ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ

Transcript

1 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ Saccharomyces cerevisiae ΕΝΑΝΤΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΚΑΡΛΑΤΟΣ ΛΕΩΝΙΔΑΣ ΑΘΗΝΑ 2018

2 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ Saccharomyces cerevisiae ΕΝΑΝΤΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΚΑΡΛΑΤΟΣ ΛΕΩΝΙΔΑΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Πανάγου Ευστάθιος, Αναπληρωτής Καθηγητής ΑΘΗΝΑ 2018

3 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ Saccharomyces cerevisiae ΕΝΑΝΤΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΣΚΑΡΛΑΤΟΣ ΛΕΩΝΙΔΑΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Πανάγου Ευστάθιος, Αναπληρωτής Καθηγητής (επιβλέπων) Νυχάς Γεώργιος-Ιωάννης, Καθηγητής Τσιτσιγιάννης Δημήτριος, Αναπληρωτής Καθηγητής ΑΘΗΝΑ 2018

4 ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ Saccharomyces cerevisiae ΕΝΑΝΤΙ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Σκαρλάτος Λεωνίδας Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου, Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων, Ιερά Οδός 75, Αθήνα , ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η αντιμικροβιακή δράση της ζύμης Saccharomyces cerevisiae Y 33 έναντι 35 διαφορετικών ειδών μυκήτων των γενών Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Alternaria, Cladosporium και Aurebacidium. Εξετάστηκε η ανάπτυξη των συγκεκριμένων ειδών μυκήτων και η παραγωγή ωχρατοξίνης Α (ΩΤΑ) των ωχρατοξιγόνων. Η ανάπτυξη εξετάστηκε σε θερμοκρασία 25 ο C σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ για 14 ημέρες. Η μεταξύ τους επίδραση μελετήθηκε χρησιμοποιώντας εμβόλιο ζύμης και μύκητα 10 5 cfu/ml και 10 5 conidia/ml, αντίστοιχα. Η ζύμη σε όλες τις περιπτώσεις παρεμπόδισε την ανάπτυξη των μυκήτων που εξετάστηκαν. Οι μύκητες παρήγαγαν μεγαλύτερη ποσότητα τοξίνης απουσία της ζύμης. Επίσης εξετάστηκε η αντιμικροβιακή δράση της ζύμης σε προϊόντα όπως η κορινθιακή σταφίδα και το κριθάρι. Η ζύμη εμβολιάστηκε με διαφορετικές επεμβάσεις με εμβόλιο 10 6 cfu/ml. Επιπλέον σε ένα δείγμα έγινε προσθήκη του αντιβιοτικού ναταμυκίνη με συγκέντρωση 0,0088 g/l. Τα δείγματα συντηρήθηκαν στους 25 ο C για 28 ημέρες. Σε κάθε περίπτωση συντηρήθηκαν και τα αντίστοιχα δείγματα αναφοράς. Η ζύμη παρεμπόδισε την ανάπτυξη των μυκήτων περισσότερο στην κορινθιακή σταφίδα σε σχέση με το κριθάρι. Το χρησιμοποιούμενο στέλεχος S. cerevisiae Y 33 μπορεί να θεωρηθεί ως ένας αντιμικροβιακός παράγοντας ικανός να παρεμποδίσει ή να αναστείλει την ανάπτυξη και παραγωγή ωχρατοξίνης Α διαφορετικών ειδών μυκήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση και ασφάλεια τροφίμων όπως δημητριακά, αποξηραμένα φρούτα κ.α. Λέξεις κλειδιά: Saccharomyces cerevisiae, μύκητες, παρεμπόδιση, κορινθιακή σταφίδα, κριθάρι, ωχρατοξίνη Α i

5 ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF Saccharomyces cerevisiae AGAINST FUNGI ASSOCIATED WITH FOOD QUALITY AND SAFETY Skarlatos Leonidas Faculty of Food Science and Human Nutrition, Department of Microbiology and Biotechnology of Foods, Athens , ABSTRACT Τhe aim of the present study was to assay Saccharomyces cerevisiae Y 33 as a control factor against fungal growth and toxin production. Competition experiments were conducted using 35 different fungal species belonging to Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Alternaria, Cladosporium and Aurebacidium genera. S. cerevisiae was spread inoculated on MEA Petri dishes (ca cfu/ml) and fungal species were spot inoculated at ca conidia/ml. The plates were incubated at 25 o C for 14 days. Control plates were also inoculated in every case study. Under S. cerevisiae interaction effect, no growth was observed for all fungal species and toxin production was lower. The antimicrobial activity of S. cerevisiae was also assayed in products such as currants and barley. The yeast was inoculated with different treatments at ca cfu/ml. In addition, natamycin was added at ca. of g/l into a sample. The samples were incubated at 25 C for 28 days. Control plates were also incubated in every case study. S. cerevisiae has inhibited the growth of fungi more in currants than barley. S. cerevisiae Y 33 can be considered as a natural antimicrobial agent, able to suppress or limit the growth of many different fungal species, which colonize selected foods such as cereals, dried fruits, etc. and are considered as food spoilers or pathogens due to toxin production. Keywords: Saccharomyces cerevisiae, fungi, inhibition, currants, barley, ochratoxin A ii

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΣΠΟΥΔΑΙΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΣΙΤΗΡΩΝ Πλεονεκτήματα των σιτηρών Σπουδαιότητα και εξάπλωση των σιτηρών στην Ελλάδα ΓΕΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΧΕΙΜΕΡΙΝΩΝ ΣΙΤΗΡΩΝ Καρπός Αποθήκευση ΚΡΙΘΑΡΙ Εξάπλωση και οικονομική σημασία Ταξινόμηση Προϊόντα και ποιότητα αυτών Μικροχλωρίδα δημητριακών ΣΤΑΦΙΔΑ Γενικά στοιχεία Ιστορία Έρευνα και πλεονεκτήματα της Κορινθιακής Σταφίδας Διατροφική αξία Μικροχλωρίδα αποξηραμένων φρούτων ΖΥΜΕΣ ΜΥΚΗΤΕΣ Εισαγωγή Γενικά στοιχεία βιολογίας μυκήτων ΤΟΞΙΝΕΣ Μικροβιακές τοξίνες Μυκοτοξίνες Γιατί οι μικροοργανισμοί παράγουν τοξίνες iii

7 Αναλυτικές μέθοδοι ανίχνευσης μυκοτοξινών Σύστημα HPLC Ωχρατοξίνη Α ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ Θρεπτικά υποστρώματα Στελέχη και προετοιμασία μικροοργανισμών Εμβολιασμός τριβλίων Ανάπτυξη μυκήτων ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ Θρεπτικά υποστρώματα Στελέχη μικροοργανισμών Ανανέωση/Έλεγχος καθαρότητας ζύμης Καθαρισμός ζύμης Εμβολιασμός δειγμάτων τροφίμων με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης Δειγματοληψίες τροφίμων ΛΗΨΗ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ ΤΟΞΙΝΕΣ Διαλύματα Δειγματοληψία Μέθοδος εκχύλισης Σύστημα HPLC ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ iv

8 3.1. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ Σύγκριση μυκήτων απουσία ζύμης Σύγκριση μυκήτων παρουσία της ζύμης Saccharomyces cerevisiae Y ΟΠΤΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΤΟΞΙΝΕΣ Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus carbonarius Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus niger Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus tubigensis Παραγωγή ΩΤΑ από στέλεχος του μύκητα Penicillium verrucosum ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΕΠΕΜΒΑΣΗΣ Συντήρηση δειγμάτων Κορινθιακής σταφίδας παρουσία και απουσία ζύμης με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης Συντήρηση δειγμάτων καρπού κριθαριού παρουσία και απουσία ζύμης με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης ΟΠΤΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΕΠΕΜΒΑΣΗΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΓΩΓΟΜΕΝΗ ΩΤΑ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΕΠΕΜΒΑΣΗΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ v

9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω όσους μου προσέφεραν την βοήθειά τους για την εκπόνηση της μεταπτυχιακής ερευνητικής μου μελέτης και πιο συγκεκριμένα: Τον Καθηγητή κ. Γεώργιο-Ιωάννη Νυχά, Διευθυντή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γ.Π.Α. Τον κ. Δημήτριο Τσιτσιγιάννη, Αναπληρωτή Καθηγητή του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας του Γ.Π.Α. Την κ. Πασχαλίτσα Τρυφινοπούλου, μέλος Ε.ΔΙ.Π. του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γ.Π.Α. Τον κ. Αναστάσιο Σταματίου, μέλος Ε.ΔΙ.Π. του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γ.Π.Α. Τις υποψήφιες διδάκτορες κ. Μάνθου Ευανθία, κ. Μπονάτσου Σταματούλα, κ. Παυλή Φωτεινή και κ. Φέγγου Λεμονιά για τη συνεισφορά τους στην εκπόνηση της παρούσας μελέτης Τον επιβλέποντά μου κ. Ευστάθιο Πανάγου, Αναπληρωτή Καθηγητή του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του Γ.Π.Α. Αθήνα, Απρίλιος 2018 Λεωνίδας Σκαρλάτος vi

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ 1.1. ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΣΠΟΥΔΑΙΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΣΙΤΗΡΩΝ Γενικά - Εξάπλωση Από το σύνολο των φυτικών ειδών μόνο 50 περίπου καλλιεργούνται παγκοσμίως σημαντικά για την παραγωγή προϊόντων, ενώ πολύ λιγότερα από αυτά, 17 είδη, καλύπτουν τις διατροφικές ανάγκες του ανθρώπου άμεσα, ή έμμεσα ως ζωοκομικά προϊόντα και καταλαμβάνουν περίπου το 17% του συνόλου των καλλιεργούμενων εκτάσεων της γης (Stoskopf 1985). Σε αυτά περιλαμβάνονται και τα σιτηρά τα οποία ανήκουν στην οικογένεια Poaceae ή Gramineae. Τα σιτηρά είναι μονοκοτυλήδονα φυτά. Οκτώ καρποδοτικά σιτηρά, το σιτάρι, το ρύζι, το καλαμπόκι, το κριθάρι, η βρώμη, η σίκαλη (βρίζα), το σόργο και το κεχρί παρέχουν το 56% των θερμίδων από τις τροφές και το 50% της πρωτεΐνης που καταναλώνεται παγκοσμίως. Δύο από αυτά, το σιτάρι και το ρύζι, συμβάλλουν άμεσα στη διατροφή του ανθρώπου. Το καλαμπόκι συμβάλει άμεσα, κυρίως όμως έμμεσα, στη διατροφή του ανθρώπου, καθόσον αποτελεί σημαντικότερο προϊόν στη διατροφή των ζώων. Το 75% των σπόρων των σιτηρών παράγεται από το σιτάρι, το ρύζι και το καλαμπόκι και το 25% από τα υπόλοιπα πέντε. Σε πολύ περιορισμένη κλίμακα τα σιτηρά χρησιμοποιούνται στη διατροφή των ζώων ως χονδροειδής ζωοτροφή (κυρίως βόσκηση και ενσιρωμένη τροφή) (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Με τα όσα αναφέρθηκαν καταδεικνύεται η μεγάλη παγκόσμια σπουδαιότητα των σιτηρών και δικαιολογείται η σημαντική ερευνητική προσπάθεια που γίνεται για την αύξηση της απόδοσης και τη βελτίωση της καλλιεργητικής τεχνικής με σκοπό την κάλυψη των συνεχώς αυξανόμενων αναγκών για τη διατροφή του πληθυσμού της γης (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Από αρχαιολογικές έρευνες προκύπτει ότι το σιτάρι και το κριθάρι στον παλαιό κόσμο και το καλαμπόκι στον νέο κόσμο είχαν αναγνωρισθεί ως σπουδαία φυτά από πολύ παλιά. Πιθανόν αυτά τα φυτά να αποτέλεσαν τη βάση για τη μετάβαση του ανθρώπου από την κάλυψη των αναγκών του με τη συλλογή προϊόντων και το κυνήγι, σε μια αγροτική κοινωνία. Για το σιτάρι και το κριθάρι αναφέρεται ότι καλλιεργήθηκαν στη Μέση Ανατολή χρόνια πριν. Η μορφή των καλλιεργούμενων σιτηρών άλλαξε με την επιλογή που έγινε σταδιακά, εμπειρικά αρχικά, προς ορισμένα χαρακτηριστικά π.χ. γενότυπους που δεν τίναζαν τους σπόρους εύκολα και συστηματικά αργότερα εφαρμόζοντας τους νόμους της Γενετικής που 1

11 παρουσιάστηκαν από τον Mendel το δεύτερο ήμισυ του 19 ου αιώνα (Παπακώστα- Τασοπούλου 2012). Τα σιτηρά καλλιεργούνται σε όλες τις χώρες του κόσμου και έχουν παγκόσμια οικονομική σημασία. Κατά το 2010 (FAOSTAT 2012) καλλιεργήθηκαν 6825 εκατομμύρια στρέμματα σε όλο τον κόσμο με συνολική παραγωγή 2432 εκατομμύρια τόνους. Η κατανομή κατά είδος καλλιέργειας παρουσιάζεται στον Πίνακα 1.1. Είδος Καλλιεργηθείσα έκταση (εκατομμ. Παραγωγή (εκατομμ. Μέση απόδοση στρ.) tn) (kg/στρ. Σιτάρι Ρύζι Καλαμπόκι Κριθάρι Σόργο Κεχρί Βρώμη Βρίζα Λοιπά Σύνολο Πίνακας 1.1. Παγκόσμια παραγωγή και καλλιεργηθείσες εκτάσεις των σπουδαιότερων καρποδοτικών σιτηρών κατά το 2010 (FAOSTAT Database) Στα λοιπά σιτηρά κατατάσσονται διάφορα μικρής σημασίας αγρωστώδη που καλλιεργούνται για καρπό, όπως π.χ. το Digitaria exilis και το Digitaria uburua (Αγγλ. Fonio), το τριτικάλε ή σιταρόβριζα (Triticum x Secale) (Αγγλ. Triticale) το Phalaris canariensis (Αγγλ. Carary grass), τα ψευδο-σιτηρά Chenopodium quinoa (Αγγλ. Quinoa) και το Fagopyrum esculentum (Αγγλ. Buckwheat) (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Τα ψευδο-σιτηρά είναι δικοτυλήδονα είδη τα οποία ούτε σχετίζονται μεταξύ τους, ούτε και με τα πραγματικά σιτηρά. Το όνομά τους το πήραν από τους σπόρους που παράγουν και χρησιμοποιούνται στη διατροφή του ανθρώπου όπως και οι σπόροι των σιτηρών (Belton και Taylor 2002) (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Η παγκόσμια καλλιεργούμενη έκταση με σιτηρά παρουσίασε μικρές μεταβολές τις τελευταίες δεκαετίες. Αντίθετα η παραγωγή υπερδιπλασιάστηκε. Η αύξηση της παραγωγής προήλθε από τη χρησιμοποίηση πιο παραγωγικών ποικιλιών, της βελτίωση της τεχνικής καλλιέργειας και την αύξηση της χρησιμοποίησης εισροών (π.χ. λιπάσματα, φυτοπροστατευτικά προϊόντα). Επίσης η προοπτική αύξησης των καλλιεργούμενων εκτάσεων στο προσεχές μέλλον είναι περιορισμένη. Αύξηση της παραγωγής για την κάλυψη των αναγκών του συνεχώς αυξανόμενου πληθυσμού της γης θα προκύψει κυρίως από την αύξηση των αποδόσεων στις αναπτυσσόμενες χώρες, οι οποίες συνεχίζουν να είναι χαμηλές. Αύξηση των αποδόσεων σε 2

12 αυτές τις χώρες θα επιτευχθεί με τη χρήση βελτιωμένων ποικιλιών και την αύξηση των εισροών στην καλλιέργεια (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) Πλεονεκτήματα των σιτηρών Η παγκόσμια κυριαρχία και η αποδοχή των σιτηρών σε ολόκληρο τον κόσμο οφείλεται σε ορισμένα χαρακτηριστικά τα οποία σχολιάζονται στη συνέχεια. Αποδοτικότητα. Μπορούν να αποδώσουν τόσο με μειωμένες εισροές όσο και σε συνθήκες υψηλών εισροών και πλήρους εκμηχάνισης. Σε εκτατικές συνθήκες παράγουν περισσότερο από τις άλλες κατηγορίες φυτών. Τα σιτηρά σε παγκόσμια κλίμακα έχουν πολύ μεγαλύτερες αποδόσεις από τα καρποδοτικά ψυχανθή και τα ελαιοδοτικά. Ασφάλεια παραγωγής. Η μεγάλη προσαρμοστικότητα, η ευελιξία και η αξιοπιστία είναι κριτήρια τα οποία συντελούν ώστε τα σιτηρά να προσφέρουν ασφάλεια ως πηγή προϊόντων για τη διατροφή του ανθρώπου και των ζώων. Μπορούν να αναπτυχθούν σε περιοχές με μεγάλες διαφορές ως προς τις εδαφολογικές συνθήκες. Ακόμη καλλιεργούνται και σε περιβάλλοντα όπου άλλες κύριες καλλιέργειες για παραγωγή τροφών δεν μπορούν αν επιβιώσουν. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το ρύζι το οποίο αναπτύσσεται και παράγει σε στάσιμο νερό. Ένα από τα χαρακτηριστικά που συντελούν στην ασφάλεια της παραγωγής είναι και η καθορισμένη μορφή ανάπτυξης που παρουσιάζουν. Στα σιτηρά η ανάπτυξη χωρίζεται σε βλαστική και αναπαραγωγική περίοδο, ενώ στα φυτά συνεχούς ανάπτυξης, οι δύο προηγούμενες φάσεις συμπίπτουν για μεγάλο χρονικό διάστημα. Σε κλίματα με μία ξηρά περίοδο του έτους, το καθοριστικό της καθορισμένης ανάπτυξης είναι δυνατόν αν εξασφαλίσει γρήγορη ανάπτυξη και ομοιόμορφη ωρίμαση, απαραίτητες προϋποθέσεις για πλήρως μηχανοποιημένη συγκομιδή, χωρίς απώλειες. Άλλο χαρακτηριστικό που συντελεί στην ασφάλεια της παραγωγής των χειμερινών σιτηρών είναι η μη εξάρτησή τους από την φωτοπερίοδο. Τα σιτηρά προσφέρουν ευελιξία στην εφαρμογή διαφόρων συστημάτων παραγωγής με τη μεγάλη διαφοροποίηση που παρουσιάζεται εντός ορισμένων ειδών ως προς τη διάρκεια του βιολογικού κύκλου και με την ικανότητά τους να αποδίδουν σε συγκαλλιέργεια με άλλα είδη φυτών. Πηγή τροφίμων. Τα προϊόντα των σιτηρών αποτελούν τη βάση της διατροφής του πληθυσμού ολόκληρου του κόσμου. Η εξάρτηση της διατροφής από κάποιο είδος διαφέρει στις διάφορες περιοχές. Για παράδειγμα βάση της διατροφής στην Ασία αποτελεί το ρύζι, στην Ευρώπη το σιτάρι, στην Αφρική το καλαμπόκι. Οι σπόροι των σιτηρών καταναλίσκονται αυτούσιοι ή μετά από άλεση με τη μορφή διαφόρων 3

13 σκευασμάτων όπως ψωμί, ζυμαρικά, προϊόντα ζαχαροπλαστικής. Πλήθος δε άλλων προϊόντων όπως η μπύρα, το ουίσκι και άλλα, έχουν ως πρώτη ύλη κάποιο σιτηρό. Εύκολη αποθήκευση και διαχείριση. Οι σπόροι των σιτηρών είναι συμπυκνωμένη μορφή τροφής με μικρή περιεκτικότητα σε υγρασία και συνεπώς απαιτεί μικρό χώρο αποθήκευσης. Δεν υφίσταται ζημιές από την παγωνιά και την ξηρασία, είναι σκληροί και η διαχείρισή τους με μηχανήματα συλλογής και αποθήκευσης, γίνεται εύκολα και χωρίς σημαντικές ζημιές. Η αποθήκευσή τους στην κατάλληλη υγρασία (συνήθως 14%) είναι ασφαλής για αρκετό χρονικό διάστημα. Η τυποποίησή τους είναι εύκολη και κυριαρχούν στο διεθνές εμπόριο. Ποιοτική τροφή. Ως τροφή τα σιτηρά παρουσιάζουν μεγάλη αποδοχή εκ μέρους των καταναλωτών και είναι απαλλαγμένα από αντιθρεπτικούς παράγοντες, με αποτέλεσμα η διατροφή να κυριαρχείται από αυτά. Γενικά λόγω των υδατανθράκων που περιέχουν, θεωρούνται ως πηγή ενέργειας στον οργανισμό του ανθρώπου. Το άμυλο των σιτηρών παρουσιάζει μεγάλη πεπτικότητα. Η περιεκτικότητα των σπόρων των σιτηρών σε πρωτεΐνες είναι πολύ μικρότερη εκείνης των ψυχανθών. Επίσης οι πρωτεΐνες είναι ελλειμματικές στα ουσιώδη αμινοξέα, λυσίνη και μεθειονίνη. Λόγω όμως της μεγάλης ποσότητας σιτηρών που καταναλώνονται από τον άνθρωπο, αυτά παρέχουν το 50% της προσλαμβανόμενης πρωτεΐνης (Stoskopf 1985). Εκτός από πηγή υδατανθράκων και πρωτεΐνης, τα σιτηρά παρέχουν στη διατροφή λιπαρές ουσίες, μεταλλικά άλατα και βιταμίνες. Ζωοτροφή. Οι σπόροι των σιτηρών χρησιμοποιούνται στη διατροφή των εσταυλισμένων ζώων σε μίγματα με πρωτεϊνούχες τροφές για τη σύσταση ορθολογικών σιτηρεσίων. Εκτός από τους σπόρους, τα σιτηρά παρέχουν και χλωρά τροφή στα ζώα όπως π.χ. με τη βόσκηση χειμερινών σιτηρών και την ενσίρωση του καλαμποκιού και του σόργου. Προστασία του περιβάλλοντος και της υγείας των καταναλωτών. Παρόλο ότι τα σιτηρά προσβάλλονται από διάφορους εχθρούς και ασθένειες, δεν γίνεται εκτεταμένη χρήση αγροχημικών, γιατί η εφαρμογή τους δεν συμφέρει από οικονομική άποψη. Επίσης με τη εκμετάλλευση της γενετικής παραλλακτικότητας που βρέθηκε στα σιτηρά, δημιουργήθηκαν ανθεκτικές ποικιλίες, γεγονός που επίσης συντελεί στη μείωση της χρήσης αγροχημικών (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) Σπουδαιότητα και εξάπλωση των σιτηρών στην Ελλάδα Τα σιτηρά οι αρχαίοι Έλληνες τα ονόμαζαν κοινώς «Δήμητρας καρποί», «δημητριακοί καρποί», «δημητριακά σπέρματα» ή απλούστερα «δημητριακοί». Καλλιεργούσαν δε τέσσερα 4

14 γένη δημητριακών: το πύρον (σίτον), την όλυρα (ζειάν), την κριθήν και τον κέχρον. Η όλυρα αντιστοιχεί στο είδος Triticum aestivum L. subsp. Spelta (Λέτσας 1957). Από τους Λατίνους αποδίδονταν με το όνομα Cerealia, από όπου προέρχεται η αγγλική ονομασία των καρποδοτικών σιτηρών cereal grain crops (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Η καλλιεργούμενη έκταση με σιτηρά στη χώρα μας, από 15 εκατομ. στρ. το 1940 αυξήθηκε μόλις στα 15,5 εκατομ. στρ. το 1970 και μειώθηκε στα 12,6 εκατομ. στρ. το 2004 και στα 9,8 το Αντίθετα η παραγωγή αυξήθηκε σημαντικά, από 1,39 εκατομ. τόνους το 1940 σε 3,56 το 1970 και σε 5,86 εκατομ. τόνους το Η αύξηση αυτή της παραγωγής οφείλεται στην αύξηση των αποδόσεων. Βελτιωμένες ποικιλίες και καλλιεργητικές φροντίδες, χρησιμοποίηση λιπασμάτων και φυτοπροστατευτικών προϊόντων (καταπολέμηση εχθρών, ασθενειών και ζιζανίων) συνέβαλαν στην αύξηση των αποδόσεων. Η έκταση που καταλαμβάνουν τα σιτηρά σήμερα στη χώρα μας αντιστοιχεί στο 60% περίπου των εκτάσεων που καλλιεργούνται με φυτά μεγάλης καλλιέργειας ή αροτραίες καλλιέργειες (ΕΣΥΕ 2004, FAOSTAT Database). Το κεχρί καλλιεργήθηκε σε μικρές εκτάσεις παλαιότερα, σήμερα όμως η καλλιέργειά του είναι πολύ περιορισμένη και δεν υπάρχουν αξιόπιστα στατιστικά στοιχεία. Η καλλιεργούμενη έκταση με σιτηρά στη χώρας μας την τελευταία δεκαετία παρουσίασε μικρές αυξομειώσεις. Τα περιθώρια για περαιτέρω αύξηση των καλλιεργούμενων με σιτηρά εκτάσεων είναι περιορισμένα. Η επιλογή του είδους του σιτηρού εκ μέρους του παραγωγού γίνεται κυρίως ανάλογα με την τιμή και τη δυνατότητα διάθεσης του προϊόντος (Παπακώστα- Τασοπούλου 2012). Ανάλογα με την αντοχή τους στις χαμηλές θερμοκρασίες και την εποχή σποράς, τα σιτηρά στη χώρα μας κατατάσσονται σε χειμερινά και εαρινά. Το σιτάρι, το κριθάρι, η βρίζα, η βρώμη και το τριτικάλε είναι χειμερινά και συνήθως σπέρνονται το φθινόπωρο, ενώ το καλαμπόκι, το ρύζι, το σόργο και το κεχρί είναι εαρινά και σπέρνονται την άνοιξη. Τα χειμερινά σιτηρά καταλαμβάνουν περίπου το 80% των καλλιεργούμενων εκτάσεων με σιτηρά γιατί αξιοποιούν τις μη αρδευόμενες εκτάσεις στις οποίες δεν είναι δυνατόν να καλλιεργηθούν ανοιξιάτικες καλλιέργειες, λόγω των περιορισμένων βροχοπτώσεων κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Η μεγάλη τους σημασία επίσης οφείλεται στην ικανότητά τους να αξιοποιούν φτωχές, άγονες και ορεινές εκτάσεις, όπου καμία άλλη καλλιέργεια δε θα μπορούσε να αποδώσει οικονομικά. Από τα τέσσερα χειμερινά σιτηρά την πρώτη θέση κατέχει το σιτάρι και σε μεγάλη απόσταση ακολουθεί το κριθάρι. Καλλιεργείται τόσο το μαλακό όσο και το σκληρό σιτάρι, τα οποία αποτελούν τη βάση της διατροφής του πληθυσμού. Ο κύριος όγκος του κριθαριού διατίθεται στην κτηνοτροφία και ένα μικρό μέρος, συγκριτικά, για την παραγωγή μπύρας. Η σπουδαιότητα της βρώμης και της σίκαλης είναι πολύ μικρότερη(παπακώστα-τασοπούλου 2012). 5

15 Από τα λοιπά σιτηρά που προαναφέρθηκαν, ενδιαφέρον για τη χώρα μας θα μπορούσε να έχει το τριτικάλε (σιταρόβριζα) το οποίο αξιοποιεί οριακά εδάφη με δυνατότητα μεγαλύτερων αποδόσεων σε σύγκριση με τα άλλα χειμερινά σιτηρά. Τη μεγαλύτερη σημασία για τη χώρα μας από τα τέσσερα εαρινά σιτηρά έχουν το καλαμπόκι και το ρύζι, των οποίων οι αποδόσεις κατατάσσονται μεταξύ των μεγαλύτερων αποδόσεων παγκοσμίως. Το καλαμπόκι καλλιεργείται σε γόνιμα εδάφη και απαιτεί άφθονη άρδευση. Το ρύζι εντοπίζεται κυρίως σε αλατούχα και αλκαλιωμένα εδάφη, όταν υπάρχει άφθονο νερό για άρδευση. Παράλληλα με την παραγωγή ρυζιού για κάλυψη των εγχώριων αναγκών και για εξαγωγές, η καλλιέργειά του συντελεί και στη βελτίωση αυτών των εδαφών. Η καλλιέργεια του σόργου είναι πολύ περιορισμένη. Πιθανόν να αυξηθεί τα προσεχή έτη λόγω της μείωσης των αποθεμάτων του νερού για άρδευση σε ορισμένες περιοχές της χώρας μας, καθ όσον το σόργο αντέχει πολύ περισσότερο από το καλαμπόκι στην ξηρασία και τα άλατα. Προοπτικές για επέκταση της καλλιέργειας του κεχριού δεν διαφαίνονται (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) ΓΕΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΧΕΙΜΕΡΙΝΩΝ ΣΙΤΗΡΩΝ Καρπός Ο καρπός των σιτηρών είναι καρύοψη, όπου το περίβλημα του σπόρου είναι ενωμένο σταθερά και σε ολόκληρη την έκτασή του με την εσωτερική πλευρά του περικαρπίου, ώστε καρπός και σπόρος να αποτελούν μια μονάδα, τον κόκκο. Το σχήμα και το μέγεθος των κόκκων επηρεάζεται από τον γενότυπο, τη θέση τους στο στάχυ ή το σταχύδιο και την ποσότητα του αποθηκευθέντος ενδοσπερμίου. Στον κόκκο του κριθαριού και της βρώμης (εκτός από τις γυμνές ποικιλίες) το περικάρπιο είναι ενωμένο εντελώς με τα δύο εσωτερικά λέπυρα, τα οποία δεν απομακρύνονται με τον αλωνισμό. Σε ορισμένα είδη σιταριού όπως π.χ. στο Triticum spelta δεν γίνεται προσκόλληση. Απλώς τα λέπυρα και μετά τον αλωνισμό εξακολουθούν να μένουν ενωμένα σφιχτά μεταξύ τους, ώστε για την απομάκρυνσή τους να χρειάζονται ειδικά μηχανήματα (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Ο κόκκος αποτελείται από το περικάρπιο, το περίβλημα του σπόρου, το ενδοσπέρμιο και το έμβρυο. Το περικάρπιο αποτελείται από στρώματα κυττάρων τα οποία προέρχονται από τη διαφοροποίηση των τοιχωμάτων της ωοθήκης. Το περίβλημα του σπόρου βρίσκεται κάτω από το περικάρπιο, αποτελείται από ημιπερατό λεπτό στρώμα κυττάρων, το οποίο προέρχεται από τη διαφοροποίηση των χιτώνων της σπερματικής βλάστης και περιβάλλει πλήρως το έμβρυο και το ενδοσπέρμιο. Στα κύτταρα του περιβλήματος του σπόρου μπορούν να υπάρχουν χρωστικές, οι οποίες δίνουν χρώμα στον κόκκο. 6

16 Το ενδοσπέρμιο είναι ο αμυλώδης ιστός που σχηματίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του κόκκου και καλύπτει το εσωτερικό του κόκκου, εκτός από τον χώρο που καταλαμβάνει το έμβρυο. Προσφέρει θρεπτικά στοιχεία στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και στο νεαρό φυτάριο μετά τη βλάστηση του σπόρου, μέχρι το φυτό να μπορέσει να ικανοποιήσει τις ανάγκες του από το έδαφος. Το εξωτερικό στρώμα του ενδοσπερμίου αποτελεί την αλευρόνη. Τα κύτταρα της αλευρόνης είναι μεγάλα, ορθογώνια, δεν περιέχουν άμυλο και είναι πλούσια σε αλευρόκοκκους, οι οποίοι περιέχουν κυρίως πρωτεΐνες. Οι αλευρόκοκκοι περιβάλλονται από ελαιώδη σταγονίδια (Lersten 1987). Τα κύτταρα της αλευρόνης παραμένουν ζωντανά στον ώριμο κόκκο (Bradbury κ.α. 1956). Το υπόλοιπο τμήμα του ενδοσπερμίου εκτός από την αλευρόνη αποτελείται από μεγάλα κύτταρα πλούσια σε αμυλόκοκκους και διάσπαρτους αλευρόκοκκους. Τα κύτταρα αυτά νεκρώνονται κατά την ωρίμαση (Campbell κ.α. 1981). Οι αμυλόκοκκοι διαφέρουν πολύ στο μέγεθος και το σχήμα. Όταν οι αλευρόκοκκοι βρίσκονται σε μεγάλη αναλογία στο ενδοσπέρμιο ο κόκκος γίνεται σκληρός και σε τομή εμφανίζει διαφανή, γυαλιστερή όψη. Αντίθετα όταν βρίσκονται σε μικρή αναλογία, το ενδοσπέρμιο γίνεται μαλακό και παρουσιάζει αλευρώδη εμφάνιση (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Το έμβρυο βρίσκεται τοποθετημένο στο ένα άκρο του κόκκου κοντά στον ποδίσκο, σε κατάσταση λήθαργου. Συνήθως ο λήθαργος οφείλεται στην ξήρανση των ιστών του κόκκου, σε ορισμένα όμως φυτά έχουν βρεθεί ουσίες στο ενδοσπέρμιο που προκαλούν το λήθαργο. Το έμβρυο είναι ήδη διαφοροποιημένο νεαρό φυτάριο, στη μια πλευρά του οποίου προεξέχει μια ογκώδης κοτυλήδονα, η οποία ονομάζεται ασπίδιο, λόγω της δισκοειδούς της μορφής. Το ασπίδιο περιέχει αποθησαυριστικές ουσίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται από το έμβρυο κατά τη βλάστηση του σπόρου. Το έμβρυο περιέχει κυρίως λάδι και πρωτεΐνες. Η περιεκτικότητά του σε άμυλο είναι μικρή. Επειδή το λάδι ταγγίζει, συνήθως το έμβρυο απομακρύνεται από το ενδοσπέρμιο πριν την άλεση του κόκκου για την παραγωγή αλευριού (Παπακώστα- Τασοπούλου 2012) Αποθήκευση Η παραγωγή των σπόρων των χειμερινών σιτηρών είναι εποχιακή, ενώ η κατανάλωσή τους συνεχής, συνεπώς η αποθήκευσή τους είναι απαραίτητη. Η αποθήκευση είναι ασφαλής όταν συγχρόνως η ποσότητα και η ποιότητα του αποθηκευμένου σπόρου παραμένουν αμετάβλητες. Η αποθήκευση των σπόρων γίνεται μετά την ενσάκισή τους ή χύμα στην αποθήκη του παραγωγού, συνηθέστερα όμως στους αποθηκευτικούς χώρους των αγοραστών, που είναι απλές αποθήκες και σιλό μεταλλικά ή από μπετόν, διαφόρων μεγεθών και διαστάσεων. Ενώ τα ενσακισμένα σιτηρά με απλές επεμβάσεις μπορούμε να τα συντηρήσουμε για μακρύ 7

17 χρονικό διάστημα χωρίς να υποστούν αλλοιώσεις, τα χύμα αντίθετα διατρέχουν πολλούς κινδύνους να αλλοιωθούν. Η αποθήκευση του άχυρου γίνεται σε σωρούς (χωρίς ή μετά από δεματοποίηση) στο ύπαιθρο ή σε υπόστεγα (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) Συνθήκες αποθήκευσης και κίνδυνοι αλλοιώσεων Ο σπουδαιότερος παράγοντας που καθορίζει την ασφαλή ή μη αποθήκευση των σπόρων είναι η υγρασία τους. Ακολουθούν σε σπουδαιότητα τα έντομα, οι μύκητες και η θερμοκρασία. Ο τελευταίος αυτός παράγοντας επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από τους προηγούμενους, αλλά και η επίδραση των προηγούμενων εξαρτάται από τη θερμοκρασία. Η περιεκτικότητα των σπόρων σε υγρασία έχει σημαντική επίδραση στην καταλληλότητά τους για συγκομιδή και αποθήκευση. Υγρασία σπόρων 13,5% και χαμηλότερη θεωρείται κατάλληλη για αποθήκευση για χρονικό διάστημα ενός έτους χωρίς καμία βλάβη από μύκητες. Με περιεκτικότητα υγρασίας μεγαλύτερη από 13,5%, η ασφαλής αποθήκευση καθορίζεται από τη θερμοκρασία και το χρόνο αποθήκευσης. Σημασία για την ασφαλή αποθήκευση των σπόρων δεν έχει τόσο η απόλυτη περιεκτικότητα τους σε υγρασία, όσο η σχετική υγρασία της ατμόσφαιρας μέσα στη μάζα των σπόρων, η οποία εξαρτάται από τη θερμοκρασία και βρίσκεται σε ισορροπία με την υγρασία των σπόρων. Για παράδειγμα, όταν η υγρασία του αποθηκευμένου σιταριού είναι 12% βρίσκεται σε ισορροπία με υγρασία περιβάλλοντος 60%, όταν η θερμοκρασία παραμένει μεγαλύτερη από 27 ο C. Όταν όμως ψυχθεί η επιφάνεια του αποθηκευμένου σπόρου στους 16 ο C τότε η σχετική υγρασία της ατμόσφαιρας φθάνει στον κορεσμό και οι σπόροι κοντά στην επιφάνεια απορροφούν υγρασία από την ατμόσφαιρα. Εάν ο αέρας ψυχθεί περισσότερο ξεπερνά το σημείο κορεσμού και νερό συγκεντρώνεται πάνω στους σπόρους. Επίσης σε ψυχρό καιρό είναι δυνατόν σταγόνες νερού που συγκεντρώνονται στην οροφή του σιλό να πέσουν στην επιφάνεια του σπόρου (Bailey 1992). Στην επιφάνεια αυτών των υγρών σπόρων αναπτύσσονται μύκητες. Σχετική υγρασία περιβάλλοντος 65-70% που βρίσκεται σε ισορροπία με υγρασία σπόρου 12-14% σε θερμοκρασία περιβάλλοντος 25 o C θεωρείται ικανοποιητική για εμπορική αποθήκευση μέχρι ένα έτος. Για μακρόχρονο όμως συντήρηση 2 έως 3 έτη, αυτή πρέπει να διατηρείται σε χαμηλότερα επίπεδα (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012). Αναφέρονται 150 είδη μυκήτων, τα οποία μπορούν να προσβάλλουν τους αποθηκευμένους σπόρους των σιτηρών. Σε αποθηκευμένους σπόρους κάτω από διαφορετικές συνθήκες αναπτύσσονται και διαφορετικά είδη μυκήτων, τα οποία χαρακτηρίζουν τις συνθήκες αποθήκευσης. Οι κυριότεροι παράγοντες που ρυθμίζουν το είδος και τη διαδοχή ανάπτυξης των μυκήτων είναι κυρίως η υγρασία και η θερμοκρασία του σπόρου και σε μικρότερο βαθμό 8

18 η σύνθεση του αέρα μεταξύ των σπόρων. Καθώς αυξάνεται η υγρασία, αυξάνεται και ο αριθμός των ειδών μυκήτων που μπορεί να αναπτυχθούν. Οι σπουδαιότεροι μύκητες που προσβάλλουν τους σπόρους ανήκουν στα γένη Aspergillus και Penicillium. Οι κυριότερες ζημιές που προκαλούν οι μύκητες είναι: μείωση της βλαστικής ικανότητας, καθόσον προσβάλουν κυρίως τα έμβρυα και πολλές φορές αποκλειστικά μόνο τα έμβρυα, ευρωτιάσεις και αποχρωματισμός ολόκληρου ή μέρους του σπόρου συμπεριλαμβανομένου και του εμβρύου, αύξηση της θερμοκρασία στο χώρο αποθήκευσης με την αναπνοή τους, μείωση του βάρους των σπόρων, μεταβολές στα συστατικά των σπόρων και τη θρεπτική τους αξία (π.χ. αύξηση των ελεύθερων λιπαρών οξέων τα οποία προσδίδουν δυσάρεστη οσμή, υδρόλυση πρωτεϊνών και υδατανθράκων), δημιουργία μυκοτοξινών, σπουδαιότερη από τις οποίες είναι η αφλατοξίνη που παράγεται από το μύκητα Aspergillus flavus και θεωρείται ως ισχυρή καρκινογόνος ουσία, ολοκληρωτική αλλοίωση του σιταριού και μετατροπή του σε μια συμπαγή μάζα (Sauer κ.α. 1992, Bala 1997). Διάγραμμα 1.1. Σχέση μεταξύ της περιεκτικότητας του σπόρου σε υγρασία και της θερμοκρασίας αποθήκευσης στην ανάπτυξη των μυκήτων (Gooding and Davies, 1997) Έλεγχοι διατήρησης της ποιότητας Η μέτρηση της ποιότητας των αποθηκευμένων σπόρων κατά διαστήματα είναι απαραίτητη, για να εντοπισθούν έγκαιρα τυχόν αλλοιώσεις. Η διατηρησιμότητα είναι ένα ποιοτικό χαρακτηριστικό που εκφράζει την ικανότητα των σπόρων να διατηρούνται χωρίς αλλοίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, της θρεπτικής αξίας και της υγιεινής κατάστασης. Με τον έλεγχο της διατηρησιμότητας μπορεί να διαπιστωθεί η υφιστάμενη ποιοτική κατάσταση, 9

19 να εξαχθούν συμπεράσματα για τον βαθμό καταλληλότητας καις τον ενδεικνυόμενο προορισμό του προϊόντος και να ληφθούν αποφάσεις για δυνατές επεμβάσεις. Ο έλεγχος στηρίζεται σε ορισμένες μεθόδους όπως αξιολόγηση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών, χρώμα, στιλπνότητα, ακεραιότητα, ελαττώματα, οσμή, γεύση, μέτρηση της θερμοκρασίας και του CO 2 για τη διαπίστωση της έντασης της αναπνοής, μέτρηση της φυτρωτικής ικανότητας και βιοχημική δοκιμή ελέγχου της οξύτητας και της παρουσίας ορισμένων ενζύμων (Pomeranz 1992) ΚΡΙΘΑΡΙ Εξάπλωση και οικονομική σημασία Το κριθάρι είναι το δεύτερο σε σπουδαιότητα χειμερινό σιτηρό μετά το σιτάρι. Η παγκόσμια παραγόμενη όμως ποσότητα κριθαριού ανέρχεται περίπου στο ένα πέμπτο της παραγωγής του σιταριού. Δεν είναι πλήρως εξακριβωμένη η περιοχή καταγωγής του κριθαριού. Πιθανές περιοχές θεωρούνται η κοιλάδα του Νείλου, η Αιθιοπία, η Μέση Ανατολή ή το Θιβέτ. Είναι όμως αρκετά σίγουρο ότι συγκαταλέγεται μεταξύ των πρώτων καλλιεργηθέντων σιτηρών, περίπου την ίδια εποχή κατά την οποία εξημερώθηκε το σιτάρι. Καλλιεργήθηκε στη Μέση Ανατολή πριν από το π.χ. Αρχικά καλλιεργήθηκε το δίστοιχο κριθάρι και αργότερα, πείπου το 6000 π.χ. το εξάστοιχο. Στην αρχαία Αίγυπτο το ψωμί από κριθάρι και η μπύρα από κριθάρι ήταν συνηθισμένα στη διατροφή του ανθρώπου από το 3200 π.χ. (Wikipedia contributors 2006). Παρ όλο ότι κατάγεται από σχετικά θερμές περιοχές, καλλιεργείται σε μεγαλύτερο γεωγραφικό πλάτος και υψόμετρο από κάθε άλλη καλλιέργεια. Στη Σιβηρία καλλιεργείται σε 68 ο ΒΠ, στη Νορβηγία σε 70 ο ΒΠ και στα Ιμαλάια σε υψόμετρο 5000m. Το κριθάρι είναι λιγότερο ανθεκτικό από το σιτάρι στις χαμηλές θερμοκρασίες, εντούτοις όμως σπέρνεται σε μεγαλύτερα υψόμετρα, επειδή διαθέτει πρώιμους βιότυπους. Υπάρχουν ποικιλίες κριθαριού που ωριμάζουν σε ημέρες και με ανοιξιάτικη σπορά μπορούν να αξιοποιούν περιοχές με μικρή βλαστική περίοδο και ξηροθερμικές συνθήκες. Το κριθάρι όμως μπορεί να καλλιεργηθεί και σε 11 ο ΒΠ στις Ινδίες, ενώ στα υψίπεδα της Ινδονησίας πλησιάζει ακόμα και τον Ισημερινό (Φασούλας και Σενλόγλου 1966). Καλλιεργείται επίσης στις οάσεις της Σαχάρας και σε περιοχές της Αιγύπτου και Αυστραλίας με αλατούχα εδάφη, γιατί είναι το χειμερινό σιτηρό που παρουσιάζει τη μεγαλύτερη αντοχή στα άλατα. Συμπερασματικά το κριθάρι καλλιεργείται σε ευρύτερες περιοχές από άποψη κλιματολογικών συνθηκών σε σχέση με άλλα σιτηρά και η μεγαλύτερη παγκόσμια παραγωγή του, λαμβάνεται από περιοχές όπου το κλίμα δεν είναι ευνοϊκό για τα άλλα σιτηρά. 10

20 Η παγκόσμια καλλιεργούμενη έκταση με κριθάρι ανήλθε το 2006 στα 550 εκατομ. Στρ., από τα οποία παρήχθησαν 138 εκατομ. tn σπόρου. Η μέση παγκόσμια απόδοση ήταν 250 kg/στρ. Μεταξύ των διαφόρων χωρών παραγωγής παρατηρείται σημαντική διαφοροποίηση των αποδόσεων ανάλογα με τις εδαφοκλιματικές συνθήκες και την εντατικοποίηση της καλλιέργειας. Η κυριότερη χώρα παραγωγής κριθαριού το 2006 ήταν η Ρωσία και ακολούθησαν η Γερμανία, η Ουκρανία, η Γαλλία, ο Καναδάς, η Τουρκία και η Ισπανία. Μικρότερη παραγωγή αλλά πάνω από 3 εκατομ. tn είχαν η Αγγλία, οι ΗΠΑ, η Αυστραλία, η Κίνα, η Δανία, η Πολωνία και το Ιράκ (FAOSTAT 2006). Στη χώρα μας το κριθάρι είναι το δεύτερο σε σπουδαιότητα χειμερινό σιτηρό μετά το σιτάρι. Τα τελευταία όμως χρόνια η καλλιεργούμενη έκταση μειώθηκε σημαντικά, στρ. το 2006 από στρ. το 1990 (FAOSTAT 2006). Ο περιορισμός αυτός της έκτασης είχε σαν αποτέλεσμα όχι μόνο τη μείωση της συνολικής παραγωγής αλλά και σε ένα βαθμό τη μείωση της στρεμματικής απόδοσης, δεδομένου ότι τα καλύτερα χωράφια της ζώνης του κριθαριού χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια πιο προσοδοφόρων καλλιεργειών. Η καλλιέργεια του κριθαριού έχει μετατοπιστεί στα πιο φτωχά και ορεινά για τα σιτηρά χωράφια ( Ο καρπός του κριθαριού χρησιμοποιείται ως ζωοτροφή. Μόνο μια μικρή ποσότητα καταναλώνεται για την παρασκευή, από τη βιομηχανία τροφίμων, νέων προϊόντων με βάση το κριθάρι, τα οποία συνδέονται με την υγιεινή διατροφή. Η δεύτερη σπουδαία χρήση του κριθαριού είναι η παραγωγή βύνης που χρησιμοποιείται για την παρασκευή αλκοολούχων ποτών, κυρίως μπύρας και δευτερευόντως ουίσκι, αλλά και ως προσθετικό γεύσης και αρώματος σε διάφορα τρόφιμα. Η παγκόσμια παραγωγή του κριθαριού προβλέπεται ότι θα παραμείνει αξιόλογη και για το μέλλον, λόγω των πολλών χρήσεων και της προσαρμοστικότητάς του. Η στρεμματική απόδοση αυξήθηκε τα τελευταία χρόνια, όχι όμως με τον ίδιο ρυθμό που αυξήθηκε η απόδοση του σιταριού ή του καλαμποκιού. Χρειάζεται στο μέλλον προσπάθεια για τη δημιουργία πιο παραγωγικών ποικιλιών (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) Ταξινόμηση Το κριθάρι ανήκει στο γένος Hordeum. Αναφέρονται διάφορες ταξινομήσεις των καλλιεργούμενων τύπων κριθαριού. Σύμφωνα με πρόσφατη ταξινόμηση (Wiersema και Leon 1999) όλοι οι τύποι ανήκουν στο είδος Hordeum vulgare L. subsp. vulgare (συν. Hordeum distichon L., Hordeum hexastichon L., Horeum irregulare A.E. Aberg and Wiebe, Horedum sativum Jess.). Το καλλιεργούμενο σήμερα κριθάρι θεωρείται ότι προήλθε από το άγριο είδος 11

21 Hordeum vulgare L. subsp. spontaneum (K. Koch) Thell. (συν. Hordeum spontaneum K. Koch), οποίο φύεται ακόμη ως άγριο στη Μέση Ανατολή. Τόσο το άγριο όσο και το καλλιεργούμενο είδος είναι διπλοειδή με 2n=24 χρωμοσώματα. Μεταξύ των άγριων Hordeum υπάρχουν επίσης τετραπλοειδή και εξαπλοειδή είδη. Το καλλιεργούμενο κριθάρι είναι ετήσιο φυτό, αλλά υπάρχουν και άλλα πολυετή είδη Τύποι και ποικιλίες κριθαριού Το κριθάρι δεν παρουσιάζει τόσο μεγάλη παραλλακτικότητα τύπων όπως το σιτάρι, υπάρχουν όμως τύποι που διακρίνονται από αγροκομική και μορφολογική άποψη και από άποψη χρήσης του προϊόντος. Η ταξινόμηση γίνεται με βάση τα παρακάτω κριτήρια: Αριθμός των σειρών σπόρων στο στάχυ. Η ταξιανθία του κριθαριού είναι επάκρειος στάχυς με τρία σταχύδια σε κάθε γόνατο της ράχης της ταξιανθίας. Κάθε σταχύδιο έχει μόνο ένα ανθίδιο. Εάν μόνο το μεσαίο σταχύδιο είναι γόνιμο και σχηματίζει σπόρο τότε το κριθάρι έχει μια στήλη κόκκων σε κάθε πλευρά του στάχυ και ονομάζεται δίστοιχο. Στο εξάστοιχο κριθάρι και τα τρία σταχύδια κάθε θέσης είναι γόνιμα. Ύπαρξη ή όχι αγάνων. Η πλειονότητα των ποικιλιών έχει σπόρους με άγανο το οποίο σπάζει κατά τη συγκομιδή. Υπάρχουν όμως και λίγες ποικιλίες χωρίς άγανο. Προσκόλληση των λεπύρων με τον κόκκο. Στις περισσότερες ποικιλίες ο χιτώνας και η λεπίδα είναι κολλημένα με τον κόκκο, χαρακτηριστικό επιθυμητό για τον σπόρο που προορίζεται για Παρασκευή μπύρας. Τα λέπυρα προσφέρουν στον κόκκο ένα προστατευτικό κάλυμμα κατά την προβλάστηση και λειτουργούν ως φίλτρο. Οι ποικιλίες των οποίων τα λέπυρα αποχωρίζονται από τον κόκκο κατά τον αλωνισμό, «γυμνές» ποικιλίες, πιο συχνά καλλιεργούνται σε περιοχές όπου το κριθάρι χρησιμοποιείται στη διατροφή του ανθρώπου. Λέπυρα που δεν αποχωρίζονται από το σπόρο έχουν κατά κανόνα και οι ποικιλίες που προορίζονται για ζωοτροφή, γιατί θεωρούνται πιο αποδοτικές και με μεγαλύτερη διατροφική αξία. Χρήση του προϊόντος. Οι ποικιλίες διακρίνονται σε κτηνοτροφικές, ζυθοποιίας ή διπλής κατεύθυνσης (κτηνοτροφικές και ζυθοποιίας). Οι ποικιλίες ζυθοποιίας δίνουν σπόρους που μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για ζωοτροφή, δεν συμβαίνει όμως το ίδιο και για τις κτηνοτροφικές ποικιλίες. Στις ευρωπαϊκές χώρες όπως και στη χώρα μας οι ποικιλίες της ζυθοποιίας είναι κυρίως δίστοιχες, ενώ στις ΗΠΑ είναι κυρίως εξάστοιχες. Επίσης στις ΗΠΑ χρησιμοποιείται μίγμα σπόρων από δίστοιχες και εξάστοιχες ποικιλίες. Τα χαρακτηριστικά όμως τόσο των δίστοιχων όσο και των εξάστοιχων ποικιλιών είναι διαφορετικά στις ευρωπαϊκές χώρες και στις ΗΠΑ. Τόσο οι εξάστοιχες ποικιλίες που 12

22 εμφανίζονται ως τετράστοιχες όσο και εκείνες με γυμνούς σπόρους θεωρούνται ακατάλληλες για την παραγωγή βύνης ( Εικόνα 1.1. Μορφολογία του κόκκου στο κριθάρι Προϊόντα και ποιότητα αυτών Ο καρπός του κριθαριού χρησιμοποιείται κυρίως ως ζωοτροφή και δευτερευόντως ως πρώτη ύλη στη ζυθοποιία, ενώ μικρές μόνο ποσότητες στη διατροφή του ανθρώπου. Η μέση απόδοση στη χώρα μας τα τελευταία χρόνια είναι περίπου 250 kg σπόρου/στρ., σε γόνιμα όμως χωράφια μπορεί να υπερβεί τα 400 kg σπόρου/στρ. Επίσης το κριθάρι μπορεί να καλλιεργηθεί σαν χορτοδοτικό φυτό για απευθείας βόσκηση ή μετά από κοπή σαν σανός ή ενσιρωμένη τροφή για τα ζώα. Κατάλληλο στάδιο για κοπή του κριθαριού για παραγωγή χόρτου είναι το στάδιο του γαλακτώδους καρπού και όχι πέραν του κηρώδους καρπού. Στην κτηνοτροφία χρησιμοποιούνται επίσης τα υποπροϊόντα της ζυθοποιίας και το άχυρο που μένει μετά τη συγκομιδή του σπόρου. Κατανάλωση κριθαριού για ανθρώπινη διατροφή γίνεται σε περιοχές όπου δεν ευνοείται η καλλιέργεια των άλλων σιτηρών, λόγω υψομέτρου, ξηρασίας ή αλκαλικότητας του εδάφους. Ο καρπός χρησιμοποιείται αφού γίνει αποφλοίωση, είτε ολόκληρος ή αλεσμένος σε διάφορο βαθμό. Οι γυμνόσπερμες ποικιλίες χρησιμοποιούνται σχεδόν αποκλειστικά στη διατροφή του ανθρώπου. Και στις ανεπτυγμένες όμως χώρες χρησιμοποιείται το κριθάρι σαν συστατικό παιδικών τροφών και βρίσκει διάφορες χρήσεις στη μαγειρική. Αλεύρι κριθαριού σε ανάμειξη με αλεύρι σιταριού χρησιμοποιείται για την παραγωγή ψωμιού. Τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του κριθαριού ανάλογα με τη χρήση για την οποία προορίζεται είναι: Κτηνοτροφικό κριθάρι. Αποτελεί πηγή υδατανθράκων και πρωτεΐνης για τα ζώα. Επιθυμητή είναι η υψηλή περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, η οποία κυμαίνεται από 10 έως 15% και εξαρτάται από την ποικιλία και τις κλιματολογικές συνθήκες της περιοχής που καλλιεργήθηκε. Γενικά η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη είναι συγκρίσιμη με εκείνη του σιταριού που καλλιεργείται κάτω από τις ίδιες συνθήκες και μεγαλύτερη από εκείνη του 13

23 ρυζιού, καλαμποκιού και σόργου. Η πρωτεΐνη είναι φτωχή σε λυσίνη, όπως σε όλα τα σιτηρά, περιέχει όμως σχετικά υψηλή περιεκτικότητα σε μεθειονίνη και κυστίνη. Το κριθάρι συνήθως χορηγείται στα ζώα αφού προηγουμένως γίνει σπάσιμο του κόκκου ή άλεσμά του σε διάφορα μεγέθη. Παρόλο ότι η ισορροπία των πρωτεϊνών και η ολική πρωτεΐνη του κριθαριού είναι ανώτερη αυτής του καλαμποκιού και του σόργου, η θρεπτική του αξία είναι μικρότερη, λόγω των λεπύρων που είναι ενωμένα με το σπόρο και τα οποία έχουν μικρή πεπτικότητα. Κριθάρι ζυθοποιίας. Είναι το κυριότερο σιτηρό που χρησιμοποιείται για την Παρασκευή βύνης, από την οποία παράγονται αλκοολούχα ποτά, κυρίως μπύρα, αλκοόλη, σιρόπι βύνης και μπαίνει σε διάφορα είδη διατροφής. Παρ όλο ότι και άλλα σιτηρά, όπως το σιτάρι και η σίκαλη μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον ίδιο σκοπό, το κριθάρι πλεονεκτεί κυρίως επειδή ο κόκκος έχει τα λέπυρα τα οποία προστατεύουν το έμβρυο κατά το φύτρωμα και δρουν σαν φίλτρο για διάφορες ουσίες. Η βυνοποίηση είναι μια ελεγχόμενη, περιορισμένη βλάστηση του σπόρου, η οποία έχει σχεδιασθεί για τη δραστηριοποίηση της παραγωγής α- και β-αμυλασών, οι οποίες υδρολύουν το άμυλο σε δεξτρίνες και ζυμώσιμα σάκχαρα. Σε γενικές γραμμές για την παρασκευή της μπύρας ακολουθείται η εξής διαδικασία: Ο σπόρος καθαρίζεται από τις ξένες ύλες και τους σπασμένους σπόρους και αποθηκεύεται με υγρασία μικρότερη από 13,5% για ένα χρονικό διάστημα, προκειμένου να γίνει η διακοπή του λήθαργου. Το πρώτο στάδιο για την παραγωγή της βύνης είναι η διαβροχή των σπόρων με νερό και στη συνέχεια η μεταφορά τους σε ειδικά βλαστητήρια, με ελεγχόμενη ατμόσφαιρα και θερμοκρασία μικρότερη από 18οC, για το φύτρωμα των σπόρων. Η διαδικασία φυτρώματος σταματά όταν έχει βγει το ριζίδιο και η κολεοπτίλη έχει μήκος ίσο με 75 έως το 100% του μήκους του κόκκου. Κατά τη διάρκεια της βλάστησης παράγονται στο σπόρο η α-αμυλάση και η β-αμυλάση, που τροποποιούν τη σύσταση του ενδοσπερμίου (το άμυλο υδρολύεται σε δεξτρίνες και ζυμώσιμα σάκχαρα). Ακολουθεί ξήρανση των σπόρων, απαλλαγή τους από τα ριζίδια, άλεσμα, εκχύλιση με ζεστό νερό, παραλαβή του βυνογλέυκους, προσθήκη λυκίσκου και θέρμανση για την καθίζηση των πρωτεϊνών και άλλων πεπτιδίων με τη βοήθεια των δεψικών ουσιών του λυκίσκου. Στη συνέχεια το βυνογλεύκος (ζυθογλέυκος) ψύχεται και οδηγείται στη δεξαμενή όπου προστίθενται ειδικές ζύμες (Saccharomyces spp.) με τη βοήθεια των οποίων γίνεται η μετατροπή των σακχάρων σε αλκοόλη και CO2 (Burger and LaBerge 1985). Κριθάρι για ανθρώπινη διατροφή. Από άποψη υγιεινής το πιο σημαντικό συστατικό του κριθαριού είναι οι φυτικές ίνες και ιδιαίτερα οι διαλυτές όπως αραβινοξυλάνες και 14

24 γλυκάνες. Οι διαλυτές φυτικές ίνες επιβραδύνουν την απορρόφηση της γλυκόζης και τη διατήρησή της σε χαμηλά επίπεδα στους σακχαροδιαβητικούς και αναφέρεται ότι συντελούν στη μείωση της χοληστερόλης στο αίμα. Οι αδιάλυτες φυτικές ίνες επίσης χαρακτηρίζονται από υψηλή ικανότητα ενυδάτωσης που συμβάλλουν στην καλή λειτουργία του παχέος εντέρου (Παπακώστα-Τασοπούλου 2012) Μικροχλωρίδα δημητριακών Λόγω της εκτεταμένης χρήσης τους ως τρόφιμα και ζωοτροφές, η υγιεινή και η ασφάλεια των καρπών των δημητριακών και των προϊόντων τους είναι πολύ σημαντική. Οι πηγές μικροβιακής μόλυνσης των δημητριακών είναι πολλές και όλες σχεδόν ανευρίσκονται στο περιβάλλον όπου αναπτύσσονται, χειρίζονται και επεξεργάζονται οι σπόροι τους. Οι μικροοργανισμοί αυτοί μπορεί να προέρχονται από τον αέρα, το χώμα, το νερό, τα έντομα, τα τρωκτικά, τα ζώα, τους ανθρώπους καθώς και τις συνθήκες αποθήκευσης, μεταφοράς και επεξεργασίας των προϊόντων. Πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες επίσης συντελούν στην επιμόλυνση των δημητριακών όπως η ξηρασία, η υγρασία, η θερμοκρασία, ο παγετός, οι εδαφοκλιματικές συνθήκες, ο άνεμος κ.α. (Lloyd B. Bullerman et al., 2011). Η μικροχλωρίδα των σιτηρών και των προϊόντων τους ποικίλει και περιλαμβάνει μύκητες, ζύμες, βακτήρια (θερμόφιλοι, ψυχρόφιλοι, ψυχρότροφοι), γαλακτικά βακτήρια, βάκιλλοι (Bacillus spp.), παθογόνα βακτήρια, εντεροβακτήρια κ.α. Παθογόνα βακτήρια που μολύνουν τα δημητριακά και τα προϊόντα τους και προκαλούν προβλήματα αποτελούν τα Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Escherichia coli, Salmonella και Staphylococcus aureus. Τα εντεροβακτήρια εμφανίζονται ως αποτέλεσμα λανθασμένων χειρισμών υγιεινής και συνθηκών επεξεργασίας. Τα βακτήρια συχνά επιμολύνουν την επιφάνεια των δημητριακών. Για να αναπτυχθούν τα βακτήρια στα σιτηρά απαιτείται υψηλή υγρασία ή ενεργότητα νερού (a w ), σε ισορροπία με με υψηλή σχετική υγρασία. Γενικά τα βακτήρια δεν εμπλέκονται σημαντικά στην αλλοίωση των καρπών των σιτηρών και αναπτύσσονται μόνο σε συνθήκες υψηλής υγρασίας. Ωστόσο τα παθογόνα και αλλοιωγόνα βακτήρια όπως τα σπορογόνα βακτήρια μπορούν να επιβιώσουν και μεταφερθούν στα μεταποιημένα προϊόντα. Τα γαλακτικά βακτήρια μπορούν να αναπτυχθούν στον καρπό των σιτηρών και να μεταφερθούν στα άλευρα και κατά συνέπεια στα προϊόντα που παρασκευάζονται από αυτά. Οι ζύμες επίσης ανευρίσκονται στους καρπούς των δημητριακών όπως και στα μεταποιημένα προϊόντα. Οι μικροοργανισμοί όμως που αλλοιώνουν κυρίως τα σιτηρά είναι οι μύκητες (Lloyd B. Bullerman et al., 2011). 15

25 Υπάρχουν περισσότερα από 150 είδη νηματοειδών μυκήτων που επιμολύνουν τα σιτηρά. Οι νηματοειδείς αυτοί μύκητες χωρίζονται σε δύο ομάδες ανάλογα με το πότε αυτοί υπερισχύουν στους καρπούς σε σχέση με την υγρασία των σπόρων. Αυτές οι ομάδες αποτελούν τους μύκητες που αναπτύσσονται λόγω των χειρισμών στο χωράφι καθώς και τους μύκητες που αναπτύσσονται λόγω των συνθηκών αποθήκευσης. Η πρώτη ομάδα μυκήτων προσβάλλει τον καρπό όταν η υγρασία σε αυτόν είναι υψηλή (18-30%, δηλαδή υψηλή a w ) όπως και η σχετική υγρασία (90-100%). Οι μύκητες αυτοί περιλαμβάνουν είδη των γενών Alternaria, Cladosporidium, Fusarium και Helminthosporium. Οι μύκητες που αναπτύσσονται λόγω των συνθηκών αποθήκευσης ανήκουν στα γένη Penicillium, Aspergillus και Eurotium. Για να αποτραπεί η αλλοίωση από αυτούς τους μύκητες, η περιεκτικότητα σε υγρασία των αμυλούχων δημητριακών πρέπει να είναι χαμηλότερη από άλλους ελαιούχους σπόρους όπως τα φυστίκια (8,5%), οι σπόροι ηλίανθου (14%) και η σόγια (12%). Ορισμένοι μύκητες όπως το Eurotium glaucus μπορεί να αναπτυχθεί σε χαμηλή aw και υγρασία (15-16%) και μέσω της αναπνοής τους αυξάνουν την aw και την υγρασία έτσι ώστε να διευκολυνθεί η ανάπτυξη και των υπόλοιπων μυκήτων και να αλλοιωθούν οι καρποί. Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τους μύκητες και την υγρασία στην οποία αναπτύσσονται εμφανίζονται στον Πίνακα 1.2. Τα κυριότερα προβλήματα της μυκητιακής προσβολής των δημητριακών περιλαμβάνουν τη μειωμένη βλαστική ικανότητα, τον αποχρωματισμό, την ορατή ανάπτυξη μούχλας, την όξινη μυρωδιά καθώς και την παραγωγή μυκοτοξινών. Η μειωμένη βλαστική ικανότητα παρουσιάζεται όταν οι μύκητες προσβάλλουν τα έμβρυα των σπόρων και προηγείται του αποχρωματισμού. Ωστόσο ο αποχρωματισμός μπορεί να προκληθεί είτε από τους μύκητες που προσβάλλουν τα σιτηρά στο χωράφι είτε από τους μύκητες που τα προσβάλλουν κατά την αποθήκευσή τους. Περαιτέρω ανάπτυξη των μυκήτων μπορεί να προκαλέσει μούχλα στην επιφάνεια των σπόρων και συσσωμάτωσή τους. Από εκείνη τη στιγμή, η ανάπτυξη της μούχλας έχει γίνει εκτεταμένη και οι σπόροι είναι σε προχωρημένα στάδια αποσύνθεσης. Σε αυτό το σημείο η υγρασία των σπόρων αυξάνεται λόγω της αναπνοής των μυκήτων, των ζυμών και των βακτηρίων (Lloyd B. Bullerman et al., 2011). 16

26 Μύκητες Προϊόν Υγρασία (%) Aspergillus restrictus Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Καρποί ηλίανθου, φυστίκια 14-14, ,5 8,5-9 Eurotium glaucus Aspergillus candidus Aspergillus ochraceus Aspergillus flavus Penicillium sp. Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Καρποί ηλίανθου, φυστίκια Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Καρποί ηλίανθου Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Καρποί ηλίανθου Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Αμυλούχοι σπόροι Σόγια Καρποί ηλίανθου 14, , ,5 15, , ,5 15, , , ,5 16, Πίνακας 1.2. Κυρίαρχοι μύκητες κατά την αποθήκευση δημητριακών και η υγρασία στην οποία αναπτύσσονται (Lloyd B. Bullerman et al., 2011) 1.4. ΣΤΑΦΙΔΑ Γενικά στοιχεία Η Κορινθιακή Σταφίδα είναι το φυσικό προϊόν που προκύπτει μετά την αποξήρανση των σταφυλιών της αντίστοιχης ελληνικής ποικιλίας αμπέλου με την επιστημονική ονομασία Vitis vinifera L. Η Κορινθιακή Σταφίδα καλλιεργείται στον ελλαδικό χώρο και ειδικά στα παράλια μέρη της Βόρειας και Δυτικής Πελοποννήσου και στα Ιόνια νησιά, όπου οι εδαφοκλιματικές συνθήκες με την επίδραση της θαλάσσιας αύρας και της ηλιοφάνειας είναι ιδανικές για την παραγωγή ενός, αξεπέραστης ποιότητας, φυσικού προϊόντος. Το εξαίρετο άρωμα και η πλούσια γεύση της την τοποθετούν ως την κορυφαία των σταφίδων. Χάρη στις εξαιρετικές φυσικές ιδιότητές της, η Κορινθιακή Σταφίδα έχει ενταχθεί στο καθημερινό διαιτολόγιο από την αρχαιότητα. Σήμερα, καταναλώνεται απευθείας ως σνακ ή χρησιμοποιείται ως συστατικό στην μαγειρική, αρτοποιία, ζαχαροπλαστική κ.ά. διατηρώντας όλες τις θρεπτικές της ιδιότητες. Η Κορινθιακή Σταφίδα διακρίνεται, ανάλογα με την ποιότητά της, κατά σειρά προτεραιότητας, στις παρακάτω κατηγορίες: VOSTIZZA P.D.O. Gulf Provincial 17

27 Η παγκόσμια γνωστή Κορινθιακή Σταφίδα με το όνομα "ΒΟΣΤΙΤΣΑ" ("VOSTIZZA") θεωρείται ως η ανώτερη ποιότητα Κορινθιακής Σταφίδας και ξεχωρίζει για το υπέροχο άρωμα και την μοναδική γεύση της. Η "ΒΟΣΤΙΤΣΑ" καλλιεργείται αποκλειστικά στην ημιορεινή και ορεινή περιοχή της Αιγιάλειας ( Ιστορία Η σταφίδα αποτελεί ένα ιστορικό παραδοσιακό προϊόν της ελληνικής οικονομικής και κοινωνικής δραστηριότητας. Η καλλιέργεια της σταφίδας συνέβαλλε αποφασιστικά στην στήριξη και ανάπτυξη της ελληνικής κοινωνίας και οικονομίας. Η ύπαρξη της καλλιέργειας στην περιοχή της Βόρειας Πελοποννήσου αναφέρεται από τον αρχαίο έλληνα φιλόσοφο Αριστοτέλη από τον 4ο π.χ. αιώνα. Επίσης, υπάρχουν μαρτυρίες εμπορίας της σταφίδας στην Ελλάδα κατά τη διάρκεια του 12ου και 13 ου αιώνα. Η καλλιέργεια της σταφίδας ξεκίνησε στην Πάτρα και το Αίγιο, και στη συνέχεια, επεκτάθηκε στην Κόρινθο, τον Πύργο, την Αμαλιάδα, την Πύλο, την Ζάκυνθο, την Κεφαλονιά, την Ναύπακτο κ.ά. Οι εξαγωγές πραγματοποιούνταν από τα λιμάνια της Πάτρας και του Αιγίου. Για τον λόγο αυτό η ονομασία «Currants» προέρχεται από τον «Κορινθιακό κόλπο» (Corinthian Gulf). Μετά την απελευθέρωση από τους Τούρκους η επέκταση της σταφιδοκαλλιέργειας είναι ταχύτατη. Η ραγδαία αύξηση της παραγωγής πραγματοποιήθηκε κατά την διάρκεια του 19ου αιώνα κυρίως λόγω της καταστροφής των Γαλλικών αμπελώνων από την φυλλοξήρα. Η μεγάλη αύξηση της ζήτησης συντέλεσε στην αύξηση της τιμής πώλησης. Πολύς πλούτος εισρέει από τις εξαγωγές της σταφίδας, οι παραγωγοί απολαμβάνουν υψηλά εισοδήματα και το Αίγιο, η Πάτρα, ο Πύργος, η Κορινθία κ.λ.π. ακμάζουν. Τα έσοδα του κράτους στηρίζονταν κυρίως στη φορολογία επί της σταφίδας και τα δημόσια έργα σταματούσαν ή προχωρούσαν ανάλογα με την παραγωγή της σταφίδας. Κατά το δεύτερο ήμισυ του 19ου αιώνα και κατά την αναδιάρθρωση του Ελληνικού Κράτους οι εξαγωγές σταφίδας αποτελούσαν το 80% του συνόλου των ελληνικών εξαγωγών. Παρόλα αυτά, κατά τη διάρκεια δεκαετίας του 1880, η αναμπέλωση στη Γαλλία με αντιφυλλοξηρικά φυτά μείωσε σταδιακά την ζήτηση και σε συνδυασμό με τις μεγάλες παραγωγές που προέκυψαν από τις αλόγιστες επεκτάσεις έφεραν την αγορά της σταφίδας σε μεγάλη ύφεση και τους σταφιδοπαραγωγούς σε πλήρη φτώχεια, πείνα και απόγνωση. Στη Βοστίτσα και την Κορινθία τα πράγματα για τους σταφιδοπαραγωγούς ήταν κάπως υποφερτά λόγω καλύτερης ποιότητας του προϊόντος. Αυτή η ανατροπή της κατάστασης έφερε μεγάλη αναταραχή, διαδηλώσεις αλλά και έντονες αντιπαραθέσεις στη Βουλή σε τέτοιο βαθμό που ανάγκασε την Κυβέρνηση Τρικούπη σε παραίτηση. Το 1925 ιδρύθηκε από το Ελληνικό Κράτος ο Αυτόνομος Σταφιδικός Οργανισμός 18

28 (Α.Σ.Ο.) με κύριο σκοπό την διαχείριση και τον έλεγχο της παραγωγής και την εμπορίας της σταφίδας. Επίσης, ο ρόλος του Α.Σ.Ο. για την βελτίωση της ποιότητας ήταν πολύ σημαντικός. Κατά την διάρκεια της Γερμανικής κατοχής η σταφιδοκαλλιέργεια αντιμετωπίζει μεγάλες δυσκολίες και οι τρεις 10ετίες που ακολουθούν δίνουν πολύ μικρό εισόδημα στην παραγωγή. Σήμερα, η Κορινθιακή Σταφίδα (Currants) εξάγεται σχεδόν σε όλες της χώρες του κόσμου. Οι κύριες αγορές παραμένουν οι χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης (κυρίως Αγγλία, Ολλανδία) αλλά και τρίτες χώρες όπως η Αυστραλία, οι Η.Π.Α. κ.ά. ( Έρευνα και πλεονεκτήματα της Κορινθιακής Σταφίδας Πρόσφατες μελέτες που έγιναν ειδικά για την Κορινθιακή σταφίδα έχουν καταδείξει την υψηλή διατροφική της αξία. Η Κορινθιακή σταφίδα αποτελεί εξαιρετική πηγή αντιοξειδωτικών/πολυφαινολικών συστατικών (φλαβονοειδή, ανθοκυανίνες, προανθοκυανιδίνες, προκυανιδίνες, ρεσβερατρόλη) και διαθέτει πολύ υψηλό αντιοξειδωτικό περιεχόμενο. Η Κορινθιακή σταφίδα πλεονεκτεί έναντι αρκετών άλλων φρούτων και τύπων σταφίδων γιατί προέρχεται από μαύρο σταφύλι που θεωρείται κατά πολύ ανώτερο των λευκών ποικιλιών σταφυλιού σε αντιοξειδωτικά και ειδικά σε ανθοκυανίνες. Η αποξήρανση των σταφυλιών γίνεται στις ήπιες περιβαλλοντικές συνθήκες που επικρατούν στα ορεινά της Ελλάδας και η καταστροφή των αντιοξειδωτικών και βιταμινών είναι αμελητέα. Η Κορινθιακή σταφίδα καταναλώνεται μαζί με τον -σκούρου χρώματος- φλοιό της, ο οποίος είναι πλήρης ανθοκυανινών και άλλων αντιοξειδωτικών, ενώ έχει μεγάλη αναλογία επιφάνειας/μάζα λόγω μικρού μεγέθους καρπού. Ο φλοιός έχει πολύ υψηλό ποσοστό διαιτητικών ινών που λειτουργούν ως υπόστρωμα για ωφέλιμα βακτήρια του παχέος εντέρου, προσδίδουν δηλ. στην σταφίδα πρεβιοτικές ιδιότητες, βοηθώντας έτσι στην καλή λειτουργία του εντέρου και παράλληλα εμποδίζουν τη βιοσύνθεση χοληστερίνης. Η Κορινθιακή σταφίδα είναι εξαιρετική πηγή ιχνοστοιχείων όπως ο ψευδάργυρος, το μαγνήσιο, ο σίδηρος και ιδιαίτερα το κάλιο. Η περιεκτικότητά της σε κάλιο βοηθά στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης και είναι πολύ μεγαλύτερη άλλων φρούτων που θεωρούνται εξαιρετικές πηγές του στοιχείου αυτού, όπως η μπανάνα. Κλινικές μελέτες που διεξήχθησαν κατέδειξαν ότι υπάρχει βιοδιαθεσιμότητα των μικροσυστατικών της σταφίδας στο αίμα και μεγάλη αντιοξειδωτική ικανότητα. Ο γλυκαιμικός δείκτης της σταφίδας είναι μέτριος επί δε διαβητικών η επίδραση είναι επίσης μέτρια, και καλύτερη πολλών άλλων φρούτων, γεγονός που το καθιστά κατάλληλο ακόμη και για ειδικές κατηγορίες ασθενών. Η γλυκύτητα της σταφίδας οφείλεται στην μεγάλη περιεκτικότητά της σε φρουκτόζη (35% κ.β.). Έτσι πρόκειται για ένα πολύ γλυκό φρούτο 19

29 χωρίς να προξενεί αύξηση του σακχάρου στο αίμα, όταν καταναλώνεται σε κανονικές ποσότητες. Σε εθελοντές που κατανάλωναν σταφίδα καθημερινά βρέθηκε ότι δεν υπάρχει αύξηση βάρους, αντίθετα μία μικρή μείωση. Αυτό μπορεί να οφείλεται στον κορεσμό που δημιουργεί η σταφίδα τόσο λόγω των πολλών φυτικών ινών που περιέχει, όσο και της γλυκύτητάς της. Σε δημοσιευμένες μελέτες in vitro αποδείχθηκε ότι εκχυλίσματα Κορινθιακής σταφίδας επιδρούν σημαντικά στην αύξηση των αποπτωτικών καρκινικών κυττάρων του στομάχου και του παχέος εντέρου ενώ η έρευνα συνεχίζεται με την επίδραση της σταφίδας σε άλλες καρκινικές σειρές. Η Κορινθιακή σταφίδα χορηγήθηκε, υπό κατάλληλη ιατρική παρακολούθηση, σε ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ και φάνηκε ότι η κατανάλωση συγκεκριμένης ποσότητας δεν αυξάνει τη γλυκόζη του αίματος, ότι μειώνει την σημαντικά αρτηριακή πίεση και ότι αυξάνει σημαντικά την αντιοξειδωτική ικανότητα του αίματος. Σε κλινική μελέτη που διεξήχθη σε υγιείς εθελοντές-καπνιστές φαίνεται ότι η κατανάλωση μικρής ποσότητας Κορινθιακής σταφίδας αναστρέφει το φαινόμενο του οξειδωτικού στρες στο οποίο υποβάλλεται ο οργανισμός τους λόγω του καπνίσματος. Το οξειδωτικό στρες θεωρείται ως βασικός παράγων για την εμφάνιση πολύ σοβαρών ασθενειών, όπως τα καρδιαγγειακά νοσήματα και ο καρκίνος. Σε νέες σημαντικές κλινικές μελέτες που εκπονούνται για την επίδραση της Κορινθιακής σταφίδας επί της λιπώδους διήθησης του ήπατος αλλά και στην αθηρωμάτωση φαίνεται εξαιρετική δράση της Κορινθιακής σταφίδας στις ασθένειες αυτές. Οι έρευνες αυτές που είναι σε εξέλιξη καθώς και οι προηγούμενες έρευνες που έχουν ήδη δημοσιευθεί σε έγκριτα περιοδικά, αναδεικνύουν τη διατροφική αξία του έξοχου αυτού προϊόντος, ενός αρχαίου ξηρού φρούτου, μοναδικού προϊόντος της ορεινής Ελλάδας και μοναδικού διατροφικού προϊόντος ( Διατροφική αξία Το προϊόν αυτό, ως τα αφυδατωμένα σταφύλια της ομώνυμης ποικιλίας, είναι ένα φυσικό προϊόν, το οποίο διατηρεί όλα τα συστατικά των νωπών σταφυλιών, όπως είναι τα σάκχαρα, οι βιταμίνες, τα μεταλλικά άλατα, οι φυτικές ίνες, τα αντιοξειδωτικά και τα αρώματα. Γενικά το προϊόν έχει εκτιμηθεί σαν ένα τέλειο εναλλακτικό τρόφιμο και γλυκαντικό με εξαίρετη γεύση και αρώματα. Τα σάκχαρά της, που είναι η φρουκτόζη (κυρίως) και η γλυκόζη, είναι απλά σάκχαρα (μονοσακχαρίτες) και θεωρούνται πολύτιμη άμεση πηγή ενέργειας για τον ανθρώπινο οργανισμό. Είναι ιδιαίτερα πλούσια σε σίδηρο, κάλιο και μαγνήσιο. Περιέχει επίσης υψηλά ποσοστά ασβεστίου, μαγγανίου, ψευδαργύρου και άλλων μεταλλικών στοιχείων και βιταμινών. Είναι 20

30 πλούσια σε φυτικές ίνες, περιέχει αντιοξειδωτικά (φλαβονοειδή, ανθοκυανίνες, κ.α.) και είναι απαλλαγμένη χοληστερόλης και νατρίου ( Μικροχλωρίδα αποξηραμένων φρούτων Τα φρούτα μετά την συγκομιδή τους φέρουν παθογόνα μικρόβια από την περιοχή καλλιέργειά τους τα οποία μπορεί να επιβιώσουν κατά τη διαδικασία της ξήρανσης. Επίσης ανευρίσκονται τοξινογόνοι μύκητες κατά τη διαδικασία της αποθήκευσης διάφορων αποξηραμένων φρούτων. Οι Tournas et al. (2004, αδημοσίευτα στοιχεία) απομόνωσαν στελέχη των A. niger, A. carbonarius, και A. ochraceus από σταφίδες, ενώ οι Hocking et al. (2007) ανέφεραν την παρουσία στελεχών των Aspergillus Nigri και A. ochraceus σε σταφύλια από τα οποία προέρχονται προϊόντα όπως οι σταφίδες. Η παρουσία ωχρατοξίνης Α σε αποξηραμένα φρούτα όπως η κορινθιακή σταφίδα και η σταφίδα σουλτανίνα έχει επίσης αναφερθεί στη βιβλιογραφία. Αν διατηρείται η υγρασία των αποξηραμένων προϊόντων σε κατάλληλα επίπεδα, αποφεύγεται η ανάπτυξη μούχλας. Όταν όμως η ενεργότητα νερού (a w ) ξεπερνά το 0,65, τότε γίνονται επιρρεπείς σε αλλοίωση από διάφορους παθογόνους μύκητες, συμπεριλαμβανομένων των Aspergillus και Eurotia. H παρουσία αυτών των μυκήτων μπορεί να επηρεάσει την ποιότητα των προϊόντων και να είναι η αιτία για σοβαρές επιπτώσεις στην υγεία των καταναλωτών. Αν και πληροφορίες για μυκητιακές προσβολές των ξηρών καρπών και αποξηραμένων φρούτων υπάρχουν στην βιβλιογραφία, οι εν εξελίξει αλλαγές στους τύπους μυκητοκτόνων και στα επίπεδα που αυτά χρησιμοποιούνται, μπορεί με την πάροδο του χρόνου να προκαλέσουν αλλαγές σε αυτά τα προϊόντα. Ως εκ τούτου, έχει θεωρηθεί σκόπιμο να επανεξεταστεί το θέμα και να διεξαχθούν μελέτες όπως των Tournas et al. (2015) προκειμένου να αξιολογηθεί η μυκητολογική ποιότητα των διαφόρων ξηρών καρπών και αποξηραμένων φρούτων που διατίθενται σήμερα στην αγορά. Μεταξύ των αποξηραμένων φρούτων που ελέγχθηκαν κατά τη διάρκεια μελέτης των Tournas et al. (2015), μόνο οι σταφίδες έδειξαν αξιοσημείωτο βαθμό προσβολής από μύκητες, κυρίως A. niger. Η προσβολή από μύκητες στα αποξηραμένα φρούτα ήταν μεταξύ 2 και 3,86 log 10 cfu/g με τα υψηλότερα επίπεδα να ανιχνεύονται στις σταφίδες. Παλαιότερες μελέτες έδειξαν επίσης παρόμοια προσβολή από μύκητες σε σταφίδες. Οι Iamanaka et al. (2005) ανέφεραν ότι η σταφίδα σουλτανίνα (μαύρη και άσπρη) ήταν μολυσμένη με τοξινογόνους μύκητες. Οι μύκητες που απομονώθηκαν από αυτή τη μελέτη ήταν οι A. niger, A. ochraceus και A. carbonarius. Η παρουσία αυτών των μυκήτων είναι ανεπιθύμητη λόγω της ικανότητάς τους να παράγουν μυκοτοξίνες στις σταφίδες. Γενικά οι 21

31 μύκητες A. niger και A. tubigensis βρέθηκαν να είναι πιο διαδεδομένοι στα σταφύλια από τον A. carbonarius στελέχη του οποίου παρήγαγαν την υψηλότερη ποσότητα ωχρατοξίνης Α. Σύμφωνα με τους Iamanaka et al. (2005), το 15% των απομονωθέντων στελεχών A. niger, το 60% των A. carbonarius και το 87% των A. ochraceus που απομονώθηκαν από μαύρες και άσπρες σταφίδες σουλτανίνες ήταν σε θέση να παράγουν ωχρατοξίνη Α. Η δεύτερη μελέτη απέδειξε επίσης πως στο 33% των δειγμάτων μαύρης σουλτανίνας ανιχνεύθηκε ωχρατοξίνη Α σε επίπεδα πάνω από 5 ng/g. Άλλη μελέτη έδειξε επίσης πως στελέχη των A. niger και A. tubigensis, που απομονώθηκαν από αποξηραμένα φρούτα, παρήγαναν επίσης ΩΤΑ, ενώ στελέχη του A. flavus που απομονώθηκαν από σταφύλια παρήγαναν αφλατοξίνες. Σύμφωνα με τα ευρήματα της μελέτης των Tournas et al. (2015), ένα μικρό ποσοστό από αποξηραμένα βερύκοκα και cranberries περιείχαν μύκητες του γένους Penicillium σε πολύ χαμηλά επίπεδα, ενώ στην παπάγια δεν βρέθηκαν μύκητες. Οι Iamanaka et al. (2005) ανέφεραν επίσης την απουσία μυκήτων σε ορισμένα αποξηραμένα φρούτα όπως βερύκοκα. Η απουσία μυκήτων σε αυτά τα προϊόντα ίσως οφειλόταν σε χειρισμούς μετά τη συγκομιδή ΖΥΜΕΣ Οι ζύμες είναι μονοκύτταροι μικροοργανισμοί με μεγάλη σημασία στη βιομηχανία τροφίμων και ποτών (Querol και Fleet 2006). Πολλαπλασιάζονται με εκβλάστηση, διχοτόμηση ή σχηματισμό σπορίων. Επίσης χρησιμοποιούνται ως προβιοτικά στις ζωοτροφές και μελετώνται οι προβιοτικές τους ιδιότητες για τον άνθρωπο. Ταξινομούνται στο βασίλειο των μυκήτων με περισσότερα από 1500 αναγνωρισμένα είδη (Kurtzman και Fell 2006). Τα γενικά χαρακτηριστικά που αποδίδονται στις ζύμες είναι τα ακόλουθα: Είναι ευρείας διαδόσεως στη φύση όπως τα βακτήρια. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των ζυμών κατέχει ενδιάμεση θέση μεταξύ εκείνου των βακτηρίων και των μυκήτων. Οι ζύμες στην πλειοψηφία τους είναι μεσόφιλοι μικροοργανισμοί και εμφανίζουν το βέλτιστο ανάπτυξής τους στην περιοχή ο C. Ελάχιστα είδη ζυμών αναπτύσσονται σε θερμοκρασία ανώτερη των 30 ο C (Cyniclomyces guttulatus, Pityrosporum ovalis, παράσιτα θερμόαιμων ζώων) ενώ πολλά είδη μπορεί να αναπτυχθούν σε θερμοκρασίες 0-15 ο C (Rhodotorula spp.). Οι ζύμες στο σύνολό τους είναι οξεόφιλοι μικροοργανισμοί. Προτιμούν ελαφρώς ή μετρίως όξινο περιβάλλον με ph μεταξύ 4,5-6,5. Τα είδη των ζυμών που αναπτύσσονται σε μικρότερες τιμές ph ( 3,7) και στην ουδέτερη ή αλκαλική περιοχή (7-8) είναι 22

32 περιορισμένα. Έτσι, έχουν την ικανότητα να αλλοιώνουν τρόφιμα με ελαφρώς ή καταφανώς όξινη αντίδραση, ενώ σπάνια αλλοιώνουν τρόφιμα που δεν έχουν υποστεί γαλακτική ζύμωση. Οι ζύμες έχουν εκπροσώπους που αντέχουν σε μεγάλη ωσμωτική πίεση του υποστρώματος (ωσμόφιλες, ωσμοανθεκτικές, αλόφιλες, αλοανθεκτικές). Με αυτόν τον τρόπο, επιβιώνουν σε τρόφιμα πλούσια σε σάκχαρα ή σε αλάτι στα οποία η ενεργότητα του νερού είναι χαμηλή. Ως προς τις απαιτήσεις τους σε οξυγόνο κατατάσσονται στις αυστηρώς αερόβιες (οξειδωτικές) και στις προαιρετικά αναερόβιες. Οι ζύμες χρησιμοποιούνται σε μεγάλη έκταση στην παραγωγή αλκοολούχων ποτών, όπως είναι ο οίνος, η μπύρα και τα αποστάγματα. Τα είδη που χρησιμοποιούνται κυρίως για την παραγωγή μπύρας είναι τα Saccharomyces uvarum και Saccharomyces cerevisiae. Για την παραγωγή του οίνου έχει χρησιμοποιηθεί ποικιλία ζυμών του γένους Saccharomyces όπως S. uvarum, S. cerevisiae, S. bayanus, S. oviformis, S. sake, S. vini, S. pausterianus, S. fructuum και S. diastaticus. Η επιλογή της κατάλληλης ζύμης εξαρτάται από την γεωγραφική περιοχή, το κλίμα, την ποικιλία του σταφυλιού και τα επιθυμητά οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Επίσης σημαντική είναι η επίδραση των ζυμών στην παραγωγή ζυμωμένων γαλακτοκομικών προϊόντων όπως το τυρί, το γιαούρτι, το κεφίρ και το κουμίς. Στην περίπτωση αυτή οι ζύμες ενισχύουν τη δράση της καλλιέργειας, αναστέλλουν την ανάπτυξη ανεπιθύμητων μικροοργανισμών που προκαλούν αλλοιώσεις στο τρόφιμο και συμβάλλουν στην παραγωγή συστατικών του αρώματος (Κατεχάκη 2010). Η ζύμη S. cerevisiae είναι η μαγιά που καλλιεργείται περισσότερο από κάθε άλλη και αποτελεί εδώ και χρόνια βασικό πρόσθετο στην αρτοποιία. Έχει πολύ μεγάλη τεχνολογική σημασία και στελέχη του χρησιμοποιούνται στην παραγωγή οίνου και μπύρας. Ζυμώνει μέχρι % vol/vol ΜΥΚΗΤΕΣ Εισαγωγή Οι μύκητες (fungus, πλ. fungi, προέρχεται από την ελληνική λέξη σπόγγος, σφόγγος) αποτελούν διακριτή κατηγορία οργανισμών και υπάγονται ταξινομικά σε ξεχωριστό βασίλειο, είναι δε η δεύτερη πολυπληθέστερη μετά τα έντομα, ομάδα οργανισμών στην βιόσφαιρα. Ο αριθμός των καταγεγραμμένων ειδών μυκήτων σε όλο τον κόσμο ανέρχεται σε περίπου, ενώ συντηρητικοί υπολογισμοί εκτιμούν πως το συνολικό μέγεθος των υπαρχόντων ειδών υπερβαίνει το 1,5 εκατομμύριο. Στην Ελλάδα έχουν μέχρι σήμερα καταγραφεί

33 περίπου είδη μυκήτων, από τα οποία πάνω από περιλαμβάνουν μακρομύκητες. Τα γνωστά είδη μυκήτων, αποτελούν μόλις το 5% του ολικού αριθμού και η συντριπτική πλειοψηφία αυτών παραμένει άγνωστη στον άνθρωπο, παρόλο που η σημασία τους για την φύση και τον άνθρωπο είναι τεράστια. Η εκτίμηση πως μόλις το 5% του συνολικού αριθμού των μυκήτων στην Γη είναι γνωστό, έχει σημαντικές επιπτώσεις στην επιστήμη της μυκητολογίας (και ιδιαίτερα στην συστηματική και την ταξινόμηση). Η ανάγκη για δραστηριοποίηση πάνω στο θέμα καταγραφής νέων ειδών είναι πιο επιτακτική από ποτέ άλλοτε, καθώς την τελευταία δεκαετία υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανίχνευση και τη διατήρηση της βιοποικιλότητας, την προστασία του περιβάλλοντος και τις εφαρμογές της βιοτεχνολογίας από τον επιστήμονα ερευνητή, τον ερασιτέχνη φυσιοδίφη, από κοινωνικές ομάδες και φορείς. Η σημασία που έχουν οι μύκητες για τον άνθρωπο και την παγκόσμια οικονομία είναι τεράστια. Μπορεί μόνο να αποτιμηθεί σε δισεκατομμύρια δολάρια, αφού οι μύκητες χρησιμοποιούνται εμπορικά για την παραγωγή ενζύμων, αμινοξέων, αντιβιοτικών, φαρμακευτικών, ποτών και αλκοόλης, τροφίμων, βιταμινών, οργανικών οξέων, δευτερογενών μεταβολιτών, συντηρητικών, εντομοκτόνων, καυσίμων (αιθανόλη, βιοαέριο), στην βιοαποδόμηση υπολειμμάτων και παραπροϊόντων της γεωργίας και βιομηχανίας, σε εφαρμογές της γενετικής μηχανικής με χρήσεις στον ιατρικό τομέα ή στη γεωργική παραγωγή κλπ Γενικά στοιχεία βιολογίας μυκήτων Οι μύκητες αποτελούν ένα άθροισμα ετερότροφων μικροοργανισμών, δηλ. δεν έχουν την ικανότητα να συνθέτουν οργανικές ουσίες, διαθέτουν συμπαγή κυτταρικά τοιχώματα και γενικά στερούνται κίνησης (εκτός ορισμένων ειδών που διαθέτουν αναπαραγωγικά κύτταρα με δυνατότητα κίνησης). Το σώμα ή θαλλός (thallus) των μυκήτων αποτελείται από λεπτά σωληνοειδή νημάτια που ονομάζονται υφές (hyphae) και αυξάνονται-επιμηκύνονται επάκρια (νηματοειδείς μύκητες, filamentous fungi). Οι υφές διακλαδίζονται προς όλες τις κατευθύνσεις συνήθως κατά την έννοια της ακτίνας, και δημιουργούν το βλαστικό σώμα ή μυκήλιο (mycelium). Όμως υπάρχουν μύκητες που δεν σχηματίζουν μυκήλιο, όπως οι ζύμες (yeasts) που απαντώνται ως μονοκυτταρικοί οργανισμοί και αναπαράγονται με εκβλάστηση η διαίρεση. Κάθε υφή αποτελείται από συνήθως διαφανή κυτταρικά τοιχώματα που περιβάλλουν το πρωτόπλασμα. Σε πολλούς μύκητες που ανήκουν σε συγκεκριμένες ταξινομικές κατηγορίες, η συνέχεια του πρωτοπλάσματος στο εσωτερικό των υφών διακόπτεται ή παρεμποδίζεται από την ύπαρξη εγκάρσιων χωρισμάτων τοιχωμάτων που ονομάζονται εγκάρσια διαφράγματα ή σέπτα, οπότε το μυκήλιο χαρακτηρίζεται ως 24

34 «πολυκύτταρο». Σε άλλες κατηγορίες μυκήτων, οι υφές γενικά στερούνται σέπτων (ή αυτά σχηματίζονται μόνο στην βάση αναπαραγωγικών οργάνων ή σε σχεδόν απονεκρωμένες υφές) και το μυκήλιο χαρακτηρίζεται ως κοινοκυτικό (coenocytic). Το κυτταρικό τοίχωμα του μύκητα αποτελεί μια θεμελιώδους σημασίας δομή η οποία υπόκειται σε συνεχή τροποποίηση κατά τη διάρκεια του βιολογικού κύκλου του οργανισμού. Εσωτερικά αποτελείται από β-γλυκάνες και χιτίνη και εξωτερικά από υδατοδιαλυτούς πολυσακχαρίτες. Η ανάπτυξη των μυκήτων συντελείται ή μέσω της επάκριας αύξησης των υφών είτε μέσω της επάκριας βλάστησης των σπορίων και του σχηματισμού βλαστικού σωλήνα. Οι μύκητες προσλαμβάνουν τα θρεπτικά στοιχεία με προσρόφηση από το εξωτερικό περιβάλλον μέσω του κυτταρικού τοιχώματος και της κυτταρικής μεμβράνης. Πρώτα εκκρίνουν ένζυμα πέψης στο εξωτερικό τους περιβάλλον που διασπούν σύνθετα μεγαλομόρια (υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, λιπίδια κλπ) σε μικρότερα και πιο εύκολα αφομοιώσιμα μόρια, τα οποία και προσροφούν στα κύτταρα τους. Γενικά με βάση τις τροφικές τους απαιτήσεις και τις οικολογικές τους προσαρμογές, οι μύκητες διαχωρίζονται σε τρείς κατηγορίες: Σαπροτροφικούς, οι οποίοι αναπτύσσονται πάνω σε νεκρή οργανική ύλη και αποτελούν έναν από τους σημαντικότερους παράγοντες αποσύνθεσης-ανακύκλωσης της στη φύση, Παρασιτικούς, οι οποίοι αναπτύσσονται σε βάρος άλλων οργανισμών (χαρακτηρίζονται ως ξενιστές, είναι συνήθως ζώα ή φυτά) προκαλώντας τη σταδιακή εξασθένιση ή και το θάνατο τους. Η πλειοψηφία τους μπορεί να αναπτυχθεί και σε νεκρή οργανική ύλη (προαιρετικά ή δυνητικά παρασιτικοί, ενώ όσοι δεν μπορούν να καλλιεργηθούν σε συνθετικά υποστρώματα χαρακτηρίζονται ως υποχρεωτικά παρασιτικοί, Συμβιωτικούς, οι οποίοι αναπτύσσουν σχέσεις αμοιβαίας ωφέλειας με άλλους οργανισμούς ζώντας γη ανεξάρτητα (π.χ. μυκόρριζες: ειδικοί σχηματισμοί προερχόμενη από την συμβίωση μυκήτων με ρίζες φυτών), είτε σχηματίζοντας ένα νέο οργανισμό π.χ. λειχήνες: οργανισμοί προερχόμενη από συμβίωση μυκήτων και φυκών ή κυανοβακτηρίων). Η αναπαραγωγή στους μύκητες, όπως άλλωστε σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς, σημαίνει τη δημιουργία νέων ατόμων που διαθέτουν τα τυπικά χαρακτηριστικά του είδους. Υπάρχουν δύο γενικευμένοι τύποι αναπαραγωγής: Η εγγενής και η αγενής. Η εγγενής αναπαραγωγή χαρακτηρίζεται από τη σύντηξη δύο πυρήνων (καρυογαμία) και την επακόλουθη μειωτική διαίρεση. Η εγγενής αναπαραγωγή πραγματοποιείται με την βοήθεια ειδικών αναπαραγωγικών μονάδων (σπόρια, μονοκύτταρα ή πολυκύτταρα) και οργάνων. Η όλη διαδικασία αποτελείται από τρείς διακριτές φάσεις: την πλασμογαμία (ένωση υφών), την καρυογαμία (ένωση πυρήνων) και την μειωτική διαίρεση. Η αγενής αναπαραγωγή δεν 25

35 περιλαμβάνει τη διαδικασία της καρυογαμίας και της μείωσης, υλοποιείται δε ή με απλή διαίρεση ενός μονοκυτταρικού οργανισμού σε θυγατρικά κύτταρα είτε με την κατάτμηση ενός πολυκυτταρικού οργανισμού σε πολλά τμήματα που μπορούν να εξελιχθούν σε νέο άτομο. Τέλος, ενδιαφέρον έχει και ο μηχανισμός που χρησιμοποιούν ορισμένοι μύκητες, που στερούνται εγγενούς αναπαραγωγής, να ανασυνδυάζουν το γενετικό τους υλικό (παρόλο που αναπαράγονται μόνο αγενώς). Ο μηχανισμός αυτός ονομάζεται παρασεξαουαλικός κύκλος και η σημασία που έχει για την εξέλιξη και την προσαρμογή τέτοιων οργανισμών αμφισβητείται επειδή πιστεύεται ότι σπάνια συμβαίνει στην φύση (Ζερβάκης, 2014) ΤΟΞΙΝΕΣ Μικροβιακές τοξίνες Με τον όρο τοξίνη εννοούμε μία δηλητηριώδη ουσία που παράγεται εντός ζωντανών κυττάρων ή οργανισμών. Οι τοξίνες μπορεί να είναι μικρά μόρια, πεπτίδια η πρωτεΐνες που είναι ικανές να προκαλέσουν μία ασθένεια κατά την επαφή ή την απορρόφηση τους από ιστούς του σώματος, μέσω της αλληλεπίδραση τους με βιολογικά μακρομόρια όπως ένζυμα και κυτταρικούς υποδοχείς. Οι κυριότεροι παραγωγοί μικροβιακών τοξινών είναι τα βακτήρια και οι μύκητες. Οι μικροβιακές τοξίνες επιδρούν στην άμεση καταστροφή των ιστών και την απενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή (Bordoloi and Ganguly, 2014). Η ικανότητα ενός μικροοργανισμού να προκαλεί παθολογικές καταστάσεις μέσω μια παραγόμενης τοξίνης που παρεμποδίζει την λειτουργία η προκαλεί θάνατο των κυττάρων του ξενιστή ονομάζεται τοξικότητα (Madigan and Martinko, 2006) Μυκοτοξίνες Οι μυκοτοξίνες είναι δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται οπό ορισμένα είδη μυκήτων που ανήκουν στα γένη Aspergillus, Fusarium και Penicillium όταν αυτοί αναπτύσσονται στα τρόφιμα κάτω από κατάλληλες συνθήκες. Οι ουσίες αυτές διαφέρουν χημικά αλλά έχουν ως κοινή ιδιότητα να μολύνουν τα τρόφιμα και τις ζωοτροφές και να προκαλούν τοξικές επιδράσεις στα ζώα και στους ανθρώπους. Γι αυτό τον λόγο θα πρέπει να προσδιορίζεται συγκέντρωση (μέγιστα νομοθετημένα επιτρεπτά όρια) και να ελέγχεται η παρουσία των παραγόμενων μυκοτοξίνων κατά την διαδικασία παραγωγής των τροφίμων και των ζωοτροφών (FAO, Krska et al., 2008). Οι μυκοτοξίνες ταξινομούνται σε έξι κύριες κατηγορίες: αφλατοξίνες, τριχοθισίνες (ή τριχοθεκένια), φουμοσίνες, ζεαραλενόνη, ωχρατοξίνη και αλκαλοειδή εργοτισμού (Richard and Payne, 2003). Μια μυκοτοξίνη μπορεί να παράγεται από περισσότερα από ένα γένη 26

36 μυκήτων. Στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας 1.3.) παρουσιάζονται τα κυριότερα είδη μυκήτων καθώς και οι μυκοτοξίνες που παράγουν (Weidenborner, 2001, Κιοσεόγλου και Μπλέκας, 2009). Όσον αναφορά την χημική τους δομή οι αφλατοξίνες και η ωχρατοξίνη αποτελούν παράγωγα της κουμαρίνης, η ισλαδικίνη της ανθρακινόνης, η μαλτορυζίνη του βενζονίου, η πατουλίνη της πυρόνης και η εργοταμίνη των αλκαλοειδών (Κιοσεόγλου και Μπλέκας 2009).Ύστερα από εκτεταμένη επιστημονική έρευνα οι μυκοτοξίνες έχουν χαρακτηριστεί ως καρκινογόνες, τερατογόνες, δερματοπαθογόνες, ηπατοτοξικές, νεφροτοξικές, νευροτοξικές, και ανοσοκατασταλτικές. Οι αφλατοξίνες αποτελούν μια από τις πιο τοξικές ουσίες που απατώνται στην φύση και είναι υπεύθυνες για την πρόκληση καρκίνου και κίρρωσης του ήπατος. Καρκίνος του ήπατος προκαλείτε επίσης από την φουμοσίνη και την στεριριγματοκυστίνη, ενώ οι ωχρατοξίνες χαρακτηρίζονται από νεφροβλαπτική δράση (Richard, 2007). Οι αφλατοξίνες και η μαλτορυζίνη έχουν ανιχνευτεί σε ξηρούς καρπούς (αράπικα φιστίκια), γαλακτοκομικά προϊόντα και προϊόντα δημητριακών. Η ωχρατοξίνη εντοπίζεται σε δημητριακά και στο κρέας, ενώ η στεριγματοκυστίνη και ζεαραλενόνη σε δημητριακά και ζωοτροφές. Η φουμοσίνη έχει βρεθεί στον αραβόσιτο. Στην σίκαλη η πιο συχνά εμφανιζόμενη μυκοτοξίνη είναι η εργοταμίνη και άλλα αλκαλοεδή που προάγονται από τον μύκητα Claviceps purpurea (Κιοσεόγλου και Μπλέκας, 2009). 27

37 Γένος Είδος Μυκοτοξίνη A.flavus A.parasiticus Αφλατοξίνη (B 1, B 2, G 1, G 2, M 1, M2) A. ochraceus Ωχρατοξίνη Α, Μαλτορυζίνη A. clavatus Aspergillus A. terreus Πατουλίνη A. versicolor A. nidulans Στεριγματοκυστίνη A. terreus A. niveus Κιτρινίνη P. verrucosum Ωχρατοξίνη Α P. viridicatum P. citrinum P. verrucosum Κιτρινίνη Penicillium P. expansum P. Claviforme Πατουλίνη P. roqueforti P. islandicum Ισλανδικίνη F. graminearum F. Avenaceum Τύπου Α Τριχοθισίνες F. culmorum F. poae Fusarium F. equisetiκ.ά. Τύπου Β Τριχοθισίνες F. graminearum F. culmorum Ζεαραλενόνη F. sporotrichiodes F. moniliforme Φουμοσίνη Claviceps C. purpurea Αλκαλοειδή-εργοτισμού: C. fusifornis Εργοταμίνη Πίνακας 1.3. Είδη μυκήτων και οι μυκοτοξίνες που παράγουν (Weidenborner 2001, Κιοσεόγλου και Μπλέκας 2009) Γιατί οι μικροοργανισμοί παράγουν τοξίνες Εδώ και πολλά χρόνια υπήρχαν αμφιλεγόμενες απόψεις μεταξύ των επιστημόνων σχετικά με το πότε και γιατί οι μικροοργανισμοί παράγουν τοξίνες. Ακόμη και σήμερα γίνονται πολλές συζητήσεις προκειμένου να διευκρινιστεί η προέλευση, ο ρόλος και σημαντικότητα που έχουν αυτοί οι δευτερογενείς μεταβολίτες για τους μικροοργανισμούς. Ορισμένες ομάδες επιστημόνων υποστήριζαν ότι οι τοξίνες αποτελούν προϊόντα αποταμίευσης ή προϊόντα αποτοξικοποίησης (detoxification), ενώ άλλες ομάδες υποστήριζαν την υψηλή τοξικότητα τους και την αδυναμία της επιστημονικής κοινότητας να δώσει επαρκείς πληροφορίες για το ποιες χημικές ουσίες γίνονται μη τοξικές κατά την διάρκεια των μεταβολικών διεργασιών (Dijksterhuis and Samson, 2007). 28

38 Το 1998 ο Williams και ο Clarke προσπάθησαν να απαντήσουν στο ερώτημα γιατί οι μικροοργανισμοί παράγουν τοξίνες αναλύοντας όλες τις πτυχές που απορρέουν γύρω από το ερώτημα αυτό. Αναφέρουν ότι επικρατούσα και η ανθρωποκεντρική άποψη ότι οι μικροοργανισμοί παράγουν τις τοξίνες για να προκαλέσουν ασθένειες και θάνατο είναι εσφαλμένη. Υποστηρίζουν ότι οι μικροοργανισμοί δεν παράγουν τις τοξίνες με σκοπό την ανάπτυξη παθογένειας αλλά επειδή αντιλαμβάνονται το ανθρώπινο σώμα ως μια απλή οικολογική θέση που αποτελεί μια άφθονη πηγή θρεπτικών συστατικών. Έτσι αναπτύσσουν εξελιγμένους προσαρμοστικούς μηχανισμούς (τοξίνες) προκειμένου να προσπεράσουν τους μηχανισμούς άμυνας του ανθρώπινου οργανισμού (ανοσοποιητικό σύστημα) και να έχουν πρόσβαση στα θρεπτικά αυτά. Ωστόσο θεωρούν ότι και αυτή η άποψη είναι λίγο προκατειλημμένη γιατί οι μικροοργανισμοί αποτελούν τις προγενέστερες μορφές ζωής στον πλανήτη μας οπότε η ανάπτυξη αυτών των μηχανισμών ήταν αποτέλεσμα της εξελικτικής πίεσης που υπήρχε εξαιτίας της μεγάλης μικροβιακής ποικιλότητας αλλά και των άφθονων οικολογικών θέσεων. Επομένως κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι τοξίνες αποτελούν μηχανισμούς για την πρόσβαση των μικροοργανισμών σε διάφορα περιβάλλοντα (σώμα του ξενιστή) προκειμένου να χρησιμοποιήσουν το διαθέσιμους πόρους σε αφομοιώσιμη γι αυτούς μορφή και στην συνέχεια να μεταβούν σε άλλα (Williams and Clarke, 1998). Η επικρατούσα άποψη σχετικά με την παραγωγή τοξινών από τους μύκητες ήταν ότι οι μύκητες παράγουν μυκοτοξίνες μόνο όταν οι συνθήκες του περιβάλλοντος γίνουν δυσμενείς για την ανάπτυξη και την επιβίωση τους, παρέχοντας τους ένα συγκριτικό πλεονέκτημα. Η παραγωγή μυκοτοξινών απαιτεί μεγάλη κατανάλωση ενέργειας και αποτελεί απόκριση των μυκήτων σε περιβαλλοντικούς παράγοντες. Αποτελέσματα εργαστηριακών πειραμάτων έχουν δείξει ότι οι μυκοτοξίνες παράγονται σε συνθήκες έλλειψης θρεπτικών συστατικών συνοδευόμενες από μεγάλη κατανάλωσης ενέργειας, ενισχύοντας έτσι την άποψη του συγκριτικού πλεονεκτήματος που παρέχουν στον μύκητα για επιβίωση. Η παραγωγή κάποιων μυκοτοξινών δεν ενεργοποιείται κάτω από συνθήκες έλλειψης θρεπτικών συστατικών αλλά απαιτεί ειδικευμένους παράγοντες για τον κάθε μεταβολίτη (μυκοτοξίνη) (Dijksterhuis and Samson, 2007). Οι τοξίνες στα βακτήρια παράγονται για πολλούς και διαφόρους λόγους. Οι τοξίνες αποτελούν προϊόντα του δευτερογενούς μεταβολισμού των βακτηρίων που μερικές φορές τυχαίνει να είναι τοξικά. Για παράδειγμα η εντεροτοξίνη που παράγει ο Staphylococcus aureus δημιουργεί τοξικές επιδράσεις μόνο κατά την κατανάλωση μολυσμένου τροφίμου, αφού παράγεται κατά την ανάπτυξη του οργανισμού στο τρόφιμο. Αρά η εμφάνιση των τοξικών επιδράσεων μια τοξίνης πολλές φορές είναι τυχαία (Williams and Clarke, 1998). Άλλες τοξίνες παράγονται προκειμένου το βακτήριο να αποκομίσει τα απαραίτητα θρεπτικά 29

39 συστατικά που χρειάζεται από το κύτταρο του ξενιστή του. To βακτήριo Streptococcus pyogenes παράγει την στρεπτολυσίνη. Ο μια τοξίνη πού λύει την αιμοσφαιρίνη και έτσι καθιστά ικανό το βακτήριο να χρησιμοποιήσει τον διαθέσιμο σίδηρο της (Madigan and Martinko, 2006). Κάποιες τοξίνες παράγονται μόνο όταν το βακτήρια βρίσκονται στο εσωτερικό του ξενιστικού κυττάρου και απαιτούν μεγάλο χρόνο επώασης μέχρι την εμφάνιση των συμπτωμάτων. Μια τέτοια τοξίνη είναι σιγκατοξίνη (Shigatoxin) που παράγουν τα βακτήρια του γένους Shigella (Sears and Kaper, 1996).Ορισμένα βακτήρια παράγουν τοξίνες που δρουν εναντίον άλλων βακτηρίων που σχετίζονται στενά μεταξύ τους χωρίς να επηρεάζουν τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι τοξίνες αυτές ονομάζονται βακτηριοσίνες (Pattus et al., 1990). Τέλος όσον αφορά τις ενδοτοξίνες δεν χρειάζεται να διερευνηθεί ο μηχανισμός παράγωγης τους αφού αποτελούν δομικό συστατικό του βακτηριακού κυττάρου και απελευθερώνονται μόνο μετά την λύση του (Madigan and Martinko, 2006). Πολλά βακτήρια παράγουν τοξίνες μόνο όταν ο αριθμός τους αυξηθεί υπερβολικά. Έχει βρεθεί ότι η διαδικασία «αίσθηση απαρτίας» (quorum sensing) βοήθα τα παθογόνα βακτήρια (Staphylococcus aureus, E. coli O157:H7 κ.α.) να ρυθμίσουν την έκφραση των μηχανισμών τοξικότητας τους ώστε να μπορούν να αποφεύγουν τους μηχανισμούς άμυνας του ξενιστή (ανοσοποιητικό σύστημα). Η Αίσθηση απαρτίας στην προκαρυωτική βιολογία αποτελεί την ικανότητα ενός βακτηρίου να αντιλαμβάνεται πληροφορίες μέσω εκκρινόμενων μορίωνσημάτων από γειτονικά βακτηριακά κύτταρα όταν ο πληθυσμός τους φτάσει σε μία κρίσιμη συγκέντρωση (απαρτία) και να ανταποκρίνεται σε αυτές (Deep et al., 2011). Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί έχουν αναπτύξει μηχανισμούς όπως είναι οι τοξίνες προκειμένου να διαταράσσουν την λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή τους. Το ερώτημα έγκειται στο γεγονός κατά πόσο οι τοξίνες αυτές έχουν εξελιχθεί και έχουν αναπτύξει προσαρμογές που τους επιτρέπουν να αποφεύγουν την ανοσοαπόκριση (Galan, 2005) Αναλυτικές μέθοδοι ανίχνευσης μυκοτοξινών Σύμφωνα με την νομοθεσία και συγκριμένα την παράγραφο 3 του Κανονισμού 882/2004 οι μέθοδοι ανάλυσης που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο στα τρόφιμα θα πρέπει να πληρούν τις εξής προϋποθέσεις: α) ορθότητα, β) ευκολία εφαρμογής, γ) όριο ανίχνευσης, δ) όριο προσδιορισμού, ε) ακρίβεια, στ) επαναληψιμότητα, ζ) αναπαραγωγιμότητα, η) ανάκτηση, θ) επιλεκτικότητα, ι) ευαισθησία, ια) γραμμικότητα, και ιβ) αβεβαιότητα. Υπάρχει μια πληθώρα βιβλιογραφικών πηγών για τις μεθόδους ανάλυσης των μυκοτοξινών στα τρόφιμα καθώς και προτεινόμενες επίσημες μέθοδοι από τον AOAC (Association of Analytical Communities). Η ανάπτυξη και η επικύρωση των μεθόδων που θα 30

40 χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση των μυκοτοξινών στα τρόφιμα θα πρέπει να ακολουθούν τα ισχύοντα θεσμοθετημένα όρια. Επίσης είναι αναγκαίο τα αναλυτικά εργαστήρια να χρησιμοποιούν μεθόδους με ποσοστά απόδοσης που είναι απαιτούμενα από την νομοθεσία (Κανονισμός 401/2006). Οι κυριότερες μέθοδοι ανίχνευσης μυκοτοξινών στα τρόφιμα είναι η ELISA, RIA (ανοσολογικές μέθοδοι), SPR (βιοφυσική μέθοδος), TLC, HPLC (χρωματογραφικές μέθοδοι) και οι ανοσοδοκιμές. Η Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας (TLC-Thin Layer Chromatography) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της αφλατοξίνης και είχε προταθεί ως επίσημη μέθοδος ανάλυσης των αφλατοξινών στα κελυφωτά φιστικιά από τον AOAC (Aghamohammadi et al. 2007, AliSheibani 2008). H Υψηλής Απόδοσης Υγρή Χρωματογραφία (HPLC-High Performance Liquid Chromatography) αποτελεί την πλέον σύγχρονη και ευρύτατα χρησιμοποιούμενη μέθοδο ανάλυσης των αφλατοξινών στα τρόφιμα, ενώ έχει γίνει αποδεκτή μέθοδος από τον AOAC. Η επικράτηση της οφείλεται στην μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με την TLC και της σταθερότητας των αποτελεσμάτων σε σχέση με την ELISA. Οι ανοσολογικές μέθοδοι (ELISA και RIA) προσφέρουν ταχύτητα και αξιοπιστία αποτελεσμάτων άλλα η χρήση τους είναι μάλλον συμπληρωματική. Τα κυριότερα πλεονεκτήματα της HPLC είναι η αυτοματοποίηση, η ταχύτητα και η υψηλή ακρίβεια ανάλυσης, ενώ αποτελεί μείον το υψηλό της κόστος και το εξειδικευμένο και έμπειρο προσωπικό που απαιτεί (Jaimez et al., 2000, Gilbert and Anklam, 2002). Η εφαρμογή της HPLC για την ανίχνευση μυκοτοξινών (αφλατοξίνης, ωχρατοξίνης και πατουλίνης) έχει εντοπιστεί σε πάρα πολλά τρόφιμα και υποστρώματα όπως σιτηρά, χυμούς, μυκηλιακά εκχυλίσματα, κρασί, ξηροί καρποί, αραβόσιτο κ.α. (Haghighi et al., 1981).Η υγρή χρωματογραφία έχει συνδυαστεί με την φασματοσκοπία μάζας (LC-MS) για την ανίχνευσή και τον ποσοτικό προσδιορισμό μυκοτοξινών με δυνατότητα ανίχνευσης της παραγόμενης τοξίνης ακόμη και σε πολύ μικρές ποσότητες όποτε αυτό είναι εφικτό. Το σύστημα συντονισμού επιφανειακών πλασμονίων (SPR) έχει χρησιμοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό μυκοτοξινών χαμηλού μοριακού βάρους όπως της αφλατοξίνη Β 1, της ωχρατοξίνης Β 1, της φουμοσίνης Β 1 και της ζεαραλενόνης (Hodnik and Anderluh, 2009) Σύστημα HPLC H χρωματογραφία HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ή High Performance Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης ή Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης) αποτελεί σημαντικά εξελιγμένη μορφή της χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση πλέον δεν ρέει υπό την επίδραση της βαρύτητας, αλλά με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και επιτρέπει τη χρήση χρωματογραφικών στηλών με μικρό 31

41 μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης. Η χρήση μικρoύ μεγέθους σωματιδίων υλικού πλήρωσης αυξάνει το εμβαδόν της επιφάνειας της στατικής φάσης, που είναι διαθέσιμο να αλληλεπιδράσει με τα μόρια που μεταφέρονται μέσω της κινητής φάσης. Κατά συνέπεια, βελτιώνεται ο διαχωρισμός των αναλυόμενων μορίων και μειώνεται σημαντικά το μέγεθος της στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC και γενικότερα η περισσότερο κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού ουσιών για αναλυτικούς σκοπούς. Ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας. Η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο, οκτύλιο), φαινύλιο, διόλες, αμινομάδες, κυανομάδες κ.α., οι οποίες προσδίδουν στη στατική φάση ιδιαίτερα άπολο χαρακτήρα. Η κινητή φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα ή με νερό. Η έκλουση των προσροφημένων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται με τη μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την αύξηση του περιεχόμενου σε αυτή ποσοστού του οργανικού διαλύτη. Η μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ελαττώνει την υδρόφοβη αλληλεπίδραση μεταξύ των προσροφημένων μορίων και της στατικής φάσης: είναι προφανές ότι όσο πιο άπολο είναι ένα διαχωριζόμενο μόριο, τόσο περισσότερο χρόνο θα αλληλεπιδράσει με την άπολη στατική φάση και τόσο υψηλότερη θα είναι η συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, που θα απαιτείται για να επιτευχθεί η αποδέσμευσή του. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική έκλουση των άπολων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη. Μία βασική εργαστηριακή διάταξη υγρής χρωματογραφίας περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους μέρη: Περιέκτες διαλυτών: Οι διαλύτες που θα αποτελέσουν την κινητή φάση βρίσκονται αποθηκευμένοι σε ειδικές φιάλες. Η κινητή φάση είναι απαραίτητη για τη μεταφορά των δειγμάτων μέσα από το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας. Απαερωτής κενού: Ο απαερωτής εξασφαλίζει την απαέρωση της κινητής φάσης, ώστε να είναι εφικτός ο έλεγχος της πίεσης στη χρωματογραφική στήλη. Αντλία (pump): Η αντλία εξασφαλίζει τη συνεχή άντληση και προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου του συνόλου του συστήματος, από τους περιέκτες των διαλυτών μέχρι το δοχείο συλλογής των αποβλήτων του συστήματος, υπό ρυθμιζόμενη υψηλή πίεση και ροή. Σύστημα εισαγωγής δείγματος (injection system/injector valve): περιλαμβάνει βρόγχο σταθερού όγκου ή αυτόματο σύστημα εισαγωγής, μεταβλητού (προεπιλεγμένου) όγκου 32

42 έγχυσης. Βρίσκεται πριν τη χρωματογραφική στήλη και επιτρέπει την εισαγωγή του δείγματος στη ροή της κινητής φάσης. Χρωματογραφική στήλη (column): στη στήλη επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός του μίγματος στα συστατικά του. Εφόσον ο διαχωρισμός καθορίζεται και από τη θερμοκρασία, η στήλη εμπεριέχεται σε θερμοστατούμενο κλίβανο (column oven). Ανιχνευτής (detector): Η ανίχνευση των ουσιών που εξέρχονται της στήλης γίνεται συνεχώς, κυρίως με φασματομετρία UV/Vis, όπου το παραγόμενο από τον ανιχνευτή φως προσπίπτει σε κυψελίδα συνεχούς ροής από χαλαζία και μετριέται η απορρόφηση του φωτός. Καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή που παράγει το χρωματογράφημα της ανάλυσης. Δεξαμενή αποβλήτων: Είναι η δεξαμενή όπου συλλέγεται η κινητή φάση μαζί με τα περιεχόμενα συστατικά του δείγματος. Όταν είναι επιθυμητή η συλλογή κλασμάτων της κινητής φάσης, (όπως στην προπαρασκευαστική HPLC), χρησιμοποιείται αυτόματος κλασματοσυλλέκτης (fraction collector) Ωχρατοξίνη Α Γενικά Η ΩΤΑ απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1965 από τον A. ochraceus Wilh. στη Νότιο Αφρική (Van der Merwe et al. 1965). Μέσα στα επόμενα χρόνια, είδη του γένους Penicillium, όπως ο μύκητας P. verrucosum συνδέθηκαν με την παραγωγή της εν λόγω τοξίνης (Pitt 1987, Varga et al. 1996). Πρόσφατα, ο A. carbonarius ταυτοποιήθηκε ως η τρίτη κύρια πηγή της ΩΤΑ (Teren et al. 1996). Παρόλο που υπάρχουν αρκετά είδη ωχρατοξινών, η ΩΤΑ αποτελεί τη συχνότερα απαντώμενη και την ισχυρότερα τοξική μορφή (Εικόνα 1.2.). 33

43 Εικόνα 1.2. Χημικές δομές της ομάδας των ωχρατοξινών (Anli et al. 2010) Τα είδη μυκήτων που προαναφέρθηκαν είναι ικανά για ανάπτυξη σε διαφορετικές κλιματικές συνθήκες και υποστρώματα (τρόφιμα), με συνέπεια η παρουσία της ΩΤΑ να αποτελεί έναν κίνδυνο παγκόσμιας κλίμακας. Συγκεκριμένα, η ανίχνευση της τοξίνης σε ψυχρά κλίματα οφείλεται συνήθως στον μύκητα P. verrucosum, ενώ η εμφάνισή της σε προϊόντα που παράγονται σε θερμές και τροπικές περιοχές έχει συσχετιστεί με τα είδη του γένους Aspergillus. Η ΩΤΑ είναι δυνατόν να απομονωθεί από ένα ευρύ φάσμα τροφίμων. Σύμφωνα με δεδομένα που έχουν συλλεχθεί από ευρωπαϊκούς οργανισμούς, προϊόντα όπως τα σιτηρά, το κρασί, ο χυμός του σταφυλιού, ο καφές και το χοιρινό αποτελούν τις κύριες πηγές της ΩΤΑ επί της συνολικής προσλαμβανόμενης ποσότητας της τοξίνης με 58%, 21%, 7%, 5% και 3% αντίστοιχα (JECFA, 2001). Μελέτες αναφέρουν τις νεφροτοξικές, τερατογόνες, ανοσοτοξικές, ηπατοτοξικές και νευροτοξικές ιδιότητες της ΩΤΑ (Sclatter et al. 1996, Petzinger and Zieger 2000). Πρόσφατα, η εν λόγω τοξίνη καθορίστηκε ως πιθανό καρκινογόνο για τον άνθρωπο (group 2B) (IARC, 1993). Επιπλέον, έχει συνδεθεί με την ανθρώπινη ασθένεια, Βαλκανική Ενδημική Νεφροπάθεια (Balkan Endemic Nephropathy BEN), μία θανατηφόρα, χρόνια νεφρική ασθένεια που εμφανίζεται σε περιορισμένες περιοχές της Βουλγαρίας, της πρώην Γιουγκοσλαβίας και της Ρουμανίας. Τα πρώτα σημάδια της ασθένειας περιλαμβάνουν κόπωση, πονοκέφαλο, απώλεια σωματικού βάρους και ωχρό δέρμα. Συχνά συνοδεύεται από πρωτεϊνουρία και υπέρταση. Τα κύρια γνωρίσματά της είναι οι χρόνιες αλλοιώσεις στο φλοιό των νεφρών, ενώ σε προχωρημένο στάδιο, το σχήμα και το βάρος των νεφρών παρουσιάζει σημαντική μείωση (Marquarrdt and Frohlich 1992, Esser and Lemke 1996, Petzinger and 34

44 Ziegler 2000). Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι η πρόσληψη παρόμοιων συγκεντρώσεων ΩΤΑ δεν έχει προκαλέσει την ασθένεια σε άλλες περιοχές της Ευρώπης (Jimenez et al. 1999, Blank et al. 2003, Atanasova et al. 2005). Η τοξικότητα της ΩΤΑ και η επικινδυνότητά της για την ανθρώπινη υγεία έχει εκτιμηθεί από ευρωπαϊκούς και διεθνείς οργανισμούς καθορίζοντας τα μέγιστα επιτρεπτά όρια κατανάλωσης στα τρόφιμα (SCF 1998, JECFA 2001). Πολλές χώρες έχουν χρησιμοποιήσει τα όρια αυτά ως βάση για τη θέσπιση κανονισμών για τις μέγιστες επιτρεπόμενες συγκεντρώσεις της ΩΤΑ ανά κατηγορία τροφίμου Νομοθεσία Η παρουσία υψηλής τοξικότητας των μυκοτοξινών συγκαταλέγοντας και την ΩΤΑ σε συνδυασμό με τη σημερινή ανάγκη για υγιεινά, ποιοτικά και κυρίως ασφαλή τρόφιμα έχει οδηγήσει τις εποπτικές αρχές που σχετίζονται με την ποιότητα των τροφίμων στον καθορισμό ανώτατων επιτρεπτών ορίων, στον εγχώριο ελλαδικό και στον διεθνή χώρο. Οι μυκοτοξίνες αποτέλεσαν τα τελευταία χρόνια, τους κύριους ρυπαντές στο Σύστημα Ταχείας Προειδοποίησης για τα μη ασφαλή Τρόφιμα και τις Ζωοτροφές (Rapid Alert System for Food and Feed RASFF). Οι περισσότερες περιπτώσεις αφορούσαν στις αφλατοξίνες και δευτερευόντως στην ΩΤΑ. Η παρουσία της ΩΤΑ αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους αναδυόμενους διατροφικούς κινδύνους και είναι σημαντικό να ελέγχεται σε όλα τα στάδια (από το χωράφι μέχρι το τελικό προϊόν). Η Ευρωπαϊκή Ένωση θέσπισε μια σειρά νομοθετημάτων για την πρόληψη του προβλήματος των μυκοτοξινών και συγκεκριμένα της ΩΤΑ ( Κανονισμός 466/2001 για μυκοτοξίνες και βαρέα μέταλλα (Commission Regulation, 2001) Κανονισμός 472/2002. Αποτελεί τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθμ. 466/2001 για τον καθορισμό των μέγιστων τιμών ανοχής για ορισμένες προσμείξεις στα τρόφιμα. Παράλληλα θεσπίστηκαν τα ανώτερα επιτρεπτά όρια ΩΤΑ σε δημητριακά, προϊόντα δημητριακών και σταφίδες (Commission Regulation, 2002) Κανονισμός 683/2004 για αφλατοξίνες και ΩΤΑ σε βρεφικές και παιδικές τροφές. Αποτελεί τροποποίηση του (ΕΚ) αριθμ. 472/2002 και καθορίζει τα επίπεδα της ΩΤΑ σε τρόφιμα που προορίζονται για βρέφη και νήπια. Σύμφωνα με αυτόν τον κανονισμό ως κυριότερες πηγές πρόσληψης της ΩΤΑ αναγνωρίζονται τα δημητριακά και τα προϊόντα δημητριακών (Commission Regulation, 2004) Κανονισμός 123/2005 για ΩΤΑ σε οίνους. Με τον κανονισμό (ΕΚ) αριθμ. 123/2005 της Επιτροπής, της 26 ης Ιανουαρίου 2005, γίνεται τροποποίηση του κανονισμού (ΕΚ) αριθμ. 35

45 466/2001, καθορίζοντας ως νέο ανώτατο επιτρεπτό όριο της ΩΤΑ, τα 2 ppb για το κρασί, τον χυμό σταφυλιού και τα σταφύλια (Commission Regulation, 2005) Κανονισμός 1881/2006. Με τον παραπάνω κανονισμό της επιτροπής της 19 ης Δεκεμβρίου 2006 καθορίστηκαν νέα μέγιστα επιτρεπτά επίπεδα για ορισμένες ουσίες (ανάμεσά τους και η ΩΤΑ), οι οποίες επιμολύνουν τρόφιμα όπως τα δημητριακά, τα προϊόντα δημητριακών, τις σταφίδες, τον καφέ, το κρασί, τον χυμό σταφυλιών και τα τρόφιμα για βρέφη και μικρά παιδιά (Commission Regulation, 2006) (Πίνακας 1.4.) Κανονισμός 105/2010. Αποτελεί τροποποίηση του (ΕΚ) αριθμ. 1881/2006 και καθορίζει νέα μέγιστα επιτρεπτά επίπεδα της ΩΤΑ στα καρυκεύματα (30 ppb από έως και 15 ppb από ), στη ρίζα και στο εκχύλισμα γλυκόριζας (20 ppb και 80 ppb, αντίστοιχα) (Commission Regulation, 2010) Αρχικά είχε προταθεί ως προσωρινή ανεκτή εβδομαδιαία πρόσληψη 100 ng ΩΤΑ/kg σ.β. (σωματικού βάρους) (JECFA, 1996). Στις 4 Απριλίου 2006 όμως η ευρωπαϊκή αρχή για την ασφάλεια των τροφίμων (European Food Safety Authority EFSA) εξέδωσε επικαιροποιημένη επιστημονική γνώμη, λαμβάνοντας υπόψη τις νέες επιστημονικές πληροφορίες για την ΩΤΑ και έθεσε ένα ανεκτό όριο εβδομαδιαίας πρόσληψης (ΑΟΕΠ) ύψους 120 ng/kg σ.β. Τρόφιμα Μέγιστα επιτρεπτά επίπεδα (μg/kg) Μη μεταποιημένα δημητριακά 5,0 Όλα τα προϊόντα που παράγονται από μη μεταποιημένα δημητριακά, συμπεριλαμβανομένων των μεταποιημένων προϊόντων με βάση τα δημητριακά και των δημητριακών που 3,0 προορίζονται για άμεση κατανάλωση από τον άνθρωπο Σταφίδες (κορινθιακή, ξανθή σταφίδα και σουλτανίνα) 10,0 Φρυγμένοι κόκκοι καφέ και φρυγμένος και αλεσμένος καφές, εξαιρουμένου του διαλυτού καφέ 5,0 Διαλυτός καφές (στιγμιαίος καφές) 10,0 Οίνοι (συμπεριλαμβανομένων των αφρωδών οίνων, εξαιρουμένων των οίνων λικέρ και των οίνων με αλκοολικό τίτλο όχι μικρότερο του 15 % vol) και ποτά που προέρχονται 2,0 από ζύμωση φρούτων Αρωματισμένοι οίνοι, αρωματισμένα ποτά με βάση τον οίνο και αρωματισμένα κοκτέιλ αμπελοοινικών προϊόντων 2,0 Χυμός σταφυλιών, συμπυκνωμένος χυμός σταφυλιών, όπως αυτός ανασυστάθηκε, νέκταρ σταφυλιών, γλεύκος σταφυλιών 2,0 36

46 και συμπυκνωμένος γλεύκος σταφυλιών όπως αυτός ανασυστάθηκε, οι οποίοι προορίζονται για άμεση κατανάλωση από τον άνθρωπο Μεταποιημένα τρόφιμα με βάση τα δημητριακά και παιδικές 0,50 τροφές για βρέφη και μικρά παιδιά Διαιτητικά τρόφιμα για ειδικούς ιατρικούς σκοπούς που 0,50 προορίζονται ειδικά για βρέφη Ωμός καφές, ξηρά φρούτα εκτός από τις σταφίδες, μπίρα, κακάο και προϊόντα με βάση το κακάο, λικέρ, προϊόντα με - βάση το κρέας, καρυκεύματα και γλυκόριζα Πίνακας 1.4. Μέγιστα επιτρεπτά όρια της ΩΤΑ (Commision Regulation, 2006) 37

47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το πείραμα σχεδιάστηκε για την εξέταση της αλληλεπίδρασης της ζύμης Saccharomyces cerevisiae έναντι διαφορετικών ειδών μυκήτων που σχετίζονται με την αλλοίωση και ασφάλεια διαφόρων δημητριακών καρπών καθώς και αποξηραμένων φρούτων, όπως η Κορινθιακή σταφίδα. Η θερμοκρασία επώασης, το μέσο ανάπτυξης καθώς και το μέγεθος των εμβολίων της ζύμης και των μυκήτων ήταν σταθερά. Κατά τη διάρκεια του πειράματος συλλέχθηκαν τα δεδομένα για τη δημιουργία καμπύλης ανάπτυξης για κάθε μύκητα, την ποσότητα της τοξίνης που παράχθηκε καθώς επίσης και την συλλογή φωτογραφιών ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΥ ΜΕΤΑΞΥ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ Θρεπτικά υποστρώματα Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή των πειραμάτων ανταγωνισμού είναι: Malt Extract Agar (MEA), παρασκευάστηκε όπως προτείνεται από τους Pitt και Hocking (2009), Yeast Medium broth (YMbroth), παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται από τους Kapetanakou et al. (2012), Yeast Medium agar (YMagar), παρασκευάστηκε με τροποποίηση από την προτεινόμενη συνταγή των Kapetanakou et al. (2012) Άλλα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή των μικροβιολογικών αναλύσεων του πειράματος ήταν το υδατικό διάλυμα για την απόξεση των σπορίων (0,2ml v/v Tween80 και 0,9g w/v NaCl) και Ringer Στελέχη και προετοιμασία μικροοργανισμών Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στη βάση του Εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων. Οι μικροοργανισμοί φυλάσσονται σε -80 ο C. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν, ανανεώθηκαν και ελέγχθηκαν για την καθαρότητά τους πριν τη χρήση. Από την ανανέωση της ζύμης, σε στερεό υπόστρωμα YM συλλέχθηκαν αποικίες και με μικροβιολογικό κρίκο υπό ασηπτικές συνθήκες τοποθετήθηκαν 38

48 σε 30% γλυκερόλη και 70% YMbroth και φυλάχθηκαν στους -20 ο C. Οι μύκητες ανανεώθηκαν σε ΜΕΑ, επωάστηκαν για 7 ημέρες ώστε να σπορογονήσουν. Στη συνέχεια έγινε συλλογή των σπορίων. Τα σπόρια κάθε μύκητα τοποθετήθηκαν σε 30% γλυκερόλη και φυλάχθηκαν στους 4 ο C. Όλοι οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή του πειράματος ανανεώνονταν από τις παραπάνω συνθήκες. Η ζύμη που χρησιμοποιήθηκε είναι το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae FMCC Y 33 Οι μύκητες που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα παρακάτω στελέχη: Aspergillus flavus F 8 Aspergillus clavatus F 9 Aspergillus puniceus F 10 Aspergillus carbonarius ITEM5010 F 26 Aspergillus carbonarius F 70 Aspergillus carbonarius F 71 Aspergillus carbonarius F 80 Aspergillus niger F 30 Aspergillus niger F 88 Aspergillus niger F 142 Aspergillus niger F 157 Aspergillus tubigensis F 31 Aspergillus westerdijkiae F 32 Aspergillus ochraceus F 33 Aspergillus westerdijkiae F 35 Aspergillus tubigensis F 37 Aspergillus tubigensis F 38 Aspergillus ibericus F 108 Aspergillus japonicus F 131 Aspergillus tubigensis F 160 Penicillium expansum F 1 Penicillium commune F 2 Penicillium chrysogenum F 3 Penicillium corylophillum F 4 Penicillium spinulosum F 5 Penicillium purpurogenum F 6 Penicillium verrucosum F 36 Fusarium oxysporum F 11 Mucor circineloides F 12 Alternaria sp. F 13 Phoma herbarum F 14 Trichoderma longibrachiatum F 16 Rhizopus oryzae F 17 Cladosporium cladosporioides F 18 Aureobacidium sp. F 20 Ο παραπάνω συμβολισμός των στελεχών της ζύμης και των μυκήτων ισχύει για όλη την παρακάτω εργασία. 39

49 Ανανέωση/Έλεγχος καθαρότητας ζύμης Από τη βάση που δημιουργήθηκε (70% YMbroth, 30% γλυκερόλη, -20 ο C) γινόταν έλεγχος της καθαρότητας της καλλιέργειας σε υπόστρωμα YMagar. Στη συνέχεια γινόταν η πρώτη ανανέωση, σε θάλαμο νηματικής ροής υπό ασηπτικές συνθήκες, μεταφέρονταν 50μl σε 9 ml YMbroth και επωάζονταν σε θερμοκρασία 25 ο C για 72 ώρες. Από την πρώτη ανανέωση πραγματοποιούνταν η δεύτερη ανανέωση σε 9 ml YMbroth με προσθήκη 100 μl υπό ασηπτικές συνθήκες. Η επώαση γινόταν για 18h σε θερμοκρασία 25 ο C Καθαρισμός ζύμης Ακολούθως γινόταν καθαρισμός της ανανεωμένης καλλιέργειας της ζύμης υπό ασηπτικές συνθήκες, ώστε να απομακρυνθούν τα υπολείμματα του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας. Η υγρή καλλιέργεια φυγοκεντρήθηκε σε 6000g στους 4 ο C για 10 λεπτά, αποχύθηκε το υπερκείμενο και μετά την προσθήκη 9 ml Ringer και επαναιώρηση του ιζήματος, επαναλήφθηκε η φυγοκέντρηση στις πρότερες συνθήκες. Μετά την απόχυση του υπερκείμενου επαναλήφθηκε η πλύση. Παρασκευάστηκε εμβόλιο με τελική συγκέντρωση 10 5 cfu/ml Μύκητες Οι μύκητες καλλιεργήθηκαν σε υπόστρωμα ΜΕΑ, μετά από εμβολιασμό των σπορίων τους σε τρία σημεία του τριβλίου με 10 μl σπόρια/ml. Για κάθε μύκητα χρησιμοποιήθηκαν 6 επαναλήψεις. Τα τριβλία επωάζονταν σε θερμοκρασία 25 ο C για 7 ημέρες για να σπορογονήσουν. Η συλλογή των σπορίων γινόταν σε θάλαμο νηματικής ροής. Χρησιμοποιούνταν 10 ml υδατικού διαλύματος για την απόξεση των σπορίων (0,2ml v/v Tween80 και 0,9g w/v NaCl). Από το πυκνό διάλυμα σπορίων του μύκητα γίνονταν δεκαδικές αραιώσεις, από τις οποίες λαμβάνονταν δείγμα για τη μέτρηση των σπορίων του διαλύματος (σπόρια/ml) σε αντικειμενοφόρο πλάκα Neubauer. Η τελική συγκέντρωση των σπορίων ήταν 10 7 cfu/ml Εμβολιασμός τριβλίων Η πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε τριβλία με διάμετρο 9cm. Από τη ζύμη γίνονταν μία δεκαδική αραίωση, Υπό ασηπτικές συνθήκες λαμβάνονταν 100μl και επιστρώνονταν επιφανειακά σε τριβλία που περιείχαν ΜΕΑ. Τα τριβλία εμβολιάζονταν ώστε να έχουν πληθυσμό 10 5 cfu/ml. Για τον εμβολιασμό των μυκήτων λαμβάνονταν 5μl από κάθε μύκητα και ενοφθαλμίζονταν το κέντρο του κάθε τριβλίου. Τα τριβλία επωάστηκαν στους 40

50 25 ο C για 14 ημέρες. Για κάθε δείγμα πραγματοποιήθηκαν 6 επαναλήψεις ώστε να λαμβάνονται μετρήσεις για τη διάμετρο των μυκήτων, τη λήψη φωτογραφιών και τη δειγματοληψία των τοξινών Ανάπτυξη μυκήτων Σε τακτούς χρόνους μετρήθηκαν οι διάμετροι του μυκηλίου σε δύο κάθετους άξονες εκφραζόμενοι σε cm. Για τον υπολογισμό του εμβαδού ανάπτυξης των μυκήτων εφαρμόσθηκε ο τύπος Ε(cm 2 )=π*r 1 *R 2. Στη συνέχεια τα δεδομένα προσαρμόστηκαν στο μοντέλο Baranyi et al (1993) ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ Θρεπτικά υποστρώματα Τα θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν για την διεξαγωγή των πειραμάτων ανταγωνισμού είναι (Πίνακας ): Plate Count Agar (PCA), Plate Count Agar (PCA),,στο οποίο έγινε προσθήκη κυκλοεξιμιδίου, Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol agar (DRBC agar) Ringer Τα δείγματα Κορινθιακής σταφίδας προέρχονται από τον Παναιγιάλειο Συνεταιρισμό ενώ τα δείγματα καρπών κριθαριού είναι τοπικής ποικιλίας «Κριθάρι Παναγιάς» από την Λήμνο Στελέχη μικροοργανισμών Η ζύμη που χρησιμοποιήθηκε είναι το στέλεχος Saccharomyces cerevisiae FMCC Y Ανανέωση/Έλεγχος καθαρότητας ζύμης Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως περιγράφεται στην παράγραφο Καθαρισμός ζύμης Ακολουθήθηκε η ίδια διαδικασία όπως περιγράφεται στην παράγραφο , με εξαίρεση ότι η τελική συγκέντρωση της ζύμης ήταν 10 6 cfu/ml. 41

51 Ομάδες μικροοργανισμών Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα (ΟΜΧ) Ολική Βακτηριακή Χλωρίδα (ΟΒΧ) Θρεπτικό υλικό Προσθήκη αντιβιοτικού PCA - PCA Κυκλοεξαμίδιο Τεχνική εμβολιασμού Επιφανειακή επίστρωση Επιφανειακή επίστρωση Συνθήκες επώασης 25 ο C 2-3 ημέρες 25 ο C 2-3 ημέρες Ζύμες DRBC Χλωραμφενικόλη Επιφανειακή 25 ο C επίστρωση 3-5 ημέρες Μύκητες DRBC Χλωραμφενικόλη Επιφανειακή 25 ο C επίστρωση 3-5 ημέρες Πίνακας 2.1. Θρεπτικά υλικά και συνθήκες επώασης που χρησιμοποιήθηκαν για την καταμέτρηση των μικροβιακών ομάδων που μελετήθηκαν Εμβολιασμός δειγμάτων τροφίμων με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης Επιλέχθηκαν 2 διαφορετικές μέθοδοι εμβολιασμού της ζύμης στα δείγματα τροφίμων. Η πρώτη μέθοδος αφορούσε την εμβάπτιση των δειγμάτων Κορινθιακής σταφίδας και καρπού κριθαριού σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml. Τα δείγματα παρέμειναν επί 30 λεπτά και στη συνέχεια αποστραγγίστηκαν. Η δεύτερη μέθοδος αφορούσε την εμβάπτιση και παραμονή των δειγμάτων τροφίμων σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml. Επίσης πραγματοποιήθηκαν και άλλες 2 μέθοδοι επέμβασης στα δείγματα τροφίμων. Η μία αφορούσε την εμβάπτιση και παραμονή των δειγμάτων σε αποστειρωμένο διάλυμα αντιβιοτικού ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l, ενώ η άλλη αφορούσε τη συντήρηση των δειγμάτων χωρίς καμία επέμβαση. Σε κάθε περίπτωση συντηρήθηκαν και τα αντίστοιχα δείγματα αναφοράς των τροφίμων Δειγματοληψίες τροφίμων Όλα τα δείγματα συντηρήθηκαν στους 25 ο C για 28 ημέρες. Δειγματοληψίες πραγματοποιήθηκαν την 0, 3 η, 7 η, 10 η, 14 η, 17 η, 21 η και 28 η ημέρα συντήρησης. Κατά τη διάρκεια της συντήρησης, οι μικροβιολογικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο των διαδοχικών δεκαδικών αραιώσεων. Ποσότητα 10 g τροφίμου ζυγίστηκε ασηπτικά μέσα σε στείρα σακούλα Stomacher χρησιμοποιώντας λαβίδα η οποία είχε στειρωθεί με τη βοήθεια της αλκοόλης και της φλόγας. Στη συνέχεια προστέθηκαν 90 ml Ringer ασηπτικά ώστε η αραίωση του τροφίμου να είναι 1/10. Η σακούλα τοποθετήθηκε στον ομογενοποιητή Stomacher για 1 min. Η σακούλα περιείχε την πρώτη αραίωση του τροφίμου. Οι κατάλληλες κατά περίπτωση δεκαδικές αραιώσεις χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό διπλής σειράς τρυβλίων για κάθε χρησιμοποιούμενο μικροβιολογικό υπόστρωμα. Μετά το τέλος της επώασης, για την καταμέτρηση των αποικιών επιλέχθηκαν τα τρυβλία εκείνα στα οποία ο 42

52 αριθμός των αποικιών ήταν μεγαλύτερος από 30 και μικρότερος από 300 και στη συνέχεια το αποτέλεσμα εκφράστηκε ως cfu μικροοργανισμών/g τροφίμου. Τα αποτελέσματα μετασχηματίστηκαν σε λογαριθμική μορφή και εκφράστηκαν ως log 10 cfu/g τροφίμου. Κατά τη διάρκεια της συντήρησης τα δείγματα φωτογραφίζονταν σε τακτά χρονικά διαστήματα ΛΗΨΗ ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΩΝ Οι φωτογραφίες λήφθηκαν με φωτογραφική μηχανή OLYMPUS E-330, Live view digital SLR Camera, Zuiko Digital 14-45mm 1: ΤΟΞΙΝΕΣ Διαλύματα Διάλυμα έκλουσης της στήλης: νερό:ακετονιτρίλιο:οξικό οξύ v/v σε αναλογία 49,5:49,5:1 Διάλυμα έκχύλισης της τοξίνης: 100% v/v μεθανόλη Δειγματοληψία Τα δείγματα για την ανάκτηση της τοξίνης παραλήφθησαν την 7 η και 14 η ημέρα επώασης. Χρησιμοποιήθηκαν πιππέτες Pasteur και τα δείγματα αφαιρέθηκαν από το κέντρο του τριβλίου ώστε κάθε δείγμα να περιέχει υπόστρωμα και μυκήλιο όπου ήταν υπαρκτό. Από κάθε τριβλίο λήφθησαν 5 τεμάχια ίσης διαμέτρου (plugs) και μετρημένου βάρους, τα οποία φυλάσσονταν στους -20 ο C μέχρι να αναλυθούν περαιτέρω Μέθοδος εκχύλισης Σε κάθε δείγμα προστείθονταν 1ml μεθανόλης και αναδευόταν για 5 λεπτά. Στη συνέχεια τα δείγματα αφήνονταν σε ηρεμία για 1 ώρα. Το υπερκείμενο λήφθηκε με σύριγγα και καθαρίστηκε με φίλτρο (Whatman, 0.2μm, PVDF). Τα δείγματα μετά την εκχύλιση παρέμειναν σε θερμοκρασία -20 ο C μέχρι την ανάλυσή τους στην HPLC Σύστημα HPLC Το σύστημα HPLC που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από τον δίαυλο επικοινωνίας JASCO LC-Net II, τον αυτόματο δειγματολήπτη JASCO AS-2055, την αντλία JASCO PU-980, τη συσκευή του gradient JASCO LG , τον ανιχνευτή πολλαπλού μήκους κύματος JASCO MD-910, τον ανιχνευτή δείκτη διάθλασης JASCO RI-2031, το UPS, τον ανιχνευτή φθορισμού JASCO FP-2020, τη μονάδα του υπολογιστή και την διάταξη απαέρωσης. Η 43

53 στήλη που χρησιμοποιήθηκε ήταν C18, 5μm ODS2 (4.6x250mm) C18. Τα δείγματα εκλούστηκαν υπό ισοκρατικές συνθήκες με ροή 1ml/min με το διάλυμα έκλουσης για 20 λεπτά. 44

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ Η μεταβολή της ανάπτυξης των μυκήτων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται παρακάτω σε μορφή γραφημάτων, όπου ο άξονας Y αντιπροσωπεύει την επιφάνεια του μυκηλίου εκφρασμένο σε cm 2 και ο άξονας Χ τον χρόνο επώασης σε ημέρες. Τα σημεία σε κάθε διάγραμμα παρουσιάζουν τα πειραματικά δεδομένα, ενώ η καμπύλη που περνάει από τα σημεία είναι η προσαρμογή των δεδομένων στο μοντέλο Baranyi. Από τα διαγράμματα μπορούμε να συγκρίνουμε τον ρυθμό ανάπτυξης των μυκήτων όπως επίσης και την φάση προσαρμογής τους, είτε πρόκειται για μονοκαλλιέργεια των μυκήτων είτε για συγκαλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae Y 33. Το μέγιστο εμβαδόν του μυκηλίου ήταν 56,72 cm 2. Σε κάποιες περιπτώσεις της ανάπτυξης των μυκήτων, όταν κάποιο σπόριο κατά τη διάρκεια της επώασης έπεφτε από το μυκήλιο και αναπτυσσόταν, εμπόδιζε τη μέγιστη ανάπτυξη του μυκηλίου που είχαμε εμβολιάσει, επομένως το μέγιστο της ανάπτυξης των μυκήτων ήταν μικρότερο από 56,72 cm 2. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε ένα μέσο ανάπτυξης και συγκεκριμένα το MEA. Η θερμοκρασία επώασης των τριβλίων ήταν 25 ο C για 14 ημέρες Σύγκριση μυκήτων απουσία ζύμης Από τα διαγράμματα έως φαίνεται η ανάπτυξη των μυκήτων στους 25 ο C, στο μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ. Στους πίνακες και φαίνεται ο ρυθμός ανάπτυξης σε αυτές τις συνθήκες. Συγκεκριμένα, ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν από 12,36 έως 0,23 cm 2 /ημέρα, τον μέγιστο και τον ελάχιστο ρυθμό ανάπτυξης είχαν οι μύκητες A. niger F 157 και Aureοbacidium sp. F 20, αντίστοιχα. Η φάση προσαρμογής των μυκήτων ήταν 5,54 έως 1,13 ημέρες, την μέγιστη και την ελάχιστη φάση προσαρμογής είχαν οι μύκητες P. commune F 2 και A. tubigensis F 31, αντίστοιχα. Οι μύκητες M. circineloides F 12, Tr. longibrachiatum F 16 και Rh. oryzae F 17 επειδή έφταναν το μέγιστο της ανάπτυξής τους (56,72 cm 2 ) την 3 η ημέρα επώασης, δεν προσαρμόστηκαν στο μοντέλο Baranyi αλλά πραγματοποιήθηκε γραμμική παλινδρόμηση για αυτά τα δεδομένα. 45

55 Σύγκριση μυκήτων παρουσία της ζύμης Saccharomyces cerevisiae Y 33 Στα διαγράμματα έως παρουσιάζεται η ανάπτυξη των μυκήτων στους 25 ο C παρουσία της ζύμης S. cerevisiae Y 33, στο μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ. Από τους πίνακες και φαίνεται η επίδραση της ζύμης στον ρυθμό ανάπτυξης των μυκήτων. Το εύρος των ρυθμών ανάπτυξης ήταν από 1,01 έως 0 cm 2 /ημέρα, τον μέγιστο και τον ελάχιστο ρυθμό ανάπτυξης είχαν οι μύκητες A. flavus F 8, A. puniceus F 10, A. niger F 88, A. tubigensis F 31, A. westerdijkiae F 32, A. ochraceus F 33, A. westerdijkiae F 35, A. tubigensis F 37, A. tubigensis F 38, A. tubigensis F 160, P. corylophillum F 4, Alternaria sp. F 13 και A. carbonarius ITEM5010 F 26, A. carbonarius F 71, P. spinulosum F 5, P. purpurogenum F 6, αντίστοιχα. Η φάση προσαρμογής ήταν η μέγιστη και ελάχιστη τιμή 12,93 και 0,19 ημέρες για τους μύκητες A. niger F 30 και Ph. herbarum F 14, αντίστοιχα. Οι μύκητες M. circineloides F 12, Tr. longibrachiatum F 16 και Rh. oryzae F 17 επειδή στη μονοκαλλιέργεια έφταναν το μέγιστο της ανάπτυξής τους (56,72 cm 2 ) την 3 η ημέρα επώασης, δεν προσαρμόστηκαν στο μοντέλο Baranyi αλλά πραγματοποιήθηκε γραμμική παλινδρόμηση για αυτά τα δεδομένα. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων ανταγωνισμού μεταξύ των μυκήτων και της ζύμης διαπιστώνεται πως η ανάπτυξη των μυκήτων είτε ήταν πάρα πολύ μικρή είτε δεν αναπτύχθηκαν καθόλου. Επομένως, η ζύμη S. cerevisiae δεν επέτρεψε την ανάπτυξη των μυκήτων που μελετήθηκαν σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. 46

56 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων A. flavus F 8 ( ), A. clavatus F 9 ( ), A. puniceus F 10 ( ), A. carbonarius ITEM5010 F 26 ( ), A. carbonarius F 70 ( ) και A. carbonarius F 71 (X) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 8, F 9, F 10, ITEM5010 F 26, F 70 και F 71 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 47

57 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων A. carbonarius F 80 ( ), A. niger F 30 ( ), A. niger F 88 ( ), A. niger F 142 ( ), A. niger F 157 ( ) και A. tubigensis F 31 (X) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 80, F 30, F 88, F 142, F 157 και F 31 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 48

58 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων A. westerdijkiae F 32 ( ), A. ochraceus F 33 ( ), A. westerdijkiae F 35 ( ), A. tubigensis F 37 ( ), A. tubigensis F 38 ( ) και A. ibericus F 108 (X) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 32, F 33, F 35, F 37, F 38 και F 108 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 49

59 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων A. japonicus F 131 ( ), A. tubigensis F 160 ( ), P. expansum F 1 ( ), P. commune F 2 ( ), P. chrysogenum F 3 ( ) και P. corylophillum F 4 (X) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 131, F 160, F 1, F 2, F 3 και F 4 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 50

60 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων P. spinulosum F 5 ( ), P. purpurogenum F 6 ( ), P. verrucosum F 36 ( ), F. oxysporum F 11 ( ) και Alternaria sp. F 13 (X) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 5, F 6, F 36, F 11 και F 13 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 51

61 Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Επιφάνεια (cm 2 ) Days Days Days Διαγράμματα Αλληλεπίδραση των μυκήτων Ph. herbarum F 14 ( ),, Cl. cladosporioides F 18 ( ) και Aureobacidium sp. F 20 ( ) με τη ζύμη S. cerevisiae ( ). Μονοκαλλιέργεια ( ) του F 14, F 18 και F 20 για κάθε περίπτωση που μελετήθηκε. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ, η θερμοκρασία επώασης 25 ο C και το εμβόλιο των μυκήτων και της ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 52

62 Μύκητας Ρυθμός ανάπτυξης Φάση προσαρμογής y(end) se(y(end)) R 2 F 8 F 9 F 10 ITEM5010 F 26 F 70 F 71 F 80 F 30 F 88 F 142 F 157 F 31 F 32 F 33 F 35 F 37 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 9,53 ± 1,65 2,52 ± 0,56 42,67 1,13 0,99 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 2,26 ± 0,17 20,93 0,62 0,99 ΖΥΜΗ 0,88 ± 0,24 6,33 ± 0,19 1,52 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 3,30 ± 0,21 4,50 ± 0,54 0,99 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 7,59 ± 1,04 53,83 3,08 0,96 ΖΥΜΗ 1,01 ± 0,09 3,74 ± 0,08 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 7,91 ± 1,22 53,74 3,36 0,95 ΖΥΜΗ 0,55 ± 0,06 2,85 ± 0,03 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 7,32 ± 0,98 53,75 3,06 0,96 ΖΥΜΗ 1,01 ± 0,09 3,74 ± 0,08 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 7,33 ± 0,97 53,61 2,97 0,97 ΖΥΜΗ 0,05 ± 0,01 0,74 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 12,27 ± 0,08 1,84 ± 0,02 50,20 0,05 1,00 ΖΥΜΗ 0,41 ± 0,03 12,93 ± 0,07 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,54 ± 0,22 1,62 ± 0,08 38,57 0,14 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 10,61 ± 0,49 2,24 ± 0,13 44,34 0,28 1,00 ΖΥΜΗ 0,05 ± 0,01 0,34 0,00 0,97 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 12,36 ± 0,44 1,70 ± 0,10 46,96 0,24 1,00 ΖΥΜΗ 0,08 ± 0,02 0,46 0,02 0,88 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 6,21 ± 0,22 1,13 ± 0,18 44,28 0,26 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 6,24 ± 1,15 2,86 ± 0,88 44,77 1,71 0,99 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 10,13 ± 0,15 3,10 ± 0,05 51,06 0,12 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,41 ± 0,57 3,11 ± 0,26 51,14 0,50 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 10,28 ± 0,97 2,17 ± 0,32 48,46 0,75 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 Πίνακας Συνοπτική απεικόνιση του ρυθμού ανάπτυξης (cm 2 /ημέρα), της φάσης προσαρμογής (ημέρες) και του R 2 των καμπυλών ανάπτυξης των μυκήτων F 8, F 9, F 10, ITEM5010 F 26, F 70, F 71, F 80, F 30, F 88, F 142, F 157, F 31, F 32, F 33, F 35 και F 37 53

63 Μύκητας Ρυθμός ανάπτυξης Φάση προσαρμογής y(end) se(y(end)) R 2 F 38 F 108 F 131 F 160 F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 36 F 11 F 13 F 14 F 18 F 20 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,40 ± 0,10 2,13 ± 0,05 44,94 0,10 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,75 ± 1,64 0,90 ΖΥΜΗ 0,05 ± 0,02 0,55 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 10,98 ± 2,83 0,88 ΖΥΜΗ 0,12 ± 0,05 0,68 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 6,88 ± 0,99 50,39 2,60 0,96 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 2,04 ± 0,14 3,78 ± 0,64 0,99 ΖΥΜΗ 0,43 ± 0,01 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 2,03 ± 0,33 5,54 ± 1,19 0,97 ΖΥΜΗ 0,43 ± 0,01 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 1,62 ± 0,11 0,97 ΖΥΜΗ 0,43 ± 0,01 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 3,70 ± 0,32 3,77 ± 0,49 30,00 0,90 1,00 ΖΥΜΗ 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 2,98 ± 0,21 3,52 ± 0,68 0,99 ΖΥΜΗ 1,01 ± 0,07 3,74 ± 0,07 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 3,01 ± 0,29 2,25 ± 0,63 26,92 0,79 0,99 ΖΥΜΗ 1,01 ± 0,07 3,74 ± 0,07 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 1,38 ± 0,11 3,95 ± 0,76 0,99 ΖΥΜΗ 0,12 ± 0,01 0,53 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,71 ± 0,18 1,98 ± 0,09 57,30 0,37 1,00 ΖΥΜΗ 0,37 ± 0,04 8,39 ± 0,18 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 8,27 ± 1,19 3,69 ± 0,66 8,11 30,48 2,89 ΖΥΜΗ 0,00 0,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 6,06 ± 0,61 0,96 ΖΥΜΗ 0,45 ± ,00 0,19 ± ,00 0,79 0,00 1,00 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 2,16 ± 0,21 4,10 ± 0,89 0,99 ΖΥΜΗ 0,13 ± 0,03 0,65 0,02 0,93 ΜΑΡΤΥΡΑΣ 0,23 ± 0,03 0,91 ΖΥΜΗ 0,43 ± 0,01 0,79 0,00 1,00 Πίνακας Συνοπτική απεικόνιση του ρυθμού ανάπτυξης (cm 2 /ημέρα), της φάσης προσαρμογής (ημέρες) και του R 2 των καμπυλών ανάπτυξης των μυκήτων F 38, F 108, F 131, F 160, F 1, F 2, F 3, F 4, F 5, F 6, F 36, F 11, F 13, F 14, F 18 και F 20 54

64 3.2. ΟΠΤΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ Οι παρακάτω πίνακες έως παρουσιάζουν την ανάπτυξη των μυκήτων A. flavus F 8, A. clavatus F 9, A. puniceus F 10, A. carbonarius ITEM5010 F 26, A. carbonarius F 70, A. carbonarius F 71, A. carbonarius F 80, A. niger F 30, A. niger F 88, A. niger F 142, A. niger F 157, A. tubigensis F 31, A. westerdijkiae F 32, A. ochraceus F 33, A. westerdijkiae F 35, A. tubigensis F 37, A. tubigensis F 38, A. ibericus F 108, A. japonicus F 131, A. tubigensis F 160, P. expansum F 1, P. commune F 2, P. chrysogenum F 3, P. corylophillum F 4, P. spinulosum F 5, P. purpurogenum F 6, P. verrucosum F 36, F. oxysporum F 11, M. circineloides F 12, Alternaria sp. F 13, Ph. herbarum F 14, Tr. longibrachiatum F 16, Rh. oryzae F 17, Cl. cladosporioides F 18, Aureobacidium sp. F 20 την 3 η, 7 η και 14 η ημέρα επώασης. Το μέσο ανάπτυξης ήταν ΜΕΑ και η θερμοκρασία 25 ο C. Σε κάθε περίπτωση παρουσιάζεται και η συγκαλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae Y 33. Τα εμβόλια των μυκήτων και της ζύμης ήτα 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται και στα διαγράμματα ανάπτυξης, η ζύμη παρεμποδίζει την ανάπτυξη όλων των στελεχών μυκήτων που εξετάστηκαν στην παρούσα εργασία. 55

65 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Aspergillus flavus F Aspergillus clavatus F Aspergillus puniceus F Aspergillus carbonarius ITEM5010 F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Aspergillus flavus F 8, Aspergillus clavatus F 9, Aspergillus puniceus F 10 και Aspergillus carbonarius ITEM5010 F 26 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 56

66 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Aspergillus carbonarius F Aspergillus carbonarius F Aspergillus carbonarius F Aspergillus niger F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Aspergillus carbonarius F 70, Aspergillus carbonarius F 71, Aspergillus carbonarius F 80 και Aspergillus niger F 30 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 57

67 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Aspergillus niger F Aspergillus niger F Aspergillus niger F Aspergillus tubigensis F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Aspergillus niger F 88, Aspergillus niger F 142, Aspergillus niger F 157 και Aspergillus tubigensis F 31 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 58

68 Aspergillus westerdijkiae Aspergillus westerdijkiae ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 3 F Aspergillus ochraceus F F Aspergillus tubigensis F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Aspergillus westerdijkiae F 32, Aspergillus ochraceus F 33, Aspergillus westerdijkiae F 35 και Aspergillus tubigensis F 37 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 59

69 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Aspergillus tubigensis F Aspergillus ibericus F Aspergillus japonicus F Aspergillus tubigensis F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Aspergillus tubigensis F 38, Aspergillus ibericus F 108, Aspergillus japonicus F 131 και Aspergillus tubigensis F 160 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 60

70 Penicillium corylophillum ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Penicillium expansum F Penicillium commune F Penicillium chrysogenum F F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Penicillium expansum F 1, Penicillium commune F 2, Penicillium chrysogenum F 3 και Penicillium corylophilum F 4 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 61

71 Penicillium purpurogenum ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Penicillium spinulosum F F Penicillium verrucosum F Fusarium oxysporum F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Penicillium spinulosum F 5, Penicillium purpurogenum F 6, Penicillium verrucosum F 36 και Fusarium oxysporum F 11 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 62

72 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Mucor circineloides F Alternaria sp. F Phoma herbarum F Trichoderma longibrachiatum F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Mucor circineloides F 12, Alternaria sp. F 13, Phoma herbarum F 14 και Trichoderma longibrachiatum F 16 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 63

73 ΜΥΚΗΤΑΣ ΧΡΟΝΟΣ ΕΠΩΑΣΗΣ (ΗΜΕΡΕΣ) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Rhizopus oryzae F Cloadosporium cladosporioides F Aureobacidium sp. F Πίνακας Ανάπτυξη των μυκήτων Rhizopus oryzae F 17, Cladosporium cladosporioides F 18 και Aureobacidium sp. F 20 μετά από 3, 7 και 14 ημέρες επώασης σε μέσο ανάπτυξης ΜΕΑ στους 25 ο C. Η ανάπτυξη των μυκήτων περιορίζεται από τη ζύμη S. cerevisiae Υ 33. Οι μύκητες και η ζύμη βρίσκονται σε εμβόλια 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Επίσης οι μύκητες παρουσιάζονται και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) 64

74 3.3. ΤΟΞΙΝΕΣ Τα δείγματα της τοξίνης παρελήφθησαν την 7 η και 14 η ημέρα επώασης. Οι μύκητες των οποίων τα δείγματα αναλύθηκαν για την ανίχνευση της ωχρατοξίνης Α είναι οι εξής: A. carbonarius ITEM5010 F 26, A. carbonarius F 70, A. carbonarius F 71, A. carbonarius F 80, A. niger F 30, A. niger F 88, A. niger F 142, A. niger F 157, P. verrucosum F 36, A. tubigensis F 31, A. tubigensis F 160, A. tubigensis F 38 και A. tubigensis F 37. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι η ποσότητα της ωχρατοξίνης Α που παράχθηκε από τους παραπάνω μύκητες. Η θερμοκρασία επώασης των μυκήτων ήταν 25 o C σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ. Τα εμβόλια των μυκήτων καθώς και της ζύμης S. cerevisiae Y 33 ήταν 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα. Από τους πίνακες που ακολουθούν μπορούμε να συγκρίνουμε την ποσότητα της ΩΤΑ που παράγουν οι μύκητες παρουσία και απουσία ζύμης (Μάρτυρας) Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus carbonarius Ειδικότερα παρατηρούμε πως τα στελέχη του μύκητα A. carbonarius παράγουν τη μέγιστη ποσότητα ΩΤΑ σε σχέση με τους υπόλοιπους μύκητες. Η ΩΤΑ που παράγουν αυτά τα στελέχη κυμαίνεται από 62,01 ng/g έως 1579,30 ng/g. Συγκεκριμένα, ο A. carbonarius ITEM5010 F 26 παράγει 101,07 ng/g απουσία ζύμης και 10,43 ng/g παρουσία ζύμης στις 7 ημέρες επώασης. Ο A. carbonarius F 70 παράγει 1186,51 ng/g απουσία ζύμης και 3,35 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. carbonarius F 71 παράγει τη μέγιστη ποσότητα ΩΤΑ από όλους τους εξεταζόμενους μύκητες. Συγκεκριμένα παράγει 1579,30 ng/g απουσία ζύμης και 11,45 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. carbonarius F 80 παράγει 1034,41 ng/g απουσία ζύμης και 5,72 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ). Στις 14 ημέρες επώασης παρήχθησαν μικρότερες ποσότητες ΩΤΑ από τους μύκητες. Ειδικότερα, ο A. carbonarius ITEM5010 F 26 παράγει 62,01 ng/g απουσία ζύμης και 3,94 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. carbonarius F 70 παράγει 621,27 ng/g απουσία ζύμης και 4,03 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. carbonarius F 71 παράγει 821,77 ng/g απουσία ζύμης και 3,74 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. carbonarius F 80 παράγει 867,85 ng/g απουσία ζύμης και 4,93 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ) Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus niger Όσον αφορά τα στελέχη του μύκητα A. niger, η ΩΤΑ που παράγουν αυτά τα στελέχη κυμαίνεται από 4,34 ng/g έως 24,37 ng/g. Συγκεκριμένα, ο A. niger F 30 παράγει 13,79 ng/g απουσία ζύμης και 4,20 ng/g παρουσία ζύμης στις 7 ημέρες επώασης. Ο A. niger F 88 παράγει 6,69 ng/g απουσία ζύμης και 5,46 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. niger F 142 παράγει 12,52 ng/g απουσία ζύμης και 7,54 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. carbonarius F 157 παράγει τη 65

75 μέγιστη ποσότητα ΩΤΑ από όλα τα στελέχη του A. niger στις 7 ημέρες επώασης. Συγκεκριμένα παράγει 24,37 ng/g απουσία ζύμης και 3,51 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ). Στις 14 ημέρες επώασης παρήχθησαν μικρότερες ποσότητες ΩΤΑ από τους μύκητες. Ειδικότερα, ο A. niger F 30 παράγει 9,61 ng/g απουσία ζύμης και 9,80 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. niger F 88 παράγει 6,06 ng/g απουσία ζύμης και 9 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. niger F 142 παράγει 4,34 ng/g απουσία ζύμης και 5,08 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. niger F 157 παράγει 8,65 ng/g απουσία ζύμης και 6,67 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ) Παραγωγή ΩΤΑ από στελέχη του μύκητα Aspergillus tubigensis Όσον αφορά τα στελέχη του μύκητα A. tubigensis, η ΩΤΑ που παράγουν αυτά τα στελέχη κυμαίνεται από 4,16 ng/g έως 31,52 ng/g. Συγκεκριμένα, ο A. tubigensis F 31 παράγει τη μέγιστη ποσότητα ΩΤΑ από όλα τα στελέχη του A. tubigensis. Συγκεκριμένα παράγει 31,52 ng/g απουσία ζύμης και 4,87 ng/g παρουσία ζύμης στις 7 ημέρες επώασης. Ο A. tubigensis F 160 παράγει 4,95 ng/g απουσία ζύμης και 3,49 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. tubigensis F 38 παράγει 4,16 ng/g απουσία ζύμης και 3,34 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. tubigensis F 37 παράγει 4,25 ng/g απουσία ζύμης και 3,61 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ). Στις 14 ημέρες επώασης ο A. tubigensis F 31 παράγει 17,09 ng/g απουσία ζύμης και 4,88 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. tubigensis F 160 παράγει 15,84 ng/g απουσία ζύμης και 15,28 ng/g παρουσία ζύμης. Ο A. tubigensis F 38 παράγει 6,12 ng/g απουσία ζύμης και 4,07 ng/g παρουσία ζύμης. Τέλος, ο A. tubigensis F 37 παράγει 4,51 ng/g απουσία ζύμης και 4,26 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ) Παραγωγή ΩΤΑ από στέλεχος του μύκητα Penicillium verrucosum Όσον αφορά τo στέλεχος του μύκητα P. verrucosum F 36, η ΩΤΑ που παράγει αυτό το στέλεχος είναι 10,31 ng/g απουσία ζύμης και 4,33 ng/g παρουσία ζύμης στις 7 ημέρες επώασης (Διαγράμματα ). Στις 14 ημέρες επώασης παράγεται περισσότερη ποσότητα ΩΤΑ από το στέλεχος. Συγκεκριμένα παράγει 12,22 ng/g απουσία ζύμης και 5,54 ng/g παρουσία ζύμης (Διαγράμματα ). 66

76 ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) Days Days Διαγράμματα Παρουσιάζεται η ποσότητα της ωχρατοξίνης Α που παράχθηκε στις 7 και 14 ημέρες επώασης σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ στους 25 ο C, κατά τη διάρκεια μονοκαλλιέργειας από τους μύκητες Aspergillus carbonarius ITEM5010 F 26 ( ), Aspergillus carbonarius F 70 ( ), Aspergillus carbonarius F 71 ( ) και Aspergillus carbonarius F 80 ( ) και συγκαλλιέργειας με τη ζύμη S. cerevisiae από τους μύκητες F 26 ( ), F 70 ( ), F 71 ( ) και F 80 ( ) με εμβόλιο μυκήτων και ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 67

77 ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) Days Days Διαγράμματα Παρουσιάζεται η ποσότητα της ωχρατοξίνης Α που παράχθηκε στις 7 και 14 ημέρες επώασης σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ στους 25 ο C, κατά τη διάρκεια μονοκαλλιέργειας από τους μύκητες Aspergillus niger F 30 ( ), Aspergillus niger F 88 ( ), Aspergillus niger F 142 ( ) και Aspergillus niger F 157 ( ) και συγκαλλιέργειας με τη ζύμη S. cerevisiae από τους μύκητες F 30 ( ), F 88 ( ), F 142 ( ) και F 157 ( ) με εμβόλιο μυκήτων και ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 68

78 ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) ΩΧΡΑΤΟΞΙΝΗ Α (ng/g) Days Days Διαγράμματα Παρουσιάζεται η ποσότητα της ωχρατοξίνης Α που παράχθηκε στις 7 και 14 ημέρες επώασης σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ στους 25 ο C, κατά τη διάρκεια μονοκαλλιέργειας από τους μύκητες Penicillium verrucosum F 36 ( ), Aspergillus tubigensis F 31 ( ), Aspergillus tubigensis F 160 ( ), Aspergillus tubigensis F 38 ( ) και Aspergillus tubigensis F 37 ( ) και συγκαλλιέργειας με τη ζύμη S. cerevisiae από τους μύκητες F 36 ( ), F 31 ( ), F 160 ( ), F 38 ( ) και F 37 ( ) με εμβόλιο μυκήτων και ζύμης 10 5 conidia/ml και cfu/ml, αντίστοιχα 69

79 Μύκητας Aspergillus carbonarius ITEM5010 F 26 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Χρόνος επώασης (ημέρες) Ωχρατοξίνη Α (ng/g) 101,07 10,43 Aspergillus carbonarius F 70 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 1186,51 3,35 Aspergillus carbonarius F 71 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 1579,30 11,45 Aspergillus carbonarius F 80 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 1034,41 5,72 Aspergillus niger F 30 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 13,79 4,20 Aspergillus niger F 88 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 6,69 5,46 Aspergillus niger F 142 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 7 12,52 7,54 Aspergillus niger F 157 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 24,37 3,51 Penicillium verrucosum F 36 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 10,31 4,33 Aspergillus tubigensis F 31 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 31,52 4,87 Aspergillus tubigensis F 160 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ ,49 Aspergillus tubigensis F 38 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 4,16 3,34 Aspergillus tubigensis F 37 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 4,25 3,61 Πίνακας Παρουσίαση της ποσότητας Ωχρατοξίνης Α (ng/g) που παράγουν οι μύκητες ITEM5010 F 26, F 70, F 71, F 80, F 30, F 88, F 142, F 157, F 36, F 31, F 160, F 38 και F 37, σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ στους 25 o C στις 7 ημέρες επώασης 70

80 Μύκητας Aspergillus carbonarius ITEM5010 F 26 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ Χρόνος επώασης (ημέρες) Ωχρατοξίνη Α (ng/g) 62,01 3,94 Aspergillus carbonarius F 70 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 621,27 4,03 Aspergillus carbonarius F 71 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 821,77 3,74 Aspergillus carbonarius F 80 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 867,85 4,93 Aspergillus niger F 30 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 9,61 9,80 Aspergillus niger F 88 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 6,06 9,00 Aspergillus niger F 142 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 14 4,34 5,08 Aspergillus niger F 157 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 8,65 6,67 Penicillium verrucosum F 36 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 12,22 5,54 Aspergillus tubigensis F 31 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 17,09 4,88 Aspergillus tubigensis F 160 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 15,84 15,28 Aspergillus tubigensis F 38 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 6,12 4,07 Aspergillus tubigensis F 37 ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΖΥΜΗ 4,51 4,26 Πίνακας Παρουσίαση της ποσότητας Ωχρατοξίνης Α (ng/g) που παράγουν οι μύκητες ITEM5010 F 26, F 70, F 71, F 80, F 30, F 88, F 142, F 157, F 36, F 31, F 160, F 38 και F 37, σε θρεπτικό υπόστρωμα ΜΕΑ στους 25 o C στις 14 ημέρες επώασης 71

81 3.4. ΣΥΝΤΗΡΗΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΕΠΕΜΒΑΣΗΣ Τα παρακάτω διαγράμματα και παρουσιάζουν την συντήρηση δειγμάτων Κορινθιακής σταφίδας και καρπό κριθαριού για 28 ημέρες, αντίστοιχα. Παρουσιάζονται κατά σειρά η σταφίδα χωρίς καμία επέμβαση ( Α), τα δύο δείγματα αναφοράς ήτοι η αποστραγγισμένη σταφίδα μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer ( B) και μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer ( C) καθώς και οι διαφορετικές επεμβάσεις που πραγματοποιήθηκαν. Συγκεκριμένα παρουσιάζονται η σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,008 g/l ( D), αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ( Ε) και τέλος μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ( F). Όσον αφορά τον καρπό κριθαριού, παρουσιάζονται κατά σειρά ο καρπός κριθαριού χωρίς καμία επέμβαση ( Α), τα δύο δείγματα αναφοράς ήτοι ο αποστραγγισμένος καρπός κριθαριού μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer ( B) και μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer ( C) καθώς και οι διαφορετικές επεμβάσεις που πραγματοποιήθηκαν. Συγκεκριμένα παρουσιάζονται ο καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l ( D), αποστραγγισμένος μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ( Ε) και τέλος μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ( F). Η θερμοκρασία συντήρησης των δειγμάτων ήταν 25 ο C. Σε κάθε περίπτωση τα εμβόλια της ζύμης ήταν 10 6 cfu/ml Συντήρηση δειγμάτων Κορινθιακής σταφίδας παρουσία και απουσία ζύμης με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης Όπως φαίνεται στα διαγράμματα συντήρησης των δειγμάτων, η ζύμη παρεμποδίζει την ανάπτυξη των μυκήτων σε όσα δείγματα εμβολιάστηκαν σε σχέση με τα δείγματα-αναφοράς. Συγκεκριμένα, στην Κορινθιακή σταφίδα όπου έγινε προσθήκη του αντιβιοτικού ναταμυκίνη ( D) δεν παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C). Η ΟΒΧ (Ολική Βακτηριακή Χλωρίδα) αρχικά αυξήθηκε φτάνοντας τους 5,54 log 10 cfu/g την 7 η ημέρα συντήρησης και στη συνέχεια μειώθηκε μέχρι τους 2 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα συντήρησης. Ο πληθυσμός των μυκήτων 72

82 αυξήθηκε μέχρι τους 6,56 log 10 cfu/g και μειώθηκε στους 5,53 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες.. Ο πληθυσμός των ζυμών παρέμεινε σταθερός στους 4 log 10 cfu/g μέχρι τις 14 ημέρες και στη συνέχεια αυξήθηκε στους 7,54 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες συντήρησης. Τέλος η ΟΜΧ (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα) αυξήθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g στους 7,57 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Εν αντιθέσει με την συγκεκριμένη επέμβαση, στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C) παρατηρείται μια σταθερότηττα στην ΟΒΧ στους 2 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες συντήρησης. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε στους 7,47 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Σχετικά με τις ζύμες αυξήθηκαν μέχρι τους 7,85 log 10 cfu/g στις 21 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκαν στους 6,97 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 5,95 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 7,98 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Στο δείγμα Κορινθιακής σταφίδας, όπου πραγματοποιήθηκε εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης ( F), παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C). Συγκεκριμένα ο πληθυσμός των μυκήτων μειώθηκε από τους 5 log 10 cfu/g στους 2 log 10 cfu/g στις 3 ημέρες συντήρησης και αυξήθηκε από την 21 η έως την 28 η ημέρα στους 4 log 10 cfu/g. Η ΟΒΧ παρέμεινε σταθερή μεταξύ των 2 log 10 cfu/g και 2,6 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκαν από τους 7 log 10 cfu/g στους 8,29 log 10 cfu/g στις 21 ημέρες και τη συνέχεια μειώθηκαν στους 5,39 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα συντήρησης. Τέλος, η ΟΜΧ παρέμεινε μεταξύ των 7 και 8,26 log 10 cfu/g και μειώθηκε στους 5,37 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Εν αντιθέσει με την συγκεκριμένη επέμβαση, στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C) παρατηρείται μια σταθερότητα στην ΟΒΧ στους 2 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες συντήρησης. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε στους 7,47 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Σχετικά με τις ζύμες αυξήθηκαν μέχρι τους 7,85 log 10 cfu/g στις 21 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκαν στους 6,97 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 5,95 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 7,98 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Στο δείγμα Κορινθιακής σταφίδας, όπου πραγματοποιήθηκε αποστράγγιση μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης ( Ε), παρατηρήθηκε επίσης παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( Β). Συγκεκριμένα ο πληθυσμός των μυκήτων μειώθηκε από τους 5,04 log 10 cfu/g στους 4,67 log 10 cfu/g στις 10 ημέρες συντήρησης και μειώθηκε περαιτέρω στους 2,78 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ αυξήθηκε από τους 2 log 10 cfu/g στους 3,42 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των ζυμών παρέμεινε σταθερός μεταξύ των 6,99 log 10 cfu/g και 6,16 log 10 cfu/g μέχρι τις 14 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκαν στους 5,17 log 10 cfu/g μέχρι την 28 η ημέρα συντήρησης. Τέλος, η ΟΜΧ μειώθηκε από τους 6,78 log 10 cfu/g στους 5,68 log 10 cfu/g κατά τη διάρκεια των 28 ημερών. Εν αντιθέσει με την συγκεκριμένη επέμβαση, στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς 73

83 ( Β) παρατηρείται μια σταθερότητα στον πληθυσμό των μυκήτων μεταξύ των 5,73 και 5,40 log 10 cfu/g τις 21 πρώτες ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκε στους 4,10 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ αυξήθηκε από τους 2,7 log 10 cfu/g στους 3,98 log 10 cfu/g στις 7 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκε στους 2 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Σχετικά με τις ζύμες, παρέμεινε σταθερός ο πληθυσμός τους στους 2 log 10 cfu/g καθ όλη τη διάρκεια της συντήρησης. Τέλος, η ΟΜΧ μειώθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 3,99 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, στο δείγμα Κορινθιακής σταφίδας όπου δεν πραγματοποιήθηκε καμία επέμβαση ( Α), ο πληθυσμός των μυκήτων μειώθηκε από τους 5,73 log 10 cfu/g στους 4,32 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ παρέμεινε σταθερή μεταξύ των 2,70 log 10 cfu/g και 2,60 log 10 cfu/g όπως και ο πληθυσμός των ζυμών όπου παρέμεινε σταθερός στους 2 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες. Η ΟΜΧ μειώθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g στους 4,57 log 10 cfu/g μέχρι την 28 η ημέρα συντήρησης Συντήρηση δειγμάτων καρπού κριθαριού παρουσία και απουσία ζύμης με διαφορετικές μεθόδους επέμβασης Όπως φαίνεται στα διαγράμματα συντήρησης των δειγμάτων, η ζύμη παρεμποδίζει την ανάπτυξη των μυκήτων σε όσα δείγματα εμβολιάστηκαν σε σχέση με τα δείγματα-αναφοράς. Συγκεκριμένα, στον καρπό κριθαριού όπου έγινε προσθήκη του αντιβιοτικού ναταμυκίνη ( D) δεν παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C). Η ΟΒΧ (Ολική Βακτηριακή Χλωρίδα) αυξήθηκε από τους 5,77 log 10 cfu/g φτάνοντας τους 10,62 log 10 cfu/g την 17 η ημέρα συντήρησης και στη συνέχεια μειώθηκε στους 8,95 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα συντήρησης. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε από τους 4,45 log 10 cfu/g μέχρι τους 9,22 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε από τους 5,39 log 10 cfu/g στους 8,10 log 10 cfu/g στις 14 ημέρες συντήρησης και στη συνέχεια μειώθηκε μέχρι τους 7,08 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Τέλος η ΟΜΧ (Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα) αυξήθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g στους 10,23 log 10 cfu/g στις 14 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκε στους 8,70 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C) παρατηρείται αύξηση στην ΟΒΧ από τους 5,77 log 10 cfu/g στους 10,34 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε από τους 4,45 log 10 cfu/g στους 7,80 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Σχετικά με τις ζύμες αυξήθηκαν από τους 5,39 log 10 cfu/g μέχρι τους 7,15 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 10,03 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. 74

84 Στο δείγμα καρπού κριθαριού, όπου πραγματοποιήθηκε εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης ( F), παρατηρήθηκε παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C). Συγκεκριμένα ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε από τους 2 log 10 cfu/g στους 7,79 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες συντήρησης. Η ΟΒΧ αυξήθηκε από τους 5 log 10 cfu/g στους 10,82 log 10 cfu/g στις 17 ημέρες και στη συνέχεια μειώθηκε στους 9,16 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των ζυμών αυξήθηκε από τους 6,80 log 10 cfu/g στους 8,34 log 10 cfu/g στις 10 ημέρες και τη συνέχεια μειώθηκαν στους 5,48 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα συντήρησης. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 6,92 log 10 cfu/g στους 10,85 log 10 cfu/g στις 17 ημέρες και έπειτα μειώθηκε στους 9,09 log 10 cfu/g μέχρι την 28 η ημέρα. Στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( C) παρατηρείται αύξηση στην ΟΒΧ από τους 5,77 log 10 cfu/g στους 10,34 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των μυκήτων αυξήθηκε από τους 4,45 log 10 cfu/g στους 7,80 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Σχετικά με τις ζύμες αυξήθηκαν από τους 5,39 log 10 cfu/g μέχρι τους 7,15 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 10,03 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Στο δείγμα καρπού κριθαριού, όπου πραγματοποιήθηκε αποστράγγιση μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης ( Ε), παρατηρήθηκε επίσης παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με το αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( Β). Συγκεκριμένα ο πληθυσμός των μυκήτων παρέμεινε σταθερός μεταξύ των 6,48 log 10 cfu/g και 7 log 10 cfu/g στις 14 ημέρες συντήρησης και έπειτα αυξήθηκε στους 8,16 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ αυξήθηκε από τους 5,90 log 10 cfu/g στους 10,10 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Ο πληθυσμός των ζυμών κυμάνθηκε μεταξύ των 7 log 10 cfu/g και 7,94 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες συντήρησης. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 6,98 log 10 cfu/g στους 9,99 log 10 cfu/g κατά τη διάρκεια των 28 ημερών. Στο αντίστοιχο δείγμα αναφοράς ( Β) παρατηρείται αύξηση στον πληθυσμό των μυκήτων από τους 4,48 log 10 cfu/g στους 7,85 log 10 cfu/g μέχρι τις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ αυξήθηκε από τους 5,77 log 10 cfu/g στους 8,79 log 10 cfu/g καθ όλη τη διάρκεια της συντήρησης. Σχετικά με τις ζύμες, παρέμεινε σταθερός ο πληθυσμός τους μεταξύ των 5,39 log 10 cfu/g και 5,95 log 10 cfu/g στις 21 ημέρες και αυξήθηκε στους 7,26 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Τέλος, η ΟΜΧ αυξήθηκε από τους 5,96 log 10 cfu/g, που ήταν αρχικά, στους 8,61 log 10 cfu/g την 28 η ημέρα. Τέλος, στο δείγμα καρπού κριθαριού όπου δεν πραγματοποιήθηκε καμία επέμβαση ( Α), ο πληθυσμός των μυκήτων μειώθηκε από τους 4,45 log 10 cfu/g στους 3,46 log 10 cfu/g στις 28 ημέρες. Η ΟΒΧ παρέμεινε σταθερή μεταξύ των 5,77 log 10 cfu/g και 5 log 10 cfu/g όπως και ο πληθυσμός των ζυμών όπου παρέμεινε σταθερός μεταξύ των 5,39 log 10 cfu/g και 5 log 10 cfu/g και τις 28 ημέρες. Η ΟΜΧ κυμάνθηκε μεταξύ των 5,96 log 10 cfu/g και 5,23 log 10 cfu/g μέχρι την 28 η ημέρα συντήρησης. 75

85 Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g 12 A 12 B 12 C Days Days Days 12 D 12 E 12 F Days Days Days Διαγράμματα Α: Κορινθιακή σταφίδα χωρίς καμία επέμβαση ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ) Β: Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), C: Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), D: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), E: Κορινθιακή σταφίδα αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), F: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), μετά από 28 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 76

86 Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g Log 10 CFU/g 12 A 12 B 12 C Days Days Days 12 D 12 E 12 F Days Days Days Διαγράμματα Α: Καρπός κριθαριού χωρίς καμία επέμβαση ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ) Β: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), C: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), D: Καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), E: Καρπός κριθαριού αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), F: Καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml ΟΜΧ ( ), ΟΒΧ ( ), ζύμες ( ) και μύκητες ( ), μετά από 28 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 77

87 3.5. ΟΠΤΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΤΗΣ ΣΥΝΤΗΡΗΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΟΡΙΝΘΙΑΚΗΣ ΣΤΑΦΙΔΑΣ ΚΑΙ ΚΑΡΠΟΥ ΚΡΙΘΑΡΙΟΥ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΥΣΙΑ ΖΥΜΗΣ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΕΠΕΜΒΑΣΗΣ Οι παρακάτω εικόνες και παρουσιάζουν την ανάπτυξη των μυκήτων σε δείγματα Κορινθιακής σταφίδας κατά την 7 η και 14 η ημέρα συντήρησης, αντίστοιχα. Παρουσιάζονται κατά σειρά τα δύο δείγματα αναφοράς ήτοι η αποστραγγισμένη σταφίδα μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer (Α) και μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer (Β) καθώς και οι 4 διαφορετικές επεμβάσεις που πραγματοποιήθηκαν. Συγκεκριμένα παρουσιάζονται η σταφίδα χωρίς καμία επέμβαση (C), αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml (D), μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml (E) και μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l (F). Τα ίδια ισχύουν και για τα δείγματα του καρπού κριθαριού που παρουσιάζονται στις εικόνες και για την 7 η και 14 η ημέρα συντήρησης, αντίστοιχα. Παρόμοια εικόνα παρατηρήθηκε κατά την 21 η και 28 η ημέρα συντήρησης τόσο για την Κορινθιακή σταφίδα όσο και για τον καρπό κριθαριού. Η θερμοκρασία συντήρησης ήταν 25 ο C. Σε κάθε περίπτωση τα εμβόλια της ζύμης ήταν 10 6 cfu/ml. Όπως φαίνεται και στα διαγράμματα συντήρησης των δειγμάτων, η ζύμη παρεμποδίζει την ανάπτυξη των μυκήτων σε όσα δείγματα εμβολιάστηκαν σε σχέση με τα δείγματα-αναφοράς. Αντίθετα η προσθήκη του αντιβιοτικού ναταμυκίνη έδειξε πως δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη των μυκήτων στα δείγματα είχε προστεθεί. Συγκεκριμένα, στην Κορινθιακή σταφίδα παρατηρείται μεγαλύτερη παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των μυκήτων σε σχέση με τον καρπό κριθαριού. 78

88 A B C D E F Εικόνα Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer, B: Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer, C: Κορινθιακή σταφίδα χωρίς καμία επέμβαση, D: Κορινθιακή σταφίδα αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml, E: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml και F: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l, μετά από 7 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 79

89 A B C D E F Εικόνα A: Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer, B: Κορινθιακή σταφίδα (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer, C: Κορινθιακή σταφίδα χωρίς καμία επέμβαση, D: Κορινθιακή σταφίδα αποστραγγισμένη μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml, E: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml και F: Κορινθιακή σταφίδα μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l, μετά από 14 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 80

90 A B C D E F Εικόνα A: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) αποστραγγισμένος μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer, B: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer, C: Καρπός κριθαριού χωρίς καμία επέμβαση, D: Καρπός κριθαριού αποστραγγισμένος μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml, E: Καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml και F: Καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l, μετά από 7 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 81

91 A B C D E F Εικόνα A: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) αποστραγγισμένος μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε αποστειρωμένο ορό Ringer, B: Καρπός κριθαριού (Μάρτυρας) μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο ορό Ringer, C: Καρπός κριθαριού χωρίς καμία επέμβαση, D: Καρπός κριθαριού αποστραγγισμένος μετά από 30 λεπτά εμβάπτισης σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml, E: Καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε διάλυμα ζύμης S. cerevisiae Y 33 συγκέντρωσης 10 6 cfu/ml και F: καρπός κριθαριού μετά από εμβάπτιση και παραμονή σε αποστειρωμένο διάλυμα ναταμυκίνης συγκέντρωσης 0,0088 g/l, μετά από 14 ημέρες συντήρησης στους 25 ο C, αντίστοιχα 82