Received 6 Sep 2011 Revised 19 Dec 2011 Accepted 8 Jan 2012

Transcript

1 Journal of Gorgan University of Medical Sciences / 32 Autumn 2012 / vol 14 / no 3 Original Paper Effect of transforming growth factor alpha of dentyte jyrus neurons and pyramidal cells of CA1 subfiled of hippocampus following ischemia-reperfusion in Rats Alipanahzade H (MSc) 1, Soleimani M (PhD) 2, Soleimani Asl S (PhD) 3 Mehdizadeh M (PhD)* 4, Katebi M (PhD) 5 1 MSc in Anatomy, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 2 Assistant Professor, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 3 Assistant Professor, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Hamadan University of Medical Sciences, Hamadan, Iran. 4 Professor, Cellular and Molecular Research Center, Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 5 Assistant Professor, Department of Anatomy, School of Medicine, Hormozgan University of Medical Sciences, Bandar Abbas, Iran. Abstract Background and Objective: Ischemia-reperfusion invoke cell death in hippocampus. This study was carried out to investigate the effect of transforming growth factor alpha (TGF-alpha) of dentyte jyrus neurons and pyramidal cells of CA1 subfiled of hippocampus following ischemia-reperfusion in rat models. Materials and Methods: This experimental study was done on 40 male Wistar rats weighing gr. Animals were divided in four groups: control (n=7), sham (n=7), ischemia (n=14) and treatment (n=14). Sham group was just under surgical stress. In ischemia and treatment groups after induction of ischemiareperfiusion by obstruction of carotid arteries blocked for 30 minutes, reperfusion PBS (phosphate buffer salin) and subsequently TGF-alpha (50 ng) were injected stereotaxicaly in lateral ventricle, respectively. In 12 and 72 days after treatment the brains were fixated by transcardial perfusion and stained by immunohistochemestry and nissle methods. Furthermore, morris water maze was used to evaluate the learning memory. Data were analyzed using SPSS-16 and ANOVA test. Results: Injection of TGF-alpha increased the cell number in hippocampus of treatment group compared to ischemic group. TGF-alpha increased expression of neuron in dentyte jyrus of treatment group in comparison with ischemic group (P<0.05). Also spatial memory improved in treatment group in comparison with ischemia group. Conclusion: TGF-alpha improves ischemia-induced neurodegenration and memory impairment. Keywords: Ischemia-reperfusion, Spatial memory, Neurogeneis, Hippocampus, Transforming growth factor alpha * Corresponding Author: Mehdizadeh M (PhD), mehdizadehm@tums.ac.ir Received 6 Sep 2011 Revised 19 Dec 2011 Accepted 8 Jan 2012 This paper should be cited as: Alipanahzade H, Soleimani M, Soleimani Asl S, Mehdizadeh M, Katebi M. [Effect of transforming growth factor alpha of dentyte jyrus neurons and pyramidal cells of CA1 subfiled of hippocampus following ischemia-reperfusion in Rats]. J Gorgan Uni Med Sci. 2012; 14(3): [Article in Persian]

2 / ٢٦ مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره / ۱۴ شماره ۳ (پي در پي ۴۳) تحقيقي اثر TGF-α بر سلولهاي عصبي بنيادي شکنج دندانهاي و سلولهاي پيراميدال ناحيه CA1 هيپوکامپ در موش صحرايي به دنبال ايسکمي - ريپرفيوژن ۴ ۳ ۲ ۱ حسن عليپناهزاده دکتر منصوره سليماني دکتر سارا سليماني اصل دکتر مهدي مهديزاده* د ۵ كتر مجيد كاتبي ۱- کارشناس ارشد گروه علوم تشريحي دانشکده پزشکي دانشگاه علوم پزشکي تهران. ۲- استاديار گروه علوم تشريحي دانشکده پزشکي دانشگاه علوم پزشکي تهران. ۳- استاديار گروه علوم تشريحي دانشکده پزشکي دانشگاه علوم پزشکي همدان. ۴- استاد مرکز تحقيقات سلولي و مولکولي و گروه علوم تشريحي دانشکده پزشکي دانشگاه علوم پزشکي تهران. ۵- استاديار گروه علوم تشريحي مركز تحقيقات سلولهاي بنيادي دانشگاه علوم پزشكي هرمزگان. چكيده زمينه و هدف : در ايسکمي مغزي کاهش ميزان متابوليتهاي مغزي در اثر کاهش جريان خون به کاهش ذخيره اکسيژن و در نتيجه مرگ بافت مغزي يا سکته مغزي منجر ميشود. اين مطالعه به منظور تعيين اثر (transforming growth factor alpha) TGF-α بر سلولهاي عصبي بنيادي شکنج دندانهاي و سلولهاي پيراميدال ناحيه CA1 هيپوکامپ براساس مطالعات ايمونوهيستوشيمي و رفتاري در مدل تجربي ايسکمي ريپرفيوژن مغزي در موش صحرايي نر انجام شد. روش بررسي : اين مطالعه تجربي روي ٤٢ سر موش صحرايي نر نژاد ويستار با وزن ٣٠٠-٢٥٠ گرم در دانشکده پزشکي دانشگاه علوم پزشکي تهران انجام شد. موشها بهصورت تصادفي در گروهه يا کنترل (تعداد: ٧ ) شم (تعداد: ٧ ) ايسکمي (تعداد: ١٤ ) و درمان (تعداد: ١٤ ) قرار گرفتند. براي گروه کنترل مداخلهاي صورت نگرفت. گروه شم فقط تحت استرس جراحي قرار گرفت. گروه ايسکمي (14=n) به دو زيرگروه تقسيم شد. ٧ سر موش تحت القاء ايسکمي با انسداد شريانهاي کاروتيد مشترک بهمدت ٣٠ دقيقه قرار گرفتند و ٧ روز بعد به روش استريوتاکسي ٥ ميکروليتر (phoshate buffer salin) PBS به داخل بطن راست تزريق شد و در روز ١٢ ازنظر بيان Nestin بررسي شدند. ٧ سر موش باقيمانده پس از القاء ايسکمي و دريافت PBS دوماه بعد از نظر حافظه فضايي بررسي شدند. گروه درمان (14=n) به دو زيرگروه تقسيم شد. ٧ سر موش تحت القاء ايسکمي قرار گرفتند و ٧ روز بعد ٥٠ نانوگرم TGF-α حل شده در ٥ ميکروگرم PBS به روش استريوتاکسي به داخل بطن راست تزريق شد. سپس در روز دوازدهم از نظر بيان Nestin بررسي شدند. ٧ سر موش باقيمانده پس از القاء ايسکمي و دريافت TGF-α دوماه بعد از نظر حافظه فضايي بررسي شدند. سپس از هر گروه نيمي از موشها (٥ سر) در روز ١٢ و نيمي ديگر (٥ سر) در روز ٧٢ بعد از فيکساسيون با روش پرفيوژن داخل قلبي از نظر بافتي با روش ايمونوهيستوشيمي و رنگا ميزي نيسل بررسي شدند. براي بررسي حافظه فضايي از روش morris water maze استفاده شد. دادهها با استفاده از نرمافزار ا ماري SPSS-16 و ا زمون ANOVA تجزيه و تحليل شدند. يافتهها : تجويز TGF-α بهدنبال ايسکمي - ريپرفيوژن موجب افزايش بيان سلولهاي عصبي در شکنج دندانهاي شد و اختلاف معنيداري در تعداد نورونهاي پيراميدال ناحيه CA1 هيپوکامپ موشها در گروهه يا ايسکمي و درمان مشاهده گرديد (٠/٠٥>P). همچنين در ا زمون ماز ا بي اختلاف معنيداري در شاخص حافظه فضايي در دو گروه ايسکمي و درمان مشاهده شد (٠/٠٥>P). نتيجهگيري : اين مطالعه نشان داد که استفاده از TGF-α باعث کاهش ا سيبهاي ناشي از ايسکمي ريپرفيوژن به صورت افزايش تعداد نورونهاي پيراميدال بيان Nestin و بهبود حافظه ميگردد. کليد واژهها : ايسکمي ريپرفيوژن حافظه فضايي نوروژنزيس هيپوکامپ TGF-α * نويسنده مسو ول : دکتر مهدي مهديزاده پست الکترونيکي mehdizadehm@tums.ac.ir نشاني : تهران دانشگاه علوم پزشکي تهران دانشکده پزشکي گروه علوم تشريحي تلفن ۰۲۱-۸۸۶۲۲۶۸۹ نمابر ۸۸۶۲۲۶۸۹ وصول مقاله : ۹۰/۶/۱۵ اصلاح نهايي : ۹۰/۹/۲۸ پذيرش مقاله : ۹۰/۱۰/۱۸ مقدمه سکته مغزي یکی ازمهمترین دلایل مرگ و میر و معلولیت در جهان است و افزایش سن مهمترین عامل خطر آن میباشد (1). ایسکمی مغزي عبارت است از کاهش میزان متابولیتهاي مغزي در اثر کاهش جریان خون که به کاهش ذخیره اکسیژن و در نتیجه مرگ بافت مغزي یا سکته مغزي منجر میشود (2). در طی ایسکمی میزان اکسیژن و ATP مغز کاهش یافته و بهدنبال آن میزان برداشت رادیکالهاي آزاد کاهش مییابد و در نتیجه رادیکالهاي آزاد و صفحات ۲۶ تا ۳۲

3 و 6 ش/ حسن عليپناهزاده و همکاران / ٢٧ لاکتات ناشی از تنفس بیهوازي افزایش مییابد که موجب اسیدوز و مرگ سلولی میشود. در نتیجه فرایند ایسکمی - ریپرفیوژن رادیکالهاي آزاد اکسیژن واکنشدهنده از قبیل پراکسید هیدروژن و رادیکال هیدروکسیل (OH ) تولید میشوند که به بافت هدف حمله کرده و بهشدت آسیب میرساند و آسیب ناشی از آن بهمراتب بیشتر از ایسکمی تنها است (3). هیپوکامپ نقش مهمی را در تشکیل حافظه جدید و تجزیه و تحلیل اطلاعات فضایی ایفا میکند (4). این ناحیه از مغز توسط شریان کروییدي قدامی که شاخهاي از کاروتید داخلی میباشد خونرسانی میشود. این شریان به دلیل بلند و نازك بودن مستعد ترومبوزیس است. بنابراین هیپوکامپ جزو اولین مناطقی از مغز است که در بیماريهاي مغزي مثل آلزایمر هانتیگتون صرع سکتهمغزي ایسکمی و بهویژه تروماي مغزي دچار آسیب میشود (5). با توجه به نقش حیاتی هیپوکامپ کاهش آسیب وارده و ترمیم آن در پی بیماريها و آسیبهاي تروماتیک بسیار با اهمیت است. سلولهاي عصبی جدیدي در نواحی مختلف مغز بالغ شامل (DG) dentate gyrus و (SVZ) sub ventricular zone تولید میشوند ) 7). همچنین به دنبال آسیب هیپوکامپ در اثر بیماريها ایسکمی وآسیبهاي تروماتیک نوروژنزیس تحت تاثیر عوامل درونی در ناحیه DG و SVZ براي جایگزینی نورونهاي آسیبدیده و ترمیم ضایعه افزایش مییابد (8). افزایش نوروژنزیز ناشی از سلولهاي بنیادي واقع در SVZ و DG مغز بالغ در گونههاي مختلف پستانداران ممکن است موجب پیشرفت بهبود مورفولوژیکی و تروما یا آسیبهاي دژنراتیو اولیه شود (9 ) عملکردي بعد از ایسکمی مغز ولی این روند افزایشی درونی قادر به جبران آسیب وارده نیست. لذا استفاده از عواملی که میزان نوروژنزیز را در DG و SVZ تحریک کند میتواند گامی موثر در بهبود و ترمیم ضایعات هیپوکامپ بهدنبال ایسکمی مغزي باشد. (transforming growth factor alpha) TGF-α اولین پلیپپتید میتوژن و یکی از اعضاي خانواده EGF factors) (epidermal growth است که رسپتورهاي تیروزین کیناز سرتاسر غشایی EGFR را فعال میکنند. فعالیت تیروزین کیناز به ترتیب انتقال آبشاري از سیگنالها را آغاز میکند که موجب تغییرات بیوشیمیایی مختلفی در سلول میگردد (10) این تغییرات شامل افزایش سطح کلسیم داخل سلولی افزایش گلیکولیز و افزایش بیان بعضی از ژنها مانند ژنهاي EGFR است که در نهایت منجر به سنتز DNA و تکثیر سلول میگردد. عوامل رشد خانواده EGF در رشد تمایز حفظ و ترمیم بافتهاي مختلف مانند سیستم عصبی و دستگاه گوارش دخالت دارن د. این عوامل رشد توسط انواع مختلف سلولها اعم از نورونها سلولهاي گلیال و سلولهاي اپیتلیال روده تولید و نقش مهمی را در تنظیم تکثیر تمایز مهاجرت زندهماندن سلول و حفظ هموستاز بافت ایفا میکنند. TGF-α که یکی از اعضاي این خانواده است در سطح بالایی در سیستم عصبی مرکزي بیان میشود و در مقایسه با سایر لیگاندها فراوانی و توزیع گستردهتري دارد (10). TGF-α بهعنوان فراوانترین لیگاند EGF-R در تکامل سیستم عصبی مرکزي بالغین بهخصوص در استریاتوم بولب بویایی هیپوکامپ و SVZ و ساقه مغز شناخته شده است (11). باتوجه به نقش این عامل رشد در تکامل سیستم عصبی مرکزي و عدم وجود مطالعهاي دال بر نقش آن در بهبود نوروردژنراسیون القاء شده توسط ایسکمی ریپرفیوژن این مطالعه به منظور تعیین اثر TGF-α بر سلولهاي عصبی بنیادي شکنج دندانهاي و سلولهاي پیرامیدال ناحیه CA1 هیپوکامپ براساس مطالعات ایمونوهیستوشیمی و رفتاري در مدل تجربی ایسکمی ریپرفیوژن مغزي در موش صحرایی نر انجام شد. روش بررسي این مطالعه تجربی روي 42 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن گرم خریداري شده از انستیتو پاستور تهران در دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران از تابستان 1388 تا پاییز 1389 انجام شد. این مطالعه با تصویب کمیته اخلاق پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تهران و طبق پروتکل اصول کار با حیوانات انجام گردید. حیوانات تحت شرایط استاندارد با دوره روشنایی و تاریکی 12 ساعته و دماي 21±3 درجه سانتیگراد نگهداري شدند و دسترسی کامل به آب آشامیدنی و غذاي کافی داشتند. گروه بندي حيوانات حیوانات به صورت تصادفی انتخاب و در چهار گروهکنترل شم ایسکمی و درمان قرار گرفتند. در گروه کنترل (7=n) هیچ مداخلهاي روي حیوانات انجام نشد. حیوانات گروه شم (7=n) تحت استرس جراحی بدون مسدود کردن شریانهاي کاروتید مشترك قرار گرفتند. حیوانات گروه ایسکمی (14=n) بهطور تصادفی در دو گروه زیر قرار گرفتند: الف) تعداد 7 سر موش تحت القاء ایسکمی قرار گرفتند و 7 روز بعد به روش استریوتاکسی 5 میکرولیتر PBS به داخل بطن راست تزریق شد و در روز 12 ازنظر بیان Nestin بررسی شدند. مطالعات نشان میدهند که 12 روز بعد از القاء نوروژنزیس اوج بیان Nestin میباشد (12). ب) تعداد 7 سر موش پس از القاء ایسکمی و دریافت PBS دوماه بعد از نظر حافظه فضایی بررسی شدند. با توجه به سیناپتوژنز مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره ۱۴ ماره ۳ (پي در پي ۴۳)

4 / ٢٨ اثر TGF-α به دنبال ايسکمي - ريپرفيوژن بر CA1 هيپوکامپ موش صحرايي دوماه بعد از القاء نوروژنزیس حافظه فضایی براي تایید فیزیکی فانکشنال شدن سیناپسها انجام گردید (9). گروه درمان (14=n) : بهطور تصادفی در دو زیرگروه قرار گرفتند: الف) تعداد 7 سر موش تحت القاء ایسکمی قرار گرفتند. 7 روز بعد 50 نانوگرم TGF-α حل شده در 5 میکروگرم PBS به روش استریوتاکسی به داخل بطن راست تزریق شد. سپس در روز دوازدهم از نظر بیان Nestin بررسی شدند (12). ب) تعداد 7 سر موش پس از القاء ایسکمی و دریافت TGF-α دوماه بعد از نظر حافظه فضایی بررسی شدند. ايجاد مدل ايسکمي براي ایجاد مدل ایسکمی ابتدا حیوانات با استفاده از مخلوط کتامین (شرکت دارو پخش ایران) 100 میلیگرم براي هرکیلوگرم وزن و گزیلازین (شرکت دارو پخش ایران) 10 میلیگرم براي هر کیلوگرم وزن بیهوش شدند. سپس تحت شرایط استریل در قسمت قدامی گردن برشی به اندازه 1-1/5 سانتیمتر داده شد و پس از مشخص کردن شریان کاروتید مشترك با استفاده از کلمپهاي مخصوص این شریان به مدت 30 دقیقه مسدود گردی د. پس از آن کلمپها برداشته شد تا مجددا جریان خون برقرار گردد (13). رنگا ميزي نيسل staining) (Nissl براي بررسی کاهش تعداد سلول به دنبال ایسکمی در ناحیه CA1 هیپوکامپ از رنگآمیزي کرزیل ویوله استات 0/1 درصد استفاده شد. در این رنگآمیزي سلولهاي سالم بهصورت سلولهاي یوکروماتین گرد دیده میشوند. از هر گروه 4 سر موش و از هر موش تعداد 10 برش براي رنگآمیزي نیسل انتخاب گردید. بعد از تهیه عکس توسط نرمافزار Olysia bio report شمارش سلولی در یک میلیمتر مربع انجام شد. بدین منظور مغز موشهاي صحرایی در روز 12 و بعد از پرفیوژن داخل قلبی با پارافرمالدهید 4 درصد خارج و پس از آمادهسازي بافتی با پارافین قالبگیري شد. سپس مقاطع 10 میکرومتري تهیه و مقاطع با رنگ کریزل ویوله رنگآمیزي گردید. ايمونوهيستوشيمي براي بررسی اثر القایی TGF-α بر سلولهاي عصبی بنیادي DG بیان پروتین Nestin با روش ایمونوهیستوشیمی انجام شد. مقاطع طبق روشی که در رنگآمیزي نیسل توضیح داده شد تهیه گردید و بعد از شفافسازي و آبدهی براي بلاك کردن لامها در محلول 10 درصد پروکسیدهیدروژن به مدت 10 دقیقه قرار گرفتند و پس از احیاي آنتیژن با سیترات بافر و برداشتن آنتیژنهاي نامربوط با BSA لامها با ی ک آنتیبادي (abcam,ca:ab6142) Nestin به مدت (abcam,ca6789) به مدت ی ک ساعت و با DAB substrate kit ( : number (CA به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند و در نهایت براي رنگآمیزي متضاد از رنگ نیسل استفاده گردید. بررسي حافظه فضايي با دستگاه Morris water maze براي بررسی حافظه فضایی به دنبال بهکار بردن TGF-α از دستگاه Morris water maze استفاده شد. این دستگاه براي بررسی یادگیري و حافظه فضایی طراحی شده و شامل حوضچه استوانهاي سیاهرنگ با قطر 136 سانتیمتر و ارتفاع 60 سانتیمتر میباشد که تا ارتفاع 25 سانتیمتر با آب درجه سانتیگراد پر میشود. این حوضچه به صورت فرضی به چهار ربع دایره تقسیم شده و سکوي کوچکی از جنس پلکسیگلاس با قطر 10 سانتیمتر و در یک سانتیمتري زیر سطح آب در مرکز یکی از چهار ربع دایره قرار دارد که حیوان میتواند براي فرار از آب روي آن قرار گیرد. یک فرستنده نور مادون قرمز به موش متصل و مسیر حرکت حیوان از طریق یک دوربین مدار بسته که نور مادون قرمز را ردیابی کرده است به کامپیوتر انتقال مییابد. هر موش به مدت 3 روز و هر روز دو بلوك وهر بلوك شامل چهار کارآزمایی تحت آموزش قرار گرفتند. در هر کارآزمایی حیوان از یکی از چهار نقطه شروع شمال جنوب شرق یا غرب در آب رها شد. بهطوري که صورتش به طرف آب حوض بود. یک کارآزمایی زمانی اتمام مییافت که موش بر روي سکو میرفت یا 90 ثانیه شنا میکرد. موشهایی که سکو را پیدا نکردند به روي سکو منتقل شدند. در هر دو حالت فوق به حیوان 20 ثانیه فرصت داده شد که روي سکو بماند. پس از اتمام بلوك اول حیوان را از آب خارج کردیم و بعد از 5 دقیقه استراحت بلوك 2 را با همان شرایط بلوك اول انجام دادیم و در نهایت پس از اتمام کار حیوانات را از حوضچه خارج و خشک نموده و به حیوانخانه منتقل کردیم. در روز چهارم آزمایش براي انجام probe سکو را برداشتیم و یک بلوك با یک کارآزمایی انجام دادیم. سپس براي بررسی توانایی دیداري حسی - حرکتی و انگیزشی حیوان تست سکوي آشکار انجام شد. به این صورت که سکو را در مرکز ربع دایره جنوب شرقی بالاتر از سطح آب قرار دادیم و با فویل آلومینیومی پوشاندیم که براي موش کاملا قابل دید باشد و سپس یک بلوك با چهار کارآزمایی مشابه سکوي نهان انجام دادیم. در این تست زمان سیدن به سکوي مخفی مسافت طی شده براي رسیدن به سکو و درصد ورود در ربع دایره هدف بررسی گردید. تجزيه و تحليل ا ماري دادهها با استفاده از نرمافزار آماري SPSS-16 و آزمون ANOVA نظر گرفته شد. تجزیه و تحلیل شدند. سطح معنیداري کمتر از 0/05 در ساعت آنتیبادي (HRP) goat polyclonal secondary مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره / ۱۴ شماره ۳ (پي در پي ۴۳)

5 ش/ حسن عليپناهزاده و همکاران / ٢٩ شکل : ۱ سلولهاي ناحيه CA1 هيپوکامپ در برش کرونال در سطح ۳/۸ نسبت به برگما و با رنگا ميزي کريزل ويوله در روز ۱۲ درمان در گروههاي کنترل (A) ايسکمي (B) و درمان (C). علامت ستاره نورونهاي سالم داراي هسته سالم و يوکروماتين و نوک پيکان ساول پيکنوزه با هسته هتروکروماتين را نشان ميدهند. رنگا ميزي نيسل بزرگنمايي ۴۰ شکل : ۲ سلولهاي ناحيه CA1 هيپوکامپ در برش کرونال در سطح ۳/۸ نسبت به برگما و با رنگا ميزي کريزل ويوله در روز ۷۲ درمان در گروههاي کنترل (A) ايسکمي (B) و درمان (C). علامت ستاره نورونهاي سالم داراي هسته سالم و يوکروماتين و نوک پيکان ساول پيکنوزه با هسته هتروکروماتين را نشان ميدهند. رنگا ميزي نيسل بزرگنمايي ۴۰ شکل : ۳ مقطعي از DG هيپوکامپ موش صحرايي در گروه ايسکمي (A) و درمان (B). نقاط قهوهاي (نوک پيکان) نشانگر بيان Nestin است که در گروه ايسکمي در مقايسه با گروه درمان توزيع کمتري دارد. رنگا ميزي ايمونوهيستوشيمي بزرگنمايي ۴۰۰ يافتهها با توجه به عدم وجود تفاوت معنیدار بین گروه کنترل و شم فقط دادههاي مربوط به گروه شم بیان شده است. تعداد سلولهاي یوکروماتین ناحیه CA1 هیپوکامپ در گروه ایسکمی در روزهاي 12 و 72 درمقایسه با گروه شم کاهش یافت.(P<0/05) تجویز TGF-α منجر به افزایش سلولهاي یوکروماتین و سالم این ناحیه گردید که بررسی درونگروهی نشان داد این افزایش در مقایسه با گروه ایسکمی معنیدار است (0/05>P) (شکلهاي 1 و 2 ) (نمودارهاي 1 و 2 ). نتايج ايمونوهيستوشيمي بيان Nestin بررسی بیان پروتي ین Nestin در ناحیه DG هیپوکامپ با روش ایمونوهیستوشیمی نشان داد که این پروتي ین در گروه دریافت کننده TGF-α توزیع بیشتري داشته است. همانطوري که در شکل 3 مشخص شده است در رنگآمیزي ایمونوهیستوشیمی رنگ قهوهاي نشانگر بیان Nestin (مارکر نورال استم سل) میباشد. مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره ۱۴ ماره ۳ (پي در پي ۴۳)

6 / ٣٠ اثر TGF-α به دنبال ايسکمي - ريپرفيوژن بر CA1 هيپوکامپ موش صحرايي داشت (0/01>P) و گروه ایسکمی زمان بیشتري را براي رسیدن به نمودار : ۱ تعداد سلولهاي يوکروماتين ناحيه CA1 هيپوکامپ در گروههاي مختلف تجربي در روز ۱۲ درمان * ۰/۰۱>P در مقايسه با گروه شم ** ۰/۰۵>P در مقايسه با گروه ايسکمي نمودار : ۲ تعداد سلولهاي يوکروماتين ناحيه CA1 هيپوکامپ در گروههاي مختلف تجربي در روز ۷۲ درمان * ۰/۰۱>P در مقايسه با گروه شم ** ۰/۰۵>P در مقايسه با گروه ايسکمي سکو طی کرد (نمودار 4) و درمان با TGF-α منجر به کاهش معنیدار این زمان در مقایسه با گروه ایسکمی گردید (0/05>P). نمودار : ۴ زمان طي شده براي رسيدن به سکوي مخفي در تست MWM در روز ۷۲ درمان * ۰/۰۱>P در مقايسه با گروه شم ** ۰/۰۵>P در مقايسه با گروه ايسکمي بحث در مطالعه حاضر اثر القایی TGF-α بر سلولهاي عصبی بنیادي شکنج دندانهاي هیپوکامپ و اثر حفاظتی آن بر سلولهاي پیرامیدال ناحیه CA1 هیپوکامپ براساس مطالعات ایمونوهیستوشیمی و رفتاري در مدل تجربی ایسکمی ریپرفیوژن مغزي در موش صحرایی نر بررسی شد. براساس نتایج حاصله TGF-α تعداد نورونها در ميليمتر مربع مسافت طي شده براي رسيدن به سکو تعداد نورونها در ميليمتر مربع توانست موجب تحریک تکثیر سلولهاي عصبی بنیادي شکنج دندانهاي هیپوکامپ و سبب کاهش مرگ سلولهاي پیرامیدال ناحیه بهدنبال ایسکمی گردد. در مطالعه CA1 هیپوکامپ و بهبود الگوي رفتاري حیوانات Schmidt و Reymann مدل ایسکمی گلوبال مغزي موجب نورودژنراسیون وسیع در ناحیه CA1 هیپوکامپ استریاتوم و ني وکورتکس گردید زمان طي شده براي رسيدن به سکو (14) که موافق با مطالعه حاضر بود. بهطوري که بستن هردو کاروتید مشترك (CCO) به مدت 30 دقیقه موجب نمودار : ۳ مسافت طي شده براي رسيدن به سکوي مخفي در تست MWM در روز ۷۲ درمان P<۰/۰۱ * در مقايسه با گروه شم ۰/۰۵>P در مقايسه با گروه ايسکمي ** نتايج ا زمون رفتاري با توجه به نتایج آزمون MWM گروه ایسکمی مسافت زیادي را براي رسیدن به سکوي مخفی در مقایسه با گروه شم طی نمود (0/01>P) (نمودار 3). همچنین تجویز TGF-α منجر به کاهش معنیدار مسافت طی شده در مقایسه با گروه ایسکمی گردید (0/05>P). در رابطه با زمان طی شده براي رسیدن به سکوي مخفی تفاوت آماري معنیداري بین گروه شم و گروه ایسکمی وجود مرگ سلولی گسترده در ناحیه CA1 هیپوکامپ شد. به نحوي که کاهش معنیداري در میانگین تعداد سلولهاي ناحیه CA1 در گروه ایسکمی نسبت به سایر گروهها و نیز تغییرات معنیداري در آزمایشات رفتاري حیوانات مشاهده شد. همچنین استفاده از آنتیبادي علیه Nestin افزایش قابل ملاحظهاي را در بیان این پروتي ین در شکنج دندانهاي هیپوکامپ در گروههاي درمانی با TGF-α در این مدل ایسکمی در موش صحرایی نشان داد. در مطالعه Salazar-Colocho و همکاران ایسکمی مغزي موجب شروع تکثیر در CA1 و نوروژنزیز در DG هیپوکامپ در پاسخ به مرگ نورونهاي هرمی در CA1 گردید که این امر مستقل از مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره / ۱۴ شماره ۳ (پي در پي ۴۳)

7 ش/ حسن عليپناهزاده و همکاران / ٣١ کاهش جریان خون مغزي یا مهاجرت سلولی از SVZ است (9). افزایش نوروژنزیز ناشی از سلولهاي بنیادي واقع در SVZ و DG مغز بالغ در گونههاي مختلف پستانداران ممکن است موجب پیشرفت بهبود مورفولوژیکی و عملکردي بعد از ایسکمی مغز تروما یا آسیبهاي دژنراتیو اولیه شود (11) که مطابق با نتایج حاصله در مطالعه حاضر است. در مطالعه Guerra-Crespo و همکاران TGF-α حجم آسیب ناشی از ایسکمی را کاهش داد. به طوري که این اثر ناشی از تغییر در نفوذپذیري عروق مغزي نبود و نتیجهگیري شد که TGF-α یک اثر محافظتی در مقابل مرگ سلولهاي عصبی بعد از ایسکمی موضعی گذرا دارد (15). همچنین Leker و همکاران عنوان کردند که TGF-α میتواند موجب القاء آنژیوژنز نوروژنز و نوروپوتکشن بعد از سکته شود (16). پاسخ سلولهاي بنیادي عصبی به آسیبهاي ایسکمیک و نیز بهبودي رفتاري بهطور قابلتوجهی با بهکار بردن TGF-α افزایش مییابد که نشاندهنده نزدیکشدن به یک روش درمانی براي سکته مزمن و سایر آسیبهاي نورولوژیک در انسان است (17). نتيجهگيري این مطالعه نشان داد که استفاده از TGF-α باعث کاهش آسیبهاي ناشی از ایسکمی ریپرفیوژن به صورت افزایش تعداد نورونهاي پیرامیدال بیان Nestin و بهبود حافظه میگردد. تشكر و قدرداني این مقاله حاصل پایان نامه حسن علی پناه زاده براي اخذ کارشناسی ارشد در رشته علوم تشریحی از دانشگاه علوم پزشکی تهران بود. بدینوسیله از کارکنان آزمایشگاه علوم اعصاب گروه علوم تشریحی دانشگاه علوم پزشکی تهران سپاسگزاري میگردد. References 1. Senelick RC, Rossi PW, Dougherty K. Living with stroke: a guide for families: help and new hope for all those touched by stroke. 1 st. New York: McGraw-Hill. 1999; pp: Johansson BB. Current trends in stroke rehabilitation. A review with focus on brain plasticity. Acta Neurol Scand Mar; 123(3): Zini I, Tomasi A, Grimaldi R, Vannini V, Agnati LF. Detection of free radicals during brain ischemia and reperfusion by spin trapping and microdialysis. Neurosci Lett Apr; 138(2): Taupin Ph. The Hippocampus: Neurotransmission and Plasticity in the Nervous System. 1 st. New York: Nova Biomedical Books. 2008; pp: Eichenbaum H. Hippocampus: cognitive processes and neural representations that underlie declarative memory. Neuron Sep; 44(1): Lucas JA. Disorders of memory. Psychiatr Clin North Am Sep; 28(3):581-97, Altman J, Das GD. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol Jun;124(3): Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science Feb; 287(5457): Salazar-Colocho P, Lanciego JL, Del Rio J, Frechilla D. Ischemia induces cell proliferation and neurogenesis in the gerbil hippocampus in response to neuronal death. Neurosci Res May;61(1): Xian CJ, Zhou XF. EGF family of growth factors: essential roles and functional redundancy in the nerve system. Front Biosci Jan;9: Altman J. Autoradiographic and histological studies of postnatal neurogenesis. IV. Cell proliferation and migration in the anterior forebrain, with special reference to persisting neurogenesis in the olfactory bulb. J Comp Neurol Dec;137(4): Cooper O, Isacson O. Intrastriatal transforming growth factor alpha delivery to a model of Parkinson's disease induces proliferation and migration of endogenous adult neural progenitor cells without differentiation into dopaminergic neurons. J Neurosci Oct;24(41): McBean DE, Kelly PA. Rodent models of global cerebral ischemia: a comparison of two-vessel occlusion and four-vessel occlusion. Gen Pharmacol Apr;30(4): Schmidt W, Reymann KG. Proliferating cells differentiate into neurons in the hippocampal CA1 region of gerbils after global cerebral ischemia. Neurosci Lett Dec;334(3): Guerra-Crespo M, Gleason D, Sistos A, Toosky T, Solaroglu I, Zhang JH,et al. Transforming growth factor-alpha induces neurogenesis and behavioral improvement in a chronic stroke model. Neuroscience May;160(2): Leker RR, Toth ZE, Shahar T, Cassiani-Ingoni R, Szalayova I, Key S, et al. Transforming growth factor alpha induces angiogenesis and neurogenesis following stroke. Neuroscience Sep;163(1): Peng H, Wen TC, Tanaka J, Maeda N, Matsuda S, Desaki J, et al. Epidermal growth factor protects neuronal cells in vivo and in vitro against transient forebrain ischemia- and free radical-induced injuries. J Cereb Blood Flow Metab Apr;18(4): مجله علمي دانشگاه علوم پزشكي گرگان / پاييز / ١٣٩١ دوره ۱۴ ماره ۳ (پي در پي ۴۳)