Βιολογία Ζώων Ι. ίνος Γκιώκας. Πανεπιστήμιο Πατρών Σμήμα Βιολογίας. Πάτρα 2015

Transcript

1 Βιολογία Ζώων Ι ίνος Γκιώκας Πανεπιστήμιο Πατρών Σμήμα Βιολογίας Πάτρα 2015 Πατρών

2 Μικροσκοπία Πατρών

3 Σο σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο Σύπος οπτικού μικροσκοπίου με δύο ξεχωριστά συστήματα φακών (προσοφθάλμιοι & αντικειμενικοί) Παρέχει μεγεθύνσεις της τάξης 1000x- 2000x Ένα από τα πιο σημαντικά και χρήσιμα «εργαλεία» του ζωολόγου Φρησιμοποιείται για τη μελέτη κυττάρων, ιστών, και ανάπτυξης εμβρύων, καθώς και για αρκετές άλλες εφαρμογές Διάφοροι τύποι και μάρκες Σα βασικά χειριστήρια είναι παρόμοια Πατρών

4 Προσοχή! Ακριβό όργανο Φειριστείτε το με προσοχή Να το μεταφέρετε πάντοτε με τα δύο χέρια (όπως στη φωτογραφία) Σο ένα χέρι στο βραχίονα και το άλλο στη βάση του μικροσκοπίου Πατρών

5 Σα μέρη του μικροσκοπίου Προσοζθάλμιοι ζακοί Περιστρεζόμενη πλάκα ζακών Αντικειμενικοί ζακοί Σράπεζα εργασίας σγκεντρωτικοί ζακοί & Γιάζραγμα ίριδας ηωτισμός Κοτλίες μετακίνησης Κοτλίες εστίασης Βάση Γιακόπτης on/off Ρύθμιση έντασης ζωτισμού Πατρών

6 Απόσταση εργασίας & Εστίαση Για την ακριβή παρατήρηση ενός παρασκευάσματος απαιτείται η τοποθέτηση του αντικειμενικού φακού σε μια συγκεκριμένη απόσταση από το παρασκεύασμα Αυτή η απόσταση εξαρτάται από τον τύπο του αντικειμενικού φακού και ονομάζεται απόσταση εργασίας τη σωστή απόσταση εργασίας το παρασκεύασμα θα είναι εστιασμένο Η απόσταση εργασίας αλλάζει αντιστρόφως ανάλογα με τη μεγεθυντική ικανότητα του αντικειμενικού φακού Υακοί μικρής μεγέθυνσης απαιτούν μεγαλύτερη απόσταση εργασίας Υακοί μεγάλης μεγέθυνσης απαιτούν μικρότερη απόσταση εργασίας Πατρών

7 Απόσταση εργασίας & Εστίαση Η εστίαση επιτυγχάνεται αλλάζοντας μηχανικά την απόσταση μεταξύ του παρασκευάσματος και των αντικειμενικών φακών με τη χρήση του μακρομετρικού και του μικρομετρικού κοχλία εστίασης Πατρών

8 Είδωλα Όταν παρατηρείτε ένα αντικείμενο με ένα σύνθετο μικροσκόπιο, σχηματίζονται αρκετές εικόνες (είδωλα) από το οπτικό σύστημα του μικροσκοπίου Σρία είναι τα πιο σημαντικά Σο αληθινό είδωλο (real image) Σο εικονικό είδωλο (virtual image) Σο είδωλο στον αμφιβληστροειδή (retinal image) Σο αληθινό είδωλο σχηματίζεται σε συγκεκριμένη απόσταση πάνω από τον αντικειμενικό (objective) φακό Αυτό που ουσιαστικά βλέπετε μέσω του μικροσκοπίου είναι το εικονικό είδωλο το οποίο εμφανίζεται μεγαλύτερο και μακρύτερα από ότι το αντικείμενο στην τράπεζα εργασίας Σο είδωλο στον αμφιβληστροειδή σχηματίζεται από τις ακτίνες του φωτός που πέφτουν πάνω του Σο εικονικό είδωλο είναι χρήσιμο εάν θέλετε να υπολογίσετε το μέγεθος του αντικειμένου που παρατηρείτε μέσω του οπτικού μικροσκοπίου Πατρών

9 Μεγέθυνση Ο κύριος σκοπός του μικροσκοπίου είναι η μεγέθυνση του ειδώλου του αντικειμένου Η μεγέθυνση ενός αντικειμένου καθορίζεται από την κατασκευή των προσοφθάλμιων και των αντικειμενικών φακών Η συνολική μεγέθυνση είναι το γινόμενο των επιμέρους μεγεθύνσεων αυτών των δύο φακών Παράδειγμα: 10x προσοφθάλμιος X 10x αντικειμενικός = 100x υνολική Μεγέθυνση Πατρών

10 Μεγέθυνση Σα εκπαιδευτικά μικροσκόπια έχουν συνήθως 10x προσοφθάλμιους φακούς και 10x & 43x (ή 40x & 44x) αντικειμενικούς φακούς υχνά τα εκπαιδευτικά μικροσκόπια έχουν και 3.5x αντικειμενικούς φακούς που είναι χρήσιμοι για την παρατήρηση σχετικά μεγάλων αντικειμένων ή για τον προκαταρκτικό εντοπισμό του αντικειμένου σε ένα μικροσκοπικό παρασκεύασμα Ενίοτε μπορεί να υπάρχουν 90x ή 100x καταδυτικοί φακοί για την παρατήρηση πολύ μικρών οργανισμών, π.χ. βακτηρίων Προσοχή στη χρήση των καταδυτικών φακών Πατρών

11 Διακριτική ισχύς Διακριτική ισχύς: η μικρότερη απόσταση ανάμεσα σε δύο σημεία έτσι ώστε να μπορούν διακριθούν οπτικά ως δύο ξεχωριστά σημεία Η ικανότητα των φακών ενός μικροσκοπίου να αναδείξουν τις λεπτομέρειες του παρατηρούμενου αντικειμένου Η μεγέθυνση δεν συνοδεύεται πάντοτε από αύξηση της ευκρίνειας μέσα στο παρασκεύασμα Μετά από κάποια όρια, η επιπρόσθετη μεγέθυνση κάνει πιο ασαφές το είδωλο Η διακριτική ισχύς εξαρτάται από το σχεδιασμό και την ποιότητα των αντικειμενικών φακών Η διακριτική ισχύς καθορίζει τη χρήσιμη μεγέθυνση Πατρών

12 Υωτισμός Ο σωστός φωτισμός του αντικειμένου είναι σημαντικός γιατί ακατάλληλος φωτισμός προκαλεί κακά είδωλα, ανακριβείς παρατηρήσεις και κούραση ματιών Σα σύγχρονα μικροσκόπια έχουν ενσωματωμένη πηγή φωτισμού στη βάση Μπορείτε επίσης να ρυθμίσετε την ποσότητα του φωτός που φτάνει στον αντικειμενικό φακό περιστρέφοντας το διάφραγμα της ίριδας Ο καλύτερος φωτισμός επιτυγχάνεται με το μικρότερο διάφραγμα που μπορεί να φωτίσει ολόκληρο το μικροσκοπικό πεδίο Ο φωτισμός ελέγχεται και με τους συγκεντρωτικούς φακούς (η καλύτερη θέση συνήθως είναι η ανώτερη) Πατρών

13 Εστίαση Για να δείτε ένα καθαρό είδωλο του αντικειμένου πρέπει να ρυθμίσετε προσεκτικά την απόσταση μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του παρασκευάσματος Αυτό λέγεται εστίαση Αυτό γίνεται με τους κοχλίες εστίασης Μακρομετρικός: μεγάλες ρυθμίσεις Μικρομετρικός: μικρές ρυθμίσεις Μερικές φορές μπορεί να διαπιστώσετε ότι δεν μπορείτε να επιτύχετε καλή εστίαση με τη χρήση του μικρομετρικού κοχλία Λύση: Γυρίστε πίσω τελείως το μικρομετρικό κοχλία Εστιάστε πάλι με τον μακρομετρικό Κατόπιν χρησιμοποιήστε πάλι τον μικρομετρικό κοχλία Πατρών

14 ΠΡΟΟΦΗ ΠΡΟΟΧΗ ΠΟΣΕ μην αφήσετε τον αντικειμενικό φακό να «αγγίξει» το παρασκεύασμα ή τους συγκεντρωτικούς φακούς Μην εστιάζετε ΠΟΣΕ προς τα κάτω κοιτώντας μέσα από το μικροσκόπιο ΠΑΝΣΟΣΕ να εντοπίζετε το παρασκεύασμα πρώτα με το μικρότερο αντικειμενικό φακό ΠΟΣΕ να μην αναποδογυρίζετε ή γέρνετε το μικροσκόπιο. Μπορεί να πέσουν οι προσοφθάλμιοι φακοί Πατρών

15 ΠΡΟΟΦΗ ΠΡΟΟΧΗ Διατηρείτε ΠΑΝΣΟΣΕ καθαρό και ξηρό το μικροσκόπιο ΠΟΣΕ μην ανάβετε ή κλείνετε τη λάμπα του μικροσκοπίου προτού σβήσετε το μικροσκόπιο ΠΟΣΕ μην χρησιμοποιείτε τον μακρομετρικό κοχλία εστίασης όταν έχετε αντικειμενικό φακό υψηλής μεγέθυνσης. Εστιάστε μόνο με τον μικρομετρικό ΠΑΝΣΟΣΕ να προσέχετε τα καλώδια ΠΑΝΣΟΣΕ όταν τελειώσετε την παρατήρηση να βάζετε τον αντικειμενικό φακό χαμηλής μεγέθυνσης, να ανεβάζετε πλήρως τους αντικειμενικούς φακούς, και να μην αφήνετε παρασκεύασμα στο μικροσκόπιο Πατρών

16 Βήματα Παρατήρησης Πατρών

17 Προετοιμασία 1. Ανοίξτε το μικροσκόπιο και ρυθμίστε την ένταση του φωτός 2. Περιστρέψτε την πλάκα των αντικειμενικών φακών στη μικρότερη μεγέθυνση μέχρι να ακουστεί κλικ 3. Φρησιμοποιήστε τον μακρομετρικό κοχλία για να αυξήσετε την απόσταση μεταξύ τράπεζας εργασίας και αντικειμενικού φακού Πατρών

18 Σοποθετείστε το δείγμα στην τράπεζα εργασίας 1. Πάρτε ένα παρασκεύασμα και εξετάστε το για να εντοπίσετε τη θέση του δείγματος στο παρασκεύασμα 2. ιγουρευτείτε ότι το κάλυμμα (καλυπτρίδα) και το δείγμα είναι στο πάνω μέρος της αντικειμενοφόρου πλάκας 3. Φρησιμοποιείστε τις λαβίδες της τράπεζας για να συγκρατήσετε το παρασκεύασμα 4. Σοποθετήστε το παρασκεύασμα στην τράπεζα εργασίας, με το δείγμα να βρίσκεται στο κέντρο του συγκεντρωτικού φακού, χρησιμοποιώντας τους κοχλίες μετακίνησης κατά τον Φ και Τ άξονα Πατρών

19 Σοποθετείστε το δείγμα στην τράπεζα εργασίας Πατρών

20 Ρύθμιση της διακορικής απόστασης 1. Προσπαθήστε να συγχωνεύεστε σε μια μοναδική εικόνα τη δεξιά και αριστερή εικόνα των ματιών σας μετακινώντας τους προσοφθάλμιους φακούς 2. Εάν χρησιμοποιούν και άλλοι το μικροσκόπιο σημειώστε την προσωπική σας τιμή της διακορικής απόστασης Πατρών

21 Ρύθμιση της διόπτρας (αντιστάθμιση της διαφοράς ανάμεσα στα δύο μάτια) 1. Εάν φοράτε γυαλιά διπλώστε τα σκίαστρα των προσοφθάλμιων φακών Πατρών

22 Ρύθμιση της διόπτρας (αντιστάθμιση της διαφοράς ανάμεσα στα δύο μάτια) 1. Εστιάστε κοιτώντας πρώτα από το δεξιό προσοφθάλμιο με το δεξί σας μάτι 2. Κατόπιν εστιάστε κοιτώντας από τον αριστερό προσοφθάλμιο με το αριστερό σας μάτι περιστρέφοντας το δακτύλιο του αριστερού προσοφθάλμιου Πατρών

23 Ρύθμιση φωτεινότητας (συγκεντρωτικός φακός & διάφραγμα ίριδας) 1. Ανοίξτε πλήρως το διάφραγμα της ίριδας 2. Μειώστε το φως στο δείγμα, τόσο όσο να έχετε μια ευκρινή παρατήρηση Μετακινείστε τον συγκεντρωτικό φακό στην ανώτερη θέση (συνήθως εκεί βρίσκεται) Ο δακτύλιος της ίριδας αναγράφει την κλίμακα μεγέθυνσης του αντικειμενικού φακού. Περιστρέψτε το δακτύλιο έτσι ώστε η γραμμή του περιστρεφόμενου δακτύλιου να ευθυγραμμίζεται με τη μεγέθυνση που αναγράφεται στον αντικειμενικό φακό που χρησιμοποιείτε Πατρών

24 Εστίαση 1. Παρατηρώντας, πάντοτε από το πλάι, τον αντικειμενικό φακό και το παρασκεύασμα, ρυθμίστε προσεκτικά την μεταξύ τους απόσταση περίπου στα 3 mm. Μην κοιτάτε μέσω των προσοφθάλμιων φακών όταν κάνετε αυτή τη ρύθμιση Πατρών

25 Εστίαση 3. Κοιτάξτε μέσω των προσοφθάλμιων φακών και αργά αυξήστε την απόσταση μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του παρασκευάσματος μέχρι να εστιάστε καλά στο δείγμα χρησιμοποιώντας τον μακρομετρικό κοχλία. Ποτέ μην εστιάζετε ακολουθώντας την αντίστροφη διαδρομή (δηλ. μειώνοντας την απόσταση μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του δείγματος) 4. τη συνέχεια κεντράρετε το δείγμα, εάν είναι απαραίτητο, και κάντε πιο λεπτή εστίαση χρησιμοποιώντας τον μικρομετρικό κοχλία Πατρών

26 Αλλάζοντας τη μεγέθυνση 1. Γυρίστε την περιστρεφόμενη πλάκα των αντικειμενικών φακών μέχρι ο φακός της μεγαλύτερης μεγέθυνσης (π.χ. 43x) να βρεθεί ακριβώς πάνω από το συγκεντρωτικό φακό και να «κουμπώσει» 2. Οι αντικειμενικοί φακοί στα σύγχρονα μικροσκόπια απαιτούν μικρές μόνο ρυθμίσεις εστίασης όταν αλλάζει η μεγέθυνση. Επομένως, θα χρειαστεί να κάνετε ρυθμίσεις μόνο με τον μικρομετρικό κοχλία εστίασης 3. Επίσης μπορεί να χρειαστεί να ανοίξετε το διάφραγμα της ίριδας Πατρών

27 Φρησιμοποιώντας τον καταδυτικό φακό Ελαιοκατάδυση: Χρησιμοποιείται μόνο με τον αντικειμενικό φακό 100x (μέγιστη μεγέθυνση) 1. Εστιάστε στο δείγμα χρησιμοποιώντας ξεκινώντας από το αντικειμενικό φακό μικρότερης μεγέθυνσης 2. Πριν χρησιμοποιήσετε τον καταδυτικό φακό (100x) ρίξτε μια σταγόνα ελαίου (κεδρέλαιο) στην περιοχή του παρασκευάσματος που θέλετε να παρατηρήσετε 3. Περιστρέψτε την πλάκα των φακών και χρησιμοποιήστε τον καταδυτικό φακό (100x) εστιάζοντας πολύ προσεκτικά μόνο με τον μικρομετρικό κοχλία 4. Για να αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων μετακινείστε ελαφρά μπρος-πίσω τον καταδυτικό φακό χρησιμοποιώντας την περιστροφική πλάκα 5. Αφού τελειώσετε την παρατήρηση καθαρίστε προσεκτικά το φακό και το παρασκεύασμα με τη βοήθεια ειδικού χαρτιού εμποτισμένου με οινόπνευμα Πατρών

28 Σο στερεοσκόπιο Φρήσιμο για την παρατήρηση μικρών ζώων, π.χ. έντομα και τμημάτων τους, π.χ. αυγά, και για την ανατομία τους Σο είδωλο δεν είναι ανεστραμμένο όπως στο σύνθετο μικροσκόπιο Οι φακοί και τα πρίσματα παρέχουν διπλά μονοπάτια φωτός και παράγουν στερεοσκοπική (τρισδιάστατη) εικόνα Η μεγέθυνση είναι περιορισμένη σε σχέση με το οπτικό μικροσκόπιο (συνήθως 5-50x) και x στα ερευνητικά στερεοσκόπια υνεχής ή σταδιακή μεγέθυνση Προσπίπτων ή/και διερχόμενος φωτισμός Πατρών

29 Σα μέρη του στερεοσκοπίου 1. Προσοφθάλμιοι φακοί 2. Λαβή μεταφοράς 3. Επιλογέας μεγέθυνσης 4. Ρυθμιστής εστίασης 5. Προσπίπτων φωτισμός 6. Διερχόμενος φωτισμός 7. Διακόπτης προσπίπτοντος/ διερχόμενου φωτός Πατρών

30 Άλλοι τύποι μικροσκοπίων Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσεων (Phase Contrast Microscope) Επιτρέπει την άμεση εξέταση διαφανών, μη-χρωσμένων δειγμάτων (κύτταρα, ιστοί) Φρησιμοποιεί μια μέθοδο που αυξάνει την αντίθεση (contrast) Πολωτικό μικροσκόπιο (Interference microscope) Φρησιμοποιεί δύο δέσμες πολωμένου φωτός σε ένα σύνθετο οπτικό σύστημα για την απεικόνιση δομών σε ζωντανά, μη-χρωσμένα κύτταρα Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Ακτινοβόληση με δέσμη ηλεκτρονίων Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (Transmission Electron Microscope): παρέχει πολύ μεγάλες μεγεθύνσεις x (100x σε σχέση με το οπτικό μικροσκόπιο) Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Scanning Electron Microscope): παρέχει τρισδιάστατες εικόνες Πατρών

31 Ασκήσεις χρησιμοποιώντας το σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο Πάρτε ένα μικροσκοπικό παρασκεύασμα με το γράμμα «Ρ» πάνω του Σοποθετήστε το παρασκεύασμα στην τράπεζα εργασίας και παρατηρήστε το σε μικρή μεγέθυνση Ποιος είναι ο προσανατολισμός του γράμματος «Ρ» όπως το βλέπετε μέσω του σύνθετου μικροσκοπίου; Γιατί διαφέρει από το «Ρ» που είναι τυπωμένο; Μετακινείστε ελαφρώς το παρασκεύασμα προς τα αριστερά κοιτώντας μέσα από τον προσοφθάλμιο Προς τα πού μετακινείται το γράμμα «Ρ»; Μετακινείστε το παρασκεύασμα μακριά από εσάς. Προς τα πού μετακινείται τώρα το γράμμα «Ρ»; Πατρών

32 Ασκήσεις χρησιμοποιώντας το σύνθετο οπτικό μικροσκόπιο Αλλάξτε τους αντικειμενικούς φακούς περιστρέφοντας την πλάκα των φακών Παρατηρήστε το γράμμα «Ρ» σε μεγάλη μεγέθυνση «Πόσο» από το «Ρ» μπορείτε να δείτε; Πάρτε ένα παρασκεύασμα ιστού και παρατηρήστε το πρώτα σε μικρή μεγέθυνση και κατόπιν σε μεγάλη μεγέθυνση Ποιο είναι το σχήμα των κυττάρων; Σι δομές μπορείτε να παρατηρήσετε; χεδιάστε αυτό που βλέπετε και βάλτε ενδείξεις εάν γνωρίζετε Πατρών

33 Μετρώντας μικροσκοπικά δείγματα Εάν παρατηρείτε ένα κύτταρο που φαίνεται να έχει διάμετρο περίπου 25mm, απλώς διαιρέστε το μέγεθος με την μεγέθυνση για να υπολογίσετε το πραγματικό μέγεθος του κυττάρου, π.χ.: 25mm (παρατηρούμενο μέγεθος) /103 (μεγέθυνση) = 0.24 mm (πραγματικό μέγεθος) Πολλά μικροσκόπια έχουν ενσωματωμένο μικρομετρικό δίσκο στον έναν προσοφθάλμιο φακό Ο μικρομετρικός δίσκος έχει μια κλίμακα σε χιλιοστά Πάρτε ένα παρασκεύασμα με κολλημένο πάνω του ένα κομμάτι χαρτί μιλιμετρέ & χρησιμοποιείστε ένα μικρό πλαστικό χάρακα Μετρήστε το παρατηρούμενο μέγεθος και κατόπιν υπολογίστε το πραγματικό μέγεθος Πατρών

34 Μετρώντας μικροσκοπικά δείγματα Μετακινήστε το παρασκεύασμα για να κεντράρετε ένα τετράγωνο (1mm x 1mm) με δύο πλευρές του τετραγώνου να είναι παράλληλες με την άκρη της τράπεζας εργασίας Σοποθετήστε το χάρακα στη δεξιά πλευρά της τράπεζας έτσι ώστε να μπορείτε να βλέπετε το χάρακα με το ένα μάτι ενώ παράλληλα να βλέπετε το παρασκεύασμα με το άλλο μάτι Έχοντας ανοικτά και τα δύο σας μάτια, εστιάστε και στα δύο είδωλα Αυτό είναι παράξενο στην αρχή, αλλά εάν συνεχίσετε θα τα βλέπετε επάλληλα Όταν βλέπετε και τα δύο επάλληλα είδωλα μετρήστε το παρατηρούμενο μέγεθος του μιλιμετρέ τετραγώνου όπως αυτό εμφανίζεται στο χάρακα ημειώστε τη μέτρηση. Τπολογίστε το πραγματικό μέγεθος Πατρών

35 Ασκήσεις χρησιμοποιώντας το στερεοσκόπιο Πάρτε ένα μακροσκοπικό παρασκεύασμα και εξετάστε το κάτω από το στερεοσκόπιο Πειραματιστείτε με διάφορα παρασκευάσματα έτσι ώστε να εξοικειωθείτε με τη χρήση του στερεοσκοπίου Δοκιμάστε διαφορετικές εντάσεις φωτισμού, προσπίπτοντα ή/και διερχόμενο φωτισμό Μπορείτε να παρατηρήσετε διαφορετικές δομικές λεπτομέρειες ανάλογα με το φωτισμό; χεδιάστε αυτό που βλέπετε Πατρών