بررسی حساسیت روش Real-time PCR برای تشخیص ویروس بیماری نیوکاسل

Transcript

1 b b پژوهش و سازندگی شماره 110 بهار 1395 بررسی حساسیت روش Real-time PCR برای تشخیص ویروس بیماری نیوکاسل سمیه ستاری دانشجوی کارشناسی ارشد ژنتیک و اصالح نژاد دام دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه محمدحسین بناءبازی )نويسنده مسئول( عضو هیات علمی بخش پژوهشهای بیوتکنولوژی موسسه تحقیقات علوم دامی کشور کرج شیدا ورکوهی عضو هیات علمی گروه علوم دامی دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه میثم طباطبایی عضو هیات علمی تیم تحقیقاتی نانو سیستمها, پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران کرج تاريخ يافت: خرداد 94 تاريخ پذيرش: مهر 94 h_banabazi@asri.ir چکيده بیماری نیوکاسل یکی از مخربترین بیماریهای ویروسی طیور سرتاسر جهان است. باتوجه به اینکه روشهای سنتی قابلیت محدودی کنترل این بیماری دارند هدف از انجام این مطالعه استفاده از تکنولوژیهای نوین برای تشخیص به موقع بیماری جهت کاهش خسارت پیش روی صنعت طیور میباشد. این مطالعه به منظور تشخیص ویروس نیوکاسل یک روش Real-time-PCR بهینه سازی گردید. استخراج RNA با استفاده از کیت RNease mini )شرکت کیاژن آمریکا( و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد. RNA استخراج شده با 10 68/23 9 رونوشت اولیه به صورت سری رقتهاي 100 μl برای انجام واکنش Real-time PCR تهیه شد. این آزمایش از سویه B1 واکسن ویروس استفاده شد. آزمایش Real-time-PCR با استفاده از کیت تجاری ساخت شرکت Genekam Biotechnology کشور آلمان انجام شد. حساسیت واکنش Real-time PCR با توجه به سری رقتهای تهیه شده رونوشت/میکرولیتر تعیین گردید. با توجه به اینکه سرعت و دقت تشخیص ویروس نیوکاسل همهگیریها نقش مهمی کنترل بیماری دارد. استفاده از این روش به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت باال توصیه میگردد. كلمات كليدي: ویروس بیماری نیوکاسل) NDV ( تشخیص Real-time PCR حساسیت روش تشخیصی

2 شماره 110 نشريه دامپزشكی بهار 1395 Veterinary Journal (Pajouhesh & Sazandegi) No 110 pp: Assessment of the sensitivity of Real-time PCR for diagnosis of Newcastle disease virus Sattari, S., M.Sc student of animal genetics and breeding, Faculty of Agriculture, Razi University, Kermanshah, Iran. Banabazi, MH., Member of scientific board, Department of Biotechnology, Animal Science Research Institute of Iran (ASRI), Karaj, Iran. Vakoohi, Sh., Member of scientific board, Faculty of Agriculture, Razi University, Kermanshah, Iran. Tabatabaei, M. Member of scientific board, Nanosystems Research team, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran (ABRII), Karaj, Iran. Received: May 2015 Accepted: September Newcastle disease is one of the most serious viral diseases in the poultry worldwide. Since the traditional strategies have been not control it well, the aim of this study was to introduce new methods for early and rapid diagnosis of Newcastle. In this study, to detect the virus, a Real-time PCR method was optimized,viral RNA was extracted from strain B1 using the kit RNease mini (Qiagen, USA), according to the manufacturer's instructions. This sample had copy numbers of viral RNA per each microliter. Then, a serial dilution as 100-fold was prepare from the initial sample. Then, these dilutions were simultaneously applied in reverse transcription and Realtime PCR using commercial kits (Genekam Biotechnology, Germany) according to the manufacture s instruction. The sensitivity of Real-time PCR reaction was determined based on serial dilutions of copy number per micro liter. Since, speed and accuracy in diagnosis of contagious of Newcastle disease virus plays an important role to control the disease, so adopting this method is recommended as a diagnostic test with high sensitivity. Keyword: Newcastle disease virus (NDV), diagnosis, Real-time PCR, Sensitivity مقدمه بیماری نیوکاسل عفونت شایع طیور میباشد که عموما به صورت ناراحتی تنفسی و عصبی نشان داده میشود. عامل این بیماری ویروس نیوکاسل میباشد و یک دوره شیوع بیماری میتواند باعث تلفات بسیاری طیور شود که از نظر اقتصادی بسیار حائز اهمیت میباشد NDV سالهاست که بررسی جوانب مختلف ویروس.)Alexander )1991, کانون توجهات است ولی از همه مهمتر این که به دلیل سرعت باالی گسترش بیماری گله تشخیص سریع آن به منظور کنترل بهینه و پیشگیری به هنگام اهمیت فوقالعادهای دارد. از همین رو سرتاسر جهان با استفاده از روشهای گوناگون اعم از کالسیک و امروزین تحقیقات بسیار گستردهای مورد روشهای تشخیص سریعتر و دقیقتر تعیین پاتوتیپ ویژگیهای مولکولی و خاستگاه اصلی ویروس و نهایت رسیدن به کنترل و پیشگیری مطلوب این بیماری انجام گرفته است و همچنان ادامه دارد )2003, al.)al-garib et این بیماری 200 گونه از پرندگان از جمله بوقلمون ماکیان طوطی سانان گنجشک سانان اردک غاز مرغ کبوتر و گونههای دیگر را بر میگیرد. ویروس از طریق دستگاه تنفس منتقل میشود و میتواند میزبان مرده یا مدفوع زنده بماند Alexander,( 1991(. این بیماری به عنوان سروتیپ 1 پارامیکسوویروس مرغی )APMV-1( 1 شناخته میشود )1991.)Alexander, استفاده از روش مولکولی بدلیل سریع بودن حساس بودن و عدم استفاده از حیوانات آزمایشگاهی مقایسه با روشهای مانند جداسازی ویروس و روشهای سرولوژیکی جهت تشخیص بیماری کاربرد و اهمیت باالتری دارد )2003 al,.)al-garib et بر اساس عالیم بیماری تشخیص سریع این بیماری جلوگیری از صدمات اقتصادی ناشی از تلفات بسیار حائز اهمیت میباشد. امروزه اکثر آزمایشگاههای دامپزشکی تشخیص از طریق سرولوژی صورت میپذیرد. روش مولکولی Real-time PCR که از حساسیت باالیی برخوردار است و میتواند تشخیص سریع بیماری به ما کمک کند و موارد شیوع یک اپیدمی جلوگیری از تلفات و ضررهای اقتصادی وارده موثر باشد. هدف از انجام این مطالعه بهینه سازی روش تشخیص ویروس نیوکاسل با استفاده از تکنیک مولکولی Real-time PCR میباشد. مواد و روشها ویروس مورد استفاده این مطالعه ویروس واکسن نیوکاسل )سویه B1( تولید شده موسسه رازی بوده است. استخراج RNA با استفاده از پروتکل protocol) Purification of Viral RNA (Spin کیت RNease mini )شرکت کیاژن آمریکا( و بر اساس دستورالعمل شرکت سازنده بعمل آمد. به منظور اطمینان از کیفیت مطلوب RNA استخراج شده و تعیین غلظت آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر نانواپ 2000 )شرکت Thermo Fisher آمریکا( جذب هر نمونه طول موجهای 260 و 280 خوانده شود. به منظور تعیین حساسیت روش مورد مطالعه پس از استخراج RNA رقتهای 1/100 به صورت متوالی از تیتر مشخصی از ویروس تهیه 67

3 بررسی حساسیت روش Real-time PCR برای... گردید. واکنشهای ساخت cdna و PCR قالب یک واکنش مطابق با شرایط منج جدول 1 و با استفاده از کیت تجاری تشخیص ویروس نیوکاسل )شرکت Genekam Biotechnology آلمان( و با دستگاه Real- time PCR )شرکت BIORAD آمریکا( بر روی رقتهای تهیه شده انجام شد. کنترلهای مثبت و منفی نیز کیت مذکور تعبیه شده و طبق دستور شرکت سازنده آماده گردیدند. این آزمایش معیار تشخیص حساسیت حداقل رقت ویروس بیماری میان سریالی از رقتهای مختلف تهیه شده از RNA استخراج شده یک نمونه واکسن نظر گرفته شد. بر این اساس حداکثر حساسیت مورد مطالعه حداقل رقتی است که آن همچنان یک نمودار با سیکل آستانهای کمتر از 40 تشکیل گردد. با تعیین غلظت RNA ویروسی استخراج شده از نمونه اولیه و اطالع از وزن مولکولی کل RNA تشکیلدهنده ژنوم هر تک ویروس میتوان تعداد نسخه RNA ویروسی موجود نمونه اولیه را نیز تعیین و میزان حساسیت را بطور دقیقتر و بر اساس حداقل تعداد نسخه RNA ویروسی قابل تشخیص به روش Real- time PCR برآورد و گزارش نمود. نتایج و بحث نتایج نشان میدهدکه تعداد رونوشت از ویروس بیماریزای نیوکاسل که از یک نمونه واکسن سویهB1 جدا گردیده بود معادل /68 محاسبه گردید و نیز غلظت اولیه نمونه مورد استفاده 533/7 نانوگرم/میکرولیتر بود. همانطور که شکل 1 مشاهده میشود تکثیر نمونه کنترل مثبت و کنترل منفی برای آزمایش Real-time PCR طبق دستورالعمل کیت مورد استفاده با موفقیت انجام و سیکل آستانه 2 برای نمونه کنترل مثبت 18/55 گزارش گردید که این تکثیر میتواند نشاندهنده موفقیت تکثیر نمونههای مورد آزمایش باشد. همانطور که شکل 2 مشاهده میشود آخرین نمودار تکثیر رقت با سیکل آستانهای برابر با 44 38/ نسبت به نمونه RNA استخراج شده با تعداد /23 رونوشت/ ماکرولیتر از نمونه ویروس بکار رفته واکسن سویه B1 تشکیل گردیده است. طبق دستورالعمل کیت سیکل آستانه )ct( کمتر از )36 ct(36 قابل قبول سیکل آستانهای بین 36 تا 40 حد آستانه )40 )36 ct و باالتر از این سیکل غیرقابل قبول میباشد. محاسبه تعداد کپی نامبر نمونه RNA با استفاده از معادله 1 محاسبه گردید است. بدین ترتیب مطالعه حاضر حداکثر حساسیت روش Real- time PCR برای تشخیص بیماری نیوکاسل طیور مبتال یا به عبارت دیگر کمترین میزان رقت قابل تشخیص از ویروس نیوکاسل بافتها جدول 1- شرایط دمایی و چرخههای آزمون Real-time PCR دما زمان چرخه ثانیه 600 ثانیه 42 جه سانتیگراد 70 جه سانتیگراد 1 چرخه 2 15 ثانیه 60 ثانیه 95 جه سانتیگراد 52 جه سانتیگراد 40 چرخه شکل 1- نمودار تکثیر نمونه کنترل مثبت و منفی با دستگاه.Real-time PCR تکثیر نمونه کنترل مثبت و کنترل منفی برای آزمایش Real-time PCR طبق دستورالعمل کیت مورد استفاده با موفقیت انجام و مقدار سیکل آستانهای نمونه کنترل مثبت 18/55 گزارش گردید که این تکثیر میتواند نشان دهنده موفقیت تکثیر نمونههای مورد آزمایش باشد. 68

4 شماره 110 نشريه دامپزشكی بهار 1395 و مایعات پرنده به روش Real-time PCR برابر بوده همچنین حداقل تعداد رونوشت قابل تشخیص با روش فوق رونوشت هر میکرولیتر گزارش شد. مجموع روش Real-time PCR از حساسیت کافی)قابلیت تشخیص بیماری تا رقت برابر از RNA موجود نمونه اولیه( و نیز سهولت سرعت و دقت مناسبی برای تشخیص ویروس برخوردار است واستفاده ازآن به عنوان یک روش تشخیصی با حساسیت باال توصیه میگردد. شکل 3 منحنی استاندارد تهیه شده با استفاده از واکنش PCR از تکثیر سری رقتهای تهیه شده میباشد. همانطور که شکل مشاهده میشود ضریب تبیین) R2 ( این نمودار برابر با %91 میباشد که نشان دهنده برازش مطلوب منحنی بر نقاط پراکنش مربوط و پوشش دادن مناسب همه نقاط میباشد. طبق مطالعات )2006( TevfikDorak منحنی استانداردی خوب است که شیب آن بین )3/3-( تا )3/6-( باشد و کارایی شکل 2 - نمودار تکثیر سری رقتهای تهیه شده از RNA استخراج شده از واکسن سویه B1. آخرین نمودار تکثیر رقت با مقدار سیکل آستانهای 44/38 نسبت به نمونه RNA استخراج شده از نمونه ویروس بکار رفته واکسن سویه B1 تشکیل شده است. طبق دستورالعمل کیت سیکل آستانهای کمتر از 36 قابل قبول سیکل آستانهای بین 33 تا 40 حد آستانه و باالتر از این سیکل غیرقابل قبول میباشد. شکل 3- منحنی استاندارد تهیه شده با استفاده از واکنش PCR از تکثیر سری رقتهای تهیه شده. ضریب تبیین ( 2 ) R این نمودار برابر با %91 میباشد که نشان دهنده برازش مطلوب منحنی بر نقاط پراکنش مربوط و پوشش دادن مناسب همه نقاط میباشد. 69

5 برای... Real-time PCR روش حساسیت بررسی باشد. %100 تا 90 بین آن همچنین و نمود. جلوگیری احتمالی اقتصادی ضررهای از و داده تشخیص به نیاز بدون بافتی عفونتهای تشخیص به قا Real-time PCR روش بروماید اتیدیوم از استفاده و PCR محصوالت آنالیز برای الکتروفورز مرحله است. بودن( سمی دلیل )به 1- Avian paramixo virus 2 - Threshold Cycle(ct) پاورقیها )2006, Guan et al( 1 معادله به آلودگی تشخیص آنها که دسترسی قابل و موجود مراجع از گرفته انجام Real-time PCR روش از استفاده با نیوکاسل بیماری ویروس مطالعات انجام امکان امکانات بودن دسترس و کار سهولت بدلیل و توسط مطالعه مورد روشهای به میتوان است بوده امکانپذیر مشابه نتایج که نمود اشاره )2005(, Pham et al و )2010( Nidzworski et al Real- آزمون چرخههای و دمایی شرایط تفاوت علت به تحقیق این نمونه تفاوت نداشت. همخوانی مذکور تحقیق دو نتایج با time PCR با مطالعه مورد روش حساسیت تفاوت دلیل میتواند آزمایش مورد Real-time RT-PCR روش حساسیت همچنین باشد. قبلی گزارشات باشد متفاوت مطالعه مورد سویه و آزمایش زمان اساس بر میتواند تحقیق نتایج راستای تحقیق این نتایج )2005(. Michelle et al یک عنوان به را Real-time PCR روش که بوده )2013( Sharawi et al حداقل با نیوکاسل بیماری ویروس سویه تشخیص باال حساسیت با روش Real-time PCR روش میکند. معرفی آزمایش انجام برای نیاز مورد زمان و میباشد طیور بیماریزای ویروس تشخیص باالیی حساسیت دارای باال سرعت و حساسیت با جایگزینی را تست این میتوان ترتیب بدین روش همچنین و دانست رایج ویروسشناسی و سرولوژی روشهای بر مرحله به نیاز بدون بافتی عفونتهای تشخیص به قا Real-time PCR )به بروماید اتیدیوم از استفاده و PCR محصوالت آنالیز برای الکتروفورز Enders تحقیقات راستای تحقیق این نتایج که است بودن( سمی دلیل مختلف روشهای مقایسه با که است )2004( Hairul et al ;)2005( et al یک عنوان به را Real-time PCR روش بیماری ویروس تشخیص برای که زمانی حتی تشخیص زیرا کردند معرفی باالتر حساسیت با روش میباشد. امکانپذیر باشد شده ایجاد بدن ویروس تیتر میزان کمترین کپینامبر تعداد خود مطالعات )2001( Wang et al )2011( Liu et al گزارش مطالعه این نتایج از کمتر را Real-time روشPCR به تشخیص قابل دانست. مطالعه مورد نمونه علت به میتوان را نتایج اختالف نمودند سرولوژی مرسوم روشهای از ایران نیوکاسل بیماری تشخیص برای وقتگیر و مشکل بسیار که میشود استفاده ویروس جداسازی روش و روشهای به نسبت کمتری حساسیت از روشها این همچنین میباشند. روش مطالعه این.)Aghakhan et al, )1994 هستند برخوردار مولکولی سریع تشخیص برای مولکولی روش یک به دستیابی برای Real-time PCR بسیار تکنیکی Real-time PCR روش گردید. سازی بهینه نیوکاسل بیماری تشخیص رسید. نتیجه به میتوان کاری روز یک حداکثر که است سریع وقتگیر بسیار ویروسشناسی کالسیک روشهای طریق از ویروسها این کمتری زمان را ویروس میتوان حاضر روش با و میباشد مشکل و استفاده مورد منابع 1- Alexander, D. J. (1991). Newcastle diseas and other paramixovirus infections. In B W Diseases of poultry Iowa State University Press, PP Aghakhan, S. M., Abshar, N., Fereidouni, S. R., Marunesi, C., & Khodashenas, M. (1994). Studies on avian viral infectious in Iran. Arch. Razi. Inst,Vol,44, No, 45. PP: AL-Garib, S. O., Gielkens, A. L. J., Gruys, E., and Koch, G. (2003). Review of Newcastle disease virus with particular references to immunity and vaccination worlds poultry science journal- Vol.59. pp: Enders, K. O., P K.Cheng, Antia, Y. Y., Hoang, T. L., & L. Wilina, W. (2005). Influenza A H5N1 Detection. The 5th Annual Seminar of National Science Fellowship PP: Guan, M. K., Cheng, H. L., Liang, Y. K., Wen, T. J., Chulu, J. L., Liao, M. H., et al. (2006). Development of a quantitative Light Cycler real-time RT- PCR for detection of avian reovirus. Journal of Virological Methods. Vol 133. PP: Hairul, A. H., Omar, A. R., Mohd Hair-Bejo, and Ideris, A. (2004). [BIO24] Detection of infectious bursal disease virus using SYBR Green 1 based realtime polymerase chain reaction The 4th Annual Seminar of National Science Fellowship, pp: Liu, H., Zhao, Y., Zheng, D., Lv, Y., Zhang, W., Xu, T., et al. (2011). Multiplex RT-PCR for rapid detection and differentiation of class I and class II Newcastle disease viruses.journal of Virological Methods, Vol, 171. PP: Michelle, A., Lin, T. L., & Wu, C. C. (2005). Real-time RT-PCR differentiation and quantitation of infectious bursal disease virus strains using dual labeled fluorescent probes. Journal of virological method.vol, 127. PP: Nidzworski, D., Rabalski, L., & Gramadzka, B. (2010). Detection and differentiation of virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus by real-timepcr.journal of Virological Methods, Vol, 173. PP: Pham, H. M., Konnai, S., Usui, T., Chang, K. S., Murata, S., 70

6 شماره 110 نشريه دامپزشكی بهار 1395 Mase, M., et al. (2005). Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus real-time PCR with melting-curve analysis. Journal of Arch Virological.Vol, 150, No, 12. PP: Sharawi, S., Al-Habeeb, M. A., and Mohamed, M. H. A. (2013). Detection and characterization of Newcastle disease virus in clinical samples using real time RT-PCR and melting curve analysis based on matrix and fusion genes amplification. Journal of Veterinaryworld.Vol, 10, PP: TevfikDorak, M. (2006). Real-time PCR.Taylor & Francis e- Library, New York, NY, USA. pp: Wang, Z., Vreede, F. T., Mitchell, J. O., & Viljoen, G. J. (2001). Rapid detection and differentiation of Newcastle disease virus isolates by a triple one-step RT-PCR. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, Vol 68, No, 2. PP: