TMHMA ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ. Επιμέλεια: Αργυρώ Μπεκατώρου

Transcript

1 TMHMA ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ Επιμέλεια: Αργυρώ Μπεκατώρου Πάτρα

2 ΑΣΚΗΣΕΙΣ Άσκηση 1. Ανάλυση αλευριού. α. Προσδιορισμός υγρής και ξηρής γλουτένης β. Ανίχνευση οξειδωτικών Άσκηση 2. Ανάλυση ποιότητας ελαιολάδου. α. Προσδιορισμός βαθμού οξύτητας β. Προσδιορισμός αριθμού σαπωνοποίησης γ. Ανάλυση λίπους σε τρόφιμα β. Ανίχνευση νοθείας ελαίων με παραφινέλαιο γ. Ανίχνευση των αντιοξειδωτικών BHT και PG στα έλαια Άσκηση 3. Προσδιορισμός σακχάρων, αιθανόλης και οργανικών οξέων με HPLC (ανιχνευτές RID & DAD). Άσκηση 4. Ανάλυση αλκοολούχων ποτών με αέρια χρωματογραφία (GC-FID) και ανίχνευση νοθείας. α. Προσδιορισμός αιθανόλης β. Προσδιορισμός μεθανόλης Άσκηση 5. Μέθοδος ΝΜR επίδειξη οργάνου και εφαρμογές στην ανάλυση τροφίμων. Άσκηση 6. Ανάλυση ιχνοστοιχείων σε τρόφιμα με ατομική απορρόφηση (AAS) 2

3 ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΤΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Παρακάτω αναφέρονται οι κανόνες που διέπουν την εργαστηριακή εξάσκηση των φοιτητών στο εργαστήριο Χηµείας Τροφίµων. 1. Η προσέλευση στο εργαστήριο πρέπει να γίνεται κατά την κανονισµένη ώρα ενάρξεως των ασκήσεων. 2. Aπαραίτητες προϋποθέσεις για την εκτέλεση της άσκησης είναι: α. Η επαρκής µελέτη του θεωρητικού µέρους της άσκησης. Αυτό διαπιστώνεται µε προφορική ή σύντοµη γραπτή εξέταση από τον υπεύθυνο της άσκησης. β. Παράδοση έκθεσης της προηγούµενης άσκησης στον υπεύθυνο της άσκησης. 3. Ο βαθµός κάθε άσκησης (0-10) είναι ο µέσος όρος των βαθµών της προφορικής εξέτασης, της εργαστηριακής επιδεξιότητας κατά την εκτέλεση της άσκησης και της τελικής έκθεσης. 4. Για κάθε άσκηση που δεν εκτελείται λόγω αδικαιολόγητης απουσίας ο ασκούµενος παίρνει βαθµό µηδέν (0). Με µια απουσία θεωρείται πως έχει ασκηθεί ελλιπώς και µε δύο απουσίες λίαν ελλιπώς. Σε όσους απουσιάζουν δικαιολογηµένα δίνεται η ευκαιρία µέσα σε δύο µόνο συµπληρωµατικές εργαστηριακές περιόδους να συµπληρώσουν τις ασκήσεις που δεν εκτελέστηκαν. Κατά την παραπάνω χρονική περίοδο παρέχεται επίσης η ευκαιρία στον ασκούµενο να επαναλάβει άσκηση στην οποία έχει βαθµό κάτω του πέντε (5). Ο λίαν ελλιπώς ασκούµενος φοιτητής υποχρεώνεται να συµπληρώσει τις υπόλοιπες εργαστηριακές ασκήσεις κατά τα επόµενα Ακαδηµαϊκά έτη. 5. Κάθε φοιτητής πρέπει κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής της άσκησης να φοράει λευκή, καθαρή εργαστηριακή ποδιά σε ευπρεπή κατάσταση. 6. Πριν την έναρξη της άσκησης οι φοιτητές υποχρεώνονται να ελέγχουν, βάση καταστάσεως, εάν υπάρχουν στην εργαστηριακή θέση όλα τα απαραίτητα όργανα και οι συσκευές για την διεξαγωγή της άσκησης. Εάν κάτι λείπει αναφέρεται στο υπεύθυνο της άσκησης διαφορετικά θεωρείται πως τα σχετικά όργανα έχουν παραληφθεί σε άρτια κατάσταση. Μετά το τέλος των πειραµάτων τα όργανα καθαρίζονται από τους ασκούµενους και ελέγχονται από τον υπεύθυνο. Όποιος κατέστρεψε κάποιο όργανο υποχρεώνεται να το αντικαταστήσει. 7. Κάθε ασκούµενος καταγράφει τα αποτελέσµατά του και τα παραδίδει στον υπεύθυνο της άσκησης αφού κάνει τους απαραίτητους υπολογισµούς. 8. εν επιτρέπεται το κάπνισµα ή η κατανάλωση τροφής µέσα στο εργαστήριο. 3

4 Άσκηση 1. Ανάλυση αλευριού α. Προσδιορισμός υγρής και ξηρής γλουτένης Ζυγίζονται 33,33 g αλεύρι και αναμιγνύονται με 17 ml απεσταγμένου ψυχρού νερού σε κάψα πορσελάνης, διαμέτρου cm και με τη βοήθεια σπάτουλας σχηματίζεται μια μαλακή μάζα που δεν κολλάει στα δάκτυλα. Για 30 min αυτή η μάζα μαλάσσεται κάτω από τη συνεχή ροή νερού ο C που πέφτει κατά σταγόνες ώστε να αποχωριστεί το άμυλο και να αρχίσει να συσσωματώνεται η γλουτένη. Η πλύση με το νερό συνεχίζεται μέχρι να πάψει να ανιχνεύεται άμυλο στο νερό έκπλυσης. Η ανίχνευση γίνεται με τη χρήση διαλύματος ιωδίου. Τέλος η γλουτένη συμπιέζεται με τα δάκτυλα ώστε να απομακρυνθεί το νερό που πλεονάζει και ζυγίζεται. Το ποσό που ζυγίζεται αν τριπλασιαστεί παρέχει αμέσως την % ποσότητα της λεγόμενης υγρής γλουτένης στο αλεύρι. Στη συνέχεια υποβάλλεται προς ξήρανση στο πυριαντήριο ( ο C) μέχρι σταθερού βάρους για την εύρεση της % ποσότητας της ξηρής γλουτένης (% κ.β. επί ξηρού). Από τη διαφορά μεταξύ του βάρους της υγρής και της ξηρής γλουτένης μπορεί να υπολογιστεί η λεγόμενη εφυδάτωση της γλουτένης (εκφράζεται σε ποσοστό % κ.β.). β. Ανίχνευση οξειδωτικών Μια ποσότητα αλευριού πιέζεται με σπάτουλα σε επίπεδη επιφάνεια και σε αυτή ρίχνονται λίγες σταγόνες διαλύματος ιωδιούχου καλίου 10% και υδροχλωρικού οξέος 20%. Η εμφάνιση μελανών στιγμάτων αποδεικνύει την παρουσία οξειδωτικών βελτιωτικών. Αντιδράσεις: BrO J - + 6H + 3J 2 + Br - + 3H 2 O (KBrO 3 + 6KI + 6HCl 3J 2 + KBr + 6KCl + 3H 2 O) J 2 + άμυλο μελανές κηλίδες 4

5 Άσκηση 2. Ανάλυση ποιότητας ελαιολάδου Ανάλυση λίπους σε τρόφιμα α. Προσδιορισμός βαθμού οξύτητας Ορισμοί βαθμού οξύτητας 1. κατά Reichert-Meissl: ml 0.1 Ν αλκαλίου για την εξουδετέρωση των διαλυτών στο νερό λιπαρών οξέων που αποστάζουν υπό ειδικές συνθήκες από 5 g λιπαρής ύλης (κυρίως C4-6). 2. κατά Polenske: ml 0.1 Ν αλκαλίου για την εξουδετέρωση των αδιάλυτων στο νερό λιπαρών οξέων που αποστάζουν υπό ειδικές συνθήκες από 5 g λιπαρής ύλης (κυρίως C8-14). 3. κατά Kirshner: ml 0.1 Ν αλκαλίου για την εξουδετέρωση των υδατοδιαλυτών πτητικών λιπαρών οξέων που σχηματίζουν διαλυτά άλατα με Ag και αποστάζουν υπό ειδικές συνθήκες από 5 g λιπαρής ύλης (βουτυρικό). 4. κατά Kottstorfer: ml 0.1 Ν αλκαλίου για την εξουδετέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων που περιέχονται σε 100 g λιπαρής ύλης. 5. κατά Burstyn: ml 0.1 Ν αλκαλίου για την εξουδετέρωση των ελεύθερων λιπαρών οξέων που περιέχονται σε 100 ml λιπαρής ύλης. Πολλές φορές το αποτέλεσμα του προσδιορισμού της οξύτητας στα φυτικά έλαια εκφράζεται σε ελαϊκό οξύ επί τοις % (η οξύτητα σε ελαϊκό οξύ υπολογίζεται με πολλαπλασιασμό του βαθμού οξύτητας κατά Kottstorfer επί τον συντελεστή ). Η ποσότητα των ελεύθερων οξέων που περιέχονται σε διάφορες λιπαρές ύλες εξαρτάται από τον τρόπο της παραλαβής και της διατήρησής τους. Προσδιορισμός βαθμού οξύτητας κατά Kottstorfer Αντιδραστήρια 1. Μίγμα αιθέρα & αλκοόλης: οργανικός διαλύτης κατάλληλος για την διάλυση τόσο της λιπαρής ύλης όσο και του υδατικού ΝαΟΗ. 2. ΝαΟΗ Ν/10: πρότυπο διάλυμα ογκομέτρησης. 3. Φαινολοφθαλεϊνη: δείκτης (1% αλκοολικό διάλυμα). Διαλύονται 8-10 g λίπους σε μίγμα ίσων μερών αιθέρα και αλκοόλης που έχει προηγουμένως εξουδετερωθεί. Προστίθενται 3-4 σταγόνες φαινολοφθαλεΐνης (αλκοολικό διάλυμα 1%) και γίνεται εξουδετέρωση με Ν/10 διαλύματος ΝαΟΗ ή ΚΟΗ. 5

6 β. Προσδιορισμός αριθμού σαπωνοποίησης Ο αριθμός σαπωνοποίησης (AΣ) ή αριθμός του Κottstorfer παρέχει τα γραμμάρια του ΚΟΗ που απαιτούνται για την πλήρη σαπωνοποίηση 1 g λίπους ή ελαίου. Σαπωνοποίηση ονομάζεται η υδρόλυση ενός εστέρα υπό αλκαλικές συνθήκες προς τα δομικά του συστατικά, την αλκοόλη και το άλας του οξέος (σάπωνας): Ο AΣ λιπαρών υλών που περιέχουν μικρές μόνο ποσότητες ασαπωνοποίητων υλών εξαρτάται από το μέσο μοριακό βάρος των λιπαρών οξέων που περιέχονται στις λιπαρές ύλες. Άρα ο AΣ αποτελεί μέτρο του μέσου ΜΒ της λιπαρής ύλης. Π.χ.: - φυτικά έλαια: ΑΣ ~ βούτυρο: ΑΣ ~ κοκόλιπος & φοινικοπυρηνέλαιο: ΑΣ ~ 250 Αντιδραστήρια 1. Αλκοολικό διάλυμα ΚΟΗ Διαλύονται 28g ΚΟΗ σε μικρή ποσότητα νερού, το διάλυμα μεταφέρεται σε ογκομετρική φιάλη του 1 λίτρου και συμπληρώνεται μέχρι την χαραγή με αλκοόλη. Η χρησιμοποιούμενη αλκοόλη πριν τη χρήση της, υποβάλλεται σε καθαρισμό με προσθήκη 10g ΚΟΗ ανά λίτρο αλκοόλης, παραμονή για λίγες μέρες και απόσταξη. 2. Διάλυμα Ν/2 ΗCl Η απαιτούμενη ποσότητα υδροχλωρίου διαλύεται στο νερό και το διάλυμα συμπληρώνεται μέχρι 1 λίτρο. Η τιτλοδότηση γίνεται με ανθρακικό νάτριο. Μέθοδος Ζυγίζονται 1-2 g της λιπαρής ύλης σε κωνική εσμυρισμένη φιάλη των 250 ml και προστίθενται 25 ml του αλκοολικού διαλύματος του ΚΟΗ τα οποία έχουν μετρηθεί επακριβώς με προχοΐδα. 6

7 Ακολουθεί θέρμανση του μίγματος σε ατμούς υδρόλουτρου για 30 min με κάθετο ψυκτήρα. Το περιεχόμενο της φιάλης αναταράσσεται συχνά με προσοχή ώστε να αποφευχθεί η εκτίναξη σταγονιδίων του υγρού προς το λαιμό της φιάλης. Όταν δεν φαίνονται πια σταγονίδια λίπους, συνεχίζεται η θέρμανση για 15 min ακόμα διότι στην αρχή γίνεται η μετεστεροποίηση των σχηματιζόμενων ευδιάλυτων στην αλκοόλη αιθυλικών εστέρων που με την παράταση της θέρμανσης σαπωνοποιούνται πλήρως. Στο θερμό ακόμα διάλυμα προστίθενται λίγες σταγόνες αλκοολικού διαλύματος φαινολοφθαλεΐνης (1%) και η περίσσεια του ΚΟΗ εξουδετερώνεται με διάλυμα Ν/2 ΗCl. Για κάθε σειρά προσδιορισμού είναι απαραίτητο να γίνεται, με τον ίδιο ακριβώς τρόπο, λευκός προσδιορισμός χωρίς την παρουσία λίπους, ώστε να προσδιοριστεί η ισχύ του αλκοολικού διαλύματος του υδροξειδίου του καλίου έναντι του διαλύματος Ν/2 ΗCl. Ο αριθμός σαπωνοποίησης υπολογίζεται με τον τύπο: ΑΣ = [(α-β) 28] / γ όπου το α είναι τα ml του διαλύματος Ν/2 HCl που χρησιμοποιήθηκαν κατά τον λευκό προσδιορισμό, β είναι τα ml του διαλύματος Ν/2 HCl που χρησιμοποιήθηκαν κατά τον πραγματικό προσδιορισμό και γ είναι η ποσότητα της λιπαρής ύλης σε g. γ. Ανάλυση λίπους σε τρόφιμα Κατά την ανάλυση των τροφίμων, ευφραντικών κτλ. με το όρο λίπος εννοείται γενικά ότι παραλαμβάνεται με την εκχύλιση της άνυδρης ύλης δηλ. όλα τα μη πτητικά συστατικά που παραλαμβάνονται από την προξηραμένη ουσία με τη χρήση άνυδρου αιθέρα. Για τον προσδιορισμό της συνολικής ποσότητας των λιπαρών υλών που περιέχονται στα διάφορα τρόφιμα υπάρχουν πολλές μέθοδοι οι οποίες μπορούν να καταταχθούν σε τρεις κυρίως ομάδες: 1. Στις μεθόδους όπου το λίπος παραλαμβάνεται από την στερεά ή υγρή ύλη, με ανατάραξη με κατάλληλο διαλύτη, είτε απ ευθείας είτε μετά από προκατεργασία της προς ανάλυση ύλης με αλκάλια ή οξέα. 2. Στις μεθόδους αυτές η παραλαβή γίνεται με συστηματική εκχύλιση της ξηραμένης ύλης (ή του ξηρού υπολείμματος αν πρόκειται για υγρά). Η εκχύλιση γίνεται ή απ ευθείας ή με προηγούμενη κατεργασία της σχετικής ύλης με οξέα, διήθηση και ξήρανση. 7

8 3. Με αυτές τις μεθόδους η παραλαβή γίνεται με φυγοκέντρησηη της ύλης αφού προηγηθεί επεξεργασία της με αλκάλια ή οξέα ή ουδέτερα άλατα. Προσδιορισμός ολικούς λίπους με τη μέθοδο Soxhlet Θα προσδιοριστεί το συνολικό λίπος σε φιστίκια με τη συσκευή Soxhlet. 1. Μελετήστε την λειτουργία της συσκευής, με τη βοήθεια του υπεύθυνου της άσκησης. 2. Ζυγίστε 5 g (με ακρίβειαα 0.1 g), λειοτριβημένης και προξηραμένης (για μια ώρα στους 110 ο C) ύλης μέσα στο φυσίγγιο εκχύλισης και τοποθετήστε το στον εκχυλιστήρα της συσκευής. 3. Ζυγίστε με ακρίβεια (0.01 g) τον υποδοχέα της συσκευής μέσα στην οποία έχουν τεθεί τεμαχίδια πορσελάνης ή κομμάτια κίσσηρη για να διευκολυνθεί ο βρασμός. 4. Ακολουθεί η σύνδεση της όλης συσκευής και η προσθήκη με χωνί ποσότητας αιθέρος ίση με το 1 1 / 2 του όγκου του εκχυλιστήρα. Αφού γίνει η σύνδεση του ψυκτήρα τίθεται σε λειτουργία η θέρμανση μέσω του μετασχηματιστή τάσεως. Ο ρυθμός επαναρροής του αιθέρα στον ψυκτήρα πρέπει να είναι περίπου 2-3 σταγόνες/sec. 5. Η εκχύλιση συνεχίζεται για 2 1 / 2 ώρας. Με την βοήθεια του υπεύθυνου διακόπτεται η θέρμανση, αποσυνδέεται η συσκευή και απομακρύνεται με εξάτμιση ο αιθέρας από τον υποδοχέα με τη βοήθεια του περιστρεφόμενου εξατμιστήρα, απουσία φλόγας. Το μεγαλύτερο μέρος του αιθέρα συλλέγεται σε φιάλη που έχει προψυχθεί στους 0 ο C. 6. Το υπόλειμμα του υποδοχέα ξηραίνεται στο πυριαντήριο (105 ο C) μέχρι σταθερού βάρους και μετά από ψύξη σε ξηραντήρα, ζυγίζεται με ακρίβεια. Γίνεται υπολογισμός της επί τοις % περιεκτικότητας σε λίπος της ξηραμένης ύλης. δ. Ανίχνευση νοθείας ελαίων με παραφινέλαιο Με την μέθοδο αυτή είναι δυνατόν να ανιχνευθεί το παραφινέλαιο στα έλαια λινέλαιο, σησαμέλαιο, ηλιέλαιο, καρυδέλαιο, αραχιδέλαιο, φοινικόλιπος και ελαιόλαδο. Η μέθοδος ανιχνεύει νοθεία μέχρι 2% το ελάχιστο. Η ανίχνευση γίνεται με ψεκασμό της πλάκας με επίστρωση Al 2 O 3 με 0.2% διάλυμα 2,7 διχλωροφλουοροσκεΐνης σε αιθανόλη και παρατήρηση με λυχνία υπεριώδους του βαθιά κίτρινου χρώματος φλουοροσκεΐνης σε σχέση με το πρασινοκίτρινο περιβάλλον. Το παραφινέλαιο εμφανίζεται στο μέτωπο του διαλύτη ενώ το έλαιο εμφανίζεται σαν μια διάχυτη κηλίδα. 8

9 Υλικά 1. Πλάκες με επίστρωση γ-al 2 O 3. Για την επίστρωση ζυγίζονται 40 g γ-al 2 O 3 και 75 ml απεσταγμένο H 2 O σε εσμυρισμένη κωνική φιάλη των 250 ml. Το μίγμα ανακινείται για sec και μεταφέρεται αμέσως στη συσκευή επιστρώσεως. 2. Πάχος επιστρώσεως: 0.25 mm. 3. Συνθήκες ενεργοποιήσεως: 105 ο C για μια ώρα. 4. Διαλύτης αναπτύξεως: πετρελαϊκός αιθέρας (60-80 ο C). 5. Μέτωπο αναπτύξεως: 10 cm. Πειραματικό μέρος Δίνονται προς ανίχνευση νοθείας τα δείγματα Α, Β, και Γ. Τοποθετείται από μια σταγόνα από το κάθε δείγμα και από τα δύο πρότυπα διαλύματαα (ένα με καθαρό παραφινέλαιο κι ένα με έλαιο νοθευμένο με παραφινέλαιο), πάνω στην επιστρωμένη πλάκα σε ευθεία οριζόντια γραμμή με τη βοήθεια του υπεύθυνου. Η ευθεία γραμμή θα απέχει από την αρχή της πλάκας 1.5 cm ώστε κατά της τοποθέτησή της μέσα στο δοχείο ανάπτυξης να μην εμβαπτίζονται στον διαλύτη ανάπτυξης οι σταγόνες του δείγματος και αποτύχει το χρωματογράφημα. Το μέτωπο του διαλύτη σημειώνεται με γραφίδα πάνω στην πλάκα. Ακολουθεί η πορεία όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Δίνεται απάντηση για την ύπαρξη ή μη νοθείας με παραφινέλαιο στα δείγματα. ε. Ανίχνευση των αντιοξειδωτικών BHT και PG στα έλαια Για την ανίχνευση των αντιοξειδωτικών στα έλαια με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας, εκχυλίζεται το προς εξέταση δείγμα ελαίου και χρωματογραφείται το εκχύλισμα το οποίο παρέλαβε τα αντιοξειδωτικά. PG (Propyl Gallate) ΠΡΟΠΥΛΙΚΟΣ ΕΣΤΕΡΑΣ ΓΑΛΛΙΚΟΥ ΟΞΕΩΣ BHA (Butylated Hydroxyanisole) ΒΟΥΤΥΛΙΩΜΕΝΗ ΥΔΡΟΞΥΑΝΙΣΟΛΗ TBHQ (Tert-Butyl-Ηydroquinone) TERT-ΒΟΥΤΥΛΟ-ΥΔΡΟΚΙΝΟΝΗ BHT (Butylated Hydroxy-Τoluene ) ΒΟΥΤΥΛΙΩΜΕΝΟ ΥΔΡΟΞΥΤΟΛΟΥΟΛΙΟ 9

10 Υλικά 1. Πλάκες με επίστρωση Silica Gel τύπου γ. Για την επίστρωση ζυγίζονται 40 g Silica Gel τύπου γ και 75 ml απεσταγμένο H 2 O σε εσμυρισμένη κωνική φιάλη των 250 ml. Το μίγμα ανακινείται για sec και μεταφέρεται αμέσως στη συσκευή επιστρώσεως. 2. Πάχος επιστρώσεως: 0.25 mm. 3. Συνθήκες ενεργοποιήσεως: 105 ο C για μια ώρα. 4. Διαλύτης αναπτύξεως: χλωροφόρμιο 5. Μέτωπο αναπτύξεως: 12 cm. Η ανίχνευση γίνεται με 1.5% διάλυμα δώδεκα-μολυβδοφωσφορικού οξέος (H 3 PO 4 12MoO 3 24H 2 O) σε αιθανόλη και στη συνέχεια έκθεση της πλάκας πάνω από ατμούς πυκνής αμμωνίας. Η εμφάνιση μπλε-γκρι κηλίδων πιστοποιεί την παρουσία BHT στο δείγμα ενώ καφέ-γκρι κηλίδες πιστοποιούν την παρουσία PG. Πειραματικό μέρος Δίνονται για ανίχνευση τα δείγματα Α, Β και Γ. Τοποθετείται από μια σταγόνα από το κάθε δείγμα και από τα πρότυπα διαλύματα των αντιοξειδωτικών πάνω στην επιστρωμένη πλάκα. Ακολουθεί η πορεία όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Υπολογίζονται τα R f των ουσιών που ανιχνεύονται και δίνεται απάντηση για την ύπαρξη ή όχι αντιοξειδωτικών BHT και PG στα δείγματα. 10

11 Χρωματογραφική Ανάλυση Η αρχή της χρωματογραφικής ανάλυσης έγκειται στον φυσικό διαχωρισμό και προσδιορισμό ενός μείγματος συστατικών, ανόργανων ή οργανικών ενώσεων, ο οποίος επιτυγχάνεται με την κατανομή των συστατικών μεταξύ 2 φάσεων, μιας κινητής και μιας στατικής και βασίζεται σε ορισμένες ιδιότητες των συστατικών του μείγματος όπως το σημείο ζέσεως, η πολικότητα, το μέγεθος μορίων, η πτητικότητα, κ.ά. Έτσι, η κινητή φάση, διερχόμενη μέσα από τη στατική, προκαλεί διαφορετική μετατόπιση των συστατικών του μείγματος, τα οποία εκλούονται μεταξύ τους σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός κάθε συστατικού επιτυγχάνεται από ένα σύστημα ανίχνευσης και καταμέτρησης που βρίσκεται στην έξοδο της στήλης. Η ταξινόμηση η των μεθόδων χρωματογραφικής ανάλυσης μπορεί να γίνει με βάση τη φύση της κινητής φάσης, τη φύση και τη μορφή της στατικής φάσης, το μηχανισμό διαχωρισμού και τον τρόπο εισαγωγής του δείγματος στη στατική φάση και κινήσεώς του μέσα από αυτή: «Υγρή Χρωματογραφία» (Liquid Chromatography) εάν η κινητή φάση είναι υγρή. Ανάλογα με τη φύση της στατικής φάσης διακρίνεται σε «Υγρή-Στερεή Χρωματογραφία» (Liquid-Solid Chromatography),, αν αυτή είναι στερεή, και σε «Υγρή-Υγρή Χρωματογραφία» (Liquid-Liquid Chromatography), αν αυτή είναι υγρή. «Αέρια Χρωματογραφία» (Gas Chromatography) εάν η κινητή φάση είναι αέρια, η οπoία ανάλογα με τη φύση της στατικής φάσης διακρίνεται σε «Αέρια- Στερεή Χρωματογραφία» (Gas-Solid Chromatography),, αν αυτή είναι στερεή και σε «Αέρια-Υγρή Χρωματογραφία» (Gas-Liquid Chromatography), αν αυτή είναι υγρή. 11

12 Ανάλογα με τον μηχανισμό με τον οποίο τα συστατικά του μείγματος ανάλυσης κατακρατούνται από την στατική φάση, διακρίνονται οι εξής μέθοδοι Χρωματογραφία Προσρόφησης (Adsorption Chromatography). Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με την κατανομή των προσροφημένων σωματιδίων και των σωματιδίων στην κινητή φάση, η οποία μπορεί να είναι υγρή ή αέρια. Χρωματογραφία Ιονανταλλαγής (Ion-Exchange Chromatography), όπου ως στερεή στατική φάση φέρονται ιονανταλλακτικές ρητίνες ή πηκτές και ως κινητή φάση ένα υγρό. Χρωματογραφία Κατανομής (Partition Chromatography), όπου τα συστατικά κατανέμονται μεταξύ υγρής στοιβάδας στατικής φάσης και μιας υγρής κινητής φάσης. Χρωματογραφία Μοριακού Αποκλεισμού (Molecular Exclusion Chromatography), όπου τα μόρια διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους, με τα μόρια μεγάλου μεγέθους να εξέρχονται πρώτα. Είναι επίσης γνωστή ως χρωματογραφία διηθήσεως πηκτής ή χρωματογραφία διαπερατότητας πηκτής. Χρωματογραφία Συγγενείας (Affinity Chromatography) που είναι νεότερη και πιο εκλεκτική τεχνική βασιζόμενη στην εξειδικευμένη αλληλεπίδραση ενός μορίου του δείγματος με ένα μόριο που είναι ακινητοποιημένο στη στερεή στατική φάση. Η ποσοτικοποίηση των συστατικών ενός μίγματος με GC ή HPLC γίνεται με τις παρακάτω μεθόδους: peak 1 peak 3 area peak 2 t R 1 t R 2 t R 3 time Σχήμα: Χρωματογράφημα GC ή HPLC τριών συστατικών. area= εμβαδό κορυφής (peak). time=χρόνος έκλουσης. 12

13 Μέθοδος πρότυπης καμπύλη αναφοράς Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη αναφοράς εμβαδού κορυφής προς συγκέντρωση με ανάλυση GC ή HPLC ενός αριθμού διαφορετικών γνωστών συγκεντρώσεων πρότυπων ουσιών, ίδιων με τις προς ανάλυση ουσίες στο άγνωστο μίγμα. Μέθοδος προσθήκης εσωτερικού προτύπου Λαμβάνεται χρωματογράφημα ουσίας άγνωστης συγκέντρωσης (C x ) και καταγράφεται η απόκριση (εμβαδό κορυφής Ε x ). Στη συνέχεια προστίθεται στο άγνωστο δείγμα γνωστή ποσότητα της προς ανάλυση (C γ ) και καταγράφεται η νέα απόκριση (εμβαδό κορυφής Ε xγ ) που αντιστοιχεί στην ολική συγκέντρωση C x +C γ. Η άγνωστη συγκέντρωση C x θα είναι: = (+) = ( ) Μέθοδος προσθήκης εξωτερικού προτύπου Ποσοτικοποίηση πολλών άγνωστων συστατικών σε ένα μόνο χρωματογράφημα με προσθήκη γνωστής ποσότητας μιας ουσίας που πρέπει να είναι της ίδιας φύσης αλλά όχι ίδια με κανένα από τα προς ανάλυση συστατικά και να εκλούεται χωρίς να επικαλύπτεται η κορυφή της με τις κορυφές των άλλων συστατικών. Αν C x η άγνωστη συγκέντρωση ενός εκ των συστατικών του μίγματος με απόκριση Ε x και C γ η συγκέντρωση του εξωτερικού προτύπου με απόκριση Ε γ, τότε η άγνωστη συγκέντρωση C x θα είναι: = = 13

14 Άσκηση 3. Προσδιορισμός σακχάρων, αιθανόλης και οργανικών οξέων με HPLC Στην HPLC (High Performance Liquid Chromatography), η κινητή φάση είναι υγρό ενώ η στατική φάση αποτελείται από πολύ μικρής διαμέτρου και μεγάλης αντιστάσεως σωματίδια υψηλής διαχωριστικής απόδοσης. Είναι η πλέον χρησιμοποιούμενη μέθοδος ποσοτικής ανάλυσης πολύπλοκων μειγμάτων. Σε αντίθεση με την GC, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάλυση ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους, υψηλής πολικότητας, πολυμερών και ιονικών ενώσεων. α. Προσδιορισμός σακχάρων και αιθανόλης Για τον προσδιορισμό σακχάρων και αιθανόλης με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) κατασκευάζεται αρχικά πρότυπη καμπύλη με πρότυπα διαλύματα 1-10 % v/v αιθανόλης και διάφορων σακχάρων (γλυκόζη, φρουκτόζη, σακχαρόζη κ.α., σύμφωνα με τις οδηγίες του επιβλέποντος) σε καλά απαερωμένο και φιλτραρισμένο νερό υψηλής καθαρότητας και συγκεντρώσεις 1-10 % w/v, με 0.1 % v/v βουτανόλη-1 ως εσωτερικό πρότυπο. Ο προσδιορισμός γίνεται ισοκρατικά σε χρωματογράφο SHIMADZU LC-9A με στήλη Shim-pack SCR-101 N, θερμοκρασία στήλης 60 C, κινητή φάση καλά απαερωμένο και φιλτραρισμένο νερό υψηλής καθαρότητας, ταχύτητα ροής 0.8 ml/min, και ανιχνευτή δείκτη διάθλασης (RID). Τα δείγματα εισάγονται στη στήλη αφού αραιωθούν κατάλληλα με τρεις φορές απεσταγμένο νερό σε συγκέντρωση 1% v/v και διηθηθούν με μικροφίλτρο 0,45 μm. β. Προσδιορισμός οργανικών οξέων Για τον προσδιορισμό οργανικών οξέων με HPLC κατασκευάζεται αρχικά πρότυπη καμπύλη με πρότυπα διαλύματα διάφορων οργανικών οξέων (γαλακτικό, οξικό, κιτρικό, ηλεκτρικό, κ.α., σύμφωνα με τις οδηγίες του επιβλέποντος) σε καλά απαερωμένο και φιλτραρισμένο νερό υψηλής καθαρότητας. Ο προσδιορισμός γίνεται σε χρωματογράφο Jasco LC-2000 Series HPLC system (Jasco Inc., Japan) με στήλη Bio-rad Aminex HPX-87H (300 x 7.8 mm i.d., 9 μm particle size), φούρνο CO PLUS, αντλία PU-2089 pump, αυτόματο δειγματολήπτη AS 2050 PLUS και ανιχνευτή MD-2018 Photodiode Αrray. Ο διαχωρισμός γίνεται ισοκρατικά στους 50 ο C με κινητή φάση N H 2 SO 4 και ροή 0.6 ml/min. Η ανίχνευση γίνεται στα 210 nm. Ποσότητες δειγμάτων 20 μl αναλύονται μετά από φιλτράρισμα με μικροφίλτρα 0.22 μm. 14

15 Άσκηση 4. Ανάλυση αλκοολούχων ποτών με αέρια χρωματογραφία (GC-FID) και ανίχνευση νοθείας Διαγραμματική απεικόνιση μεθόδου GC α. Προσδιορισμός αιθανόλης και μεθανόλης Για τον προσδιορισμό της αιθανόλης και μεθανόλης σε αλκοολούχα ποτά με αέρια χρωματογραφία κατασκευάζεται αρχικά πρότυπη καμπύλη με πρότυπα διαλύματα mg/l μεθανόλης και 1-10 % αιθανόλης, με 0.05 % v/v βουτανόλη-1 ως εσωτερικό πρότυπο. Ο προσδιορισμός γίνεται σε αέριο χρωματογράφο SHIMADZU GC-8A με ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID) συνδεδεμένο με ολοκληρωτή SHIMADZU C-R6A. Το αέριο καύσης στον ανιχνευτή είναι μίγμα από καθαρά αέρια υδρογόνου και οξυγόνου με πιέσεις 0,6 και 0,2 Kg/cm 2 αντίστοιχα. Η στήλη του χρωματογράφου είναι τύπου Porapac S μήκους 2 m από ανοξείδωτο χάλυβα και εσωτερική διάμετρο 1/8 της ίντσας. Η θερμοκρασία στήλης είναι o C, προγραμματισμένη να αυξάνει με ρυθμό 3 o C/min. Η θερμοκρασία στο σημείο έγχυσης του δείγματος και στον ανιχνευτή είναι 210 o C. Ως φέρον αέριο χρησιμοποιείται άζωτο υψηλής καθαρότητας με ροή 60 ml/min. Οι ενέσεις των δειγμάτων (2 μl) γίνονται απευθείας στο χρωματογράφο χωρίς αραίωση. 15

16 Άσκηση 5. Μέθοδος ΝΜR Επίδειξη οργάνου και εφαρμογές στην ανάλυση τροφίμων Πυρηνικός μαγνητικός συντονισμός (Nuclear magnetic resonance) (NMR) είναι το φαινόμενο κατά το οποίο πυρήνες ατόμων σε μαγνητικό πεδίο απορροφούν και επανεκπέμπουν ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία λόγω συντονισμού με συγκεκριμένη συχνότητα που εξαρτάται από την ισχύ του μαγνητικού πεδίου και τις μαγνητικές ιδιότητες των ατόμων. Η φασματοσκοπια NMR είναι από τις πλέον χρησιμοποιούμενες αναλυτικές τεχνικές για την ταυτοποίηση μοριακών δομών, και για τη μελέτη της πορείας χημικών αντιδράσεων. Το NMR χρησιμοποιείται ευρέως στην ιατρική ραδιολογία για απεικονίσεις μαλακών ιστών για διαγνωστικούς σκοπούς. Οι επιστήμονες τροφίμων επίσης χρησιμοποιούν ευρέως το NMR και συνεχώς εξερευνούν εφαρμογές του στην ανάλυση και επεξεργασία των τροφίμων, όπως για παράδειγμα, την ταυτοποίηση της δομής βιοδραστικών συστατικών των τροφίμων, τον προσδιορισμό της δομής υλικών συσκευασίας, την ανίχνευση νοθείας και επιβεβαίωση της αυθεντικότητας των τροφίμων, τη βελτιστοποίηση διεργασιών παραγωγής και τον έλεγχο των μκροβιολογικών, και φυσικοχημικών παραμέτρων των τροφίμων. Παράδειγμα: Μελέτη αυθεντικότητας αγνού παρθένου ελαιολάδου με φασματοσκοπία 1Η-NMR και φασματοσκοπία 13C NMR με την οποία ανιχνεύεται η νοθεία αγνού παρθένου ελαιόλαδου με σπορέλαια (σχήματα που ακολουθούν). 16

17 17

18 18

19 Άσκηση 6. Ανάλυση ιχνοστοιχείων σε τρόφιμα με ατομική απορρόφηση (AAS) Η φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης (Atomic Absorption Spectroscopy) βασίζεται στη μέτρηση της απορροφήσεως ακτινοβολίας χαρακτηριστικού μήκους κύματος από ελεύθερα ουδέτερα άτομα ενός στοιχείου που βρίσκονται στη θεμελιώδη κατάσταση. Η ατομοποίηση του προσδιοριζόμενου στοιχείου γίνεται συνήθως με φλόγα ή σε ηλεκτρικά θερμαινόμενο κλίβανο. Στη συνέχεια φως από μια εξωτερική πηγή διαβιβάζεται μέσα από το νέφος των ατόμων και απορροφάται από αυτά. Επειδή ενδιαφέρει ο αριθμός Νο των ατόμων στη θεμελιώδη κατάσταση και όχι ο αριθμός Nu των διεγερμένων ατόμων, η θερμοκρασία της φλόγας πρέπει να διατηρείται κατά τον δυνατόν χαμηλή, με την προϋπόθεση όμως ότι η ενέργεια της φλόγας επαρκεί για την ατομοποίηση του προσδιοριζόμενου στοιχείου. Στη φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης ο νόμος του Beer διατυπώνεται με τη μορφή: A log όπου Α P o P k v P / P 0,434k b k bn k C o = απορρόφηση v o = ισχύς της ακτινοβολίας που προσπίπτει στο νέφος των ατόμων = ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας, μετά τη δίοδο από το νέφος = συντελεστής ατομικής απορροφήσεως, ανάλογος του αριθμού των ατόμων, που απορροφούν την ακτινοβολία συχνότητας v, και επομένως και της συγκεντρώσεως του διαλύματος k, k = σταθερές αναλογίας, που σχετίζονται με το συντελεστή ατομικής απορροφήσεως και εξαρτώνται από τις πειραματικές συνθήκες b Ν ο C = μήκος διαδρομής που διανύθηκε μέσα στο νέφος των ατόμων, (στην περίπτωση της φασματοφωτομετρίας ατομικής απορρόφησης, η φλόγα επιτελεί και το ρόλο της κυψελίδας) = συγκέντρωση απορροφούντων ατόμων μέσα στο νέφος (αριθμός ατόμων ανά ml) = συγκέντρωση του προσδιοριζόμενου στοιχείου στο εισαγόμενο διάλυμα Ο συντελεστής ατομικής απορροφήσεως εξαρτάται από το μήκος κύματος της απορροφούμενης ακτινοβολίας και από τις πειραματικές συνθήκες ατμοποιήσεως. Η χρήση της εξισώσεως στην ανάλυση γίνεται όχι με υπολογισμό του Ν ο, αλλά με σχετικές μετρήσεις με τη βοήθεια καμπύλης αναφοράς. 19

20 Σχηματικό διάγραμμα φασματοφωτομετρίας ατομικής απορρόφησης Οι βασικές μονάδες ενός φασματοφωτόμετρου ατομικής απορροφήσεως είναι: i) Η πηγή ακτινοβολίας, που συνήθως είναι μια λυχνία κοίλης καθόδου. ii) Εκνεφωτής-καυστήρας προαναμείξεως. Ο συνηθέστερος συνδυασμός αερίων είναι μείγμα ακετυλενίου-αέρα. iii) Μονοχρωμάτορας, που επιτρέπει τη δίοδο μόνο της επιθυμητής ακτινοβολίας. iv) Ανιχνευτής, κατά κανόνα φωτοπολλαπλασιαστής. v) Ενισχυτής εναλλασσόμενου ρεύματος vi) Όργανο μέτρησης, καταγραφέας ή εκτυπωτής. Το όλο σύστημα ολοκληρώνεται με: Μια λάμπα δευτερίου για μέτρηση του background και διόρθωση. Σύστημα κατόπτρων και φακών για το σχηματισμό ειδώλου της πηγής γραμμικής ακτινοβολίας στο κέντρο του νέφους των ατόμων. Το όργανο που θα χρησιμοποιηθεί είναι το ΑΑ-6500 series AAS της εταιρείας Shimadzu που αποτελείται από κεντρική μονάδα ΑΑ-6501 αυτόματο δειγματολήπτη ASC-6000 Autosampler φούρνο γραφίτη GFA

21 Θα χρησιμοποιηθεί η συνεχής φλόγα και όχι ο φούρνος γραφίτη. Θα γίνει πρότυπη καμπύλη για το κάθε ιχνοστοιχείο (σε ppm = mg/l) πριν την ανάλυση των δειγμάτων σύμφωνα με τις υποδείξεις του υπευθύνου της άσκησης. Π.χ από πυκνά διαλύματα Fe, Cu και Ca (1000 mg/l) γίνονται με αραιώσεις πρότυπα διαλύματα (π.χ. για Cu και Fe 2,5, 5, 10 και 20 ppm, και για Ca 5, 10, 40 και 80 ppm) με προσθήκη και αιθανόλης τόσης όση έχουν και τα δείγματά μας (π.χ. 11,5 για οίνους). To μήκος κύματος στο οποίο ο Fe έχει τη μέγιστη απορρόφηση είναι λ=248,3 nm, το Ca λ=422,7 nm και o Cu λ=324,8 nm. Σχηματικό διάγραμμα του μοντέλου Shimadzu ΑΑ-6500 series AAS 21

22 Βιβλιογραφία 1. Ανδρικόπουλος Ν., Ανάλυση Τροφίμων - Θεωρία Μεθοδολογίας- Οργανολογίας και Εργαστηριακές Ασκήσεις. Β Έκδοση Pecsok/Shields/Cairns/McWilliam "Σύγχρονες Μέθοδοι στη Χημική Ανάλυση", Απόδοση στα ελληνικά Στ. Βολιώτης, Εκδόσεις Γ.Α. Πνευματικός, Αθήνα, Δ. ΜΠΟΣΚΟΥ: Χημεία Τροφίμων, εκδόσεις Γαρταγάνη, Θεσσαλονίκη (12/5/2015). 22