ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΟΤΑΝΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΕΠΑΝΑΣΥΓΧΡΟΝΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΗΜΕΡΗΣΙΟΥ ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΡΟΛΟΓΙΟΥ ΣΤΟ ΦΑΣΟΛΙ (Phaseolus vulgaris) ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΗΣ ΑΓΓΕΛΙΚΗΣ ΓΑΛΕΟΥ ΓΕΩΠΟΝΟΥ ΑΘΗΝΑ 2018

2 ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΡΟΥΣΣΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών (ΕΚΠΑ) Επιβλέπων Α. ΠΡΟΜΠΟΝΑ, Ερευνήτρια Β, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» (ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ») Κ. ΧΑΡΑΛΑΜΠΙΔΗΣ, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΡΟΥΣΣΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Α. ΠΡΟΜΠΟΝΑ, Ερευνήτρια Β, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» Κ. ΧΑΡΑΛΑΜΠΙΔΗΣ, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Κ. ΘΑΝΟΣ, Καθηγητής, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Σ. ΡΙΖΟΠΟΥΛΟΥ, Καθηγήτρια, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Μ.-Σ. ΜΕΛΕΤΙΟΥ-ΧΡΗΣΤΟΥ, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ Α. ΒΟΛΟΥΔΑΚΗΣ, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών 1

3 «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από τη Σχολή Θετικών Επιστημών του Εθνικού και Καποδιαστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Ν.5343/1932, άρθρο 202) 2

4 Ποτέ δεν πρέπει να διστάζεις να πουλήσεις την αγελάδα σου για μια χούφτα μαγικά φασόλια. - Tom Robbins. 3

5 ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή υποστηρίχτηκε οικονομικά από τετραετή υποτροφία που μου δόθηκε από το Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» το οποίο και ευχαριστώ. Εκπονήθηκε στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του Κέντρου, στο εργαστήριο Χρονοβιολογίας, υπεύθυνη του οποίου είναι η Δρ Αναστασία Προμπονά. Την κυρία Προμπονά την ευχαριστώ για την ευκαιρία που μου έδωσε και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε εντάσσοντάς με στην ερευνητική της ομάδα, για την καθοδήγησή της σε κάθε στάδιο της μέχρι τώρα ερευνητικής μου πορείας και κυρίως για την πολύτιμη υποστήριξη και εμψύχωση που μου πρόσφερε απλόχερα όλα αυτά τα χρόνια στην εργαστηριακή καθημερινότητα. Στη συνέχεια, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Δρ Αναστασία Ρεπούσκου, προηγούμενο μέλος του εργαστηρίου και ακούραστο συμπαραστάτη μου. Η Νατάσα υπήρξε δασκάλα και συνεργάτης μου, αλλά κυρίως μία καλή φίλη και μαζί με την κυρία Προμπονά κάνανε για μένα το εργαστήριο Χρονοβιολογίας ένα δεύτερο, ζεστό σπιτικό. Δε θα μπορούσα εδώ να παραλείψω να ευχαριστήσω τον Δρ Μάριο Ξυδούς, πρώην μέλος του συνεργαζόμενου «διπλανού» εργαστηρίου Πυρηνικών Πρωτεϊνών στη Λειτουργικότητα της Χρωματίνης, που με επέμενε σχεδόν καθημερινά τα τελευταία χρόνια και έκανε την καθημερινότητα του εργαστηρίου πάντα λίγο καλύτερη. Την υπεύθυνη του ίδιου εργαστηρίου, Δρ Θωμαή Σουρλίγκα την ευχαριστώ για τις ευχάριστες και εποικοδομητικές συζητήσεις μας και τη βοήθειά της όποτε τη χρειάστηκα. Όλα τα παιδιά που πέρασαν κατά καιρούς από το δικό μας και τα γύρω εργαστήρια και ήρθαμε κοντά, συζητήσαμε και μοιραστήκαμε την αγωνία αλλά και τη χαρά της εργαστηριακής πρακτικής, τη Μαρία, τη Σοφία αλλά και όλους τους άλλους, σας ευχαριστώ. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου, Επίκουρο Καθηγητή του Τομέα Βοτανικής του Τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α., Ανδρέα Ρούσση, που ανέλαβε την εποπτεία της διδακτορικής μου, για την άριστη συνεργασία μας και την υποστήριξή του. Επίσης ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή, Κοσμά Χαραλαμπίδη, που ως μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής της διδακτορικής, με το ενδιαφέρον του, συνέβαλε στην ομαλή ολοκλήρωσή της. Επιπλέον τα μέλη της Εξεταστικής Επιτροπής, Καθηγητή Κ. Θάνο, Καθηγήτρια Σ. Ριζοπούλου, Επίκουρη Καθηγήτρια Μ.-Σ. Μελετίου-Χρήστου, που δέχτηκαν να με αξιολογήσουν, τους ευχαριστώ πολύ για το χρόνο τους. Ένα ιδιαίτερο ευχαριστώ θα 4

6 ήθελα να απευθύνω στον Επίκουρο Καθηγητή Ανδρέα Βολουδάκη από το Γ.Π.Α., ο οποίος έχει παρακολουθήσει την ερευνητική πορεία μου από την πολύ αρχή της, καθώς ήταν εκείνος που με σύστησε στο «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟ» και τη Δρ Προμπονά και τον ευχαριστώ για αυτό. Ένα μεγάλο ευχαριστώ σε όλους τους φίλους μου και κυρίως στην Ελευθερία, γιατί η ζωή χωρίς φίλους δεν έχει χαρά. Στην οικογένειά μου, σε αυτούς που επέμειναν ώστε να έρθω στον κόσμο, σε εκείνους που με μεγάλωσαν, με φρόντισαν και με αυταπάρνηση με σπούδασαν, αλλά και σε αυτούς που με επέλεξαν για οικογένειά τους και με στηρίζουν μέχρι σήμερα, ένα ευχαριστώ δεν είναι αρκετό. Νίκο, είσαι ο άνεμος κάτω από τα φτερά μου Σε ευχαριστώ. Ευχαριστώ και όποιον μπει στον κόπο να διαβάσει τη διδακτορική διατριβή μου, ελπίζω να βρείτε σε αυτή κάτι ενδιαφέρον και χρήσιμο! 5

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ... 6 i. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ii. SUMMARY Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Το Ημερήσιο Βιολογικό Ρολόι (ΗΒΡ) Α.1.1. Γενικά στοιχεία A.1.2. Χαρακτηριστικά του ΗΒΡ Α.1.3. Το ΗΒΡ των βακτηρίων Α.1.4. Το ΗΒΡ στους μύκητες Α.1.5. Το ΗΒΡ των εντόμων (το παράδειγμα της Drosophila melanogaster) Α.1.6. Το ΗΒΡ των θηλαστικών Α.2. Το ΗΒΡ των φυτών Α.2.1. Γενικά στοιχεία Α.2.2. Σηματοδοτικά μονοπάτια εισόδου στο ΗΒΡ (inputs) Α Φωτοδέκτες Α Η σηματοδότηση μέσω φυτοχρωμάτων Α.2.3. Ο κεντρικός ταλαντωτής του ΗΒΡ Α Κατασταλτικοί βρόχοι ανάδρασης Α Κύριος βρόχος Α Πρωινός βρόχος Α Εσπερινός βρόχος Α Αναλυτικά στοιχεία για ορισμένους εκ των βασικών παραγόντων του κεντρικού ταλαντωτή Α Οι μεταγραφικοί παράγοντες CCA1 και LHY Α Ο μεταγραφικός παράγοντας TOC Α Ο μεταγραφικός παράγοντας ELF Α Μεταγραφική ενεργοποίηση εντός του κεντρικού ταλαντωτή A Οι τροποποιήσεις της χρωματίνης ως μηχανισμός ρύθμισης της λειτουργίας του κεντρικού ταλαντωτή Α Μετα-μεταγραφικός και μετα-μεταφραστικός έλεγχος των γονιδίων του κεντρικού ταλαντωτή A.2.4. Μονοπάτια εξόδου του ΗΒΡ (outputs) A Επίδραση του ΗΒΡ στην ανάπτυξη των φυτών Α Επίδραση του ΗΒΡ στο χρόνο άνθησης

8 Α Επίδραση του ΗΒΡ στην απόκριση των φυτών σε καταπονήσεις A Επίδραση του ΗΒΡ στο μεταβολισμό A Ρυθμοί στις κινήσεις των φύλλων των ψυχανθών Α.3. Το φασόλι (Phaseolus vulgaris L.) ως πειραματόφυτο Α.4. ΣΚΟΠΟΣ B. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1. Υλικά και όργανα Β.1.1. Υλικά Β.1.2. Όργανα B.2. Φυτικό υλικό και πειραματικός σχεδιασμός Β.2.1. Φυτικό υλικό και συνθήκες ανάπτυξης Β.2.2. Εφαρμογή φωτός κατά τη διάρκεια της νύχτας («Τεχνητό Ξημέρωμα») Β.2.3. Χορήγηση ουσιών σε ολόκληρα φύλλα φασολιού Β.2.4. Καταγραφή κινήσεων φύλλων φασολιού B.3. Χειρισμός βακτηρίων και βακτηριακών καλλιεργειών B.3.1. Παρασκευή ηλεκτροδιαπερατών βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α B.3.2. Μετασχηματισμός βακτηρίων μέσω ηλεκτροδιάτρησης B.3.3. Παρασκευή δεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α για χημικό μετασχηματισμό (μέθοδος Inoue) B.3.4. Χημικός μετασχηματισμός βακτηρίων (heat shock) B.3.5. Αποθήκευση βακτηριακών κλώνων (stock γλυκερόλης) B.4. Απομόνωση και χειρισμός νουκλεϊκών οξέων B.4.1. Απομόνωση ολικού φυτικού RNA B.4.2. Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription reaction, RT) B.4.3. Απομόνωση γενωμικού DNA από φύλλα φασολιού Β Απομόνωση πυρήνων Β Μέθοδος CTAB για απομόνωση γενωμικού DNA B.4.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA B Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (plasmid mini prep) B Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας (plasmid midi prep) B.4.5. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) B PCR με χρήση προσαρμοστή (Adaptor mediated PCR) B PCR για ενίσχυση τμημάτων των υποκινητών Β PCR για κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση (Site Directed Mutagenesis) B PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR)

9 B.4.6. Ηλεκτροφορητική ανάλυση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης B.4.7. Καθαρισμός προϊόντων PCR και εξαγωγή προϊόντων PCR από πήκτωμα αγαρόζης (PCR clean up, DNA gel extraction) B.4.8. Πέψη DNA Β Πέψη γενωμικού DNA για τη δημιουργία μήτρας DNA για τις PCR με χρήση προσαρμοστή B.4.9. Συνένωση τμημάτων DNA (Ligation) Β Συνένωση τμημάτων DNA για τη δημιουργία μήτρας DNA για τις PCR με χρήση προσαρμοστή B Αντίδραση συμπλήρωσης άκρων DNA (Klenow treatment) B.5. Πρωτοπλάστες από φύλλα φασολιού B.5.1. Απομόνωση πρωτοπλαστών B.5.2. Μετασχηματισμός πρωτοπλαστών B.5.3. Μέτρηση φωταύγειας από δείγματα πρωτοπλαστών B.6. Ανάλυση πρωτεϊνών B.6.1. Λύση πρωτοπλαστών και εκχύλιση πρωτεϊνών B.6.2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοσουλφονικού νατρίου (SDS-PAGE) B.6.3. Ανοσοαποτύπωμα WESTERN B.6.4. Προσθήκη πρώτου και δεύτερου αντισώματος B.6.5. Αντίδραση ανίχνευσης του συμπλόκου αντιγόνου πρώτου αντισώματος δεύτερου αντισώματος (εμφάνιση) B.7. Περιγραφή εξειδικευμένων τεχνικών - Κλωνοποιήσεις B.7.1. Κατασκευή των φορέων έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τμημάτων υποκινητών γονιδίων του ρολογιού του φασολιού B Παρασκευή φορέα κλωνοποίησης ptz57r με τυφλά άκρα B Εισαγωγή των τμημάτων υποκινητών στο φορέα κλωνοποίησης ptz57r B Αντιδράσεις πέψης του φορέα έκφρασης και του τμήματος υποκινητή από το φορέα κλωνοποίησης B Αντίδραση συνένωσης του τμήματος υποκινητή και του φορέα έκφρασης 97 B Παρασκευή φορέα μικρότερου τμήματος υποκινητή από φορέα που περιέχει υποκινητή μεγαλύτερου μήκους Η περίπτωση του φορέα Ε B Παρασκευή όλων των υπολοίπων φορέων έκφρασης με μικρότερου μήκους ή τροποποιημένο υποκινητή B.7.2. Κατασκευή των φορέων υπερέκφρασης γονιδίων του ρολογιού του φασολιού 99 B.8. Ανάλυση διαγονιδιακών φυτών Arabidopsis thaliana, PvLHY-ox B.8.1. Φυτικό υλικό και συνθήκες ανάπτυξης

10 B Φύτευση σπερμάτων B.8.2. Παρατήρηση και καταγραφή φαινοτύπων B.8.3. Ανάλυση των διαγονιδιακών A. thaliana μέσω PCR Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Μελέτη της έκφρασης γονιδίων του ΗΒΡ στο φασόλι Γ.1.1. Απομόνωση ολικού RNA από φυτά φασολιού Γ.1.2. Ρυθμική έκφραση των γονιδίων του ΗΒΡ του φασολιού Γ Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων PvTOC1 και PvELF4 υπό διάφορες φωτοπεριοδικές συνθήκες Γ Επίδραση της εφαρμογής φωτός τη νύχτα στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ Γ Επίδραση της χορήγησης τριχοστατίνης Α και νικοτιναμιδίου στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ σε φύλλα φασολιού Γ Σύγκριση των ρυθμών στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ με τους ρυθμούς στις κινήσεις των φύλλων φυτών φασολιού Γ. 2. Οι πρωτοπλάστες από φύλλα φασολιού ως σύστημα μελέτης του ΗΒΡ Γ.2.1. Απομόνωση πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού Γ.2.2. Μελέτη ρυθμών γονιδίων του ΗΒΡ σε πρωτοπλάστες φασολιού Γ.2.3. Επίδραση της χορήγησης τριχοστατίνης Α και νικοτιναμιδίου στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ σε πρωτοπλάστες φασολιού Γ.2.4. Παροδικός μετασχηματισμός πρωτοπλαστών φασολιού Γ.3. Μελέτη περιοχής των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1, PvLHY και PvELF4, με χρήση του συστήματος πρωτοπλαστών Γ.4. Επίδραση της υπερέκφρασης πρωτεϊνών του ΗΒΡ στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων του ΗΒΡ στο φασόλι Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvLHY Γ Υπερέκφραση της PvLHY σε ετερόλογο σύστημα, φυτών A. thaliana (φυτά PvLHY-ox) Γ α. Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του PvLHY mrna στα φυτά PvLHY-ox141 Γ β. Καταγραφή φαινοτύπων στα φυτά PvLHY-ox Γ γ. Ανάλυση γονιδίων του ΗΒΡ στα φυτά PvLHY-ox Γ Υπερέκφραση της PvLHY σε ομόλογο σύστημα, πρωτοπλαστών φασολιού 145 Γ.4.2. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvELF Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC Γ Εξακρίβωση της υπερέκφρασης της PvTOC1 σε πρωτοπλάστες φασολιού 149 Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της PvTOC1 στην έκφραση υποκινητών γονιδίων του ρολογιού

11 Γ Εντοπισμός της περιοχής του υποκινητή PvTOC1 όπου δρα η πρωτεΐνη PvTOC Γ Εντοπισμός της λειτουργικής περιοχής της πρωτεΐνης PvTOC1 που ευθύνεται για την καταστολή επί του υποκινητή PvTOC Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δ.1. Οι πρωτοπλάστες φασολιού ως σύστημα για τη μελέτη του ΗΒΡ Δ.2. Ο επανασυγχρονισμός του ΗΒΡ του φασολιού από εξωτερικά ερεθίσματα Δ.2.1. Επίδραση του φωτός Δ.2.2. Ο ρόλος των HDACs Δ.3. Ανάλυση και μελέτη των υποκινητών των γονιδίων του ΗΒΡ, PvTOC1, PvLHY και PvELF Δ.4. Ο κατασταλτικός ρόλος του παράγοντα PvTOC ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Βιογραφικό Σημείωμα iii. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ

12 i. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα φυτά, ως οργανισμοί που δεν έχουν τη δυνατότητα μετακίνησης, έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς για να αντιδρούν στις διάφορες περιβαλλοντικές αλλαγές. Ένας από αυτούς είναι το ημερήσιο βιολογικό ρολόι (ΗΒΡ), το οποίο παράγει 24-ωρους ρυθμούς στη φυσιολογία και τη συμπεριφορά των οργανισμών, σε συμφωνία με το γεωφυσικό χρόνο. Το ΗΒΡ συντονίζει σημαντικές λειτουργίες των φυτών, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός και η άνθηση. Ως εκ τούτου, φυτά με καλά συγχρονισμένο ΗΒΡ παρουσιάζουν αυξημένη ευρωστία, ανθεκτικότητα και, κατ επέκταση, βελτιωμένες αποδόσεις. Το ΗΒΡ συγκροτείται από τρία δομικά συστατικά: τα μονοπάτια σηματοδότησης του κεντρικού ταλαντωτή (μονοπάτια εισόδου), τον ενδογενή κεντρικό ταλαντωτή και τα μονοπάτια εξόδου από αυτόν, δηλαδή τους βιοχημικούς και φυσιολογικούς ρυθμούς υπό τον έλεγχο του ρολογιού. Ο κύριος παράγοντας σηματοδότησης του ΗΒΡ είναι το φως, το οποίο συγχρονίζει το κεντρικό ταλαντωτή, μέσω των φωτοδεκτών. Ο κεντρικός ταλαντωτής αποτελείται από βρόχους επανατροφοδότησης μεταγραφικών παραγόντων με, κυρίως, αρνητική δράση. Για τη μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ επιλέχτηκε ως πειραματόφυτο το φασόλι (Phaseolus vulgaris). Στο φασόλι, πέραν της υψηλής διατροφικής του σημασίας και του καλλιεργητικού του ενδιαφέροντος, υπήρχαν στοιχεία ότι το ΗΒΡ λειτουργεί με διαφορετικό τρόπο από αυτό του ευρέως μελετώμενου Arabidopsis thaliana, γεγονός που ενισχύθηκε και από την παρούσα εργασία. Καθώς οι διαφορές αυτές πιθανά να αντικατοπτρίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς προσαρμογής στο περιβάλλον, έχει σημασία η μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και του μοριακού μηχανισμού που το διέπει. Η in vitro καλλιέργειά του, όμως, παρουσιάζει σημαντικά προβλήματα, καθιστώντας τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών φασολιού ιδιαίτερα δύσκολη. Έτσι, αναπτύχθηκε ένα in vitro κυτταρικό σύστημα πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, το οποίο αφού διαπιστώθηκε ότι διαθέτει άριστα λειτουργικό ΗΒΡ, χρησιμοποιήθηκε για μεγάλο μέρος των πειραμάτων της παρούσας εργασίας. Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζονται πειράματα με στόχο τη μελέτη των ρυθμών της έκφρασης υποψηφίων γονιδίων του ρολογιού. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο επανασυγχρονισμός του ρολογιού. Στο φασόλι, ο επανασυγχρονισμός από το φως είχε μελετηθεί ως προς την απόκριση του PvLHY, ενός πρωινά 11

13 εκφραζόμενου γονιδίου του ρολογιού. Έτσι, εξετάσθηκε επιπροσθέτως ο επανασυγχρονισμός από το φως των ρυθμών των εσπερινών γονιδίων, PvTOC1 και PvELF4 και δείχτηκε για πρώτη φορά απόκριση εσπερινών γονιδίων στο φως τη νύχτα, η οποία ρυθμίζεται από το ρολόι. Αυτές οι παρατηρήσεις συνδέθηκαν στη συνέχεια με μία φυσιολογική λειτουργία του φυτού, την περιοδική 24-ωρη κίνηση των φύλλων του, ενισχύοντας, έτσι, την άποψη ότι το ρολόι του φασολιού είναι δεκτικό στο φως τη νύχτα. Για τη μελέτη του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ του φασολιού, απομονώθηκε μέρος των υποκινητών τριών εκ των βασικών παραγόντων του, PvTOC1, PvELF4 και PvLHY και μελετήθηκε η λειτουργία cis-ρυθμιστικών στοιχείων τους. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε μία μέθοδος in vivo καταγραφής της ρυθμικής ενεργότητας υποκινητών γονιδίων του ρολογιού με τη χρήση γονιδίου αναφοράς, από το ίδιο δείγμα ζωντανών πρωτοπλαστών, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τέλος, έμφαση δόθηκε στο ρόλο του παράγοντα PvTOC1, κεντρικού στοιχείου του ρολογιού ο οποίος εκτός από την καταστολή του αναμενόμενου στόχου του, PvLHY, παρουσίασε και αυτοκαταστολή, μειώνοντας την ενεργότητα του υποκινητή του ίδιου του γονιδίου του. Επιπλέον, εντοπίστηκε η περιοχή του υποκινητή του PvTOC1 η οποία εμπλέκεται στην καταστολή της μεταγραφικής έκφρασης, καθώς και η λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης PvTOC1 η οποία είναι απαραίτητη για αυτή τη δράση. Προσδόθηκε, έτσι, ένας ρόλος στην πρωτεΐνη PvTOC1, ο οποίος δεν είχε αναφερθεί για ορθόλογές της από άλλα φυτικά είδη. Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε το ΗΒΡ του φασολιού, τόσο ως προς τον επανασυγχρονισμό του (π.χ. φως), όσο και ως προς τη λειτουργία κεντρικών στοιχείων του μοριακού μηχανισμού του. Για την διενέργεια των πειραμάτων, αναπτύχθηκε ένα in vitro σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού για την μελέτη του ΗΒΡ του φυτού, δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα νέο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί γενικότερα για την έρευνα στο φασόλι. Τα πειράματα και τα συμπεράσματα της εργασίας αυτής ανοίγουν καινούριους δρόμους στη μελέτη των μηχανισμών και της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και παρέχουν τις βάσεις για την περαιτέρω διεύρυνση της έρευνας στο πεδίο, η οποία μπορεί να καταλήξει στην κατανόηση του ΗΒΡ και ως εκ τούτου στην ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων ποικιλιών φασολιού, με αυξημένες αποδόσεις και/ή ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις του περιβάλλοντος. 12

14 ii. SUMMARY Study of the function and the resynchronization of the circadian clock in bean (Phaseolus vulgaris) Plants, as sessile organisms, have developed complex mechanisms to cope with the various environmental changes. One of these is the circadian clock, which generates the 24-hour rhythms in the physiology and behavior of the organisms, in agreement with the geophysical time. It coordinates important plant functions such as photosynthesis, metabolism and flowering. Therefore, plants with well-synchronized circadian clocks exhibit increased fitness, resistance and hence, higher yields. The plant clock is composed of three structural components: the signaling input pathways, the endogenous central oscillator and its output pathways, i.e. the biochemical and physiological rhythms under the control of the clock. The main signaling cue of the clock is light, which synchronizes the central oscillator through the photoreceptors. The central oscillator consists of feedback loops of transcription factors with, mainly, repressive function. Phaseolus vulgaris (common bean) was selected as the experimental plant, to study the function of the circadian clock. Besides its high nutritional value and hence its cultivation interest, there is evidence that the bean clock operates in a different way from that of the widely-studied Arabidopsis thaliana, a fact that was reinforced by the present work. These variations may reflect different mechanisms of adaptation to the environment. Thus, it has been challenging to analyze aspects of the clock function in bean in order to study the molecular mechanism that governs it. Its in vitro culture, however, presents significant problems, which makes the production of transgenic bean plants particularly difficult. Thus, to study the molecular mechanisms of the bean circadian clock, an in vitro cellular system of bean leaf protoplasts, which possesses a functional circadian clock, was developed and, therefore, it was largely used in the experiments of the present study. In the first part of the thesis experiments regarding the study of the expression patterns of putative clock genes are being presented. As a next step, the clock resynchronization was investigated. In bean, resynchronization by light was studied in respect to PvLHY, a morning expressed clock gene. Thus, additionally, resynchronization by light regarding the rhythms of the evening expressed genes, 13

15 PvTOC1 and PvELF4, was explored. A response of evening expressed genes to light at night, which is governed by the clock, was revealed for the first time. Moreover, the observed oscillations in gene expression were correlated to a physiological plant response, the periodic 24-hour leaf movements, a fact that reinforced the observation that the bean clock is receptive to light at night. To study the bean circadian clock s central oscillator, the promoters of three of its key factors, PvTOC1, PvELF4 and PvLHY were isolated and the function of selected cis-regulatory elements was examined. Furthermore, an in vivo method for recording the rhythmic activity of a reporter driven by clock gene promoters in the same sample of living bean protoplasts was developed. Finally, focus was given on the role of the central clock element, PvTOC1, which was found to exhibit selfreppression activity, by reducing the promoter activity of its own gene, in addition to repressing its expected target, PvLHY. The PvTOC1 promoter region, where this repression takes place, as well as the functional domain of the PvTOC1 protein that is necessary for this action were identified. Therefore, a role to the PvTOC1 protein was assigned, which has not been reported before for orthologue proteins in any plant species. Briefly, in this study, the bean circadian clock was examined, both in terms of its synchronization by light and the function of central elements of its molecular mechanism. For this purpose, an in vitro bean protoplast system was developed, thereby creating a new tool that can be used in bean research. The experiments and conclusions of the present work open new paths to study the mechanisms and function of the bean circadian clock and provide the basis for the expansion of the research in this field, leading to a deeper understanding of the circadian clock and to the perspective to develop new, improved bean varieties with higher crop yields and/or resistant to environmental stress. 14

16 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Το Ημερήσιο Βιολογικό Ρολόι (ΗΒΡ) Α.1.1. Γενικά στοιχεία Πώς θα μπορούσαμε να καθορίσουμε εάν ένα άτομο είναι ζωντανό ή νεκρό; Η πιο πιθανή απάντηση θα ήταν, από την παρουσία ή την απουσία ενός ρυθμού, από τους χτύπους της καρδιάς. Οι βιολογικοί ρυθμοί είναι εγγενείς στην ίδια τη ζωή και μπορούν να ανιχνευθούν από όλες τις αισθήσεις. Μπορούμε να τους δούμε, να τους ακούσουμε, να τους αισθανθούμε, να τους μυρίσουμε και ίσως να γευτούμε στοιχεία αυτών (Εικ. Α.1). Εικ. Α.1. Οι ρυθμοί μπορούν να ανιχνευθούν και από τις πέντε αισθήσεις: όραση (μετανάστευση των πουλιών, κινήσεις των φυτών, έκδυση των εντόμων), ακοή (νυκτερινή δραστηριότητα των τρωκτικών), αφή (λήψη καρδιακών παλμών ή αίσθηση του δαγκώματος κάποιου εντόμου σε ορισμένες χρονικές στιγμές της ημέρας), όσφρηση (άρωμα των φυτών) και γεύση (περιεκτικότητα αμύλου/ζάχαρης σε μήλα ή καλαμπόκια) (Koukkari και Sothern 2006). Ίσως η ίδια η αίσθηση του χρόνου θα μπορούσε να θεωρηθεί ως μία έκτη αίσθηση. Με πολλούς τρόπους μπορούμε να αντιληφθούμε πόσος χρόνος έχει 15

17 περάσει από την τελευταία εμφάνιση κάποιου γεγονότος, καθώς και την ώρα της ημέρας, το μήνα και το έτος, από διάφορα στοιχεία γύρω μας. Η ζωή κινείται σε συμφωνία με το ρυθμό των ρολογιών και των ημερολογίων, μερικά από αυτά βρίσκονται έξω από το σώμα και κάποια μέσα στα ίδια τα κύτταρα των έμβιων όντων. Εξ ορισμού, ρυθμός είναι μια αλλαγή που επαναλαμβάνεται με παρόμοιο μοτίβο. Στην πραγματικότητα, η αλλαγή, και όχι η σταθερότητα, είναι ο κανόνας για τη ζωή και η ρυθμική επανάληψη της αλλαγής καθιστά την προβλεψιμότητα πραγματικότητα. Για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια κάθε 24-ώρου, τα φύλλα ορισμένων φυτών αλλάζουν τον προσανατολισμό τους, η θερμοκρασία του ανθρώπινου σώματος αυξάνεται και ξαναπέφτει, οι μύκητες σποριοποιούν συγχρονισμένα και τα επίπεδα δραστηριότητας των τρωκτικών αυξομειώνονται. Αυτές οι ρυθμικές αλλαγές αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό τμήμα ενός τεράστιου δικτύου βιολογικών ρυθμών, που πέρασε από τη μία γενιά στην άλλη. Όλες οι γνωστές μεταβλητές της ζωής, είτε πρόκειται για επίπεδα ιόντων καλίου σε ένα κύτταρο, τα στάδια του ύπνου ή το άνοιγμα και το κλείσιμο των λουλουδιών, είτε άμεσα είτε έμμεσα βρέθηκαν να εμφανίζουν ρυθμούς. Επιπλέον, η προσαρμογή των οργανισμών σε σχέση με τους γεωφυσικούς κύκλους, όπως η ηλιακή ημέρα, οι εποχές και παλίρροιες, βεβαιώνουν την εξέλιξη των γενετικών πτυχών ορισμένων τύπων ρυθμικού συγχρονισμού (W. Koukkari και R. Sothern, 2006). A.1.2. Χαρακτηριστικά του ΗΒΡ Ως αποτέλεσμα της περιστροφής της γης γύρω από τον άξονά της κάθε 24 ώρες, οποιαδήποτε θέση στην επιφάνειά της βρίσκεται εναλλάξ στραμμένη προς και μακριά από τον ήλιο (η ημέρα και η νύχτα, αντίστοιχα). Το γεγονός ότι ο μεταβολισμός, η φυσιολογία, και η συμπεριφορά των περισσότερων οργανισμών αλλάζει εμφανώς μεταξύ της ημέρας και της νύχτας είναι προφανές ακόμα και για τον πιο απλό παρατηρητή. Αυτές οι βιολογικές ταλαντώσεις είναι οι λεγόμενοι περιημερήσιοι ρυθμοί. Αυτό που είναι λιγότερο προφανές είναι ότι οι περισσότεροι οργανισμοί έχουν την έμφυτη ικανότητα να μετρούν το χρόνο. Πράγματι, οι περισσότεροι οργανισμοί δεν ανταποκρίνονται απλά στην ανατολή του ηλίου, αλλά, μάλλον, προβλέπουν την αυγή και προσαρμόζουν τη βιολογία τους αναλόγως. Όταν στερούνται εξωγενών χρονικών ερεθισμάτων, πολλοί από αυτούς τους ημερήσιους 16

18 ρυθμούς διατηρούνται, υποδεικνύοντας το ότι δημιουργούνται και συντηρούνται από ένα ενδογενές ημερήσιο βιολογικό ρολόι (ΗΒΡ ή ρολόι, για συντομία). Οι περιημερήσιοι ρυθμοί είναι το υποσύνολο των βιολογικών ρυθμών με περίοδο περίπου 24 ωρών (Dunlap et al., 2004). Από αυτό το καθοριστικό χαρακτηριστικό εμπνεύστηκε ο Franz Halberg το 1959 για να δημιουργήσει τον όρο circadian, από τις λατινικές λέξεις circa (περίπου) και dies (ημέρα). Ένα δεύτερο χαρακτηριστικό των ρυθμών αυτών είναι ότι δημιουργούνται ενδογενώς και είναι αυτοσυντηρούμενοι, έτσι ώστε να συνεχίζουν και κάτω από σταθερές περιβαλλοντικές συνθήκες, συνήθως συνεχές φως (ή σκοτάδι) και σταθερή θερμοκρασία. Υπό αυτές τις ελεγχόμενες συνθήκες, ο οργανισμός στερείται εξωτερικών δεικτών χρόνου και παρατηρείται η ελεύθερη περίοδος των 24 ωρών. Ένα τρίτο χαρακτηριστικό όλων των περιημερήσιων ρυθμών είναι η αντιστάθμιση θερμοκρασίας: η περίοδός τους παραμένει σχετικά σταθερή σε ένα εύρος θερμοκρασιών περιβάλλοντος (Pittendrigh, 1954). Εικ. Α.2. Παράδειγμα αντιπροσωπευτικού περιημερήσιου ρυθμού, στον οποίο το επίπεδο ενός συγκεκριμένου μέτρου (π.χ. επίπεδα κάποιας δραστηριότητας) ποικίλλει ανάλογα με το χρόνο. Amplitude: πλάτος ταλάντωσης, period: περίοδος ταλάντωσης ( Οι περιημερήσιες ταλαντώσεις είναι ένα βιοχημικό σύστημα που εναλλάσσεται με έναν σταθερό ρυθμό μεταξύ δύο ακραίων καταστάσεων. Μοιάζει έτσι με ένα εκκρεμές που ταλαντώνεται σταθερά μεταξύ δύο αντίθετων θέσεων. Γενικά, ως πλάτος της ταλάντωσης (amplitude) ορίζεται το ήμισυ της διαφοράς της τιμής του ελαχίστου από την τιμή του μεγίστου. Η περίοδος της ταλάντωσης (period) αναφέρεται στο χρόνο που απαιτείται για τη συμπλήρωση ενός πλήρους κύκλου ταλάντωσης (Εικ. Α.2). Η φάση του ρυθμού αναφέρεται σε συγκεκριμένα 17

19 χαρακτηριστικά του ρυθμού, όπως είναι η μέγιστη ή η ελάχιστη τιμή, σε σχέση με την αντίστοιχη χρονική κλίμακα. Όπως είχε προταθεί από τον Bünning ήδη από το 1936, οι οργανισμοί χρησιμοποιούν ένα ρολόι τύπου εκκρεμούς για να μετρούν το χρόνο που περνάει. Το εκκρεμές αυτό αναφέρεται ως το ΗΒΡ, το οποίο διέπει τους 24-ωρους ρυθμούς ως ο εγγενής βηματοδότης των οργανισμών (Engelman, 2007). Μόνο σε εξαιρετικές περιπτώσεις, όπως στο εργαστήριο, ένας οργανισμός στερείται περιβαλλοντικών δεικτών χρόνου, όπως οι κύκλοι φωτός/σκοταδιού ή κύκλοι θερμοκρασίας που προκύπτουν από την εναλλαγή ημέρας και νύχτας. Αυτά τα περιβαλλοντικά σήματα του χρόνου, που ονομάζονται Ζeitgebers («δότες» χρόνου, στα γερμανικά) συγχρονίζουν το ενδογενές σύστημα μέτρησης του χρόνου σε μια περίοδο 24 ωρών, αντίστοιχη με την εξωγενή περίοδο της περιστροφής της γης γύρω από τον άξονά της (McClung, 2006). Τα ΗΒΡ των διαφόρων οργανισμών ανταποκρίνονται κατά κανόνα στο φως (Devlin, 2002) και ο σωστός συγχρονισμός τους βασίζεται, εν μέρει, στη διαφορετική απόκριση στο φως κατά τη διάρκεια του κύκλου. Η απόκριση υφίσταται τη λεγόμενη χρονοεξαρτώμενη απόκριση (gating): ο ταλαντωτής φαίνεται να αποκρίνεται σε ερεθίσματα επανασυγχρονισμού μόνο σε συγκεκριμένες και κατάλληλες ώρες του 24-ώρου (Somers, 2005). Το φωτεινό σήμα πρέπει, επίσης, να είναι έντονο και παρατεταμένο, αποτρέποντας έτσι συγχρονισμό από λανθασμένα σήματα, όπως το φως του φεγγαριού ή φως από αστραπή (Devlin, 2002). Α.1.3. Το ΗΒΡ των βακτηρίων Τα κυανοβακτήρια έχουν αναδειχθεί σε σημαντικούς πρότυπους οργανισμούς για τη μελέτη των περιημερήσιων ρυθμών και, προς το παρόν, ο μηχανισμός λειτουργίας του ΗΒΡ τους είναι ο καλύτερα μελετημένος από άποψη βιοχημείας, δομικής βιολογίας, βιοφυσικής, μοριακής γενετικής και προσαρμοστικής σημασίας. Πρόσφατες αναφορές υποδηλώνουν την ύπαρξη εκτεταμένης καθημερινής χρονομέτρησης στα Ευβακτήρια και τα Αρχαία, μέσω μηχανισμών που μοιράζονται κοινά στοιχεία με το ρολόι των κυανοβακτηρίων αλλά είναι διαφορετικοί (Johnson et al., 2017). Επιπλέον, η χρονική συνιστώσα της σχέσης ξενιστή-μικροβίου ελέγχει σημαντικές πτυχές της σχέσης τους. Τουλάχιστον κάποια από τα μέλη της μικροβιακής χλωρίδας του ανθρώπινου εντέρου έχουν, πιθανά, ενδογενείς χρονομετρητές, κάτι που βοηθά τόσο στην προσαρμογή τους στο εντερικό 18

20 περιβάλλον όσο και στο εξωτερικό περιβάλλον μετά την απέκκρισή τους (Paulose et al., 2016). Όσον αφορά το ΗΒΡ των κυανοβακτηρίων αρχικά πειράματα υποστήριζαν το μοντέλο του ανατροφοδοτούμενου βρόχου μεταγραφής-μετάφρασης (transcriptiontranslation feedback loop, TTFL), όπως αυτό του ΗΒΡ των θηλαστικών (βλ. ενότ. Α.1.6). Ωστόσο, η αξιοσημείωτη ανακάλυψη ότι τρεις πρωτεΐνες του κυανοβακτηριακού ρολογιού (KaiA, KaiB και KaiC) θα μπορούσαν να ανασυγκροτήσουν έναν 24-ωρο ταλαντωτή in vitro για πολλές ημέρες (Nakajima et al., 2005) οδήγησε στην τρέχουσα κατανόηση του συστήματος του ρολογιού στα κυανοβακτήρια ένας βιοχημικός ταλαντωτής είναι ο πυρήνας του βηματοδότη, ο οποίος ρυθμίζει μία μεγαλύτερη TTFL που, με τη σειρά της, ελέγχει τα μονοπάτια εξόδου και αναπληρώνει τις βασικές πρωτεΐνες του ταλαντωτή (Johnson et al., 2017). Εικ. Α.3. Ο ταλαντωτής του ΗΒΡ στα κυανοβακτήρια. Ένας αυτοσυντηρούμενος μεταμεταφραστικός ταλαντωτής (Post-Translational Oscillator, PTO) ενσωματώνεται σε έναν βρόχο ανάδρασης μεταγραφής-μετάφρασης (Transcription-Translation Feedback Loop, TTFL) (Johnson et al., 2017). Το μόριο-κλειδί είναι η πρωτεΐνη KaiC. Η σύνθεση των μη φωσφορυλιωμένων μονομερών της KaiC τροφοδοτείται στον μοριακό ταλαντωτή, ο 19

21 οποίος υφίσταται έναν κύκλο σύνδεσης με και αποσύνδεσης από το νανοσύμπλοκο KaiA-KaiB-KaiC (Qin et al., 2010). Η KaiC αλληλεπιδρά με την KaiB, διαμεσολαβώντας στη δραστηριότητα μεταγραφικών παραγόντων και τη ρυθμική συμπύκνωση-αποσυμπύκνωση του DNA για τον καθολικό έλεγχο των επιπέδων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων που καθοδηγούν την έκφραση των βασικών γονιδίων του ρολογιού kaia, kaib και kaic (Εικ. Α.3). Α.1.4. Το ΗΒΡ στους μύκητες Ο νηματοειδής μύκητας Neurospora crassa έχει χρησιμοποιηθεί εδώ και σχεδόν μισό αιώνα ως μοντέλο για τη μελέτη της βασικής φυσιολογίας και μοριακής βιολογίας του ΗΒΡ. Η έρευνα στο N. crassa έχει αποσαφηνίσει τα βασικά στοιχεία για την κατανόηση του ΗΒΡ ως ένα σύστημα αλληλοδιαπλεκόμενων βρόχων θετικής και αρνητικής ανάδρασης που ρυθμίζονται μέσω μεταγραφικών και μεταμεταγραφικών διαδικασιών (Baker et al., 2012). Στο ΗΒΡ της N. crassa, η κεντρική ταλάντωση συμβαίνει σε δύο σημαντικά στάδια (Merrow et al., 1997). Ξεκινώντας από αργά στην υποκειμενική νύχτα, το σύμπλοκο WCC (πρωτεΐνες white collar 1 και 2 [WC-1 και WC-2]) προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου frq (frequency) για την επαγωγή της έκφρασης του frq, η οποία φτάνει σε μέγιστο νωρίς το υποκειμενικό πρωί. Αυτό είναι το «θετικό χέρι» του βρόχου ανατροφοδότησης (Crosthwaite et al., 1997; He et al., 2002). Η σύνθεση της πρωτεΐνης FRQ αρχίζει και εντός των πρώτων 3-6 ωρών από την έκφρασή της σχηματίζει λειτουργικά ομοδιμερή, τα οποία εισέρχονται στον πυρήνα και καταστέλλουν ταχύτατα τη μεταγραφή του ίδιου του γονιδίου frq, μέσω αλληλεπίδρασής της με το WCC (Denault et al., 2001; Hong et al., 2008). Η αλληλεπίδραση της FRQ με το WCC διευκολύνει τη φωσφορυλίωση του WCC, η οποία το απενεργοποιεί, αφαιρώντας το WCC από τον υποκινητή του frq. Καθώς η αρνητική ανατροφοδότηση ολοκληρώνεται κατά το μέσο προς αργά την ημέρα, η έκφραση του frq μειώνεται, όπως και ο ρυθμός σύνθεσης της FRQ. Ο κύκλος ολοκληρώνεται με την καθυστερημένη απελευθέρωση της FRQ-διαμεσολαβούμενης καταστολής, μιας διαδικασίας που απαιτεί την εκτεταμένη φωσφορυλίωση της FRQ (Merrow et al., 1997; Schafmeier et al., 2006). Απαραίτητη για την αρνητική ανάδραση της FRQ είναι η αλληλεπίδρασή της με την FRH (FRQ-interacting RNA helicase) (Εικ. Α.4). 20

22 Εικ. Α.4. Οργάνωση των μοριακών συνιστωσών του βρόχου ανατροφοδότησης στον μύκητα Neurospora crassa. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες συγχρονισμού του ΗΒΡ, φως και θερμοκρασία, υπεισέρχονται σε διαφορετικά στοιχεία του ταλαντωτή. Το φως δρα μέσω της λειτουργίας φωτοδέκτη, του WC-1, για την επαγωγή της μεταγραφής του frq, και η θερμοκρασία ρυθμίζει την ποσότητα της FRQ. Τα ρυθμικά αποτελέσματα του ΗΒΡ δημιουργούνται κυρίως μέσω της ρυθμικής έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού (clock controlled genes, ccgs), αλλά μπορεί επίσης να οφείλονται και σε μεταβολές στη σταθερότητα του mrna και ενδεχομένως στη φωσφορυλίωση. Στη χρονοκαθυστέρηση συμβάλλουν κινάσες, επηρεάζοντας τη σταθερότητα της πρωτεΐνης FRQ (Baker et al., 2012). Α.1.5. Το ΗΒΡ των εντόμων (το παράδειγμα της Drosophila melanogaster) Στην περίπτωση των εντόμων, η δροσόφιλα (Drosophila melanogaster) υπήρξε πρότυπος οργανισμός επιλογής για την κατανόηση σε γενετικό επίπεδο, σε μοριακό επίπεδο και στο επίπεδο των νευρικών κυκλωμάτων, του πώς παράγονται οι περιημερήσιοι ρυθμοί, πώς συγχρονίζονται από περιβαλλοντικούς παράγοντες και πώς οδηγούν σε συμπεριφορικούς κύκλους, όπως οι κινητικοί ρυθμοί (locomotor activity rhythms). Το ΗΒΡ στη δροσόφιλα καθορίζει πληθώρα συμπεριφορών, όπως ο χρόνος έκδυσης και ζευγαρώματος, ρυθμίζει την περίοδο ξεκούρασης/ενεργού δραστηριότητας και το χρόνο λήψης τροφής και επηρεάζει τη θερμοκρασιακή προτίμηση (Tataroglu και Emery, 2014). 21

23 Εικ. Α.5. Ο μεταγραφικός βρόχος ανατροφοδότησης του ΗΒΡ της δροσόφιλα. Τα CLK/CYC οδηγούν την έκφραση των ίδιων των καταστολέων τους, PER και TIM. Τα PER/TIM υφίστανται διάφορες τροποποιήσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας, μέχρι να αποικοδομηθούν τελικά, για να απελευθερωθούν τα CLK/CYC από την καταστολή, ξεκινώντας τον επόμενο κύκλο (Tataroglu και Emery, 2014). Ο ταλαντωτής του ΗΒΡ της δροσόφιλα έχει μελετηθεί σε βάθος. Οι μεταγραφικοί παράγοντες CLOCK (CLK) και CYCLE (CYC) σχηματίζουν ένα ετεροδιμερές και επάγουν τη μεταγραφή των γονιδίων period (per) και timeless (tim) (Allada et al., 1998; Rutila et al.; 1998, Darlington et al., 1998). Οι πρωτεΐνες PER και ΤΙΜ συσσωρεύονται κατά τη διάρκεια της νύχτας και σχηματίζουν, επίσης, ετεροδιμερές. Tο σύμπλοκο PER/TIM εισέρχεται στον πυρήνα σε φωσφορυλιωμένη μορφή και καταστέλλει τη δράση του συμπλόκου CLK/CYC. Ωστόσο, οι PER και TIM επίσης φωσφορυλιώνονται, σταδιακά, κατά τη διάρκεια της ημέρας. Αυτό τελικά καταλήγει στην αποικοδόμησή τους και απελευθερώνει την καταστολή του επαγωγικού συμπλόκου CLK/CYC, ώστε να ξεκινήσει ένας νέος κύκλος (Εικ. Α.5). Αυτό το μοριακό ρολόι λαμβάνει μία από τις ισχυρότερες περιβαλλοντικές εισροές, το φως, μέσω της ενεργοποίησης του CRYPTOCHROME (CRY). Με την απορρόφηση φωτονίων, αυτός ο φωτοδέκτης του μπλε φωτός (CRY) υφίσταται μια στερεοχημική αλλαγή που του επιτρέπει να δεσμεύσει την πρωτεΐνη TIM (Stanewsky et al., 1998). Αυτό προάγει την ουβικιτινιλίωση του TIM και την πρωτεασωμική αποικοδόμησή του, επαναφέροντας έτσι το ρολόι. 22

24 Οι παραπάνω μηχανισμοί είναι αρκετά συντηρημένοι στα θηλαστικά και στους ανθρώπους. Η συντήρηση αυτή επεκτείνεται και στα νευρικά κυκλώματα που ελέγχουν την 24-ωρη συμπεριφορά. Πράγματι, ομόλογα νευροπεπτίδια και υποδοχείς εμπλέκονται στον έλεγχο της ρυθμικής συμπεριφοράς. Η δροσόφιλα είναι, λοιπόν, ένα πολύ χρήσιμο μοντέλο οργανισμού για να κατανοήσουμε τις βασικές μοριακές και νευρικές βάσεις των περιημερήσιων ρυθμών (Tataroglu και Emery, 2014). Α.1.6. Το ΗΒΡ των θηλαστικών Τα ΗΒΡ φαίνεται να είναι προϊόντα συγκλίνουσας εξέλιξης, καθώς οι αρχές σχεδιασμού των περιημερήσιων μεταγραφικών κυκλωμάτων μοιράζονται ένα κοινό μοτίβο (δηλαδή, την αρνητική ανάδραση με χρονο-καθυστέρηση), αν και τα εξειδικευμένα συστατικά τους διαφέρουν σημαντικά ανάμεσα στα διάφορα βασίλεια της ζωής. Το εάν τα ΗΒΡ δημιουργήθηκαν για να προσαρμοστούν οι οργανισμοί στις ενεργειακές απαιτήσεις του περιβάλλοντος ή για να αποφευχθούν οι επιζήμιες συνέπειες της ηλιακής ακτινοβολίας παραμένει ένα θέμα συζήτησης. Ανεξαρτήτως αυτού, είναι προφανές σήμερα ότι τα αυτόνομα-σε-επίπεδο-κυττάρου ρολόγια είναι πανταχού παρόντα. Στα θηλαστικά, για παράδειγμα, η ανακάλυψη των γονιδίων του ρολογιού στη δεκαετία του 1990 έδειξε ότι ουσιαστικά όλα τα κύτταρα εκφράζουν αυτά τα γονίδια και έχουν την ικανότητα να παράγουν περιημερήσιες ταλαντώσεις. Το ΗΒΡ στα θηλαστικά θεωρείται πλέον ως ένα ιεραρχικό σύστημα, στο οποίο το ρολόι που εδρεύει στον υπερχιασματικό πυρήνα του υποθαλάμου του εγκεφάλου ενεργεί ως ο κύριος βηματοδότης που συγχρονίζει τα περιφερειακά ρολόγια που κατανέμονται σε όλο το σώμα (Takahashi, 2017) (Εικ. Α.6). Ο μοριακός μηχανισμός του ΗΒΡ στα θηλαστικά συγκροτείται από ένα δίκτυο κυτταρικά αυτόνομων μεταγραφικών αυτορυθμιζόμενων βρόχων ανατροφοδότησης. Τα βασικά γονίδια του ρολογιού περιλαμβάνουν τα CLOCK και BMAL1, τα οποία κωδικοποιούν μεταγραφικούς ενεργοποιητές, και τα PER1, PER2, CRY1 και CRY2, τα οποία κωδικοποιούν καταστολείς. Ένα σημαντικό κλάσμα (~ 5-20%) των γονιδίων που εκφράζονται σε κάθε συγκεκριμένο κύτταρο ή ιστό έχει βρεθεί ότι υφίσταται περιημερήσιες ταλαντώσεις σε επίπεδο mrna (Zhang et al., 2014). Ωστόσο, αυτό το επίπεδο ρύθμισης είναι μόνο ένα από το πλήθος των επιπέδων ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στο ΗΒΡ. Σχεδόν κάθε ρυθμιστικό στάδιο της γονιδιακής έκφρασης που έχει εξεταστεί λεπτομερώς, όπως της μεταγραφής, του ματίσματος, του 23

25 τερματισμού, της πολυαδενυλίωσης, της πυρηνικής εξαγωγής, της ρύθμισης των microrna, της μετάφρασης και της αποικοδόμησης του mrna, έχει αποκαλύψει επιπλέον επίπεδα ελέγχου σε 24-ωρη βάση (Lim και Allada, 2013; Kojima και Green, 2015). Εικ. Α.6. (Α) Ένα διατηρημένο μοτίβο ΗΒΡ περιλαμβάνει βρόχους αρνητικής ανάδρασης μεταγραφής-μετάφρασης, με χρόνο-καθυστέρηση. (Β) Στα θηλαστικά, όπως ο άνθρωπος, τα ΗΒΡ είναι αυτόνομα σε κυτταρικό επίπεδο και βρίσκονται σε όλα τα κύρια συστήματα και ιστούς των οργάνων του σώματος. Υπάρχει μια ιεραρχική οργάνωση στην οποία ο υπερχιασματικός πυρήνας (suprachiasmatic nucleus, SCN) του υποθαλάμου του εγκεφάλου λειτουργεί ως ο κύριος βηματοδότης για το συγχρονισμό συμπεριφορικών και φυσιολογικών ρυθμών σε όλο το σώμα. (RE: ρυθμιστικό στοιχείο). (Takahashi, 2017). 24

26 Α.2. Το ΗΒΡ των φυτών Α.2.1. Γενικά στοιχεία Τα φυτά έχουν διαδραματίσει σημαντικό ιστορικό ρόλο στη μελέτη των περιημερήσιων ρυθμών. Η πρώτη αναφορά ενός περιημερήσιου ρυθμού ανοίκει στην παρατήρηση-ορόσημο του Γάλλου αστρονόμου Jean Jacques Ortous de Mairan, ο οποίος μελέτησε τη συμπεριφορά φυτών του γένους Mimosa sp., σχετικά με το άνοιγμα και το κλείσιμο των φύλλων τους. Ο de Mairan παρατήρησε ότι οι ρυθμοί αυτοί των φύλλων του φυτού συνεχίζονταν ακόμα και απουσία φωτός (de Mairan, 1729). Άλλοι περιημερήσιοι ρυθμοί στα φυτά συμπεριλαμβάνουν την κίνηση οργάνων όπως φύλλων και πετάλων, το άνοιγμα των στοματίων, καθημερινές ταλαντώσεις σε βιοχημικές/μεταβολικές δραστηριότητες όπως η αναπνοή και η φωτοσύνθεση. Οι περιημερήσιοι ρυθμοί, επομένως, κυμαίνονται από τους σχετικά μη-εμφανείς, όπως οι ρυθμοί στη φωτοσύνθεση, μέχρι τους συγκριτικά εμφανείς, όπως οι ρυθμοί στην κίνηση των φύλλων των φυτών και το άνοιγμα των ανθέων (Hernando et al., 2017). Οι περισσότεροι από αυτούς τους ρυθμούς είναι πλέον γνωστό ότι συνδέονται στενά με ισχυρές ταλαντώσεις σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης στους περισσότερους οργανισμούς, ένα φαινόμενο που χαρακτηρίστηκε, σε επίπεδο γονιδιώματος πρώτη φορά στα φυτά (Harmer et al., 2000). Για να καταλάβουμε το λόγο της δημιουργίας των ΗΒΡ στα φυτά είναι απαραίτητο να λάβουμε υπόψη την εξελικτική «πίεση» που αυτά υφίστανται. Τα φυτά είναι οργανισμοί χωρίς δυνατότητα μετακίνησης, άρα βρίσκονται αναπόφευκτα σε στενή σύνδεση με το περιβάλλον τους. Η δυνατότητα συγχρονισμού με τις ημερήσιες εναλλαγές στο φως και στη θερμοκρασία παρέχει μεγάλο πλεονέκτημα επιβίωσης στα φυτά. Ο Pittendrigh (1993) υπέθεσε ότι η κινητήρια δύναμη πίσω από την εξέλιξη των ΗΒΡ είναι το κληρονομούμενο πλεονέκτημα πρόβλεψης των αντιδράσεων που επηρεάζονται αρνητικά από το φως, έτσι ώστε να συμβούν κατά τη διάρκεια της νύχτας. Επίσης, μπορεί να υπάρχουν εξελικτικά πλεονεκτήματα στο χρονικό προγραμματισμό. Η πρόβλεψη τακτικών αλλαγών στο περιβάλλον μειώνει την καθυστέρηση μεταξύ μιας αλλαγής στο περιβάλλον και της κατάλληλης μεταβολής στη φυσιολογία του οργανισμού (Harmer et al., 2001; Johnson et al., 2001; Dodd et al., 2005). Στα φυτά, η επαγωγή των μονοπατιών πρόσληψης φωτός πριν το ξημέρωμα επιτρέπει την πλήρη εκμετάλλευση της φωτεινής περιόδου, ενώ η 25

27 επαγωγή του μηχανισμού απόκρισης σε συνθήκες υδατικής καταπόνησης λόγω ανεπάρκειας νερού αργά το απόγευμα, μπορεί να προετοιμάσει το φυτό κατάλληλα για την αντιμετώπιση της εν λόγω αβιοτικής καταπόνησης (Harmer et al., 2000). Το ΗΒΡ φαίνεται να έχει μία απαραίτητη συνεισφορά στη φωτοσύνθεση, η οποία έχει ως αποτέλεσμα το ρολόι να θεωρείται ότι αυξάνει την ανάπτυξη και επιβίωση των φυτών, προσδίδοντάς τους έτσι ανταγωνιστικό πλεονέκτημα στη φύση (Dodd et al., 2005). Η συντριπτική πλειοψηφία της έρευνας σχετικά με το ΗΒΡ των φυτών έχει διεξαχθεί στο πειραματόφυτο Arabidopsis thaliana. Στο παρόν κείμενο, εάν δε διευκρινίζεται κάτι διαφορετικό, θα εννοείται ότι αναφερόμαστε σε δεδομένα που έχουν προέλθει από τη σχετική έρευνα στο φυτό αυτό. Εικ. Α.7. Τα περιβαλλοντικά ερεθίσματα ενσωματώνονται από τον κεντρικό ταλαντωτή του φυτού για τον συντονισμό πολλών φυσιολογικών διεργασιών. Εξωτερικά ερεθίσματα όπως το φως και η θερμοκρασία, λειτουργούν ως μονοπάτια εισόδου του ρολογιού και επηρεάζουν το ρυθμό του (μαύρο κύμα) συγχρονίζοντάς τον. Στη συνέχεια το ρολόι συγχρονίζει ανάλογα τους ρυθμούς των μονοπατιών εξόδου (χρωματιστά κύματα). Η σωστή λειτουργία ρολογιού απαιτείται για την ενορχήστρωση πολλών φυσιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της φωτοπεριοδικής άνθησης, της ορμονικής σηματοδότησης, της ανάπτυξης, του μεταβολισμού και των αποκρίσεων σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις (Nohales και Kay, 2016). 26

28 Το ΗΒΡ χωρίζεται, χάριν απλούστευσης, σε τρία βασικά μέρη (Εικ. Α.7). Τα μονοπάτια εισόδου στον κεντρικό ταλαντωτή (inputs), τον ίδιο τον ενδογενή κεντρικό ταλαντωτή (central oscillator) και τα μονοπάτια εξόδου από τον κεντρικό ταλαντωτή (outputs), δηλαδή τους βιοχημικούς και φυσιολογικούς ρυθμούς υπό τον έλεγχο του ρολογιού (Cuin, 2007). Για να συγχρονιστεί με το περιβάλλον, ο κεντρικός ταλαντωτής αντιλαμβάνεται και αποκρίνεται σε εξωτερικά σήματα, τα οποία παρέχουν την πληροφορία του χρόνου. Αυτές οι πληροφορίες ενσωματώνονται στη συνέχεια από το ρολόι και μεταφέρονται στα μονοπάτια εξόδου (δίκτυα εξόδου) για τη ρύθμιση μιας πληθώρας φυσιολογικών διεργασιών που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη, το μεταβολισμό, αποκρίσεις σε βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις και αναπτυξιακές μεταβάσεις (Εικ. Α.7) (Nohales και Kay, 2016). Εκτός από τη χρονική ρύθμιση, στη δυναμική του ΗΒΡ του φυτού συμβάλλει και η χωρική ρύθμιση. Τα μέρη του ρολογιού δρουν σε διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα. Τα στοιχεία του πρώτου μέρους, οι φωτοδέκτες, βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα αλλά η δράση τους εκδηλώνεται στον πυρήνα. Τα στοιχεία του κεντρικού ταλαντωτή, οι μεταγραφικοί παράγοντες που εκτελούν τις ταλαντώσεις, εδρεύουν στον πυρήνα και εκεί εκδηλώνεται η δράση τους. Τέλος, τα στοιχεία του τρίτου μέρους θα εκδηλώσουν τη δράση του κεντρικού ταλαντωτή μέσω βιοχημικών μονοπατιών του φυτού που θα παράγουν συγκεκριμένους φαινοτύπους (Cuin, 2007). Σε επίπεδο ιστών και οργάνων, η οργάνωση της λειτουργίας του ρολογιού αποδείχθηκε για πρώτη φορά από τη δυνατότητα συγχρονισμού των δύο κοτυληδόνων και του κορυφαίου μεριστώματος του βλαστού σε εκτός-φάσης κύκλους φωτός-σκοταδιού (Thai et al., 2000). Επίσης, έχουν παρατηρηθεί σαφείς διαφορές ανάμεσα στο ρολόι των φύλλων και αυτού της ρίζας (James et al., 2008). Πιο πρόσφατες έρευνες έχουν δώσει επιπλέον στοιχεία για την ύπαρξη ιστοειδικότητας και ιεραρχικής οργάνωσης στο ΗΒΡ των φυτών, καθώς φαίνεται πως το ρολόι στο αγγειακό σύστημα του φύλλου επικοινωνεί και μπορεί να ρυθμίσει το ρολόι του μεσοφύλλου, ενώ το ρολόι στο μεσόφυλλο δεν μπορεί να κάνει κάτι αντίστοιχο, κάτι που υποδηλώνει ιεραρχικό έλεγχο (Endo et al., 2014). Επιπλέον, έχει προταθεί πως το κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού λειτουργεί ως το «κύριο» ρολόι στα φυτά, σε αναλογία με τον υπερχιασματικό πυρήνα του εγκεφάλου στο ρολόι των θηλαστικών (βλ. ενότ. Α.1.6) (Takahashi et al., 2015). Ωστόσο, συγκεκριμένες αλλαγές στη λειτουργία του ρολογιού στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού δεν επηρέασαν την άνθηση (Endo et al., 2014), καθώς επίσης έχουν αναφερθεί 27

29 τουλάχιστον δύο περιπτώσεις ρολογιών με διαφορετική ευαισθησία στη θερμοκρασία (Michael et al., 2003). Έτσι, είναι πιθανό να υπάρχουν και άλλοι κόμβοι ελέγχου του ρολογιού πέρα από το κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού, κάτι που συνάδει καλύτερα με ένα μοντέλο αποκεντρωμένου δικτύου για το ΗΒΡ των φυτών (Endo, 2016). Α.2.2. Σηματοδοτικά μονοπάτια εισόδου στο ΗΒΡ (inputs) Το ΗΒΡ διατηρεί ένα εσωτερικό μέτρο του χρόνου και προγραμματίζει φυσιολογικές διεργασίες ώστε να συμβούν τις σωστές ώρες της ημέρας. Οι περιημερήσιοι ρυθμοί που παράγονται είναι ενδογενείς, δηλαδή είναι γενετικά ελεγχόμενοι. Για να μείνουν, όμως, συγχρονισμένα με το περιβάλλον τους, τα ΗΒΡ συγχρονίζονται από συγκεκριμένους παράγοντες, κυρίως τους κύκλους παρουσίας/απουσίας φωτός (φωτοπερίοδος) και θερμοκρασίας (Harmer et al., 2001). Ο συγχρονισμός του ΗΒΡ επιτυγχάνεται προκαλώντας μία σταθερή αλλαγή φάσης μέσω της μεταβολής στα επίπεδα mrna, πρωτεΐνης και/ή τα επίπεδα δράσης ενός ή περισσοτέρων στοιχείων του κεντρικού ταλαντωτή. Αυτή η αλλαγή φάσης δεν αλλάζει την εσωτερική ροή των διεργασιών, αλλά την επανατοποθετεί σύμφωνα με την ημερήσια πρόοδο στο περιβάλλον επιτρέποντας, για παράδειγμα, την προσαρμογή ενός οργανισμού στο μεταβαλλόμενο μήκος της ημέρας κατά τις εναλλαγές των εποχών (Devlin, 2002). Α Φωτοδέκτες Το ρόλο της αντίληψης του φωτεινού σήματος στα φυτά έχουν οι φωτοδέκτες (photoreceptors), οι οποίοι κατατάσσονται σε τρεις κύριες οικογένειες, ανάλογα με την ποιότητα του φωτός που ανιχνεύουν. Το ερυθρό και υπέρυθρο φως απορροφώνται από τα φυτοχρώματα (PHYs), ενώ τρεις τύποι φωτοδεκτών αντιλαμβάνονται το μπλε/uv-a φως: τα κρυπτοχρώματα (CRYs), οι φωτοτροπίνες (PHOTs) και τρεις πρωτεΐνες που περιέχουν επαναλήψεις του μοτίβου LOV/Fbox/Kelch και εντοπίζονται μόνο στα φυτά, οι ZEITLUPE (ZTL), FLAVIN- BINDING KELCH REPEAT F-BOX (FKF) και η LOV KELCH REPEAT PROTEIN 2 (LKP2). Επίσης, πρόσφατα αναφέρθηκε και η δράση της πρωτεΐνης UV RESISTANCE LOCUS 8 (UVR8) ως φωτοδέκτης της UV-B ακτινοβολίας (Serrano- Bueno et al., 2017). 28

30 Τα κρυπτοχρώματα είναι φωτοδέκτες που μεσολαβούν για τις φωτοεπαγώμενες αποκρίσεις των οργανισμών στην περιοχή του κυανού-υπεριώδους φάσματος. Απορροφούν φως σε δύο περιοχές του φωτός: στην περιοχή του υπεριώδους UV-A ( nm) και στην περιοχή του κυανού ( nm) (Gressel, 1979; Senger, 1984). Έτσι, στην περιοχή του κυανού-υπεριώδους τα φυτά έχουν δύο φωτοδέκτες, τις φωτοτροπίνες που μεσολαβούν για τις αποκρίσεις του φωτοτροπισμού και τα κρυπτοχρώματα, τα οποία σε συνδυασμό με τα φυτοχρώματα ελέγχουν ένα πλήθος αναπτυξιακών μονοπατιών μεταξύ των οποίων και τη σηματοδότηση του κεντρικού ταλαντωτή. Όσον αφορά τις πρωτεΐνες ZTL, FKF και LKP2, αυτές διαθέτουν τρεις διακριτές δομικές περιοχές: τη LOV (Light, Oxygen, Voltage) περιοχή, μία περιοχή F-box και ένα μοτίβο kelch. Η περιοχή LOV της ZTL είναι μία φωτοευαίσθητη περιοχή δέσμευσης φλαβίνης (Somers et al., 2005). Η περιοχή kelch είναι μία περιοχή αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και μαζί με το F-box, εμπλέκει τις πρωτεΐνες αυτές στη διαμεσολαβούμενη-από-ουμπικουϊτίνη πρωτεοσωμική αποικοδόμηση (Kim et al., 2003). Σε in vitro πειράματα βρέθηκε ότι η πρωτεΐνη ZTL αλληλεπιδρά με αμφότερα τα PHYB και CRY2 (Jarillo et al., 2001), καθώς επίσης ότι εμπλέκεται στο μονοπάτι φωτοεπαγωγής του ρολογιού (Somers et al., 2000, 2004). Τα φυτοχρώματα ανακαλύφθηκαν πριν από περισσότερα από 50 χρόνια και ανήκουν σε μία οικογένεια που αριθμεί πέντε μέλη PHYA-E (Sharrock και Quail, 1989). Τα μέλη αυτά μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο υποκατηγορίες. Στην υποκατηγορία Ι ανήκουν τα φυτοχρώματα που αποικοδομούνται παρουσία έντονου φωτός (PHYA), ενώ στην υποκατηγορία ΙΙ ανήκουν τα μη φωτοευαίσθητα φυτοχρώματα (PHYB-E), με το φυτόχρωμα Β να είναι το πλέον επικρατές φυτόχρωμα στα φυτά που έχουν αναπτυχθεί στο φως. Όλα τα μέλη της οικογένειας των φυτοχρωμάτων είναι φωτοδέκτες του ορατού φάσματος του φωτός και ανιχνεύονται σε δύο μορφές. Η πρώτη μορφή καλείται Pr (Phytochrome red form), είναι η ανενεργός μορφή των φυτοχρωμάτων και σε αυτή τη μορφή βιοσυντίθεται το μόριο. Η δεύτερη είναι η Pfr (Phytochrome far-red form) και είναι η βιολογικά ενεργή μορφή του φωτοδέκτη. Έκθεση στο ερυθρό μήκος κύματος του φωτός (667 nm) έχει ως αποτέλεσμα τη μετάπτωση της Pr (667) μορφής στη βιολογικά ενεργή Pfr (730) μορφή που συνοδεύεται τόσο από αλλαγές στη δομή του μορίου όσο και στο μήκος κύματος που απορροφά. Έκθεση σε ακτινοβολία στο υπέρυθρο μήκος κύματος 29

31 του φωτός (730 nm) μετατρέπει το φυτόχρωμα από την Pfr ξανά στη βιολογικά ανενεργή Pr μορφή του (Quail, 1997). Η καρβοξυ-τελική περιοχή του μορίου περιέχει δύο PAS μοτίβα (Period circadian protein, Ah receptor nuclear translocator protein and Single-minded protein) τα οποία σηματοδοτούν ένα πλήθος διεργασιών μέσω της αλληλεπίδρασης με μεταγραφικούς παράγοντες όπως τον παράγοντα τύπου bhlh (basic Helix Loop Helix), PIF3 (Phytochrome Interacting Factor 3). Τα φυτοχρώματα θεωρούνται ότι είναι κινάσες με φωτοεξαρτώμενη ικανότητα φωσφορυλίωσης. Η δράση τους αυτή, αποδίδεται στην ύπαρξη μιας περιοχής με δομή παραπλήσια με την κινάση της ιστιδίνης (Histidine-Kinase-Related-Domain, HKRD) με αποτέλεσμα να μπορούν να φωσφορυλιώσουν άμεσα άλλες πρωτεΐνες όταν βρίσκονται στη βιολογικά ενεργή Pfr μορφή τους, όπως την πρωτεΐνη PKS1 (Phytochrome Kinase Substrate 1), η οποία δρα ως αρνητικός ρυθμιστικός παράγοντας της δράσης του φυτοχρώματος (Fankhauser, 1999; Quail, 1997). Έτσι, τα φυτοχρώματα δρουν ως μοριακοί διακόπτες, το αποτέλεσμα των οποίων εξαρτάται από το λόγο R/FR (Red/Far Red) του φωτός. Α Η σηματοδότηση μέσω φυτοχρωμάτων Από την αρχή της ανακάλυψής τους μέχρι και σήμερα, τα φυτοχρώματα θεωρούνται ότι ελέγχουν άμεσα ή έμμεσα ένα πλήθος φυσιολογικών διεργασιών του φυτού, είτε από μόνα τους είτε μέσω συνδυασμένης δράσης με τις υπόλοιπες τάξεις φωτοδεκτών. Το φυτόχρωμα Β κατά την παραμονή του στο κυτταρόπλασμα εντοπίζεται διάσπαρτο σε όλο το κύτταρο. Μόλις όμως εισαχθεί στον πυρήνα, τότε σχηματίζει πυρηνικά συσσωματώματα. Παρόμοια συμπεριφορά επιβεβαιώθηκε και για τα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας και σήμερα είναι πλέον αποδεκτό ότι όλα τα φυτοχρώματα εισέρχονται στον πυρήνα μετά από την επίδραση ερυθράς ακτινοβολίας και σχηματίζουν πυρηνικά συσσωματώματα (Nagy και Schäfer, 2002). Πώς, όμως, τα φυτοχρώματα, ενώ δεν περιέχουν κάποιο μοτίβο πρόσδεσης στο DNA, ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και την περαιτέρω απόκριση του φυτού στο φως; Ένα έργο ορόσημο στην έρευνα της σηματοδότησης μέσω των φυτοχρωμάτων ήταν η ανακάλυψη μιας ομάδας αλληλεπιδρώντων με το φυτόχρωμα πρωτεϊνών, των PIFs (Phytochrome Interacting Factors). Έχει αποδειχθεί ότι όλοι οι PIFs αλληλεπιδρούν με το phyb με φωτοαναστρέψιμο τρόπο (R/FR) μέσω ενός διατηρημένου μοτίβου APB (Active PhyB Binding) (Leivar και Quail, 2011). Οι PIF1 30

32 και PIF3 αλληλεπιδρούν επίσης με τη μορφή Pfr του phya μέσω μίας περιοχής ΑΡΑ (Active PhyA Binding) (Khanna et al., 2004). Επιπλέον, το phyb και ο PIF3 βρέθηκαν να σχηματίζουν σύμπλοκα στο DNA, in vitro, κάτι που υποδηλώνει ότι τα φυτοχρώματα πιθανά να στοχεύουν άμεσα τους υποκινητές των γονιδίων-στόχων τους για να ρυθμίσουν την έκφρασή τους (Martinez-Garcia et al., 2000). Αυτή η ιδέα υποστηρίζεται περαιτέρω από το εύρημα ότι το σύμπλοκο phya-fhy1 επιστρατεύεται στον υποκινητή του CHALCONE SYNTHASE (CHS, γονίδιο του οποίου η έκφραση είναι κρίσιμη για τη βιοσύνθεση των ανθοκυανινών) σε συνδυασμό με τους μεταγραφικούς παράγοντες HY5 (LONG HYPOCOTYL 5) ή PIF3, για να ρυθμίσουν από κοινού τη μεταγραφή του γονιδίου CHS (Chen et al., 2012). Εικ. Α.8. Το μοντέλο συνοδού (escort model) που δείχνει τη δράση του φυτοχρώματος στο μεταγραφικό έλεγχο. Τα φυτοχρώματα αλληλεπιδρούν άμεσα με υποκινητές γονιδίων-στόχων μέσω αλληλεπίδρασης με διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες (Transcription Factors, TF) και συν-ρυθμιστών (Coregulators, C), διευκολύνοντας έτσι τη διαφορική ρύθμιση πολλών πτυχών της αντιμετώπισης των καταπονήσεων, της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης του φυτού, οι οποίες συνολικά αποτελούν την ενοποιημένη απόκριση στο φως (Wang και Wang, 2015). Επιπλέον, πρόσφατη μελέτη ταυτοποίησης στόχων του phya σε επίπεδο γονιδιώματος αποκάλυψε ότι δεκάδες cis-ρυθμιστικά στοιχεία, 31

33 συμπεριλαμβανομένων των μοτίβων G-box και PBE-box που αναγνωρίζονται από τα PIFs, βρίσκονται εμπλουτισμένα σε υποκινητές που είναι άμεσοι στόχοι του phya. Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει το λεγόμενο μοντέλο συνοδού (escort model, Εικ. Α.8), το οποίο προτείνει ότι πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των PIFs και HY5, μπορεί να δρουν άμεσα στο μονοπάτι της σηματοδότησης από το phya και θα μπορούσαν να αλληλεπιδρούν άμεσα ή έμμεσα με το phya στους υποκινητές των γονιδίων-στόχων, ώστε να ρυθμίζουν την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων, επιτρέποντας έτσι την ταχεία απόκριση σε διάφορα ενδογενή ή εξωγενή σήματα (Chen et al., 2014). Τα προηγούμενα ευρήματα, ότι τα φυτοχρώματα αλληλεπιδρούν άμεσα με διάφορες άλλες κατηγορίες μεταγραφικών ρυθμιστών, είναι επίσης σε συμφωνία με ένα τέτοιο μοντέλο. Σε δουλειά που αφορά συγκεκριμένα μεταγραφικούς παράγοντες του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ, το phyb βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα, τόσο σε in vitro όσο και σε in planta πειράματα, με διάφορους από τους παράγοντες αυτούς (CCA1, LHY, GI, TOC1, LUX και ELF3, βλ. ενότ. Α.2.3) (Yeom et al., 2014). Ωστόσο, υπάρχουν επίσης αναφορές ότι το phyb δρα για να αναστέλλει την ικανότητα δέσμευσης των PIFs στο DNA (Park et al., 2012) και ότι τα συνδεδεμένα στο DNA PIF1 και PIF4 δεν μπορούν ταυτόχρονα να δεσμευτούν στα ενεργοποιημένα phyb ή phya, in vitro (Huq και Quail, 2002; Huq et al., 2004). Άρα, ο ακριβής μηχανισμός που το φωτεινό σήμα μεταφέρεται από τα φυτοχρώματα στους μετέπειτα στόχους του παραμένει υπό διερεύνηση (Wang και Wang, 2015). Α.2.3. Ο κεντρικός ταλαντωτής του ΗΒΡ Παρά την ανεξάρτητη εξελικτική προέλευσή τους, σε όλες τις περιπτώσεις όπου είναι γνωστή η μοριακή βάση τους, τα ΗΒΡ των ευκαρυωτών βασίζονται σε βρόχους ανάδρασης μεταγραφής-μετάφρασης. Στα θηλαστικά, στη δροσόφιλα και στους μύκητες ο κεντρικός ταλαντωτής του ρολογιού αποτελείται από μεταγραφικούς παράγοντες που δρουν ως θετικά στοιχεία και προάγουν την έκφραση των ίδιων τους των μεταγραφικών καταστολέων, οι οποίοι αποτελούν τα αρνητικά στοιχεία στο βρόχο. Εκτός από τον κεντρικό ταλαντωτή, με την πάροδο των ετών, έχουν ταυτοποιηθεί και επιπλέον βρόχοι ανατροφοδότησης, δημιουργώντας έτσι μία πιο περίπλοκη αντίληψη του ρολογιού ως ένα δίκτυο βρόχων ανατροφοδότησης (Nohales και Kay, 2016). Αν και η φύση των επιμέρους συστατικών του ρολογιού ενδέχεται να διαφέρει, η συνολική αρχιτεκτονική του δικτύου του είναι διατηρημένη στα διάφορα 32

34 βασίλεια της ζωής. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό των ΗΒΡ των φυτών, ωστόσο, είναι η επικράτηση των κατασταλτικών στοιχείων στο σύστημα (Millar, 2016). Οι πρώτες ενδείξεις, σε μοριακό επίπεδο, για τον έλεγχο της μεταγραφής από το ΗΒΡ εμφανίστηκαν στα τέλη της δεκαετίας του '80, όταν διαπιστώθηκε η 24-ωρη διακύμανση στα επίπεδα mrna των γονιδίων που κωδικοποιούν την αποπρωτεΐνη του φωτοσυλλεκτικού συμπλόκου του φωτοσυστήματος ΙΙ (CAB ή LHCB) (Kloppstech, 1985; Nagy et al., 1988). Την εποχή εκείνη, υπήρχαν σαφείς ενδείξεις που υποδείκνυαν ότι το ΗΒΡ ρυθμίζει την έκφραση αυτών των γονιδίων σε μεταγραφικό επίπεδο, αλλά δεν υπήρχε κανένα στοιχείο ως προς τη μοριακή φύση του ίδιου του ΗΒΡ των φυτών (Hernando et al., 2017). Η τρέχουσα κατανόηση του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ στα φυτά βασίζεται σε γενετικές και βιοχημικές μελέτες από τα τέλη της δεκαετίας του 1990 που παρείχαν την περιγραφή του πρώτου μεταγραφικού βρόχου (Alabadí et al., 2001). Από τότε, το αρχικό μοντέλο του κεντρικού ταλαντωτή, ως αποτελούμενος από ελάχιστα στοιχεία που εκφράζονται το πρωί και το βράδυ, τα οποία ρυθμίζουν αμοιβαία το ένα την μεταγραφή του άλλου, έχει εξελιχθεί σε ένα πολύ πιο περίπλοκο δίκτυο. Α Κατασταλτικοί βρόχοι ανάδρασης Σήμερα, ο κεντρικός ταλαντωτής του ΗΒΡ του A. thaliana θεωρείται ότι αποτελείται από τρεις κύριους βρόχους, τον κύριο ή κεντρικό, τον πρωινό και τον εσπερινό βρόχο, οι οποίοι πλέκονται μεταξύ τους μέσω των αλληλεπιδράσεων των παραγόντων που τους αποτελούν. Έτσι, στην αναθεωρημένη του μορφή, ο κεντρικός ταλαντωτής του ρολογιού βασίζεται κυρίως σε βρόχους αρνητικής ανάδρασης, όπου οι διάφοροι πρωινοί και εσπερινοί παράγοντες διασυνδέονται μέσω των αμοιβαίων κατασταλτικών δραστηριοτήτων τους (Millar, 2016) (Εικ. Α.10). Α Κύριος βρόχος Τα πρώτα στοιχεία του ΗΒΡ των φυτών που χαρακτηρίστηκαν στο A. thaliana ήταν οι μεταγραφικοί παράγοντες τύπου MYB (MYeloBlastosis), CCA1 (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1) (Wang και Tobin, 1998) και LHY (LATE ELONGATED HYPOCOTYL) (Schaffer et al., 1998), οι οποίοι εκφράζονται με μέγιστο την αυγή (πρωινοί παράγοντες). Αυτές οι δύο πρωτεΐνες ετεροδιμερίζονται 33

35 (Lu et al., 2009) και καταστέλλουν την έκφραση εσπερινών γονιδίων (με μέγιστο έκφρασης το απόγευμα) μέσω δέσμευσης σε ένα cis-ρυθμιστικό μοτίβο υποκινητή, το λεγόμενο εσπερινό στοιχείο (Evening Element, EE) (Harmer et al., 2000; Kamioka et al., 2016). Εικ. Α.9. Αναθεωρημένη δομή του κύριου βρόχου του κεντρικού ταλαντωτή στο A. thaliana. Οι παράγοντες CCA1/LHY εκφράζονται και καταστέλλουν την έκφραση του TOC1 προσδενόμενοι σε στοιχεία EE (Evening Element) στον υποκινητή του. Αντίστοιχα, ο TOC1 εκφράζεται και καταστέλλει τους CCA1/LHY προσδενόμενος σε στοιχεία T1ME (TOC1 Morning Element) των υποκινητών τους (μορφοποιημένο από Gardner et al., 2006). Το πρώτο γονίδιο ρολογιού που αποδείχθηκε ότι καταστέλλεται από τους CCA1 και LHY ήταν το εσπερινό TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1, επίσης γνωστό ως PRR1), ένα μέλος της οικογένειας PRR (Pseudo-Response Regulators), του οποίου η μετάλλαξη συντομεύει την περίοδο του ρολογιού (Strayer et al., 2000). Αυτές οι τρεις πρωτεΐνες συνθέτουν τον πρώτο και κύριο βρόχο του κεντρικού ταλαντωτή (Εικ. Α.9), καθώς είχε προταθεί ότι ο TOC1 πιθανά να προάγει την έκφραση των CCA1/LHY, έμμεσα (Alabadí et al., 2001). Αν και τόσο ο μηχανισμός ενεργοποίησης όσο και η βιοχημική λειτουργία του TOC1 ήταν για καιρό ασαφείς, ο TOC1 έχει πλέον αποδειχτεί ότι στην πραγματικότητα καταστέλλει τα CCA1 και LHY προσδενόμενος σε στοιχεία των υποκινητών τους (TOC1 Morning Elements, T1ME) (Εικ. Α.9) (Huang et al., 2012; Gendron et al., 2012; Pokhilko et al., 2012). 34

36 Α Πρωινός βρόχος Το πρωί, οι CCA1/LHY καταστέλλουν σε μεταγραφικό επίπεδο, εκτός από το TOC1, και άλλα μέλη της οικογένειας PRR (Εικ. Α.10) (Adams et al., 2015; Kamioka et al., 2016). Οι πρωτεΐνες PRR, με τη σειρά τους, εκφράζονται διαδοχικά κατά τη διάρκεια ολόκληρης της ημέρας και καταστέλλουν τη μεταγραφή των CCA1/LHY. Αυτός ο τόσο οργανωμένος χρονικά κατασταλτικός μηχανισμός ξεκινάει το μεσημέρι με τον PRR9 και ακολουθείται διαδοχικά από τους PRR7 και PRR5 νωρίς το απόγευμα και τελικά από τον TOC1 αργότερα το απόγευμα. Τελικά, αυτός ο μηχανισμός συμβάλλει στον κατάλληλο περιορισμό της έκφρασης των CCA1 και LHY σε ένα μικρό χρονικό παράθυρο κοντά στην αυγή (Nakamichi et al., 2010). Ένα άλλο στοιχείο που συμβάλλει στην καταστολή του CCA1 είναι το CCA1 HIKING EXPEDITION (CHE), ένας μεταγραφικός παράγοντας της οικογένειας TCP, ο οποίος αλληλεπιδρά με το TOC1 και καταστέλλει άμεσα τη μεταγραφή του CCA1, αλλά όχι του LHY (Pruneda-Paz, 2009). Ενώ τα PRRs συνεισφέρουν από κοινού στην καταστολή των CCA1/LHY, καταστέλλουν επίσης το ένα την μεταγραφή του άλλου (Huang et al., 2012; Nakamichi et al., 2012; Liu et al., 2013; Liu et al., 2016) και επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο την εξέλιξη του ρολογιού. Τα PRRs παίζουν σημαντικούς ρόλους όχι μόνο στον κεντρικό ταλαντωτή αλλά και στη σύνδεσή του με τα μονοπάτια εισόδου και εξόδου. Τα PRR9 και PRR7 εμπλέκονται στη μετάδοση του φωτεινού σήματος (Farré et al., 2005; Kaczorowski και Quail, 2003) και στην αντίληψη της θερμοκρασίας ως σηματοδοτικό στοιχείο (Salomé et al., 2005; Kolmos et al., 2014; Nagel et al., 2014) και μαζί με το PRR5 διαμορφώνουν επίσης ποικίλες διεργασίες εξόδου του ρολογιού, όπως ο χρόνος άνθησης, η επιμήκυνση του υποκοτυλίου και οι αποκρίσεις στις αβιοτικές καταπονήσεις, καταστέλλοντας την έκφραση βασικών μεταγραφικών παραγόντων με μέγιστο έκφρασης το πρωί (Nakamichi et al., 2012; Liu et al., 2013; Liu et al., 2016). Α Εσπερινός βρόχος Το απόγευμα, η GI (GIGANTEA), μια μεγάλη πρωτεΐνη που συναντάται μόνο στα φυτά και η οποία δεν περιέχει κάποια καλά χαρακτηρισμένη λειτουργική περιοχή, είναι επίσης απαραίτητη για τη σωστή λειτουργία του ΗΒΡ (Gould et al., 2006; Martin-Tryon et al., 2007). Το GI είναι ένα εσπερινό γονίδιο του ρολογιού και 35

37 καταστέλλεται το πρωί από τα CCA1 και LHY (Lu et al., 2012), τα οποία με τη σειρά τους φαίνεται να επάγονται από αυτό (Martin-Tryon et al., 2007), χωρίς όμως να είναι γνωστό αν η ενεργοποίηση αυτή είναι άμεση ή έμμεση. Το βράδυ, το TOC1 και το λεγόμενο εσπερινό σύμπλοκο (Evening Complex, EC) συμβάλλουν στην καταστολή του GI (Huang et al., 2012; Mizuno et al., 2014). Παρόμοια με τα PRRs, η GI εμπλέκεται όχι μόνο στον κεντρικό ταλαντωτή, αλλά και στα μονοπάτια εισόδου του φωτός και της θερμοκρασίας (Gould et al., 2006; Martin-Tryon et al., 2007) αλλά και σε πολλαπλά μονοπάτια εξόδου που κυμαίνονται από τη φωτοπεριοδική άνθηση και την ανάπτυξη έως τη συσσώρευση αμύλου και την απόκριση σε αβιοτικές καταπονήσεις (Mishra και Panigrahi, 2015). Εικ. Α.10. Πρόσφατο μοντέλο του μοριακού μηχανισμού του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ στο A. thaliana, το οποίο βασίζεται σε αλληλοδιαπλεκόμενους βρόγχους ανάδρασης: τον κεντρικό βρόχο που αποτελείται από τους TOC1 και CCA1/LHY, τον πρωινό βρόχο, που αποτελείται από τα PRR5, PRR7 και PRR9, τον εσπερινό βρόχο, με κύρια στοιχεία τον GI και το εσπερινό σύμπλοκο (ELF3, ELF4 και LUX) και τα πρόσφατα περιγραφόμενα θετικά στοιχεία της οικογένειας RVE (Kim et al., 2014). 36

38 Τρεις εσπερινές πρωτεΐνες σχηματίζουν ένα κομβικό στοιχείο του ρολογιού που ονομάζεται EC. Το EC (Nusinow et al., 2011; Herrero et al., 2012) συμμετέχει στην καταστολή τόσο πρωινών όσο και εσπερινών στοιχείων του ταλαντωτή. Το σύμπλοκο αυτό περιλαμβάνει τον παράγοντα LUX (LUX ARRHYTHMO), έναν μεταγραφικό παράγοντα τύπου MYB και τις ELF3 (EARLY FLOWERING 3) και ELF4, δύο πρωτεΐνες που συναντώνται μόνο στα φυτά και οι οποίες δε σχετίζονται μεταξύ τους. Τα στοιχεία του EC καταστέλλονται από τα CCA1 και LHY το πρωί (Portolés και Más, 2010; Li et al., 2011; Lu et al., 2012) και από το TOC1 το βράδυ (Huang et al., 2012) (Εικ. Α.10) και η μετάλλαξη οποιουδήποτε από τα στοιχεία αυτά καταλήγει σε αρρυθμικό φαινότυπο (Herrero et al., 2012; Helfer et al. 2011). Το EC λειτουργεί ως μεταγραφικός καταστολέας και προσδένεται στους υποκινητές των PRR9, PRR7 και GI και στον ίδιο τον υποκινητή του LUX (Helfer et al. 2011; Dixon et al. 2011; Chow et al., 2012; Mizuno et al., 2014). Η προκαλούμενη από το EC καταστολή των PRR9 και PRR7 μπορεί έτσι να επάγει έμμεσα την έκφραση των CCA1 και LHY στο τέλος της νύχτας (Nohales και Kay, 2016). Α Αναλυτικά στοιχεία για ορισμένους εκ των βασικών παραγόντων του κεντρικού ταλαντωτή Α Οι μεταγραφικοί παράγοντες CCA1 και LHY Οι παράγοντες CCA1 και LHY ανήκουν στην οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων MYB, χαρακτηριστικό όλων των μελών της οποίας είναι η συντήρηση του μοτίβου MYB που μεσολαβεί στην πρόσδεση του DNA. Οι περιοχές MYB των συγκεκριμένων παραγόντων σχηματίζουν τρισδιάστατη δομή α-έλικας/στροφής/αέλικας (helix-turn-helix), όπως συμβαίνει και με τους bhlh-μεταγραφικούς παράγοντες, τον τρόπο σύνδεσης στο DNA των οποίων φαίνεται να ακολουθούν: η μία έλικα τοποθετείται κάθετα στη μεγάλη αύλακα του DNA και η δεύτερη έλικα τοποθετείται κάθετα στην πρώτη αλληλεπιδρώντας με τη μεταγραφική μηχανή. Τόσο το γονίδιο LHY όσο και το CCA1 είναι πρωινά, καθώς σε φυτά A. thaliana αγρίου τύπου, η 24ωρη ταλάντωση των επιπέδων mrna τους παρουσιάζει μέγιστο την αυγή. Στη συνέχεια τα επίπεδα mrna των CCA1/LHY αρχίζουν να φθίνουν μέσα στην ημέρα και παρουσιάζουν τελικά ελάχιστο κατά τις εσπερινές ώρες. Ακολούθως τα επίπεδα μεταγραφής των δύο παραγόντων αρχίζουν και πάλι να 37

39 αυξάνονται κατά τη διάρκεια της νύχτας, για να κορυφωθούν και πάλι την αυγή, ένα φαινόμενο που είναι γνωστό ως πρόβλεψη του φωτός (light anticipation). Σε ωχρωτικά φυτάρια, στα οποία τα επίπεδα των CCA1/LHY είναι μηδαμινά, αρκεί μία ελάχιστη έκθεση στο φως για να επάγει την έκφραση των δύο παραγόντων ρυθμίζοντας έτσι το ρολόι στην ώρα «μηδέν» και ξεκινώντας τους κύκλους των ταλαντώσεων, με τη διαμεσολάβηση ενός πρώτου κύκλου που ολοκληρώνεται σε πολύ λιγότερο από 24 ώρες. Το φαινόμενο αυτό είναι χαρακτηριστικό των πρωινών ρυθμικών γονιδίων και αποκαλείται «οξεία απόκριση» (acute response) στο φως. Όπως προαναφέρθηκε, αυτές οι δύο πρωτεΐνες ομο- και ετερο-διμερίζονται (Lu et al., 2009), προσδένονται στο cis-ρυθμιστικό στοιχείο Evening Element (EE) και καταστέλλουν την έκφραση εσπερινών γονιδίων (Harmer et al., 2000; Kamioka et al., 2016). Η σημασία αυτών των δύο καταστολέων στη σωστή μέτρηση του χρόνου αποδεικνύεται από το φαινότυπο των αντίστοιχων διαγονιδιακών φυτών, είτε απώλειας δράσης είτε υπερέκφρασης των παραγόντων αυτών: ενώ η απλή απώλεια είτε της CCA1 είτε της LHY πρωτεΐνης προκαλεί τη σμίκρυνση της περιόδου ταλάντωσης υπό σταθερές συνθήκες (συνεχές φως), το διπλά μεταλλαγμένο φυτό cca1lhy, καθώς και τα αντίστοιχα φυτά που υπερεκφράζουν καθένα από τους παράγοντες αυτούς, είναι αρρυθμικά (Alabadí et al., 2002). Όταν τα στοιχεία CCA1/LHY υπερεκφράζονται, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα τόσο του ενδογενούς LHY όσο και του CCA1, καταστέλλονται (Wang και Tobin, 1998; Schaffer et al., 1998). Επιπλέον, η υπερέκφραση αυτή καταστέλλει και τα επίπεδα μεταγραφής του TOC1 (Alabadí et al., 2001). Σε πιο πρόσφατη μελέτη, τόσο ο LHY όσο και ο CCA1 βρέθηκαν να αυτοκαταστέλλονται και να αλληλοκαταστέλλονται (Adams et al., 2015). Τα στοιχεία αυτά συνηγορούν στην πρόταση ότι οι πρωτεΐνες CCA1 και LHY αυτορυθμίζονται, καθώς και ότι καταστέλλουν την έκφραση του TOC1. Σε φυτά που έχουν υποστεί μεταλλάξεις απώλειας δράσης είτε του CCA1 είτε του LHY, παρατηρείται σμίκρυνση της περιόδου ταλάντωσης πολλών ρυθμικών γονιδίων, τόσο πρωινών [CAB (Green και Tobin, 1999)] όσο και εσπερινών [ELF3 και CCR2 (Strayer et al., 2000)]. Το ενδιαφέρον είναι ότι, εάν ένα εκ των CCA1/LHY υποστεί απώλεια δράσης λόγω μεταλλαξιγένεσης, οι περιημερήσιοι ρυθμοί διατηρούνται, αλλά η περίοδος της ταλάντωσης είναι πιο μικρή, δηλαδή το ρολόι «τρέχει» πιο γρήγορα. Αυτό επιβεβαιώνει τη θεωρία ότι η δράση των CCA1/LHY αλληλοσυμπληρώνεται και κανένα από τα δύο δεν θεωρείται αποκλειστικό για την 38

40 ομαλή λειτουργία του κεντρικού ταλαντωτή, αφού η δράση του ενός, καλύπτει τις απώλειες δράσης του άλλου (Green και Tobin, 2002). Α Ο μεταγραφικός παράγοντας TOC1 Ο μεταγραφικός παράγοντας TOC1 χαρακτηρίστηκε μεταγενέστερα των παραγόντων CCA1/LHY, ως στοιχείο του κεντρικού ταλαντωτή στο A. thaliana. To γονίδιο TOC1 (TIMING OF CAB EXPRESSION 1) απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε σε μία απόπειρα ανίχνευσης γονιδίων που σχετίζονται με το ρολόι των φυτών (Strayer et al., 2000). Το πείραμα περιελάμβανε μεταλλάξεις σε διάφορα γονίδια και παρατήρηση του φαινοτύπου των φυτών για αλλαγές στην περιοδική έκφραση γνωστών ρυθμικών γονιδίων, όπως τα πρωινά γονίδια CAB (από όπου και πήρε το όνομά του ο παράγοντας). Τα γονίδια CAB ή LHCB κωδικοποιούν πρωτεΐνες του φωτοσυλλεκτικού συμπλόκου, οι οποίες δεσμεύουν χλωροφύλλη a/b (lightharvesting chlorophyll a/b-binding protein). Η ελεύθερη και ρυθμική έκφρασή τους αποτελεί έναν καλά μελετημένο δείκτη των περιημερήσιων φαινομένων, αφού αποτελούν πιθανόν το μετέπειτα στόχο των μονοπατιών εξόδου από τον κεντρικό ταλαντωτή (Millar et al., 1995). Το μεταλλαγμένο στέλεχος toc1-1 παρουσίαζε μείωση της περιόδου ταλάντωσης των γονιδίων CAB (21 έναντι 24,5 ωρών σε φυτά αγρίου τύπου) σε συνθήκες συνεχούς φωτός. Ο συγκεκριμένος φαινότυπος παρατηρήθηκε και σε άλλα ρυθμικά γονίδια (όπως το εσπερινό γονίδιο CCR2, COLD CIRCADIAN RHYTHM- RNA-BINDING 1). Επιπλέον πειράματα σε φυτά μετασχηματισμένα με την τεχνολογία της RNA παρεμπόδισης ως προς τον παράγοντα TOC1 (TOC1 RNA interference, RNAi), βρέθηκε ότι τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης του γονιδίου TOC1 ελαττώθηκαν, με αποτέλεσμα να παρατηρείται σμίκρυνση της περιόδου στο ρυθμό των προαναφερθέντων γονιδίων (Más et al., 2003). Αντίθετα, TMG φυτά (TOC1 Mini Gene technology) στα οποία αυξήθηκε η γενετική δόση του TOC1, παρουσίασαν αύξηση της περιόδου σε ρυθμικά γονίδια (Más et al., 2003). Ο παράγοντας TOC1 ανήκει στην COL (COnstans-Like) οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων. Το αμινο-τελικό άκρο της πρωτεΐνης του περιέχει ένα μοτίβο ίδιο με την περιοχή υποδοχής σήματος που εμπεριέχουν οι ρυθμιστές απόκρισης (Response Regulators, RRs) των συστημάτων μεταγωγής σήματος δύοσυστατικών (two-component signal transduction systems). Η τυπική λειτουργία 39

41 αυτού του είδους των συστημάτων μεταγωγής σήματος περιλαμβάνει ως πρώτο συστατικό μία κινάση-δέκτη (Histidine protein Kinase, HK), η οποία αντιλαμβάνεται αλλαγές στις συνθήκες του περιβάλλοντος και μεταδίδει σήματα με αυτοφωσφορυλίωση ενός συντηρημένου κατάλοιπου ιστιδίνης (Stock et al., 1991). Στη συνέχεια αυτή η φωσφορική ομάδα μεταφέρεται σε ένα κατάλοιπο ασπαραγινικού οξέος που βρίσκεται στην περιοχή υποδοχής ενός ρυθμιστή απόκρισης, με τελικό αποτέλεσμα μία αλλαγή στη μεταγραφή γονιδίων-στόχων μέσω ενεργοποίησής τους (Stock et al., 1991) (Mizuno, 2004). Ωστόσο, ο παράγοντας TOC1 έχει μία ιδιαιτερότητα και γι αυτό εντάσσεται στην οικογένεια των ψευδορυθμιστών απόκρισης (Pseudo-Response Regulators, PRRs). Η ιδιαιτερότητά του συνίσταται στο ότι το κρίσιμο κατάλοιπο ασπαραγινικού οξέος (D) της περιοχής υποδοχής, το οποίο προσλαμβάνει τη φωσφορική ομάδα, έχει αντικατασταθεί από γλουταμινικό οξύ (Ε) (Εικ. Α.11) (Makino et al., 2000). Οι άτυποι αυτοί ρυθμιστές απόκρισης, επειδή δεν μπορούν να υποστούν φωσφορυλίωση σε in vitro συνθήκες, πιθανόν να μην εμπλέκονται στο κανονικό μονοπάτι φωσφορυλίωσης ιστιδίνης ασπαραγινικού. Η οικογένεια των PRRs περιλαμβάνει άλλα τέσσερα μέλη εκτός από τον TOC1 (ή PRR1), τα PRR3, 5, 7 και 9 (Asakura et al., 2003). Χαρακτηριστικό της οικογένειας των PRRs είναι η παρουσία ενός χαρακτηριστικού μοτίβου CCT (CONSTANS, CO-like and TOC1) στο καρβοξυ-τελικό άκρο των πρωτεϊνών τους (Asakura et al., 2003). To μοτίβο CCT στην πρωτεΐνη TOC1 είναι μία περιοχή που αποτελείται από αμινοξέα πλούσια σε βασικά κατάλοιπα, η οποία εκτός από μία αλληλουχία πυρηνικού εντοπισμού, NLS, την οποία εμπεριέχει έχει αποδειχθεί ότι είναι υπεύθυνη και για την πρόσδεση της πρωτεΐνης TOC1 σε DNA. Η περιοχή PR (pseudoreceiver domain) που εδρεύει στο αμινο-τελικό άκρο της πρωτεΐνης TOC1 διαμεσολαβεί πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις (Putteril et al., 1997; Wenkel et al., 2006; Tiwari et al., 2010; Gendron et al., 2012). Ο TOC1 είναι ένας εσπερινός παράγοντας, διότι τα επίπεδα του TOC1 mrna σε συνθήκες φωτοπεριόδου παρουσιάζουν μέγιστο προς το τέλος της ημέρας. Ο ρυθμός είναι καθαρά ενδογενής, καθώς σε συνθήκες συνεχούς φωτισμού ο ρυθμός διατηρείται. Η περίοδος των ταλαντώσεων των επιπέδων mrna του παράγοντα μειώθηκε στα toc-1 μεταλλαγμένα φυτά, γεγονός που υποδηλώνει ότι η πρωτεΐνη TOC1 επανατροφοδοτεί τη μεταγραφή του γονιδίου TOC1 (Strayer et al., 2000). Μεταβολές στη ρυθμική έκφραση του TOC1 μέσω τροποποιήσεων της χρωματίνης 40

42 και μεταγραφικής ή μετα-μεταφραστικής ρύθμισης μπορεί να επηρεάσουν τη λειτουργία του ρολογιού (Somers et al., 1998; Strayer et al., 2000; Alabadí et al., 2001; Más et al., 2003; Perales και Más, 2007). Εικ. Α.11. Σχηματική αναπαράσταση των μεταφορέων σήματος μέσω φωσφορυλίωσης ιστιδίνης ασπαραγινικού (His Asp) στο φυτό A. thaliana. Στην οικογένεια του TOC1/PRR1 που αποτελείται από πέντε ψευδο-ρυθμιστές απόκρισης, το ασπαραγινικό οξύ (D) που προσλαμβάνει τη φωσφορική ομάδα έχει αντικατασταθεί από γλουταμινικό οξύ (Ε) στην περιοχή υποδοχέα (PR) των πρωτεϊνών αυτών (Mizuno, 2004). Ως μεταγραφικός ρυθμιστής, ο TOC1 ελέγχει επίσης την έκφραση μιας πληθώρας γονιδίων που σχετίζονται με το ρολόι. Πρόσφατα αποτελέσματα έχουν δείξει ότι ο TOC1 ενεργεί ως γενικός μεταγραφικός καταστολέας που ρυθμίζει αρνητικά τα CCA1/LHY, καθώς και μια ομάδα γονιδιωματικών στόχων που εμπλέκονται σε σημαντικές λειτουργίες των φυτών (Huang et al., 2012; Gendron et al., 2012; Pokhilko et al., 2012). Βιοχημικά και μοριακά δεδομένα δείχνουν ότι ο TOC1 είναι ένας μεταγραφικός καταστολέας με ικανότητα πρόσδεσης στο DNA. Η κατασταλτική δράση του TOC1 οφείλεται στην περιοχή PR, αλλά είναι απαραίτητη και η ύπαρξη λειτουργικής περιοχής CCT, ώστε να ρυθμίσει αρνητικά τους στόχους του (Gendron et al., 2012). Η in vivo και in vitro πρόσδεση του TOC1 στο ΤΙΜΕ (ένα cis-ρυθμιστικό στοιχείο), στους υποκινητές των CCA1 και LHY υποδεικνύει ότι ο TOC1 προσδένεται απευθείας στους υποκινητές των CCA1 και LHY για την καταστολή της έκφρασης αυτών των γονιδίων (Huang et al., 2012; Gendron et al., 2012; Pokhilko et al., 2012). 41

43 Ο πλήρους μήκους TOC1 δεσμεύει άμεσα, μέσω της περιοχής CCT, το στοιχείο T1ME (TGTG) (Gendron et al., 2012), το οποίο είναι μέρος του στοιχείου απόκρισης του παράγοντα CO (CONSTANS) [TGTG (N2-N3) ATG], του στοιχείου ΜΕ (Morning Element, GTGTGG) και του στοιχείου HUD (Hormone Upregulated at Dawn, CATGTG) (Xing et al., 1993; Michael et al., 2008; Tiwari et al., 2010). Έρευνες σε επίπεδο γονιδιώματος είχαν ως αποτέλεσμα την αναγνώριση επιπρόσθετων cis-ρυθμιστικών στοιχείων που βρίσκονται εμπλουτισμένα σε γονίδια που ρυθμίζονται από τον TOC1: ένα στοιχείο G-box (CACGTG), καθώς και ένα στοιχείο TBS (CCNGGGTG) όπου δεσμεύονται παράγοντες TCP κατηγορίας Ι, όπως είναι ο παράγοντας CHE (Pruneda-Paz et al., 2009; Huang et al., 2012). Η ανακάλυψη των ιδιοτήτων του TOC1 για τη πρόσδεση σε DNA και την καταστολή παρέχει ένα μηχανισμό για το ρυθμιστικό ρόλο του TOC1 στον κεντρικό βρόχο του ταλαντωτή, καθώς και μια εξήγηση για τα πειραματικά δεδομένα που είναι ασυμβίβαστα με τον ενεργοποιητικό ρόλο που αποδιδόταν παλαιότερα στο TOC1. Ένα παράδειγμα αποτελεί το φυτό απώλειας λειτουργίας του παράγοντα ZTL, στο οποίο η συσσώρευση του TOC1 λόγω μειωμένης αποικοδόμησης, συνοδεύεται από μειωμένη έκφραση των LHY και CCA1 (Más et al., 2003; Baudry et al., 2010). Έτσι, μπορεί να βγει το συμπέρασμα ότι η κατασταλτική δράση του TOC1 ασκείται είτε μέσω άμεσης σύνδεσής του, μέσω της περιοχής CCT, με το στοιχείο T1ME ή με παρόμοιες περιοχές που βρίσκονται στους υποκινητές των στόχων του, ή με την στρατολόγησή του στους υποκινητές των στόχων του μέσω αλληλεπίδρασης με άλλες πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύουν DNA (Wang και Ma, 2013). Α Ο μεταγραφικός παράγοντας ELF4 Ο παράγοντας του ρολογιού ELF4 (όπως και ο ELF3) ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά σε μία γενετική μελέτη που στόχευε στον εντοπισμό μεταλλαγμένων φυτών με φαινότυπο σχετικό με τη φωτοπερίοδο και βρέθηκε ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση των 24-ωρων ρυθμών (Doyle et al., 2002). Το ELF4 κωδικοποιεί μία μικρή πυρηνική πρωτεΐνη (15 kda) και ανήκει σε μια μικρή οικογένεια γονιδίων με τέσσερα -ομόλογα ως προς την αλληλουχία- μέλη (EFL1-EFL4). Αυτές οι αλληλουχίες δεν έχουν κάποια ανιχνεύσιμη αμινοξική ομοιότητα με άλλες πρωτεΐνες εκτός της υπεροικογένειας του ELF4 και γενικότερα, δεν έχουν ανιχνευθεί έξω από το φυτικό βασίλειο (Doyle et al., 2002; Khanna et al., 2003; Boxall et al., 2005). Για το λόγο 42

44 αυτό, τα διάφορα αποθετήρια αλληλουχίας έχουν ταξινομήσει την οικογένεια του ELF4 ως ξεχωριστή λειτουργική κατηγορία (Kolmos et al., 2009). [InterPro DUF1313 ( IPR009741)] Η ρυθμική έκφραση του ELF4 οφείλεται στη συντονισμένη δράση τόσο του φωτός όσο και του ρολογιού (Li et al., 2011). Η μεταγραφική του ρύθμιση αποτελεί ένα καλό παράδειγμα διασταύρωσης μεταξύ της σηματοδότησης από το φως και των στοιχείων του ρολογιού, για τη σωστή λειτουργία του ταλαντωτή (Εικ. Α.12). Τρεις θετικοί ρυθμιστές σηματοδότησης μέσω του phya, οι ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), FAR RED IMPAIRED RESPONSE 1 (FAR1) και FAR RED ELONGATED HYPOCOTYL 3 (FHY3), προσδένονται άμεσα στον υποκινητή του ELF4 και προάγουν την έκφρασή του καθώς προχωράει η ημέρα. Αυτή η θετική δράση αναστέλλεται αργότερα από τις πρωτεΐνες CCA1 και LHY, οι οποίες καταστέλλουν την έκφραση του ELF4 την αυγή (Li et al., 2011) (Εικ. Α.12). Ο ELF4 συνδέεται με τα LUX και ELF3, σχηματίζοντας το EC (Evening Complex) (Nusinow et al., 2011), τα στοιχεία του οποίου έχουν μέγιστα επίπεδα έκφρασης το απόγευμα και απαιτείται για τη διατήρηση των 24-ωρων ρυθμών. Από αυτά τα τρία συστατικά, ο LUX είναι ο μόνος μεταγραφικός παράγοντας ικανός να προσδεθεί σε DNA (Helfer et al., 2011), αλλά ο σχηματισμός του συμπλόκου είναι απαραίτητος για τη δράση του (Mizuno et al., 2014; Nusinow et al., 2011). Η ELF3 γεφυρώνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των LUX και ELF4, ενώ η ELF4 απαιτείται για το σωστό πυρηνικό εντοπισμό της ELF3, οδηγώντας έτσι στο σχηματισμό διακριτών πυρηνικών συσσωματωμάτων (Herrero et al., 2012). Το EC δρα ως μεταγραφικός ρυθμιστής, καταστέλλοντας μεταγραφικούς παράγοντες που σχετίζονται τόσο με το ρολόι όσο και με την ανάπτυξη του φυτού, για τη ρύθμιση των περιημερήσιων ρυθμών και της επιμήκυνσης του υποκτυλίου (Nusinow et al., 2011; Huang et al., 2016). 43

45 Εικ. Α.12. Οι FHY3, FAR1, HY5, CCA1 και LHY ελέγχουν συντονισμένα τη ρυθμική έκφραση του ELF4. Το μοντέλο απεικονίζει την ανταγωνιστική ρύθμιση της έκφρασης του ELF4 μέσω της θετικής και της αρνητικής δράσης μεταγραφικών παραγόντων κατά την αυγή και το σούρουπο. Οι CCA1 και LHY μπορούν να επιδράσουν στην έκφραση του ELF4 καταστέλλοντας την ενεργοποίησή του από τους FHY3, FAR1 και HY5. (Τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν μεταγραφική ενεργοποίηση, ενώ οι γραμμές που απολήγουν σε κάθετο υποδεικνύουν καταστολή. X: αποτέλεσμα αποκλεισμού) (Li et al., 2011). Α Μεταγραφική ενεργοποίηση εντός του κεντρικού ταλαντωτή Παρά την επικράτηση των κατασταλτικών αλληλεπιδράσεων εντός του ΗΒΡ των φυτών, τα τελευταία χρόνια έχουν ανακαλυφθεί αρκετοί ενεργοποιητικοί παράγοντες, όπως το ομόλογο των CCA1 και LHY, REVEILLE 8 (RVE8, επίσης γνωστό ως LHY-CCA1-LIKE 5 ή LCL5). Το RVE8 εκφράζεται το πρωί, αλλά είναι πιο ενεργό το απόγευμα, όταν προάγει άμεσα την έκφραση τόσο πρωινών όσο και εσπερινών γονιδίων, συγκεκριμένα των PRR9, PRR5, TOC1, GI, ELF4 και LUX (Εικ. Α.10) (Farinas και Más 2011; Rawat et al., 2011; Hsu et al., 2013). Με τη σειρά της, η έκφραση του RVE8 αναστέλλεται με την πρόσδεση των PRR5, PRR7 και PRR9 στον υποκινητή του (Nakamichi et al., 2012; Liu et al., 2016; Farinas και Más 44

46 2011; Rawat et al., 2011; Hsu et al., 2013). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το RVE8 προσδένεται σε στοιχεία ΕΕ, όπως συμβαίνει και με τα CCA1/LHY, μόνο που η πρόσδεση του RVE8 έχει επαγωγικό αποτέλεσμα, ενώ στην περίπτωση των CCA1/LHY καταλήγει σε καταστολή (Hsu et al., 2013). Επιπρόσθετα, μερικώς λειτουργικά επικαλυπτόμενη φαίνεται να είναι η δράση των ομολόγων του RVE8 στο ΗΒΡ, όπως είναι το RVE4 και το RVE6, τα οποία και πάλι προσδένονται σε στοιχεία ΕΕ (Rawat et al., 2011; Hsu et al., 2013). Τα NIGHT LIGHT-INDUCIBLE AND CLOCK REGULATED 1 (LNK1) και LNK2 έχει προταθεί ότι δρουν ως συνενεργοποιητές με τα RVE8 και 4 (Rugnone et al., 2013). Τα LNKs εκφράζονται κατά τη διάρκεια της ημέρας και πιστεύεται ότι επάγουν την έκφραση των εσπερινών και βραδινών γονιδίων PRR5, TOC1 και ELF4 (Xie et al., 2014). Το LIGHT-REGULATED WD 1 (LWD1) και το LWD2 δεσμεύονται στους υποκινητές των CCA1, PRR9, PRR5 και TOC1 και είναι απαραίτητα για την έκφρασή τους (Wang et al., 2011; Wu et al., 2016). Επιπλέον, έχει προταθεί ότι το LWD1 σχηματίζει βρόχο θετικής ανάδρασης με το PRR9 (Wang et al., 2011). Δύο πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το LWD1, οι TEOSINTE BRANCHED1- CYCLOIDEA-PCF20 (TCP20) και TCP22, έχει αποδειχθεί ότι απαιτούνται για την ενεργοποίηση του CCA1 κατά την αυγή μέσω της άμεσης πρόσδεσής τους στον υποκινητή του CCA1 (Wu et al., 2016). A Οι τροποποιήσεις της χρωματίνης ως μηχανισμός ρύθμισης της λειτουργίας του κεντρικού ταλαντωτή Η κατάσταση της χρωματίνης συνδέεται άμεσα με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Οι χημικές τροποποιήσεις του DNA και των ιστονών επηρεάζουν την αρχιτεκτονική της χρωματίνης και συνεπώς την προσβασιμότητα των μεταγραφικών ρυθμιστών, συμπεριλαμβανομένων των ρυθμιστών του ρολογιού. Στην περίπτωση του υποκινητή TOC1, για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι η καταστολή του από την CCA1 εξαρτάται από ένα κατασταλτικό περιβάλλον χρωματίνης προωθούμενο από την αποακετυλίωση της ιστόνης Η3 (Perales και Màs, 2007). Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (Chromatin Immunoprecipitation, ChIP) αποκάλυψαν ότι η μεταγραφική κατάσταση του γονιδίου TOC1 εξαρτάται από τη δυναμική μεταβολή της διαμόρφωσης της χρωματίνης στον υποκινητή του, η οποία ρυθμίζει επακριβώς την 24-ωρη ρυθμική ταλάντωση του TOC1 (Εικ. Α.13). 45

47 Εικ.Α. 13. Σχηματική αναπαράσταση του ρυθμικού ελέγχου της έκφρασης του TOC1. Η 24- ωρη έκφραση του TOC1 ελέγχεται από αλλαγές στη δομή της χρωματίνης στο γονιδιακό τόπο του TOC1. Η καταστολή του TOC1 το ξημέρωμα εξαρτάται από τη ρυθμική πρόσδεση του CCA1. Μειωμένη πρόσδεση του CCA1 κατά τη διάρκεια της ημέρας επιτρέπει τη μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω ρυθμικών κύκλων ακετυλίωσης ιστονών, οι οποίοι ευνοούν το σχηματισμό μεταγραφικά ενεργών δομών χρωματίνης. Η δράση της αποακετυλάσης ιστονών (HDAC, histone deacetylase) μετά το μέγιστο της έκφρασης του TOC1 βοηθά τη μετάβαση σε κατασταλτικές για την έκφραση δομές χρωματίνης και συνεισφέρει στη μειούμενη φάση της ταλάντωσης του TOC1 κοντά στο σούρουπο. Τα νουκλεοσώματα αναπαρίστανται ως γαλάζιοι κύκλοι, η σκούρα μπλε γραμμή αναπαριστά την καμπύλη της έκφρασης του TOC1 mrna, τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν μεταγραφική ενεργοποίηση, ενώ οι γραμμές που απολήγουν σε κάθετο υποδεικνύουν καταστολή. Τα άσπρα και μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν την ημέρα και τη νύχτα, αντίστοιχα (Màs, 2008). Η μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου TOC1 ακολουθεί ένα μοντέλο ακετυλίωσης της Η3, το οποίο εξαρτάται από το ρολόι, επιπρόσθετα με την πρόσδεση παραγόντων αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης στον υποκινητή του TOC1. Ρυθμοί ταλάντωσης σε μεταγραφικά ενεργές δομές χρωματίνης υφίστανται ανταγωνισμό από την πρόσδεση του CCA1, το οποίο συνεισφέρει στην καταστολή μέσω της επικειμένης ακετυλίωσης ιστονών στον υποκινητή του TOC1. Έχει προταθεί ότι η μειωμένη πρόσδεση του CCA1 κατά τη διάρκεια του 24-ωρου κύκλου μπορεί να ενεργοποιεί τη δράση του ενζύμου της ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης (ΗΑΤ) για την 46

48 ακετυλίωση ιστονών στο γονιδιακό τόπο του TOC1, διευκολύνοντας με αυτόν τον τρόπο την προσβασιμότητα της μεταγραφικής μηχανής και των ενεργοποιητών. Επίσης, η αποακετυλίωση των ιστονών έχει προταθεί ότι βοηθά στη μετάβαση σε παρεμποδιστικές δομές χρωματίνης στον υποκινητή του TOC1, ενισχύοντας τη συμπύκνωση των νουκλεοσωμικών ινών και/ή διευκολύνοντας την πρόσδεση κατασταλτικών παραγόντων, όπως ο CCA1 (Perales και Màs, 2007). Στον αντίποδα των παραπάνω, ο RVE8 διευκολύνει μία υπερακετυλιωμένη κατάσταση της Η3 στον υποκινητή του TOC1 (Farinas και Màs, 2011). Οι ανταγωνιστικές επιδράσεις των CCA1 και RVE8 σε επίπεδο χρωματίνης στο γονιδιακό τόπο του TOC1 μπορεί να συνεισφέρουν σε μεγάλο βαθμό στη ρυθμική έκφρασή του, αν και ο ακριβής μηχανισμός μέσω του οποίου συμβαίνουν αυτές οι αλλαγές σε επίπεδο ακετυλίωσης δεν είναι πλήρως κατανοητός. Οι μεταβολές στην ακετυλίωση και τη μεθυλίωση της Η3 στους υποκινητές των CCA1, LHY, PRR9, PRR7, TOC1, GI και LUX έχουν συσχετιστεί με τα επίπεδα έκφρασής τους και έχει προταθεί ότι η μεθυλοτρανσφεράση ιστονών SET DOMAIN PROTEIN 2 (SDG2) εμπλέκεται σε αυτές τις δυναμικές αλλαγές είτε άμεσα είτε έμμεσα (Ni et al., 2009; Malapeira et al., 2012). Η JMJD5 (JUMONJI DOMAIN CONTAINING 5, επίσης γνωστή ως JMJ30), μία εσπερινά εκφραζόμενη απομεθυλάση ιστονών που ρυθμίζεται από τους CCA1 και LHY, εμπλέκεται επίσης στη ρύθμιση του ΗΒΡ (Jones et al., 2010; Lu et al., 2011), όπως επίσης και η Ε3 λιγάση HISTONE ΜΟΝΟUΒΙQUITINATION 1 (HUB1), η οποία επηρεάζει τη μονοουβικιτινίωση της Η2Β και το σχετικό σήμα μεθυλίωσης της Η3 σε πολλά γονίδια του ρολογιού και μεταβάλλει το πλάτος ταλάντωσης της έκφρασής τους (Bourbousse et al., 2012; Himanen et al., 2012). Α Μετα-μεταγραφικός και μετα-μεταφραστικός έλεγχος των γονιδίων του κεντρικού ταλαντωτή Το εναλλακτικό μάτισμα (alternative splicing) θεωρείται πως συμμετέχει επίσης στη λειτουργία του ρολογιού (James et al., 2012). Πολλά γονίδια του ρολογιού υφίστανται εναλλακτικό μάτισμα, το οποίο εξαρτάται από τη θερμοκρασία, με τη συσσώρευση των διαφόρων ισομορφών τους να ποικίλλει ανάλογα με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Για παράδειγμα, η ρύθμιση του εναλλακτικού 47

49 ματίσματος του CCA1 σε συνθήκες ψύχους συνεισφέρει στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στο ψύχος (Seo et al., 2012). Όσον αφορά τους μηχανισμούς που δρουν στην καρδιά του ΗΒΡ των φυτών σε μεταφραστικό και μετα-μεταφραστικό επίπεδο ρύθμισης, σημαντικό ρόλο μπορεί να διαδραματίσει η καθυστέρηση μεταξύ της παραγωγής mrna κάποιων γονιδίων του ρολογιού και των αντίστοιχων πρωτεϊνών τους. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί μέσω ελέγχου του ρυθμού της αποικοδόμησης της πρωτεΐνης, κάτι που φαίνεται να είναι μεγάλης σημασίας στη διατήρηση έντονων 24-ωρων ταλαντώσεων στα επίπεδα των πρωτεϊνών (Daniel et al., 2004). Η προοδευτική φωσφορυλίωση πριν από την αποικοδόμηση φαίνεται να είναι στοιχείο-κλειδί της διαδικασίας, αφού στοχεύει τις πρωτεΐνες προς αποικοδόμηση μέσω του μονοπατιού ουμπικουϊτίνηςπρωτεασώματος. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες TOC1 και PRR5 υφίστανται πρωτεασωμική αποικοδόμηση, η οποία επάγεται από το σκοτάδι, συμβαίνει στο κυτταρόπλασμα και ρυθμίζεται από την αλληλεπίδρασή τους με την πρωτεΐνη ZTL (βλ. ενότ. Α.2.2.1) (Más et al., 2003; Kiba et al., 2007). Οι PRR9, PRR7 και PRR3 υποβάλλονται επίσης σε πρωτεασωμική αποικοδόμηση, αλλά παρά την υψηλή ομολογία μεταξύ των PRRs είναι απίθανο να είναι στόχοι του ZTL, καθώς σε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης δεν ανιχνεύθηκε να αλληλεπιδρά ο ZTL με αυτά (Fujiwara et al., 2008). Από την άλλη πλευρά, το PRR3, το οποίο εκφράζεται συγχρονισμένα με το TOC1 αλλά μόνο σε συγκεκριμένους ιστούς, αλληλεπιδρά με τον TOC1 και συνεπώς εμποδίζει την πρόσβαση του ZTL και την επακόλουθη αποικοδόμηση του TOC1 (Fujiwara et al., 2008; Para et al., 2007). Επίσης, το PRR5 αλληλεπιδρά με το TOC1 και ενισχύει την πυρηνική συσσώρευση του τελευταίου, εμποδίζοντας έτσι την κυτταροπλασματική αποικοδόμηση του TOC1 μέσω του ZTL (Wang et al., 2010). Επιπλέον, το ZTL αλληλεπιδρά με το GI με τρόπο που εξαρτάται από το μπλε φως και προάγει έμμεσα τη σταθερότητα των PRR5 και TOC1, οδηγώντας έτσι σε πιο έντονες και υψηλότερου πλάτους ταλαντώσεις των πρωτεϊνικών τους επιπέδων (Fujiwara et al., 2008; Kim et al., 2007). 48

50 A.2.4. Μονοπάτια εξόδου του ΗΒΡ (outputs) Στο A. thaliana υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός γονιδίων που εξαρτώνται από το ρολόι, με περίπου το 2-16% των mrna που κωδικοποιούνται στο γονιδίωμα του φυτού να εμφανίζουν ρυθμούς στα επίπεδά τους (Harmer et al., 2000). Σε αυτά συμπεριλαμβάνονται τα mrnas γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην άνθηση, τη σύνθεση φλαβονοειδών, τη σύνθεση λιγνίνης, την κυτταρική επιμήκυνση, το μεταβολισμό, την αφομοίωση θρεπτικών στοιχείων και τη φωτοσύνθεση. Επίσης, το ένα τρίτο των υποκινητών που εξετάστηκαν σε μελέτη παγίδευσης ενισχυτών (enhancer trapping) εμφάνισαν 24-ωρο ρυθμό, επιβεβαιώνοντας την επίδραση του ρολογιού στη μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων (Michael και McClung, 2003). Τα μονοπάτια εξόδου του ΗΒΡ των φυτών οδηγούν σε φυσιολογικούς και βιοχημικούς ρυθμούς σε διεργασίες όπως στη φωτοσύνθεση, την κίνηση των φύλλων, το άνοιγμα και κλείσιμο των στοματίων, τη νεύση και την ελικοειδή κίνηση των φυτών (Webb, 1998; Harmer et al., 2001; McClung et al., 2002; Webb, 2003). Είναι οι ρυθμοί αυτοί οι οποίοι, σε τελική ανάλυση, προσδίδουν τα πλεονεκτήματα στην ανάπτυξη και τον ανταγωνισμό που παρέχονται από το ρολόι (Dodd et al., 2005). Έχει βρεθεί ότι η φυσικά προκύπτουσα ποικιλομορφία στο ρολόι προσδίδει αυξημένη ευρωστία (Michael et al., 2003), καθώς και ότι μεταβολές στους 24-ωρους ρυθμούς ελέγχουν την ευρωστία σε υβρίδια και αλλοπολυπλοειδή του A. thaliana (Ni et al, 2009). Οι ρυθμοί στα επίπεδα mrna είναι ένα αρχικό μονοπάτι εξόδου του ταλαντωτή του ΗΒΡ. Για παράδειγμα, ο CCA1 ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων του συμπλόκου συλλογής φωτός (Mizoguchi et al., 2002) και καταστέλλει την έκφραση αρκετών άλλων γονιδίων, προσδενόμενος στα εσπερινά στοιχεία (EE) των υποκινητών τους (Harmer et al., 2000; Alabadí et al., 2001). A Επίδραση του ΗΒΡ στην ανάπτυξη των φυτών Για το σωστό συντονισμό των διαφόρων μονοπατιών που εμπλέκονται σε ορισμένες πτυχές της ανάπτυξης του φυτού απαιτείται σύνθετη ρύθμιση γονιδίων του ΗΒΡ. Η καλά χαρακτηρισμένη διεργασία της επιμήκυνσης του υποκοτυλίου διαστήματος κατά τη βλάστηση (επιμήκυνση του υποκοτυλίου) αποτελεί παράδειγμα της ρύθμισης της ανάπτυξης στα φυτά από το ΗΒΡ. Η ρυθμική επιμήκυνση του 49

51 υποκοτυλίου σε συνεχές φως είναι ενδεικτική της ρύθμισης αυτής της διαδικασίας από το ρολόι (Dowson-Day και Millar, 1999) αν και σε συνεχές σκοτάδι είναι αρρυθμική (Nozue et al., 2007), αποδεικνύοντας ότι το φως είναι απαραίτητο για τη ρύθμισή της από το ρολόι. Η επιμήκυνση του υποκοτυλίου βασίζεται σε δύο μεταγραφικούς παράγοντες bhlh, τους PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4 (PIF4) και PIF5 (Nozue et al., 2007). Η σωστή ρύθμιση της έκφρασης των PIF4 και PIF5 εξαρτάται από την καταστολή τους νωρίς το απόγευμα από το εσπερινό σύμπλοκο (Evening Complex, βλ. ενότ. Α ) (Nusinow et al., 2011). Το ELF3 είναι απαραίτητο για τη διατήρηση της ρυθμικής ανάπτυξης των φύλλων και των κινήσεων αυτών (Dornbusch et al., 2014). Ο μέγιστος ρυθμός αύξησης των φύλλων εμφανίζεται αρκετές ώρες μετά την αυγή και η ρυθμική ανάπτυξη των φύλλων μπορεί να διατηρηθεί κάτω από συνεχείς συνθήκες και σε άλλα δικοτυλήδονα φυτά, συμπεριλαμβανομένου του Ricinus communis, αλλά όχι στα μονοκοτυλήδονα Zea mays ή Oryza sativa (Poiré et al., 2010). Α Επίδραση του ΗΒΡ στο χρόνο άνθησης Πολλά φυτά χρησιμοποιούν το μήκος της ημέρας για το συντονισμό της άνθησής τους με την κατάλληλη εποχή του χρόνου, βελτιώνοντας έτσι την αναπαραγωγική τους επιτυχία (Greenham και McClung, 2015). Το μήκος της ημέρας μετράται στα φύλλα μέσω σύνθετων δικτύων που ρυθμίζουν την έκφραση των ανθογόνων, δηλαδή μορίων που είναι υπεύθυνα για την επαγωγή της άνθησης, τα οποία μεταδίδονται στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού για την επαγωγή γονιδίων ταυτότητας του ανθοφόρου μεριστώματος (floral meristem identity, FMI). Η μέτρηση του μήκους της ημέρας προϋποθέτει την ύπαρξη λειτουργικού ΗΒΡ, ενώ μεταλλάξεις που διαταράσσουν τη λειτουργία του ρολογιού σχετίζονται συχνά με αλλαγή στο χρόνο άνθησης (Andrés και Coupland, 2012; Romera-Branchat et al., 2014; Song et al., 2015). Το A. thaliana ανθίζει νωρίτερα σε μεγάλες ημέρες σε σχέση με τις μικρές ημέρες (φυτό μεγάλης ημέρας). Αυτή η αντίδραση ελέγχεται εν μέρει από το ρολόι (Hayama και Coupland, 2003) και ανάλυση μεταλλαγών έχει προσδιορίσει τον παράγοντα GI (GIGANTEA) ως το συστατικό του ρολογιού το οποίο ελέγχει την επαγωγή της άνθησης (Mizoguchi et al., 2005). Η GI (βλ. ενότ. Α ) αλληλεπιδρά με την SPY (SPINDLY), μία πρωτεΐνη που εμπλέκεται στη μεταγωγή 50

52 σήματος μέσω γιββερελλίνης (Tseng et al., 2004). Οι GI και SPY επάγουν τη ρυθμική έκφραση του CO (CONSTANS). Το CO κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη με δακτύλιο ψευδαργύρου, η οποία ενεργοποιείται από το φως. Κάτω από συνθήκες μικρής ημέρας, η έκφραση του CO παρουσιάζει μέγιστο κατά τη διάρκεια της νύχτας. Σε μεγάλες ημέρες, όμως, το μέγιστο στην έκφραση του CO παρουσιάζεται κατά τη διάρκεια της φωτεινής περιόδου (ημέρα). Αυτό οδηγεί στην παραγωγή ενεργής πρωτεΐνης CO, η οποία είναι σε θέση να επάγει την έκφραση ενός πιθανού καταστολέα κινάσης, του FT (FLOWERING LOCUS T) (Valverde et al., 2004). Όπως και ο CO, έτσι και o FT εκφράζεται ως επί των πλείστον στα φύλλα αλλά το mrna του FT μεταναστεύει στο κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού (Huang et al., 2005). Εκεί η FT (ανθογόνο) αλληλεπιδρά με άλλους μεταγραφικούς παράγοντες, έτσι ώστε να επαχθεί η έκφραση και άλλων γονιδίων, τα οποία διαμεσολαβούν τη μετάβαση στην άνθηση (Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005). Α Επίδραση του ΗΒΡ στην απόκριση των φυτών σε καταπονήσεις Ένα μεγάλο ποσοστό, περίπου 68%, των ρυθμικά εκφραζόμενων γονιδίων του A. thaliana αντιδρούν άμεσα σε περιβαλλοντικές καταπονήσεις (stress) (Kreps et al., 2002). Η ρυθμική έκφραση αυτών των γονιδίων για την πρόβλεψη επικείμενων περιβαλλοντικών αλλαγών μπορεί να προετοιμάσει το φυτό έτσι ώστε να αντέξει μία επικείμενη καταπόνηση ή να κάνει καλύτερη χρήση των διαθέσιμων πόρων του, για να μπορέσει να συγχρονίσει την επακόλουθη αντίδρασή του στην καταπόνηση (Green et al., 2002). Για παράδειγμα, τα φυτά αποκρίνονται στον ετήσιο κύκλο του μήκους της ημέρας, παράγοντας άνθη, κονδύλους ή ανθεκτικά στο ψύχος μπουμπούκια την κατάλληλη εποχή και τα ανταγωνιστικά πλεονεκτήματα του σωστού συγχρονισμού των φυτών με την εποχή είναι ευνόητα (Hayama και Coupland, 2003). Το TOC1 λειτουργεί ως μοριακός «διακόπτης» που συνδέει το ρολόι με την απόκριση του φυτού στην ξηρασία (Legnaioli et al., 2009). Επίσης, άλλα μέλη της οικογένειας των PRRs (PRR5, 7 και 9), τα οποία όπως αναφέρθηκε παραπάνω αποτελούν συστατικά του κεντρικού ταλαντωτή του ρολογιού, φαίνεται να εμπλέκονται στο μηχανισμό πρόβλεψης της καθημερινής καταπόνησης από το ψύχος (Nakamichi et al., 2009). Σε πολλά φυτικά είδη, οι χαμηλές θερμοκρασίες συμμετέχουν σε σημαντικές αναπτυξιακές διεργασίες, όπως η διαχείμαση για την άρση του ληθάργου των σπόρων και η εαρινοποίηση για την επαγωγή της άνθησης. 51

53 Οι θερμοκρασίες ψύχους, όμως, κατά την περίοδο καλλιέργειας δημιουργούν προβλήματα στην παραγωγή των καλλιεργειών, στρέφοντας το ενδιαφέρον των ερευνητών στην απόκριση των φυτών και τον εγκλιματισμό τους σε χαμηλές θερμοκρασίες (Greenham και McClung, 2015). Οι μεταγραφικοί παράγοντες CBFs (C REPEAT BINDING FACTOR) επάγονται εντός 15 λεπτών ως απόκριση στο ψύχος (4 C). Οι CBFs ρυθμίζουν πάνω από 100 γονίδια που αποκρίνονται στο ψύχος (Thomashow, 1999). Η επαγωγή των CBFs από το ψύχος υφίσταται χρόνοεξαρτώμενη απόκριση (βλ. ενότ. A.1.2) από το ΗΒΡ, καθώς όταν η επίδραση του ψύχους γίνει στις 4 ώρες μετά την αυγή παρατηρούνται υψηλότερα επίπεδα επαγωγής της μεταγραφής των CBFs, από ότι αν γίνει μετά από 16 ώρες (Fowler et al., 2005). Η πρώτη ένδειξη του ενδεχόμενου ρόλου του ρολογιού στην απόκριση του φυτού σε παθογόνα (βιοτική καταπόνηση) ήρθε όταν παρατηρήθηκε ότι το PATHOGEN AND CIRCADIAN CONTROLLED 1 (PCC1), ένα γονίδιο που επάγεται άμεσα μετά από μόλυνση από το Pseudomonas syringae, ταλαντώνεται με εσπερινό μέγιστο (Sauerbrunn και Schlaich, 2004). Όπως και με την απόκριση σε αβιοτικές καταπονήσεις, η συνεχής έκφραση των αμυντικών μονοπατιών που προσδίδουν ανθεκτικότητα σε παθογόνους παράγοντες και τους εχθρούς είναι επιβλαβής. Η υπόθεση της βέλτιστης άμυνας (optimal defence hypothesis, ODH) προϋποθέτει ότι ένα φυτό πρέπει να κατανέμει τους αμυντικούς πόρους του σε ιστούς που είναι πολύτιμοι και πιο ευάλωτοι σε παθογόνα ή σε φυτοφάγα ζώα (Meldau et al., 2012). Τα τελευταία χρόνια, η ODH έχει επεκταθεί συμπεριλαμβάνοντας και μια χρονική συνιστώσα, καθώς τα φυτά χρησιμοποιούν το ΗΒΡ για να περιορίσουν χρονικά τόσο τη βασική έκφραση όσο και την επαγωγή των αμυντικών τους μονοπατιών στην ώρα που μεγιστοποιείται η απειλή από τα παθογόνα και τους εχθρούς, ελαχιστοποιώντας έτσι το κόστος στην ευρωστία του φυτού (Greenham και McClung, 2015). A Επίδραση του ΗΒΡ στο μεταβολισμό Το ρολόι ρυθμίζει ποικίλες πλευρές του μεταβολισμού των φυτών, συμπεριλαμβανομένων της φωτοσύνθεσης (Dodd et al., 2005), της οξειδωτικής ομοιόστασης (Lai et al., 2012), της αφομοίωσης των θρεπτικών συστατικών (Gutiérrez et al., 2008) και του δευτερογενούς μεταβολισμού (Kerwin et al., 2011). Σε μελέτη των επιπέδων των φυτικών μεταβολιτών προσδιορίστηκε ότι το 30% της 52

54 συσσώρευσης πρωτογενών μεταβολιτών (στους 20 C) βρίσκεται υπό τον έλεγχο του ΗΒΡ (Espinoza et al., 2010). Επίσης, το ΗΒΡ ρυθμίζει βασικά μετάγραφα που σχετίζονται με τη φωτοσύνθεση, τη βιοσύνθεση των φαινυλοπροπανοειδών (φλαβονοειδών και ανθοκυανινών), και των ισοπρενοειδών (χλωροφύλλη και καροτένια) (Covington et al., 2008; Haydon et al., 2013). Η ταχύτητα αφομοίωσης του CO 2 βρίσκεται κάτω από τη ρύθμιση του ρολογιού, καθώς σε φυτά άγριου τύπου, υπό συνεχές φως, ταλαντώνεται, αλλά είναι αρρυθμική σε φυτά που υπερεκφράζουν τον CCA1. Σε συνθήκες φωτοπεριόδου, τα φυτά αυτά είχαν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη, μειωμένη αφομοίωση CO 2 και μειωμένη βιομάζα, σε σύγκριση με τα αγρίου τύπου, υπογραμμίζοντας έτσι τη σημασία του ρολογιού για τη βέλτιστη φωτοσύνθεση (Dodd et al., 2005). H σύνδεση του ΗΒΡ και της παραγωγικότητας των φυτών πιθανόν να έγκειται και στον έλεγχο της αφομοίωσης των υδατανθράκων από το ΗΒΡ, μέσω του ελέγχου της αποικοδόμησης του αμύλου κατά τη διάρκεια της νύχτας. Η αποικοδόμηση του αμύλου ρυθμίζεται χρονικά από το ρολόι έτσι ώστε αυτό να έχει καταναλωθεί μέχρι την αυγή, αλλά όχι νωρίτερα (Graf et al., 2010; Graf και Smith, 2011). A Ρυθμοί στις κινήσεις των φύλλων των ψυχανθών Τα φύλλα ορισμένων φυτικών ειδών και ιδιαίτερα των ψυχανθών (π.χ. ακακία, τριφύλλι, φασόλι) πραγματοποιούν περιοδικές κινήσεις κατά τη διάρκεια της ημέρας, σε συντονισμό με τη φωτοπερίοδο. Στις φωτεινές ώρες της ημέρας, τα ελάσματα των φύλλων στρέφονται προς το φως, ενώ όταν βραδιάζει «διπλώνουν» (Εικ. Α.14). Οι κινήσεις αυτές εμφανίζουν περίοδο περίπου 24 ωρών και διατηρούνται ακόμα και αν το φυτό βρεθεί σε συνθήκες συνεχούς φωτισμού. Οφείλονται δε, στην περιοδική αλλαγή των ιδιοτήτων των κυτταρικών μεμβρανών όπου η μετακίνηση ιόντων K + και Ca +2 έχει ως αποτέλεσμα τις αλλαγές της σπαργής των κυττάρων του μίσχου (Καράταγλης, 1992). 53

55 Εικ. Α.14. Η καθημερινά επαναλαμβανόμενη κίνηση των φύλλων στη διάρκεια του 24-ώρου μπορεί να καταγραφεί και πραγματοποιείται ακόμα και αν το φυτό βρεθεί σε συνθήκες συνεχούς φωτισμού. Στη γραφική παράσταση απεικονίζεται η καταγραφή της ρυθμικής αυτής κίνησης σε ένα περιστρεφόμενο τύμπανο στη διάρκεια πέντε ημερών. Α.3. Το φασόλι (Phaseolus vulgaris L.) ως πειραματόφυτο Το φυτό Α. thaliana είναι ένα καλά μελετημένο σύστημα σε επίπεδο μοριακής βιολογίας. Πρόκειται για αγγειόσπερμο, δικοτυλήδονο με μικρό αριθμό χρωματοσωμάτων, εύκολο μετασχηματισμό και μικρό χρόνο γενιάς. Το φασόλι (P. vulgaris) αποτελεί καλό πειραματόφυτο γιατί έχει γρήγορη και μη απαιτητική ανάπτυξη, μεγάλα πρωτογενή φύλλα για απομόνωση υλικού, μικρό χρόνο γενιάς, αλλά δύσκολο μετασχηματισμό. Το φασόλι έχει πενταπλάσιο γονιδίωμα σε σχέση με το Α. thaliana και η πλήρης αλληλουχία του γονιδιώματός του έχει πλέον αποκωδικοποιηθεί (Schmutz et al., 2014). Ανήκει στην οικογένεια των ψυχανθών (Fabaceae) και είναι συγγενικό με τη σόγια, το μπιζέλι, τη μηδική κ.ά. Τα ψυχανθή αποτελούν την τρίτη μεγαλύτερη οικογένεια μεταξύ των αγγειοσπέρμων και τη δεύτερη μεγαλύτερη οικογένεια καλλιεργούμενων φυτών. Το φασόλι είναι μια σημαντική πηγή πρωτεΐνης και επομένως θεμελιώδους σημασίας για τη διατροφή περισσότερων από 500 εκατομμυρίων ανθρώπων στις αναπτυσσόμενες χώρες 54

56 (Graham και Vance, 2003). Καλλιεργούνταν από τα αρχαία χρόνια. Στην Ευρώπη η έλευσή του συντελέστηκε το 16 ο αιώνα, έπειτα από την ανακάλυψη της Αμερικής. Ο ελληνικός λαός αποκαλούσε το φασόλι «κρέας του φτωχού» και καθιέρωσε την φασολάδα ως «εθνικό φαγητό» χάρη στη μεγάλη αξία των ξερών φασολιών ως βασική τροφή. Η πρωτεΐνη τους αντιπροσωπεύεται από την φασεολίνη, η οποία περιέχει όλα τα βασικά αμινοξέα που δεν μπορούν να βιοσυντεθούν στον ανθρώπινο οργανισμό. Παρά τη μεγάλη διατροφική σημασία του φασολιού, το ΗΒΡ του παραμένει ανεξιχνίαστο. Έτσι, η σχετική μελέτη αφορά δύο βασικές κατευθύνσεις: την ταυτοποίηση στο φασόλι στοιχείων του κεντρικού ταλαντωτή (ορθόλογα ρυθμικά γονίδια με το Α. thaliana) και την κατανόηση της λειτουργίας τους. Προηγούμενες μελέτες αναφορικά με την απόκριση του ΗΒΡ του φασολιού στο φως φανέρωσαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με το ρολόι του Α. thaliana. Συγκεκριμένα, το φαινόμενο της χρονοεξαρτώμενης απόκρισης στο φως (gating) φαίνεται να λειτουργεί αντίθετα στο φασόλι σε σχέση με το Α. thaliana. Πιο συγκεκριμένα, το ρολόι του Α. thaliana δεν είναι δεκτικό στο φωτεινό σήμα κατά τη διάρκεια της νύχτας, ενώ στην περίπτωση του φασολιού το ρολόι αποκρίνεται στο φως τη νύχτα (Millar και Kay, 1996; Kaldis et al., 2003; Kaldis και Prombona, 2006). Τα παραπάνω αποτελέσματα προέκυψαν από μελέτη του PvLHY (Phaseolus vulgaris LATE ELONGATED HYPOCOTYL), ορθόλογο του LHY. Υπάρχουν, λοιπόν, ενδείξεις ότι τα δύο είδη (P. vulgaris και Α. thaliana) ακολουθούν διαφορετικές στρατηγικές αναφορικά με την απόκρισή τους στο φως. Η μελέτη ενός βιολογικού φαινομένου, λόγω των διαφορών μεταξύ των ειδών, θεωρείται πιο εμπεριστατωμένη όταν εστιάζεται σε περισσότερους οργανισμούς. Πόσο μάλλον για το ΗΒΡ, για το οποίο θέτουμε ερωτήματα που αφορούν τη σημασία του στα φυτά, καθώς αποτελεί ένα μηχανισμό προσαρμογής τους στο εξωτερικό περιβάλλον, ο οποίος προσδίδει εξελικτικά πλεονεκτήματα σε αυτά. Είναι γνωστό, από πειράματα στο φυτό A. thaliana, ότι το βιολογικό ρολόι ελέγχει την άνθηση (Hayama and Coupland, 2003). Το φασόλι, αναφορικά με την άνθηση, δεν επηρεάζεται από τη φωτοπερίοδο. Δημιουργείται, έτσι, το ερώτημα αν το βιολογικό ρολόι στο φασόλι και γενικότερα στα φυτικά είδη στα οποία δεν ελέγχεται η άνθηση από τη φωτοπερίοδο, συνεισφέρει στην καλύτερη προσαρμοστικότητα ή/και την ευρωστία των φυτών στο περιβάλλον που αναπτύσσονται, παρέχοντάς τους μεγαλύτερη ευελιξία συγχρονισμού και κατ επέκταση προσαρμογής στα φωτεινά 55

57 ερεθίσματα του περιβάλλοντος. Όλα λοιπόν τα παραπάνω στοιχεία οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η μελέτη του ΗΒΡ στο φασόλι, ενός φυτού με οικονομική και διατροφική αξία, είναι σημαντική. 56

58 Α.4. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι. Το ΗΒΡ είναι ζωτικής σημασίας για τα φυτά, ρυθμίζοντας σημαντικές λειτουργίες τους, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός και η άνθηση. Ως εκ τούτου, φυτά με καλά συγχρονισμένο ΗΒΡ παρουσιάζουν αυξημένη ευρωστία, ανθεκτικότητα και, κατ επέκταση, αυξημένες αποδόσεις. Το φασόλι, που αποτελεί αντικείμενο της παρούσας διατριβής, δεν επιλέχτηκε τυχαία. Το μεγαλύτερο μέρος της βιβλιογραφίας έχει εστιαστεί στο A. thaliana, που ως πειραματόφυτο είναι σημαντικό, αλλά δεν έχει κάποια καλλιεργητική αξία. Στο φασόλι, πέραν της υψηλής διατροφικής του σημασίας και του καλλιεργητικού του ενδιαφέροντος, υπήρχαν στοιχεία ότι το ΗΒΡ λειτουργεί με διαφορετικό τρόπο, το οποίο ενισχύθηκε και από τα πειράματα της παρούσας εργασίας. Πιθανά οι διαφορές αυτές να αντικατοπτρίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς προσαρμογής στο περιβάλλον. Η κατανόησή τους μας φέρνει ένα βήμα πιο κοντά στην ανάπτυξη φυτών με βελτιωμένα χαρακτηριστικά. Το ΗΒΡ στο φασόλι δεν έχει μελετηθεί προηγουμένως από κάποια άλλη ερευνητική ομάδα, αλλά ακόμα και στο A. thaliana, ο μοριακός μηχανισμός που ελέγχει το ρολόι των φυτών δεν έχει διερευνηθεί πλήρως, με τα αποτελέσματα να είναι συχνά αποσπασματικά και μερικές φορές αντικρουόμενα. Έτσι, θεωρήθηκε σημαντικό να αναλυθούν πτυχές της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και να μελετηθεί ο μοριακός μηχανισμός που το διέπει. Η μελέτη του ΗΒΡ στρέφεται γύρω από τρεις κύριους άξονες οι οποίοι απορρέουν από τα βασικά δομικά συστατικά του ρολογιού (βλ. ενότ. Α.2.1): 1) τα μονοπάτια εισόδου, δηλαδή τον τρόπο που τα σήματα από το περιβάλλον (π.χ. μήκος φωτοπεριόδου) συγχρονίζουν το ΗΒΡ, 2) τον ενδογενή κεντρικό ταλαντωτή, δηλαδή το μοριακό μηχανισμό στην καρδιά του ρολογιού και 3) τα μονοπάτια εξόδου, δηλαδή τους φυσιολογικούς ρυθμούς του φυτού που ελέγχονται από το ρολόι. Εφόσον δεν υπάρχει εκτενής προηγούμενη έρευνα επί του ΗΒΡ στο φασόλι, το πρώτο που έπρεπε να γίνει ήταν να προσδιοριστούν οι υποψήφιοι παράγοντες του ρολογιού του φασολιού και να μελετηθεί η έκφρασή τους. Έτσι, επιλέχθηκαν κάποιοι από τους βασικούς παράγοντες που είναι γνωστό ότι λειτουργούν στο ρολόι του A. thaliana και αναλύθηκε η γονιδιακή έκφραση των ορθόλογών τους στο φασόλι. Στα 57

59 πρώτα στάδια της εργασίας μελετήθηκαν οι ορθόλογοι LHY, TOC1 και ELF4 και αργότερα συμπεριλήφθηκε και ο RVE8. Στη συνέχεια, για την προσέγγιση του πρώτου άξονα μελέτης του ΗΒΡ στο φασόλι (μονοπάτια εισόδου), διερευνήθηκε ο επανασυγχρονισμός των ημερήσιων ρυθμών έκφρασης των παραγόντων του ρολογιού σε διάφορα εξωγενή ερεθίσματα, όπως το φως κατά τη διάρκεια της νύχτας, αλλά και χημικές ενώσεις που επιδρούν στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, ενός εκ των πιθανών μηχανισμών ρύθμισης του ρολογιού. Αναλύοντας τη γονιδιακή έκφραση των παραγόντων του ρολογιού υπό την επίδραση των παραπάνω ερεθισμάτων, πέρα από την εμβάθυνση της γνώσης επί του ελέγχου του ΗΒΡ από το περιβάλλον, προσεγγίστηκε και μέρος των μονoπατιών εξόδου από το ΗΒΡ. Διαπιστώθηκε ότι η επίδραση του φωτός τη νύχτα συνδέεται με τους ρυθμούς κίνησης των φύλλων του φασολιού, ένα χαρακτηριστικό μονοπάτι εξόδου του ρολογιού στα ψυχανθή. Κάνοντας το συσχετισμό αυτό, παρέχεται και μία μοριακή ερμηνεία για τη φυσιολογική λειτουργία των ρυθμών αυτών. Τα μονοπάτια εξόδου αναλύθηκαν και ως προς την έκφραση του γονιδίου PvLHCB2 που κωδικοποιεί την αποπρωτεΐνη του φωτοσυλλεκτικού συμπλόκου του φωτοσυστήματος ΙΙ (PSII) και είναι από τα συχνότερα μελετούμενα γονίδια που ρυθμίζονται από το ρολόι. Για την μελέτη του κεντρικού ταλαντωτή του ρολογιού στο φασόλι είναι σημαντική η διερεύνηση της λειτουργίας παραγόντων του ρολογιού. Στην κατεύθυνση αυτή, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά φυτά A. thaliana που υπερεκφράζουν έναν εκ των παραγόντων του ΗΒΡ του φασολιού (PvLHY-ox) και ελέγχθηκαν ως προς διάφορα αναπτυξιακά χαρακτηριστικά και την έκφραση στοιχείων του ρολογιού, χωρίς όμως επιτυχή αποτελέσματα. Στη συνέχεια, σε ένα ομόλογο in vitro σύστημα μελετήθηκαν τμήματα των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1, PvLHY και PvELF4 ελέγχοντάς τα ως προς την ενεργότητα, τη ρυθμικότητα και την δυνατότητα αλληλεπίδρασης με πρωτεΐνες του ρολογιού με απώτερο σκοπό τον χαρακτηρισμό των υποκινητών και τον εντοπισμό cisρυθμιστικών στοιχείων που εμπλέκονται στη λειτουργία του κεντρικού ταλαντωτή. Επιπλέον, για τον λειτουργικό προσδιορισμό των παραγόντων του ρολογιού, μελετήθηκε η επίδραση της υπερέκφρασης των πρωτεϊνών τους στην ενεργότητα των εν λόγω υποκινητών. Με αυτόν τον τρόπο ανακαλύφθηκαν νέες λειτουργίες του παράγοντα PvTOC1, ο οποίος βρέθηκε να αυτοκαταστέλλεται. Αυτή η καταστολή 58

60 διερευνήθηκε περεταίρω, προσδιορίζοντας την περιοχή του υποκινητή που λαμβάνει χώρα αλλά και την λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης που είναι απαραίτητη για αυτή τη λειτουργία. Συνοπτικά, ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη του ΗΒΡ στο φασόλι και του επανασυγχρονισμού του από εξωγενείς (φως) και ενδογενείς (αναδιαμόρφωση χρωματίνης) παράγοντες. Το θέμα αυτό προσεγγίστηκε σφαιρικά, μελετώντας και τα τρία στοιχεία του ΗΒΡ: τα μονοπάτια εισόδου σε αυτό, μελετώντας τον επανασυγχρονιμό του ΗΒΡ κυρίως από το φως, τον κεντρικό ταλαντωτή, μελετώντας τους υποκινητές και τις επιδράσεις των αντίστοιχων πρωτεϊνών κύριων παραγόντων του ρολογιού και τα μονοπάτια εξόδου, κυρίως ως προς τις κινήσεις των φύλλων στο φασόλι. Η κυτταροκαλλιέργεια του φασολιού, όπως και στα περισσότερα ψυχανθή, παρουσιάζει έντονα προβλήματα, κυρίως στην αναγέννηση και τον μετασχηματισμό των φυτών. Σε πολλές περιπτώσεις η χρήση ενός ετερόλογου συστήματος (διαγονιδιακά φυτά A. thaliana, φύλλα καπνού κλπ.) μπορεί να αποδειχτεί χρήσιμη. Στη μελέτη, όμως, του ΗΒΡ διαφαίνονται διαφορές στη λειτουργία και στη ρύθμισή του μεταξύ των διαφορετικών ειδών, οι οποίες επιτάσσουν τη χρήση ομόλογου συστήματος. Ελλείψει διαθέσιμου πρωτοκόλλου, μεγάλο μέρος της παρούσας διατριβής αφιερώθηκε στην κατασκευή ενός in vitro συστήματος από πρωτοπλάστες φασολιού, στον μετασχηματισμό τους και στην αξιολόγηση του συστήματος για την καταλληλότητα της χρήσης του για τη μελέτη του ΗΒΡ. Το σύστημα αυτό χρησιμοποιήθηκε για μεγάλο μέρος των πειραμάτων της παρούσας εργασίας. 59

61 B. ΥΛΙΚΑ και ΜΕΘΟΔΟΙ Β.1. Υλικά και όργανα Β.1.1. Υλικά Όλα τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων ήταν καθαρότητας αναλυτικού βαθμού. Τα περισσότερα προμηθεύτηκαν από την εταιρία SIGMA (Saint Louis, Missouri, USA). Για όσα προμηθεύτηκαν από άλλη εταιρία θα γίνεται ειδική αναφορά στο αντίστοιχο κεφάλαιο όπου περιγράφεται αναλυτικά η χρησιμοποιηθείσα μέθοδος. Β.1.2. Όργανα Για τις φυγοκεντρήσεις που έγιναν σε θερμοκρασία δωματίου, σε πλαστικούς σωλήνες (1.5-2 ml), χρησιμοποιήθηκε επιτραπέζια φυγόκεντρος (Mikro 200, Hettich, Germany). Για τις φυγοκεντρήσεις πλαστικών σωλήνων τύπου Falcon 15 και 50 ml χρησιμοποιήθηκε ψυχόμενη επιτραπέζια φυγόκεντρος (Hermle, Z323, Germany) με δυνατότητα αλλαγής κεφαλών. Η φυγοκέντρηση πλαστικών σωλήνων χωρητικότητας 30 και 250 ml έγινε σε επιδαπέδια, ψυχόμενη φυγόκεντρο με δυνατότητα αλλαγής κεφαλών, τύπου Sorvall RC-5B (GMI, USA). Οι φασματοφωτoμετρικές μετρήσεις έγιναν με το όργανο model της εταιρείας Hitachi (Japan). Για την επώαση των υγρών καλλιεργειών βακτηριακών κυττάρων χρησιμοποιήθηκε επωαστήρας της εταιρίας Daihan Labtech (Korea) ενώ για την ανάπτυξη σε στερεό υπόστρωμα ο κλίβανος ΙΗ-150 της Gallenkamp (UK). Σε όλα τα υδατικά διαλύματα χρησιμοποιήθηκε υπερ-καθαρό νερό (PureLab Plus, ELGA, UK). Η αποστείρωση των πλαστικών υλικών, των διαλυμάτων και των αποβλήτων έγινε με αποστείρωση σε υγρό κλίβανο (Tuttnauer 3870E, Germany) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία 121 ο C και υπό πίεση 15 atm. Οι συσκευές διηθήσεως και οι ηθμοί (0.22 mm) που χρησιμοποιήθηκαν για την αποστείρωση ευαίσθητων υγρών υλικών που δεν αποστειρώνονται είναι της εταιρείας Millipore (USA). Τυχόν πιο εξειδικευμένα όργανα θα αναφερθούν κατά την περιγραφή της μεθοδολογίας στα επόμενα κεφάλαια. Όλοι οι χώροι, τα όργανα και οι συσκευές που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος». 60

62 B.2. Φυτικό υλικό και πειραματικός σχεδιασμός Β.2.1. Φυτικό υλικό και συνθήκες ανάπτυξης Το πειραματικό υλικό αποτελούν πρωτογενή φύλλα από σπόρους κόκκινου φασολιού (Phaseolus vulgaris L., cv. Red Kidney). Οι σπόροι φασολιού αναπτύχθηκαν στο σκοτάδι για 7 ημέρες, σε διαβρεγμένο περλίτη, υπό συνθήκες σταθερής θερμοκρασίας (22 ο C) και υγρασίας (80%), ενώ ποτίζονταν με νερό κάθε δύο ημέρες. Με την ανάπτυξη των φυτών σε απόλυτο σκοτάδι πετυχαίνουμε αφενός μεν την ταχύτερη απόκτηση πειραματικού υλικού (τα φυτά απουσία φωτός ψηλώνουν ταχύτατα), αφετέρου δε, διαπιστώνουμε ξεκάθαρα τις επιδράσεις του φωτός, με την μετέπειτα εφαρμογή φωτισμού στα ωχρωτικά φυτά. Πριν την έκθεση των φυταρίων στο φως αφαιρέθηκαν τα περικάρπιά τους, για να διευκολυνθεί η ανάπτυξή τους. Ως πηγή φωτισμού χρησιμοποιήθηκαν λάμπες φθορισμού και πυρακτώσεως. Η ένταση του φωτισμού ήταν 35 με/m 2 s. Για την πραγματοποίηση των πειραμάτων μελέτης του επανασυγχρονισμού του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού από το φως, τα φυτά εκτέθηκαν την 8 η ημέρα σε φως, σε διάφορες συνθήκες, ως εξής: α) συνεχές λευκό φως, β) φωτοπερίοδος με ίση αναλογία ημέρας-νύχτας (LD 12:12) και γ) φωτοπερίοδος με μικρή αναλογία ημέραςνύχτας (LD 6:18). Η συλλογή των δειγμάτων (πρωτογενή φύλλα από ~10 φυτά για κάθε δείγμα) πραγματοποιούταν ανά τακτά χρονικά διαστήματα και συγκεκριμένα στις χρονικές στιγμές που αναγράφονται στα διαγράμματα (βλ. ενότ. Γ.1). Τα δείγματα καταψύχονταν επί τόπου, πρώτα σε υγρό άζωτο (Ν 2 ) και στη συνέχεια στους -80 o C, μέχρι την απομόνωση του ολικού RNA από αυτά. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν, ανεξάρτητα μεταξύ τους, από δύο μέχρι πέντε φορές. Για τα πειράματα απομόνωσης πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, τα φυτά αναπτύχθηκαν τις πρώτες 7 ημέρες στις προαναφερθείσες συνθήκες και την όγδοη ημέρα μεταφέρθηκαν σε φωτοπερίοδο με ίση αναλογία ημέρας-νύχτας (12:12) όπου παρέμειναν, για περίπου 7 ημέρες, μέχρι την απομόνωση των πρωτοπλαστών. Β.2.2. Εφαρμογή φωτός κατά τη διάρκεια της νύχτας («Τεχνητό Ξημέρωμα») Για την εφαρμογή του «τεχνητού ξημερώματος» (AD: Artificial Dawn), φυτά που είχαν αναπτυχθεί σε φωτοπερίοδο με μικρή αναλογία ημέρας-νύχτας (6:18), 61

63 εκτέθηκαν σε φως τις χρονικές στιγμές AD57, AD60 και AD68 που αντιστοιχούν στις συνολικές ώρες έκθεσης σε φωτοπερίοδο 6:18. Έτσι, το ξημέρωμα αντιστοιχεί στις χρονικές στιγμές 0, 24, 48, 72 και 96 και η δύση 6 ώρες αργότερα, δηλαδή στις χρονικές στιγμές 6, 30, 54, 78 και 102, αντίστοιχα. Επομένως, τα AD57 και AD60 εφαρμόστηκαν τρεις και έξι ώρες, αντίστοιχα, μετά τη «δύση» του τρίτου 24ώρου σε φωτοπερίοδο, ενώ το AD68 εφαρμόστηκε τέσσερις ώρες πριν από το «ξημέρωμα» του τέταρτου 24-ώρου σε φωτοπερίοδο (βλ. Εικ. Γ.4). Μετά την εφαρμογή του AD, τα φυτά διατηρήθηκαν υπό συνεχή φωτισμό μέχρι το τέλος της συλλογής των δειγμάτων. Η συλλογή των δειγμάτων AD και των δειγμάτων του ρυθμού της φωτοπεριόδου μικρής αναλογίας ημέρας-νύχτας (6:18) πραγματοποιήθηκε ταυτόχρονα στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Β.2.3. Χορήγηση ουσιών σε ολόκληρα φύλλα φασολιού Για τα πειράματα του ελέγχου της επίδρασης της χορήγησης ουσιών στους ρυθμούς γονιδίων του ρολογιού σε ολόκληρα φύλλα φασολιού, τα φυτά αναπτύχθηκαν στο σκοτάδι, όπως αναφέρθηκε, για 7 ημέρες. Στη συνέχεια, τα πρωτογενή φύλλα μαζί με τη μία κοτυληδόνα κόπηκαν και τοποθετήθηκαν σε διάφανα κουτιά πάνω σε χαρτί διαβρεγμένο με νερό και μεταφέρθηκαν σε φωτοπερίοδο μικρής αναλογίας ημέρας-νύχτας (LD 6:18). Τη χρονική στιγμή 57 τοποθετήθηκαν σε διάφανα τρυβλία πάνω σε διηθητικό χαρτί, διαβρεγμένο με TSA (trichostatin A, 40 μμ) ή NAM (nicotinamide, 1 Μ). Σε όλες τις περιπτώσεις διατηρήθηκαν δείγματα μάρτυρες (control), τα οποία είχαν υποστεί παρόμοιους χειρισμούς, με τη διαφορά ότι το διηθητικό χαρτί στα τρυβλία όπου τοποθετήθηκαν είχε διαβραχεί με νερό. Φύλλα συλλέχτηκαν κατά τη χρονική στιγμή χορήγησης των ουσιών, καθώς και τρεις και έξι ώρες μετά και αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C, μέχρι την απομόνωση RNA από αυτά. Β.2.4. Καταγραφή κινήσεων φύλλων φασολιού Τα φύλλα του φασολιού κινούνται από εντελώς κάθετη θέση ως προς τον βλαστό μέχρι πλήρως παράλληλη θέση. Η καταγραφή κινήσεων φύλλων φυτών φασολιού πραγματοποιήθηκε σε φασόλια (μία λεκάνη με 20 φυτά, ανά περίπτωση) που είχαν αναπτυχθεί σε φωτοπερίοδο μικρής αναλογίας ημέρας-νύχτας (6:18) καθώς 62

64 επίσης και σε φυτά στα οποία εφαρμόστηκε «τεχνητό ξημέρωμα», όπως περιγράφεται παραπάνω (ενότ. Β.2.2), παράλληλα με τη συλλογή δειγμάτων για απομόνωση RNA. Οι κινήσεις των φύλλων καταγράφηκαν για περίπου τρία 24-ωρα κάθε μία ώρα ως εξής: ως τιμή «1» θεωρούταν όταν όλα τα φύλλα ήταν «κάτω», δηλαδή στην παράλληλη προς το βλαστό θέση. Ως τιμή «3» θεωρούταν όταν όλα τα φύλλα ήταν «πάνω», δηλαδή στην κάθετη προς το βλαστό θέση και όλες οι ενδιάμεσες θέσεις καταγράφηκαν ως τιμή «2». B.3. Χειρισμός βακτηρίων και βακτηριακών καλλιεργειών B.3.1. Παρασκευή ηλεκτροδιαπερατών βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α Η παρασκευή ηλεκτροδιαπερατών βακτηριακών κυττάρων αναφέρεται στην πλήρη αφαίρεση των αλάτων του υδατικού περιβάλλοντος των βακτηρίων, ώστε να είναι δυνατός ο μετέπειτα μετασχηματισμός τους μέσω ηλεκτροδιάτρησης (electroporation). Μοναδιαία αποικία βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α μεταφέρθηκε σε πλαστικό σωλήνα τύπου Falcon, ο οποίος περιείχε 10 ml θρεπτικού διαλύματος LB (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, ph 7.0 με NaOH). Η βακτηριακή καλλιέργεια αναπτύχθηκε στους 37 ο C υπό ανάδευση στις 220 στροφές/λεπτό (rpm), για 12 ώρες. Στη συνέχεια μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας στα 600 nm (OD600) και αφέθηκε να αναπτυχθεί μέχρι να φτάσει σε OD600>2,5. Στη συνέχεια, 1 ml αυτής αναμείχθηκε με 250 ml LB (OD600=~0,02), αναπτύχθηκε στους 37 ο C υπό ανάδευση (220 rpm) μέχρι να φτάσει σε OD=0,6 και τοποθετήθηκε στον πάγο ώστε να διακοπεί ο πολλαπλασιασμός των βακτηρίων. Ακολούθως, τα κύτταρα της παραπάνω καλλιέργειας (OD=0,6) φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά (4000 X g, 4 o C) και απομακρύνθηκε το υπερκείμενο. Το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 250 ml αποστειρωμένο, κρύο dh 2 O και πραγματοποιήθηκε νέα φυγοκέντρηση για 15 λεπτά (5800 X g, 4 o C). Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 125 ml αποστειρωμένο, κρύο dh 2 O. Το εναιώρημα κυττάρων μοιράστηκε σε 4 πλαστικούς σωλήνες, οι οποίοι φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά (5800 X g, 4 o C). Αφού απομακρύνθηκε το υπερκείμενο, 30 ml αποστειρωμένο, κρύο dh 2 O προστέθηκαν σε κάθε σωλήνα επαναδιαλύοντας τα ιζήματα. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 15 λεπτά (5800 X g, 4 63

65 o C), απομάκρυνση του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος κάθε σωλήνα σε 1,25 ml αποστειρωμένο, κρύο dh 2 O. Το περιεχόμενο των σωλήνων μοιράστηκε σε 4 σωληνάκια των 1,5 ml, τα οποία φυγοκεντρήθηκαν για 15 λεπτά (6500 X g, 4 o C). Το υπερκείμενο κάθε σωλήνα απομακρύνθηκε, προστέθηκαν 250 μl 10% αποστειρωμένη γλυκερόλη ανά σωλήνα (10% γλυκερόλη σε dh 2 O, αποστειρωμένη μέσω φίλτρου 0,2 μm) και συνενώθηκαν σε σωλήνα τύπου Falcon. Το τελικό διάλυμα βακτηριακών κυττάρων μοιράστηκε σε πλαστικά σωληνάκια (50 μl/σωλήνα) πάνω στον πάγο, ψύχθηκε σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκε στους -80 ο C μέχρι τη χρήση του. B.3.2. Μετασχηματισμός βακτηρίων μέσω ηλεκτροδιάτρησης Η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) είναι η διαδικασία κατά την οποία η μεμβράνη κάποιου βακτηριακού κυττάρου που εκτίθεται σε πολύ μικρούς χρονικά (ms) παλμούς υψηλής έντασης ηλεκτρικού πεδίου, μπορεί παροδικά να αποσταθεροποιηθεί και να δημιουργήσει «μεμβρανικούς πόρους», οι οποίοι στη συνέχεια κλείνουν. Η εφαρμογή των παλμών του ηλεκτρικού πεδίου πρέπει να είναι τέτοια, ώστε η ηλεκτροδιάτρηση να μη δημιουργεί μόνιμη καταστροφή των κυττάρων. Είναι μια φυσική μέθοδος μετασχηματισμού βακτηρίων με χρήση του ηλεκτρικού πεδίου, για μεταφορά νουκλεϊνικών οξέων (π.χ. πλασμίδιο) στο ενδοκυτταρικό περιβάλλον. Το βακτηριακό στέλεχος E. coli που χρησιμοποιήθηκε ήταν το DH5α, τα κύτταρα του οποίου προηγουμένως είχαν καταστεί ηλεκτροδιαπερατά. Πριν τη χρήση τους τα βακτηριακά κύτταρα αφέθηκαν να ξεπαγώσουν για περίπου 1 λεπτό στον πάγο. Το εξωγενές DNA που εισάγεται στα βακτήρια μπορεί να είναι είτε το προϊόν αντίδρασης συνένωσης (ανασυνδυασμένο πλασμίδιο), είτε υπερελικωμένο πλασμίδιο το οποίο έχει απομονωθεί από βακτήρια. Το μείγμα πλασμιδίου (0,5-5 μl) - βακτηρίων (50 μl) μεταφέρθηκε σε ειδική κυψελίδα η οποία τοποθετήθηκε σε συσκευή ηλεκτροδιάτρησης (ECM399, BTX Harvard Apparatus, U.S.A.), μέσω της οποίας εφαρμόσθηκε στο μείγμα παλμός τάσης 1,4 kv. Στην κυψελίδα προστέθηκαν 945 μl θρεπτικού μέσου LB ή SOC (2% w/v tryptone, 0,5% w/v yeast extract, 8,56 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, 20 mm γλυκόζη, ph 7,0 με NaOH) προθερμασμένου στους 37 ο C και μετά από ελαφριά ανάδευση, το μείγμα μεταφέρθηκε σε πλαστικό σωλήνα τύπου Falcon (15 64

66 ml) και τοποθετήθηκε για μία ώρα στους 37 ο C, υπό ανάδευση στις 180 rpm. Στη συνέχεια, επιστρώθηκε (από 100 μl μέχρι ολόκληρο, μετά από φυγοκέντρηση και επαναιώρηση σε 100 μl υπερκειμένου) σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB-άγαρ (15 g/l) που περιείχε κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής (π.χ. αμπικιλλίνη, 100 μg/ml) για την επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων. Το τρυβλίο επωάστηκε για 16 τουλάχιστον ώρες στους 37 ο C, μέχρι που βακτηριακές αποικίες του E. coli έγιναν εμφανείς στην επιφάνεια του τρυβλίου. Το πλασμίδιο που εισήχθη στα βακτηριακά κύτταρα μέσω της ηλεκτροδιάτρησης, φέρει γονίδιο ανθεκτικότητας σε κάποιο προκαρυωτικό αντιβιοτικό (π.χ. αμπικιλλίνη). Με αυτόν τον τρόπο, όσα βακτήρια έχουν μετασχηματιστεί από το πλασμίδιο αυτό επιβιώνουν στο θρεπτικό μέσο παρουσία του αντιβιοτικού, ενώ όσα δεν το έχουν προσλάβει πεθαίνουν, επιτρέποντας έτσι την επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων. Τα βακτήρια που επιβιώνουν σχηματίζουν μοναδιαίες αποικίες, καθεμία από τις οποίες προέρχεται από ένα αρχικό βακτηριακό κύτταρο. B.3.3. Παρασκευή δεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α για χημικό μετασχηματισμό (μέθοδος Inoue) Μοναδιαία αποικία βακτηριακών κυττάρων E. coli DH5α μεταφέρθηκε σε κωνική φιάλη των 250 ml, η οποία περιείχε 25 ml θρεπτικού διαλύματος LB και επωάστηκε για 6-8 ώρες στους 37 ο C στις 220 rpm. Από την παραπάνω βακτηριακή καλλιέργεια εμβολιάστηκαν 8, 4 και 2 ml αντίστοιχα σε τρεις φιάλες του ενός λίτρου που περιείχαν 250 ml SOB (2% w/v tryptone, 0,5% w/v yeast extract, 8,56 mm NaCl, 2,5 mm KCl, 10 mm MgCl 2, ph 7,0 με NaOH) η καθεμία. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 22 o C για περίπου ώρες, στις 130 rpm. Στη συνέχεια μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 600 nm των καλλιεργειών (OD600). Όποια από τις 3 καλλιέργειες έφτασε σε OD600=0,55 μεταφέρθηκε σε λουτρό πάγου-νερού όπου ψύχθηκε για 10 λεπτά. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στα 2500 X g για 10 λεπτά στους 4 C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 80 ml παγωμένου ρυθμιστικού διαλύματος Inoue (55 mm MnCl 2.4H 2 O, 15 mm CaCl 2.2H 2 O, 10 mm KCl, 10 mm PIPES ph 6.7). Η φυγοκέντρηση και η απομάκρυνση του υπερκειμένου επαναλήφθηκαν και το ίζημα των κυττάρων επαναιωρήθηκε σε 20 ml παγωμένου διαλύματος Inoue όπου προστέθηκαν 1,5 ml 65

67 DMSO. Το διάλυμα αναμίχθηκε και επωάστηκε στον πάγο για 10 λεπτά. Το τελικό εναιώρημα βακτηριακών κυττάρων μοιράστηκε σε πλαστικούς σωλήνες των 1,5 ml (50 μl/σωλήνα), τα οποία ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και διατηρήθηκαν στους -80 ο C μέχρι τη χρήση τους, μέχρι έξι μήνες μετά την παρασκευή τους. B.3.4. Χημικός μετασχηματισμός βακτηρίων (heat shock) Η μέθοδος θερμικής διέγερσης (heat shock) στηρίζεται στην πρόσληψη πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα, τα οποία έχουν καταστεί επιδεκτικά μετά από επίδραση με ιόντα ασβεστίου. Μετά από ένα σύντομο θερμικό σοκ δημιουργούνται οπές στην κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων από όπου το DNA περνά εντός του κυττάρου. Η μέθοδος παρασκευής επιδεκτικών κυττάρων που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία (Inoue) αποτελεί παραλλαγή της κλασικής μεθόδου χημικού μετασχηματισμού με CaCl 2. Η τεχνική αυτή έχει υψηλή απόδοση μετασχηματισμού (1-3 X 10 8 /μg πλασμιδιακού DNA), συγκρίσιμη με αυτή της ηλεκτροδιάτρησης. Η διαφορά της έγκειται κυρίως στον τρόπο παρασκευής των δεκτικών βακτηρίων. Πριν τη χρήση τους τα βακτηριακά κύτταρα αφέθηκαν να ξεπαγώσουν για περίπου 1 λεπτό στον πάγο. Τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένο σωλήνα τύπου Falcon των 15 ml, στον πάγο. Προστέθηκαν έως 25 ng DNA (μέχρι 5% του όγκου των κυττάρων), αναμείχθηκαν και το μίγμα επωάστηκε στον πάγο για 30 λεπτά. Ο σωλήνας μεταφέρθηκε σε υδατόλουτρο στους 42 o C για 90 δευτερόλεπτα και αμέσως στον πάγο για 1-2 λεπτά. Προστέθηκαν 800 μl θρεπτικού υλικού SOC και επωάστηκε στους 37 C στις 180 rpm για 45 λεπτά. Στη συνέχεια, επιστρώθηκε (από 100 μl, μέχρι ολόκληρο μετά από φυγοκέντρηση και επαναιώρηση σε 100 μl υπερκειμένου) σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα LB-άγαρ που περιείχε κατάλληλο αντιβιοτικό για την επιλογή των μετασχηματισμένων βακτηρίων. Το τρυβλίο επωάστηκε για 16 ώρες στους 37 ο C, μέχρι που βακτηριακές αποικίες του E. coli έγιναν εμφανείς στην επιφάνειά του. B.3.5. Αποθήκευση βακτηριακών κλώνων (stock γλυκερόλης) Στην περίπτωση που απαιτείται η αποθήκευση αποικιών βακτηρίων για μεταγενέστερες διαδικασίες, εξασφαλίζοντας παράλληλα τη βιωσιμότητά τους, 66

68 δημιουργείται stock γλυκερόλης. Σε στείρα πλαστικά σωληνάκια (1.5-2 ml) τοποθετήθηκαν 900 μl υγρής βακτηριακής καλλιέργειας και 100 μl γλυκερόλης και αναμίχθηκαν καλά. Τα σωληνάκια ψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύθηκαν στους -80 C, όπου και διατηρούνται για τουλάχιστον ένα χρόνο. B.4. Απομόνωση και χειρισμός νουκλεϊκών οξέων B.4.1. Απομόνωση ολικού φυτικού RNA Για την απομόνωση ολικού RNA από φύλλα ή πρωτοπλάστες φασολιού χρησιμοποιήθηκε το RNA plant kit (Macherey-Nagel). Η όλη διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε συνθήκες απαλλαγμένες από RNάσες, ακολουθώντας τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας. Αρχικά, για τα δείγματα από πρωτογενή φύλλα, η συνολική ποσότητα του δείγματος λειοτριβήθηκε παρουσία υγρού αζώτου (Ν 2 ) μέχρι κονιορτοποιήσεως. Μέρος του ομογενοποιημένου δείγματος, περίπου 50 mg, μεταφέρθηκε σε 350 μl διαλύματος λύσης (RA1+ 3,5 μl β-μερκαπτοαιθανόλη). Το διάλυμα αυτό καταστρέφει την κυτταρική μεμβράνη για να απελευθερωθεί το RNA από τα κύτταρα και το προστατεύει από τη δράση RNασών. Στην περίπτωση που το δείγμα προς επεξεργασία ήταν ίζημα πρωτοπλαστών δεν πραγματοποιήθηκε λειοτρίβηση, δεδομένου ότι η διαδικασία αυτή αποσκοπεί στη θραύση των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτικών κυττάρων, τα οποία στους πρωτοπλαστάστες έχουν αφαιρεθεί κατά τη διαδικασία παρασκευής τους. Αντίθετα, προστέθηκε απευθείας διάλυμα λύσης στο ίζημα των πρωτοπλαστών. Στη συνέχεια, το μείγμα διηθήθηκε μέσα από φίλτρο. Το πέρασμα από φίλτρα και στήλες έγινε, σε κάθε περίπτωση, με φυγοκέντρηση στα X g για 1 λεπτό. Στο διήθημα προστέθηκαν 350 μl αιθανόλη (70%), για τη ρύθμιση των συνθηκών πρόσδεσης του RNA στη μεμβράνη της επόμενης στήλης. Το συνολικό μείγμα φορτώθηκε σε στήλη πρόσδεσης. Έτσι, το RNA, προσδέθηκε στη μεμβράνη (silica) της στήλης, στην οποία προστέθηκαν 350 μl διαλύματος αφαλάτωσης της μεμβράνης (MDB) κάνοντας τη διαδικασία της πέψης με DNάση πιο αποτελεσματική. Η πέψη με DNάση (ελεύθερη RNασών) πραγματοποιήθηκε φορτώνοντας στη στήλη 95 μl διαλύματος DNάσης και επωάζοντας τα δείγματα για 15 λεπτά σε θερμοκρασία 67

69 δωματίου. Με την πέψη αυτή καταστρέφεται το γενωμικό DNA που έχει προσδεθεί στη μεμβράνη της στήλης μαζί με το RNA. Ακολούθησε ξέπλυμα της μεμβράνης από την DNάση (RA2, διάλυμα απενεργοποίησης DNάσης) και ξεπλύματα της μεμβράνης (RA3) για τον καθαρισμό της από ξένα προς το RNA συστατικά (π.χ. πρωτεΐνες), επίσης προσδεδεμένα σε αυτή. Όταν απομακρύνθηκαν και οι χρωστικές που είχαν προσδεθεί στη μεμβράνη (χλωροφύλλες, κ.λπ.), κάτι που ήταν εμφανές αφού απομακρύνθηκε το πράσινο χρώμα, το RNA εκλούστηκε από τη στήλη φορτώνοντας σε αυτή 60 μl νερό απαλλαγμένο από RNάσες. Για την πλήρη απομάκρυνση τυχόν εναπομείναντος γενωμικού DNA στο τελικό δείγμα RNA, πραγματοποιήθηκε επιπλέον πέψη με DΝάση. Σε 45 μl από το παραπάνω δείγμα RNA προστέθηκαν 5 μl διαλύματος DNάσης, επωάζοντας στους 37 ο C για 10 λεπτά. Για την απομάκρυνση της DNάσης από το δείγμα ακολούθησε κατακρήμνιση με αιθανόλη, προσθέτοντας στο μίγμα 5 μl 3 Μ οξικό νάτριο, απαλλαγμένο από RNάσες, ph 5.2 και 125 μl απόλυτη αιθανόλη, επωάζοντας για περίπου 16 ώρες στους -20 ο C. Μετά την επώαση το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στα X g για 10 λεπτά στους 4 ο C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε, το ίζημα ξεπλύθηκε με 500 μl 70% αιθανόλη, φυγοκεντρώντας για 5 λεπτά στις ίδιες συνθήκες και απομακρύνοντας πάλι το υπερκείμενο. Το ίζημα αφέθηκε να στεγνώσει για 5-10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και τέλος επαναδιαλύθηκε σε νερό απαλλαγμένο από RNάσες, κατάλληλου όγκου ώστε να έχει την επιθυμητή συγκέντρωση RNA (περίπου μl). Τέλος, πριν την αποθήκευσή του στους -40 ο C, το RNA φωτομετρήθηκε στα 260 και 280 nm για τον προσδιορισμό της ποσότητας και της καθαρότητας του (ND- 100 spectrophotometer, Nanodrop Inc.). Το βήμα αυτό ήταν απαραίτητο για τον προσδιορισμό του απαιτούμενου όγκου του κάθε δείγματος για τις αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription, RT) που ακολούθησαν. B.4.2. Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription reaction, RT) Η αντίδραση RT χρησιμοποιείται για την παραγωγή cdna (complementary DNA) από αρχική μήτρα RNA. Tο ένζυμο της αντίστροφης μεταγραφάσης (RT, Reverse Transcriptase) χρησιμοποιεί ως εκμαγείο μόρια RNA και παρουσία εκκινητών με ελεύθερο 3 -ΟΗ άκρο, δεοξυτριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps: datp, dttp, dctp, dgtp) και Mg 2+, παράγει cdna, δηλαδή συμπληρωματικό 68

70 DNA προς το αρχικό RNA. Ως εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν τυχαία εξαμερή (random hexamers, Invitrogen), τα οποία υβριδίζουν σε διάφορα σημεία των μορίων του RNA, μετατρέποντας θεωρητικά τη συνολική ποσότητα RNA ενός δείγματος σε cdna. Για κάθε αντίδραση ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Αναμείχθηκαν 0,5 μg (από πρωτοπλάστες) - 2,5 μg (από φύλλα) ολικού RNA, 1,5 μl dntps (10 mm), 1 μl εκκινητή τυχαίων εξαμερών (100 μμ) συμπληρώνοντας νερό απαλλαγμένο από RNάσες, μέχρι τα 12,5 μl. Το μείγμα τοποθετήθηκε στους 65 ο C για 5 λεπτά για την αποδιάταξη του RNA στα σημεία που υπήρχαν βρόγχοι. Στη συνέχεια, προστέθηκαν 4 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (5 X first strand buffer: 250 mm Tris-HCl, ph 8.3 στους 25 ο C, 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2 ), 2 μl DTT (0,1 Μ) και 1 μl αναστολέας RNασών (RNase inhibitor, Invitrogen). Το μείγμα τοποθετήθηκε στους 25 ο C για 2 λεπτά, ώστε να πραγματοποιηθεί ο υβριδισμός των εκκινητών στο RNA. Ακολούθως, προστέθηκε στην αντίδραση 1 μl ένζυμου RT (Super-Script TM II Reverse Transcriptase, Invitrogen, 200 u/μl) και επωάστηκε στους 25 ο C για 10 λεπτά, στους 42 ο C για 50 λεπτά και στους 70 ο C για 15 λεπτά, σε θερμοκυκλοποιητή (icycler TM, Biorad). Το προϊόν της RT αποθηκεύτηκε στους -20 ο C, μέχρι τη χρήση του ως υπόστρωμα σε μετέπειτα αντιδράσεις PCR. B.4.3. Απομόνωση γενωμικού DNA από φύλλα φασολιού Β Απομόνωση πυρήνων Αρχικά, απομονώθηκαν πυρήνες από φύλλα φασολιού (Gilmartin and Bomler, 2002), ώστε να αποφευχθεί η παρουσία πλαστιδιακού και μιτοχονδριακού DNA στο τελικό διάλυμα DNA. Λειοτριβήθηκε φρέσκος ιστός από φύλλα φασολιού (2,5-5 g), παρουσία υγρού αζώτου. Στον ιστό, αφού αφέθηκε να ξεπαγώσει για λίγα λεπτά, προστέθηκαν ml κρύου διαλύματος NIB (Nuclei Isolation Buffer: 10 mm Tris:Cl ph 9,5, 10 mm EDTA, 100 mm KCl, 0,5 M σακχαρόζη, 4 mm σπερμιδίνη, 1 mm σπερμίνη, 0,1 % β/ο β-μερκαπτοαιθανόλη) και το μίγμα αναμίχθηκε ήπια. Το διάλυμα διηθήθηκε δύο φορές από νάιλον γάζα (διαμέτρου πόρων 79 μm) και στο διήθημα προστέθηκε 1/12 του όγκου ΝIB + 10% Triton-X 100. Μετά από ήπια ανάμιξη, το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε στα 2000 X g για 10 λεπτά στους 4 C. Το 69

71 ίζημα που προέκυψε (πυρήνες) χρησιμοποιήθηκε για απομόνωση DNA με τη μέθοδο CTAB (βλ. ενότ. Β.4.3.2). Β Μέθοδος CTAB για απομόνωση γενωμικού DNA Σε ίζημα πυρήνων (βλ. ενότ. Β.4.3.1) προστέθηκαν 4-8 ml διαλύματος απομόνωσης 2Χ CTAB (100 mm Tris-Cl, ph 8,0, 1,4 M NaCl, 20 mm EDTA, 2% CTAB, 0,2% β-μερκαπτοαιθανόλη), προθερμασμένο στους 60 C. Το μείγμα επωάστηκε στους 60 C για μία ώρα. Προστέθηκε ίσος όγκος μείγματος χλωροφορμίου:ισοαμυλικής αλκοόλης (24:1) και ακολούθησε φυγοκέντρηση στα 5000 X g για 10 λεπτά. Στην υδατική φάση προστέθηκε κρύα ισοπροπανόλη, τόση όσο τα 2/3 του όγκου της υδατικής φάσης. Μετά από ήπια ανάδευση και φυγοκέντρηση στα 4000 X g για 2 λεπτά, το ίζημα επαναδιαλύθηκε (20 λεπτά, σε θερμοκρασία δωματίου) σε 25 ml διαλύματος πλύσης (76% αιθανόλη, 10 mm NH 4 Ac). Στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα 4000 X g για 3 λεπτά, και το ίζημα, μετά από στέγνωμα σε κλίβανο ξηρού αέρα για λεπτά, επαναιωρήθηκε σε 1 ml διαλύματος επαναιώρησης (10 mm NH 4 Ac, 0,25 mm EDTA). Σε αυτό προστέθηκαν 4 μl RNaseA (10 μg/ml), επωάζοντας για 30 λεπτά στους 37 C. Το διάλυμα εκχειλίστηκε με ίσο όγκο φαινόλης:χλωροφορμίου (1:1), αναδεύτηκε ήπια και φυγοκεντρήθηκε στα 5000 X g για 10 λεπτά. Στην υδατική φάση προστέθηκε NaCl σε τελική συγκέντρωση 1 Μ και φυγοκεντρήθηκε (16000 X g, 10 λεπτά, 4 C). Στο υπερκείμενο πραγματοποιήθηκε κατακρήμνιση του DNA προσθέτοντας διπλάσιο όγκο αιθανόλης 100% και επωάζοντας στους -20 C για ~16 ώρες. Στη συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση (16000 X g, 30 λεπτά, 4 C). Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα ξεπλύθηκε με 500 μl 70% αιθανόλη. Μετά από σύντομη φυγοκέντρηση (5-10 λεπτά) στα X g στους 4 C και στέγνωμα, το ίζημα επαναδιαλύθηκε σε συνολικά μl νερό και η συγκέντρωση του DNA προσδιορίστηκε φωτομετρικά (~ 40 μg/g νωπού βάρους του αρχικού ιστού). 70

72 B.4.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA B Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (plasmid mini prep) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας ήταν απαραίτητη κυρίως για τον έλεγχο της επιτυχίας μιας διαδικασίας κλωνοποίησης. Περίπου τρεις με δέκα ευδιάκριτες και καλά αναπτυγμένες αποικίες που έχουν προκύψει μετά από μετασχηματισμό βακτηρίων, επιλέχθηκαν και μεταφέρθηκαν η κάθε μία σε ξεχωριστό σωλήνα τύπου Falcon (15 ml) που περιείχε 5 ml LB-αντιβιοτικό επιλογής. Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο επώασης στους 37 ο C υπό ανάδευση στις 220 rpm για 16 ώρες. Από τις καλλιέργειες αυτές απομονώθηκε πλασμιδιακό DNA όπως περιγράφεται παρακάτω. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε για περισσότερες από μία αποικίες, διότι υπάρχει πιθανότητα το πλασμίδιο που θα έχουν προσλάβει τα κύτταρα να μην έχει ανασυνδυαστεί επιτυχώς σε όλες τις περιπτώσεις. Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA από τις προαναφερθείσες κυτταροκαλλιέργειες πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen). Η μέθοδος χρησιμοποιεί την τεχνική της αλκαλικής λύσης (alkaline lysis) για τη λύση των βακτηριακών κυττάρων. Η απομόνωση του πλασμιδιακού DNA έγινε με χρήση στήλης με μεμβράνη πυριτίου. Οι φυγοκεντρήσεις πραγματοποιήθηκαν στα X g. Φυγοκεντρήθηκαν 1-5 ml από κάθε καλλιέργεια και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 250 μl διαλύματος το οποίο περιείχε RNάσηΑ (P1), προστέθηκαν 250 μl διαλύματος λύσης (P2) και αναμείχθηκαν με απαλούς χειρισμούς, επωάζοντας σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά και προσθέτοντας 350 μl διαλύματος για την ουδετεροποίηση του μείγματος (Ν3). Στη συνέχεια το μείγμα φυγοκεντρήθηκε για 10 λεπτά και το υπερκείμενο που περιείχε το πλασμιδιακό DNA διηθήθηκε σε στήλη συγκράτησης του DNA, φυγοκεντρώντας για 1 λεπτό. Στη στήλη φορτώθηκε διάλυμα για καθαρισμό της μεμβράνης (PB) και φυγοκεντρήθηκε. Η διαδικασία καθαρισμού επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας το διάλυμα PE και πραγματοποιήθηκε επιπλέον φυγοκέντρηση για δύο λεπτά για καλή απομάκρυνση της αιθανόλης που περιέχει το τελευταίο διάλυμα. Η στήλη τοποθετήθηκε σε πλαστικό σωλήνα των 1,5 ml και το πλασμιδιακό DNA εκλούστηκε φορτώνοντας στη στήλη 50 μl dh 2 O και φυγοκεντρώντας για 1 λεπτό. Τέλος, το προϊόν της απομόνωσης φωτομετρήθηκε για να προσδιοριστεί η ποσότητα 71

73 πλασμιδιακού DNA που απομονώθηκε (μέχρι 20 μg) και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία -20 ο C μέχρι την περαιτέρω χρήση του. B Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας (plasmid midi prep) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA σε μεσαία ή μεγάλη κλίμακα είναι απαραίτητη για τα πειράματα παροδικού μετασχηματισμού πρωτοπλαστών της παρούσας εργασίας καθώς η ποσότητα πλασμιδίου για κάθε δείγμα πρωτοπλαστών που μετασχηματίζεται κυμαίνεται μεταξύ 20 και 40 μg. Η μέθοδος αυτή ακολουθεί τη γενική λογική της μεθόδου απομόνωσης πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας που αναλύθηκε παραπάνω (ενότ. Β.3.4.1) και βασίζεται και πάλι στην αλκαλική λύση των βακτηρίων και την απομόνωση του πλασμιδιακού DNA σε στήλη πυριτίου. Στη συνέχεια θα περιγραφεί η διαδικασία της απομόνωσης πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας (plasmid midi prep), η οποία αποδίδει περίπου 400 μg πλασμιδιακού DNA. Η απομόνωση μεγάλης κλίμακας (plasmid maxi prep) ακολουθεί ακριβώς το ίδιο πρωτόκολλο με αναλογικά αυξημένους όγκους βακτηριακής καλλιέργειας και λοιπών διαλυμάτων, καταλήγοντας σε ποσότητες πλασμιδίου μέχρι 1000 μg. Τόσο για την απομόνωση μεσαίας κλίμακας όσο και για τη μεγάλης κλίμακας, χρησιμοποιήθηκε kit της εταιρείας Macherey-Nagel (NucleoBond Xtra Midi και NucleoBond Xtra Maxi, αντίστοιχα). Μοναδιαία αποικία E. coli που φέρει το πλασμίδιο προς πολλαπλασιασμό μεταφέρθηκε σε σωλήνα τύπου Falcon (των 50 ml) που περιείχε 5 ml LB με αντιβιοτικό επιλογής. Ο σωλήνας τοποθετήθηκε σε θάλαμο επώασης στους 37 ο C υπό ανάδευση στις 220 rpm για 6-8 ώρες. Στη συνέχεια, 2 ml από την παραπάνω καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό μεγαλύτερου όγκου καλλιέργειας (200 ml LB-αντιβιοτικό επιλογής) η οποία επωάστηκε για 16 ώρες στους 37 ο C υπό ανάδευση στις 220 rpm. Μετά την επώαση, τα βακτηριακά κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν (6000 X g, 20 λεπτά, 4 ο C) και το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 8 ml διαλύματος αναδιάλυσης (RES) που περιέχει και RNάσηΑ για την αποικοδόμηση του RNA. Η λύση των βακτηρίων πραγματοποιήθηκε προσθέτοντας 8 ml διαλύματος λύσης (LYS), αναδεύοντας ήπια και επωάζοντας 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το μίγμα ουδετεροποιήθηκε προσθέτοντας 8 ml διαλύματος εξουδετέρωσης (NEU). Το λύμα φυγοκεντρήθηκε (11000 X g, 20 λεπτά, 4 ο C) για απομάκρυνση των στερεών θραυσμάτων τα οποία 72

74 μετά τη φυγοκέντρηση κατακάθονται ως ίζημα. Το καθαρισμένο λύμα φορτώθηκε σε στήλη συγκράτησης του DNA, η οποία περιέχει φίλτρο συγκράτησης τυχόν στερεών υπολειμμάτων. Το φίλτρο θα πρέπει να έχει διαβραχεί, πριν το φόρτωμα του λύματος, με 12 ml διαλύματος εξισορρόπησης (EQU). Η στήλη αφέθηκε να αδειάσει με τη δύναμη της βαρύτητας και ξεπλύθηκε πρώτα με 5 ml διαλύματος EQU και, μετά την απομάκρυνση του φίλτρου, με 8 ml διαλύματος πλύσης (WASH). Στη συνέχεια, το DNA εκλούστηκε από τη στήλη με 5 ml διαλύματος έκλουσης (ELU), προθερμασμένο στους 50 ο C, το οποίο περάστηκε δύο φορές από τη στήλη. Στο διάλυμα του DNA προστέθηκαν 3,5 ml ισοπροπανόλη και φυγοκεντρήθηκε (11000 X g, 30 λεπτά, 4 ο C) ώστε να κατακρημνιστεί το DNA. Το ίζημα ξεπλύθηκε με 2 ml 70% αιθανόλης η οποία απομακρύνθηκε με 15 λεπτά φυγοκέντρηση (11000 X g, 4 ο C) και στέγνωμα του ιζήματος για τουλάχιστον 10 λεπτά στους 37 o C. Το DNA αναδιαλύθηκε σε κατάλληλο όγκο dh 2 O (περίπου μl). Τέλος, το προϊόν της απομόνωσης φωτομετρήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση πλασμιδιακού DNA που απομονώθηκε (συνήθως ~2 μg/μl). B.4.5. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Η PCR αποτελεί μία in vitro μέθοδο για την ενζυμική σύνθεση εξειδικευμένων αλληλουχιών DNA με τη χρήση δύο ολιγονουκλεοτιδίων (εκκινητές) για την αντιγραφή μίας μήτρας DNA μέσω της δράσης του ενζύμου DNA πολυμεράση. Το ζεύγος των εκκινητών σχεδιάζεται με τέτοιο τρόπο ώστε κάθε ένας να υβριδίζει σε κατάλληλη θέση στις αντίθετες αλυσίδες της μήτρας του δίκλωνου DNA, περικλείοντας την περιοχή της οποίας είναι επιθυμητή η παραγωγή μεγάλου αριθμού αντιγράφων (ενίσχυση περιοχής DNA). Ο κάθε εκκινητής επεκτεινόμενος μέσω της σύνθεσης του DNA από την DNA πολυμεράση προς την κατεύθυνση του άλλου, οδηγεί στη σύνθεση της δίκλωνης αλυσίδας. Η μέθοδος PCR βασίζεται σε μία σειρά επαναλαμβανόμενων κύκλων κάθε ένας από τους οποίους περιλαμβάνει τρία διακριτά στάδια: Στο πρώτο στάδιο, η δίκλωνη μήτρα DNA αποδιατάσσεται με θέρμανση στους ο C. Κατά το δεύτερο στάδιο, η θερμοκρασία μειώνεται σε επίπεδα που επιτρέπουν τον υβριδισμό των εκκινητών στις συμπληρωματικές θέσεις των μονόκλωνων αλυσίδων της μήτρας DNA. Τέλος, στο τρίτο στάδιο, πραγματοποιείται η σύνθεση της συμπληρωματικής αλυσίδας μέσω της δράσης του ενζύμου DNA 73

75 πολυμεράση και με τη χρήση των τεσσάρων δεοξυτριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (datp, dttp, dgtp, dctp), τα οποία περιλαμβάνονται σε περίσσεια στο μίγμα της αντίδρασης PCR. B PCR με χρήση προσαρμοστή (Adaptor mediated PCR) Η τεχνική της PCR με χρήση προσαρμοστή είναι προσαρμοσμένη από το πρωτόκολλο των Zhang και Gurr (Zhang and Gurr, 2000). Κατά τη μέθοδο αυτή, γενωμικό DNA φασολιού, κομμένο με περιοριστική ενδονουκλεάση που δίνει τυφλά άκρα, ενώνεται με τον προσαρμοστή (μικρό σε μήκος, δίκλωνο DNA, γνωστής αλληλουχίας για την οποία μπορεί να σχεδιαστεί εκκινητής PCR) με αποτέλεσμα η αντίδραση πολυμερισμού να δουλεύει με ένα πρόσθιο εκκινητή σχεδιασμένο για τον προσαρμοστή και έναν ανάστροφο από τη γνωστή αλληλουχία DNA. Στις αντιδράσεις PCR είναι πολλοί οι παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα και συχνά απαιτείται μεγάλη προσπάθεια για τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης. Αυτό είναι συχνό φαινόμενο για τις περιπτώσεις που έχουμε πολλά ανομοιογενή μόρια π.χ. γενωμικό DNA και θέλουμε με την αντίδραση να απομονώσουμε ένα επιθυμητό προϊόν. Το πρόβλημα γίνεται εντονότερο όταν ο ένας από τους δύο εκκινητές που χρησιμοποιούνται μπορεί και υβριδίζει σε όλα τα μόρια (εδώ στους προσαρμοστές) και η διάκριση γίνεται μόνο με τον ειδικό για το γονίδιο εκκινητή. Οι αντιδράσεις PCR που πραγματοποιήθηκαν ακολουθούν το γενικότερο παρακάτω σχήμα. Γενικά, στις πρώτες PCR χρησιμοποιήθηκαν οι εξωτερικοί εκκινητές και στις δεύτερες (nested PCR) οι πιο εσωτερικοί αυτών. Οι αρχικές PCR πραγματοποιήθηκαν με εκκινητές (εξωτερικό και εσωτερικό) που υβριδίζουν κοντά στο γνωστό 5 -άκρο του ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου, ανοδικά του οποίου αναμένεται να βρίσκεται ο υποκινητής του. Η συνθήκη της 1 ης PCR ήταν: Υπόστρωμα: 3 μl από τα 200 μl της αντίδρασης συνένωσης (ενότ. Β.3.9.1) Εξωτερικός εκκινητής-ειδικός για το γονίδιο: 0,6 μl (0,4 μμ) Εξωτερικός εκκινητής-ειδικός για τον προσαρμοστή (LΤdown): 0,6 μl (0,4 μμ) dntps: 0,3 μl (0,2 mm από κάθε dntp) Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (5Χ): 3μl GoTaq DNA πολυμεράση (Promega, USA, 5u/μl): μl 74

76 ddh 2 O: μέχρι τα 15 μl τελικό όγκο. Το πρωτόκολλο της 1 ης PCR ήταν: ºC, 3 λεπτά ºC, 25 δευτερόλεπτα ºC, 3 λεπτά X 6 φορές, τα βήματα ºC, 25 δευτερόλεπτα ºC, 3 λεπτά X 31 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά Στο βήμα 3 ο υβριδισμός γίνεται στους 72 ºC, ώστε να αποτραπούν μη ειδικές προσδέσεις. Γι αυτό το λόγο ο ειδικός εκκινητής σχεδιάζεται με υψηλή θερμοκρασία τήξης. Επίσης, η θερμοκρασία του βήματος 5 (Τ α ) εξαρτάται από τη θερμοκρασία τήξης (T m ) των ειδικών για το γονίδιο εκκινητών. Το ποιά θερμοκρασία χρησιμοποιήθηκε στην κάθε περίπτωση αναγράφεται αναλυτικά στον Πίνακα Β.1. Το προϊόν της 1 ης PCR αραιώθηκε 4 φορές με dh 2 O και χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα στη 2 η PCR. Η συνθήκη της 2 ης PCR ήταν: Υπόστρωμα: 1 μl (αραιωμένη 1 η PCR) Εσωτερικός εκκινητής-ειδικός για το γονίδιο: 0,6 μl (0,4 μμ) Εσωτερικός εκκινητής-ειδικός για τον προσαρμοστή (LΤdownB): 0,6 μl (0,4 μμ) dntps: 0,3 μl (0,2 mm από κάθε dntp) Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (5Χ): 3 μl GoTaq DNA πολυμεράση (Promega, USA, 5 u/μl): μl ddh 2 O: μέχρι τα 15 μl τελικό όγκο. Το πρωτόκολλο της 2 ης PCR ήταν: ºC, 3 λεπτά ºC, 25 δευτερόλεπτα ºC, 3 λεπτά X 4 φορές, τα βήματα ºC, 25 δευτερόλεπτα ºC, 3 λεπτά X 19 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά 75

77 Η θερμοκρασία του βήματος 5 (Τ α ) που χρησιμοποιήθηκε στην κάθε περίπτωση αναγράφεται αναλυτικά στον Πίνακα Β.1. Τα προϊόντα των 2 ων PCR ηλεκτροφορήθηκαν (ενότ. Β.3.6). Στις περιπτώσεις που το αποτέλεσμα ήταν κάποια σχετικά καθαρή ζώνη επαρκώς μεγάλου μεγέθους (>300 bp), τότε η ζώνη αυτή εξήχθη από την πηκτή αγαρόζης (ενότ. Β.3.7) και αλληλουχήθηκε (Eurofins Genomics). Νέοι εκκινητές (εξωτερικός και εσωτερικός) σχεδιάζονταν κάθε φορά κοντά στο 5 -άκρο της προκύπτουσας νέας αλληλουχίας και η διαδικασία επαναλαμβανόταν από την 1 η PCR μέχρι και την αλληλούχηση του νέου τμήματος DNA. Με τον τρόπο αυτό, έγινε γνωστό, τμηματικά, μεγάλο μέρος της αλληλουχίας των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 (2285 bp της ανάρρους περιοχής), PvLHY (1955 bp της ανάρρους περιοχής) και PvELF4 (502 bp της ανάρρους περιοχής). 76

78 Πίνακας B.1. Χαρακτηριστικά εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των «υποκινητών» των γονιδίων PvTOC1, PvLHY και PvELF4. Εκκινητής T m ( o C) Θέση Υβριδισμού (*) Θερμοκρασία Υβριδισμού (Τ α, o C) Αλληλουχία (5 3 ) Ειδικοί προς τον προσαρμοστή (πρόσθιοι) Εξωτερικός LTdown GTAATACGACTCACTATAGGGC Εσωτερικός LTdownB ACTATAGGGCACGCGTGGT Ειδικοί προς το γονίδιο PvTOC1 (ανάστροφοι) Εξωτερικός TOCex1R CACCTTACTTCTATCAATGAACCCA Εσωτερικός TOCex1R CTTCTATCAATGAACCCATCACCAC Εξωτερικός PvTOCup-608R 60, AGCGAAGCATGGTAACCTCAG Εσωτερικός PvTOCup-591R 61, TCAGGTTTGTGTGTTTTGGGAG Εξωτερικός PvTOCup-533R 61, GGTTGGGTTAAGGGAGAGGC Εσωτερικός PvTOCup-37R ATTTTTACTATGGATTAAGATAT Εξωτερικός PvTOC1171R1 47, ACATTTTACCTATTATGAGATT Εσωτερικός PvTOC1171R ATTACACCATACTTAGTATGT Εξωτερικός Εσωτερικός TOCUP-1162R TOCUP-1344R Εξωτερικός TOCUP-1465 Εσωτερικός TOCUP-1477 Ειδικοί προς το γονίδιο PvLHY (ανάστροφοι) Εξωτερικός Mikerev1 Εσωτερικός Mikerev2 Εξωτερικός Εσωτερικός Mikerev3 Mikerev4 Εξωτερικός promlhy-555r Εσωτερικός promlhy-559r Εξωτερικός LHY-767R Εσωτερικός LHY-773R Εξωτερικός PvLHYup-883R Εσωτερικός PvLHYup-990R Εξωτερικός LHYup-1165R Εσωτερικός LHYup-1408R Ειδικοί προς το γονίδιο PvELF4 (ανάστροφοι) Εξωτερικός PvELF4+23R Εσωτερικός PvELF4+9R Εξωτερικός Εσωτερικός PvELF4-12R PvLF4-87R 57,5 57,6 60,4 59,2 68,4 58,9 57,6 61,6 60,4 61,8 58,6 60,4 63,5 63,5 60,2 59,6 60,1 61,1 59,3 59, TTTAATGAATACGTTAACCTAATTATGT CGTCTCTTTTTTAAGATTTATTTTTC GCAACTTGACATCTCAAATAACGA TCAAATAACGACAATTATCTATCATCA GCCATGCTCGCCCGTGCAGTT CTCCTCCTCTGTCCATCGTTC TCAAGACTCAACCGAGTGAGAG GAACTCGACAGCGCCAAAACC TTCCTGCTGTTTGGTTGCC TGCTGTTTGGTTGCCGAGA AAACGAATACCTCGGAACGA ATACCTCGGAACGAAACCATG TTCAAATCGCAAACCGAAAAAG ACAGCACACTCACCCCGAAAG TGCTGATGCTTACACCTTTGC TTTTATCTCGCTGGAATCTCATC AAAGGAAGAAACCATGAGTGGC TGAGTGGCTTTATTTGGAAGGG GAAACACAGAGACGACTCAACCA TATATACACACCACTGCAAGGGC (*) Ως 1 ορίζεται η Αδενίνη (Α) του κωδικονίου έναρξης (ATG) του Ανοικτού Πλαισίου Ανάγνωσης (Open Reading Frame, ORF) του γονιδίου 77

79 B PCR για ενίσχυση τμημάτων των υποκινητών Τα τμήματα υποκινητών ανοδικά του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης, ORF, γονιδίων ενισχύθηκαν μέσω PCR χρησιμοποιώντας την DNA πολυμεράση Phusion (New England Biolabs, ΝΕΒ) η οποία έχει χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης λάθους από της απλές Taq πολυμεράσες. Τα προϊόντα όμως που προκύπτουν από τη δράση της έχουν τα 5 άκρα των εκκινητών από τα οποία λείπει η φωσφορική ομάδα και είναι τυφλά, καθώς οι πολυμεράσες αυτού του τύπου δεν προσθέτουν da στα 3 άκρα σε αντίθεση με τις Taq πολυμεράσες. Ως εκ τούτου οι εκκινητές είχαν φωσφορυλιωμένα (P)-άκρα που επιτρέπουν στο προϊόν PCR που προκύπτει να συμμετάσχει σε μετέπειτα αντίδραση συνένωσης (ligation) με κατάλληλο φορέα έκφρασης. Ως εκμαγείο της PCR χρησιμοποιήθηκε γενωμικό DNA από φύλλα φασολιού (βλ. ενότ. Β.4.3). Τα ζεύγη εκκινητών, καθώς και οι θερμοκρασίες υβριδισμού (Τ α ) του κάθε ζεύγους φαίνονται στον Πίνακα Β.4. Οι συνθήκες της PCR ήταν: Υπόστρωμα: 50 ng γενωμικό DNA Πρόσθιος εκκινητής: 2,5 μl (0,5 μμ) Ανάστροφος εκκινητής: 2,5 μl (0,5 μμ) dntps: 1 μl (200 μm από κάθε dntp) Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (5Χ): 10μl Phusion DNA πολυμεράση (2 u/μl): 0,5 μl ddh2o: μέχρι τα 50 μl τελικό όγκο. Το πρωτόκολλο της PCR ήταν: ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 10 δευτερόλεπτα ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 1 λεπτό X 35 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά Τα προκύπτοντα προϊόντα PCR αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε πηκτή αγαρόζης και εξήχθησαν από αυτή, όπως περιγράφεται παρακάτω (ενότ. Β.3.6, Β.3.7). 78

80 Β PCR για κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση (Site Directed Mutagenesis) Η τεχνική της PCR για κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση χρησιμοποιήθηκε για την αλλαγή ανασυνδυασμένων φορέων έκφρασης με κατάλληλο τρόπο. Κατά βάση, απομακρύνθηκαν τμήματα υποκινητή, μεταλλάχτηκαν συγκεκριμένες αλληλουχίες υποκινητή, προστέθηκαν επίτοποι και απομακρύνθηκαν τμήματα ανοικτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF: Open Reading Frame) που κωδικοποιούν συγκεκριμένες δομικές περιοχές πρωτεϊνών. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε με χρήση του kit κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (Q5-SDM, E0554S, ΝΕΒ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί ως μήτρα σε αντίδραση PCR με Q5 DNA πολυμεράση ένα αρχικό πλασμίδιο στο οποίο γίνεται η μετατροπή (αφαίρεση, προσθήκη ή τροποποίηση τμήματος DNA), αντιγράφοντας τελικά όλο το πλασμίδιο. Το προϊόν της PCR υφίσταται ταυτόχρονα πέψη με DpnI που κατακερματίζει μεθυλιωμένο DNA, πρακτικά το πλασμίδιο-μήτρα χωρίς να επηρεάζει το προϊόν της PCR, φωσφορυλίωση και συνένωση των τυφλών άκρων του. Τα αντίστοιχα ζεύγη εκκινητών και οι αντίστοιχες θερμοκρασίες υβριδισμού τους (Τ α ) φαίνονται στον Πίνακα Β.4. B PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR) Η σχετική έκφραση ενός γονιδίου, αντιστοιχεί στην ποσότητα του mrna που έχει παραχθεί από το γονίδιο αυτό τη δεδομένη χρονική στιγμή της συλλογής του δείγματος. Για να γίνει μετρήσιμη αυτή η ποσότητα, το ολικό RNA του δείγματος μετατρέπεται αρχικά σε cdna, μέσω αντίστροφης μεταγραφής και στη συνέχεια πολλαπλασιάζεται, ειδικά πλέον, το cdna που αντιστοιχεί στο mrna του γονιδίου προς μελέτη, μέσω PCR με εκκινητές, ειδικούς προς το γονίδιο. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR), για την ανάλυση της σχετικής έκφρασης των γονιδίων που μας ενδιαφέρουν, σε διάφορες χρονικές στιγμές. Σε αντίθεση με την κλασική μέθοδο PCR, την ημιποσοτική, στην οποία μετριέται η ποσότητα του παραχθέντος DNA στο τέλος της αντίδρασης, στην PCR πραγματικού χρόνου η μέτρηση γίνεται στο τέλος κάθε κύκλου, χρησιμοποιώντας μία φθορίζουσα χρωστική η οποία δεσμεύεται εκλεκτικά σε δίκλωνο DNA (SYBR- 79

81 Green), οπότε μπορεί να παρακολουθηθεί η πορεία της αντίδρασης και να προσδιοριστεί η απόδοσή της, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη ακρίβεια και αξιοπιστία. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε το KAPA SYBR FAST qpcr kit (Kapa), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συνθήκη της PCR ήταν: 4 μl από το προϊόν της αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής, φορές αραιωμένο 0,4-1,2 pmoles από κάθε εκκινητή (ανάλογα με το γονίδιο που αναλύεται) 10 μl από το έτοιμο μίγμα του kit (περιέχει Taq πολυμεράση, τα τέσσερα δεοξυνουκλεοτίδια, κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα με MgCl 2 σε τελική συγκέντρωση 2,5 mm και τη φθορίζουσα χρωστική SYBR Green I) 50 nm χρωστική αναφοράς ROX (χρησιμεύει για διόρθωση των μετρήσεων του φθορισμού) ddh 2 O μέχρι τα 20 μl τελικό όγκο αντίδρασης. Το πρωτόκολλο της PCR ήταν: ºC, 3 λεπτά ºC, 3 δευτερόλεπτα ºC, 20 δευτερόλεπτα ºC, 15 δευτερόλεπτα X40 φορές, τα βήματα 2-4 Η θερμοκρασία του βήματος 3 (T α ) διαφέρει ανάλογα το γονίδιο (βλ. Πίν. Β.2). Το μηχάνημα το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την PCR πραγματικού χρόνου ήταν το MX300P (Stratagene). Για την ποσοτική έκφραση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το ελεύθερα διαθέσιμο στατιστικό πρόγραμμα DART-PCR, Version 1.0 (Peirson et al., 2003). Το πρόγραμμα αυτό, εισάγοντας τα ακατέργαστα δεδομένα του φθορισμού, υπολογίζει την αρχική συγκέντρωση του δείγματος (R 0 ). Συγκεκριμένα, στην εκθετική φάση αύξησης της αντίδρασης, καθορίζεται μία τιμή C t για κάθε δείγμα. Η τιμή αυτή εκφράζει τον αριθμό των κύκλων ενίσχυσης ο οποίος αντιστοιχεί σε μία συγκέντρωση Α, κοινή για όλα τα δείγματα. Η συγκέντρωση Α, αντιστοιχεί στην τιμή του φθορισμού που ορίζεται αυτόματα από το πρόγραμμα ως το μέσο της εκθετικής φάσης ενίσχυσης όλων των δειγμάτων, λαμβάνοντας υπ όψη ότι ο φθορισμός είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του DNA. Εφαρμόζοντας τον τύπο: A = R 0 X 2 Ct, το πρόγραμμα υπολογίζει το R 0 για κάθε ένα δείγμα. 80

82 Πίνακας B.2. Χαρακτηριστικά των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR πραγματικού χρόνου, για την ανάλυση της έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων του φασολιού. Γονίδιο PvTOC1 PvELF4 PvLHY PvRVE8.PvLHCB2 PvTOC1 5 UTR συνθάση ATP-άσης β-ακτίνη Αλληλουχία (5 3 ) Πρόσθιος ATGAGGTATCCGTTGTTGTTAAG Ανάστροφος TGTTTGTATTGGCATCACTGG Πρόσθιος CAGCAGGTGAACGAGAAC Ανάστροφος AAAGGAAGAAACCATGAGTG Πρόσθιος TCCTTGTATCCACTCCTTGTC Ανάστροφος CTCCTCTGTCCATCGTTCC Πρόσθιος GGGTTTGCCGCATGGGATG Ανάστροφος GTGCTGTTGGTAATCTGTGTTGTC Πρόσθιος CGTCAAGAGTGCTCCTCAG Ανάστροφος TCCCATCCGTAGTCACCAG Πρόσθιος GGTCTTGTTCAGTTCCCTTAGC Ανάστροφος CCGCACCTTACTTCTATCAATG Πρόσθιος GCCCTCCCTTCCAAACTCAC Ανάστροφος AGGACACCAGGTTTCAACTCAG Πρόσθιος GCTGTGCTTTCCCTTTAC Ανάστροφος TTCCTGCTCGTAATCAAG T a ( ο C) Για την κανονικοποίηση των διαφορών που προκύπτουν από τους χειρισμούς ανάμεσα στα διαφορετικά δείγματα, χρησιμοποιούνται γονίδια αναφοράς, των οποίων η έκφραση θεωρείται ότι παραμένει σταθερή κατά τη διάρκεια του πειράματος (ιδιοσύστατα γονίδια, housekeeping genes). Έτσι, οι διαφορές στη σχετική έκφραση του γονιδίου προς μελέτη ανάμεσα στα διαφορετικά δείγματα, εκφράζονται ως διαφορές των λόγων της έκφρασης του γονιδίου αυτού προς την έκφραση του γονιδίου αναφοράς. Στην παρούσα εργασία, για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της β-ακτίνης του φασολιού (H ) στα δείγματα από ολόκληρα φύλλα και το γονίδιο της ATPase synthase του φασολιού (delta' chain, mitochondrial precursor, EG563015) στα δείγματα από πρωτοπλάστες φύλλων του φυτού. Το κάθε δείγμα αναλύθηκε εις διπλούν ή τριπλούν, για μεγαλύτερη ακρίβεια και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές. Για τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων υπολογίστηκε η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση για κάθε δείγμα και εφαρμόστηκε το Student s t-test για να προσδιοριστούν στατιστικώς σημαντικές διαφορές μεταξύ των δειγμάτων. Στα προς σύγκριση δείγματα, όπου η διαφορά ήταν στατιστικώς σημαντική (p>0.05) αυτό σημειώνεται με * στα αντίστοιχα διαγράμματα (βλ. ενότ. Γ.). 81

83 B.4.6. Ηλεκτροφορητική ανάλυση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιείται για την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων και για τον προσδιορισμό των μεγεθών τους, καθώς και για τον έλεγχο της ποιότητάς τους (καθαρότητα, πιθανή αποικοδόμηση κ.λπ.). Η μέθοδος της ηλεκτροφόρησης αποτελεί μια ηλεκτροχημική διαδικασία, η οποία προκαλεί διαχωρισμό ηλεκτρικά φορτισμένων σωματιδίων από ένα μίγμα τους. Κατά τη διαδικασία αυτή τα κομμάτια του DNA αναλύονται σε πηκτή αγαρόζης κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Τα τμήματα του DNA, εξαιτίας των φωσφορικών ομάδων που φέρουν, έχουν αρνητικό φορτίο και κάτω από την επίδραση του ηλεκτρικού πεδίου κινούνται από τον αρνητικό προς το θετικό πόλο, με ταχύτητα που αυξάνει όσο μικραίνει το μέγεθος του μορίου. Ένα κυκλικό μόριο DNA που είναι χαλαρό (relaxed) ή φέρει εγκοπή στη μία αλυσίδα (nicked) μετακινείται βραδύτερα από ένα γραμμικό μόριο ίσης μάζας. Επίσης, τα υπερσυσπειρωμένα μόρια DNA, επειδή είναι συμπαγή μετακινούνται ταχύτερα στην ηλεκτροφόρηση απ ότι τα λιγότερο συσπειρωμένα. Σημαντικό πλεονέκτημα της ηλεκτροφόρησης αποτελεί η διατήρηση των βιολογικών ιδιοτήτων των δειγμάτων, γεγονός που εξασφαλίζει την επαναχρησιμοποίηση τους. Το μέγεθος των τμημάτων DNA (π.χ. προϊόντα PCR, προϊόντα πέψης) μπορεί να εκτιμηθεί κατά προσέγγιση από την απόσταση που διήνυσε κατά μήκος της πηκτής σε σύγκριση με την απόσταση που διανύουν τμήματα DNA γνωστού μεγέθους κατάλληλου δείκτη (molecular size marker). Οι δείκτες DNA που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν: γενωμικό DNA του φάγου λάμδα κομμένο με περιοριστική ενδονουκλεάση BstEII, γενωμικό DNA του φάγου φx174 κομμένο με περιοριστική ενδονουκλεάση HaeIII, 1 kb DNA ladder (#N3232, NEB) και 2Log DNA Ladder (#N3200, NEB). Η οπτικοποίηση της ηλεκτροφόρησης γίνεται μέσω χρώσης της πηκτής αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο. Το βρωμιούχο αιθίδιο δεσμεύεται εκλεκτικά μεταξύ επαλλήλων βάσεων του DNA. Όταν η πηκτή εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) το βρωμιούχο αιθίδιο φθορίζει έντονα, αποδίδοντας μία ακτινοβολία πορτοκαλί χρώματος, κάνοντας έτσι το DNA ορατό. Αρχικά, παρασκευάστηκε το πήκτωμα αγαρόζης (0,8-1,5 % ανάλογα το μέγεθος των προς διαχωρισμό τμημάτων DNA) σε διάλυμα ΤAE (40 mm Tris, ph 7.6, 20 mm οξικό οξύ, 1 mm EDTA) θερμαίνοντας μέχρι βρασμού, προσθέτοντας 0,2-0,5 μg/ml βρωμιούχο αιθίδιο και τοποθετώντας το μίγμα σε κατάλληλο δοχείο 82

84 ηλεκτροφόρησης με χτένα που δημιουργεί τα πηγαδάκια στα οποία φορτώνονται τα δείγματα. Το πήκτωμα σταθεροποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου και η χτένα απομακρύνθηκε. Το δοχείο μεταφέρθηκε στη συσκευή ηλεκτροφόρησης, στην οποία είχε προστεθεί διάλυμα ΤΑΕ ώστε να καλύπτει πλήρως το πήκτωμα. Στα δείγματα DNA προστέθηκε διάλυμα φορτώματος σε τελική συγκέντρωση 1X (6X: 0.25% bromophenol blue, 30% glycerol) και τοποθετήθηκαν στις θέσεις που είχαν σχηματιστεί με τη βοήθεια της χτένας. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε παρουσία συνεχούς τάσης Volt για λεπτά, ανάλογα με τις ανάγκες του πειράματος, το πάχος και την περιεκτικότητα του πηκτώματος και τα χαρακτηριστικά της συσκευής. Οι διαχωρισμένες πλέον ζώνες του DNA παρατηρήθηκαν κάτω από λάμπα υπεριώδους ακτινοβολίας και φωτογραφήθηκαν. Η ίδια ακριβώς τεχνική χρησιμοποιήθηκε και για την ανάλυση των δειγμάτων RNA μετά την απομόνωσή τους, κυρίως για τον έλεγχο της καθαρότητας και για ενδείξεις αποικοδόμησής τους. B.4.7. Καθαρισμός προϊόντων PCR και εξαγωγή προϊόντων PCR από πήκτωμα αγαρόζης (PCR clean up, DNA gel extraction) Σκοπός του καθαρισμού προϊόντων PCR αποτελεί η απομάκρυνση τυχόν ανεπιθύμητων υπολειμμάτων από το δείγμα όπως ένζυμα, άλατα, RNA και εκκινητές. Τα συγκεκριμένα προϊόντα μπορεί να παρεμβαίνουν αρνητικά στη χρήση του δείγματος DNA σε μεταγενέστερες διαδικασίες. Στη συγκεκριμένη εργασία έγινε χρήση του kit NucleoSpin Gel and PCR clean-up, (Macherey-Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες της κατασκευάστριας εταιρίας. Οι ίδιες στήλες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για τον καθαρισμό DNA που έχει προκύψει από άλλες ενζυμικές διαδικασίες (π.χ. πέψη). Αναμίχθηκε ένας όγκος δείγματος και δύο όγκοι ρυθμιστικού διαλύματος NTI για τη ρύθμιση των συνθηκών δέσμευσης του DNA. Το μίγμα φορτώθηκε στη στήλη συλλογής, NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Column. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα X g, απόρριψη του υγρού από τη στήλη συλλογής και πλύση της στήλης με 500 μl διάλυμα ΝΤ3 για δύο φορές. Η μεμβράνη στεγνώθηκε φυγοκεντρώντας τη στήλη για 1 λεπτό στα X g για να απομακρυνθεί πλήρως το διάλυμα NT3. Η έκλουση του καθαρισμένου δείγματος DNA πραγματοποιήθηκε τοποθετώντας τη στήλη σε ένα σωλήνα των 1,5 ml όπου προστέθηκαν μl 83

85 διάλυμα NE και φυγοκεντρώντας στα X g για 1 λεπτό. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε και για την εξαγωγή προϊόντος PCR από πηκτή αγαρόζης με μόνη διαφορά τη θέρμανση του αρχικού μίγματος του πηκτώματος αγαρόζης που εμπεριέχει το DNA και του διαλύματος ΝΤ1 στους 50 ο C για 10 λεπτά. B.4.8. Πέψη DNA Η πέψη είναι μια διαδικασία που χρησιμοποιείται για τη διάσπαση μορίων DNA σε συγκεκριμένες θέσεις με τη χρήση των ενζύμων περιορισμού και συγκεκριμένα των περιοριστικών ενδονουκλεασών. Τα ένζυμα αυτά έχουν τη δυνατότητα να αναγνωρίζουν και να κόβουν ειδικές αλληλουχίες 4 έως 8 ζευγών βάσεων ανεστραμμένης επανάληψης (παλίνδρομα) σε δίκλωνο DNA. Τα προϊόντα της πέψης του DNA έχουν είτε «τυφλά» άκρα είτε 5' ή 3' «κολλώδη» άκρα. Η διαδικασία της πέψης DNA χρησιμοποιήθηκε εκτενώς, στην παρούσα εργασία, κατά τη δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων-φορέων κλωνοποίησης ή έκφρασης (κλωνοποίηση). Κάθε περίπτωση κλωνοποίησης είχε εξειδικευμένες συνθήκες, οι οποίες περιγράφονται παρακάτω (ενότ. Β.6). Μια γενική, όμως, αντίδραση πέψης DNA έχει ως εξής: Σε πλαστικό σωλήνα προστίθενται 1 μg DNA, κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης σε συγκέντρωση 1X, 1-10 U ενζύμου και dh 2 O, σε τελικό όγκο 20 μl. Το διάλυμα επωάζεται για μία ώρα, συνήθως στους 37 o C. Στην περίπτωση ταυτόχρονης πέψης με δύο περιοριστικές ενδονουκλεάσες (διπλή πέψη), πρέπει να δίνεται προσοχή στη σύσταση του ρυθμιστικού διαλύματος και στη θερμοκρασία επώασης, καθώς οι βέλτιστες συνθήκες δράσης του κάθε ενζύμου ενδέχεται να διαφέρουν. Β Πέψη γενωμικού DNA για τη δημιουργία μήτρας DNA για τις PCR με χρήση προσαρμοστή Η διαδικασία της πέψης DNA εφαρμόστηκε, επίσης, για τη δημιουργία της μήτρας DNA για τις PCR με χρήση προσαρμοστή, με ένζυμα που αφήνουν «τυφλά» άκρα. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες: DraI, EcoRV, HaeIII, HincII, PvuII, ScaI, SmaI και SspI. Σε κάθε περίπτωση, κόπηκαν 5 μg γενωμικού DNA (ενότ. B.3.3), με 50 u από κάθε ένζυμο και 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10X) σε τελικό όγκο 50 μl (37 ο C, ~16 ώρες, εκτός του 84

86 SmaI: 30 ο C, ~16 ώρες). Ακολούθησε καθαρισμός των πέψεων μέσω εκχύλισης με ίσο όγκο φαινόλη:χλωροφόρμιο (1:1) και κατακρήμνισης με αιθανόλη. Το τελικό ίζημα επαναδιαλύθηκε σε 20 μl νερό και προσδιορίστηκε φωτομετρικά η συγκέντρωση του DNA ( ng/μl). B.4.9. Συνένωση τμημάτων DNA (Ligation) Πρόκειται για τη διαδικασία κατά την οποία το ένζυμο Τ4 DNA λιγάση ενώνει τα άκρα τμημάτων DNA. Κατά την αντίδραση συνένωσης, δημιουργείται φωσφοδιεστερικός δεσμός μεταξύ του 5 -φωσφορικού άκρου του ενός τμήματος DNA και του 3 -υδροξυλίου του άκρου του άλλου τμήματος. Η δράση της Τ4 DNA λιγάσης εξαρτάται από το ATP και έχει τη δυνατότητα να αναγνωρίζει κολλώδη ή «τυφλά» άκρα τμημάτων DNA, ενώνοντάς τα in vitro. Δημιουργείται, έτσι, ένα χιμαιρικό μόριο DNA με τις ιδιότητες και των δύο αρχικών τμημάτων. Η πιο συνηθισμένη περίπτωση χρήσης της ligation είναι στη δημιουργία ανασυνδυασμένων πλασμιδίων-φορέων κλωνοποίησης ή έκφρασης (κλωνοποίηση). Κάθε περίπτωση κλωνοποίησης, στην παρούσα εργασία, είχε εξειδικευμένες συνθήκες, οι οποίες περιγράφονται αναλυτικά στο εν λόγω κεφάλαιο (ενότ. Β.6). Μια γενική αντίδραση συνένωσης τμημάτων DNA έχει ως εξής: Σε πλαστικό σωλήνα προστίθενται συνολικά περίπου 100 ng DNA, ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης σε συγκέντρωση 1X, 1-5 U ενζύμου T4 DNA λιγάση και dh 2 O σε τελικό όγκο 20 μl. Το διάλυμα επωάζεται στους 22 o C για λεπτά. Για το χημικό μετασχηματισμό βακτηρίων (ενότ. Β.2.4), χρησιμοποιούνται 5 μl από την αντίδραση συνένωσης, ενώ στην περίπτωση της ηλεκτροδιάτρησης βακτηρίων (ενότ. Β.2.2), χρειάζονται 1-2 μl της αντίδρασης. Β Συνένωση τμημάτων DNA για τη δημιουργία μήτρας DNA για τις PCR με χρήση προσαρμοστή Για την κατασκευή της μήτρας DNA που χρησιμοποιήθηκε για τις PCR με χρήση προσαρμοστή, αρχικά παρασκευάστηκαν τα μόρια των προσαρμοστών. Οι προσαρμοστές που χρησιμοποιήθηκαν προκύπτουν από τον υβριδισμό των ολιγονουκλεοτιδίων AD1 και AD2, τα οποία είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους και μη πλήρως επικαλυπτόμενα: 85

87 ΑD1 : 3 GCACCACCGG 5 AD2: 5 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTGGCC 3 Ο υβριδισμός των ολιγονουκλεοτιδίων πραγματοποιήθηκε αναμιγνύοντας 1 nmol AD1 και 1 nmol AD2 σε τελικό όγκο 40 μl και θέρμανση στους 92 ºC για 2 λεπτά. Το μείγμα αφέθηκε μέχρι η θερμοκρασία να πέσει σε θερμοκρασία δωματίου και μετά τοποθετήθηκε στον πάγο. Οι προσαρμοστές που προέκυψαν από την παραπάνω διαδικασία συνενώθηκαν με το κομμένο DNA, μέσω αντίδρασης συνένωσης (ligation) στα τυφλά άκρα. Για κάθε περίπτωση πέψης, 1,5 μg κομμένου και καθαρισμένου DNA αναμείχθηκαν με 6 μl από την αντίδραση υβριδισμού των προσαρμοστών. Σε αυτά προστέθηκαν 2,5 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10Χ) και 1 μl T4 DNA λιγάση (5 u/μl, Fermentas-Thermo Scientific), σε τελικό όγκο 25 μl. Η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιήθηκε στους 22 ºC για 1 ώρα. Στη συνέχεια αραιώθηκαν στα 200 μl τελικό όγκο η κάθε μία, για να χρησιμοποιηθούν ως υπόστρωμα σε αντιδράσεις PCR (ενότ. Β.3.5.1). B Αντίδραση συμπλήρωσης άκρων DNA (Klenow treatment) Μετά από πρωτεολυτική πέψη του ολοένζυμου της DNA πολυμεράσης Ι με συμπτιλυσίνη προκύπτουν δύο πολυπεπτιδικά κλάσματα. Το μεγαλύτερο κλάσμα είναι γνωστό σαν Klenow κομμάτι (αμινοξέα ) και έχει μοριακό βάρος 76 ΚD. Το κομμάτι Klenow διαθέτει 5-3 συνθετική δράση πολυμεράσης και 3-5 εξωνουκλεολυτική δράση, ενώ έχει απωλέσει την 5-3 εξωνουκλεολυτική δράση. Ως εκ τούτου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη συμπλήρωση άκρων σε κομμάτια DNA με προεξέχοντα 5 ή 3 άκρα. Συγκεκριμένα, 1 μg DNA αναμίχτηκε με 1Χ τελική συγκέντρωση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (50 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl 2, 1 mm DTT, ph 7.9 στους 25 C) 1 mm dntps και 2,5 u ενζύμου Klenow (NEB) σε τελικό όγκο 50 μl. Το μίγμα επωάστηκε στους 25 ο C για 15 λεπτά και το ένζυμο απενεργοποιήθηκε με θέρμανση στους 75 ο C για 20 λεπτά. 86

88 B.5. Πρωτοπλάστες από φύλλα φασολιού Η μεταφορά DNA σε ένα φυτικό κύτταρο είναι μια διαδικασία σημαντική για τη μελέτη της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης (π.χ. ανάλυση των ρυθμιστικών στοιχείων ενός υποκινητή). Τεχνικές για άμεση μεταφορά DNA και παροδική έκφραση παρέχουν εναλλακτική λύση στη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών όπου έχουμε σταθερό μετασχηματισμό. Αν και η δημιουργία διαγονιδιακών φυτών είναι πια εφικτή και ενίοτε εύκολη, αυτό δεν ισχύει για το φασόλι (Cadle και Jahn, 2005). Έτσι, οι πρωτοπλάστες του φασολιού αποτελούν μία καλή εναλλακτική λύση για τη μελέτη του ρολογιού στο φασόλι, χωρίς να καταφύγει κανείς σε ετερόλογο σύστημα. B.5.1. Απομόνωση πρωτοπλαστών Για την απομόνωση πρωτοπλαστών χρησιμοποιούνται μυκητιακά ένζυμα του εμπορίου π.χ. από το γένος Rhizopus που αποικοδομούν τα συστατικά του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Τα ένζυμα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η κυτταρινάση R10 (cellulase Onozuka R10, Serva) και το maceroenzyme R10 (Serva). Οι κυτταρινάσες είναι μείγμα ενζύμων που διασπούν κυρίως κυτταρίνη αλλά και ημικυτταρίνες και πηκτινικές ενώσεις. Το maceroenzyme είναι μείγμα πηκτινασών. Στους απομονωμένους πρωτοπλάστες πρέπει να αναπληρωθεί η πίεση του τοιχώματος από μια ωσμωτικά ενεργό ουσία, π.χ. μαννιτόλη (μεταβολικά ανενεργός ουσία). Το ιδανικό ωσμωτικό δυναμικό ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία του ιστού και το είδος του. Ως υλικό για την πέψη προτιμήθηκαν νεαρά πρωτογενή φύλλα φασολιού (12-15 ημερών) σε καλή υδατική κατάσταση. Από τα φύλλα αφαιρέθηκε το κεντρικό νεύρο και απομακρύνθηκε όσο το δυνατόν μεγαλύτερο μέρος της κάτω επιδερμίδας, ξεφλουδίζοντάς τη με τη βοήθεια ξυραφιού. Στη συνέχεια, τα ξεφλουδισμένα φύλλα τεμαχίστηκαν σε μικρότερα κομμάτια και τοποθετήθηκαν σε τρυβλίο με διάλυμα πέψης [1% cellulase Onozuka R10, 0,3% macerozyme R10, 0,5 M μαννιτόλη, 5 mm Mes, ph 5.7 με Tris, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2 και 0,1% Bovine Serum Albumin- BSA (20 ml για 1 g φύλλα)], με την κάτω επιφάνεια να ακουμπά το διάλυμα πέψης. Η πέψη πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες στο σκοτάδι στους 30 C. Μετά το πέρας της πέψης, ο ιστός πιέστηκε ελαφρά με μία γυάλινη ράβδο, ώστε να απελευθερωθούν πλήρως οι πρωτοπλάστες. Το διάλυμα πέψης από 87

89 υποκίτρινο καταλήγει πράσινο. Το διάλυμα διηθήθηκε από νάιλον γάζα (διαμέτρου πόρων 79 μm), η οποία είχε προηγουμένως διαβραχεί σε διάλυμα πλύσης (0,5 M μαννιτόλη, 5 mm Mes, ph 7.0 με Tris, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2 και 0,1% BSA). Το διάλυμα των πρωτοπλαστών φυγοκεντρήθηκε στα 80 X g για 5 λεπτά στους 4 o C. Στο ίζημα προστέθηκε ίσος όγκος διαλύματος πλύσης, με τον αρχικό (20 ml) και επαναιωρήθηκε αναδεύοντας ελαφρά. Η διαδικασία επαναλήφθηκε, επαναιωρώντας, αυτή τη φορά στο μισό όγκο διαλύματος πλύσης. Στο σημείο αυτό πραγματοποιήθηκε μέτρηση του αριθμού των ζωντανών πρωτοπλαστών. Η χρώση πραγματοποιήθηκε με 0,4% trypan blue (Gibco), το οποίο βάφει τα νεκρά κύτταρα, αναμιγνύοντας ίσους όγκους του διαλύματος της χρωστικής με το δείγμα των πρωτοπλαστών. Η μέτρηση του αριθμού των πρωτοπλαστών πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια αιματοκυτταρόμετρου (Neubauer, mm βάθος, mm 2 ). Η φυγοκέντρηση επαναλήφθηκε και οι πρωτοπλάστες επαναιωρήθηκαν σε κατάλληλη ποσότητα διαλύματος διατήρησης (0,5 M μαννιτόλη, 5 mm Mes, ph 7.0 με Tris, 5 mm CaCl 2 ), ώστε το τελικό διάλυμα να έχει την επιθυμητή συγκέντρωση πρωτοπλαστών (2X10 6 κύτταρα/ml για τα πειράματα μετασχηματισμoύ και 1X10 6 κύτταρα/ml για τα πειράματα ρυθμού). Στην περίπτωση των πειραμάτων ρυθμού, οι πρωτοπλάστες (1 ml/δείγμα) μεταφέρθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων επικαλυμμένα με 0,1% BSA (coating) και επεστράφησαν στο θάλαμο ανάπτυξης, στην προϋπάρχουσα φωτοπερίοδο. Για τα πειράματα επίδρασης ουσιών, 20 μm TSA ή mm ΝΑΜ χορηγήθηκαν σε συγκεκριμένες χρονικές στιγμές στα αντίστοιχα δείγματα, διατηρώντας πάντα δείγματα μάρτυρες στα οποία δεν είχε γίνει κάποιος χειρισμός. Ιζήματα πρωτοπλαστών συλλέχτηκαν σε τακτά χρονικά διαστήματα και αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C μέχρι την απομόνωση RNA από αυτά. B.5.2. Μετασχηματισμός πρωτοπλαστών Το διάλυμα πρωτοπλαστών, αμέσως μετά την απομόνωσή τους (βλ. ενότ. Β.5.1) επωάστηκε στον πάγο για περίπου μία ώρα και στη συνέχεια, για κάθε δείγμα, τοποθετήθηκαν 200 μl διαλύματος πρωτοπλαστών σε σωλήνα τύπου Falcon των 15 ml, στον οποίο προστέθηκε το DNA (μέγιστο 40 μg συνολική ποσότητα DNA, σε μέγιστο τελικό όγκο 1/10 του όγκου του διαλύματος πρωτοπλαστών, δηλ. 20 μl). Σε κάθε δείγμα, προστέθηκαν 200 μl διαλύματος PEG [40% (β/ο) PEG (MW 4000, 88

90 Serva), 0,4 Μ μαννιτόλη, 100 mm Ca(NO 3 ) 2 ] και ακολούθησε ελαφρά ανάδευση. Το μίγμα επωάστηκε για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια, αραιώθηκε σταδιακά με 3 ml διαλύματος διατήρησης. Ακολούθησε φυγοκέντρηση (100 X g, 10 λεπτά, 4 o C), επαναδιάλυση του ιζήματος σε 1 ml διαλύματος διατήρησης και μεταφορά των δειγμάτων σε τρυβλία 6 φρεατίων επικαλυμμένα με 0,1% BSA. Οι πρωτοπλάστες επωάστηκαν στους 22 o C στο σκοτάδι, για ώρες. Στα αρχικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν για την εξακρίβωση της απόδοσης της συγκεκριμένης μεθόδου μετασχηματισμού πρωτοπλαστών, το DNA που εισήχθη στους πρωτοπλάστες ήταν αποκλειστικά ο φορέας υπερέκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP, psat6-egfp (Tzfira, 2005). Η απόδοση του μετασχηματισμού αξιολογήθηκε μετρώντας το ποσοστό των μετασχηματισμένων πρωτοπλαστών (φθορίζουν πράσινο υπό UV ακτινοβολία) επί του συνόλου των κυττάρων. Η ανίχνευση του φθορισμού πραγματοποιήθηκε σε ανάστροφο μικροσκόπιο φθορισμού (Axiovet, Zeiss). B.5.3. Μέτρηση φωταύγειας από δείγματα πρωτοπλαστών Δείγματα πρωτοπλαστών ώρες μετά το μετασχηματισμό τους, συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 100 X g για 10 λεπτά στους 4 o C. Η ενεργότητα του ενζύμου της λουσιφεράσης που είναι ενδεικτική των επιπέδων έκφρασης του υποκινητή ο οποίος βρίσκεται κλωνοποιημένος πριν από αυτή (αναροϊκά), μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τρεις διαφορετικές προσεγγίσεις. Το Steady Glo Assay System (Promega, # E2510), το Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, # Ε1910) και τη μέτρηση σε ζωντανούς πρωτοπλάστες με υπόστρωμα D-luciferin (BIOSYNTH). Στην πρώτη περίπτωση, μετρήθηκε η σχετική φωταύγεια του πλασμιδίου αναφοράς που φέρει το γονίδιο της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (firefly luciferase, LUC) υπό τον έλεγχο του κάθε τμήματος υποκινητή προς μελέτη (15-30 μg ανά δείγμα), κανονικοποιώντας ως προς την απόδοση του μετασχηματισμού με τον φθορισμό του φορέα psat6-egfp (Tzfira, 2005), ο οποίος φέρει το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης EGFP υπό τον έλεγχο του υποκινητή 35S του ιού του μωσαϊκού του κουνουπιδιού CaMV (5 μg ανά δείγμα). Η τελική περιεκτικότητα DNA ρυθμίστηκε στα 35 μg συμπληρώνοντας, όπου ήταν απαραίτητο, με το φορέα λουσιφεράσης-χωρίς-υποκινητή PLpΒI (PromoterLess pbi, κενός φορέας). Το δείγμα 89

91 πρωτοπλαστών επαναιωρήθηκε σε 100 μl Phosphate Buffer Saline-PBS (1,37 M NaCl, 27 mm KCl, 100 mm Na 2 HPO 4, 18 mm KH 2 PO 4, ph 7,4) και επωάστηκε στους -80 C για μία ώρα. Μετά από μια σύντομη φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα X g, το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε τρυβλίο 96 φρεατίων (Greiner 96 flat bottom white polystyrol microplate) και μετρήθηκε αρχικά ο φθορισμός του χρησιμοποιώντας το Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd). Η φωταύγεια υπολογίστηκε στο ίδιο microplate μετά την προσθήκη 10 μl του αντιδραστηρίου Steady Glo. Η σχετική έκφραση της λουσιφεράσης προέκυψε διαιρώντας τη μέτρηση της φωταύγειας με αυτή του φθορισμού για κάθε δείγμα. Κάθε πείραμα εκτελέστηκε τουλάχιστον δύο φορές. Στη δεύτερη περίπτωση, μετρήθηκε και πάλι η σχετική φωταύγεια του πλασμιδίου αναφοράς που φέρει το γονίδιο της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο του κάθε τμήματος υποκινητή προς μελέτη, κανονικοποιώντας ως προς την απόδοση του μετασχηματισμού με τη φωταύγεια του γονιδίου της λουσιφεράσης της Renilla reniformis υπό τον έλεγχο του υποκινητή 35S CaMV (35S:Ren, 10 ng ανά δείγμα). Η συνολική περιεκτικότητα DNA του κάθε δείγματος ήταν 30 μg. Στα πειράματα αναφοράς-τελεστή (reporter-effector), 15 μg από κάθε πλασμίδιο αναφοράς συνδυάστηκαν με 15 μg είτε ενός φορέα υπερέκφρασης ή του αντίστοιχου κενού φορέα (psatev ή pbiev). Η φωταύγεια τόσο από τη λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (LUC) όσο και από τη R. reniformis (Ren) για κάθε δείγμα, μετρήθηκε διαδοχικά στο ίδιο microplate χρησιμοποιώντας το Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd) και το Dual-Luciferase Reporter Assay System της Promega. Η σχετική έκφραση της λουσιφεράσης προέκυψε διαιρώντας την μέτρηση της φωταύγειας από τη λουσιφεράση της πυγολαμπίδας (LUC) με αυτήν από τη λουσιφεράση της R. reniformis (Ren) για κάθε δείγμα. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν και κάθε πείραμα εκτελέστηκε τουλάχιστον δύο φορές. Στην περίπτωση της μέτρησης φωταύγειας σε ζωντανά κύτταρα, το δείγμα πρωτοπλαστών μετά το μετασχηματισμό, αναδιαλύθηκε σε τροποποιημένο διάλυμα διατήρησης [0,5 M μαννιτόλη, 50 mm CaCl 2, 100 μμ D-luciferin (BIOSYNTH), 50 μμ αμπικιλλίνη (Sigma-Aldrich) και 5% FBS (Fetal Bovine Serum, Merck Millipore)] σε τελικό όγκο 0,8 ml. Κάθε δείγμα διαχωρίστηκε σε 4 μέρη ( κύτταρα/200 μl/φρεάτιο) σε τρυβλίο 96 φρεατίων (Greiner 96 flat bottom white polystyrol) και μεταφέρθηκε στο ΖΤ7 (7 μετά το ξημέρωμα της φωτοπεριόδου LD 12:12) σε σταθερό κόκκινο φως (10 μεm -2 s -1 ), στους 22 C. Η μέτρηση της 90

92 φωταύγειας της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας υπό τον έλεγχο του κάθε υποκινητή προς μελέτη, σε πραγματικό χρόνο, πραγματοποιήθηκε in νίνο, ξεκινώντας από την επόμενη ημέρα μετά το μετασχηματισμό, κάθε δύο με πέντε ώρες για περίπου 30 συνολικά ώρες. Οι μετρήσεις έγιναν στο Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd) και κάθε πείραμα εκτελέστηκε δύο φορές. B.6. Ανάλυση πρωτεϊνών Η ανάλυση πρωτεϊνών ήταν απαραίτητη στην παρούσα διατριβή για την εξακρίβωση της υπερέκφρασης παραγόντων του ρολογιού σημασμένων με επιτόπους (myc ή HA, βλ. ενότ. Β.7.2) σε δείγματα πρωτοπλαστών. Ιζήματα μετασχηματισμένων πρωτοπλαστών συλλέχτηκαν ώρες μετά το μετασχηματισμό και αποθηκεύτηκαν στους -80 ο C μέχρι την εκχύλιση των πρωτεϊνών από αυτά. Οι πρωτοπλάστες είχαν μετασχηματιστεί με φορέα υπερέκφρασης σημασμένης με επίτοπο (myc ή HA) πρωτεΐνης του ρολογιού του φασολιού ή με τον αντίστοιχο κενό φορέα. Τα στάδια για την απομόνωση, την ανάλυση και την οπτικοποίηση των αναλυμένων πρωτεϊνών περιγράφονται παρακάτω. B.6.1. Λύση πρωτοπλαστών και εκχύλιση πρωτεϊνών Για την εκχύλιση ολικής πρωτεΐνης, σε κάθε ίζημα πρωτοπλαστών προστέθηκαν 100 ml παγωμένο διάλυμα λύσης που περιείχε: 1% Igepal CA-630, 50 mm Tris:Cl ph 7,4, 150 mm NaCl, 2 mm EGTA, 25 mm NaF, 0,25% Deoxycholic acid, 0,2 mm sodium orthovanadate, 1 mm PMSF, 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml aprotinin και complete protease inhibitors (Roche). Ακλούθησε ισχυρή ανάδευση και επώαση για 1 ώρα στους 4 ο C. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα X g, στους 4 ο C και στο υπερκείμενο προστέθηκε ίσος όγκος διαλύματος χρώσης και διαλυτοποίησης (2% SDS, 0.05 M Tris-HCl, ph 7.6, 0.3 Μ σακχαρόζη, 4% β-μερκαπτoαιθανόλη, 0.01% μπλε της βρωμοφαινόλης). Τα δείγματα βράστηκαν στους 100 ο C για 10 λεπτά ώστε να αποδιαταχτούν οι πρωτεΐνες και αποθηκεύτηκαν στους -40 ο C. Τα δείγματα σε αυτό το στάδιο μπορούν να αναλυθούν με ηλεκροφόρηση και να εκτιμηθεί ή έκφραση των πρωτεϊνών με ανοσοστύπωμα Western. 91

93 B.6.2. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου παρουσία δωδεκυλοσουλφονικού νατρίου (SDS-PAGE) Η ηλεκτροφόρηση με δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο (sodium dodecyl sulfate, SDS) σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) αποτελεί μια ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για το διαχωρισμό και την αναγνώριση των πρωτεϊνών. Σε ένα σύστημα SDS-PAGE οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται με βάση το μοριακό τους βάρος. Το SDS είναι ισχυρό ανιονικό απορρυπαντικό που αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες προσδίδοντάς τους ταυτόχρονα μεγάλο αρνητικό φορτίο. Έτσι, η φορά της ηλεκτροφόρησης πραγματοποιείται από τον αρνητικό προς το θετικό πόλο. Μία πηκτή πολυακρυλαμιδίου αποτελείται από την πηκτή συμπύκνωσης και την πηκτή διαχωρισμού, με προσαρμοζόμενη περιεκτικότητα πολυακριλαμιδίου. Στον Πίνακα Β.3. παρουσιάζονται οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που απαιτούνται για την προετοιμασία δύο πηκτών διαχωρισμού (με 12.5% και 8% ακρυλαμίδιο) και συμπύκνωσης. Πίνακας B.3. Ποσότητες διαλυμάτων για την παρασκευή πηκτής πολυακριλαμίδης για τον διαχωρισμό πρωτεϊνών. ΠΥΚΝΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΗΚΤΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ 12.5% ΠΗΚΤΗ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ 8% ΠΗΚΤΗ ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗΣ ακρυλ./bis 32/0.8 % (w/v) Tris-HCl ph 8.8, 3M Tris-HCl ph 6.8, 0.5Μ Σουκρόζη Μ 7.5 ml 4.8 ml 1.5 ml 2.45 ml 2.45 ml ml 0.35 ml 0.35 ml - EDTA 0.2 M 190 μl 190 μl 150 μl Ουρία 6 Μ 3.2 ml 3.2 ml 2.5 ml SDS 10% (w/v) 290 μl 290 μl 225 μl ddh 2 O 5.1 ml 7.8 ml 3,63 ml TEMED 20 μl 24 μl 25 μl APS 10% (w/v) 100 μl 100 μl 100 μl 92

94 Η ηλεκτροφορητική συσκευή που χρησιμοποιήθηκε ήταν της εταιρείας Hoefer Sci., Model SE 250. Για τον υπολογισμό των μοριακών βαρών χρησιμοποιήθηκαν ήδη βαμμένοι δείκτες μοριακού βάρους. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν οι μοριακοί δείκτες, ColorPlus Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kda) (New England Biolabs) και PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kda (#26616, Thermo Fisher Scientific). Το ρυθμιστικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης περιείχε 0,05 Μ Tris, 0,38 Μ γλυκίνη, 2 mm EDTA, 5 mm θειοθειϊκό νάτριο και 0,15% SDS. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στους 4 ο C, σε σταθερή τάση 150 Volt για περίπου 2 ώρες. B.6.3. Ανοσοαποτύπωμα WESTERN Το ανοσοστύπωμα Western είναι μια τεχνική που παρέχει τη δυνατότητα εντοπισμού μιας συγκεκριμένης πρωτεΐνης από ένα μείγμα πρωτεϊνικών μορίων. Μετά την ηλεκτροφόρηση η πηκτή έρχεται σε επαφή με μεμβράνη και καθέτως προς την επιφάνειά τους διαβιβάζεται ηλεκτρικό ρεύμα. Με αυτό τον τρόπο οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν από την πηκτή στη μεμβράνη (στην παρούσα εργασία, μεμβράνη νιτροκυτταρίνης Protran BA83, Whatman). Μετά τη μεταφορά των πρωτεϊνών στη μεμβράνη είναι δυνατή η χρήση αντισωμάτων για την ανίχνευση τους. Προκειμένου να ανιχνευθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ του αντισώματος και της πρωτεΐνης χρησιμοποιείται δεύτερο αντίσωμα έναντι του πρώτου. Το δεύτερο αντίσωμα φέρει προσδεδεμένο ένα ένζυμο και ανιχνεύεται μέσω ενζυμικής αντίδρασης. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τόσο η πηκτή όσο και η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης εμβαπτίστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (50 mμ Tris, 0,38 Μ γλυκίνη και 20% (v/v) μεθανόλη). Στο σύστημα μεμβράνης-πηκτής τοποθετήθηκαν εκατέρωθεν από δύο φύλλα Whatman 3 ΜΜ ίσου μεγέθους και εξωτερικά αυτών σπογγώδες υλικό. Η όλη διάταξη μεταφέρθηκε σε θήκη και η θήκη σε ειδική συσκευή, (Hoefer Sci., Model TE 22) που περιείχε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς, με την πλευρά της μεμβράνης προς την άνοδο (+). Εφαρμόστηκε ηλεκτρικό πεδίο έντασης 390 ma, για 2 περίπου ώρες στους 4 ο C υπό συνεχή ανάδευση. 93

95 B.6.4. Προσθήκη πρώτου και δεύτερου αντισώματος Για να μειωθεί η μη ειδική πρόσδεση των αντισωμάτων είναι απαραίτητο να καλυφθούν οι αδέσμευτες θέσεις που παρέμειναν μετά τη μεταφορά. Η μεμβράνη επωάστηκε για 30 λεπτά υπό συνεχή ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου με διάλυμα κορεσμού (blocking buffer) που περιείχε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη σε 1Χ PBS-T (PBS, 0,2% Tween-20). Στη συνέχεια, η μεμβράνη ξεπλύθηκε 3 φορές με 1Χ PBS-T για 5 λεπτά και μετά επωάστηκε με διάλυμα που περιείχε διαλυμένο το κατάλληλο αντίσωμα με ανάδευση, όλη τη νύκτα στους 4 ο C. Το διάλυμα αυτό ήταν ουσιαστικά ίδιας σύστασης με το διάλυμα κορεσμού. Η συγκέντρωση του αντισώματος που χρησιμοποιείται κάθε φορά εξαρτάται από τις προδιαγραφές του αντισώματος. Μετά το πέρας της πρώτης επώασης η μεμβράνη πλύθηκε πάλι με PBS- T, 5 λεπτά (3 φορές) και ακολούθησε η επώαση με το δεύτερο αντίσωμα. Το δεύτερο αντίσωμα που χρησιμοποιείται αλληλεπιδρά με τις βαριές αλυσίδες του πρώτου αντισώματος. Επομένως, τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιούνται (αντι-αντισώματα) εξαρτώνται από την προέλευση του εκάστοτε πρώτου αντισώματος. Και τα δεύτερα αντισώματα αραιώθηκαν καταλλήλως σε διάλυμα κορεσμού. Η επώαση έγινε με ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για δύο ώρες. Μετά και τη δεύτερη επώαση, η μεμβράνη ξεπλύθηκε 3 φορές με PBS-T, 5 λεπτά και ακολούθησε η αντίδραση ανίχνευσης του συμπλόκου αντιγόνουαντισώματος. Χρησιμοποιήθηκαν τα εξής πρώτα αντισώματα στις αναγραφόμενες αραιώσεις: HA-Tag (C29F4) Rabbit mab (Cell Signaling Technology, #3724), 1:1500, Monoclonal anti-c-myc Purified Mouse Immunoglobulin, Clone 9E10 (Sigma, #M4439), 1:5000. Δευτερογενή αντισώματα: Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (KPL, # ) 1:10000, HRP-linked Antibody Antimouse-HRP (Cell Signaling, #7076) 1: B.6.5. Αντίδραση ανίχνευσης του συμπλόκου αντιγόνου πρώτου αντισώματος δεύτερου αντισώματος (εμφάνιση) H αντίδραση της ανίχνευσης του συμπλόκου πρωτεΐνης πρώτου αντισώματος δεύτερου αντισώματος (εμφάνιση) βασίζεται στη μέθοδο της χημειοφωταύγειας. Το ένζυμο HRP (Horse Radish Peroxidase), που βρίσκεται 94

96 συζευγμένο με το δεύτερο αντίσωμα, οξειδώνει κατάλληλο υπόστρωμα, παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου και εκπέμπεται φως. Το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το ECL, Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche) και η εμφάνιση πραγματοποιήθηκε με τον αναλυτή της Fujifilm LAS B.7. Περιγραφή εξειδικευμένων τεχνικών - Κλωνοποιήσεις Η μέθοδος της κλωνοποίησης αναφέρεται στη δημιουργία πλασμιδιακών φορέων τόσο κλωνοποίησης όσο και έκφρασης. Οι φορείς κλωνοποίησης χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία ως ενδιάμεσοι φορείς που διευκόλυναν την τελική κλωνοποίηση των επιθυμητών τμημάτων DNA στον τελικό φορέα έκφρασης. Οι φορείς έκφρασης που κατασκευάστηκαν ήταν πλασμίδια για παροδική έκφραση πρωτεϊνών σε φυτικά κύτταρα. Ο σκοπός της παρασκευής τους ήταν η χρήση τους σε πειράματα παροδικού μετασχηματισμού πρωτοπλαστών. Οι τελικοί φορείς που κατασκευάστηκαν ήταν είτε φορείς έκφρασης του γονιδίου της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (LUC) υπό τον έλεγχο των διαφόρων τμημάτων υποκινητών των γονιδίων του ρολογιού του φασολιού, είτε φορείς υπερέκφρασης γονιδίων του ρολογιού του φασολιού υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή 35S του ιού του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (CaMV), καθώς και οι αντίστοιχοι κενοί φορείς (empty vectors, EV). B.7.1. Κατασκευή των φορέων έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τμημάτων υποκινητών γονιδίων του ρολογιού του φασολιού Οι φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα μετασχηματισμού των πρωτοπλαστών κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το φορέα pbi221luc, ο οποίος φέρει το γονίδιο LUC υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή 35S του ιού του μωσαϊκού του καπνού (35S CaMV) (Iwata and Koizumi, 2005). Ουσιαστικά, στο τελικό κατασκεύασμα (ανασυνδυασμένο πλασμίδιο) τα τμήματα των προς μελέτη υποκινητών έχουν αντικαταστήσει τον υποκινητή 35S, με αποτέλεσμα το γονίδιο LUC να τίθεται υπό τον έλεγχο του εκάστοτε τμήματος υποκινητή. Συνοπτικά, τα κατασκευάσματα που φέρουν το μέγιστο μήκος υποκινητή και για τα τρία υπό μελέτη γονίδια, δηλαδή bp ανοδικά από το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) του PvTOC1, bp 95

97 από το ORF του PvELF4 και bp από το ORF του PvLHY κατασκευάστηκαν σε δύο βήματα. Αρχικά, τα τμήματα υποκινητή ενισχύθηκαν με PCR από γενωμικό DNA φασολιού (τυφλά άκρα) και τα προϊόντα PCR εισήχθησαν στο φορέα κλωνοποίησης ptz57r στη θέση SmaI (βλ. ενότ. Β.6.1.1, Β ). Στη συνέχεια, κόπηκαν με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού από αυτόν και αντικατέστησαν τον 35S υποκινητή στο φορέα έκφρασης pbi221luc, ο οποίος είχε αποκοπεί από το φορέα χρησιμοποιώντας τα ίδια ένζυμα περιορισμού. Έτσι προέκυψαν οι φορείς PvTOC1-1653:LUC, PvELF4-1449:LUC και PvLHY-1905:LUC ή T-1653, E-1449 και L-1905 για συντομία, αντίστοιχα. Η ίδια τεχνική χρησιμοποιήθηκε και για την κατασκευή των φορέων Τ-1108, Τ-558, Ε-940, L-1008 και L-452. B Παρασκευή φορέα κλωνοποίησης ptz57r με τυφλά άκρα Ο φορέας κλωνοποίησης επιτρέπει τον πολλαπλασιασμό του ένθετου DNA που εισάγεται σε αυτόν. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας ptz57r (Fermentas, Thermo Fisher Scientific). Ο φορέας κλωνοποίησης υπέστη πέψη με το περιοριστικό ένζυμο SmaI, το οποίο αφήνει τυφλά άκρα. Αναμείχθηκαν 5 μg του πλασμιδιακού φορέα ptz57r (2887 bp), 5 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10Χ) και 2,5 μl ενζύμου SmaI (10 u/μl, Takara) σε τελικό όγκο 50 μl. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε στους 25 o C για 3-4 ώρες, ώστε να κοπεί πλήρως το πλασμίδιο. Το προϊόν της αντίδρασης πέψης αναλύθηκε σε πηκτή αγαρόζης και εξήχθη από αυτή (βλ. ενότ. Β.4.6, B.4.7). B Εισαγωγή των τμημάτων υποκινητών στο φορέα κλωνοποίησης ptz57r Η εισαγωγή τμήματος DNA (ένθεμα) σε πλασμίδιο αποτελεί μία μέθοδο δημιουργίας ανασυνδυασμένων μορίων DNA. Ο κομμένος με SmaI και καθαρισμένος φορέας ptz57r και τα καθαρισμένα προϊόντα PCR ενώθηκαν με τη βοήθεια του ενζύμου της Τ4 DNA λιγάσης. Για την αντίδραση συνένωσης αναμείχθηκαν 50 ng φορέα κλωνοποίησης ptz57r, προϊόν PCR προς ένθεση σε τρεις φορές περίσσεια σε σχέση με τον πλασμιδιακό φορέα, 2 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10Χ), 2 μl 50% PEG (PolyEthylen Glycol) 4000 και 1 μl T4 DNA λιγάσης (Thermo Fisher Scientific, 5 u), σε τελικό όγκο 20 μl. Η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιήθηκε στους 22 ο C για 1 ώρα. Το προϊόν της αντίδρασης εισήχθη σε 96

98 βακτήρια E. coli DH5α και τουλάχιστον δύο κλώνοι, που περιείχαν το επιθυμητό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (βλ. ενότ. B.3), εστάλησαν προς αλληλούχηση (Eurofins Genomics). B Αντιδράσεις πέψης του φορέα έκφρασης και του τμήματος υποκινητή από το φορέα κλωνοποίησης Αφού εξακριβώθηκε ο σωστός προσανατολισμός του ενθέματος, στη συγκεκριμένη περίπτωση 3-5 ώστε στη μεριά του 5 άκρου να υπάρχει διαθέσιμη θέση περιορισμού PstI και στο 3 άκρο, θέση περιορισμού BamHI, τόσο ο δεδομένος κλώνος όσο και ο φορέας έκφρασης pbi221luc υπέστησαν πέψη με κατάλληλα ένζυμα περιορισμού. Οι αντιδράσεις είχαν ως εξής: Πέντε μg πλασμιδιακού DNA, 50 u από κάθε ένζυμο, 1Χ τελική συγκέντρωση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (50 mm Potassium Acetate, 20 mm Tris-acetate, 10 mm Magnesium Acetate, 100 μg/ml BSA, ph 7.9) σε τελικό όγκο 100 μl (37 ο C, ~3 ώρες). Το προϊόν της πέψης ηλεκτροφορήθηκε και πραγματοποιήθηκε εξαγωγή από την πηκτή αγαρόζης της ζώνης DNA που αντιστοιχούσε στο ένθεμα (τμήμα υποκινητή) και του φορέα έκφρασης χωρίς τον υποκινητή 35S (~4600 bp). B Αντίδραση συνένωσης του τμήματος υποκινητή και του φορέα έκφρασης Τα δύο κομμάτια DNA (τμήμα υποκινητή και φορέας έκφρασης χωρίς τον υποκινητή 35S) συνενώθηκαν με τη βοήθεια του ενζύμου της Τ4 DNA λιγάσης. Για την αντίδραση συνένωσης αναμείχθηκαν 50 ng φορέα έκφρασης χωρίς τον υποκινητή 35S, τμήμα υποκινητή σε τρεις φορές περίσσεια σε σχέση με τον φορέα, 2 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10Χ) και 0,25 μl T4 DNA λιγάσης (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, 5 u), σε τελικό όγκο 20 μl. Η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιήθηκε στους 22 ο C για 10 λεπτά. Το προϊόν της αντίδρασης εισήχθη σε βακτήρια E. coli DH5α και αφού βρέθηκαν θετικοί κλώνοι που περιείχαν το επιθυμητό ανασυνδυασμένο πλασμίδιο (βλ. ενότ. B.3) τουλάχιστον δύο εστάλησαν προς αλληλούχηση (Eurofins Genomics). Το προϊόν της όλης διαδικασίας είναι ο τελικός φορέας έκφρασης της LUC υπό τον έλεγχο του εκάστοτε τμήματος υποκινητή προς μελέτη. Τα πλασμίδια αυτά πολλαπλασιάστηκαν σε μεσαία ή μεγάλη 97

99 κλίμακα (βλ. ενότ ) και χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα μετασχηματισμού πρωτοπλαστών ως πλασμίδια αναφοράς (reporter plasmids). B Παρασκευή φορέα μικρότερου τμήματος υποκινητή από φορέα που περιέχει υποκινητή μεγαλύτερου μήκους Η περίπτωση του φορέα Ε-381 Ο φορέας έκφρασης PvELF4-381:LUC (ή Ε-381) κατασκευάστηκε μέσω πέψης του φορέα Ε-940 με τα ένζυμα περιορισμού PstI και PmeI. Με αυτήν την πέψη αφαιρούνται 558 bp από τον υποκινητή του γονιδίου PvELF4 που βρίσκεται ανορροικά της LUC στον φορέα Ε-940. Έτσι, το κομμάτι του υποκινητή που παραμένει είναι από το -1 ως το -381 του PvELF4. Η πέψη πραγματοποιήθηκε ως εξής: Πέντε μg πλασμιδιακού DNA (E-940), 50 u από κάθε ένζυμο, 1Χ τελική συγκέντρωση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (50 mm Potassium Acetate, 20 mm Tris-acetate, 10 mm Magnesium Acetate, 100 μg/ml BSA, ph 7.9) σε τελικό όγκο 50 μl (37 ο C, ~3 ώρες). Το προϊόν της πέψης ηλεκτροφορήθηκε και πραγματοποιήθηκε εξαγωγή από την πηκτή αγαρόζης της ζώνης DNA που αντιστοιχούσε στο φορέα έκφρασης χωρίς το τμήμα υποκινητή μήκους 558 bp. Το παραπάνω καθαρισμένο προϊόν πέψης υπέστη επεξεργασία με το κομμάτι Klenow για δημιουργία τυφλών άκρων (ενότ. B.4.10). Το προϊόν της αντίδρασης καθαρίστηκε με χρήση κολώνας καθαρισμού προϊόντων PCR (βλ. ενότ. B.4.7) και ακολούθησε αντίδραση συνένωσης των τυφλών άκρων με τη βοήθεια της T4 DNA λιγάσης: αμείχθηκαν 50 DNA, 2 μl ρυθμιστικού διαλύματος της αντίδρασης (10Χ), 2 μl 50% PEG (PolyEthylen Glycol, ΜΒ 4000) και 1 μl T4 DNA λιγάσης (Thermo Fisher Scientific, 5 u), σε τελικό όγκο 20 μl. Η αντίδραση συνένωσης πραγματοποιήθηκε στους 22 ο C για 1 ώρα. Το προϊόν της αντίδρασης εισήχθη σε βακτήρια E. coli DH5α και αφού βρέθηκαν θετικοί κλώνοι (βλ. ενότ. B.3) τουλάχιστον δύο κλώνοι εστάλησαν προς αλληλούχηση (Eurofins Genomics). 98

100 B Παρασκευή όλων των υπολοίπων φορέων έκφρασης με μικρότερου μήκους ή τροποποιημένο υποκινητή Όλα τα υπόλοιπα κατασκευάσματα ενδιάμεσου μεγέθους ή με οποιοδήποτε μέσο τροποποιημένα τμήματα υποκινητών δημιουργήθηκαν μέσω του kit κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (Q5-SDM, E0554S, ΝΕΒ) (βλ. ενότ. Β.4.5.3). Το τελικό προϊόν εισάγεται σε βακτήρια E. coli και ακολουθεί ανάλυση των κλώνων που προκύπτουν (βλ. ενότ. B.3). Τα αντίστοιχα ζεύγη εκκινητών και οι αντίστοιχες θερμοκρασίες υβριδισμού τους (Τ α ) φαίνονται στον Πίνακα B.4. Το πλασμίδιο Τ-1108 χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα για την κατασκευή των Τ-241, Τ-369, Τ-612, Τ-663, Τ-715, Τ-747, Τ-790 και Τ-964 φορέων, καθώς επίσης και για το 2T1MEmut κατασκεύασμα (οι αλληλουχίες TATG στις θέσεις -570 και -555 bp ανοδικά του ORF του PvTOC1, έχουν μετατραπεί σε ΑΑΑΑ). Για τη δημιουργία των Τ-598, Τ-585 και Τ-570 φορέων, καθώς και το 1T1MΕmut κατασκεύασμα (αλληλουχία TATG στη θέση -570 bp ανοδικά του ORF μετατράπηκε σε ATCC) ως μήτρα χρησιμοποιήθηκε ο φορέας T-612. Ο φορέας E- 940 ήταν η μήτρα DNA για την κατασκευή των φορέων E-433, Ε-492, Ε-548, Ε-604, Ε-614, Ε-624, Ε-636, Ε-646, Ε-656 και Ε-773 και del10bpe-940. Στον τελευταίο (del10bpe-940) έχει αφαιρεθεί η αλληλουχία 10 bp του υποκινητή του PvELF4 μεταξύ των θέσεων -656 και -646 (TGAACTTTTG) ανοδικά του ORF («δεκαμερές»). Αντίστοιχα, φορέας 2X10bpE-656, που περιέχει εις διπλούν το εν λόγω δεκαμερές, δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το φορέα E-656 ως μήτρα και ο φορέας 1X10bpE-381, που περιέχει το δεκαμερές μία φορά, στο 5 -άκρο της αλληλουχίας του υποκινητή, δημιουργήθηκε με μήτρα το φορέα Ε-381. Ο φορέας-χωρίς-υποκινητή του πλασμιδίου pbi221luc (PromoterLess pbi, PLpBI) συναρμολογήθηκε μέσω πέψης HindIII/XbaI, αφαίρεσης του υποκινητή 35S, επεξεργασία με Klenow και συνένωση των «τυφλών» άκρων με τη βοήθεια του ενζύμου της Τ4 DNA λιγάσης (βλ. ενότ. B.4.8-B.4.10). B.7.2. Κατασκευή των φορέων υπερέκφρασης γονιδίων του ρολογιού του φασολιού Οι φορείς υπερέκφρασης των PvTOC1 και PvELF4 δημιουργήθηκαν με αντικατάσταση του γονιδίου EGFP στο φορέα psat6-egfp-c1 (Tzfira et al., 2005) με το αντίστοιχο ORF (psatpvtoc1 και psatpvelf4), ενώ ο φορέας υπερέκφρασης του PvLHY δημιουργήθηκε με βάση το φορέα pbi221luc, 99

101 αντικαθιστώντας το γονίδιο LUC με το PvLHY ORF (pbipvlhy). Αρχικά, κάθε ORF ενισχύθηκε με PCR με Phusion DNA πολυμεράση (βλ. Πίν. B.4, για λεπτομέρειες των εκκινητών) από cdna (βλ. ενότ. B.4.2). Το PvLHY ORF αρχικά εισήχθη σε φορέα κλωνοποίησης (pgεμ-τ, Promega). Το γονίδιο LUC αποκόπηκε από το φορέα pbi221luc μέσω πέψης με EcoRV/SacI και αντικαταστάθηκε από το PvLHY ORF από το φορέα pgεμ-τ μέσω της πέψης SmaI/SacI, δημιουργώντας τον φορέα pbipvlhyox. Το PvELF4 ORF (με επίτοπο myc στο 5' άκρο του) και το PvTOC1 ORF πολλαπλασιάστηκαν μέσω PCR με Phusion DNA πολυμεράση με το εξής πρωτόκολλο (βλ. Πίν. B.4): Υπόστρωμα: 1 μl αντίδραση RT Πρόσθιος εκκινητής: 2,5 μl (0,5 μμ) Ανάστροφος εκκινητής: 2,5 μl (0,5 μμ) dntps: 1 μl (200 μm από κάθε dntp) Ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (5Χ): 10 μl Phusion DNA πολυμεράση (2 u/μl): 0,5 μl ddh 2 O: μέχρι τα 50 μl τελικό όγκο. Το πρωτόκολλο της PCR ήταν: º C, 30 δευτερόλεπτα º C, 10 δευτερόλεπτα 3. 3 ο C<T α, 30 δευτερόλεπτα ºC, 1 λεπτό X 2 φορές, τα βήματα ºC, 10 δευτερόλεπτα 6. T α, 30 δευτερόλεπτα ºC, 1 λεπτό X 33 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά Στην περίπτωση του PvELF4 ORF οι εκκινητές είχαν φωσφορυλιωμένα (P) 5 -άκρα και έτσι το προϊόν τοποθετήθηκε με συνένωση τυφλών άκρων (με Τ4 DNA λιγάση) στο φορέα psat6-egfp-c1, από τον οποίο είχε αφαιρεθεί το EGFP μέσω πέψης με NcoI/HindIII, εξαγωγής από πηκτή αγαρόζης και επεξεργασίας με Klenow πολυμεράση (βλ. ενότ. B.4.9, B.4.7, B.4.10). Στην περίπτωση αυτή δόθηκε προσοχή στον προσανατολισμό του ενθέματος (προϊόν PCR, PvELF4 ORF), αφού η αντίδραση 100

102 συνένωσης δεν είναι κατευθυνόμενη και πρέπει το ένθεμα να έχει συγκεκριμένο προσανατολισμό ώστε να εκφραστεί. Το τελικό προϊόν ήταν ο φορέας υπερέκφρασης του PvELF4 ORF, ο οποίος φέρει επίτοπο myc στο 5 άκρο του, ο psatmycpvelf4ox (ή PvELF4ox). To προϊόν PCR για το PvTOC1 ORF εξήχθη από πηκτή αγαρόζης (βλ. ενότ. Β.4.7) και στη συνέχεια κόπηκε σε ολονύχτια πέψη με τα ένζυμα HindIII/NcoI και καθαρίστηκε με στήλη καθαρισμού PCR προϊόντων (βλ. ενότ. 2.7). Η διαφορά της δεδομένης πέψης πέρα από το χρόνο επώασης έγκειται στην ποσότητα των ενζύμων περιορισμού (20 u/1μg DNA) και τον τελικό όγκο της αντίδρασης (100 μl). Με τα ίδια ένζυμα είχε κοπεί και ο φορέας psat6-egfp-c1. Ο φορέας χωρίς το EGFP εξήχθη από την πηκτή αγαρόζης και στη θέση του γονιδίου EGFP τοποθετήθηκε το PvTOC1 ORF (καθαρισμένο προϊόν ολονύκτιας πέψης) με συνένωση μέσω Τ4 DNA λιγάσης, παράγοντας το φορέα psat-pvtoc1ox (ή PvTOC1ox). Η αλληλουχία που κωδικοποιεί τον επίτοπο ΗΑ προστέθηκε στο 5' άκρο του PvTOC1 ORF μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (Q5-SDM, ΝΕΒ) (βλ. Πίν. Β.4). Αυτός ο φορέας χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε αντιδράσεις Q5-SDM για την παρασκευή των ελλείψεων των δομικών περιοχών της πρωτεΐνης PvTOC1, CCT (CONSTANS, CONSTANS-LIKE, και TOC1, αμινοξέα ) και PR (Pseudo- Receiver, αμινοξέα 1-157), δημιουργώντας τους φορείς PvTOC1ΔCCT και PvTOC1ΔPR, αντίστοιχα (βλ. Πίν. Β.4). Ο κενός φορέας του psat6-egfp (psatev) δημιουργήθηκε αφαιρώντας το γονίδιο EGFP από αυτόν μέσω πέψης NcoI/HindIII, επεξεργασίας με Klenow και συνένωσης τυφλών άκρων με T4 DNA λιγάση. Αντίστοιχα, ο κενός φορέας του pbi221luc (pbiev) δημιουργήθηκε απομακρύνοντας το γονίδιο LUC από τον pbi221luc με πέψη EcoRV/HindIII, επεξεργασία με Klenow και συνένωση τυφλών άκρων με T4 DNA λιγάση. Όλα τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν μέσω αλληλούχησης DNA (Eurofins Genomics). 101

103 Πίνακας B.4. Χαρακτηριστικά των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στις κλωνοποιήσεις. Φορέας Κατεύθυνση Αλληλουχία (5 3 ) Tα ( o C) Τμήμα υποκινητή PvTOC1 T-1653 πρόσθιος ATTCATACCCATCAACTCCAA ανάστροφος ATCCAACTCAAAAATTCGATTTT 57 T-1108 πρόσθιος CCAATTTCAATGGTAATAAAAACTT ανάστροφος ATCCAACTCAAAAATTCGATTTT 48 T-558 πρόσθιος TTTTGTGGACAGTCATCGG ανάστροφος AAAATCACACACTCAGTCACCTA 54 T-926 πρόσθιος TGTTTTATATTGATAAGTCAACATAG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 59 T-790 πρόσθιος GAGAAGAGATAAAAATAATTTAATGTG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 57 T-747 πρόσθιος CATATTTAATCTTTTAATAAAATATCAATTATG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 58 T-715 πρόσθιος GAAAATAAAATTCAAATTTGATTTAATAAATG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 58 T-663 πρόσθιος TAAAATTTCCATTATTATTATTATTATTATGG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 58 T-612 πρόσθιος TTGCATGAATGAATTTATTATGG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 58 T-369 πρόσθιος CACGTTAGTCCCCCTTTTTTTAATC ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 61 Τ-241 πρόσθιος CTTCTGCTAACGTGCGCC ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 63 2T1MEmut πρόσθιος atatttaaaagacagtcatcggcgattg ανάστροφος cccatttttcctctgaatcaaatctgctcc 59 T-598 πρόσθιος tccttattatggagcagatttgattc ανάστροφος tccggcgtaatcatggtcatag 59 T-585 πρόσθιος tccgatttgattcagaggtgtg ανάστροφος tccggcgtaatcatggtcatag 58 T-570 πρόσθιος tcctgtgatgggatattttgtg ανάστροφος tccggcgtaatcatggtcatag 58 1T1MEmut πρόσθιος GATTCAGAGGatccATGGGATATTTTGTG ανάστροφος AAATCTGCTCCATAATAAATTC 57 Τμήμα υποκινητή PvELF4 E-1449 πρόσθιος AAATCGTTCAGAAGTCGATAGG ανάστροφος CGGAGGTGCTTCTTGGAG 64 E-940 πρόσθιος AAGACGTGCTTAGTTCGATCA ανάστροφος CGGAGGTGCTTCTTGGAG 64 E-778 πρόσθιος TTGTATTTTTTTTTAGATATTTGAGTG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 58 E-656 πρόσθιος TGAACTTTTGACTTTTTCTTCC ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 59 E-646 πρόσθιος ACTTTTTCTTCCTAGATCTATCTTC ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 61 E-636 πρόσθιος CCTAGATCTATCTTCCATCTG ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG 60 E-624 πρόσθιος TTCCATCTGTAGGTGTGC

104 E-614 E-604 E-548 E-492 E-433 1X10bpE-381 2X10bpE-656 mut10bpε-940 Τμήμα υποκινητή PvLHY L-1905 L-1008 L-452 ORF γονιδίου myc-pvelf4 PvLHY PvTOC1 HA (PvTOC1) PvTOC1ΔCCT PvTOC1ΔPR ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος πρόσθιος ανάστροφος GGCGTAATCATGGTCATAG AGGTGTGCTGCACGCGCC GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC CACGCGCCAATGGATAGT GGCGTAATCATGGTCATAG ACAATATTTTCTCAAGATTAAAATGAG GGCGTAATCATGGTCATAG TCCTTTTAATTATTACATTTTAAATAAAAAAAC GGCGTAATCATGGTCATAG CAAACCAAAGATTGATGAAAATTG GGCGTAATCATGGTCATAG ttttgtgccaaactaacaactag gttcacttggcgtaatcatggtc aacttttgtgaacttttgactttttcttcc caaagcttggcgtaatcatggtcatag tccactttttcttcctagatctatc tccattgaatactactttaggcc AGCACACGACACGTCAATGA AGCTACCGCTGCTTCAGATC AGTTTCCCTCTCTTTTCCGC AGCTACCGCTGCTTCAGATC TCGGGGTGAGTGTGCTGTA AGCTACCGCTGCTTCAGATC GAACAAAAACTTATTTCTGAAGAAGATCTGATGAACTCATCTTGCTCCG GTGGCTTTATTTGGAAGGGGTT CCCGGGTCAGGGAAGATCTGAAGC GAGCTCTCAAGTCGAAGTATCCCCTTC GAACCATGGAGTTGGATATGGAGTC AATTAAGCTTTCAAGCATCCTCAGG gtgccggattatgcgatggagtctggcgaggag atcatacggatacatggctatcgttcgtaaatgg TGAAAGCTTCGAATTCTGC AACTTTACTTAATTTTGCTTCTG CTCGTAGAGAAGAACATCTTG CGCATAATCCGGCACATC Στον παραπάνω πίνακα (Πίν. Β.4) τα νουκλεοτίδια που σημειώνονται με μικρά γράμματα, δεν υπάρχουν στο αντίστοιχο πλασμίδιο που χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο DNA, αλλά έχουν εισαχθεί στους εκκινητές για την μεταλλαξιγένεση της δεδομένης αλληλουχίας (βλ. ενότ. Β και Β.7.1.6). 103

105 B.8. Ανάλυση διαγονιδιακών φυτών Arabidopsis thaliana, PvLHY-ox B.8.1. Φυτικό υλικό και συνθήκες ανάπτυξης Στα πλαίσια συνεργασίας του εργαστηρίου Χρονοβιολογίας του Ινστιτούτου Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» και του τομέα Βοτανικής του τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α., ως μέρος της διπλωματικής εργασίας της φοιτήτριας, Δανάης Γεωργιάδου (Γεωργιάδου, Διπλωματική μελέτη, Ε.Κ.Π.Α. 2015) παρασκευάστηκαν διαγονιδιακά φυτά A. thaliana, τα οποία εκφράζουν σταθερά το γονίδιο του ρολογιού του φασολιού, PvLHY. Η εργασία αυτή είχε φτάσει μέχρι την ανάλυση ομοζυγωτών φυτών της γενιάς Τ2. Σκοπός ήταν η χρήση των A. thaliana ως ετερόλογο σύστημα έκφρασης του PvLHY και κατ επέκταση η μελέτη του εν λόγω παράγοντα, συγκρίνοντας φυτά αγρίου τύπου με τα διαγονιδιακά φυτά που εκφράζουν το PvLHY. Υπενθυμίζεται ότι τα γονίδια LHY στα δύο φυτικά είδη έχουν διαφορετική χρονοεξαρτώμενη άμεση απόκριση στο φως τη νύχτα (gating effect). B Φύτευση σπερμάτων Σπέρματα του φυτού A. thaliana (οικότυπος Columbia) διαμοιράστηκαν σε σωληνάκια με νερό και αφέθηκαν στο ψυγείο (4 C) για 2 ημέρες, επιτυγχάνοντας με αυτό τον τρόπο άρση λήθαργου (imbibition). Για την αποφυγή οποιουδήποτε είδους μόλυνσης που μπορεί να καταστρέψει τα αρτίβλαστα, προτού γίνει φύτευση των σπερμάτων σε χώμα, πρέπει να αποστειρωθούν. Αρχικά, τα σπέρματα εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα αιθανόλης 75% για 2 λεπτά και έπειτα σε υδατικό διάλυμα χλωρίνης 25% για 3 λεπτά, ανακινώντας συνεχώς τα σωληνάκια. Στη συνέχεια, τα σπέρματα ξεπλύθηκαν 5-6 φορές με αποστειρωμένο, απιονισμένο νερό. Έπειτα, επιστρώθηκαν σε πλαστικά γλαστράκια με χώμα και μεταφέρθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης με φωτοπερίοδο LD 16:8 και σχετική υγρασία 50-60%, στους C. Την πρώτη εβδομάδα ανάπτυξης των αρτιβλάστων, τα γλαστράκια καλύφθηκαν με καπάκι δημιουργώντας συνθήκες θερμοκηπίου. Τα φυτά ποτίζονταν κάθε 2 ημέρες. 104

106 B.8.2. Παρατήρηση και καταγραφή φαινοτύπων Φυτά A. thaliana, τόσο αγρίου τύπου όσο και διαγονιδιακά (γενιά Τ3, σειρές: 1, 3, 6, 8, 16), αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, φυτεύοντας μόνο 2-3 σπέρματα ανά γλαστράκι. Έγινε παρατήρηση και καταγραφή των χαρακτηριστικών του φαινοτύπου τους και συγκεκριμένα του αριθμού φύλλων ροζέττας, του αριθμού πλάγιων βλαστών, του αριθμού δευτερογενών βλαστών, του μήκους του κύριου βλαστού, καθώς και του νωπού και ξηρού βάρους του υπέργειου τμήματος των φυτών. Η συλλογή των δεδομένων και η σύγκριση αυτών με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά φυτών άγριου τύπου καθώς και τον υπολογισμό στατιστικών στοιχείων οδηγεί στο χαρακτηρισμό των φαινοτύπων των διαγονιδιακών φυτών. B.8.3. Ανάλυση των διαγονιδιακών A. thaliana μέσω PCR Για την εξακρίβωση των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου PvLHY στις σειρές διαγονιδιακών A. thaliana που επιλέχθησαν προς ανάλυση, πραγματοποιήθηκε απομόνωση RNA, δημιουργία cdna μέσω RT (βλ. ενότ. 4.1, 4.2) και ενίσχυση ολόκληρης της αλληλουχίας του γονιδίου PvLHY μέσω PCR. Ως γονίδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο για το 18S rrna του A. thaliana (18S). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, αναγράφονται στον Πίνακα B.5. Η συνθήκη της PCR ήταν η εξής: 4 μl, προϊόν της αντίδρασης RT, 10 φορές αραιωμένο πρόσθιος εκκινητής: 0,6 μl (0,4 μμ) ανάστροφος εκκινητής: 0,6 μl (0,4 μμ) dntps: 0,3 μl (0,2 mm από κάθε dntp) ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (5Χ): 3 μl GoTaq DNA πολυμεράση (Promega, 5 u/μl): μl ddh 2 O: μέχρι τα 15 μl τελικό όγκο. Το πρωτόκολλο της PCR για το PvLHY ήταν: ºC, 2 λεπτά ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 2 λεπτά X 30 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά 105

107 Το πρωτόκολλο της PCR για το 18S ήταν: ºC, 2 λεπτά ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 30 δευτερόλεπτα ºC, 20 δευτερόλεπτα X 15 φορές, τα βήματα ºC, 5 λεπτά Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης. Η ένταση της ζώνης του 18S χρησιμοποιήθηκε για κανονικοποίηση της ποσότητας της ζώνης του PvLHY. Αναλύθηκε, ομοίως, RNA και από φυτά αγρίου τύπου (wt), ήτοι φυτά που δεν εκφράζουν το PvLHY. Για περαιτέρω ανάλυση επιλέχθηκε η σειρά διαγονιδιακή 6, δεδομένου ότι παρουσίαζε σχετικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του PvLHY, συγκριτικά με τις υπόλοιπες διαγονιδιακές σειρές που ελέχθησαν. Για τη συγκριτική ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του βιολογικού ρολογιού του A. thaliana, τόσο σε φυτά αγρίου τύπου, όσο και στα διαγονιδιακά φυτά της σειράς 6, απομονώθηκε από αυτά RNA και η σχετική έκφραση των εν λόγω γονιδίων μελετήθηκε με την τεχνική της PCR πραγματικού χρόνου (βλ. ενότ. B.4.1, B.4.2, B.4.5.4), χρησιμοποιώντας ως εκκινητές τα ζεύγη που αναγράφονται στον Πίνακα B.5 και ως ιδιοσύστατο γονίδιο το IPP2 του A. thaliana. Πίνακας B.5. Χαρακτηριστικά εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των φυτών A. thaliana. Γονίδιο PvLHY 18S IPP2 CCA1 TOC1 PRR9 ELF4 Αλληλουχία (5 3 ) Πρόσθιος CCCGGGTCAGGGAAGATCTGAAGC Ανάστροφος GAGCTCTCAAGTCGAAGTATCCCCTTC Πρόσθιος TTGATTCTATGGGTGGTG Ανάστροφος CCTTGTTACGACTTCTCCT Πρόσθιος CACACCAACACCAATGTCTGC Ανάστροφος GATGGGCAAATCGGAAAGAAG Πρόσθιος GGATGCGGTTGGAAACTCAAG Ανάστροφος CAGGAAGACTATGGACAAGGAAAC Πρόσθιος ACCAAGAACTGAAAACCGTTGTG Ανάστροφος GCCGCAAGAGCCAACATTG Πρόσθιος CTAGCAGAACAACGTCCTC Ανάστροφος AAAATCAACAAAAGAAATCAGAGG Πρόσθιος GGAAGAACGGTCACGATGG Ανάστροφος CCACGGATTATTCTAACGACAATC T a ( ο C)

108 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Μελέτη της έκφρασης γονιδίων του ΗΒΡ στο φασόλι Γ.1.1. Απομόνωση ολικού RNA από φυτά φασολιού Η απομόνωση RNA από δείγματα φύλλων φασολιού πραγματοποιήθηκε με στόχο τη μελέτη των επιπέδων mrna γονιδίων του ρολογιού. Το υλικό που συλλέχθηκε (ολικό RNA) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription, RT) για τη μετατροπή του RNA των δειγμάτων σε συμπληρωματικό DNA (complementary DNA, cdna), το οποίο αποτέλεσε με τη σειρά του μήτρα σε αντίδραση PCR. Για την εξακρίβωση της ποιότητας του RNA το οποίο απομονώθηκε, 1-2 μg από κάθε δείγμα αναλύθηκαν μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης 1,2% (μη αποδιατακτικές συνθήκες, σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE). Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης, ενδεικτικά πέντε δειγμάτων, παρουσιάζονται παρακάτω (Εικ. Γ.1). Εικ. Γ.1. Απεικόνιση ηλεκτροφόρησης πέντε δειγμάτων ολικού RNA από φύλλα φασολιού, σε μη αποδιατακτικές συνθήκες (1% αγαρόζη, 80V). Στην παραπάνω εικόνα (Εικ. Γ.1) παρατηρούνται σε κάθε δείγμα κάποιες ζώνες, καθώς και διάχυτο υλικό (smear) σε όλη τη διαδρομή του RNA. Το διάχυτο υλικό αντιστοιχεί στα mrnas διαφόρων μεγεθών. Στην πρώτη παχιά ζώνη, βρίσκεται το rrna της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας των φυτικών κυττάρων (28S) και των χλωροπλαστών (23S), τα οποία δεν ξεχωρίζουν μεταξύ τους λόγω 107

109 παραπλήσιου μεγέθους. Η επόμενη παχιά ζώνη αντιστοιχεί σε rrna της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας τόσο του κυτταροπλάσματος των φυτικών κυττάρων (18S), όσο και των χλωροπλαστών (16S). Η κατώτερη ζώνη (άρα, με τα μικρότερα σε μέγεθος RNA), αντιστοιχεί στα rrna της μεγάλης ριβοσωμικής υπομονάδας των φυτικών κυττάρων (5S και 5,8S) και των χλωροπλαστών (4,5S) και πιθανόν σε μόρια trna τα οποία είναι επίσης μικρού μεγέθους. Το γεγονός ότι παρατηρείται smear από την αρχή της διαδρομής της ηλεκτροφόρησης και εμφανίζοτναι έντονες ζώνες για τα rrna είναι ενδεικτικό του ότι το απομονωθέν RNA (και ιδιαίτερα το mrna που μας ενδιαφέρει) δεν έχει αποικοδομηθεί και άρα είναι κατάλληλο να χρησιμοποιηθεί στις αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής (RT). Γ.1.2. Ρυθμική έκφραση των γονιδίων του ΗΒΡ του φασολιού Στα πρώτα στάδια της παρούσας διατριβής, ταυτοποιήθηκαν υποψήφια γονίδια του ΗΒΡ στο φασόλι (PvLHY, PvTOC1, PvELF4) βάσει της διαθέσιμης πληροφορίας από το A. thaliana, αλλά και από άλλα είδη (Glycine max, Mesebrianthemum crystalinum). Η ονομασία τους έγινε κατ αντιστοιχία με τα ομόλογά τους από το A. thaliana, προσθέτοντας το πρόθεμα Pv μπροστά από το όνομα του γονιδίου, που αντιστοιχεί στα αρχικά του είδους Phaseolus vulgaris. Στον κεντρικό ταλαντωτή του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού του ευρέως μελετώμενου πειραματόφυτου A. thaliana, έχει ταυτοποιηθεί πληθώρα μεταγραφικών παραγόντων, οι οποίοι οργανώνονται σε βρόγχους αρνητικής επανατροφοδότησης (βλ. ενότ. Α). Σε προηγούμενη δραστηριότητα του εργαστηρίου είχε μελετηθεί η ρυθμική έκφραση του πρωινού παράγοντα, PvLHY. Στην αρχή, λοιπόν, της παρούσας εργασίας, μελετήθηκαν ως προς τη γονιδιακή τους έκφραση σε διαφορετικές φωτοπεριοδικές συνθήκες οι εσπερινοί παράγοντες του ρολογιού του φασολιού, PvTOC1 και PvELF4. Η μελέτη του προτύπου έκφρασης των γονιδίων αυτών, καθώς και του πιθανού επανασυγχρονισμού τους από το φως μπορούν να βοηθήσουν να κατανοήσουμε το βασικό μηχανισμό λειτουργίας του κεντρικού ταλαντωτή του ρολογιού στο φασόλι, καθώς και διαφορές που παρουσιάζουν μεταξύ τους διαφορετικά είδη φυτών. 108

110 Γ Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων PvTOC1 και PvELF4 υπό διάφορες φωτοπεριοδικές συνθήκες Προκειμένου να εξεταστεί εάν τα επίπεδα mrna των PvTOC1 και PvELF4 εμφανίζουν περιημερήσιες διακυμάνσεις, ωχρωτικά φυτά φασολιού εκτέθηκαν αρχικά, σε συνεχές λευκό φως (Continuous White Light, CWL) και αναλύθηκαν τα σχετικά επίπεδα mrna τους μέσω RT-PCR πραγματικού χρόνου. Εάν η ρύθμιση της έκφρασης είναι ενδογενής, ακόμα και υπό σταθερές συνθήκες φωτός αναμένεται κυκλική αυξομείωση των επιπέδων mrna με περίοδο κοντά στις 24 ώρες. Παρατηρήθηκε ρυθμική έκφραση, με περίπου 24ωρη περίοδο και για τα δύο γονίδια, με μέγιστα επίπεδα έκφρασης γύρω από τις χρονικές στιγμές 12 και 36 (Εικ. Γ.2). Ωστόσο, η έκφραση του PvELF4 παρουσιάζει υψηλότερα μέγιστα επίπεδα και μια έντονη διαφορά μεταξύ μεγίστου και ελαχίστου (πλάτος ταλάντωσης), η οποία δεν παρατηρήθηκε για το PvTOC1. Εικ. Γ.2. Ρυθμική έκφραση των γονιδίων (Α) PvTOC1 και (Β) PvELF4, μετά από έκθεση των ωχρωτικών φυτών φασολιού σε συνεχές λευκό φως (CWL). Όταν τα φυτά εκτέθηκαν σε φωτοπερίοδο ίσης διάρκειας ημέρας-νύχτας (LD 12:12), τα μέγιστα στην έκφραση και των δύο γονιδίων εμφανίζονται στο τέλος της ημέρας, κάτι που δείχνει ότι τόσο το PvTOC1 όσο και το PvELF4 είναι εσπερινά γονίδια (Εικ. Γ.3 Α και Β). Στην φωτοπερίοδο μεγάλης νύχτας (LD 6:18), τα μέγιστα παρουσιάζονται στην αρχή της νύχτας, ενώ τα κατώτερα επίπεδα ανιχνεύονται κοντά στο ξημέρωμα (Εικ. Γ.3 Γ και Δ). To PvELF4 εμφανίζει μια οξεία κορυφή (μέγιστο) 109

111 υπό αμφότερες τις φωτοπεριοδικές συνθήκες που εξετάστηκαν. Το PvTOC1 εμφανίζει σταδιακή μείωση μετά τα μέγιστα επίπεδα, ιδιαίτερα υπό τις συνθήκες μεγάλης νύχτας, όπου παρατηρείται ένα δεύτερο, μικρότερο μέγιστο (Εικ. Γ.3). Εικ. Γ.3. Ρυθμική έκφραση των γονιδίων PvTOC1 (Α και Γ) και PvELF4 (Β και Δ) σε φωτοπερίοδο ίσης ημέρας νύχτας (LD 12:12, Α και Β) και φωτοπερίοδο μεγάλης νύχτας (LD 6:18, Γ και Δ). Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι τα PvTOC1 και PvELF4 εκφράζονται ρυθμικά υπό διαφορετικές φωτοπεριόδους και ότι μετά την πρώτη έκθεση των φυτών στο φως παρατηρείται μια αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων των mrna τους σε σχέση με αυτά που αναπτύχθηκαν στο σκοτάδι. Η ύπαρξη ρυθμικότητας, χωρίς να έχει προηγηθεί έκθεση των φυτών σε φωτοπερίοδο, υποδεικνύει την ενδογενή φύση αυτών των ρυθμών. 110

112 Γ Επίδραση της εφαρμογής φωτός τη νύχτα στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ Προηγούμενα πειράματα στο Ρ. vulgaris, τα οποία είχαν σχεδιαστεί για να μελετηθεί η άμεση απόκριση στο φως των ρυθμικά εκφραζόμενων πρωινών γονιδίων LHCB (γονίδιο αποπρωτεΐνης του φωτοσυλλεκτικού συμπλόκου του φωτοσυστήματος ΙΙ) και PvLHY (στοιχείο του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ) έδειξαν ότι ο μηχανισμός χρονοεξαρτώμενης άμεσης απόκρισης στο φως τη νύχτα (gating effect) διαφέρει μεταξύ των Ρ. vulgaris και Α. thaliana (Kaldis et al., 2003, Kaldis και Prombona, 2006). Ενώ τα LHCB και PvLHY του P. vulgaris αποκρίνονται στο φως τη νύχτα, το ρολόι του Α. thaliana δεν αποκρίνεται στο φως τη νύχτα (Millar και Kay, 1996). Εικ. Γ.4. Σχηματική αναπαράσταση της συνθήκης ανάπτυξης φυτών φασολιού σε φωτοπερίοδο μεγάλης νύχτας (LD 6:18). Με μαύρο βέλος σημειώνεται η αρχή της φωτοπεριόδου. Τα άσπρα και μαύρα κουτιά αναπαριστούν την ημέρα και τη νύχτα, αντίστοιχα. Στο σχήμα εμφανίζονται με κόκκινα βέλη οι χρονικές στιγμές κατά τις οποίες εκτέθηκαν στο φως τα φυτά κατά τη διάρκεια της νύχτας (AD57, 60 και 68). Προκειμένου να μελετηθεί περαιτέρω ο λειτουργικός μηχανισμός του ΗΒΡ στο P. vulgaris, νεαρά φυτά φασολιού εκτέθηκαν σε «τεχνητό ξημέρωμα» (Artificial Dawn: AD) σε διαφορετικές νυχτερινές φάσεις της φωτοπεριόδου μεγάλης νύχτας (LD 6:18) (Εικ. Γ.4) και αναλύθηκε η απόκριση στο φως μέσω της παρακολούθησης της επακόλουθης 24-ωρης ταλάντωσης των επιπέδων έκφρασης των εσπερινών γονιδίων, PvTOC1 και PvELF4, καθώς και του πρωινού γονιδίου PvLHY. Στη φωτοπερίοδο αυτή το «ξημέρωμα» είναι στις χρονικές στιγμές 0, 24, 48, 72, 96 και 120, ενώ η «δύση» στις χρονικές στιγμές 6, 30, 54, 78 και 126 (Εικ. Γ.4). Προτιμήθηκε αυτή η φωτοπεριοδική συνθήκη (LD 6:18) ώστε η εφαρμογή του φωτεινού ερεθίσματος κατά τη διάρκεια της νύχτας να μπορεί να πραγματοποιηθεί σε 111

113 χρόνους κατά τους οποίους τα εξεταζόμενα ρυθμικά γονίδια να εμφανίζουν τόσο τα μέγιστα όσο και τα ελάχιστα επίπεδα έκφρασής τους (Εικ. Γ.3 Γ και Δ). Εικ. Γ.5. Αλλαγή του ρυθμικού προτύπου έκφρασης των εσπερινών γονιδίων PvTOC1 (A και Γ) και PvELF4 (Β και Δ) μετά την εφαρμογή «τεχνητού ξημερώματος» στην αρχή της μεγάλης νύχτας 3 (AD57, Α και Β), και 6 (ΑD60, Γ και Δ) ώρες μετά την έναρξη της σκοτεινής περιόδου. Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν στο ρυθμό υπό φωτοπερίοδο, LD 6:18 και τα ανοιχτά στο ρυθμό μετά την εφαρμογή του «τεχνητού ξημερώματος». Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται με μαύρα κουτιά η τελευταία σκοτεινή περίοδος για τα φυτά που εκτέθηκαν σε «τεχνητό ξημέρωμα». *P < Όταν το «τεχνητό ξημέρωμα» εφαρμόστηκε στα φυτά στην αρχή της μεγάλης νύχτας, στα μέγιστα επίπεδα των εσπερινών γονιδίων, συγκεκριμένα 3 ώρες μετά την έναρξη της σκοτεινής περιόδου (AD57), παρατηρήθηκε μία παροδική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του PvTOC1 (άμεση απόκριση στο φως) και συνολικά υψηλότερα επίπεδα έκφρασης με καθυστέρηση φάσης περίπου 6 ώρες σε σύγκριση με το ρυθμό στη φωτοπερίοδο (Εικ. Γ.5 Α). Παρόμοιες και σημαντικά ενισχυμένες αποκρίσεις παρατηρούνται επίσης και για το PvELF4 (Εικ. Γ.5 Β). Συγκεκριμένα, η παροδική 112

114 αύξηση των επιπέδων του PvELF4 είναι έντονη 3 ώρες μετά το AD57, με υψηλότερα μέγιστα επίπεδα mrna, 6 ώρες αργότερα από το ρυθμό σε φωτοπερίοδο. Η συμφασικότητα των ρυθμών στην έκφραση των PvTOC1 και PvELF4 ακόμα και μετά το AD57 υποδεικνύει ανάλογο μηχανισμό ρύθμισης, ο οποίος ελέγχει την απόκρισή τους στο φως. Όταν το AD εφαρμόστηκε 6 ώρες μετά την έναρξη της νύχτας (AD60), οι ρυθμοί της έκφρασης των PvTOC1 (Εικ. Γ.5 Γ) και PvELF4 (Εικ. Γ.5 Δ) παρουσίασαν καθυστέρηση φάσης περίπου 6 ώρες, παράλληλα με ένα συνολικά μικρότερο πλάτος ταλάντωσης. Η παρατηρούμενη μετατόπιση φάσης στο ρυθμό έκφρασης των δύο γονιδίων υποδεικνύει ότι το ρολόι τη συγκεκριμένη χρονική στιγμή αποκρίνεται στο φως και επανασυγχρονίζεται. Συμπερασματικά, στα μέγιστα επίπεδα ρυθμικής έκφρασης τόσο του PvTOC1 όσο και του PvELF4, τα οποία επιτυγχάνονται στην αρχή της νύχτας, έχουμε επανασυγχρονισμό, ενώ η άμεση απόκριση συνοδεύεται με αυξημένο πλάτος ταλάντωσης. Στη συνέχεια εξετάστηκε η επίδραση του «τεχνητού ξημερώματος» στην έκφραση των δύο γονιδίων (PvTOC1, PvELF4) στο τέλος της μεγάλης νύχτας (AD68, τέσσερις ώρες πριν το ξημέρωμα), όταν αυτά βρίσκονται στα ελάχιστα επίπεδα έκφρασής τους. Η έκφραση του PvTOC1, όσον αφορά τη φάση και το πλάτος του ρυθμού, δεν δείχνει καμία αλλαγή μετά το AD (Εικ. Γ.6 Α). Η φάση του PvELF4 δεν παρουσιάζει επίσης καμία αλλαγή, αλλά τα μέγιστα επίπεδα έκφρασής του αυξάνονται τουλάχιστον στο διπλάσιο (Εικ. Γ.6 Β). Αυτό είναι μία ένδειξη της θετικής δράσης του φωτός στην έκφραση του PvELF4, η οποία παρουσιάζεται ανεξάρτητη του ρολογιού. Συνοπτικά, η εφαρμογή φωτός στην αρχή της νύχτας δρα ως ένα σήμα επανασυγχρονισμού της ρυθμικής έκφρασης των PvTOC1 και PvELF4 μέσω πιθανώς κάποιου ρυθμικού παράγοντα, ενώ στο τέλος της νύχτας, το φως δεν προκαλεί κάποια αλλαγή φάσης στη ρυθμική έκφραση των PvTOC1 και PvELF4. 113

115 Εικ. Γ.6. Επίδραση της εφαρμογής «τεχνητού ξημερώματος» στην έκφραση των (A) PvTOC1 και (Β) PvELF4, 4 ώρες πριν το ξημέρωμα (AD68). Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν στο ρυθμό υπό φωτοπερίοδο, LD 6:18, και τα ανοιχτά στο ρυθμό μετά την εφαρμογή του AD68. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται με μαύρα κουτιά η τελευταία σκοτεινή περίοδος για τα φυτά που εκτέθηκαν σε «τεχνητό ξημέρωμα». Στην ίδια σειρά δειγμάτων εξετάστηκε η ρυθμική έκφραση του πρωινού παράγοντα PvLHY κατά την εφαρμογή τεχνητού φωτός, τόσο κατά την αρχή της νύχτας (AD57 και AD60), που βρίσκεται στα ελάχιστα επίπεδα του ρυθμού έκφρασής του, όσο και στο τέλος της νύχτας (AD68), που είναι στα μέγιστα [Σημ: οι ρυθμοί του πρωινού και των εσπερινών γονιδίων είναι αντίθετοι]. Η γονιδιακή έκφραση του παράγοντα PvLHY σε διάφορες φωτοπεριόδους έχει μελετηθεί σε προηγούμενες εργασίες (Kaldis et al., 2003). Αρχικά, στην εξεταζόμενη φωτοπερίοδο μεγάλης νύχτας παρατηρήθηκε η αναμενόμενη 24-ωρη ταλάντωση στα επίπεδα έκφρασης του PvLHY. Τα μέγιστα της έκφρασής του εμφανίζονται κατά το ξημέρωμα (πρωινός παράγοντας) και τα ελάχιστα στη διάρκεια της νύχτας (Εικ. Γ.7). Όταν το «τεχνητό ξημέρωμα» εφαρμόστηκε στην αρχή της μεγάλης νύχτας, 3 ώρες μετά την έναρξή της (AD57), παρατηρήθηκε καθυστέρηση της φάσης του ρυθμού έκφρασης του PvLHY κατά περίπου έξι ώρες (Εικ. Γ.7 Α). Αντίστοιχα, όταν το AD πραγματοποιήθηκε στην αρχή της μεγάλης νύχτας μεν, αλλά 6 ώρες μετά την έναρξη της νύχτας (AD60) παρατηρήθηκε και πάλι καθυστέρηση φάσης (αυτή τη φορά περίπου δέκα ώρες). Στην περίπτωση αυτή, παρατηρήθηκε και στατιστικώς σημαντική αύξηση της έκφρασής του (απόκριση στο φως) άμεσα μετά το AD (Εικ. Γ.7 Β). Η άμεση απόκριση συνοδεύεται από αλλοίωση της διαμόρφωσης της 114

116 καμπύλης ταλάντωσης της έκφρασης του γονιδίου (Εικ. Γ.7 Β). Τα αποτελέσματα της άμεσης απόκρισης στο φως είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες αναφορές του εργαστηρίου (Kaldis et al., 2003). Εικ. Γ.7. Επίδραση της εφαρμογής «τεχνητού ξημερώματος» στην έκφραση του PvLHY (Α και Β) στην αρχή της μεγάλης νύχτας, 3 ώρες μετά την έναρξη του σκοταδιού (Α, AD57), 6-ώρες μετά την έναρξη του σκοταδιού (Β, AD60) και στο τέλος της νύχτας, 4 ώρες πριν το ξημέρωμα (Γ, AD68). Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν στο ρυθμό υπό φωτοπερίοδο, LD 6:18, και τα ανοιχτά στο ρυθμό μετά την εφαρμογή του AD. Στον οριζόντιο άξονα φαίνεται με μαύρα κουτιά η τελευταία σκοτεινή περίοδος για τα φυτά που εκτέθηκαν σε «τεχνητό ξημέρωμα». Συνοπτικά, παρατηρείται ότι στην αρχή της νύχτας η εφαρμογή «τεχνητού ξημερώματος» προκαλεί μετατόπιση της φάσης και του πρωινού γονιδίου, PvLHY όπως και στα εσπερινά, PvTOC1 και PvELF4 (Εικ. Γ.5). Στην περίπτωση της εφαρμογής «τεχνητού ξημερώματος» στο τέλος της νύχτας (τέσσερις ώρες πριν το ξημέρωμα, AD68) δεν παρατηρήθηκε κάποια επίδραση στη φάση του ρυθμού 115

117 έκφρασης του PvLHY (Εικ. Γ.7 Γ), όπως και των εσπερινών γονιδίων που εξετάστηκαν παραπάνω (Εικ. Γ.5). Συμπερασματικά, το ρολόι του φασολιού αποκρίνεται στο φως στην αρχή της νύχτας (Εικ. Γ.5 και Εικ. Γ.7 Α και Β), ενώ είναι «αναίσθητο» στο φως όταν αυτό εφαρμόζεται λίγο πριν το αναμενόμενο ξημέρωμα (Εικ. Γ.6 και Εικ. Γ.7 Γ). Γ Επίδραση της χορήγησης τριχοστατίνης Α και νικοτιναμιδίου στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ σε φύλλα φασολιού Πιθανόν στη ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων του ΗΒΡ να συμμετέχει και η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης ως ένας μηχανισμός που έχει δειχθεί ότι παίζει ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης παραγόντων του ρολογιού στο A. thaliana (Perales και Más, 2007; Song και Noh, 2012; Malapeira et al., 2012; Hemmes et al., 2012). Για το λόγο αυτό θελήσαμε να εξετάσουμε αν μπορεί να ανιχνευθεί τυχόν επίδραση εξωγενών ουσιών, που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού του φασολιού. Μία τέτοια ουσία είναι η τριχοστατίνη Α (trichostatin A, TSA). Πρόκειται για έναν αναστολέα των αποακετυλασών των ιστονών (HDACs), η χορήγηση του οποίου έχει ως αποτέλεσμα το «ξεδίπλωμα» της χρωματίνης και τη μετάβαση σε μεταγραφικά ενεργές δομές χρωματίνης (Yoshida et al., 1995). Αντίστοιχα, το νικοτιναμίδιο (ΝΑΜ), έχει δειχθεί στα θηλαστικά ότι δρα ως αναστολέας των σιρτουινών, μίας άλλης τάξης αποακετυλασών των ιστονών, που επίσης εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης (Denu, 2005). Για το σκοπό αυτό, πρωτογενή φύλλα μαζί με τη μία κοτυληδόνα από φυτά φασολιού που είχαν φυτρώσει στο σκοτάδι για μία εβδομάδα, τοποθετήθηκαν σε χαρτί διαβρεγμένο με νερό σε διάφανα κουτιά και μεταφέρθηκαν σε φωτοπερίοδο μικρής αναλογίας ημέρας-νύχτας (LD 6:18). Στην αρχή της νύχτας (χρονική στιγμή 57), που το ρολόι του φασολιού έχει φανεί να είναι δεκτικό στο φως (ενότ. Γ.1.2.2), χορηγήθηκε TSA (40 μμ) ή NAM (10 mμ) σε αυτά, τοποθετώντας τα σε τρυβλία διαβρεγμένα με κατάλληλης συγκέντρωσης διάλυμα TSA ή ΝΑΜ, διατηρώντας, παράλληλα στις ίδιες συνθήκες, δείγματα μάρτυρες (control), απουσία δραστικής ουσίας. Στη συνέχεια, συλλέχθηκαν δείγματα RNA στις 3 και στις 6 ώρες μετά τη χορήγηση των ουσιών και εξετάστηκαν τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PvTOC1 116

118 (Εικ. Γ.8 Α), PvELF4 (Εικ. Γ.8 Β) και PvLHY (Εικ. Γ.8 Γ), μέσω RT και PCR πραγματικού χρόνου. Εικ. Γ.8. Επίδραση της χορήγησης TSA ή NAM στην έκφραση των γονιδίων (A) PvTOC1, (Β) PvELF4 και (Γ) PvLHY σε φύλλα φασολιού αναπτυγμένα σε φωτοπερίοδο LD 6:18. Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν στο ρυθμό απουσία δραστικής ουσίας και τα ανοιχτά στο ρυθμό μετά από τη χορήγηση των ουσιών. Στον οριζόντιο άξονα, με μαύρο κουτί αντιπροσωπεύεται η νύχτα. Σε καμία από τις περιπτώσεις που εξετάστηκαν δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική αλλαγή στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης κάποιου από τους εξεταζόμενους παράγοντες του ρολογιού (Εικ. Γ.8). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει, αλλά δεν αποδεικνύει ότι το TSA και το ΝΑΜ δεν έχουν κάποια επίδραση στην έκφραση αυτών των γονιδίων, τη δεδομένη χρονική στιγμή. Καθώς οι συγκεντρώσεις στις οποίες χορηγήθηκαν οι ουσίες αυτές στα φυτά, βάσει της βιβλιογραφίας (Perales και Más, 2007; Malapeira et al., 2012) θα έπρεπε να επαρκούν, το γεγονός ότι δεν παρατηρήθηκε καμία απολύτως μεταβολή υποδεικνύει ότι πιθανά με τον τρόπο που χορηγήθηκαν οι ουσίες να μην ήταν δυνατό να απορροφηθούν από τα φύλλα. Για 117

119 αυτό το λόγο, τελικά, χρησιμοποιήθηκε το κυτταρικό σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού για τα πειράματα αυτά (βλ. ενότ. Γ.2.3). Γ Σύγκριση των ρυθμών στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ με τους ρυθμούς στις κινήσεις των φύλλων φυτών φασολιού Τα φύλλα του φασολιού είναι γνωστό ότι κινούνται από εντελώς κάθετη ως προς τον βλαστό θέση μέχρι πλήρως παράλληλη θέση. Στις φωτεινές ώρες της ημέρας τα ελάσματα των φύλλων στρέφονται προς το φως, ενώ όταν βραδιάζει "διπλώνουν" (Εικ. Γ.9 Α). Αυτή η κίνηση έχει 24-ωρη περιοδικότητα και διατηρείται ακόμη και σε σταθερές συνθήκες (ενδογενής ρυθμός). Το φαινόμενο αυτό, είναι εμφανές ότι διέπεται από το ημερήσιο βιολογικό ρολόι του φυτού. Εικ. Γ.9. Ημερήσιες κινήσεις φύλλων φασολιού. (Α) Φωτογραφίες πρωτογενών φύλλων φασολιού. Κατά τη διάρκεια της ημέρας τα φύλλα του φασολιού βρίσκονται σε κάθετη προς το βλαστό θέση («επάνω»), ενώ τη νύχτα σε παράλληλη θέση («κάτω»). (Β) Ρυθμοί στις κινήσεις των φύλλων. Στα φύλλα που βρίσκονταν «επάνω» δόθηκε η τιμή «3» και σε αυτά που βρίσκονταν «κάτω» η τιμή «1». Σε όποια ενδιάμεση θέση δόθηκε η τιμή «2». Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. 118

120 Για τον έλεγχο μιας πιθανής συσχέτισης των ρυθμών των γονιδίων του ρολογιού που παρουσιάζονται παραπάνω (ενότ. Γ Γ.1.2.2) με το φαινόμενο της 24-ωρης κίνησης των φύλλων, πραγματοποιήθηκε καταγραφή των κινήσεων των φύλλων σε φασόλια που είχαν μεγαλώσει σε φωτοπερίοδο μικρής αναλογίας ημέρας:νύχτας (LD 6:18). Η καταγραφή πραγματοποιήθηκε παράλληλα με τη συλλογή δειγμάτων για απομόνωση RNA, τόσο σε φυτά του βασικού ρυθμού (φωτοπερίοδος), όσο και για φυτά στα οποία πραγματοποιήθηκε «τεχνητό ξημέρωμα» (Artificial Dawn, AD). Στην Εικόνα Γ.9 επιβεβαιώνεται η αναμενόμενη περιοδικότητα στις κινήσεις των φύλλων του φασολιού. Στη συνέχεια, για να διαπιστωθεί τυχόν συσχέτιση μεταξύ των ρυθμών γονιδίων του ρολογιού με τις κινήσεις των φύλλων του φασολιού, τοποθετήθηκαν οι εν λόγω ρυθμοί στο ίδιο γράφημα (Εικ. Γ.10). Οι ρυθμοί στην έκφραση των γονιδίων του ρολογιού είναι οι ίδιοι που αναφέρθηκαν παραπάνω ως βασικοί ρυθμοί των γονιδίων PvTOC1 και PvLHY στη φωτοπερίοδο LD 6:18 (Εικ. Γ.3 Γ και Γ.7, αντίστοιχα). Εξετάστηκαν δύο γονίδια που αποτελούν κεντρικά στοιχεία του ρολογιού, το εσπερινό γονίδιο, PvTOC1 (Εικ. Γ.10 Α) και το πρωινό γονίδιο, PvLHY (Εικ. Γ.10 Β). Ένα συμπέρασμα που εξάγεται από την αντιπαραβολή των ρυθμών αυτών είναι ότι ο ρυθμός στις κινήσεις των φύλλων του φασολιού είναι συμφασικός με το ρυθμό στην έκφραση του PvLHY. Όταν τα φύλλα είναι «επάνω», η έκφραση του PvLHY βρίσκεται στα μέγιστα επίπεδα, ενώ όταν τα φύλλα είναι «κάτω», ο παράγοντας PvLHY παρουσιάζει ελάχιστο στα επίπεδα έκφρασής του (Εικ. Γ.10 Α). Άρα, φαίνεται η ρύθμιση του φαινομένου της ρυθμικής κίνησης των φύλλων να μη γίνεται μέσω του παράγοντα PvLHY. Όσον αφορά το PvTOC1, παρατηρήθηκε ότι τα φύλλα αρχίζουν να «πέφτουν», δηλαδή πραγματοποιείται η μετάβαση από την θέση «επάνω» στη θέση «κάτω» ή στην ενδιάμεση κατάσταση, όταν η γονιδιακή έκφραση του PvTOC1 παρουσιάζει μέγιστο (Εικ. Γ.10 Β). Έτσι, ο παράγοντας PvTOC1 παρουσίασε μεγαλύτερο ενδιαφέρον για περαιτέρω μελέτη σχετικά με το φαινόμενο της ρυθμικής κίνησης των φύλλων. 119

121 Εικ. Γ.10. Καταγραφή των ρυθμών στις κινήσεις φύλλων φασολιού, σε φωτοπερίοδο LD 6:18, σε αντιπαραβολή με τους ρυθμούς στην έκφραση των γονιδίων του ρολογιού (Α) PvLHY και (Β) PvTOC1. Στα φύλλα που βρίσκονταν «επάνω» δόθηκε η τιμή «3» και σε αυτά που βρίσκονταν «κάτω» η τιμή «1». Σε όποια ενδιάμεση θέση δόθηκε η τιμή «2». Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. Προκειμένου να διαπιστωθεί τυχόν συσχέτιση της απόκρισης του παράγοντα PvTOC1 στο φως με το φαινόμενο της ρυθμικής κίνησης των φύλλων, εξετάστηκαν οι κινήσεις των φύλλων και σε φυτά που είχαν εκτεθεί σε «τεχνητό ξημέρωμα» όπως έχει ήδη περιγραφεί αναλυτικά τόσο στην ενότητα Β.2.2, όσο και στην ενότητα Γ Σε αυτά τα φυτά καταγράφηκαν οι ρυθμοί στην κίνηση των φύλλων, ενώ παράλληλα αναλύθηκε η γονιδιακή έκφραση του παράγοντα του ρολογιού, PvTOC1 (βλ. ενότ. Γ.1.2.2) και τοποθετήθηκαν οι εν λόγω ρυθμοί στο ίδιο γράφημα (Εικ. Γ.11). Διαπιστώνεται και πάλι, σε κάθε περίπτωση, ότι τα φύλλα αρχίζουν να «πέφτουν» όταν η γονιδιακή έκφραση του PvTOC1 παρουσιάζει μέγιστο (Εικ. Γ.11 Α, Β και Γ). 120

122 Εικ. Γ.11. Καταγραφή των ρυθμών στις κινήσεις φύλλων φασολιού, που έχουν αναπτυχθεί σε φωτοπερίοδο LD 6:18, σε αντιπαραβολή με τους ρυθμούς στη γονιδιακή έκφραση του παράγοντα PvTOC1. Τα φυτά είχαν εκτεθεί σε «τεχνητό ξημέρωμα» (AD) τη χρονική στιγμή (Α) 57, AD57, (B) 60, AD60 και (Γ) 68, AD68. Στα φύλλα που βρίσκονταν «επάνω» δόθηκε η τιμή «3» και σε αυτά που βρίσκονταν «κάτω» η τιμή «1». Σε όποια ενδιάμεση θέση δόθηκε η τιμή «2». Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. 121

123 Γ. 2. Οι πρωτοπλάστες από φύλλα φασολιού ως σύστημα μελέτης του ΗΒΡ Οι πρωτοπλάστες των φυτών, δηλαδή κύτταρα χωρίς κυτταρικό τοίχωμα, αποτελούν δεκτικά συστήματα για εισαγωγή ξένου DNA και έχουν χρησιμοποιηθεί για μελέτες υποκινητών, υποκυτταρικού εντοπισμού διαφόρων πρωτεϊνών, σε πειράματα φυσιολογίας μελετώντας την απόκριση στην παρουσία ορμονών, στη μεταγωγή μηνυμάτων κ.ά. (Sheen, 2001). Επειδή η απομόνωση των πρωτοπλαστών απαιτεί ενζυμική απομάκρυνση του κυτταρικού τοιχώματος, υπάρχει η εσφαλμένη εντύπωση ότι πρόκειται για κύτταρα που έχουν υποστεί μη αντιστρεπτή καταπόνηση και συνεπώς οδηγούνται προς το θάνατο. Στην πραγματικότητα, όταν η απομόνωση έχει γίνει σωστά, όπως και η διατήρηση τους, τα κύτταρα έχουν τις ίδιες κυτταρικές, βιοχημικές και φυσιολογικές ιδιότητες. Διατηρούν δε τη βιωσιμότητά τους για πάνω από 48 ώρες μέσα σε ένα απλό διάλυμα μαννιτόλης (Sheen, 2001). Στην παρούσα διατριβή, οι πρωτοπλάστες από πρωτογενή φύλλα φασολιού χρησιμοποιήθηκαν ως σύστημα για τη μελέτη του βιολογικού ρολογιού του φασολιού, αξιοποιώντας τους τόσο για τη μελέτη της επίδρασης χορήγησης ουσιών, όσο και ως σύστημα παροδικού μετασχηματισμού με εξωγενές DNA για τη μελέτη των μηχανισμών λειτουργίας του ΗΒΡ. Γ.2.1. Απομόνωση πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού Στο φασόλι, ο σταθερός μετασχηματισμός είναι μία κοστοβόρος και χρονοβόρος διαδικασία, με εξαιρετικά χαμηλή αποδοτικότητα. Αυτός άλλωστε είναι και ο λόγος που, ενώ αποτελεί ένα φυτό μεγάλης οικονομικής σημασίας, δεν υπάρχει μεγάλος αριθμός διαθέσιμων μεταλλαγμάτων (Hnatuszko-Konka et al., 2004). Έτσι, οι πρωτοπλάστες από φύλλα φασολιού μπορούν να αποτελέσουν ένα καλό εναλλακτικό σύστημα μελέτης της φυσιολογίας και των μοριακών μηχανισμών στο φασόλι. Ελλείψει αναλυτικού και αποδοτικού πρωτοκόλλου απομόνωσης και μετασχηματισμού πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού στη διαθέσιμη βιβλιογραφία, πραγματοποιήθηκαν διάφορες δοκιμές προς αυτή την κατεύθυνση, οι οποίες έχουν περιγραφεί σε προηγούμενη ερευνητική δουλειά (Γαλέου, Μεταπτυχιακή διατριβή, Γ.Π.Α. 2012). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται το τελικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς, για την απομόνωση, τη διατήρηση, το χειρισμό και το μετασχηματισμό των πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού. 122

124 Χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή φύλλα φασολιού ημερών. Αφού αφαιρέθηκε με ένα ξυράφι όσο μεγαλύτερο μέρος της κάτω επιδερμίδας του φύλλου ήταν δυνατό, τα φύλλα τεμαχίστηκαν σε μικρότερα κομμάτια και μεταφέρθηκαν σε γυάλινο τρυβλίο (Εικ. Γ.12 Α). Η πέψη πραγματοποιήθηκε για 2 ώρες, σε διάλυμα πέψης στους 30 C (Εικ. Γ.12 Β). Μετά την απομόνωσή τους, λήφθηκε δείγμα πρωτοπλαστών προς χρώση με trypan blue, ώστε να εκτιμηθεί η ζωτικότητά τους και να μετρηθεί ο αριθμός τους. Το trypan blue εισέρχεται στα νεκρά κύτταρα και τα χρωματίζει μπλε, ενώ δεν μπορεί να εισέλθει στα ζωντανά. Στην εικόνα Γ.12 φαίνονται φρεσκοαπομονωμένοι πρωτοπλάστες φασολιού, πριν και μετά τη χρώση με trypan blue (Εικ. Γ.12 Γ και Δ, αντίστοιχα), όπως παρατηρούνται στο μικροσκόπιο (μεγέθυνση 100 x). Η απόδοση της μεθόδου ήταν περίπου 2-5x10 5 πρωτοπλάστες/25 mg φύλλων/ml διαλύματος πέψης. Εικ. Γ.12. Απομόνωση πρωτοπλαστών από πρωτογενή φύλλα φασολιού. (Α-Β) Φύλλα φασολιού σε διάλυμα πέψης, (Α) πριν και (Β) μετά την πέψη. (Γ-Δ) Πρωτοπλάστες φασολιού όπως παρατηρούνται σε οπτικό μικροσκόπιο, σε μεγέθυνση 100 x, (Γ) πριν και (Δ) μετά τη χρώση με trypan blue. 123

125 Γ.2.2. Μελέτη ρυθμών γονιδίων του ΗΒΡ σε πρωτοπλάστες φασολιού Η διαδικασία της απομόνωσης πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού καταλήγει σε ένα σύνολο κυττάρων, τα οποία έχουν προέλθει κατά βάση από το μεσόφυλλο του φυτού. Στα φυτά θεωρείται ότι ο συγχρονισμός του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού γίνεται μέσω του φωτός, το οποίο λειτουργεί ως ο κύριος χρονοδότης. Σε άλλα φυτικά είδη, τόσο στο πειραματόφυτο A. thaliana (Kim και Somers, 2010), όσο και στο ψυχανθές Samanea saman (Kim et al., 1993) έχει δειχθεί ότι οι πρωτοπλάστες διαθέτουν λειτουργικό ρολόι. Για να εξακριβωθεί το κατά πόσο ισχύει το ίδιο και για το σύστημα πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, συλλέχθηκαν δείγματα για απομόνωση RNA ανά τακτά χρονικά διαστήματα για 48 ώρες από την ημέρα της απομόνωσης των πρωτοπλαστών. Ως ώρα «μηδέν» τέθηκε η χρονική στιγμή που άναψαν τα φώτα την ημέρα της απομόνωσης. Τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν μέσω RT και PCR πραγματικού χρόνου ως προς την έκφραση διαφόρων γονιδίων του ρολογιού (Εικ. Γ.13). Σε όλες τις περιπτώσεις, παρατηρήθηκαν έντονοι 24-ωροι ρυθμοί. Επιπλέον, όλα τα εξεταζόμενα ρυθμικά γονίδια παρουσίασαν τις ακροφάσεις τους στις αναμενόμενες χρονικές στιγμές, με βάση προηγούμενες μελέτες από ολόκληρα φύλλα φασολιού και τη σχετική βιβλιογραφία. Συγκεκριμένα, το PvLHY εμφάνισε τα μέγιστα επίπεδα έκφρασής του νωρίς το πρωί και τα ελάχιστα το απόγευμα (Εικ. Γ.13 Α), όπως έχει αναφερθεί σε προηγούμενα πειράματα του εργαστηρίου σε άθικτα φύλλα (Kaldis et al., 2003). Ομοίως, το PvRVE8 εκφράζεται ρυθμικά ως πρωινό γονίδιο (Εικ. Γ.13 Β), παρόμοια με το ορθόλογό του, RVE8, από το A. thaliana (Rawat et al., 2011). Τα PvTOC1 και PvELF4 είναι εσπερινά γονίδια, δηλαδή εμφανίζουν ρυθμούς στην έκφρασή τους με μέγιστο το απόγευμα και ελάχιστο το πρωί (Εικ. Γ.13 Γ και Δ, αντίστοιχα), σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα από ολόκληρα φύλλα φασολιού (ενότ. Γ.1.2.1, Εικ. Γ.3 Α και Β, αντίστοιχα και Galeou και Prombona, 2012). Στη συνέχεια, εξετάστηκε ένα γονίδιο που σχετίζεται με τη φωτοσύνθεση, το PvLHCB2, γονίδιο της αποπρωτεΐνης του φωτοσυλλεκτικού συμπλόκου του φωτοσυστήματος ΙΙ, το οποίο έχει καθιερωθεί ως γονίδιο αναφοράς για τη λειτουργία του ρολογιού (output). Παρατηρήσαμε ότι η έκφρασή του ήταν ρυθμική, με τις ακροφάσεις στις αναμενόμενες χρονικές στιγμές (Εικ. Γ.14) (Kaldis et al., 2003). Διαπιστώθηκε, λοιπόν, ότι το ρολόι στο σύστημα των πρωτοπλαστών που κατασκευάστηκε, είναι λειτουργικό και ότι τα εξεταζόμενα γονίδια του ρολογιού 124

126 διατηρούν τους 24-ωρους ρυθμούς τους, επομένως θα πρέπει να θεωρείται αξιόπιστο για χρήση σε πειράματα μελέτης του ΗΒΡ. Γ.2.3. Επίδραση της χορήγησης τριχοστατίνης Α και νικοτιναμιδίου στην έκφραση γονιδίων του ΗΒΡ σε πρωτοπλάστες φασολιού Αφού διαπιστώθηκε πως το ρολόι στους πρωτοπλάστες φασολιού παραμένει λειτουργικό και ότι οι ρυθμοί των γονιδίων του ρολογιού διατηρούνται σε 24-ωρη βάση και σε συμφωνία με αντίστοιχες αναφορές από ολόκληρα φυτά (ενότ. Γ.2.2), θελήσαμε να δούμε αν οι ουσίες, των οποίων τη δράση θέλαμε να εξετάσουμε στο ρολόι, έχουν κάποια επίδραση όταν χορηγούνται στους πρωτοπλάστες. Δεδομένου ότι η χορήγηση αυτών των ουσιών δεν είχε κάποια επίδραση στους ρυθμούς των γονιδίων του ρολογιού που εξετάστηκαν σε ολόκληρα φύλλα (ενότ. Γ.1.2.3) και αν λάβουμε υπόψη την πιθανότητα αυτό να οφείλεται στη μη απορρόφηση τους από τα φύλλα, οι πρωτοπλάστες αποτελούν μία καλή εναλλακτική λύση. Οι ουσίες χορηγούνται απευθείας στο διάλυμα διατήρησης που βρίσκονται οι πρωτοπλάστες, οι οποίοι ως κυτταρικό σύστημα, πιθανά να είναι πιο δεκτικοί σε χορήγηση εξωγενών ουσιών, ακόμα και σε μικρότερες συγκεντρώσεις της ουσίας. Για τη μελέτη της αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, ως ένας πιθανός μηχανισμός της ρύθμισης του ρολογιού του φασολιού, αρχικά, η ουσία που επιλέχθηκε να εξεταστεί ήταν η τριχοστατίνη Α (TSA). Προστέθηκαν 20 μμ TSA (Sigma) στις επιλεγμένες χρονικές στιγμές, κατά το πρώτο 24-ωρο μετά την απομόνωση των πρωτοπλαστών. Τα κύτταρα παρέμειναν στη φωτοπερίοδο που είχαν αναπτυχθεί τα φυτά (LD 12:12), τόσο μετά την απομόνωση, όσο και μετά τη χορήγηση της TSA. Συλλέχθηκαν δείγματα για απομόνωση RNA, τόσο από πρωτοπλάστες στους οποίους είχε γίνει χορήγηση TSA, όσο και από δείγματαμάρτυρες (control) για 48 ώρες από την ημέρα της απομόνωσης των πρωτοπλαστών, ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Ως ώρα «μηδέν» ορίστηκε η χρονική στιγμή που άναψαν τα φώτα την ημέρα της απομόνωσης. Τα δείγματα αυτά αναλύθηκαν μέσω RT και PCR πραγματικού χρόνου ως προς την έκφραση διαφόρων γονιδίων του ρολογιού (Εικ. Γ.13), παράλληλα με τα δείγματα στα οποία δεν είχε γίνει χορήγηση TSA (Εικ. Γ.13, διακεκομμένες γραμμές). 125

127 Εικ. Γ.13. Ρυθμοί στην έκφραση γονιδίων του ρολογιού και επίδραση χορήγησης TSA σε πρωτοπλάστες φασολιού. Σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων (Α) PvLHY, (B) PvRVE8, (Γ) PvTOC1 και (Δ) PvELF4. Μετά την απομόνωση, οι πρωτοπλάστες επανατοποθετήθηκαν στην προϋπάρχουσα φωτοπερίοδο (LD 12:12) και προστέθηκε TSA (20 μμ) τις χρονικές στιγμές 12 (TSA 12), 18 (TSA18), 24 (TSA 24) και 30 (TSA 30) της ημέρας απομόνωσης. Με διακεκομμένες γραμμές παρουσιάζονται τα δείγματα μάρτυρες, τα οποία δεν έχουν υποστεί κάποιο χειρισμό (κλειστά σύμβολα) και με ανοιχτά σύμβολα, τα δείγματα μετά την προσθήκη της TSA. Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. Η TSA προωθεί τη «χαλάρωση» της χρωματίνης, στα σημεία που δρουν οι αποακετυλάσες ιστονών και τη μετάβαση σε μεταγραφικά ενεργές δομές (Yoshida et al., 1995). Αυτό συνήθως ακολουθείται από αύξηση των επιπέδων έκφρασης ορισμένων γονιδίων (Görisch et al., 2005). Σύμφωνα με τα δικά μας αποτελέσματα, η TSA είχε διαφορετική επίδραση στην έκφραση κάθε εξεταζόμενου γονιδίου. Το PvLHY παρουσίασε καθυστέρηση της φάσης του ρυθμού του, ανάλογα με το χρόνο της εφαρμογής της TSA (Εικ. Γ.13 Α). Παρόμοια επίδραση παρατηρήθηκε στην 126

128 έκφραση και του γονιδίου, PvLHCB2 (Εικ. Γ.14). Το PvRVE8 (Εικ. Γ.13 Β) και το PvTOC1 (Εικ. Γ.13 Γ) καταστέλλονται από την TSA, σε κάθε περίπτωση, ενώ το PvELF4 (Εικ. Γ.13 Δ) επάγεται σταθερά σε υψηλότερα επίπεδα, ανεξάρτητα από το χρόνο εφαρμογής της TSA. Επομένως, η αναδιαμόρφωση χρωματίνης είναι ένας πιθανός ρυθμιστικός μηχανισμός της έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού του φασολιού, ο οποίος διαφοροποιείται ανάλογα με το εξεταζόμενο γονίδιο. Εικ. Γ.14. Ρυθμοί στην έκφραση του γονιδίου PvLHCB2 πριν και μετά τη χορήγηση TSA (20 μμ) σε πρωτοπλάστες φασολιού, τις χρονικές στιγμές 12 (TSA 12), 18 (TSA 18), 24 (TSA 24) και 30 (TSA 30). Ως 0 θεωρείται η χρονική στιγμή που άνοιξαν τα φώτα την ημέρα της απομόνωσης. Με διακεκομμένες γραμμές παρουσιάζονται τα δείγματα μάρτυρες, τα οποία δεν έχουν υποστεί κάποιο χειρισμό (κλειστά σύμβολα) και με ανοιχτά σύμβολα, τα δείγματα μετά την προσθήκη της TSA. Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. Πραγματοποιήθηκαν, επίσης, πειράματα για την επίδραση του νικοτιναμιδίου (ΝΑΜ, αναστολέας των σιρτουινών, βλ. ενότ. Γ.1.2.3) (10 mm) στους ρυθμούς έκφρασης γονιδίων του ρολογιού, αλλά δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική μεταβολή σε σχέση με τα επίπεδα των δειγμάτων μαρτύρων (control), τόσο για τα εσπερινά γονίδια, PvTOC1 (Εικ. Γ.15 Α) και PvELF4 (Εικ. Γ.15 Β) όσο και για το πρωινό, PvLHY (Εικ. Γ.15 Γ) που εξετάστηκαν. Παρόμοια πειράματα πραγματοποιήθηκαν και με πενταπλάσια συγκέντρωση της ουσίας (50 mm) αλλά και πάλι δεν υπήρξε αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού. Η αρχική συγκέντρωση που δοκιμάστηκε (10 mm) είχε επίδραση στο ρολόι του A. thaliana 127

129 (Malapeira et al., 2012) ενώ στο φασόλι δεν έδωσε αποτέλεσμα ούτε η πενταπλάσια συγκέντρωση της ουσίας. Για το λόγο αυτό, δε διερευνήθηκε περαιτέρω η επίδραση του ΝΑΜ. Εικ. Γ.15. Επίδραση της χορήγησης NAM στην έκφραση των γονιδίων (A) PvTOC1, (Β) PvELF4 και (Γ) PvLHY, σε πρωτοπλάστες φασολιού. Μετά την απομόνωση, οι πρωτοπλάστες επανατοποθετήθηκαν στην προϋπάρχουσα φωτοπερίοδο (LD 12:12) και προστέθηκε NAM (10 mμ) τη χρονική στιγμή 24 (ΝΑΜ 24) της ημέρας απομόνωσης. Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν στον προϋπάρχοντα ρυθμό (control) και τα ανοιχτά στο ρυθμό μετά από τη χορήγηση του ΝΑΜ (NAM 24). Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. Γ.2.4. Παροδικός μετασχηματισμός πρωτοπλαστών φασολιού Ο μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε σε πρωτοπλάστες φασολιού, αμέσως μετά την απομόνωσή τους, χρησιμοποιώντας πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG 4000). Αρχικά, για την εξακρίβωση της απόδοσης της συγκεκριμένης μεθόδου μετασχηματισμού πρωτοπλαστών, το DNA που εισήχθη στους πρωτοπλάστες ήταν ο 128

130 φορέας υπερέκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης GFP, psat6-egfp (Tzfira, 2005). Η απόδοση του μετασχηματισμού αξιολογήθηκε μετρώντας το ποσοστό των μετασχηματισμένων πρωτοπλαστών (φθορίζουν πράσινο υπό UV ακτινοβολία) επί του συνόλου των μετρούμενων κυττάρων (Εικ. Γ.16 Α). Το κόκκινο χρώμα που παρατηρείται στην εικόνα προκύπτει από τον αυτοφθορισμό της χλωροφύλλης (φθορίζει κόκκινο μετά από έκθεση σε UV ακτινοβολία). Η απόδοση του μετασχηματισμού ήταν σταθερά μεγαλύτερη του 80%, ποσοστό αρκετά ικανοποιητικό. Εικ. Γ.16. Μετασχηματισμός πρωτοπλαστών φασολιού. Παροδικά μετασχηματισμένοι πρωτοπλάστες φασολιού, που εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη,gfp, όπως παρατηρούνται (Α) σε μικροσκόπιο φθορισμού (μεγέθυνση 100 x) και (Β) σε συνεστιακό μικροσκόπιο. Σε πρωτοπλάστες φασολιού, εξετάστηκαν οι διακυμάνσεις στα επίπεδα έκφρασης (Γ) ενός εσπερινού (PvELF4) και (Δ) ενός πρωινού (PvLHY) γονιδίου του ρολογιού, για 24 ώρες μετά το μετασχηματισμό τους. Τα κλειστά σύμβολα αντιστοιχούν σε δείγματα μάρτυρες, ενώ τα ανοιχτά σύμβολα, σε δείγματα μετά από μετασχηματισμό. Στον οριζόντιο άξονα, τα μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν τη νύχτα και τα άσπρα την ημέρα. 129

131 Στην Εικόνα Γ.16 Β παρουσιάζεται εικόνα από συνεστιακό μικροσκόπιο, το οποίο διαθέτει μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα και απεικονίζονται δύο πρωτοπλάστες φασολιού, που εκφράζουν την GFP. Η GFP φαίνεται να φθορίζει πράσινη και να βρίσκεται διάχυτη στο κυτταρόπλασμα, γεγονός αναμενόμενο, αφού εκφράζεται κυτταροπλασματικά. Με κόκκινο διακρίνονται καθαρά να φθορίζουν οι χλωροπλάστες των κυττάρων, λόγω του αυτοφθορισμού της χλωροφύλλης που περιέχουν (Εικ. Γ.16 Β). Επειδή ο μετασχηματισμός είναι μια διαδικασία που μπορεί να προκαλέσει καταπόνηση στα κύτταρα, εξετάστηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης mrna ορισμένων γονιδίων ρολογιού, προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι οι ρυθμοί τους δεν άλλαξαν. Συγκεκριμένα, εξετάστηκαν μέσω RT και PCR πραγματικού χρόνου, η έκφραση του εσπερινού γονιδίου του ρολογιού, PvELF4 και του πρωινού, PvLHY (Εικ. Γ.16 Γ και Δ, αντίστοιχα). Οι ενδογενείς ρυθμοί και των δύο παρέμειναν ανεπηρέαστοι μετά την υπερέκφραση της GFP, μιας εξωγενούς πρωτεΐνης που δεν σχετίζεται με το δίκτυο του ρολογιού. Από όλα τα παραπάνω αποτελέσματα (ενότ. Γ.2.2-Γ.2.4), μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το σύστημα των πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, που κατασκευάστηκε κατά την παρούσα διατριβή, είναι κατάλληλο για τη μελέτη του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού του φυτού. Γ.3. Μελέτη περιοχής των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1, PvLHY και PvELF4, με χρήση του συστήματος πρωτοπλαστών Κατά τα πρώτα χρόνια διεξαγωγής των πειραμάτων της παρούσας διδακτορικής διατριβής δεν ήταν γνωστή η αλληλουχία DNA του χρησιμοποιούμενου πειραματόφυτου (P. vulgaris), καθιστώντας τη διαδικασία απομόνωσης και αλληλούχησης δεδομένων άγνωστων περιοχών του γονιδιώματος του φυτού απαραίτητη για τη μετέπειτα μελέτη τους. Έτσι, με την τεχνική της PCR με χρήση προσαρμοστή (βλ. ενότ. Β.4.5.1) έγινε γνωστό μεγάλο μέρος της αλληλουχίας των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 (Εικ. Γ.17 Α), PvLHY (Εικ. Γ.17 Β) και PvELF4 (Εικ. Γ.17 Γ). Στην εικόνα Γ.17 παρουσιάζονται επισημασμένα με διαφορετικά χρώματα τα διάφορα πιθανά cis-ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίστηκαν, τα οποία συζητούνται παρακάτω (βλ. ενότ. Δ.3). Μετά τη δημοσίευση της αλληλουχίας του γονιδιώματος του φασολιού (Schmutz et al., 2014), οι αλληλουχίες αυτές ήταν πλέον 130

132 διαθέσιμες διαδικτυακά ( και για το λόγο αυτό διακόπηκε η αναζήτηση με αυτή τη μέθοδο. 131

133 Εικ. Γ.17. Η αλληλουχία των τμημάτων των υποκινητών των γονιδίων, (Α) PvTOC1, (B) PvLHY και (Γ) PvELF4. Επισημασμένα με χρώματα, παρουσιάζονται τα διάφορα πιθανά cis-ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίστηκαν. Κάθε στοιχείο αντιπροσωπεύεται από διαφορετικό χρώμα. Με την ένδειξη -1 σημειώνεται το πρώτο νουκλεοτίδιο ανοδικά του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (Open Reading Frame, ORF) κάθε γονιδίου. Για να μελετηθεί η ικανότητα διαφόρων τμημάτων της ανάρρους περιοχής των παραπάνω τριών γονιδίων του ρολογιού να λειτουργήσουν ως υποκινητές, κλωνοποιήθηκαν διαδοχικά αυξανόμενα τμήματα των περιοχών αυτών (περίπου bp, ανοδικά των ORF των γονιδίων) σε φορέα έκφρασης της λουσιφεράσης της πυγολαμπίδας (firefly luciferase, LUC). Τέθηκε, με τον τρόπο αυτό, το γονίδιο της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του εκάστοτε τμήματος του υποψήφιου υποκινητή. Στη συνέχεια, μετασχηματίζοντας παροδικά πρωτοπλάστες φασολιού με τους εν λόγω φορείς και μετρώντας την ενεργότητα του ενζύμου της λουσιφεράσης, εκτιμήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης από το δεδομένο τμήμα υποκινητή. Από τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παρακάτω, έγινε εμφανές ότι το σύστημα πρωτοπλαστών που αναπτύχθηκε είναι κατάλληλο για την in vitro μελέτη υποκινητών. 132

134 Η ενεργότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με τρεις μεθόδους. Οι δύο πρώτες μέθοδοι (Steady Glo και Dual Luciferase Reporter -DLR assay systems, Promega) μετρούν την ενεργότητα της λουσιφεράσης σε λύμα πρωτοπλαστών, οι οποίοι έχουν προηγουμένως μετασχηματιστεί με κατάλληλο/κατάλληλους φορείς έκφρασης του γονιδίου της λουσιφεράσης. Στην τρίτη μέθοδο (in vivo μέτρηση) μετριέται η ενεργότητα της λουσιφεράσης σε πραγματικό χρόνο σε ζωντανούς πρωτοπλάστες, οι οποίοι και πάλι έχουν προηγουμένως μετασχηματιστεί με κατάλληλο/κατάλληλους φορείς έκφρασης του γονιδίου της λουσιφεράσης, προσθέτοντας το υπόστρωμα της λουσιφεράσης, D-luciferin, στο διάλυμα διατήρησης των πρωτοπλαστών. Αρχικά, με το σύστημα Steady Glo, χρησιμοποιώντας το φθορισμό από φορέα υπερέκφρασης της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) για την κανονικοποίηση της απόδοσης του μετασχηματισμού μεταξύ των δειγμάτων, ελέγχθηκε το δυναμικό τμημάτων που καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος των υποκινητών των PvTOC1 και PvELF4, σε σύγκριση με τα επίπεδα του φορέα υπερέκφρασης της λουσιφεράσης, pbi35s:luc και του αντίστοιχου φορέα-χωρίς-υποκινητή, PLpBI (Εικ. Γ.18). Παρατηρήθηκε ότι η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης από το φορέα υπερέκφρασής της, pbi35s:luc, ήταν τα υψηλότερα. Δέκα φορές λιγότερα ήταν τα επίπεδα της λουσιφεράσης από το φορέα που εμπεριέχει το μεγαλύτερου μήκους υποκινητή του γονιδίου PvELF4 (PvELF4-1445:LUC) και εκατό φορές λιγότερα εκείνα του PvTOC1 (PvTOC1-1653:LUC) (Εικ. Γ.18). Παρόλα αυτά, τα επίπεδα του PvTOC1 ήταν δέκα φορές περισσότερα από τα επίπεδα του φορέα-χωρίς-υποκινητή, PLpBI (Εικ. Γ.18). Επίσης, παρατηρήθηκε ότι διπλασιάζοντας την ποσότητα πλασμιδίου στην περίπτωση των υποκινητών των δύο γονιδίων, από τα 15 στα 30 μg, αυξήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης της λουσιφεράσης (Εικ. Γ.18). Το γεγονός αυτό είναι ενδεικτικό του ότι πρόκειται για λειτουργικές περιοχές υποκινητή. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διαφορά που παρατηρείται δεν οφείλεται στη μείωση της συνολικής ποσότητας DNA, καθώς αυτή παρέμενε σταθερή, συμπληρώνοντας, όπου χρειαζόταν, με το φορέα-χωρίς-υποκινητή, PLpBI. 133

135 Εικ. Γ.18. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν μετασχηματιστεί παροδικά με τους αντίστοιχους φορείς: plpbi (φορέας-χωρίςυποκινητή), pbi35s:luc (φορέας υπερέκφρασης της LUC), pbipvtoc1-1653:luc (φορέας έκφρασης της LUC υπό τον έλεγχο του μεγαλύτερου μήκους τμήματος υποκινητή του PvTOC1, 1653 bp) και pbipvelf4-1445:luc (φορέας έκφρασης της LUC υπό τον έλεγχο του μεγαλύτερου μήκους τμήματος υποκινητή του PvELF4, 1445 bp). Σε παρενθέσεις παρουσιάζεται η ποσότητα πλασμιδίου που εισήχθη στους πρωτοπλάστες, από τον κάθε φορέα. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα DLR, στο οποίο χρησιμοποιείται η ενεργότητα της λουσιφεράσης από τη Renilla reniformis (Ren) για την κανονικοποίηση της απόδοσης του μετασχηματισμού μεταξύ των δειγμάτων. Προτιμήθηκε αυτή η μέθοδος, καθώς η λουσιφεράση από την R. reniformis είναι ένα ένζυμο με μικρό χρόνο ζωής, σε αντίθεση με την GFP. Έτσι, μελλοντικά, αυτή η μέθοδος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί και για την ανίχνευση αλλαγών στα επίπεδα έκφρασης κάποιου υποκινητή από γονίδιο του ρολογιού, σε διαφορετικούς χρόνους του 24-ώρου. 134

136 Εικ. Γ.19. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν μετασχηματιστεί παροδικά με τους αντίστοιχους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC), υπό τον έλεγχο τμημάτων του υποκινή του γονιδίου PvLHY. PLpBI: φορέας-χωρίς-υποκινητή. Οι φορείς έκφρασης παριστάνονται γραφικά, κάτω από το διάγραμμα. Με (+1) σημειώνεται το πρώτο ζεύγος βάσεων του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) του γονιδίου της LUC. Μέσω του DLR ανιχνεύθηκαν διαφορές στα επίπεδα έκφρασης διαφόρων τμημάτων των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1, PvELF4 και PvLHY. Παρατηρήθηκε ότι ο υποκινητής του γονιδίου PvLHY έχει χαμηλά σχετικά επίπεδα έκφρασης, καθώς το μεγαλύτερο διαθέσιμο τμήμα του (1905 bp) εμφάνισε μόλις τριπλάσια επίπεδα έκφρασης από αυτά του φορέα-χωρίς-υποκινητή, PLpBI (Εικ. Γ.19). Επίσης, οι φορείς που περιείχαν μικρότερα τμήματα του υποκινητή, δηλαδή ο L-452 και ο L-1008, εμφάνισαν παρόμοια επίπεδα με το φορέα-χωρίς-υποκινητή (Εικ. Γ.19). Άρα, η περιοχή μεταξύ και bp ανοδικά του ORF του γονιδίου φαίνεται να λειτουργεί ως υποκινητής με, σημειωτέον, ασθενή ενεργότητα. Η ενεργότητα υποκινητή του PvTOC1 αυξάνεται σταδιακά όσο αυξάνεται και το μήκος του υποκινητή από τις -241 έως τις bp και στη συνέχεια παραμένει σταθερή έως τις bp (Εικ. Γ.20 Α). Άρα, η περιοχή υποκινητή του PvTOC1 εκτείνεται μέχρι περίπου ζεύγη βάσεων ανοδικά του ORF του 135

137 γονιδίου. Τα επίπεδα ενεργότητας υποκινητή του PvELF4 (Εικ. Γ.20 Β) παραμένουν αμετάβλητα από τις -381 έως τις -604 bp, στη συνέχεια διπλασιάζονται εντός των επόμενων 50 bp (Ε-656, Εικ. Γ.20 Β) και μετά παραμένουν σταθερά ως τις bp. Αυτό υποδεικνύει ότι η περιοχή υποκινητή του PvELF4 εκτείνεται μέχρι -656 ζεύγη βάσεων ανοδικά του ORF του γονιδίου, καθώς και ότι στην περιοχή μεταξύ των -604 και -656 bp μπορεί να περιέχονται κάποια θετικά ρυθμιστικά στοιχεία. 136

138 Εικ. Γ.20. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν μετασχηματιστεί παροδικά με τους αντίστοιχους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC), υπό τον έλεγχο τμημάτων των υποκινητών των γονιδίων (Α) PvTOC1 και (B) PvELF4. PLpBI: φορέας-χωρίς-υποκινητή. Οι φορείς έκφρασης παριστάνονται γραφικά, κάτω από το κάθε διάγραμμα. Με (+1) σημειώνεται το πρώτο ζεύγος βάσεων του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης (ORF) του γονιδίου της LUC. Για να διερευνηθεί περαιτέρω η περιοχή αυτή των περίπου 50 bp του υποκινητή PvELF4 (-604 bp μέχρι -656 ανοδικά του ORF του γονιδίου), αρχικά κατασκευάστηκαν φορείς έκφρασης της LUC που περιείχαν την περιοχή του υποκινητή από τις -604 μέχρι τις -656 bp, ανά 10 bp. Χρησιμοποιώντας το σύστημα DLR, παρατηρήθηκε ότι η περιοχή που παρέχει τη μέγιστη ενεργότητα στον υποκινητή του PvELF4 περικλείεται μεταξύ των -646 και -656 bp (Εικ. Γ.21 Α). 137

139 Εικ. Γ.21. Λεπτομερής εξέταση περιοχής του υποκινητή του γονιδίου PvELF4. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν μετασχηματιστεί με τους αντίστοιχους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC), υπό τον έλεγχο τμημάτων του υποκινητή του γονιδίου PvELF4. (Α) Ανάλυση επιπέδων έκφρασης της περιοχής υποκινητή του PvELF4 μεταξύ -656 και -604 bp, ανά 10 bp. (Β) Ανάλυση τμημάτων υποκινητή του PvELF4 (μαύρα) και των αντίστοιχων τροποποιημένων τμημάτων (γκρι) μετά από προσθήκη ή απαλοιφή του 10μερούς τμήματος υποκινητή (μεταξύ -646 και -656). Αυτά τα 10 ζεύγη βάσεων του υποκινητή του PvELF4 (10μερές: TGAACTTTTG) φαίνεται να περιέχουν κάποιο θετικό ρυθμιστικό στοιχείο της μεταγραφής. Η αλληλουχία μελετήθηκε in silico, αλλά δεν εντοπίστηκαν γνωστά ρυθμιστικά μοτίβα υποκινητών. Για το λόγο αυτό, η αλληλουχία εισήχθη δεύτερη φορά στο φορέα Ε-656 (φορέας 2x10bpE-656) καθώς και μία φορά στο φορέα που περιείχε το μικρότερο διαθέσιμο κομμάτι υποκινητή του γονιδίου PvELF4 (φορέας 1x10bpE-381). Επίσης, η αλληλουχία αυτή αφαιρέθηκε από τον υποκινητή που 138

140 περιέχονταν στο φορέα Ε-940 (φορέας del10bpε-940). Τα επίπεδα υποκινητή από τον κάθε φορέα (σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης) αναλύθηκαν παράλληλα με το αντίστοιχο δείγμα μάρτυρα, δηλαδή τα επίπεδα του Ε-381, του Ε-656 και του Ε-940, ανά περίπτωση (Εικ. Γ.21 Β). Τα αποτελέσματα δεν ήταν αναμενόμενα. Με την προσθήκη και τον διπλασιασμό του στοιχείου των 10 bp δεν παρατηρήθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης, αλλά τα επίπεδα παρέμειναν σταθερά (φορέας 2x10bpΕ-656 και 1x10bpE-381). Το ίδιο όμως συνέβη και στην περίπτωση της απαλοιφής του δεκαμερούς από το φορέα Ε-940 (φορέας del10bpε-940), καθώς και σε αυτή την περίπτωση τα επίπεδα παρέμειναν σταθερά. Τέλος, διερευνήθηκε η δυνατότητα του συστήματος πρωτοπλαστών να χρησιμοποιηθεί για μετρήσεις in vivo, δηλαδή οι μετρήσεις να λαμβάνονται σε διαφορετικές χρονικές στιγμές από το ίδιο δείγμα ζωντανών πρωτοπλαστών. Μετά το μετασχηματισμό τους, οι πρωτοπλάστες τοποθετήθηκαν σε διάλυμα διατήρησης εμπλουτισμένου με το υπόστρωμα της λουσιφεράσης, D-luciferin και μεταφέρθηκαν σε συνεχές κόκκινο φως στο ΖΤ 7 (δηλ. 7 ώρες μετά το ξημέρωμα στην φωτοπερίοδο LD 12:12). Την επόμενη ημέρα καταγράφηκε η βιοφωταύγειά τους, ανά περίπου 3 ώρες, για έως και 30 ώρες, με χρήση λουμινόμετρου εξοπλισμένου με φωτοπολλαπλασιαστή (PMT, photomultiplier tube). Εξετάστηκε η δράση της λουσιφεράσης που κατευθύνεται από τους υποκινητές των γονιδίων του ρολογιού του φασολιού PvTOC1 (PvTOC1-1108:LUC), PvLHY (PvLHY-1905:LUC) και PvELF4 (PvELF4-940:LUC). Όσον αφορά τους υποκινητές των PvTOC1 και PvLHY (Εικ Γ.22 Α), πιθανώς λόγω τεχνικών περιορισμών της χρησιμοποιούμενης μεθόδου και των χαμηλών επιπέδων φωταύγειας, δεν ανιχνεύθηκαν ρυθμικές αλλαγές. Από την άλλη πλευρά, η ενεργότητα του υποκινητή του PvELF4 εμφάνισε υψηλά επίπεδα φωταύγειας, τα οποία παρουσίασαν έντονη ταλάντωση με περίοδο περίπου 24 ωρών. Τα μέγιστα επίπεδα παρατηρήθηκαν περίπου στο CT12 (υποκειμενική «δύση») και τα ελάχιστα κοντά στο υποκειμενικό «ξημέρωμα», στο CT22 (Εικ. Γ.22 Β). Τα παραπάνω αποτελέσματα βρίσκονται σε συμφωνία με εκείνα των επιπέδων mrna του PvELF4 υπό συνθήκες φωτοπεριόδου που παρουσιάστηκαν στην ενότ. Γ.2.2 (εικ. Γ.13 Δ). Έτσι, εκτός των άλλων, το σύστημα πρωτοπλαστών που κατασκευάστηκε στην παρούσα εργασία επιτρέπει και την παρακολούθηση του ΗΒΡ σε πραγματικό χρόνο. 139

141 Εικ. Γ.22. Βιοφωταύγεια από δείγματα ζωντανών πρωτοπλαστών, σε πραγματικό χρόνο. Οι πρωτοπλάστες είχαν μετασχηματιστεί με φορέα έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο τμήματος των υποκινητών των γονιδίων, PvTOC (- -), PvLHY-1905 ( x ) και PvELF4-940 (- -). Μεταφέρθηκαν σε σταθερό κόκκινο φως στο ZT7 και οι μετρήσεις φωταύγειας λήφθηκαν από την επόμενη μέρα ανά 2-5 ώρες, για συνολικά 30 ώρες. Κάθε τιμή αντιστοιχεί στο μέσο όρο ± SD (n = 4). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Στον οριζόντιο άξονα, τα λευκά και τα ριγωτά μαύρα κουτιά αντιπροσωπεύουν την υποκειμενική ημέρα και την υποκειμενική νύχτα, αντίστοιχα. Γ.4. Επίδραση της υπερέκφρασης πρωτεϊνών του ΗΒΡ στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων του ΗΒΡ στο φασόλι Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvLHY Γ Υπερέκφραση της PvLHY σε ετερόλογο σύστημα, φυτών A. thaliana (φυτά PvLHY-ox) Σε προηγούμενη ερευνητική δουλειά, είχαν παρασκευαστεί διαγονιδιακά φυτά A. thaliana, ώστε να εκφράζουν σταθερά το γονίδιο του ρολογιού του φασολιού, PvLHY, κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή 35S (Δ. Γεωργιάδου, Διπλωματική μελέτη, Ε.Κ.Π.Α. 2015). Η εργασία αυτή είχε φτάσει μέχρι την ανάλυση ομοζυγωτών φυτών της γενιάς Τ2. Στόχος ήταν η χρήση των A. thaliana ως ετερόλογο σύστημα 140

142 έκφρασης του PvLHY και κατ επέκταση η in vivo μελέτη της λειτουργίας του εν λόγω παράγοντα, συγκρίνοντας φυτά αγρίου τύπου με τα διαγονιδιακά που εκφράζουν το PvLHY (φυτά PvLHYox). Γ α. Εξακρίβωση της υπερέκφρασης του PvLHY mrna στα φυτά PvLHY-ox Στο πρώτο στάδιο της ανάλυσης των διαγονιδικών φυτών PvLHY-ox ήταν απαραίτητη πρώτα η εξακρίβωση της υπερέκφρασης του PvLHY στα δεδομένα φυτά. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκε RNA από δύο φυτά από κάθε επιλεγμένη σειρά, καθώς και από ένα φυτό αγρίου τύπου (wt), ως αρνητικός μάρτυρας. Η έκφραση του PvLHY εξετάστηκε μέσω RT-PCR. Ως ιδιοσύστατο γονίδιο χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο που κωδικοποιεί για το 18S rrna του φυτού. Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης των PCR φαίνονται στην εικόνα Γ.23. Εντοπίστηκε έκφραση του PvLHY σε όλα τα φυτά πλην αυτών του αγρίου τύπου (wt). Πιο έντονη ήταν η έκφραση του γονιδίου στα φυτά της σειράς 6 (Εικ. Γ.23). Για αυτό το λόγο, αυτή η σειρά επιλέχθηκε για τη μετέπειτα εξέταση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού. Εικ. Γ.23. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης των PCR από φυτά αγρίου τύπου (wt) και διαγονιδιακά PvLHY-ox φυτά, για τα γονίδια PvLHY και 18S rrna. Στην πρώτη διαδρομή φαίνονται ζώνες του μοριακού δείκτη 2-Log DNA Ladder (New England Biolabs) και με βέλη σημειώνονται τα μεγέθη τους. Γ β. Καταγραφή φαινοτύπων στα φυτά PvLHY-ox Για την περαιτέρω ανάλυση των διαγονιδικών φυτών PvLHY-ox πραγματοποιήθηκε παρατήρηση και καταγραφή πληθώρας χαρακτηριστικών του φαινοτύπου των φυτών αγρίου τύπου και διαγονιδιακών, όπως φαίνεται στους 141

143 πίνακες Γ.1.-Γ.6. Αναλύθηκαν 6 φυτά αγρίου τύπου (wt) ως μάρτυρες και από 8 φυτά για κάθε μία από τις επιλεγμένες σειρές της γενιάς Τ2, 1+4, 3+8, 3+16, 6+12 και Η καταγραφή πραγματοποιήθηκε όταν είχαν ολοκληρώσει την ανάπτυξή τους, στις 55 ημέρες μετά την φύτευση. Στην περίπτωση της μέτρησης των φύλλων ροζέττας, μετρήσεις ελήφθησαν για τα φυτά αγρίου τύπου και ενδεικτικά μόνο για τα φυτά των σειρών 1+4 και Υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι (Μ.Ο.) και οι τυπικές αποκλίσεις (Τ.Α.). Για κάθε σειρά φυτών και παρατηρήθηκε και ο χρόνος άνθησης των φυτών, αλλά δεν καταγράφηκε διότι άνθησαν σχεδόν την ίδια ημέρα. Δυστυχώς, σε κανένα από τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που καταγράφηκαν δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά μεταξύ των φυτών αγρίου τύπου και των διαγονιδιακών φυτών, PvLHY-ox, όπως διαπιστώνεται από τους παραπάνω πίνακες (Πίν. Γ.1-Γ-6). Πιθανά, επειδή το PvLHY είναι γονίδιο του ρολογιού, οι επιδράσεις της υπερέκφρασής του να μπορούσαν να εντοπιστούν σε πιο εξειδικευμένα χαρακτηριστικά. Πίνακας. Γ.1. Αριθμός φύλλων ροζέττας. Φυτό wt Μ.Ο. 22, ,75 22,25 Τ.Α. 2, , , Πίνακας. Γ.2. Αριθμός πλάγιων βλαστών. Φυτό wt Μ.Ο. 2, ,75 1,5 2,5 2,5 2,375 Τ.Α. 0, , , , , ,

144 Πίνακας. Γ.3. Αριθμός δευτερογενών βλαστών. Φυτό wt Μ.Ο. 3 2,5 3,125 2,625 2,875 3 Τ.Α. 0 0, , , , , Πίνακας. Γ.4. Μήκος κύριου βλαστού. Φυτό wt ,7 29,5 26, , ,6 30,5 31,2 24,5 31,5 33,7 3 27,3 33, ,5 28,2 4 26, ,4 26, , , , ,5 29,2 29, , , , , ,5 28,5 Μ.Ο. (cm) 26,15 29,975 27, , ,6 32,225 Τ.Α. 2, , , , , , Πίνακας. Γ.5. Νωπό βάρος υπέργειου τμήματος. Φυτό wt ,92 3,2 1,96 2,12 3,28 2,47 2 2,48 2,6 2,42 2,62 2,59 3,43 3 2,16 3,03 1,56 2,16 2,79 2,27 4 2,4 2,06 2,25 2,49 2,7 2,71 5 2,32 2,51 2,16 1,63 1,9 3,01 6 2,17 2,59 2,45 2 2,85 2,45 7 2,74 2,16 3,36 1,73 2,37 8 2,27 2,55 1,81 2,3 2,34 Μ.Ο. (g) 2, ,625 2, , ,5175 2,63125 Τ.Α. 0, , , , , ,

145 Πίνακας Γ.6. Ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος. Φυτό wt 1(4) 3(8) 3(16) 6(12) 6(17) 1 0,17 0,28 0,13 0,16 0,29 0,2 2 0,21 0,24 0,2 0,21 0,23 0,31 3 0,18 0,22 0,12 0,16 0,23 0,18 4 0,19 0,18 0,19 0,18 0,23 0,22 5 0,2 0,19 0,17 0,11 0,16 0,24 6 0,19 0,17 0,19 0,12 0,25 0,18 7 0,22 0,18 0,27 0,15 0,2 8 0,18 0,2 0,13 0,18 0,18 M.O.(g) 0,19 0,21 0,1725 0,1675 0,215 0,21375 T.A. 0, , , , , , Γ γ. Ανάλυση γονιδίων του ΗΒΡ στα φυτά PvLHY-ox Σε μια τελευταία προσπάθεια εντοπισμού διαφορών μεταξύ των φυτών αγρίου τύπου και των φυτών που εκφράζουν το γονίδιο PvLHY του ρολογιού του φασολιού (PvLHY-ox, σειρά 6), αναλύθηκαν τα σχετικά επίπεδα έκφρασης διαφόρων γονιδίων του ρολογιού του φυτού (TOC1, CCA1, PRR9 και ELF4) μέσω PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. Γ.24). Οι διαφορές, όμως, που εντοπίστηκαν δεν ήταν στατιστικώς σημαντικές σε κανένα από τα εξεταζόμενα γονίδια (Εικ. Γ.24). Εικ. Γ.24. Ανάλυση των σχετικών επιπέδων έκφρασης mrna διαφόρων γονιδίων του ρολογιού του φυτού, A. thaliana, μέσω PCR πραγματικού χρόνου, από φυτά αγρίου τύπου (wt) και από φυτά που υπερεκφράζουν το γονίδιο του ρολογιού του φασολιού, PvLHY (PvLHY-ox). 144

146 Παρατηρήθηκε ότι τόσο στα wt, όσο και στα PvLHY-ox φυτά, τα επίπεδα των γονιδίων TOC1 και ELF4 ήταν χαμηλά, ενώ των γονιδίων CCA1 και PRR9 ήταν υψηλά (Εικ. Γ.24). Κάτι τέτοιο ήταν αναμενόμενο, αφού τα δείγματα RNA είχαν συλλεχθεί κατά το ξημέρωμα (άνοιγμα των φώτων, ZT0). Τη χρονική αυτή στιγμή είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι τα PRR9 και CCA1 βρίσκονται κοντά στο μέγιστο της έκφρασής των mrna τους, ενώ τα ELF4 και TOC1, κοντά στο ελάχιστό τους. Συμπεραίνουμε, λοιπόν, ότι παρόλο που τα γονίδια εκφράζονται με τις αναμενόμενες φάσεις, δεν παρουσιάζουν διαφορά στα επίπεδα έκφρασής τους ανάμεσα στα wt και στα PvLHY-ox φυτά. Άρα, ενώ η έκφραση του PvLHY σε φυτά A. thaliana ήταν επιτυχής, τουλάχιστον σε επίπεδο mrna (Εικ. Γ.23), τα φυτά αυτά δεν παρουσίασαν κάποια φαινοτυπική διαφορά (Γ β), αλλά ούτε κάποια διαφορά στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων του ρολογιού συγκριτικά με φυτά αγρίου τύπου (Εικ. Γ.24). Γ Υπερέκφραση της PvLHY σε ομόλογο σύστημα, πρωτοπλαστών φασολιού Η επίδραση της υπερέκφρασης του παράγοντα PvLHY μελετήθηκε και στο ομόλογο σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού. Η αλληλουχία που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη PvLHY εισήχθη στον φορέα υπερέκφρασης pbi, κάτω από τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή 35S (φορέας PvLHYox). Στη συνέχεια εξετάστηκε, αν η υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvLHY επιφέρει κάποια αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων του ρολογιού. Για το λόγο αυτό, οι πρωτοπλάστες συν-μετασχηματίστηκαν με το φορέα υπερέκφρασης της PvLHY (PvLHY-ox) και τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων του ρολογιού, PvTOC1 (PvΤOC1-1653:LUC) και PvELF4 (PvELF4-1445:LUC). Η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης εξετάστηκε μέσω του DLR συστήματος και συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ενεργότητα δειγμάτων-μαρτύρων, τα οποία αντί για το φορέα PvLHY-ox είχαν συν-μετασχηματιστεί με το αντίστοιχο κενό φορέα, EV (pbiev). Ούτε σε αυτή την περίπτωση παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά στα δείγματα που εκφράζουν την πρωτεΐνη PvLHY, σε σχέση με τον κενό φορέα (Εικ. Γ.25). 145

147 Εικ. Γ.25. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvLHY στην ενεργότητα των υποκινητών γονιδίων του ΗΒΡ. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συνμετασχηματιστεί με τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 (PvTOC1-1653:LUC) και PvELF4 (PvELF4-1449:LUC) και το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvLHY (PvLHYox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα (EV). Συμπερασματικά, η υπερέκφραση της PvLHY τόσο στο ετερόλογο σύστημα διαγονιδιακών φυτών A. thaliana, όσο και στο ομόλογο σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού, δεν είχε κάποια επίδραση στα επίπεδα έκφρασης ούτε του PvTOC1 ούτε του PvELF4. Καθώς δεν υπάρχει εμπορικά διαθέσιμο αντίσωμα έναντι της PvLHY και ούτε είχε ενσωματωθεί κάποιος επίτοπος (π.χ. myc, FLAG, HA) σε καμία από τις δύο περιπτώσεις, δεν υπήρχε δυνατότητα ανίχνευσής της έκφρασης του παράγοντα σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Έτσι, υπάρχει η πιθανότητα, για κάποιο άγνωστο λόγο, να μην είχε υπερεκφραστεί επιτυχώς σε επίπεδο πρωτεΐνης και συνεπώς για αυτό το λόγο να μην παρατηρήθηκε καμία επίδραση σε κανένα από τα εξεταζόμενα γονίδια. Γ.4.2. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvELF4 Η αλληλουχία που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PvELF4 κλωνοποιήθηκε σε φορέα υπερέκφρασης κάτω από τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή, 35S (psat). Παράλληλα, στο 5 -άκρο του ORF του PvELF4 προστέθηκε και η αλληλουχία που 146

148 κωδικοποιεί για τον επίτοπο myc (φορέας PvELF4ox). Ο επίτοπος προστέθηκε ώστε να μπορεί να ανιχνευθεί η πρωτεΐνη PvELF4, που θα τον περιέχει στο Ν-τελικό άκρο της, χρησιμοποιώντας αντίσωμα ειδικό ως προς τον επίτοπο, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο. Ο χιμαιρικός φορέας χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα μετασχηματισμού πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού και αρχικά, απομονώθηκε πρωτεΐνη από τους μετασχηματισμένους πρωτοπλάστες, ώστε να διαπιστωθεί η υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvELF4. Διαφορετικές ποσότητες του ίδιου δείγματος πρωτεΐνης από πρωτοπλάστες, μετασχηματισμένους με τον φορέα PvELF4ox, αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακριλαμίδης (5, 10 και 20 μl από 100 μl δείγματος). Μετά από μεταφορά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η πρωτεΐνη PvELF4 ανιχνεύθηκε με αντίσωμα έναντι του επιτόπου myc (Εικ. Γ.26 Α). Η χιμαιρική πρωτεΐνη myc:pvelf4 αναμένεται να έχει μέγεθος περίπου 20 kda και όπως φαίνεται στην εικόνα Γ. 26Α, εκφράστηκε επιτυχώς στο σύστημα πρωτοπλαστών και είχε μέγεθος κοντά στο αναμενόμενο. Το επόμενο βήμα ήταν να διερευνηθεί η επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvELF4 στα επίπεδα έκφρασης των υπό μελέτη υποκινητών γονιδίων του ρολογιού. Για το λόγο αυτό, πρωτοπλάστες φασολιού συν-μετασχηματίστηκαν με το φορέα υπερέκφρασης της PvELF4 (PvELF4ox) και τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 (PvΤOC1-1653:LUC) και PvLHY (PvLYH-1905:LUC). Η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης εξετάστηκε μέσω του Steady Glo συστήματος και συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ενεργότητα δειγμάτων-μαρτύρων, τα οποία αντί για το φορέα PvELF4ox είχαν συν-μετασχηματιστεί με τον αντίστοιχο κενό φορέα, EV (psatev) (Εικ. Γ.26 Β). Σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά (Εικ. Γ.26 Β), γεγονός που σημαίνει ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvELF4 δεν είχε κάποια άμεση ή έμμεση επίδραση στην ικανότητα έκφρασης από κάποιον από τους εξεταζόμενους υποκινητές των γονιδίων του ρολογιού. 147

149 Εικ. Γ.26. Υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvELF4. (Α) Ανάλυση πρωτεϊνικών δειγμάτων (5, 10 και 20 μl) από πρωτοπλάστες φασολιού που είχαν μετασχηματιστεί με το φορέα υπερέκφρασης της PvELF4 (PvELF4ox). Η ανοσοαποτύπωση πραγματοποιήθηκε με αντίσωμα έναντι του επιτόπου myc, ο οποίος έχει προστεθεί στο αμινοτελικό-άκρο της πρωτεΐνης PvELF4. Τα βέλη αναλογούν στις αντίστοιχες ζώνες του μοριακού δείκτη, ColorPlus Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kda) (New England Biolabs). (Β) Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συν-μετασχηματιστεί με τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 (PvTOC1-1653:LUC) και PvLHY (PvLHY-1905:LUC) και το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvELF4 (PvELF4ox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα (EV). 148

150 Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 Γ Εξακρίβωση της υπερέκφρασης της PvTOC1 σε πρωτοπλάστες φασολιού Η αλληλουχία που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη PvTOC1 κλωνοποιήθηκε σε φορέα υπερέκφρασης (psat) κάτω από τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή, 35S. Παράλληλα, στο 5 -άκρο του ORF του PvTOC1 προστέθηκε και η αλληλουχία που κωδικοποιεί για τον επίτοπο HA (haemagglutinin) (φορέας PvTOC1ox). Ο επίτοπος προστέθηκε ώστε να μπορεί να ανιχνευθεί η πρωτεΐνη PvTOC1, που θα τον περιέχει στο Ν-τελικό άκρο της, χρησιμοποιώντας αντίσωμα ειδικό ως προς τον επίτοπο, το οποίο διατίθεται στο εμπόριο. Ο χιμαιρικός φορέας χρησιμοποιήθηκε σε πειράματα μετασχηματισμού πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού και αρχικά, απομονώθηκε τόσο RNA όσο και πρωτεΐνη από τους μετασχηματισμένους πρωτοπλάστες, ώστε να διαπιστωθεί η υπερέκφραση του PvTOC1. Η υπερέκφραση, αρχικά, ελέγχθηκε σε επίπεδο mrna μέσω PCR πραγματικού χρόνου (Εικ. Γ.27 Α). Παρατηρήθηκε έκφραση του PvTOC1 (PvTOC1ox) σε 80-πλάσια επίπεδα σε σχέση με τα επίπεδα του δείγματος που είχε μετασχηματιστεί με τον κενό φορέα (EV, ενδογενή επίπεδα). Άρα, σε επίπεδο mrna το PvTOC1 εκφράστηκε επιτυχώς. Παράλληλα, χρησιμοποιώντας το φορέα PvTOC1ox, κατασκευάστηκαν ελλείψεις των περιοχών με λειτουργικά στοιχεία της πρωτεΐνης PvTOC1 (βλ. ενότ. Α ), της PR (Pseudo-Receiver, αμινοξέα 1-157) και της CCT (CONSTANS, CONSTANS-LIKE and TOC1, αμινοξέα ), δημιουργώντας τους φορείς PvTOC1ΔPR και PvTOC1ΔCCT, αντίστοιχα. Πρωτεϊνικά δείγματα από πρωτοπλάστες, μετασχηματισμένους με τον κενό φορέα (EV), το φορέα PvTOC1ox και τους φορείς PvTOC1ΔPR και PvTOC1ΔCCT, αναλύθηκαν σε πηκτή πολυακριλαμίδης (50 μg πρωτεΐνης/δείγμα), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και η υπερέκφρασή τους ελέγχθηκε με αντίσωμα έναντι του επιτόπου HA (Εικ. Γ.27 Β). Η υπερέκφραση ήταν επιτυχής, καθώς εντοπίστηκαν ζώνες κοντά στα αναμενόμενα μεγέθη των πρωτεϊνών και στην περίπτωση της πλήρους μήκους πρωτεΐνης PvTOC1 (Εικ. Γ.27 Β, PvTOC1ox) και στην περίπτωση των ελλειπτικών κατασκευών αυτής (Εικ. Γ.27 Β, PvTOC1ΔPR και PvTOC1ΔCCT), ενώ δεν εντοπίστηκε κάποια ειδική ζώνη στο δείγμα του αρνητικού μάρτυρα (Εικ. Γ.27 Β, EV). 149

151 Εικ. 27. Υπερέκφραση του παράγοντα PvTOC1 σε πρωτοπλάστες φασολιού. (Α) Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ολικού mrna του PvTOC1 εκτιμήθηκαν μέσω PCR πραγματικού χρόνου, σε πρωτοπλάστες μετασχηματισμένους είτε με τον κενό φορέα (EV) είτε με το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν ως προς την τιμή του δείγματος EV, η οποία ορίστηκε ως 1. (Β) Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνικών δειγμάτων πρωτοπλαστών φασολιού. Οι πρωτοπλάστες μετασχηματίστηκαν είτε με τον κενό φορέα (EV), είτε με τους φορείς υπερέκφρασης της PvTOC1 που έχουν επισημανθεί με επίτοπο ΗΑ και κωδικοποιούν την πλήρους μήκους πρωτεΐνη PvTOC1 (PvTOC1ox), την πρωτεΐνη χωρίς την περιοχή PR (PvTOC1ΔPR) ή την περιοχή CCT (PvTOC1ΔCCT), αντίστοιχα. Η ανοσοστύπωση διεξήχθη με το αντίσωμα ΗΑ-Tag. Τα βέλη αναλογούν στις αντίστοιχες ζώνες του μοριακού δείκτη, PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kda (Thermo Fisher Scientific). 150

152 Γ Επίδραση της υπερέκφρασης της PvTOC1 στην έκφραση υποκινητών γονιδίων του ρολογιού Αφού εξακριβώθηκε η υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvTOC1, ελέγχθηκε η επίδρασή της στην έκφραση των υπό εξέταση γονιδίων του ρολογιού, συνμετασχηματίζοντας πρωτοπλάστες φασολιού με το φορέα υπερέκφρασης της PvTOC1 (PvTOC1ox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα, EV (psatev) και τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων του ρολογιού, PvELF4 (PvELF4-1445:LUC, Ε-1449), PvLHY (PvLYH-1905:LUC, L- 1905) και PvTOC1 (PvTOC1-1653:LUC, T-1653). Εικ. Γ. 28. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 στην ενεργότητα των υποκινητών γονιδίων του ΗΒΡ. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συνμετασχηματιστεί με τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο των υποκινητών των γονιδίων (Α) PvELF4 (PvELF4-1449:LUC, E-1449) (Β) PvLHY (PvLHY-1905:LUC, L-1905) και (Γ) PvTOC1 (PvTOC1-1653:LUC, T-1653) και το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα (EV). *P < Η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης εξετάστηκε μέσω του DLR συστήματος και συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ενεργότητα δειγμάτων-μαρτύρων, τα οποία αντί για το φορέα PvTOC1ox είχαν συν-μετασχηματιστεί με τον αντίστοιχο κενό φορέα, EV (psatev). Παρατηρήθηκε ότι στην περίπτωση του υποκινητή PvELF4 δεν υπήρξε κάποια σημαντική μεταβολή στα επίπεδα ενεργότητάς του (Εικ. Γ.28 Α), ενώ στην περίπτωση τόσο του υποκινητή του PvLHY (Εικ. Γ.28 Β) όσο και 151

153 του ίδιου του PvTOC1, (Εικ. Γ.28 Γ) διαπιστώθηκε μείωση των επιπέδων τους κατά ποσοστό μεγαλύτερο του 50%. Ο υποκινητής του PvLHY είναι αναμενόμενος στόχος της πρωτεΐνης PvTOC1, καθώς και στο A. thaliana η ορθόλογη πρωτεΐνη, TOC1, είναι γνωστός καταστολέας του υποκινητή του γονιδίου LHY. Η καταστολή, όμως, της έκφρασης του ίδιου του υποκινητή του γονιδίου PvTOC1 από την πρωτεΐνη PvTOC1 δεν έχει καταγραφεί προηγουμένως, ούτε στο φασόλι, αλλά ούτε και σε κάποιο άλλο φυτικό είδος. Για να επιβεβαιωθεί η καταστολή με ένα επιπλέον τρόπο, εξετάστηκε η επίδραση της υπερέκφρασης του PvTOC1 στα ενδογενή επίπεδα έκφρασης του γονιδίου PvTOC1. Πρωτοπλάστες φασολιού μετασχηματίστηκαν με το φορέα υπερέκφρασης της PvTOC1 (PvTOC1ox) και συγκρίθηκαν μέσω PCR πραγματικού χρόνου, τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης mrna του PvTOC1 με τα αντίστοιχα επίπεδα από πρωτοπλάστες που είχαν μετασχηματιστεί με τον κενό φορέα, EV (Εικ. Γ.29 Γ). Εικ. Γ. 29. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων του ΗΒΡ. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του ενδογενούς mrna των γονιδίων (Α) PvELF4 (Β) PvLHY και (Γ) PvTOC1 εκτιμήθηκαν μέσω RT και PCR πραγματικού χρόνου, σε πρωτοπλάστες μετασχηματισμένους είτε με τον κενό φορέα (EV) είτε με το πλασμίδιο υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν στην τιμή του δείγματος EV, η οποία είχε οριστεί ως 1. Κάθε τιμή αντιστοιχεί στο μέσο ± SD (n = 3). H PCR πραγματοποιήθηκε με εκκινητές οι οποίοι υβριδίζουν εντός της 5 UTR περιοχής του γονιδίου PvTOC1. Άρα, οι εκκινητές αυτοί δίνουν τα ενδογενή 152

154 επίπεδα του PvTOC1 mrna, καθώς η 5 UTR μεταγράφεται στην περίπτωση του ενδογενούς γονιδίου, αλλά δεν υπάρχει στην περίπτωση του υπερεκφραζόμενου mrna του PvTOC1 από το φορέα υπερέκφρασης, PvTOC1ox. Παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική μείωση των ενδογενών επιπέδων του PvTOC1 (Εικ. Γ.29 Γ), οπότε βεβαιώθηκε και με αυτόν τον τρόπο η καταστολή του γονιδίου PvTOC1 από την πρωτεΐνη PvTOC1. Στα ίδια δείγματα εξετάστηκαν και τα επίπεδα έκφρασης του mrna των γονιδίων PvLHY και PvELF4. Παρατηρήθηκε και σε αυτήν την περίπτωση στατιστικώς σημαντική μείωση των επιπέδων έκφρασης του PvLHY mrna όταν υπερεκφράζεται η πρωτεΐνη PvTOC1 (Εικ. Γ.29 Β), ενώ στην περίπτωση του PvELF4 δεν ανιχνεύθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική αλλαγή στα επίπεδα έκφρασης του mrna του (Εικ. Γ.29 Α), επαληθεύοντας και στις δύο περιπτώσεις τα προηγούμενα δεδομένα (Εικ. Γ.28). Γ Εντοπισμός της περιοχής του υποκινητή PvTOC1 όπου δρα η πρωτεΐνη PvTOC1 Με σκοπό να διερευνηθεί περαιτέρω το φαινόμενο της καταστολής του γονιδίου PvTOC1 από την πρωτεΐνη PvTOC1, αρχικά, θελήσαμε να εντοπίσουμε την περιοχή του υποκινητή PvTOC1 που εμπλέκεται στην καταστολή. Για το σκοπό αυτό πρωτοπλάστες φασολιού συν-μετασχηματίστηκαν με το φορέα υπερέκφρασης της PvTOC1 (PvTOC1ox) και τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο των διαφόρων τμημάτων του υποκινητή του γονιδίου PvTOC1. Η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης εξετάστηκε μέσω του DLR συστήματος και συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ενεργότητα δειγμάτων-μαρτύρων, τα οποία αντί για το φορέα PvTOC1ox είχαν συν-μετασχηματιστεί με τον αντίστοιχο κενό φορέα, EV (psatev) (Εικ. Γ.30). Αξιολογήθηκε η επίδραση της πρωτεΐνης PvTOC1 σε τμήματα του υποκινητή του PvTOC1 που κυμαίνονται από τις -141 έως bp ανοδικά του ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης του γονιδίου. Διαπιστώθηκε ότι η καταστολή λαμβάνει χώρα ανοδικά των -558 bp, καθώς όλοι οι φορείς με τμήματα μεγαλύτερα από τις -558 bp έδειξαν μειωμένη ενεργότητα λουσιφεράσης όταν συνμετασχηματίστηκαν με το φορέα υπερέκφρασης της PvTOC1 (Εικ. Γ.30). Οι φορείς που περιείχαν τμήματα μικρότερα από τις -558 bp δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική μεταβολή (Εικ. Γ.30). Άρα, η καταστολή λαμβάνει χώρα στην περιοχή πάνω από τις bp του υποκινητή του γονιδίου. 153

155 Εικ. Γ. 30. Επίδραση της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 στην ενεργότητα τμημάτων του υποκινητή του γονιδίου PvTOC1. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συνμετασχηματιστεί με τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο διαφόρων τμημάτων του υποκινητή του PvTOC1 και το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα (EV). *P < Στην περιοχή αυτή του υποκινητή του PvTOC1 (>-558 bp) εντοπίστηκε πληθώρα υποψήφιων cis-ρυθμιστικών στοιχείων όπου θα μπορούσε να προσδένεται η πρωτεΐνη PvTOC1. Πρόκειται για στοιχεία T1ME (TOC1 Morning Element, TGTG/CACA), τα οποία έχουν ταυτοποιηθεί ως στοιχεία πρόσδεσης της ομόλογης πρωτεΐνης, TOC1 από το A. thaliana, στους υποκινητές των γονιδίων LHY και CCA1 (Gendron et al., 2012). Καθώς η καταστολή δεν παρατηρείται μέχρι τις -558 bp, ενώ είναι έκδηλη στις -612 bp του υποκινητή PvTOC1, εξετάστηκαν τα πιθανά στοιχεία T1ME γύρω από αυτή την περιοχή (T1ME-570 και T1ME-555). 154

156 Εικ. Γ. 31. Διερεύνηση υποψήφιων αλληλουχιών δέσμευσης της πρωτεΐνης PvTOC1 στον υποκινητή του PvTOC1. Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συνμετασχηματιστεί με τους φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο των μεταλλαγμένων υποκινητών του γονιδίου PvTOC1 (Α) μονού μεταλλάγματος στη θέση -570 (1T1MEmut) και (Β) διπλού μεταλλάγματος στις θέσεις -570 και -555 (2T1MEmut) και το φορέα υπερέκφρασης της πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox) ή τον αντίστοιχο κενό φορέα (EV). *P < Κάτω από τα διαγράμματα παρατίθεται μέρος της αλληλουχίας του υποκινητή PvTOC1 και επισημαίνονται τα στοιχεία που μεταλλάχτηκαν. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν φορείς έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο μεταλλαγμένων υποκινητών PvTOC1, αντικαθιστώντας αυτά τα στοιχεία (TGTG) με την αλληλουχία AAAA. Αρχικά, κατασκευάστηκε ένα μονό μετάλλαγμα (1Τ1ΜΕ mut) με μεταλλαγμένο το στοιχείο T1ME στη θέση -570, το οποίο όμως δεν είχε κάποια επίδραση στην καταστολή της ενεργότητας του υποκινητή PvTOC1 από την πρωτεΐνη PvTOC1 (Εικ. Γ.31 Α). Επειδή τα υποψήφια στοιχεία T1ME σε αυτές τις θέσεις ήταν τα μοναδικά που ήταν σε τόσο κοντινή απόσταση μεταξύ τους (-555 και -570 bp) στον υποκινητή PvTOC1, διερευνήθηκε η πιθανότητα να παίζει κάποιο ρόλο η εις διπλούν παρουσία του στοιχείου στην καταστολή από την πρωτεΐνη PvTOC1. Έτσι, κατασκευάστηκε και ένα διπλό μετάλλαγμα (2T1MEmut) με μεταλλαγμένα και τα δύο T1ME στοιχεία της περιοχής (T1ME-570 και -555). Διαπιστώθηκε, όμως, ότι δεν υπήρξε άρση της καταστολής ούτε στο διπλό μετάλλαγμα (Εικ. Γ.31 Β). Άρα, πιθανά η καταστολή να λαμβάνει 155

157 χώρα σε κάποιο νέο στοιχείο της αλληλουχίας μεταξύ -558 και -612 bp, αλλά και έξω από αυτή, πάνω από τις -558 bp του υποκινητή PvTOC1. Γ Εντοπισμός της λειτουργικής περιοχής της πρωτεΐνης PvTOC1 που ευθύνεται για την καταστολή επί του υποκινητή PvTOC1 Τέλος, εξετάστηκε το ποιές πιθανές λειτουργικές περιοχές της πρωτεΐνης ευθύνονται για την καταστολή. Έτσι, συν-μετασχηματίστηκαν πρωτοπλάστες φασολιού με το φορέα υπερέκφρασης της PvTOC1 και με τους φορείς PvTOC1ΔPR και PvTOC1ΔCCT που φέρουν ελλειπτικές μορφές για τις λειτουργικές περιοχές της πρωτεΐνης PvTOC1, μαζί με το φορέα έκφρασης της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο του bp τμήματος του υποκινητή του γονιδίου PvTOC1. Η σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης συγκρίθηκε με την αντίστοιχη ενεργότητα δείγματος-μάρτυρα, το οποίο είχε συν-μετασχηματιστεί με τον κενό φορέα, EV. Παρατηρείται ότι η καταστολή παραμένει στα ίδια επίπεδα όταν αφαιρεθεί η περιοχή PR, ενώ καταργείται στην περίπτωση της αφαίρεσης της περιοχής CCT (Εικ. Γ. 32). Άρα, η περιοχή PR (αμινοτελικό άκρο) δεν εμφανίζεται να έχει κάποιο ρόλο στην εν λόγω καταστολή. Από την άλλη πλευρά, η περιοχή CCT της πρωτεΐνης PvTOC1 (καρβοξυτελικό άκρο) φαίνεται να είναι απαραίτητη για την κατασταλτική δράση της πρωτεΐνης επί του υποκινητή του ίδιου του γονιδίου της. 156

158 Εικ. Γ. 32. Η λειτουργική περιοχή CCT της πρωτεΐνης PvTOC1 είναι απαραίτητη για την καταστολή της ενεργότητας τoυ υποκινητή του γονιδίου PvTOC1. Σχετικά επίπεδα λουσιφεράσης από δείγματα πρωτοπλαστών που είχαν συνμετασχηματιστεί με τον φορέα έκφρασης της λουσιφεράσης (LUC) υπό τον έλεγχο του bp τμήματος του υποκινητή του γονιδίου PvTOC1 (Τ-1108) και τους φορείς υπερέκφρασης της πλήρους μήκους πρωτεΐνης PvTOC1 (PvTOC1ox) ή την πρωτεΐνη PvTOC1 που στερείται είτε της περιοχής PR (PvTOC1ΔPR) είτε της περιοχής CCT (PvTOC1ΔCCT). Οι τιμές κανονικοποιήθηκαν ως προς το δείγμα που είχε συν-μετασχηματιστεί με τον κενό φορέα, EV το οποίο ορίστηκε ως 1. *P < Συνοπτικά, στον πίνακα Γ.7 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα που είχε η υπερέκφραση κάθε πρωτεΐνης του ΗΒΡ του φασολιού που εξετάστηκε επί των υποκινητών γονιδίων του ρολογιού. Πίνακας Γ.7. Σύνοψη της επίδρασης της υπερέκφρασης πρωτεϊνών του ρολογιού στα επίπεδα έκφρασης γονιδίων του ρολογιού. Υποκινητής Πρωτεΐνη PvLHY PvELF4 PvTOC1 PvLHY Δεν εξετάστηκε Καμία επίδραση Καμία επίδραση PvELF4 Καμία επίδραση Δεν εξετάστηκε Καμία επίδραση PvTOC1 Καταστολή Καμία επίδραση Καταστολή 157

159 Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα φυτά, αδυνατώντας να μετακινηθούν για να αποφύγουν τις δυσμενείς συνθήκες του περιβάλλοντός τους, έχουν αναπτύξει τρόπους για να ανταπεξέρχονται σε αυτές. Ένα ΗΒΡ καλά εναρμονισμένο με το περιβάλλον του φυτού προσδίδει σε αυτό σημαντικό εξελικτικό πλεονέκτημα, όχι μόνο βοηθώντας στην πρόβλεψη των καθημερινών καταπονήσεων, αλλά και στο συγχρονισμό της φυσιολογίας του φυτού με τις κυκλικά επαναλαμβανόμενες αλλαγές του περιβάλλοντος για τον κατάλληλο καταμερισμό των πόρων του. Το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας σχετικά με το ΗΒΡ των φυτών έχει περιοριστεί στο A. thaliana. Τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να διερευνώνται τα ρολόγια και από άλλα φυτικά είδη, αλλά η σχετική έρευνα βρίσκεται ακόμα σε πρώιμο στάδιο. Η μελέτη του ΗΒΡ και σε άλλα, εμπορικού και διατροφικού ενδιαφέροντος είδη, πέρα από το καθαρά πειραματόφυτο A. thaliana, μπορεί να ενισχύσει την γνώση γύρω από τους μηχανισμούς του συγχρονισμού και της προσαρμογής των καλλιεργούμενων φυτών σε ένα περιβάλλον που συνεχώς αλλάζει και μάλιστα τα τελευταία χρόνια με συνεχώς επιταχυνόμενους ρυθμούς. Δεδομένου του προβλήματος της αύξησης του πληθυσμού ανά την υφήλιο και της επακόλουθης αύξησης των διατροφικών αναγκών των ανθρώπων, αλλά και των εκτρεφόμενων ζώων, η βελτίωση της παραγωγής φυτών υψηλής διατροφικής αξίας, όπως είναι το φασόλι, καθίσταται τουλάχιστον χρήσιμη, αν όχι αναγκαία. Κατανοώντας και επιδρώντας, μελλοντικά, επί του μηχανισμού του ΗΒΡ θα μπορούσαμε να οδηγηθούμε σε βελτιωμένα είδη, καλύτερα συγχρονισμένα με το περιβάλλον τους, με υψηλότερες αποδόσεις, ακόμα και ανθεκτικά σε δεδομένες βιοτικές και αβιοτικές καταπονήσεις. Η παρούσα διατριβή αποτελεί ένα βήμα προς αυτή την κατεύθυνση, όχι μόνο διευρύνοντας την κατανόηση του ΗΒΡ στο φασόλι, με το οποίο δεν έχει ασχοληθεί κάποια άλλη ερευνητική ομάδα προηγουμένως, αλλά παρέχοντας και ένα εργαλείο για τη μελέτη τόσο του ΗΒΡ του, όσο και άλλων πτυχών της βιολογίας του φυτού. 158

160 Δ.1. Οι πρωτοπλάστες φασολιού ως σύστημα για τη μελέτη του ΗΒΡ Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής παρουσιάζονται τα πειράματα που αφορούν τη μελέτη των ρυθμών της έκφρασης υποψηφίων γονιδίων του ρολογιού στο φασόλι. Το ρολόι στο φασόλι διαθέτει ξεχωριστές ιδιότητες από αυτό του A. thaliana, όπως φαίνεται και από τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας και συζητείται στη συνέχεια. Πέρα από αυτό, το φασόλι τα τελευταία χρόνια προσελκύει όλο και περισσότερο το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας. Η in vitro καλλιέργειά του, όμως, παρουσιάζει σημαντικά προβλήματα, τόσο σε επίπεδο αναγέννησης των φυτών όσο και στον μετασχηματισμό τους, καθιστώντας τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών φασολιού ιδιαίτερα δύσκολη (Hnatuszko-Konka et al., 2014). Έτσι, για τη μελέτη των μοριακών μηχανισμών του ΗΒΡ στο φασόλι, κρίθηκε απαραίτητη η ανάπτυξη ενός in vitro κυτταρικού συστήματος από πρωτοπλάστες φασολιού. Σε σχέση με τα μέχρι τώρα πρωτόκολλα που απαιτούν τουλάχιστον 4 ώρες επώαση στο διάλυμα πέψης και αυξημένες συγκεντρώσεις των ενζύμων για την απομόνωση πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού (Nanjareddy et al., 2016), η μέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί σημαντική βελτίωση (Galeou et al., 2018). Τα πλεονεκτήματα προέκυψαν μετά από τροποποίηση του πρωτοκόλλου για το A. thaliana (Wu et al. 2009) αφαιρώντας την κάτω επιδερμίδα των φύλλων του φασολιού με ξεφλούδισμα, κάτι που φέρνει σε άμεση επαφή τα κύτταρα του μεσόφυλλου με το διάλυμα πέψης και μειώνει το χρόνο επώασης σε μόλις δύο ώρες. Ο μικρότερος χρόνος επώασης, πέρα από την οικονομία χρόνου, προσφέρει και το πλεονέκτημα της έκθεσης των κυττάρων στην ελάχιστη δυνατή καταπόνηση από τη διαδικασία. Επίσης, με τον τρόπο αυτό δεν ήταν απαραίτητη κάποια αύξηση στις συγκεντρώσεις των ενζύμων πέψης, η οποία είχε αναφερθεί στην εργασία των Nanjareddy et al. (2016). Το αποτέλεσμα είναι η απομόνωση πρωτοπλαστών καλής ποιότητας, οι οποίοι παραμένουν ζωντανοί και σε καλή κατάσταση για τουλάχιστον δύο 24-ωρα. Κατά τη διεξαγωγή της παρούσας διατριβής, τα διαθέσιμα από τη βιβλιογραφία πρωτόκολλα επετύγχαναν πολύ μικρά ποσοστά μετασχηματισμού πρωτοπλαστών φασολιού (Giovinazzo et al. 1997; Cadle και Jahn, 2005). Εξ αιτίας αυτού, δαπανήθηκε σημαντικό μέρος της διατριβής για την εξεύρεση των κατάλληλων συνθηκών απομόνωσης, διατήρησης και μετασχηματισμού των πρωτοπλαστών. Χρησιμοποιώντας το βελτιωμένο πρωτόκολλο απομόνωσης και τη μέθοδο του παροδικού μετασχηματισμού με πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG4000) 159

161 επετεύχθη απόδοση μετασχηματισμού σταθερά πάνω από 80%. Η μελέτη δε στους πρωτοπλάστες της έκφρασης γονιδίων παραγόντων του κεντρικού ταλαντωτή του ρολογιού (PvTOC1, PvELF4, PvLHY και PvRVE8), αλλά και του PvLHCB2, ενός γνωστού γονιδίου που αποτελεί μέρος των μονοπατιών εξόδου που ελέγχονται από το ΗΒΡ, έδειξε ότι αυτά εμφανίζουν τις ακροφάσεις τους στις αναμενόμενες χρονικές στιγμές της φωτοπεριόδου, σε συμφωνία με τη βιβλιογραφία και τα αντίστοιχα δεδομένα από ολόκληρα φύλλα φασολιού και ότι δεν επηρεάζονται από το μετασχηματισμό. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το σύστημα πρωτοπλαστών διαθέτει άριστα λειτουργικό ΗΒΡ, κάτι που επιβεβαιώθηκε και με πειράματα χορήγησης τριχοστατίνης Α (TSA), η οποία προκάλεσε διαφορική απόκριση σχετικά με την ταλάντωση των ρυθμών των γονιδίων του ρολογιού που εξετάστηκαν, ανάλογα με το γονίδιο και, σε ορισμένες περιπτώσεις, ανάλογα και με τη χρονική στιγμή που χορηγήθηκε. Η χρήση αυτού του in vitro συστήματος εφαρμόστηκε στη συνέχεια για την ανάλυση της ενεργότητας υποκινητών από γονίδια του ρολογιού (βλ. ενότ. Γ.3) και τη διερεύνηση της επίδρασης της υπερέκφρασης παραγόντων του ρολογιού στην ενεργότητα των υποκινητών αυτών (βλ. ενότ. Γ.4). Το σύστημα των πρωτοπλαστών που αναπτύχθηκε θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί μελλοντικά και σε περαιτέρω μελέτες σχετικά με το ΗΒΡ (π.χ. επίδραση του φωτός, αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ρολογιού, μελέτη της υπερέκφρασης ή σιώπισης γονιδίων του ρολογιού κ.λπ.), ώστε να απαντηθούν ερωτήματα που αφορούν τη μεταγωγή σήματος από το φως στο ΗΒΡ, την αλληλεπίδραση παραγόντων του κεντρικού ταλαντωτή του ρολογιού, όπως και τη σημασία τους. Παρόλο που πλέον έχουν δημοσιευτεί και άλλα πρωτόκολλα παροδικού μετασχηματισμού, τόσο πρωτοπλαστών όσο και φύλλων φασολιού (Nanjareddy et al., 2016) θα μπορούσε το σύστημα που αναπτύχθηκε στην παρούσα διατριβή να χρησιμοποιηθεί και σε διαφορετικές από το ρολόι μελέτες, καθώς πρόκειται για ένα απλό, γρήγορο και οικονομικό πρωτόκολλο, που παράγει πρωτοπλάστες με καλή βιωσιμότητα και υψηλά επίπεδα μετασχηματισμού. Επομένως, το νέο σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού αποτελεί ένα ερευνητικό εργαλείο για τη βαθύτερη και εκτενέστερη μελέτη των μοριακών μηχανισμών που λειτουργούν εντός του ΗΒΡ, όπως και άλλων διεργασιών που διέπουν τη φυσιολογία του φασολιού. 160

162 Δ.2. Ο επανασυγχρονισμός του ΗΒΡ του φασολιού από εξωτερικά ερεθίσματα Η δυνατότητα επανασυγχρονισμού από εξωτερικά ερεθίσματα (π.χ. φως) αποτελεί τον τρόπο με τον οποίο το ρολόι «αντιλαμβάνεται» τις αλλαγές στο περιβάλλον, ώστε να συγχρονίσει κατάλληλα τη φυσιολογία του φυτού. Επίσης, η απόκριση των στοιχείων του ρολογιού σε κατάλληλες χημικές ουσίες (βλ. ενότ. Δ.2.2) μπορεί να βοηθήσει στην κατανόηση μηχανισμών που το διέπουν, οι οποίοι επηρεάζονται από τις δεδομένες χημικές ουσίες. Δ.2.1. Επίδραση του φωτός Μελετώντας τον επανασυγχρονισμό του ρολογιού από το φως ενισχύθηκαν τα αρχικά δεδομένα (Kaldis et al., 2003) ότι το ΗΒΡ του φασολιού εμφανίζει διαφορετική αρχική απόκριση στο φως σε σχέση με το Α. thaliana, καθώς στο Α. thaliana το ΗΒΡ δεν είναι δεκτικό στην επίδραση του φωτεινού ερεθίσματος κατά τη διάρκεια της νύχτας (Millar και Kay, 1996). Αυτό στηρίχθηκε επιπλέον από τα πειράματα της παρούσας εργασίας, όπου διερευνήθηκε το πώς επανασυγχρονίζονται οι ρυθμοί ενός πρωινού, του PvLHY, και δύο εσπερινών γονιδίων, των PvTOC1 και PvELF4, ώστε να γίνουν κατανοητές οι ιδιαιτερότητες του ΗΒΡ στο φασόλι. Στην περίπτωση του PvLHY, βρέθηκε ότι αυτό εμφανίζει απόκριση στο φως στα ελάχιστα της γονιδιακής του έκφρασης. Αντίθετα, τα εσπερινά γονίδια, PvTOC1 και PvELF4 αποκρίνονται στο φως στα μέγιστα επίπεδα της έκφρασής τους. Αυτό δείχνει ότι η απόκριση που παρατηρήθηκε είναι ένα φαινόμενο που ελέγχεται από το ρολόι και ότι πιθανόν να απαιτούνται κάποιοι παράγοντες, οι οποίοι προσδένονται ρυθμικά στους υποκινητές τους. Στο A. thaliana, έχει αναφερθεί ότι το TOC1 επάγεται από το ρυθμικό παράγοντα RVE8 (Hsu et al., 2013), ενώ στην περίπτωση του ELF4 η επαγωγή του διαμεσολαβείται από τους παράγοντες FHY3, FAR1 και HY5 που σχετίζονται με το φυτόχρωμα (βλ. επίσης Δ.3.), οι οποίοι βρίσκονται στον υποκινητή του και καταστέλλονται ρυθμικά του από τους παράγοντες του ρολογιού CCA1/LHY (Li et al., 2011). Για το LHY δεν έχει αναφερθεί κάποιος επαγωγέας, αλλά έχει βρεθεί ότι το συγγενές του γονίδιο, CCA1, επάγεται από το σύμπλοκο των ρυθμικών παραγόντων LWD1 και TCP20 ή 22 (Wu et al., 2016). Παραμένει επομένως προς διερεύνηση το ερώτημα από ποιούς ρυθμικούς παράγοντες 161

163 διαμεσολαβείται η επαγωγή από το φως των γονιδίων του φασολιού που εξετάστηκαν. Επιπλέον, είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι οι ρυθμοί του πρωινού γονιδίου, PvLHY, όπως και των εσπερινών, PvTOC1 και PvELF4, επανασυγχρονίζονται μόνο σε συγκεκριμένες ώρες (αρχή) της νύχτας. Στο τέλος της νύχτας, δεν αποκρίνεται κανένα από τα γονίδια του ρολογιού που εξετάστηκαν, εφόσον δεν εμφανίζεται επανασυγχρονισμός των ρυθμών τους. Άρα, ο επανασυγχρονισμός φαίνεται να εξαρτάται άμεσα από το ίδιο το ρολόι και να εμπλέκεται σε αυτόν κάποιος κοινός μηχανισμός για το πρωινό και τα εσπερινά γονίδια. Το φαινόμενο αυτό θα μπορούσε να οφείλεται σε αλλαγή της διαμόρφωσης της χρωματίνης, η οποία να διαμεσολαβείται από κάποιον παράγοντα με ρυθμική ενεργότητα, ο οποίος να επιδρά στην αρχή της νύχτας (π.χ. «χαλαρώνοντας» τη δομή της χρωματίνης) αλλάζοντας τα επίπεδα της μεταγραφής, μεταβάλλοντας με αυτό τον τρόπο τη φάση του ρυθμού έκφρασης των γονιδίων. Ο αντίστοιχος παράγοντας στο τέλος της νύχτας είτε δεν υφίσταται στους υποκινητές των εξεταζόμενων γονιδίων, είτε είναι ανενεργός. Στο ΗΒΡ των θηλαστικών, ένα από τα βασικά στοιχεία του κεντρικού ταλαντωτή είναι η πρωτεΐνη CLOCK (CIRCADIAN LOCOMOTOR OUTPUT CYCLES KAPUT), η οποία έχει ρυθμική δράση ακετυλομεταφοράσης ιστονών, ενεργοποιώντας ρυθμικά τα γονίδια-στόχους της εντός και εκτός του κεντρικού ταλαντωτή (Doi et al., 2006). Αντίστοιχος παράγοντας δεν έχει ανακαλυφθεί στο ρολόι των φυτών, αλλά συνιστά μία ενδιαφέρουσα πιθανότητα, καθώς παραμένει ακόμα σε μεγάλο μέρος ανεξερεύνητο και συνεχώς ταυτοποιούνται καινούρια στοιχεία του. Ένα φαινόμενο επανασυγχρονισμού του ρολογιού, το οποίο μπορεί να παρατηρηθεί μακροσκοπικά, αποτελούν οι 24-ωρες κινήσεις των φύλλων. Το φασόλι και άλλα φυτά της οικογένειας των ψυχανθών, διατηρούν τα φύλλα τους σε οριζόντια θέση την ημέρα και τα «κατεβάζουν» σε κάθετη θέση τη νύχτα. Το φαινόμενο αυτό είναι ενδογενές και ελέγχεται τόσο από το φως όσο και από το ΗΒΡ (βλ. ενότ. A.2.4.5). Η παρατήρηση ότι τα εσπερινά γονίδια αποκρίνονται στο φως κατά τη διάρκεια της νύχτας ήταν κάτι που δεν είχε καταγραφεί προηγουμένως. Έτσι, εξετάστηκαν οι ρυθμικές κινήσεις των φύλλων του φασολιού, ως μία φυσιολογική απόκριση του φυτού που συνδέεται με το ρολόι, ώστε να μελετηθεί η επίδραση που έχει σε αυτές το φως τη νύχτα και το εάν μπορεί να διαπιστωθεί κάποιος συσχετισμός κατ αντιστοιχία με την επαναπροσαρμογή των ρυθμών των γονιδίων που εξετάστηκαν. Παρατηρήθηκε συσχετισμός των κινήσεων των φύλλων με τους 162

164 ρυθμούς του γονιδίου PvTOC1 και συγκεκριμένα ότι τα φύλλα αρχίζουν να «κατεβαίνουν» όταν στο PvTOC1 καταγράφονται τα μέγιστα επίπεδα της γονιδιακής του έκφρασης. Το φαινόμενο αυτό διατηρήθηκε και μετά από έκθεση των φυτών στο φως, κατά τη διάρκεια της νύχτας. Εφόσον το PvELF4 είναι σε κάθε περίπτωση συμφασικό του PvTOC1, το «κατέβασμα» των φύλλων, ως εκ τούτου, συμπίπτει με το μέγιστο στην έκφραση των εσπερινών γονιδίων, PvTOC1 και PvELF4. Από την άλλη μεριά, η άνοδος τον φύλλων δεν φαίνεται να μπορεί να λειτουργήσει ως δείκτης πρόβλεψης των ρυθμών κάποιου γονιδίου του ρολογιού, καθώς δεν συμπίπτει ούτε με το μέγιστο ούτε με το ελάχιστο κανενός από τα εξεταζόμενα γονίδια. Πιθανά η διαδικασία αυτή να σχετίζεται με κάποιο άλλο στοιχείο του ρολογιού. Η παρατήρηση των κινήσεων των φύλλων είναι σαφώς πιο απλή πειραματική διαδικασία από τη μελέτη των ρυθμών στη γονιδιακή έκφραση. Άρα, η γνώση ότι αυτοί οι δύο ρυθμοί σχετίζονται θα μπορούσε να χρησιμεύσει και ως ένας τρόπος πρόβλεψης του αναμενόμενου μεγίστου στην έκφραση των εσπερινών γονιδίων του ρολογιού. Επιπλέον, θα μπορούσε να χρησιμεύσει ακόμα και στην ταυτοποίηση μεταλλαγμάτων φυτών φασολιού (φυσικά προκύπτοντα ή μετά από μεταλλαξιγένεση), καθώς φυτά με αλλαγμένους ρυθμούς στις κινήσεις των φύλλων πιθανά να έχουν υποστεί μετάλλαξη σε γενετικό τόπο κάποιου γονιδίου του ΗΒΡ. Παρόλο που ο μηχανισμός μέσω του οποίου πραγματοποιούνται οι κινήσεις των φύλλων των ψυχανθών έχει μελετηθεί, η φυσιολογική του σημασία παραμένει ακόμη αδιευκρίνιστη. Είναι αποδεκτό ότι τα φύλλα παραμένουν στην οριζόντια θέση κατά τη διάρκεια της ημέρας για τη βέλτιστη εκμετάλλευση της φωτεινής ενέργειας του ήλιου για τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης. Ο λόγος, όμως, που τα φυτά «κατεβάζουν» τα φύλλα τους τη νύχτα δεν είναι γνωστός. Ψυχανθή στα οποία η διαδικασία του κατεβάσματος των φύλλων τη νύχτα είχε παρεμποδιστεί χημικά, παρουσίασαν μειωμένη βιωσιμότητα (Ueda et al., 2003), γεγονός που τονίζει τη σημασία του φαινομένου αυτού για την επιβίωσή τους. Ο Δαρβίνος (1880) πίστευε ότι αυτή η διαδικασία παρέχει προστασία στα φυτά από τις χαμηλές θερμοκρασίες της νύχτας. Ο Bünning (1969) είχε προτείνει ότι τα ψυχανθή κατεβάζουν τα φύλλα τους για να προστατεύεται ο μηχανισμός του ρολογιού από το φως του φεγγαριού, το οποίο όταν πέφτει στα φύλλα κατά τη διάρκεια της νύχτας μπορεί να παρεμποδίζει την ακριβή μέτρηση του μήκους αυτής. Η παρατήρηση ότι το ρολόι του φασολιού είναι δεκτικό στο φωτεινό ερέθισμα τη νύχτα, όπως τεκμηριώνεται από την απόκριση στο φως και τον επανασυγχρονισμό από αυτό, τόσο του πρωινού όσο και των 163

165 εσπερινών γονιδίων του ΗΒΡ που εξετάστηκαν στην παρούσα διατριβή, ενισχύει την τελευταία πρόταση. Το γεγονός ότι αυτό το φαινόμενο δεν παρατηρείται σε φυτά όπως το A. thaliana, το οποίο δεν «κατεβάζει» σε κάθετη θέση τα φύλλα του και του οποίου το ΗΒΡ δεν εμφανίζεται να είναι δεκτικό στο φως τη νύχτα, επιβεβαιώνει την άποψη αυτή. Έτσι, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής παρέχουν μια ένδειξη για την εμπλοκή στοιχείων του ΗΒΡ στις κινήσεις των φύλλων των ψυχανθών. Δ.2.2. Ο ρόλος των HDACs Ένας πολύ σημαντικός μηχανισμός ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης είναι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης. Στα θηλαστικά είναι γνωστό ότι αυτός ο μηχανισμός αποτελεί βασικό τρόπο ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων του ΗΒΡ (Sassone-Corsi, 2016). Στο ρολόι του A. thaliana έχει επίσης δειχθεί ότι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, μέσω ακετυλίωσης και μεθυλίωσης συγκεκριμένων αμινοξέων των ιστονών, συμμετέχει στη ρύθμιση της έκφρασης παραγόντων του ΗΒΡ (Perales και Más, 2007; Song και Noh, 2012; Malapeira et al., 2012; Hemmes et al., 2012; Baerenfaller et al., 2016). Ένας από τους τρόπους μελέτης του εν λόγω φαινομένου είναι η χορήγηση στα φυτά αναστολέων της δράσης των αποακετυλασών των ιστονών, HDACs (π.χ. TSA και NAM), οι οποίοι, κατά κανόνα, προάγουν το «ξεδίπλωμα» της χρωματίνης και τη μετάβαση σε μεταγραφικά πιο ενεργές δομές. Στο ρολόι του φασολιού η χορήγηση TSA είχε διαφορετική επίδραση στην έκφραση κάθε εξεταζόμενου γονιδίου. Στην περίπτωση του PvLHY, παρατηρήθηκε περαιτέρω αύξηση των επιπέδων έκφρασής του όταν αυτά βρίσκονταν στα υψηλότερα επίπεδα. Αυτό υποδεικνύει ότι σε αυτή τη φάση έχουμε πιθανόν αυξημένη δράση των HDACs. Σε όλους τους άλλους χρόνους η TSA κράτησε τα επίπεδα πιο χαμηλά σε σχέση με τον βασικό ρυθμό. Άρα, φαίνεται ότι στο συγκεκριμένο υποκινητή (PvLHY) εκδηλώνεται ρυθμική δράση των αποακετυλασών. Στην περίπτωση των PvRVE8 και PvELF4, με την επίδραση της TSA παρατηρήθηκε σε όλους τους χρόνους καταστολή ή επαγωγή, αντίστοιχα, με επακόλουθη αλλαγή της φάσης, ενώ αντίθετα το PvTOC1 βρέθηκε πάντα να καταστέλλεται χωρίς να επανακάμπτει ο ρυθμός έκφρασής του. Αυτό πιθανόν να είναι ένδειξη ότι στη ρυθμική έκφραση των PvRVE8 και PvELF4 εμπλέκονται κάποιοι παράγοντες η δράση των οποίων επηρεάζεται από την ακετυλίωση τους. Στο 164

166 PvTOC1, αντιθέτως, η μόνιμη μείωση της μεταγραφής σε όλες τις φάσεις δείχνει ότι πιθανόν οι αποακετυλάσες να ρυθμίζουν γενικότερα τα επίπεδα έκφρασής του, ανεξαρτήτως του ρολογιού. Από την άλλη πλευρά, η επίδραση της εφαρμογής TSA επί της ρύθμισης της έκφρασης του TOC1 από το A. thaliana, ήταν σε όλους τους χρόνους επαγωγική (Perales και Más, 2007). Έτσι, η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης αποτελεί έναν πιθανό ρυθμιστικό μηχανισμό του ρολογιού του φασολιού και μάλιστα φαίνεται να λειτουργεί διαφορετικά απ ότι στο ρολόι του A. thaliana. Η χορήγηση νικοτιναμιδίου (ΝΑΜ), δεν είχε επίδραση στα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων του ΗΒΡ του φασολιού, ούτε στα ολόκληρα φύλλα, ούτε στους πρωτοπλάστες. Σε πειράματα στο A. thaliana το ΝΑΜ είχε επίδραση στην περίοδο και το πλάτος ταλάντωσης των ρυθμών έκφρασης γονιδίων του ρολογιού όταν αυτοί παρακολουθήθηκαν για αρκετές ημέρες (Malapeira et al., 2012). Τα πειράματα της παρούσας εργασίας εστιάστηκαν στην ποσότητα της χορηγούμενης ουσίας, ενώ η χρονική περίοδος που εξετάστηκε περιορίστηκε σε μερικές ώρες και πιθανά για αυτό το λόγο να μην ανιχνεύθηκε κάποια αλλαγή. Η παρακολούθηση της επίδρασης του ΝΑΜ σε μεγαλύτερο βάθος χρόνου είναι απαραίτητη για τη μελέτη της επίδρασής του στα γονίδια του HBP του φασολιού. Δ.3. Ανάλυση και μελέτη των υποκινητών των γονιδίων του ΗΒΡ, PvTOC1, PvLHY και PvELF4 Οι υποκινητές των γονιδίων του ΗΒΡ αποτελούν τις σημαντικότερες περιοχές των στοιχείων ελέγχου της έκφρασής τους, καθώς αυτοί, μαζί με τους μεταγραφικούς παράγοντες, προσδιορίζουν σε μεγάλο βαθμό το υπό ποιές συνθήκες (π.χ. φως/σκοτάδι) το γονίδιο θα εκφραστεί και σε τι βαθμό (φάση του ρυθμού). Έτσι, για να μελετηθεί η ρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων του ρολογιού στο φασόλι, περίπου bp των αλληλουχιών των υποψήφιων υποκινητών τους ελέγχθηκαν αρχικά in silico για την ύπαρξη πιθανών cis-ρυθμιστικών στοιχείων, που να σχετίζονται κυρίως με τη ρυθμική έκφραση ή την επαγωγή από το φως. Μερικά από τα πιο ενδιαφέροντα από τα πιθανά cis-ρυθμιστικά στοιχεία που εντοπίστηκαν μέσω αυτής της ανάλυσης παρουσιάζονται στην εικόνα Γ.17. Κατά την εξέταση του υποκινητή PvTOC1 εντοπίστηκαν στοιχεία T1ME (TOC1 Morning Element, TGTG/CACA) (Εικ. Γ.17.Α), στα οποία έχει δειχθεί, στο A. thaliana, ότι προσδένεται ο παράγοντας TOC1 στους υποκινητές, όμως, των 165

167 γονιδίων LHY και CCA1 και τα καταστέλλει (Gendron et al., 2012). Έτσι θεωρήθηκε ότι το στοιχείο αυτό αποτελεί πιθανή θέση δέσμευσης του παράγοντα PvTOC1 στον υποκινητή του PvTOC1. Στην πειραματική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε, στη συνέχεια, για την καταστολή των επιπέδων έκφρασης του υποκινητή του PvTOC1 από την πρωτεΐνη PvTOC1 διαπιστώθηκε ότι ήταν απαραίτητη η περιοχή υποκινητή μήκους τουλάχιστον 612 βάσεων (Galeou et al., 2018). Για το λόγο ότι στην περιοχή μεταξύ του -558 και του -612 εντοπίστηκαν τα μοναδικά δύο κοντινά στοιχεία T1ME της περιοχής, αυτά μεταλλάχθηκαν είτε μεμονωμένα είτε και τα δύο μαζί, αλλά δεν διαπιστώθηκε να παίζουν κάποιο ρόλο στην καταστολή από τον PvTOC1. Άρα, πιθανόν ο παράγοντας να προσδένεται σε διαφορετικό cis-στοιχείο από το T1ME στον υποκινητή του γονιδίου του ή η καταστολή να πραγματοποιείται μέσω διαφορετικού μηχανισμού. Στο A. thaliana έχει δειχθεί ότι ο TOC1 προσδένεται στον υποκινητή του CCA1 και μέσω του παράγοντα CHE, ο οποίος προσδένεται σε DNA στο στοιχείο TBS (GGNCCCAC) (Pruneda-Paz et al., 2009). Επίσης, έχει αναφερθεί και αλληλεπίδραση του TOC1 με τον παράγοντα PIF3 ο οποίος προσδένεται σε στοιχεία G-boxes (CACGTG). Σε αυτήν την περίπτωση ο ρόλος του TOC1 είναι έμμεσα κατασταλτικός στην έκφραση γονιδίων που ρυθμίζονται από κοινού από τους δύο παράγοντες, αφού o TOC1 παρεμποδίζει τον επαγωγέα τους, PIF3 (Soy et al., 2016). Κατ αναλογία με τα παραπάνω, στον υποκινητή του PvTOC1 θα μπορούσε η πρόσδεση της PvTOC1 να είναι έμμεση και να γεφυρώνεται από κάποιον άλλο παράγοντα (ή και παράγοντες) άγνωστο προς το παρόν, o οποίος να προσδένεται σε στοιχεία υποκινητή, διαφορετικά του T1ME. Στον υποκινητή του PvTOC1 εντοπίστηκαν επίσης και δύο στοιχεία παρόμοια με το EΕ (Evening Element, AAAATATCT/AGATATTTT) (Εικ. Γ.17.Α), στο οποίο έχει δειχθεί, για το ρολόι του A. thaliana, ότι δεσμεύονται οι LHY/CCA1 στους υποκινητές των TOC1 και ELF4 και τα καταστέλλουν (Alabadí et al., 2001; Li et al., 2011). Άρα, το στοιχείο αυτό αποτελεί πιθανή θέση δέσμευσης ορθόλογων παραγόντων του φασολιού, όπως ο PvLHY, τόσο στον υποκινητή του PvTOC1, όσο και στον υποκινητή του PvELF4, που επίσης εντοπίστηκε (Εικ. Γ.17.Γ). Καθώς η υπερέκφραση του PvLHY δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση γονιδίων του ρολογιού, και επειδή δεν ήταν δυνατή η επιβεβαίωση της υπερέκφρασής του σε πρωτεϊνικό επίπεδο, δεν ελέγχθηκαν πειραματικά τα συγκεκριμένα στοιχεία. Αναφορικά με τον υποκινητή του PvLHY, κατά τη θεωρητική ανάλυση εντοπίστηκαν στοιχεία T1ME, στα οποία θα μπορούσε να προσδένεται ο PvTOC1 166

168 (Εικ. Γ.17.Β). Μάλιστα, στην περίπτωση αυτή, το στοιχείο T1ME αποτελεί μέρος του στοιχείου HUD (CACATG/CATGTG) (Εικ. Γ.17.Β), το οποίο έχει βρεθεί σε υποκινητές ορμονο-εξαρτώμενων γονιδίων που εκφράζονται κοντά στο ξημέρωμα (Michael et al., 2008a) και έχει ταυτοποιηθεί και σε αυτό η πρόσδεση του TOC1 στον υποκινητή του LHY (Gendron et al.,2012). Επίσης, αποτελεί και μέρος του ME (Morning Element, CCACAC/GTGTGG) που εντοπίστηκε στον ίδιο υποκινητή (PvLHY, Εικ. Γ.17.Β) και έχει βρεθεί στο A. thaliana ότι είναι ικανό να παρέχει ρυθμικότητα με μέγιστο έκφρασης το πρωί (Michael et al., 2008b). Στον υποκινητή του PvLHY βρέθηκαν επίσης αρκετά στοιχεία που ομοιάζουν με το G-box, τα λεγόμενα G-box expanded (ανοιχτό πράσινο χρώμα, Εικ. Γ.17.Β). Τα στοιχεία αυτά έχουν εντοπιστεί ως περιοχές δέσμευσης του TOC1 σε υποκινητές διαφόρων ρυθμικών γονιδίων (Huang et al., 2012). Στην παρούσα εργασία, παρόλο που εντοπίστηκε η καταστολή του PvLHY από την PvTOC1 (Galeou et al., 2018), δεν εξετάστηκαν περαιτέρω πιθανά στοιχεία πρόσδεσης του PVTOC1, διότι τα επίπεδα έκφρασης του υποκινητή PvLHY ήταν οριακά ανιχνεύσιμα στο χρησιμοποιούμενο σύστημα, γεγονός που δεν διευκόλυνε τις μελέτες. Αναφορικά με τον υποκινητή του γονιδίου PvELF4 κατά τη θεωρητική ανάλυσή του, εντοπίστηκαν αλληλουχίες στις οποίες έχει δειχθεί στο A. thaliana, ότι προσδένονται οι μεταγραφικοί παράγοντες FHY3/FAR1 (FBS, FHY3-FAR1 Binding Site, CACGCGC/GCGCGTG) και HY5 (ACE, ACGT Containing Element, ACGT/ACGT) (Εικ. Γ.17.Γ). Τα στοιχεία αυτά αποτελούν λειτουργικά στοιχεία πρόσδεσης στον υποκινητή του ELF4 των επαγωγικών και σχετιζόμενων με τη φωτομορφογένεση παραγόντων FHY3/FAR1 και HY5, αντίστοιχα (Li et al., 2011). Στην περίπτωση του A. thaliana όπου μελετήθηκαν ως προς τη λειτουργικότητά τους, αυτά τα στοιχεία (FBS και ACE) βρίσκονται πάντα εις διπλούν στον υποκινητή του ELF4, σε κοντινή μεταξύ τους απόσταση (Li et al., 2010), ενώ στον υποκινητή του PvELF4 εντοπίζονται μόνο από μία φορά ή σε μεγάλη απόσταση μεταξύ τους (Εικ. Γ.17.Γ), οπότε δεν εξετάστηκαν πειραματικά. Επιπλέον, ένα στοιχείο συγγενές του G- box (CACGTG/CACGTG), το Hex (TGACGTGG/CCACGTCA), εντοπίστηκε τόσο στον υποκινητή του PvELF4 (Εικ. Γ.17.Γ) όπως και στους υποκινητές των PvLHY και PvTOC1 (Εικ. Γ.17.Α και Β, αντίστοιχα). Και τα δύο στοιχεία (Hex και G-box) αποτελούν υποψήφια στοιχεία πρόσδεσης για παράγοντες που μεταβάλλουν τη φάση του ρυθμού γονιδίων με φωτο-ειδικό τρόπο (Michael και McClung, 2002). Η 167

169 πειραματική ανάλυση αυτών των στοιχείων αποτελεί μία ενδιαφέρουσα προοπτική για μελλοντικά πειράματα. Τέλος, ελέγχθηκε η δράση της πρωτεΐνης PvELF4 επί των υποκινητών των γονιδίων PvTOC1 και PvLHY. Ενώ σε αυτή την περίπτωση είχε επιβεβαιωθεί η επιτυχής υπερέκφραση της πρωτεΐνης PvELF4, με τη βοήθεια του επιτόπου myc, δεν διαπιστώθηκε να έχει κάποια επίδραση επί των παραπάνω υποκινητών. Αυτό συμφωνεί με τα δεδομένα από το ρολόι του A. thaliana στο οποίο τα δύο γονίδια, TOC1 και LHY δεν έχουν βρεθεί να αποτελούν στόχο της ELF4. Επίσης, η ELF4 έχει διαπιστωθεί ότι δεν έχει ικανότητα δέσμευσης σε DNA, αλλά αποτελεί μέρος του εσπερινού συμπλόκου (ELF3/ELF4/LUX), μέσω του οποίου εκδηλώνει την κατασταλτική της δράση στο ρολόι του A. thaliana, καθώς η δέσμευση του τριμερούς στο DNA έχει δειχθεί ότι γίνεται μέσω της πρωτεΐνης LUX (Nusinow et al., 2011). Ενδιαφέρουσα προσέγγιση για το μέλλον παρουσιάζει η προοπτική ανίχνευσης των γονιδίων-στόχων της πρωτεΐνης PvELF4, με τη βοήθεια του διαθέσιμου επιτόπου (π.χ. μέσω της πειραματικής διαδικασίας ChIP). Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε επιπλέον η μέθοδος της in vivo καταγραφής της ενεργότητας ρυθμικών υποκινητών με γονίδιο αναφοράς τη λουσιφεράση, κατά την οποία καταγράφονται τα επίπεδα ενεργότητας υποκινητή από το ίδιο δείγμα σε διαφορετικούς χρόνους. Με αυτή τη μέθοδο εξετάστηκαν και οι τρεις διαθέσιμοι υποκινητές. Στην περίπτωση του υποκινητή του PvELF4, ανιχνεύθηκε ρυθμικότητα χρησιμοποιώντας το τμήμα -940 bp του υποκινητή του γονιδίου (Galeou et al., 2018). Αυτό σημαίνει πως στο κομμάτι αυτό εμπεριέχονται στοιχεία τα οποία προσδίδουν 24-ωρη ρυθμικότητα στην έκφραση του γονιδίου PvELF4. Μία ενδιαφέρουσα προσέγγιση για την ταυτοποίηση αυτών των στοιχείων, θα ήταν να εξεταστούν και τα μικρότερα διαθέσιμα τμήματα υποκινητή και να προσδιοριστεί το μικρότερο κομμάτι που είναι ικανό να παρέχει 24-ωρη ρυθμική έκφραση και στη συνέχεια να γίνουν και μελέτες μεταλλαξιγένεσης στα υποψήφια ρυθμιστικά στοιχεία (Εικ. Γ.17.Γ) ώστε να εντοπιστούν αυτά που ευθύνονται για τη ρυθμική 24-ωρη έκφραση του εν λόγω γονιδίου. Οι αντίστοιχες in vivo μετρήσεις με τους υποκινητές των PvTOC1 (τμήμα bp) και PvLHY (τμήμα bp) δεν έδωσαν ρυθμικά επίπεδα, κάτι που υποδεικνύει ότι τα υπεύθυνα ρυθμιστικά στοιχεία, στην περίπτωση αυτών των γονιδίων, είτε βρίσκονται περισσότερο ανοδικά στην αλληλουχία των υποκινητών τους, είτε δεν προάγουν ικανά επίπεδα έκφρασης, ώστε να ανιχνεύονται από τη 168

170 διαθέσιμη συσκευή καταμέτρησης. Συμπερασματικά, απαιτείται μία μέθοδος καταγραφής της ενεργότητας των υποκινητών (ενεργότητα λουσιφεράσης) με αυξημένη ευαισθησία ώστε να ανιχνευθούν οι διακυμάνσεις στην ενεργότητα όλων των ρυθμικών υποκινητών που εξετάστηκαν ή πρόκειται να εξεταστούν στο μέλλον. Αυτό είναι απαραίτητο, ώστε να καταστεί δυνατή η ταυτοποίηση των στοιχείων υποκινητών που ευθύνονται για τη ρυθμική έκφραση στο φασόλι, καθώς και των μεταγραφικών παραγόντων που την κατευθύνουν. Δ.4. Ο κατασταλτικός ρόλος του παράγοντα PvTOC1 Ο TOC1 έχει αναδειχθεί σε βασικό μεταγραφικό παράγοντα του ρολογιού του A. thaliana. Συμμετέχει στον κύριο βρόχο του κεντρικού ταλαντωτή και μέσω της κατασταλτικής του δράσης έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει μεγάλο ποσοστό των ρυθμικά εκφραζόμενων γονιδίων του φυτού (Huang et al., 2012). Όμως, η εικόνα γύρω από τον παράγοντα TOC1 δεν ήταν πάντα τόσο ξεκάθαρη. Από την αρχή της ανακάλυψής του (Strayer et al., 2000), βάσει γενετικών πειραμάτων, είχε υποτεθεί ότι αποτελούσε επαγωγικό στοιχείο, καθώς φυτά με μη-λειτουργική πρωτεΐνη TOC1 εμφάνιζαν μειωμένα επίπεδα mrna των παραγόντων CCA1 και LHY (Alabadí et al., 2001). Έτσι, είχε εισαχθεί ένα μοντέλο του κεντρικού ταλαντωτή των φυτών, πιθανά κατά αντιστοιχία με τα ΗΒΡ στα θηλαστικά ή και σε άλλα συστήματα, όπου οι αρνητικοί παράγοντες αλληλεπιδρούν με θετικούς παράγοντες για την καταστολή της ίδιας τους της έκφρασης (Takahashi, 2017). Στα φυτά, οι παράγοντες CCA1 και LHY που προσδένονται στον υποκινητή του TOC1 έχει αποδειχθεί ότι είναι αρνητικοί, δηλ. κατασταλτικοί, ενώ ο TOC1 θεωρούταν θετικός, δηλ. επαγωγικός παράγοντας για τα γονίδια CCA1 και LHY, χωρίς να είναι γνωστός ο βιοχημικός του ρόλος (Alabadí et al., 2001). Ήδη από εκείνη την εποχή υπήρχαν αντικρουόμενα στοιχεία που έδειχναν προς την αντίθετη κατεύθυνση, ότι δηλαδή ο TOC1 θα μπορούσε να έχει κατασταλτική δράση επί των CCA1 και LHY, καθώς φυτά που υπερέκφραζαν τον TOC1 εμφάνιζαν χαμηλότερα (και με διαφοροποιημένους ρυθμούς) επίπεδα mrna των γονιδίων αυτών (Makino et al., 2002). Επειδή η αναμενόμενη θετική δράση του TOC1 δεν επιβεβαιωνόταν από πειραματικά δεδομένα, είχε υποτεθεί ότι η επαγωγική του ιδιότητα ασκείται μέσω ενός ενδιάμεσου μηχανισμού ή ενός παράγοντα «Χ» (Gardner et al., 2006). Μετά από περισσότερο από μία δεκαετία που ο TOC1 θεωρούταν θετικός παράγοντας, τρεις αναφορές οι οποίες δημοσιεύθηκαν σχεδόν 169

171 παράλληλα έδειξαν πως συμβαίνει ακριβώς το αντίθετο (Huang et al., 2012; Gendron et al., 2012; Pokhilko et al., 2012), ότι δηλαδή ο TOC1 καταστέλλει όχι μόνο τα CCA1/LHY, αλλά αποτελεί και γενικότερα καταστολέα της μεταγραφής ρυθμικών γονιδίων. Το ενδιαφέρον που είχε δημιουργηθεί γύρω από το ρόλο του TOC1 και με δεδομένο τις ιδιαιτερότητες του ΗΒΡ του φασολιού σε σχέση με εκείνο του A. thaliana, αποτέλεσε το έναυσμα για τη μελέτη του ρόλου του ορθόλογου παράγοντα του TOC1 από το φασόλι, του PvTOC1 (Galeou et al., 2018). Η υπερέκφραση της PvTOC1 δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του γονιδίου PvELF4, ενώ ο υποκινητής του ELF4 έχει βρεθεί να αποτελεί στόχο της TOC1 στο A. thaliana (Huang et al., 2012). Από την άλλη μεριά, η PvTOC1 κατέστειλε κατά το ήμισυ την ενεργότητα του υποκινητή του PvLHY, γεγονός που συμφωνεί με την υπάρχουσα θεώρηση του ταλαντωτή του A. thaliana ότι το LHY καταστέλλεται από την TOC1 (Gendron et al., 2012). Βλέπουμε, λοιπόν, ότι και στην «καρδιά» του ΗΒΡ του φασολιού υπάρχουν διαφορές με το A. thaliana, αλλά όμως και κάποια κοινά συστατικά. Το πλέον εντυπωσιακό στοιχείο που προέκυψε από τη μελέτη του ρόλου του PvTOC1 στο ρολόι του φασολιού ήταν η αυτοκαταστολή του υποκινητή του PvTOC1 από την ίδια την πρωτεΐνη PvTOC1. Κάτι ανάλογο δεν έχει διερευνηθεί ως ενδεχόμενο για το ρολόι του A. thaliana, άρα δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα να συμβαίνει κάτι αντίστοιχο. Εντούτοις, η αυτοκαταστολή είναι ένας μηχανισμός που έχει αναφερθεί και σε άλλες περιπτώσεις γονιδίων του ρολογιού. Οι LHY και CCA1 του A. thaliana έχει βρεθεί σε πειράματα επαγόμενης υπερέκφρασής τους ότι καταστέλλουν την ίδια τους την έκφραση (Adams et al., 2015), όπως και ο παράγοντας LUX προσδένεται στον ίδιο του τον υποκινητή ως μέρος του «εσπερινού συμπλόκου» και καταστέλλει την έκφρασή του (Helfer et al., 2011; Nusinow et al., 2011). Πέρα από την ελάχιστη περιοχή υποκινητή του PvTOC1 (-612 bp, βλ. ενότ. Δ.3) διερευνήσαμε και τη λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης PvTOC1, η οποία είναι απαραίτητη για την εν λόγω καταστολή (Galeou et al., 2018). Στην πρωτεΐνη PvTOC1 εντοπίζονται τρεις δομικές περιοχές, με βάση την ομοιότητά της με την TOC1 (61% ομολογία). Στο αμινο-τελικό άκρο της υπάρχει μία περιοχή PR, χαρακτηριστική για τους ψευδορυθμιστές απόκρισης (PRRs). Η περιοχή αυτή έχει χαρακτηριστεί ως εκείνη που έχει το δυναμικό καταστολής στην περίπτωση του 170

172 TOC1 (Gendron et al., 2012). Κάτι τέτοιο δεν φαίνεται να επιβεβαιώνεται για τον PvTOC1, καθώς η απαλοιφή της περιοχής PR δεν είχε καμία επίπτωση στην καταστολή του PvTOC1 από την PvTOC1. Το αντίστοιχο δυναμικό καταστολής, στα υπόλοιπα μέλη της οικογένειας των PRRs, έχει εντοπιστεί σε συγκεκριμένο μοτίβο της «ενδιάμεσης περιοχής» των παραγόντων αυτών (IR, Intermediate Region) (Nakamichi et al., 2010). Η συγκεκριμένη περιοχή όμως δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία με την αντίστοιχη του TOC1 και συνεπώς δεν αναμένεται να παίζει και κάποιο ρόλο σχετικά με την κατασταλτική δράση του TOC1. Ούτε στην περίπτωση του PvTOC1 εντοπίζεται το εν λόγω «κατασταλτικό» μοτίβο των IR από τους PRRs στην αντίστοιχη περιοχή της πρωτεΐνης PvTOC1. Στο καρβοξυ-τελικό άκρο της PvTOC1 βρίσκεται η περιοχή CCT, χαρακτηριστική μεταξύ των μελών της ευρύτερης οικογένειας του TOC1 (COL). Η περιοχή αυτή έχει βρεθεί να διαμεσολαβεί την πρόσδεση των παραγόντων που τη διαθέτουν στο DNA (Tiwari et al., 2010; Gendron et al., 2012) και ως συνέπεια να είναι απαραίτητη στην κατασταλτική δράση του TOC1, αδυνατώντας, όμως, να καταστείλει χωρίς την ύπαρξη λειτουργικής περιοχής PR (Gendron et al., 2012). Στην περίπτωση του PvTOC1, η περιοχή αυτή βρέθηκε να είναι απαραίτητη για την καταστολή της PvTOC1 επί του υποκινητή του PvTOC1. Βάσει της βιβλιογραφίας, πιθανά η καταστολή αυτή να γίνεται μέσω δέσμευσης της PvTOC1 στον υποκινητή του PvTOC1, καθώς η περιοχή CCT είναι γνωστό ότι είναι υπεύθυνη για τη δέσμευση σε DNA. Παραμένει, όμως, ανοιχτό το ερώτημα του ακριβούς μηχανισμού δράσης της PvTOC1 επί του ίδιου της του υποκινητή, καθώς και η σημασία της δράσης αυτής στο ρολόι του φυτού. Η διερεύνηση του ρόλου της πρωτεΐνης PvTOC1 είναι σημαντική για πολλούς λόγους. Καταρχάς, η ορθόλογή της στο A. thaliana θεωρείται απαραίτητο στοιχείο του κεντρικού ταλαντωτή του HBP. Επιπλέον, πιο σημαντικά, διαπιστώνεται δράση της στο ρολόι του φασολιού, η οποία δεν έχει αναφερθεί στο A. thaliana. Ως εκ τούτου είναι σκόπιμο να διερευνηθεί το ερώτημα αν ο κεντρικός ταλαντωτής του ρολογιού είναι ή όχι πανομοιότυπος στα διάφορα φυτά και πώς οι πιθανές διαφορές συνδέονται με τη φυσιολογία κάθε φυτικού είδους. Καθώς το ΗΒΡ του φασολιού παραμένει ένα ευρύ πεδίο προς διερεύνηση, είναι σημαντικές οι σχετικές μελλοντικές έρευνες. Η πλήρης αλληλούχηση του γονιδιώματος και οι βελτιωμένες μέθοδοι μετασχηματισμού μπορούν να συνεισφέρουν σημαντικά στη διερεύνηση των στοιχείων του ΗΒΡ και της 171

173 λειτουργίας τους στο φασόλι ως πειραματόφυτο για την προαγωγή της βασικής έρευνας αλλά και βιοτεχνολογικών εφαρμογών. 172

174 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Συστατικά ρυθμιστικών/θρεπτικών διαλυμάτων. Διάλυμα Συστατικά Hλεκτροφόρηση DNA-RNA TAE 40 mm Tris, ph 7.6, 20 mm οξικό οξύ, 1 mm EDTA, ph: Διάλυμα φορτώματος (6x) 0.25% bromophenol blue, 30% glycerol Απομόνωση γενωμικού DNA NIB 2xCTAB Διάλυμα πλύσης Διάλυμα επαναιώρησης 10 mm Tris:Cl ph 9.5, 10 mm EDTA, 100 mm KCl, 0.5 M σακχαρόζη, 4 mm σπερμιδίνη, 1 mm σπερμίνη, 0.1 % β/ο β-μερκαπτοαιθανόλη 100 mm Tris-Cl, ph: 8.0, 1.4 M NaCl, 20 mm EDTA, 2% CTAB, 0.2 % β-μερκαπτοαιθανόλη 76% αιθανόλη,10 mm NH 4 Ac 10 mm NH4Ac, 0.25 mm EDTA Χειρισμός βακτηρίων LB LB-Άγαρ SOB SOC Διάλυμα Inoue 1% β/ο tryptone, 0.5% β/ο yeast extract, 1% β/ο NaCl, ph: 7.0 με NaOH LB, 15 g/l agar 2% β/ο tryptone, 0.5% β/ο yeast extract, 8.56mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl 2, ph: 7.0 με NaOH 2% β/ο tryptone, 0.5% β/ο yeast extract, 8.56mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl2, 20mM γλυκόζη, ph: 7.0 με NaOH 55 mm MnCl 2.4H 2 O, 15 mm CaCl 2.2H 2 O, 10 mm KCl, 10 mm PIPES ph: 6.7 Χειρισμός πρωτοπλαστών Διάλυμα πέψης Διάλυμα πλύσης Διάλυμα διατήρησης 1% β/ο cellulase Onozuka R10, 0.3% β/ο macerozyme R10, 0.5 Μ μαννιτόλη, 5 mm Mes ph: 5.7, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2, 0.1% β/ο BSA 0.5 M μαννιτόλη, 5 mm Mes, ph: 7.0 με Tris, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2, 0.1% β/ο BSA 0.5 M μαννιτόλη, 5 mm Mes, ph: 7.0 με Tris, 5 mm CaCl 2 173

175 Τροποποιημένο διάλυμα διατήρησης 0.5 M μαννιτόλη, 50 mm CaCl 2, 100 μμ D-luciferin (BIOSYNTH), 50 μμ αμπικιλλίνη (Sigma-Aldrich), 5% ο/ο FBS (Fetal Bovine Serum, Merck Millipore) Διάλυμα PEG 40% β/ο PEG (MW 4000, Serva), 0.4 Μ μαννιτόλη, 100 mm Ca(NO 3 ) 2 PBS 1,37M NaCl, 27mM KCl, 100mM Na 2 HPO 4, 18mM KH 2 PO 4, ph 7,4 Ανάλυση πρωτεϊνών Διάλυμα λύσης Διάλυμα χρώσης και διαλυτοποίησης Διάλυμα ηλεκτροφόρησης Διάλυμα μεταφοράς Διάλυμα κορεσμού 1% Igepal CA-630, 50mM Tris:Cl ph: 7.4, 150mM NaCl, 2mM EGTA, 25mM NaF, 0.25% Deoxycholic acid, 0.2 mm sodium orthovanadate, 1mM PMSF, 2μg/mL leupeptin, 2μg/mL aprotinin, complete protease inhibitors (Roche) 2% SDS, 0.05M Tris-HCl ph: 7.6, 0.3 Μ σακχαρόζη, 4% ο/ο β- μερκαπτoαιθανόλη, 0.01% μπλε της βρωμοφαινόλης 0.05 Μ Tris, 0.38Μ γλυκίνη, 2mM EDTA, 5mM θειοθειϊκό νάτριο, 0.15% SDS 50mΜ Tris, 0.38Μ γλυκίνη, 20% (ο/ο) μεθανόλη 5% β/ο αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη, σε 1Χ PBS-T (PBS, 0.2% Tween-20) 174

176 Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Abe M., Kobayashi Y., Yamamoto S., Daimon Y., Yamaguchi A., Ikeda Y., Ichinoki H., Nogaguchi M., Goto K., Araki T. (2005) FD, a bzip protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science 309: Adams S., Manfield I., Stockley P., Carré I.A. (2015) Revised morning loops of the Arabidopsis circadian clock based on analyses of direct regulatory interactions. PLoS One 10, e Alabadí D., Oyama T., Yanovsky M.J., Harmon F.G., Más P., Kay S.A. (2001) Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock. Science 293: Alabadí D., Yanovsky M.J., Más P., Harmer S.L., Kay S.A. (2002) Critical role for CCA1 and LHY in maintaining circadian rhythmicity in Arabidopsis. Curr. Biol. 12: Allada R., White N.E., So W.V., Hall J.C., Rosbash M., (1998) A mutant Drosophila homolog of mammalian Clock disrupts circadian rhythms and transcription of period and timeless. Cell 93: Andrés F. and Coupland G. (2012) The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat. Rev. Genet. 13: Asakura Y., Hagino T., Ohta Y., Aoki K., Yonekura-Sakakibara K., Deji A., Yamaya T., Sugiyama T., Sakakibara H. (2003) Molecular characterization of His-Asp phosphorelay signaling factors in maize leaves: implications of the signal divergence by cytokinin-inducible response regulators in the cytosol and the nuclei. Plant Mol. Biol. 52: Baerenfaller K., Shu H., Hirsch-Hoffmann M., Fütterer J., Opitz L., Rehrauer H., Hennig L., Gruissem W. (2016) Diurnal changes in the histone H3 signature H3K9ac H3K27ac H3S28p are associated with diurnal gene expression in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 39: Baker C.L., Loros J.J., Dunlap J.C. (2012) The circadian clock of Neurospora crassa. FEMS Microbiol. Rev. 36: Baudry A., Ito S., Song Y.H., Strait A.A., Kiba T., Lu S., Henriques R., Pruneda-Paz J.L., Chua N.H., Tobin E.M., Kay S.A., Imaizumi T. (2010) F-box proteins FKF1 and LKP2 act in concert with ZEITLUPE to control Arabidopsis clock progression. Plant Cell 22: Bourbousse C., Ahmed I., Roudier F., Zabulon G., Blondet E., Balzergue S., Colot V., Bowler C., Barneche F. (2012) Histone H2B monoubiquitination facilitates the rapid modulation of gene expression during Arabidopsis photomorphogenesis. PLoS Genet. 8, e Boxall S.F., Foster J.M., Bohnert H.J., Cushman J.C., Nimmo H.G., Hartwell J. (2005) Conservation and divergence of circadian clock operation in a stress-inducible Crassulacean acid metabolism species reveals clock compensation against stress Plant Physiol. 137: Bünning E. and Moser. I. (1969) Interference of moonlight with the photoperiodic measurement of time by plants, and their adaptive reaction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:

177 Cadle M.M. and Jahn M.M. (2005) Resistance conferred against bean common mosaic virus by the incompletely dominant I locus of Phaseolus vulgaris is active at the single cell level. Arch. Virol. 150: Chen F., Shi X., Chen L., Dai M., Zhou Z., Shen Y., Li J., Li G., Wei N., Deng X.W. (2012) Phosphorylation of FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL1 is a key mechanism defining signaling dynamics of phytochrome A under red and far-red light in Arabidopsis. Plant Cell 24: Chen F., Li B., Li G., Charron J.B., Dai M., Shi X., Deng X.W.(2014) Arabidopsis phytochrome A directly targets numerous promoters for individualized modulation of genes in a wide range of pathways. Plant Cell 26: Chow B.Y., Helfer A., Nusinow D.A. and Kay S.A. (2012) ELF3 recruitment to the PRR9 promoter requires other Evening Complex members in the Arabidopsis circadian clock. Plant Signal. Behav. 7: Christie J.M. and Briggs W.R. (2001) Blue light sensing in higher plants. J Biol. Chem. 276: Covington M.F., Maloof J.N., Straume M., Kay S.A., Harmer S.L. (2008) Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9:R130. Crosthwaite S.K., Dunlap J.C., Loros J.J. (1997) Neurospora wc-1 and wc-2: transcription, photoresponses, and the origins of circadian rhythmicity. Science 276: Cuin T.-A. (2007) Rhythms in Plants: Phenomenology, Mechanisms, and Adaptive Significance. Molecular aspects of the Arabidopsis circadian clock. S. Mancuso and Shabala (Eds.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. Daniel X., Sugano S., Tobin E.M. (2004) CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillation function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: Darlington T.K., Wager-Smith K., Ceriani M.F., Staknis D., Gekakis N., Steeves T.D.L., Weitz C.J., Takahashi J.S., Kay S.A., (1998) Closing the circadian loop: CLOCK-induced transcription of its own inhibitors per and tim. Science 280: Darwin C. (1880) The power of movement in plants. John Murray, London. Denault D.L., Loros J.J., Dunlap J.C. (2001) WC-2 mediates WC-1 FRQ interaction within the PAS protein-linked circadian feedback loop of Neurospora. EMBO J. 20: Denu J.M. (2005) Vitamin B3 and sirtuin function. Trends Biochem. Sci. 30: Devlin P.F. (2002) Signs of time: environmental input to the circadian clock. J Exp. Bot. 53: Dixon L.E., Knox K., Kozma-Bognar L., Southern M.M., Pokhilko A., Millar A.J. (2011) Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21: Dodd A.N., Salathia N., Hall A., Tóth E.-K., Nagy F., Hibberg J.M., Millar A.J., Webb A.A.R. (2005) Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival and competitive advantage. Science 309:

178 Doi M, Hirayama J, Sassone-Corsi P (2006) Circadian regulator CLOCK is a histone acetyltransferase. Cell. 125: Dornbusch T., Michaud O., Xenarios I., Fankhauser C. (2014) Differentially phased leaf growth and movements in Arabidopsis depend on coordinated circadian and light regulation. Plant Cell 26: Dowson-Day M. J. and Millar A. J. (1999) Circadian dysfunction causes aberrant hypocotyl elongation patterns in Arabidopsis. Plant J. 17: Doyle M.R., Davis S.J., Bastow R.M., McWatters H.G., Kozma-Bognar L., Nagy F., Millar A.J., Amasino R.M. (2002) The ELF4 gene controls circadian rhythms and flowering time in Arabidopsis thaliana. Nature (London) 419: Dunlap J.C. (1999) Molecular bases for circadian clocks. Cell 96: Dunlap J.C., Loros J.J., DeCoursey P. (2004). Chronobiology: Biological Timekeeping. Sunderland, MA: Sinauer Associates. Endo M. (2016) Tissue-specific circadian clocks in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 29: Engelmann W. (2007) Rhythms in Plants: Phenomenology, Mechanisms, and Adaptive Significance. How plants identify season by using a circadian clock. S, Mancuso and Shabala (Eds.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. Espinoza C., Degenkolbe T., Caldana C., Zuther E., Leisse A., Willmitzer L., Hincha D.K., Hannah M.A. (2010) Interaction with diurnal and circadian regulation results in dynamic metabolic and transcriptional changes during cold acclimation in Arabidopsis. PLoS ONE 5:e Fankhauser C., Yeh K.-C., Lagarias C., Zhang H., Elich T.D., Chory J. (1999) PKS1, a substrate phosphorylated by phytochrome that modulates light signaling in Arabidopsis. Science 284: Farinas B. and Más P. (2011) Functional implication of the MYB transcription factor RVE8/LCL5 in the circadian control of histone acetylation. Plant J. 66: Farré E.M., Harmer S.L., Harmon F.G., Yanovsky M.J., Kay S.A. (2005) Overlapping and distinct roles of PRR7 and PRR9 in the Arabidopsis circadian clock. Curr. Biol. 15: Fowler S.G., Cook D., Thomashow M.F. (2005) Low temperature induction of Arabidopsis CBF1, 2, and 3 is gated by the circadian clock. Plant Physiol. 137: Fujiwara S., Wang L., Han L., Suh S.S., Salomé P.A., McClung C.R., Somers D.E. (2008) Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283: Galeou A. and Prombona A. (2012) Light at night resynchronizes the evening-phased rhythms of TOC1 and ELF4 in Phaseolus vulgaris. Plant Sci. 184: Galeou A., Roussis A., Prombona A. (2018) Investigation of the Phaseolus vulgaris circadian clock and the repressive role of the PvTOC1 factor by a newly established in vitro system. J. Plant Physiol. 222: Gardner M.J., Hubbard K.E., Hotta C.T., Dodd A.N., Webb A.A.R. (2006) How plants tell the time. Biochem. J. 397:

179 Gendron J.M., Pruneda-Paz J.L., Doherty C.J., Gross A.M., Kang S.E., Kay S.A. (2012) Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: Gilmartin P.M. and Bowler C. (2002) Molecular Plant Biology, Vol. 2, Oxford Univercity Press, ISBN: , pp Giovinazzo G., Greco V., Vitale A., Bollini R. (1997) Bean (Phaseolus vulgaris L.) protoplasts as a model system to study the expression and stability of recombinant seed proteins. Plant Cell Rep. 16: Görisch S.M., Wachsmuth M., Tóth K.F., Lichter P., Rippe K. (2005) Histone acetylation increases chromatin accessibility. J. Cell Sci. 118: Gould P.D., Locke J.C., Larue C., Southern M.M., Davis S.J., Hanano S., Moyle R., Milich R., Putterill J., Millar A.J., Hall A. (2006) The molecular basis of temperature compensation in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 18: Graf A., Schlereth A., Stitt M., Smith A.M. (2010) Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: Graf A. and Smith A.M. (2011) Starch and the clock: the dark side of plant productivity. Trends Plant Sci. 16:1-7. Graham P.H. and Vance C.P. (2003) Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131: Green R.M. and Tobin E.M. (1999) Loss of the circadian clock-associated protein 1 in Arabidopsis results altered clock-regulated gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: Green R.M. and Tobin E.M. (2002) The role of CCA1 and LHY in the plant circadian clock. Dev. Cell 5: Greenham K. and McClung C.R. (2015) Integrating circadian dynamics with physiological processes in plants. Nat. Rev. Genet. 16: Greesel J. (1979) Blue light photoreceptor. Photochem. Photobiol. 30: Gutiérrez R.A., Stokes T.L., Thum K., Xu X., Obertello M., Katari M.S., Tanurdzic M., Dean A., Nero D.C., McClung C.R., Coruzzi G.M. (2008) Systems approach identifies an organic nitrogen-responsive gene network that is regulated by the master clock control gene CCA1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: Harmer S.L., Hogenesch J.B., Straume M., Chang H.S., Han B., Zhu T., Wang X., Kreps J.A., Kay S.A. (2000) Orchestrated transcription of key pathways in Arabidopsis by the circadian clock. Science 290: Harmer S.L., Panda S., Kay S.A. (2001) Molecular bases of circadian rhythms. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: Hayama R. and Coupland G. (2003) Shedding light on the circadian clock and the photoperiodic control of flowering. Curr. Opin. Plant Biol. 6:

180 Haydon Μ.J., Hearn T.J., Bell L.J., Hannah M.A., Webb A.A.R. (2013) Metabolic regulation of circadian clocks. Semin. Cell Dev. Biol. 24: He Q., Cheng P., Yang Y., Wang L., Gardner K.H., Liu Y. (2002) White collar-1, a DNA binding transcription factor and a light sensor. Science 297: Helfer A., Nusinow D.A., Chow B.Y., Gehrke A.R., Bulyk M.L., Kay S.A. (2011) LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr. Biol. 21: Hemmes H.,Henriques R., Jang I.-C., Kim S., Chua N.-H. (2012) Circadian clock regulates dynamic chromatin modifications associated with arabidopsis CCA1/LHY and TOC1 transcriptional rhythms. Plant Cell Physiol. 53: Hernando E. Romanowski A., Yanovsky M.J. (2017) Transcriptional and post-transcriptional control of the plant circadian gene regulatory network. Biochim. Biophys. Acta 1860: Herrero E., Kolmos E., Bujdoso N., Yuan Y., Wang M., Berns M.C., Uhlworm H., Coupland G., Saini R., Jaskolski M., Webb A., Gonçalves J., Davis S.J. (2012) EARLY FLOWERING4 recruitment of EARLY FLOWERING3 in the nucleus sustains the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 24: Himanen K., Woloszynska M., Boccardi T.M., De Groeve S., Nelissen H., Bruno L., Vuylsteke M., Van Lijsebettens M. (2012) Histone H2B monoubiquitination is required to reach maximal transcript levels of circadian clock genes in Arabidopsis. Plant J. 72: Hnatuszko-Konka K., Kowalczyk T., Gerszberg A., Wiktorek-Smagur A., Kononowicz A. K. (2014) Phaseolus vulgaris - Recalcitrant potential. Biotechnol. Adv. 32: Hong C.I., Ruoff P., Loros J.J. & Dunlap J.C. (2008) Closing the circadian negative feedback loop: FRQ-dependent clearance of WC-1 from the nucleus. Gene Dev. 22: Hsu P.Y., Devisetty U.K., Harmer S.L. (2013) Accurate timekeeping is controlled by a cycling activator in Arabidopsis. elife 2, e Huang H., Alvarez S., Bindbeutel R, Shen Z., Naldrett M.J., Evans B.S., Briggs S.P., Hicks L.M., Kay S.A., Nusinow D.A. (2016) Identification of Evening Complex associated proteins in Arabidopsis by affinity purification and mass spectrometry. ASBMB 15: Huang T., Bohlenius H., Eriksson S., Parcy F., Nilsson O. (2005) The mrna of the Arabidopsis gene FT moves from leaf to shoot apex and induces flowering. Science; 309: Huang W., Perez-Garcia P., Pokhilko A., Millar A.J., Antoshechkin I., Riechmann J.L., Más P. (2012) Mapping the core of the Arabidopsis circadian clock defines the network structure of the oscillator. Science 336: Huq E. and Quail P.H. (2002) PIF4, a phytochrome-interacting bhlh factor, functions as a negative regulator of phytochrome B signaling in Arabidopsis. EMBO J. 21: Huq E., Al-Sady B., Hudson M., Kim C., Apel K., Quail P.H. (2004) Phytochromeinteracting factor 1 is a critical bhlh regulator of chlorophyll biosynthesis. Science 305: Imaizumi T., Tran H.G., Schultz T.F., Briggs W.R., Kay S.A. (2003) FKF1 is essential for photoperiodic-specific light signaling in Arabidopsis. Nature 426:

181 Inoue H., Nojima H., Okayama H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: Iwasaki H., Nishiwaki T., Kitayama Y., Nakajima M., Kondo T. (2002) KaiA-stimulated KaiC phosphorylation in circadian timing loops in cyanobacteria. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99: Iwata Y. and Koizumi N. (2005) An Arabidopsis transcription factor, AtbZIP60, regulates the endoplasmic reticulum stress response in a manner unique to plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102(14): James A.B., Monreal J.A., Nimmo G.A., Kelly C.L., Herzyk P., Jenkins G.I., Nimmo H.G. (2008) The circadian clock in Arabidopsis roots is a simplified slave version of the clock in shoots. Science 322: James A.B. Syed N.H., Bordage S., Marshall J., Nimmo G.A., Jenkins G.I., Herzyk P., Brown J.W., Nimmo H.G. (2012) Alternative splicing mediates responses of the Arabidopsis circadian clock to temperature changes. Plant Cell 24: Jarillo J.A., Capel J., Tang R.H., Yang H.Q., Alonso J.M., Ecker J.R., Cashmore A.R. (2001) An Arabidopsis circadian clock component interacts with both CRY1 and PHYB. Nature 410: Johnson C.H. (2001) Endogenous timekeepers in photosynthetic organisms. Annu. Rev. Physiol. 63: Johnson C.H., Zhao C., Xu Y., Mori T. (2017) Timing the day: what makes bacterial clocks tick? Nat. Rev. Microbiol. 15: Jones M.A., Covington M.F., DiTacchio L., Vollmers C., Panda S., Harmer S.L. (2010) Jumonji domain protein JMJD5 functions in both the plant and human circadian systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107: Kaczorowski K.A. and Quail P.H. (2003) Arabidopsis PSEUDO-RESPONSE REGULATOR7 is a signaling intermediate in phytochrome-regulated seedling deetiolation and phasing of the circadian clock. Plant Cell 15: Kaldis A.-D., Kousidis P., Kesanopoulos K., Prombona A. (2003) Light and circadian regulation in the expression of LHY and Lhcb genes in Phaseolus vulgaris. Plant Mol. Biol. 52: Kaldis A.D. and Prombona A. (2006) Synergy between the light-induced acute response and the circadian cycle: a new mechanism for the synchronization of the Phaseolus vulgaris clock to light. Plant Mol. Biol. 61: Kamioka M., Takao S., Suzuki T., Taki K., Higashiyama T., Kinoshita T., Nakamichi N. (2016) Direct repression of evening genes by CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED1 in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 28: Kerwin R.E., Jimenez-Gomez J.M., Fulop D., Harmer S.L., Maloof J.N., Klieben-stein D.J. (2011) Network quantitative trait loci mapping of circadian clock outputs identifies metabolic pathway-to-clock linkages in Arabidopsis. Plant Cell 23: Khanna R., Kikis E.A., Quail P.H. (2003) EARLY FLOWERING 4 functions in phytochrome B-regulated seedling de-etiolation. Plant Physiol. 133:

182 Khanna R., Huq E., Kikis E.A., Al-Sady B., Lanzatella C. Quail P.H. (2004) A novel molecular recognition motif necessary for targeting photoactivated phytochrome signaling to specific basic helix-loop helix transcription factors. Plant Cell 16: Kiba T., Henriques R., Sakakibara H., Chua N.H. (2007) Targeted degradation of PSEUDO- RESPONSE REGULATOR5 by an SCFZTL complex regulates clock function and photomorphogenesis in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 19: Kim H.Y., Coté G.G., Crain R.C. (1993) Potassium channels in Samanea saman protoplasts controlled by phytochrome and the biological clock. Science 260: Kim W.Y., Geng R.S., Somers D.E. (2003) Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: Kim W.Y., Fujiwara S., Suh S.S., Kim J., Kim Y., Han L., David K., Putterill J., Nam H.G., Somers D.E. (2007) ZEITLUPE is a circadian photoreceptor stabilized by GIGANTEA in blue light. Nature 449: Kim J. and Somers D.E. (2010) Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microrna in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154: Kim T.-S., Somers D.E., Park Y.-J. (2014) The importance of the plant circadian clock to confer heat tolerance. Plant Breed. Biotech. 2: Kloppstech K. (1985) Diurnal and circadian rhythmicity in the expression of light-induced plant nuclear messenger RNAs. Planta 165: Kojima S. and Green C. B. (2015) Circadian genomics reveal a role for post-transcriptional regulation in mammals. Biochemistry 54: Kolmos E., Nowak M., Werner M., Fischer K., Schwarz G., Mathews S., Schoof H., Nagy F., Bujnicki J.M., Davis S.J. (2009) Integrating ELF4 into the circadian system through combined structural and functional studies. HSFP J 3: Kolmos E., Chow B.Y., Pruneda-Paz J.L. and Kay S.A. (2014) HsfB2b-mediated repression of PRR7 directs abiotic stress responses of the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: Koukkari W.L. and Sothern R.B. (2006) Introducing biological rhythms. A primer on the temporal organization of life, with implications for health, society, reproduction and the natural environment. ISBN: pp Kreps J.A., Wu Y.J., Chang H.S., Zhu T., Wang X., Harper J.F. (2002) Transcriptome changes for Arabidopsis in respond to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiol. 130: Lai A.G., Doherty C.J., Mueller-Roeber B., Kay S.A., Schippers J.H.M., Dijkwel P.P. (2012) CIR-CADIAN CLOCK-ASSOCIATED 1 regulates ROS homeostasis and oxidative stress responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: Legnaioli T, Cuevas J, Más P. (2009) TOC1 functions as a molecular switch connecting the circadian clock with plant responses to drought. EMBO J. 28: Leivar P. and Quail P.H. (2011) PIFs: pivotal components in a cellular signaling hub. Trends Plant Sci. 16:

183 Lescot M., Déhais P., Thijs G., Marchal K., Moreau Y., Van de Peer Y., Rouzé P. Rombauts S. (2002) PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Res. 30: Li G., Siddiqui H., Teng Y., Lin R., Wan X.-Υ., Li J., Lau O.-S., Ouyang X., Dai M., Wan J., Devlin P.F., Deng X.W., Wang H. (2011) Coordinated transcriptional regulation underlying the circadian clock in Arabidopsis. Nat. Cell Biol. 13: Lim C. and Allada R (2013) Emerging roles for posttranscriptional regulation in circadian clocks. Nat Neurosci. 16: Liu T., Carlsson J., Takeuchi T., Newton L., Farré E.M. (2013) Direct regulation of abiotic responses by the Arabidopsis circadian clock component PRR7. Plant J. 76: Liu T.L., Newton L., Liu M.J., Shiu S.H., Farré E.M. (2016) A G-box-like motif is necessary for transcriptional regulation by circadian pseudo-response regulators in Arabidopsis. Plant Physiol. 170: Lu S.X., Knowles S.M., Andronis C., Ong M.S., Tobin E.M. (2009) CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 and LATE ELONGATED HYPOCOTYL function synergistically in the circadian clock of Arabidopsis. Plant Physiol. 150: Lu S.X., Knowles S.M., Webb C.J., Celaya R.B., Cha C., Siu J.P., Tobin E.M. (2011) The Jumonji C domain-containing protein JMJ30 regulates period length in the Arabidopsis circadian clock. Plant Physiol. 155: Lu S.X., Webb C.J., Knowles S.M., Kim S.H., Wang Z., Tobin E.M. (2012) CCA1 and ELF3 interact in the control of hypocotyl length and flowering time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158: de Mairan J. (1729) Observation botanique. Hist. Acad. Roy. Sci Makino S., Kiba T., Imamura A., Hanaki N., Nakamura A., Suzuki T., Taniguchi M., Ueguchi C., Sugiyama T., Mizuno T. (2000) Gene encoding pseudo-response regulators: insight into His-to-Asp phosphporelay and circadian rhythm in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 41: Malapeira J., Crhak Khaitova L., Más P. (2012) Ordered changes in histone modifications at the core of the Arabidopsis circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: Martin-Tryon E.L., Kreps J.A., Harmer S.L. (2007) GIGANTEA acts in blue light signaling and has biochemically separable roles in circadian clock and flowering time regulation. Plant Physiol. 143: Martinez-Garcia J.F., Huq E., Quail P.H. (2000) Direct targeting of light signals to a promoter element-bound transcription factor. Science 288: Màs P., Alabadi D., Yanovsky M.J., Oyama T., Kay S.A. (2003a) Dual role of TOC1 in the control of circadian and photomorphogenic responses in Arabidopsis. Plant Cell 15: Más P., Kim W.Y., Somers D.E., Kay S.A. (2003b) Targeted degradation of TOC1 by ZTL modulates circadian function in Arabidopsis thaliana. Nature 426: Màs P. (2008) Circadian clock function in Arabidopsis thaliana: time beyond transcription. Trends in Cell Biology 18:

184 McClung C.R., Salomé S.A., Michael T.P. (2002) The Arabidopsis circadian system. In The Arabidopsis Book. Somerville C.R. and Meyerowitz E.M., eds. American Society of Plant Biologists. McClung C.R. (2006) Plant Circadian Rhythms. Plant Cell 18: Meldau S., Erb M., Baldwin I.T. (2012) Defence on demand: mechanisms behind optimal defence patterns. Ann. Bot. 110: Merrow M.W., Garceau N.Y., Dunlap J.C. (1997) Dissection of a circadian oscillation into discrete domains. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: Michael T.P. and McClung C.R. (2002) Phase-specific circadian clock regulatory elements in Arabidopsis. Plant Physiol. 130: Michael T.P., Salome P.A., McClung C.R. (2003) Two Arabidopsis circadian oscillators can be distinguished by differential temperature sensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: Michael T.P. and McClung C.R. (2003) Enhancer trapping reveals widespread circadian clock transcriptional control in Arabidopsis. Plant Physiol. 132: Michael, T.P., Mockler T.C., Breton G., McEntee C., Byer A., Trout J.D., Hazen S.P., Shen R., Priest H.D., Sullivan C.M., Givan S.A., Yanovsky M., Hong F., Kay S.A., Chory J. (2008). Network discovery pipeline elucidates conserved time-of-day-specific cis-regulatory modules. PLoS Genet. 4(2):e14. Millar A.J., Carré I.A., Strayer C.A., Chua N.H., Kay S.A. (1995) Circadian clock mutants in Arabidopsis identified by luciferace imaging. Science 267: Millar A.J. and Kay S.A. (1996) Integration of circadian and phototransduction pathways in the network controlling CAB gene transcription in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: Millar A.J. (2016) The intracellular dynamics of circadian clocks reach for the light of ecology and evolution. Annu. Rev. Plant Biol. 67: Mishra P. and Panigrahi K.C. (2015) GIGANTEA: an emerging story. Front. Plant Sci. 6, 8. Mizoguchi T., Wheatley K., Hanzawa Y., Wright L., Mizoguchi M., Song H.-R., Carré I.A., Coupland G. (2002) LHY and CCA1 are partially redundant genes required to maintain circadian rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell 2: Mizoguchi T., Wright L., Fujiwara S., Cremer F., Lee K., Onouchi H., Mouradov A., Fowler S., Kamada H., Putterill J., Coupland G. (2005) Distinct roles of GIGANTEA in promoting flowering and regulating circadian rhythms in Arabidopsis. Plant Cell 17: Mizuno T. (2004) Plant response regulators implicated in signal transduction and circadian rhythm. Curr. Opin. Plant Biol. 7: Mizuno T., Nomoto Y., Oka H., Kitayama M., Takeuchi A., Tsubouchi M., Yamashino T. (2014) Ambient temperature signal feeds into the circadian clock transcriptional circuitry through the EC night-time repressor in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 55:

185 Nagel D.H., Pruneda-Paz J.L. and Kay S.A. (2014) FBH1 affects warm temperature responses in the Arabidopsis circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: Nagy F., Kay S.A., Chua N.-H. (1988) A circadian clock regulates transcription of the wheat Cab-1 gene. Genes Dev. 2: Nagy F., Schäfer E. (2002) Phytochromes control photomorphogenesis by differentially regulated, interacting signalling pathways in higher plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53: Nakajima M., Imai K., Ito H., Nishiwaki T., Murayama Y., Iwasaki H., Oyama T., Kondo T. (2005) Reconstitution of circadian oscillation of cyanobacterial KaiC phosphorylation in vitro. Science 308: Nakamichi Ν., Kusano M., Fukushima A., Kita M., Ito S., Yamashino T., Saito K., Sakakibara H., and Mizuno T. (2009) Transcript profiling of an Arabidopsis PSEUDO RESPONSE REGULATOR arrhythmic triple mutant reveals a role for the circadian clock in cold stress response. Plant Cell Physiol. 50: Nakamichi, N., Kiba T., Henriques R., Mizuno T., Chua N.H., Sakakibara H. (2010) PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 22: Nakamichi N., Kiba T., Kamioka M., Suzuki T., Yamashino T., Higashiyama T., Sakakibara H., Mizuno T.. (2012) Transcriptional repressor PRR5 directly regulates clock-output pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: Nanjareddy K., Arthikala M.-K., Blanco L., Arellano E.S., Lara M. (2016) Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16:53. doi: /s Ni, Z., Kim E.D., Ha M., Lackey E., Liu J., Zhang Y., Sun Q., Chen Z.J. (2009) Altered circadian rhythms regulate growth vigour in hybrids and allopolyploids. Nature 457: Nohales M.A. and Kay S.A. (2016) Molecular mechanisms at the core of the plant circadian oscillator. Nat. Stuct. Mol. Biol. 23: Nozue K., Covington M.F., Duek P.D., Lorrain S., Fankhauser C., Harmer S.L., Maloof J.N. (2007) Rhythmic growth explained by coincidence between internal and external cues. Nature 448: Nusinow D.A., Helfer A., Hamilton E.E., King J.J., Imaizumi T., Schultz T.F., Farré E.M., Kay S.A. (2011) The ELF4 ELF3 LUX complex links the circadian clock to diurnal control of hypocotyl growth. Nature 475: Para A., Farré E.M., Imaizumi T., Pruneda-Paz J.L., Harmon F.G., Kay S.A. (2007) PRR3 is a vascular regulator of TOC1 stability in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 19: Park E., Park J., Kim J., Nagatani A., Lagarias J.C., Choi G. (2012) Phytochrome B inhibits binding of phytochrome-interacting factors to their target promoters. Plant J. 72: Paulose J.K., Wright J.M., Patel A. G., Cassone V.M. (2016) Human gut bacteria are sensitive to melatonin and express endogenous circadian rhythmicity. PLoS ONE 11, e

186 Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. (2003) Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucleic Acids Res. 31 e73. Perales M. and Más P. (2007) A functional link between rhythmic changes in chromatin structure and the Arabidopsis biological clock. Plant Cell 19: Pittendrigh C.S. (1954) On the temperature independence in the clock system controlling emergence time in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 40: Pittendrich C.S. (1993) Temporal organization: reflections of a Darwinian clock-watcher. Annu. Rev. Physiol. 55: Poiré R.,, Wiese-Klinkenberg A., Parent B., Mielewczik M., Schurr U., Tardieu F., Walter A. (2010) Diel time-courses of leaf growth in monocot and dicot species: endogenous rhythms and temperature effects. J. Exp. Bot. 61: Pokhilko A., Fernández A.P., Edwards K.D., Southern M.M., Halliday K.J., Millar A.J. (2012) The clock gene circuit in Arabidopsis includes a repressilator with additional feedback loops. Mol. Syst. Biol. 8:574. Portolés S. and Más P (2010). The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6, e Pruneda-Paz J.L., Breton G., Para A., Kay S.A. (2009) A functional genomics approach reveals CHE as a component of the Arabidopsis circadian clock. Science 323: Putterill J., Robson F., Lee K., Simon R., Coupland G. (1995) The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors. Cell 80: Qin X., Byrne M., Xu Y., Mori T., Johnson C.H. (2010) Coupling of a core post-translational pacemaker to a slave transcription/translation feedback loop in a circadian system. PLoS Biol. 8, e Quail P.H. (1997) An emerging molecular map of the photochromes. Plant Cell Environ. 20: Quail P.H. (1999) Phytochrome: a light-activated molecular switch that regulates plant gene expression. Annu. Rev. Genet. 25: Rawat R., Takahashi N., Hsu P.Y., Jones M.A., Schwartz J., Salemi M.R., Phinney B.S., Harmer S.L. (2011) REVEILLE8 and PSEUDO-REPONSE REGULATOR5 form a negative feedback loop within the Arabidopsis circadian clock. PLoS Genet. 7: e Romera-Branchat M., Andres F. and Coupland G. (2014) Flowering responses to seasonal cues: what s new? Curr. Opin. Plant Biol. 21: Rugnone M.L.(2013) LNK genes integrate light and clock signaling networks at the core of the Arabidopsis oscillator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110: Rutila J.E., Suri V., Le M., So W.V., Rosbash M., Hall J.C., (1998) CYCLE is a second bhlh-pas clock protein essential for circadian rhythmicity and transcription of Drosophila period and timeless. Cell 93:

187 Salomé P.A. and McClung C.R. (2005) PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7 and 9 are partially redundant genes essential for the temperature responsiveness of the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 17: Sassone-Corsi P. (2016) The epigenetic and metabolic language of the circadian clock; A time for metabolism and hormones. Springer. ISBN-13: Sauerbrunn N. and Schlaich N.L. (2004) PCC1: a merging point for pathogen defence and circadian signalling in Arabidopsis. Planta 218: Schaffer R., Ramsay N., Samach A., Corden S., Putterill J., Carre I.A., Coupland G. (1998) The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering. Cell 93: Schaffer R., Landgraf J., Accerbi M., Simon V., Larson M., Wisman E. (2009) Microarray analysis of diurnal and circadian-regulated genes in Arabidopsis. Plant Cell 13: Schafmeier T., Kaldi K., Diernfellner A., Mohr C., Brunner M. (2006) Phosphorylationdependent maturation of Neurospora circadian clock protein from a nuclear repressor toward a cytoplasmic activator. Gene Dev. 20: Schmutz, J., McClean, P.E., Mamidi, S., Wu, G.A., Cannon, S.B., Grimwood, J., Jenkins, J., Shu, S., Song, Q., Chavarro, C., Torres-Torres, M., Geffroy, V., Moghaddam, S.M., Gao, D., Abernathy, B., Barry, K., Blair, M., Brick, M.A., Chovatia, M., Gepts, P., Goodstein, D.M., Gonzales, M., Hellsten, U., Hyten, D.L., Jia, G., Kelly, J.D., Kudrna, D., Lee, R., Richard, M.M.S., Miklas, P.N., Osorno, J.M., Rodrigues, J., Thareau, V., Urrea, C.A., Wang, M., Yu, Y., Zhang, M., Wing, R.A., Cregan, P.B., Rokhsar, D.S., Jackson, S.A. (2014) A reference genome for common bean and genome-wide analysis of dual domestications. Nat. Genet. 46: Senger H. (1984). Cryptochrome, some terminological thoughts. Blue Light Effects in Biological systems p. 72. Berlin: Springer-Verlag. Seo P.J., Park M.J., Lim M.H., Kim S.G., Lee M., Baldwin I.T., Park C.M. (2012) A selfregulatory circuit of CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 underlies the circadian clock regulation of temperature responses in Arabidopsis. Plant Cell:24, Serrano-Bueno G., Romero-Campero F.J., Lucas-Reina E., Romero J.M., Valverde F. (2017) Evolution of photoperiod sensing in plants and algae. Curr. Opin. Plant Biol. 37: Sharrock R.A. and Quail P.H. (1989) Novel phytochrome sequences in Arabidopsis thaliana: structure, evolution and differential expression of a plant regulatory photoreceptor family. Gene Dev. 3: Sheen J. (2001) Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 127: Somers D.E., Webb A.A., Pearson M., Kay S.A. (1998) The shortperiod mutant, toc1-1, alters circadian clock regulation of multiple outputs throughout development in Arabidopsis thaliana. Development 125: Somers D.E., Schultz F.T., Milnamow M. and Kay A.S. (2000) Zeitlupe encodes a novel clock-associated PAS protein from Arabidopsis. Cell 101:

188 Somers D.E., Kim W.Y., Geng R.S. (2004) The F-box protein ZEITLUPE confers dosagedependent control on the circadian clock, photomorphogenesis and flowering time. Plant Cell 16: Somers D.E. (2005) Entrainment of the circadian clock. In: Hall AJW, McWtters HG (eds). Endogenous plant rhythms. Blackwell Oxford pp: Song H.-R. and Noh Y.-S. (2012) Rhythmic oscillation of histone acetylation and methylation at the Arabidopsis central clock loci. Mol. Cells 34: Song Y.H., Shim J.S., Kinmonth-Schultz H.A., Imaizumi T. (2015) Photoperiodic flowering: time measurement mechanisms in leaves. Annu. Rev. Plant Biol. 66: Soy J., Leivar P., González-Schain N., Martín G., Diaz C., Sentandreu M., Al-Sady B., Quail P.H., Monte E. (2016) Molecular convergence of clock and photosensory pathways through PIF3 TOC1 interaction and co-occupancy of target promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113: Stanewsky R., Kaneko M., Emery P., Beretta M., Wager-Smith K., Kay S.A., Rosbash M., Hall J.C. (1998) The cryb mutation identifies cryptochrome as a circadian photoreceptor in Drosophila. Cell 95: Stock, A.M., Stock J.B., Mottonen J.M. (1991) Signal transduction in bacteria. Nature 344: Strayer C., Oyama T., Schultz T.F., Raman R., Somers D.E., Más P., Panda S., Kreps J.A., Kay S.A. (2000) Cloning of the Arabidopsis clock gene TOC1, an autoregulatory response regulator homolog. Science 289: Takahashi N., Hirata Y., Aihara K., Más P. (2015) A hierarchical multioscillator network orchestrates the Arabidopsis circadian system. Cell 163: Takahashi J.S. (2017) Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat. Rev. Genet. 18: Tataroglu O. and Emery P. (2014) Studying circadian rhythms in Drosophila melanogaster. Methods 68: Thai S.C., Hal A., Millar A.J. (2000) Functional independence of multiple circadian clocks that regulate plant gene expression. Curr. Biol. 10: Thomashow M.F. (1999) Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50: Tiwari S.B., Shen Y., Chang H.C., Hou Y., Harris A., Ma S.F., McPartland M., Hymus G.J., Adam L., Marion C., Belachew A., Repetti P.P., Reuber T.L., Ratcliffe O.J. (2010) The flowering time regulator CONSTANS is recruited to the FLOWERING LOCUS T promoter via a unique cis-element. New Phytol. 187: Tseng T.-S., Salomé P.A., McClung C.R., Olszewski N.E. (2004). SPINDLY and GIGANTEA interact and act in Arabidopsis thaliana pathways involved in light responses, flowering and rhythms in cotyledon movements. Plant Cell 16: Tzfira T. (2005) psat vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57:

189 Ueda M., Sugimoto T., Sawai Y., Ohnuki T., Yamamura S. (2003) Chemical studies on plant leaf movement controlled by a biological clock. Pure Appl. Chem. 75: Valverde F., Mouradov A., Soppe W., Ravenscroft D., Samach A., Coupland G. (2004) Photoreceptor regulation of CONSTANS protein and mechanism of photoperiodic flowering. Science 303: Wang H. and Wang H. (2015) Phytochrome signaling: time to tighten up the loose ends. Mol. Plant 8: Wang L., Fujiwara S., Somers D.E. (2010) PRR5 regulates phosphorylation, nuclear import and subnuclear localization of TOC1 in the Arabidopsis circadian clock. EMBO J. 29: Wang X. and Ma L. (2013) Unraveling the circadian clock in Arabidopsis. Plant Signal. Behav. 8:2, e Wang Y., Wu J.F., Nakamichi N., Sakakibara H., Nam H.G., Wu S.H. (2011) LIGHT- REGULATED WD1 and PSEUDO-RESPONSE REGULATOR9 form a positive feedback regulatory loop in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 23: Wang Z.Y. and Tobin E.M. (1998) Constitutive expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) gene disrupts circadian rhythms and suppresses its own expression. Cell 93: Webb A.A.R. (1998) Stomatal rhythms in biological rhythms and photoperiodism in plants. Lumsden P.J. and Millar A.J. eds pp , Bios Scientific Publications, Oxford. Webb A.A.R. (2003) The physiology of circadian rhythms in plants. New Phytol. 160: Wenkel S., Turck F., Singer K., Gissot L., Le Gourrierec J., Samach A., Coupland G. (2006) CONSTANS and the CCAAT box binding complex share a functionally important domain and interact to regulate flowering of Arabidopsis. Plant Cell 18: Whitelam G.C. and Devlin P.F. (1998) Light signalling in Arabidopsis. Plant Physiol. Biochem. 36: Wigge P.A., Kim M.C., Jaeger K.E., Busch W., Schmid M., Lohmann J.U., Weigel D. (2005) Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis. Science 309: Wu F.H., Shen S.C., Lee L.Y., Lee S.H., Chan M.T., Lin C.S. (2009) Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods 5:16 doi: / Wu J.F., Wang Y., Wu S.H. (2008) Two new clock proteins, LWD1 and LWD2, regulate Arabidopsis photoperiodic flowering. Plant Physiol. 148: Wu J.F., Tsai H.L., Joanito I., Wu Y.C., Chang C.W., Li Y.H., Wang Y., Hong J.C., Chu J.W., Hsu C.P., Wu S.H. (2016) LWD TCP complex activates the morning gene CCA1 in Arabidopsis. Nat. Commun. 7: Xie Q., Wang P., Liu X., Yuan L., Wang L., Zhang C., Li Y., Xing H., Zhi L., Yue Z., Zhao C., McClung C.R., Xu X. (2014) LNK1 and LNK2 are transcriptional coactivators in the Arabidopsis circadian oscillator. Plant Cell 26:

190 Xing Y., Fikes J.D., Guarente L. (1993) Mutations in yeast HAP2/HAP3 define a hybrid CCAAT box binding domain. EMBO J. 12: Yeom M., Kim H., Lim J., Shin A.-Y., Hong S., Kim J.-I., H.G. Nam (2014) How do phytochromes transmit the light quality information to the circadian clock in Arabidopsis? Mol. Plant 7: Yoshida M., Horinouchi S., Beppu T. (1995) Trichostatin A and trapoxin: novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function. Bioessays 17: Zhang R., Lahens N. F., Ballance H. I., Hughes M. E., Hogenesch J. B. (2014) A circadian gene expression atlas in mammals: implications for biology and medicine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 45: Zhang Z. and Gurr S.J. (2000) Walking into the unknown: a step down PCR based technique leading to the direct sequence analysis of flanking genomic DNA. Gene 253: Γαλέου Α. (2011) Μελέτη ρυθμιστικών στοιχείων ενός φωτοπεριοδικά ελεγχόμενου γονιδίου του φασολιού (Phaseolus vulgaris). Μεταπτυχιακή μελέτη. Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών. Γεωργιάδου Δ. (2015) Μελέτη της υπερέκφρασης στοιχείων του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού του Phaseolus vulgaris σε ετερόλογα συστήματα (Arabidopsis thaliana). Διπλωματική εργασία. Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας. Καράταγλης Σ. (1992) Ημερήσια κίνηση φύλλων, ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΤΩΝ, σελ Διαδικτυακοί τόποι psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/ IPR

191 Βιογραφικό Σημείωμα Αγγελική Γαλέου Προσωπικές πληροφορίες Διεύθυνση: Παλαιολόγου 6, Ηλιούπολη, Αθήνα Τηλέφωνο: , Ηλεκτρονική διεύθυνση: Στοιχεία Εργασίας: ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών Τέρμα Πατριάρχου Γρηγορίου και Νεαπόλεως 15310, Αγ. Παρασκευή, Ημερομηνία γέννησης: 21/11/1984 Υπηκοότητα: Ελληνική Εκπαίδευση Απόφοιτος του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας (2009), με βαθμό πτυχίου Λίαν Καλώς (8,07). Κάτοχος Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στον επιστημονικό τομέα «Φυτά Μεγάλης Καλλιέργειας και Βελτίωση Φυτών», του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών, τμήμα Επιστήμης Φυτικής Παραγωγής (2011), με βαθμό Άριστα (9,56). Υποψήφια Διδάκτωρ του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βοτανικής, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Χρονοβιολογίας, του Ινστιτούτου Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «Μελέτη της λειτουργίας και του επανασυγχρονισμού του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού στο φασόλι (Phaseolus vulgaris)», (2012- σήμερα) Ξένες γλώσσες Άριστη γνώση Αγγλικών [πιστοποίηση Proficiency των Πανεπιστημίων Cambridge (CPE) και Michigan (ECPE)] Μέτρια γνώση Γαλλικών (πιστοποίηση DELF-1, ενότητες Α 1 και Α 2 ) Υποτροφίες Κάτοχος Υποτροφίας του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» για εκπόνηση Διδακτορικής Διατριβής στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών (έναρξη: Ιανουάριος 2009) Λήψη υποτροφίας από το Ίδρυμα Ωνάση, για την παρακολούθηση της θερινής σειράς διαλέξεων στη Βιολογία: «A World of RNAs» (Ηράκλειο Κρήτης, 2012) 190

192 Εργαστηριακή Εμπειρία Εκτεταμένη εμπειρία στη χρήση μεθόδων και τεχνικών Μοριακής Βιολογίας, όπως απομόνωση DNA/RNA και πρωτεϊνών, RT-PCR, PCR πραγματικού χρόνου, SDS- PAGE και αποτύπωση Western, μοριακή κλωνοποίηση, χειρισμός και ανάπτυξη βακτηριακών καλλιεργειών, απομόνωση πρωτοπλαστών από φυτά και μετασχηματισμός πρωτοπλαστών Επιστημονική Δραστηριότητα Εκπόνηση πτυχιακής εργασίας με θέμα «Μελέτη της γονιδιακής έκφρασης του PvTOC1 ρυθμιστικού στοιχείου του φωτοπεριοδισμού στο φασόλι», η οποία εξετάστηκε από τριμελή επιτροπή (Αναπληρωτής Καθηγητής Δημήτριος Μπουράνης, Αναπληρωτής Καθηγητής Σπυρίδων Κίντζιος και Επίκουρος Καθηγητής Ανδρέας Βολουδάκης) με βαθμό Άριστα-10 ( ) Εκπόνηση Μεταπτυχιακής Διατριβής με θέμα «Μελέτη ρυθμιστικών στοιχείων ενός φωτοπεριοδικά ελεγχόμενου γονιδίου του φασολιού (Phaseolus vulgaris)», η οποία εξετάστηκε από τριμελή επιτροπή (Καθηγητής Γεώργιος Σκαράκης, Επίκουρος Καθηγητής Ανδρέας Βολουδάκης και Δρ. Αναστασία Προμπονά) με βαθμό Άριστα-10 ( ) Μεταπτυχιακός συνεργάτης, στο ερευνητικό πρόγραμμα: «Ενίσχυση Μεταδιδακτόρων Ερευνητών/τριών», «Ο ρόλος της ακετυλομεταφοράσης Τip60 στη ρύθμιση γονιδίων του μεταβολισμού που ελέγχονται από το κιρκαδικό ρολόι και σχετίζονται με το μεταβολικό σύνδρομο» (Ε 1696), που υλοποιήθηκε μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και δια Βίου Μάθηση», ΕΣΠΑ και συγχρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση (ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους (Φεβρουάριος 2014-Φεβρουάριος 2015) Συμμετοχή ως εθελόντρια στη «Βραδιά του Ερευνητή 2016» στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», στο κυρίως και στο pre-event Εκπαιδεύτρια στο πρόγραμμα Έξυπνοι καλοφαγάδες και Παρατηρώντας την Επιστήμη της BASF, σε συνεργασία με το ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» για επισκέψεις μαθητών πρωτοβάθμιας εκπαίδευσης (Μάιος 2017-Δεκέμβριος 2017) Μεταπτυχιακός συνεργάτης, στο ερευνητικό πρόγραμμα: «Προσδιορισμός Στόχων και Ανάπτυξη Καινοτόμων Προσεγγίσεων για Εφαρμογές στην Υγεία και το Περιβάλλον (SANITURA)» (έναρξη: Φεβρουάριος 2018), με ερευνητικό αντικείμενο: «Μελέτη μοριακών μηχανισμών ρύθμισης και λειτουργίας του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού σε φυτικά και ζωικά συστήματα». Μέλος της οργανωτικής επιτροπής του Forum νέων ερευνητών της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας,

193 Επιστημονικά Ενδιαφέροντα Οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού των φυτών, στο ψυχανθές Phaseolus vulgaris. Ο επανασυγχρονισμός των ταλαντούμενων προτύπων έκφρασης των γονιδίων του ρολογιού, κάτω από διάφορες συνθήκες φωτισμού (διαφορετικές φωτοπεριόδους, συνεχές λευκό φως). Η ανάλυση φυσιολογικών αποκρίσεων των φυτών που ελέγχονται από το ημερήσιο βιολογικό ρολόι (π.χ. κινήσεις φύλλων). Η διαλεύκανση του μοριακού κυκλώματος του ρολογιού, χρησιμοποιώντας κλασικές μοριακές μεθόδους (ανάλυση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων και πρωτεϊνών, μελέτη των υποκινητών αυτών χρησιμοποιώντας γονίδια αναφοράς και υπερέκφραση πρωτεϊνών σε σύστημα πρωτοπλαστών) και προσεγγίσεις αντίστροφης γενετικής (δημιουργία φυτών που υπερεκφράζουν κάποιο/κάποια γονίδια του ρολογιού, αδρανοποίηση γονιδίων του ρολογιού) Έλεγχος των αντιμικροβιακών ιδιοτήτων διαφόρων τύπων νανοσωματιδίων και υλικών, χρησιμοποιώντας ως πρότυπο οργανισμό το κωλοβακτηρίδιο E. coli Σεμινάρια Παρακολούθηση των μεταπτυχιακών σεμιναρίων Κυτταρικής Σηματοδότησης, στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος» (2009) Βιβλιογραφικό σεμινάριο στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «Establishing RNA Interference as a Reverse- Genetic Approach for Gene Functional Analysis in Protoplasts», Z. Zhai et al. (2009), Plant Physiology: 149, (2009) Σεμινάριο στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «Μελέτη του παράγοντα PvTOC1 του κιρκαδικού ρολογιού στο φασόλι» (2010) Βιβλιογραφικό σεμινάριο στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night», A. Graf et al. (2010), PNAS: 102, (2011) Σεμινάρια στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ» με θέμα: «Μελέτη της λειτουργίας και του επανασυγχρονισμού του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού στο φασόλι (Phaseolus vulgaris)» (2012, 2014) Βιβλιογραφικό σεμινάριο στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor», J.M. Gendron, et al., (2012), PNAS: 109(8), (2013) Βιβλιογραφικό σεμινάριο στο Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών του ΕΚΕΦΕ «ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», με θέμα: «How do phytochromes transmit the light quality information to the circadian clock in Arabidopsis?», Yeom et al., Mol. Plant, Nov 2014; 7(11): , (2015) 192

194 Συνέδρια Παρακολούθηση του 1 ου -3 ου Διεθνούς Συνεδρίου Βιοτεχνολογίας στην Ελλάδα (igbf), (Αθήνα, ) Παρακολούθηση της θερινής σειράς διαλέξεων στη Βιολογία, του Ιδρύματος Ωνάση: «A World of RNAs», μετά από λήψη της σχετικής υποτροφίας από το Ίδρυμα Ωνάση (Ηράκλειο Κρήτης, 2012) Παρακολούθηση του Συνεδρίου «Gene Regulation: from DNA sequence to Nuclear structure» (InteGeR ITN, Αθήνα, 2012) Συμμετοχή στο 35 ο Επιστημονικό Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστημών, με γραπτή ανακοίνωση: «Πρωτοπλάστες φασολιού: ένα νέο σύστημα υψηλής απόδοσης μετασχηματισμού για τη λειτουργική μελέτη γονιδίων του περιημερήσιου βιολογικού ρολογιού», Α. Γαλέου και Α. Προμπονά (Ναύπλιο, 2013) Συμμετοχή στο XXIX Πανελλήνιο Συνέδριο Φυσικής Στερεάς Κατάστασης και Επιστήμης Υλικών, με γραπτή ανακοίνωση: «Controlled Drug Release And Antibacterial Activity Of Composite P(MAA-co-MBAAm)/Fe3O4/Ag Microspheres» A. Chatzipavlidis, L.-A. Tziveleka, P. Bilalis, A. Galeou, G. Kordas, C. A. Charitidis (ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος», 2013) Συμμετοχή στο 65 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, με γραπτή ανακοίνωση: «Functional analysis of Phaseolus vulgaris putative core clock genes» A. Galeou, A. Prombona (Θεσσαλονίκη, 2014) Συμμετοχή στο 66 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, με γραπτές ανακοινώσεις: «Chromatin remodeling and the Phaseolus vulgaris circadian clock: effect of TSA on the expression of core clock genes» A. Galeou, A. Prombona, «Multilevel regulation of the c-myc oncoprotein by the circadian clock» A. Repouskou, A. Galeou, A. Prombona (Αθήνα, 2015) Συμμετοχή στο Topical Conference: Nanomaterials for Applications in Energy and Biology, με προφορική ανακοίνωση από τον Γ. Καρανικολό: «Ag/Cu Bimetallic Nanoparticle and Ion - Graphene Composites with Enhanced Antibacterial Performance» Anna Perdikaki, Angeliki Galeou, Georgios N. Karanikolos (Minneapolis, MN, U.S.A., 2017) Συμμετοχή στο 68 ο Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρείας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, με γραπτή ανακοίνωση: «The repressive role of the PvTOC1 factor in the Phaseolus vulgaris circadian clock» Α. Galeou, A. Prombona (Αθήνα, 2017) 193

195 Δημοσιεύσεις σε διεθνή περιοδικά με κριτές Angeliki Galeou and Anastasia Prombona (2012) Light at night resynchronizes the evening-phased rhythms of TOC1 and ELF4 in Phaseolus vulgaris. Plant Science 184: Nikolaos S. Heliopoulos, Sergios K. Papageorgiou, Angeliki Galeou, Evangelos P. Favvas, Fotios K. Katsaros, Kostas Stamatakis (2013) Effect of copper and copper alginate treatment on wool fabric. Study of textile and antibacterial properties. Surface and Coatings Technology 235: Nikolaos S. Heliopoulos, Angeliki Galeou, Sergios K. Papageorgiou, Evangelos P. Favvas, Fotios K. Katsaros, Kostas Stamatakis (2015) An in situ antimicrobial susceptibility testing method based on in vivo measurements of chlorophyll a fluorescence. Journal of Microbiological Methods 112: Anna Perdikaki, Angeliki Galeou, George Pilatos, Ioannis Karatasios, Nick K. Kanellopoulos, Anastasia Prombona, Georgios N. Karanikolos (2016) Ag and Cu Monometallic and Ag/Cu Bimetallic Nanoparticle Graphene Composites with Enhanced Antibacterial Performance. ACS Appl. Mater. Interfaces 8 (41): Angeliki Galeou, Andreas Roussis, Anastasia Prombona (2018) Investigation of the Phaseolus vulgaris circadian clock and the repressive role of the PvTOC1 factor by a newly established in vitro system. Journal of Plant Physiology 222:

196 Plant Science 184 (2012) Contents lists available at SciVerse ScienceDirect Plant Science jo u rn al hom epa ge: Light at night resynchronizes the evening-phased rhythms of TOC1 and ELF4 in Phaseolus vulgaris Angeliki Galeou, Anastasia Prombona Institute of Biology, Chronobiology Laboratory, NCSR Demokritos, Aghia Paraskevi, Attiki, Greece a r t i c l e i n f o Article history: Received 14 October 2011 Received in revised form 14 December 2011 Accepted 15 December 2011 Available online 3 January 2012 Keywords: Circadian rhythm Light induction Evening-phased gene Phaseolus vulgaris a b s t r a c t Circadian clocks regulate the adaptation of the organisms physiology to the environmental light dark cycles. Photic resetting of the clock differs among plant species. In Arabidopsis thaliana, morning-phased genes are not responsive to light signals at night, while in Phaseolus vulgaris, morning-phased genes are responsive to light at trough phases that are reached during the night. In order to explore this further, in this work we investigated the light-responsiveness at night of two P. vulgaris evening phased genes, the orthologs of TOC1 and ELF4. Our results demonstrate that the oscillation of their expression is symphasic under all applied photic conditions. Thus, under photoperiod peak phases are obtained in the evening (LD 12:12) or early at night (LD 6:18). Light application at the beginning of the night under LD 6:18 results in a phase shift of the PvTOC1 and PvELF4 oscillation, while at the end of the night the phase remains unchanged. Moreover, when light is applied at the narrow time window of the peak phase, a significant transient increase in the expression of both PvTOC1 and PvELF4 is caused. These results indicate that, depending on the plant species, evening-phased genes may also participate in the resetting of the circadian clock machinery by light Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. 1. Introduction Circadian clocks are crucial to physiology and metabolism in order to synchronize life of the organisms with the geophysical time [1]. The internal rhythms have a period of approximately 24 h and are set to match with the environmental light dark cycles, a phenomenon known as entrainment. The molecular mechanism underlying clock function is based on transcriptional translational feedback loops, although the molecules involved differ among distantly related species [2,3]. Moreover, posttranslational modifications like phosphorylation and ubiquitination are critical in order to keep the pace of the clock near the 24-h period [4 6]. In almost all organisms where clock function is studied, transcriptional translational negative feedback loops are central to the circadian oscillator, with the exception of the cyanobacterium Synechococcus, where rhythms are generated by protein phosphorylation and ATPase activity [7,8]. In plants, three major clock components have been identified in Arabidopsis thaliana that constitute the first described feedback loop: CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1), LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) and Abbreviations: AD, artificial dawn; ZT, Zeitgeber time; LD, light dark cycle; CWL, continuous white light. Corresponding author. Tel.: ; fax: address: prombona@bio.demokritos.gr (A. Prombona). TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1). CCA1 and LHY are Myb-like DNA-binding proteins expressed in the early part of the day [9 11] and act as repressors of TOC1 expression by binding to the evening element (EE) of its promoter [12]. TOC1 is a pseudoresponse regulator (PRR) that has substituted two of the three phosphorylation targets within the receiver domain that are necessary for signal transduction of two-component systems [13]. TOC1 is expressed in the evening and from genetic and in vitro experimental approaches, it has been proposed that TOC1 protein activates indirectly, as it has no DNA-binding motifs, CCA1 and LHY transcription [12]. This activation is thought to require additional components, such as GIGANTEA (GI) [14,15], LUX ARRHYTHMO (LUX) [16] and EARLY FLOWERING 4 (ELF4) [17], but the molecular mechanism remains unknown. TOC1 also interacts with CHE (CCA1 HIKING EXPEDI- TION) to bind the CCA1, but not the LHY promoter [18]. Moreover, four additional PRR genes from Arabidopsis, PRR9, PRR7, PRR5 and PRR3, are expressed rhythmically and in a sequential manner every 2 3 h from dawn to dusk [19]. Mathematical modelling and experimental work suggest that PRR5, PRR7 and PRR9 are part of an additional feedback loop, the so-called morning-phased oscillator. In this loop, the light-activated CCA1 and LHY activate the gene expression of PRR7 and PRR9, which in turn repress the expression of the CCA1 and LHY genes [20 22]. Light anticipation and gating of light input signals, are important properties of the clock. Gating is essential for resetting clock function and synchronizing the central oscillator to environmental /$ see front matter 2011 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved. doi: /j.plantsci

197 142 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) light. LHY and LHCB (light-harvesting complex of chlorophyll a/b binding protein genes) are at the trough levels of their expression a few hours after lights-off and exhibit increasing levels to reach the peak either at dawn (LHY) or a few hours later (LHCB) under diurnal cycles [23,24]. This is referred to as light-anticipation and occurs during the night in the absence of light signals. On the other hand, when light is given to seedlings, the responsiveness of CAB (chlorophyll a/b-binding protein genes) is modulated according to the circadian time of light application. Little or no acute response during the subjective night is indicative of a closed gate and strong acute responses are indicative of an open gate during the subjective day. In A. thaliana, the circadian rhythm of responsiveness to light has been shown to be dependent on EARLY FLOWERING 3 (ELF3), as elf3 mutant plants exhibit acute responses throughout the subjective night [25]. A role for circadian gating of light input signals has also been shown for ELF4 [26]. Moreover, ELF4 promoter was reported to be positively regulated by a phytochrome A mediated light-signalling pathway, in which CCA1-LHY proteins suppress ELF4 expression at dawn [27]. Phaseolus vulgaris is differentiated from A. thaliana with respect to the gating effect of light input signals. It has been shown that under long nights (LD 6:18) P. vulgaris exhibits strong responses to light applied as artificial dawn in the morning-phased PvLHY and LHCB during the night, when the expression is at trough levels. On the other hand, no or low acute responses occur at the beginning (3 h after lights-off) or the end of the night, respectively [24]. Thus, in order to explore any interaction of light with additional putative components of the P. vulgaris circadian clock, we applied artificial dawn (AD) at different time points of the shortday photoperiodic night and monitored the induced changes in the expression of the evening-phased genes, PvTOC1 and PvELF4. In this study, we addressed two questions: a. how does light application during the scotophase of diurnal cycles influence the rhythmic expression of the evening-phased PvTOC1 and PvELF4 genes and b. are these putative clock genes light-responsive? Work addressing these questions concerning the synchronization of the plant clock by light mainly has been confined to the study of the immediate responses of morning-phased genes after light application to A. thaliana plants grown under diurnal conditions and transferred to constant darkness [23,26]. Moreover, in a recent report, the follow-up of the newly induced rhythms in CCA1 and CAB were monitored after a 10-min far-red light treatment of A. thaliana seedlings after transfer to continuous darkness [28]. The light responsiveness of evening-phased genes, presented here for the first time, may contribute to our better understanding of the clock mechanisms leading to adaptation to the environmental light dark cycles as some differences in clock function are beginning to become apparent among various plant species [29,30]. 2. Materials and methods 2.1. Plant material and experimental design Bean seedlings (Phaseolus vulgaris cv. Red kidney) were germinated in the dark for 7 days, in perlite under standard temperature and relative humidity conditions (22 C and 80%, respectively). On the 8th day seedlings were exposed to the light conditions, as following: (1) light/dark cycles of equal day/night duration (LD 12:12) (2) light/dark cycles of short days (LD 6:18) or (3) continuous white light (CWL). In all cases of light application, the light sources were two incandescent and four fluorescent lamps at 35 E m 2 s 1. Samples were collected at the indicated time points. In order to treat seedlings with artificial dawn (AD), plants of condition (2) were exposed to light at the time points 57, 60 and 68 that correspond to total hours under LD 6:18. Thus, AD57 and AD60 were applied three and 6 h after dusk, respectively, while AD68 was applied 4 h before dawn. Following AD, seedlings were kept under continuous illumination until the end of sample collection at time 123. Collection for AD and control samples of the short-day photoperiod was simultaneously performed at the indicated time points. Following AD, sample collection was initially at 0, 3 and 6 h after lights-on and approximately every 6 h thereafter. For each sample, 10 primary bean leaves were collected from different plants, frozen in liquid N 2 and stored at 80 C (for up to one week) until total RNA was extracted. Experiments were performed independently at least 3 times Isolation of full-length PvTOC1 cdna PvTOC1 cdna was obtained by reverse transcription and PCR (RT PCR) of total RNA isolated from primary bean leaves exposed to LD 12:12. Initially, a partial cdna fragment of 1077 bases was isolated using for the RT reaction gene-specific antisense primer 5 -GTTTTCTGTTGACATACCTA-3 and for PCR degenerate forward primer 5 -TTGTGGA(CT)(AGC)CACATGTGG-3 and reverse primer 5 -GTTTTCTGTTGACATACCTA-3. PvTOC1 cdna of 1728 bases containing an ORF of 1686 bases, was obtained with primers forward 5 -TATGGAGTCTGGCGAGGAG-3 and reverse 5 - GCCCTTCATTTTGTCAAGTA RNA extraction and RT PCR The study of steady-state mrna levels was performed by RT PCR from total leaf RNA. Total RNA was isolated using the NucleoSpin RNA Plant kit (Macherey-Nagel, Düren, Germany). An extra DNAse I treatment step was performed for all samples. RNA concentration was determined spectrophotometrically and checked for its intactness on non-denaturing agarose gels. For quantification of relative RNA levels by the SYBR Green real-time polymerase chain reaction (PCR) technology, 2.5 g of total RNA was reverse transcribed using random hexamers (Fermentas, Ontario, Canada) and Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) following the manufacturer s protocol. cdnas were diluted 1:80 and 5 l of sample was PCRamplified on a Stratagene thermal cycler (MX-3000P) using the Brilliant II SYBR QPCR kit (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). All samples were run in duplicate. The relative levels for each RNA sample were calculated using the open access software DART-PCR [31]. For the normalization of input RNA, beta-actin was used. The primer pairs used for real-time PCR are given below. PvTOC1 Forward 5 -ATGAGGTATCCGTTGTTGTTAAG-3 Reverse 5 -TGTTTGTATTGGCATCACTGG-3 PvELF4 Forward 5 -CAGCAGGTGAACGAGAAC-3 Reverse 5 -AAAGGAAGAAACCATGAGTG-3 Beta-actin Forward 5 -GCTGTGCTTTCCCTTTAC-3 Reverse 5 -TTCCTGCTCGTAATCAAG-3 PCR cycles were 40 cycles of: 95 C for 30 s, 53 C (beta-actin, PvELF4) or 54 C (PvTOC1) for 45 s and 72 C for 45 s Statistical analysis For each time point studied, the mean value and standard deviation were calculated for all repeated experiments. Student s t-test was applied to ascertain statistically significant differences between control samples and samples following AD at specific time points indicated by asterisks in the relevant figures.

198 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) Fig. 1. Alignment of TOC1 deduced protein sequences from P. vulgaris (PvTOC1, JF520783), M. crystallinum (McTOC1, AY371288) and A. thaliana (AtTOC1, AF272039). Receiver domains are depicted by bold letters. Highlighted are the residues that have substituted in TOC1 proteins the aspartate, an amino acid required for phosphorelay signalling in other systems. Underlined is the CCT motif and italic letters show the acidic domain found in transcriptional regulators. 3. Results 3.1. Identification of the PvTOC1 cdna and motifs of the putative protein In our attempt to identify putative circadian clock elements in P. vulgaris, we proceeded to the isolation of the cdna for the TOC1 ortholog of A. thaliana, hereafter referred to as PvTOC1 (GenBank ID: JF520783). TOC1 is reported to be part of the central oscillator that positively regulates the expression of the negative elements CCA1/LHY [12]. The deduced protein sequence from PvTOC1 cdna has 61% similarity to A. thaliana and 74% to Mesembryanthemum crystallinum TOC1. The protein motifs identified in AtTOC1 are conserved in PvTOC1 (Fig. 1). These include the pseudoreceiver domain, the CCT motif and the acidic domain [13], also found in the respective M. crystallinum protein. Thus, the PvTOC1 protein is another member of the pseudo-response regulators, that have substituted the two aspartate (Asp, D) residues of the regulator receiver domain by an asparagine (Asn, N) and a glutamate (Glu, E), respectively (highlighted residues in Fig. 1). A divergence is found in the direct repeats-region, which extends in AtTOC1 from position 287 to 383 (Fig. 1) that is absent from the two other proteins. Thus, the absence of about 60 amino acids results in shorter P. vulgaris (561 residues) and M. crystallinum (544 residues) TOC1 proteins, as compared to A. thaliana TOC1 (618 residues). However, the high conservation of the motifs between the three proteins indicates that they are functionally relevant. Based on the shown similarity, it is rational to suppose that the structural modules identified by modeling in the amino- and carboxy-terminal regions of TOC1 proteins from several plant species are also of importance for the function of PvTOC1. The variability of the central, not conserved, region supports the hypothesis that it may constitute a linker domain in the P. vulgaris protein, as it has been proposed for the TOC1 proteins from other plant species [32] Temporal expression pattern of PvTOC1 and PvELF4 under diurnal cycles In continuation, we were interested in analyzing the expression pattern of PvTOC1 under photoperiodic conditions. In this analysis, PvELF4 was additionally included, since it is reported to also be a positive regulator and to form an extra feedback loop with CCA1/LHY. Moreover, CCA1/LHY, TOC1 and ELF4 are proposed to be involved in the light regulation of the central oscillator [17]. Thus, in order to examine whether the expression of PvTOC1 and PvELF4 displays a circadian pattern, we initially exposed etiolated bean seedlings to continuous white light (CWL) and monitored the steady-state mrna levels by applying real-time RT PCR. We observed rhythmic expression for both genes with peak levels around times 12 and 36 (Fig. 2). However, PvELF4 exhibits a sharper peak and a significant difference between peak and trough levels that are not observed in PvTOC1. When seedlings are exposed to photoperiods of equal day night length, the peaks in the expression of the two genes are reached at the end of the day, a finding indicating that PvTOC1 and PvELF4 are evening-phased genes (Fig. 3A and B). Under photoperiods of long nights (LD 6:18), the peaks are reached at the beginning of the night while trough levels are detected at dawn (Fig. 3C and D). PvELF4 displays a sharp peak under both photoperiods of equal day night length and long night, while PvTOC1 exhibits a gradual decrease following peak levels, especially under long night conditions, where a second, smaller peak is detected (Fig. 3C). These results demonstrate that PvTOC1 and PvELF4 are rhythmically expressed under different photoperiods and that after exposure

199 144 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) Fig. 2. Rhythmic accumulation of PvTOC1and PvELF4 steady-state mrna levels in bean primary leaves. Etiolated seedlings were transferred to CWL on the 8th day and samples were collected at the indicated time points. Transcript levels were determined by RT PCR. The value of each time point corresponds to the mean ± standard deviation (SD) from all independent experiments. Data are expressed relative to the value of the first time point which was arbitrarily set as 1. of etiolated seedlings to light, a notable increase of the mrna dark-levels is observed, which is more prominent in the case of PvELF4. This prompted us to examine the effect of light on the rhythmic expression levels of PvTOC1 and PvELF4 under photoperiodic conditions The effect of light on the expression of PvTOC1 and PvELF4 when applied as artificial dawn at the beginning of the long night Previous experiments with P. vulgaris designed to study the response to light of the rhythmically expressed light-harvesting Lhcb gene and of the putative central oscillator gene PvLHY showed that the gating mechanism differs between P. vulgaris and A. thaliana. While the circadian gate is open in P. vulgaris at trough phases of the light responsive genes Lhcb and PvLHY [24,30], in A. thaliana the opposite is true [23]. In order to further elucidate the mechanism operating in P. vulgaris, we exposed the seedlings to artificial dawn (AD) at different phases of the 18-h long night photoperiod and analyzed the light response and the ensuing circadian oscillation of PvTOC1 and PvELF4. AD applied to the seedlings at the beginning of the long night, i.e. 3 h after lights-off (AD57), causes a transient increase in PvTOC1 expression levels 3 h after the artificial onset of light and overall higher levels with a phase delay of approximately 6 h as compared to the pre-existing rhythm (Fig. 4A). Similar effects are also observed in PvELF4, albeit significantly amplified (Fig. 4B). In particular, increase of PvELF4 levels is vigorous 3 h after AD57 with higher peak levels that are reached 6 h later than the pre-existing peak. The coincidence of the PvTOC1 and PvELF4 rhythms also after AD57 points to an analogous regulation mechanism controlling their circadian response to light. It should be noted that the time point 57 corresponds to the peak levels of PvTOC1 and PvELF4 expression. In the next approach, AD was applied to the seedlings 6 h after lights-off (AD60). The peaks of PvTOC1 (Fig. 5A) and PvELF4 (Fig. 5B) exhibit a phase delay of approximately 6 h, resulting in an overall lower amplitude of oscillation. However, in this case no transient increase of their expression can be detected shortly after AD. This indicates that the observed phase shift in the rhythm may be the result of synchronization by a distinct clock element The effect of light on the expression of PvTOC1 and PvELF4 when applied as artificial dawn at the end of the long night The influence of artificial dawn on the expression of the two genes when applied at the end of the long night (AD68, 4 h before photoperiodic dawn) was examined in the next approach. The temporal pattern of the expression of PvTOC1, with respect to the phase and the amplitude of the rhythm, shows no change after AD in comparison to the photoperiodic rhythm (Fig. 6A). The phase of PvELF4 also shows no change, but the expression levels at the peak increase more than twofold (Fig. 6B). This is an indication of PvELF4 sustained light-sensing, which is attained independently of the time of light application (see also Fig. 4B). From these and the above results we conclude that light application at the beginning of the night acts as a resynchronization signal for PvTOC1 and PvELF4 rhythmic expression, while at the end of the night light does not induce any phase change. 4. Discussion 4.1. PvTOC1 and PvELF4 exhibit a phase-dependent transient response to light The central aim of the present study was to explore the involvement of P. vulgaris putative clock genes to resynchronization by light. For this purpose the 18-h long night of the applied photoperiod was interrupted at three different time points by exposing seedlings to artificial dawn. This enabled us to monitor a. any immediate responses of the studied genes to light and b. the progression of the rhythmic phenomena following the light application at different time points of the long night. Previous studies examining the response and the synchronization of the morning-phased gene PvLHY by light have shown that, in contrast to A. thaliana, in P. vulgaris the gate is open at night for light signals [24,25,30]. For this reason, in the present study two evening-phased genes, PvTOC1 and PvELF4 were investigated, in order to explore any possible resynchronization of the rhythmic expression of these putative P. vulgaris clock elements by photic signals during the night. The data of the present study document the lightresponsiveness of two evening-phased genes and support the hypothesis for a role of evening-phased genes in clock

200 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) Fig. 3. Expression pattern of PvTOC1 (A) and (C) and PvELF4 (B) and (D) under different diurnal cycles is rhythmic. Steady-state mrna levels were analyzed at the indicated times from bean primary leaves exposed to photoperiods of 12 h light:12 h dark (A) and (B) or photoperiods of long nights 6 h light:18 h dark (C) and (D). Data were acquired as described in Fig. 2. Black and white boxes represent nights and days, respectively. Fig. 4. Application of artificial dawn 3 h after lights-off (AD57) resets PvTOC1 (A) and PvELF4 (B) rhythmic expression. Bean primary leaves were synchronized to LD 6:18 and steady-state mrna levels were analyzed at the indicated time points in samples exposed to photoperiod (closed symbols) or AD57 (open symbols). Asterisks indicate statistical significant difference (p < 0.01) between samples of the same time point. Data were acquired as described in Fig. 2.

201 146 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) Fig. 5. Application of artificial dawn 6 h after lights-off (AD60) causes a phase-shift in PvTOC1 (A) and PvELF4 (B) rhythmic expression. Bean primary leaves were synchronized to LD 6:18 and steady-state mrna levels were analyzed at the indicated time points in samples exposed to photoperiod (closed symbols) or AD60 (open symbols). Data were acquired as described in Fig. 2. synchronization by light. Thus, in green seedlings illuminated at the beginning of the night at the peak phase of the PvTOC1 and PvELF4 rhythms, the observed transient increase in expression implies that these two genes are light-responsive. For TOC1, there is no report documenting regulation of its promoter by light-dependent transcription factors. Regarding ELF4, important recent findings from the work of Li et al. [27] showed that its circadian expression is regulated by transcription factors FHY3, FAR1 and HY5 that are known to act as phytochrome signaling intermediates. Additional previous work had documented that FHY3 acts specifically also as a red light gating factor [33]. The positive action of these factors on specific ELF4 promoter motifs was found to be inhibited by the binding of the negative elements CCA1, LHY at the EE of the ELF4 promoter during the early morning (ZT 1), when CCA1/LHY genes are at their peak of expression. A similar mechanism could also operate in our system, as the induction of PvELF4 and PvTOC1 is observed only at the beginning of the night, when they are at peak levels and PvLHY near the trough phase of expression [24]. The lack of light induction 3 h later or towards the end of the night may be due to low protein levels of the phytochrome signaling intermediates, as it was shown that FHY3 protein levels decrease during the night of light dark cycles [27]. In addition, studies with mutants of A. thaliana point to a regulatory role of ELF4 on the expression of morning genes, suggesting that it is functionally active during the night [34]. Further work with P. vulgaris is necessary in order to unravel a possible role of PvELF4, as well as that of PvTOC1 on the expression of morning genes Regulation by light and the circadian clock is similar, but not identical for the evening-phased genes PvTOC1 and PvELF4 TOC1 and ELF4 of A. thaliana are rhythmically expressed genes with peaks attained before dusk or at early night, depending on the external photoperiod (evening-phased genes) [13,35]. This also holds true for the orthologs from P. vulgaris. Both genes exhibit the same phase under photoperiodic conditions and the same phase delay after AD application. These observations indicate that they are both regulated by light and clock elements in a similar way. The transient response to light only at their peak phase of expression at the beginning of the night points to a stringent control of synchronization of the evening-phased PvTOC1 and PvELF4 that occurs at a narrow time-window. In addition, at this specific ZT, 3 h after lights-off, light acts positively on the amplitude of expression. However, PvELF4 levels are under all AD positively influenced by light, independently of the time of light application, pointing to a higher sensitivity of the PvELF4 promoter to light. In A. thaliana seedlings it has been shown that normal induction of ELF4 expression during Fig. 6. Application of artificial dawn 4 h before lights-on (AD68) does not change the phase of the rhythm in PvTOC1 (A) and PvELF4 (B) expression. Bean primary leaves were synchronized to LD 6:18 and steady-state mrna levels were analyzed at the indicated time points in samples exposed to photoperiod (closed symbols) or AD68 (open symbols). Data were acquired as described in Fig. 2.

202 A. Galeou, A. Prombona / Plant Science 184 (2012) de-etiolation is dependent on PhyB [36]. Thus, a role of the phytochromes in the extensive increase of expression levels of PvELF4 has to be hypothesized. In A. thaliana, FHY3, a component of the phya signal transduction pathway, exhibits higher protein levels under conditions of continuous light [27]. However, an immediate response to light by transient increase of expression levels has not been reported for AtELF4. Similarly, there is no direct evidence reporting any induction of AtTOC1 expression by light. Although it was shown to be implicated in photomorphogenetic responses of A. thaliana and to be required for the light-mediated induction of CCA1 [37], its exact role in these processes remains unexplored. Circadian gating in the acute induction of the AtTOC1 promoter has been shown to occur after the administration of abscisic acid (ABA) [38]. In this work, the most extensive induction was 5 10 h after the subjective dawn with decreased amplitude and a slight phase-delay in the following days. No induction was detected when ABA was administered during the subjective night. Thus, our results and data from other research groups strongly suggest that TOC1 and ELF4 play a role in mediating various environmental signals to the clock in different plant species. Acknowledgment We thank Dr. T. Sourlingas for critically reading the manuscript. References [1] U. Albrecht, Orchestration of gene expression and physiology by the circadian clock, J. Physiol. (Paris) 100 (2006) [2] S.L. Harmer, S. Panda, S.A. Kay, Molecular bases of circadian rhythms, Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 17 (2001) [3] P. Lakin-Thomas, Transcriptional feedback oscillators: maybe, maybe not, J. Biol. Rhythm 21 (2006) [4] M. Gallego, D.M. Virshup, Post-translational modifications regulate the ticking of the circadian clock, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (2007) [5] S.L. Harmer, The circadian system in higher plants, Ann. Rev. Plant Biol. 60 (2009) [6] A. Baudry, S. Ito, Y.H. Song, A.A. Strait, T. Kiba, S. Lu, R. Henriques, J.L. Pruneda- Paz, N.H. Chua, E.M. Tobin, S.A. Kay, T. Imaizumi, F-box proteins FKF1 and LKP2 act in concert with ZEITLUPE to control Arabidopsis clock progression, Plant Cell 22 (2010) [7] M.J. Rust, J.S. Markson, W.S. Lane, D.S. Fisher, E.K. O Shea, Ordered phosphorylation governs oscillation of a three-protein circadian clock, Science 318 (2007) [8] K. Terauchi, Y. Kitayama, T. Nishiwaki, K. Miwa, Y. Murayama, T. Oyama, T. Kondo, ATPase activity of KaiC determines the basic timing for circadian clock of cyanobacteria, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104 (2007) [9] Z.Y. Wang, D. Kenigsbuch, L. Sun, E. Harel, M.S. Ong, E.M. Tobin, A Myb-related transcription factor is involved in the phytochrome regulation of an Arabidopsis Lhcb gene, Plant Cell 9 (1997) [10] R. Schaffer, N. Ramsay, A. Samach, S. Corden, J. Putterill, I.A. Carré, G. Coupland, The late elongated hypocotyl mutation of Arabidopsis disrupts circadian rhythms and the photoperiodic control of flowering, Cell 93 (1998) [11] Z.Y. Wang, E.M. Tobin, Constitutive expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSO- CIATED 1 (CCA1) gene disrupts circadian rhythms and suppresses its own expression, Cell 93 (1998) [12] D. Alabadí, T. Oyama, M.J. Yanovsky, F.G. Harmon, P. Más, S.A. Kay, Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the Arabidopsis circadian clock, Science 293 (2001) [13] C. Strayer, T. Oyama, T.F. Schultz, R. Raman, D.E. Somers, P. Más, S. Panda, J.A. Kreps, S.A. Kay, Cloning of the Arabidopsis clock gene TOC1, an autoregulatory response regulator homolog, Science 289 (2000) [14] S. Fowler, K. Lee, H. Onouchi, A. Samach, K. Richardson, B. Morris, G. Coupland, J. Putterill, GIGANTEA: a circadian clock-controlled gene that regulates photoperiodic flowering in Arabidopsis and encodes a protein with several possible membrane-spanning domains, EMBO J. 18 (1999) [15] T. Mizoguchi, L. Wright, S. Fujiwara, F. Cremer, K. Lee, H. Onouchi, A. Mouradov, S. Fowler, H. Kamada, J. Putterill, G. Coupland, Distinct roles of GIGANTEA in promoting flowering and regulating circadian rhythms in Arabidopsis, Plant Cell 17 (2005) [16] S.P. Hazen, T.F. Schultz, J.L. Pruneda-Paz, J.O. Borevitz, J.R. Ecker, S.A. Kay, LUX ARRHYTHMO encodes a Myb domain protein essential for circadian rhythms, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) [17] E.A. Kikis, R. Khanna, P.H. Quail, ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY, Plant J. 44 (2005) [18] J.L. Pruneda-Paz, G. Breton, A. Para, S.A. Kay, A functional genomics approach reveals CHE as a component of the Arabidopsis circadian clock, Science 323 (2009) [19] A. Matsushika, S. Makino, M. Kojima, T. Mizuno, Circadian waves of expression of the APRR1/TOC1 family of pseudo-response regulators in Arabidopsis thaliana: insight into the plant circadian clock, Plant Cell Physiol. 41 (2000) [20] E.M. Farré, S.L. Harmer, F.G. Harmon, M.J. Yanovsky, S.A. Kay, Overlapping and distinct roles of PRR7 and PRR9 in the Arabidopsis circadian clock, Curr. Biol. 15 (2005) [21] J.C. Locke, L. Kozma-Bognár, P.D. Gould, B. Fehér, E. Kevei, F. Nagy, M.S. Turner, A. Hall, A.J. Millar, Experimental validation of a predicted feedback loop in the multi-oscillator clock of Arabidopsis thaliana, Mol. Syst. Biol. 2 (2006) 59. [22] N. Nakamichi, T. Kiba, R. Henriques, T. Mizuno, N.-H. Chua, H. Sakakibara, PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock, Plant Cell 22 (2010) [23] A.J. Millar, S.A. Kay, Integration of circadian and phototransduction pathways in the network controlling CAB gene transcription in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) [24] A.D. Kaldis, P. Kousidis, K. Kesanopoulos, A. Prombona, Light and circadian regulation in the expression of LHY and Lhcb genes in Phaseolus vulgaris, Plant Mol. Biol. 52 (2003) [25] H.G. McWatters, R.M. Bastow, A. Hall, A.J. Millar, The ELF3 Zeitnehmer regulates light signalling to the circadian clock, Nature 408 (2000) [26] H.G. McWatters, E. Kolmos, A. Hall, M.R. Doyle, R.M. Amasino, P. Gyula, F. Nagy, A.J. Millar, S.J. Davis, ELF4 is required for oscillatory properties of the circadian clock, Plant Physiol. 44 (2007) [27] G. Li, H. Siddiqui, Y. Teng, R. Lin, X.Y. Wan, J. Li, O.S. Lau, X. Ouyang, M. Dai, J. Wan, P.F. Devlin, X.W. Deng, H. Wang, Coordinated transcriptional regulation underlying the circadian clock in Arabidopsis, Nat. Cell Biol. 13 (2011) [28] B. Wenden, L. Kozma-Bognár, K.D. Edwards, A.J.W. Hall, J.C.W. Locke, A.J. Millar, Light inputs shape the Arabidopsis circadian system, Plant J. (2011), doi: /j x x. [29] L.C. Liew, V. Hecht, R.E. Laurie, C.L. Knowles, J.K. Vander Schoor, R.C. Macknight, J.L. Weller, DIE NEUTRALIS and LATE BLOOMER 1 contribute to regulation of the pea circadian clock, Plant Cell 21 (2009) [30] A.D. Kaldis, A. Prombona, Synergy between the light-induced acute response and the circadian cycle: a new mechanism for the synchronization of the Phaseolus vulgaris clock to light, Plant Mol. Biol. 61 (2006) [31] S.N. Peirson, J.N. Butler, R.G. Foster, Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis, Nucleic Acids Res. 31 (2003) e73. [32] E. Kolmos, H. Schoof, M. Plümer, S.J. Davis, Structural insights into the function of the core-circadian factor TIMING OF CAB2 EXPRESSION 1 (TOC1), J. Circadian Rhythms 6 (3) (2008), doi: / [33] T. Allen, A. Koustenis, G. Theodorou, D.E. Somers, S.A. Kay, G.C. Whitelam, P.F. Devlin, Arabidopsis FHY3 specifically gates phytochrome signaling to the circadian clock, Plant Cell 18 (2006) [34] E. Kolmos, M. Nowak, M. Werner, K. Fischer, G. Schwarz, S. Mathews, H. Schoof, F. Nagy, J.M. Bujnicki, S.J. Davis, Integrating ELF4 into the circadian system through combined structural and functional studies, HFSP J. 3 (2009) [35] M.R. Doyle, S.J. Davis, R.M. Bastow, H.G. McWatters, L. Kozma-Bognár, F. Nagy, A.J. Millar, R.M. Amasino, The ELF4 gene controls circadian rhythms and flowering time in Arabidopsis thaliana, Nature 419 (2002) [36] R. Khanna, E.A. Kikis, P.H. Quail, EARLY FLOWERING 4 functions in phytochrome B-regulated seedling de-etiolation, Plant Physiol. 133 (2003) [37] P. Más, D. Alabadí, M.J. Yanovsky, T. Oyama, S.A. Kay, Dual role of TOC1 in the control of circadian and photomorphogenic responses in Arabidopsis, Plant Cell 15 (2003) [38] T. Legnaioli, J. Cuevas, P. Más, TOC1 functions as a molecular switch connecting the circadian clock with plant responses to drought, EMBO J. 28 (2009)

203 Journal of Plant Physiology 222 (2018) Contents lists available at ScienceDirect Journal of Plant Physiology journal homepage: Investigation of the Phaseolus vulgaris circadian clock and the repressive role of the PvTOC1 factor by a newly established in vitro system Angeliki Galeou a,b, Andreas Roussis b, Anastasia Prombona a, T a National Centre for Scientific Research DEMOKRITOS, Institute of Biosciences and Applications, Patr. Grigoriou E & 27 Neapoleos str., , Agia Paraskevi, Greece b National and Kapodistrian University of Athens, Faculty of Biology, Department of Botany, Athens, Greece ARTICLE INFO Keywords: Circadian Phaseolus vulgaris PvTOC1 Protoplast transformation ABSTRACT The circadian clock is crucial for the synchronization of an organism s physiology and metabolism with the geophysical time. In plants, previous work on the common bean (Phaseolus vulgaris) has identified various differing aspects of clock function compared to the widely studied Arabidopsis thaliana clock. However, transformation of legumes for the study of the circadian clock regulatory mechanisms is extremely laborious. In the present work, we describe an easy-to-follow and rapid method of preparing bean leaf protoplasts with high transformation potential and a functional circadian clock. In this system, we show that application of trichostatin A differentially changes the expression levels of several clock genes. More importantly, we investigate the effect of the clock protein PvTOC1 (Phaseolus vulgaris TIMING OF CAB EXPRESSION 1) on the activity of bean circadian promoters. We present new evidence on the function of PvTOC1 as a repressor of the promoter activity of its own gene, mediated by its conserved CCT (CONSTANS, CO-LIKE and TOC1) domain. Using our protoplast system we were able to uncover functions of the bean circadian clock and to identify an additional target of the PvTOC1clock transcription factor, not previously reported. 1. Introduction The majority of living organisms possess an endogenous mechanism, the circadian clock, which allows them to synchronize their physiological functions with the daily environmental fluctuations (e.g. photoperiod). It coordinates physiology, development, stress responses and utilization of resources. This way it contributes to the enhanced fitness of plants, conferring an evolutionary advantage (Sanchez and Kay, 2016; Yerushalmi and Green, 2009). The molecular system of the clock in the model plant, Arabidopsis thaliana, involves rhythmically expressed transcription factors, organized in feedback loops. The best characterized loop consists of two MYB transcription factors, LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) and CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) and a pseudo-response regulator, TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1). LHY/ CCA1 are expressed at higher levels at dawn and repress TOC1 expression by binding to its promoter (Alabadi, 2001). The protein TOC1 is one of the five clock-associated members of PSEUDO-RE- SPONSE REGULATORS (PRRs). PRR5, 7 and 9 have been characterized to be transcriptional repressors and to suppress LHY and CCA1 expression by rhythmic association with their promoters (Nakamichi et al., 2010). Initially, work with TOC1 (PRR1)-overexpressing A. thaliana plants showed an altered, lowered, rhythmic mrna profile of CCA1 and LHY (Makino et al., 2002), while two TOC1 alleles, toc1-1 and toc1-2, resulted in reduced CCA1/LHY levels (Alabadi, 2001). Later findings elucidated the biochemical function of TOC1 as a transcription factor that binds to the promoters of CCA1and LHY and as a general repressor of oscillator gene expression of the morning and evening loops (Gendron et al., 2012; Huang et al., 2012). LHY also negatively regulates a set of proteins referred to as the evening complex (EC), comprised of LUX (LUX ARRHYTHMO) and EARLY FLOWERING 3 (ELF3) and ELF4 (Adams et al., 2015). Recently, a new loop was described, involving the REVEILLE (RVE) group of genes. RVE8 is a morning-phased factor with positive transcriptional activity for evening-phased genes such as TOC1, LUX, and ELF4 (Hsu et al., 2013). All these factors are involved in multiple feedback loops formingacomplexnetworkwhichgivesthepacefortherhythmic expression of a plethora of output genes, such as the widely studied photosynthesis-related genes, LIGHT HARVESTING PROTEIN COM- PLEX (LHC) (Millar and Kay, 1996). Abbreviations: Pv, Phaseolus vulgaris; TOC1, TIMING OF CAB EXPRESSION 1; LHY, LATE ELONGATED HYPOCOTYL; PRRs, PSEUDO-RESPONSE REGULATORS; ELF4, EARLY FLOWERING 4; RVE8, REVEILLE 8; LHCB2, LIGHT HARVESTING PROTEIN COMPLEX OF PSII 2; GFP, GREEN FLUORESCENT PROTEIN; L12:D12, photoperiod of 12 h light and 12 h dark; TSA, trichostatin A; HDAC, histone deacetylase; LUC, firefly LUCIFERASE; CCT, CONSTANS CO-LIKE and TOC1; PR, PSEUDORECEIVER; EV, empty vector; PL, promoterless Corresponding author. address: prombona@bio.demokritos.gr (A. Prombona). Received 16 June 2017; Received in revised form 1 November 2017; Accepted 15 December 2017 Available online 31 January / 2018 Elsevier GmbH. All rights reserved.

204 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Legumes constitute the third largest family among angiosperms and the second largest class of crops. The legume, common bean (Phaseolus vulgaris L.), is a major source of protein and thus fundamental for the nutrition of more than 500 million people in developing countries (Graham and Vance, 2003). In recent years, advances have been made regarding P. vulgaris genetics, as its full genome sequence has become available (Schmutz et al., 2014). Furthermore, the circadian clock of the common bean has been shown to possess distinct properties from that of A. thaliana, regarding the light-induced resynchronization mechanism of PvLHY, PvTOC1 and PvELF4 (Galeou and Prombona, 2012; Kaldis et al., 2003). Due to the growing scientific interest in bean biology, the need to develop an in vitro system for studying the circadian clock of P. vulgaris has become essential. The highly demanding and laborious nature of transgenic bean production and the lack of available mutants prompted us to develop a bean protoplast system as an attractive alternative for elucidating aspects of circadian clock function. Utilizing this system we were able to show oscillations in gene expression and reporter activity, along with histone deacetylase (HDAC) activity involvement in the expression of bean clock genes. Moreover, our results lead to the novel finding that PvTOC1 functions, apart from repressing the morning oscillator gene, PvLHY, as a transcriptional repressor of its own gene promoter activity. 2. Materials and methods 2.1. Plant material and growth conditions Bean seeds (P. vulgaris L., cv. Red Kidney) were germinated in the dark for seven days on perlite, at 22 C and 80% relative humidity. Seedlings were switched to a photoperiod of 12 h day (light intensity: 35 μem 2 s 1 ) and 12 h night (light-dark cycle L12:D12) Cloning Promoter fragments of PvTOC1, PvELF4 and PvLHY genes (1653 bp, 1445 bp and 1905 bp upstream of the open reading frame (ORF) of each gene, respectively) were PCR amplified from bean genomic DNA (supplementary Table S1) and inserted into the PstI/BamHI sites of pbi221luc (Iwata and Koizumi, 2005), replacing the 35S promoter and creating the 1653PvTOC1:LUC, 1449PvELF4:LUC and 1905PvLHY:LUC constructs (or T-1653, E-1449 and L-1905). The same method was implemented for the constructs L-1375, L-1008, L- 452, T-1108, T-558 and E-940. E-381 was created by digesting the E- 940 construct at PstI/PmeI sites. All the intermediate size promoter fragment constructs were generated via site directed mutagenesis (Q5-SDM, E0554S, NEB) using T and E-940 as templates (supplementary Table S1). The promoterless pbi221luc vector (PLpBI) was assembled by HindIII/XbaI excision of the 35S promoter. PvTOC1 ORF was PCR amplified (supplementary Table S1) from cdna and the PvTOC1 overexpression vector (PvTOC1ox) was created by replacing the EGFP ORF with the PvTOC1 ORF in the NcoI/HindIII sites of psat6-egfp-c 1 (Tzfira et al., 2005). The HA epitope coding sequence was added to its 5 -end using the Q5-SDM kit. This vector was used in Q5-SDM reactions to create deletions of the CONSTANS, CONSTANS-LIKE, and TOC1 domain (CCT, amino acids ) and PSEUDORECEIVER domain (PR, amino acids 1 157), respectively (constructs PvTOC1ΔCCT and PvTOC1ΔPR). The empty vector of psat6-egfp-c 1 (EV) was created by removing the EGFP ORF with NcoI/HindIII digestion. All constructs were verified via sequencing Bean leaf protoplast isolation Primary leaves of days-old bean seedlings were peeled with a razor blade, removing as much as possible of the lower epidermis. Protoplast isolation was performed in the digestion solution (10 ml solution/200 mg leaves, 1% cellulase Onozuka R10, 0.3% macerozyme R10, 0.5 M mannitol, 5 mm Mes:Tris ph 5.7, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2, 0.1% bovine serum albumin-bsa) at 30 C for 2 h. The protoplast suspension was filtered through nylon gauze (79 μm) and centrifuged (80g, 5 min, 4 C). The pellet was washed twice with 10 ml wash solution (0.5 M mannitol, 5 mm Mes:Tris ph 7.0, 20 mm KCl, 10 mm CaCl 2, 0.1% BSA) and was resuspended in preservation solution (0.5 M mannitol, 5 mm Mes:Tris ph 7.0, 5 mm CaCl 2 ). For the transformation experiments, protoplasts ( cells/ml) were incubated at 4 C, on ice, for 30 min. For the rhythm experiments, protoplasts ( cells/ ml/sample) were returned to the preexisting photoperiod in 6-well plates, coated with 0.1% BSA. Trichostatin A (TSA, Sigma) was added at the indicated time points, at a concentration of 20 μm. The time the lights went on at the day of the protoplasts isolation is considered as zero hours Protoplast transformation Approximately protoplasts in 0.2 ml of preservation solution were mixed with μg plasmid DNA. An equal volume of freshly-prepared polyethylene glycol (PEG) solution (40% (w/v) PEG, MW 4000, 0.4 Μ mannitol, 100 mm Ca(NO 3 ) 2 ) was added and incubated at room temperature for 5 min. Three ml of preservation solution were added slowly, mixed and centrifuged (100g, 10 min, 4 C). The protoplasts were resuspended in 1 ml of preservation solution and incubated in 6-well plates, coated with 0.1% BSA, at 22 C in the dark for h. Alternatively, for rhythmic gene expression analysis in post-transformation samples, protoplasts were returned to the preexisting photoperiod. For the real-time monitoring of promoter activity, post-transformation protoplast samples were resuspended in preservation solution containing 50 mm final CaCl 2 concentration, supplemented with 100 μm D-luciferin (BIOSYNTH), 50 μm ampicillin (Sigma-Aldrich) and 5% FBS (Fetal Bovine Serum, Merck Millipore) at a final volume of 0.8 ml. Each sample was split in 4 parts ( cells/200 μl/well) in 96-well plates (Greiner 96 flat bottom white polystyrol) and was transferred at ZT 7 to constant red light (10 μem 2 s 1 ) at 22 C Luminescence assay Firefly luciferase activity was measured using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, # Ε1910). Renilla reniformis luciferase luminescence served as a transformation control (10 ng 35S:Ren plasmid per sample). In the reporter-effector experiments, 15 μg of each reporter plasmid were combined with 15 μg of either the effector plasmid or the empty vector (EV). Reporter experiments were performed with 20 μg DNA. Luminescence was accessed in a microplate (Greiner 96 flat bottom white polystyrol) using an Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd). Each sample was run in duplicate and each experiment was performed three times. Alternatively, for the real-time promoter activity experiments, firefly luciferase luminescence was measured in vivo, every two to five hours in protoplasts transformed with 20 μg of promoter-reporter constructs. Measurements were performed in an Infinite M200 microplate reader (Tecan Group Ltd), with an integration time of 1000 ms. Each experiment was performed twice RNA extraction and RT-PCR Total RNA was isolated using the RNA II kit (Macherey-Nagel). For quantification of relative RNA levels by the SYBR Green real-time PCR technology, total RNA (1 μg) was reverse transcribed using random hexamers and Superscript III reverse transcriptase (Invitrogen) following the manufacturer s protocol. cdnas were diluted 10 times and 4 μl of each sample were PCR-amplified on a Stratagene thermal cycler (MX-3000P) using the KAPA SYBR FAST Universal qpcr kit (KAPA 80

205 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Fig. 1. Bean leaf protoplasts possess a functional circadian clock. (A) Peeled bean leaf stripes in protoplast isolation buffer. (B) Bean leaf stripes following digestion. (C) Protoplasts expressing EGFP, following transformation. Under UV, EGFP emits green light and chlorophyll, red light. (D-E) Protoplastic rhythmic mrna levels of two clock genes, (D) PvELF4 and (E) PvLHY. Closed circles correspond to untreated controls and open squares to transformed samples. Black and white bars under each graph represent night and day, respectively. Each value corresponds to the mean ± SD (n = 3). Data are expressed relative to the value of the first time point (controls), set as 1. (For interpretation of the references to colour in this figure legend, the reader is referred to the web version of this article.) Biosystems). The PCR cycling conditions were 40 cycles of: 95 C for 3 s, 58 C for 20 s and 72 C for 15 s. The relative levels for each RNA sample were calculated using the open access software DART-PCR (Peirson et al., 2003). ATP synthase (delta' chain, mitochondrial precursor) transcript levels were used to normalize input RNA. Primers are given in supplementary Table S2. Each sample was run in triplicate and each biological experiment was executed three times Protein analysis Total protein was extracted from protoplasts [lysis buffer: 1% Igepal CA-630, 50 mm Tris:Cl ph 7.4, 150 mm NaCl, 2 mm EGTA, 25 mm NaF, 0.25% Deoxycholic acid, 0.2 mm sodium orthovanadate, 1 mm PMSF, 2 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml aprotinin and complete protease inhibitors (Roche)]. Samples were separated by SDS-PAGE and transferred onto nitrocellulose membranes (Sigma). Membranes were blocked (1 h) and incubated with primary antibody followed by HRP-conjugated secondary antibody. The signals were visualized with the chemiluminescence reagent, Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, #32209) and captured with the LAS 4000 imaging system (Fujifilm). The primary antibody was HA-Tag (C29F4) rabbit mab (Cell Signaling Technology, #3724) and the secondary antibody was goat anti-rabbit IgG (H + L) (KPL, # ). 3. Results and discussion 3.1. Bean protoplasts are an efficient and reliable system for the ex vivo study of the circadian clock Protoplasts of A. thaliana, as well as of the legume species Samanea saman, have been described to possess a functional circadian clock (Kim and Somers, 2010; Kim et al., 1993). Therefore, we sought to establish a homologous protoplast system to study the bean circadian clock. Chopped primary bean leaves were digested for two hours (Fig. 1A and B), yielding about protoplasts/25 mg leaf weight/ml digestion solution, with a life-span of at least 48 h after isolation. A major improvement of our method was the peeling of the lower leaf epidermis. This treatment facilitated better access of the enzymes to the mesophyll, lowering the digestion time to two hours, in contrast to previous protocols that reported digestion times of 4 h or longer and higher concentrations of the enzymes (Nanjareddy et al., 2016). The transformation potential of our system was tested with a vector that overexpresses EGFP (Fig. 1C), yielding an efficiency of over 80%. To test whether transformation affected endogenous rhythmic mrna expression, two clock genes were examined after overexpression of EGFP. The rhythms of the evening-phased, PvELF4 and the morning-phased, PvLHY (Fig. 1D and E, respectively) remained unaffected. Subsequently, the expression levels of various putative clock genes were examined in the bean protoplast system and robust 24-h rhythms were detected, persisting for 48 h. All examined genes exhibited their acrophases at the expected time points. Specifically, PvLHY displays peak levels in the morning (Fig. 2A, dashed line), as reported previously (Kaldis et al., 2003). PvRVE8 oscillates as a morning-phased gene (Fig. 2B, dashed line), similar to its A. thaliana orthologue, RVE8 (Rawat et al., 2011). PvTOC1 and PvELF4 oscillated with evening-peaking rhythms (Fig. 2C and D, dashed lines), in accordance with previous data on intact bean leaves (Galeou and Prombona, 2012). We then examined a photosynthesis-related gene, PvLHCB2, which is a well-established clock output and we observed that it also oscillated with the expected acrophases (supplementary Fig. S1), as documented before (Kaldis et al., 2003). In our next approach, we tested whether the clock of our protoplast system is responsive to external interventions. Trichostatin A (20 μm) was administered at different time points and the expression levels of PvLHY, PvRVE8, PvTOC1, PvELF4 and PvLHCB2 genes were monitored. TSA, an inhibitor of histone deacetylases (HDACs), promotes the 81

206 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Fig. 2. Trichostatin A (TSA) treatment alters the expression of bean clock genes. Relative expression levels of the clock genes (A) PvLHY, (B) PvRVE8, (C) PvTOC1 and (D) PvELF4, in TSAtreated protoplasts. TSA (20 μm) was added at 12 h (squares), 18 h (triangles), 24 h (circles) and 30 h (x marks) after lights-on at the day of the isolation. Dotted lines correspond to untreated controls (closed symbols). Black and white bars under each graph represent night and day, respectively. Each value corresponds to the mean ± SD (n = 3). Data are expressed relative to the value of the first time point, set as 1. unfolding of the chromatin and the transition into transcriptionally active structures (Yoshida et al., 1995). Our results show that TSA had a differential effect on the expression of each gene examined. Specifically, PvLHY displayed a variable phase shift in its rhythm, depending on the time of the TSA application, either with or without an immediate induction (Fig. 2A). A similar effect was observed on the expression of the clock output gene, PvLHCB2 (supplementary Fig. S1). This indicates that the effect of TSA on PvLHY and PvLHCB2 expression might be gated by the clock. PvRVE8 (Fig. 2B) and PvTOC1 (Fig. 2C) were always repressed, while PvELF4 (Fig. 2D) was consistently induced. Therefore, chromatin remodeling is a potential regulatory mechanism of the bean circadian clock that can be analyzed using our in vitro system. Nevertheless, the effect of TSA application, studied on the regulation of A. thaliana TOC1expression, was inductive and correlated with the declining phase of TOC1 rhythm (Perales and Más, 2007). Our experiments indicate that the regulation of PvTOC1, and also PvRVE8, expression relies on a different mechanism, mediated by the activity of HDACs, but is not gated by the clock. Based on these results, we can conclude that there are species-specific differences, regarding the regulation of the circadian clock. Aiming to further test the potential of our protoplast system for the in vitro study of the P. vulgaris clock, we fused promoter fragments of three genes, PvTOC1, PvELF4 and PvLHY to the ORF of the LUC reporter gene. In order to determine the promoter region of each clock gene, we transformed our system with these constructs. Thus, PvTOC1 promoter activity gradually rises by increasing the promoter length from 241 up to 1108 bp upstream of the ORF and then it remains unchanged up to 1653 bp (Fig. 3A). PvELF4 promoter activity levels are invariable from 381 up to 604 bp, they are doubled within the next 52 bp and then remain stable up to 1449 bp (Fig. 3B). Therefore, we can assume that the PvTOC1 promoter region extends up to approximately 1108 bp and the PvELF4, to 656 bp. In the case of the PvLHY gene, weak promoter activity could be detected only with the largest fragment ( 1905 bp, supplementary Fig. S2). In the next step, we investigated the rhythmic activity of promoterreporter constructs, in vivo. After transformation, bean protoplasts were transferred to continuous red light at ZT7 and, on the next day, bioluminescence was monitored for up to 30 h, using a luminometer microplate reader. We inspected the activity of luciferase driven by PvTOC1, PvLHY and PvELF4 promoters. Nevertheless, we were not able to detect rhythmic changes regarding the PvTOC1 and PvLHY promoter activities (supplementary Fig. S3), probably due to technical limitations of the method applied (low sensitivity). On the other hand, PvELF4 promoter exhibited a circa 24-h oscillation with a high amplitude. Peak levels were reached around CT12 (subjective dusk) and trough levels around CT22 (Fig. 3C). These results point towards a rhythmic promoter with evening-phased activity, in accordance with our gene analysis results under photoperiodic conditions, presented above (Fig. 2D). Thus, our protoplast system allows for the real-time monitoring of the circadian clock PvTOC1 protein downregulates the activity of its own promoter In A. thaliana, TOC1 protein has been documented to bind to the promoters of CCA1 and LHY and to act as a repressor (Gendron et al., 2012). Therefore, due to the species-specific differences in clock regulation, we sought to explore the potential role of PvTOC1 protein on the bean clock gene promoters, studied above. Bean protoplasts were transformed with the plasmid overexpressing PvTOC1 (PvTOC1ox) and the PvTOC1 mrna and protein levels were inspected (Fig. 4A and B). 82

207 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Fig. 3. Activity of clock gene promoters. (A B) Bean leaf protoplasts were transformed with promoter-truncate constructs driving firefly luciferase gene (LUC) expression and relative LUC activity was determined for the (A) PvTOC1 and (B) PvELF4 promoters. Each value corresponds to the mean ± SD (n = 3). Data are expressed relative to the value of the promoterless PLpBI vector background levels, set as 1. The promoter-truncate constructs are schematically illustrated below the graphs. (C) Bean leaf protoplasts were transformed with the 940PvELF4:LUC expression vector and were transferred to constant red light at ZT7. Bioluminescence measurements were taken starting the next day, every 2 5 h, for a total of 30 h. Each value corresponds to the mean ± SD (n = 4). Similar results were obtained from two independent experiments. White and striped black bars represent subjective day and subjective night, respectively. Having confirmed high expression levels of PvTOC1, we proceeded to co-transformation of our reporter constructs with the PvTOC1ox effector plasmid. This revealed no significant effect on the PvELF4 promoter activity (Fig. 5A) but resulted in an obvious reduction of the PvLHY promoter activity (Fig. 5B), despite the generally low expression levels of the PvLHY promoter observed, especially in the region of up to 1375 bp (supplementary Fig. S2). This is in accordance with the reported role of the A. thaliana TOC1 as a repressor of LHY transcription (Gendron et al., 2012). Although Huang et al. (2012) report occupation of the ELF4 promoter by TOC1, we were not able to detect any direct effect of PvTOC1 on the PvELF4 promoter. The results obtained when the relative transcript levels for each of the genes PvELF4 and PvLHY were inspected upon PvTOC1 overexpression were along the same line. PvELF4 mrna levels remained unchanged (Fig. 5C), while PvLHY mrna levels showed a significant reduction (Fig. 5D). Subsequently, we assessed the effect of the PvTOC1 protein on fragments of the PvTOC1 promoter ranging from 241 to Surprisingly, overexpression of the PvTOC1 protein reduced the activity of its own gene promoter. More specifically, we found that the downregulation takes place upstream of 558 bp, as all constructs with fragments larger than the 558 showed reduced luciferase activity when co-transformed with the PvTOC1 overexpression plasmid (Fig. 5E). The constructs containing fragments smaller than the 558 showed no statistically significant change. Overexpression of PvTOC1 also resulted in reduction of the endogenous PvTOC1 mrna levels (Fig. 5F), verifying the PvTOC1 repressive role on its own gene promoter. These results ascribe a novel role to PvTOC1 in the bean circadian clock that has not been previously reported. TOC1 protein possesses two conserved regions, the PSEUDORECEIVER (PR) domain at the N-terminus and the CONSTANS, CO-LIKE, and TOC1 (CCT) domain at its C-terminus (Strayer et al., 2000), that are greatly conserved in the PvTOC1 protein (Galeou and Prombona, 2012). Creating C-terminal and N-terminal deletions of the PvTOC1 protein (PvTOC1ΔCCT and PvTOC1ΔPR) and co-transforming them with the T-1108 promoter construct, we found that the C-terminal CCT domain region is necessary for repression (Fig. 6). Conserved CCT domains have been found to bind to DNA (Nakamichi et al., 2012, 2010; Tiwari et al., 2010). Gendron et al. (2012) attribute the repressive role of the TOC1 protein to the PR domain, but the CCT domain remains essential for the TOC1-mediated repression of CCA1. Regarding the other members of the PRR family, their repressive activity was localized outside of the CCT and the PR domains (Nakamichi et al., 2010). In our case, the luciferase reporter assays show that the downregulation of the PvTOC1 promoter is retained after the deletion of the PR domain (PvTOC1ΔPR) of the PvTOC1 protein, but is abolished after deletion of the CCT domain (PvTOC1ΔCCT). Therefore, these results clearly indicate that the CCT domain of the PvTOC1 protein is required for its repressive function on the PvTOC1 promoter. 4. Conclusion In this work, we present a protocol for the isolation of, fully viable and with high transformation potential, protoplasts from primary leaves of the common bean. This system possesses a functional circadian clock that can be investigated in vitro. Moreover, the study of circadian promoters by reporter-effector assays, prompted us to propose an additional role for the 83

208 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Fig. 4. Overexpression of PvTOC1 in bean protoplasts. (A) Total PvTOC1 relative mrna expression levels assessed via real time PCR in bean protoplasts transformed with either the empty vector (EV) or the PvTOC1 overexpression plasmid (PvTOC1ox). Values were normalized to the EV-transformed sample value which was set as 1. Each value corresponds to the mean ± SD (n = 3). (B) Protein gel blot analysis of bean protoplast lysates. Protoplasts were transformed either with the empty vector (EV) or the HA-tagged PvTOC1 overexpression vectors coding for the full-length PvTOC1 protein (PvTOC1ox), the protein with the PR domain deletion (PvTOC1ΔPR) or the CCT domain deletion (PvTOC1ΔCCT), respectively. Immunoblotting was performed with the HA-Tag antibody. Fig. 5. PvTOC1 clock protein downregulates the activity of its own promoter. (A, B, E) Bean protoplasts were co-transformed with a promoter construct driving firefly luciferase (LUC) as the reporter and the PvTOC1 overexpression plasmid (PvTOC1ox) or the respective empty vector (EV) as the effector. (A) Activity of the 940PvELF4:LUC (E-940). (B) Activity of the 1905PvLHY:LUC (L-1905). (E) Activity of PvTOC1:LUC promoter truncates (PvTOC1ox, open bars; EV, closed bars). All data are expressed relative to the promoterless PLpBI vector background levels, set as 1. (C, D, F) Endogenous relative mrna expression levels of (C) PvELF4, (D) PvLHY and (F) PvTOC1 in samples transformed either with the PvTOC1 overexpression plasmid (PvTOC1ox) or the empty vector (EV). Values were normalized to the EV-transformed sample which was set as 1. All data are expressed as the mean ± SD (n = 3). *P <

209 A. Galeou et al. Journal of Plant Physiology 222 (2018) Fig. 6. The CCT domain is necessary for the repressive activity of PvTOC1. Activity of the 1108PvTOC1:LUC construct (T-1108), co-transformed with the plasmid overexpressing the full-length PvTOC1 protein (PvTOC1ox), or the PvTOC1 protein lacking either the PR domain (PvTOC1ΔPR) or the CCT domain (PvTOC1ΔCCT). Values are normalized to the EV co-transformed sample which was set as 1. All data are expressed as the mean ± SD (n = 3). *P < PvTOC1 protein, as a repressor of its own gene expression, expanding the role of this component in the regulation of the circadian clock. Declaration of potential conflict of interest The authors declare that they have no conflict of interest. Acknowledgements This work was supported by the General Secretariat of Research and Technology, Greece and a PhD scholarship to A.G. from NCSR DEMOKRITOS. The authors would like to thank Dr. T. Tzfira (Ben-Gurion University of the Negev, Israel) for kindly providing the psat-egfp vector and Prof. N. Koizumi (Osaka Prefecture University, Japan) for the generous gift of pbi221luc vector. The 35S:Ren construct was a kind offer of Prof. D. Somers (The Ohio State University, U.S.A.). We thank Dr. T. Sourlingas for critically reading the manuscript. Appendix A. Supplementary data Supplementary data associated with this article can be found, in the online version, at References Adams, S., Manfield, I., Stockley, P., Carré, I.A., Dowidar, N., Dunaway, D., Revised morning loops of the arabidopsis circadian clock based on analyses of direct regulatory interactions. PLoS One 10, e pone Alabadi, D., Reciprocal regulation between TOC1 and LHY/CCA1 within the arabidopsis circadian clock. Science 293, (80-.). Galeou, A., Prombona, A., Light at night resynchronizes the evening-phased rhythms of TOC1 and ELF4 in Phaseolus vulgaris. Plant Sci. 184, doi.org/ /j.plantsci Gendron, J.M., Pruneda-Paz, J.L., Doherty, C.J., Gross, A.M., Kang, S.E., Kay, S.A., Arabidopsis circadian clock protein TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, Graham, P.H., Vance, C.P., Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131, Hsu, P.Y., Devisetty, U.K., Harmer, S.L., Accurate timekeeping is controlled by a cycling activator in Arabidopsis. Elife 2, e Huang, W., Pérez-García, P., Pokhilko, A., Millar, A.J., Antoshechkin, I., Riechmann, J.L., Mas, P., Mapping the core of the Arabidopsis circadian clock defines the network structure of the oscillator. Science 336, science Iwata, Y., Koizumi, N., An Arabidopsis transcription factor AtbZIP60, regulates the endoplasmic reticulum stress response in a manner unique to plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, Kaldis, A.-D., Kousidis, P., Kesanopoulos, K., Prombona, A., Light and circadian regulation in the expression of LHY and Lhcb genes in Phaseolus vulgaris. Plant Mol. Biol. 52, Kim, J., Somers, D.E., Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microrna in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154, Kim, H.Y., Coté, G.G., Crain, R.C., Potassium channels in samanea saman protoplasts controlled by phytochrome and the biological clock. Science 260, Makino, S., Matsushika, A., Kojima, M., Yamashino, T., Mizuno, T., The APRR1/ TOC1 quintet implicated in circadian rhythms of Arabidopsis thaliana: i. Characterization with APRR1-overexpressing plants. Plant Cell Physiol. 43, Millar, A.J., Kay, S.A., Integration of circadian and phototransduction pathways in the network controlling CAB gene transcription in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, Nakamichi, N., Kiba, T., Henriques, R., Mizuno, T., Chua, N.-H., Sakakibara, H., PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell 22, Nakamichi, N., Kiba, T., Kamioka, M., Suzuki, T., Yamashino, T., Higashiyama, T., Sakakibara, H., Mizuno, T., Transcriptional repressor PRR5 directly regulates clock-output pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, /pnas Nanjareddy, K., Arthikala, M.-K., Blanco, L., Arellano, E.S., Lara, M., Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16, s Peirson, S.N., Butler, J.N., Foster, R.G., Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. Nucleic Acids Res. 31, e73. Perales, M., Más, P., A functional link between rhythmic changes in chromatin structure and the Arabidopsis biological clock. Plant Cell 19, doi.org/ /tpc Rawat, R., Takahashi, N., Hsu, P.Y., Jones, M.A., Schwartz, J., Salemi, M.R., Phinney, B.S., Harmer, S.L., REVEILLE8 and PSEUDO-REPONSE REGULATOR5 form a negative feedback loop within the Arabidopsis circadian clock. PLoS Genet. 7, e Sanchez, S.E., Kay, S.A., The plant circadian clock: from a simple timekeeper to a complex developmental manager. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 8, a Schmutz, J., McClean, P.E., Mamidi, S., Wu, G.A., Cannon, S.B., Grimwood, J., Jenkins, J., Shu, S., Song, Q., Chavarro, C., Torres-Torres, M., Geffroy, V., Moghaddam, S.M., Gao, D., Abernathy, B., Barry, K., Blair, M., Brick, M.A., Chovatia, M., Gepts, P., Goodstein, D.M., Gonzales, M., Hellsten, U., Hyten, D.L., Jia, G., Kelly, J.D., Kudrna, D., Lee, R., Richard, M.M.S., Miklas, P.N., Osorno, J.M., Rodrigues, J., Thareau, V., Urrea, C.A., Wang, M., Yu, Y., Zhang, M., Wing, R.A., Cregan, P.B., Rokhsar, D.S., Jackson, S.A., A reference genome for common bean and genome-wide analysis of dual domestications. Nat. Genet. 46, Strayer, C., Oyama, T., Schultz, T.F., Raman, R., Somers, D.E., Más, P., Panda, S., Kreps, J.A., Kay, S.A., Cloning of the Arabidopsis clock gene TOC1, an autoregulatory response regulator homolog. Science 289, Tiwari, S.B., Shen, Y., Chang, H.-C., Hou, Y., Harris, A., Ma, S.F., McPartland, M., Hymus, G.J., Adam, L., Marion, C., Belachew, A., Repetti, P.P., Reuber, T.L., Ratcliffe, O.J., The flowering time regulator CONSTANS is recruited to the FLOWERING LOCUS T promoter via a unique cis-element. New Phytol. 187, org/ /j x. Tzfira, T., Tian, G.-W., Lacroix, B., Vyas, S., Li, J., Leitner-Dagan, Y., Krichevsky, A., Taylor, T., Vainstein, A., Citovsky, V., psat vectors: a modular series of plasmids for autofluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, Yerushalmi, S., Green, R.M., Evidence for the adaptive significance of circadian rhythms. Ecol. Lett. 12, x. Yoshida, M., Horinouchi, S., Beppu, T., Trichostatin A and trapoxin: novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function. Bioessays 17,