با.)eu/food/food/foodlaw/traceability/index_en. htm بر. تهران- )MBST(رMolecular Biological System Transfer موسسه )2 ایران

Transcript

1 Original Article شماره 71 دوره 1395 دامپزشکی تحقیقات مجله Journal of Veterinary Research. 71,1:83-89, 2016 تحقیقی مقاله در DNA ژنومی بقایای آنالیز برای DNA استخراج متفاوت روش 3 کارگیری به سویا شده تصفیه و خام روغن *2 4 شایان پرویز 3 اشرافی ایرج 1 نوری نگین 1 بستی زاده آخوند افشین 2 اکرت بریجیت 1 کامکار ابولفضل 1 نعمتی غزال ایران تهران- تهران دانشگاه دامپزشکی دانشکده غذایی مواد کنترل و بهداشت گروه 1( ایران تهران- )MBST(رMolecular Biological System Transfer موسسه )2 ایران تهران- تهران دانشگاه دامپزشکی دانشکده میکروبیولوژی گروه 3( ایران تهران- تهران دانشگاه دامپزشکی دانشکده شناسی انگل گروه 4( چکیده )1394 ماه بهمن 7 نهایی: پذیرش 1394 ماه آذر 22 مقاله: )دریافت شده ژنتیکی اصالح سویا دانههای از استفاده روزها این است. جهان در گیاهی روغنهای ترین پرمصرف از یکی سویا زمینهمطالعه:روغن باال میزان با غذا و روغن در شده ژنتیکی اصالح گیاهان تشخیص برای مناسب روش میباشد. افزایش حال در مداوم طور به سویا روغن تولید برای استفاده مورد روش شدیدا به شده استخراج موفقDNA تکثیر و کارایی باشد. غذا در موجود ژنتیکی بقایای آنالیز پایه بر که است روشی فرآوری به روغن در موجود ژنتیکی بقایای بررسی برای DNA استخراج مختلف روش بردن 3 کار به هدف: است. وابسته روغن از DNA استخراج برای )ستون( بهغشاهایسیلیکایی اختصاصیDNA اتصال اساس بر استخراج روشهای کار: روش باخلوصباالمیباشد. دستیابیبهDNA منظور و 5.8S rrna و 18S rrna ژن از شده پرایمرطراحی جفت از استفاده با و PCR روش با شده استخراج DNA آنالیز اند. شده طراحی رزین و روغن نمونههای تکثیراز قابل DNA روش 1 از استفاده با مطالعه این در نتایج: شد. انجام سویا گیاه لکتین ژن از شده مشتق اختصاصی پرایمر نشد مشاهده تکثیر نیز روش این در شد داده رسوب ایزوپروپانول از استفاده با سپس و مخلوط PBS با ابتدا روغن روش 2 در نشد. استخراج سویا روش آلودگی مؤثرتر حذف برای نبود. خالص کافی میزان به تکثیر جهت شده استخراج DNA روش 1 و 2 در یافت. کاهش OD260 میزان اما تکثیرشدند.نتیجهگیرینهایی: ازتمامینمونههاباموفقیت استخراجشده کهDNA گردید استفاده بود کلرفرم همراه به روش 2 از ترکیبی که 3 مهمترین واقع در اما میباشد روغن در موجود DNA میزان کمی غذایی ماده در DNA استخراج مشکالت از یکی چه اگر است این بر ما اعتقاد خالص سازیDNA جدا برای مناسبی روش عنوان به میتواند روش 3 دارد. آن خلوص روغن از شده استخراج تکثیرDNA موفقیت در را نقش گیرد. قرار استفاده مورد سویا روغن از شده تصفیه سویا روغن PCRر DNA استخراج خام سویا روغن واژههایکلیدی: مقدمه آرایشی و دارویی غذایی صنایع در را مهمی نقش گیاهی روغنهای پتانسیل گیاهی روغنهای قیمت و غذایی ارزش در تفاوت دارند. برعهده سالمت مدیریت حیطه در بنابراین است. برده باال را ماده این در تقلب برخوردار خاصی ارزش از روغنها این پیگیری قابلیت و اعتبار تعیین جامعه به غذایی ماده پیگیری قابلیت اروپا کمیسیون تعاریف براساس میباشد. تمامی در آن دهنده تشکیل مواد و دام خوراک غذایی ماده ردیابی توانایی میشود گفته ماده آن توزیع و فرآوری تولید مراحل این با.)eu/food/food/foodlaw/traceability/index_en. htm بر باالیی اهمیت از معیار استانداردهای و معتبر روشهای تعیین رویکرد )6(. است خوردار است جهان در روغنهایگیاهی مصرفترین پر از یکی سویا روغن است داده اختصاص خود به را گیاهی روغنهای جهانی مصرف از 30 که برای شده ژنتیکی اصالح سویا دانههای از استفاده روزها این )5 11(. برای مناسب روش است. افزایش حال در مداوم طور به سویا روغن تولید باالی میزان با یی غذا و روغن در شده ژنتیکی اصالح گیاهان تشخیص غذا ماده درآن موجود ژنتیکی بقایای آنالیز پایه بر که است روشی فرآوری مورد روش به شدیدا شده استخراج DNA موفق تکثیر و کارایی باشد. مختلفی روشهای است. وابسته روغن از DNA استخراج برای استفاده روشها این جمله از )4(. دارد وجود روغن ازنمونههای استخراجDNA برای نمونه 100-1ml از روش این در قبلی مطالعات اساس بر میباشد. CTAB ) (. است گردیده استفاده DNA استخراج جهت روغن اولیه بردهاند بهره روش این بهبود برای هگزان و کلرفرم از مطالعات از برخی در DNA بودن خالص نا روش این معایب از پیشین گزارشهای در )۳ ۷(. ناخالصی این کاهش جهت در )11(. است شده ذکر شده استخراج در موجود سیلیکایی غشای با DNA اختصاصی اتصال پایه بر روشهایی DNA استخراج برای پیشین مطالعات در یافت. گسترش رزین یا ستون کیت )3 9( Nucleospin غذایی و گیاهی کیتهای روغن نمونههای از استفاده مورد )14( DNeasy گیاهی کیت )1 5 14( QIAamp مدفوع استخراج جهت روغن اولیه نمونه 200-1ml مقدار از است. گرفته قرار است. گردیده استفاده کیتها این توسط DNA DNA استخراج در اصلی مشکالت از یکی که میرسد نظر به اینگونه pshayan@ut.ac.ir نمابر: تلفن: مسئول: نویسنده )*

2 شماره 71 دوره دامپزشکی تحقیقات مجله 84 میباشد. شده استخراج DNA پایین خلوص و DNA کم میزان روغن از و بو بردن بین از جهت شوند عرضه بازار به اینکه از قبل روغنها معموال رنگهاینامناسب توسطپروسههایشیمیاییومکانیکیتصفیهمیشوند. بری رنگ شستشو سازی خنثی گیری صمغ شامل شیمیایی پروسههای خرد سبب آن تصفیه و روغن استخراج مراحل تمامی میباشد. بوگیری و روغن و غذایی نمونههای دیگر سوی از )8(. میگردد ژنومی شدنDNA مواد این که میباشند ساکاریدها پلی و پروتیئن قبیل از ترکیباتی شامل بطور )13(. گردند )PCR( پلیمراز زنجیرهای واکنش مهار سبب میتوانند برخی با میتواند روغن مختلف نمونههای از شده استخراج DNA کلی افزایش هدف با مطالعه این در باشد. همراه PCR کنندههای ممانعت از DNA استخراج بهبود روشهای بررسی به شده استخراج DNA خلوص است. شده پرداخته خام و شده تصفیه سویا روغن از کار روش و مواد کارخانه از سویا شده تصفیه و خام روغن 2 مطالعه این در نمونه: GC آزمایش توسط نمونهها تمامی شد. تهیه تهران( - )ایران مارگارین صحت برای مثبت کنترل نمونه عنوان به سویا گیاه دانه بودند. شده تأیید شد. گرفته کار به پرایمرها عملکرد سویا دانه از DNA استخراج برای سویا: گیاه دانه از DNA استخراج قرار استفاده مورد تهران( - )ایران MBST گیاه از DNA استخراج کیت به خوبی به و جداسازی دانه از رویشی جوانه قسمت منظور این به گرفت. گردید. مخلوط و کوبیده 1.5ml تیوبهای بافردر الیزیس 300μl همراه ساعت 2 مدت به 56 o C در و افزوده نمونهها به K پروتیناز 20μl 8000 xg با دقیقه 5 مدت به مخلوط سپس شد. گرمخانهگذاری جدید تیوب به رویی مایع و گردید سانتریفوژ آلمان( دور )اپندرف 5810 در و افزوده مخلوط به بافر بایندینگ 540μl بعد مرحله در شد. داده انتقال سانتریفوژ 8000xg با دقیقه 5 مدت به مخلوط شد. گذاری گرمخانه 70 o C به سانتریفوژ از پس شد. داده انتقال کیت A ستون به رویی مایع و گردید مانده باقی مخلوط به شد. انداخته دور ستون 8000xg با دقیقه 1 مدت به مخلوط گردید. افزوده آلمان( Merck( خالص اتانول 410μl تیوب در 2 ستون 8000xg سانتریفوژ دقیقه 1 از پس ادامه در و منتقل B ستون توسط شده استخرج ژنومی DNA پایان در شد. شسته شستشو بافر با بار گردید. جداسازی B ستون از 70o C در گذاری گرمخانه و استریل آب 40μl روغن از DNA استخراج برای 1: روش روغن از DNA استخراج اساس گرفت. قرار استفاده مورد )ایران( DNA MBST استخراج کیت این ستونهای در که است سیلیکایی غشای کیت این در DNA استخراج به روغنها از کدام هر از 1ml است. شده داده قرار کیت گشت. مخلوط خوبی به بافر الیزیس 300μl با و افزوده 1.5ml تیوب به ورتکس دقیقه یک از بعد و گذاری گرمخانه 70o درC ساعت یک مخلوط سپس گردید. سانتریفوژ آلمان( دور )اپندرف 5810 دقیقه 8000xg مدت 5 شد. داده انتقال جدید استریل تیوب به میانی فاز همراه به زیرین محلول گرمخانه دقیقه 20 مدت به 56o درC و افزوده نمونهها به K پروتیناز 20μl به افزوده مخلوط به بافر بایندینگ 540μl بعدی مرحله در شد. گذاری به سپس شد. گذاری گرمخانه 70o C در دقیقه 10 مدت به و زده هم خوبی به مخلوط گردید. افزوده آلمان( Merck( خالص اتانول 410μl مخلوط با بار 2 ستون 8000 xg سانتریفوژ دقیقه 1 از پس منتقل MBST ستون 40μl توسط شده استخرج ژنومی DNA پایان در شد. شسته شستشو بافر گردید. جداسازی ستون از 70o C در گذاری گرمخانه و استریل آب روش این به روغن استخراج برای 2: روش روغن از DNA استخراج روغن نمونه از 5ml گرفت. قرار استفاده مورد نمونهها از کدام هر از 5 g0.24 Na2HPO4 g1.44 PBSر) 8gرNaCl ر 0.2gرKClر 5ml با تویین و 1ml آلمان( Merck مقطر آب 1l در ph 8.0 KH2PO4 مدت به 70 o C در و مخلوط 15ml تیوبهای در آلمان( Merck( 80 بطور گذاری گرمخانه حین در نمونهها گردید. گذاری گرمخانه ساعت 3 مخلوط آن از پس میشدند. مخلوط کامال دقیقه یک مدت به بار 4 منظم 5810 )اپندرف 4000 xg دقیقه 20 مدت به ورتکس دقیقه یک مدت به الیه که گشت ایجاد فاز 3 سانترفوژ از پس گردید. سانتریفوژ آلمان( دور دو به DNA رسوب برای شد. ریخته دور و جداسازی روغن( )فاز آن رویی استات سدیم محلول حجم 0.1 زیرین( و میانی )الیههای مانده باقی الیه و آلمان( Merck( پروپانول ایزو محلول حجم هم )ph 5.5= )3M سرد 20- o C در دقیقه 20 مدت به و افزوده ایران( MBST( رزین 60μl دور رویی محلول 4000 xg سانتریفوژ دقیقه 20 از پس شد. گذاری خانه MBST( بافر باندینگ 540μl بافرو الیزیس 300μl در رسوب و ریخته به مخلوط یافت. انتقال استریل 1.5ml تیوپ به و شد حل مجدد ایران( به سپس شد. گذاری گرمخانه 70 o C در دقیقه 10 مدت وبه زده هم خوبی MBST رزین 30μl و آلمان( Merck( خالص اتانول 410μl مخلوط مخلوط سپس شد. داده قرار اتاق دمای در ساعت 1 مدت به و گردید افزوده ته رزین رویی محلول تخلیه پس و گردید سانتریفوژ 8000 xg دقیقه 5 استخرج ژنومی DNA پایان در شد. شسته شستشو بافر با بار 2 شده نشین جداسازی رزین از 70 o درC گذاری گرمخانه و استریل آب 40μl توسط شده گردید. روش این به روغن استخراج برای روش 3 : روغن از DNA استخراج روغن نمونه از 5ml گرفت. قرار استفاده مورد نمونهها از کدام هر از 5ml 0.24g Na2HPO4 1.44g PBSر) 8gرNaCl ر 0.2gرKClر 5ml با تویین آلمان( 1ml Merck مقطر آب 1l در ph 8.0 KH2PO4 3 مدت به 70 o C در و مخلوط 15ml تیوبهای در آلمان( Merck( 80 منظم بطور گذاری گرمخانه حین در نمونهها گردید. گذاری گرمخانه ساعت مدت به مخلوط آن از پس میشدند. مخلوط کامال دقیقه یک مدت به بار 4

3 85 سویا روغن از DNA استخراج آلمان( دور )اپندرف xg دقیقه 20 مدت به ورتکس دقیقه یک )فاز آن الیهرویی که گشت ایجاد فاز 3 سانترفوژ از پس گردید. سانتریفوژ و میانی )الیههای مانده باقی الیه دو شد. ریخته دور و جداسازی روغن( سانتریفوژ 4000 xg دقیقه 5 مدت به و شسته کلرفرم 5ml با بار دو زیرین( به و سازی جدا بود PBS محلول حاوی که شده ایجاد رویی الیه گردید. مانده باقی الیه دو به DNA رسوب برای شد. داده انتقال جدید تیوب 5.5= 3 )M استات سدیم محلول حجم 0.1 زیرین( و میانی )الیههای رزین 60μl و آلمان( Merck( پروپانول ایزو محلول حجم هم )ph گذاری خانه سرد 20- o C در دقیقه 20 مدت به و افزوده ایران( MBST( دور رویی محلول گردید سانتریفوژ 4000 xg دقیقه 20 مدت به سپس شد. MBST( بافر باندینگ 540μl و بافر الیزیس 300μl در رسوب و ریخته به مخلوط یافت. انتقال استریل 1.5ml تیوپ به و شده حل مجدد ایران( سپس شد. گذاری گرمخانه 70o C در دقیقه 10 مدت به و زده هم خوبی MBST رزین 30μl و آلمان( Merck( خالص اتانول 410μl مخلوط به سانتریفوژ از پس شد. داده قرار اتاق دما در ساعت 1 مدت به و گردید افزوده بار 2 شده نشین ته رزین و تخلیه رویی محلول 8000xg دقیقه 5 مخلوط توسط شده استخرج ژنومی DNA پایان در شدند. شسته شستشو بافر با گردید. جداسازی رزین از 70o C در گذاری گرمخانه و استریل آب 40μl DNA نمونههای از 5 PCRر 2.1μlیا تکثیر برای :PCR واکنش گرفت انجام 100μl حجم در واکنش این شد. برده کار به شده استخراج )سیناژن مراز پلی Taq آنزیم واحد 2.5 1x PCR بافر شامل که MWG 20 Mm(رantisense و sense پرایمرهای از 2μl ایران( )Fermenta(رdGTP و datp dttp dctp μm200 آلمان( با آلمان( MWG( ترموسایکلر اتوماتیک بود. رو 1.5mMرMgCl2 ثانیه 45 اتصال( ی )مرحله o ثانیهC 45 سیکل برنامه پایان در و واسرشت( )مرحله 94 o C ثانیه 45 تکثیر( )مرحله 72 o C مورد پرایمرهای شد. برده کار به نهایی( تکثیر )مرحله 72 o C دقیقه accession( 5.8S rrna 18Sو rrna ژن توالی از استفاده sense پرایمر توالی شد. طراحی 320( - نوکلوتید 27 number: FJ antisense پرایمر توالی و ر` 5`TGCGGAAGGATCATTGTCG3 بر عالوه بود. 5`ATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGC 3 ر` forward pr( لکتین ژن به متعلق سویا گیاه اختصاصی پرایمرهای این reverse و 5`GCCCTCTACTCCACCCCCATCC3`ر:imer مورد نیز )3`GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG.5`ر:primer TBE وبافر آگارز %1.8 ژل توسط PCR محصول )11(. گرفت قرار استفاده 2mlر 0.5M EDTA بوریک اسید 2.75gر Tris baseر5.4g(ر0.5x و برامید اتیدیوم ژل آمیزی رنگ برای شد. آنالیز مقطر( آب 1l در ph 8.0 گرفت. قرار استفاده مورد ایران( )سیناژن cyber safe نتایج و خام روغنهای از DNA استخراج برای روش 3 مطالعه این در سویا دانه از شده استخراج گرفت. DNA قرار استفاده مورد سویا شده تصفیه موفقیت با 5.8S rrna و 18S ژنrRNA توالی از شده طراحی پرایمر با براساس MBST کیت از استفاده با DNA استخراج اول روش شد. تکثیر این در بود. ستونها درون سیلیکایی غشاهای با DNA اختصاصی اتصال نشد. استخراج شده برده کار به روغنهای از تکثیر قابل DNA روش DNA استخراج در مشکالت مهمترین از یکی میرسد نظر به اینگونه به نتایج میباشد. DNA خلوص میزان شده ذکر روغنهای از تکثیر قابل نشان اسپکترفوتومتر توسط DNA خلوص میزان سنجش از آمده دست جالب بود. 14.5±1.5μl/ng نشده تکثیر نمونههای در DNA میزان که داد تشخیصی قابل DNA هیچگونه آگارز ژل روی بر DNA آنالیز اینکه روغنهای از شده استخراج DNA که معناست این به این نداد. نشان را به که هستند مخلوط DNA از غیر ترکیبی با سویا شده تصفیه و خام 260nm موج درطول و میکند عمل مراز پلی DNA کننده ممانعت عنوان پلی DNA کننده ممانعت فاکتور کاهش برای میباشد. نوری جذب دارای PBS 5ml با روغن 5ml ابتدا روش این در شد. برده کار به 2 روش مراز روش این در شد. انجام DNA رسوب ایزوپروپانول توسط ادامه در مخلوط و 18S rrna ژن توالی از شده طراحی پرایمر با شده استخراج DNA نیز گیری اندازه DNA میزان نداد. تشکیل مشاهدهای قابل باند 5.8S rrna ممانعت حذف برای بود. 5.2±0.8 μl/ng نشده تکثیر نمونههای در شده از پس و مخلوط PBS با ابتدا در روغنها سویا روغنهای از PCR کننده مانده باقی الیه دو بود روغن حاوی که رویی الیه سازی جدا و سانتریفوژ DNA رسوب مرحله ادامه در 3( )روش شد شسته کلرفرم با بار دو زیرین نمونههای پذیرفت. انجام ایران( MBST( رزین حضور در پروپانول ایزو با از استفاده با شده تصفیه و خام سویا روغنهای از شده استخراج DNA موفقیت با 5.8S rrna و 18S rrna ژن توالی از شده طراحی پرایمر طول در باند تشکیل به منتج آمده دست به PCR محصول شدند تکثیر استخراج DNA این بر عالوه گشت. آگارز ژل روی بر 1( )تصویر 293bp تکثیر موفقیت با لکتین ژن از شده طراحی اختصاصی پرایمر توسط شده نتایج داد. تشکیل 2( )تصویر طول 118bp با باندی PCR محصول شد. 3 روش توسط شده استخراج نمونههای در OD260 خوانش از حاصل حداقل با نتایج تمامی داد. نشان تشخیص قابل غیر را موجود DNA مقدار مهمترین که داد نشان ما نتایج شد. تکرار سویا مختلف روغنهای با بار سه DNA خلوص سویا روغن نمونههای از DNA استخراج برای مشکل میباشد. شده استخراج بحث عملی روشهای یافتن غذایی ماده ارزیابی مهم جنبههای از یکی

4 شماره 71 دوره دامپزشکی تحقیقات مجله 86 DNA تکثیر از حاصل PCR محصول به متعلق آگارز ژل الکتروفورز 1. تصویر استفاده با و 3 روش کاربردن به با سویا شده تصفیه و خام روغن از شده استخراج 1: شماره )چاهک 5.8S rrna و 18S rrna ژن از شده پرایمرطراحی جفت از چاهک خام سویا روغن از شده استخراج DNA 2 µl 2: شماره چاهک منفی کنترل شده(. تصفیه سویا روغن از شده استخراج DNA 2 µl 3: شماره DNA تکثیر از حاصل PCR محصول به متعلق آگارز ژل الکتروفورز 2. تصویر جفت از استفاده با و 3 روش کاربردن به با سویا خام روغن از شده استخراج DNA 2 µl 1: شماره )چاهک سویا گیاه لکتین ژن از شده مشتق اختصاصی پرایمر 2 µl 3: شماره چاهک منفی کنترل 2: خام چاهک سویا روغن از شده استخراج سویا(. دانه از شده استخراج DNA آن تولید مراحل تمامی در غذایی ماده اولیه منشأ یابی رد جهت مناسب گیاهی روغنهای مصرفترین پر از یکی سویا روغن )6(. میباشد ماده شده ژنتیکی اصالح سویا دانههای از استفاده روزها این است. جهان در روش )5 11(. میباشد افزایش حال در مداوم طور به سویا روغن تولید برای با غذایی و روغن در شده ژنتیکی اصالح گیاهان تشخیص برای مناسب در موجود ژنتیکی بقایای آنالیز پایه بر که است روشی فرآوری باال میزان مورد روش به شدیدا شده استخراج DNA موفق تکثیر و کارایی باشد. غذا )4(. است وابسته روغن از DNA استخراج برای استفاده مناسب ش رو به دستیابی جهت بسیاری تحقیقات اخیر سالهای در و Nicolic ) (. است گرفته انجام روغن از DNA استخراج روغن از شده استخراج DNA که کردند گزارش 2014 درسال همکاران واکنش انجام برای کافی مقدار به CTAB روش از استفاده با خام سویا برای محققین توسط شده توصیه روش بیشترین )11(. نبود خالص PCR اختصاصی اتصال برپایه که است روشهایی روغن از DNA استخراج از آمده دست به نتایج با که باشد شده طراحی سیلیکایی غشای به DNA روش با مقایسه در روش این برتری )6 11(. دارد همخوانی نیز مطالعه این میباشد. استخراج پروسه در DNA دادن دست از کمتر میزان CTAB استخراج DNA خلوص دادند نشان سال 2010 در همکاران و Gimenez مراحل در کلروفرم و هگزان کاربردن به با CTAB روش توسط شده )7(. مییابد افزایش استخراج MBST کیت از استفاده با شده برده کار به اول روش مطالعه این در که بود )ستون( سیلیکایی غشای با DNA اختصاصی اتصال مبنای بر و ادامه در نیامد. دست به PCR روش از استفاده با تکثیر قابل DNA آن در μl/ نشده تکثیر DNAهای غلظت که داد نشان اسپکترفتومتری نتایج هیچگونه آگارز ژل روی بر DNA آنالیز حالیکه در بود 14.5±1.5ng میزان که است این بر ما اعتقاد نداد. نشان را تشخیصی قابل DNA احتماال و نمیباشد مرتبط شده استخراج DNA با OD260 در جذب باالی DNA خلوص افزایش برای است. وابسته نمونهها در آلودگی حضور به کاهش رغم علی روش این با شد. برده کار به 2 روش شده استخراج میرسد نظر به اینگونه نشد. انجام موفقیت با PCR واکنش اما OD260 بهتر حذف برای است. یافته کاهش حدی تا روش این توسط آلودگی که حالل عنوان به کلروفرم آن در که شد طراحی 3 روش کننده ممانعت اینکه جالب گرفت. قرار استفاده مورد ازDNA ( غیر )به آلی ملکولهای سویا ی شده تصفیه و خام روغن نمونههای از شده استخراج DNA تمامی 5.8S و 18S rrna ژن از شده پرایمرطراحی و PCR ازروش استفاده با میزان و شدند تکثیر لکتین ژن از شده مشتق اختصاصی پرایمر و rrna تشخیص قابل غیر نمونهها همه در 260nm موج طول تحت نوری جذب استخراج مشکالت از یکی چه اگر که است آن دهنده نشان نتایج این بود. در اما میباشد روغن در موجود DNA میزان کمی غذایی ماده در DNA روغن از شده استخراج DNA تکثیر موفقیت در را نقش مهمترین واقع را 2012 سال همکاران و Costa تحقیقات ما نتایج دارد. آن خلوص اعتقاد اما )6(. میکند تأیید گیاهی روغنهای در DNA کم میزان بر مبنی DNA تکثیر عدم علت روغن در DNA کم میزان که است این بر ما و Nicolic نتایج با همچنین ما نتایج باشد. نمی روغنها از شده استخراج اهمیت بر مبنی 2010 درسال همکاران و Costa و 2014 درسال همکاران PCR روش با تکثیرDNA برای روغن از شده استخراج DNA خلوص )5 11(. دارد مطابقت شده طراحی پرایمر با میتواند شده استخراج دادDNA نشان ما نتایج روغن تصفیه پروسه در دهد. تشکیل را طول 293bp با باندی و گردد تکثیر اسید با کردن اسیدی 240( o )C گیری فازبو مکانیکی و شیمیایی مراحل

5 87 سویا روغن از DNA استخراج References 1. Ayed, R.B., Grati-Kamoun, N., Moreau, F., Rebaï, A. (2009) Comparative study of microsatellite profiles of DNA from oil and leaves of two Tunisian olive cultivars. Eur Food Res Technol. 229: Busconi, M., Foroni, C., Corradi, M., Bongiorni, C., Cattapan, F., Fogher, C. (2003) DNA extraction from olive oil and its use in the identification of the production cultivar. Food Chem. 83: Consolandi, C., Palmieri, L., Severgnini, M., Maestri, E., Marmiroli, N., Agrimonti, C., Baldoni, L., Donini, P., De Bellis, G., Castiglioni, B. (2008) A procedure for olive oil traceability and authenticity: DNA extraction, multiplex PCR and LDR-universal array analysis. Eur Food Res Technol. 227: Costa, J., Mafra, I., Amaral, J.S., Oliveira, M. (2010a) Monitoring genetically modified soybean along the industrial soybean oil extraction and refining processes by polymerase chain reaction techniques. Food Res Int. 43: Costa, J., Mafra, I., Amaral, J.S., Oliveira, M.B.P. (2010b) Detection of genetically modified soybean DNA in refined vegetable oils. Eur Food Res Technol. 230: Costa, J., Mafra, I., Oliveira, M. (2012) Advances in vegetable oil authentication by DNA-based markers. Trends Food Sci Tech. 26: Giménez, M.J., Pistón, F., Martín, A., Atienza, S.G. (2010) Application of real-time PCR on the development of molecular markers and to evaluate critical aspects for olive oil authentication. Food Chem. 118: Gryson, N., Messens, K., Dewettinck, K. (2004) Influence of different oil-refining parameters and sampling size on the detection of genetically modified DNA in soybean oil. J Am Oil Chem Soc. 81: Martins-Lopes, P., Gomes, S., Santos, E., Guedes-Pinto, H. (2008) DNA markers for Portuguese olive oil fingerprinting. J Agric Food Chem. 56: Muzzalupo, I., Perri, E. (2002) Recovery and )4(. میگردد DNA شدگی خرد به منجر سود با سازی خنثی و فسفزیک استخراج DNA تکثیر در که میکنند توصیه محققین از برخی این بنابر ار 150bp از کوچکتر توالی که پرایمرهایی از گیاهی روغنهای از شده 2010 سال در همکاران و Costa )5 11(. گردد استفاده مینماید تکثیر 103bp طول پرایمربا با سویا روغن از شده استخراج DNA کردند گزارش طول با پرایمرهایی با شده استخراج DNA تکثیر و شد تکثیر موفقیت با )5(. بود ناموفق و bp شده آوری فر غذایی مواد در میکنند توصیه نیز همکاران و Nikolic وجود با )11(. گردد استفاده 150bp طول حداکثر با DNA از ناحیهای PCR محصول تولید و DNA موفق تکثیر به قادر مطالعه این در ما اینکه 2014 سال در همکاران و Nicolic توصیه با اما بودیم 293bp طول با مورد کوچکتر قطعات تکثیر بر مبنی 2010 سال در همکاران و Costa و مورد ژن چراکه موافقیم شده آوری فر غذاهای درردیابی DNA در تکثیر بود 5.8S( rrna و 18S rrna( ژن کپی مولتی مطالعه این در استفاده استفاده کمتر کپی تعداد با ژنهایی از مطالعات سایر در احتماال حالیکه در )5 11(. است شده اصلی مشکل مطالعه این در آمده دست به نتایج اساس بر کلی بطور میباشد. PCR کننده ممانعت ترکیبات وجود روغن از DNA استخراج در از DNA استخراج برای روش بهترین میدهد نشان نتایج که همانگونه از را PCR کننده ممانعت بهتر حذف توانمندی که است روشی روغن باشد. داشته شده استخراج DNA قدرانی و تشکر دکتر آقای اسدی فرزاد دکتر آقای جناب از مقاله این نویسندگان این رساندن انجام به در را ما که خسروی علی دکتر آقای و برین عباس دارد. را قدردانی تشکرو کمال نمودند یاری پژوهش characterisation of DNA from virgin olive oil. Eur Food Res Technol. 214: Nikolić, Z., Vasiljević, I., Zdjelar, G., Đorđević, V., Ignjatov, M., Jovičić, D., Milošević, D. (2014) Detection of genetically modified soybean in crude soybean oil. Food Chem. 145: Pauli, U., Liniger, M., Zimmermann, A. (1998) Detection of DNA in soybean oil. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und-forschung A. 207: Pinto, A.D., Forte, V., Guastadisegni, M.C., Martino, C., Schena, F.P., Tantillo, G. (2007) A comparison of DNA extraction methods for food

6 88 مجله تحقیقات دامپزشکی دوره 71 شماره analysis. Food Control. 18: Testolin, R., Lain, O. (2005) DNA extraction from olive oil and PCR amplification of microsatellite markers. J Food Sci. 70: C108-C112.

7 89 Journal of Veterinary Research. 71,1:83-89,2016 Original Article Analysis of residual genomic DNA in crude and refined soybean oil using three different DNA extraction methods Nemati, Gh. 1, Kamkar, A. 1, Eckert, B. 2, Akhondzadeh Basti, A. 1, Noori, N. 1, Ashrafi, I. 3, Shayan, P. 2,4* 1 Department of Food Hygiene, Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Tehran- Iran 2 Research Institute Molecular Biological System Transfer, Tehran- Iran 3 Department of Microbiology, Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Tehran- Iran 4 Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine University of Tehran, Tehran- Iran (Received 13 December 2015, Accepted 27 January 2016) Abstract: BACKGROUND: Soybean oil is one of the highly consumed vegetable oil worldwide. Nowadays, usage of genetically modified (GM) soybean seeds for soybean oil production is constantly increasing. The recommended methods for GMO detection are based on analysis of residual DNA in vegetable oil and highly processed food. However, the successful amplification of isolated DNA depends on the efficiency of DNA extraction method. OB- JECTIVES: The purpose of this study was to apply three different DNA extraction methods for analysis of residual genomic DNA in crude and refined soybean oil to obtain high pure of DNA suitable for DNA amplification. METHODS: Extraction methods were developed based on the specific binding of DNA molecules to the silica membrane (column) or resin. The isolated DNA was then analyzed by PCR technique using primer pairs, derived from 18S rrna and 5.8S rrna gene and soybean lectin gene. RESULTS: The results showed that amplifiable DNA could not be extracted from crude/refined soybean oil in method 1. In method 2, by pre-treating of oil with PBS and subsequent precipitation with Isopropanol, the amplification was not observed but OD260 was decreased. In method 1 and 2 the DNA was not pure enough to be amplifiable. To remove more effectively contaminant, method 2 was combined with chloroform extraction as method 3. The extracted DNA from all examined oil samples could be amplified. CONCLUSIONS: We believe that the purity of DNA in samples is decisive for amplification and not necessarily the low amount of DNA in samples. Method 3 can be determined as a suitable method for the isolation of the pure DNA. Keyword: crude soybean oil, DNA extraction method, PCR, refined soybean oil Figure Legends and Table Captions Figure 1. Agarose gel electrophoresis of PCR products from the amplification of DNA extraction from refined and crude soybean oil extracted with method 3 using primer pair derived from 18S rrna and 5.8S rrna genes (lane1: negative control, lane 2: 2 μl of DNA extracted from crude soybean oil, lane 3: 2 μl of DNA extracted from refined soybean oil). Figure 2. Agarose gel electrophoresis of PCR products from the amplification of DNA extraction from refined and crude soybean oil extracted with method 3 using primer pair derived from soybean lectin gene (lane 1: 2 μl of DNA extracted from crude soybean oil, lane1: negative control, lane 3: 2 μl of DNA extracted from soybean). *Corresponding author s pshayan@ut.ac.ir, Tel: , Fax: J. Vet. Res. 71, 1, 2016