Λειτουργικές και μορφολογικές μεταβολές του περιτοναίου. υπό την επίδραση γαλακτικών και διττανθρακικών

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ Διευθυντής: Καθηγητής Δ. Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ Λειτουργικές και μορφολογικές μεταβολές του περιτοναίου υπό την επίδραση γαλακτικών και διττανθρακικών διαλυμάτων περιτοναϊκής κάθαρσης Πρωτεωμική ανάλυση περιτοναϊκού διαλύματος για την ανίχνευση βιοδεικτών περιτοναϊκής ίνωσης και σκληρυντικής περιτονίτιδας Διδακτορική Διατριβή ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Γ. ΖΑΒΒΟΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2018

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΟΣ ΤΟΜΕΑΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΙΚΟ ΚΕΝΤΡΟ Διευθυντής: Καθηγητής Δ. Σ. ΓΟΥΜΕΝΟΣ Λειτουργικές και μορφολογικές μεταβολές του περιτοναίου υπό την επίδραση γαλακτικών και διττανθρακικών διαλυμάτων περιτοναϊκής κάθαρσης Πρωτεωμική ανάλυση περιτοναϊκού διαλύματος για την ανίχνευση βιοδεικτών περιτοναϊκής ίνωσης και σκληρυντικής περιτονίτιδας Διδακτορική Διατριβή ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ Γ. ΖΑΒΒΟΣ ΝΕΦΡΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Δημήτριος Σ. Γούμενος Καθηγητής Παθολογίας-Νεφρολογίας Πανεπιστημίου Πατρών, Επιβλέπων Καθηγητής Κωνσταντίνος Φουρτούνας Αναπληρωτής Καθηγητής Παθολογίας-Νεφρολογίας Πανεπιστημίου Θεσσαλίας, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Ιωάννης Μαρούλης Αναπληρωτής Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Δημήτριος Σ. Γούμενος Καθηγητής Παθολογίας-Νεφρολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Επιβλέπων Καθηγητής Χαράλαμπος Γώγος Καθηγητής Παθολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Σταμάτιος-Νικόλαος Λιόσης Καθηγητής Παθολογίας-Ρευματολογίας Πανεπιστημίου Πατρών - Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Μάρκος Μαραγκός Καθηγητής Παθολογίας-Λοιμωδών Νοσημάτων Πανεπιστημίου Πατρών - Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Ιωάννης Κεχαγιάς Αναπληρωτής Καθηγητής Χειρουργικής Πανεπιστημίου Πατρών - Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Ευάγγελος Παπαχρήστου Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας-Νεφρολογίας Πανεπιστημίου Πατρών - Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής Μάριος Παπασωτηρίου Επίκουρος Καθηγητής Παθολογίας-Νεφρολογίας Πανεπιστημίου Πατρών - Μέλος επταμελούς εξεταστικής επιτροπής 3

4 Στην Αιμιλία και τον Γιώργο Στους γονείς μου Στους Δασκάλους μου 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ 8 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ 9 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ ΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ ΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΟΥΡΑΙΜΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ 18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Γενικές αρχές Ενδείξεις και Αντενδείξεις Περιτοναϊκής Κάθαρσης Πλεονεκτήματα περιτοναϊκής κάθαρσης Συνοπτική ιστορική αναδρομή ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΙΟΥ Μακροσκοπική ανατομία Αιμάτωση και Λεμφική παροχέτευση Μικροσκοπική ανατομία ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Μοντέλο τριών πόρων Μοντέλο κατανομής Φυσιολογία της μεταφοράς ουσιών και ύδατος Κλινική εκτίμηση της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Περιτοναϊκός Καθετήρας Διαλύματα Περιτοναϊκής Κάθαρσης Διαλύματα δεξτρόζης Διάλυμα ικοδεξτρίνης Διάλυμα αμινοξέων ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Συνεχής Φορητή Περιτοναϊκή Κάθαρση (ΣΦΠΚ) Αυτοματοποιημένη Περιτοναϊκή Κάθαρση (ΑΠΚ) 43 5

6 2.6. ΕΠΑΡΚΕΙΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Εβδομαδιαία κάθαρση ουρίας Εβδομαδιαία κάθαρση κρεατινίνης ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΝΤΑΓΟΓΡΑΦΗΣΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ ΕΠΙΠΛΟΚΕΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ ΙΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΙΟΥ (ΠΙ) Παθοφυσιολογία της ίνωσης του περιτοναίου Διάγνωση της ίνωσης του περιτοναίου ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ 58 ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Πληθυσμός μελέτης επιλογή ασθενών Η μελέτη GLOBAL (Global Fluid Study) Ομάδα ασθενών του ΠΓΝ Πατρών Συλλογή κλινικών και δημογραφικών δεδομένων Συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων Προετοιμασία επεξεργασία δειγμάτων για την πρωτεωμική ανάλυση Ισοηλεκτρική εστίαση (ηλεκτροφόρηση πρώτης διάστασης) Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE (ηλεκτροφόρηση δεύτερης διάστασης) Χρώση με άργυρο Απεικόνιση gel Εξόρυξη πρωτεώματος (proteome mining) Κατιονική θραυσματοποίηση πεπτιδίων Strong Cation Exchange 69 (SCX) Fractionation of Peptides Φασματογραφία μάζας Mass Spectrometry (MS) Ανάλυση δεδομένων φασματογραφίας μάζας Ποσοτικός προσδιορισμός των dermatopontin 71 και col1a1 στο περιτοναϊκό διάλυμα Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων από τον 71 προσδιορισμό των dermatopontin και col1a1 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Επιλογή ασθενών από τη μελέτη GLOBAL 72 6

7 Επιλογή ασθενών ΠΓΝ Πατρών ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΣΥΜΒΑΙΝΟΥΝ ΣΤΟ 79 ΠΡΩΤΕΩΜΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ, ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΤΑΘΕΡΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ 4.4. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΣΥΜΒΑΙΝΟΥΝ ΣΤΟ 82 ΠΡΩΤΕΩΜΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ, ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΠΟΥ ΕΚΔΗΛΩΣΑΝ ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ 4.5. ΕΞΟΡΥΞΗ ΠΡΩΤΕΩΜΑΤΟΣ (PROTEOME MINING) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΕ ΧΑΜΗΛΗ 88 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΑΛΛΟΝΤΑΙ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΠΟΥ ΕΚΔΗΛΩΣΑΝ ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ 4.7. ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ-α1 ΤΟΥ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ (Ι) 90 ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΕΡΜΑΤΟΠΟΝΤΙΝΗΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΥΠΟΒΑΛΛΟΝΤΑΙ ΣΕ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ Δερματοποντίνη Αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι 95 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗΝ ΠΚ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 114 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 115 SUMMARY 117 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 118 ΣΥΝΤΟΜΕΥΣΕΙΣ 127 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΠΙΝΑΚΩΝ 129 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ 130 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ 133 7

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η περιτοναϊκή κάθαρση αποτελεί μία από τις μεθόδους υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας για τους ασθενείς με χρόνια νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Αν και η μέθοδος είναι τουλάχιστον ισοδύναμη της αιμοκάθαρσης ως προς την αποτελεσματικότητά της και την επιβίωση των ασθενών, η χρήση της επί μακρό χρονικό διάστημα περιορίζεται από την εμφάνιση επιπλοκών όπως η περιτοναϊκή ίνωση και, σπανιότερα, η σκληρυντική περιτονίτιδα. Η αιτιολογία των επιπλοκών αυτών δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, ωστόσο θεωρείται ότι είναι εν μέρει αποτέλεσμα της χρόνιας έκθεσης του περιτοναίου στα μη βιοσυμβατά συστατικά των διαλυμάτων περιτοναϊκής κάθαρσης. Η ανεύρεση βιοδεικτών στο περιτοναϊκό διάλυμα οι οποίοι θα μπορούσαν να προβλέψουν την εμφάνιση των επιπλοκών αυτών, θα συνέβαλε στην καλύτερη επιλογή/διαστρωμάτωση των ασθενών, στην έγκαιρη διάγνωση, στην καλύτερη κατανόηση της παθογένειας και πιθανώς στην ανεύρεση νέων θεραπευτικών στόχων. Στην παρούσα διατριβή, χρησιμοποιήσαμε μεθόδους πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος από ασθενείς που υποβάλλονταν σε περιτοναϊκή κάθαρση για διαφορετικά χρονικά διαστήματα, ορισμένοι εκ των οποίων είχαν εμφανίσει ίνωση του περιτοναίου και σκληρυντική περιτονίτιδα και προσπαθήσαμε να εντοπίσουμε τις μεταβολές που συμβαίνουν στο πρωτέωμα του περιτοναϊκου διαλύματος προϊόντος του χρόνου. Επιπλέον, αναπτύξαμε μία πρωτοπόρο μεθοδολογία για την βελτίωση των τεχνικών πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος, η οποία δεν είχε χρησιμοποιηθεί ποτέ στο παρελθόν στη μελέτη του περιτοναϊκού διαλύματος. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από ασθενείς που υποβάλλονταν σε περιτοναϊκή κάθαρση στο ΠΓΝ Πατρών, καθώς και δείγματα από τη μελέτη GLOBAL Fluid Study, μία πολυκεντρική, προοπτική μελέτη κοόρτης η οποία αποτελεί από τις μεγαλύτερες συλλογές δειγμάτων περιτοναϊκού διαλύματος παγκοσμίως. Τα πειράματα πρωτεωμικής ανάλυσης πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο του Νεφρολογικού Ινστιτούτου του Πανεπιστημίου του Sheffield, ενώ ορισμένα δευτερεύοντα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο του Νεφρολογικού Κέντρου του ΠΓΝ Πατρών. 8

9 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τον Καθηγητή Δημήτριο Γούμενο, Διευθυντή του Νεφρολογικού Κέντρου του ΠΓΝ Πατρών και επιβλέποντα Καθηγητή στην παρούσα διατριβή. Ο Καθηγητής κύριος Γούμενος, αρχικά με ενέπνευσε να ασχοληθώ ερευνητικά με την περιτοναϊκή κάθαρση, στη συνέχεια μου ανέθεσε την εκπόνηση της συγκεκριμένης μελέτης, μου προσέφερε την ευκαιρία να μετεκπαιδευθώ στο Νεφρολογικό Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου του Sheffield, ενώ παρείχε την αμέριστη στήριξή του καθ όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της μελέτης. Επιπλέον, υπήρξε μοναδικός Δάσκαλος καθ όλη τη διάρκεια της ειδίκευσής μου στη Νεφρολογία, όπου εκτός από την ευρεία επιστημονική και κλινική του γνώση, μου μετέδωσε το ήθος του και την σύγχρονη και εξωστρεφή επιστημονική και ερευνητική του αντίληψη. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Κωνσταντίνο Φουρτούνα, για την πολύπλευρη αρωγή του και τη βαθιά επιστημονική και κλινική γνώση την οποία μου μετέδωσε, καθώς και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κύριο Ιωάννη Μαρούλη, για τις πολύτιμες συμβουλές και τη στήριξή του κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω προς τον Καθηγητή Timothy Johnson, Διευθυντή του Εργαστηρίου του Νεφρολογικού Ινστιτούτου του Πανεπιστημιου του Sheffield, για τη μοναδική ευκαιρία που μου παρείχε να εργαστώ στο εργαστήριό του και τη συνεχή του βοήθεια έως την ολοκλήρωση της μελέτης, καθώς και τη σημαντική επιρροή που μου άσκησε η βαθιά επιστημονική του γνώση, η οξυδέρκειά του και το ήθος του. Ευχαριστώ επίσης την κυρία Ειρήνη Σαββιδάκη, για τη μοναδική καθοδήγηση που μου παρείχε στα θέματα της περιτοναϊκής κάθαρσης, αλλά και τη Διευθύντρια του Νεφρολογικού Κέντρου του ΠΓΝ Πατρών, κυρία Παντελίτσα Καλλιακμάνη και τον Επίκουρο Καθηγητή κύριο Ευάγγελο Παπαχρήστου, για τις γνώσεις και την εμπειρία που μου μετέδωσαν κατά τα 4 ετη της ειδίκευσής μου στη Νεφρολογία, παράλληλα με την εκπόνηση της διδακτορικής μου διατριβής. 9

10 Επίσης, ευχαριστώ θερμά τη Δήμητρα Καλαβριζιώτου για τη βοήθειά της στα πειράματα που διενεργήθηκαν στο ΠΓΝ Πατρών και το προσωπικό του εργαστηρίου του Πανεπιστημίου του Sheffield για την εξαίρετη συνεργασία τους. Τέλος, ευχαριστώ θερμά το νοσηλευτικό προσωπικό της Νεφρολογικής Κλινικής και της Μονάδας Περιτοναϊκής Κάθαρσης του ΠΓΝ Πατρών για την εξαίρετη συνεργασία τους και την πολύτιμη βοήθειά τους στη συγκέντρωση του υλικού της μελέτης. 10

11 Ι. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ 1.1. ΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Ως Χρόνια Νεφρική Νόσος (ΧΝΝ) ορίζεται κάθε διαταραχή της δομής ή της λειτουργίας των νεφρών η οποία χρονολογείται για τουλάχιστον 3 μήνες και η οποία έχει επιπτώσεις στην υγεία του πάσχοντος (KDIGO 2012). Για τη διάγνωση της ΧΝΝ απαιτείται η παρουσία τουλάχιστον ενός από τα κριτήρια του αναφέρονται στον πίνακα 1. Πίνακας 1: Κριτήρια διάγνωσης ΧΝΝ (οποιοδήποτε από τα κάτωθι για >3 μήνες) Δείκτες νεφρικής βλάβης Αλβουμινουρία [AER 30mg/24ωρο ή ACR 30mg/g ( 3mg/mmol)] Διαταραχές ιζήματος ούρων Διαταραχές σωληναριακής λειτουργίας Ιστολογικές αλλοιώσεις Δομικές αλλοιώσεις διαγνωσθείσες με απεικονιστικές μεθόδους Μεταμόσχευση νεφρού Μειωμένος GFR GFR <60ml/min/1,73m 2 GFR: Glomerular Filtration Rate (Ρυθμός Σπειραματικής Διήθησης) 1.2. ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Ο ρυθμός σπειραματικής διήθησης [Glomerular Filtration Rate (GFR)], αποτελεί κριτήριο διάγνωσης της ΧΝΝ, αλλά και τον βασικό δείκτη για την εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας. Η σταδιοποίηση της ΧΝΝ λαμβάνει υπ όψιν την αιτία της ΧΝΝ, τον GFR και την αλβουμινουρία. Με βάση τον GFR, η ΧΝΝ ταξινομείται σε 5 (πέντε) στάδια (βλ. Πίνακας 2). 12

13 Πίνακας 2: Στάδια ΧΝΝ βάσει του GFR Στάδιο GFR (ml/min/1,73m 2 ) Σχόλια G1 >90 Φυσιολογικός ή αυξημένος G Ήπια μείωση* G3a Ήπια/μέτρια μείωση G3b Μέτρια/Σοβαρή μείωση G Σοβαρή μείωση G5 <15 Νεφρική ανεπάρκεια * Σε σχέση με τον GFR νεαρού, υγιούς ενήλικα Στα στάδια G1 και G2, η διάγνωση ΧΝΝ τίθεται μόνο εάν συνυπάρχουν ενδείξεις νεφρικής βλάβης. 3). Με βάση την αλβουμινουρία, η ΧΝΝ ταξινομείται σε 3 (τρεις) κατηγορίες (βλ. Πίνακας Πίνακας 3: Ταξινόμηση ΧΝΝ βάσει της αλβουμινουρίας Κατηγορία AER ACR ACR Σχόλια (mg/24ωρο) (mg/mmol) (mg/g) Α1 <30 <3 <30 Φυσιολογική Α Μέτρια αύξηση* Α3 >300 >30 >300 Σοβαρή αύξηση AER: Albumin Excretion Rate, ACR: Albumin to Creatinine Ratio * Σε σχέση με την τιμή νεαρού, υγιούς ενήλικα Η χρήση των δύο ως άνω σταδιοποιήσεων σε συνδυασμό, χρησιμοποιείται για την αδρή εκτίμηση του κινδύνου εξέλιξης της νεφρικής νόσου ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Η ΧΝΝ αποτελεί παγκόσμιο πρόβλημα. Στις Η.Π.Α. υπολογίζεται ότι περίπου το 10% του ενήλικου πληθυσμού πάσχει από κάποιου βαθμού ΧΝΝ και η επίπτωση της ΧΝΝ αυξάνεται με ρυθμό 5-8% ετησίως (NKUDIC). Το έτος 2013, η ΧΝΝ αποτέλεσε την 9 η κατά σειρά αιτία θανάτου στις Η.Π.Α. (Xu et al., 2016). Σύμφωνα με τα στοιχεία της 13

14 επιδημιολογικής μελέτης NHANES για τα έτη (CDC/MMWR, 2007), ο εκτιμώμενος επιπολασμός της ΧΝΝ κατά στάδιο είναι: Στάδιο 1: 5,7% Στάδιο 2: 5,4% Στάδιο 3: 5,4% Στάδιο 4: 0,4% Στάδιο 5: 0,4% Στην Ευρώπη, ο συνολικός επιπολασμός της ΧΝΝ είναι επίσης περίπου 10% ωστόσο έχει παρατηρηθεί μεγάλη διακύμανση μεταξύ διαφορετικών χωρών. Ενδεικτικά, αναφέρεται επιπολασμός 3,31% στη Νορβηγία και 17,3% στη Βορειοανατολική Γερμανία (Bruck et al., 2015). Η επίπτωση της ΧΝΝ τελικού σταδίου στις ΗΠΑ αυξανόταν σταθερά από το 1980 έως το 2001, ωστόσο έκτοτε έχει σταθεροποιηθεί σε περίπου 350 νέες περιπτώσεις/εκατομμύριο πληθυσμού/έτος. Αυτό, σημαίνει ότι περισσότεροι από ασθενείς ετησίως καταλήγουν σε τελικό στάδιο ΧΝΝ. Στα τέλη του 2009, ο αριθμός των ασθενών που υποβάλλονταν σε θεραπεία υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας ανερχόταν σε , εκ των οποίων >90% υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση και 6,9% σε περιτοναϊκή κάθαρση. Ταυτόχρονα, ο αριθμός των ασθενών που είχαν υποβληθεί σε μεταμόσχευση νεφρού και έφεραν λειτουργούν μόσχευμα ανερχόταν σε (NKUDIC). Στην Ευρώπη, το έτος 2013 η επίπτωση της ΧΝΝ τελικού σταδίου ανήλθε σε 112 νέες περιπτώσεις/εκατομμύριο πληθυσμού, και ασθενείς ξεκίνησαν θεραπεία υποκατάστασης. Στην Ελλάδα, παρατηρήθηκε η υψηλότερη επίπτωση μεταξύ των ευρωπαϊκών χωρών, με 216 νέες περιπτώσεις/ εκατομμύριο πληθυσμού, ενώ ο αριθμός των ασθενών που ξεκίνησαν θεραπεία υποκατάστασης ανήλθε σε Έως το τέλος του 2013, στην Ελλάδα υποβάλλονταν σε θεραπεία υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας συνολικά ασθενείς, εκ των οποίων το 93,4% σε αιμοκάθαρση και το 6,6% σε περιτοναϊκή κάθαρση. Ταυτόχρονα, ασθενείς έφεραν λειτουργούν νεφρικό μόσχευμα (Kramer et al., 2016, ERA-EDTA Registry Annual Report 2013). 14

15 1.4. ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ ΧΡΟΝΙΑΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΝΟΣΟΥ Πολυάριθμα νοσήματα δύνανται να προκαλέσουν χρόνια νεφρική νόσο (Πίνακας 4). Πίνακας 4: Κυριότερα αίτια ΧΝΝ κατά ομάδες νοσημάτων Σακχαρώδης Διαβήτης Διαβητική νεφροπάθεια Αρτηριακή Υπέρταση Υπερτασική νεφροσκλήρυνση Αγγειακά νοσήματα Αγγειίτιδες Αθηροεμβολική νόσος Στένωση νεφρικής αρτηρίας/θρόμβωση νεφρικής φλέβας Πρωτοπαθείς παθήσεις του σπειράματος Δευτεροπαθείς παθήσεις του σπειράματος Νοσήματα συνδετικού ιστού Λοιμώξεις Φάρμακα Νεοπλασίες Αιματολογικά νοσήματα Κυστικές παθήσεις των νεφρών Νοσήματα του διαμεσο-σωληναριακού χώρου Αποφρακτικές παθήσεις του ουροποιητικού συστήματος Νεφρολιθίαση Συγγενή Κληρονομικά νεφρικά νοσήματα Εμμένουσα οξεία νεφρική βλάβη 15

16 Συχνά, οι ασθενείς με ΧΝΝ διαγιγνώσκονται όταν πλέον βρίσκονται στο τελικό στάδιο της νόσου. Στις περιπτώσεις αυτές, η ιστολογική διάγνωση της πρωτοπαθούς αιτίας της ΧΝΝ ενδέχεται να είναι αδύνατη καθώς οι νεφροί παρουσιάζουν εκσεσημασμένη ίνωση. Σύμφωνα με τα στοιχεία του μητρώου καταγραφής των ΗΠΑ (2015, US RDS, Annual Report) για το έτος 2013, οι κυριότερες αιτίες ΧΝΝ τελικού σταδίου στους ασθενείς που εντάχθηκαν σε θεραπεία υποκατάστασης νεφρικής λειτουργίας ήταν οι ακόλουθες: Σακχαρώδης Διαβήτης 43,88% Αρτηριακή Υπέρταση 28,72% Σπειραματονεφρίτιδες 7,52% Πολυκυστική Νόσος/Κυστικές Νόσοι 2,12% Άλλη αιτία/άγνωστη 17,76% 1.5. ΧΡΟΝΙΑ ΝΕΦΡΙΚΗ ΝΟΣΟΣ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΟΥΡΑΙΜΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ Οι λειτουργίες του φυσιολογικού νεφρού περιλαμβάνουν την διατήρηση της ομοιόστασης ύδατος, ηλεκτρολυτών και της οξεοβασικής ισορροπίας, την απομάκρυνση προϊόντων του μεταβολισμού και την παραγωγή και έκκριση ορμονών. Προϊούσης της χρόνιας νεφρικής νόσου, η σταδιακή απώλεια των λειτουργιών αυτών έχει ως συνέπεια την εμφάνιση μεταβολικών διαταραχών και συστηματικών κλινικών εκδηλώσεων. Το σύνολο των εκδηλώσεων αυτών περιγράφεται ως «ουραιμικό σύνδρομο» και είναι ανεξάρτητο από την αιτία της ΧΝΝ. Το ουραιμικό σύνδρομο συνήθως εκδηλώνεται όταν η κάθαρση κρεατινίνης μειωθεί κάτω από 10ml/min. Ωστόσο, ορισμένοι ασθενείς με υψηλότερες τιμές κάθαρσης κρεατινίνης μπορεί να εκδηλώσουν το σύνδρομο εάν η έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας είναι ταχεία. Επίσης, κάθε ασθενής δύναται να εκδηλώσει διαφορετικό συνδυασμό συμπτωμάτων και σημείων, διαφορετικής έντασης και διάρκειας. Στον Πίνακα 5 παρατίθενται κατά συστήματα τα κλινικά συμπτώματα και σημεία του ουραιμικού συνδρόμου. 16

17 Πίνακας 5: Συμπτώματα και σημεία ουραιμικού συνδρόμου κατά σύστημα ΣΥΣΤΗΜΑ ΣΥΜΠΤΩΜΑΤΑ ΣΗΜΕΙΑ Δέρμα Οφθαλμοί Καρδιαγγειακό Αναπνευστικό Γαστρεντερικό Νευρικό Μυοσκελετικό Ενδοκρινείς Αιμοποιητικό Ουροποιητικό Μεταβολισμός Διαταραχές υγρών - ηλεκτρολυτών Κνησμός Μείωση όρασης, επιπεφυκίτις Δύσπνοια, ορθόπνοια, οίδημα άκρων, θωρακικό άλγος Δύσπνοια Ανορεξία, έμετος, διάρροια, αιμορραγία Αδυναμία, τρόμος, αστηριξία, κεφαλαλγία, λήθαργος, σπασμοί, κώμα, διαταραχές ύπνου, έκπτωση επιπέδου συνείδησης Αδυναμία, μυικές κράμπες, αρθραλγίες, οστικά άλγη, κατάγματα Μείωση libido, ανικανότητα, διαταραχές εμμήνου ρύσεως/αμηνόρροια Αδυναμία, δύσπνοια, επίσταξη, αιμορραγική διάθεση Νυκτουρία, ενούρηση Απώλεια βάρους Δίψα Υπέρχρωση, δρυφάδες, ωχρότητα εκχυμώσεις, δερματικές εναποθέσεις, ξηρότητα Αμφιβληστροειδοπάθεια, εναποθέσεις ασβεστίου στον σκληρό χιτώνα (κόκκινο μάτι) Υπέρταση, αρρυθμία, περικαρδίτις, περικαρδιακή συλλογή, ήχος τριβής, καρδιακή ανεπάρκεια, ισχαιμική καρδιοπάθεια, πνευμονικό οίδημα, αορτική στένωση, ασβεστώσεις βαλβίδων Τρίζοντες, πνευμονικό οίδημα, ήχος υπεζωκοτικής τριβής, ουραιμικός πνεύμονας, ουραιμική απόπνοια Στοματικά έλκη, παρωτίτιδα, γαστρίτιδα, πεπτικό έλκος, αιμορραγία πεπτικού Εγκεφαλοπάθεια, περιφερική νευροπάθεια, κώμα, υποσκληρίδιο αιμάτωμα Ουρική αρθρίτιδα, οστική νόσος, οστεοπόρωση, εναποθέσεις ασβεστίου, απώλεια μυικής μάζας, μυική ατροφία Καθυστέρηση ανάπτυξης/ήβης, κοντό ανάστημα, γυναικομαστία, υπερπαραθυρεοειδισμός Αναιμία, εκχυμώσεις, πορφύρα, αιμορραγία Πρωτεϊνουρία, παθολογικό ίζημα ούρων Διαταραχές μεταβολισμού λιπιδίων, υδατανθράκων, πρωτεϊνών Υπερκαλιαιμία, υπο- /υπερνατριαιμία, υπασβεστιαιμία, υπερφωσφαταιμία, υπερμαγνησιαιμία, μεταβολική οξέωση, έκπτυξη/συρρίκνωση εξωκυττάριου όγκου 17

18 Το ουραιμικό σύνδρομο, εάν δεν αντιμετωπιστεί έγκαιρα μπορεί να οδηγήσει σε θανατηφόρες επιπλοκές όπως κώμα, καρδιακή ανακοπή και αιφνίδιο θάνατο. Επιπλέον, δύναται να συνοδεύεται από απειλητικές για τη ζωή αιμορραγίες, κατάγματα και ανεπιθύμητες ενέργειες φαρμάκων λόγω ανεπαρκούς απομάκρυνσής τους από τους νεφρούς ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ ΝΕΦΡΙΚΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ Η θεραπεία υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας στοχεύει στην πρόληψη εμφάνισης των επιπλοκών του ουραιμικού συνδρόμου, στη διατήρηση της εναπομείνασας νεφρικής λειτουργίας όπου αυτό είναι εφικτό, στην παράταση της επιβίωσης των ασθενών που καταλήγουν σε ΧΝΝ τελικού σταδίου και στη βελτίωση της ποιότητας ζωής. Για την επίτευξη των στόχων αυτών είναι απαραίτητος ο έγκαιρος εντοπισμός των ασθενών που έχουν αυξημένη πιθανότητα να εμφανίσουν τελικού σταδίου ΧΝΝ και η αδρή εκτίμηση του χρόνου κατά τον οποίο οι ασθενείς αυτοί θα χρειαστούν θεραπεία υποκατάστασης. Με αυτόν τον τρόπο, επιτυγχάνεται η καλύτερη δυνατή προετοιμασία του ασθενούς και της οικογένειάς του και δίδεται χρόνος για την ομαλή ένταξη του ασθενούς στη θεραπεία υποκατάστασης. Η υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας περιλαμβάνει την αιμοκάθαρση (ΑΚ) και την περιτοναϊκή κάθαρση (ΠΚ) αλλά η ιδεώδης λύση είναι η μεταμόσχευση νεφρού. Είναι απαραίτητη η ευελιξία στην επιλογή της θεραπευτικής μεθόδου, καθώς και οι τρεις μέθοδοι μπορούν να χρησιμοποιούνται διαδοχικά ώστε να εξασφαλιστεί η μεγαλύτερη δυνατή επιβίωση και η καλύτερη δυνατή ποιότητα ζωής για τους ασθενείς με ΧΝΝ τελικού σταδίου. Οι δύο πρώτες μέθοδοι, αποκαθιστούν εν μέρει την ομοιόσταση του ύδατος, των ηλεκτρολυτών και τη ρύθμιση της οξεοβασικής ισορροπίας, όπως και την απομάκρυνση προϊόντων του μεταβολισμού. Η μεταμόσχευση νεφρού, υπό προϋποθέσεις, δύναται να αποκαταστήσει πλήρως τις παραπάνω λειτουργίες καθώς επίσης και τις ορμονικές λειτουργίες του νεφρού. Ως εκ τούτου, η μεταμόσχευση νεφρού σχετίζεται με σημαντικά καλύτερη επιβίωση (ERA-EDTA Registry Annual Report 2013, 2015, USRDS, Annual Report) και ποιότητα ζωής (Liem YS et al., 2008) και για το λόγο αυτό αποτελεί τη θεραπεία εκλογής για όσους ασθενείς κριθούν κατάλληλοι να λάβουν νεφρικό μόσχευμα. 18

19 Η περιτοναϊκή κάθαρση φαίνεται να υπερτερεί ελαφρά της αιμοκάθαρσης ως προς την επιβίωση των ασθενών, τουλάχιστον κατά τα πρώτα 2 έτη (Yeates K et al., 2012). Ενδεικτικά στις Η.Π.Α, η διετής επιβίωση των ασθενών που εντάχθηκαν σε θεραπεία υποκατάστασης το 2008 ήταν 76,4% για την περιτοναϊκή κάθαρση έναντι 64,4% για την αιμοκάθαρση, ενώ η πενταετής επιβίωση ήταν 50,3% και 40,2% αντίστοιχα. Σε παγκόσμια κλίμακα, η πλειοψηφία των ασθενών με ΧΝΝ τελικού σταδίου εντάσσεται σε χρόνιο πρόγραμμα αιμοκάθαρσης. Ωστόσο, η χρήση των δύο μεθόδων παρουσιάζει σημαντικές γεωγραφικές διαφορές. Στον Πίνακα 6 παρουσιάζονται τα ποσοστά των ασθενών που υποβάλλονταν σε ΑΚ και ΠΚ σε 10 ενδεικτικές χώρες για το έτος 2011 (2015, USRDS, Annual Report). Πίνακας 6: Ποσοστό ασθενών που υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση και περιτοναϊκή κάθαρση το έτος 2011 ΧΩΡΑ ΑΙΜΟΚΑΘΑΡΣΗ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ Χονγκ - Κονγκ 25,9% 74,1% Μεξικό 50,6% 49,4% Νέα Ζηλανδία 66,8% 33,2% Ην. Βασίλειο 85,4% 14,6% Γαλλία 89,8% 10,2% Η.Π.Α. 92,6% 7,4% Ελλάδα 92,8% 7,2% Ισραήλ 94,7% 5,3% Αργεντινή 95,1% 4,9% Ιαπωνία 96,9% 3,1% 19

20 Οι διαφορές αυτές σχετίζονται με το κόστος των θεραπειών, την προσβασιμότητα σε μονάδες αιμοκάθαρσης, την εκπαίδευση του ιατρικού και νοσηλευτικού προσωπικού και την επάρκεια των υποδομών του συστήματος υγείας (Jain AK et al., 2012). Στην Ελλάδα, το ποσοστό χρήσης της περιτοναϊκής κάθαρσης είναι χαμηλό και τα τελευταία έτη έχει υποχωρήσει κάτω από το 7% (βλ. 1.3). Ωστόσο, δεδομένης της ιδιαίτερης γεωμορφολογίας της χώρας, η ανάπτυξη προγραμμάτων περιτοναϊκής κάθαρσης θα μπορούσε να προσφέρει σημαντικά πλεονεκτήματα (βλ. Κεφάλαιο 2). 20

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ 2.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ Γενικές αρχές Η περιτοναϊκή κάθαρση είναι μέθοδος υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας. Χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία ασθενών με ΧΝΝ τελικού σταδίου, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τη θεραπεία της Οξείας Νεφρικής Βλάβης. Κατά την εφαρμογή της μεθόδου, στείρο διάλυμα εγχέεται στην περιτοναϊκή κοιλότητα μέσω ενός μόνιμα εγκατεστημένου καθετήρα. Το περιτόναιο λειτουργεί ως ημιδιαπερατή μεμβράνη, μέσω της οποίας ύδωρ και διαλυμένες ουσίες μετακινούνται από το αίμα που βρίσκεται στα τριχοειδή του περιτοναίου προς το διάλυμα που βρίσκεται στην περιτοναϊκή κοιλότητα και αντιστρόφως. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, τυπικά 4 φορές την ημέρα, το διάλυμα αντικαθίσταται με νέο, προκειμένου να εξασφαλίζονται οι απαραίτητες κλίσεις συγκέντρωσης και άρα η απόδοση της μεθόδου Ενδείξεις και Αντενδείξεις Περιτοναϊκής Κάθαρσης Η πλειοψηφία των ασθενών με ΧΝΝ τελικού σταδίου, είναι κατάλληλοι για θεραπεία με ΠΚ. Στον Πίνακα 7 συνοψίζονται οι κυριότερες ενδείξεις και αντενδείξεις εφαρμογής της μεθόδου (Shetty A, Oreopoulos G, 2000): Πίνακας 7: Ενδείξεις και Αντενδείξεις Περιτοναϊκής Κάθαρσης ΙΣΧΥΡΕΣ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΑΠΟΛΥΤΕΣ ΑΝΤΕΝΔΕΙΞΕΙΣ Αποτυχία αγγειακής προσπέλασης Τεκμηριωμένη ανεπάρκεια υπερδιήθησης τύπου ΙΙ Δυσανεξία αιμοκάθαρσης Ενεργός φλεγμονώδης νόσος εντέρου Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια Οξεία εκκολπωματίτιδα Παρουσία προσθετικών βαλβίδων Ενδοκοιλιακό απόστημα Παιδιά 0-5 ετών Ενεργός ισχαιμική νόσος εντέρου Προτίμηση ασθενούς Ενεργός ψυχωσική διαταραχή Απόσταση από κέντρο αιμοκάθαρσης Βαριά νοητική υστέρηση Πτωχή καρδιακή λειτουργία Τρίτο τρίμηνο κύησης Περιφερική αγγειακή νόσος 21

22 ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ Αιμορραγική διάθεση Πολλαπλούν μυέλωμα Σακχαρώδης διαβήτης τύπου Ι με δυσχέρεια ρύθμισης (labile diabetes) Χρόνιες λοιμώξεις Ισχυρή πιθανότητα μεταμόσχευσης νεφρού στο άμεσο μέλλον Ηλικία 6-16 ετών Φοβία/Άγχος για τις βελόνες Δραστήριος τρόπος ζωής Συχνά ταξίδια ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΝΤΕΝΔΕΙΞΕΙΣ Σοβαρή υποθρεψία Πολλαπλές ενδοκοιλιακές συμφύσεις Παρουσία στομίας Πρωτεϊνουρία >10gr/ημέρα Ακρωτηριασμός άνω άκρου χωρίς κατ οίκον υποστήριξη Κακή ατομική υγιεινή Άνοια Έλλειψη στέγης ΔΥΝΑΤΗ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΡΟΤΙΜΗΤΕΑ Παχυσαρκία Πολλαπλές κήλες Σοβαρή οσφυαλγία Πολλαπλές χειρουργικές επεμβάσεις κοιλίας Πτωχή κινητικότητα άκρων χειρών Τύφλωση Κακές συνθήκες διαβίωσης Κατάθλιψη Ισχυρή ένδειξη για την επιλογή της ΠΚ ως θεραπείας υποκατάστασης νεφρικής λειτουργίας σε ασθενείς με τελικού σταδίου ΧΝΝ αποτελεί η παρουσία συμφορητικής καρδιακής ανεπάρκειας (ΣΚΑ). Με την εφαρμογή της ΠΚ η οποία είναι ηπιότερη μέθοδος κάθαρσης αποφεύγονται οι ταχείες μετακινήσεις ύδατος που παρατηρούνται στην αιμοκάθαρση, με αποτέλεσμα μικρότερη επιβάρυνση της καρδιακής λειτουργίας. Ωστόσο, μία πρόσφατη μελέτη από τη Γαλλία (Sens F et al., 2011) έδειξε ότι οι ασθενείς με ΣΚΑ έχουν χειρότερη επιβίωση στην ΠΚ σε σχέση με την αιμοκάθαρση. Τα ευρήματα αυτά χρήζουν επιβεβαίωσης και σε άλλους πληθυσμούς ασθενών προκειμένου να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα. 22

23 Πλεονεκτήματα περιτοναϊκής κάθαρσης Υπάρχουν ενδείξεις ότι η υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας με ΠΚ προσφέρει ορισμένα σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την ΑΚ. Συνοπτικά, τα πιθανά αυτά πλεονεκτήματα είναι: Καλύτερη επιβίωση ασθενών για τα πρώτα 1-2 έτη (Yeates K et al., 2012 και 1.6) Μεγαλύτερη ικανοποίηση των ασθενών και καλύτερη ποιότητα ζωής (Barendse SM et al. 2005, Rubin HR et al. 2004, Juergensen E et al. 2006) Καλύτερη έκβαση επικείμενης μεταμόσχευσης (Van Biesen W et al. 2006, Goldfarb- Rumyantzev et al. 2005, Perez-Fontan M et al. 1996) Ρύθμιση της αναιμίας, με μικρότερες δόσεις ερυθροποιητίνης (Snyder JJ et al. 2004). Διατήρηση της υπολειπόμενης νεφρικής λειτουργίας (Misra M et al. 2001, Lang SM et al. 2001) Χαμηλότερο κόστος (Berger A et al. 2009, Roggeri A et al. 2016) Συνοπτική ιστορική αναδρομή Οι πρώτες παρατηρήσεις σχετικά με τη δομή και τη λειτουργία του περιτοναίου χρονολογούνται από τα μέσα του 19 ου αιώνα. Η δομή του περιτοναίου περιγράφηκε αναλυτικά για πρώτη φορά το 1862 από τον FD von Recklinghausen. Οι μεταφορικές ιδιότητες του περιτοναίου μελετήθηκαν αρχικά από τον G Wegner το 1877, ακολούθως από τους EH Starling και ΑΗ Tubby το 1894 και στη συνέχεια τη δεκαετία του 1920, κυρίως από τους Cunningham, Putnam και Engel. Η πρώτη κλινική εφαρμογή περιτοναϊκής κάθαρσης αναφέρθηκε από τον G Ganter το 1923, ωστόσο η χρήση της άρχισε να εξαπλώνεται τις δεκαετίες του και να γενικεύεται από τη δεκαετία του 1970 και έπειτα. Θεμελιώδεις σταθμοί σε αυτή την πορεία ήταν: 1. Η κατασκευή του περιτοναϊκού καθετήρα από σιλικόνη από τους Palmer και Quinton το 1962, τον οποίο στη συνέχεια βελτίωσε ο H. Tenckhoff καταλήγοντας στον τύπο καθετήρα ο οποίος χρησιμοποιείται μέχρι σήμερα. 2. Η εισαγωγή της Συνεχούς Φορητής Περιτοναϊκής Κάθαρσης (ΣΦΠΚ CAPD) από τους R. Popovich και J. Moncrief το

24 3. Η εισαγωγή της συνδεσμολογίας τύπου Υ από τον U. Buoncristiani στις αρχές της δεκαετίας του 1980, η οποία μείωσε δραματικά τα επεισόδια περιτονίτιδας. Τα επιτεύγματα αυτά βελτίωσαν κατά πολύ την αποδοτικότητα της περιτοναϊκής κάθαρσης και μείωσαν σημαντικά τις επιπλοκές, κυρίως δε τα επεισόδια περιτονίτιδας, με αποτέλεσμα να καταστεί η περιτοναϊκή κάθαρση μια ασφαλής και αποτελεσματική μέθοδος για την μακροχρόνια υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΝΑΤΟΜΙΑΣ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΙΟΥ Μακροσκοπική ανατομία Το περιτόναιο είναι ορογόνος υμένας ο οποίος αφ ενός επενδύει εσωτερικά τα κοιλιακά τοιχώματα, αφ ετέρου ανακάμπτει γύρω από τα ενδοκοιλιακά σπλάγχνα περιβάλλοντάς τα. Κατ αυτόν τον τρόπο, διακρίνονται δύο πέταλα του περιτοναίου: το τοιχωματικό περιτόναιο, το οποίο επενδύει εσωτερικά τα κοιλιακά τοιχώματα και το διάφραγμα, και το σπλαγχνικό περιτόναιο, το οποίο περιβάλλει τα ενδοκοιλιακά σπλάγχνα. Οι αναδιπλώσεις του περιτοναίου σχηματίζουν πτυχές, οι κυριότερες εκ των οποίων είναι: Το μείζον και το έλασσον επίπλουν Το μεσεντέριο Το εγκάρσιο και σιγμοειδές μεσόκολον Οι διάφοροι σύνδεσμοι (πχ. γαστροσπληνικός, σπληνονεφρικός, ηπατογαστρικός κλπ.) Οι πτυχές αυτές αποτελούν στηρικτικές δομές για τα ενδοκοιλιακά όργανα, ενώ εντός των πτυχών πορεύονται αιμοφόρα αγγεία, λεμφαγγεία και νεύρα τα οποία αρδεύουν και νευρώνουν τα αντίστοιχα όργανα. 24

25 Εικόνα 1: Μακροσκοπική ανατομική του περιτοναίου (Netter 2006, plate 348) Μεταξύ των δύο πετάλων του περιτοναίου, καταλείπεται ελεύθερος χώρος, ο οποίος ονομάζεται περιτοναϊκή κοιλότητα. Η περιτοναϊκή κοιλότητα αποτελείται από δύο διαμερίσματα: Τον μείζονα σάκο Τον ελάσσονα σάκο, μέρος του οποίου είναι το μείζον και το έλασσον επίπλουν Τα διαμερίσματα αυτά επικοινωνούν μέσω του επιπλοϊκού τρήματος (τρήμα Winslow). Στους άνδρες, η περιτοναϊκή κοιλότητα είναι ένας απόλυτα κλειστός σάκος, ενώ στις γυναίκες υπάρχει δυνητική επικοινωνία με το γεννητικό σύστημα μέσω των σαλπίγγων. Η επιφάνεια του περιτοναίου είναι περίπου 1-2m 2 εκ των οποίων το 10% αντιστοιχεί στο τοιχωματικό περιτόναιο. Η όψη του περιτοναίου είναι διάφανη και στιλπνή, ενώ η υφή του είναι υγρή και κολλώδης. Εντός της περιτοναϊκής κοιλότητας υπάρχει μικρή ποσότητα ορώδους υγρού, το 25

26 οποίο ονομάζεται περιτοναϊκό υγρό. Το υγρό αυτό παράγεται και εκκρίνεται από τη στιβάδα μεσοθηλιακών κυττάρων της περιτοναϊκής μεμβράνης (βλ ) και ο όγκος του είναι περίπου 100ml. Η παρουσία του περιτοναϊκού υγρού μειώνει την τριβή μεταξύ του τοιχωματικού και του σπλαγχνικού περιτοναίου, επιτρέποντας τη σχετική ολίσθηση των σπλάγχνων κατά τη διάρκεια των αναπνευστικών κινήσεων, των περισταλτικών κινήσεων του εντέρου και της σύσπασης των κοιλιακών τοιχωμάτων Αιμάτωση και Λεμφική παροχέτευση Το περιτόναιο αιματώνεται από δύο συστήματα κυκλοφορίας. Το τοιχωματικό περιτόναιο αιματώνεται από κλάδους των αρτηριών που μεταφέρουν το αίμα στο υπερκείμενο κοιλιακό τοίχωμα. Οι κλάδοι αυτοί προέρχονται από τις μεσοπλεύριες, οσφυικές και επιγάστριες αρτηρίες, ενώ η φλεβική απορροή γίνεται κατ ευθείαν στην συστηματική κυκλοφορία μέσω της κάτω κοίλης φλέβας. Το σπλαγχνικό περιτόναιο αιματώνεται από κλάδους της άνω μεσεντερίου αρτηρίας και η φλεβική απορροή γίνεται στην πυλαία φλέβα. Η συνολική ροή αίματος στο περιτόναιο υπολογίζεται σε ml/min. Η λεμφική παροχέτευση του περιτοναίου γίνεται κατά 70-80% από τα υποδιαφραγματικά λεμφαγγεία. Το υποδιαφραγματικό λεμφικό δίκτυο χαρακτηρίζεται από την παρουσία των «στομάτων». Πρόκειται για σχισμοειδείς οπές (lacunae) στην κάτω επιφάνεια του διαφράγματος, διαμέτρου 4-22μm. Στα σημεία αυτά, το μεσοθήλιο που καλύπτει το περιτόναιο μεταπίπτει σε λεμφικό ενδοθήλιο. Μέσω των «στομάτων», μεγαλομοριακές ενώσεις και κύτταρα είναι δυνατό να περάσουν από την περιτοναϊκή κοιλότητα στη λεμφική κυκλοφορία. Ο αριθμός και η διάμετρος των «στομάτων» μεταβάλλεται με τις κινήσεις του διαφράγματος. Κατά την εκπνοή υπάρχει μεγαλύτερος αριθμός «στομάτων», ενώ με τη σύσπαση του διαφράγματος στην εισπνοή ο αριθμός τους μειώνεται. Από τα «στόματα», η λέμφος παροχετεύεται στον δεξιό θωρακικό πόρο και ακολούθως στη φλεβική κυκλοφορία. Η λεμφική απορροή είναι σημαντική για τη φυσιολογία της περιτοναϊκής κάθαρσης. Σε σταθερούς ασθενείς που υποβάλλονται σε ΠΚ, η λεμφική απορροή είναι περίπου 7-20 ml/h. 26

27 Μικροσκοπική ανατομία Μικροσκοπικά, η περιτοναϊκή μεμβράνη αποτελείται από τις ακόλουθες διακριτές στοιβάδες, με φορά από τα τριχοειδή του περιτοναίου προς την ελεύθερη επιφάνειά του: 1. Λεπτή στοιβάδα υγρού που λιμνάζει στην προς τον αυλό επιφάνεια του τριχοειδούς. 2. Στοιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων του τοιχώματος του τριχοειδούς. 3. Βασική μεμβράνη του ενδοθηλίου. 4. Διάμεσο υπόστρωμα: Στοιβάδα συνδετικού ιστού και εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας υπό μορφή γέλης. Διακρίνεται σε στρώμα χαλαρού συνδετικού ιστού (πλουσιότερο σε ύδωρ), στο οποίο βρίσκονται τα τριχοειδή του περιτοναίου και ορισμένα λεμφαγγεία, και σε στρώμα πυκνού συνδετικού ιστού (πλουσιότερο σε κολλοειδή, πτωχότερο σε ύδωρ). Το πάχος του στρώματος πυκνού συνδετικού ιστού κυμαίνεται από 20 (σπλαγχνικό περιτόναιο) έως 50μm (τοιχωματικό), σε ασθενείς οι οποίοι ξεκινούν την περιτοναϊκή κάθαρση. 5. Βασική μεμβράνη μεσοθηλίου. 6. Μεσοθήλιο: Μονήρης στοιβάδα κροσσωτών μεσοθηλιακών κυττάρων (0,5-2μm). 7. Στοιβάδα περιτοναϊκού υγρού: Επαλείφει τα μεσοθηλιακά κύτταρα. Από αυτές, η στοιβάδα των ενδοθηλιακών κυττάρων του τριχοειδούς αποτελεί τον σημαντικότερο φραγμό στη διαδρομή μιας ουσίας από τον αυλό του τριχοειδούς προς την περιτοναϊκή κοιλότητα (βλ. Μοντέλο τριών πόρων) ενώ το διάμεσο υπόστρωμα δύναται να προβάλει κάποιου βαθμού αντίσταση στη διέλευση ουσιών μεγαλύτερου μοριακού βάρους. Η συμβολή των υπολοίπων στοιβάδων στη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου είναι αμελητέα. Η περιτοναϊκή μεμβράνη χαρακτηρίζεται από σχετικά αυξημένη πυκνότητα τριχοειδών. Σε κάθε 1m 2 εμβαδού επιφάνειας του περιτοναίου και 200μm πάχους μεμβράνης, αντιστοιχούν 2m 2 εμβαδού επιφάνειας τριχοειδών (Rippe B., 1994), (Grey s Anatomy, 2008). 27

28 2.3. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Για την περιγραφή της λειτουργίας της περιτοναϊκής μεμβράνης στην περιτοναϊκή κάθαρση έχουν χρησιμοποιηθεί μαθηματικά μοντέλα, εκ των οποίων τα εξής δύο έχουν τύχει ευρύτερης αποδοχής: το μοντέλο τριών πόρων (three pore model) και το μοντέλο κατανομής (distributed model) (Flessner MF et al., 1991, Rippe et al., 2004). Τα μοντέλα αυτά λειτουργούν συμπληρωματικά το ένα ως προς το άλλο Μοντέλο τριών πόρων Σύμφωνα με αυτό, τα περιτοναϊκά τριχοειδή αποτελούν τον σημαντικότερο φραγμό στη μετακίνηση ουσιών και ύδατος. Η μετακίνησή τους εξαρτάται από τη σχετική αφθονία πόρων τριών διαφορετικών μεγεθών: Μεγάλοι πόροι: Είναι σχετικά ολιγάριθμοι, έχουν ακτίνα 20-40nm και θεωρείται ότι σχηματίζονται από μεγάλα ανοίγματα μεταξύ παρακείμενων ενδοθηλιακών κυττάρων. Από τους πόρους αυτούς δύνανται να διέλθουν μεγάλα μόρια πχ. πρωτεΐνες. Μικροί πόροι: Είναι πολυάριθμοι, με ακτίνα 4-6nm και αντιπροσωπεύουν μικρότερου μεγέθους ανοίγματα μεταξύ παρακείμενων ενδοθηλιακών κυττάρων. Η πυκνότητα αυτών των πόρων καθορίζει τη μεταφορά μικρομοριακών ουσιών (ουρίας, κρεατινίνης, νατρίου και καλίου) καθώς και τη μεταφορά ύδατος. Πολύ μικροί πόροι: Έχουν ακτίνα <0.8nm και αποτελούνται από διαμεμβράνικές πρωτεΐνες της οικογένειας των ακουαπορινών, στην μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων. Είναι διαπερατοί μόνο στο ύδωρ και σε αυτούς οφείλεται το φαινόμενο του «κοσκινίσματος» (sieving) του νατρίου. 28

29 Εικόνα 2: Μοντέλο τριών πόρων: Ο φραγμός του ενδοθηλίου στη μεταφορά ύδατος στην περιτοναϊκή κάθαρση. Στο ενδοθήλιο, η μεταφορά ύδατος γίνεται μέσω: 1. Ακουαπουρινών (διαμεμβρανικών πρωτεϊνών) 2. Διακυτταρικού κενού καλυμμένου από πυκνό γλυκοκάλυκα (μικρός πόρος) 3. Διακυτταρικού κενού καλυμμένου από λιγότερο πυκνό γλυκοκάλυκα, που επιτρέπει τη δίοδο μακρομορίων (μεγάλος πόρος). Οι κύριες δυνάμεις που οδηγούν σε μεταφορά ύδατος μέσω των ακουαπορινών και των μικρών και μεγάλων πόρων είναι η ωσμωτική πίεση, η υδροστατική και η ωσμωτική πίεση και η υδροστατική πίεση αντίστοιχα. Το πάχος του βέλους (εικόνα 2) αντιπροσωπεύει το μέγεθος της μεταφοράς ύδατος που συντελείται δια μέσου των τριών πόρων (Flessner MF et al., 1991) Μοντέλο κατανομής Το μοντέλο αυτό αναδεικνύει τη σημασία της κατανομής των τριχοειδών στην περιτοναϊκή μεμβράνη και της απόστασης την οποία πρέπει να διανύσουν οι διάφορες ουσίες και το ύδωρ από τα τριχοειδή μέχρι τη μεσοθηλιακή στοιβάδα. Σύμφωνα με το μοντέλο, η μεταφορά εξαρτάται από το εμβαδόν επιφανείας των περιτοναϊκών τριχοειδών και όχι από τη συνολική επιφάνεια του περιτοναίου. Η απόσταση κάθε τριχοειδούς από το μεσοθήλιο, καθορίζει και τη συμβολή του στη μεταφορά. Όσο πιο κοντά στη μεσοθηλιακή στοιβάδα 29

30 βρίσκεται ένα τριχοειδές, τόσο περισσότερο συμβάλει στη μεταφορά. Η συμβολή όλων των τριχοειδών αθροιστικά, καθορίζει τη «δραστική επιφάνεια του περιτοναίου» και την αντίσταση της μεμβράνης. Ως δραστική επιφάνεια του περιτοναίου ορίζεται η επιφάνεια που βρίσκεται αρκετά κοντά στα τριχοειδή ώστε να συμβάλει στη μεταφορά. Σε συνθήκες αύξησης της αγγειοβρίθειας του περιτοναίου, πχ. περιτονίτιδα, η δραστική επιφάνεια και η μεταφορική ικανότητάτου μεταβάλλονται Φυσιολογία της μεταφοράς ουσιών και ύδατος Η μεταφορά ουσιών και ύδατος διαμέσου της περιτοναϊκής μεμβράνης γίνεται με τις ακόλουθες διαδικασίες: Διάχυση Ώσμωση (Υπερδιήθηση) Ταυτόχρονη μετακίνηση ουσιών με ύδωρ (convection) Διάχυση: Ως διάχυση ορίζεται η μετακίνηση ουσιών μεταξύ δύο διαμερισμάτων κατά τη φορά της κλίσης συγκέντρωσής τους, από το διαμέρισμα υψηλότερης συγκέντρωσης προς το διαμέρισμα χαμηλότερης συγκέντρωσης μέσω ημιδιαπερατής μεμβράνης. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η εξίσωση των συγκεντρώσεων της ουσίας μεταξύ των δύο διαμερισμάτων. Η ικανότητα διάχυσης μιας ουσίας διαμέσου της περιτοναϊκής μεμβράνης εξαρτάται από το μοριακό της βάρος (μικρότερα μόρια κινούνται ταχύτερα), από την κλίση συγκέντρωσης της ουσίας μεταξύ του αίματος και του περιτοναϊκού διαλύματος, αλλά και από ιδιότητες του περιτοναίου, όπως το εμβαδόν επιφανείας του περιτοναίου που είναι διαθέσιμο προς διάχυση, και η αντίσταση της μεμβράνης. Η διάχυση αποτελεί την κυριότερη διαδικασία μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η μετακίνηση ουσιών στην περιτοναϊκή κάθαρση. Η ουρία, η κρεατινίνη, οι ηλεκτρολύτες καθώς και πρωτεΐνες και τοξίνες μετακινούνται μέσω διάχυσης. Η μέγιστη διάχυση επιτυγχάνεται κατά την 1 η ώρα παραμονής του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα, όταν η κλίση συγκέντρωσης είναι μεγάλη, και στη συνέχεια μειώνεται προοδευτικά. Μετά από 4 ώρες παραμονής του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα, η συγκέντρωση της ουρίας στο διάλυμα έχει προσεγγίσει το 90% της συγκέντρωσης του πλάσματος και η 30

31 συγκέντρωση της κρεατινίνης το 60% περίπου. Από το σημείο αυτό και έπειτα, η διάχυση μικρομοριακών ουσιών είναι ελάχιστη και η περαιτέρω παραμονή του διαλύματος εξυπηρετεί κυρίως τη μετακίνηση μεγαλύτερων μορίων (πχ. β2-μικροσφαιρίνη). Στην εικόνα 3, παρουσιάζεται σχηματικά η διάχυση της ουρίας και της κρεατινίνης σε σχέση με τη διάχυση μακρομορίων. Εικόνα 3: Εξισορρόπηση συγκεντρώσεων κατά την παραμονή του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα (Nolph KD et al., 1979) Ώσμωση (Υπερδιήθηση): Ως ώσμωση, ορίζεται η μετακίνηση διαλύτη (ύδατος), από διαμέρισμα χαμηλής συγκέντρωσης ωσμωτικά δραστικά ουσιών, προς διαμέρισμα υψηλής συγκέντρωσης ωσμωτικά δραστικά ουσιών, μέσω ημιδιαπερατής μεμβράνης. Στην περιτοναϊκή κάθαρση, η μετακίνηση ύδατος διεξάγεται εξίσου μέσω των μικρών πόρων και των ακουαπορινών, σύμφωνα με το μοντέλο τριών πόρων (βλ Εικόνα 2). Η προσθήκη ωσμωτικά δραστικού παράγοντα (συνήθως γλυκόζης) στο περιτοναϊκό διάλυμα, καθιστά το περιτοναϊκό διάλυμα ελαφρά υπέρτονο σε σχέση με το αίμα των περιτοναϊκών τριχοειδών, δημιουργώντας μια ωσμωτική κλίση. Ως αποτέλεσμα αυτής της κλίσης, ύδωρ μετακινείται από το αίμα προς το 31

32 περιτοναϊκό διάλυμα. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται υπερδιήθηση. Η αποτελεσματικότητα της υπερδιήθησης εξαρτάται από ποικίλους παράγοντες, οι κυριότεροι εκ των οποίων είναι: η υδραυλική αγωγιμότητα της περιτοναϊκής μεμβράνης, ο συντελεστής ανάκλασης του ωσμωτικού παράγοντα, το είδος του ωσμωτικού παράγοντα, η ωσμωτική κλίση, η δραστική επιφάνεια του περιτοναίου, ο χρόνος παραμονής του διαλύματος, η κλίση υδροστατικής πίεσης εκατέρωθεν της μεμβράνης, η κλίση κολλοειδωσμωτικής πίεσης και η λεμφική απορροή. Η υδραυλική αγωγιμότητα της μεμβράνης ποικίλλει μεταξύ των ατόμων και εκφράζει την πυκνότητα των πόρων στην περιτοναϊκή μεμβράνη και την κατανομή των τριχοειδών (απόσταση από το μεσοθήλιο). Ο συντελεστής ανάκλασης του ωσμωτικού παράγοντα, εκφράζει την ικανότητά του να διαχέεται στο διαμέρισμα του αίματος, ελαττώνοντας την ωσμωτική κλίση. Η τιμή του για τη γλυκόζη είναι 0.3, με τιμή 0 να σημαίνει πλήρη διάχυση και 1 μηδενική διάχυση. Η λεμφική απορροή του περιτοναίου ανθίσταται στην υπερδιήθηση, μετακινώντας ύδωρ από την περιτοναϊκή κοιλότητα στην κυκλοφορία του αίματος, με ρυθμό περίπου 0,2-0,4ml/λεπτό. Εικόνα 4: Οδοί υπερδιήθησης διαμέσου της περιτοναϊκής μεμβράνης, με χρήση υπέρτονου διαλύματος γλυκόζης 3,86%. Μετά από 240 λεπτά παραμονής του διαλύματος, η ωσμωτική κλίση μηδενίζεται. Από το σημείο αυτό και έπειτα, ύδωρ επαναρροφάται στην κυκλοφορία του αίματος, κυρίως μέσω των μικρών πόρων και των λεμφαγγείων, μειώνοντας τη συνολική υπερδιήθηση (net UF). Επειδή η μεταφορά ουσιών είναι ανάλογη του εμβαδού επιφανείας των μικρών πόρων, οι μεμβράνες με υψηλή μεταφορική ικανότητα, επαναρροφούν 32

33 περισσότερο ύδωρ και συνεπώς χαρακτηρίζονται από μειωμένη ικανότητα υπερδιήθησης (Davies SJ, 2006). Η συνηθέστερα χρησιμοποιούμενη ωσμωτικά δραστική ουσία είναι η δεξτρόζη, σε συγκεντρώσεις 1,5%, 2,5% και 4,25%, ενώ ευρέως χρησιμοποιείται και το πολυμερές της γλυκόζης ικοδεξτρίνη, σε συγκέντρωση 7,5%. Κατά την παραμονή του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα, η γλυκόζη απορροφάται σχετικά γρήγορα με αποτέλεσμα την μείωση της ωσμωτικής κλίσης και της υπερδιήθησης μετά από λίγες ώρες. Αντίθετα η ικοδεξτρίνη απορροφάται με πολύ βραδύτερο ρυθμό, γεγονός που την καθιστά κατάλληλη για πολύωρη παραμονή του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα (βλ. Εικόνα 5). Εικόνα 5: Προσομοίωση της υπερδιήθησης που επιτυγχάνεται με τη χρήση διαλυμάτων δεξτρόζης και ικοδεξτρίνης μετά από παραμονή του διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα για 14 ώρες. Ταυτόχρονη μετακίνηση ουσιών με ύδωρ (convection): Κατά τη διαδικασία της υπερδιήθησης, το ύδωρ που μετακινείται διαμέσου των μικρών και των μεγάλων πόρων συμπαρασύρει και μόρια ουσιών μεγάλου μοριακού βάρους (πχ. αλβουμίνη, ανοσοσφαιρίνες) (Krediet RT, 2000). 33

34 Κλινική εκτίμηση της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου Για την κλινική εκτίμηση της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου χρησιμοποιείται η «δοκιμασία εξισορρόπησης του περιτοναίου» (Peritoneal Equilibration Test PET). (Twardowski ZJ et al., 1987). Με τη δοκιμασία αυτή, προσδιορίζεται ο ρυθμός εξισορρόπησης των συγκεντρώσεων ουσιών μικρού μοριακού βάρους (ουρία, κρεατινίνη, νάτριο) μεταξύ του πλάσματος και του περιτοναϊκού διαλύματος. Οι λόγοι των συγκεντρώσεων των ουσιών αυτών στο περιτοναϊκό διάλυμα προς τις συγκεντρώσεις τους στο πλάσμα (Dialysate/Plasma (D/P) ratios) χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου. Με τη δοκιμασία ΡΕΤ εκτιμάται επίσης ο ρυθμός απορρόφησης της γλυκόζης από το περιτοναϊκό διάλυμα στο πλάσμα (λόγος D/D 0 γλυκόζης). Η συγκέντρωση της γλυκόζης στο διάλυμα μετά από 4 ώρες παραμονής στην περιτοναϊκή κοιλότητα (D) συγκρίνεται με την αρχική συγκέντρωση της γλυκόζης του διαλύματος (D 0 ). Επιπλέον, με τη δοκιμασία ΡΕΤ αξιολογείται και η ικανότητα υπερδιήθησης, μέσω της μέτρησης του όγκου του διαλύματος στην αρχή και στο τέλος της δοκιμασίας. Με βάση το λόγο D/P κρεατινίνης, οι ασθενείς ταξινομούνται σε μία από τις παρακάτω 4 κατηγορίες (βλ. Εικόνα 6): Ταχείς μεταφορείς (high transporters): Επιτυγχάνουν ταχεία εξισορρόπηση των συγκεντρώσεων ουρίας και κρεατινίνης, λόγω σχετικά αυξημένης δραστικής επιφάνειας του περιτοναίου ή αυξημένης διαπερατότητας της μεμβράνης. Ωστόσο η γλυκόζη απορροφάται εξίσου ταχέως, με αποτέλεσμα την απώλεια της ωσμωτικής κλίσης. Οι ασθενείς αυτοί χαρακτηρίζονται από υψηλούς λόγους D/P κρεατινίνης, ουρίας και νατρίου αλλά χαμηλό λόγο D/D 0 γλυκόζης και μειωμένη υπερδιήθηση. Τέλος, παρουσιάζουν αυξημένη απώλεια πρωτεϊνών ως αποτέλεσμα της υψηλής διαπερατότητας, με αποτέλεσμα να εμφανίζουν χαμηλότερες τιμές αλβουμίνης ορού. Βραδείς μεταφορείς (low transporters): Οι συγκεντρώσεις ουρίας και κρεατινίνης εξισορροπούνται βραδέως και μερικώς, λόγω χαμηλής διαπερατότητας/μειωμένης δραστικής επιφάνειας του περιτοναίου. Οι λόγοι D/P είναι χαμηλοί, αλλά o λόγος D/D 0 είναι υψηλός. Λόγω βραδείας απώλειας της ωσμωτικής κλίσης, οι ασθενείς αυτοί εμφανίζουν πολύ ικανοποιητική υπερδιήθηση. Επίσης παρουσιάζουν μικρότερη απώλεια πρωτεϊνών και εμφανίζουν υψηλότερες τιμές αλβουμίνης στον ορό. 34

35 Ενδιάμεσοι ταχείς και βραδείς μεταφορείς (high average/low average transporters): Οι λόγοι των συγκεντρώσεων, η υπερδιήθηση και οι απώλειες πρωτεϊνών λαμβάνουν ενδιάμεσες τιμές. Κατά την έναρξη της περιτοναϊκής κάθαρσης, περίπου 70% ασθενών ανήκουν στις ενδιάμεσες κατηγορίες, ενώ περίπου 15% των ασθενών είναι ταχείς και 15% βραδείς μεταφορείς. Εικόνα 6: Κατηγορίες μεταφορικής ικανότητας της περιτοναϊκής μεμβράνης βάσει των λόγων D/P κρεατινίνης και D/D 0 γλυκόζης. Η δοκιμασία ΡΕΤ είναι τυποποιημένη και εκτελείται βάσει του παρακάτω πρωτοκόλλου: 1. Τη νύχτα προ της δοκιμασίας, παραμονή 2 lt διαλύματος στην περιτοναϊκή κοιλότητα για 8-12 ώρες. 2. Κατά την έναρξη της δοκιμασίας, παροχέτευση του νυχτερινού διαλύματος σε καθιστή θέση εντός 20 λεπτών και καταγραφή του όγκου του. 3. Έγχυση 2 lt διαλύματος γλυκόζης 2,27% σε θερμοκρασία σώματος, με τον ασθενή σε ύπτια θέση και ρυθμό έγχυσης 200 ml/λεπτό. Κατά τη διάρκεια της έγχυσης, ο ασθενής μετακινείται εναλλάξ στην αριστερή και δεξιά πλάγια κατακεκλιμένη θέση μετά από κάθε 400 ml εγχεόμενου διαλύματος. Η χρονική στιγμή ολοκλήρωσης της έγχυσης καταγράφεται ως χρόνος 0. 35

36 4. Με την πάροδο 4 ωρών από τον χρόνο 0, το διάλυμα παροχετεύεται με τον ασθενή σε όρθια θέση, εντός 20 λεπτών. Καταγράφεται ο όγκος του διαλύματος. 5. Στους χρόνους 0 και 2 ώρες, λαμβάνεται δείγμα διαλύματος ως εξής: 200 ml διαλύματος παροχετεύονται σε κενό σάκο. Αναρροφώνται 10 ml και το υπόλοιπο εγχέεται εκ νέου στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Στις 2 ώρες λαμβάνεται επίσης δείγμα ορού. 6. Μετά την παροχέτευση του διαλύματος στις 4 ώρες, ο σάκος ανακινείται και λαμβάνεται δείγμα 10 ml διαλύματος. Σε όλα τα δείγματα διαλύματος και ορού, προσδιορίζονται η γλυκόζη και η κρεατινίνη. Οι λόγοι D/P κρεατινίνης και D/D 0 γλυκόζης υπολογίζονται ως ακολούθως: D/P = Κρεατινίνη* διαλύματος στις 0, 2 και 4 ώρες Κρεατινίνη* ορού D/D 0 = Γλυκόζη διαλύματος στις 0, 2 και 4 ώρες Αρχική Γλυκόζη διαλύματος *Εάν η κρεατινίνη προσδιορίζεται με μη ενζυματική μέθοδο (πχ. μέθοδο πικρικού οξέος), απαιτείται διόρθωσή της με τον εξής τύπο: Διορθωμένη κρεατινίνη = Κρεατινίνη (γλυκόζη x 0, ) 2.4. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Περιτοναϊκός Καθετήρας Η πρόσβαση στην περιτοναϊκή κοιλότητα για την εφαρμογή της ΠΚ, εξασφαλίζεται με την τοποθέτηση ενός καθετήρα ο οποίος διαπερνά το κοιλιακό τοίχωμα. Οι σύγχρονοι καθετήρες κατασκευάζονται από σιλικόνη, υλικό εγνωσμένης βιοσυμβατότητας και αντοχής. Ο καθετήρας τύπου Tenckhoff με ευθύ ή εσπειραμένο άκρο και συνήθως δύο δακτυλίους από Dacron (cuffs) αποτελεί μακράν τον πλέον δημοφιλή τύπο περιτοναϊκού καθετήρα παγκοσμίως. Επιπλέον, έχουν αναπτυχθεί παραλλαγές του καθετήρα Tenckhoff με στόχο την αντιμετώπιση προβλημάτων όπως η προσκόλληση ιστού στον καθετήρα (πχ. επιπλόου), η μετακίνηση του άκρου του καθετήρα και οι διαφυγή περιτοναϊκού υγρού (leak). Ενδεικτικά, αναφέρεται ο καθετήρας Oreopoulos-Zellerman (Toronto Western), ο οποίος διαθέτει ευθύ 36

37 άκρο και δύο δίσκους σιλικόνης στον άκρο του ώστε να αποτρέπει την προσκόλληση ιστών στις οπές. Άλλες παραλλαγές περιλαμβάνουν καθετήρες με κυρτό εξωτερικό τμήμα (swan neck), με παραλλαγές στον αριθμό και το είδος των cuffs, με βαρίδιο από βολφράμιο ώστε να αποτρέπεται η μετακίνηση του άκρου του καθετήρα κ.ά. (βλ. Εικόνα 7). Εικόνα 7: Παραλλαγές περιτοναϊκών καθετήρων και πιθανοί συνδυασμοί ενδοπεριτοναϊκού και εξωπεριτοναϊκού τμήματος (Gokal R et al., 1998). Η επιλογή του κατάλληλου καθετήρα για κάθε ασθενή είναι κομβικής σημασίας για την επιτυχία της μεθόδου και την ελαχιστοποίηση της πιθανότητας επιπλοκών. Για την επιλογή θα πρέπει να λαμβάνεται υπ όψιν η σωματοδομή του ασθενούς, το ύψος τοποθέτησης της ζώνης (belt line), τυχόν συνυπάρχουσα παχυσαρκία ή παρουσία δερματικών πτυχών, ουλών ή δερματικών παθήσεων, καθώς επίσης και η παρουσία ακράτειας ούρων ή κινητικών 37

38 περιορισμών αλλά και κοινωνικοί παράγοντες όπως το επάγγελμα του ασθενούς και οι συνήθειες καθαριότητας. Η τοποθέτηση του περιτοναϊκού καθετήρα μπορεί να γίνει χειρουργικά, λαπαροσκοπικά, περιτοναιοσκοπικά ή διαδερμικά (Asif et al., 2004, Crabtree JH et al., 2006, Riella MC et al., 2012). Ανεξαρτήτως της μεθόδου που επιλέγεται, πρέπει να εξασφαλίζεται η τοποθέτηση του άκρου του καθετήρα στην ελάσσονα πύελο, η σωστή τοποθέτηση των cuffs και η κατασκευή του σημείου εξόδου με τρόπο που να δυσχεραίνεται η είσοδος βακτηρίων. Τυπικά, στους καθετήρες με δύο cuffs, το πρώτο τοποθετείται εντός της θήκης του ορθού κοιλιακού μυός και το δεύτερο στον υποδόριο ιστό, 2-4 εκ. από το σημείο εξόδου. Γύρω από τα cuffs αναπτύσσεται ινώδης ιστός, ο οποίος αφ ενός μεν σταθεροποιεί και ακινητοποιεί τον καθετήρα στο κοιλιακό τοίχωμα, αφ ετέρου δε σχηματίζει φραγμό που εμποδίζει την είσοδο βακτηρίων και κυτταρικών συγκριμμάτων του δέρματος στη σήραγγα (tunnel) του καθετήρα (βλ. Εικόνα 8). Εικόνα 8: Η βέλτιστη θέση για την τοποθέτηση του περιτοναϊκού καθετήρα στο κοιλιακό τοίχωμα (Ash SR et al., 2005) Διαλύματα Περιτοναϊκής Κάθαρσης Τα διαλύματα περιτοναϊκής κάθαρσης περιέχουν ύδωρ, ηλεκτρολύτες, γαλακτικά ή διττανθρακικά ανιόντα και έναν ωσμωτικό παράγοντα, συνήθως δεξτρόζη. Επίσης, υπάρχουν 38

39 διαλύματα αμινοξέων για τη θρεπτική υποστήριξη επιλεγμένων ασθενών. Τα διαλύματα περιέχονται σε αποστειρωμένους πλαστικούς σάκους Διαλύματα δεξτρόζης Ο ευρύτερα χρησιμοποιούμενος ωσμωτικός παράγοντας στα διαλύματα περιτοναϊκής κάθαρσης είναι η δεξτρόζη. Κυκλοφορούν διαλύματα τριών διαφορετικών συγκεντρώσεων δεξτρόζης 1,5%, 2,5% και 4,25%, οι οποίες αναλογούν σε συγκεντρώσεις άνυδρης γλυκόζης 1,36%, 2,27% και 3,86%. Η δεξτρόζη είναι ασφαλής, φθηνή και πλούσια σε θερμίδες. Ωστόσο, μπορεί να επιδεινώσει συνυπάρχουσα υπεργλυκαιμία, να οδηγήσει σε παχυσαρκία, δυσλιπιδαιμία και αντίσταση στην ινσουλίνη και μακροπρόθεσμα, να προκαλέσει βλάβη στην περιτοναϊκή μεμβράνη. Η τοξική επίδραση της γλυκόζης στη μεμβράνη προκαλείται τόσο άμεσα, όσο και μέσω «προϊόντων αποδόμησης της γλυκόζης Glucose Degradation Products (GDP)», καθώς και μέσω των «προϊόντων τελικής γλυκοζυλίωσης Advanced Glycation End Products (AGEs)». Τα GDPs παράγονται κατά τη διαδικασία θερμικής αποστείρωσης των διαλυμάτων, ενώ τα AGEs παράγονται κατά τον μεταβολισμό της γλυκόζης. Η απορρόφηση γλυκόζης στην κυκλοφορία του αίματος, οδηγεί σε θετικό ισοζύγιο υδατανθράκων το οποίο είναι υπεύθυνο για την εμφάνιση παχυσαρκίας και μεταβολικών διαταραχών. Η ημερήσια πρόσληψη γλυκόζης μέσω των διαλυμάτων κυμαίνεται από γρ. Η συγκέντρωση νατρίου στο διάλυμα είναι mmol/l ώστε να αποφεύγεται η υπονατριαιμία αλλά και να επιτυγχάνεται επαρκής απομάκρυνση άλατος. Τα διαλύματα περιέχουν επίσης ασβέστιο σε συγκεντρώσεις 1,25-1,75mmol/l. Συνήθως, η συγκέντρωση ιονισμένου ασβεστίου πλάσματος είναι χαμηλότερη αυτής του διαλύματος, οπότε ο ασθενής προσλαμβάνει ασβέστιο. Αυτό δύναται να οδηγήσει σε υπερασβεστιαιμία, καταστολή της έκκρισης παραθορμόνης και αγγειακές επασβεστώσεις, ιδίως σε ασθενείς οι οποίοι λαμβάνουν επίσης φωσφοροδεσμευτικά που περιέχουν ασβέστιο. Οι ασθενείς αυτοί ωφελούνται από τη χρήση διαλυμάτων χαμηλής συγκέντρωσης ασβεστίου. Τα κλασικά διαλύματα περιέχουν γαλακτικά σε συγκεντρώσεις 35-40mmol/l. Τα γαλακτικά μεταβολίζονται στο ήπαρ και για τον μεταβολισμό τους καταναλώνονται κατιόντα Η +, οδηγώντας σε αύξηση 39

40 των διττανθρακικών. Ωστόσο, τα γαλακτικά καθιστούν το ph του διαλύματος όξινο (ph=5,2-5,5), γεγονός που συμβάλλει στη μειωμένη βιο-συμβατότητά τους. Το όξινο ph των διαλυμάτων έχει ενοχοποιηθεί ως πιθανό αίτιο μακροπρόθεσμης βλάβης στην περιτοναϊκή μεμβράνη, χωρίς να έχει όμως διαλευκανθεί ο ακριβής παθογενετικός μηχανισμός. Με σκοπό τη βελτίωση της βιο-συμβατότητας και, κατ επέκταση, τη μείωση της πιθανής βλαπτικής επίδρασης στην περιτοναϊκή μεμβράνη, έχουν αναπτυχθεί διαλύματα με συνδυασμό γαλακτικών/διττανθρακικών ή με διττανθρακικά αμιγώς. Ωστόσο, αν και η χρήση αυτών των διαλυμάτων είναι ευρεία, τα οφέλη από τη χρήση τους είναι αμφιλεγόμενα (Cho Y et al., 2013) Διάλυμα ικοδεξτρίνης Η ικοδεξτρίνη είναι υδατοδιαλυτό πολυμερές γλυκόζης, το οποίο παράγεται από υδρόλυση αμύλου. Αποτελείται από συνενούμενες αλυσίδες μορίων γλυκόζης, ποικίλου μεγέθους. Ως εκ τούτου, το μοριακό της βάρος δεν είναι σταθερό, αλλά κυμαίνεται από έως Da. Η ικοδεξτρίνη είναι κολλοειδής ουσία, η οποία δημιουργεί σημαντική ωσμωτική κλίση μεταξύ των τριχοειδών και της περιτοναϊκής κοιλότητας. Αν και η ωσμωτική κλίση που επιτυγχάνεται με την ικοδεξτρίνη είναι κατώτερη αυτής του υπέρτονου διαλύματος γλυκόζης (3,86%), η ικοδεξτρίνη απορροφάται βραδέως λόγω μεγάλου μοριακού βάρους, οπότε η ωσμωτική κλίση διατηρείται επί μακρόν. Το αποτέλεσμα είναι η επίτευξη σημαντικής υπερδιήθησης μετά από πολύωρη παραμονή του διαλύματος. Η ικοδεξτρίνη μεταβολίζεται σε μαλτόζη στο ήπαρ και δεν έχουν αναφερθεί ανεπιθύμητες ενέργειες από την αύξηση της συγκέντρωσης μαλτόζης στο αίμα. Η ικοδεξτρίνη έχει ενοχοποιηθεί για την πρόκληση αλλεργικής αντίδρασης με εξάνθημα και για την εμφάνιση άσηπτης περιτονίτιδας, ωστόσο η συχνότητα αυτών των συμβαμάτων είναι χαμηλή και δεν περιορίζει τη χρήση της Διάλυμα αμινοξέων Το διάλυμα αυτό έχει δημιουργηθεί με σκοπό την υποστήριξη της θρέψης, αν και η χρήση του περιορίζεται σε μία αλλαγή ημερησίως προκειμένου να διατηρείται το ισοζύγιο αζώτου. Επιπλέον, δύναται να επιδεινώσει τη μεταβολική οξέωση και να οδηγήσει σε αύξηση 40

41 της συγκέντρωσης ουρίας στον ορό. Ωστόσο, εάν η χρήση του συνδέεται με μακροπρόθεσμα οφέλη για την επιβίωση των ασθενών δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί (Τjiong HL et al., 2009) ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ - ΤΕΧΝΙΚΕΣ Οι δύο βασικές τεχνικές της περιτοναϊκής κάθαρσης είναι η Συνεχής Φορητή Περιτοναϊκή Κάθαρση ΣΦΠΚ (Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis CAPD) και η Αυτοματοποιημένη Περιτοναϊκή Κάθαρση ΑΠΚ (Automated Peritoneal Dialysis APD) Συνεχής Φορητή Περιτοναϊκή Κάθαρση (ΣΦΠΚ) Στην ΣΦΠΚ, διάλυμα περιτοναϊκής κάθαρσης παραμένει στην περιτοναϊκή κοιλότητα καθ όλη τη διάρκεια του 24ώρου. Ανά τακτά χρονικά διαστήματα, τυπικά 4 φορές ημερησίως, το διάλυμα αντικαθίσταται με νέο. Η αντικατάσταση του διαλύματος γίνεται χειροκίνητα. Ο όγκος του διαλύματος που εγχέεται σε κάθε αλλαγή είναι συνήθως 2 λίτρα, αλλά μπορεί να ποικίλει από 1,5 2,5 λίτρα, ανάλογα με τη σωματοδομή και τις ανάγκες του ασθενούς. Προ της έγχυσης, το διάλυμα θερμαίνεται σε θερμοκρασία σώματος. Για την εφαρμογή της ΣΦΠΚ, το ευρύτερα χρησιμοποιούμενο σύστημα είναι το σύστημα «διπλού σάκου» (αποσπώμενο σύστημα Υ). Το σύστημα αυτό περιλαμβάνει: 1.) Τον περιτοναϊκό καθετήρα 2.) το συνδετικό τμήμα του καθετήρα (transfer set) και 3.) τον διπλό σάκο του περιτοναϊκού διαλύματος (βλ. Εικόνα 9). 41

42 Εικόνα 9: Σχηματική απεικόνιση συστήματος διπλού σάκου για την εφαρμογή της ΣΦΠΚ. Η αντικατάσταση του περιτοναϊκού διαλύματος γίνεται βάσει του παρακάτω πρωτοκόλλου: 1. Ο ασθενής συνδέει τον σωλήνα σχήματος Υ στο συνδετικό τμήμα του καθετήρα, με άσηπτη τεχνική. 2. Μικρή ποσότητα διαλύματος από τον πλήρη σάκο αφήνεται να παροχετευτεί στον άδειο σάκο του συστήματος με σκοπό την έκπλυση του σημείου σύνδεσης από τυχόν βακτήρια. 3. Ο πλήρης σάκος απομονώνεται με σφιγκτήρα (clamp) και το διάλυμα που ήδη βρίσκεται στην περιτοναϊκή κοιλότητα αφήνεται να παροχετευθεί στον άδειο σάκο διά της αρχής των συγκοινωνούντων δοχείων. Για τον σκοπό αυτό, ο άδειος σάκος πρέπει να βρίσκεται πάντοτε σε χαμηλότερο επίπεδο από την περιτοναϊκή κοιλότητα. 4. Με την ολοκλήρωση της παροχέτευσης, απομονώνεται ο άδειος σάκος και απελευθερώνεται ο πλήρης, ώστε το νέο διάλυμα να εισρεύσει στην περιτοναϊκή κοιλότητα. 5. Με την ολοκλήρωση της έγχυσης, αποσυνδέεται το σύστημα Υ και στο άκρο του καθετήρα τοποθετείται αποστειρωμένη καλύπτρα. Η εισαγωγή του συστήματος διπλού σάκου αποτέλεσε κομβικό σημείο στην ιστορία της ΠΚ, καθώς απλοποίησε τη διαδικασία σύνδεσης και αποσύνδεσης, με αποτέλεσμα τη δραματική 42

43 μείωση των επεισοδίων περιτονίτιδας στους ασθενείς. Αυτή η μείωση, επέτρεψε τη μακροχρόνια εφαρμογή της ΠΚ και την κατέστησε ασφαλή και εφάμιλλη της ΑΚ μέθοδο για την υποκατάσταση της νεφρικής λειτουργίας Αυτοματοποιημένη Περιτοναϊκή Κάθαρση (ΑΠΚ) Στην ΑΠΚ, οι αλλαγές περιτοναϊκού διαλύματος γίνονται με τη βοήθεια ειδικής συσκευής (cycler). Η ΑΠΚ περιλαμβάνει τις εξής παραλλαγές: Συνεχής Κυκλική Περιτοναϊκή Κάθαρση (CCPD) Νυχτερινή Διαλείπουσα Περιτοναϊκή Κάθαρση (NIPD) Διαλείπουσα Περιτοναίκή Κάθαρση (IPD) Παλιρροϊκή Περιτοναϊκή Κάθαρση (TPD) Στις CCPD και NIPD, οι αλλαγές περιτοναϊκού διαλύματος με τη χρήση του cycler γίνονται κατά τη διάρκεια της νύχτας. Η διαφορά μεταξύ τους είναι ότι στη μεν NIPD η περιτοναϊκή κοιλότητα παραμένει άδεια στη διάρκεια της ημέρας, στη δε CCPD παραμένει περιτοναϊκό διάλυμα στην περιτοναϊκή κοιλότητα στη διάρκεια της ημέρας. Το χαρακτηριστικό της TPD είναι ότι σε κάθε αλλαγή διαλύματος αντικαθίσταται μόνο το 40-60% του αρχικού όγκου. Για το λόγο αυτό τα θεραπευτικά σχήματα της TPD απαιτούν πολύ μεγαλύτερο όγκο διαλυμάτων ανά 24ωρο (περίπου λίτρα) και ως εκ τούτου είναι κοστοβόρα. Δεδομένου επίσης ότι δεν απεδείχθη να προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των άλλων παραλλαγών, η χρήση τους έχει περιοριστεί κατά πολύ. Τέλος, η IPD, αποτελεί παραλλαγή κατά την οποία η ΑΠΚ δεν εφαρμόζεται καθημερινά, αλλά συνήθως πραγματοποιούνται 3 συνεδρίες την εβδομάδα, διάρκειας 8-10 ωρών εκάστη. Η μέθοδος αυτή προσφέρεται για ασθενείς οι οποίοι δεν δύνανται να αυτοεξυπηρετηθούν και πραγματοποιείται στο χώρο της Μονάδας Περιτοναϊκής Κάθαρσης (in-centre PD). 43

44 Εικόνα 10: Παραλλαγές της περιτοναϊκής κάθαρσης (Il Soo Ha, 2009). Η συσκευή cycler, δύναται να προγραμματιστεί σύμφωνα με τις ανάγκες του ασθενούς και της θεραπείας. Ο χρόνος θεραπείας, ο αριθμός και η διάρκεια των αλλαγών και ο όγκος και το είδος του διαλύματος που χρησιμοποιείται σε κάθε αλλαγή είναι στοιχεία που μπορούν να μεταβληθούν, οδηγώντας στη δυνατότητα συνταγογράφησης πολλών διαφορετικών σχημάτων. Σημαντικό πλεονέκτημα της ΑΠΚ είναι η μείωση της επίπτωσης των επεισοδίων περιτονίτιδας, αν και ο σχετικός κίνδυνος ανάπτυξης περιτονίτιδας για κάθε ασθενή δεν φαίνεται να διαφέρει. Επίσης, η ΑΠΚ προσφέρει μεγαλύτερη ευελιξία, καθώς οι ασθενείς δεν απαιτείται να πραγματοποιούν αλλαγές στη διάρκεια της ημέρας. Ως πιθανά πλεονεκτήματα έχουν αναφερθεί επίσης η μείωση των μηχανικών επιπλοκών και η επίτευξη υψηλότερης κάθαρσης μικρομοριακών ουσιών, ενώ ως μειονέκτημα η ταχύτερη απώλεια της υπολειπόμενης νεφρικής λειτουργίας. Ωστόσο, τα ευρήματα αυτά δεν έχουν επαληθευτεί σε συστηματική ανασκόπηση τυχαιοποιημένων κλινικών μελετών και απαιτούνται μεγαλύτερες μελέτες για τη διαλεύκανσή τους (Rabindranath KS et al., 2007). 44

45 Εικόνα 11: Σύγχρονη συσκευή ΑΠΚ 2.6. ΕΠΑΡΚΕΙΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Με τον όρο «επάρκεια» της περιτοναϊκής κάθαρσης, εννοείται η ικανότητα της μεθόδου να αποκαθιστά, κατά το δυνατόν, την ομοιόσταση των υγρών, των ηλεκτρολυτών και την οξεοβασική ισορροπία. Ωστόσο, η περιτοναϊκή κάθαρση αποκαθιστά τις λειτουργίες αυτές μόνο εν μέρει, σε σχέση με τους φυσιολογικούς νεφρούς. Για τον λόγο αυτό η κάθαρση θεωρείται επαρκής, όταν περαιτέρω ενίσχυσή της δεν συνοδεύεται από κλινική βελτίωση του ασθενούς, ούτε από αύξηση της επιβίωσής του. Για την εκτίμηση της επάρκειας της περιτοναϊκής κάθαρσης χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός κλινικών παρατηρήσεων κριτηρίων και εργαστηριακών παραμέτρων. Η κλινική εκτίμηση στοχεύει στην αναγνώριση της κατάστασης του όγκου, στον έλεγχο της αρτηριακής πίεσης και στην παρουσία ή απουσία συμπτωμάτων και σημείων ενδεικτικών του ουραιμικού συνδρόμου και της μεταβολικής οξέωσης. Η υπερφόρτωση με υγρά, η παρουσία αρτηριακής υπέρτασης ή/και ουραιμικής συμπτωματολογίας αποτελούν ενδείξεις μη επαρκούς κάθαρσης. Για την εργαστηριακή εκτίμηση της επάρκειας της ΠΚ, χρησιμοποιούνται η εβδομαδιαία κάθαρση της ουρίας και της κρεατινίνης Εβδομαδιαία κάθαρση ουρίας Εκτιμάται με τον υπολογισμό του λόγου Kt/V της ουρίας. Ο λόγος αυτός αντιστοιχεί στην εβδομαδιαία κάθαρση ουρίας (Kt), προς τον εκτιμώμενο όγκο κατανομής της ουρίας (V). Σύμφωνα με τις σχετικές κατευθυντήριες οδηγίες, ο λόγος Kt/V ουρίας δεν θα πρέπει να είναι 45

46 χαμηλότερος από 1,7 (Lo WK et al., 2006). Ο στόχος αυτός περιλαμβάνει τόσο την κάθαρση που επιτυγχάνεται μέσω της ΠΚ, όσο και την κάθαρση που οφείλεται στην υπολειπόμενη νεφρική λειτουργία του ασθενούς. Ο υπολογισμός του Kt/V γίνεται ως ακολούθως: Ολικό Kt/V = Kt/V περιτοναίου+ Kt/V νεφρών (1). Ημερήσιο Kt περιτοναίου = Συγκέντρωση ουρίας σε 24ωρη συλλογή διαλύματος / συγκέντρωση ουρίας ορού (σε δείγμα που ελήφθη το 24ωρο της συλλογής) (2). Ημερήσιο Kt νεφρών = Συγκέντρωση ουρίας σε 24ωρη συλλογή ούρων / συγκέντρωση ουρίας ορού (3). Με τους τύπους (2) και (3) υπολογίζεται η ημερήσια κάθαρση ουρίας. Εβδομαδιαίο ολικό Kt = Ημερήσιο Kt x 7 (4). Ο όγκος κατανομής της ουρίας (V) υπολογίζεται με βάση τον τύπο Watson. Άνδρες: V = 2,447 (0,09516 x A) + (0,1704 x H) + (0,3362 x W). Γυναίκες: V = -2,097 + (0,1069 x H) + (0,2466 x W). Όπου Α: Ηλικία (έτη), Η: Ύψος (εκ.), W: Βάρος (κιλά) Εβδομαδιαία κάθαρση κρεατινίνης Ο υπολογισμός είναι παρόμοιος με αυτόν του Kt/V ουρίας. Απαιτείται 24ωρη συλλογή περιτοναϊκού διαλύματος και ούρων. Ολική Cl Cr = Cl Cr περιτοναίου + Cl Cr νεφρών Ημερήσια Cl Cr περιτοναίου = Ημερήσιος όγκος διαλύματος x D/P κρεατινίνης. Ημερήσια Cl Cr νεφρών = 0,5 x (Cr ούρων 24ώρου/Cr ορού + Ουρία ούρων 24ώρου/Ουρία ορού). Η υπολογιζόμενες, Cl Cr περιτοναίου και νεφρών διορθώνονται για την επιφάνεια σώματος (ανά 1,73m 2 BSA). Η επιφάνεια σώματος (BSA) υπολογίζεται συνήθως από τον τύπο Du Bois ως εξής: BSA (m 2 ) = 0, x W 0,425 x H 0,725. Όπου: BSA: Body Surface Area, W: Βάρος (κιλά), Η: Ύψος (εκ.). Επειδή στη νεφρική νόσο τελικού σταδίου η κάθαρση κρεατινίνης υπερεκτιμά κατά πολύ τον πραγματικό ρυθμό σπειραματικής διήθησης (GFR), η νεφρική κάθαρση κρεατινίνης υπολογίζεται συμβατικά από τον μέσο όρο της κάθαρσης κρεατινίνης και της κάθαρσης ουρίας. 46

47 2.7. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΣΥΝΤΑΓΟΓΡΑΦΗΣΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Στην κλινική πράξη, οι τιμές του λόγου Kt/V και της Cl Cr που υπολογίζονται με τις παραπάνω μεθόδους παρουσιάζουν μεγάλες διακυμάνσεις μεταξύ διαφορετικών ασθενών, αλλά και στον ίδιο ασθενή σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Η κυριότερη αιτία αυτών των διακυμάνσεων είναι η υπολειπόμενη νεφρική λειτουργία. Είναι προφανές, ότι σε ασθενείς με σημαντική υπολειπόμενη νεφρική λειτουργία αρκούν μικρότερες τιμές περιτοναϊκής Cl Cr και Kt/V για την επίτευξη των θεραπευτικών στόχων. Αντιθέτως, ασθενείς που καθίστανται άνουροι απαιτούν προσαρμογή της θεραπείας τους ώστε το σύνολο των στόχων να επιτυγχάνεται μέσω της ΠΚ. Οι ασθενείς αυτοί απαιτούν επιπλέον αύξηση της υπερδιήθησης με τη χρήση περισσότερων υπέρτονων διαλυμάτων. Έτερος σημαντικός παράγοντας είναι η μεταφορική ικανότητα της περιτοναϊκής μεμβράνης. Γενικά, οι αργοί μεταφορείς επωφελούνται από μεγάλης διάρκειας αλλαγές και μεγάλο όγκο διαλύματος, ενώ αντίθετα οι ταχείς μεταφορείς επωφελούνται από σύντομης διάρκειας αλλαγές. Πίνακας 8: Παράγοντες που καθορίζουν την κάθαρση στην ΠΚ Υπολειπόμενη Νεφρική λειτουργία Μεταφορική ικανότητα περιτοναίου Σωματοδομή Όγκος διαλύματος / αλλαγή Συχνότητα αλλαγών Τονικότητα διαλύματος Χρόνος παραμονής διαλύματος Συνολικός όγκος διαλύματος (ΑΠΚ) Συνολικός χρόνος θεραπείας (ΑΠΚ) Συνήθως, η αρχική συνταγογράφηση της θεραπείας γίνεται βάσει πρωτοκόλλου που τηρείται από τη Μονάδα Περιτοναϊκής Κάθαρσης, λαμβάνοντας υπ όψιν τη σωματοδομή του 47

48 ασθενούς και την υπολειπόμενη νεφρική λειτουργία. Κατά τον δεύτερο μήνα της θεραπείας διενεργείται τυπικά το πρώτο ΡΕΤ και η συνταγογράφηση αναθεωρείται βάσει της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου. Έκτοτε, η συνταγογράφηση αναθεωρείται βάσει της κλινικής εικόνας του ασθενούς, των τιμών Kt/V και Cl Cr οι οποίες προσδιορίζονται σε τακτά διαστήματα, των αποτελεσμάτων νέων ΡΕΤ, τα οποία επαναλαμβάνονται συνήθως 1-2 φορές ετησίως και τέλος βάσει της υπολειπόμενης νεφρικής λειτουργίας η οποία παρακολουθείται τακτικά ΕΠΙΠΛΟΚΕΣ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ Οι επιπλοκές της ΠΚ διακρίνονται σε λοιμώδεις και μη λοιμώδεις. Οι λοιμώδεις επιπλοκές οφείλονται είτε στον εποικισμό του σημείου εξόδου από παθογόνους μικροοργανισμούς, είτε στην είσοδο μικροοργανισμών στην υποδόρια σήραγγα του καθετήρα και/ή στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Οι μη λοιμώδεις επιπλοκές οφείλονται σε δυσλειτουργία του περιτοναϊκού καθετήρα, σε αύξηση της ενδοπεριτοναϊκής πίεσης ή σε διαταραχές της δομής και της λειτουργίας της περιτοναϊκής μεμβράνης, οι οποίες εμφανίζονται προϊόντος του χρόνου. Τέλος, η ΠΚ συνοδεύεται συχνά από μεταβολικές διαταραχές. Οι επιπλοκές που σχετίζονται με τον καθετήρα τείνουν να εμφανίζονται το πρώτο χρονικό διάστημα από την έναρξη της μεθόδου, ενώ οι μεταβολικές διαταραχές και η δυσλειτουργία της περιτοναϊκής μεμβράνης αποτελούν συνήθως όψιμες επιπλοκές. Αντίθετα, οι λοιμώδεις επιπλοκές δύνανται να παρουσιαστούν οποιαδήποτε χρονική στιγμή. Πίνακας 9: Επιπλοκές Περιτοναϊκής Κάθαρσης ΛΟΙΜΩΔΕΙΣ ΕΠΙΠΛΟΚΕΣ Περιτονίτιδα Λοίμωξη σημείου εξόδου καθετήρα Λοίμωξη υποδόριας σήραγγας ΜΗ ΛΟΙΜΩΔΕΙΣ ΕΠΙΠΛΟΚΕΣ Δυσλειτουργία περιτοναϊκού καθετήρα Δυσχέρεια εισροής/εκροής Μετανάστευση άκρου καθετήρα Απόφραξη αυλού (ινική, επίπλουν κ.ά.) Διαφυγή υγρού (leak) Διαφυγή από σημείο εξόδου Υδροθώρακας 48

49 Κήλες Άλγος εισόδου/εξόδου διαλύματος Αιματηρός σάκος Διαταραχές περιτοναϊκής μεμβράνης (Ίνωση περιτοναίου, Σκληρυντική περιτονίτιδα) Μεταβολικές διαταραχές Διαφυγή στο κοιλιακό τοίχωμα (οίδημα) Βουβωνοκήλη Ομφαλοκήλη Μηροκήλη Ανεπάρκεια κάθαρσης/υπερδιήθησης Υποθρεψία Δυσλιπιδαιμία Παχυσαρκία 2.9. ΕΠΙΒΙΩΣΗ ΜΕΘΟΔΟΥ Παρά το γεγονός ότι η ΠΚ θεωρείται ισάξια ή ακόμη και υπέρτερη της αιμοκάθαρσης (ΑΚ) σε ό,τι αφορά στην επιβίωση των ασθενών, η επιβίωση της μεθόδου υπολείπεται σημαντικά αυτής της ΑΚ. Στοιχεία από μεγάλη επιδημιολογική μελέτη στον Καναδά σε ασθενείς που εντάχθηκαν σε θεραπεία υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας σε διάστημα 17 ετών ( ), εκ των οποίων σε ΠΚ (30,5%), έδειξαν ότι στο 50% των ασθενών η μέθοδος διακόπηκε εντός των πρώτων 2 ετών από την έναρξή της, ενώ λιγότερο από 20% των ασθενών παρέμεναν στη μέθοδο μετά από 5 έτη (Yeates K et al., 2012). 49

50 Εικόνα 12: Πραγματική επιβίωση μεθόδου ανά χρονική περίοδο και συνολικά, για διάστημα παρακολούθησης 60 μηνών. Παρατηρείται πρώιμος διαχωρισμός της επιβίωσης μεταξύ ΑΚ και ΠΚ, με την επιβίωση της δεύτερης να μειώνεται σημαντικά ήδη από τους πρώτους 10 μήνες (Yeates K et al., 2012). Στο σύνολο των ασθενών που εντάσσονται σε θεραπεία υποκατάστασης νεφρικής λειτουργίας με ΠΚ, οι κυριότερες αιτίες διακοπής της μεθόδου είναι η μεταμόσχευση νεφρού και ο θάνατος. Εάν ληφθούν υπ όψιν μόνο οι αιτίες που σχετίζονται με τη μέθοδο καθ εαυτή, οι κυριότερες αιτίες διακοπής της διαφέρουν ανάλογα με το χρονικό διάστημα από την έναρξη της μεθόδου. Στοιχεία από επιδημιολογική μελέτη στην Ολλανδία σε 709 ασθενείς που εντάχθηκαν σε ΠΚ, έδειξαν ότι οι λοιμώδεις επιπλοκές ήταν η κύρια αιτία απώλειας της μεθόδου σε 10-18% των ασθενών. Οι σχετιζόμενες με τον καθετήρα επιπλοκές ήταν η αιτία σε 15% των ασθενών κατά τους πρώτους 3 μήνες από την έναρξη της μεθόδου, σε 7% κατά το πρώτο έτος, ενώ έκτοτε υποχώρησαν σε 1-2%. Οι επιπλοκές που σχετίζονται με διαταραχές της περιτοναϊκής μεμβράνης (ανεπάρκεια κάθαρσης/υπερδιήθησης) αποτελούσαν την αιτία απώλειας της μεθόδου σε 2% των ασθενών κατά τους πρώτους 3 μήνες και σε 6% του συνόλου μετά τα 2 έτη. Ωστόσο, από τις σχετιζόμενες με τη μέθοδο αιτίες, μετά τα πρώτα 2 έτη η ανεπάρκεια κάθαρσης/υπερδιήθησης αποτελεί τη δεύτερη συχνότερη αιτία απώλειας της μεθόδου μετά τις λοιμώξεις (Kolesnyk I et al., 2010). 50

51 Εικόνα 13: Αίτια (Α) και επίπτωση ανά αίτιο (Β) εγκατάλειψης της ΠΚ για 4 περιόδους παρακολούθησης. UFF=Ανεπάρκεια υπερδιήθησης, Tx=Μεταμόσχευση νεφρού (Kolesnyk I et al., 2010) ΙΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΙΟΥ (ΠΙ) Η οντότητα αυτή περιγράφηκε πρώτη φορά το 1994 (Chaimovitz C, 1994) σε έναν ασθενή υπό ΠΚ. Το πιο σημαντικό εύρημα ήταν η απώλεια της μεσοθηλιακής στοιβάδας και η πάχυνση του υπομεσοθηλιακού συνδετικού ιστού, ενδεικτική ίνωσης, εύρημα που επιβεβαίωσε προηγούμενες παρατηρήσεις (Dobbie JW, 1980, 1990). Ωστόσο, έως σήμερα δεν υπάρχει ενιαίος και συμπαγής ορισμός της ΠΙ και ο όρος χρησιμοποιείται για να περιγράψει ένα φάσμα εκδηλώσεων το οποίο κυμαίνεται από την ήπια, ασυμπτωματική σκλήρυνση του περιτοναίου που απαντάται σχεδόν σε όλους τους ασθενείς της ΠΚ, έως τις σπάνιες και συχνά θανατηφόρες περιπτώσεις σκληρυντικής περιτονίτιδας (βλ. 2.11) (Garosi G et al., 2006) Παθοφυσιολογία της ίνωσης του περιτοναίου Η παθοφυσιολογία της ΠΙ δεν έχει διαλευκανθεί πλήρως, ωστόσο θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα δύο επί μέρους διεργασιών οι οποίες αλληλεπιδρούν: Της ίνωσης και της φλεγμονής (βλ. Εικόνα 14). Ίνωση: Η απώλεια της μεσοθηλιακής στοιβάδας και η πάχυνση του υποκείμενου συνδετικού ιστού θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα της διαφοροποίησης των μεσοθηλιακών κυττάρων σε μυοϊνοβλάστες, διεργασία γνωστή ως επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάπτωση 51

52 (epithelial-mesenchymal transition EMT) (Yañez-Mo Μ et al., 2003) (βλ. Εικόνα 15). Τα μεσοθηλιακά κύτταρα διηθούν την υπομεσοθηλιακή στοιβάδα και παράγουν εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (extracellular matrix ECM) προκαλώντας ίνωση. Η ΕΜΤ θεωρείται ότι είναι αποτέλεσμα της δράσης του TGF-β (Transforming Growth Factor-β). Η άμεση συνέπεια είναι η αυξημένη παραγωγή VEGF (vascular endothelial growth factor), υποδοχείς του οποίου έχουν ταυτοποιηθεί σε μεσοθηλιακά κύτταρα τόσο σε ανθρώπους όσο και σε πειραματόζωα (Perez-Lozano ML et al., 2013). Ο VEGF προκαλεί αγγειοδιαστολή και αύξηση της διαπερατότητας των τριχοειδών, επάγοντας ταχεία μεταφορά ουσιών και μείωση της υπερδιήθησης (Aroeira LS et al., 2005). Ωστόσο, η συμβολή της ΕΜΤ στην ΠΙ in vivo δεν έχει αποδειχθεί επαρκώς και παραμένει αμφισβητούμενη (Liu Y et al., 2015). Η δράση του TGF-β εξαρτάται από διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια που περιλαμβάνουν τα μόρια Smad, τις κινάσες PKC, JNK, PI3K και μη-κωδικοποιά μόρια RNA με ρυθμιστικές λειτουργίες, όπως τα mirna-28,30a,589,129-5p. Οι κυριότεροι παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για τη λειτουργική διαταραχή των μεσοθηλιακών κυττάρων και για την παραγωγή TGF-β και VEGF, είναι η γλυκόζη και τα προϊόντα αποδόμησης της γλυκόζης (GDP) (βλ ). Τέλος, έχει ενοχοποιηθεί το ενδογενές σύστημα της πρωτεΐνης gremlin, η οποία αναστέλλει τις πρωτεΐνες της οικογένειας BMP (bone morphogenic proteins), οι οποίες φυσιολογικά αναστέλλουν τη δράση του TGF-β. Το σύστημα αυτό είναι ενεργοποιημένο στους ασθενείς υπό ΠΚ και επάγει την ΕΜΤ οδηγώντας σε ίνωση (Siddique I et al., 2014). Φλεγμονή: Τα επεισόδια περιτονίτιδας μπορούν να οδηγήσουν σε βλάβη των μεσοθηλιακών κυττάρων και ίνωση. Η συχνότητα των επεισοδίων, η βαρύτητά τους και ο χρόνος εμφάνισής τους σχετίζονται με την εμφάνιση των διαταραχών της μεμβράνης (Wong YY et al. 2013, del Peso G et al. 2005, Selgas R et al. 1998). Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6), ως δείκτης φλεγμονής, έχει σχετιστεί με την μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου, προδιαθέτοντας σε ίνωση (Lambie M et al., 2013, Davies SJ, 2014). Η φλεγμονή ξεκινά με τη βλάβη των μεσοθηλιακών κυττάρων και την αύξηση του transcription nuclear factor of activated T cells, ο οποίος επάγει τον πυρηνικό παράγοντα κβ (NF-κΒ) με αποτέλεσμα την προσέλκυση και συσσώρευση μακροφάγων (Yung S et al., 2012, Kitterer D et al., 2015). 52

53 Κατά τη διάρκεια ενός επεισοδίου περιτονίτιδας ο φαινότυπος των μακροφάγων διαφέρει ανάλογα με την έκβαση του επεισοδίου. Κατά τις πρώτες ημέρες του επεισοδίου, τα μακροφάγα ενεργοποιούνται μέσω της κλασσικής οδού. Μετά τη λύση της λοίμωξης, κυριαρχούν οι πληθυσμοί μακροφάγων που έχουν ενεργοποιηθεί μέσω της εναλλακτικής οδού, βοηθώντας στην αποκατάσταση της βλάβης. Η χημοκίνη CCL-18 ενέχεται στην ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού των μακροφάγων (Bellon T et al., 2011). Εάν τα μακροφάγα αυτά παραμείνουν ενεργά επί μακρόν, εμφανίζεται ίνωση. Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυξημένη συγκέντρωση CCL-18 στο περιτοναϊκό διάλυμα προαναγγέλλει ανεπάρκεια της μεμβράνης και σκληρυντική περιτονίτιδα, αλλά τα αποτελέσματα είναι αντικρουόμενα (Ahmad S et al., 2010, Goodlad C et al., 2014). Δεδομένα από πειραματικά μοντέλα έχουν δείξει ότι τα ενεργοποιημένα μακροφάγα παράγουν πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τον TGF-β προάγοντας την ΕΜΤ (Lee SH et al., 2012). Μέσω των μηχανισμών αυτών η φλεγμονή και η ΕΜΤ συνδέονται προάγοντας την ίνωση. Στη φλεγμονώδη διεργασία συμμετέχουν τέλος και δύο άλλα συστήματα, το σύστημα του tumor necrosis factor like weak inducer of apoptosis (TWEAK)/Fn14 (Sanz AB et al., 2014) και το σύστημα ιντερλευκίνης-17/τ-βοηθητικών κυττάρων-17 (Th-17/IL-17) (Rodriguez-Diez R et al., 2014). Στη διάρκεια της φλεγμονής, τα μεσοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν το μόριο Fn14, και ο TWEAK προκαλεί την παραγωγή χημοκινών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του NF-κΒ. Η διεργασία αυτή επιστρατεύει μακροφάγα στο περιτόναιο μέσω της χημοκίνης CCL- 21 η οποία δρα και στους ινοβλάστες, προάγοντας πιθανώς την ίνωση. Η έκφραση IL-17 σε δείγματα από βιοψία περιτοναίου ασθενών υπό ΠΚ σχετίζεται με τη διήθηση του ιστού από φλεγμονώδη κύτταρα. 53

54 Εικόνα 14: Αίτια και χρονική εξέλιξη της βλάβης της περιτοναϊκής μεμβράνης που οδηγεί στην περιτοναϊκή ίνωση (Fraser DJ & Topley N, 2009). Εικόνα 15: Επιθηλιακή-μεσεγχυματική μετάπτωση των μεσοθηλιακών κυττάρων (Aroeira LS et al., 2007). 54

55 Διάγνωση της ίνωσης του περιτοναίου Η οριστική διάγνωση της ίνωσης του περιτοναίου μπορεί να τεθεί μόνο με μικροσκοπική εξέταση ιστού από βιοψία περιτοναίου (gold standard). Οι προεξάρχουσες μορφολογικές αλλοιώσεις της περιτοναϊκής μεμβράνης είναι οι ακόλουθες (βλ. Εικόνες 16, 17): Απώλεια της μεσοθηλιακής στοιβάδας Πάχυνση της υπομεσοθηλιακής ζώνης συνδετικού ιστού Υαλίνωση των τριχοειδών Νεοαγγειογένεση Οι μορφολογικές αυτές αλλοιώσεις ξεκινούν ήδη από το στάδιο της ουραιμίας (πριν την έναρξη της ΠΚ) αλλά συνήθως γίνονται εμφανείς μετά τα πρώτα 2 έτη της θεραπείας (Williams JD et al., 2002). Υπάρχουν ενδείξεις ότι η χρήση περισσότερο βιοσυμβατών διαλυμάτων συνοδεύεται από ηπιότερες ιστολογικές αλλοιώσεις (Kawanishi K et al., 2013). 55

56 Εικόνα 16: Μορφολογικές αλλοιώσεις του τοιχωματικού περιτοναίου υγιούς ατόμου (1a) και ασθενούς μετά από 9 έτη θεραπείας με ΠΚ (1b). Διακρίνεται η πάχυνση της υπομεσοθηλιακής ζώνης πυκνού συνδετικού ιστού. Χρώση μπλε τολουιδίνης, κλίμακα 1:500μm. Εικόνες 2a-2d: Μορφολογικά χαρακτηριστικά αιμοφόρων αγγείων τοιχωματικού περιτοναίου. Εγκάρσιες τομές όπου διακρίνονται διαφορετικά στάδια υαλινωτικής αγγειοπάθειας: (2a): Υπενδοθηλιακή ζώνη υαλίνης <7μm, (2b): >7μm με φυσιολογικό αυλό, (2c): Στένωση αυλού, (2d): Πλήρης απόφραξη αυλού από συνδετικό ιστό. Χρώση μπλε τολουιδίνης, κλίμακα 1:10μm (Williams JD et al., 2002). 56

57 (α) (β) Εικόνα 17: (α). Εγκάρσια διατομή φυσιολογικού περιτοναίου Διακρίνεται η μεσοθηλιακή στοιβάδα και η υπομεσοθηλιακή ζώνη (50μm). (β). Εγκάρσια διατομή περιτοναίου διαβητικού ασθενούς μετά από 4 έτη υπό ΠΚ Διακρίνεται η απώλεια του μεσοθηλίου και η πάχυνση της υπομεσοθηλιακής ζώνης συνδετικού ιστού (1600μm) (Savidaki I et al., 2003). Οι ιστολογικές αλλοιώσεις της περιτοναϊκής μεμβράνης οδηγούν σε λειτουργικές διαταραχές, οι οποίες είναι αποτέλεσμα της αύξησης της μεταφορικής ικανότητας του περιτοναίου. Η κυριότερη κλινική εκδήλωση είναι η απώλεια της υπερδιήθησης, λόγω ταχείας απορρόφησης της γλυκόζης από την περιτοναϊκή κοιλότητα και απώλειας της ωσμωτικής κλίσης (Davies SJ, 2004). Η φυσική πορεία αυτού του φαινομένου ξεκινά με την έναρξη της ΠΚ, αλλά δεν είναι όμοια σε όλους τους ασθενείς. Τυχόν επεισόδια περιτονίτιδας δύνανται να επιταχύνουν την εξέλιξη του φαινομένου. 57

58 2.11. ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ Η σκληρυντική περιτονίτιδα (encapsulating peritoneal sclerosis EPS) είναι μία σπάνια αλλά σοβαρή επιπλοκή της ΠΚ η οποία συνοδεύεται από μεγάλη νοσηρότητα και θνητότητα. Ο συνολικός κίνδυνος εμφάνισής της κυμαίνεται από 0,54% έως 3,3% (Afthentopoulos IE et al., 1998, Summers AM et al., 2005). Η επίπτωσή της αυξάνεται με τη διάρκεια της ΠΚ και κυμαίνεται από 0,7% έως 8,1% στα 5 έτη θεραπείας και από 2,1% έως 19,4% στα 8 έτη θεραπείας (Kawanishi H et al., 2004, Brown MC et al., 2009, Rigby RJ et al., 1998). Το γεγονός αυτό προκαλεί ανησυχία καθώς η βελτιωμένη επιβίωση της μεθόδου κατά τις τελευταίες δεκαετίες έχει καταστήσει δυνατή την εφαρμογή της για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Η ανάπτυξη της EPS έχει συσχετιστεί με ποικίλα δημογραφικά και κλινικά χαρακτηριστικά, όπως φορτίο γλυκόζης, ταχεία μεταφορά ουσιών από το περιτόναιο, ενδοπεριτοναϊκή φλεγμονή, χρήση ικοδεξτρίνης, ανεπάρκεια υπερδιήθησης, διακοπή της μεθόδου, ηλικία και γενετική προδιάθεση (Johnson DW et al, 2010, Korte MR et al. 2011, Morelle J et al. 2015, Sampimon DE et al. 2010, Lambie ML et al. 2010, Balasubramaniam G et al. 2009, Yamamoto R et al. 2005, Summers AM et al. 2006). Η παθογένεια της EPS δεν έχει διευκρινιστεί. Θεωρείται ότι αποτελεί ακραία εκδήλωση της ίνωσης του περιτοναίου (Garosi G et al., 2006). Για την ερμηνεία της έχει προταθεί η θεωρία των πολλαπλών προσβολών (multiple hit theory). Σύμφωνα με αυτή, η ουραιμία και η έκθεση στα συστατικά των διαλυμάτων ΠΚ προκαλεί τις χρόνιες βλάβες που παρατηρούνται στην ίνωση. Σε μία μειοψηφία ασθενών, η επίδραση μίας ή περισσοτέρων επιπρόσθετων προσβολών (πχ. επεισόδια περιτονίτιδας), δύναται να εκτρέψει τις διεργασίες αυτές προς την εκδήλωση της EPS. Ιστολογικά, η EPS χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη εναπόθεση ινώδους και περισσότερη φλεγμονή σε σχέση με την ίνωση του περιτοναίου, ωστόσο δεν έχει καταστεί δυνατή η θέσπιση κριτηρίων που να διαχωρίζουν πλήρως τις δύο αυτές οντότητες (Honda K et al. 2005). Το κλινικό σύνδρομο της EPS χαρακτηρίζεται κυρίως από εμμένοντα ή υποτροπιάζοντα συμπτώματα και σημεία εντερικής δυσλειτουργίας (που κυμαίνονται από εναλλαγές συνηθειών του εντέρου έως πλήρη εντερική απόφραξη και ειλεό) και από διαταραχές θρέψης (Kawaguchi Y et al. 2000). Η διάγνωση της EPS γίνεται είτε με 58

59 λαπαροτομή είτε με αξονική τομογραφία (Tarzi RM et al. 2008). Κατά τη λαπαροτομή, χαρακτηριστικό μακροσκοπικό εύρημα αποτελεί η εκσεσημασμένη πάχυνση και σκλήρυνση του περιτοναίου, το οποίο σχηματίζει ένα σκληρό, ινώδες περίβλημα (cocoon), εγλωβίζοντας τις εντερικές έλικες (βλ. Εικόνα 18). Ενδεικτικά ακτινολογικά ευρήματα της EPS αποτελούν: Η πάχυνση του περιτοναίου, η συγκόλληση (tethering) των εντερικών ελίκων και η παρουσία εντοπισμένων ασκιτικών συλλογών (βλ. Εικόνα 19). Για την EPS δεν υπάρχει έως σήμερα αποτελεσματική θεραπεία. Θεραπευτικές επιλογές αποτελούν η διακοπή της μεθόδου, τα στεροειδή, η ταμοξιφένη και η χειρουργική λύση των συμφύσεων, με ποικίλα ωστόσο αποτελέσματα. Εικόνα 18: Μακροσκοπική εικόνα EPS. Διακρίνεται το ινώδες περίβλημα (cocoon) το οποίο εγκλωβίζει τις εντερικές έλικες (Serafimidis et al. 2006). 59

60 Εικόνα 19: Ακτινολογικά ευρήματα EPS: Πάχυνση περιτοναίου (κόκκινα βέλη), συγκόλληση εντερικών ελίκων (κίτρινο βέλος), εντοπισμένες ασκιτικές συλλογές (πράσινα βέλη) (Cameron et al. 2010). 60

61 ΙΙ. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 61

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 3.1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός βιοδεικτών περιτοναϊκής ίνωσης και/ή σκληρυντικής περιτονίτιδας, στο περιτοναϊκό διάλυμα ασθενών που υποβάλλονται σε ΠΚ, με τη χρήση μεθόδων πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος. Δευτερεύων σκοπός της μελέτης ήταν η συσχέτιση αυτών των πιθανών βιοδεικτών με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους των ασθενών και με τη χρήση διαλυμάτων που περιέχουν γαλακτικά ανιόντα έναντι των πιο σύγχρονων διαλυμάτων που περιέχουν μίγμα γαλακτικών/διττανθρακικών ανιόντων. 62

63 3.2. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με το Νεφρολογικό Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου του Σέφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο (Sheffield Kidney Institute, University of Sheffield, UK). Αποτέλεσε αναπόσπαστο τμήμα μιας μεγαλύτερης μελέτης με τίτλο «Προσδιορισμός Βιοδεικτών και Παθογενετικών Μηχανισμών στην Περιτοναϊκή Ίνωση και τη Σκληρυντική Περιτονίτιδα» (Identification of Biomarkers and Pathological Mechanisms in Peritoneal Fibrosis and Encapsulating Peritoneal Sclerosis), η οποία πραγματοποιήθηκε στο εν λόγω Ινστιτούτο υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Timothy Johnson, Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Σέφιλντ. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις επιταγές της Διακήρυξης του Ελσίνκι και όλοι οι συμμετέχοντες ασθενείς παρείχαν έγγραφη συγκατάθεση Πληθυσμός μελέτης επιλογή ασθενών Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν επιλεγμένα δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος απο δύο ομάδες (cohorts) ασθενών: από τη μελέτη GLOBAL (Global Fluid Study) και από μία ομάδα ασθενών που υποβάλλονταν σε ΠΚ στο Νεφρολογικό Κέντρο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών Η μελέτη GLOBAL (Global Fluid Study) Η μελέτη GLOBAL είναι μία διεθνής, πολυκεντρική, προοπτική μελέτη παρατήρησης η οποία σχεδιάστηκε με σκοπό να απαντήσει μια σειρά ερευνητικών ερωτημάτων που στοχεύουν: α.) στη συσχέτιση της λειτουργίας της περιτοναϊκής μεμβράνης με τοπικούς και συστηματικούς βιοδείκτες και β.) στη συσχέτιση των βιοδεικτών αυτών με προκαθορισμένες κλινικές παραμέτρους (επιβίωση ασθενών, αποτυχία μεθόδου κ.ά.). Στη μελέτη συμμετείχαν δέκα (10) Κέντρα από το Ηνωμένο Βασίλειο, την Νότια Κορέα και τον Καναδά, ωστόσο η συμμετοχή ήταν ανοιχτή σε οποιοδήποτε Κέντρο παγκοσμίως. Στη μελέτη εντάχθηκαν ασθενείς που ήδη υποβάλλονταν σε ΠΚ (prevalent) και ασθενείς που ξεκινούσαν τη θεραπεία με ΠΚ (incident). Προϋπόθεση για τον χαρακτηρισμό ενός ασθενούς ως «νέου ασθενούς» στη μελέτη ήταν η συμμετοχή του εντός των πρώτων 90 ημερών από την έναρξη της θεραπείας. Η στρατολόγηση των ασθενών ξεκίνησε τον Ιούνιο 2002 και ολοκληρώθηκε τον Δεκέμβριο 63

64 2008, ενώ η συλλογή δειγμάτων και κλινικών δεδομένων ολοκληρώθηκε σε καθορισμένες ανά κέντρο ημερομηνίες τον Δεκέμβριο Όλοι οι ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ ήταν κατάλληλοι να συμμετάσχουν στη μελέτη, εφ όσον χορηγούσαν έγγραφη συγκατάθεση. Από τους ασθενείς συλλέγονταν δείγματα περιτοναϊκού υγρού κατά τη διάρκεια μιας 4-ωρης δοκιμασίας εξισορρόπησης του περιτοναίου (ΡΕΤ) (βλ. Κεφ ) με τη χρήση διαλύματος γλυκόζης 2,27%, ενώ ορισμένα Κέντρα συνέλεγαν δείγματα και από τη νυχτερινή παραμονή του διαλύματος. Ταυτόχρονα, συλλέγονταν κλινικά και δημογραφικά δεδομένα των ασθενών και αποθηκεύονταν σε βάση δεδομένων που δημιουργήθηκε για τον σκοπό αυτό (Lambie M et al., 2013) Ομάδα ασθενών του ΠΓΝ Πατρών Το έτος 2010, στο πλαίσιο εκπόνησης της παρούσας διδακτορικής διατριβής δημιουργήθηκε στο Νεφρολογικό Κέντρο του ΠΓΝ Πατρών μια δεξαμενή δειγμάτων περιτοναϊκού υγρού από ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ στο ίδιο Κέντρο. Το πρόγραμμα αυτό εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του ΠΓΝ Πατρών και στη μελέτη στρατολογήθηκαν ασθενείς που επρόκειτο να ξεκινήσουν θεραπεία με ΠΚ (ασθενείς στους οποίους είχε προγραμματιστεί τοποθέτηση περιτοναϊκού καθετήρα) και ασθενείς οι οποίοι ήδη υποβάλλονταν σε ΠΚ. Δείγματα περιτοναϊκού υγρού μεγάλου όγκου (100ml) λαμβάνονταν από τη νυχτερινή παραμονή διαλύματος. Το πρώτο δείγμα συλλέχθηκε κατά την ένταξη του ασθενούς στη μελέτη (για τους νέους ασθενείς, η συλλογή πραγματοποιήθηκε εντός του πρώτου μήνα από την έναρξη της θεραπείας). Η συλλογή των επόμενων δειγμάτων πραγματοποιούνταν ανά 6 μήνες. Δείγματα περιτοναϊκού υγρού συλλέγονταν επίσης σε περίπτωση διακοπής της θεραπείας με ΠΚ, λόγω μεταμόσχευσης νεφρού ή μεταφοράς του ασθενούς σε αιμοκάθαρση. Σε κάθε επίσκεψη συλλογής δείγματος, συλλέγονταν επίσης κλινικά και δημογραφικά δεδομένα των ασθενών. Το έτος 2014, διενεργήθηκε δοκιμασία εξισορρόπησης περιτοναίου 4 ωρών με τη χρήση διαλύματος γλυκόζης 2,27% σε όλους τους ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ στο ΠΓΝ Πατρών και συλλέχθηκαν δείγματα περιτοναϊκού υγρού και ορού κατά τη διενέργεια της δοκιμασίας. 64

65 Συλλογή κλινικών και δημογραφικών δεδομένων Σε κάθε περίσταση συλλογής δειγμάτων, συλλέγονταν πληθώρα κλινικών και δημογραφικών δεδομένων των ασθενών, τα οποία αποθηκεύονταν σε κατάλληλη βάση δεδομένων. Τα δεδομένα που συλλέχθησαν αφορούσαν στις παρακάτω παραμέτρους: Δημογραφικά και Κλινικά Δεδομένα: Ημερομηνία επίσκεψης, Φύλο, Ηλικία, Αιτία ΧΝΝ, Ημερομηνία έναρξης ΠΚ, Συνοδά νοσήματα (*), Προηγηθείς χρόνος αιμοκάθαρσης, Επεισόδια Περιτονίτιδας. (*): Για την καταγραφή των συνοδών νοσημάτων χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης Stoke Comorbidity Index, ο οποίος έχει αναπτυχθεί από το Πανεπιστήμιο Keele, Ηνωμένο Βασίλειο για χρήση σε ασθενείς που υποβάλλονται σε ΠΚ. Ο δείκτης αυτός λαμβάνει υπ όψιν την παρουσία επτά (7) κατηγοριών συνοδών νοσημάτων, που είναι οι ακόλουθες: Κακοήθης νεοπλασία: Ενεργός νόσος, εκτός νεοπλασιών του δέρματος. Ισχαιμική Καρδιοπάθεια: Προηγηθέν οξύ στεφανιαίο σύνδρομο, ισχαιμική καρδιοπάθεια διαγνωσθείσα με αγγειογραφία ή άλλη απεικονιστική μέθοδο ή παρουσία ισχαιμικών αλλοιώσεων σε ΗΚΓ ηραμίας. Περιφερική Αγγειακή Νόσος: Περιλαμβάνεται είτε συμπτωματική αγγειακή νόσος, είτε ακτινολογική/υπερηχογραφική διάγνωση αγγειακών στενώσεων >50%. Δυσλειτουργία αριστερής κοιλίας: Παρουσία πνευμονικού οιδήματος που δεν σχετίζεται με τη διαχείριση του ισοζυγίου υγρών του ασθενούς και/ή υπερηχογραφικά ευρήματα μέτριας ή σοβαρής δυσλειτουργίας της αριστερής κοιλίας. Σακχαρώδης Διαβήτης: Περιλαμβάνεται διαβήτης τύπου Ι και ΙΙ. Συστηματική νόσος κολλαγόνου Άλλη σοβαρή νόσος: Οποιαδήποτε άλλη νόσος, η παρουσία της οποίας σχετίζεται με μειωμένη επιβίωση στον γενικό πληθυσμό (π.χ. Αποφρακτική πνευμονοπάθεια, κίρρωση ήπατος, ψύχωση). Το συνολικό σκορ συννοσηρότητας προκύπτει από το άθροισμα των επί μέρους κατηγοριών και επομένως λαμβάνει τιμές 0 έως 7. Ακολούθως, οι ασθενείς κατηγοριοποιούνται σε χαμηλού κινδύνου (σκορ = 0), μέτριου κινδύνου (σκορ = 1-2) και υψηλού κινδύνου (σκορ >3) (Davies SJ et al., 2002). 65

66 Δεδομένα σχετιζόμενα με την ΠΚ: Τεχνική ΠΚ, Χρήση ικοδεξτρίνης, Χρήση διαλυμάτων γαλακτικών ή διττανθρακικών, Παράμετροι ΡΕΤ (D/P κρεατινίνης, D/D 0 γλυκόζης, υπερδιήθημα), υπολειπόμενη διούρηση, ολικό υπερδιήθημα 24ώρου, κάθαρση κρεατινίνης, εβδομαδιαίος λόγος Kt/V. Εργαστηριακές παράμετροι: IL-6 (διαθέσιμη μόνο για τους ασθενείς από τη μελέτη GLOBAL), αλβουμίνη ορού, CRP ορού. Τα κλινικά και δημογραφικά δεδομένα των ασθενών παρουσιάζονται συνοπτικά στους πίνακες Συλλογή και αποθήκευση δειγμάτων Η συλλογή των δειγμάτων περιτοναϊκού υγρού πραγματοποιήθηκε με άσηπτη τεχνική, αναρροφώντας το διάλυμα με σύριγγα από τη θέση ένεσης (port) του σάκου. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε σωλήνες πολυπροπυλενίου και αποθηκεύτηκαν άμεσα στους - 80 ο C. Τα δείγματα αποψύχθηκαν μόνο για τον διαμοιρασμό τους και στη συνέχεια αμέσως πριν τη χρησιμοποίησή τους σε πειράματα. Τα δείγματα από το ΠΓΝ Πατρών που χρησιμοποιήθηκαν στην πρωτεωμική ανάλυση, μεταφέρθηκαν στο Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ με ξηρό πάγο Προετοιμασία επεξεργασία δειγμάτων για την πρωτεωμική ανάλυση Το πρώτο βήμα στην επεξεργασία των δειγμάτων για την πρωτεωμική ανάλυση ήταν η απομόνωση της ολικής πρωτεΐνης. Για να επιτευχθεί η καθίζηση της πρωτεΐνης, το δείγμα αναμίχθηκε με παγωμένη ακετόνη στους -20 ο C και 100% τριχλωρο-οξικό οξύ (TCA) σε αναλογία όγκων: 1 (δείγμα) : 3,5 (ακετόνη) : 0,5 (TCA). Στη συνέχεια, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε σε φυγόκεντρο Sigma 3-18 (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Germany), σε ταχύτητα 4248 RCF για 40 λεπτά, σε θερμοκρασία 10 ο C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα πρωτεΐνης επαναδιαλύθηκε σε 500μl ρυθμιστικού διαλύματος το οποίο περιείχε: 8Μ ουρία, 2Μ θειοουρία, 4% CHAPS, 0.2% (v/v) αμφολύτες (ph 4 7), 100 mm διθειοθρεϊτόλη (DTT), 40 mm Tris base και % bromophenol blue σε κεκαθαρμένο ύδωρ 18.2Mohm. 66

67 Για να διευκολυνθεί η διάλυση της πρωτεΐνης, τα δείγματα ανακινήθηκαν σε vortex για 30 δευτερόλεπτα και τοποθετήθηκαν σε κρύο λουτρό με υπερήχους (sonicator bath) για 15 λεπτά. Μετά την επαναδιάλυση της πρωτεΐνης, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της πρωτεΐνης στο νέο διάλυμα με το κιτ Thermo Scientific Pierce 660nm Protein Assay (Thermo Fisher Scientific Rockford, IL., U.S.A), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Στη συνέχεια, όγκος διαλύματος που αντιστοιχούσε σε 60μg πρωτεΐνης απομονώθηκε και σε αυτόν προστέθηκε επιπλέον ρυθμιστικό διάλυμα, μέχρι τελικού όγκου 350μl. Ο όγκος αυτός φορτώθηκε σε ταινίες με σταθερή διαβάθμιση ph 4-7 (immobilised ph gradient (IPG) strip Bio-Rad Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.). Οι ταινίες καλύφθηκαν με 3ml ορυκτέλαιο και αφέθηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας σε θερμοκρασία δωματίου, ώστε να επιτραπεί η πλήρης απορρόφηση του δείγματος στην ταινία Ισοηλεκτρική εστίαση (ηλεκτροφόρηση πρώτης διάστασης) Οι ταινίες υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε ισοηλεκτρική εστίαση (isoelectric focusing IEF) με τη χρήση συστήματος PROTEAN IEF (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.). Η θερμοκρασία τέθηκε στους 20 ο C. Χρησιμοποιήθηκε πρωτόκολλο αποτελούμενο από 4 βήματα, ως ακολούθως: Βήμα 1: 250V για 4,5 ώρες. Βήμα 2: Γραμμική αύξηση τάσης έως τα V εντός 2,5 ωρών. Βήμα 3: Ταχεία αύξηση τάσης στα V έως τη συμπλήρωση V*ώρες. Βήμα 4: Ταχεία μείωση τάσης στα 500V έως ότου συμπληρωθούν V*ώρες Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE (ηλεκτροφόρηση δεύτερης διάστασης) Μετά την ολοκλήρωση της ισοηλεκτρικής εστίασης, οι ταινίες βυθίστηκαν σε διάλυμα 2% DTT και ακολούθως 2,5% ιωδοακεταμίδης σε ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης, για 15 λεπτά στο καθένα. Το ρυθμιστικό διάλυμα εξισορρόπησης περιείχε 36% (w/v) ουρία, 20% γλυκερόλη, 2% SDS και 0.005M Tris-HCl (ph 8.8). Στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες ηλεκτροφορήθηκαν σε gel SDS- 10% πολυακρυλαμίδης, διαστάσεων 20 x 23 cm. Τα gel περιείχαν επίσης 0.1% SDS, 2.5% Rhinohide (Invitrogen ), 0.05% APS, 0.025% TEMED και 0.375M Tris-HCl. Μετά την παρασκευή των gel, στην κορυφή του κάθε gel προστέθηκε 1ml βουταν-2-όλης κορεσμένης σε νερό 50:50, ώστε να απομακρυνθούν τυχόν φυσαλίδες 67

68 αέρα και να δημιουργηθεί μία επίπεδη επιφάνεια στην οποία να τοποθετηθεί η ταινία. Μετά την τοποθέτηση της ταινίας προστέθηκε επίστρωση αγαρόζης 1% με bromophenol blue, ώστε να δημιουργηθεί μία λωρίδα χρωστικής για την παρακολούθηση της πορείας της ηλεκτροφόρησης. Μετά την παρασκευή τους, τα gel αφέθηκαν να πήξουν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες και στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με κεκαθαρμένο ύδωρ 3 φορές και τέλος με το διάλυμα ηλεκτροφόρησης (running buffer), το οποίο περιείχε (25 mm Tris, 192 mm γλυκίνη, 0.1% SDS, ph 8.3). Ακολούθως, αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασία 4 ο C μέχρι τη χρήση τους. Για την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε σύστημα PROTEAN Plus Dodeca Cell (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.). Η τάση τέθηκε στα 80V για τουλάχιστον 4 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε σε 40V, έως την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης Χρώση με άργυρο Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, κάθε gel εμβαπτίσθηκε σε διάλυμα μεθανόλης 40% / οξικού οξέος 10% σε απιονισμένο νερό για 2 ώρες. Ακολούθως, τα gel εκπλύθηκαν με διάλυμα αιθανόλης 30% σε νερό 3 φορές, επί 20 λεπτά εκάστη. Για τη χρώση των gel με άργυρο χρησιμοποιήθηκε ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο, βασισμένο στη μέθοδο που έχει περιγραφεί από τους Blum et al., Αρχικά, τα gels εμβαπτίσθηκαν σε διάλυμα θειοθειικού ματρίου 0,035% για 90 δευτερόλεπτα και ακολούθως εκπλύθηκαν 3 φορές με απιονισμένο νερό, από 20 δευτερόλεπτα την κάθε φορά. Εν συνεχεία, παρέμειναν σε διάλυμα νιτρικού αργύρου 0,2% και φορμαλδεΰδης 0,02% επί 20 λεπτά. Ακολούθησαν τρεις νέες εκπλύσεις, των 20 δευτερολέπτων εκάστη, με απιονισμένο ύδωρ. Ακολούθως, προστέθηκε διάλυμα ανθρακικού νατρίου 3%, πενταϋδρικού θειοθειικού νατρίου 0,003% και φορμαλδεΰδης 0,05%. Το διάλυμα αυτό απομακρύνθηκε μετά από 5 λεπτά, με την προϋπόθεση ότι οι πρωτεϊνικές κηλίδες ήταν πλήρως ορατές. Ακολούθησαν 2 εκπλύσεις με απιονισμένο ύδωρ, εκάστη 30 δευτερολέπτων και στη συνέχεια προστέθηκε διάλυμα γλυκίνης 0,5% για 10 λεπτά. Τέλος, το διάλυμα γλυκίνης απομακρύνθηκε και τα gels εκπλύθηκαν 2 φορές με απιονισμένο ύδωρ, από 30 λεπτά την κάθε φορά Απεικόνιση gel 68

69 Μετά τη χρώση με άργυρο, ακολούθησε σάρωση των gel σε ένα πυκνόμετρο Genetools. Για την ανάλυση των εικόνων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό PD Quest v8.0 (Bio- Rad Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.) Εξόρυξη πρωτεώματος (proteome mining) Για τη μείωση του δυναμικού εύρους των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία των «συνδυασμένων βιβλιοθηκών ολιγοπεπτιδίων» - CPLL (combined peptide-ligand libraries). Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε το κιτ μικρής χωρητικότας Proteominer (Biorad, Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.). Ελήφθη όγκος δείγματος που αντιστοιχεί σε 15mg πρωτεΐνης. Το δείγμα αυτό φυγοκεντρήθηκε με τη χρήση φίλτρου μεγέθους 3kDa, έως ότου ο όγκος του δείγματος μειώθηκε σε 500μl. Προσδιορίστηκε εκ νέου η συγκέντρωση πρωτεΐνης και ελήφθη όγκος δείγματος που αντιστοιχεί σε 10mg πρωτεΐνης. Ο όγκος αυτός επωάστηκε στην στήλη της βιβλιοθήκης ολιγοπεπτιδίων σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για τη διαδικασία αυτή επελέγη και χρησιμοποιήθηκε αναλογία 20μl διαλύματος σφαιριδίων (beads) για 10mg πρωτεΐνης. Η έκλουση των πρωτεϊνών από τη στήλη έγινε βάσει τροποποιημένου πρωτοκόλλου σε 2 βήματα. Η πρώτη έκλουση έγινε με τη χρήση διαλύματος 8Μ ουρίας, 2% CHAPS, ενυδατωμένου με διάλυμα οξικού οξέος 5%. Ακολούθησε δεύτερη έκλουση με διάλυμα 25mM διθειοθρεϊτόλης (DTT) και 4% SDS σε θερμοκρασία βρασμού, με σκοπό τη βελτίωση της ανάκτησης πρωτεΐνης από τη στήλη (Candiano G et al., 2009). Στο τελικό δείγμα, επαναπροσδιορίστηκε η συγκέντρωση πρωτεΐνης και στη συνέχεια το δείγμα υποβλήθηκε στην ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων, όπως περιγράφηκε παραπάνω Κατιονική θραυσματοποίηση πεπτιδίων Strong Cation Exchange (SCX) Fractionation of Peptides Η θραυσματοποίηση πραγματοποιήθηκε όπως έχει περιγραφεί από τους Osada S et al., Συνοπτικά, χρησιμοποιήθηκε στήλη PolySULFOETHYL A (PolyLC, Columbia, MD), 5 µm μέγεθος σωματιδίων, 200 mm μήκους 2.1 mm id, και 200 Å μέγεθος πόρων, σε μονάδα BioLC HPLC (Dionex, Surrey, UK). Επετεύχθη βαθμίδωση 60 λεπτών μεταξύ διαλύματων Buffer A (10 mm KH2PO4 και 25% ακετονιτρίλιο, ph 3.0), και Buffer B (10 mm KH2PO4, 25% ακετονιτρίλιο και 500 mm KCl, ph 3.0), αποτελούμενη από 100% A για 69

70 5 λεπτά, 5 30% B για 40 λεπτά, % B για 5 λεπτά, 100% B για 5 λεπτά και τέλος 100% A για 5 λεπτά. Το χρωματογράφημα ανιχνεύθηκε με τη χρήση ανιχνευτή υπεριώδους (UV) (Dionex/LC Packings, Amsterdam, the Netherlands), στα 214 nm. Τα θραύσματα συγκεντρώθηκαν για να ακολουθήσει ανάλυση με συνδυασμό υγρής χρωματογραφίας φασματογραφίας μάζας (nano-lc-ms/ms). Τα συγκεντρωμένα θραύσματα αποξηράνθηκαν σε συμπυκνωτή κενού (Eppendorf, Hamburg, Germany), και αποθηκεύτηκαν στους 20 C μέχρι την περαιτέρω ανάλυσή τους με φασματογράφία μάζας Φασματογραφία μάζας Mass Spectrometry (MS) Κάθε πεπτιδικό θραύσμα επαναδιαλύθηκε σε 20 µl διαλύματος μυρμηκικού οξέος 0.1% και ακετονιτριλίου 3%. Έπειτα, 6 µl δείγματος ενέθηκαν στο σύστημα nano-lc-esi- MS/MS. Η φασματογραφία μάζας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση φασματογράφου χρόνου πτήσης Q-Star XL Hybrid ESI Quadrupole, ESI-qQ-TOF-MS/MS (Applied Biosystems; MDS- Sciex) συνδεδεμένου online με ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας (U3000, Thermo, Hemel Hempstead, UK). Τα πεπτίδια διαχωρίστηκαν σε στήλη PepMap C-18 RP (LC Packings), με σταθερή ροή 0.3 µl/λεπτό. Η βαθμίδωση της υγρής χρωματογραφίας ξεκίνησε με 3% διάλυμα Buffer B (0.1% μυρμηκικό οξύ σε 97% ακετονιτρίλιο) και 97% διάλυμα Buffer A (0.1% μυρμηκικό οξύ σε 3% ακετονιτρίλιο) για 3 λεπτά, ακολούθησε 3 30% διάλυμα Buffer B για 90 λεπτά, εν συνεχεία 90% διάλυμα Buffer B για 7 λεπτά και τέλος 3% διάλυμα Buffer B για 8 λεπτά. Ο φασματογράφος μάζας ρυθμίστηκε να συλλέξει τα δεδομένα των θετικά φορτισμένων ιόντων, με εύρος μάζας 400 1,600 m/z. Τα πεπτίδια με κατάσταση φορτίου +2 έως +4 επελέγησαν για παράλληλη (tandem) φασματογραφία μάζας, και ο χρόνος άθροισης των γεγονότων MS/MS τέθηκε στα 3 δευτερόλεπτα. Τα δύο πλέον φορτισμένα πεπτίδια πάνω από το όριο των 5 μονάδων επελέγησαν για MS/MS, ακολούθησε η μέθοδος του «δυναμικού αποκλεισμού» (dynamic exclusion) για 60 δευτερόλεπτα με όριο ανοχής μάζας ±50 mmu Ανάλυση δεδομένων φασματογραφίας μάζας Η επεξεργασία των δεδομένων από τη φασματογραφία μάζας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του mascot.dll embedded script (V1.6) στο λογισμικό Analyst QS (ABSCIEX, Framingham, MA, USA). Η ταυτοποίηση και ο σχετικός ποσοτικός προσδιορισμός των 70

71 πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό Phenyx v2.6 (GeneBio S.A., Geneva, Switzerland), χρησιμοποιώντας μια βάση δεδομένων των πρωτεϊνών του ανθρώπου. Αποδεκτές παράμετροι για την ταυτοποίηση πεπτιδίων ήταν οι εξής: μήκος 6, z-score 5.0 και p-value 1.0 e-4. Το ποσοστό των ψευδώς ταυτοποιημένων πεπτιδίων υπολογίστηκε με τη μέθοδο αναστροφής των αλληλουχιών (Elias JE, 2007) και βρέθηκε να είναι 1% Ποσοτικός προσδιορισμός των dermatopontin και col1a1 στο περιτοναϊκό διάλυμα Οι πρωτεΐνες dermatopontin και col1a1 προσδιορίστηκαν στο περιτοναϊκό διάλυμα με τη μέθοδο ELISA (Cloud-Clone Corp., CCC, USA). Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και η ανεκτή διακύμανση των τιμών (CV) μεταξύ των δύο μετρήσεων ήταν 20% Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων από τον προσδιορισμό των dermatopontin και col1a1 Οι συγκρίσεις μεταξύ διαφορετικών ομάδων έγιναν με τη χρήση των Student s t-test και Mann-Whitney test. Οι συσχετίσεις μεταξύ δύο μεταβλητών πραγματοποιηθηκαν με τη χρήση των συσχετίσεων κατά Pearson και κατά Spearman. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έγινε με την εφαρμογή μοντέλου πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης (multiple linear regression). Η επιλογή των μεταβλητών στο μοντέλο παλινδρόμησης έγινε με τις μεθόδους forward selection και backward elimination και επελέγη το μοντέλο με τις υψηλότερες τιμές adjusted R square. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό SPSS v23.0 (IBM Corp., New York, USA). 71

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. ΕΠΙΛΟΓΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Επιλογή ασθενών από τη μελέτη GLOBAL Στα πειράματα που περιλαμβάνονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή, χρησιμοποιήθηκαν αρχικά δείγματα από 5 ασθενείς με παραμονή στη μέθοδο επί >4 έτη και σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης. Τα δείγματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για τη διαπίστωση της επαναληψιμότητας των μεθόδων πρωτεωμικής ανάλυσης και για την ανίχνευση των αλλαγών που επισυμβαίνουν στο πρωτέωμα του περιτοναϊκού διαλύματος προϊόντος του χρόνου. Για την ανίχνευση διαφορών στο πρωτέωμα περιτοναϊκού διαλύματος μεταξύ ασθενών που ανέπτυξαν σκληρυντική περιτονίτιδα και ασθενών μαρτύρων, χρησιμοποιήθηκε η ακόλουθη διαδικασία: 1. Εντοπίστηκαν ασθενείς οι οποίοι ανέπτυξαν σκληρυντική περιτονίτιδα, βάσει των κατευθυντήριων οδηγιών της Διεθνούς Κοινότητας Περιτοναϊκής Κάθαρσης (ISPD) (Kawaguchi Y et al., 2000), σε 5 από τα συμμετέχοντα Κέντρα, προερχόμενα από το Ηνωμένο Βασίλειο. 2. Κάθε ένας από αυτούς τους ασθενείς αντιστοιχίστηκε με έναν ασθενή-μάρτυρα από το ίδιο κέντρο, ο οποίος υποβάλλονταν σε ΠΚ για το ίδιο χρονικό διάστημα, είχε δείγματα περιτοναϊκού υγρού σε παρόμοια χρονικά σημεία και δεν είχε εκδηλώσει σημεία ή συμπτώματα ανεπάρκειας της περιτοναϊκής μεμβράνης ή σκληρυντικής περιτονίτιδας. Λόγω του μικρού αριθμού ασθενών με μεγάλο χρόνο παρακολούθησης και του εξαιρετικά μικρού αριθμού ασθενών με EPS, δεν κατέστη δυνατή η αντιστοίχιση με τη χρήση περισσότερων κριτηρίων. Με τη διαδικασία αυτή σχηματίστηκαν 6 ζεύγη ασθενών (EPS μαρτύρων). Τα κλινικά και δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα

73 Πίνακας 10: Κλινικά και δημογραφικά δεδομένα ασθενών από τη μελέτη GLOBAL 2D Gels EPS Μάρτυρες (6 ασθενείς, 33 δείγματα) (6 ασθενείς, 33 δείγματα) Ηλικία (έτη) 54.8 (15.4) 51.8 (16.5) Άρρεν Φύλο 66.70% 66.70% Συννοσηρότητα (Χαμηλή/Μέτρια/Υψηλή) Προηγηθέντα επεισόδια περιτονίτιδας 50.0/50.0/0% 50/33.3/16.7% 0 (0-4) 1 (0-4) Μήνες από έναρξη ΠΚ 35.2 (26.0) 33.9 (25.2) Μήνες έως διακοπή ΠΚ 29.5 (21.9) 30.4 (16.7) Υπολειπόμενη διούρηση (ml) 663 (0-2128) 816 (0-2092) Χρήση ικοδεξτρίνης 36.40% 26.50% Χρήση ΑΠΚ 21.20% 30.30% IL-6 διαλύματος (pg/ml) 13.9 ( ) 7.0 ( ) IL-6 πλάσματος(pg/ml) 3.8 ( ) 1.1 ( ) Αλβουμίνη πλάσματος (g/dl) 3.39 (0.82) 3.69 (0.47) D/P Cr 0.72 (0.14) 0.69 (0.12) Επιλογή ασθενών ΠΓΝ Πατρών Στα πειράματα πρωτεωμικής ανάλυσης της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιτοναίκού υγρού από 9 επιλεγμένους ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών και συγκεκριμένα: Τρεις (3) ασθενείς που μόλις είχαν ξεκινήσει θεραπεία υποκατάστασης με ΠΚ (incident) Τρείς (3) ασθενείς οι οποίοι υποβάλλονταν σε ΠΚ για >5 έτη και είχαν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (prevalent controls). Τρεις (3) ασθενείς οι οποίοι υποβάλλονταν σε ΠΚ επί μακρόν και είχαν κλινική εικόνα συμβατή με EPS. Σε δύο από αυτούς τους ασθενείς η διάγνωση της EPS τεκμηριώθηκε με λαπαροτομία. 73

74 Τα δείγματα περιτοναϊκού υγρού προέρχονταν από ολονύχτια παραμονή του διαλύματος, με τη χρήση διαλύματος γλυκόζης 1,36%. Στα πειράματα προσδιορισμού των συγκεντρώσεων υποψήφιων βιοδεικτών στο περιτοναϊκό υγρό και στον ορό, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από τριάντα (30) ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών. Τα δείγματα αυτά συνελέγησαν κατά τη διενέργεια ΡΕΤ διάρκειας 4 ωρών με τη χρήση διαλύματος γλυκόζης 2,27%. Τα κλινικά και δημογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών συνοψίζονται στους πίνακες 11 και

75 Πίνακας 11: Κλινικά και δημογραφικά δεδομένα ασθενών από το ΠΓΝ Πατρών (πρωτεωμική ανάλυση) EPS Μάρτυρες Νέοι ασθενείς (n=3) (n=3) (n=3) Ηλικία (έτη) 59 (30-64) 56 (50-80) 45 (43-60) Άρρεν Φύλο 67% 33% 33% Συννοσηρότητα (Χαμηλή/Μέτρια/Υψηλή) 67/0/33% 67/33/0% 33/67/0% Προηγηθέντα επεισόδια περιτονίτιδας 1 (0-4) 0 0 Μήνες από έναρξη ΠΚ 108 (61-178) 85 (68-97) <1 Υπολειπόμενη διούρηση (ml) 0 (0-200) 300 (0-500) 1000 ( ) Χρήση ικοδεξτρίνης 67% 33% 0% Χρήση ΑΠΚ 33% 33% 33% Αλβουμίνη ορού (g/dl) 3.2 ( ) 3.4 ( ) 4.0 ( ) D/P Cr 0.89 ( ) 0.62 ( ) 0.72 ( ) Πίνακας 12: Κλινικά και δημογραφικά δεδομένα ασθενών από το ΠΓΝ Πατρών (ELISA) N 30 Ηλικία (έτη) 58.5 (32-90) Άρρεν Φύλο 47% Προηγηθέντα επεισόδια περιτονίτιδας 0 (0-4) Μήνες από έναρξη ΠΚ 26 (1-94) Υπερδιήθηση (ml) 300 ( ) Υπολειπόμενη διούρηση (ml) 800 (0-3250) Διάλυμα βιοσυμβατό/κλασικό 22/8 Χρήση ικοδεξτρίνης 20% Χρήση ΑΠΚ 37% Αλβουμίνη ορού (g/dl) 3.77±0.35 CRP ορού 0.72±0.85 D/P Cr 0.66±0.1 Πίνακες 10,11,12: Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή±sd, διάμεση τιμή (εύρος) και ποσοστά αναλόγως. Η συννοσηρότητα καταγράφηκε με τη χρήση του Stoke Comorbidity Index, ο οποίος κατατάσσει τους ασθενείς σε χαμηλού κινδύνου (σκορ 0), μετρίου κινδύνου (σκορ 1 2), και υψηλού κινδύνου (σκορ >2) ενώ επιτρέπει ταυτόχρονα την ανάλυση για κάθε μια από τις επί μέρους κατηγορίες που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του. 75

76 4.2. ΕΠΑΝΑΛΗΨΙΜΟΤΗΤΑ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Η επαναληψιμότητα της μεθόδου πρωτεωμικής ανάλυσης εκτιμήθηκε αδρά με τη σύγκριση των εικόνων των gel ηλεκτροφόρησης α.) σε επαναληπτικά δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από ασθενή της μελέτης GLOBAL με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (Εικόνα 20) και β.) σε δύο επαναληπτικές ηλεκτροφορήσεις των δειγμάτων από τους εννέα (9) ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών (Εικόνα 21-23). Η ανάλυση των εικόνων των gel με το λογισμικό PDQuest κατέδειξε ότι σε κάθε ένα από τα δείγματα που αναλύθηκαν ανιχνεύθηκαν περίπου 800 διακριτές πρωτεϊνικές κηλίδες, η μεγάλη πλειοψηφία των οποίων είχε σταθερή έκφραση σε όλα τα δείγματα. Επιπλέον, το πρότυπο διασποράς των κηλίδων ήταν παρόμοιο σε όλα τα gel. Οι δύο αυτές παρατηρήσεις ήταν ενθαρρυντικές σε ό, τι αφορά στην αξιοπιστία και στην επαναληψιμότητα της μεθόδου. Εικόνα 20: Επαναληψιμότητα μεθόδου πρωτεωμικής ανάλυσης 76

77 Εικόνα 20: Συγκριτική απεικόνιση των gel ηλεκτροφόρησης από ασθενή της μελέτης GLOBAL με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεβράνης. Δέκα δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος που καλύπτουν το χρονικό διάστημα μεταξύ των ημερών 9 και 1410 από την έναρξη της ΠΚ και όγκου 2ml, υπέστησαν επεξεργασία με τριχλωρο-οξικό οξύ και ακετόνη ώστε να καθιζάνουν οι πρωτεΐνες. Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα και όγκος που αντιστοιχεί σε 60μg πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Ακολούθησε χρώση των gel ηλεκτροφόρησης με άργυρο σύμφωνα με τη μέθοδο κατά Blum. Οι εικόνες των gel αναλύθηκαν με το λογισμικό PDQuest και συγκρίθηκαν τα πρότυπα κατανομής των πρωτεϊνικών κηλίδων. Οι εικόνες του υποδείγματος προέρχονται από τον ασθενή με κωδικό μελέτης G (Zavvos V et al., 2017). Εικόνα 21: Επαναληψιμότητα μεθόδου πρωτεωμικής ανάλυσης 77

78 Εικόνα 22: Επαναληψιμότητα μεθόδου πρωτεωμικής ανάλυσης Εικόνα 23: Επαναληψιμότητα μεθόδου πρωτεωμικής ανάλυσης 78

79 Εικόνα 21-23: Συγκριτική απεικόνιση των gel ηλεκτροφόρησης δειγμάτων περιτοναϊκού διαλύματος προερχόμενων από 9 (εννέα) ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών, σε δύο διαφορετικά πειράματα ηλεκτροφόρησης (Ηλεκτροφόρηση 1 και 2). Τα δείγματα προέρχονταν από 3 (τρεις) ασθενείς οι οποίοι είχαν μόλις ενταχθεί στην ΠΚ (Εικόνα 21), 3 (τρεις) ασθενείς οι οποίοι υποβάλλονταν σε ΠΚ επί μακρόν και είχαν κλινική εικόνα συμβατή με EPS (Εικόνα 22) και 3 (τρεις) ασθενείς οι οποίοι υποβάλλονταν σε ΠΚ για >5 έτη και είχαν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (Εικόνα 23) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΣΥΜΒΑΙΝΟΥΝ ΣΤΟ ΠΡΩΤΕΩΜΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΤΟΥ ΧΡΟΝΟΥ, ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΣΤΑΘΕΡΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ Για την ανίχνευση μεταβολών που συμβαίνουν στο πρωτέωμα των ασθενών που υποβάλλονται σε ΠΚ επί μακρόν και έχουν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από 5 (πέντε) ασθενείς της μελέτης GLOBAL. Οι ασθενείς αυτοί είχαν τουλάχιστον 10 διαδοχικά δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος τα οποία κάλυπταν χρονικό διάστημα παραμονής στη μέθοδο τουλάχιστον 4 ετών. Τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης 2 διαστάσεων όπως περιγράφηκε παραπάνω ( και ). Η ανάλυση των εικόνων των gel με το λογισμικό PDQuest ανέδειξε ότι 25 πρωτεΐνες αυξάνονταν ή μειώνονταν με την πάροδο του χρόνου, κατά έναν παράγοντα της τάξης του 2 (δηλαδή διπλασιάζονταν ή υποδιπλασιάζονταν με την πάροδο του χρόνου στην ΠΚ). Από αυτές τις πρωτεΐνες ωστόσο, μόνο 2 μεταβάλλονταν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο τουλάχιστον στο 80% των ασθενών (4 από 5 ασθενείς). Η ανάλυση των πρωτεϊνών αυτών με φασματογραφία μάζας κατέδειξε ότι πρόκειται για την γ-αλυσίδα του ινωδογόνου (fibrinogen γ-chain) (Εικόνα 24) και για την πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης (heparan sulphate proteoglycan HSPG) (Εικόνα 25). Η μέτρηση της έντασης του σήματος των πρωτεϊνικών κηλίδων ανέδειξε ότι η γ-αλυσίδα του ινωδογόνου άρχισε να αυξάνεται μετά την παρέλευση χρονικού διαστήματος ίσου με το 30% του συνολικού χρόνου θεραπείας με ΠΚ και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκε (plateau). 79

80 Αντίθετα, η πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης παρουσίασε σταθερή αύξηση καθ όλη τη διάρκεια της θεραπείας με ΠΚ. Εικόνα 24: Η γ-αλυσίδα του ινωδογόνου στο περιτοναϊκό διάλυμα αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου στην ΠΚ, σε ασθενή με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (υποδειγματικές εικόνες) Εικόνα 24: Οι εικόνες του υποδείγματος προέρχονται από τον ασθενή G της μελέτης GLOBAL (σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης). Δέκα (10) δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος ήταν διαθέσιμα, τα οποία κάλυπταν το χρονικό διάστημα από την ημέρα 30 έως την ημέρα 3013 της θεραπείας με ΠΚ. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Η ανάλυση των εικόνων με το λογισμικό PDQuest ανέδειξε ότι η πρωτεΐνική κηλίδα με αριθμό 6001, μεταβαλλόταν με τον χρόνο. Η κηλίδα απομονώθηκε από το gel και ταυτοποιήθηκε με τη μέθοδο MALDI-TOF/MS ως η γ-αλυσίδα του ινωδογόνου. Το γράφημα απεικονίζει την οπτική πυκνότητα της πρωτεϊνικής κηλίδας από 1 gel σε κάθε ένα από 10 χρονικά σημεία. Οι εικόνες απεικονίζουν τις αλλαγές στην γ-αλυσίδα του ινωδογόνου μεταξύ των 2,5 και των 5 ετών στην ΠΚ (Zavvos V et al., 2017). 80

81 Εικόνα 25: Η πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης (HSPG) στο περιτοναϊκό διάλυμα αυξάνεται με την πάροδο του χρόνου στην ΠΚ, σε ασθενή με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (υποδειγματικές εικόνες) Εικόνα 25: Οι εικόνες του υποδείγματος προέρχονται από τον ασθενή G της μελέτης GLOBAL (σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης). Δέκα (10) δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος ήταν διαθέσιμα, τα οποία κάλυπταν το χρονικό διάστημα από την ημέρα 30 έως την ημέρα 3013 της θεραπείας με ΠΚ. Τα δείγματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Η ανάλυση των εικόνων με το λογισμικό PDQuest ανέδειξε ότι η πρωτεΐνική κηλίδα με αριθμό 6003, μεταβαλλόταν με τον χρόνο. Η κηλίδα απομονώθηκε από το gel και ταυτοποιήθηκε με τη μέθοδο MALDI-TOF/MS ως η πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης (HSPG). Το γράφημα απεικονίζει την οπτική πυκνότητα της πρωτεϊνικής κηλίδας από 1 gel σε κάθε ένα από 10 χρονικά σημεία. Οι εικόνες απεικονίζουν τις αλλαγές στην HSPG από την έναρξη της μεθόδου έως τα 3 έτη στην ΠΚ (Zavvos V et al., 2017). 81

82 4.4. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ ΠΟΥ ΕΠΙΣΥΜΒΑΙΝΟΥΝ ΣΤΟ ΠΡΩΤΕΩΜΑ ΤΟΥ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ, ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΠΟΥ ΕΚΔΗΛΩΣΑΝ ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ Για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνών που μεταβάλλονται σε ασθενείς που τελικώς διαγνώσθηκαν με EPS, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 6 ασθενείς της μελέτης GLOBAL, προερχόμενοι από Κέντρα της Μ. Βρετανίας, οι οποίοι είχαν >4 δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος διαθέσιμα. Στους ασθενείς αυτούς, η διάγνωση τηw EPS τέθηκε από το συνδυασμό της κλινικής εικόνας με απεικονιστικά ευρήματα από αξονική τομογραφία. Κάθε ένας από αυτούς τους ασθενείς αντιστοιχίστηκε με έναν ασθενή από το ίδιο Κέντρο, βάσει των ακόλουθων κριτηρίων: 1. Αντίστοιχος χρόνος έκθεσης στην ΠΚ 2. Συγκρίσιμα σημεία δειγματοληψίας στη μελέτη GLOBAL 3. Σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης 4. Απουσία κλινικών ευρημάτων συμβατών με EPS Τα χρονικά σημεία αντιστοίχισης των ασθενών συνοψίζονται στον Πίνακα 13. Πίνακας 13: Αντιστοίχιση ασθενών μελέτης GLOBAL Κωδικός ασθενούς στη μελέτη EPS vs σταθεροί ασθενείς G vs. G G vs G G vs G G vs G G vs G01-15 G vs G G05-72 vs G01-57 Ημέρες από έναρξη ΠΚ Δείγμα 1 Δείγμα 2 Δείγμα 3 Δείγμα 4 Δείγμα vs 1448 vs 2868 vs 2429 vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs vs

83 Πίνακας 13: Δείγματα από ασθενείς με EPS και σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης αντιστοιχίστηκαν βάσει της ημερομηνίας έναρξης της θεραπείας με ΠΚ και ακολούθησε πρωτεωμική ανάλυση με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Κάθε σύγκριση δείχνει την ημέρα κατά την οποία συλλέχθηκε το δείγμα από τον ασθενή με EPS έναντι του ασθενούς με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης (Zavvos V et al., 2017). Το σύστημα ηλεκτροφόρησης Dodeca (Bio-Rad) που χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα, είχε τη δυνατότητα ταυτόχρονης ηλεκτροφόρησης 12 gel. Επομένως, η μέγιστη δυνατή σύγκριση σε κάθε πείραμα περιελάμβανε 6 δείγματα από ασθενείς με EPS και 6 δείγματα από ασθενείς μάρτυρες. Από την ανάλυση εντοπίστηκαν εικοσι-τέσσερις (24) πρωτεΐνες οι οποίες μεταβάλλονταν με την πάροδο του χρόνου στους ασθενείς με EPS, σε σχέση με τους ασθενείς μάρτυρες. Από αυτές τις πρωτεΐνες, 2 μεταβάλλονταν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο και στους 6 ασθενείς με EPS. Η ανάλυση αυτών των πρωτεϊνών με φασματογραφία μάζας κατέδειξε ότι πρόκειται για την αλυσίδα α1 του κολλαγόνου τύπου Ι (Εικόνα 26α) και για την γ-ακτίνη (Εικόνα 26β). Η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι άρχισε να αυξάνεται στους ασθενείς με EPS μετά την παρέλευση του 30% του συνολικού χρόνου έκθεσής τους στην ΠΚ, ενώ η γ-ακτίνη άρχισε να αυξάνεται σχετικά νωρίς ( ημέρες από την έναρξη της ΠΚ) και περέμεινε αυξημένη καθ όλη τη διάρκεια της θεραπείας με ΠΚ (μέγιστη διάρκεια 2868 ημέρες) και μέχρι την τελική διάγνωση της EPS. Σε 5 από τους 6 ασθενείς με EPS, εντοπίστηκαν άλλες 2 πρωτεΐνες οι οποίες μεταβάλλονταν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο. Η ανάλυσή τους κατέδειξε ότι πρόκειται για τους παράγοντες Β και Ι του συμπληρώματος (ΕΙκόνα 27). Ο παράγοντας Β ήταν απών (ή μόλις ανιχνεύσιμος) στους ασθενείς μάρτυρες, ενώ ήταν αυξημένος (και παρέμεινε διαρκώς αυξημένος) στους ασθενείς που εκδήλωσαν EPS, έως και 6 έτη πριν τη διάγνωση. Ο παράγοντας Ι ήταν παρών και στις δύο ομάδες ασθενών και παρουσίασε ελαφρά μείωση με την πάροδο του χρόνου. Ωστόσο, σε κάθε χρονικό σημείο, βρισκόταν σε υψηλότερη συγκέντρωση στους ασθενείς που εκδήλωσαν EPS σε σχέση με τους μάρτυρες. 83

84 Εικόνα 26: Η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι (α) και η γ-ακτίνη (β) αυξάνονται στους ασθενείς με EPS, 5 έτη πριν τη διάγνωση Εικόνα 26: Οι εικόνες του υποδείγματος προέρχονται από τους ασθενείς της μελέτης GLOBAL G (EPS) και G (μάρτυρας). Ο ασθενής G είχε 5 διαθέσιμα δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος, τα οποία κάλυπταν το χρονικό διάστημα από την ημέρα 1043 έως την ημέρα 2868 της θεραπείας του με ΠΚ. Τα δείγματα αυτά αντιστοιχίστηκαν με 5 δείγματα από τον ασθενή G (βλ. Πίνακα 13) και αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Δύο κηλίδες (μαύρα βέλη) βρέθηκε ότι μεταβάλλονταν με τον ίδιο τρόπο σε όλους τους ασθενείς με EPS. Οι κηλίδες αυτές απομονώθηκαν από τα gel και ταυτοποιήθηκαν με τη μέθοδο MALDI-TOF/MS ως η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι (α) και γ-ακτίνη (β). Η πρωτεΐνη που σημειώνεται με λευκό βέλος (55kDa) μεταβλήθηκε μόνο στον συγκεκριμένο ασθενή και δεν ταυτοποιήθηκε περαιτέρω. Τα γραφήματα απεικονίζουν την οπτική πυκνότητα μίας πρωτεϊνικής κηλίδας στα 5 σημεία δειγματοληψίας. Οι πρώτες 5 στήλες του γραφήματος αφορούν στον ασθενή με EPS και οι επόμενες 5 στήλες στον ασθενή μάρτυρα, με χρονολογική σειρά. Con: Control (μάρτυρας) (Zavvos V et al., 2017). 84

85

86 μεγάλες ποσότητες π.χ. αλβουμίνη, γ-σφαιρίνες. (Εικόνα 28α). Αυτό σήμαινε ότι <5% της συνολικής ποσότητας πρωτεΐνης που αναλύονταν περιείχε τις πρωτεΐνες με δυνητικό ενδιαφέρον ως βιοδείκτες. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το πρόβλημα, χρησιμοποιήθηκε μία τεχνολογία εξόρυξης του πρωτεώματος (proteome mining) και συγκεκριμένα το σύστημα ProteoMiner TM (Biorad, Laboratories Ltd., Hercules, CA, U.S.A.). Η εφαρμογή του συστήματος αυτού είχε ως σκοπό τη μείωση του δυναμικού εύρους των πρωτεϊνών που βρίσκονται σε υψηλή συγκέντρωση, και την ταυτόχρονη διατήρηση των σχετικών ποσοτήτων των πρωτεϊνών που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση. Ο τελικός στόχος ήταν ο εμπλουτισμός των δειγμάτων με πρωτεΐνες που φυσιολογικά βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση, γεγονός το οποίο θα διευκόλυνε τον εντοπισμό και την ανάλυσή τους με την ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Σε αντίθεση με τα αρχικά δείγματα, όπου η ανάλυση ανέδειξε περίπου 800 πρωτεϊνικές κηλίδες ανά gel, πολλές εκ των οποίων σχετίζονταν μεταξύ τους, η ανάλυση των δειγμάτων μετά την εφαρμογή του συστήματος ProteoMiner είχε ως αποτέλεσμα την ανάδειξη >2000 πρωτεϊνικών κηλίδων ανά gel, οι οποίες ήταν καλώς αφορισμένες (Εικόνα 28β). 86

87

88 4.6. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΒΡΙΣΚΟΝΤΑΙ ΣΕ ΧΑΜΗΛΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΑΛΛΟΝΤΑΙ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΠΟΥ ΕΚΔΗΛΩΣΑΝ ΣΚΛΗΡΥΝΤΙΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ Η διαδικασία της εξόρυξης πρωτεώματος που περιγράφηκε παραπάνω, απαιτούσε αρχική μάζα πρωτεϊνών περίπου 15mg, για να αποδώσει τελικά τουλάχιστον 60μg πρωτεΐνης για την πρωτεωμική ανάλυση. Λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης πρωτεϊνών στο περιτοναϊκό διάλυμα, αυτό σήμαινε πως απαιτούνταν μεγάλος όγκος διαλύματος για την αρχική επεξεργασία. Τα δείγματα από τη μελέτη GLOBAL δεν διέθεταν τον απαιτούμενο όγκο για αυτού του είδους την ανάλυση, οπότε σε αυτό το πείραμα χρησιμοποιήθηκαν μόνο δείγματα από την ομάδα ασθενών του ΠΓΝ Πατρών, όπου υπήρχαν διαθέσιμα 100ml περιτοναϊκού διαλύματος για κάθε δείγμα. Επελέγησαν δείγματα από εννέα (9) ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών (βλ ). Τρεις ασθενείς είχαν εικόνα συμβατή με σκληρυντική περιτονίτιδα, τρεις ασθενείς υποβάλλονταν σε ΠΚ για >5 έτη και είχαν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης και τρεις ασθενείς είχαν μόλις ξεκινήσει θεραπεία υποκατάστασης νεφρικής λειτουργίας με ΠΚ. Τα 9 αυτά δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το σύστημα Proteominer και στη συνέχεια αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Από την ανάλυση αυτή εντοπίστηκαν τρεις (3) πρωτεινες οι οποίες ήταν αυξημένες μόνο στους ασθενείς με EPS. Η ιντελεκτίνη-1 (Εικόνα 29α) ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στους ασθενείς που είχαν ξεκινήσει πρόσφατα ΠΚ και στους ασθενείς με σταθερή λειτουργία της περιτοναϊκής μεμβράνης. Ωστόσο, στους ασθενείς με EPS, ήταν ορατή μια πολύ πυκνότερη κηλίδα. Παρομοίως, η δερματοποντίνη (Εικόνα 29β) εκφραζόταν επίσης ισχυρά σε όλους τους ασθενείς με EPS, ενώ ήταν μόνο ήπια αυξημένη σε έναν από τους τρεις ασθενείς με σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης και δεν εκφράζονταν καθόλου στους νέους ασθενείς. Τέλος, η πρωτεΐνη RBP-4 (retinolbinding protein 4) ήταν επίσης αυξημένη στους ασθενείς με EPS σε σχέση με τους ασθενείς μάρτυρες. 88

89 Εικόνα 29: Σε περιτοναϊκό διάλυμα που έχει υποστεί επεξεργασία με το σύστημα Proteominer, oι πρωτεϊνες ιντελεκτίνη-1 (α) και δερματοποντίνη (β) βρίσκονται αυξημένες σε ασθενείς με σκληρυντική περιτονίτιδα Εικόνα 29: Από την ομάδα ασθενών του ΠΓΝ Πατρών, επελέγησαν δείγματα από 9 ασθενείς. 3 ασθενείς με εικόνα συμβατή με EPS, 3 ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ για >5 έτη και είχαν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης και 3 ασθενείς που είχαν μόλις ξεκινήσει θεραπεία με ΠΚ. Όγκος περιτοναϊκού διαλύματος που αντιστοιχούσε σε 15mg πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το σύστημα Proteominer, και ακολούθως αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων. Η πρωτεϊνική κηλίδα με αριθμό 7203 (α) βρέθηκε αυξημένη σε όλους τους ασθενείς με EPS σε σχέση με τους ασθενείς μάρτυρες. Παρομοίως, η κηλίδα με αριθμό 1001 βρέθηκε αυξημένη σε όλους τους ασθενείς με EPS και σε 1 από τους 3 ασθενείς που υποβάλλονταν σε ΠΚ >5 έτη. Οι κηλίδες αυτές απομονώθηκαν από τα gel και ταυτοποιήθηκαν με φασματογραφία μάζας (MALDI-TOF) ως ιντελεκτίνη-1 (α) και δερματοποντίνη (β). Στα γραφήματα παρουσιάζεται η μέση τιμή της οπτικής πυκνότητας για κάθε ομάδα ασθενών υπό τη μορφή mean±sem. H στατιστική σημαντικότητα ελέγχθηκε με 89

90 μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (one-way ANOVA). *p<0,05 και **p<0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ασθενών που είχαν <1 μήνα στην ΠΚ (Zavvos V et al., 2017) ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ-α1 ΤΟΥ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ (Ι) ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΕΡΜΑΤΟΠΟΝΤΙΝΗΣ ΣΤΟ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΠΟΥ ΥΠΟΒΑΛΛΟΝΤΑΙ ΣΕ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ Η ανάλυση του πρωτεώματος με την ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων παρέχει κυρίως ποιοτικές πληροφορίες για την πρωτεϊνική σύσταση του περιτοναϊκού διαλύματος, ενώ η ποσοτική έκφραση των διαφόρων πρωτεϊνών μπορεί να εκτιμηθεί αδρά, από την διαφορετική οπτική πυκνότητα των κηλίδων στα επί μέρους δείγματα. Για τον λόγο αυτό, μετά την ολοκλήρωση των πειραμάτων ηλεκτροφόρησης, η ερευνητική εργασία περνά στο δεύτερο στάδιο, στο οποίο θα διενεργηθεί ποσοτικός προσδιορισμός όλων των πρωτεϊνών που ανιχνεύθηκαν ως πιθανοί βιοδείκτες από τα πειράματα ηλεκτροφόρησης, και συσχέτιση των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών αυτών στο περιτοναϊκό διάλυμα με κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους των ασθενών. Στην προκαταρκτική φάση αυτού του σταδίου, οι πρωτεΐνες αλυσίδα α1 του κολλαγόνου τύπου Ι και δερματοποντίνη, προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη μέθοδο ELISA σε δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από τριάντα (30) ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών (βλ , πίνακας 12). Σε 14 από αυτούς, υπήρχαν επιπλέον διαθέσιμα δείγματα ορού που είχαν ληφθεί κατά τη διάρκεια ΡΕΤ και οι πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν και στον ορό. Η μέση συγκέντρωση της δερματοποντίνης στο περιτοναϊκό διάλυμα ήταν 0,331±0,121 ng/ml, ενώ στον ορό ήταν 1,895±0,577 ng/ml. Αντίστοιχα, η μέση συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι ήταν 0,683±0,272 ng/ml στο περιτοναϊκό διάλυμα και 136,67±40,05 ng/ml στον ορό Δερματοποντίνη Σε ό,τι αφορά στο περιτοναϊκό διάλυμα, η μονοπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε ότι η δερματοποντίνη παρουσιάζει μετρίως ισχυρή συσχέτιση με τη μεταοφορική ικανότητα του περιτοναίου (r=0,521, p<0,01 για το λόγο D/P κρεατινίνης και r=-0,58, p<0,01 για το λόγο 90

91 D/D 0 γλυκόζης, Εικόνα 30) και μετρίως ισχυρή αρνητική συσχέτιση με το υπερδιήθημα (r=- 0,6, p<0,01, Εικόνα 31). Αντίστοιχα, η δερματοποντίνη του ορού παρουσιάζει ισχυρή θετική συσχέτιση με τη CRP ορού (r=0,71, p<0,01, Εικόνα 32). Ο αριθμός των διαθέσιμων δειγμάτων ορού κρίθηκε πολύ μικρός για τη διενέργεια πολυπαραγοντικής ανάλυσης. Στο περιτοναϊκό διάλυμα, η συγκέντρωση της δερματοποντίνης αναλύθηκε πολυπαραγοντικά με τη χρήση μοντέλου πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης. Οι μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση ήταν: Φύλο, ηλικία, παρουσία σακχαρώδους διαβήτη, χρόνος στην ΠΚ (ημέρες), είδος ΠΚ, είδος διαλύματος, λόγος D/P κρεατινίνης, αριθμός επεισοδίων περιτονίτιδας, υπερδιήθημα και υπολειπόμενη διούρηση). Από την ανάλυση αυτή προέκυψε ότι η δερματοποντίνη του περιτοναϊκού διαλύματος συσχετίζεται με τον λόγο D/P κρεατινίνης (β=0,98, 95%CI 0,447-1,513, p=0,002), με τον αριθμό των επεισοδίων περιτονίτιδας (β=0,084, 95%CI 0,038-0,131, p=0,002) και με το χρόνο στη μέθοδο (β=- 0,000102, 95%CI -0, ,000017, p=0,022) (Πίνακας 14). Η συγκέντρωση της δερματοποντίνης στο περιτοναϊκό διάλυμα δεν παρουσίασε καμία συσχέτιση με το είδος του διαλύματος ΠΚ (βιοσυμβατό ή κλασσικό) ούτε στην μονοπαραγοντική ούτε στην πολυπαραγοντική ανάλυση. 91

92 Εικόνα 30: Η δερματοποντίνη στο περιτοναϊκό διάλυμα σχετίζεται με τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου Εικόνα 30: Η δερματοποντίνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ELISA σε δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από 30 ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών. Τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διενέργεια ΡΕΤ με διάλυμα 2,27%. Ακολούθησε μονοπαραγοντική συσχέτιση με τις παραμέτρους του ΡΕΤ κατά Pearson. Οι συγκεντρώσεις της δερματοποντίνης εκφράζονται σε ng/ml. 92

93 Εικόνα 31: Η δερματοποντίνη στο περιτοναϊκό διάλυμα παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με το υπερδιήθημα Εικόνα 31: Η δερματοποντίνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ELISA σε δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από 30 ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών. Τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διενέργεια ΡΕΤ με διάλυμα 2,27%. Ακολούθησε μονοπαραγοντική συσχέτιση με τις παραμέτρους του ΡΕΤ κατά Pearson. Οι συγκεντρώσεις της δερματοποντίνης εκφράζονται σε ng/ml και το υπερδιήθημα σε ml. 93

94 Εικόνα 32: Η δερματοποντίνη ορού παρουσιάζει θετική συσχέτιση με τη CRP Εικόνα 32: Η δερματοποντίνη προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ELISA σε δείγματα ορού από 14 ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών. Τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διενέργεια ΡΕΤ με διάλυμα 2,27%. Ακολούθησε μονοπαραγοντική συσχέτιση με τη CRP ορού κατά Pearson. Οι συγκεντρώσεις της δερματοποντίνης εκφράζονται σε ng/ml και της CRP σε mg/l. 94

95 Πίνακας 14: Η συγκέντρωση της δερματοποντίνης στο περιτοναϊκό διάλυμα, επηρεάζεται από τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου, τον αριθμό των προηγηθέντων επεισοδίων περιτονίτιδας και τον χρόνο στην ΠΚ. Β 95% P D/P κρεατινίνης 0,980 0,447 1,513 0,002 Επεισόδια 0,084 0,038 0,131 0,002 περιτονίτιδας Χρόνος υπό ΠΚ -0, , , ,022 Πίνακας 14: Η συγκέντρωση της δερματοποντίνης στο περιτοναϊκό διάλυμα αναλύθηκε πολυπαραγοντικά με τη χρήση μοντέλου πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης με ανάδρομη επιλογή των μεταβλητών (backward elimination). Οι μεταβλητές που ελέγχθηκαν ήταν: Φύλο, ηλικία, παρουσία σακχαρώδους διαβήτη, χρόνος στην ΠΚ (ημέρες), είδος ΠΚ, είδος διαλύματος, λόγος D/P κρεατινίνης, αριθμός επεισοδίων περιτονίτιδας, υπερδιήθημα και υπολειπόμενη διούρηση) Αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, η συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα παρουσιάζει μετρίως ισχυρή συσχέτιση με τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου (r=0,501, p<0,01 για το λόγο D/P κρεατινίνης και r=-0,527, p<0,01 για το λόγο D/D 0 γλυκόζης) (Εικόνα 33). Η συγκέντρωσή της στον ορό ωστόσο δεν παρουσίασε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με καμία από τις παραμέτρους που εξετάστηκαν. Η πολυπαραγοντική ανάλυση με τις ίδιες μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν και στην ανάλυση της δερματοποντίνης, ανέδειξε ότι η συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα σχετίζεται με το λόγο D/P κρεατινίνης (β=1,240, 95% CI -0,176-2,656, p=0,05) και τον αριθμό των επεισοδίων περιτονίτιδας (β=0,102, 95% CI 0,001-0,203, p=0,047) (Πίνακας 15). Η συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα δεν παρουσίασε καμία συσχέτιση με το είδος του διαλύματος ΠΚ (βιοσυμβατό ή κλασσικό) ούτε στην μονοπαραγοντική ούτε στην πολυπαραγοντική ανάλυση. 95

96 Εικόνα 33: Η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα σχετίζεται με τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου Εικόνα 33: Η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ELISA σε δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από 30 ασθενείς του ΠΓΝ Πατρών. Τα δείγματα ελήφθησαν κατά τη διενέργεια ΡΕΤ με διάλυμα 2,27%. Ακολούθησε μονοπαραγοντική συσχέτιση με τις παραμέτρους του ΡΕΤ κατά Pearson. Οι συγκεντρώσεις της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι εκφράζονται σε ng/ml. 96

97 Πίνακας 15: Η συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα, επηρεάζεται από τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου και τον αριθμό των προηγηθέντων επεισοδίων περιτονίτιδας Β 95% P D/P κρεατινίνης 1,240-0,176 2,656 0,050 Επεισόδια περιτονίτιδας 0,102 0,001 0,203 0,047 Πίνακας 15: Η συγκέντρωση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι στο περιτοναϊκό διάλυμα αναλύθηκε πολυπαραγοντικά με τη χρήση μοντέλου πολλαπλής γραμμικής παλινδρόμησης με ανάδρομη επιλογή των μεταβλητών (backward elimination). Οι μεταβλητές που ελέγχθηκαν ήταν: Φύλο, ηλικία, παρουσία σακχαρώδους διαβήτη, χρόνος στην ΠΚ (ημέρες), είδος ΠΚ, είδος διαλύματος, λόγος D/P κρεατινίνης, αριθμός επεισοδίων περιτονίτιδας, υπερδιήθημα και υπολειπόμενη διούρηση). 97

98 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΣΥΖΗΤΗΣΗ - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 5.1. ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗΝ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΚΑΘΑΡΣΗ Όπως περιγράφηκε αναλυτικά σε προηγούμενα κεφάλαια ( 2.9,2.10), η ίνωση του περιτοναίου (ΠΙ) και η συνακόλουθη ανεπάρκεια κάθαρσης και/ή υπερδιήθησης αποτελούν σημαντική αιτία απώλειας της μεθόδου της ΠΚ προϊόντος του χρόνου. Επιπλέον, η σκληρυντική περιτονίτιδα (EPS) ( 2.11) αποτελεί μία σπάνια αλλά δυνητικά θανατηφόρο επιπλοκή, η πιθανότητα εμφάνισης της οποίας αυξάνεται σημαντικά μετά τα πρώτα 5 έτη θεραπείας με ΠΚ. Έως σήμερα, η διάγνωση της ΠΙ βασίζεται κυρίως στην παρακολούθηση των λειτουργικών μεταβολών της περιτοναϊκής μεμβράνης, όπως αυτές εκφράζονται μέσω αλλαγών στο ΡΕτεστ και στην κάθαρση ουσιών, καθώς και μέσω εμφάνισης της ανεπάρκειας υπερδιήθησης. Αν και η ΠΙ δύναται να διαγνωσθεί ιστολογικά, η διενέργεια βιοψιών περιτοναίου δεν αποτελεί πραγματιστική επιλογή, διότι εγείρει ηθικά ζητήματα, αποτελεί επεμβατική πράξη η οποία δυνητικά συνοδεύεται από επιπλοκές και μπορεί να οδηγήσει σε προσωρινή διακοπή της ΠΚ, συνεπάγεται τη δημιουργία ουλής στο περιτόναιο με άγνωστες μακροπρόθεσμες επιπτώσεις και τέλος εγείρει τεχνικές δυσκολίες που σχετίζονται με την τυποποίηση της διαδικασίας και την επαναληιμότητά της. Αντίστοιχα, η διάγνωση της EPS βασίζεται στον συνδυασμό ενδεικτικών συμπτωμάτων και σημείων συμβατών με EPS (π.χ. υποθρεψία, εντερική απόφραξη) με απεικονιστικά ευρήματα από την αξονική τομογραφία κοιλίας ή με χαρακτηριστικά μακροσκοπικά ευρήματα κατά τη διενέργεια ερευνητικής λαπαροτομίας. Ωστόσο, η σπανιότητα της EPS, η ποικίλη κλινική εικόνα και η έλλειψη εργαλείων προ-συμπτωματικού ελέγχου (screening), καθώς και η έλλειψη ιστολογικών διαγνωστικών κριτηρίων έχει ως αποτέλεσμα την συχνά καθυστερημένη διάγνωση. Για τους παραπάνω λόγους, η ανεύρεση βιοδεικτών στο περιτοναϊκό διάλυμα οι οποίοι θα μπορούσαν να προβλέψουν ή να επιβεβαιώσουν τη διάγνωση της ΠΙ και/ή της EPS, θα ήταν ιδιαιτέρως σημαντική, καθώς θα επέτρεπε: Την καλύτερη παρακολούθηση της συμπεριφοράς του περιτοναίου και κατ επέκταση των ασθενών 98

99 Την ανάπτυξη προγνωστικών δεικτών/εργαλείων Την πιθανή διαλεύκανση της παθογένειας της ΠΙ/ EPS Τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων Η επίτευξη των ανωτέρω στόχων, θα μπορούσε να οδηγήσει σε καλύτερη επιλογή και διαστρωμάτωση των ασθενών που εντάσσονται σε θεραπεία με ΠΚ (π.χ. σε σχέση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΠΙ/ EPS) και ενδεχομένως σε βελτίωση της μακροπρόθεσμης επιβίωσης της μεθόδου. Για να αποτελέσει τον ιδανικό βιοδείκτη, μία πρωτεΐνη που ανευρίσκεται στο περιτοναϊκό διάλυμα θα πρέπει να πληροί τις ακόλουθες προϋποθέσεις: Να είναι εύκολα ανιχνεύσιμη/μετρήσιμη, με απλές και φθηνές εργαστηριακές μεθόδους Να παράγεται/εκκρίνεται από τους τοπικούς ιστούς Να έχει τεκμηριωμένη συμμετοχή στην παθογένεια της ΠΙ/ EPS Να χαρακτηρίζεται από υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα για την υπό μελέτη παθολογική διεργασία Έως σήμερα, πλήθος πρωτεϊνών έχει εξεταστεί για την πιθανή χρησιμότητά τους ως βιοδείκτες ΠΙ/EPS, ωστόσο κανείς δεν πληροί όλες τις παραπάνω προϋποθέσεις. Οι δύο πλέον μελετημένες πρωτεΐνες για αυτόν τον σκοπό είναι η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) και το καρκινικό αντιγόνο-125 (CA125). Η IL-6 είναι μία κυτοκίνη 26kD, με πλειοτροπική δράση στη φλεγμονή η οποία παράγεται από τους τοπικούς ιστούς αλλά παρουσιάζει μεγάλη διακύμανση τιμών μεταξύ διαφορετικών ατόμων. Εχει ήδη αποδειχθεί ότι αυξάνεται στη διάρκεια επεισοδίου περιτονίτιδας και παρουσιάζει ισχυρή συσχέτιση με τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου (PSTR), υποδηλώνοντας πιθανή υποκλινική ενδοπεριτοναϊκή φλεγμονή. Το CA-125, είναι μια γλυκοπρωτεΐνη 220kD η οποία παράγεται από τα μεσοθηλιακά κύτταρα και θεωρείται ότι η συγκέντρωσή του στο περιτοναϊκό διάλυμα αντανακλά τη μάζα των μεσοθηλιακών κυττάρων στο περιτόναιο. Επίσης, το CA125 έχει βρεθεί ότι αυξάνεται στη διάρκεια επεισοδίου περιτονίτιδας και με τη χρήση βιοσυμβατών έναντι μη-βιοσυμβατω ν διαλυμάτων, ενώ οι περισσότερες σχετικές μελέτες δείχνουν ότι μειώνεται με την πάροδο του χρόνου στην ΠΚ, εύρημα που έχει σχετιστεί με την απώλεια της 99

100 μεσοθηλιακής στοιβάδας του περιτοναίου (Lopes-Barreto D et al., 2013). Σε ό, τι αφορά στην πιθανή αξία αυτών των πρωτεϊνών ως βιοδεικτών EPS, μία παλαιότερη case-control μελέτη έχει δείξει ότι ο συνδυασμός χαμηλού CA-125 και υψηλής IL-6 είναι δυνατόν να προβλέψει την εμφάνιση σκληρυντικής περιτονίτιδας (Sampimon DE et al., 2010). Πέραν των δύο προαναφερθεισών πρωτεϊνών, ένας αριθμός άλλων πρωτεϊνών με πιθανό παθοφυσιολογικό ρόλο στην ανάπτυξη της EPS έχει μελετηθεί χωρίς ωστόσο κανείς να έχει αναδειχθεί ως καλός βιοδείκτης. Στις πρωτεΐνες αυτές περιλαμβάνονται αυξητικοί παράγοντες, πρωτεΐνες σχετιζόμενες με την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, κυτοκίνες, πρωτεΐνες του συστήματος πήξηςινωδόλυσης, AGEs και φλεγμονώδεις μεσολαβητές. Στον Πίνακα 16, συνοψίζονται οι κυριότερες ουσίες οι οποίες έχουν έως σήμερα μελετηθεί ως πιθανοί βιοδείκτες στο περιτοναϊκό διάλυμα. Πίνακας 16: Υποψήφιοι βιοδείκτες στο περιτοναϊκό διάλυμα 100

101 Πίνακας 16: Λίστα υποψηφίων βιοδεικτών στο περιτοναϊκό διάλυμα. Τροποποίηση από Lopes-Barreto D et al., TGF-β: Transforming Growth Factor β; VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor; CTGF: Connective Tissue Growth Factor; TNF-α: Tumour Necrosis Factor-α; MTAC: Mass Transfer Area Coefficient; ECM: Extracellular Matrix; PAI-1: Plamsinogen Activator Inhibitor-1; PSTR: Peritoneal Solute Transport Rate; MMP-2: Matrix Metalloproteinase-2; EMT: Epithelial-Mesenchymal Transition; CCL-18: Chemokine (C-C motif) Ligand-18; ICAM-1: Intercellular Adhesion Molecule-1; VCAM-1: Vascular Cell Adhesion Molecule-1; EPS: Encapsulating Peritoneal Sclerosis ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΟΥ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ Κοινό χαρακηριστικό όλων των μελετών ανεύρεσης βιοδεικτών στο περιτοναϊκό διάλυμα έως σήμερα, είναι ότι εξετάζονται μόνο πρωτεΐνες που είναι ήδη γνωστές. Επιλέγονται μόρια τα οποία συμμετέχουν σε γνωστά βιοχημικά μονοπάτια που θεωρείται ότι έχουν παθογενετικό ρόλο στην ΠΙ/EPS, τα μόρια αυτά ποσοτικοποιούνται στο περιτοναϊκό διάλυμα επιλεγμένων ασθενών και ακολουθεί συσχέτισή τους με κλινικές παραμέτρους. Αυτή η μεθοδολογική προσέγγιση προϋποθέτει εκ των προτέρων γνώση του υπό μελέτη βιοδείκτη, 101

102 ενώ δεν επιτρέπει την ανακάλυψη νέων, άγνωστων μέχρι σήμερα, μορίων. Οι τεχνολογίες που επιτρέπουν ανάλυση βιολογικών δειγμάτων σε μεγάλη κλίμακα (high throughput), όπως είναι η πρωτεωμική ανάλυση (proteomics) ξεπερνούν αυτό το πρόβλημα, καθώς επιτρέπουν την ταυτόχρονη ανάλυση εκατοντάδων πρωτεϊνών, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται και πρωτεΐνες οι οποίες ενδεχομένως δεν έχουν μελετηθεί στο παρελθόν. Οι τεχνολογίες πρωτεωμικής ανάλυσης μας παρέχουν εργαλεία που επιτρέπουν την εις βάθος εξέταση της πρωτεϊνικής σύστασης του περιτοναϊκού διαλύματος, ωστόσο η χρήση τους παραμένει περιορισμένη (Brewis IA, 2010). Οι σχετικές μελέτες είναι έως σήμερα λίγες σε αριθμό, πρώιμες ως προς τη μεθοδολογία τους, περιλαμβάνουν μικρό αριθμό ασθενών και είναι ετερογενείς ως προς τους σκοπούς τους. Στον Πίνακα 17, συνοψίζονται όλες οι μελέτες οι οποίες έχουν χρησιμοποιήσει μεθόδους πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος. Πρέπει να σημειωθεί ότι καμία μελέτη έως σήμερα δεν έχει προσπαθήσει να αναλύσει το πρωτέωμα του περιτοναϊκού διαλύματος προοπτικά και καμία δεν έχει μελετήσει τις μεταβολές που σχετίζονται με την ανάπτυξη ΠΙ/EPS. Πίνακας 17: Μελέτες πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος 102

103 Πίνακας 17: Από ανασκόπηση της βιβλιογραφίας εντοπίστηκαν 14 μελέτες οι οποίες έχουν χρησιμοποιήσει μεθόδους πρωτεωμικής ανάλυσης στο περιτοναϊκό διάλυμα. HD: Hemodialysis; CAPD: Continuous Ambulatory Peritoneal Dialysis; ESRD: End Stage Renal Disease; DM: Diabetes Mellitus; GN: Glomerulonephritis; CKD: Chronic Kidney Disease. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε μια βελτιστοποιημένη προσέγγιση πρωτεωμικής ανάλυσης, με σκοπό να ανιχνεύσουμε προοπτικά μεταβολές στο πρωτέωμα του περιτοναϊκού διαλύματος, σε δείγματα από επιλεγμένους ασθενείς της μελέτης GLOBAL, μιας από τις μεγαλύτερες παγκοσμίως συλλογές δειγμάτων ασθενών που υποβάλλονται σε ΠΚ. Οι ασθενείς οι οποίοι εκδήλωσαν EPS αντιστοιχίστηκαν με ασθενείς μάρτυρες, οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε ΠΚ για παρόμοιο χρονικό διάστημα και είχαν σταθερή λειτουργία περιτοναϊκής μεμβράνης. Η αντιστοίχιση των ασθενών έγινε με σημείο αναφοράς τον χρόνο εκδήλωσης της EPS ή τον χρόνο διακοπής της θεραπείας με ΠΚ. Ο κύριος σκοπός της μελέτης ήταν η ανίχνευση πρωτεϊνών στο περιτοναϊκό διάλυμα, η μέτρηση των οποίων θα μπορούσε να προβλέψει την εμφάνιση ΠΙ και/ή EPS. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος από επιλεγμένους Έλληνες ασθενείς που υποβάλλονταν σε θεραπεία με ΠΚ στο ΠΓΝ Πατρών, αναπτύξαμε και βελτιστοποιήσαμε μια μεθοδολογία για την ανίχνευση πρωτεϊνών που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση στο περιτοναϊκό διάλυμα και των οποίων η παρουσία συνήθως επισκιάζεται από τις πρωτεΐνες που βρίσκονται σε πολύ υψηλή συγκέντρωση. Πρέπει να σημειωθεί ότι η συγκεκριμένη μεθοδολογία εφαρμόστηκε για πρώτη φορά παγκοσμίως σε δείγματα περιτοναϊκού διαλύματος. Από τα πειράματα αυτά, καταφέραμε να εντοπίσουμε πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται στους ασθενείς που εκδήλωσαν ΠΙ/EPS. Σε ορισμένες δε περιπτώσεις, οι μεταβολές αυτές φαίνεται να προηγούνται της κλινικής διάγνωσης. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη συμπληρώνουν τα ολοένα αυξανόμενα στοιχεία που υποδεικνύουν ότι φλεγμονώδεις και ινωτικές διεργασίες στο περιτόναιο, προηγούνται της κλινικής εκδήλωσης της EPS. Οι πρωτεΐνες οι οποίες ανιχνεύθηκαν στην παρούσα μελέτη ενδέχεται να είναι καλοί βιοδείκτες της ΠΙ/EPS και για το λόγο αυτό χρήζουν περαιτέρω μελέτης στην κατεύθυνση αυτή. 103

104 5.3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Είναι ήδη γνωστό ότι το χρόνιο ουραιμικό περιβάλλον (milieu) σε συνδυασμό με τη μακρόχρονη έκθεση της περιτοναϊκής μεμβράνης στα μη βιοσυμβατά συστατικά των διαλυμάτων περιτοναϊκής κάθαρσης, επάγουν την εμφάνιση μορφολογικών αλλοιώσεων στο περιτόναιο, οι οποίες έχουν περιγραφεί αναλυτικά σε μελέτες στις οποίες αναλύθηκαν βιοψίες περιτοναίου (Williams JD et al., 2002, Mateijsen MA et al., 1999). Είναι ιδιαιτέρως ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν οι ιστολογικές αυτές αλλοιώσεις μπορούν να συσχετιστούν ή και να προβλεφθούν, από μεταβολές σε πρωτεΐνες που ευρίσκονται στο περιτοναϊκό διάλυμα, ανεξάρτητα από την προέλευση αυτών (δηλαδή ανεξάρτητα από το εάν παράγονται τοπικά ή προέρχονται από το πλάσμα). Επίσης, είναι σημαντικό να προσδιοριστεί εάν οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών αυτών μεταβάλλονται προϊόντος του χρόνου που υποβάλλεται ένας ασθενής σε ΠΚ. Εάν αποδειχθεί ότι συμβαίνουν τέτοιες μεταβολές στις συγκεντρώσεις πρωτεϊνών, οι πρωτεΐνες αυτές θα είχαν ιδιαίτερη χρησιμότητα ως βιοδείκτες η μέτρηση των οποίων στο περιτοναϊκό διάλυμα θα μπορούσε να υποδεικνύει την παρουσία ιστολογικής βλάβης, ενώ θα είχαν και αδιαμφισβήτητη προγνωστική αξία. Στον Πίνακα 18 παρουσιάζονται συνοπτικά οι πρωτεΐνες υποψήφιοι βιοδείκτες που εντοπίστηκαν από την μελέτη πρωτεωμικής ανάλυσης. Πίνακας 18: Υποψήφιοι βιοδείκτες ΠΙ/EPS στο περιτοναϊκό διάλυμα 104

105 Πίνακας 18: Από τα πειράματα πρωτεωμικής ανάλυσης του περιτοναϊκού διαλύματος εντοπίστηκαν 9 πρωτεΐνες οι οποίες παρουσιάζουν δυνητικό ενδιαφέρον ως βιοδείκτες ΠΙ/ΕPS. Οι πρωτεΐνες αυτές μεταβάλλονται με τον ίδιο τρόπο σε όλους τους ασθενείς που μελετήθηκαν. FP: Full Proteome; MP: Mined Proteome; EPS: Encapsulating Peritoneal Sclerosis; RBP-4: Retinol-Binding-Protein-4. Η λειτουργία των περισσότερων από αυτές τις πρωτεΐνες είναι ήδη γνωστή. Επομένως μπορεί κανείς να εικάσει τον πιθανό ρόλο τους στην ανάπτυξη της ΠΙ/EPS. Η εναπόθεση ινώδους είναι ένα χαρακτηριστικό ιστολογικό γνώρισμα της ΠΙ αλλά και της EPS (Honda K, 2005). Το ινώδες παράγεται από το ινωδογόνο και αμφότερα εμπλέκονται στον καταρράκτη της πήξης αλλά και σε φλεγμονώδεις διεργασίες. Στο περιτοναϊκό διάλυμα, η αλυσίδα-γ του ινωδογόνου έχει βρεθεί ότι αυξάνεται κατά τη διάρκεια ενός επεισοδίου περιτονίτιδας και υποχωρεί μετά από επιτυχή θεραπεία. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η αλυσίδα-γ του ινωδογόνου στο περιτοναϊκό διάλυμα αρχίζει να αυξάνεται μετά τους πρώτους 6-18 μήνες στην ΠΚ, ενώ στη συνέχεια σταθεροποιείται. Δεδομένου ότι οι ιστολογικές αλλοιώσεις στο περιτόναιο εμφανίζονται συνήθως μετά τα πρώτα 2 έτη στην ΠΚ (Williams JD et al., 2002), το πρότυπο μεταβολής της αλυσίδας-γ του ινωδογόνου πιθανώς αντανακλά την εξέλιξη των διεργασιών που οδηγούν στην εγκατάσταση ΠΙ. Δηλαδή είναι πιθανό ότι η αλυσίδα-γ του ινωδογόνου αρχίζει να αυξάνεται με την έναρξη των προ-ινωτικών διεργασιών και σταθεροποιείται όταν πλέον υπάρχει εγκατεστημένη ίνωση στο περιτόναιο. Ένα άλλο χαρακτηριστικό της ΠΙ είναι η εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Η πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης είναι κύριο συστατικό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των βασικών μεμβρανών και η προοδευτική αύξησή της στο περιτοναϊκό διάλυμα είναι πιθανό να αντανακλά τον αυξημένο μεταβολισμό (turnover) της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (Osada S et al., 2009). Σε 6 ασθενείς που εκδήλωσαν EPS, παρατηρήθηκαν αυξημένες συγκεντρώσεις της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι και της γ-ακτίνης στο περιτοναϊκό διάλυμα. Οι μεταβολές αυτές δεν παρατηρήθηκαν στο περιτοναϊκό διάλυμα των ασθενών-μαρτύρων. Η αύξηση της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι είναι πιθανό να αντανακλά τον αυξημένο μεταβολισμό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (όπως και η πρωτεογλυκάνη θειικής 105

106 ηπαράνης) και την εναπόθεση κολλαγόνου στο περιτόναιο (Fielding CA et al., 2014). Εξάλλου, έχει ήδη βρεθεί ότι το mrna της αλυσίδας-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι είναι αυξημένο στον περιτοναϊκό ιστό ασθενών με EPS, ενώ η εναπόθεσή του στην υπομεσοθηλιακή στοιβάδα του περιτοναίου των ασθενών αυτών έχει τεκμηριωθεί με ανοσοϊστοχημικές μεθόδους (Reimold FR et al., 2013; Guo H et al., 2007). Η συσχέτιση που παρουσιάζει η αλυσίδα-α1 του κολλαγόνου τύπου Ι με τη μεταφορική ικανότητα του περιτοναίου και με τον αριθμό των προηγηθέντων επεισοδίων περιτονίτιδας είναι πιθανή ένδειξη της συμμετοχής της και στις διεργασίες της ΠΙ, εκτός από την EPS. Η γ-ακτίνη είναι μία από τις βασικότερες πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και η αναδιαμόρφωση (remodeling) του κυτταροσκελετού της γ-ακτίνης είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της επιθηλιακήςμεσεγχυματικής μετάπτωσης (Haynes J et al., 2011). Η γ-ακτίνη είναι μία κατά βάση ενδοκυττάρια πρωτεΐνη, επομένως η πρώιμη αύξησή της στο περιτοναϊκό διάλυμα είναι πιθανό να είναι αποτέλεσμα της απελευθέρωσής της από κατεστραμμένο περιτοναϊκό ιστό (Mejean C et al., 1987). Είναι πιθανό ότι η ανάπτυξη της EPS είναι, μεταξύ άλλων, αποτέλεσμα και μιας ενεργού φλεγμονώδους διεργασίας (Lambie M et al., 2016). Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από τις παρατηρούμενες, στη μελέτη μας αλλά και σε άλλες μελέτες, αυξήσεις στις συγκεντρώσεις παραγόντων του συμπληρώματος (Reimold FR et al., 2013). Οι παράγοντες του συμπληρώματος Ι και Β ανιχνεύθηκαν και παρέμειναν αυξημένοι στο περιτοναϊκό διάλυμα ασθενών που εκδήλωσαν EPS, αρκετά έτη πριν τη διάγνωση. Κατά την ενεργοποίηση της εναλλακτικής οδού του συμπληρώματος, ο παράγοντας Β διχοτομείται από τον παράγοντα D καταλείποντας την καταλυτική υπομονάδα Bb. Εν συνεχεία, η ενεργός υπομονάδα Bb συνδέεται με τον παράγοντα C3b, σχηματίζοντας την C3-κονβερτάση της εναλλακτικής οδού και οδηγώντας στην περαιτέρω ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Ο παράγοντας Ι (γνωστός και ως απενεργοποιητής C3b/C4b) είναι επίσης ένας κομβικός ρυθμιστής της ενεργοποίησης του συμπληρώματος και η αυξημένη συγκέντρωσή του στο περιτοναϊκό διάλυμα είναι ενδεικτική της συνεχούς ενεργότητας των φλεγμονωδών μονοπατιών στους ασθενείς με EPS. Τα βιολογικά υγρά περιέχουν εκατοντάδες πρωτεΐνες οι συγκεντρώσεις των οποίων χαρακτηρίζονται από μεγάλο δυναμικό εύρος, το οποίο στην περίπτωση του πλάσματος 106

107 υπολογίζεται σε τάξεις μεγέθους. Το γεγονός αυτό αποτελεί μείζον πρόβλημα στην πρωτεωμική ανάλυση, καθώς οι πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται σε πολύ υψηλή συγκέντρωση εμποδίζουν την ανίχνευση των πρωτεϊνών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση (Hortin GL et al., 2008, 2010). Ωστόσο, οι πρωτεΐνες σε χαμηλή συγκέντρωση είναι πιθανότερο να είναι χρήσιμες ως βιοδείκτες. Στις μελέτες με ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων, το μεγάλο δυναμικό εύρος έχει δύο κύριες συνέπειες: 1) Συνεπάγεται ότι η συντριπτική πλειοψηφία της πρωτεϊνικής μάζας που φορτώνεται σε κάθε gel ηλεκτροφόρησης αποτελείται από τις πρωτεΐνες υψηλής συγκέντρωσης (πχ. αλβουμίνη, ανοσοσφαιρίνες, τρανσφερίνη κ.ά.) 2) Η παρουσία των πρωτεϊνών αυτών στο gel, δημιουργεί περιοχές αυξημένης πυκνότητας εμποδίζοντας την ανίχνευση άλλων πρωτεϊνών (βλ. Εικόνα 28Α). Οι συνδυαστικές βιβλιοθήκες ολιγοπεπτιδίων (CPLL) είναι μία τεχνολογία που μπορεί να συμπιέσει το δυναμικό εύρος των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών, μεταβάλλοντας την αναλογία των πρωτεϊνών υψηλής/χαμηλής συγκέντρωσης στο δείγμα (Hartwig S et al., 2012). Η τεχνολογία αυτή προτιμήθηκε έναντι άλλων τεχνικών όπως η απαλοιφή της αλβουμίνης με αντισώματα, καθώς οι τελευταίες στερούνται ειδικότητας και έχει βρεθεί ότι απαλείφουν και δυνητικά χρήσιμες πρωτεΐνες οι οποίες συνδέονται με την αλβουμίνη. Οι CPLL αποτελούνται από εξαπεπτίδια τα οποία είναι συνδεδεμένα σε πορώδη σφαιρίδια (beads), παρέχοντας έναν πληθυσμό από εκατομμύρια θέσεις σύνδεσης πρωτεϊνών (ligands). Καθώς το δείγμα διοχετεύεται μέσα από τη στήλη των σφαιριδίων, οι πρωτεΐνες του δείγματος συνδέονται στις διαθέσιμες θέσεις σύνδεσής τους. Οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε υψηλή συγκέντρωση στο δείγμα, προκαλούν γρήγορα κορεσμό των διαθέσιμων θέσεων δέσμευσής τους και η πλεονάζουσα πρωτεΐνη εξέρχεται από τη στήλη. Αντίθετα, οι πρωτεΐνες που βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση δεν προκαλούν κορεσμό των θέσεων δέσμευσής τους και δεσμεύονται σε αυξανόμενη ποσότητα, όσο περισσότερη πρωτεΐνη διοχετεύεται μέσα από τη στήλη. Το τελικό αποτέλεσμα είναι η συμπίεση του δυναμικού εύρους των συγκεντρώσεων των πρωτεϊνών. Στην Εικόνα 34, απεικονίζεται η αρχή λειτουργίας της τεχνολογίας CPLL. Καθώς η τεχνολογία αυτή δεν είχε χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν στην ανάλυση περιτοναϊκού διαλύματος, αναπτύξαμε μία μεθοδολογία επεξεργασίας των δειγμάτων με 107

108 κύριο στόχο να αντιμετωπίσουμε το πρόβλημα της πολύ χαμηλότερης συγκέντρωσης πρωτεϊνών στο περιτοναϊκό διάλυμα σε σχέση με το πλάσμα. Κατά την ανάπτυξη αυτής της μεθοδολογίας, το κύριο πρόβλημα ήταν να βρεθεί η βέλτιστη αναλογία πρωτεΐνης προς μάζα σφαιριδίων που θα χρησιμοποιούνταν. Αν η αναλογία αυτή ήταν πολύ υψηλή, τότε πολύ περισσότερες πρωτεΐνες θα προκαλούσαν κορεσμό των θέσεων δέσμευσής τους. Επειδή οι βιβλιοθήκες περιέχουν ίσες ποσότητες από τα διαφορετικά εξαπεπτίδια, το τελικό δείγμα θα περιείχε ίσες ποσότητες όλων των πρωτεϊνών που προκάλεσαν κορεσμό των θέσεων δέσμευσης, με αποτέλεσμα να χαθούν σημαντικές πληροφορίες ως προς την ποσοτική σύσταση του αρχικού δείγματος. Αντιθέτως, αν η αναλογία πρωτεΐνης προς μάζα σφαιριδίων ήταν πολύ μικρή, τότε ακόμη και πρωτεΐνες υψηλής συγκέντρωσης δεν θα προκαλούσαν κορεσμό των θέσεων δέσμευσής τους, οδηγώντας σε μη αποτελεσματική συμπίεση του δυναμικού εύρους. Στην παρούσα μελέτη, καταλήξαμε στην αναλογία 20μl σφαιριδίων για κάθε 10mg πρωτεΐνης. Εικόνα 34: Λειτουργία συνδυαστικών βιβλιοθηκών ολιγοπεπτιδίων Εικόνα 34: Το σύστημα εξόρυξης πρωτεώματος Proteominer (Bio-Rad Laboratories Ltd., Hercules, CA, USA) αποτελείται από βιβλιοθήκες εξαπεπτιδίων συνδεδεμένων σε πορώδη σφαιρίδια. Το δείγμα διοχετεύεται μέσα από τη στήλη των σφαιριδίων και οι πρωτεΐνες που δεν συνδέονται σε θέσεις δέσμευσης στα σφαιρίδια διαφεύγουν από τη στήλη και 108