Σελίδες 126. Σπύρος Συγγελάκης ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΟΜΟΣ IIΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA. Ομάδα προσανατολισμού θετικών σπουδών

Transcript

1 Σελίδες 126 Σπύρος Συγγελάκης ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΓΕΝΙΚΟΥ ΛΥΚΕΙΟΥ ΤΟΜΟΣ IIΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥ DNA Ομάδα προσανατολισμού θετικών σπουδών

2 Πρόλογος Με τθ διδαςκαλία του μακιματοσ τθσ Βιολογίασ ςτο ςχολείο επιδιϊκεται θ απόκτθςθ γνϊςεων ςχετικϊν με ζννοιεσ, κεωρίεσ, νόμουσ και αρχζσ που αφοροφν τθν επιςτιμθ τθσ Βιολογίασ. Οι απαιτιςεισ των κεμάτων ςτο μάκθμα τθσ βιολογίασ, τθσ ομάδασ προςανατολιςμοφ κετικϊν ςπουδϊν, που τίκενται ςτισ Πανελλαδικζσ εξετάςεισ απαιτοφν πολφ καλι κατανόθςθ τθσ διδακτζασ φλθσ, κριτικι και ςυνδυαςτικι ςκζψθ και επιπλζον απαιτοφνται γνϊςεισ οι οποίεσ δεν αναλφονται με ςαφινεια από το ςχολικό βιβλίο. Μζςα από το βιβλίο αυτό, που ζχει ςυγγραφεί με ιδιαίτερθ επιμζλεια και μεκοδικότθτα, προςπάκθςα να καλφψω τα τμιματα εκείνα τθσ διδακτζασ φλθ που δεν αναλφονται ςε ικανοποιθτικό βακμό από το ςχολικό βιβλίο. Για το λόγο αυτό, εκτόσ από τισ απλζσ ερωτιςεισ κατανόθςθσ, το βιβλίο περιζχει ςχόλια, διευκρινίςεισ και επιςθμάνςεισ που διευκρινίηουν τυχόν απορίεσ του μακθτι. Επίςθσ κεϊρθςα απαραίτθτο να υπάρχει ζνασ μεγάλοσ αρικμόσ αςκιςεων. Εκτόσ από τισ ςυνθκιςμζνεσ αςκιςεισ, που υπάρχουν για το ςυγκεκριμζνο κεφάλαιο, ζκρινα απαραίτθτο το βιβλίο να περιζχει, μεταξφ άλλων, πρωτότυπεσ αςκιςεισ, άλλα και αςκιςεισ των οποίων θ κεματολογία είναι απαραίτθτθ για τθν επίλυςθ κεμάτων που καλείται να αντιμετωπίςει ο μακθτισ ςτα επόμενα κεφάλαια τθσ διδακτζασ φλθσ. Ιδιαίτερα ςθμαντικζσ είναι οι εικόνεσ που ςυμπλθρϊνουν τθ κεωρία, τθν κακιςτοφν πιο εφλθπτθ και κατανοθτι και δίνουν τθ δυνατότθτα ςτο μακθτι να ζχει άμεςθ αντίλθψθ των διαδικαςιϊν που δεν περιγράφονται λεπτομερϊσ. Επίςθσ θ αναλυτικι μεκοδολογία των αςκιςεων, τα παραδείγματα με υποδειγματικι αιτιολόγθςθ κακϊσ και θ παράκεςθ ποικίλων αςκιςεων διαβακμιηόμενθσ δυςκολίασ, κακιςτοφν, κατά τθ γνϊμθ μου, το ςυγκεκριμζνο βιβλίο ςθμαντικι προςφορά ςτθν προςπάκεια των μακθτϊν και των ςυναδζλφων. Σπύρος Δ. Συγγελάκης Βιολόγος

3

4 Το βιβλίο περιέχει: Ερωτήσεις Θεωρίας όπως η παρακάτω Πώς μπορούμε να δημιουργήσουμε ένα ανασυνδυασμένο πλασμίδιο με τη χρήση της EcoRI; Απάντηση Η αλλθλουχία GAATTC υπάρχει διάςπαρτθ ςτα γονιδιϊματα των οργανιςμϊν. Το γονιδίωμα ενόσ ανϊτερου ευκαρυωτικοφ οργανιςμοφ μπορεί να κοπεί ςε χιλιάδεσ κομμάτια με τθν περιοριςτικι αυτι ενδονουκλεάςθ. Στθ ςυνζχεια, τα κομμάτια αυτά ενςωματϊνονται ςε ειδικοφσ φορείσ. Οι πιο χαρακτθριςτικοί τφποι φορζων είναι τα πλαςμίδια και το DΝΑ φάγων. Τα πλαςμίδια που χρθςιμοποιοφνται ωσ φορείσ κλωνοποίθςθσ ζχουν τθ ςυγκεκριμζνθ αλλθλουχία μία μόνο φορά. Ζτςι, τα πλαςμίδια κόβονται από τθν EcoRI ςε αυτι τθ κζςθ και δθμιουργείται ζνα γραμμικό μόριο DΝΑ με μονόκλωνα άκρα. Τα δφο είδθ DNA, του πλαςμιδίου και του οργανιςμοφ, αναμειγνφονται και, επειδι ζχουν ςυμπλθρωματικά άκρα, ενϊνονται μεταξφ τουσ με τθ μεςολάβθςθ ενόσ ενηφμου, τθσ DΝΑ δεςμάςθσ. Ζτςι, δθμιουργοφνται ανα-ςυνδυαςμζνα πλαςμίδια. Μερικά πλαςμίδια ξαναγίνονται κυκλικά χωρίσ να προςλάβουν ξζνο DNA.

5 Σχόλια και Επισημάνσεις όπως τα παρακάτω «Σχόλια και επισημάνσεις» Μετά τθν ολοκλιρωςθ τθσ διαδικαςίασ μεταςχθματιςμοφ των βακτθρίων ξενιςτϊν, ςτθν καλλιζργεια υπάρχουν δυο διαφορετικζσ ομάδεσ βακτθρίων. Η μια ομάδα περιλαμβάνει βακτιρια που δεν κατάφεραν να προςλάβουν πλαςμίδιο και ςυνεπϊσ είναι ευαίςκθτα ςε όλα τα αντιβιοτικά. Η δεφτερθ ομάδα περιλαμβάνει μεταςχθματιςμζνα βακτιρια που ζχουν προςλάβει πλαςμίδια αναςυνδυαςμζνα ι μθ. Η προςκικθ επιλεγμζνων αντιβιοτικϊν ςτο κρεπτικό υλικό των βακτθρίων αποςκοπεί ςτθν κανάτωςθ των βακτθρίων που δεν ζχουν προςλάβει πλαςμίδιο. Συνεπϊσ θ παρουςία κατάλλθλου αντιβιοτικοφ ςτο κρεπτικό υλικό ζχει ωσ αποτζλεςμα τθν επιβίωςθ και ανάπτυξθ μόνο των μεταςχθματιςμζνων βακτθρίων που ζχουν προςλάβει πλαςμίδιο αναςυνδυαςμζνο ι μθ.

6 Ερωτήσεις Πολλαπλής Επιλογής όπως οι παρακάτω: 14. Η γονιδιωματικι βιβλιοκικθ α. αποτελείται από κλϊνουσ βακτθρίων που ο κακζνασ περιζχει ζνα αναςυνδυαςμζνο μόριο DNA διαφορετικό από τουσ υπόλοιπουσ κλϊνουσ β. είναι το ςφνολο των βακτθριακϊν κλϊνων που περιζχουν τμιμα του DNA του οργανιςμοφ-δότθ γ. είναι το ςφνολο των βακτθριακϊν κλϊνων που περιζχουν αντίγραφα των γονιδίων που εκφράηονται ςε ζνα ςυγκεκριμζνο ιςτό δ. περιζχει μόνο κλωνοποιθμζνα κομμάτια χρωμοςωμικοφ DNA που δεν κωδικοποιοφν πρωτεΐνεσ 15.Η επιλογι ενόσ βακτθριακοφ κλϊνου, που περιζχει ζνα ςυγκεκριμζνο χρωμοςωμικό τμιμα, επιτυγχάνεται με α. τθν ανάπτυξθ των κυττάρων-ξενιςτϊν παρουςία κατάλλθλου αντιβιοτικοφ β. τθ χριςθ τθσ τεχνικισ PCR γ. τθ χριςθ ιχνθκετθμζνων αλλθλουχιϊν DΝΑ ι RNA δ. τθ χριςθ του βακτθριοφάγου λ 16. Κατά τθν καταςκευι γονιδιωματικισ βιβλιοκικθσ, οι φορείσ κλωνοποίθςθσ πρζπει α. να κόβονται ςε χιλιάδεσ κομμάτια β. να φζρουν γονίδια ανκεκτικότθτασ ςε ζνα ι δφο αντιβιοτικά γ. να κόβονται από τισ περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ των βακτθρίωνξενιςτϊν δ. να μποροφν να χρθςιμοποιθκοφν και ωσ ανιχνευτζσ

7 Ερωτήσεις τύπου «Σωστό Λάθος» όπως οι παρακάτω 49. Η ιχνθκζτθςθ βρίςκει εφαρμογι ςτθν καταςκευι cdna βιβλιοκικθσ. 50. Η κερμοκραςία ςτθν οποία επιτυγχάνεται θ αποδιάταξθ ενόσ μορίου DNA είναι ανεξάρτθτθ από τον αρικμό νουκλεοτιδίων αλλά εξαρτάται από τθν επί τοισ % αναλογία βάςεων του μορίου. 51. Το κλωνοποιθμζνο cdna είναι μονόκλωνο μόριο. 52. Οι ανιχνευτζσ αποτελοφνται από ραδιενεργά νουκλεοτίδια. 53. Στθ μζκοδο PCR χρθςιμοποιοφνται τα ζνηυμα DNA πολυμεράςθ, DNA δεςμάςθ και αντίςτροφθ μεταγραφάςθ.

8 Ερωτήσεις Κρίσεως και Συνδυαστικές όπως οι παρακάτω Πως μπορούμε να διαπιστώσουμε ποια γονίδια εκφράζονται σε δυο διαφορετικούς κυτταρικούς τύπου του ανθρώπου. Απάντηση Απομονϊνουμε το ολικό ϊριμο mrna από κφτταρα του ενόσ κυτταρικοφ τφπου. Το ϊριμο mrna χρθςιμοποιείται ωσ καλοφπι για τθ ςφνκεςθ μιασ ςυμπλθρωματικισ αλυςίδασ DNA,(cDNA). Η ςφνκεςθ των cdna γίνεται με τθν βοικεια του ενηφμου αντίςτροφθσ μεταγραφάςθ. Τα cdna μόρια ιχνθκετοφνται προκειμζνου να χρθςιμοποιθκοφν ωσ ανιχνευτζσ. Οι ιχνθκετθμζνοι πλζον ανιχνευτζσ cdna αναμειγνφονται με ϊριμα mrna που απoμονϊκθκαν από τα κφτταρα του άλλου κυτταρικοφ τφπου. Τα μόρια mrna που υβριδοποιοφν οι ανιχνευτζσ προζρχονται από γονίδια που μεταγράφονται και μεταφράηονται και ςτουσ δυο κυτταρικοφσ τφπουσ. Κατασκευάστηκαν δυο DNA βιβλιοθήκες από κύτταρα του ίδιου πολυκύτταρου οργανισμού. Με την ολοκλήρωση της κατασκευής προέκυψε διαφορετικός αριθμός βακτηριακών κλώνων. Σε ποιους λόγους οφείλεται αυτή η διαφορά; Απάντηση Διακρίνουμε τισ παρακάτω περιπτϊςεισ: α. Και οι δυο βιβλιοθήκες είναι γονιδιωματικζς. Στθν περίπτωςθ αυτι θ διαφορά ςτον αρικμό των κλϊνων οφείλεται ςτθν περιοριςτικι ενδονουκλεάςθ και ςτο είδοσ των φορζων κλωνοποίθςθσ (πλαςμίδια ι βακτθριοφάγοσ λ) που χρθςιμοποιικθκε ςε κάκε βιβλιοκικθ. Οι περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ αναγνωρίηουν ςτο δίκλωνο DNA αλλθλουχίεσ 4-8 νουκλεοτιδίων. Οι αλλθλουχίεσ μικουσ 4 νουκλεοτιδίων ςυναντϊνται πιο ςυχνά ςτο γονιδίωμα του οργανιςμοφ δότθ ςε ςχζςθ με τισ μεγαλφτερεσ αλλθλουχίεσ. Η επιλογι μιασ περιοριςτικισ ενδονουκλεάςθσ που αναγνωρίηει μια αλλθλουχία 8

9 νουκλεοτιδίων οδθγεί ςε λιγότερα τμιματα DNA ςε ςχζςθ με μια άλλθ ενδονουκλεάςθ που αναγνωρίηει μια μικρότερθ αλλθλουχία. Επίςθσ για μεγαλφτερα τμιματα DNA ωσ φορείσ κλωνοποίθςθσ χρθςιμοποιοφνται βακτθριοφάγοι (βακτθριοφάγοσ λ). Οι βακτθριοφάγοι μποροφν να ενςωματϊςουν μεγαλφτερα κομμάτια ξζνου DNA ςε ςχζςθ με τα πλαςμίδια. β. Η μια είναι γονιδιωματική και η άλλη cdna βιβλιοθήκη. Στθν περίπτωςθ αυτι θ γονιδιωματικι αποτελείται από μεγαλφτερο αρικμό κλϊνων ςε ςχζςθ με τθν cdna βιβλιοκικθ. Η γονιδιωματικι βιβλιοκικθ περιζχει ολόκλθρο το γονιδίωμα του οργανιςμοφ δότθ ςε αντίκεςθ με τθ cdna που περιζχει μόνο τα εξϊνια των γονιδίων που εκφράηονται ςε ζνα ςυγκεκριμζνο κυτταρικό τφπο. γ. Οι δυο βιβλιοθήκες είναι cdna. Στθν περίπτωςθ αυτι οι βιβλιοκικεσ καταςκευάςτθκαν από κφτταρα που ανικουν ςε διαφορετικοφσ κυτταρικοφσ τφπουσ και ςτα οποία εκφράηονται διαφορετικά γονίδια και ςυνεπϊσ διαφορετικόσ αρικμόσ γονιδίων. Στην εικόνα απεικονίζονται ο αριθμός των βακτηριακών κλώνων που περιέχουν τα γονίδια Α,Β,Γ, Δ και Ε σε cdna και σε γονιδιωματική βιβλιοθήκη που κατασκευάστηκαν από κύτταρα του ίδιου κυτταρικού τύπου. α. Ποιο από τα διαγράμματα Ι και ΙΙ αναφέρεται στη cdna βιβλιοθήκη και ποιο στη γονιδιωματική και γιατί; β. Σε περίπτωση που κατασκευάσουμε cdna και γονιδιωματική βιβλιοθήκη από κύτταρα που ανήκουν σε διαφορετικό κυτταρικό τύπο του ίδιου οργανισμού, ποιο από τα διαγράμματα Ι και ΙΙ θα είναι διαφορετικό και γιατί;

10 Αναλυτική Μεθοδολογία Ασκήσεων Είναι δυνατόν δυο διαφορετικζσ περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ να ςχθματίηουν ςτο DNA τα ίδια μονόκλωνα άκρα. Στθν περίπτωςθ αυτι το ξζνο DNA και ο φορζασ κλωνοποίθςθσ μποροφν να κοποφν από διαφορετικζσ ενδονουκλεάςεσ. Διαφορετικζσ περιοριςτικζσ ενδονουκλεάςεσ μποροφν να κόβουν το DNA ςτθν ίδια αλλθλουχία βάςεων. Αυτό ςυμβαίνει όταν θ αλλθλουχία που κόβεται από τθ μια ενδονουκλεάςθ περιζχει τθν αλλθλουχία που κόβει θ άλλθ.

11 Παραδείγματα Ασκήσεων με Υποδειγματική Αιτιολόγηση όπως το παρακάτω Δίνεται το παρακάτω τμήμα DNA προκαρυωτικού κυττάρου Αλυσίδα Ι 5'CGAATTCTTAAAGGATCCACATCGAATTC3' Αλυσίδα ΙΙ 3'GCTTAAGAATTTCCTΑGGTGTAGCTTAAG5' Το τμήμα αυτό πρόκειται να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο της εικόνας προκειμένου να εισαχθεί σε βακτήριο για την παραγωγή πεπτιδίου. Το πλασμίδιο αυτό διαθέτει θέση έναρξης της αντιγραφής (Θ.Ε.Α), γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά αμπικιλίνη (amp) και τετρακυκλίνη (tet) και μπορεί να κοπεί από τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες E1,Ε2 και Ε3 στις θέσεις που υποδεικνύονται στην εικόνα. α. Ποια από τις ενδονουκλεάσες Ε1,Ε2 και Ε3 πρέπει να επιλεγεί ώστε η κλωνοποίηση του συγκεκριμένου τμήματος DNA να είναι επιτυχής; β. Ποια είναι αλληλουχία αμινοξέων του πεπτιδίου που θα παραχθεί από τα μετασχηματισμένα βακτήρια; Δίνονται οι αλληλουχίες που κόβουν οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες Ε1, Ε2 και Ε3. Ε1: 5 CGAATTC 3 E2: 5 GGATCC 3 E3: 5 GAATTC 3 3 GCTTAAG 5 3 CCTAGG 5 3 CTTAAG 5

12 Ασκήσεις για Λύση όπως οι παρακάτω Δίνεται το παρακάτω τμήμα μορίου DNA το οποίο περιέχει συνεχές γονίδιο. Το τμήμα αυτό, με τη χρήση κατάλληλων ενζύμων, πρόκειται να ενσωματωθεί σε πλασμίδιο και στη συνέχεια να εισαχθεί σε βακτήριο για την παραγωγή πεπτιδίου. Το πλασμίδιο, που χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης, μπορεί να κοπεί από τέσσερις διαφορετικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες, τις BamHI, SacI, BglII και την SalI. Στην εικόνα απεικονίζεται το πλασμίδιο, που χρησιμοποιείται ως φορέας κλωνοποίησης, η θέση πέψης από κάθε ενδονουκλεάση, δυο γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά αμπικιλίνη (amp) και τετρακυκλίνη (tetra) και ένα γονίδιο που κωδικοποιεί κάποιο ένζυμο. Το ένζυμο αυτό, παρουσία κατάλληλης χρωστικής, χρω-ματίζει τις βακτηριακές αποικίες μπλε. Τέλος το πλασμίδιο διαθέτει και δυο υποκινητές (Υ) οι οποίοι είναι κατάλληλοι για την μεταγραφή του συνεχούς γονιδίου.

13 α. Ποια ένζυμα πρέπει να χρησιμοποιηθούν για την κατασκευή του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου; β. Πως θα επιλεγούν τα βακτήρια που δέχτηκαν τα ανασυνδυασμένα βακτήρια; γ. Αν όλες οι αποικίες βακτηριών που επιζούν, παρουσία και των δυο αντιβιοτικών, έχουν μπλε χρώμα, να εξηγήσετε τι είδους πλασμίδια έχουν προσλάβει τα ανα-συνδυασμένα πλασμίδια. Tο παρακάτω τμήμα DNA περιέχει ασυνεχές γονίδιο Α. το οποίο κωδικοποιεί πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για φαρμακευτική χρήση. Για το σκοπό αυτό το γονίδιο Α πρόκειται να κλωνοποιηθεί ώστε να γίνει παραγωγή του πεπτιδίου, από βακτηριακή καλλιέργεια, σε μεγάλη ποσότητα. Δίνεται ότι όλα τα εσώνια αρχίζουν πάντα από τις βάσεις 5 GU 3 και τελειώνουν με τις βάσεις 5 AG 3. α. Να γράψετε το τμήμα του γονιδίου Α που πρέπει να εισαχθεί στα βακτήρια για την παραγωγή του πεπτιδίου. β. Για την εισαγωγή του γονιδίου Α στα βακτήρια χρησιμοποιείται το πλασμίδιο της παρακάτω εικόνας το οποίο μπορεί να κοπεί από τρείς διαφορετικές περιοριστικές ενδονουκλεάσες τις Ε 1, Ε 2 και Ε 3, στις θέσεις που υποδεικνύονται στην εικόνα.

14 Οι αλληλουχίες που κόβουν οι ενδονουκλεάσες αυτές είναι: Ε 1 5 TCTAGA 3 E 2 5 GAATTC 3 E 3 5 CTCGAG 3 3 AGATCT 5 3 CTTAAG 5 3 GAGCTC 5 Δίνεται επίσης η κατεύθυνση με την οποία αντιγράφεται ο κλώνος ΙΙ του πλασμιδίου. Το μόριο Γ αποτελείται από το τμήμα του γονιδίου Α, που πρόκειται να εισαχθεί στα βακτήρια και από τα μονόκλωνα άκρα που πρέπει να διαθέτει ώστε να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο. Επίσης υποδεικνύεται και η κωδική αλυσίδα αυτού του μορίου. 1. Για ποιο λόγο το μόριο Γ πρέπει να ενσωματωθεί στη συγκεκριμένη θέση του πλασμιδίου; 2.Να γράψετε την αλληλουχία βάσεων του μορίου Γ ώστε αυτό να ενσωματωθεί στο πλασμίδιο με τον σωστό προσανατολισμό. γ. Σε ποιον από τους κλώνους Ι και ΙΙ του πλασμιδίου θα συνδεθεί η κωδική αλυσίδα του γονιδίου Α;

15 δ. Έχετε στη διάθεσή σας τους ανιχνευτές 1 και 2. Ανιχνευτής 1 Ανιχνευτής 2 5 CAAACGAUCUG 3 5 GTTTACTAG 3 Ποιος από τους δυο ανιχνευτές είναι κατάλληλος για τον εντοπισμό των βακτηρίων που συνθέτουν το φαρμακευτικό πεπτίδιο; Σε τι μπορεί να είναι χρήσιμος ο άλλος ανιχνευτής και γιατί;