέν του πειράµατος θεωρείται η µέρα επαγωγής της ΠΑΕ και ακολούθησαν θυσίες την ηµέρα 17 (οξεία φάση) καθώς και αιµοληψίες και από τις 3 οµάδες του πειράµατος. Στο πειραµατικό πρωτόκολλο χρησιµοποιήθηκαν µόνο οι οροί από τις αιµοληψίες των προαναφερθέντων οµάδων. Οι ιστοί που µελετήθηκαν προήλθαν από φυσιολογικά πειραµατόζωα τριών διαφορετικών ηλικιών (ηµ.3,ηµ.16 και 3 µην.) στα οποία πριν θυσιαστούν είχε προηγηθεί έγχυση ενδοπεριτοναϊκά BrdU (σήµανση των κυττάρων που διαιρούνται εκείνη τη χρονική στιγµή). Η BrdU αποτελεί ανάλογο θυµιδίνης το οποίο ενσωµατώνεται στο DNA κατά τη σύνθεσή του (φάση S κυτταρικού κύκλου) και παραµένει εκεί, οπότε και µπορεί να ανιχνευθεί [66]. Αυτά χρησιµοποιήθηκαν για µελέτες ανοσοϊστοχηµείας και ανοσοφθορισµού, ενώ τα στελεχιαία προγονικά κύτταρα χρησιµοποιήθηκαν για τη µέθοδο του στυπώµατος κατά Western. 9α. Επαγωγή Πειραµατικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλοµυελίτιδας Η επαγωγή της ΠΑΕ πραγµατοποιήθηκε µε τη χρησιµοποίηση ενός συνθετικού πεπτιδίου της MOG και συγκεκριµένα ο επίτοπός της, MOG Tην ηµέρα επαγωγής της ΠΑΕ στους µύες (ηµέρα 0), έγινε υποδόρια έγχυση 0,15mg MOG (Sigma) στη βάση της ουράς των πειραµατοζώων. Η MOG ήταν διαλυµένη σε 100µL ατελούς συµπληρώµατος (Incomplete Freund s adjuvant- IFA, Sigma) στο οποίο είχε προστεθεί µυκοβακτηρίδιο της φυµατίωσης Η37Ra (Difco Laboratories) µε αναλογία 4mg/ml IFA, καθώς και 100µl PBS (Sigma). Την ίδια ηµέρα, χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά 400ng/πειραµατόζωο της τοξίνης pertussis toxin (Sigma) διαλυµένη σε 500µl PBS. Την ηµέρα 2 χορηγήθηκε ενισχυτική δόση, η µισή από την αρχική δόση της τοξίνης pertussis, δηλαδή 200ng/πειραµατόζωο διαλυµένη σε 500µl PBS. Την ηµέρα 7 χορηγήθηκε επαναληπτική δόση του αρχικού αντιγόνου, MOG35-55, 41

42 στη βάση της ουράς των πειραµατοζώων, διαλυµένη πάλι σε 100 µl IFA, µε προσθήκη του µυκοβακτηρίδιο της φυµατίωσης Η37Ra (4mg/ml IFA) και 100µl PBS. 9β. Κλινική παρακολούθηση των πειραµατοζώων Καθηµερινά στα πειραµατόζωα διεξάγεται κλινική εξέταση, κατά την οποία καταγράφεται το βάρος τους και αξιολογούνται για την πορεία της ΠΑΕ βάση µιας καθιερωµένης κλίµακας, µε ελάχιστο σκορ το 0 και µέγιστο το 6 (Εικόνα 12). Συγκεκριµένα η κλίµακα κλινικής εξέτασης είναι: 0: Κανένα κλινικό σηµείο. Η ουρά ανέρχεται κάθετα ως προς τον οριζόντιο άξονα του πειραµατόζωου και παραµένει σε αυτή τη θέση, ύστερα από άσκηση πίεσης στον αυχένα. 0,5: Γενική κλινική εικόνα καλή. Η θέση της ουράς ποικίλει, από την κάθετη ως προς την οριζόντια θέση σε σχέση µε τον επιµήκη (οριζόντιο) άξονα του πειραµατόζωου. Υπάρχει εµφανής αδυναµία του πειραµατόζωου να διατηρήσει την ουρά του στην κατακόρυφη θέση για αρκετή ώρα ύστερα από άσκηση πίεσης στον αυχένα. Η ουρά όµως δεν είναι στον οριζόντιο άξονα κατά την συγκράτηση του πειραµατόζωου από την ράχη, αλλά σχηµατίζει γωνία ως προς αυτόν, προς τα πάνω. Το ακραίο τµήµα της ουράς παρουσιάζει ποικίλου βαθµού χαλαρή παράλυση. 1: Έναρξη εµφανούς κλινικής συµπτωµατολογίας: κατάπτωση, απώλεια βάρους. Κατά την συγκράτηση του πειραµατόζωου από τη ράχη, η ουρά βρίσκεται στο οριζόντιο επίπεδο και διατηρείται σε αυτή τη θέση µετά από άσκηση πίεσης στον αυχένα. Επιπλέον το περιφερικό τµήµα της ουράς εµφανίζει χαλαρή παράλυση. 42

43 1,5: Χαρακτηρίζονται όλα τα περιστατικά που δεν µπορούν να βαθµολογηθούν ούτε ξεκάθαρα 1 ούτε όµως και 2. Στην περίπτωση αυτή η ουρά εµφανίζει: α) το περιφερικό της τµήµα χαλαρή παράλυση, β) η βάση της ουράς σχηµατίζει γωνία µε τον οριζόντιο άξονα του ζώου προς τα κάτω, γ) δεν έχουµε πλήρη παράλυση της ουράς από την βάση της και δ) αυτή εµφανίζει ένα βαθµό κινητικότητας και µπορεί να ανυψώνεται για λίγο ποτέ όµως πάνω από το οριζόντιο επίπεδο του ζώου. 2: Χαλαρή παράλυση της ουράς από την βάση της και έλλειψη παντελούς κινητικότητας. Όταν ανατρέπεται το πειραµατόζωο παρατηρείται ταχεία επάνοδος στα τέσσερα άκρα του. 2,5: Το 2 και επιπλέον όταν εκτρέπεται το πειραµατόζωο, παρατηρείται βραδεία επάνοδος στα τέσσερα άκρα του. 3: Το 2 και παντελής αδυναµία του πειραµατόζωου να επανέλθει στα τέσσερα άκρα, όταν αυτό τοποθετείται µε τη ράχη. 3,5: Το 3 και παράλυση του ενός από τα δύο οπίσθια άκρα.το άκρο αυτό µπορεί να εµφανίζει κατά την κίνηση ένα ελάχιστο βαθµό κινητικότητας, διατηρεί την εν τω βάθει αισθητικότητα του άλγους, αλλά δεν χρησιµοποιείται για την στήριξη και την ώθηση του πειραµατόζωου κατά την κίνηση. 4: Το 3 και παράλυση του και των δύο οπισθίων άκρων. Το πειραµατόζωο κατά την κίνηση σέρνει τα δύο οπίσθια άκρα, όµως είναι δυνατό να δούµε µικρές αλλά όχι λειτουργικές κινήσεις των άκρων αυτών. 4,5: Τα δύο οπίσθια άκρα χάνουν παντελώς την κινητικότητά τους και επιπλέον εµφανίζεται έντονη µυϊκή ατροφία στα άκρα αυτά και στους οπίσθιους µύες της ράχης. Σπάνια παρατηρείται παράλυση των προσθίων άκρων και έτσι το πειραµατόζωο µπορεί να κινηθεί µε αυτά. Επίσης, παρατηρείται έντονη απώλεια βάρους και το πειραµατόζωο σπάνια επανέρχεται στη φυσιολογική κλινική του κατάσταση. 43

44 5: το 4,5 και παράλυση ενός ή και των δύο προσθίων άκρων. Το πειραµατόζωο εµφανίζει αδυναµία µετακίνησης από την θέση του. 6: θάνατος του πειραµατόζωου. Εικόνα 12. Κλίµακα κλινικής εξέτασης πειραµατοζώων στο µοντέλο της ΠΑΕ. α. κλινικό σκορ 0, β. κλινικό σκορ 1, γ. κλινικό σκορ 2, δ. κλινικό σκορ 3, ε. κλινικό σκορ 4, ζ. κλινικό σκορ 5. 9γ. Θυσίες πειραµατοζώων Τα πειραµατόζωα θυσιάστηκαν στην οξεία φάση, ηµέρα 17, της ΠΑΕ. Πραγµατοποιήθηκαν αιµοληψίες και αποµονώθηκαν διάφοροι ιστοί (δε θα χρησιµοποιηθούν γι αυτό το πείραµα). Η συλλογή του αίµατος έγινε µε γυάλινο τριχοειδές από την οφθαλµική κοιλότητα των πειραµατοζώων της κάθε οµάδας. Η αποµόνωση του ορού από το αίµα έγινε µε φυγοκέντρηση στις rpm για 44

45 20 λεπτά. Αποθηκεύτηκαν στους -20 ο C, καθώς θα γινόταν άµεση χρησιµοποίησή τους. Οι ιστοί που χρησιµοποιήθηκαν γι αυτό το πειραµατικό πρωτόκολλο, εγκέφαλος και νωτιαίος µυελός, αποµονώθηκαν από φυσιολογικά ζώα ηλικίας 3 ηµερών, 16 ηµερών και 3 µηνών. Η µέθοδος της θυσίας πειραµατοζώων επιλέγεται ανάλογα µε την ηλικία των ζώων και το είδος της µελέτης. Η µέθοδος θυσίας που εφαρµόσθηκε ήταν µε διακαρδιακή διήθηση και µονιµοποίηση µε παραφορµαλδεΰδη. Αυτό χρειάστηκε να γίνει µόνο για τους ενήλικες µύες, καθώς τα νεογνά και της ενδιάµεσης ηλικίας πειραµατόζωα δε χρήζουν της ανάγκης διακαρδιακής διήθησης, παρά µόνο την άµεση αποµόνωση των ιστών σε διάλυµα 4% παραφορµαλδεΰδης (PFΑ). Προτού θυσιαστούν τα πειραµατόζωα, τους έγινε έγχυση ενδοπεριτοναϊκά BrdU δύο φορές σε χρονικό διάστηµα 4 ωρών, και η τελευταία δόση δύο ώρες πριν την θυσία. Η δόση γενικά που χρησιµοποιείται σε κάθε πείραµα είναι: 60mgr / kgr ζώου. Τα ζώα ζυγίστηκαν και τους χορηγήθηκε η ακριβής ποσότητα BrdU διαλυµένη σε PBS 1X. Η διάλυση είναι δύσκολη και γίνεται υπό ανάδευση. Απαραίτητη είναι και η ρύθµιση του ph που πρέπει να κυµαίνεται µεταξύ 7,2-7,4. Συνήθως, το διάλυµα PBS + BrdU είναι όξινο και απαιτείται η προσθήκη σταγόνων NaOH. 45

46 9γ1. Θυσία µε διακαρδιακή διήθηση H πειραµατική διαδικασία ξεκινάει µε την αναισθητοποίηση του πειραµατοζώου σε περιβάλλον κορεσµένο µε αιθέρα και η εκτίµηση της αναισθησίας γίνεται µε έλεγχο αντανακλαστικού της κινητικότητας των δακτύλων των πρόσθιων και οπίσθιων άκρων µετά από πίεση τους. Έχει προετοιµαστεί η δηµιουργία ενός συστήµατος ορών, ο ένας περιέχει την PFΑ (4% Παραφορµαλδεΰδη σε PBS 1x). και ο άλλος PBS 1X (Phospate Buffer Saline), διαλύµατα τα οποία φροντιζόταν να είναι κρύα και προστίθονταν στις αντίστοιχες φιάλες του συστήµατος ορών λίγο πριν την αναισθησία του πειραµατοζώου. Στη συνέχεια το πειραµατόζωο τοποθετείται και ακινητοποιείται σε ύπτια θέση πάνω σε επιφάνεια συµπαγούς φελλού, η οποία βρίσκεται µέσα σε µεταλλική λεκάνη. Ακολουθεί η διάνοιξη του θωρακικού τοιχώµατος και η αποκάλυψη της παλλόµενης καρδιάς. Έπειτα τοποθετείται µια βελόνα, η οποία συνδέεται µε το σύστηµα ορών, στην αριστερή κοιλία της καρδιάς και το ζώο διηθείται αρχικά µε περίπου 5mL διαλύµατος PBS 1Χ,εκτέµνοντας παράλληλα τον δεξιό κόλπο της καρδιάς. Έτσι δηµιουργείται ένα ανοιχτό σύστηµα κυκλοφορίας µε διερχόµενο το PBS από όλους τους ιστούς του πειραµατοζώου. Μετά το πέρας περίπου ενός λεπτού, αλλάζει η φορά της βαλβίδας του συστήµατος ορών, παρέχοντας διάλυµα 4% PFΑ. Η παροχή της PFΑ διαρκεί περίπου 10 λεπτά κατά τα οποία διηθούνται όλοι οι ιστοί του ζώου ώστε να µονιµοποιηθούν και τέλος η PFΑ εξέρχεται του ανοιχτού δεξιού κόλπου. Κατόπιν αποµακρύνεται η βελόνα, αφαιρείται προσεκτικά ο εγκέφαλος και ο νωτιαίος µυελός και αποθηκεύονται σε διάλυµα 4% PFΑ και διατηρούνται στο ψυγείο (4 ο C) για ώρες. Ακολουθεί αλλαγή του διαλύµατος PFΑ σε PBS 1X, οι ιστοί αποθηκεύονται και πάλι στο ψυγείο µέχρι να ξεκινήσει η επεξεργασία τους για παθολογοανατοµική µελέτη. 46

47 10. Σκήνωση και µικροτόµηση ιστών Η διαδικασία της σκήνωσης είναι ο εγκλεισµός ενός ιστού σε µπλοκ παραφίνης, χρησιµεύει στη λήψη ικανοποιητικά λεπτών τοµών. Αρχικά οι ιστοί (εγκέφαλος) µετά από την παραµονή τους σε PBS 1X, τοποθετούνται σε ειδικά βαθµονοµηµένη συσκευή (molt) και κόβονται σε συγκεκριµένα mm, ανάλογα µε τις υπό µελέτη περιοχές. Συγκεκριµένα, σε αυτό το πειραµατικό πρωτόκολλο ο εγκέφαλος κόπηκε σε 4 τµήµατα πάχους 2mm, το πρώτο τµήµα περιείχε τον οσφρητικό βολβό, το δεύτερο τις κοιλίες, το τρίτο τον ιππόκαµπο και το τέταρτο την παρεγκεφαλίδα. Τα κοµµάτια αυτά τοποθετήθηκαν σε ειδικά πλαστικά µπλοκ, ξεπλύθηκαν για 1 ώρα και 30 λεπτά σε τρεχούµενο νερό βρύσης και ακολούθησε αφυδάτωσή τους, καθώς η παραφίνη δεν αναµιγνύεται µε το νερό. Η αφυδάτωση γίνεται µε εµβαπτίσεις των µπλοκ σε ανιούσα σειρά οινοπνευµάτων. Πιο συγκεκριµένα, ακολουθήθηκε η εξής διαδοχική σειρά: - 1 ώρα σε αλκοόλη 50%, - 1 ώρα σε αλκοόλη 70%, - 1 ώρα σε αλκοόλη 95%, - 30 λεπτά σε αλκοόλη 100%, - ολονύχτια παραµονή σε αλκοόλη 100% Όταν το υλικό είναι πολύ λεπτό, χρειάζεται στην αρχή αραιότερο οινόπνευµα. Εάν το οινόπνευµα είναι πυκνό, τότε η απότοµη αφυδάτωση προκαλεί συρρίκνωση του ιστού. Όσο περισσότερες είναι οι διαβαθµίσεις οινοπνεύµατος τόσο ο κίνδυνος συρρίκνωσης µικραίνει. Επειδή η παραφίνη είναι ελάχιστα διαλυτή στην αλκοόλη, µεταξύ των οινοπνευµάτων και της παραφίνης παρεµβάλλεται ένα υγρό που αναµιγνύεται εύκολα τόσο µε την παραφίνη όσο και µε την αλκοόλη. Το στάδιο αυτό καλείται «διαύγαση» γιατί τα χρησιµοποιούµενα υγρά (που είναι πτητικά) δίνουν µια ηµιδιαφανή όψη στον µέχρι τότε αδιαφανή ιστό. Τα συνηθέστερα χρησιµοποιούµενα διαυγαστικά υγρά είναι η ξυλόλη και η τολουόλη. Οπότε, την εποµένη ακολουθείται η εξής διαδικασία : 47

48 - 1 ώρα σε ξυλόλη (Ι), - 1 ώρα σε ξυλόλη (ΙΙ), - 1 ώρα σε παραφίνη (Ι), - 1 ώρα σε παραφίνη (ΙΙ) και ακολουθεί ο εγκλεισµός σε παραφίνη µέσα σε ειδικά µεταλλικά καψίδια. Αφού στερεοποιηθεί η παραφίνη, αφαιρούµε το µεταλλικό καλούπι από το κάθε ένα και παίρνουµε πλέον τα µπλοκ παραφίνης, τα οποία είναι έτοιµα να τοποθετηθούν στον ειδικό υποδοχέα µικροτόµου παραφίνης και να κοπούν σε τοµές πάχους 6µm. 11. Ανοσοϊστοχηµικές χρώσεις Σκοπός της χρώσης είναι η ανίχνευση της πρωτεϊνικής έκφρασης στα ιστικά στοιχεία µέσω απόκτησης διαφορετικών χροιών που τα καθιστούν διακριτά κατά την µικροσκοπική τους παρατήρηση. Ακολουθήθηκε συγκεκριµένο πρωτόκολλο για την ανοσοϊστοχηµεία, καθώς χρησιµοποιήσαµε για την ανίχνευση αντιγόνου, αντιορό από ποντίκι πάνω σε ιστό από ποντίκι. Αυτή η ανίχνευση του αντιγόνου καθίσταται δύσκολη µε τη συµβατική µεθοδολογία, διότι παίρνουµε ψευδώς θετικά αποτελέσµατα. Αυτό κυρίως οφείλεται στη δέσµευση του δευτέρου αντισώµατος σε ενδογενείς ανοσοσφαιρίνες και άλλα συστατικά του ιστού. Για το λόγο αυτό απαιτείται επιπρόσθετος αποκλεισµός µη ειδικής σύνδεσης µπλοκάροντας τις ενδογενείς ανοσοσφαιρίνες, ώστε να επιτύχουµε το καλύτερο, δυνατό και ξεκάθαρο αποτέλεσµα. Η πειραµατική διαδικασία ξεκινάει µε την αποπαραφίνωση των τοµών µε 2 διαλύµατα ξυλόλης και µε χρόνο παραµονής στην καθεµία 5 λεπτά και έπειτα εµβαπτίσεις σε διαδοχική κατιούσα σειρά οινοπνευµάτων 96%-50%. Το δεύτερο βήµα είναι η αναστολή της ενδογενούς υπεροξειδάσης µε χρήση διαλύµατος 10% υπεροξειδίο του υδρογόνου σε µεθανόλη για 10 λεπτά και ακόλουθο ξέπλυµα 5 λεπτών καταρχήν σε απεσταγµένο νερό και κατόπιν σε διάλυµα ΤΒS 1X (Tris-buffered saline). Το τρίτο βήµα στοχεύει στον αποκλεισµό µη-ειδικών αντιγονικών θέσεων στον ιστό και επιτελείται µε επώαση των τοµών για 30 λεπτά µε διάλυµα που 48

49 περιέχει βόειο εµβρυϊκό ορό (Fetal Bovine Serum, FBS), φυσιολογικό ορό αλόγου (Normal Horse Serum,NHS) και Τriton-X διαλυµένα σε PBS 1X. Ακολούθησε ένα πεντάλεπτο ξέπλυµα µε TBS 1X. Το τέταρτο στάδιο βοηθάει, όπως προαναφέρθηκε, στον επιπρόσθετο αποκλεισµό µη ειδικής σύνδεσης µπλοκάροντας τις ενδογενείς ανοσοσφαιρίνες, µε επώαση των τοµών µε διάλυµα PBS1X (Phosphate-buffered saline) στο οποίο έχει προστεθεί Fab fragment,goat anti-mouse (Jackson) για 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί πάλι πεντάλεπτο ξέπλυµα µε TBS 1X. Στο πέµπτο στάδιο προστίθενται τα πρώτα αντισώµατα, πολυκλωνικοί αντιοροί από ποντίκια, διαλυµένα σε TBS 1X, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Οι αντιοροί, που είχαν ληφθεί από προηγηθείσα αιµοληψία των πειραµατοζώων κάθε γκρουπ (Φυσιολογικοί µάρτυρες-naive, CFA, MOG+CFA), χρησιµοποιήθηκαν σε διάφορες αραιώσεις (τιτλοποίηση αντιορών), διότι δε γνωρίζαµε τη συγκέντρωση των αντισωµάτων στον καθένα πολυκλωνικό αντιορό και έτσι θα µπορούσαµε να οδηγηθούµε σε εσφαλµένη ένταση της έκφρασης του αντιγόνου. Κάνοντας λοιπόν την τιτλοποίηση έχουµε µια πλήρη και ακριβή εικόνα της συµπεριφοράς των διαφορετικών αντιορών. Οι διαφορετικές αραιώσεις έγιναν σε όλες τις οµάδες φυσιολογικών πειραµατοζώων (νεογνά, ενδιάµεσης ηλικίας και ενήλικα), ξεκινώντας από την πιο πυκνή συνηθισµένη χρησιµοποίηση αντισωµάτων για ανοσοϊστοχηµεία, 1:100 και σταµάτησαν στη συγκέντρωση 1:4000 για τα νεογνά, 1:2000 για τα ενδιάµεσης ηλικίας και 1:1000 για τα ενήλικα. Τέλος, χρησιµοποιήθηκαν τοµές ως αρνητικός έλεγχος (negative control), στις οποίες δεν έγινε προσθήκη του πρώτου αντισώµατος, έτσι ώστε να ανιχνευτεί οποιαδήποτε κάθε µη-ειδική σύνδεση και ψευδή χρώση από τα δεύτερα αντισώµατα. Σ αυτές τις τοµές προστέθηκε µόνο ο διαλύτης των ορών, δηλαδή σκέτο TBS 1X. Μετά την επώαση οι τοµές ξεπλύθηκαν 3 φορές από 5 λεπτά µε TBS 1X. Ακολουθεί εφαρµογή του δεύτερου αντισώµατος, το οποίο είναι βιοτυνιλιωµένο horse anti-mouse IgG για τους πολυκλωνικούς αντιορούς σε διάλυση 1:200 σε TBS 1X, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Πλύσεις πεντάλεπτες µε TBS 1X. Έγινε µια τελική ωριαία επώαση των τοµών µε αβιδίνη συνδεδεµένη µε υπεροξειδάση, έτσι ώστε να γίνει το σύµπλεγµα αβιδίνης- βιοτίνηςυπεροξειδάση. 49

50 Αφού ξεπλύθηκαν οι τοµές µε TBS 1Χ, η υπεροξειδάση βοηθάει στην οπτικοποίηση των ανοσοαντιδράσεων µέσω της προσθήκης της χρωστικής υδροχλωρική τετρα-υδροχλωρική 3,3 διαµινοβενζιδίνη (3,3 diaminobenzidinetetra-hydrochloride,dab, Fluka). Ξέπλυµα µε απεσταγµένο νερό. Στο τελευταίο στάδιο οι τοµές εµβαπτίστηκαν σε διάλυµα αιµατοξυλίνης (2-3 εµβαπτίσεις ) και ακολούθησε ξέπλυµα µε νερό βρύσης. Έγινε αφυδάτωση των τοµών µε ανιούσα σειρά οινοπνευµάτων (50%-96%), δεκάλεπτη παραµονή σε N-butyl acetate, προστέθηκαν σταγόνες από ειδικό υλικό συγκόλλησης (entellan) και καλύφθηκαν µε καλυπτρίδα. Οι τοµές διατηρούνται σε θερµοκρασία δωµατίου µέχρι τη µελέτη τους στο οπτικό µικροσκόπιο. 12. ιπλός ανοσοφθορισµός Ο διπλός ανοσοφθορισµός χρησιµοποιήθηκε µε σκοπό να προσδιοριστεί αν ο αντιορός MOG είχε συνέκφραση µε στελεχιαία κύτταρα του εγκεφάλου. Οι ιστοί όπως αναφέρθηκε παραπάνω προέκυψαν από naive ζώα στα οποία τους είχε γίνει έγχυση BrdU λίγες ώρες πριν θυσιαστούν. Συνεπώς, ως πρώτο αντίσωµα χρησιµοποιήσαµε anti-brdu (Abcam) σε συνδυασµό µε αντιορό MOG και αντίσωµα MOG (R&D). Το πρωτόκολλο που χρησιµοποιήσαµε για τον ανοσοφθορισµό έχει κάποια κοινά στάδια µε αυτό της ανοσοϊστοχηµείας. Η διαφορά εντοπίζεται στο αρχικό στάδιο της πειραµατικής διαδικασίας, που στοχεύει στην αποδιάταξη του πυρηνικού DNA του κυττάρου προκειµένου να αποκαλυφθεί στο πρώτο αντίσωµα η ενσωµατωµένη BrdU. Αρχικά οι τοµές αποπαραφινώθηκαν σε διαλύµατα ξυλόλης (2 διαλύµατα από 5 λεπτά στο καθένα) και ακολούθησαν εµβαπτίσεις σε κατιούσα σειρά οινοπνευµάτων (96%-50%). Έγιναν 2 πεντάλεπτες πλύσεις, πρώτα σε απεσταγµένο νερό και έπειτα σε TBS 1X. Στη συνέχεια, ακολουθεί το διαφορετικό βήµα της αποδιάταξης της διπλής αλύσου DNA µε χρήση διαλύµατος υδροχλωρικού οξέως 2N (92,71ml απεσταγµένο νερό και 7,29ml HCl 37%) για 30 λεπτά στους 37 ο C. Ακολούθησαν 2 πεντάλεπτες πλύσεις µε διάλυµα 0,1M BORAX (2gr στα 100ml απεσταγµένου νερού), το οποίο σταµατάει τη δράση του HCl και 1 πεντάλεπτη πλύση µε TBS 1X. 50

51 Το επόµενο στάδιο είναι ο αποκλεισµός των µη-ειδικών αντιγονικών θέσεων στον ιστό µε επώαση για 30 λεπτά µε διάλυµα 10% βόειου εµβρυϊκού ορού (Fetal Bovine Serum, FBS), φυσιολογικό ορό αίγας (Normal Goat Serum,NGS) και Τriton-X διαλυµένα σε PBS 1X. Ακολούθησε ένα πεντάλεπτο ξέπλυµα µε TBS 1X. Eπειδή πάλι θα χρησιµοποιούσαµε ως πρώτο αντίσωµα αντιορό από ποντίκι χρειάζεται ένας επιπρόσθετος αποκλεισµός µη ειδικής σύνδεσης µπλοκάροντας τις ενδογενείς ανοσοσφαιρίνες, µε επώαση των τοµών µε διάλυµα PBS1X στο οποίο έχει προστεθεί Fab fragment, goat anti-mouse (Jackson) για 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθεί πάλι πεντάλεπτο ξέπλυµα µε TBS 1X. Στο επόµενο βήµα γίνεται εφαρµογή των ζευγών πρώτων αντισωµάτων, δηλαδή οι διαφορετικοί αντιοροί µε anti-βrdu µονοκλωνικό αντίσωµα επίµυος (Abcam): α) MOG αντιορός + anti-βrdu β) anti-mog (R&D) + anti-βrdu Οι συγκεντρώσεις στις οποίες χρησιµοποιήθηκε ο αντιορός προέκυψαν από διαδοχικές αραιώσεις (τιτλοποίηση), ξεκινώντας από 1:50 για τον καθένα ξεχωριστά και καταλήγοντας στην 1:3000 για τα νεογνά, 1:2000 για τα ενδιάµεσης ηλικίας και 1:1000 για τα ενήλικα. Το αντίσωµα anti-mog (R&D) εφαρµόστηκε µε συγκέντρωση 5µg/ml και το αντίσωµα έναντι της BrdU µε διάλυση 1:500. Όλα τα αντισώµατα διαλύθηκαν σε TBS 1X. Ακόµα, χρησιµοποιήθηκαν τοµές ως αρνητικός έλεγχος (negative control), στις οποίες δεν έγινε προσθήκη του πρώτου αντισώµατος και η επώαση διήρκησε περίπου 20 ώρες στους 4 ο C. Την εποµένη οι τοµές ξεπλύθηκαν 3 φορές από 5 λεπτά µε TBS 1X και ακολούθησε η εφαρµογή κατάλληλων για φθορισµό ζευγών δεύτερων αντισωµάτων. Συγκεκριµένα, για τους πολυκλωνικούς αντιορούς χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα goat anti-mouse (Biotium 555) το οποίο δίνει κόκκινο φθορισµό και για την BrdU το goat anti-rat FITC (AlexaFluor 488) που αντιστοιχεί στον πράσινο φθορισµό. Για το αντίσωµα MOG-R&D χρησιµοποιήθηκε το αντίσωµα donkey anti-goat (Alexa Fluor 568) το οποίο δίνει κόκκινο χρώµα και για την BrdU χρησιµοποιήθηκε το goat anti-rat FITC 51

52 (AlexaFluor 488) που αντιστοιχεί στον πράσινο φθορισµό. Η διάλυση όλων των δεύτερων αντισωµάτων έγινε σε TBS 1X. Πλύσεις πεντάλεπτες µε TBS 1X. Ακολούθησε 30 λεπτά επώαση µε διάλυµα Hoechst που ανήκει σε µια οικογένεια φθοριζουσών χρωστικών µε χαρακτηριστικό µπλε χρώµα, βάφοντας τον πυρήνα (DNA). Πλύσεις µε TBS 1X, 3 φορές επί 5 λεπτά. Η διαδικασία ολοκληρώνεται µε προσθήκη περίπου 20µl συγκολλητικού διαλύµατος Antifate πάνω στις τοµές ώστε να καλυφθούν και να κολλήσει η καλυπτρίδα. Οι τοµές διατηρούνται σε σκοτεινό µέρος στους 4 ο C µέχρι την παρατήρησή τους στο µικροσκόπιο φθορισµού. 13. Μικροσκοπική παρατήρηση και Μετρήσεις Η παθολογοανατοµική µελέτη των παρασκευασµάτων από τις ανοσοϊστοχηµικές χρώσεις και χρώσεις φθορισµού έγιναν µε τη βοήθεια µικροσκοπίου οπτικού και φθορισµού (Zeiss Axioplan2). Η λήψη των φωτογραφιών πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση κάµερας (Nikon) συνδεµένης στο µικροσκόπιο και αποθήκευση αυτών σε κάρτα µνήµης. Η ανάλυση των φωτογραφιών και η πραγµατοποίηση των µετρήσεων έγινε µε το πρόγραµµα ImageJ ver.1.44o, Wayne Rasband (NIH). 14. Καλλιέργεια Στελεχιαίων Προγονικών Κυττάρων του ΚΝΣ από µύες Η καλλιέργεια των στελεχιαίων προγονικών κυττάρων (ΣΠΚ) πραγµατοποιήθηκε µέσα σε απαγωγό νηµατικής ροής (laminar flow), έτσι ώστε όλες οι διαδικασίες να γίνονται υπό στείρες συνθήκες. Τα ΣΠΚ αποµονώθηκαν από εγκεφάλους νεογνών (1-3 ηµερών) της φυλής C56BL/6 και για µία καλλιέργεια θυσιάζονται 6-8 πειραµατόζωα. Αρχικά, τα νεογνά τοποθετήθηκαν µέσα σε τρυβλίο µε 70% αιθανόλη ώστε να αναισθητοποιηθούν. Έπειτα ετοιµάστηκε άλλο τρυβλίο µε καλλιεργητικό µέσο ΜΕΜ-ΗΕΡΕS (Gibco) στο οποίο τοποθετήθηκαν οι εγκέφαλοι που αποµονώθηκαν από τα νεογνά. Τα τρυβλία αυτά βρισκόταν πάνω σε πάγο και όλη η διαδικασία επεξεργασίας του ιστού γινόταν εκεί ώστε να διατηρηθεί ο 52

53 ιστός κρύος. Όταν όλοι οι εγκέφαλοι είχαν συλλεχθεί ακολουθούσε η αφαίρεση του στελέχους και της παρεγκεφαλίδας και τα εναποµείναντα εγκεφαλικά ηµισφαίρια τοποθετούνταν κάτω από το στερεοσκόπιο ώστε να γίνει και η αφαίρεση των µηνίγγων. Το στάδιο αυτό είναι πολύ σηµαντικό καθώς τα κύτταρα έχουν την τάση να προσκολλούν στις µήνιγγες και έτσι να αναστέλλεται η ανάπτυξη των ΣΠΚ σε νευροσφαιρίδια. Ο καθαρός ιστός διασπάστηκε µηχανικά µε νυστέρι (50 κάθετες και 50 οριζόντιες τοµές) και συλλέχθηκε µαζί µε 25ml προθερµασµένης θρυψίνης (37 ο C) σε σωληνάριο όγκου 50ml. Ακολούθησε επώαση αυτού σε θερµοκρασία 37 C για 20 λεπτά ακριβώς, τόσο ώστε να πραγµατοποιηθεί η ενζυµική διάσπαση και µην καθίσταται τοξική και καταστρέψει τα κύτταρα. Μετά το πέρας των 20 λεπτών για να σταµατήσει η δράση της θρυψίνης προστέθηκαν 500µl αναστολέας θρυψίνης (trypsin inhibitor). Μετά από 2-3 λεπτά, αφού έχει κατασταλεί η αντίδραση, προστέθηκαν 500µl MgSO4 και 250µl εοξυριβονουκλεάση (DNase) και έγινε φυγοκέντρηση στους 25 C µέχρι τις 2000rpm. Ετοιµάστηκαν 20 ml διαλύµατος κονιορτοποίησης (trituration solution) που περιείχε 800µl DNase, 400µl MgSO4 και 18,8ml MEM-Hepes. Αφού τελείωσε η φυγοκέντρηση αφαιρέθηκε το υπερκείµενο, το ίζηµα επαναδιαλύθηκε σε 10 ml διαλύµατος κονιορτοποίησης και χωρίστηκε ισόποσα (από 5ml) σε 2 σωληνάρια 50ml. Στη συνέχεια χρησιµοποιώντας σωληνάριο των 5 ml έγιναν περίπου 15 αναρροφήσειςεγχύσεις υπό γωνία 90, ώστε να σπάσει ακόµα περισσότερο ο ιστός και να διαχωριστούν τα κύτταρα. Το εναιώρηµα µένει σε ηρεµία για περίπου 10 λεπτά, ώστε να καθιζάνουν αδιάσπαστα τµήµατα ιστού (ίζηµα) και να µείνουν στο υπερκείµενο τα κύτταρα. Μόλις παρατηρήθηκε ότι έγινε καλός διαχωρισµός ιζήµατος υπερκειµένου, συλλέχτηκε η περισσότερη ποσότητα του υπερκειµένου σε καθαρό σωληνάριο 50ml. Στα ιζήµατα των 2 σωληναρίων προστέθηκε ξανά από 5ml διαλύµατος κονιορτοποίησης και επαναλήφθηκε η ίδια διαδικασία (αναρροφήσεις- εγχύσεις). Έπειτα µετά το πέρας 10 λεπτών ηρεµίας του διαλύµατος συλλέχθηκε πάλι το υπερκείµενο (κύτταρα) στο 50ml σωληνάριο. Εν συνεχεία προστέθηκε στον πάτο του σωληναρίου µε τα κύτταρα 1ml BSA 4% και έγινε φυγοκέντρηση στα 800rpm για 8 λεπτά. Έτσι στο ίζηµα είχαµε τα κύτταρα και στο υπερκείµενο ακαθαρσίες. Το ίζηµα ανασυστάθηκε µε 4,5ml καλλιεργητικού διαλύµατος Ν2 (Ν2 medium) και πραγµατοποιήθηκε 53

54 καταµέτρηση του αριθµού των κυττάρων. Συγκεκριµένα αφού έγινε καλή ανάδευση του διαλύµατος, 50µl από το διάλυµα των κυττάρων προστέθηκαν σε 50µl χρωστικής trypan blue 4% ώστε να γίνει µέτρηση του αριθµού των κυττάρων σε πλάκα Neubauer και υπολογίστηκε ο συνολικός αριθµός των κυττάρων σύµφωνα µε τον τύπο : Α x 2 x 5 x x 5 (όπου Α είναι ο αριθµός των κυττάρων που µετρήθηκαν, το 2 δηλώνει τη διάλυση των κυττάρων στη χρωστική, το 5 είναι ο αριθµός των τετραγώνων που µετρούνταν στην πλάκα Neubauer, το είναι η αναγωγή στο 1 ml, και το 5 είναι η αναγωγή στα 5 ml του θρεπτικού µέσου που βρίσκονται διαλυµένα τα κύτταρα). Με βάση τον αριθµό των κυττάρων που προέκυψαν από την καλλιέργεια χωρίστηκαν σε τόσες καλλιεργητικές φλάσκες Τ75 (Corning), ώστε να περιέχουν σε 10ml N2 καλλιεργητικού µέσου x 10 6 κύτταρα. Η συγκέντρωση των κυττάρων είναι τέτοια ώστε να µπορούν τα κύτταρα να πολλαπλασιάζονται και στο τέλος να σχηµατίσουν νευροσφαιρίδια. Οι φλάσκες διατηρούνται σε επωαστικό κλίβανο µε σταθερές συνθήκες 10% CO 2 και 37 C. Στην κάθε φλάσκα καθηµερινά γινόταν έγχυση αυξητικών παραγόντων, bfgf (R&D) και EGF (R&D) σε συγκέντρωση 1µl/ml καλλιεργητικού υλικού Ν2. Οι παράγοντες αυτοί εµποδίζουν την προσκόλληση και διαφοροποίηση των ΣΠΚ, ενισχύοντας τον πολλαπλασιασµό τους. Το καλλιεργητικό µέσο Ν2 είναι κατάλληλο για την επιβίωση και ανάπτυξη µόνο των ΣΠΚ (τα υπόλοιπα κύτταρα δεν επιβιώνουν) αποτελείται από (για 100 ml του Ν2: 1) 1ml human apotransferin (Sigma) 2) 1ml Bovine Serum Albumin 5% (Fluka) 3) 1ml sodium pyruvate (Gibco) 4) 1ml L- glutamine (Gibco) 5) 250 µl Bovine Insulin (Sigma) 6) 250 µl gentamycin (Sigma) 7) 100 µl d- biotin (Sigma) 8) 100 µl putrescine (Sigma) 9) 100 µl progesterone (Sigma) 10) 100 µl sodium selenite (Sigma) 54

55 διαλυµένα σε 95,2ml βασικού διαλύµατος DMEM-F12 (Gibco). To διάλυµα φιλταριζόταν µε ειδικό φίλτρο και διατηρούνταν στους 4 C για 7 ηµέρες. Τη δεύτερη µέρα της καλλιέργειας τα ΣΠΚ αποτελούν περίπου το 0.2% του συνολικού κυτταρικού πληθυσµού και για την αποµάκρυνση των µη επιθυµητών κυττάρων συλλέχθηκε το περιεχόµενο κάθε φλάσκας και φυγοκεντρήθηκε στα 700 rpm για 7 λεπτά. Αφού αφαιρέθηκε το υπερκείµενο έγινε ανασύσταση του ιζήµατος (ΣΠΚ) σε καλλιεργητικό διάλυµα Ν2 στο µισό του αρχικού όγκου (5ml) και στη συνέχεια χωρίστηκαν τα κύτταρα σε φλάσκες Τ25 (Corning, 5 ml ανά φλάσκα) και τοποθετήθηκαν ξανά στον επωαστικό κλίβανο στους 37 C και 10% CO 2. Η καλλιέργεια συνεχίστηκε µε καθηµερινή προσθήκη µιτογόνων παραγόντων (bfgf, EGF) µέχρι την ηµέρα 7, όπου σχηµατίστηκαν συσσωµατώµατα κυττάρων (περίπου 100 κύτταρα), τα νευροσφαιρίδια. Αφού συλλέχθηκαν τα αιωρούµενα νευροσφαιρίδια, φυγοκεντρήθηκαν στα 700rpm για 9 λεπτά, έγιναν 2 πλύσεις µε φιλτραρισµένο PBS1X, µετρήθηκαν στην πλάκα Neubaeur, φυγοκεντρήθηκαν πάλι στα 700rpm για 9 λεπτά και το ίζηµα αποθηκεύτηκε στους -20 ο C. 15. Στύπωµα κατά Western (Western blotting) Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης βασίζεται σε εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου σε πρωτεϊνικό διάλυµα ώστε τα µόρια να µεταναστεύσουν προς µία ορισµένη κατεύθυνση. Ο διαχωρισµός των πρωτεϊνών έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαµίδης- SDS (SDS-PAGE). Η διαδικασία του στυπώµατος κατά Western ξεκίνησε µε την προετοιµασία των πηκτών πολυακρυλαµίδης. Αρχικά στην ειδική συσκευή ετοιµάστηκε separating gel πολυακρυλαµίδης 10% (sterile water, 30% πολυακρυλαµίδη, Tris 1.5Μ ph :8.8, SDS 10% -Sodium dodecyl sulfate, APS 10% -Ammonium persulfate και ΤΕΜΕD- Tetramethylethylenediamine). Μετά την πήξη της πηκτής προστέθηκε από πάνω το stacking gel 4% (sterile water, 30% πολυακρυλαµίδη, Tris 1.5Μ ph:6.8, SDS 10%,APS 10% και ΤΕΜΕD) και το ειδικό χτενάκι που θα σχηµατίσει τα πηγαδάκια. Οι πηκτές τοποθετήθηκαν στην ειδική συσκευή ηλεκτροφόρησης. Προστέθηκε Running Buffer 1X (Tris-HCl,Glycine,SDS) και έπειτα φορτώθηκαν τα δείγµατα. 55

56 Τα υποστρώµατα (δείγµατα) που χρησιµοποιήθηκαν για το Western blot ήταν ολικό εκχύλισµα πρωτεϊνών από ΣΠΚ και από ιστό νωτιαίου µυελού από φυσιολογικό µυ. Προσδιορίστηκε η ολική πρωτεΐνη µε τη µέθoδο Bradford, που στηρίζεται στη δέσµευση της πρωτεΐνης στη χρησιµοποιούµενη χρωστική που απορροφά σε µήκος κύµατος nm. Για την κατασκευή της πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιήθηκε διάλυµα BSA (αλβουµίνη από ορό βοδιού) συγκέντρωσης 0.2 mg/ml. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που φορτώθηκε και από τα δύο δείγµατα ήταν 20µg και αντιστοιχούσε σε 10µl πρωτεϊνικό εκχύλισµα κυττάρων και 8µl πρωτεϊνικό εκχύλισµα ιστού. Πριν φορτωθούν τα δείγµατα αραιώθηκαν σε Loading Buffer 1X, το οποίο περιέχει γλυκερόλη, Tris-HCl, 2-µερκαπτοαιθανόλη ή DTT και SDS. Τα ηλεκτραρνητικά µόρια του δωδεκυλοθειϊκού νατρίου έχουν απορρυπαντική δράση καθώς διαλυτοποιούν τις πρωτεΐνες, σχηµατίζουν σύµπλοκο µε τα µόρια αυτά ( φορτίζουν τις πρωτεΐνες αρνητικά) και µεταναστεύουν διαµέσου της πορώδους πηκτής πολυακρυλαµίδης. Η µερκαπτοαιθανόλη είναι ένας αναγωγικός παράγοντας που προστίθεται για να διασπαστούν οι δισουλφιδικοί δεσµοί των πρωτεϊνών. Κάτω από αυτές τις συνθήκες οι πρωτεΐνες µεταναστεύουν µε ταχύτητα που αντανακλά το µοριακό βάρος τους. Έπειτα τα δείγµατα (διαλυµένα στο loading buffer) και ο marker (µείγµα πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους) βράσανε για 7 λεπτά στους 96 ο C και φυγοκεντρήθηκαν για δευτερόλεπτα. H ηλεκτροφόρηση γίνεται περίπου στα 150V, 26mA για περίπου 60 λεπτά. Το επόµενο βήµα που ακολουθεί είναι η ηλεκτροµεταφορά (transfer), δηλαδή η µεταφορά των πρωτεϊνών από την πηκτή σε µεµβράνη από διφθοριούχο πολυβινυλιδένιο (polyvinylidene difluoride, PVDF). Το βήµα αυτό στηρίζεται τόσο στις υδροφοβικές, όσο και στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πρωτεϊνών και της µεµβράνης. Αρχικά έγινε διαβροχή της συσκευής µε Transfer Buffer 1X (Tris-HCl, Glycine,Methanol,SDS) και ετοιµάσαµε την κασέτα που τοποθετείται µέσα στη συσκευή. Η κασέτα περιλαµβάνει σε συγκεκριµένη σειρά από την κάθοδο προς την άνοδο: 1 σφουγγαράκι, 3 χαρτάκια Whattmann, το gel, τη µεµβράνη, 3 χαρτάκια Whattmann και τέλος 1 σφουγγαράκι. Η διαδικασία της ηλεκτροµεταφοράς έγινε στα 100V, µε περίπου 250mA,στους 4 ο C, για 2 ώρες. Όταν τελείωσε η ηλεκτροµεταφορά, αφαιρέθηκε προσεκτικά η µεµβράνη και ελέγχθηκε αν έγινε σωστά η µεταφορά των πρωτεϊνών, επαληθεύοντας εάν έχει µεταφερθεί ο marker και κάνοντας χρώση της µεµβράνης µε τη χρωστική Ponceau Stain. Αφού εµφανίστηκαν οι µπάντες η µεµβράνη κόπηκε προσεκτικά σε τόσα 56

57 τµήµατα ανάλογα µε τα αντισώµατα που θέλαµε να βάψουµε. Η µεµβράνη ξεβάφτηκε από τη χρωστική µε NaOH 0.1M και ακολούθησε ξέπλυµα µε sterile water και PBST 1X (Phosphate buffered saline µε Τween %). Στη συνέχεια τα κοµµένα τµήµατα της µεµβράνης επωάστηκαν µε blocking buffer, το οποίο περιέχει 5% σκόνη αποβουτυρωµένου γάλακτος διαλυµένο σε PBST 1X, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Έπειτα έγινε µια δίλεπτη πλύση µε PBST 1X και ακολούθησε επώαση των τµηµάτων µε τα πρώτα αντισώµατα, τους πολυκλωνικούς αντιορούς Φυσιολογικό µάρτυρα (NAIVE),CFA, MOG+CFA και το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της MOG (goat anti-mmog,r&d). Οι αντιοροί χρησιµοποιήθηκαν σε αραίωση 1:200 και το εµπορικό αντίσωµα σε συγκέντρωση 400ng/ml, διαλυµένα σε blocking buffer. Επίσης ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε η β- ακτίνη. Η επώαση διήρκησε περίπου 16 ώρες στους 4 ο C. Την εποµένη τα τµήµατα µεµβράνης ξεπλύθηκαν µε PBST1X για 30 λεπτά (1 πλύση δεκαπεντάλεπτη και 3 πεντάλεπτες). Ακολούθησε εφαρµογή των δεύτερων αντισωµάτων που ήταν κατάλληλα για τα πρώτα αντισώµατα και συνδεδεµένα µε HRP (horseradish peroxidase), ένζυµο που βοηθάει στην ανίχνευση της πρωτεΐνης κατά την εµφάνισή της στο φιλµ. Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν είναι το HRP rabbit anti-mouse (Pierce) για τους αντιορούς, το HRP goat anti-rabbit (Pierce) για την ακτίνη και το HRP donkey anti-goat (R&D) για το anti-mog (R&D) σε συγκέντρωση 800ng/ml, 100ng/ml και 100ng/ml αντίστοιχα (διαλυµένα σε blocking buffer). Πραγµατοποιήθηκε επώαση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου και µετά το πέρας του χρόνου αυτού έγιναν πλύσεις µε PBST1X για 30 λεπτά (1 πλύση δεκαπεντάλεπτη και 3 πεντάλεπτες). Το τελικό στάδιο είναι η εµφάνιση της µεµβράνης σε σκοτεινό θάλαµο. Η ανίχνευση γίνεται µέσω εφαρµογή ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας (ΕCL). Το ECL είναι µείγµα λουµινόλης και υπεροξειδίου του υδρογόνου, το οποίο είναι φωτοευαίσθητο. Η εκποµπή φωτός (φωτονίων) στο φωτογραφικό φιλµ στηρίζεται στην αντίδραση της λουµινόλης µε το οξειδωτικό µέσο (HRP). Αφήσαµε φιλµ (Κodak) µε διαφορετικούς χρόνους έκθεσης, τα οποία εµφανίστηκαν µε ειδικά φωτογραφικά υγρά, Developer και Fixative (Kodak). 57

58 16. Στατιστική Ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσµάτων ανοσοϊστοχηµείας πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του προγράµµατος GraphPad Prism 5. ιενεργήθη έλεγχος κανονικότητας µε το Kolmogorov-Smirnov και Shapiro-Wilk test. Χρησιµοποιήθηκαν τα παραµετρικά τεστ One-way Analysis of Variance και τα Post hoc τεστ Bonferroni, ώστε να εκτιµηθούν οι στατιστικές διαφορές µεταξύ των οµάδων. Οι τιµές εκφράζονται ως µέσες τιµές ± τυπική απόκλιση και όλες οι διαπιστώσεις έγιναν µε διάστηµα εµπιστοσύνης 95% και θεωρήθηκαν σηµαντικές στο p<0,05. 58

59 17. Αποτελέσµατα 17.1 Αποτελέσµατα Στυπώµατος κατά Western Επιλέξαµε επίσης να µελετήσουµε την έκφραση των πολυκλωνικών αντιορών (Φυσιολογικός µάρτυρας-naιve, CFA, MOG) και anti-mog(r&d) σε υπόστρωµα κυττάρων, ΣΠΚ και ιστού, Νωτιαίου Μυελού. Τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από το στύπωµα (Western blot) είναι τα εξής: Εικόνα 13. Στύπωµα (µετά από ανάλυση µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE) στο οποίο ανιχνεύεται η έκφραση των αντιορών σε υπόστρωµα ολικής πρωτεΐνης από ΣΠΚ µυών. Παρατηρούµε ότι ο πολυκλωνικός αντιορός έναντι της MOG δίνει δύο διακριτές µπάντες στα 60 ΚDa και στα ΚDa. 59

60 Εικόνα 14. Στύπωµα (µετά από ανάλυση µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE) στο οποίο ανιχνεύεται η έκφραση των αντιορών σε υπόστρωµα ολικής πρωτεΐνης από Νωτιαίο µυελό φυσιολογικού ποντικού. Παρατηρούµε ότι ο πολυκλωνικός αντιορός έναντι της MOG δίνει δύο διακριτές µπάντες στα 26ΚDa και στα 30ΚDa, και δύο πολύ αχνές στα ΚDa.. 60

61 17.2 Παθολογοανατοµικά αποτελέσµατα 17.2α Αποτελέσµατα Ανοσοϊστοχηµείας και Μετρήσεις Στην παρακάτω εικόνα παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα από την επώαση φυσιολογικών εγκεφάλων µυών µε πολυκλωνικούς αντιορούς από τις τρεις οµάδες πειραµατοζώων (Φυσιολογικός µάρτυρας-naιve,cfa,mog). Οι τοµές των φυσιολογικών ιστών είναι τριών διαφορετικών ηλικιών, νεογνά (P4),ενδιάµεσης ηλικίας (Ρ16) και ενήλικα(3µηνών). Εικόνα 15. Τοµές εγκεφάλου Νεογνών, Ρ16 και Ενηλίκων. Έκφραση των πολυκλωνικών αντιορών Φυσιολογικός µάρτυρας-naιve,cfa,mog (1:100) στην Υποκοιλιακή Ζώνη (ΥΚΖ). Με µπλε χρώµα απεικονίζονται οι πυρήνες (H&E) και µε καφέ το σήµα (DAB).Μεγέθυνση 40Χ. 61

62 Παρατηρήθηκε ότι στην αραίωση 1:100 υπάρχει ψευδώς θετικό σήµα από τον καθένα πολυκλωνικό αντιορό και θα µπορούσαµε να οδηγηθούµε σε εσφαλµένη εκτίµηση της έκφρασης του αντιγόνου. Οπότε, παρόλο που αναγνωρίζεται αύξηση της έντασης του πολυκλωνικού αντιορού έναντι της MOG και στις τρεις οµάδες των ηλικιών, για να έχουµε πλήρη και ακριβή εικόνα της συµπεριφοράς των διαφορετικών ορών πραγµατοποιήθηκε τιτλοποίησή τους (διαδοχικές αραιώσεις), ώστε να χαθεί το ψευδώς θετικό σήµα και όχι το σήµα του κάθε αντιορού. Εποµένως, στην επόµενη εικόνα απεικονίζεται η έκφραση των αντιορών στην κατάλληλη αραίωση για τις διαφορετικές οµάδες ηλικιών. Εικόνα 16. Τοµές εγκεφάλου Νεογνών, Ρ16 και Ενηλίκων. Έκφραση των πολυκλωνικών αντιορών Φυσιολογικός µάρτυρας-naιve,cfa,mog (χρήση τιτλοποιηµένων αντιορών) στην Υποκοιλιακή Ζώνη (ΥΚΖ). Με µπλε χρώµα απεικονίζονται οι πυρήνες (H&E) και µε καφέ το σήµα (DAB).Μεγέθυνση 40Χ. 62

63 Προκειµένου να εκτιµήσουµε ακριβώς το πόσα θετικά κύτταρα (καφέ χρώµα) έχουµε από την δέσµευση κάθε αντιορού σε φυσιολογικούς ιστούς των τριών ηλικιών, έγιναν µετρήσεις του αριθµού των θετικών κυττάρων ανά mm 2 στην ίδια έκταση περικοιλιακής περιοχής. Τα αποτελέσµατα από 5 διαφορετικά φυσιολογικά ζώα (Μέσος όρος µετρήσεων) για κάθε στάδιο ανάπτυξης φαίνονται στα παρακάτω διαγράµµατα: Α)Νεογνά Εικόνα 17. Μέσος όρος θετικών κυττάρων στην περικοιλιακή περιοχή φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου νεογνών µυών, ύστερα από επώασή τους µε αντιορό Φυσιολογικός µάρτυρας-ναιve,cfa,mog και anti-mog-r&d. 63

64 Β)Ρ.16 Εικόνα 18. Μέσος όρος θετικών κυττάρων στην περικοιλιακή περιοχή φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου Ρ.16 µυών, ύστερα από επώασή τους µε αντιορό Φυσιολογικός µάρτυρας -ΝΑΙVE,CFA,MOG και anti-mog-r&d. 64

65 Γ)Ενήλικα Εικόνα 19. Μέσος όρος θετικών κυττάρων στην περικοιλιακή περιοχή φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου ενήλικων µυών, ύστερα από επώασή τους µε αντιορό Φυσιολογικός µάρτυρας-ναιve,cfa,mog και anti-mog-r&d. 65

66 Εικόνα 20. Μέσος όρος θετικών κυττάρων στην περικοιλιακή περιοχή φυσιολογικών τοµών εγκεφάλου ενήλικων µυών, ύστερα από επώασή τους µε αντιορό MOG. Πραγµατοποιήθηκαν: Ρarametric test: One-way analysis of Variance, για να ελεγχθεί η στατιστική σηµαντικότητα µεταξύ όλων των διαφορετικών αντιορών. Post hoc test: Bonferroni, έτσι ώστε συγκριθούν οι οµάδες ανά δύο, βαθµολογώντας µε * την διαφορά ως στατιστικά σηµαντική, ** ως µέτρια σηµαντική και µε *** ως πολύ σηµαντική. 66