ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Β ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Β ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΘΗΝΩΝ Ομότιμος Καθηγητής: Σ. ΡΑΠΤΗΣ ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΙΝΩΣΗΣ ΣΤΗ ΜΗ ΑΛΚΟΟΛΙΚΗ ΣΤΕΑΤΟΗΠΑΤΙΤΙΔΑ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΛΕΝΗ Ε. ΛΥΔΑΤΑΚΗ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ Ε.Σ.Υ. Β ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΓΕΝΙΚΟ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟ ΝΙΚΑΙΑΣ «ΑΓ. ΠΑΝΤΕΛΕΗΜΩΝ» ΑΘΗΝΑ 2014

2 Στον Μάνο, Θοδωρή, Διονύση

3

4

5 Σύντομο Βιογραφικό Αποφοίτηση από το Λύκειο Καλλιθέας Αθήνα Εισαγωγή μετά από πανελλαδικές εξετάσεις το στην Ιατρική σχολή του Πανεπιστημίου Πατρών : Ιατρική σχολή Πάτρα : Αγροτικό ιατρείο : Ειδικότητα Παθολογία στην ΜΕΘ Νοσοκομείου Σωτηρία - Αθήνα : Ειδικότητα Παθολογίας Γ Παθολογική κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών, Ν. Σωτηρία υπό των καθηγητή Κο Αραπάκη : Εισαγωγή-μετά από εξετάσεις στο Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών «ΕΚΕΦΕ-Δημόκριτος» όπου είχα έμμισθο θέση. Ενασχόληση με την κυτταρομετρία ροής στο αίμα. Σε αυτό το χρονικό διάστημα, έμμισθος μετεκπαίδευση στην κυτταρομετρία ροής σε βιολογικά υγρά στο νοσοκομείο Broussais (τμήμα αργότερα του Georges Pompidou) και στο εργαστήριο βιοχημείας του νοσοκομείου Lyon-Sud Hospital Center. Νοσοκομείου ενασχολούμενο με τις επιπτώσεις της ιονίζουσας ακτινοβολίας στον άνθρωπο : Επιμελήτρια Β Γενικό νοσοκομείο Ρεθύμνου Κρήτης με διάθεση στο Πανεπιστημιακό νοσοκομείο Ηρακλείου, ερευνητικό εργαστήριο Καθηγητού Πνευμονολογίας Κο Μπούρου (κυτταρομετρία ροής βρογχικών εκπλυμάτων και πτυέλων) σήμερα : Ιατρός παθολόγος Κρατικό Νίκαιας (Β Παθολογική κλινική) : Μετεκπαίδευση μέσω ΚΕΣΥ στην πανεπιστημιακή παθολογική κλινική - ηπατολογικό κέντρο του Ιπποκράτειου νοσοκομείου Αθηνών σήμερα : Υπεύθυνος Ηπατολογικύ ιατρείου Β παθολογικής κλινικής Συμμετοχή σε: 53 σεμινάρια,28 συνέδρια εξωτερικού, 54 συνέδρια εσωτερικού. Συμμετοχή με ανακοινώσεις σε : 11 συνέδρια εξωτερικού, 28 συνέδρια εσωτερικού. Συμμετοχή με ομιλίες σε : 13 συνέδρια εσωτερικού και ημερίδες. Συμμετοχή ως διορθωτής εργασιών στο Πανελλήνιο ιατρικό συνέδριο κατά το χρονικό διάστημα Συγγραφή μονογραφιών στο βιβλίο «ημερίδες πρωτοβάθμιας φροντίδας για τους γενικούς γιατρούς» κατά το χρονικό διάστημα Συγγραφή κεφαλαίου 6 με τίτλο: «Oxidised Low Density Lipoprotein (LDL) Modification with Statin Therapy is Associated with Reduction in Carotid Stenosis», στο βιβλίο «Carotid Artery Disease - From Bench to Bedside and Beyond», ISBN , Δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά εξωτερικού : 2 { Liver International 2006, Br J Haematol }. Δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά εσωτερικού : 2 (Ιατρική 2004.Ιατρική 2007) Συμμετοχή με ομιλίες, παρουσιάσεις περιστατικών, στον παθολογικό τομέα του Κρατικού Νοσοκομείου Νίκαιας. 1 Σ ελίδα

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ως νέα επιμελήτρια ΕΣΥ στην Κρήτη κατά το χρονικό διάστημα , είχα παρατηρήσει ότι κάποιοι ασθενείς κυρίως με Σακχαρώδη Διαβήτη, νοσηλεύονταν για ΗΚΚ ή για κίρρωση ήπατος χωρίς να έχουν ιστορικό χρόνιας ιογενούς ή άλλης ηπατοπάθειας. Την παρατήρησή μου αυτή την συζήτησα με τον καθηγητή της γαστρεντερολογίας της Ιατρικής σχολής στην Κρήτη κο Ηλία Κουρούμαλη. Ο κος Κουρούμαλης αποτέλεσε για μένα τον δάσκαλο πάνω στις έννοιες του μεταβολικού συνδρόμου και την συσχέτισή του με την μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος. Το ενδιαφέρων του θέματος, με την ταυτόχρονη απουσία ουσιαστικής γνώσης πάνω στην παθοφυσιολογία και στην πρώιμη διάγνωση μίας νόσου που συνεχώς αριθμητικά αυξανόταν σε «φαινομενικά» υγιή άτομα τα οποία έφταναν πλέων στο νοσοκομείο όταν η κίρρωση είχε εγκατασταθεί, έδωσε την ιδέα για την διερεύνηση μη επεμβατικών δεικτών ηπατικής ίνωσης στην μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα στον κο Κουρούμαλη. Το θέμα αυτό αποτέλεσε και την αιτία για την πραγματοποίηση της διατριβής. Ευχαριστώ τον καθηγητή της Ιατρικής σχολής του Πανεπιστημίου Αθηνών κο Σ. Ράπτη για την ανάθεση του θέματος της παρούσας διατριβής, για την εμπιστοσύνη αλλά και ανοχή που έδειξε σε όλη την χρονική διάρκεια της εκπόνησής της παρά τις απρόοπτες δυσκολίες. Χωρίς την βοήθειά του η εργασία αυτή δεν θα ήταν δυνατή. Οι ορολογικοί δείκτες εκτιμήθηκαν στο βιοχημικό εργαστήριο του Κρατικού Νοσοκομείου Νίκαιας με την αμέριστη προσωπική συμμετοχή της τότε διευθύντριας κας Κωσταντέλλου Ευαγγελίας την οποία ευχαριστώ πολύ. Τα ιστολογικά δείγματα ηπατικών βιοψιών επίσης εξετάσθηκαν στο παθολογοανατομικό εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Νίκαιας, με την προσωπική συμμετοχή της διευθύντριας κας Παράση Αικατερίνης την οποία επίσης ευχαριστώ. Όλα τα ιστολογικά δείγματα επανελέγχθηκαν από το παθολογοανατομικό εργαστήριο του πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αττικό. Οι ασθενείς της μελέτης προερχόταν από το εξωτερικό τακτικό ηπατολογικό ή το διαβητολογικό ιατρείο της Γ παθολογικής κλινικής του Νοσοκομείου Νίκαιας. Μετά από πολλές αντιξοότητες, η τριμελής συμβουλευτική επιτροπή αποτελείτο από τον Καθηγητή κο Σ. Ράπτη ως επιβλέπων μέλος, τον Καθηγητή κο Σ. Λαδά και τον Καθηγητή κο Σ. Ντουράκη ως μέλη. Αισθάνομαι την ανάγκη και την ηθική υποχρέωση να ευχαριστήσω τον καθηγητή κο Λαδά για την συνεργασία του και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Τον καθηγητή κο Ντουράκη γιατί με το συνεχές ενδιαφέρον και παρότρυνσή του μου πρόσφερε πολύτιμη βοήθεια σε όλη την διάρκεια εκπόνησής της. Οφείλω ειλικρινά να ομολογήσω ότι χωρίς το προσωπικό ενδιαφέρων του καθηγητού Σ. Ντουράκη, η διατριβή αυτή δεν θα είχε ολοκληρωθεί. Η εμπειρία του στο συγκεκριμένο αντικείμενο, η καθοδήγησή του αλλά και η εμπιστοσύνη που μου έδειξε αποτέλεσαν για μένα πολύτιμη βοήθεια. Τους συναδέλφους μου της Β Παθολογικής κλινικής του νοσοκομείου Νίκαιας όπου εργάζομαι και ιδιαίτερα τον συντονιστή διευθυντή κο Χαράλαμπο Μπιλίνη, για την πολύτιμη βοήθεια της προσφοράς χρόνου ώστε τελικά να μπορέσω να ολοκληρώσω την συγγραφή και τον επιμελητή κο Ηλία Σκοπελίτη του οποίου η ηθική και επιστημονική συμβολή στην πραγματοποίηση της εργασίας ήταν μεγάλη. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω τους ασθενείς που έλαβαν μέρος στην μελέτη παρά του ότι δεν αισθανόταν πάσχοντες. Είναι άνθρωποι που δεν φείδονται κόπου και προσωπικού χρόνου προκειμένου να βοηθήσουν μία προσπάθεια με απήχηση στο κοινωνικό σύνολο. 2 Σ ελίδα

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ Σελ. 1 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Σελ. 2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. 3 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σελ. 5 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο Σελ. 6 Εισαγωγή ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο Σελ. 10 Ορισμός ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο Σελ. 11 Επιδημιολογία Σελ. 11 Φυσική Ιστορία Σελ. 18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο Σελ. 20 Παθοφυσιολογία (NAFLD NASH) Σελ. 20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο Σελ. 32 Διαγνωστική προσέγγιση ή Διαγνωστική στρατηγική σε NAFLD NASH Σελ. 32 Κλινικά χαρακτηριστικά Εργαστηριακά χαρακτηριστικά Σελ. 34 Απεικονιστικές εξετάσεις ρουτίνας Σελ. 36 Βιοψία ήπατος Σελ. 38 Μη επεμβατικοί δείκτες σταδίων NAFLD υπό έρευνα Σελ. 42 Βιοδείκτες στεάτωσης υπό έρευνα Σελ. 42 Μονομερείς βιοδείκτες NASH υπό έρευνα Σελ. 45 Συνδιαστικά βαθμολογικά μοντέλα πρόβλεψης NASH υπό έρευνα Σελ. 56 Μονομερείς βιοδείκτες ίνωσης στη NAFLD υπό έρευνα Σελ. 66 Συνδιαστικά μοντέλα πρόβλεψης NASH ίνωσης σε NAFLD ασθενείς υπό ερευνα Απεικονιστικές μη επεμβατικές τεχνικές ανίχνευσης σταδίων NAFLD υπό έρευνα Σελ. 71 Σελ. 91 «Σύγχρονη τακτική» για την διάγνωση των σταδίων άλλες NAFLD Σελ. 102 Προτεινόμενοι αλγόριθμοι για την διαχείριση NAFLD ασθενών Σελ Σ ελίδα

8 Αλγόριθμος «Σχεδιάζοντας» την διάγνωση NAFLD NASH Σελ. 106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο Σελ. 107 Διαχείριση ασθενούς με NAFLD Σελ. 107 Παρεμβάσεις στον τρόπο ζωής Σελ. 107 Ιατρικές θεραπείες Σελ. 108 Άλλες θεραπείες Σελ. 109 Βαρειατρική χειρουργική επέμβαση Σελ. 111 Προτεινόμενος διαγνωστικός και θεραπευτικός αλγόριθμος για τη NAFLD NASH Σελ. 113 Θεραπευτικές παρεμβάσεις υπό έρευνα Σελ. 116 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο Σελ. 121 Βιβλιογραφία Γενικού Μέρους ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σελ. 147 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο Σελ. 148 Εισαγωγή Σελ. 148 Ασθενείς και μέθοδοι Σελ. 154 Αποτελέσματα Σελ. 156 Συζήτηση Σελ. 164 Περίληψη Σελ. 183 Abstract Σελ. 184 Δημοσιεύσεις Ανακοινώσεις σχετιζόμενες με τη μελέτη Σελ. 185 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 ο Σελ. 186 Βιβλιογραφία Ειδικού Μέρους 4 Σ ελίδα

9 Γενικό Μέρος Διατριβής Λυδατάκη Ελένης 5 Σ ελίδα

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ΝΑFLD: Non Alcoholic Fatty Liver Disease (Μη Αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος) αντιπροσωπεύει ένα φάσμα καταστάσεων που χαρακτηρίζονται ιστολογικά από υπερβολική συσσώρευση λίπους (κυρίως τριγλυκεριδίων) στα ηπατοκύτταρα, απουσίας κατανάλωσης αλκοόλ. Συνήθως <20 gr/ημέρα (1). Η ΝΑFLD θεωρείται το ΗΠΑΤΙΚΟ ΜΑΝΙΦΕΣΤΟ TOY METABOΛΙΚΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ γιατί οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ανάπτυξή της, συνδυάζονται με την αντίσταση στην ινσουλίνη και το μεταβολικό σύνδρομο. Επομένως η ΝΑFLD είναι στενά συνδεδεμένη με: Παχυσαρκία, Δυσλιπιδαιμία, Δυσανεξία στη γλυκόζη (Gly), Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ (ΣΔΙΙ), Υπέρταση ή Στεφανιαία νόσο (2,3). Η ΝΑFLD είναι μια «σιωπηλή» νόσος. Επομένως, για τη διάγνωση της ΝΑFLD σε κάποιον ασθενή που στην απλή απεικόνιση ήπατος (υπέρηχο άνω κοιλίας) υπάρχουν ενδείξεις ηπατικής στεάτωσης, θα πρέπει να ισχύουν τα κάτωθι: α) Αποκλεισμός-από το ιστορικό-σημαντικής κατανάλωσης αλκοόλ (συνήθως<20 gr/ημέρα)(1). β) Ενδείξεις παρουσίας ενός ή περισσοτέρων από τα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου : Αντίσταση στην Ins Κεντρικού τύπου παχυσαρκία Δυσανεξία στη Gly ή ΣΔ ΙΙ Δυσλιπιδαιμία (υπερτριγλυκεριδαιμία καθ υπεροχή) Υπέρταση OSA: Οbstructive sleep Apnea (Αποφρακτική άπνοια στον ύπνο)(4) γ) Αποκλεισμός δευτεροπαθών αιτιών Ηπατικής Στεάτωσης ή ήπιας αύξησης των τρανσαμινασών όπως: Διατροφικές αιτίες (π.χ. ταχεία απώλεια βάρους ή ολική παρεντερική διατροφή (4) Σπάνιες Μεταβολικές Διαταραχές (καχεξία, λιποδυστροφία, αβηταλιποπρωτεϊναιμία) (5, 6) Xρήση ναρκωτικών ουσιών που προκαλούν ηπατική στεάτωση. Ενδοκρινικές διαταραχές όπως: Υποθυρεοειδισμός, Υπέρ-αλδοστερoνισμός, Σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PLOS: Polycystic Ovary Syndrome), Υποφυσιακή βλάβη. (7,8) Φάρμακα: Μεθοτρεξάτη, ταμοξυφαίνη, βαλπροϊκό, τιλτιαζέμη, οιστρογόνα, αμιοδαρόνη, κορτικοειδή, υψηλής δραστηριότητας αντιρετροϊκά (HAART: Highly Active Antiretroviral) (1,9). Τοξίνες (χλωριούχο βινύλιο) Εντερική χειρουργική επέμβαση παράκαμψης για την παχυσαρκία HIV λοίμωξη HCV λοίμωξη συνήθως γονότυπος 3 Αιμοχρωμάτωση Αυτοάνοσα ηπατικά νοσήματα Ανεπάρκεια αι-αντιθρυψίνης v. Wilson s Στα διάφορα κέντρα παραπομπής ατόμων με χρόνια αύξηση των ηπατικών ενζύμων και αρνητική εργαστηριακή αξιολόγηση για τα προαναφερθέντα νοσήματα, η επικράτηση της ΝΑFLD είναι 33% ανάμεσα σε άλλες διαγνώσεις που περιλαμβάνουν: Δευτεροπαθή ηπατική στεάτωση: 27% (10) Μη ειδικού τύπου ηπατίτιδα: 9% (10) Οζώδη αναγεννητική υπερπλασία: 2% (10) Κοκκιωματώδη ηπατική νόσο: 1% (10) 6 Σ ελίδα

11 ΣΧΗΜΑ 1: Επιβεβαίωση ύπαρξης NAFLD Επιβεβαίωση Διάγνωσης Επανάληψη LFTs για να ελεγχθεί εάν υπάρχει εμμένουσα παθολογική ή μέση τιμή ALT (>30 ) ή (>19 ) LFTs παραμένουν παθολογικά Έλεγχος Ήπατος: HBV, HCV ορολογικά tests/φερριτίνη/κορεσμός τρανσφερρίνης/ Ηπατικά αυτοαντισώματα (AMA,ASMA,ANA)/alpha-1 αντιθρυψίνη ορού/ Σερουλοπλασμίνη ορού <40 και USS Έλεγχος ήπατος Θετικός: Διαχείριση της Παθολογικής κατάστασης Έλεγχος ήπατος Αρνητικός Και Φυσιολογικό USS Έλεγχος ήπατος Αρνητικός Και Λιπώδες Ήπαρ στο USS? Αιτία? Ήπια Στεάτωση NAFLD/NASH Ερμηνεία σχήματος: Η πλειοψηφία των ασθενών με ΝΑFLD είναι ασυμπτωματικοί και μπορεί οι απλές βιοχημικές δοκιμασίες της ηπατικής λειτουργίας να είναι φυσιολογικές ή ελαφρώς αυξημένες (LFTs: Liver Function Tests). Επομένως η υποψία της ΝΑFLD διάγνωσης, τίθεται συνήθως σε ασυμπτωματικούς ασθενείς με φυσιολογικές ή ελαφρώς αυξημένες αμινοτρανσφεράσες ορού, και ηπατική στεάτωση στον υπέρηχο άνω κοιλίας (USS:ultrasound scan) σε εξέταση ρουτίνας, που ο έλεγχος για άλλη πάθηση υπεύθυνη για τη διαταραχή της ηπατικής βιοχημείας και στεάτωσης του ήπατος ήταν αρνητικός και υπάρχουν ενδείξεις ή κλινικά χαρακτηριστικά μεταβολικού συνδρόμου. AMA:Antimitochondrial Antibody ASMA:Anti-smooth muscle antibody ANA:Anti-nuclear antibody HBV:Hepatitis B virus HCV:Hepatitis C virus ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase Η ΝΑFLD αποτελεί σήμερα μία από τις πιο συχνές χρόνιες ασθένειες του ήπατος παγκοσμίως, και τη συχνότερη χρόνια ηπατική νόσο στο Δ. κόσμο (10,11,12). Τα δεδομένα από την Εθνική Έρευνα Υγείας ή Διατροφής στην Αμερική στο χρονικό διάστημα , δείχνουν ότι η επικράτηση των κοινών χρόνιων ηπατικών νοσημάτων παραμένει σταθερή, εκτός από την ΝΑFLD που αυξάνει συνεχώς (13). Η συνεχής αύξηση του επιπολασμού της στον Δυτικό κόσμο, θεωρείται ότι συσχετίζεται με τον καθιστικό τρόπο ζωής και την ανθυγιεινή διατροφή, δηλαδή με τις καταστάσεις που προάγουν την αντίσταση στην Ins (12). Στις ΗΠΑ σήμερα πλήττει 1 στους 4 ενήλικες και το 10% των παιδιών. Στην Ευρώπη φαίνεται να επηρεάζει το 1/3 των Ευρωπαίων (10). Το κλινικό-παθολογοανατομικό φάσμα της ΝΑFLD κυμαίνεται από ήπια ηπατική στεάτωση (ΝΑFL: Non Alcoholic Fatty Liver) που κλινικά είναι ασυμπτωματική, συνδεόμενη με μία μακροπρόθεσμη πρόγνωση παρόμοια με αυτή του γενικού πληθυσμού και ιστολογικά 7 Σ ελίδα

12 υπάρχει μόνο εναπόθεση λίπους στο ήπαρ, χωρίς στοιχεία ηπατικής φλεγμονής ή βλάβης του ηπατικού παρεγχύματος, έως την μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH: Non Alcoholic steatohepatitis) μία συνήθως ασυμπτωματική ή με άτυπα κλινικά συμπτώματα, αλλά σοβαρή ιστολογική μορφή της ΝΑFLD, με νεκροφλεγμονώδη ηπατική δραστηριότητα και ηπατοκυτταρική βλάβη που εξελισσόμενη μέσω ίνωσης μπορεί να οδηγήσει σε κλινική εικόνα μη αντιρροπούμενης κίρρωσης, ηπατικής ανεπάρκειας και ηπατοκυτταρικού καρκίνου (Η.Κ.Κ). (10,11). Όταν η NASH - ίνωση είναι παρούσα, η 5ετής επιβίωση κυμαίνεται στο 67% και η 10ετής στο 59% (14). Επομένως, η ΝΑFLD μπορεί να οδηγήσει σε νόσο αυξημένης νοσηρότητας και θνητότητας σε σχέση με το γενικό πληθυσμό. Περίπου το 33% των ασθενών με NASH αναπτύσσουν ίνωση και το 15% αυτών αναπτύσσουν κίρρωση (10). Διαφορετικές μελέτες έχουν δείξει ότι: ηλικία > 45 έτη, παχυσαρκία, ΣΔ ΙΙ, ALT, τριγλυκερίδια ορού, υψηλοί δείκτες αντίστασης στην ινσουλίνη (ΗΟΜΑ-IR), συστηματική υπέρταση, επίπεδα c-πεπτιδίου, συνδυάζονται με προχωρημένη ίνωση σε NASH ασθενείς (10,11,15,). Ωστόσο αυτά τα ευρήματα δεν είναι αρκετά συνεπή μεταξύ των μελετών, ώστε δεν μπορούν από μόνα τους ή σε συνδυασμό, να αποτελούν παραμέτρους που επιβεβαιώνουν τη σοβαρότητα της ίνωσης στη ΝΑFLD. Επειδή οι ασθενείς με NASH-ίνωση έχουν αυξημένη θνητότητα και νοσηρότητα σε σχέση με αυτούς με NAFL, που έχουν παρόμοια με αυτή του γενικού πληθυσμού, η διάκριση μεταξύ NAFL και ΝΑSH είναι κλινικά σημαντική για την ακριβή πρόγνωση της νόσου και την ουσιαστική θεραπευτική διαχείριση αυτών των ασθενών. Αν και δεν υπάρχει μεγάλο παρελθόν, εν τούτοις την τελευταία δεκαετία, υπάρχει ουσιαστική εξέλιξη της έρευνας για ποικίλους μη επεμβατικούς δείκτες προς διαφορική διάγνωση (ΔΔx) NAFL από NASH και NASH-ίνωση (4,10,11,14,15,16). Όμως προς το παρόν, η βιοψία ήπατος αποτελεί τον «χρυσού κανόνα» δηλαδή τη μέθοδο αναφοράς για τη διάγνωση της παρουσίας NASH και την εκτίμηση της σοβαρότητας του βαθμού νέκρωσης και φλεγμονής και του σταδίου ίνωσης στο ήπαρ. Ωστόσο, οι βιοψίες ήπατος δεν εκτελούνται εύκολα σε «φαινομενικά» υγιείς ανθρώπους, αφού η ΝΑSH δεν δίνει συμπτωματολογία ως προς το στάδιο της ηπατικής ανεπάρκειας και επιπλέον οι βιοψίες ήπατος έχουν πολλούς περιορισμούς όπως: Επεμβατική διαδικασία με δυνητικά σημαντικές επιπλοκές νοσηρότητας 3% και θνητότητας 0,03% (10). Δειγματοληπτικό Σφάλμα ή δειγματοληπτική μεταβλητότητα. Μια βιοψία ήπατος λαμβάνει ένα εξαιρετικά μικρό τμήμα του ήπατος ( 1/ της συνολικής ηπατικής μάζας) που οδηγεί σε σημαντική δειγματοληπτική μεταβλητότητα αποτελεσμάτων (25-40%)(10). Mεταβλητότητα παρατηρητή (Παθολογοανατόμου). Η έκταση της διαφορετικής ερμηνείας του παθολογοανατόμου μπορεί να κυμαίνεται στο 20% (10). Ως εκ τούτου, είναι ΕΠΙΤΑΚΤΙΚΗ ΑΝΑΓΚΗ να διερευνηθούν και να επικυρωθούν εύκολα επαναλήψιμες μη επεμβατικές εξετάσεις, που να διακρίνουν το στάδιο της NASH από το απλό λιπώδες ήπαρ (NAFL). Για να πετύχουν οι έρευνες για μία μη επεμβατική μέθοδο ή εξέταση αναγνώρισης της NASH με ή χωρίς ίνωση, απαραίτητη είναι η αποσαφήνιση των σύνθετων μεταβολικών και φλεγμονωδών οδών που εμπλέκονται στην εξέλιξη της ΝΑFLD. Παρά τις πρόσφατες προόδους, η παθογένεια της στεάτωσης και η εξέλιξή της σε στεατοηπατίτιδα (NASH), ίνωση (ΝΑSH-ίνωση) και κίρρωση (NASH-ίνωση-κίρρωση), δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητή (4,5,17). Ενώ στεάτωση φαίνεται να συσχετίζεται με μία καλοήθη πρόγνωση, (4,18) παράγοντες που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην εξέλιξή της σε πιο προχωρημένη ασθένεια περιλαμβάνουν: τις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες/αδιποκίνες, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, οξειδωτικό stress (OS) και κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης (4,19). H ΝΑFLD αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ως η ηπατική εκδήλωση της αντίστασης στην ινσουλίνη (Ins) (4,5,19,20). H αντίσταση στην Ins προκαλεί μειωμένη καταστολή της λιπόλυσης ( λιπόλυση) του λιπώδους ιστού, οδηγώντας σε αυξημένη εκροή ελεύθερων λιπαρών οξέων (Free Fatty Acids: FFAs) από το λιπώδη ιστό στο ήπαρ (21). Η Υπερινσουλιναιμία επίσης προάγει την ηπατική de novo λιπονεογένεση που είναι αξιοσημείωτα αυξημένη σε ΝΑFLD ασθενείς, συγκρινόμενη με φυσιολογικά άτομα (22). Είναι πλέον αναγνωρίσιμο ότι τα FFAS προάγουν την αντίσταση στην Ins, το οξειδωτικό stress και τη φλεγμονή (4,23,24) και ως εκ τούτου αντί να είναι επιβλαβής η ηπατική συγκέντρωση τριγλυκεριδίων, μπορεί στην πραγματικότητα να είναι προστατευτική εμποδίζοντας τις βλαβερές συνέπειες των FFAs (25). O σημαντικός ρόλος των μηχανισμών του OS, προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών όπως ο TNF-α, IL-6 και οι αδιποκίνες όπως η λεπτίνη (προφλεγμονώδης κυτταροκίνη) και η αδιπονεκτίνη (αντιφλεγμονώδης και ευαισθητοποιός της 8 Σ ελίδα

13 Ins κυτταροκίνη), για την προώθηση της NASH, όλο και περισσότερο οριοθετείται (4,12,17,19). Όμως οι αποδείξεις ότι μόνο ένας μικρός πληθυσμός NAFL εξελίσσεται σε NASH-ίνωση, δείχνουν ότι η εξέλιξη της νόσου πιθανώς να εξαρτάται από μία πολύπλοκη αλληλεπίδραση ανάμεσα σε αυτούς τους παράγοντες και βαθύτερη γενετική προδιάθεση (4,17,19). Νέοι παθογενετικοί μηχανισμοί ΝΑFLD/ΝΑSH/ίνωσης που σχετίζονται με την ΛΙΠΟΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑ επί του ήπατος αναδεικνύονται και ίσως να μας δώσουν ενθαρρυντικά στοιχεία για τη μελέτη νέων μη επεμβατικών δεικτών που θα βοηθήσουν ουσιαστικά στην αναγνώριση του κινδύνου των ασθενών με ΝΑFLD να αναπτύξουν NASH και τις επιπλοκές της: NASH-ίνωση / κίρρωση / Η.K.K. (12). Κατά την τελευταία δεκαετία πολλές απλές βιοχημικές ή ορολογικές εξετάσεις, που αποτελούν δείκτες ινογένεσης ή νεκροφλεγμονώδους ηπατικής δραστηριότητας στον ορό, καθώς και απεικονιστικές εξετάσεις (υπέρηχο, αξονική τομογραφία, μαγνητικός συντονισμός κ.ά.) μεμονωμένες ή σε συνδυασμό, έχουν αξιολογηθεί ως υποκατάστατα της ηπατικής βιοψίας σε ΝΑFLD ασθενείς και έχουν δείξει ποικίλου βαθμού ακρίβεια σε σύγκριση με τη βιοψία ήπατος. Γενικά από τις μέχρι σήμερα μελέτες δεν έχει αποδειχθεί κάποιος μη επεμβατικός δείκτης που να είναι ικανός να αναγνωρίζει πρώιμα την ύπαρξη NASH, καθώς και των πρώιμων σταδίων (F1, F2) της NASH-ίνωσης. Οι μέχρι σήμερα υπό έρευνα βιοδείκτες είτε μεμονωμένοι, είτε ως μεταβλητές μέσα σε συνδυαστικά βαθμολογικά συστήματα (μαθηματικά-αλγοριθμικά μοντέλα ή πίνακες πολλαπλών μεταβλητών) που συνδυάζουν δημογραφικές, κλινικές και εργαστηριακές παραμέτρους (μεταβλητές), απέδειξαν γενικά μεγαλύτερη χρησιμότητα στην ανίχνευση προχωρημένης NASH-ίνωσης (F3) και κίρρωσης (F4), απ ότι πρωϊμότερης μορφής (F0, F1, F2) NASH-ίνωσης (10,11,15,16,26-29). Αυτό αντιπροσωπεύει έναν σημαντικό περιορισμό στη χρήση τους ως αξιόπιστη διαγνωστική εξέταση σε ΝΑFLD ασθενείς. Στην ιδανική περίπτωση η ανίχνευση της ίνωσης σε αρχικά στάδια, θα μπορούσε να επιτρέψει την καλύτερη θεραπευτική διαχείριση του ασθενούς, δηλαδή αλλαγή του τρόπου ζωής (σωματική άσκηση, διατροφικές συνήθειες) και την έναρξη κάποιας από τις αναδυόμενες θεραπευτικές αγωγές με σκοπό την αναστολή της εξέλιξης της νόσου σε κίρρωση (30). Επιπλέον η διάγνωση της NASH σε πρώιμη φάση θα μπορούσε να καταστεί πολύ ενδιαφέρουσα στο να παρακινήσει τον ασθενή για μία συνεπή και εντατική θεραπεία των επιπλοκών του μεταβολικού συνδρόμου (άριστη ρύθμιση ΣΔ ΙΙ, υπέρτασης, χειρουργική επέμβαση παχυσαρκίας όταν ενδείκνυται). Επίσης η έγκαιρη ανίχνευση της NASH σε πρώιμη φάση ινογένεσης και η θεραπευτική συνέπεια του ασθενούς, μειώνουν τις πιθανότητες να εμφανισθεί μια οξεία επί χρόνιας ηπατική ανεπάρκεια, πράγμα που μπορεί να συμβεί σε οποιαδήποτε χρόνια ηπατική νόσο (31). Τέλος η διάγνωση της σιωπηλής κίρρωσης έχει σημαντικές συνέπειες όσον αφορά την εκτίμηση των σημείων πυλαίας υπέρτασης (περιοδικές ενδοσκοπήσεις πεπτικού για τον έλεγχο κιρσών γαστροοισοφαγικά) και του Η.Κ.Κ. (περιοδικές μετρήσεις AFP ορού και υπέρηχο άνω κοιλίας). Έτσι προλαμβάνονται έγκαιρα οι επιπλοκές της ηπατικής ανεπάρκειας λόγω πυλαίας υπέρτασης, καθώς επίσης έχουμε μια έγκαιρη αναγνώριση της ύπαρξης ενδείξεων ηπατικές μεταμόσχευσης. Επομένως η ορθή μη επεμβατική ανίχνευση της προχωρημένης ίνωσης είναι το πρώτο βήμα για τη μείωση των μελλοντικών θανάτων που σχετίζονται με NASH/κίρρωση. Συμπερασματικά η έγκαιρη αναγνώριση μη επεμβατικών δεικτών ανίχνευσης της NASH, καθώς και του βαθμού ίνωσης (F0, F1, F2, F3, F4) επί ΝΑFLD ασθενών, είναι ζωτικής σημασίας για τη μείωση της πιο συχνής χρόνιας ηπατικής ασθένειας του ανεπτυγμένου κόσμου αυτή τη χρονική στιγμή. Επικύρωση των παρόντων μελετών σε μεγάλες πληθυσμιακές σειρές, καθώς και η εμβάθυνση στους αναδυόμενους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς της NASH και NASH - ίνωσης που θα οδηγήσει στην αναγνώριση νέων και ίσως πιο αξιόπιστων μη επεμβατικών δεικτών NASH ίνωσης, αποτελούν παρόντες ερευνητικούς στόχους παγκοσμίως. 9 Σ ελίδα

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ο ΟΡΙΣΜΟΣ Ως ΝΑFLD αναφέρονται όλες οι ιστολογικές αλλαγές της ηπατικής στεάτωσης (ΝΑFL), της ηπατοκυτταρικής φλεγμονής, νέκρωσης, οιδηματώδους εκφύλισης των ηπατοκυττάρων (ballooning ηπατοκύτταρα), σωμάτια Mallory (ΝΑSH) ή ίνωσης (NASH-ίνωση) που δεν προκαλούνται από κατάχρηση αλκοόλ (10,20).Ο ορισμός της κατάχρησης αλκοόλ γενικά θεωρείται η κατανάλωση αλκοόλ > 20 gr/ημέρα για τη γυναίκα και > 30 gr/ημέρα για τον άνδρα (10). Μολονότι η ηπατική στεάτωση μπορεί εύκολα να προσδιορισθεί με μελέτες απεικόνισης [Υπέρηχοι (US), αξονική τομογραφία (CT) ή εικόνες σάρωσης με μαγνητικό συντονισμό (MRI)], καμία μέθοδος απεικόνισης δεν είναι σήμερα σε θέση να ανιχνεύει λεπτές ιστολογικές μεταβολές της φλεγμονής και ηπατοκυτταρικής βλάβης που είναι χαρακτηριστικές της ΝΑSH. Επίσης δεν υπάρχουν κλινικά συμπτώματα ή σημεία καθώς και βιοχημικές ή άλλες αιματολογικές εξετάσεις που να τεκμηριώνουν τη σοβαρότητα της ΝΑFLD δηλαδή την ύπαρξη NASH-ίνωσης. Επομένως για τον ορισμό όλου του φάσματος της σοβαρότητας της ΝΑFLD, απαιτείται και σήμερα ηπατική βιοψία.. 10 Σ ελίδα

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ο ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΦΥΣΙΚΗ ΙΣΤΟΡΙΑ NAFLD Επίπτωση της NAFLD και NASH Η συχνότητα εμφάνισης της NAFLD δεν είναι σαφής. Υπάρχουν παγκοσμίως λίγες αναφορές με σημαντικές διαφορές στην επίπτωση της νόσου, σε διαφορετικούς πληθυσμούς (Εικόνα 1). Μια μελέτη που βασίζεται σε συνήθη συστήματα υγειονομικής περίθαλψης κρατών, ανέδειξε ότι στην Ιαπωνία η ολική επίπτωση της μη αλκοολικής υπερτρανσαμινασαιμίας είναι περίπου 31 περιπτώσεις / άτομα / έτος (32). Μια άλλη Ιαπωνική μελέτη, που παρακολούθησε άτομα που δεν είχαν NAFLD κατά την έναρξη της μελέτης, αναφέρει ότι ανέπτυξαν NAFLD το 10% μέσα σε μια χρονική παρακολούθηση πάνω από 414 ημέρες (33) Μια πιο πρόσφατη μελέτη ασθενών που παρακολουθήθηκαν σε εξωτερικό ηπατολογικό Ιατρείο της Αγγλίας, αναφέρει ότι η επίπτωση της NAFLD είναι 29 περιπτώσεις / άτομα / έτος (34). Η σαφής διαφορά ανάμεσα σε αυτά τα ποσοστά μελετών, δείχνει ότι για να γίνει με σαφήνεια γνωστή η ακριβής επίπτωση της NAFLD παγκοσμίως απαιτούνται επιπλέον μελέτες. Εικόνα 1: Επίπτωση NAFLD στον γενικό πληθυσμό Aliment Pharmacol Ther 2011; 34: (34) Περιπτώσεις NAFLD/ /έτοs 11 Σ ελίδα

16 Επικράτηση της NAFLD και NASH Ο επιπολασμός της NAFLD στον γενικό πληθυσμό έχει εκτιμηθεί με μια ποικιλία διαγνωστικών εργαλείων (Εικόνα 2). Εικόνα 2 : Επιπολασμός της NAFLD ανάλογα με τον τρόπο εκτίμησής της. Aliment Pharmacol Ther 2011; 34: (34) Η βιοψία ήπατος, που αποτελεί ακόμα και σήμερα το πιο επικυρωμένο διαγνωστικό «εργαλείο» για την διάγνωση της NAFLD, την αναγνώριση του βαθμού φλεγμονής (NASH), καθώς και την σταδιοποίηση της ίνωσης (NASH-ίνωση), είναι μια επεμβατική μέθοδος και δεν μπορεί να χρησιμοποιείται σε μελέτες που βασίζονται σε πληθυσμούς. Ωστόσο τα ευρήματα της βιοψίας ήπατος, έχουν χρησιμοποιηθεί για την αναγνώριση του επιπολασμού της NAFLD σε δότες μεταμόσχευσης ήπατος που θεωρούνται ότι είναι σε καλή υγεία (35). Μια Κορεάτικη μελέτη, στην οποία πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές βιοψίες ήπατος σε 589 πιθανούς δότες ηπατικού μοσχεύματος, αναφέρει ότι η επικράτηση της NAFLD κυμαινόταν στο 51% (36). Στις ΗΠΑ οι ηπατικές βιοψίες που πραγματοποιούνται σε δυνητικούς δότες ηπατικού μοσχεύματος, ανέδειξαν ότι το 20% των δοτών ήταν μη επιλέξιμοι γα δωρεά οργάνων λόγω βαθμού στεάτωσης του ήπατος > 30%. Νεκροψίες σε 423 ιπτάμενους επιβεβαίωσαν 66 κρούσματα λιπώδους ήπατος (16%) εκ των οποίων μόνο 11 (3%) ήταν συμβατά με κατάχρηση αλκοόλ (37). Μια άλλη μελέτη από την Ινδία αναφέρει ότι σε ενήλικα άτομα που υπέστησαν νεκροψία ήπατος, τα 195 (16%) είχαν λιπώδες ήπαρ (38). Μόνο όμως το 5% αυτών των ασθενών ήταν παχύσαρκοι και τα υψηλά επίπεδα κατανάλωσης αλκοόλ συνδεόταν με λιπώδες ήπαρ. Έτσι μια μεγάλη αναλογία αυτών των ασθενών μπορεί να μην πληρούσαν τα κριτήρια για NAFLD. Σε μια άλλη σειρά από τον Καναδά, που περιελάμβανε αδύνατα άτομα που υπέστησαν νεκροψία, η επικράτηση της NASH και της NASH ίνωσης ήταν 3% και 7% αντιστοίχως (39). Τέλος μια μελέτη από την Ελλάδα αποκάλυψε στεάτωση στο 31% και NASH στο 40% των νεκροψιών που έγιναν για ισχαιμική καρδιακή νόσο ή για τροχαία ατυχήματα, μετά από αποκλεισμό της οροθετικής HBV λοίμωξης ή άλλης γνωστής ηπατικής νόσου (40). Είναι ενδιαφέρον ότι η επικράτηση της NASH στην Ελλάδα φαίνεται να είναι πολύ υψηλότερη απ ότι σε άλλες πληθυσμιακές μελέτες (40). Αυτό οι συγγραφείς το αποδίδουν σε μειωμένη φυσική δραστηριότητα και μεταβολές στις διατροφικές συνήθειες στον Ελληνικό πληθυσμό κατά τις τελευταίες δεκαετίες. Γενικά στην Ελλάδα υπολογίζεται ότι ο επιπολασμός της NAFLD κυμαίνεται στο 15 20% του πληθυσμού (17,6% σε μελέτες αιμοδοτών). Εκτός από την ηπατική βιοψία, αρκετές άλλες μη επεμβατικές διαγνωστικές μέθοδοι για NAFLD και NASH, έχουν εισαχθεί πρόσφατα. Όμως, είναι λιγότερο καθοριστικές σε σχέση με τις εκτιμήσεις επιπολασμού της NAFLD και NASH που βασίζονται σε ιστολογικά δείγματα ηπατικών βιοψιών και νεκροψιών. Από την άλλη πλευρά επειδή οι μη επεμβατικές μέθοδοι μπορούν εύκολα να εφαρμοστούν σε μεγάλες πληθυσμιακές ομάδες, εύκολα εξάγονται σημαντικά συμπεράσματα τόσο επιδημιολογικά όσο και για την κλινική πορεία της νόσου. 12 Σ ελίδα

17 Οι μη επεμβατικές απεικονιστικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση του επιπολασμού του Λιπώδους Ήπατος είναι η MRI (Magnetic Resonance Imaging) και το Υπερηχογράφημα άνω κοιλίας. Σε μια πρόσφατη πολυκεντρική μελέτη πληθυσμού της Ισπανίας, που έλαβαν μέρος ασθενείς τυχαία επιλεγμένοι από 25 κέντρα πρωτοβάθμιας περίθαλψης, διαπιστώθηκε ότι η επικράτηση την NAFLD υπερηχογραφικά ήταν 33% στους άνδρες και 20% στις γυναίκες (41). Στην μελέτη Διόνυσος, μέσω υπερηχογραφικού ελέγχου φάνηκε ότι η επικράτηση της NAFLD στον Ιταλικό πληθυσμό με υποψία ηπατικής νόσου, ήταν 25% ενώ χωρίς υποψία ηπατικής νόσου η επικράτηση της NAFLD ήταν 20% (42). Μια άλλη μελέτη από την Ιαπωνία, δείχνει ότι σε μια χρονική περίοδο ετών παρακολούθησης υπερηχογραφικά Ιαπώνων, η επικράτηση της NAFLD αυξήθηκε από το 13% στο 30% (43). Στην Ινδία η επικράτηση της NAFLD-μέσω υπερήχων καθορίζεται στο 17% (44). Μια άλλη μελέτη σε ένα στρατιωτικό Ιατρικό κέντρο, ανέδειξε υπερηχογραφική επικράτηση της NAFLD στο 46% των ατόμων, η οποία επιβεβαιώθηκε με βιοψία ήπατος στο 12% της συνολικής ομάδας των συμμετεχόντων ή στο 30% των ατόμων που είχαν υπερηχογραφική επιβεβαίωση της NAFLD (45). Αν και λιγότερο συχνά εφαρμόζεται ο μαγνητικός συντονισμός (MR) από το υπέρηχο, προς καθορισμό της επικράτησης της NAFLD σε μεγάλες πληθυσμιακές μελέτες, εντούτοις σε μια μεγάλη μελέτη σε πολυεθνικό πληθυσμό στο Ντάλας των ΗΠΑ φάνηκε ότι η MR Spectroscopy (MR φασματοσκοπία) δίνει επιπολασμό 34% για την NAFLD στον γενικό πληθυσμό (46). Άλλες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τις αμινοτρανσφεράσες ορού (AST, ALT), ως μη επεμβατικούς δείκτες NAFLD. Τα δεδομένα από την υπηρεσία Υγείας και Διατροφής των ΗΠΑ, χρησιμοποιώντας την ιδιοπαθή αύξηση των ηπατικών ενζύμων ALT και AST σε εξετάσεις των Αμερικάνων Πολιτών από το , έδειξαν αύξηση ALT (7%) και AST (4%) ή είτε ALT ή AST (8%) στους συμμετέχοντες (47). Αντίθετα για το προηγούμενο χρονικό διάστημα , η ιδιοπαθής αύξηση της ALT ήταν στο 3% των συμμετεχόντων (48). Φαίνεται 3πλασιασμός της NAFLD επικράτησης μέσα σε μερικά χρόνια ( σε μια 10ετία) όταν σαν δείκτης διάγνωσης NAFLD χρησιμοποιούνται οι αμινοτρανσφεράσες ορού. Μια άλλη πολύ σημαντική μελέτη του Johns Hopkins Νοσοκομείου των ΗΠΑ, μέσω μια αναδρομικής εκτίμησης των τιμών αμινοτρανσφερασών ορού (επίπεδα AST σε άτομα και επίπεδα ALT σε από αυτά τα άτομα), ανέδειξε ιδιοπαθή αύξηση των ηπατικών ενζύμων στο 14% των NAFLD ασθενών που είχαν τουλάχιστον μια τιμή ALT, AST και στο 21% των NAFLD ασθενών που είχαν τουλάχιστον δύο τιμές AST, ALT (49). Γενικά στις περισσότερες μελέτες που χρησιμοποιούν την ιδιοπαθή άνοδο AST ή ALT προς καθορισμό του επιπολασμού της NAFLD, φαίνεται ο επιπολασμός να κυμαίνεται στο 8 9% (50,51). Όταν λαμβάνονται υπόψη τα αποτελέσματα των μελετών που χρησιμοποιούν τις τιμές AST, ALT ορού ως ένα υποκατάστατο για την πρόβλεψη της επικράτησης της NAFLD στον πληθυσμό, είναι σημαντικό να έχουμε κατά νου τα ανώτερα φυσιολογικά όρια (ULN: upper limit normal) των τιμών ALT ορού, γιατί έχουν αμφισβητηθεί πρόσφατα και φαίνεται να σχετίζονται με το φύλο (51-53). Είναι σημαντικό να τονισθεί ότι αν και γενικά αυξημένα επίπεδα ALT ορού συνδέονται με ιστολογική διάγνωση NASH, ένας αριθμός ασθενών με φυσιολογικά επίπεδα ALT μπορεί επίσης να έχει NAFLD με πιο προχωρημένη ίνωση. Επομένως η δραστηριότητα της ALT από μόνη της, δεν αρκεί για να χρησιμοποιηθεί προς αποκλεισμό σημαντικής ηπατικής νόσου σε ασθενείς που υποψιαζόμαστε ότι έχουν NAFLD, ειδικά σε εκείνους με Σ.Διαβήτη τύπου ΙΙ (ΣΔ ΙΙ) ή ηπατομεγαλία (54). Από τις παραπάνω αναφορές φαίνεται ότι τα ποσοστά επικράτησης της NAFLD ποικίλουν, ανάλογα με το ποια μεθοδολογία χρησιμοποιείται για να ορίσουμε ότι κάποιο άτομο πάσχει από αυτήν τη νόσο. Για παράδειγμα στις ΗΠΑ όταν χρησιμοποιείται η βιοψία ήπατος ως μέθοδος διάγνωσης της NAFLD, τότε φαίνεται ένας επιπολασμός της NAFLD σε υγιείς δότες 20% (θεωρώντας ότι υπάρχει NAFLD εάν το ηπατικό μόσχευμα έχει στεάτωση >30%) (36). Ενώ μελέτες που χρησιμοποιούν MR φασματοσκοπία, αναφέρουν επιπολασμό NAFLD στον γενικό πληθυσμό ενηλίκων του Ντάλας στο Τέξας 34% (50). Μελέτες που χρησιμοποιούν ιδιοπαθείς αυξήσεις των ηπατικών ενζύμων (ALT, AST) για τον καθορισμό των ασθενών με NAFLD, αποδίδουν μια ευρεία επικράτηση της νόσου κυμαινόμενη από 8 75% (47,50). Όταν χρησιμοποιήθηκε ένα από τα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου και συγκεκριμένα ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου ΙΙ (ΣΔΙΙ), φάνηκε ότι η στεάτωση ήταν παρούσα στο 70% των ασθενών μιας μεγάλης επιλεγμένης ομάδος ασθενών με ΣΔΙΙ (55). Γενικά φαίνεται ότι όλο το φάσμα της NAFLD από την απλή ηπατική στεάτωση έως την NASH με τις ιστολογικές αλλαγές της ηπατικής φλεγμονής, νέκρωσης και βλάβης των ηπατοκυττάρων, επηρεάζει συνολικά το 9 30% των ανθρώπων στις αναπτυσσόμενες και ανεπτυγμένες χώρες αντιστοίχως, καθιστώντας την NAFLD ως την συχνότερη πάθηση του ήπατος στον κόσμο (13). 13 Σ ελίδα

18 Εικόνα 3 Παγκόσμια επικράτηση της NAFLD Aliment Pharmacol Ther 2011; 34: (34) Μάλιστα φαίνεται ότι στον Δυτικό πληθυσμό ο επιπολασμός της NAFLD τείνει να αυξάνει από το 20 30% στο 90% όταν πρόκειται για άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία (13,54,56). Εκτιμάται ότι το 15 20% του πληθυσμού της Δυτικής Ευρώπης έχει στεάτωση, ενώ περισσότερο από το ½ των Αμερικανών είναι υπέρβαροι ή παχύσαρκοι. Φαίνεται δε ότι η NAFLD θίγει οποιαδήποτε ηλικία. Μελέτες έχουν δείξει ότι στους παιδιατρικούς πληθυσμούς, NAFLD παρατηρείται στο 3% του γενικού παιδικού πληθυσμού, με αύξηση στο 53% σε παχύσαρκα παιδιά με σημαντικές συνέπειες για την μελλοντική εξάπλωση της νόσου (57). Στην Αμερική η επικράτηση της NAFLD στην εφηβική και προεφηβική ηλικία είναι περίπου 9,6%, ενώ σε άτομα ηλικίας ετών η επικράτηση είναι στο 34%, επειδή ένας στους δύο Αμερικάνους είναι παχύσαρκος (50).Οι περισσότερες μελέτες συμφωνούν ότι η παχυσαρκία όπως και πολλά άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου, συνδέονται με NAFLD (44,50,51,52,53,54,58-67) με εξαίρεση μελέτες που προέρχονται κυρίως από την Ασία, που συχνά αναφέρουν NAFLD σε μη παχύσαρκους πληθυσμούς (34,43,68-75) (Εικόνα 3). Επομένως η NAFLD με όλο το ιστολογικό της φάσμα, φαίνεται να επηρεάζει όλες τις εθνότητες παρ όλο που ο επιπολασμός της φαίνεται να είναι υψηλότερος σε Ισπανόφωνους και προερχόμενους από την Ευρώπη Αμερικανούς, συγκρινόμενους με Αφρό Αμερικανούς (34) (Εικόνα 3). Αυτή η διαφορά παραμένει και μετά τον έλεγχο για την αντίσταση στην Ins και την παχυσαρκία (4,43,46) και μπορεί να συσχετίζεται με εθνικές διαφορές στον μεταβολισμό των λιπιδίων. (4,43,46) Η NASH που αποτελεί την πιο προηγμένη και κλινικά σημαντική μορφή της NAFLD, είναι λιγότερο συχνή με εκτιμώμενη επικράτηση 2 3% στον γενικό πληθυσμό (1) και 37% σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία (4,34). Δεδομένου ότι ο όρος NASH επινοήθηκε για πρώτη φορά από τους Ludwing et al το 1980 (76), ο επιπολασμός της NASH έχει αυξηθεί με ταχείς ρυθμούς παράλληλα με την δραματική αύξηση των επιπέδων του πληθυσμού της παχυσαρκίας και του ΣΔΙΙ. Έτσι πλέον σήμερα η NASH, ως η σοβαρότερη μορφή της NAFLD, αντιπροσωπεύει την πιο κοινή αιτία χρόνιας ηπατικής νόσου στον Δυτικό κόσμο, με την δυνατότητα να οδηγήσει σε σοβαρή νοσηρότητα και θνητότητα. Σε μια 10ετή παρακολούθηση ο Matteoni et al (77), έδειξαν ότι κίρρωση αναπτύσσεται στο 21 29% των ασθενών στους οποίους η βιοψία ήπατος έδειξε NASH με την ιστολογική μορφή συνδυασμού βλαβών στεάτωσης, φλεγμονής, οιδηματώδους εκφύλισης των ηπατοκυττάρων (ballooning ηπατοκύτταρα), σωμάτια Mallory s ή ίνωσης. Ενώ μόνο το 4% των ασθενών με στεάτωση και ηπατική φλεγμονή και κανείς από τους ασθενείς με απλή στεάτωση αναπτύσσουν κίρρωση. Η NASH Clinical Research Network (NASH CRN), δηλαδή η ομάδα εργασίας για την κλινική έρευνα της NASH στην Αμερική, διαμορφώθηκε για την διεξαγωγή πολυκεντρικών μελετών σχετικών με την επιδημιολογία, φ.ιστορία, αιτιολογία και θεραπεία (Tx) της NASH, επειδή οι μέθοδοι διάγνωσής της παρουσιάζουν ποικιλομορφία στις διάφορες μελέτες και η βιοψία ήπατος δεν είναι πάντα εφικτή (14). Η ομάδα NASH CRN πραγματοποίησε μία μελέτη όπου συμμετείχαν ενήλικες μεταξύ του Για να συσχετισθούν τα ιστολογικά 14 Σ ελίδα

19 ευρήματα με τα επιδημιολογικά, κλινικά και εργαστηριακά, οι μετρήσεις επικυρώθηκαν σε 698 άτομα της μελέτης που είχαν βιοψία ήπατος. Συγκρίνοντας την ομάδα ασθενών που δεν είχε βιοψία, φάνηκε ότι οι βιοψίες γινόταν σε άτομα που υπήρχε ελαφρώς η προκατάληψη ότι θα έχουν NASH ίνωση όπως άτομα με αυξημένο επιπολασμό ΣΔΙΙ, υπέρταση, αυξημένη ηλικία και κίρρωση. Γενικά όμως, συνολικά η ομάδα ασθενών που μελετήθηκε από την NASH CRN είχε παρόμοια χαρακτηριστικά με άλλες μεγάλες ομάδες ασθενών με NAFLD. Ένα από τα κύρια επιδημιολογικά συμπεράσματα που είχαμε από αυτήν την μελέτη της NASH CRN ομάδος ήταν ότι όταν η NAFLD είναι παρούσα, NASH συνυπάρχει στο 10 30%. Η NASH επί των NAFLD ασθενών τεκμηριώθηκε με βιοψία. Παράγοντες κινδύνου για NAFLD και NASH: προδιαθεσικοί, δημογραφικοί και κλινικοί παράγοντες Ηλικία Η επικράτηση της NAFLD και NAFLD ίνωσης αυξάνει με την ηλικία (45,78). Στις περισσότερες μελέτες αυτό φαίνεται να συσχετίζεται με το ότι οι μεγαλύτεροι σε ηλικία ασθενείς ( 50 έτη), είχαν σημαντικά περισσότερους παράγοντες κινδύνου ανάπτυξης NAFLD όπως υπέρταση, παχυσαρκία, ΣΔΙΙ και υπερτριγλυκεριδαιμία. Μια άλλη όμως μελέτη (79) ενώ ανέφερε επιπολασμό της NAFLD σε ηλικιωμένους ασθενείς 46% που είναι μεγαλύτερος από τον επιπολασμό στον γενικό πληθυσμό, εντούτοις δεν έδειξε συσχέτιση μεταξύ NAFLD και μεταβολικού συνδρόμου, καρδιαγγειακού κινδύνου ή κίρρωσης. Οι συγγραφείς προτείνουν ότι η παθογένεια της NAFLD μπορεί να μεταβάλλεται στους ηλικιωμένους. Εκτός από την σύνδεση μεταξύ της ηλικίας και της NAFLD επικράτησης, οι ηλικιωμένοι ασθενείς με NAFLD έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα εξέλιξης της νόσου ή θνητότητας (83). Η μεγαλύτερη ηλικία αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης σχετικών προβλημάτων όπως σοβαρή ηπατική ίνωση, ηπατοκυτταρικό καρκίνο και ΣΔΙΙ (80-82). Μελέτες έχουν δείξει ότι η «κρυψιγενής» λεγόμενη κίρρωση, που θεωρείται πλέον επακόλουθο της «καμένης NASH», είναι πιο συχνή σε ηλικιωμένους διαβητικούς ασθενείς με τρέχουσα ή στο παρελθόν παχυσαρκία (83). Από την άλλη πλευρά, οι νεότεροι ασθενείς συνδέονται με υψηλότερες τιμές ALT δραστηριότητας (48) καθώς και με συχνότερη ύπαρξη ηπατικής στεάτωσης(84).σε αντίθεση με αυτές τις μελέτες ο Hui et al δεν επισημαίνουν σημαντικές διαφορές στην ηλικία ανάμεσα σε άτομα με εξελισσόμενη NAFLD και εκείνους που δεν έχουν εξελικτική ηπατική νόσο(85). Εν ολίγοις, η σχέση μεταξύ της ηλικίας, NAFLD και ίνωσης παραμένει έκρυθμη. Είναι άξιο να σημειωθεί ότι η συσχέτιση ανάμεσα στην ηλικία και την υψηλότερη επικράτηση της NAFLD, καθώς και το υψηλότερο στάδιο ίνωσης και κίρρωσης, μπορεί να συσχετίζονται με την διάρκεια της νόσου μάλλον απ ότι με την ηλικία από μόνη της. Γένος Η NAFLD αρχικά θεωρείτο ότι συνδέεται περισσότερο με το γυναικείο φύλο ( ). Αυτό όμως δεν έχει επαληθευθεί (20,77,86). Το άρρεν φύλο ( ) φάνηκε να συνδέεται με αυξημένα επίπεδα αμινοτρανσφερασών ορού, την παρουσία ιστολογικά NASH, ηπατικής ίνωσης και αυξημένης θνητότητας σε NAFLD ασθενείς (87-89). Μόνο λίγες μελέτες έδειξαν ότι φύλο συνδεόταν με NAFLD και ίνωση (90,91) και μια μελέτη ανέφερε ότι το φύλο αποτελεί έναν ανεξάρτητο παράγοντα για NASH σε ασθενείς με μεταβολικό σύνδρομο (90-92). Λαμβάνοντας υπ όψιν αυτές τις διαφορές, είναι πιθανόν ότι η NAFLD συμπεριφέρεται διαφορετικά στις γυναίκες και στους άνδρες. Μερικοί ειδικοί προτείνουν ότι τα ανώτερα φυσιολογικά όρια της ALT δραστηριότητας στις γυναίκες (ULN: upper limit normal) που είναι (ULN 30 U/l), θα πρέπει να μειωθούν σε ULN 19 U/L(52,53). Μία πρόσφατη μελέτη από τους Kunde et al (90) συνέκρινε τα παλιά και τα νέα όρια (ULNs) για τις αμινοτρανσφεράσες. Σύμφωνα με τα παλαιά όρια (ULN 30 U/l), η επικράτηση της αυξημένης ALT ήταν 28% σε με τάξης ΙΙ/ΙΙΙ παχυσαρκίας. Αυτό το ποσοστό αυξήθηκε στο 63% με την νέα τιμή ορίων ALT (ULN 19 U/l). Παρ όλα αυτά ο επιπολασμός NAFLD και NASH σε ασθενείς με φυσιολογικές τιμές ALT ήταν παρόμοιος ανεξάρτητα από τα ULNs. Παρόμοιες μελέτες, που εκτιμούν διαφορετικά ανώτερα φυσιολογικά όρια αμινοτρανσφερασών δεν υπάρχουν. Χρειάζονται μεγάλες πληθυσμιακές μελέτες προς επίλυση αυτού του ερωτήματος. 15 Σ ελίδα

20 Φυλή και Εθνικότητα Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι ο επιπολασμός της NAFLD διαφέρει ανάλογα με την φυλή και την εθνικότητα. Ισπανόφωνοι έχουν την υψηλότερη NAFLD επικράτηση, ηπατική στεάτωση και αυξημένες αμινοτρανσφεράσες ορού. Ακολουθούν οι μη Ισπανόφωνοι λευκοί και το χαμηλότερο ποσοστό αναφέρεται σε Αφρο Αμερικάνους. Τέλος η επικράτηση της NAFLD σε Ινδιάνους που ζουν στην Αμερική και σε αυτόχθονες πληθυσμούς της Αλάσκας, κυμαίνεται από 0,4% έως 2%(34). Επί απουσίας ηπατικής βιοψίας η επικράτηση της NAFLD πιθανώς υποτιμάται. Η εξήγηση για τις Εθνικές διαφορές στον επιπολασμό της NAFLD δεν είναι σαφής. Η έκταση του σπλαχνικού λίπους είναι παρόμοια σε διάφορες εθνικές ομάδες. Τα επίπεδα αδιπονεκτίνης ορού συνδέονται μόνο με NAFLD σε Αφροαμερικάνους ενώ η ηλικία, TG (τριγλικερίδια ορού) και ο αναστολέας-1 του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (ΡΑI 1:Plasminogen activator inhibitor-1), συνδέονται μόνο με NAFLD σε Ισπανόφωνους. Η παρουσία ή όχι NAFLD μπορεί να επηρεασθεί από σημαντικές και ακόμα άγνωστες συσχετίσεις γενετικών ή περιβαλλοντικών παραγόντων(34,92). Στην εποχή της ιατρικής του γονιδώματος, είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι πρόσφατα στοιχεία συνδέουν τα δεδομένα γονοτυπικής ανάλυσης με την επιδημιολογία της NAFLD. Η παρατηρούμενη οικογενειακή ομαδοποίηση της NAFLD (34,93-95) υποστηρίζει ότι μπορεί να επηρεάζεται από γενετικές παραλλαγές. Μελέτες σε μεγάλες οικογενειακές ομάδες δείχνουν ότι η κληρονομικότητα της ηπατικής στεάτωσης είναι περίπου στο 27%(93). Η πιο σημαντική γενετική συμβολή στην NAFLD είναι η Ι148Μ αλληλομορφία του PNPLA3 γονιδίου, που κωδικοποιεί την adiponutrin (μία πρωτεΐνη που σχετίζεται με τον ηπατικό μεταβολισμό του λίπους). Σε ομοζυγώτες αυτής της αλληλομορφίας του PNPLA3 γονιδίου, το ηπατικό λίπος είναι περισσότερο από το διπλάσιο από αυτό που υπάρχει στους μη φορείς(94). Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτή η αλληλομορφία είναι πιο διαδεδομένη σε Ισπανόφωνους (49%), που αποτελεί την πιο επιρρεπή εθνική ομάδα σε NAFLD, ενώ οι χαμηλότερες συχνότητες παρατηρήθηκαν σε Καυκάσιους (23%) και σε Αφροαμερικανούς (17%). Σε άτομα χωρίς ηπατική στεάτωση η ίδια αλληλομορφία, προδιαθέτει σε μια αύξηση της τάξης του 28% στα επίπεδα της ALT.Επιπλέον NASH πιο συχνά παρατηρείται σε Ι148Μ ομοζυγώτες (odds ratio OR:3,488). Μια άλλη παραλλαγή του ίδιου γονιδίου η PNPLA3 S453I, που είναι συχνή σε Αφροαμερικανούς (10,4%) αλλά σπάνια σε Αμερικάνους προερχόμενους από Ευρώπη (0,3%) και Ισπανούς (0,8%), συνδέεται με σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά συγκέντρωσης λίπους στο ήπαρ. Μια ανάλυση παλινδρόμησης (regression analysis) στην στατιστική, δείχνει ότι αυτές οι δύο παραλλαγές της γονιδιακής αλληλουχίας ευθύνονται για το 72% των παρατηρούμενων εθνικών διαφορών στην περιεκτικότητα ηπατικού λίπους στους ασθενείς της μελέτης που κατέληξε σε αυτό το συμπέρασμα. Επιπλέον επανεκτίμηση της PNPLA3 γονιδιακής αλληλουχίας σε άτομα με ασυνήθιστα υψηλά επίπεδα λίπους στο ήπαρ, αποκάλυψε τρεις περιπτώσεις ανενεργών (null) μεταλλάξεων που συμπίπτει με την ιδέα ότι η απώλεια της λειτουργικότητας του PNPLA3 γονιδίου ευθύνεται για την ηπατική στεάτωση. Μια πρόσφατη μελέτη όλου του εύρους του γονιδιώματος, σε άτομα που υπέστησαν CT προς ανίχνευση ηπατικής στεάτωσης και η αναπαραγωγή της σε 592 άτομα με ιστολογικά διαγνωσμένη NAFLD, επιβεβαίωσαν την σημασία των παραλλαγών του PNPLA3 γονιδίου ως προς τον βαθμό συσσώρευσης λίπους στο ήπαρ(94). Επιπλέον οι γενετικές παραλλαγές σε NCAN, GCKR και LYPLA1 γονίδια, συμβάλλουν σημαντικά στην NAFLD(109). Το GCKR έχει επίσης αναγνωρισθεί ως ένα γονίδιο που σχετίζεται ανεξάρτητα με NAFLD σε Κινέζους(95). Αρκετές άλλες γενετικές ποικιλίες έχουν αναγνωρισθεί, μολονότι υπάρχουν ακόμα λίγες πειστικές αποδείξεις. Μεταβολικές συνθήκες Η NAFLD είναι πιο διαδεδομένη σε ομάδες ασθενών με προϋπάρχοντα προβλήματα του μεταβολισμού απ ότι στον γενικό πληθυσμό. Συγκεκριμένα φαίνεται ότι ο ΣΔΙΙ και η NAFLD έχουν μία ιδιαίτερα στενή σχέση. Άτομα με ΣΔΙΙ έχουν υπερηχογραφικά επιπολασμό NAFLD 69%(96,97). Η NAFLD σχετίζεται με την παχυσαρκία, υπεριτριγλυκεριδαιμία και σε υψηλό ποσοστό με φυσιολογικά επίπεδα ALT ορού. Ωστόσο καμία συσχέτιση δεν έχει ακόμα αποδειχθεί μεταξύ διαβητικών επιπλοκών ή ελέγχου γλυκόζης ορού και της παρουσίας υπερηχογραφικά NAFLD(96). Εκτός από έναν υψηλό επιπολασμό NAFLD σε διαβητικούς, η ηπατική νόσος μπορεί να είναι πιο εξελικτική σε ασθενείς με ΣΔΙΙ. Φαίνεται ότι ο επιπολασμός της NASH αυξάνει παράλληλα με τα συστατικά του μεταβολικού συνδρόμου.είναι σημαντική η 16 Σ ελίδα

21 παρατήρηση ότι NASH ίνωση παρατηρείται συχνά σε διαβητικούς ασθενείς χωρίς συμπτώματα, σημεία ή διαταραχές των ηπατικών ενζύμων. Πρόσφατα το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PLOS: Polycystic ovarian syndrome) προτάθηκε σαν μια εκδήλωση του μεταβολικού συνδρόμου από τις ωοθήκες(113,114). Τα ποσοστά ανάπτυξης ηπατικής στεάτωσης σε γυναίκες με PLOS, κυμαίνονται από 41 55%(114,115,116). Φαίνεται ότι PLOS ασθενείς είναι σε αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη NAFLD NASH(117). Παχυσαρκία Όπως προαναφέραμε ο επιπολασμός της απλής στεάτωσης σε παχύσαρκα άτομα κυμαίνεται από 30 37% και της NAFLD από 57 98% (98-101). Είναι αξιοσημείωτο ότι η παχυσαρκία αποτελεί έναν επιπρόσθετο παράγοντα προς άλλους παράγοντες που προδιαθέτουν σε ηπατική στεάτωση. Για παράδειγμα σε πότες η παχυσαρκία αυξάνει στο διπλάσιο τον κίνδυνο για στεάτωση(102). Με δεδομένο την «επιδημία» παχυσαρκίας στην εποχή μας, η βαριατρική χειρουργική είναι μία από τις ραγδαία αναπτυσσόμενες χειρουργικές επεμβάσεις. Κατά την τελευταία δεκαετία, βιοψίες ήπατος διεγχειρητικές, δείχνουν ότι υπάρχει υψηλός επιπολασμός NAFLD και NASH σε σοβαρή και νοσογόνο (BMI 35kg/m 2 ) παχυσαρκία( ). Η μέση επικράτηση της NASH στον παχύσαρκο πληθυσμό είναι 33% κυμαινόμενη από 10 56%(34, ). Ο επιπολασμός της ίνωσης σε παχύσαρκους ασθενείς εξαρτάται από τον τύπο της ίνωσης. 67% των ασθενών με γαστρική χειρουργική παράκαμψη είχαν πυλαία ίνωση, αλλά μόνο το 4% των ασθενών με βαριατρική χειρουργική επέμβαση είχαν περικολποειδική ίνωση( ). Χρόνιες Λοιμώξεις και άλλες καταστάσεις που σχετίζονται με το λιπώδες ήπαρ Μολονότι δεν θεωρούνται ειδικές, ένα μέρος των ασθενών με NAFLD μπορεί να έχουν μια σειρά από χρόνιες λοιμώξεις. Στην πραγματικότητα ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV) φαίνεται να επιδεινώνει το μεταβολικό σύνδρομο, αυξάνοντας την αντίσταση στην Ιns(111). Στεάτωση είναι παρούσα σχεδόν στο 50% των ασθενών με χρόνια HCV λοίμωξη και συνδυάζεται συχνά με παρουσία HCV γονότυπου 3..Εκτός από τους HCV ασθενείς, μια σχετικά υψηλή επικράτηση της NAFLD εμφανίζεται σε HIV ασθενείς ειδικά σε αυτούς που θεραπεύονται με υψηλής δραστικότητας αντιρετροϊκη θεραπεία (ΗΑΑRT: Highly Active Anti Retroviral Therapy) ή HIV ασθενείς με λιποδυστροφία(112,113). Εκτός από την χρόνια HCV και HIV λοίμωξη, ασθενείς με πρωτογενή υπεραλδοστερονισμό και μυοτονική δυστροφία, μπορεί επίσης να έχουν υψηλό επιπολασμό του λιπώδους ήπατος(114,115).είναι σημαντικό να τονιστεί ότι εντός αυτών των πληθυσμών, πολλοί ασθενείς βρίσκονται σε κίνδυνο για μεταβολικές συνθήκες [αντίσταση στην Ins, παχυσαρκία, αυξημένος δείκτης μάζας σώματος (ΒΜΙ), αυξημένα τριγλυκερίδια και χαμηλά HDL επίπεδα] που προδιαθέτουν σε λιπώδες ήπαρ. 17 Σ ελίδα

22 ΦΥΣΙΚΗ ΙΣΤΟΡΙΑ Λιπώδες ΗΠΑΡ 10,5-15% NASH 15-30% ~25% Αντίσταση στην Ins (Συστηματική και ηπατική απευαισθητοποίηση των οδών σηματοδότησης της Ins) Φλεγμονή (Διαταραχή στην Έκφραση κυτταροκινών, Οξειδωτικό στρες,ηπατοκυτταρική Λιπο-απόπτωση) ΙΝΩΣΗ Διαιώνιση βλάβης και ινογένεση (Ενεργοποίηση Hepatic Stellate cells(hscs), Διαστολή προγονικών κυττάρων) Ναι, αλλά?% ~2 5%yr ΚΙΡΡΩΣΗ ~2 3%yr Η.Κ.Κ. Επίταση πολ/μου επιθηλίων/αναδιοργάνωση (Αδρανοποίηση ογκο-κατασταλτικών γονιδίων, απώλεια ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, διέγερση της ανάπτυξης του επιθηλίου από την υπερινσουλιναιμία) Εικόνα 4Το φάσμα της NAFLD: Η NAFLD περιλαμβάνει διαφορετικά στάδια, με ανά στάδιο διαφορετικούς παράγοντες κινδύνου και παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς. Journal of Gastroenterology and Hepatology 2013; 28 (Suppl. 1): (116) Μελέτες από τριτοβάθμια κέντρα περίθαλψης με βάση τα δεδομένα του αρχείου των ασθενών και τα δεδομένα των κοινοτήτων για τον πληθυσμό, αναφέρουν ότι η ηπατική νόσος είναι η τρίτη κύρια αιτία θανάτου ανάμεσα σε ασθενείς με NAFLD. Σε μια έκθεση, με βάση τα δεδομένα της κοινότητας των ασθενών με NAFLD από την Minnesota, η θνησιμότητα ήταν 13% μετά από μια μέση παρακολούθηση 7,6 ετών(91). Αυξημένη θνητότητα στους NAFLD ασθενείς φαίνεται να συσχετίζεται με διαταραχή της γλυκόζης νηστείας, κίρρωση, μη Ισπανόφωνοι ασθενείς της λευκής φυλής, χαμηλότερο μορφωτικό επίπεδο, χαμηλότερο εισόδημα, και παράγοντες κινδύνου που σχετίζονται με NAFLD(91,116). Εκτός από τις μελέτες που εξετάζουν την μακροπρόθεσμη εξέλιξη ολόκληρης της ομάδος των NAFLD ασθενών, λίγες αναφορές διαχωρίζουν τους ασθενείς με NAFLD μέσα σε δυο ιστολογικούς υπότυπούς της. Οι ασθενείς με ιστολογικό υπότυπο «οχι NASH», είναι ασθενείς με NAFLD με απλή ηπατική στεάτωση καθώς επίσης και ασθενείς με στεάτωση και μη ειδικές ιστολογικές αλλαγές(116). Μολονότι η NASH μπορεί να ακολουθήσει στους «οχι-nash» ασθενείς, φαίνεται ότι η εξέλιξη της παρουσιάζει μια πολύ βραδεία ιστολογική πορεία ή δεν εξελίσσεται καθόλου. Αντιθέτως οι ασθενείς με NAFLD που ανήκουν στον ιστολογικό υπότυπο «NASH», έχουν ταχεία εξελικτική πορεία προς NASH ίνωση κίρρωση. Γενικά οι διαφορές μεταξύ κλινικών και ιστολογικών δεδομένων, προτείνουν ότι η πολύ αργή και σπάνια εξέλιξη της ηπατικής νόσου στους ασθενείς με ιστολογικό υπότυπο «οχι NASH» μπορεί να οδηγήσει σε θάνατό τους από καρδιαγγειακά αίτια και όχι από προχωρημένη ηπατική νόσο( ). Αξίζει να σημειωθεί ότι οι σύγχρονες μορφές της βαριατρικής επέμβασης (γαστρική παράκαμψη) μπορεί να οδηγήσουν σε επίλυση του προβλήματος της ηπατικής στεάτωσης σε ασθενείς με νοσογόνο παχυσαρκία(121,122). Η παρατήρηση αυτή είναι σε πλήρη αντίθεση με τα αποτελέσματα της χειρουργικής διαδικασίας εντερικής παράκαμψης που παλαιότερα γινόταν για διόρθωση της νοσογόνου παχυσαρκίας, η οποία επιδείνωνε την ηπατική στεάτωση και ίνωση και οδηγούσε ευκαιριακά σε ηπατική ανεπάρκεια(123). Από μελέτες NAFLD ασθενών που υπέστησαν επαναλαμβανόμενες βιοψίες ήπατος με την πάροδο του χρόνου, ελήφθησαν σημαντικές πληροφορίες όσον αφορά την εξέλιξη της νόσου. Από τις περισσότερες από αυτές τις μελέτες φαίνεται ότι οι ασθενείς με ιστολογική παρουσία NASH, σε ποσοστό από 30 53% αναπτύσσουν NASH ίνωση μέσα σε μια χρονική διάρκεια 3 6,5 ετών (118,119,124,125). Κάποιες λίγες μελέτες αναφέρουν υποστροφή της ίνωσης σε ποσοστό 25 31% σε ασθενείς με NAFLD, μέσα σε ένα χρονικό διάστημα παρακολούθησης 3 ετών (122). Η βαριατρική χειρουργική επέμβαση μπορεί επίσης να εξαφανίσει την περικολποειδική ίνωση τουλάχιστον σε κάποια άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία(124). Η υποστροφή της ίνωσης αναφέρεται πιο συχνά σε περιορισμένου βαθμού 18 Σ ελίδα

23 βαριατρικές χειρουργικές πράξεις όπως είναι οι λαπαροσκοπικοί γαστρικοί δακτύλιοι, αλλά επιδείνωση της ίνωσης έχει αναφερθεί σε μερικούς ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργεία δυσαπορρόφησης όπως Bilio pancreatic (χολο-παγκρεατική) εκτροπή. Μελλοντικές μελέτες μεγάλης κλίμακας, προς εκτίμηση των επιπτώσεων της βαριατρικής χειρουργικής στην φυσική ιστορία της NASH απαιτούνται(124). Πέρα από τις μελέτες που βασίστηκαν σε διαδοχικές χρονικά βιοψίες, προς εκτίμηση της εξέλιξης της NASH, μια μελέτη στην οποία συμμετείχαν τριτοβάθμια κέντρα φροντίδας από τους Mateoni et al, εκτίμησαν την σχετιζόμενη με το ήπαρ θνητότητα σε 132 ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένη NAFLD(77). Μετά από 8 χρόνια παρακολούθησης 11% των NASH ασθενών απεβίωσαν λόγω της ηπατικής νόσου, σε σύγκριση με μόνο το 2% του ιστολογικού υποτύπου «οχι NASH». Μετά από 18,5 έτη παρακολούθησης των ιδίων ασθενών, η θνητότητα που σχετίζεται με το ήπαρ είχε αυξηθεί στο 18% για τους ασθενείς της ομάδος NASH και στο 3% για τους ασθενείς της ομάδος «οχι NASH». Παρόμοια ευρήματα αύξησης της θνητότητας που σχετίζεται με το ήπαρ, σε ασθενείς με ιστολογική παρουσία NASH, ενώ απουσία αυξημένης ηπατικής θνητότητας σε ασθενείς που ιστολογικά δεν έχουν NASH υπήρξαν και από άλλες μελέτες(30,122,125). Ανεξάρτητοι παράγοντες επιδείνωσης της ηπατικής ιστολογικής εικόνας θεωρούνται ή αντίσταση της Ins, ΣΔΙΙ ή / και άλλα συστατικά του μεταβολικού συνδρόμου. Εκτός από τις άμεσες ιστολογικές αποδείξεις για την εξελικτική φύσης της ασθένειας NAFLD, υπάρχουν και έμμεσες αποδείξεις όπως η παρουσία «κρυψιγενούς» λεγόμενης κίρρωσης σε άτομα με μεταβολικό σύνδρομο και κυρίως με ΣΔΙΙ και η παχυσαρκία( ). Η «κρυψιγενής» κίρρωση θεωρείται πλέον αποτέλεσμα της εξέλιξης της NASH σε προχωρημένη ίνωση κίρρωση («καμένη» - NASH). Φαίνεται ότι ασθενείς με «κρυψιγενής» κίρρωση σε ποσοστό >70%, είχαν στο παρελθόν NASH γιατί είναι ασθενείς παχύσαρκοι, με ΣΔΙΙ ή με άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου(84, ).είναι αξιοσημείωτο ότι ο επιπολασμός του ΣΔΙΙ και της παχυσαρκίας σε ασθενείς με κρυψιγενής κίρρωση, είναι παρόμοιος με εκείνον σε ασθενείς με NASH. Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι ασθενείς με «κρυψιγενής» κίρρωση είναι κατά μέσο όρο 10 χρόνια μεγαλύτεροι απ ότι οι ασθενείς με «NASH», είναι εμφανές ότι οι ασθενείς με «κρυψιγενής» κίρρωση μπορεί να ξεκίνησαν με NASH και την επόμενη δεκαετία προοδευτικά εξελίχθηκαν σε κίρρωση(130). Επίσης άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου όπως δυσλιπιδαιμία, αντίσταση στην Ins, υψηλότερο BMI και χαμηλή HDL (high density lipoprotein), είναι περισσότερο διαδεδομένα σε ασθενείς με «κρυψιγενής» κίρρωση απ ότι οι ιογενείς ηπατίτιδες HBV, HCV και η κίρρωση που συσχετίζεται με PBC (primary biliary cirrhosis) ( ). Γενικά ο επιπολασμός του μεταβολικού συνδρόμου σε άτομα με «κρυψιγενής» κίρρωση, είναι 500% υψηλότερος απ ότι σε άτομα χωρίς κρυψιγενής κίρρωση (128). Εκτός από την άμεση και έμμεση συσχέτιση NASH και «κρυψιγενούς» κίρρωσης, η συσχέτιση μεταξύ NASH και ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ) παρέχει ένα άλλο είδος έμμεσων αποδεικτικών στοιχείων που υποστηρίζουν την προοδευτική φύση της NASH(.Η προχωρημένη ίνωση είναι ένας ενδιαφέρον παράγοντας κινδύνου για ανάπτυξη ΗΚΚ. Ο Hashimoto et al διαπίστωσαν ότι μετά από μια μέση περίοδο παρακολούθησης 43 μηνών (3,5 έτη), η 5ετής αθροιστική επίπτωση του ΗΚΚ ήταν 8% ανάμεσα σε 118 ασθενείς με προχωρημένη NAFLD ίνωση (F 3, F 4 )(82). Παρόμοια αποτελέσματα, συσχέτισης ΗΚΚ με «κρυψιγενή» κίρρωση λόγω NAFLD, έχουν αναφερθεί και από άλλους συγγραφείς(127,131,132). Μάλιστα φάνηκε ότι το 7% της ολικής επικράτησης του ΗΚΚ, αποδίδεται σε κρυψιγενή κίρρωση. Αυτό το ποσοστό είναι σχετικά μικρότερο από το ποσοστό επικράτησης του ΗΚΚ που αποδίδεται σε κίρρωση λόγω HBV, HCV λοίμωξης ή αλκοολικής ηπατοπάθειας. Είναι όμως πολύ υψηλότερο από το ποσοστό επικράτησης του ΗΚΚ που αποδίδεται σε κίρρωση λόγω αιμοχρωμάτωσης ή PBC(127,132).Ο ΣΔΙΙ, η υπερτριγλυκεριδαιμία και η φυσιολογική τιμή ALT φαίνεται να συνδέονται ανεξάρτητα με «κρυψιγενή» κίρρωση αλλά και με ΗΚΚ(128). Εκτός από τους ασθενείς με «κρυψιγενή» κίρρωση που έχουν ΗΚΚ και οι ασθενείς με NASH κίρρωση έχει φανεί ότι έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ΗΚΚ (91.116). Η 5ετής αθροιστική επίπτωση του ΗΚΚ φαίνεται να είναι 20% σε ασθενε ίς με NASH-F 3,F 4 ίνωση(116). Μολονότι παράγοντες κινδύνου για NASH όπως η παχυσαρκία, ο ΣΔΙΙ μπορούν να συμβάλλουν στην ανάπτυξη ΗΚΚ, η ακριβής παθογένεια της συσχέτισης NASH ΗΚΚ παραμένει ασαφής. Μάλιστα φαίνεται ότι ΗΚΚ και NASH μπορεί να συσχετίζονται ανεξάρτητα ύπαρξης κίρρωσης ή όχι (133).Τα ευρήματα αυτά είναι πολύ πρώιμα για να συστηθεί γενικός έλεγχος για ΗΚΚ σε ασθενείς μη κιρρωτικούς με NASH. 19 Σ ελίδα

24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ο ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ NAFLD - NASH Η Θεωρία του «Διπλού Χτυπήματος» Από την πρώτη περιγραφή της νόσου το 1980 από τους Ludwig et al η παθογένεια της NAFLD παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Οι αρχικές θεωρίες για την παθογένεια της NASH βασίζονταν στην υπόθεση του «διπλού χτυπήματος». (two hit theory) (Day and James 1998)(134). 20 Σ ελίδα

25 Ερμηνεία σχημάτων παθογένειας. QJM. Feb 2010; 103(2): 71 83(5) (a): Η Υπόθεση των «2 χτυπημάτων»: Η στεάτωση αντιπροσωπεύει το «1ο χτύπημα», το οποίο κατόπιν ευαισθητοποιεί το ήπαρ για την βλάβη που προκαλείται από το «2ο χτύπημα» μέσω φλεγμονωδών κυττοκίνων, αντιποκίνων, οξειδωτικού στρες, και μιτοχόνδριακης δυσλειτουργίας οδηγώντας σε στεατοηπατίτιδα (NASH) και ίνωση. Η παρουσία υψηλών επιπέδων οξειδωτικού στρες, μειώνει την ικανότητα των ώριμων ηπατοκυττάρων να πολ/ζονται με αποτέλεσμα την μειωμένη ενδογενή ηπατική «επισκευή». (b): Τροποποιημένη υπόθεση του «2ου χτυπήματος»: Η συνάθροιση FFAs και μόνο, έχει προταθεί ότι επαρκή προς πρόκληση ηπατικής βλάβης, χωρίς προσφυγή σε ένα «2ο χτύπημα». Πράγματι αντί να είναι επιβλαβής η συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ με την μορφή στεάτωσης, μπορεί στην πραγματικότητα να είναι προστατευτική εμποδίζοντας την από FFAs προκαλούμενη φλεγμονή και οξειδωτικό στρες. (c): Η υπόθεση του «3ου χτυπήματος»: Το οξειδωτικό στρες περιορίζει την ικανότητα των ώριμων ηπατοκυττάρων να πολ/ζονται καταλήγοντας στην επιστράτευση άλλων οδών προς ηπατική αναγέννηση όπως τα HSCs(Hepatic stellate cells). Αυτά τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται και στις δύο μορφές: χοληφόρα και ηπατικά κύτταρα και έτσι να συμβάλουν στην ηπατική «επισκευή» ή αναγέννηση. Έχει προταθεί ότι η αδυναμία εξαπόλυσης μιας τέτοιας εκ «σωληναρίων» απάντησης, όπως φαίνεται σε ασθενείς που μεταμοσχεύονται για NASH που έχουν απονευρωμένο ήπαρ, μπορεί να ευθύνεται για μια περισσότερο εξελικτική μορφή ηπατικής βλάβης. Έτσι εξασθενημένος πολ/σμος των προγονικών κυττάρων του ήπατος, αντιπροσωπεύει την προτεινόμενη υπόθεση του «3ου χτυπήματος» στην NASH παθογένεια. Στο «1 ο χτύπημα» η ηπατική συσσώρευση τριγλυκεριδίων ή στεάτωση, αυξάνει την ευαισθησία του ήπατος προς πρόκληση ηπατικής βλάβης μέσω του «2 ου χτυπήματος» από φλεγμονώδεις κυτταροκίνες/αδιποκίνες, μιτοχονδριακή δυσλειτουργία και το οξειδωτικό stress, το οποίο με την σειρά του οδηγεί σε στεατοηπατίτιδα (NASH) με ή χωρίς ίνωση(5,133). Ωστόσο υπάρχει αυξημένη αναγνώριση του ρόλου των ελεύθερων λιπαρών οξέων (FFAs: Free Fatty Acids) στην άμεση προώθηση της ηπατικής βλάβης που έχει οδηγήσει σε τροποποίηση αυτής της θεωρίας Εικόνα 5(b). Στην παχυσαρκία και την αντίσταση στην ινσουλίνη, υπάρχει αυξημένη εισροή FFAs στο ήπαρ. Αυτά τα FFAs είτε υποβάλλονται σε β μιτοχονδριακή οξείδωση, είτε είναι εστεροποιημένα με γλυκερόλη προς σχηματισμό τριγλυκεριδίων που οδηγούν σε ηπατική συνάθροιση λίπους (στεάτωση). Υπάρχουν πλέον ουσιαστικές αποδείξεις ότι τα FFAs μπορούν άμεσα να προκαλέσουν ηπατοτοξικότητα, αυξάνοντας το οξειδωτικό stress και ενεργοποιώντας τις φλεγμονώδεις οδούς(23). Επομένως η συνάθροιση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ, μπορεί να αποτελεί έναν προστατευτικό μηχανισμό εμποδίζοντας την τοξική επίδραση των μη εστεροποιημένων FFAs(25). Επιπλέον ένα περαιτέρω συστατικό ή «τρίτο χτύπημα» έχει προστεθεί σε αυτήν την θεωρία αντανακλώντας τον ανεπαρκή ηπατοκυτταρικό πολλαπλασιασμό(5) Εικόνα 5c. Στο υγιές ήπαρ ο κυτταρικός θάνατος διεγείρει την αντιγραφή 21 Σ ελίδα

26 των ώριμων ηπατοκυττάρων τα οποία αντικαθιστούν τα νεκρά κύτταρα και επανασυστήνουν την φυσιολογική λειτουργία του ηπατικού ιστού. Ωστόσο το οξειδωτικό stress (ΟS), ένα κύριο χαρακτηριστικό της NAFLD παθογένεσης, αναστέλλει την αναπαραγωγή των ώριμων ηπατοκυττάρων οδηγώντας σε διαστολή των προγονικών κυττάρων (ωοειδή κύτταρα) του πληθυσμού. Αυτά τα κύτταρα μπορούν επίσης να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα που μοιάζουν με τα ηπατοκύτταρα (hepatocyte like cells). Και οι δύο μορφές κυττάρων, ωοειδή κύτταρα και κύτταρα «ομοιάζοντα» με ηπατοκύτταρα, συνδέονται στενά με το στάδιο ίνωσης στην NAFLD υποδηλώνοντας ότι η μαζική απώλεια ώριμων ηπατοκυττάρων, προάγει τόσο την συνάθροιση των προγονικών κυττάρων όσο και την διαφοροποίηση τους σε κύτταρα που «μοιάζουν» με τα ηπατοκύτταρα στο ήπαρ(135). Ενεργοποίηση αυτών των κυττάρων έχει επίσης ενοχοποιηθεί στην ηπατική καρκινογένεση(153). Στην χρόνια ηπατική βλάβη η ανάπτυξη ίνωσης κίρρωσης, εξαρτάται από την αποτελεσματικότητα της ηπατοκυτταρικής αναγέννησης και γι αυτό κυτταρικός θάνατος με εξασθενημένο πολλ/σμό «υγειών» προγονικών κυττάρων αντιπροσωπεύει την προτεινόμενη θεωρία του «3 ου χτυπήματος» στην NAFLD παθογένεια(5,136). Συσσώρευση λιπιδίων/στεάτωση Η NAFLD χαρακτηρίζεται από την συσσώρευση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ τα οποία σχηματίζονται από την εστεροποίηση των FFAs και γλυκερόλης εντός του ηπατοκυττάρου. Τα FFAs προκύπτουν στο ήπαρ από τρεις διαφορετικές πηγές: Λιπόλυση (υδρόλυση των FFAs και γλυκερόλης από τριγλυκερίδια) εντός του λιπώδους ιστού, Διαιτητικές πηγές, και de novo λιπογένεσης (DNL:De novo lipogenesis)(5). Τα FFAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν στο ήπαρ είτε δια μέσου της μιτοχονδριακής β οξείδωσης, είτε μέσω επανεστεροποίησής τους προς τριγλυκερίδια ως σταγονίδια λίπους, είτε μέσω δημιουργίας των πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (very low density lipoprotein VLDL) προς εξαγωγή τους στην κυκλοφορία (Εικόνα 6). Ως εκ τούτου η συσσώρευση ηπατικού λίπους μπορεί να συμβεί σαν ένα αποτέλεσμα της αυξημένης σύνθεσης λίπους, της αυξημένης απόδοσης λίπους στον ηπατικό ιστό, της μειωμένης εξαγωγής λίπους από τον ηπατικό ιστό ή και μειωμένης οξείδωσης λίπους(εικόνα 6). Εικόνα 6 Μηχανισμοί ηπατικής συνάθροισης λίπους QJM. Feb 2010; 103(2): 71 83(5) 22 Σ ελίδα

27 Προς καθορισμό της αιτιολογικής προέλευσης του λίπους στο ήπαρ σε NAFLD ασθενείς, ο Donnelly και οι συνεργάτες του (22) χρησιμοποιώντας μια μέθοδο «πολλαπλού σταθερού ισοτόπου» απέδειξαν ότι περίπου το 60% της περιεκτικότητας των ηπατικών τριγλυκεριδίων προέρχονται από την εισροή FFAs από τον λιπώδη ιστό, 26% από de novo λιπογένεση (DNL) και 15% από διαιτητική πρόσληψη. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα υγιή άτομα στα οποία η DNL συμβάλλει σε ποσοστό <5% για τον σχηματισμό ηπατικών τριγλυκεριδίων(137,138). Τριγλυκερίδια μπορούν επίσης να εξαχθούν από το ήπαρ με την μορφή VLDL οι οποίες σχηματίζονται με την ενσωμάτωση εντός των τριγλυκεριδίων απολιποπρωτεΐνης Β (apo Β) με μικροσωματιακής προέλευσης πρωτεΐνη μεταφορέα (microsomal transfer protein: MTP) (139). Ανωμαλίες ή εκτροπή στην σύνθεση MTP/apo B καθώς και στην έκκρισή τους, έχουν προταθεί ως πιθανοί μηχανισμοί που υποστηρίζουν ότι στην παθογένεια της NAFLD συμμετέχει και η μείωση της ικανότητας για έξοδο των λιπιδίων από το ήπαρ. Η Αντίσταση στην Ινσουλίνη (Insulin Resistance: IR) Εικόνα7. Παθογένεια της μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας μέσω αντίστασης στην ινσουλίνη: FFAs παρέχονται στο ήπαρ από τη δίαιτα, τη λιπόλυση στα λιποκύτταρα και διά των υπολειμμάτων των χυλομικρών. Η αντιγραφή της SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein 1c) ενισχύεται χρονίως καταλήγοντας σε DNL (De novo lipogenesis). Ταυτόχρονα, η αναστολή της σύνθεσης των VLDL (very low density lipoprotein) καταλήγει σε μειωμένη έξοδο τριγλυκεριδίων. Η περίσσεια λιπαρών οξέων αποθηκεύεται στα τριγλυκερίδια ή μεταβολίζεται διά μέσω οξειδώσεως στα μιτοχόνδρια ή τα υπεροξυσωμάτια. Η αυξημένη οξείδωση οδηγεί σε παραγωγή ROS (Reactive oxygen species) και πρόκληση οξειδωτικού στρες. Το τελευταίο επάγει φλεγμονώδη αντίδραση και απόπτωση καθώς και ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων και ίνωση(136). Σε υγιή άτομα η σύνδεση της ινσουλίνης στον υποδοχέα της οδηγεί σε φωσφορυλίωση αρκετών υποστρωμάτων συμπεριλαμβανομένων πολλών υποστρωμάτων του υποδοχέα της ινσουλίνης [insulin receptor substrates: (IRS) -1, - 2, -3 και 4] που διαδίδουν το σήμα της ινσουλίνης(136,140). Η διέγερση των IRS -1 και IRS -2 πρωτεϊνών οδηγεί σε ενεργοποίηση των ενδοκυττάριων PI3k (phosphoinositide 3 kinase) και AkT / PkB (AkT πρωτεΐνη / protein kinase B) οδών, που είναι βαθειά εμπλεκόμενες στην μεσολάβηση των μεταβολικών επιδράσεων της ινσουλίνης. Τελικά τα αποτελέσματα της ενεργοποίησης της AkT / PkB οδού, καταλήγουν σε μετατόπιση του μεταφορέα γλυκόζης-4 (Glucose Transporter-4: GLUΤ4) που περιέχει κυστίδια «κυψελίδες» στην κυτταροπλασματική μεμβράνη, διευκολύνοντας έτσι την πρόσληψη γλυκόζης. 23 Σ ελίδα

28 Επιπλέον η έκφραση βασικών λιπογενετικών γονιδίων είναι αυξημένη με μια συνακόλουθη μείωση της έκφρασης του γονιδίου γλυκονεογένεσης μέσω ρύθμισης της forkhead (FOXO) δραστηριότητας του παράγοντα μεταγραφής. Η ινσουλίνη έχει μια ισχυρή δράση για την καταστολή της λιπόλυσης του λιπώδους ιστού. Ωστόσο σε καταστάσεις αντίστασης στην ινσουλίνη (IR:insulin resistance) όπως η NAFLD, αυτή η καταστολή είναι εξασθενημένη καταλήγοντας σε μια αυξημένη εκροή των FFAs από τον λιπώδη ιστό(21). Η Υπερινσουλιναιμία που σχετίζεται με IR οδηγεί : (i) προς τα άνω ρύθμιση του παράγοντα μεταγραφής που δια μέσου στερόλης συνδέει την πρωτεΐνη 1c (via sterol regulatory element binding protein 1c ή SREBP 1c). Ο SREBP 1c είναι μέλος της οικογένειας SREBP, μιας ομάδας παραγόντων μεταγραφής που έχουν σημαντικό ρόλο στον ενδοκυττάριο μεταβολισμό λιπιδίων. Συγκεκριμένα ο SREB 1 αποτελεί έναν βασικό μεταγραφικό ρυθμιστή των γονιδίων που εμπλέκονται στην de novο λιπογένεση (DNL) και (ii) Αναστολή της β οξείδωσης των ελεύθερων λιπαρών οξέων, έτσι περαιτέρω προώθηση της συνάθροισης λιπιδίων στο ήπαρ. Εικόνα 7(136,140). Πολλές από τις ανωμαλίες που αναφέρονται στην NAFLD εμπλέκονται με τον καταρράκτη «σηματοδότησης» της ινσουλίνης. Η ινσουλίνη είναι η κύρια αναβολική ορμόνη στο σώμα και παρουσιάζει όπως προαναφέραμε αντιλιπολυτική δράση στο λιπώδη ιστό αναστέλλοντας την απελευθέρωση ελεύθερων λιπαρών οξέων, μειώνοντας την δραστηριότητα της ορμονοευαίσθητης λιπάσης (hormone sensitive lipase) και της λιπάσης των τριγλυκεριδίων του λιπώδους ιστού (adipose triglyceride lipase). Η αναστολή του σήματος της ινσουλίνης που προκαλείται από διάφορες αιτίες ονομάζεται αντίσταση στην Ινσουλίνη(Insulin Resistance :IR). Η αναστολή του σήματος της ινσουλίνης που παρατηρείται στην NAFLD και που επομένως οδηγεί σε IR προκαλείται από: FFAs, παράγοντα νέκρωσης των όγκων άλφα (Tumor necrosis factor a: TNF a), πυρηνικός παράγοντας kappa B (Nuclear Factor kappa B: NF kb), κεραμίδιο (ceramide), jun N τερματική κινάση-1 (jun N terminal kinase -1: JNK -1), καταστολείς της σηματοδότησης των κυττοκινών (supressors of cytokines signaling: SOCS) και κυττόχρωμα CYP2E1(5,136, ). Αυξημένοι μεταβολίτες λιπιδίων όπως διακυλογλυκερόλη (DAG:diacylοglycerol), εμπλέκονται σε έναν μηχανισμό εξαρτώμενο από μια πρωτεϊνική κινάση Cε [protein kinase Cε: PKCε], για να παρέμβουν στην σηματοδότηση της ινσουλίνης διαμέσου αναστολής της δραστηριότητας του υποδοχέα ινσουλίνης και τροποποίησης της IRS 2 φωσφορυλίωσης(154). Παρόμοιες διαδικασίες εμφανίζονται στα σκελετικά και μυϊκά κύτταρα, οδηγώντας σε μια πιο γενικευμένη κατάσταση της IR (Insulin Resistance). Φλεγμονή-Στεατοηπατίτιδα Φλεγμονώδεις κυττοκίνες και FFAs Η παρουσία της στεάτωσης είναι στενά συνδεδεμένη με την χρόνια ηπατική φλεγμονή. Ένα αποτέλεσμα που προκαλείται εν μέρει από την ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης IkK β/ NF kb. Η IkK β είναι μια κινάση (IkB Kinase β ή IkΚ β) που ανήκει στις φλεγμονώδεις κινάσες όπως και η κινάση JNK -1(5,141). H IkK β όπως και η JNK -1 κινάσες, επάγουν την αναστoλή της φωσφορυλίωση της σερίνης, με τελικό αποτέλεσμα αναστολή της σηματοδότησης της ινσουλίνης (αναστέλλουν την πρόσληψη γλυκόζης από το αίμα στα κύτταρα των περιφερικών ιστών και του ήπατος). Σε μοντέλα ποντικών με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά οξέα (high fat diet: HFD), η επαγόμενη στεάτωση σχετίζεται με αυξημένη δραστηριότητα του NF-kB πυρηνικού παράγοντα. Ο NF-Kb(Nuclear factor-κb) είναι ένας οξειδωτικός παράγοντας των κυττάρων, που ενεργοποιείται από τις παραγόμενες αντιδραστικές ρίζες οξυγόνου (Reactive Oxygen Species: ROS) που βρίσκονται σε περίσσεια στον ηπατικό ιστό επί αυξημένης παρουσίας FFAs. Η αυξημένη δραστηριότητα του NF-kB στο ήπαρ, οδηγεί σε αυξημένη ηπατική έκφραση φλεγμονωδών κυτταροκινών όπως ο TNF-a, ιντερλευκίνη-6 (IL-6), ιντερλευκίνη-1 βήτα (IL -1β), καθώς και σε ενεργοποίηση των κυττάρων του Kupffer. Ειδικός ηπατικός αναστολέας του NF-kB προλαμβάνει την επαγόμενη από υψηλής περιεκτηκότητας σε λιπαρά δίαιτα (HFD: high-fat diet) φλεγμονώδη γονιδιακή έκφραση, ενώ η HFD προκαλούμενη υπεργλυκαιμία και IR μπορούν να αναπαραχθούν από επιλεκτική υπερέκφραση της ιδιοσυγκρασιακά ενεργούς ΙkΚ β στα ηπατοκύτταρα. Η οδός ΙkK β / NF-kB στα ηπατοκύτταρα, μπορεί επίσης να ενεργοποιείται άμεσα από FFAs, παρέχοντας έναν επιπλέον μηχανισμό με τον οποίο η κεντρική παχυσαρκία, που έχει σαν επακόλουθο την συσσώρευση FFAs στο ήπαρ, μπορεί να συμβάλλει στην 24 Σ ελίδα

29 φλεγμονή(5,23,141). Επιπλέον η μετατροπή των FFAs στο ήπαρ σε ηπατικά τριγλυκερίδια, μπορεί να χρησιμεύει ως ένα προστατευτικό μέτρο προς πρόληψη της άμεσης ηπατικής λιποτοξικότητας (lipotoxicity). Αυτό υποστηρίζεται από ένα μοντέλο ποντικού με NAFLD, όπου η αναστολή της DGAT2 (το ένζυμο που καταλύει το τελικό στάδιο της σύνθεσης τριγλυκεριδίων) οδήγησε σε βελτίωση της ηπατικής στεάτωσης και της IR αλλά επιδείνωση της ηπατοκυτταρικής βλάβης και ίνωσης(142)(εικόνα 8). Εικόνα 8 Προτεινόμενη παθογένεια NASH. Η πιθανότητα εξέλιξης προς προχωρημένη NASH / κίρρωση είναι αποτέλεσμα συνδυασμού αλληλεπίδρασης ανάμεσα σε γενετική προδιάθεση και πολλαπλών μηχανισμών που περιγράφονται στο κείμενο. QJM. Feb 2010; 103(2): 71 83(5) ER stress (endoplasmic reticulum stress), TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), IL-6 (Interleukin 6),IL-1β(Interleukin- 1β),FFAs (free fatty acids), IkK-B (IkB Kinase β), NF-Kb (Nuclear Factor- kappa B), 11b-HSD1 (11b-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1), 5aR (5-alpha-reductase). Τόσο στον ορό όσο και στο ήπαρ, τα επίπεδα του TNA a είναι αυξημένα σε ασθενείς με NASH και σχετίζονται με την ιστολογική σοβαρότητα. Εκτός από τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις του, ο TNF a προάγει την IR. Αντιστρόφως η αναστολή της TNF a σηματοδότησης, βελτιώνει την IR και τις ιστολογικές παραμέτρους της NASH(5, ). Παρομοίως τα επίπεδα IL -6 ορού είναι επίσης αυξημένα σε μοντέλα ανθρώπων και ζώων με IR και NAFLD και τα επίπεδα αυτά σχετίζονται με αυξημένη ηπατική φλεγμονή και ίνωση (5,147,148) (Εικόνα 8). Ο βασικός ρόλος των παραγόμενων ηπατικών κυττοκινών στην παθογένεια της εξέλιξης της στεάτωσης σε NASH, υποστηρίζεται από μελέτες που απέδειξαν ότι οι κυττοκίνες μπορούν να αναπαράγουν όλα τα ιστολογικά χαρακτηριστικά που σχετίζονται με NASH συμπεριλαμβανομένων την χημειοταξία των ουδετερόφιλων, ηπατοκυτταρική απόπτωση / νέκρωση, σχηματισμό σωματίων Mallory (Mallory Body) και ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων του ήπατος (Hepatic stellate cells: HSCs) που παράγουν κολλαγόνο(19). Επιπλέον δεδομένα υποστηρίζουν ότι η φλεγμονή και η ενεργοποίηση του NF-kB, μπορούν να προάγουν την ηπατική καρκινογένεση και ότι η χρόνια φλεγμονώδης κατάσταση που συνδέεται με ηπατική στεάτωση μπορεί επίσης να διαδραματίσει ένα ρόλο στην Η.Κ.Κ. ανάπτυξη(5,19,136). 25 Σ ελίδα

30 Αντιποκίνες ή Αδιποκίνες (Adipokines) Ο Λιπώδης ιστός δεν είναι μόνο ένας αδρανής χώρος αποθήκευσης ενέργειας, αλλά και ένα ενεργά εκκριτικό ενδοκρινές όργανο. Λειτουργικός ρόλος των κυττοκινών που προέρχονται από τον λιπώδη ιστό (αντιποκίνες ή λιποκίνες) είναι πλέον όλα και περισσότερο αναγνωρίσιμος με την λεπτίνη και την αντιπονεκτίνη (αδιπονεκτίνη) από τις πιο καλά μελετημένες. Η λεπτίνη είναι μια πεπτιδική ορμόνη 16 KDa που κωδικοποιείται από το ob γονίδιο των ώριμων λιποκυττάρων. Τα ώριμα λιποκύτταρα που παράγουν λεπτίνη, δρουν στην ρύθμιση της πρόσληψης και κατανάλωσης ενέργειας(149), ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος (150,151) και στην προώθηση της φλεγμονής και ίνωσης(151,152). Σε μελέτες με πειραματόζωα η κύρια δράση της λεπτίνης φαίνεται να είναι η αποτροπή της συσσώρευσης λίπους σε μη λιπώδης θέσεις, όπως το μυοκάρδιο, οι σκελετικοί μύες, το πάγκρεας και το ήπαρ(153). Αρχικά η λεπτίνη χαρακτηρίστηκε σαν ρυθμιστής του σωματικού βάρους και της κατανάλωσης ενέργειας(153). Σε ασθενείς με NASH τα επίπεδα λεπτίνης στον ορό αυξάνονται συγκριτικά με άτομα ίδιας ηλικίας και ΒΜΙ. Γενικά έχει παρατηρηθεί μια αύξηση των επιπέδων λεπτίνης ορού σε παχύσαρκα άτομα και άτομα με NAFLD(149, ), τα οποία συνήθως αντανακλούν τον βαθμό αντίστασης στην λεπτίνη. Αν και φαίνεται παράδοξη η κατασταλτική δράση της λεπτίνης στην SREBP-1c εξαρτώμενη DNL και την IR, (τα παχύσαρκα άτομα έχουν υψηλά επίπεδα λεπτίνης και υψηλή έκφραση SREBP -1c), εντούτοις αυτό είναι εφικτό επειδή από την μια μεριά έχουμε αυξημένη παραγωγή λεπτίνης, από την αυξανόμενη μάζα λιποκυττάρων και από την άλλη μείωση της ευαισθησίας στην λεπτίνη. Τα επίπεδα λεπτίνης ορού σχετίζονται ανεξάρτητα με τον βαθμό ηπατικής στεάτωσης αλλά όχι με τον βαθμό φλεγμονής και ίνωσης του ήπατος. Παραμένει εύλογο ότι η λεπτίνη μπορεί να έχει ένα λειτουργικό ρόλο στην NAFLD παθογένεια. Σε αντίθεση με την λεπτίνη, η έκκριση και τα κυκλοφορούντα επίπεδα αδιπονεκτίνης είναι αντιστρόφως ανάλογα προς την περιεκτικότητα λίπους στο σώμα(157) και μειώνονται σε ασθενείς με NAFLD(143,158). Η αδιπονεκτίνη είναι μια αντι φλεγμονώδης, αυξάνουσα την ευαισθησία της ινσουλίνης λιποκίνη και η χορήγηση ανασυνδυασμένης αδιπονεκτίνης μειώνει την ηπατομεγαλία και βελτιώνει τις βιοχημικές και ιστολογικές παραμέτρους της NAFLD σε ένα μοντέλο ποντικού(159). Η αδιπονεκτίνη, ανταγωνίζεται την επίδραση του TNF-a που από μόνος του καταστέλλει την παραγωγή αδιπονεκτίνης(157). Η σημασία της αδιπονεκτίνης στην NAFLD, υποστηρίζεται από μελέτες που δείχνουν ότι τα επίπεδα αδιπονεκτίνης ορού μπορούν να βοηθήσουν στην διάκριση ΝΑSH από απλή στεάτωση(143,160,161). Ο κύριος τρόπος δράσης της αδιπονεκτίνης στην NAFLD, θεωρείται ότι είναι η ενεργοποίηση των ΡPAR γ (Peroxisome proliferator activated receptor γ) και η ενεργοποίηση της εξαρτώμενης από το ΑΜΡ κινάσης(162,163). Έτσι μειώνεται η στεάτωση τόσο στα μυϊκά κύτταρα όσο και στα ηπατοκύτταρα. Οι ενεργοποιημένοι υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα των υπεροξυσωμάτων (Perixisome Proliferator activated receprors PPARs) είναι μέλη της υπερ-οικογένειας των πυρηνικών υποδοχέων και η ενεργοποίηση τους, δια μέσου συνδέτη, επάγει την έκφραση γονιδίων που ρυθμίζουν την λιπογένεση, τον μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών, τον μεταβολισμό της γλυκόζης και την φλεγμονή (εικόνα7). Οι PPARs υπάρχουν σε 3 ισόμορφες: PPAR α, PPAR δ/β, ΡPAR γ. Φάρμακα που επηρεάζουν τους PPARs είναι οι φιμπράτες που αναστέλλουν τους PPAR α, και οι θειαζολιδιναιδιόνες που αναστέλλουν τους ΡPAR γ( ). Ο PPAR α εκφράζεται σε μεταβολικούς ενεργείς ιστούς όπως το ήπαρ, ο μυς, η καρδιά και τα νεφρά. Τα λιπαρά οξέα διεγείρουν τον PPAR α προς αύξηση της αντιγραφής των ενζύμων που επάγουν την υπερτροφία των υπεροξυσωμάτων, την πρόσληψη λιπιδίων και την αυξημένη β-οξείδωση των λιπιδίων. Έτσι ο PPAR α δρα μειώνοντας την συσσώρευση λιπιδίων στο ήπαρ. Στα ποντίκια η διέγερση PPAR α αποτρέπει την ενδοηπατική συσσώρευση λίπους και αποτρέπει την ανάπτυξη στεατοηπατίτιδας(163). Ο PPAR γ εκφράζεται κυρίως στον λιπώδη ιστό και λιγότερο στα μακροφάγα, τα μυϊκά και τα ηπατικά κύτταρα. Ο PPAR γ επηρεάζει κεντρικά μόρια που ρυθμίζουν τον μεταβολισμό της γλυκόζης και την διαφοροποίηση του λίπους, προάγοντας την αποθήκευση λιπιδίων σε ώριμα λιποκύτταρα και έτσι αποτρέπεται η συσσώρευση λίπους σε μη λιπώδης ιστούς. Η διέγερση του PPAR γ βελτιώνει την ευαισθησία της ινσουλίνης και το λιποπρωτεϊνικό προφίλ σε ανθρώπους (162). Τα κύτταρα Kupffer εκφράζουν επίσης τον PPAR γ όπως και τα αδρανή HSCs. Ο PPAR γ έχει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της φλεγμονής και στην ενεργοποίηση των HSCs και αποτελεί έτσι πιθανό στόχο για φαρμακευτική παρέμβαση αποτροπής της εξέλιξης σε NASH και ανάπτυξης ίνωσης σε NAFLD(161). Επομένως η αδιπονεκτίνη ως ενεργοποιητής των PPARs-γ, έχει μια συνολική βελτίωση της NAFLD μειώνοντας τόσο την ηπατική στεάτωση όσο και την ανάπτυξη στεατοηπατίτιδας και ηπατικής ίνωσης. 26 Σ ελίδα

31 Άλλοι παράγοντες, προερχόμενοι από τον λίπώδη ιστό, που βρέθηκε να είναι σε περίσσεια σε NAFLD ασθενείς αποτελούν ο TNF a, η IL-6, το αγγειοτενσινογόνο, και η ρεζιστίνη και φαίνεται να ανταγωνίζονται τις λιπογενετικές αντιδράσεις της ινσουλίνης (5) αλλά τους ακριβείς ρόλους τους στην παθογένεια της NAFLD μένει να τους ξεκαθαρίσουμε (εικονα 8). Οξειδωτικό ΣΤΡΕΣ(Ος) και Μιτοχονδριακη δυσλειτουργία Ο ρόλος του οξειδωτικού στρες (OS) και της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας στην NAFLD είναι δεδομένος, με μια πιο προχωρημένη νόσο (NASH) να σχετίζεται με μεγαλύτερο βαθμό OS(5,17,24,135,136). Στο φυσιολογικό ήπαρ η β-οξείδωση λαμβάνει χώρα στα μιτοχόνδρια αλλά στα πλαίσια της NAFLD, αυτή η διαδικασία μπορεί να υπερδραστηριοποιηθεί αρχικά και κατόπιν να υπερκεραστεί από εξωμιτοχονδριακές οδούς οξείδωσης λιπαρών οξέων (μικροσωμιακή υπεροξεισωμιακή ηπατική οξείδωση λιπαρών οξέων) που συνολικά ονομάζεται λιπιδιακή Υπεροξείδωση(5). Οι μηχανισμοί δια μέσου των οποίων αυξάνεται στο στεατικό ήπαρ αρχικά η β-οξείδωση στα μιτοχόνδρια, δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Πιθανόν τα FFAs που προέρχονται από την DNL στο ήπαρ και από την αθρόα εισροή στο ήπαρ λόγω ινσουλινοαντίστασης, καθώς και ο PPAR α, να διεγείρουν την CPT-1 (Carnitin palmitoyltranferas-1) που είναι το υπεύθυνο ένζυμο για την είσοδο FFAs στα μιτοχόνδρια. Η μαζική εισροή FFAs από τους περιφερειακούς ιστούς και η αυξημένη DNL εντός των ηπατοκκυτάρων, ξεπερνά τις μεταβολικές δυνατότητες των μιτοχονδρίων. Η κατάληξη είναι η μιτοχονδριακή υπεροξείδωσης λιπαρών οξέων, δηλαδή η αποδόμησή τους κατά την οποίαν ελεύθερες ρίζες οξυγόνου αποσπούν ηλεκτρόνια από την λιπιδιακή μεμβράνη των κυττάρων και καταστρέφουν τα μιτοχόνδρια και γενικά τα ηπατικά κύτταρα, οδηγώντας σε περαιτέρω παραγωγή RΟS και εκτροπή της μιτοχονδριακής β-οξείδωσης σε εξωμιτοχονδριακές οδούς οξείδωσης λιπαρών οξέων στο ήπαρ όπως η μικροσωμιακή και υπεροξεισωμιακή ηπατική οξείδωση, καθώς και η μετατροπή της φυσιολογικής β-μιτοχονδριακής οξείδωσης σε μια οδό υπερπαραγωγής RΟS. Ολόκληρη η παραπάνω διαδικασία (υπερδραστηριοποίηση της β- μιτοχονδριακής οξείδωσης, εκτροπή ή καταστροφή της φυσιολογικής β-μιτοχονδριακής οξείδωση με ταυτόχρονη επαγωγή των εξωμιτοχονδριακών οδών οξείδωσης λιπαρών οξέων στο ήπαρ, όπως υπεροξεισωμιακή και μικροσωμιακή οδός) συνολικά ονομάζεται Λιπιδιακή Ηπατική Υπεροξείδωσης Λιπαρών Οξέων και οδηγεί στην ανάπτυξη χρόνιου οξειδωτικού στρες στο ήπαρ σε NAFLD ασθενείς. Σύμφωνα με την υπόθεση των 2 χτυπημάτων, για την εξέλιξη της NAFLD σε NASH, απαιτείται ένα «δεύτερο χτύπημα» ικανό να προκαλέσει κυτταρικό θάνατο, φλεγμονή και ίνωση του ήπατος. Ένα τέτοιο πιθανό «δεύτερο χτύπημα» θεωρείται πως είναι η μακροχρόνια ανάπτυξη έντονου οξειδωτικού στρες στα ηπατοκύτταρα του λιπώδους ήπατος. Η μιτοχονδριακή βλάβη συμβάλλει στην αυξημένη παραγωγή ROS που με την σειρά τους δημιουργούν μια αυτοσυντηρούμενη αλυσίδα που οδηγεί στην χρόνια μιτοχονδριακή βλάβη. Η χρόνια μιτοχονδριακή βλάβη καταλήγει σε μειωμένη σύνθεση ΑΤΡ, διαταραχή στην ομοιόσταση του κυτταρικού Cα ++ και αλλαγή της μιτοχονδριακής διαπερατότητας. Όλα τα παραπάνω οδηγούν σε νέκρωση και ηπατοκυτταρική απόπτωση. Ταυτόχρονα η υπερφόρτωση των μιτοχονδρίων του ήπατος με FFAs και η προκαλούμενη μιτοχονδριακή βλάβη, συμβάλλουν στην επαγωγή του μικροσωμιακού και υπεροξεισωμιακού κυτοχρώματος Ρ450 και συγκεκριμένα των ισόμορφων του CYP-4502E1 και CYP-4A, επειδή τα FFAs αποτελούν υποστρώματα όχι μόνο των μιτοχονδρίων αλλά και μικροσωμιακών και υπεροξεισωμιακών λιποοξυγενάσων του Ρ-4502Ε1 και CYP-4Α. Έτσι υπερδραστηριοποιούνται και αυτές οι εξωμιτοχονδριακές οδοί οξείδωσης FFAs στο ήπαρ, καταλήγοντας σε λιπιδιακή υπεροξείδωση και περαιτέρω παραγωγή προϊόντων του οξειδωτικού στρες στο ήπαρ. Κυρίως υπεροξείδιο του υδρογόνο (H 2 O 2 ), ROS κ.α. που με την σειρά τους διαιωνίζουν την μιτοχονδριακή καταστροφή και έτσι αυξάνεται το οξειδωτικό στρες και τα προϊόντα του. Τελικό αποτέλεσμα είναι η κυτταρική βλάβη και κυτταρικός θάνατος όταν πλέον τα προϊόντα του οξειδωτικού στρες (RΟS) ξεπερνούν τις αντιοξειδωτικές δυνατότητες των ηπατοκυττάρων. Έχει βρεθεί έντονη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας του CYP2E1 και του ποσοστού ηπατικής στεάτωσης καθώς και του ΒΜΙ και της IR(166,167). Επομένως τα ηπατικά μιτοχόνδρια καθώς και τα ηπατικά υπεροξεισωμάτια και μικροσώμια, αποτελούν κυτταρικά οργανίδια που θεωρούνται εν δυνάμει πηγές RΟS που σχετίζονται με την στεατοηπατίτιδα και ίνωση στην NAFLD (5,1724,135,136). 27 Σ ελίδα

32 ER στρες και βακτηριακή Υπερανάπτυξη Άλλοι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην παθογένεια της NASH είναι το «Στρες του Ενδοπλασματικού Δικτύου» (ER stress: endoplasmic reticulum stress) και η βακτηριακή Υπερανάπτυξη στο έντερο που προκαλεί ενδοτοξιναιμία(5). Το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αποτελεί ένα εξειδικευμένο μεμβρανώδη δίκτυο στο εσωτερικό του κυττάρου, όπου συγκεντρώνονται πολλαπλά μεταβολικά σήματα για την ρύθμιση της ομοιόστασης του Cα++, του μεταβολισμού των λιπιδίων και κυρίως την σύνθεση πρωτεϊνών του ενδομεμβρανικού συστήματος της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και των προς έκκριση πρωτεϊνών. Μαζί με την συσκευή Golgi, φροντίζει για την σωστή αναδίπλωση αυτών των πρωτεϊνών και πραγματοποιεί την μεταφορά και απελευθέρωσή τους. Επειδή αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή των παραπάνω λειτουργιών, γίνεται κατανοητό ότι η ικανότητα του ενδοπλασματικού δικτύου να προσαρμόζει την συνθετική και μεταβολική του δραστηριότητα ανάλογα με τις εκάστοτε συνθήκες είναι μείζονος σημασίας για την σωστή λειτουργία και ομοιόσταση ολόκληρου του κυττάρου. Συνθήκες κάτω από τις οποίες, η εύρυθμη λειτουργία του οργανιδίου διαταράσσεται και ιδιαίτερα συνθήκες όπου επηρεάζεται η σωστή αναδίπλωση των νεοσυντιθέμενων πρωτεϊνών στο εσωτερικό του, οδηγούν σε μια κατάσταση γνωστή ως «Στρες Ενδοπλασματικού Δικτύου» (ER stress). Σε αυτές τις συνθήκες, η ανάγκη για επαναφορά και διατήρηση της ομοιόστασης στο εσωτερικό του οργανιδίου, οδήγησε εξελικτικά τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς στην ανάπτυξη ενός εκλεπτυσμένου μηχανισμού αποκατάστασης που ονομάζεται: UPR (Unfolded Protein Response) (εικόνα 9)(168). Σκοπός του, η διακοπή του εισερχόμενου πρωτεϊνικού φορτίου, ενίσχυση του συστήματος αναδίπλωσης και αποικοδόμηση των μη σωστά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών. Ο μηχανισμός αυτός απαρτίζεται από τρεις βραχίονες επιτήρησης του αυλού του ενδοπλασματικού δικτύου στους οποίους επιτελικό ρόλο κατέχουν τρεις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες αντίστοιχα: 1) Η IRE1 (Inositol Requiring Enzyme -1), 2) η ATF6 (Activating Transcription Factor 6) και 3) η PERK (PKR-like eukaryotic translation initiation factor 2a kinase). Απουσία στρεσογόνων συνθηκών οι αισθητήριες αυτές πρωτεΐνες βρίσκονται συνδεδεμένες στον αυλό του οργανιδίου με την πρωτεΐνη «σύνοδο» BiP/GRP78 (Glucose Regulated Protein 78) σε ανενεργή κατάσταση ( ). Κύρια λειτουργία της «συνoδού»(chaperone) ΒiΡ πρωτεΐνης είναι η αλληλεπίδρασή της με τις εισερχόμενες πρωτεΐνες, βοηθώντας στον μηχανισμό αναδίπλωσής τους. Συσσώρευση όμως μη σωστά αναδιπλωμένων πρωτεϊνών και αυξημένο πρωτεϊνικό φορτίο, οδηγεί στην στρατολόγηση της ΒiΡ και απομάκρυνση της από τους τρεις αισθητήρες. Η απομάκρυνση αυτή προκαλεί τον ολιγομερισμό και την αυτοφωσφορυλίωση των IRE1 και PERK και την μετατόπιση του ATF6 στο οργανίδιο Golgi. Τα γεγονότα αυτά ενεργοποιούν τελικά τρία πολύπλοκα καθοδικά σηματοδοτικά μονοπάτια που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους με σκοπό την γρήγορη αποκατάσταση της ομοιοστασίας στο εσωτερικό του ενδοπλασματικού δικτύου. Εικόνα 9: Ενεργοποίηση των τριών βραχιόνων του UPR (Rutkowski and Hegde)(168). UPR (Unfolded Protein Response), IRE1 (Inositol Requiring Enzyme -1), ATF6 (Activating Transcription Factor 6), PERK (PKR-like eukaryotic translation initiation factor 2a kinase). 28 Σ ελίδα

33 Επομένως η ενεργοποίηση των τριών κλάδων UPR έχει ως στόχο την επιτυχή αποσυμφόρηση του υπό στρες ενδοπλασματικού δικτύου και την επανεγκατάσταση της λειτουργικής ισορροπίας στον αυλό του οργανιδίου. Η μη επιτυχής αποκατάσταση της ισορροπίας λόγω έντονων και παρατεταμένων στρεσογόνων ερεθισμάτων, εκτρέπει το UPR από σήμα επιβίωσης σε μηχανισμό επαγωγής προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου μέσω απόπτωσης(171,172). Το αποπτωτικό αυτό σήμα διέρχεται ουσιαστικά από τα μιτοχόνδρια. Σε ασθενείς με NAFLD/NASH η «unfolded protein response: UPR» διαταράσσεται από μια ποικιλία βιολογικών καταπονήσεων περιλαμβανομένης της υπερινσουλιναιμίας και υπερλιπιδαιμίας(19,173) με αποτέλεσμα ανεπιτυχή ενεργοποίηση μηχανισμών επανόρθωσης της ομοιόστασης στο εσωτερικό του ενδοπλασματικού δικτύου. Αυτές οι αλλαγές μαζί με την κυτταροτοξικότητα των FFAs και την μιτοχονδριακή δυσλειτουργία οδηγούν σε ενεργοποίηση της κινάσης c-jun-n-terminal (C-JNK) με αποτέλεσμα φλεγμονή και απόπτωση των ηπατοκυττάρων(171). Οι JNK είναι μια οικογένεια πρωτεϊνικών κινασών που ευθύνονται για την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης c-jun που παίζει ρόλο στην μεταγραφή πληθώρας γονιδίων. Είναι ευρέως γνωστό ότι ενεργοποιούνται από διάφορες στρεσογόνες καταστάσεις όπως το οξειδωτικό στρες, η διέγερση από κυττοκίνες (TNF-a), η αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης κ.λπ. Δηλαδή από γεγονότα που υπάρχουν στη NASH. Οι JNK όταν διεγείρονται κατέχουν αποφασιστικό ρόλο μεταξύ των άλλων στην διαδικασία του αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου. Έχει πλέον επιβεβαιωθεί προς το παρόν ότι το ER στρες είναι σημαντικό στην επαγόμενη από το αλκοόλ στεατοηπατίτιδα, επομένως η περαιτέρω μελέτη του ρόλου του στη NASH είναι δικαιολογημένη(5). Αποδείξεις επίσης αναδεικνύονται για τον ρόλο της βακτηριακής υπερανάπτυξης στην παθογένεια της NASH. Βακτηριακή υπερανάπτυξη έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή αιθανόλης και απελευθέρωση βακτηριακών πολυσακχαριτών( ). Και τα δύο προϊόντα μπορούν να ενεργοποιήσουν την παραγωγή TNF-a στα κύτταρα του Kupffer και έτσι να επάγουν την ηπατική φλεγμονή. Εικόνα 10 (176). Υπερανάπτυξη βακτηρίων στο λεπτό έντερο, και αυξημένη εντερική διαπερατότητα έχουν βρεθεί πιο συχνά σε NASH ασθενείς όταν συγκρίνονται με ομάδες ελέγχου(177). Αυτό μπορεί να εξηγήσει την πιο συχνή εμφάνιση NASH και ηπατικής ίνωσης ως επιπλοκή της νηστιδο-ειλεϊκής χειρουργικής επέμβασης παράκαμψης(178). Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται περαιτέρω και από την απόδειξη ότι μεταβολή της εντερικής χλωρίδας με αντιβιοτικά(179,180) και προβιοτικά(145, ) μπορεί να μειώσει την ηπατική φλεγμονή σε αμφότερα ζώα και ανθρώπους. Εικόνα 10: Η μετάβαση από τη NAFLD σε NASH γίνεται μέσω αρκετών προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Η αντίσταση στην ινσουλίνη επηρεάζει το ήπαρ, το λιπώδη ιστό, και το πάγκρεας που συμβάλλουν στην παραγωγή προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Ο ρόλος της βακτηριακής υπερανάπτυξης στο λεπτό έντερο (small intestinal bacterial overgrowth SIBO) αμφισβητείται. Στο ήπαρ οι προφλεγμονώδεις αλλαγές αυξάνουν τη φλεγμονή και την απόπτωση που αυξάνουν έτι περαιτέρω την παραγωγή κυτταροκινών. Η τελική κατάληξη είναι η ενεργοποίηση των αστροκυττάρων που οδηγεί στην ίνωση (176) 29 Σ ελίδα

34 Τα γλυκοκορτικοειδή (GCs) Τα γλυκοκορτικοειδή και από τις δύο πηγές εξωγενή και ενδογενή είναι μια καλά αναγνωρισμένη αιτία της NAFLD. Οι ασθενείς με σύνδρομο Gushing s που έχουν αυξημένα επίπεδα GCs αναπτύσσουν ένα χαρακτηριστικό μεταβολικό φαινότυπο της κεντρικού τύπου παχυσαρκίας, IR και ΣΔΙΙ. Είναι σημαντικό ότι μεγάλο μέρος αυτών των ασθενών θα αναπτύξει επίσης ηπατική στεάτωση (183). Οι μηχανισμοί μέσω των οποίων GCs προάγουν την ηπατική συνάθροιση λίπους περιλαμβάνουν αναστολή της μιτοχονδριακής β-οξείδωσης και προώθηση της DNL στα ηπατοκύτταρα. Ωστόσο οι περισσότεροι ασθενείς με NAFLD έχουν φυσιολογικά επίπεδα κυκλοφορούσας κορτιζόνης πράγμα που υποδηλώνει ότι ιστό ειδικοί μηχανισμοί οδηγούν αυτήν την μεταβολική δυσλειτουργία. Αυτό έχει οδηγήσει σε αναδυόμενο ενδιαφέρον προς δυο ενζυμικά συστήματα που παίζουν έναν ρόλο κλειδί στον τοπικό μεταβολισμό και την επακόλουθη διαθεσιμότητα των GCs προς δέσμευση και ενεργοποίηση του υποδοχέα GCs: 11β-υδροξυστεροειδική αφυδρογονάση τύπος-1 (11b hydroxysteroid dehydrogenase typ1: 11b- HSD1) που μετατρέπει την ανενεργή κορτιζόνη προς ενεργό δραστική κορτιζόνη (GC) και έτσι αυξάνονται τα τοπικά δραστικά επίπεδα GC και ενισχύεται η GC δράση τους (184). Αναστολή της 11b-HSD1 έχει αποδειχθεί ότι μειώνει το σωματικό βάρος και τα επίπεδα λιπιδίων και βελτιώνει την ανοχή γλυκόζης σε ζώα μοντέλα και επίσης αυξάνει την ηπατική ευαισθησία στην ινσουλίνη στους ανθρώπους (185). Παράλληλα τα ένζυμα: Α-δακτυλίου ρεδουκτάση (A-ringreductase), 5a και 5b ρεδουκτάση, ευθύνονται για τον μεταβολισμό της κορτιζόλης στον ανενεργό τετραϋδρομεταβολίτη της. Αυξημένη ηπατική 5a ρεδουκτάση (5aR) σε δραστική μορφή, έχει φανεί σε ασθενείς με IR (184) και NAFLD (185) και μπορεί να αντιπροσωπεύει έναν αντισταθμιστικό μηχανισμό για μείωση της τοπικής διαθεσιμότητας ενεργών GCs σαν μια προσπάθεια να αποτραπεί η ανάπτυξη και εξέλιξη της NAFLD. Σε ζώα μοντέλα, τόσο με φαρμακευτική αγωγή όσο και με διαγονιδιακή αναστολή της δραστηριότητας της 5aR δραστηριότητας, έχει φανεί αύξηση της ευαισθησίας προς ανάπτυξη IR και λιπώδους ήπατος (186).Επομένως περιορισμός, σε τοπικό επίπεδο, της ηπατικής έκθεσης σε ενεργοποιημένα γλυκοκορτικοειδή (GCs) μέσω διαφοροποίησης 11b-HSD1 και του Α-δακτυλίου ρεδουκτάσων (ars) μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή θεραπευτική παρέμβαση για την πρόληψη της ανάπτυξης και της εξέλιξης της NAFLD (εικόνα 8). ΙΝΩΣΗ Ίνωση και η πιο προχωρημένη μορφή της (κίρρωση), αντιπροσωπεύουν το τελικό κοινό «μονοπάτι» σχεδόν όλων των ασθενειών του ήπατος, συμπεριλαμβανομένης και της NAFLD NASH. Προχωρημένη ίνωση οδηγεί σε ηπατική ανεπάρκεια και πυλαία υπέρταση με τις αντίστοιχες επιπλοκές του ασκίτη, την απειλητική για την ζωή κιρσορραγία καθώς και τον αυξημένο κίνδυνο για Η.Κ.Κ(187).Υπάρχουν ορισμένες πτυχές της ηπατικής ίνωσης και «επιδιόρθωσης» που θεωρούνται ειδικές για την NASH. Στις περισσότερες συνθήκες ηπατικής βλάβης προκύπτει «επισκευή» μέσω αναπαραγωγής των ώριμων ηπατοκυττάρων(188). Ωστόσο η συνεχής παρουσία των εν εξελίξει «ζημιογόνων» παραγόντων, όπως η NASH ή η ιογενής μόλυνση, συσχετίζεται με υψηλά επίπεδα οξειδωτικού στρες που περιορίζει την ικανότητα των ώριμων ηπατοκυττάρων να πολλαπλασιάζονται. Σε αυτή την κατάσταση, άλλες οδοί ηπατικής αναγέννησης συμμετέχουν και επιστρατεύονται τα ηπατικά προγονικά κύτταρα (HPCs: Hepatic progenitor cells). Τα HPCs είναι κύτταρα ενίσχυσης της διακίνησης που κατοικούν στο κανάλι του Hering και τα οποία πολλαπλασιαζόμενα σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα μικρών σωληναρίων «πόρων» και χολαγγειοκυττάρων γνωστό ως «σωληναριακή» ή «πορώδης» αντίδραση. Ο όρος χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά προς αναγνώριση του επεκτεινόμενου πληθυσμού των επιθηλιακών κυττάρων που βρίσκονται στην μεσόφαση αναπαραγωγής του χοληφόρου δένδρου και των ηπατοκυττάρων και αναφέρεται στον πολλαπλασιασμό των προϋπαρχόντων «πόρων», την ενεργοποίηση των προγονικών κυττάρων και την εμφάνιση των ενδιάμεσων ηπατοκυττάρων(189). Ακολούθως αυτά τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαφοροποιηθούν σε χολαγγειοκύτταρα και ηπατοκύτταρα και να συμβάλλουν στην ηπατική «επισκευή». Η διαταραχή μιας τέτοιας «σωληναριακής» απάντησης από τα προγονικά ηπατικά κύτταρα (HPCs), έχει φανεί σε ασθενείς που μεταμοσχεύονται για NASH οι οποίοι έχουν απονευρωμένο ήπαρ. Αυτή η αδυναμία μπορεί να ευθύνεται για μια πιο εξελικτική μορφή ηπατικής βλάβης(5). Διαμάχη εξακολουθεί να υπάρχει στην βιβλιογραφία, σχετικά με την αλληλεπίδραση της «σωληναριακής» αντίδρασης και ίνωσης στην NAFLD. Αρχικές εργασίες έδειξαν μια στενή σύνδεση ανάμεσα στην ανάπτυξη των HPCs και την «σωληναριακή» αντίδραση σε δείγματα ηπατικών βιοψιών ασθενών με NASH. Η έκταση των «σωληναριακών» αντιδράσεων με την 30 Σ ελίδα

35 σειρά της συσχετίζεται ισχυρά με τον βαθμό ίνωσης, προτείνοντας ότι η HPCς εξάπλωση/ σωληναριακή αντίδραση μπορεί να ευθύνεται για την διέγερση προοδευτικής περιπυλαίας ίνωσης(190).πιθανοί μηχανισμοί γι αυτήν την κατάσταση (περιπυλαία ίνωση λόγω HPCς εξάπλωσης/σωληναριακής αντίδρασης) περιλαμβάνουν την έκκριση προϊνωτικών κυτταροκίνων {TGF-b, IL-6, IL-8, και MCP-1: monocyte chemotactic protein 1 ή αλλιώς CCL2 : chemokine C-C motif ligand 2} από την σωληναριακή αντίδραση(191), καθώς και η άμεση επιθηλιακή μεσεγχυματική μετάβαση των χολαγγειοκυττάρων σε μυοϊνοβλάστες (116,192) (Εικόνα 11). Αυτή η υπόθεση είναι ελκυστική δεδομένου ότι παρέχει μια λογική για την δημιουργία πυλαίας ίνωσης στην NAFLD που είναι το βασικό χαρακτηριστικό της εξελισσόμενης νόσου. Πιο πρόσφατη εργασία σε CDE (choline-deficient) μοντέλα ποντικών με NAFLD, έδειξε ότι η ηπατική ίνωση προηγείται του πολλαπλασιασμού των HPCs προτείνοντας ότι η ίνωση δεν εμφανίζεται βραδέως ως αποτέλεσμα της HPCs επέκτασης (193).Η χρονική στιγμή της παρουσίας διαφοροποιημένων ιστολογικών ευρημάτων, σχετικά με περεταίρω αξιολόγηση, είναι λιγότερο ξεκάθαρη(194) αυξάνοντας την πιθανότητα μιας πιο πολύπλοκης αλληλεπίδρασης μεταξύ ίνωσης και HPCς επέκτασης, στην οποία και οι δυο κυτταρικές διαδικασίες μπορούν να διεγείρουν η μια την άλλη αντιστοίχως. Πράγματι η δημιουργία ενός εξειδικευμένου προγονικού κυττάρου με εναπόθεση θεμέλιας ουσίας μπορεί να δρα όχι μόνο σαν μια μεταναστευτική οδός των HPCs, ώστε να μπορούν να μεταναστεύουν κατά μήκος του αυλού της πυλαίας μέσα στο παρέγχυμα, αλλά επίσης να παρέχει τροφικούς παράγοντες για την επιβίωση αυτών των κυττάρων(116,193,194). Εικόνα 11: Journal of Gastroenterology and Hepatology 2013; 28 (Suppl. 1): 68 76(116) Παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί της εξέλιξης της ηπατικής στεάτωσης στην NAFLD σε ΙΝΩΣΗ. Η αντίσταση στην Ins και μια δυσμενής χρησιμοποίηση των FFAs αυξάνουν το περιεχόμενο του ήπατος σε τριγλυκερίδια και προάγουν την ηπατική στεάτωση. Η ανικανότητα της επεξεργασίας της περίσσειας λιπιδίων σε μια μεταβολικά μη τοξική διαδικασία, προάγει την φλεγμονή και ίνωση γιατί δημιουργεί συνθήκες χρόνιου οξειδωτικού στρες, λιπο-απόπτωσης, και απελευθέρωσης κυτταροκινών από προγονικά ηπατικά κύτταρων (HPCs: Hepatic progenitor cells). FFA: free fatty acids, HCC: hepatocellular carcinoma, IL: interleukin, NAFL: non-alcoholic fatty liver disease,tnf-α: tumor necrosis factor-α. Γενετική Προδιάθεση Παρ ότι η ηπατική στεάτωση είναι συνήθης σε ασθενείς με παχυσαρκία και IR, μόνο μια μειοψηφία ασθενών εξελίσσονται σε NASH και ίνωση κίρρωση προτείνοντας ότι υπάρχει μια ενδιαφέρουσα αλληλεπίδραση ανάμεσα σε γενετική προδιάθεση και περιβαλλοντικούς παράγοντες(17). Πολυμορφισμός σε γονίδια σχετιζόμενα με τον μεταβολισμό των λιπιδίων, IR, οξειδωτικό στρες, κυττοκίνες / αντιποκίνες και ινογένεση, μπορεί όλα να αυξάνουν την ευαισθησία του οργανισμού προς ανάπτυξη NASH(195). Αρκετές μελέτες έχουν αναγνωρίσει πολυμορφισμούς μονών νουκλεοτιδίων (single nucleotide polymorphisms: SNPs) που επηρεάζουν την ανάπτυξη ίνωσης σε άλλες ηπατικές ασθένειες, ιδιαίτερα στην χρόνια ηπατίτιδα C( ). Μελέτες στην NASH έχουν αποδείξει μέχρι σήμερα πολυμορφισμό στα γονίδια του αγγειοτενσινογόνου και TGF-b1 που συνδέονται με προχωρημένη ηπατική ίνωση σε παχύσαρκους ασθενείς(199). Επιπροσθέτως SNPs στον υποδοχέα τύπου 1 της αγγειοτενσίνης ΙΙ συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο της NAFLD και σχετιζόμενης με NAFLD ίνωσης(200). Απαιτούνται επιπλέον μελέτες προς αναγνώριση υποψηφίων γονιδίων που αναμφίβολα θα μας δίνουν πληροφορίες όχι μόνο για την παθογένεια και την πρόγνωση της νόσου, αλλά μπορεί να αντιπροσωπεύουν νέους στόχους θεραπείας. 31 Σ ελίδα

36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ο ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ Ή ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΤΡΑΤΗΓΙΚΗ ΣΕ ΝΑFLD/ΝASH ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Η ΝΑFLD είναι συνήθως ασυμπτωματική νόσος. Επομένως οι περισσότεροι ασθενείς με ΝΑFLD σε οποιοδήποτε στάδιο (NAFL, NASH, NASH-ίνωση, αντιρροπούμενη κίρρωση) συμπεριλαμβανόμενων ενηλίκων και παιδιών, είναι ασυμπτωματικοί κατά την παρουσίαση (30). Όταν υπάρχουν κλινικά συμπτώματα και φυσικά σημεία, είναι μη ειδικά και αναξιόπιστα για την εκτίμηση της σοβαρότητας της νόσου σε ασθενείς με αντιρροπούμενη ηπατική νόσο. Πιο συχνά κλινικά σημεία και συμπτώματα: Κλινικά χαρακτηριστικά μεταβολικού συνδρόμου: α) Αντίσταση στην Ins Η μελανίζουσα ακάνθωση αποτελεί μια δερματική εκδήλωση της αντίστασης στην Ins, εμφανίζεται πιο συχνά στους παιδιατρικούς πληθυσμούς και βρέθηκε ότι αποτελεί κλινική εκδήλωση στο 12% του συνόλου των ΝΑFLD ασθενών (14). Εκδηλώνεται ως μία περιφερική υπέρχρωση του δέρματος, συνήθως γύρω από το λαιμό, πάνω από τις αρθρώσεις, τους αγκώνες και τα γόνατα. Η αναγνώρισή της, αποτελεί για τους κλινικούς γιατρούς μία φυσική ένδειξη της αντίστασης στην Ins και δίνει την ευκαιρία στην εκπαίδευση των ασθενών σχετικά με την υποκείμενη αιτία αυτής της συχνά αυξημένης αλλαγής του δέρματος (14,31). β) Κεντρικού τύπου παχυσαρκία. γ) Κλινικά χαρακτηριστικά ΣΔ ΙΙ όπως: πολυουρία, πολυδιψία, πτώση ΣΒ, ξηροδερμία κ.λπ. δ) Κλινικά χαρακτηριστικά Δυσλιπιδαιμίας (Υπερτριγλυκεριδαιμίας) όπως οξεία παγκρεατίτιδα. ε) Υπέρταση. στ) Αποφρακτική άπνοια στον ύπνο (OSA: Obstructive sleep apnea) (4). Μία πρόσφατη μελέτη δημοσίευσε το νέο εύρημα ότι η οπισθοτραχηλική λιποϋπερτροφία ήταν η ανθρωπομετρική παράμετρος που συνδεόταν πιο έντονα με τη σοβαρότητα της στεατοηπατίτιδας (4). Οι ανωτέρω κλινικοί δείκτες του μεταβολικού συνδρόμου, καθώς και η μεγάλη ηλικία και μάλλον το θήλυ φύλλο, φαίνεται να αποτελούν κλινικά χαρακτηριστικά και ιστορικά δεδομένα που συσχετίζονται περισσότερο με τη βαρύτητα της νόσου, δηλαδή την εξέλιξή της σε NASH - ίνωση (4,14). Ωστόσο η ακρίβεια και η χρησιμότητα αυτών των μεταβλητών προς τη διάγνωση τη ΝΑSH και προς τον καθορισμό της παρουσίας ίνωσης έχουν εκτιμηθεί μόνο σε μικρό πληθυσμό μελετών, στις οποίες έχουν δημιουργηθεί ειδικά κλινικά μοντέλα ή αλγόριθμοι με συνδυασμό αυτών των μεταβλητών με αρκετούς βιολογικούς δείκτες (31). Για το σκοπό αυτό η ομάδα κλινικής έρευνας για την NASH στην Αμερική (NASH CRN: NASH Clinical Research Network) που διαμορφώθηκε με σκοπό τη διεξαγωγή πολυκεντρικών μελετών σχετικών με την αιτιολογία, παθογένεια, φυσική ιστορία, διάγνωση και θεραπεία της NASH (14), μελέτησε ασθενείς μεταξύ με υποψία ΝΑFLD/NASH και κλινικά χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου. Οι ασθενείς της μελέτης ήταν ενήλικες, πολλών μικρότερων ερευνητικών κέντρων, με παρόμοια κριτήρια εισόδου υποψίας ΝΑFLD(χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου), στους οποίους έγιναν εργαστηριακές εξετάσεις και βιοψία ήπατος (στους 698 ασθενείς) σε μεταβαλλόμενα χρονικά διαστήματα και υπάρχουν οι προοπτικές για τη μελλοντική είσοδο και άλλων ασθενών με παρόμοια κριτήρια εισόδου. Έτσι παρουσιάστηκαν κάποιοι πίνακες που συσχετίζουν τα κλινικά χαρακτηριστικά της ΝΑFLD και δη τα κλινικά χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου, με βιοψιακά ευρήματα και εργαστηριακά δεδομένα της σοβαρότητας της ΝΑFLD και της εξέλιξής της σε NASH-ίνωση. 32 Σ ελίδα

37 Πίνακας 1 NASH Clinical Research Network.(Bass N.M, Brunt E.M,Clark J.M,et al)κλινικές, εργαστηριακές και ιστολογικέςσυνδέσεις σε ενήλικες με ΝΑFLD Hepatology. Sep 2010; 52(3): (14) Δημογραφικά ΜΕΤΑΒΛΗΤΕΣ Ν=1266 Άνδρες( )(%) 36 Ηλικία (έτη) (μέση τιμή) 50 Λευκοί (%) 82 Ισπανοί (%) 10 Κλινικά Υπέρταση (%) 49 ΣΔΙΙ (%) (Σακχαρώδης Διαβήτης ΙΙ) 231 Μεταβολικό Σύνδρομο (%) 61 Μελανίζουσα Ακάνθωση (%) 12 Κίρρωση βασιζόμενη ή απεικόνιση ή βιοψία (%) 14 Ανθρωπομετρικά Δείκτης Μάζας Σώματος (ΒΜΙ kgr/m²) (μέση τιμή) 33 Περίμετρος μέσης (cm) (μέση τιμή) 108 Ηπατολογικές Εξετάσεις AST (U/L) (μέση τιμή) 41 Ανωμαλία AST (%) 41 ALT (U/L) (μέση τιμή) 56 Ανωμαλία ALT (%) 55 ALT/AST (μέση τιμή) 0,76 ALP (U/L) (μέση τιμή) 82 Ανωμαλία τιμής ALP (%) 4 GGT U/L (μέση τιμή) 47 Σφαιρίνη g/dl (μέση τιμή) 3 Αλβουμίνη g/dl (μέση τιμή) 4,2 Χολερυθρίνη ολική mg/dl (μέση τιμή) 0,7 Χολερυθρίνη άμεση mg/dl (μέση τιμή) 0,1 Αιματολογικές και Άλλες Εργαστηριακές Εξετάσεις Η+ (%) 42 Λευκά αιμοσφαίρια (μέση τιμή) 6500 PLT (μέση τιμή) Ολική Χοληστερόλη mg/dl (μέση τιμή) 1,92 HDL mg/dl (μέση τιμή) 43 LDL mg/dl (μέση τιμή) 117 Τριγλυκερίδια mg/dl (μέση τιμή) 144 HbA1c (%) 5,7 Γλυκόζη ορού νηστείας - mg/dl (μέση τιμή) 97 Ινσουλίνη ορού νηστείας - μu/ml (μέση τιμή) 18 HOMA-IR mg/dl (μέση τιμή) 4,4 ANA (% θετικό) 24 ASMA (% θετικό) 14 ANA+ASMA (% θετικότητα και των δύο) 5 33 Σ ελίδα

38 AMA (% θετικό) 4 Φερριτίνη ng/ml 136 Ιστολογικά Ν=698 Στεάτωση (%) 54 Λοβιδιακή Φλεγμονή (% grade 2) 47 Πυλαία Φλεγμονή (% > F2) 24 Ballooning ηπατοκύτταρα (%) 66 NAS score (% 5) 47 Ιστολογική παρουσίαση NASH (%) 57 Mallory Σωμάτια (% παρουσία) 30 Μήκος βιοψία (% < 10mm) 14 Μέση τιμή staging (βαθμού) ίνωσης 2 Χαρακτηριστικά των ενήλικων ασθενών με ΝΑFLD που συμμετείχαν στις μελέτες της ΝΑSH CRN. Φαίνεται, λοιπόν, από τον παραπάνω πίνακα, ότι παρά του ότι κανένα από τα κλινικά χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου (παχυσαρκία, υπέρταση, ΣΔ ΙΙ, δυσλιπιδαιμία κ.ά.) δεν είναι ικανό από μόνο του να προβλέψει με βεβαιότητα τη NASH, η NASH είναι ασυνήθης επί απουσίας τους. Εύκολη κόπωση Η εύκολη κόπωση αποτελεί ένα μη ειδικό σύμπτωμα ασθενών με ΝΑFLD όπως και άλλων χρόνιων ηπατοπαθειών (4). Έχει αποδοθεί στο OSA που παρατηρείται συχνά σε τυπικό παχύσαρκο πληθυσμό με ΝΑFLD. Ηπατομεγαλία Η ηπατομεγαλία αποτελεί το πιο συχνό εύρημα όσο δεν υπάρχουν κλινικά σημεία κίρρωσης. Περιοδικό άλγος δεξιού άνω κοιλιακού τεταρτημορίου Το περιοδικό άλγος δεξιού άνω κοιλιακού τεταρτημορίου, όπως και αίσθημα βάρους στο δεξιό υποχόνδριο είναι άτυπα συχνά συμπτώματα σε χρόνιες ηπατοπάθειες. Σπληνομεγαλία Η σπληνομεγαλία αποτελεί χαρακτηριστικό πυλαίας υπέρτασης λόγω κίρρωσης. Εκδηλώσεις ηπατικής ανεπάρκειας Εκδηλώσεις ηπατικής ανεπάρκειας όπως: ασκίτης, ηπατική εγκεφαλοπάθεια, ηπατονεφρικό, αιμορραγική διάθεση, ίκτερος κ.λπ., μπορεί να εμφανισθούν στα πλαίσια NASH-μη αντιρροπούμενης κίρρωσης. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Απλοί βιοδείκτες ρουτίνας Αμινοτρανσφεράσες ορού (ALT, AST) Οι αμινοτρανσφεράσες ορού αποτελούν έναν έλεγχο ρουτίνας προς ανίχνευση γενικά ηπατικής νόσου, αλλά η ειδικότητα και ευαισθησία τους για NAFL - NASH - NASH/ίνωση ή κίρρωση είναι χαμηλές και τα αποτελέσματα μπορεί να είναι πολύ διαφορετικά μεταξύ των μελετών προς το παρόν (14). Αυξημένα επίπεδα αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης (ALT) και ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης (AST) μπορούν να αντανακλούν την παρουσία ηπατικής στεάτωσης, φλεγμονής και ίνωσης αν και είναι πολύ σπάνια μεγαλύτερες από 5X πάνω από τα ανώτερα φυσιολογικά όρια (10,14, 31). Αν και τα επίπεδα ALT τείνουν να είναι υψηλότερα σε ασθενείς με ΝΑFLD σε σχέση με αυτούς χωρίς ΝΑFLD, πληθυσμιακές μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα ALT 34 Σ ελίδα

39 είναι εντός των φυσιολογικών ορίων στο 88% των ασθενών με λιπώδες ήπαρ (10). Φαίνεται δε ότι τα 2/3 των NASH ασθενών, έχουν φυσιολογικές τιμές ALT και AST σε δεδομένη χρονική στιγμή (32). Τα επίπεδα AST και ALT, τείνουν να πέσουν με την πάροδο του χρόνου καθώς η ηπατική στεάτωση και η φλεγμονή βελτιώνονται, αλλά η ίνωση εξελίσσεται. Όταν επικρατήσει η ηπατική ίνωση η αναλογία ALT/AST μπορεί να αντιστραφεί (10,30,32). Αρκετές μελέτες ασθενών που υποβάλλονται σε βιοψία ήπατος ή σε χειρουργική επέμβαση για νοσογόνο παχυσαρκία, έχουν δείξει ότι τα επίπεδα ALT είναι υψηλότερα παρουσία NASH απ ότι σε εκείνους με απλό λιπώδες ήπαρ. Αλλά αυτό δεν έχει παρατηρηθεί παγκοσμίως. Επιπλέον, πολλές σειρές αναφέρουν παρόμοια διακύμανση ιστολογικών αλλαγών ανάμεσα σε ασθενείς με αυξημένα ή φυσιολογικά επίπεδα ALT (10,11,30,32). Χρησιμοποιώντας ROC καμπύλη ανάλυσης, η ακρίβεια της τιμής της ALT για τον καθορισμό της NASH σε 139 ασθενείς με ΝΑFLD ήταν μόνο 0.58 (95% CI 0,49-0,68). Mια παρόμοια πτωχή διαγνωστική απόδοση των τιμών AST και ALT, για τη διάκριση της NASH από την απλή ηπατική στεάτωση, βρέθηκε επίσης σε 54 ασθενείς από την Τουρκία όπου οι τιμές τους, παρείχαν ακρίβεια (AUC) 0,61 για τη διάκριση της NASH από την απλή ηπατική στεάτωση (10,11,31,32). Η ακρίβεια διαφορετικών ALT cut-offs για τη διάγνωση NASH, εξετάσθηκε σε μία σειρά από 233 γυναίκες που υποβλήθηκαν σε βαριατρική χειρουργική επέμβαση (10,11,30,32). Μείωση του cutoff από την τιμή 30 IU/l στην τιμή 19 IU/l βελτίωνε την ευαισθησία για τη διάγνωση της NASH από 42% έως 72%, ωστόσο αυτό έγινε σε βάρος της ειδικότητας η οποία έπεσε από το 80 στο 42%. Δηλαδή η ορθότητα της τιμής της ALT για τη διάγνωση της NASH ήταν < 40% (105). Επομένως ασθενείς με ΝΑFLD που έχουν υψηλά επίπεδα ALT είναι πιο πιθανό να έχουν NASH. Ωστόσο NASH και προχωρημένη ίνωση δεν μπορούν να αποκλεισθούν βασιζόμενες σε φυσιολογικά επίπεδα ALT (10,11,201,202). Επιπλέον μελέτη του Morfad et al έδειξε ότι ολόκληρο το ιστολογικό φάσμα της NASH μπορεί να φαίνεται σε ασθενείς με φυσιολογικές τιμές τρανσαμινασών (201). Γενικά οι περισσότερες μελέτες έχουν αποτύχει να επιβεβαιώσουν τη σύνδεση μεταξύ των τιμών αμινοτρανσφερασών ορού και σοβαρότητας NASH σε ΝΑFLD ασθενείς (30,32). Eπίσης επιπλέον μελέτες που συνέκριναν ΝΑFLD ασθενείς με εμμένουσα αύξηση επιπέδων ALT ορού, σε σχέση με ΝΑFLD ασθενείς με φυσιολογικές τιμές ALT, δεν βρήκαν διαφορές στην επικράτηση προχωρημένης ίνωσης και κίρρωσης ανάμεσα στις δύο ομάδες (10,11.202). Επομένως η αξία της ανίχνευσης ασθενών με NASH και NASH/ίνωση μέσω αυξημένων επιπέδων ALT παραμένει υπό αμφισβήτηση (10,11). Μάλιστα φαίνεται στις περισσότερες μελέτες ότι οι ασθενείς με προχωρημένη NASH-ίνωση έχουν χαμηλότερες τιμές ALT από εκείνους με ήπια ή καθόλου ίνωση..επομένως οι τιμές ALT δεν έχουν κανένα ρόλο στον εντοπισμό ΝΑFLD ασθενών με προχωρημένη ίνωση. Πολλοί γιατροί στηρίζονται υπερβολικά στα επίπεδα ALT ως υποκατάστατος δείκτης της σοβαρότητας της NASH. Αυτό είναι λανθασμένο γιατί οι περισσότερες μελέτες το αμφισβητούν. Επί του παρόντος δεν μπορεί να υπάρχει καθοδήγηση των γενικών γιατρών σχετικά με το ποιοι ασθενείς με ΝΑFLD θα πρέπει να οδηγηθούν στη δευτεροβάθμια φροντίδα για περαιτέρω αξιολόγηση, εκτιμώντας μόνο τα επίπεδα αμινοτρανσφερασών ορού. Αλκαλική Φωσφατάση (ALP) και γ-τρανσγλουταμινάσης( γ-gt) Οι τιμές ALP ή γgt ή και οι δύο μαζί είναι ήπια αυξημένες σε πολλούς ασθενείς με ΝΑFLD. Ωστόσο η χρησιμότητά τους για τη διάγνωση ΝΑFLD/NASH είναι κακή (31). Έχει αναφερθεί ότι η αύξηση της τιμής της γ-gt μπορεί να αποτελεί έναν έμμεσο δείκτη αυξημένης θνητότητας σε NASH ασθενείς, χωρίς όμως να έχει επικρατήσει αυτή η άποψη (203). Φερριτίνη 50% των ΝΑFLD ασθενών παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα φερριτίνης ορού και ένα 10% παρουσιάζουν αυξημένο κορεσμό τρανσφερίνης (4). Αυτά τα ευρήματα, γενικά δεν φαίνεται να σχετίζονται με αύξηση της ηπατικής συγκέντρωσης σιδήρου (Fe )και ο ρόλος του ηπατικού Fe στην παθογένεια της NASH παραμένει ασαφής (204,205). Δείκτες Συνθετικής Ηπατικής Λειτουργίας Αρκετές ρουτίνας εργαστηριακές εξετάσεις λειτουργικότητας του ήπατος, μπορεί να είναι ανώμαλες επί παρουσίας προχωρημένης ηπατικής νόσου και συγκεκριμένα επί κίρρωσης και δη μη αντιρροπούμενης: Αλβουμίνη, ΧΠ, χολερυθρίνη (31) 35 Σ ελίδα

40 Αιμοπετάλια (PLT) Επί παρουσίας υπερσπληνισμού, λόγω πυλαίας υπέρτασης σε έδαφος προχωρημένης ηπατικής νόσου, έχουμε πτώση της τιμής PLT στο αίμα (31). Oι ανωτέρω δείκτες συνθετικής λειτουργίας του ήπατος και τα PLTs, βοηθούν στην αξιολόγηση της σοβαρότητας της ηπατικής αντιρρόπησης, αλλά δεν είναι ευαίσθητοι για την ανίχνευση μη κιρρωτικού σταδίου ΝΑFLD/ίνωσης. Αυτοαντισώματα Αυτοαντισώματα ανιχνεύονται σε ασθενείς με ΝΑFLD. Αυτό μπορεί να εγείρει ερωτηματικά σχετικά με το αίτιο της ηπατικής νόσου, όπως η παραγνωρισμένη PBC (πρωτοπαθής χολική κίρρωση) και η αυτοάνοσος ηπατίτιδα (14). Η ομάδα NASH CRN στη μελέτη των ασθενών με ΝΑFLD από πολλά κέντρα, αλλά και ερευνητές με άλλες μικρότερες μελέτες υποστηρίζουν ότι οι ασθενείς με ΝΑFLD έχουν στο 5% (+) ΑΜΑ (αντιμιτοχονδριακά αντισώματα) χωρίς ιστολογικές αποδείξεις PBC. Στη μελέτη της ομάδας NASH CRN το 1/3 των ασθενών είχαν (+) ΑΝΑ (αντιπυρηνικά αντισώματα) ή ASMA (αντί λείων μυϊκών ινών) και το 5% είχαν θετικά και τα δύο αυτοαντισώματα, χωρίς ιστολογικές αποδείξεις αυτοανόσου ηπατοπάθεια (14). (Πίνακας 1). Επιβεβαίωση έχουμε και από μικρότερες μελέτες ( ). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Υπάρχει μεγάλος αριθμός διαφορών σε κλινικούς και εργαστηριακούς παράγοντες που σχετίζονται με τα προοδευτικά στάδια της NASH- ίνωσης. Αξιοσημείωτες εξαιρέσεις αποτελούν ο ΣΔ ΙΙ, η αυξημένη ηλικία, ο λόγος AST/ALT και η σχετική πτώση των PLT (γνωστό ότι εμφανίζεται με την ανάπτυξη κίρρωσης) (14). Αυτές οι μεταβολές έχουν προκύψει με συνέπεια σε διάφορες μελέτες ως προγνωστικοί δείκτες της παρουσίας προχωρημένης ίνωσης ( ). Ασθενείς με μη αντιρροπούμενη κίρρωση εξαιρέθηκαν των μελετών και συνεπώς άλλες αλλαγές όπως υπολευκωματιναιμία και διαταραχές της πήξης δεν παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με κίρρωση ΝΑFLD. ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΤΙΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΡΟΥΤΙΝΑΣ Έλεγχος ηπατικής στεάτωσης (NAFL) Διαδερμική υπερηχογραφία (Ultrasound: US) Aποτελεί την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη τεχνική ανίχνευσης της ηπατικής στεάτωσης σε ασθενείς με υποψία ΝΑFLD (4,11,31). Η λιπώδης διήθηση του ήπατος παράγει μία διάχυτη αύξηση της ηχογένειας του ηπατικού παρεγχύματος στον υπέρηχο που μπορεί να αντιπαραβληθεί με τη χαμηλότερη ηχογένεια του σπληνός ή του νεφρικού φλοιού (10,11). Ένα παρόμοιο μοτίβο μπορεί να απεικονιστεί στη διάχυτη ηπατική ίνωση δίνοντας αφορμή για τον όρο «Λιπαρό ινώδες Μοτίβο», αν και οι ηχητικές σκιές τείνουν να είναι χονδροειδείς, παρουσία καθαρής ίνωσης (10,11). H ευαισθησία και η ειδικότητα των υπερήχων για την ανίχνευση της ηπατικής στεάτωσης, ποικίλουν από 60-94% και από 88-95% αντιστοίχως (4,10,11,31, ). Η ευαισθησία και η ειδικότητα φτάνουν στα ανώτερα όριά τους, δηλαδή 94% και 95% αντίστοιχα όταν η ηπατική στεάτωση καταλαμβάνει τουλάχιστον ποσοστό 30% του ηπατικού παρεγχύματος. Eπομένως, η ευαισθησία και η ειδικότητα αναγνώρισης ηπατικής στεάτωσης, μέσω υπερήχων, μειώνονται όσο μικρότερη είναι η λιπώδης διήθηση. Το US είναι χρήσιμο για τη διάγνωση της σοβαρής στεάτωσης, η ευαισθησία του μειώνεται απότομα στο 55% όταν η ηπατική περιεκτικότητα σε λίπος κυμαίνεται από 10-19%. Η υπερηχογραφική ευαισθησία για την ανίχνευση της ηπατικής στεάτωσης, μειώνεται προοδευτικά καθώς αυξάνει το ΒΜΙ (Body Mass Index:Δείκτης Μάζας Σώματος). Σε ασθενείς με νοσογόνο παχυσαρκία, δηλαδή με BMI 35 Κg/m 2, η υπερηχογραφική ευαισθησία αναγνώρισης της ηπατικής στεάτωσης, πέφτει απότομα σε ποσοστά < 40%. Αυτό πιθανώς να οφείλεται σε τεχνικές δυσκολίες κατά την εκτέλεση του US σε τέτοιους ασθενείς, όπως η εξασθένηση της ηχητικής ακτίνας από μεγάλη ποσότητα υποδορίου λίπους. Επομένως ακριβής ποσοτικοποίηση του βαθμού στεάτωσης δεν είναι εύκολη με την τρέχουσα τεχνολογία των υπερήχων άνω κοιλίας. Διαφορετικές υπερηχογραφικές παράμετροι, που περιλαμβάνουν τη μορφή του κύματος στο Doppler ηπατικής φλέβας και την παρουσία εστιακών υπόηχων περιοχών εκτός του 36 Σ ελίδα

41 ηπατικού χείλους, έχουν εκτιμηθεί ως προγνωστικοί δείκτες ηπατικής στεάτωσης. Ωστόσο και αυτοί οι δείκτες έχουν χαμηλή ακρίβεια εξαιρούμενης της απλής ηπατικής στεάτωσης (31). Τέλος το US άνω κοιλίας, είναι ανίκανο να υπολογίσει το ποσοστό λίπους που περιέχεται στο ήπαρ ή να παρέχει οποιαδήποτε σταδιοποίηση της νόσου (213,214). Υπολογιστική τομογραφία (Computed Tomography : CT) Αξονική Τομογραφία (CT) Άνω Κοιλίας Στην απλή CT κοιλίας, επί ύπαρξης ηπατικής στεάτωσης, το ήπαρ εμφανίζεται με χαμηλότερη πυκνότητα απ ότι ο σπλήνας (10,11). Η πυκνότητα του ήπατος μειώνεται καθώς αυξάνεται το λίπος. Η CT έχει μια ευαισθησία 50-86% και ειδικότητα 75-87% για την ανίχνευση της απλής ηπατικής στεάτωσης (213,215,216). Θεωρητικά, το μεγάλο πλεονέκτημα της CT συγκριτικά με το US, είναι ότι η πυκνότητα του ήπατος μπορεί να μετρηθεί αντικειμενικά με μονάδες Hounsfield (Hounsfield Units ή HU). Οι HU απεικονίζονται με την κλίμακα του γκρι που εκφράζει το ποσό της ακτινοβολίας που απορροφάται. Παράγοντες όπως ο Fe ή Cu ++, καθώς και η ύπαρξη ινώδους ιστού, προκαλούν σύγχυση γιατί μεταβάλλουν την πυκνότητα Hounsfield του ήπατος. Επίσης οι διαφοροποιήσεις στο ρυθμό της αντίθετης έγχυσης και του χρονοδιαγράμματος της σάρωσης, μπορεί να εξηγήσουν τις διαφορές στη διαγνωστική ακρίβεια που αναφέρονται σε διάφορες μελέτες. Συνολικά η ευαισθησία της CT για την ανίχνευση ηπατικής στεάτωσης που καταλαμβάνει ποσοστό > 33% του ηπατικού παρεγχύματος, φτάνει έως το 93% με μία θετική προγνωστική αξία της τάξεως του 76% (15). Ωστόσο, η CT δεν είναι ευαίσθητη στην ανίχνευση ήπιας έως μέτριας ηπατικής στεάτωσης που καταλαμβάνει το 5-30% του ηπατικού παρεγχύματος (217). Μαγνητικός συντονισμός (Magnetic Resonance - MR) H MRI είναι αξιόπιστη στην ιστολογική ανίχνευση ηπατικής στεάτωσης και προσφέρει καλή συσχέτιση με τον όγκο του ηπατικού λίπους (218,219). H ηπατική στεάτωση μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με τη MRI με βάση τις διαφορές του σήματος πρωτονίων μεταξύ του λίπους και του νερού και εμφανίζει καλή συσχέτιση με μικροσκοπικά λιπαρό περιεχόμενο σήμα ( ). Η ευαισθησία και η ειδικότητα στην ανίχνευση της ιστολογικής ηπατικής στεάτωσης με MRI, σε ασθενείς με υποψία NAFLD, όταν έχουμε 5% ηπατική λιπώδη διήθηση (δηλαδή πολύ χαμηλή συγκέντρωση ηπατικού λίπους) είναι 85% και 100% αντίστοιχα (11). Ωστόσο, η εφαρμογή απεικόνισης της ηπατικής στεάτωσης μέσω μαγνητικών εικόνων (MRI) περιορίζεται λόγω του κόστους και της έλλειψης ευρείας διαθεσιμότητας της τεχνικής. Έλεγχος NASH με ή χωρίς ΙΝΩΣΗ Το echo, η CT και η MRI άνω κοιλίας, δεν είναι ευαίσθητες στη διαφοροποίηση απλής ηπατικής στεάτωσης από NASH και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σταδιοποίηση της NASH και της NASH - ίνωσης (218). Σε μία μικρή ομάδα ασθενών με ΝΑFLD που υπέστησαν μελέτη με CT, φάνηκε ότι οι ασθενείς με NASH-ίνωση είχαν αυξημένο μέγεθος ήπατος και αυξημένο κερκοφόρο λοβό ήπατος ως προς το μέγεθος του δεξιού ηπατικού λοβού, συγκρινόμενους με εκείνους που είχαν μόνο ηπατική στεάτωση (NAFL) (217). Η αναλογία μεγέθους κερκοφόρου λοβού/δεξιό ηπατικό λοβό, ήταν στατιστικά υψηλότερη σε NASH-ίνωση ασθενείς (μέση τιμή 0,43 κυμαινόμενη από 0,31-0,55) σε σύγκριση με ΝΑFL ασθενείς (μέση τιμή 0,35 κυμαινόμενη από 0,22-0,47). Ωστόσο, οι μετρήσεις αυτές έδειξαν σημαντικές αλληλοεπικαλύψεις στις 2 κατηγορίες ασθενών και είναι απίθανο ότι οι μετρήσεις αυτές θα φανούν χρήσιμες σε μεμονωμένους ασθενείς. Συμπεράσματα Το συμβατικό echo, η CT ή η MRI άνω κοιλίας, μπορούν μη επεμβατικά, να ανιχνεύσουν την ηπατική στεάτωση και έχουν καλά επίπεδα ακρίβειας προς ανίχνευση κίρρωσης και πυλαίας υπέρτασης. Ωστόσο είναι πολύ λιγότερο αξιόπιστα στην ανίχνευση NASH και των συναφών σταδίων ίνωσης. Τα ακτινολογικά χαρακτηριστικά της σπληνομεγαλίας, η αναστροφή της ηπατικής αιματικής ροής, η αλλαγή στην αναλογία κερκοφόρου / δεξιό ηπατικό λοβό, η στένωση της πυλαίας φλέβας, ενισχύουν την ευαισθησία προς ανίχνευση κίρρωσης με πυλαία υπέρταση, αλλά είναι λιγότερο χρήσιμα σε προηγούμενα στάδια ίνωσης. Ωστόσο, νέες απεικονιστικές τεχνικές όπως υπέρηχο βασιζόμενο στην παροδική ελαστογραφία (Fibro Scan), και MRI 37 Σ ελίδα

42 βασιζόμενη στην ελαστογραφία (MRI elastography), προσφέρουν υποσχέσεις για τον προσδιορισμό της ηπατικής ίνωσης που συνδέεται με NASH. ΒIOΨΙΑ ΗΠΑΤΟΣ Η ηπατική βιοψία αποτελεί επί του παρόντος το μοναδικό διαθέσιμο εργαλείο με τη μεγαλύτερη ακρίβεια τόσο για τη διάκριση μεταξύ ασθενών με NASH με ή χωρίς ίνωση, όσο και για τη σταδιοποίηση της ίνωσης που είναι σημαντική για την παροχή συμβουλών και την παρακολούθηση του ασθενούς. Η Παθολογική Επιτροπή που ευθύνεται για την κλινική έρευνα επάνω στην ΝΑFLD στην Αμερική, σχεδίασε και επικύρωση το 2005 ένα σύστημα ιστολογικής βαθμολόγησης που αντιμετωπίζει το πλήρες φάσμα των ιστολογικών βλαβών στη ΝΑFLD (220). Προς ιστολογική ταξινόμηση του βαθμού φλεγμονής (grading) και βαθμού ίνωσης (staging) της ΝΑFLD, χρησιμοποιήθηκαν οι ηπατικές βιοψίες από 51 NASH ασθενείς από το Κέντρο Επιστημών Υγείας (Health Sciences Center). Προς καθορισμό του βαθμού φλεγμονής, αναλύθηκαν αρχικά 10 ιστολογικές μεταβλητές της δραστηριότητας της νόσου. Έγινε μια αρχική αναλυτική συνολική εκτίμηση της ήπιας, μέτριας και σοβαρής φλεγμονής και οι μεταβλητές που θεωρήθηκαν να είναι πιο σημαντικές, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη του βαθμού φλεγμονής επί NASH. Οι ιστολογικές μεταβλητές που θεωρήθηκε ότι αποτελούν χαρακτηριστικές βλάβες συνδεδεμένες ανεξάρτητα με τη φλεγμονή στη NASH ήταν: Στεάτωση, ballooning ηπατοκύτταρα (οιδηματώδη εκφύλιση ηπατοκυττάρων), ενδολοβιδιακή ή πυλαία φλεγμονή. Μια βαθμολογική σταδιοποίηση της ίνωσης επί NASH αναπτύχθηκε, για να αντανακλά τόσο την περιοχή όσο και την έκταση της ίνωσης. Η βαθμολογία του σταδίου ίνωσης, προερχόταν από τη έκταση της ίνωσης στη ζώνη 3 (περικολποειδική ίνωση) με πιθανές επεκτάσεις της ίνωσης στην πυλαία και περιπυλαία περιοχή, και αναδιαμόρφωση της αρχιτεκτονικής του ήπατος. Έτσι η βαθμολογική ταξινόμηση της στεάτωσης και φλεγμονής καθώς και η βαθμολογική σταδιοποίηση της ίνωσης επί ΝΑFLD, γίνονται σήμερα βάση την μελέτη των Kleiner και συν που αποτελεί τροποποίηση του βαθμολογικού συστήματος των Brunt και συν που είχε συνταχθεί το1999 (221). Tαξινόμηση στεάτωσης Mακροφυσσαλιδώδης Ηπατική Στεάτωση (Συγκέντρωση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ) Βαθμός 0: καμία Βαθμός 1: έως 33% του ηπατικού παρεγχύματος Βαθμός 2: 33-36% του ηπατικού παρεγχύματος Βαθμός 3: >66% του ηπατικού παρεγχύματος [Kleiner et al Hepatology 2005; 41: ] (220) Ταξινόμηση νεκρο-φλεγμονώδους ηπατικής δραστηριότητας (Ναsh-Grading) Bαθμός 1 (ήπια): Μακροφυσσαλιδώδης στεάτωση έως 66% (grading 1) Περιστασιακή παρουσία οιδηματώδους εκφύλισης ηπατοκυττάρων (ballooning ηπατοκύτταρα) κυρίως στη ζώνη 3 Διάσπαρτα ενδολοβιδακά ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα ± λεμφοκύτταρα Καθόλου ή ήπια πυλαία φλεγμονή Βαθμός 2 (μέτρια): (grading 2) Στεάτωση οποιουδήποτε βαθμού. Οιδηματώδης εκφύλιση ηπατοκυττάρων (ballooning ηπατοκύτταρα) προφανώς στη ζώνη 3. Ενδολοβιδιακά πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα ± περικολποειδική ίνωση στη ζώνη 3 ήπια έως μέτρια πυλαία και ενδολοβιδιακή φλεγμονή Βαθμός 3 (σοβαρή): Πανλοβιδιακή στεάτωση (grading 3) Eυρεία διάχυση ballooning εκφυλισμένων ηπατοκυττάρων Ενδολοβιδιακή φλεγμονή Πολυμορφοπύρηνα συνδεδεμένα με ballooning ηπατοκύτταρα Ήπια έως μέτρια πυλαία φλεγμονή [Kleiner et al Hepatology 2005; 41: ] (220) 38 Σ ελίδα

43 Σταδιοποίηση ίνωσης στην NAFLD (Staging) Στάδιο 1 (Staging 1): Ζώνη ΙΙΙ περικολποειδική/περικυτταρική ίνωση εστιακή ή σε μεγάλο βαθμό. Στάδιο 2 (Staging 2): Ζώνη ΙΙΙ περικολποειδική/περικυτταρική με εστιακή ή εκτεταμένη περιπυλαία ίνωση Στάδιο 3 (Staging 3): Ζώνη ΙΙΙ περικολποειδική/περικυτταρική και πυλαία ίνωση με εστιακή εξεσημασμένη γεφυροποιό ίνωση Στάδιο 4 (Staging 4): Kίρρωση [Brunt et al Am J Gastroenterol 1999;94: ](221) Η Ιστολογική ταξινόμηση της ίνωσης από τους Kleiner και συν το 2005, δεν διέφερε ιδιαίτερα από αυτή των Brunt και συν του 1999, απλώς δίνεται μεγαλύτερη έμφαση στην έκταση των ιστολογικών αλλαγών της ίνωσης στην περικολποειδική περιοχή. Συγκεκριμένα από τον Kleiner και τους συνεργάτες του αναφέρεται το στάδιο F0 όπου δεν υπάρχει καμία ινωτική εστία στο παρασκεύασμα, το στάδιο F1 όπου έχουμε περικολποειδική ή περιπυλαία ίνωση με το 1Α να αφορά ήπια ίνωση ζώνη 3 περικολποειδική, το στάδιο 1Β να αφορά μέτρια ίνωση ζώνη 3 περικολποειδική και το στάδιο 1Γ να αφορά πυλαία/περιπυλαία ίνωση. Αυτό το σύστημα ολοκληρώθηκε με την ανάπτυξη ενός βαθμολογικού συστήματος δραστηριότητας της ΝΑFLD (NAS: ΝΑFLD Activity Score) που μπορούσε εύκολα να χρησιμοποιηθεί και στις κλινικές μελέτες (220). To NAS score αποτελεί ένα βαθμολογικό σύστημα που περιλαμβάνει 14 ιστολογικά χαρακτηριστικά της ΝΑFLD, 4 εκ των οποίων αξιολογήθηκαν ημιποσοτικά: Στεάτωση (0-3), Λοβιδιακή φλεγμονή (0-3), Balloning Ηπατοκύτταρα (0-2) και ίνωση (0-4). Επομένως το NAS score εκτιμά ιστολογικά τη δραστηριότητα της NASH και αποτελεί το σταθμισμένο άθροισμα των βαθμολογιών για: Στεάτωση (< 5% = 0,5, έως 33% = 1,> 33-66% = 2, > 66% = 3) Λοβιδιακή φλεγμονή [χωρίς εστίες = 0,<2 εστίες (δηλαδή λιγότερο από 2 ηπατικά λόβια) / 200 x field = 1, 2-4 εστίες / 200 x field = 2, >4 εστίες / 200 x field = 3] Balloning ηπατοκύτταρα: (καθόλου= 0, λίγα = 1, πολλά κύτταρα καθ υπεροχή ballooning = 2) H ίνωση δεν έχει συμπεριληφθεί στο NAS score. Η μέγιστη βαθμολογία είναι το 8. NAS score: 0-2 δεν θεωρείται διαγνωστικό NASH NAS score 5 θεωρείται διαγνωστικό για NASH Συμπερασματικά παρουσιάστηκε ένα ισχυρό βαθμολογικό ιστολογικό σύστημα για ΝΑFLD και NASH με λογική αναπαραγωγικότητας μεταξύ των αξιολογητών, που είναι χρήσιμο και στα παιδιά και στους ενήλικες με κάποιο βαθμό ΝΑFLD. Βιοψίες με NAS score 5 συσχετίζονται με διάγνωση NASH. Βιοψίες με NAS score < 3 συσχετίζονται με διάγνωση «όχι NASH». Αν και αυτό το βαθμολογικό σύστημα βοηθά να δημιουργηθεί ένα πρότυπο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε κλινικές μελέτες, όμως η ημιποσοτική βαθμολογία δεν συσχετίζεται καλά με την οριστική διάγνωση της στεατοηπατίτιδας (Brunt et al Hepatology 2011;53(3):810)(222). Αυτό το συμπέρασμα είχε εξαχθεί και από την ομάδα NASH CRN ένα χρόνο πριν (2010), με την πολυκεντρική μελέτη των ασθενών με ΝΑFLD επιβεβαιωμένη ιστολογικά με βιοψία ήπατος στους 698 ασθενείς (14) (Πίνακας Ι). Μάλιστα η παρατήρηση της ομάδας NASH CRN που φαίνεται πιο χρήσιμη για τους κλινικούς γιατρούς, είναι ότι το 16% των βιοψιών στους ΝΑSH ασθενείς δεν πληρούσαν τα κριτήρια NAS score 5. Έτσι, έδωσε έμφαση σε προηγούμενες παρατηρήσεις ότι το θετικό NAS score δεν υποδηλώνει πάντα NASH. Ίσως να απαιτούνται βιοψίες συνολικού μήκους > 10 mm για να τεκμηριωθεί αδιάσειστα ότι κάποιοι ασθενείς με θετικό NAS 5 έχουν ή όχι NASH (14). 39 Σ ελίδα

44 Ενδείξεις βιοψίας ήπατος επί ΝΑFLD Η απόφαση όσον αφορά ποιος και πότε ασθενής με υποψία ΝΑFLD θα υποστεί βιοψία θα πρέπει να λαμβάνεται μετά από το σκεπτικό του κατά πόσον οι πληροφορίες που θα προκύψουν θα μπορούσαν να επηρεάσουν τη φροντίδα του ασθενούς. Υπάρχουν γενικά δύο ενδείξεις για τη διενέργεια βιοψίας ήπατος ασθενών με υποψία ΝΑFLD: Επιβεβαίωση της διάγνωσης και σταδιοποίηση της νόσου (grading φλεγμονής και staging ίνωσης). Δεδομένης της υψηλής συχνότητας της νόσου στον πληθυσμό, η επεμβατική φύση της βιοψίας ήπατος και η ανυπαρξία αποτελεσματικής θεραπείας, οδηγούν συχνά σε μία κατανοητή απροθυμία να εκτελεστεί βιοψία ήπατος με μοναδικό σκοπό την επιβεβαίωση της διάγνωσης. Επομένως στους περισσότερους ύποπτους για ΝΑFLD ασθενείς, όπως παχύσαρκους με εμμένουσα οριακή ή ελαφρώς αυξημένη τιμή αμινοτρανσφερασών ορού και γ-gt, η βιοψία ήπατος δεν προτείνεται ως η πρώτη διαγνωστική εξέταση εκτίμησης της ίνωσης. Η διάγνωση αρχικά θα πρέπει να βασισθεί σε κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα και απεικονιστικές μελέτες με κατάλληλο αποκλεισμό άλλων ηπατικών νοσημάτων. Προσδιορισμός της πρόγνωσης της νόσου βασιζόμενος στη σοβαρότητα της ηπατικής βλάβης και ίνωσης. Η Ευρωπαϊκή Ένωση για τη μελέτη του ήπατος, προτείνει την εκτέλεση βιοψίας ήπατος σε ασθενείς που υπάρχει ισχυρή υποψία προχωρημένης ίνωσης όπως αυτή κρίνεται από βιοχημικούς δείκτες, μαθηματικά αλγοριθμικά μοντέλα με πολλές κλινικές και ορολογικές μεταβλητές και ιστορικό παραγόντων κινδύνου για προχωρημένη ίνωση όπως η ηλικία, ΣΔ ΙΙ, σοβαρή παχυσαρκία και άλλες κλινικές εκδηλώσεις του μεταβολικού συνδρόμου (10,11), ενώ προτείνει να αποφεύγεται η βιοψία σε ΝΑFLD ασθενείς που τροποποιώντας τον τρόπο ζωής τους ΣΒ, ( σωματικής άσκησης, ελάττωση των αιτιών αντίστασης στην Ins) σταδιακά παρουσιάζουν Α LT και των επιπέδων μη επεμβατικών δεικτών ίνωσης. Μειονεκτήματα βιοψίας ήπατος Δειγματοληπτικό σφάλμα: Συνήθως τα δείγματα βιοψίας ήπατος αντιπροσωπεύουν μόνο ένα μικρό μέρος ( 1/ χιλιάδες) του συνολικού όγκου του ήπατος, έτσι δείχνουν αποσπασματικά τις ιστολογικές μεταβολές της ΝΑFLD που μπορεί να μην αντιπροσωπεύουν το ακριβές φάσμα της νόσου (10,11). Επομένως συνιστώνται ιστολογικές εκτιμήσεις από ζεύγη ηπατικών βιοψιών /ασθενή με υποψία ΝΑFLD, πράγμα δύσκολο στην πράξη. Εξάλλου μελέτες σε ζεύγη ηπατικών βιοψιών από δύο διαφορετικά σημεία ηπατικού ιστού / ασθενή, έδειξαν ότι η NASH μπορεί ψευδώς να χαθεί σε ποσοστό 24% των περιπτώσεων και το στάδιο της ίνωσης μπορεί να είναι διαφορετικό ανάμεσα στα δύο δείγματα /ασθενή, σε ποσοστό 22-40% των περιπτώσεων (10,11, ). Μεγαλύτερα δείγματα ηπατικών βιοψιών είναι πιο πιθανό να αναδείξουν χαρακτηριστικά που υποστηρίζουν τη διάγνωση της NASH με ή χωρίς ίνωση. Σε μια μελέτη που συγκρίθηκαν 3 πυρήνες ηπατικού ιστού, συλλεγμένοι από 50 ασθενείς με υποψία ΝΑFLD, τα μεγαλύτερου μεγέθους δείγματα είχαν σημαντικά μεγαλύτερη πιθανότητα να έχουν σαφή NASH (29, 46, 56 και 65%) σε βιοψίες μεγέθους 10 mm, mm, mm και 25 mm, αντιστοίχως. [Vuppalanch et al. Clinical Gastroenterol Hepatol 2009; 7(4): 481-6] (225). Σε μία άλλη μελέτη στην οποία δύο ηπατικές βιοψίες έγιναν σε 51 ΝΑFLD ασθενείς, φάνηκε ότι η αρνητική προγνωστική αξία (NPV) για μία μοναδική βιοψία προς αποκλεισμό NASH ήταν στην καλύτερη περίπτωση 0,74 (74%).Επιπλέον, 6 από τους 17 ασθενείς (35%) με γεφυροποιό ίνωση σε ένα δείγμα, είχαν σε ένα άλλο δείγμα μόνο ήπια προς μέτρια ή καθόλου ίνωση (223). Γενικά φάνηκε ότι το δειγματοληπτικό σφάλμα, για τη σταδιοποίηση της ίνωσης, φτάνει το 40% σε δείγματα ηπατικών βιοψιών από ΝΑFLD ασθενείς. Παρόμοια ποσοστά δειγματοληπτικού σφάλματος έχουμε και σε άλλες χρόνιες ηπατικές παθήσεις (10,11,14,15). 40 Σ ελίδα

45 Μεταβλητότητα παρατηρήσεων μεταξύ παθολογοανατόμων (αξιοπιστία παρατηρητών, όσον αφορά τις ερμηνείες τους). Η μεταβλητότητα των παρατηρήσεων ανάμεσα σε παθολογοανατόμους που εξέτασαν ένα δείγμα ηπατικής βιοψίας είναι λογική, αν και προσθέτει ένα ακόμα πρόβλημα στην ακρίβεια των ηπατικών βιοψιών όσον αφορά τη σταδιοποίηση της ίνωσης και το βαθμό νέκρωσης και φλεγμονής του ηπατικού παρεγχύματος (10,11,14,15). Επιπλέον μελέτες έχουν δείξει ότι όταν οι βιοψίες διαβάζονται δύο φορές, από τους ίδιους παθολογοανατόμους, η σύνθεση των δύο ανεξάρτητων αναγνώσεων παράγει μια σημαντικά υψηλότερη απόδοση, για αρκετά ιστολογικά χαρακτηριστικά, σε σύγκριση με την πρώτη ανάγνωση (10,11,14,15). Με τις στατιστικές Kappa, συνολικά η συμφωνία μεταξύ των παρατηρητών για τη διάγνωση της NASH είναι μέτρια έως υψηλή (0,66-0,90). Επικινδυνότητα βιοψίας: Διαδερμική βιοψία συνδέεται με σοβαρές επιπλοκές σε ένα ποσοστό 0,3% των περιπτώσεων: Αιμορραγία, λοιμώξεις, χολοπεριτόναιο (274). Ποσοστό θνητότητας διαδερμικής βιοψίας: 0,01% (227). Κόστος βιοψίας: Δαπανηρή πράξη που χρήζει ενδονοσοκομειακή νοσηλεία «Δυστοκία» πράξης: Επειδή ο αριθμός των ασθενών που κινδυνεύουν από ΝΑFLD είναι αρκετά μεγάλος, η βιοψία ήπατος δεν αποτελεί ένα πρακτικό, αποτελεσματικό «εργαλείο» για τον εντοπισμό εκείνων που κινδυνεύουν από προχωρημένη ίνωση. Συμπεράσματα: Τα μειονεκτήματα της βιοψίας ήπατος καθώς και ο μεγάλος πληθυσμός των «φαινομενικά» υγιών ατόμων που παγκοσμίως πάσχουν από ΝΑFLD και είναι δικαιολογημένα απρόθυμοι να υποστούν μιά επεμβατική πράξη, όπως και το ερώτημα του κατά πόσον είναι ηθικό ή δεοντολογικά σωστό, να υποβάλλονται τόσοι άνθρωποι σε βιοψία χωρίς να υπάρχει πρόταση ουσιαστικής θεραπείας, οδήγησαν την τελευταία δεκαετία την Παγκόσμια Ιατρική Κοινότητα να ερευνήσει την ύπαρξη μη επεμβατικών δεικτών δημογραφικών, κλινικών, αιματολογικών, και απεικονιστικών, που μεμονωμένοι ή σε συνδυασμό μέσα σε ένα αλγοριθμικό μοντέλο, μπορούν να αποτελέσουν αξιόπιστους πρακτικούς δείκτες μη επεμβατικής διάγνωσης και σταδιοποίησης όλου του ιστολογικού φάσματος της ΝΑFLD. 41 Σ ελίδα

46 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΑΔΙΩΝ NAFLD ΥΠΟ ΕΡΕΥΝΑ εικόνα:12 (HEPATOLOGY 2007;46: )(31). Eρμηνεία εικόνας: Ορθολογικοί στόχοι για την ανάπτυξη βιοδεικτών αναγνώρισης της NASH ή NASH ίνωσης σε NAFLD ασθενείς, αποτελούν οι γνώσεις των παθοφυσιολογικών μηχανισμών εξέλιξης της νόσου. Η ηπατική στεάτωση αποτελεί προϋπόθεση για τα επακόλουθα γεγονότα που οδηγούν σε ηπατική βλάβη και ινογένεση. Μιτοχονδριακή δυσλειτουργία πιστεύεται ότι παίζει έναν κεντρικό ρόλο για την εξέλιξη της στεάτωσης σε NASH - ίνωση - κίρρωση. Διαφορετικοί μηχανισμοί έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένων (1) μια αυξημένη παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS: Reactive Oxygen Species) και προϊόντων οξειδωτικού stress ως αποτέλεσμα αύξησης της διαπερατότητας της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης καταλήγοντας σε έναν καταρράκτη γεγονότων που οδηγούν σε (2) φλεγμονή, (3) Ηπατοκυτταρική απόπτωση και (4) ινογένεση και ίνωση. ROS, προϊόντα οξειδωτικού stress, TNF-α (Tumor necrosis factor-α), c-αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP: C-Reactive Protein), CCL2 (CC-chemokine ligand-2), Fas/Fasl (Fas-ligand), RIBP-4 (Retinol Binding protein-4), ενεργοποιημένα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (HSCs:Hepatic stellate cells), TGF-β (Tumor growth Factor-β), Υαλουρονικό οξύ (HA: hyaluronic acid), εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM: Extracellular matrix), κυτταροκερατίνη-18 (CΚ-18:cytokeratin-18).ιντερλευκίνες(IL: interleukin) και άλλες πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην παθοφυσιολογία της εξέλιξης της NAFLD σε NASH ίνωση αποτελούν σήμερα πιθανούς βιοδείκτες υπό έρευνα. Βιοδείκτες στεάτωσης υπό έρευνα SteatoTest (Bio predictive Paris France) Το SteatoTest αποτελεί μέρος του Fibro Max (Bio predictive Paris France) (16, ). Το Fibro Max αποτελείται από τρία απλά αιματολογικά Tests (εξετάσεις): Steato Test, Nash Test, Fibro Test. Το Fibro Max ολοκληρώνει τη διάγνωση της ηπατικής βλάβης στη NAFLD, γιατί μέσω του Steato Test (229) αναγνωρίζεται η ύπαρξη και ο βαθμός ηπατικής στεάτωσης, με το Nash Test (230) αναγνωρίζεται η ύπαρξη ηπατοκυτταρικής φλεγμονής και νεκρωτικής ηπατικής δραστηριότητας και τέλος με το Fibro Test (16) αναγνωρίζεται η ύπαρξη και ο βαθμός ίνωσης.με το Fibro Max βοηθούνται οι κλινικοί γιατροί για την άμεση αναγνώριση της σοβαρότητας της NAFLD σε σημαντικό ποσοστό ασθενών με υποψία NAFLD. Όλα τα Fibro Mater s tests δημιουργήθηκαν με «πατέντες» αλγορίθμων που αποκτήθηκαν από το Γαλλικό Δημόσιο Οργανισμό Υγείας (228). To Steato Test συνδυάζει 10 απλές αιματολογικές εξετάσεις, διαθέσιμες σε οποιοδήποτε εργαστήριο, με την ηλικία, το φύλο και το ΒΜΙ (Body Mass Index:Δείκτης μάζας σώματος). (Πίνακας 2). Τις ίδιες ακριβώς παραμέτρους περιλαμβάνει και το Nash test του Fibro Max. 42 Σ ελίδα

47 ΠΙΝΑΚΑΣ 2 (228) Βιοδείκτες που συνδυάζονται στο Fibro Max για το Steato Test και Nash Test: Βιοδείκτης Fibro Max (Για Steato Test και Nash Test) Ηλικία x Φύλλο x Α2 μακροσφαιρίνη (g/l) x Απτοσφαιρίνη (g/l) x Απολιποπρωτεΐνη Α1 (g/l) x Ολική Χολερυθρίνη (μmol/l) x γgt (IU/l) x ALT (IU/l) x AST (IU/l) x Ολική χοληστερόλη (mmol/l) x Τριγλυκερίδια (mmol/l) x Γλυκόζη νηστείας (mmol/l) x BMI (Kg/m 2 ) x ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase, ΒΜΙ:Body Mass Index, γgt: γ-glutamyl transpeptidase Το Steato Test έχει εύρος βαθμολογίας από 0-1 (Πίνακας 3). Bαθμολογία από 0-1 δίνει μια ποσοτική εκτίμηση της στεάτωσης διαφορετικής προέλευσης: NAFLD (υπέρβαροι, αντίσταση στην Ins, υπερλιπιδαιμία ή ΣΔ ΙΙ), χρόνια ιογενής ηπατίτιδα ή αλκοολική ηπατική νόσος. ΠΙΝΑΚΑΣ 3 (228) ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑΣ (SCORE) STEATO-TEST ΚΑΙ ΒΑΘΜΟΥ (GRADE) ΗΠΑΤΙΚΗΣ ΣΤΕΑΤΩΣΗΣ Score Steato Test 0,69-1,00 0,57-0,68 0,38-0,56 0,00-0,37 Εκτιμώμενο ποσοστό βαθμού ηπατικής στεάτωσης (grading) Στεάτωση > 32%» 6-32%» 1-5%» 0% Στο Steato Test score υπάρχει ένα cut off 0,37. Από εκεί και επάνω θεωρείται ότι υπάρχει στεάτωση (Πίνακας 3). To Steato Test έχει αρκετά πλεονεκτήματα έναντι άλλων προτεινόμενων διαγνωστικών εργαλείων ποσοτικής ανίχνευσης της ηπατικής στεάτωσης, όπως πιο σφαιρική εκτίμηση του βαθμού στεάτωσης από τη βιοψία ήπατος, όπου λαμβάνεται ένα μικρό τεμάχιο ήπατος ή την MRI. Ένα cutoff του 0,3 έχει ευαισθησία 85% ή και περισσότερο για να γίνει η διάγνωση του λιπώδους ήπατος και ένα cutoff του 0,7 έχει ειδικότητα 80%. Το Steato Test έχει επίσης μία καλύτερη απόδοση για τη διάγνωση της στεάτωσης απ ότι οι κλασικοί δείκτες της στεάτωσης, με ακρίβεια εκφραζόμενη από την περιοχή κάτω από τη ROC καμπύλη (ΑUROC: Area Under the ROC curve) ίση με 0,80 έναντι AUROC για τη γgt 0,66, για την ALT 0,61 και 0,65 για το υπέρηχο άνω κοιλία (Πίνακας 4). Επιπλέον η συμφωνία των ευρημάτων της βιοψίας, για την ανίχνευση της στεάτωσης, ήταν καλύτερη για το Sleato Test απ ότι για τον υπέρηχο άνω κοιλίας (Kappa συντελεστής 0,44, έναντι 0,32 αντιστοίχως p = 0,02). Τα καλύτερα αποτελέσματα του Steato Test σε σχέση με το US, για την ανίχνευση της στεάτωσης σε NAFLD ασθενείς, μπορούν να εξηγηθούν από τη σχετικά χαμηλή ευαισθησία του US, τη μεταβλητότητα των παρατηρήσεων του εξεταστή και τη χαμηλή ειδικότητα του US ιδίως για παχύσαρκα άτομα με ΒΜΙ > 35 Kg/m 2 και ασθενών με προχωρημένη ίνωση (4,16, ). Επιπλέον μια μελέτη με επανάληψη Steato Test και βιοψίας, έδειξε ότι το Steato Test είναι ένας ευαίσθητος δείκτης για την παρακολούθηση της Τx των ασθενών(229). Θεωρείται δηλαδή ένας αξιόπιστος δείκτης υποχώρησης της στεάτωσης με τη θεραπεία (275). Πρόσφατα δε μία πρωταρχική ανεξάρτητη μελέτη χρησιμοποίησε το Steato Test ως μία μη επεμβατική μέθοδος αναφοράς που αντικαθιστά τη βιοψία ήπατος, σκοπεύοντας να επικυρώσει μία νέα απεικονιστική μέθοδο για την ηπατική ποσοτικοποίηση της στεάτωσης (ο υπερηχογραφικός ηπατονεφρικός δείκτης: hepatorenal ultrasound index: HRI) (231). 43 Σ ελίδα

48 Δείκτης λίπους ήπατος (FLI: Fatty Liver Index) Ο δείκτης FLI αναπτύχθηκε σαν ένας απλός αλγόριθμος πρόβλεψης του λιπώδους ήπατος (4,11,59). Χρησιμοποιεί ως μεταβλητές στοιχεία από τη μελέτη Διόνυσος. (Πίνακας 5). ΠΙΝΑΚΑΣ 5 (59) BMI (Kg/m 2 ) Περίμετρος Μέσης (cm) Log e (Τριγλυκερίδια mg/dl) Log e (γgt IU/l) Σταθερά: - 15, 745 ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΠΟΥ ΣΥΝΔΥΑΖΟΝΤΑΙ ΣΤΟΝ ΔΕΙΚΤΗ FLΙ (log e: φυσικός λογάριθμος), ΒΜΙ:Body Mass Index, γgt: γ-glutamyl transpeptidase Οι ανωτέρω τέσσερις μεταβλητές έχει διαπιστωθεί στη μελέτη Διόνυσος (42), αλλά και σε άλλες μελέτες (59, ) ότι αποτελούν κύριους δυνητικούς προάγγελους του λιπώδους ήπατος και είναι εξετάσεις ρουτίνας στην καθ ημέρα κλινική πράξη. Ο FLI μπορεί να υπολογισθεί χρησιμοποιώντας έναν ειδικό τύπο: FLI = {e 0,953* log e (τριγλυκεριδίων) * ΒΜΙ * log e (γ-gt) + 0,053* Περίμετρος Μέσης 15,745} / {1 + e 0,953* loge(τριγλυκερίδια) + 0,139* ΒΜΙ + 0,718* loge (γ-gt) + 0,053* Περίμετρος Μέσης 15,745}* 100 Όπου το σύμβολο *: Μετασχηματίζεται χρησιμοποιώντας το φυσικό λογάριθμο Ο πολλαπλασιασμός x100 που γίνεται στον παραπάνω τύπο υπολογισμού του FLI, μας δίνει μια βαθμολογία που αποκαλούμε: Δείκτη Λίπους στο ήπαρ (FLI). Για να μπορούν να γίνουν οι στατιστικές αναλύσεις έπρεπε να αποκτηθεί ένας γραμμικός κλάδος (γραμμικό λογισμικό=γραμμικό logit) των προγνωστικών παραμέτρων γ-gt και τριγλυκεριδίων. Έτσι χρησιμοποιήθηκαν φυσικοί λογάριθμοι (loge) γ-gt και τριγλυκεριδίων. Η γραμμικότητα των logits εξακριβώθηκε με τη διαδικασία Box-Tidwell.Τα logits των άλλων παραμέτρων του FLI τύπου (ΒΜΙ, περίμετρος μέσης) ήταν γραμμικά (59, ). Μια βαθμολογία FLI 30 έχει ευαισθησία 87% και ειδικότητα 64% προς αποκλεισμό της ηπατικής στεάτωσης, ενώ μια βαθμολογία FLI 60 έχει ευαισθησία 61% και ειδικότητα 86% για τη διάγνωση της ηπατικής στεάτωσης όπως ανιχνεύεται με US. Η ορθότητα του δείκτη FLI για τη διάγνωση του λιπώδους ήπατος, είχε ακρίβεια (AUC:Area Under curve) εκφραζόμενη από την περιοχή κάτω από την ROC καμπύλη ίση με 0.84 (Τable 4). Ο δείκτης FLI έκτοτε χρησιμοποιείται από διάφορες ερευνητικές ομάδες σε πληθυσμιακές μελέτες ( ). O FLI είναι απλός να εκτιμηθεί και μπορεί να βοηθήσει τους κλινικούς γιατρούς στην επιλογή ατόμων που θα εξετασθούν με ηπατικό υπέρηχο ή που θα πρέπει να τροποποιήσουν τον τρόπο ζωής τους και τέλος μπορεί να βοηθήσει στην επιλογή ασθενών για επιδημιολογικές μελέτες. Όμως πρέπει πρώτα να επικυρωθεί σε πληθυσμιακές μελέτες για να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τους σκοπούς αυτούς. Προϊόν Συσσώρευσης λιπιδίων ή (LAP: Lipid Accumulation Product) O δείκτης LAP περιλαμβάνει 3 μεταβλητές: Περίμετρος Μέσης (cm) Τριγλυκερίδια (mg/dl) Φύλο Ο ανωτέρω δείκτης δεν έχει κερδίσει πολύ δημοσιότητα. Έχει στο παρελθόν χρησιμοποιηθεί σαν δείκτης πρόβλεψης του καρδιαγγειακού κινδύνου στον ΣΔ ΙΙ και της ολικής θνητότητας σε ασθενείς με υψηλό καρδιαγγειακό κίνδυνο (60). Ο φυσικός λογάριθμος (loge) του LAP προσαρμοσμένος για το φύλο, είναι ένας αρκετά ακριβής δείκτης για την αναγνώριση της ηπατικής στεάτωσης μέσω του US ήπατος. Συμπερασματικά η χρησιμότητα των υπό έρευνα μη επεμβατικών δεικτών προσδιορισμού βαθμού ηπατικής στεάτωσης (>5%) σε μη αλκοολικούς ασθενείς (NAFL) καθώς 44 Σ ελίδα

49 και η αξιοπιστία τους (προσδιοριζόμενη από την καμπύλη AUROC) σε σχέση με το γνωστό υπέρηχο (US) ήπατος, απεικονίζονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας4). ΠΙΝΑΚΑΣ 4 ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΣΤΕΑΤΩΣΗΣ ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ Δείκτης AUROC SENSE SPEC PPV NPV Cut off Steato test >85% 0,3 (4, 0,80 228) >80% 0,7 0,80 γ-gt(4) 0,66 ALT(4) 0,61 US (4) 0,65 0,84 87% 64% 30 (Για αποκλεισμό ηπατικής. * FLI στεάτωσης) (4,11) 0,84 61% 86% 60 (Για διάγνωση ηπατικής στεάτωσης) * LAP(60)??? AST,ALT, αναλογία: 0,59 AST/ALT (285) SENSE :Sensitivity (%) (Ευαισθησία) FLI: Fatty Liver Index SPEC : Specificity (%) (Ειδικότητα) Cutoff : όριο τιμής AUROC : Area under Receiver Operator Characteristic curve PPV: positive predictive value (θετική προγνωστική αξία) NPV: negative predictive value (αρνητική προγνωστική αξία) γgt: γ-glutamyl transpeptidase US:ultrasound LAP: Lipid Accumulation Product AST: aspartate aminotransferase ALT: alanine aminotransferase Μονομερείς βιοδείκτες NASH υπό έρευνα Οι βιοδείκτες του ορού που έχουν ταυτοποιηθεί για τη NASH είναι συνήθως πρωτεΐνες ή ένζυμα του ορού που εμπλέκονται στους κύριους παθογενετικούς μηχανισμούς εξέλιξης του απλού λιπώδους ήπατος (NAFL) σε στεατοηπατίτιδα (NASH) όπως η φλεγμονή, το οξειδωτικό stress, η απόπτωση και η αντίσταση στην Ins (Eικόνα 12) (15.31). Βιοδείκτες φλεγμονής στη ΝΑSH Αδιπονεκτίνη Η Αδιπονεκτίνη είναι μια κυτοκίνη που παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση για την ηπατική στεάτωση, την αντίσταση στην Ins και τη φλεγμονή στη NASH (15). Η αδιπονεκτίνη είναι μια αντιφλεγμονώδης, αύξουσα την ευαισθησία της Ins αδιποκυτοκίνη (Adipocytocine) που περιορίζει την αντίσταση της Ins σε καταστάσεις όπως ο ΣΔ ΙΙ και η παχυσαρκία. Επομένως η αδιπονεκτίνη σχετίζεται αντίστροφα με το βαθμό ηπατικής στεάτωσης σε NAFLD ασθενείς (Εικόνα 12) (31). Ωστόσο οι μελέτες που εξέτασαν το αν η αδιπονεκτίνη αποτελεί έναν ανεξάρτητο παράγοντα που συνδέεται με την ανάπτυξη νεκροφλεγμονώδους ηπατικής δραστηριότητας και επομένως NASH, σε άτομα με λιπώδες ήπαρ (NAFL), είχαν αντιφατικά αποτελέσματα (10). Μια μελέτη έδειξε ότι η έγχυση ανασυνδυασμένης αδιπονεκτίνης σε ob/ob ποντίκια, μειώνει τα επίπεδα TNF-α, που θεωρείται ότι προάγει την κυτταρική φλεγμονή στη NASH (159). Ο Hui et al έκαναν ποσοτικοποιημένη μελέτη των επιπέδων αδιπονεκτίνης ορού σε 109 ενήλικες με ιστολογικά αποδεδειγμένη NAFLD εκ των οποίων 80 είχαν NASH και 29 είχαν στεάτωση. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποίησαν 92 εθελοντές (143). Φάνηκε ότι τα επίπεδα αδιπονεκτίνης ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε NASH ασθενείς σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Η AUROC καμπύλη έδινε ακρίβεια για την διάκριση μεταξύ απλής στεάτωσης και στεατοηπατίτιδας 0,79 με ένα διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval:cl) 68%-89% (Πίνακας 6). Τα περισσότερα άτομα με NASH είχαν επίπεδα αδιπονεκτίνης < 10 μg/ml. Για κάθε μείωση των επιπέδων αδιπονεκτίνης κατά 5 μg/ml 45 Σ ελίδα

50 αυξανόταν η πιθανότητα ανάπτυξης NASH κατά 6,1% (p = 0,001). Όταν τα επίπεδα αδιπονεκτίνης των ασθενών με NASH συγκρινόταν με αυτά των ασθενών που είχαν μόνο ηπατική στεάτωση, παρέμεναν αρκετά χαμηλότερα στους ΝASH ασθενείς. Οι ασθενείς με απλή ηπατική στεάτωση είχαν κ.φ. επίπεδα αδιπονεκτίνης. Παρομοίως ο Musso et al (237) μετρώντας τα επίπεδα αδιπονεκτίνης σε 20 ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένη NASH, έδειξε ότι ήταν σημαντικά χαμηλότερα στους NASH ασθενείς σε σύγκριση με αυτά ατόμων της ίδιας ηλικίας, φύλου και ΒΜΙ που αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου (Πίνακας 6). Επίσης ο Shimada et al (238) έδειξαν ότι τα επίπεδα αδιπονεκτίνης ορού (μετρημένα με ELISA), ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε ασθενείς με πρώιμα στάδια NASH (3,6 μg/ml) σε σχέση με εκείνους με απλή στεάτωση (6,0 μg/ml) με ακρίβεια της εξέτασης (εκτιμώμενη με AUROC καμπύλη ) από 0,765, ευαισθησία 68% και ειδικότητα 79% για τη διάκριση πρώιμων σταδίων NASH (Πίνακας 6). Ωστόσο επί του παρόντος δεν υπάρχουν ουσιαστικά στοιχεία για την ακρίβεια και τη χρησιμότητα της αδιπονεκτίνης για τη μη επεμβατική διάγνωση της NASH (239,240). ΠΙΝΑΚΑΣ 6 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ ΑΔΙΠΟΝΕΚΤΙΝΗΣ Ν AUROC Ευαισθησία (SENSE) Ειδικότητα (SPEC) Αρνητική προγνωστική αξία (NPV) Θετική προγνωστική αξία (PPV) Hui et al (143) 109 0,79 77% Musso et al (237) 20 Shimada et al (238) 85 0,765 68% 79% AUROC: area under the receiver operating characteristic curve PPV: positive predictive value (θετική προγνωστική αξία) NPV: negative predictive value (αρνητική προγνωστική αξία) SENSE :Sensitivity (%) (Ευαισθησία) SPEC : Specificity (%) (Ειδικότητα) Cutoff : όριο τιμής Cutoff <10μg/ ml 3,6 μg/ml TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α) Ο TNF-α αποτελεί μία άλλη κυτταροκίνη που παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση για την ηπατική στεάτωση, την αντίσταση στην Ins και τη φλεγμονή στη NASH (Εικόνα 12). Ο TΝF-α είναι μία σημαντική φλεγμονώδης ηπατική κυτταροκίνη που επίσης εκκρίνεται από το λιπώδη ιστό και ανταγωνίζεται τα αποτελέσματα της αδιπονεκτίνης (15). Ο TNF-α είναι αυξημένος σε παχύσαρκους ασθενείς και συμβάλλει στην αντίσταση της Ins (241,242). Η παραγωγή του TNF-α πιστεύεται ότι είναι η πρώτη εκδήλωση ηπατικής βλάβης, προκαλώντας την παραγωγή άλλων κυτταροκινών που στρατολογούν φλεγμονώδη κύτταρα, καταστρέφουν ηπατοκύτταρα και ξεκινούν μια επουλωτική διαδικασία που περιλαμβάνει την ινογένεση. Μία μεγάλη μάζα στοιχείων υποστηρίζουν ότι η φλεγμονή και οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες παίζουν έναν ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη του μεταβολικού συνδρόμου και της NAFLD (4,10,15,31). Μια ανισορροπία κυτταροκινών και ειδικότερα μια αύξηση της αναλογίας ΤΝF-α/Αδιπονεκτίνη μπορεί να παίζει έναν ενδιαφέροντα ρόλο στην ανάπτυξη της NASH (4,15,31). Θεραπεία σε ob/ob ποντίκια (με ανεπάρκεια λεπτίνης), με τη χορήγηση αντισωμάτων κατά TNF-α βελτιώνει τη NASH και την αντίσταση στην Ins (31). Ποντίκια γενετικώς ανεπαρκή σε ΤNF τύπο 1 υποδοχέα (TNF-R1) είναι ανθεκτικά σε δίαιτες που επάγουν τη NAFLD (23). Επιπροσθέτως όπως προαναφέραμε- η έγχυση ανασυνδυασμένης αδιπονεκτίνης σε ob/ob ποντίκια μειώνει τα επίπεδα TNF-α και αναστρέφει τη στεατοηπατίδα (159). Αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν ερμηνεύσει τα κυκλοφορούντα επίπεδα των κυτταροκινών μεταξύ αυτών και του TNF-α στο αίμα ασθενών με NAFLD και τη συσχέτισή τους με τη σοβαρότητα της NAFLD. Ωστόσο -επί του παρόντος- δεν υπάρχουν στοιχεία σχετικά με την ακρίβεια αυτών των δεικτών για τη μη επεμβατική διάγνωση της NASH. Ο Ηui et al (143) έκαναν ποσοτικοποιημένες μετρήσεις επιπέδων TNF-α (με ELISA) σε ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη NAFLD. Τα επίπεδα TNF-α, ήταν σημαντικά υψηλότερα σε NASH ασθενείς σε 46 Σ ελίδα

51 σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Ωστόσο όταν αυτά τα επίπεδα συγκρινόταν με τα επίπεδα TNF-α ασθενών που είχαν μόνο ηπατική στεάτωση, δεν υπήρχε καμία διαφορά επιπέδων ανάμεσα στις 2 ομάδες. Επομένως ο TNF-α αυξάνει σε άτομα με απλή στεάτωση και με NASH, εν αντιθέσει με τα επίπεδα αδιπονεκτίνης, που είναι φυσιολογικά σε άτομα με απλή στεάτωση, σχετικά με τα πολύ χαμηλά που παρατηρούνται σε NASH ασθενείς. Παρομοίως ο Musso et al (237) από την Ιταλία, έδειξαν ότι τα επίπεδα TNF-α ήταν παρόμοια αυξημένα σε άτομα με επιβεβαιωμένη NASH σε σχέση με την ομάδα ελέγχου που ήταν άτομα της ίδιας ηλικίας, φύλου και BMI με απλή ηπατική στεάτωση (NAFL). Εν αντιθέσει με αυτές τις μελέτες, κάποιες άλλες αναφέρουν ότι τα επίπεδα TNF-α είναι υψηλότερα σε NASH ασθενείς, συγκρινόμενα με εκείνα των ασθενών με απλή ηπατική στεάτωση ή της ομάδος ελέγχου χωρίς γνωστή ηπατική νόσο. Αυτό κυρίως φάνηκε σε σειρές Κινέζων και Νορβηγών ασθενών. Ωστόσο αυτό δεν αποδείχθηκε σε σειρές Αυστραλών ασθενών με NASH (10,11). Αρκετοί λόγοι μπορούν να εξηγήσουν αυτές τις διαφορές στα αποτελέσματα των μελετών. Σε αυτούς περιλαμβάνονται: α) Στον άνθρωπο ο χρόνος ημίσειας ζωής (t1/2) του TNF-α είναι σχετικά μικρός, με χαμηλά επίπεδα κυκλοφορίας στο αίμα. Έτσι στην πραγματικότητα τα επίπεδα TNF-α ορού μπορεί να μην μπορούν να αντανακλούν τις αλλαγές που εμφανίζονται στον ηπατικό ιστό, β) Οι ευαισθησίες των δοκιμασιών που χρησιμοποιούνται, γ) Οι διαφορές των πληθυσμών που εξετάζονται, δ) Οι ελλείψεις προσαρμογής για αρκετούς παράγοντες, μπορεί να επηρεάζουν τα επίπεδα κυκλοφορούντος TNF-α. IL-6 (Ιντερλευκίνη-6) Θεωρείται μία άλλη κυτταροκίνη που παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση για την ηπατική στεάτωση, την αντίσταση στην Ins και τη φλεγμονή στη NASH (Εικόνα 12) (4,10,11,243). Σε μία μελέτη που σύγκρινε τα επίπεδα IL-6 σε 43 NASH ασθενείς, 40 άτομα με στεάτωση και 48 άτομα χωρίς ηπατική νόσο, που αποτελούσαν την ομάδα ελέγχου, διαπιστώθηκε ότι τα φυσιολογικά επίπεδα IL-6 είχαν υψηλή ειδικότητα για την επιβεβαίωση της απουσίας NASH με μια ακρίβεια (AUC) 0,817 (Πίνακας 7) για τη διαφορική διάγνωση της NASH από την απλή ηπατική στεάτωση (148). Τα επίπεδα IL-6 ήταν επίσης ανεξάρτητα συνδεδεμένα με NASH ίνωση σε μία μελέτη από τον Lemoine et al (244). Τα αυξημένα επίπεδα IL-6 στο ήπαρ και τη συστηματική κυκλοφορία σε ασθενείς με NASH και όχι με απλό λιπώδες ήπαρ, φαίνεται να συσχετίζονται με την αντίσταση στην Ins και το υψηλό ΒΜΙ (31). ΠΙΝΑΚΑΣ 7 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ n AUROC % Sense % Spec Cut off IL-6 Tarantino et al (148) 43 0,817 AFBP (Adipocyte fatty acid Binding Protein) (Δεσμευτική Πρωτεΐνη Λιπαρών Οξέων Λιποκυττάρων) Η AFBP εκκρίνεται από τα λιποκύτταρα και μακροφάγα και έχει φανεί ότι αποτελεί έναν ανεξάρτητο παράγοντα που συνδέεται με την αντίσταση στην Ins, τη νέκρωση και τη φλεγμονή στη NAFLD (10,11,15). Ο παθογενετικός ρόλος της στη NAFLD δεν είναι απόλυτα ξεκαθαρισμένος, αλλά επειδή σε NASH ασθενείς, φαίνεται να εμπλέκεται στην αντίσταση της Ins και τη φλεγμονή ως απάντηση στη διέγερση από τους λιποπολυζακχαρίτες. SPEA: Serum Prolidase Enzyme Activity: (Δραστηριότητα του ενζύμου Prolidase ορού) To SPEA καταλύει το τελικό στάδιο διάσπασης του κολλαγόνου απελευθερώνοντας προλίνη για την ανακύκλωση του κολλαγόνου. Αναφέρεται ότι είναι ηπατικής προέλευσης (4,10). Έχει προταθεί ως ένας μη επεμβατικός δείκτης ηπατικής ίνωσης σε χρόνια ηπατικά νοσήματα (10). Όμως σε μία μελέτη από την Τουρκία από τους Kayadibi et al (245) που 47 Σ ελίδα

52 συμμετείχαν 54 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, το SPEA ήταν σημαντικά υψηλότερο σε NASH ασθενείς, που είχαν λοβιδιακή φλεγμονή απ ότι σε εκείνους με απλή ηπατική στεάτωση ή της ομάδος ελέγχου (37 άτομα) και πιθανώς συσχετίζεται θετικά με το βαθμό λιπώδους ηπατικής διήθησης, λοβιδιακής φλεγμονής, σταδίου ίνωσης και ιστολογικού NAFLD activity score (NAS). Σε αυτή τη μελέτη φάνηκε να υπερέχει το SPEA έναντι των τιμών AST, ALT για τη διάκριση NASH από απλή στεάτωση με ακρίβεια της μεθόδου (AUC) 0,85 (Πίνακας 8). Φάνηκε επίσης πιο χρήσιμο για την πρόβλεψη της λοβιδιακής φλεγμονής απ ότι το NAS ιστολογικό score. Δεν είναι ωστόσο σαφές αν η προβλέψιμη ικανότητά του για τη φλεγμονή επί NASH, είναι ανεξάρτητη από το στάδιο ίνωσης. Απαιτείται περαιτέρω επικύρωση ΠΙΝΑΚΑΣ 8 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν=54 AUROC SENSΕ SPEC PPV NPV Cutoff ALT 0,61 58% 61% AST 0,61 60% 60% SPEA 0,85 84% 82% 0,974 Μελέτη ενός κέντρου 54 NAFLD ασθενών από τους Kayadibi et al (245). SENSΕ: Sensitivity (%) (Ευαισθησία), SPEA: Serum Prolidase Enzyme Activity SPEC : Specificity (%) (Ειδικότητα), ALT: alanine aminotransferase, AST: aspartate aminotransferase Cutoff : όριο τιμής AUROC : Area under Receiver Operator Characteristic curve SRAGE: Soluble Receptor for Advanced Glycation End products (Διαλυτός Υποδοχέας για τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης) Τελικά προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης εμπλέκονται στη γένεση των φλεγμονωδών αποκρίσεων και της αντίστασης στην Ins (10,11,15). O SRAGE είναι εύκολα μετρήσιμος στο πλάσμα και συνδέεται με ποικίλους παραμέτρους του μεταβολικού συνδρόμου. O Yilmaz et al απέδειξαν, σε μία μελέτη 57 ασθενών με NAFLD, ότι τα επίπεδα του SRAGE στο πλάσμα συνδεόταν αντιστρόφως ανάλογα με τα επίπεδα ALT και AST και ήταν προγνωστικός παράγοντας της NASH (246). H σύνδεση ανάμεσα στον SRAGE και τη NASH ήταν ανεξάρτητη ηλικίας, φύλου, αντίστασης στην Ins, BMI και επιπέδων αμινοτρανσφερασών ορού (πίνακας 9). ΠΙΝΑΚΑΣ 9 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν AUROC SENS SPEC PPV NPV Cutoff SRAGE (Yilmaze et al) (246) 57 0,77 75% 71% NASH : /- 392 pg/ml borderline (οριακή) NASH : /-278 pg/ml «όχι» NASH : /- 387 pg/ml SRAGE: Soluble Receptor for Advanced Glycation End products CRP / hs-crp /CCL2 C-Reactive Protein (c-αντιδρώσα πρωτεΐνη) hs-crp: high sensitivity (υψηλής ευαισθησίας) CRP CCL2: chemokine CC- ligand 2 (χυμοκίνη CC-σύνδεσμος 2) Η CRP είναι μια πρωτεΐνη οξείας φάσης συντιθέμενη στο ήπαρ, που αυξάνει επίσης σε χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις. Φαίνεται-μετά από εκτενείς μελέτες-ότι αποτελεί έναν δείκτη για την αντίσταση στην Ins, δείκτη φλεγμονής για τον ΣΔ ΙΙ, και την καρδιαγγειακή νόσο (31). H CRP έχει δοκιμαστεί ως δείκτης φλεγμονής στη NAFLD (4,15,31) (Eικόνα 12). Έχει αποδειχθεί από τα επίπεδα CRP ορού συνδέονται στενά με την παχυσαρκία, ιδιαίτερα με την κεντρικού ή σπλαχνικού τύπου εναπόθεση λίπους. Παραδοσιακές δοκιμασίες δεν είναι αρκετά 48 Σ ελίδα

53 ευαίσθητες και γι αυτό το λόγο χρησιμοποιείται μία υψηλής ευαισθησίας CRP (hs CRP). Η CRP μετράται με ανοσομετρική ανάλυση. Μερικές μελέτες έχουν δείξει μια σημαντική αύξηση των επιπέδων CRP ή hs-crp ορού σε NASH ασθενείς, συγκρινόμενους με την ομάδα ελέγχου (247,248). Γενικά όμως η CRP στερείται ειδικότητας για την ηπατική φλεγμονή. Σε μία μελέτη από την Αυστραλία, βρέθηκε ότι δεν υπάρχει διαφορά ανάμεσα στα επίπεδα hs-crp σε ασθενείς με NASH και εκείνους με απλή στεάτωση και επίσης δεν υπήρχε σύνδεση ανάμεσα στα επίπεδα hs-crp και κάθε ιστολογικού χαρακτηριστικού της NAFLD (249). Τα μέσα επίπεδα hs-crp για τη NASH ήταν 2,68 ± 2,10 mg/l και 2,23 ± 1,68 mg/l για την απλή στεάτωση. Σε μια άλλη μελέτη hs-crp, IL-6, και αρκετές χυμοκίνες συμπεριλαμβανόμενης και της CCL2, μετρήθηκαν σε 47 ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη NAFLD καθώς και σε 30 άτομα ίδιας ηλικίας φύλου, και ίδιας εθνικότητας που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου (250). Βρέθηκε ότι οι IL-6 και CCL2 αλλά όχι η hs-crp ήταν αυξημένες σε NAFLD ασθενείς σε σύγκριση με τα επίπεδά τους στην ομάδα ελέγχου. Επιπλέον φάνηκε ότι μόνο τα επίπεδα CCL2 ήταν διαφορετικά μεταξύ NASH ασθενών και αυτών με απλή στεάτωση. Μεγαλύτερες μελλοντικές μελέτες απαιτούνται με αυτές τις κυτταροκίνες/χυμοκίνες, καθώς και με άλλες (Εικόνα 12) που θεωρείται ότι συνδέονται με την αντίσταση στην ινσουλίνη και το μεταβολικό σύνδρομο όπως η IL-1β, φλεγμονώδεις πρωτεΐνες μακροφάγων, αδιποκίνες όπως η ρεζιστίνη και η πρόσφατα αναγνωρισμένες βισφατίνη (visfatin) και η ρετινόλης δεσμευτική πρωτεΐνη (RBP-4: Retinol Binding Protein-4) (251,252), ώστε να διαπιστωθεί αν πράγματι αποτελούν πιθανούς βιοδείκτες NASH τόσο μεμονωμένοι όσο και σε συνδυασμό σε διαγνωστικούς ιδιότυπους πίνακες (Συνδυαστικά μοντέλα). Βιοδείκτες οξειδωτικού STRESS (OS) στη NASH To OS που χαρακτηρίζεται από μία ανισορροπία ανάμεσα σε προ-οξειδωτικούς και αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς υπέρ των πρώτων, έχει από καιρό αναγνωρισθεί σαν ένας από τους κύριους μηχανισμούς που ευθύνονται για τη βλάβη του ήπατος και την εξελικτική πορεία της NAFLD (15,31). Αυξημένο OS λαμβάνει χώρα στο ήπαρ ασθενών με NASH, αλλά και σε ζώα μοντέλα με NASH. (Εικόνα 12). Αρκετοί οδοί οξείδωσης μπορεί να παίζουν έναν ρόλο στην υπερπαραγωγή ROS (δραστικών ειδών Ο 2 ) στη NASH συμπεριλαμβανομένων και των μιτοχονδρίων, των υπεροξυσωματίων, το κυτόχρωμα P450, μυελοϋπεροξειδάση ή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ συνθετάση). Κάθε ένα από αυτά τα μονοπάτια μπορεί να δημιουργήσει διάφορα προϊόντα οξείδωσης που δυνητικά θα μπορούσαν να ποσοτικοποιηθούν. Λόγω της σημασίας του OS στη NASH, αρκετές ερευνητικές ομάδες έχουν προσπαθήσει να αποσαφινοποιήσουν εάν η μέτρηση των συστηματικών δεικτών το OS μπορεί να αντανακλά τα επίπεδα του OS που συμβαίνει στο ήπαρ. Οι περισσότερες ομάδες χρησιμοποιούν είτε τη μέθοδο της μέτρησης των συστημικών επιπέδων σταθερών λιπιδίων (Λιπιδιακά Υπεροξείδια) παραγόμενων από ROS δραστηριότητα όπως: τα λιπιδιακά υπεροξείδια και αντιδρώσα ουσία θειοβαρβιτουρικού (TIBARS: Thiobarbituric acid - Reacting Substance) ή τη μέθοδο μέτρησης ολικής αντιοξειδωτικής κατάστασης η απάντηση (Total Antioxidant Response Status: TARS) (4,10,15,31). Mέθοδος μέτρησης συστημικών επιπέδων σταθερών λιπιδίων παραγομένων από ROS (Reactive Oxygen Species) δραστηριότητα (λιπιδιακά υπεροξείδια) NAFLD OS ROS (ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΙΑ ΛΙΠΙΔΙΩΝ) ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΩΣΗΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ TIBARS Molondialdehylde (Thiobarbituric adid reacting substances) Aντιδρώσες ουσίες θειοβαρβιτουρικού οξέος OX LDL (Oxidized LDL) Οξειδωμένη Καρδιολιπίνη Αλβουμίνη ορού με προσθήκη Molondialdehylde ΑΑΗΡ (Arachidonic Acid Hydroperoxide) 49 Σ ελίδα

54 Υπεροξείδια Λιπιδίων Επίπεδα πλάσματος molondialdehylde Τα προϊόντα οξείδωσης λιπιδίων μετρούνται μέσω φασματοφθορισμομετρικής μεθόδου. Αυξημένα επίπεδα προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων στο ήπαρ, έχουν παρατηρηθεί σε NASH ασθενείς συγκρινόμενα με αυτά σε ασθενείς με απλή στεάτωση (4,10). Αλλά η σύνδεση ανάμεσα στα επίπεδα προϊόντων λιπιδιακής υπεροξείδωσης και ηπατικής νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας υπήρξε ανεπαρκής (4,31,254). Δεν είναι ακόμα σαφές κατά πόσον το OS στο ήπαρ αντανακλάται ή όχι σαφώς με τα προϊόντα του στον ορό. Σε μια μελέτη 51 ασθενών με NAFLD, τα επίπεδα πλάσματος molondialdehylde ήταν αυξημένα σε σύγκριση με αυτά της ομάδος ελέγχου με NAFL (253), μολονότι δεν φάνηκε να σχετίζονται με το βαθμό νέκρωσης και φλεγμονής στο ήπαρ. Επίσης αντισωματικοί (Αb) τίτλοι IgG ανοσοσφαιρίνης προερχόμενοι από την τροποποίηση πρωτεϊνών λόγω λιπιδιακής υπεροξείδωσης, συμπεριλαμβανομένης και της ανθρώπινης αλβουμίνης ορού με την προσθήκη molondialdehylde, υπεροξειδίου αραχιδονικού οξέος (ΑΑΗΡ) ή οξειδωμένης καρδιολιπίνης, δεν ήταν διαφορετικοί ανάμεσα σε 79 ασθενείς με NAFL και 74 ασθενείς με NASH μολονότι βρέθηκε να υπάρχει μια σύνδεση με την ίνωση. TIBARS (Thiobarbituric Acid Reacting Substances) OX-LDL (oxidized-ldl) Τα επίπεδα TIBARS (μmol/l) είναι αυξημένα στον ορό ασθενών με NASH ιστολογικά επιβεβαιωμένης, σε σύγκριση με της ίδιας ηλικίας, φύλου και ΒΜΙ ατόμων της ομάδας ελέγχου. Αυτό φάνηκε σε μία μελέτη των Chalasani et al (255), όπου συνέκριναν τα επίπεδα οξειδωμένης χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνης OX-LDL και του TIBARS ορού σε μια μικρή ομάδα 21 ασθενών με βιοψιακά αποδεδειγμένη NASH σε σχέση με μία ομάδα 19 ασθενών της ίδιας ηλικίας, φύλου ή ΒΜΙ που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Η συστηματική λιπιδιακή υπεροξείδωση εκτιμούμενη με τη μέτρηση των επιπέδων OX-LDL και TIBARS ορού, ήταν σημαντικά μεγαλύτερη σε αυτά τα 21 άτομα με NASH απ ότι στην ομάδα ελέγχου. Συγκεκριμένα οι ασθενείς με NASH είχαν μέση τιμή OX-LDL ορού: 56 +/-16U/L έναντι 40+/- 12 U/L της ομάδος ελέγχου. Παρομοίως τα επίπεδα TIBARS ορού ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα των NASH ασθενών σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (3,4 +/-1,3 nmols/ml έναντι 1,8+/- 0,9 nmols/ml αντιστοίχως p<0,0001) (Πίνακας 10). Ωστόσο οι διαφορές αυτές εμφανιζόταν σε μια μονοπαραγοντική ανάλυση βηματικής παλινδρόμησης (stepwise regression analysis). Γενικά φαίνεται ότι τα επίπεδα TIBARS και ΟΧ-LDL είναι υψηλότερα σε NASH ασθενείς απ ότι σε άτομα χωρίς ηπατική νόσο, αλλά δεν φαίνεται να συνδέονται με την ηπατική ιστολογία και μπορεί να αντανακλούν απλά την αντίσταση στην Ins (10,31,256,257). ΠΙΝΑΚΑΣ 10 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν=21 AUROC SENS % SPEC% PPV NPV Cutoff ΟΧ-LDL 56+/-16U/L TIBARS 3+/-1,3 nmols/ml (Chalasani et al) (255) TIBARS (Thiobarbituric Acid Reacting Substances), OX-LDL (oxidized-ldl) Mέθοδος Μέτρησης ολικής αντιοξειδωτικής κατάστασης ή απάντησης (TARS: Total Antioxidant Response Status) και συνολικών επιπέδων ολικού υπεροξειδίου λιπιδίων πλάσματος Τα επίπεδα ολικού υπεροξειδίου λιπιδίων και ΤΑRS πλάσματος μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία νέα χρωματομετρική μέθοδο. Σε μία μελέτη από τους Horoz et al (253) εξετάσθηκαν 22 ασθενείς με επιβεβαιωμένη ιστολογικά NASH και 22 υγιείς εθελοντές. Στα άτομα της μελέτης αυτής διαπιστώθηκε ότι η ολική αντιοξειδωτική απάντηση (ΤΑR) των NASH ασθενών, ήταν σημαντικά χαμηλότερη απ ότι στην ομάδα ελέγχου, ενώ τα μέσα επίπεδα ολικού υπεροξειδίου και ο μέσος δείκτης οξειδωτικού stress (επίπεδα ολικού υπεροξειδίου/tar) ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα των NASH ασθενών σε σχέση με την ομάδα ελέγχου των υγιών εθελοντών που είχαν παρόμοια δεδομένα ως προς το φύλο, ηλικία και ΒΜΙ. Δεν είναι 50 Σ ελίδα

55 γνωστό κατά πόσον αυτά διαφέρουν στην απλή στεάτωση σε σχέση με τη NASH. Επιπλέον φάνηκε ότι ο βαθμός ίνωσης συσχετίζεται με τον δείκτη TAR και με το ολικό υπεροξείδιο λιπιδίων πλάσματος με έναν τρόπο αρνητικό και θετικό αντίστοιχα. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση ανάμεσα στο βαθμό (grade) νεκροφλεγμονώδους ηπατικής δραστηριότητας και αυτών των παραμέτρων του οξειδωτικού stress (σε όλα p>0,05). Σημαντικό στοιχείο, από αυτή τη μελέτη, είναι ότι η μέτρηση του TAR με μία νέα αυτόματη χρωματομετρική μέθοδο μας δίνει απλά, εύκολα, γρήγορα (εντός 10 ) και αξιόπιστα, αποτελέσματα μέτρησης της ολικής αντιοξειδωτικής απάντησης στο πλάσμα σε NASH ασθενείς κάνοντας εύχρηστη τη χρησιμοποίησή της σε κλινικά βιοχημικά εργαστήρια. Αντιοξειδωτικές ουσίες Οι αντιοξειδωτικές ουσίες αποτελούν προϊόντα του OS όπως: α) Προϊόντα λιπιδιακής υπεροξείδωσης (μετρημένα με φασματοφθορομετρική μέθοδο) β) Το συνένζυμο Q10 γ) Επίπεδα δραστηριότητας Cu ++ /Zn δισμουτάση υπεροξειδίου [Cu to Zn-superoxide dismutase (SOD) ] δ) Βιταμίνη Ε (μετράται χρησιμοποιώντας υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, αντίστροφης φάσης) ε) Δραστηριότητα υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-Px: Glutathione-Peroxidase). Μετράται χρησιμοποιώντας μια εμπορική αντιοξειδωτική δοκιμασία (Kit εμπορικό). Οι ανωτέρω αντιοξειδωτικές ουσίες όπως και άλλες, διερευνώνται ως υποψήφιοι βιοδείκτες φλεγμονής στη NASH (4,10,15,31) OΙ Bonnefont-Rousselot et al (254) εκτίμησαν την κατάσταση OS αίματος σε 64 ασθενείς με NAFLD ή ιογενή ηπατίτιδα μετρώντας προϊόντα λιπιδιακής υπεροξείδωσης, αντιοξειδωτικών ουσιών, παραμέτρους λιπιδίων και την κατάσταση της ηπατικής λειτουργίας. Η ηπατική στεάτωση φάνηκε να συσχετίζεται με την ποσότητα: ολικών λιπιδίων, γ-gt, TIBARS, SOD ορού και αναλογίας SOD/GSH-Px ερυθροκυττάρων, τριγλυκερίδια ορού, LDL χοληστερόλη. Καμία διαφορά στους δείκτες OS αίματος δεν βρέθηκε συσχετιζόμενη με την παρουσία ή απουσία στεάτωσης εκτός από τα επίπεδα αναλογίας SOD /GSH-Px ερυθροκυττάτων. Ολική χοληστερόλη, τριγλυκερίδια και LDL χοληστερόλη ήταν σημαντικά υψηλότερα στη NAFLD ομάδα (n = 17, 60% μέσος όρος βαθμού στεάτωσης) απ ότι στην ομάδα των ιογενών ηπατιτίδων (n = 20, 13% o μέσος όρος βαθμού στεάτωσης). Μόνο η δισμουτάση υπεροξειδίου (SOD) ήταν χαμηλότερη και η βιταμίνη Ε υψηλότερη σε NAFLD ασθενείς απ ότι σε αυτούς με ιογενή ηπατίτιδα. Φαίνεται ότι οι σταθεροί δείκτες του OS στο αίμα, δεν μπορούν να προβλέψουν την έκταση της ηπατικής στεάτωσης καθώς πιθανότητα να μην αντανακλούν το βαθμό του ενδοηπατικού OS. Τα επίπεδα λιπιδίων ορού σχετίζονται καλύτερα με ηπατική στεάτωση. Πιο πρόσφατα ο Solga et al (258), μετρώντας το εκπνεόμενο με την ανάσα ΑΙΘΑΝΙΟ (έναν ερευνητικό δείκτη το OS) σε ασθενείς που παρουσιάζονται για εγχείρηση γαστρικού bypass (παράκαμψης) παρατήρησε ότι τα άτομα με NASH δεν έχουν πιο υψηλά επίπεδα αιθανίου αναπνοής, απ ότι εκείνοι χωρίς NASH και δεν υπάρχει συσχέτιση του test αναπνοής με ηπατική στεάτωση, φλεγμονή, ίνωση ή αυξημένες τιμές ALT ή AST. Συμπερασματικά παρά την ξεκάθαρη απόδειξη ύπαρξης OS στο ήπαρ ασθενών με NASH, τα αποτελέσματα των τρεχουσών μελετών που προσπαθούν να εκτιμήσουν μη επεμβατικά τη συσχέτιση ποικίλων δεικτών OS στο αίμα με την παρουσία και εξέλιξη της NAFL σε NASH προς το παρών έχουν ασαφή αποτελέσματα. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να σχεδιάζονται με βάση μία πολυτροπική προσέγγιση προς καλύτερο χαρακτηρισμό, για το ποιοί από τους βιοδείκτες του OS θα μπορούσαν να είναι κατάλληλοι για τη NASH διάγνωση. Θειορεδοξίνη (ΤRΧ: thioredoxine) Είναι μία θειόλη που επάγεται από το οξειδωτικό stress. Η θειόλη είναι μια πρωτεΐνη που μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα κλινικά χρήσιμο δείκτη του οξειδωτικού stress Σε μία μελέτη 57 ασθενών, ο Sumida et al(259) ανέδειξε σημαντική αύξηση των επιπέδων TRX ορού [Μέση τιμή: 60,3 (17,6-104,7)] σε NASH ασθενείς (Ν=25), συγκρινόμενα με τα επίπεδα σε ασθενείς με απλή στεάτωση (N =15) [TRX = 24,6 (16,6-69,7)] και με τα επίπεδα στην ομάδα ελέγχου υγιών ατόμων [TRX = 23,5 (1,3-50,7)] p <0,0001 με μια AUC 0,785 ακρίβειας της μεθόδου για τη 51 Σ ελίδα

56 διάκριση NASH από απλή στεάτωση. Παρόμοια ευρήματα έχουν αναφερθεί σε κάποια άλλη μελέτη, με μία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων TRX ορού και φερριτίνης σε NASH ασθενείς(260). (Πίνακα 11). ΠΙΝΑΚΑΣ 11 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν=25 AUROC SENSE SPEC PPV NPV Cutoff TRX (ng/ml) 0,785 72% 86,7% 34,7 ng/ml Φερριτίνη 0,660 75% 64,3% 124 ng/ml (Sumida et al) (259) ΤRΧ: thioredoxine Βιοδείκτες απόπτωσης στη NASH CK-18 : Cytokeratin 18 (Κυτταροκερατίνη-18) Η ηπατοκυτταρική απόπτωση έχει αναδειχθεί σαν μια από τις βασικές οδούς ηπατικής βλάβης και ηπατοκυτταρικού θανάτου σε NASH ασθενείς. Τα επίπεδα δεικτών ηπατοκυτταρικής απόπτωσης είναι αυξημένα σε NASH ασθενείς συγκρινόμενα με αυτά σε ασθενείς με απλή στεάτωση (4,10,15,31). Mία αύξηση του κυτταρικού θανάτου μέσω απόπτωσης, είναι τυπικά παρούσα στη NASH (Εικόνα 12). Στη NASH φαίνεται να ενεργοποιούνται η εξωγενής και η ενδογενής οδός απόπτωσης ( ). Και οι δύο οδοί τείνουν να συγκλίνουν στο επίπεδο του μιτοχονδρίου, καταλήγοντας σε αύξηση της διαπερατότητας της εξωκυττάριας μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση πολλών πρωτεϊνών από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα. Ένα κεντρικό επακόλουθο αυτής της διαδικασίας είναι η ενεργοποίηση των κασπασών και κυρίως της κασπάσης 3 (Caspase 3). Οι κασπάσες διασπούν έναν αριθμό διαφορετικών υποστρωμάτων στο εσωτερικό του κυττάρου συμπεριλαμβανόμενης και της κυτταροκερατίνης 18 (CK-18) που είναι η κύρια πρωτεΐνη ενδιάμεσων νηματίων (filament) στο ήπαρ, καταλήγοντας σε χαρακτηριστικές μορφολογικές αλλαγές απόπτωσης (Εικόνα 12). Τα επίπεδα ηπατοκυτταρικής απόπτωσης μπορούν να αξιολογηθούν μετρώντας θραύσματα (τμήματα) της CK-18. Τα επίπεδα θραυσμάτων CK-18 μπορούν να διερευνηθούν στον ηπατικό ιστό χρησιμοποιώντας ανοσοχρώση (Immunostaining) ή μπορούν να μετρηθούν στον ορό χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα (Αb) με ΕLISA (262). O ηπατοκυτταρικός θάνατος στη NAFLD οδηγεί σε ενεργοποίηση των αστεροειδών κυττάρων του ήπατος (HSCs: Hepatic Stellate cells) προάγοντας έτσι έμμεσα την ινογένεση.. Επειδή τα απομεινάρια των αποπτωτικών κυττάρων (αποπτωτικά σωμάτια) που ενεργοποιούν τα HSCs προς έναρξη της ινογένεσης εκφράζονται στον ορό με τα επίπεδα θραυσμάτων CK-18, θεωρήθηκε πιθανόν ότι τα υψηλά επίπεδα CK-18 μπορεί να εκφράζουν την έναρξη της ινογένεσης στη NASH. Επομένως μελέτες μελλοντικές και μακροχρόνιες δικαιολογούνται για τον προσδιορισμό του κατά πόσον έχει πραγματική χρησιμότητα η τιμή της CK-18 πλάσματος (ολικής: Ag M65 ή θραυσμάτων: Ag M30) τόσο στην πρόβλεψη της ύπαρξης και της σοβαρότητας της NASH, όσο και στην πρόβλεψη της εξέλιξης προς ίνωση και της απάντησης στην Tx με την πάροδο του χρόνου (31). Προς το παρών οι μελέτες που υποδηλώνουν ότι η CK-18 θα μπορούσε να αποτελέσει έναν αξιόπιστο μη επεμβατικό δείκτη πρόβλεψης NASH είναι οι ακόλουθες: Ο Malike et al (264) σε 95 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD (βαθμολογημένη και σταδιοποιημένη χρησιμοποιώντας το NAS score και το Metavir score) εκτίμησε τα επίπεδα CK-18, υαλουρινικού οξέος (ΗΑ: Hyaluronic Acid)), ΤΙΜΡ-1 και YKL40 ορού, με σκοπό την αναγνώριση μη επεμβατικών βιοδεικτών πρόβλεψης της NASH και NASH-ίνωσης. Τα επίπεδα CK-18 ήταν υψηλότερα στην ομάδα των ασθενών με NASH συγκρινόμενα με εκείνα της ομάδος ασθενών με απλή στεάτωση (394+/-53 micro/l έναντι 194+/-26 micro/l, p<0,05). Προς εκτίμηση της κλινικής χρησιμότητας των επιπέδων CK-18 για την πρόβλεψη NASH, μια τιμή cutoff CK-18 πλάσματος της τάξεως 300 micro/l έδινε PPV (θετική προγνωστική αξία) 81% και NPV (αρνητική προγνωστική αξία) 85% με μια ακρίβεια της μεθόδου (AUC) 0.80 για τη διάκριση NASH από απλή ηπατική στεάτωση. (Πίνακα 12). Οι δείκτες ίνωσης δεν είχαν διαφορά μεταξύ 52 Σ ελίδα

57 των ομάδων. Οι βιοδείκτες που χρησιμοποιήθηκαν για τη διάκριση σταδίων ίνωσης( F1-F4) είχαν πτωχή αξιοπιστία με το ΗΑ να έχει την καλύτερη AUC: 0,79, η οποία αυξανόταν (AUC: 0,77) για την αναγνώριση προχωρημένης ίνωσης (F3) και κίρρωσης (F4). O Rayai et al (265) μέτρησε τα επίπεδα θραυσμάτων CK-18 με ELISA σε 21 παιδιά με βιοψιακά αποδεδειγμένη NAFLD και σε 13 υγιή παιδιά ως ομάδα ελέγχου. Η μέση τιμή του CΚ- 18 στα παιδιά με NAFLD ήταν 255U/L (κυμαινόμενη από ) και στην ομάδα ελέγχου 172U/L (83-238U/L), p = 0,002. Tα άτομα με ιστολογικό NAS score 4 είχαν μέση τιμή CΚ U/L ( U/L) που ήταν σημαντικά υψηλότερη από τη μέση τιμή των ατόμων που είχαν NAS score 3 [209 U/L ( U/L)] (Πίνακας 12). Paρatheodoridis et al (266) μέτρησαν την τιμή των CΚ-18 θραυσμάτων ορού σε 134 ασθενείς με χρόνια HCV ηπατίτιδα και 58 ασθενών με NAFLD που είχαν υποστεί ηπατική βιοψία και σε 40 ασθενείς της ομάδος ελέγχου. Στην ομάδα ελέγχου η μέση τιμή CΚ-18 ήταν 148 U/L, στην ομάδα με απλή στεάτωση η μέση τιμή CΚ-18 ήταν 174U/L (P=0,013) και στα άτομα με NASH η μέση τιμή θραυσμάτων CΚ-18 ήταν 355 U/L (p<0,001). Eπομένως τα επίπεδα CΚ-18 ορού, προσφέρουν εξαιρετική αξιοπιστία για τη διαφοροποίηση των ασθενών με NASH από αυτούς με NAFL και υγιής (Πίνακας 12). Στη χρόνια HCV ηπατίτιδα η τιμή CΚ-18 προσφέρει μέτρια αξιοπιστία προς διάκριση της μέτριας από τη σοβαρή ιστολογική βλάβη. Ο Wilchowska et al (267) σε μία πολυπαραγοντική μελέτη 44 ασθενών με υποψία NAFLD στους οποίους έγινε βιοψία ήπατος, διαπιστώθηκε ότι η μέση τιμή CΚ-18 θραυσμάτων ορού ήταν σημαντικά υψηλότερη στα άτομα που ιστολογικά διαπιστώθηκε NASH (765,7 U/L) σε σχέση με αυτά που είχαν απλή ηπατική στεάτωση (202,4 U/L) και από τα άτομα που είχαν φυσιολογικές βιοψίες ήπατος (215,5 U/L) P<0,001. Φάνηκε δε ότι για κάθε αύξηση της τιμής θραυσμάτων CΚ-18 κατά 50 U/L υπήρχε αύξηση κατά 1,95 φορές της πιθανότητας να υπάρχει NASH στον ασθενή. Μια τιμή cutoff CΚ-18 θραυσμάτων 395 U/L είχε ειδικότητα (Spec: 99%), ευαισθησία (Sense: 85,7%), θετική προγνωστική αξία (PPV: 99,9%) και αρνητική προγνωστική αξία (NPV: 85,7%) για τη διάγνωση NASH (Πίνακας 12), ενώ μία τιμή cutoff θραυσμάτων CΚ U/L είχε Spec:94%, Sense:90,5% με μια ακρίβεια της μεθόδου (AUC) 0,93 για τη διάγνωση NASH (Πίνακας 12). Επομένως στη μελέτη αυτή αν και μικρός ο αριθμός των συμμετεχόντων φάνηκε ξεκάθαρα ότι τα επίπεδα πλάσματος CΚ-18 αποτελούν έναν ουσιαστικό μη επεμβατικό βιοδείκτη που ανεξάρτητα μπορεί να προβλέψει την ύπαρξη NASH. Ο Yilmaz et al (268) εξέτασε μία ομάδα 83 ασθενών με υποψία NAFLD και 49 υγιών. Από αυτούς με υποψία NAFLD ιστολογικά αποδεδειγμένη NASH είχαν οι 45, «οριακή» NASH οι 24, απλό λιπώδες ήπαρ (NAFL) οι 9 και φυσιολογική βιοψία οι 5. Σε όλους εξετάσθηκαν τα επίπεδα θραυσμάτων CΚ-18 (M30 αντιγόνο) και ολικής CΚ-18 (M65 αντιγόνο) με ELISA. Τα επίπεδα του M30 Ag και Μ65 Ag ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με NASH. Μία τιμή μεγαλύτερη από 121,60 IU/L του Μ30 Ag, έδινε 60% Sense, 97,4% Spec, PPV: 94,6%, NPV: 56,10% με μια ακρίβεια (AUC) 0,783 για τη διάγνωση NASH (Πίνακας 12). Μια τιμή του ολικού Μ65 Ag CK-18> 243,82 IU/L έδινε Sense: 68,9%, Spec: 81,6%, PPV: 88,6%, NPV: 58,80% με AUC ακρίβεια της δοκιμασίας 0,804 για τη διάγνωση της NASH (Πίνακας 12). Σε ασθενείς με NAFLD και τιμές Μ30 Ag>121,60 IU/L και Μ65 Ag>243,82, η ορθότητα αυτών των τιμών για τη διάκριση ανάμεσα σε προχωρημένη ίνωση (F3, F4) και πρώιμα στάδια ίνωσης (F1-F2) έδινε μία ακρίβεια AUC: 0,733 για το Μ30 Ag με Sense: 64,7% και Spec: 77,5% και μία ακρίβεια AUC: 0,742 για το M65 Ag με Sense: 70,6% και Spec: 71,2%. O Diab et al (269) έδειξε ότι τα επίπεδα CΚ-18 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε μια ομάδα 99 ασθενών με νοσογόνο παχυσαρκία που υπέστησαν βαριατρικό χειρουργείο και είχαν ιστολογικά NASH, σε σχέση με αυτούς που δεν είχαν NASH ή είχαν «οριακή» ιστολογικά NASH ή NAFL. Μια σημαντική πτώση των επιπέδων CK-18 πλάσματος φάνηκε 6 μήνες μετά το βαριατρικό χειρουργείο. Η AUC (ακρίβεια) για την πρόβλεψη NASH ήταν 0,88 με cutoff επιπέδων CΚ-18 ορού 257 U/L, Sense: 77% και Spec: 100%. Όταν η τιμή cutoff έπεφτε στο 252 U/L η ακρίβεια για την πρόβλεψη NASH είχε AUC: 0,81 με Sense 82% και Spec: 77% (Πίνακας 12). O Yonossi et al εκτίμησαν (270) τη διαγνωστική χρησιμότητα αρκετών ELISA δοκιμασιών για την πρόβλεψη NASH σε 101 παχύσαρκους με NASH βιοψιακά αποδειγμένης Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι τα επίπεδα θραυσμάτων (AgM30) CK-18 και ανέπαφης (AgM65) CΚ-18 μπορούσαν να προβλέπουν ιστολογικά τη NASH με Sense:70%, Spec:84% με AUC: 0,711 και Sense:64%, Spec:89% με AUC: 0,814 αντιστοίχως (Πίνακας 12). Σε μια πολυκεντρική μελέτη επικύρωσης που συμπεριλήφθησαν 139 ασθενείς με NAFLD και 150 μάρτυρες από τους Feldstein et al (271), φάνηκε ότι τιμές θραυσμάτων CK-18 πλάσματος (μετρημένες με ELISA) ήταν σημαντικά υψηλότερες σε ασθενείς που είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH απ ότι σε εκείνους με ιστολογική εικόνα απλής στεάτωσης, καθώς και της ομάδας ελέγχου. Η AUC (ακρίβεια) της δοκιμασίας εκτιμήθηκε στο 0,83 για 53 Σ ελίδα

58 NASH διάγνωση με ευαισθησία 0,75 (95% CI 0,69-0,83) και ειδικότητα: 0,81 (95% CI 0,61-0,93) όταν είχαμε τιμή cutoff CK-18 πλάσματος > 250 U/L. H AUC (ακριβεία) της δοκιμασίας ανέβαινε στο 0,93 όταν η τιμή cutoff CΚ-18 πλάσματος (AgM30) ήταν πάνω από 295 U/L με Sense: 87% και Spec: 100%, PPV:100% και NPV:86% (Πίνακας 12). Αυτή η μελέτη επικύρωσης, έδειξε ότι τα θραύσματα CΚ-18 αποτελούν έναν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα πρόβλεψης τόσο της ύπαρξης NASH όσο και της σοβαρότητάς της. Άλλες μελέτες επιβεβαίωσαν τα ευρήματα των προαναφερθέντων μελετών υποδηλώνοντας ότι η CΚ-18 αποτελεί έναν δυνητικά ανεξάρτητο χρήσιμο βιοδείκτη για τη διάγνωση και διαφοροποίηση της NASH από την απλή ηπατική στεάτωση.η CΚ-18 πρόσφατα έλαβε μία ανεξάρτητη επικύρωση για τη διάγνωση της NASH σε μία σειρά 32 άρθρων (μετα-αναλύσεις) το 2010 όπου οι μετα-αναλύσεις που έγιναν έδειξαν ότι οι συγκεντρωμένες τιμές ακρίβειας (AUC), ευαισθησίας (Sense%) και ειδικότητας (Spec%) για τη NASH ήταν: 0,82 (0,78-0,88), 78%(64-92%) και 87%(77-98%) αντιστοίχως (272) (Πίνακας 12). Από τους βιοχημικούς δείκτες που είναι διαθέσιμοι για την πρόβλεψη NASH μόνο τα θραύσματα CK-18 έχουν επικυρωθεί ανεξάρτητα (10). Όλες αυτές οι μελέτες προτείνουν ότι τα επίπεδα CK-18 πλάσματος, μπορούν να βοηθήσουν στη διάκριση ανάμεσα στην απλή στεάτωση και τη NASH, αλλά η εξέταση είναι πολύ μακριά από το τέλειο όπως υποδεικνύεται από το κατώτερο διάστημα εμπιστοσύνης (CI 0,95) στο εύρος 0,60 για ευαισθησία και ειδικότητα. Η δοκιμασία CK-18 και των θραυσμάτων της είναι εμπορικά διαθέσιμη αλλά ακόμα δεν έχει καθορισθεί από το FDA (11). ΠΙΝΑΚΑΣ 12 MΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν AUROC Sense Spec PPV NPV Cutoff CK-18 (Mailik et al) (264) 95 0,80 81% 85% 300 micro/l Θραύσματα CK-18 (Rayai et al) (265) Θραύσματα CK-18 (Paρatheodoridis et al) (266) Θραύσματα CK-18 (Wieckowska et al) (267) Θραύσματα CK-18 (Ag M30) Ολική CK-18 (Ag M65) (Yilmazet et al) (268) U/L 58 0, U/L 0,93 85,7% 99% 99,9% 85,7% 395 U/L 44 0,93 90,5% 94% 95% 89,5% 380 U/L 0,78 60% 97,4% 94,6% 56,10% >121,60 U/L 83 0,804 68,9% 81,6% 88,6% 58,8% >243,821 U/L Θραύσματα CK-18 (Diab et al) (269) 99 0,88 0,81 77% 82% 100% 77% 257 U/L 252 U/L Θραύσματα CK-18 (Feldstein et al) (271) 139 0,83 75% 81% >250 U/L 0,93 87% 100% 100% 86% >395 U/L Θραύσματα CK-18 (AgM30) ολική CU-18 (AgM65) (Younossi et al) (270) 101 0,711 0,814 70% 64% 84% 89% CK-18 (Μusso et al) (272) 32 ΑΡΘΡΑ 0,82 78% 87% 54 Σ ελίδα

59 Fas Αυξημένα στοιχεία δείχνουν ένα ρόλο τόσο στη λεγόμενη εξωγενή (θάνατος με τη μεσολάβηση υποδοχέων) οδό όσο και στην ενδογενή (θάνατος με τη μεσολάβηση οργανιδίων: organelle initiated) οδό απόπτωσης στη NASH (31). Έκφραση του Fas, ενός μέλους της οικογένειας TNF-R υποδοχέων (που είναι γνωστός επίσης και ως CD95), αυξάνει σε πειραματικά μοντέλα με NASH και οδηγεί σε αυξημένη ευαισθησία προς Fas σχετιζόμενη απόπτωση (273) (Εικόνα12). Ο προσδιορισμός του Fas στον ορό πιθανώς να σχετίζεται με τη σοβαρότητα της NASH. FFAS (Free Fatty Acids: Ελεύθερα Λιπαρά Οξέα) Συσσώρευση FFAS σε ηπατικά κύτταρα, καταλήγει σε αυξημένη μιτοχονδριακή και λυσοσσωματίων διαπερατότητα (31), με επακόλουθο πυροδότηση του καταρράκτη των διαδικασιών που συναινούν στον κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης (ενεργοποίηση καταρράκτη κασπασών) και έναρξη NASH (Εικόνα 12). Καθεψίνη-Β (Cathepsin-B) Ποντίκια γενετικά ανεπαρκή σε καθεψίνη-β, μία σημαντική πρωτεάση κυστεΐνης των λυσοσσωματίων, προστατεύονται από δίαιτα που επάγει τη στεάτωση και τον ηπατοκυτταρικό αποπτωτικό θάνατο (273) που συμβαίνει μέσω ενεργοποίησης του καταρράκτη των κασπασών. Η συμμετοχή καθεμιάς από αυτές τις οδούς στην ηπατοκυτταρική βλάβη στον άνθρωπο με NAFLD, παραμένει υπό διερεύνηση. Ομοκυστεΐνη πλάσματος (Hcy) Επίπεδα ομοκυστεΐνης πλάσματος, φαίνεται να διακρίνουν τη NASH από την απλή στεάτωση με καλή ακρίβεια σε μια τουρκική μελέτη 71 NAFLD ασθενών (274). Χρησιμοποιώντας ένα όριο (cutoff) 11,935 ng/ml η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 91,7% και 95,7% αντιστοίχως με μία ακρίβεια (AUC) από 0,948 για την πρόβλεψη της NASH (Πίνακας 13). ΠΙΝΑΚΑΣ 13 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΕΠΙ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΗΣ Ν AUROC SENSE % SPEC% PPV NPV Cut off Oμοκυστεΐνη (Hcy) (Gulsen et al) (274) 71 0,948 91,7 95,7 11,935 ng/ml Συμπερασματικά, προς το παρόν, οι βιοδείκτες που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση NASH από το απλό λιπώδες ήπαρ, σε μεγάλες πληθυσμιακές μελέτες, απεικονίζονται στον κάτωθι πίνακα (Πίνακας 14). ΠΙΝΑΚΑΣ 14 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΙ ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗ NASH ΒΙΟΔΕΙΚΤΗΣ ΔΕΙΚΤΗΣ ΕΥΡΗΜΑΤΑ Αδιπονεκτίνη Ευαισθησία στην Ins Σημαντικά Χαμηλότερη σε NASH ασθενείς CΚ-18 Απόπτωση Ηπατοκυττάρων Σημαντικά υψηλότερη σε NASH ασθενείς 55 Σ ελίδα

60 Οι βιοδείκτες με αντικρουόμενα - προς το παρόν - αποτελέσματα για την πρόβλεψη NASH απεικονίζονται στον κάτωθι πίνακα. (Πίνακας 15). ΠΙΝΑΚΑΣ 15 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΙ ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ ΣΤΗ NASH ΜΕ ΑΝΤΙΦΑΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΒΙΟΔΕΙΚΤΗΣ ΔΕΙΚΤΗΣ ΕΥΡΗΜΑΤΑ TNF-α, IL-6 Φλεγμονή και αντίσταση Αντικρουόμενα αποτελέσματα στην ινσουλίνη στις μελέτες AFBP, SPEA SRAGE, hs CRP, CCL2, Λεπτίνη, ομοκυστεΐνη TIBARS, OX-LDL, AAHP, Molondialdehylde, Ολικό υπεροξείδιο λιπιδίων πλάσματος, TARS, αντιοξειδωτικές ουσίες, TRX Οξειδωτικό Stress Αντικρουόμενα αποτελέσματα στις μελέτες FAS, FFAS, Αντικρουόμενα αποτελέσματα Απόπτωση Cathepsin-B στις μελέτες TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), IL-6 (Ιντερλευκίνη-6), AFBP (Adipocyte fatty acid Binding Protein), SPEA (Serum Prolidase Enzyme Activity), SRAGE (Soluble Receptor for Advanced Glycation End products), hs-crp (high sensitivity C-Reactive Protein), CCL2 (chemokine CC- ligand 2),TIBARS (Thiobarbituric acid - Reacting Substance), OX-LDL (oxidized-low-density lipoprotein), TARS (Total Antioxidant Response Status), ΤRΧ (thioredoxine), ΑΑΗΡ (Arachidonic Acid Hydroperoxide), FFAS (Free Fatty Acids). Συνδυαστικά βαθμολογικά μοντέλα (αλγοριθμικοί πίνακες) πρόβλεψης NASH υπό έρευνα ΝASH Test Τα τελευταία χρόνια ο Τhierry Poynard και οι συνεργάτες του, ανέπτυξαν αλγοριθμικούς πίνακες απλών βιοχημικών δεικτών προς πρόβλεψη μη επεμβατικά τόσο της σοβαρότητας της ηπατικής στεάτωσης (Steato Test) (229) όσο και της ύπαρξης και σοβαρότητας της στεατοηπατίτιδας (Nash Test) (230), καθώς και του βαθμού ίνωσης (Fibro Test) (16) σε ασθενείς με μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος (NAFLD). Ο συνδυασμός των Steato Test, Nash Test και Fibro Test αποτελούν-όπως έχει προαναφερθεί- το Fibro Max (Bio predictive Paris France) (228) που θεωρείται ένας σφαιρικός δείκτης πρόβλεψης της σοβαρότητας της ηπατικής νόσου σε NAFLD ασθενείς. Οι ίδιοι ερευνητές ανέπτυξαν το Ash Test (Bio predictive Paris France) (275) για την πρόβλεψη της σοβαρότητας της νεκροφλεγμονώδους ηπατικής δραστηριότητας ή ηπατοκυτταρικής βλάβης στην AFLD (Alcocholic fatty liver disease : αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος) και το Acti Test (Bio predictive Paris France) (230) για την HBV και HCV ηπατίτιδα. Όσον αφορά τους ασθενείς με NAFLD, το Nash Test αναπτύχθηκε μετά το Fibro Test και το Steato Test και οι βιοδείκτες που συνδυάζονται για τη δημιουργία του Nash Test ήταν οι ίδιοι που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία του Steato Test νωρίτερα (Πίνακας 2). To Nash Test όπως και το Steato Test περιλαμβάνει 10 μεταβλητές (10 απλές βιοχημικές εξετάσεις) προσαρμοσμένες για την ηλικία, το φύλο και το ΒΜΙ, που αναπτύσσουν έναν αλγόριθμο διάγνωσης της φλεγμονής και νέκρωσης του ηπατικού παρεγχύματος σε NAFLD ασθενείς. Ο πληθυσμός που επιλέχθηκε για τη δημιουργία και επικύρωση του NASH Test ήταν ο ίδιος με αυτόν που συμπεριλήφθη στο Steato Test και το Fibro Test, αλλά δεν συμπεριελάμβανε άτομα χωρίς στεάτωση (Ν=160). Αυτό ήταν λογικό αφού σκοπός ήταν να εστιαστεί η NASH διάγνωση και η «όχι» NASH διάγνωση, ανάμεσα σε άτομα με στεάτωση. Επομένως τα άτομα με NAFLD που στο Steato Test είχαν βαθμολογία < 0,37 (απουσία στεάτωσης) (Πίνακας 3) δεν 56 Σ ελίδα

61 συμπεριλήφθησαν στο σύνολο των NAFLD ασθενών που αποτελούσαν τις ομάδες κατάρτισης και επικύρωσης του NASH Test. Το NASH Test δίνει μια βαθμολογία 0-1 με βάση τον αλγοριθμικό πίνακα των μεταβλητών του (Πίνακας 2). Η ομάδα κατάρτισης του NASH Test, αποτελείτο από 160 ασθενείς και η ομάδα επικύρωσης από 97 ασθενείς. Τα χαρακτηριστικά τους ήταν παρόμοια. Η μοναδική διαφορά ήταν ότι στην ομάδα κατάρτισης οι ασθενείς ήταν πιο ηλικιωμένοι, είχαν πιο συχνά ΣΔ ΙΙ, αρτηριακή υπέρταση, μεγαλύτερο σωματικό βάρος και λιγότερα ιστολογικά χαρακτηριστικά της NASH. Το μέγεθος της βιοψίας ήταν μεγαλύτερο στην ομάδα κατάρτισης με επιπλέον πυλαίες εκτάσεις απ ότι στην ομάδα επικύρωσης. Άλλα 383 άτομα αποτελούσαν την ομάδα μαρτύρων. Οι ασθενείς με ιστολογικό NAS score 5 (Διάγνωση NASH κατά Κleiner) είχαν μια βαθμολογία στο NASH Test > 0,75 που αντιστοιχούσε στην μη επεμβατική επιβεβαίωση ύπαρξης NASH. Ασθενείς με ιστολογικό NAS score 3-4 κατά Κleiner, είχαν μια μέση τιμή βαθμολογίας Nash Test 0,50 που αντιστοιχούσε στη μη επεμβατική διάγνωση ασθενών με Borderline οριακή NASH. Τέλος ασθενείς με ιστολογικό NAS score 0-2 (απουσία NASH) είχαν μια μέση τιμή βαθμολογίας Nash Test <0,25 που αντιστοιχούσε στη μη επεμβατική διάγνωση «όχι» NASH ασθενών με NAFLD. (Πίνακας 16). Επομένως η χρησιμότητα του Nash Test βασίζεται στο ότι μπορεί να ξεχωρίσει τους ασθενείς με περισσότερο σοβαρή ηπατική βλάβη από εκείνους με μικρή ηπατική βλάβη, προς αναγνώριση NAFLD ασθενών που βρίσκονται σε μεγαλύτερο κίνδυνο για εξελικτική NASH ασθένεια. ΠΙΝΑΚΑΣ 16 (230) ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ NASH ΤEST (0-1) ME cutoff >0,25 ΠΡΟΣ ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ Nash Test cutoff Σοβαρότητα ύπαρξης NASH Αναλογία NAS score 0,75 NASH 5 0,50 Borderline NASH 3-4 0,25 No NASH 0-2 To Nash Test αποτελεί έναν αλγοριθμικό πίνακα διάγνωσης της NASH σύμφωνα με το ιστολογικό NAS score Στη μελέτη των Poynard et al (230) η ακρίβεια της μεθόδου (AUC) για τη διάγνωση της NASH (όταν NAS score 5) στην ομάδα κατάρτισης (Ν=160) και επικύρωσης (N=97) ήταν ίδια: 0,79 (95% CI: 0,69-0,86) και 0,79 (95% CI: 0,67-0,87 p=0,94) αντιστοίχως. (Πίνακας 17). Παρομοίως η ΑUC για τη διάγνωση της «borderline» NASH (όταν NAS score:3-4) στην ομάδα κατάρτισης και στην ομάδα επικύρωσης, έδινε την ίδια ακρίβεια: 0,69 (95% CI: 0,60-0,77) και 0,69 (95% CI: 0, p=0,98) αντίστοιχα (Πίνακας 17). Τέλος για τη διάγνωση «οχι» NASH (NAS score: 0-2) η AUC στην ομάδα κατάρτισης και επικύρωσης ήταν 0,77 (95% CI: 0,68-0,84) και 0,83 (95% CI: 0, p = 0.34) αντίστοιχα (Πίνακας 17). Επειδή οι AUROCs καμπύλες, για τη διάγνωση της NASH, έδιναν χαμηλές χαμηλές τιμές ακρίβειας 0,79 τόσο για την ομάδα κατάρτισης όσο και για την ομάδα επικύρωσης, οι δύο ομάδες-που δεν διέφεραν ιδιαίτερα όσον αφορά τα χαρακτηριστικά των NAFLD ασθενών ομαδοποιήθηκαν μαζί. Τότε το NASH Test είχε Spec 94% με PPV 64% και Sense 33% με NPV 81% για τη διάγνωση της NASH. (Πίνακας 17). Μια ανεξάρτητη επικύρωση επί ενός πληθυσμού NAFLD ασθενών από πολλά κέντρα, έδειξε μία παρόμοια τιμή ακρίβειας (AUC) 0,83 για NASH διάγνωση (de Ledinghen Victor, CYTOL study group, personal database)(16). 57 Σ ελίδα

62 ΠΙΝΑΚΑΣ 17 ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFL ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΤΟ NASH TEST(230) ΟΜΑΔΑ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ Ν=160 NASH ΔΙΑΓΝΩΣΗ AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,79 (95% CI: 0,64-0,86) 11/ / Borderline NASH 11/ / ,75 AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,69 96/103 20/57 96/133 20/27 0,50 (95% CI: 0,60-0,77) No NASH AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,77 < 0,25 (95% CI: 0,68-0,84) ΟΜΑΔΑ EΠΙΚΥΡΩΣΗΣ Ν = 97 NASH ΔΙΑΓΝΩΣΗ AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,79 (95% CI: 0,67-0,78) 10/ /62 98 Borderline NASH 10/ / ,75 AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,69 44/56 29/41 44/56 29/41 0,50 95% CI: 060-0,77) No NASH AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,83 <0,25 (95% CI: 0,67-0,90) ΟΛΟΙ ΟΙ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ NAFL N =257 NASH ΔΙΑΓΝΩΣΗ AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,83 21/ / Borderline NASH 21/ / ,75 AUROC Sense% Spec% PPV NPV Cut off 0,83 140/259 49/58 140/189 49/68 0, CI:confidence interval Έτσι το NASH Test φάνηκε ότι μπορεί να αποτελεί ένα αξιόπιστο απλό συνδυαστικό βαθμολογικό μοντέλο, για την αναγνώριση NAFL ασθενών που έχουν εξελίξει την νόσο σε NASH ή όχι. Επειδή η ηπατική βιοψία όπως προαναφέραμε- έχει περιορισμούς και πολλές φορές δίνει λάθος διάγνωση για ύπαρξη ή όχι στεάτωσης, NASH και NASH-ίνωσης (οι ιστολογικές βλάβες κατανέμονται ανομοιόμορφα μέσα στο ηπατικό παρέγχυμα) φαίνεται ότι το Steato Test μαζί με το NASH Test (FibroMax) και το Fibro Test, μπορούν να αποτελέσουν αξιόπιστους μη επεμβατικούς δείκτες πρόβλεψης όλης της ηπατικής ιστολογικής κατάστασης του ήπατος ασθενών με NAFLD και ήδη χρησιμοποιούνται τόσο σε μεγάλες πληθυσμιακές μελέτες προς έλεγχος της ηπατικής βλάβης χωρίς βιοψία, όσο και σε πληθυσμούς υψηλού κινδύνου εξέλιξης της νόσου όπως: Διαβητικοί, Παχύσαρκοι, Υπερλιπιδαιμικοί. 58 Σ ελίδα

63 Το NASH Test επομένως θεωρείται ένας πολύ ικανοποιητικός δείκτης πρόβλεψης σταδίου NASH. Η διάκριση της απλής ηπατικής στεάτωσης από τη NASH χωρίς προχωρημένη ίνωση (F0, F1, F2) θα είναι κλινικά ιδιαίτερα σημαντική όταν θα αναπτυχθούν ειδικές θεραπείες που θα είναι αποτελεσματικές στο να προλαμβάνουν την εξέλιξη της NASH. HOMA-IR: Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance Το ΗΟΜΑ-IR εκφράζει την αντίσταση στην Ins. HOMA-IR = Ινσουλίνη νηστείας (μυ/ml) x Γλυκόζη νηστείας πλάσματος (mg/dl) 405 To μοντέλο αυτό της HOMA-IR αναπτύχθηκε από τον Matthews (276) και τροποποιήθηκε αργότερα (277). Το HOMA-IR είναι ένας δείκτης για την αντίσταση στην Ins ή το μεταβολικό σύνδρομο, το οποίο αποτελεί τον κύριο παράγοντα κινδύνου για NAFLD. Μια μελέτη έδειξε ότι υπάρχει σημαντική διαφορά του HOMA-IR μεταξύ απλής στεάτωσης και NASH στην αρχή της (238). Μία άλλη μελέτη έδειξε ότι το HOMA-IR σχετίζεται σημαντικά με το βαθμό ηπατικής στεάτωσης, αλλά όχι με το βαθμό ηπατικής ίνωσης (27) σε ανάλυση πολλαπλής παλινδρόμησης προσαρμοσμένης με την ηλικία, το φύλο και το ΒΜΙ. Άλλες μελέτες (4,10,11,278) έδειξαν ότι το HOMA-IR αποτελεί μία παράμετρο που σε συνδυασμό με άλλες όπως τα κλινικά χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου (παχυσαρκία, ΣΔ ΙΙ, υπέρταση, υπερλιπιδαιμία), θα μπορούσαν να προβλέψουν τη σοβαρότητα της ηπατικής ίνωσης ή το βαθμό φλεγμονής και κυτταρικής βλάβης στη NASH. Το συμπέρασμα είναι ότι το HOMA-IR συσχετίζεται με την αντίσταση στην Ins σε NAFLD ασθενείς και προς το παρόν, από μόνο του, δεν αποτελεί ουσιαστικό δείκτη στεατοηπατίτιδας ή ίνωσης. Όμως μπορεί να συμμετάσχει ως παράμετρος σε διάφορους συνδυαστικούς βαθμολογικούς πίνακες (μοντέλα) μη επεμβατικής πρόβλεψης τόσο της NASH όσο και της NASίνωσης (4,10,11). HAIR Index (High Activity Insulin Resistant Index) Είναι ένας αλγόριθμος από την Αυστραλία (Dixon et al) (279) που περιλαμβάνει 3 μεταβλητές σχετιζόμενες με την αντίσταση στην Ins και τη λειτουργικότητα του ήπατος:.insulin Resistance (Αντίσταση στην Ins εκφραζόμενη από το HOMA-IR).Συστηματική Υπέρταση (ΑΠ mmhg) (AΠ 130/85 mmhg).alt ορού Kάθε μεταβλητή λαμβάνει 1 βαθμό. Ο Αλγόριθμος αυτός δημιουργήθηκε μετά από τη μελέτη μιας ομάδας 105 ασθενών με παχυσαρκία (ΒΜΙ>35Κg/m 2 ) που υπέστησαν βαριατρική χειρουργική επέμβαση και τους ελήφθη ταυτόχρονα βιοψία ήπατος. Ήταν μοντέλο ομοιόστασης. 26 ασθενείς (25%) βρέθηκαν να έχουν NASH και 11 από αυτούς (42%) είχαν προχωρημένη ίνωση. Ένας αυξανόμενος δείκτης της αντίστασης στην Ins (HOMA-IR), συστηματική Υπέρταση και αυξανόμενη τιμή ALT, φάνηκε να είναι ανεξάρτητοι παράγοντες πρόκλησης NASH αλλά και ίνωσης. Ένας συνδυασμός δύο ή τριών από αυτούς τους παράγοντες (2 ή 3 score) επέτρεπε μία ευαισθησία 80% με ειδικότητα 89% και έδινε ακρίβεια της μεθόδου (AUC) 0,90 για την ανίχνευση NASH (Πίνακας 18). Αυτό το μοντέλο, αποτελεί ένα από τα πρώτα μαθηματικά μοντέλα παραγωγής διαγνωστικών αλγόριθμων πρόβλεψης NASH. Στη συνέχεια άλλα μοντέλα πρόβλεψης NASH αναπτύχθηκαν σε ομάδες παχύσαρκων ασθενών με βαριατρικό χειρουργείο που είχαν ακρίβεια (AUC) από 0,76 έως 0,91. (Πίνακας 18) (108,270, ). 59 Σ ελίδα

64 ΝΑSH κλινικό βαθμολογικό Σύστημα Πρόβλεψης NASH σε άτομα με ΒΜΙ > 40 Kg/m 2. O Campos et al (280) παρουσίασε ένα συνδυαστικό πίνακα πρόβλεψης NASH που ως παραμέτρους περιλάμβανε: Αρτηριακή Υπέρταση (ΑΠ 130/80 mm Hg) : 1 βαθμός ΣΔ ΙΙ ΑST 27 IU/l ALT 27 IU/l Υπνοαπνοϊκό Σύνδρομο «ΟΧΙ» Μαύρη Φυλή : 1 βαθμός : 1 βαθμός : 1 βαθμός : 1 βαθμός : 2 βαθμοί Το μοντέλο αυτό δημιουργήθηκε από τη μελέτη 200 παχύσαρκων ασθενών, υποψηφίων για βαριατρικό χειρουργείου παχυσαρκίας, με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD και ύπαρξη NASH όταν NASH score 5 κατά Κleiner. Μια βαθμολογία 0-2 είχε χαμηλή πιθανότητα (13%) πρόβλεψης NASH. Βαθμολογία 3-4 είχε ενδιάμεση πιθανότητα (29%) πρόβλεψης NASH. Βαθμολογία 5 είχε υψηλή πιθανότητα (59%) πρόβλεψης NASH και βαθμολογία 6-7 είχε πολύ υψηλή πιθανότητα ύπαρξης NASH (80%) (Πίνακας 18). ΠΙΝΑΚΑΣ 18 ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟΙ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΙ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ ΑΤΟΜΑ ΜΕ ΝΟΣΟΓΟΝΟ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ (ΒΜΙ > 35 Kg/m 2 ) ΔΕΙΚΤΕΣ Ν AUROC Sense Spec PPV NPV Cut off HAIR Index (Dixon et al) (279) ΣΔ ΙΙ, AST (Gholam et al) (108) AΠ, ΣΔ ΙΙ, AST, ALT, Υπνοαπνοϊκό «όχι» Μαύρη Φυλή (Campos et al) (280) ΣΔ ΙΙ, ALT Τριγλυκερίδια, Υπνοαπνοϊκό (Ulitsky et al) (281) NASH Διαγνωστικό test: (Younossi et al) (270) ΝICE Mondel: (Anty et al) (283) 105 0,90 80% 89% 97 0,82 76% 66% HOMA- IR>5 ALT>40 IU/L ΑΠ 130/ ,80 Score 0-7 cut off ,76 69 (ΟΜΑΔΑ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ) 32 (ΟΜΑΔΑ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ) 101 (ΣΥΝΟΛΟ) 310 (ΟΜΑΔΑ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ) 154 (ΟΜΑΔΑ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ) 464 (ΣΥΝΟΛΟ) 0,91 0,73 0,91 0,88 0,83 0,88 74% 71% 96% 84% 89% 73% 75% (NAS 5) 89,7% (NAS <5) 70,21% 86% 44% 98% 0,14 HAIR Index:High Activity Insulin Resistant Index),NAS:NAFLD Activity score,homa-ir:homeostasis model assessment of insulin resistance,απ:αρτηριακή Πίεση,ΣΔ ΙΙ:Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2, ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase, AUROC: area under the receiver operating characteristic curve, PPV: positive predictive value, NPV: negative predictive value, SENSE :Sensitivity (%),SPEC : Specificity (%),Cutoff : όριο τιμής 60 Σ ελίδα

65 Συνδυαστικό Βαθμολογικό Μοντέλο πρόβλεψης NASH σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία που περιλαμβάνει ως μεταβλητές: ΣΔ ΙΙ, AST. O Gholame et al (108) σε μια μελέτη μη επεμβατικής πρόβλεψης NASH σε 97 άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία, χρησιμοποίησαν ως δείκτη, το βαθμολογικό αποτέλεσμα (score) ενός συνδυαστικού αλγοριθμικού τύπου που περιελάμβανε ως μεταβλητές την τιμή AST (IU/L) ορού και την παρουσία ΣΔ ΙΙ. Όλοι οι ασθενείς (n=97) είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD. Η ορθή πρόβλεψη NASH, με αυτήν τη μέθοδο, έδινε ακρίβεια (AUC) 0,82 με ειδικότητα 66% και ευαισθησία 76% (Πίνακας 18). Στην ίδια ομάδα ασθενών βρέθηκε ότι η ενσωμάτωση της ALT με την τιμή της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης αίματος (HbAIc), είχε καλή ακρίβεια πρόβλεψης της ίνωσης. Συνδυαστικό βαθμολογικό Μοντέλο πρόβλεψης NASH σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία που περιλαμβάνει ως μεταβλητές: ΣΔ ΙΙ, ALT, τριγλυκερίδια ορού, Υπνοαπνοϊκό. O Ulitsky et al (281) εξετάζοντας 253 άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία και ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, δημιούργησαν έναν αλγόριθμο πρόβλεψης NASH χρησιμοποιώντας τις παραπάνω μεταβλητές. Αυτός ο αλγόριθμος είχε NPV 89,7%, επομένως απέκλειε την ύπαρξη NASH στο 89,7% των ασθενών με NAS ιστολογικό score < 5 Η ακρίβεια της μεθοδολογίας, εκφραζόμενη από την AUROC καμπύλη, ήταν 0,76 Ταυτόχρονα η βαθμολογία αυτού του αλγορίθμου είχε PPV 75%, δηλαδή επιβεβαίωνε την παρουσία NASH στο 75% των ασθενών με NAS ιστολογικό score 5. (Πίνακας 18). NASH Διαγνωστικό Τεστ (NASH diagnostics): Γνωρίζοντας ότι ο θάνατος των κυττάρων με απόπτωση, είναι ένα κρίσιμο στάδιο για την ανάπτυξη NASH (Εικόνα 12), η ενσωμάτωση δεικτών κυτταρικού θανάτου σε ένα σύστημα βαθμολόγησης που συνδυάζει διαφορετικές παραμέτρους, είναι εύλογα χρήσιμη στο να κατασκευαστούν πιο αξιόπιστα βαθμολογικά μοντέλα προς μη επεμβατική αναγνώριση του σταδίου NASH. Ο Younossi et al (270) έδειξε ότι ο συνδυασμός 4 παραμέτρων: Μ30AgCK-18, M65AgCK-18, Resistin (Ρεζιστίνης) ορού, Αδιπονεκτίνης ορού μετρημένες με ELISA, δημιουργούσε ένα μοντέλο που το βαθμολογικό του αποτέλεσμα είχε ακρίβεια (AUC) 0,91 για την ιστολογική πρόβλεψη της NASH, με μια ευαισθησία 96% και ειδικότητα 70% σε μια ομάδα 101 ασθενών που υπέστησαν βαριατρικό χειρουργείο για κακοήθη παχυσαρκία και είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH (NAS score 5) (Πίνακας 18) NICE Model O Anty et al (283) δημιούργησε ένα σύνθετο βαθμολογικό σύστημα (μοντέλο) πρόβλεψης μη επεμβατικά της ύπαρξης NASH, εξετάζοντας 464 ασθενείς παχύσαρκους που υπέστησαν βαριατρικό χειρουργείο και είχαν ιστολογικά αποδεδειγμένη NAFLD (είχαν NASH όταν το NAS ιστολογικό score κατά Κleiner s ήταν 5). Αυτό το βαθμολογικό σύστημα (αλγόριθμος) πρόβλεψης NASH είχε ως μεταβλητές : M30AgCK-18, ALT ορού, Παρουσία Μεταβολικού Συνδρόμου (ΜΣ) H παρουσία μεταβολικού συνδρόμου ορίζεται ως: Κεντρικού τύπου παχυσαρκία: (περίμετρος μέσης 80cm για και 94cm για ) σε συνδυασμό με τουλάχιστον 2 από τα ακόλουθα κριτήρια: Τριγλυκερίδια ορού 1,7 mmol/l ή Tx για υπερτριγλυκεριδαιμία HDL - χοληστερόλη 1, 29 mmol/l στις και 1,03 mmol/l στους Συστολική ΑΠ 130 mmhg ή διαστολική ΑΠ 85 mmhg ή Tx για υπέρταση. Γλυκόζη πλάσματος νηστείας 5,6 mmol/l ή ΣΔ ΙΙ. 61 Σ ελίδα

66 H εξίσωση αυτού του αλγοριθμικού τύπου (Nice Model) ήταν: -5, ,780E - 0,2 x ALT (IU/L) + 2,215E 0,3 x CK 18 θραύσματα (Μ30Ag) σε ΙU/L + 1,825 x (παρουσία μεταβολικού συνδρόμου = 1). Όπου Ε: μαθηματική προβολή (πόσα 0 χρειάζονται στον τύπο). Μια τιμή Cutoff 0,14 είχε την καλύτερη ακρίβεια (AUC) 0,88 πρόβλεψης της NASH (NAS 5) στην ομάδα κατάρτισης των 310 ασθενών και AUC 0,83 για την πρόβλεψης της NASH στην ομάδα επικύρωσης των 154 ασθενών. Η ομάδα κατάρτισης (Ν=310) δεν παρουσίαζε δημογραφικές ή ορολογικές διαφορές σε σχέση με την ομάδα επικύρωσης (Ν=154). Τιμή Cutoff 0,14 σχετίζετε με ευαισθησία 84% και ειδικότητα 86% πρόβλεψης NASH, με δυνατότητα αποφυγής της βιοψίας στο 98% των παχύσαρκων ασθενών (NPV : 98%) που είχαν τιμή NICE Model κάτω από το κατώτερο Cutoff του 0,14. (Πίνακας 18). Στο σύνολο των 464 ασθενών με νοσογόνο παχυσαρκία, αξιολογήθηκαν άλλα βαθμολογικά μοντέλα, μη επεμβατικής πρόβλεψης NASH, που πρότειναν άλλοι μελετητές όπως οι Dixon et al (HAIR Index) (279), Gholam et al (108) και Palekar et al (284). Φάνηκε ότι υπήρχε πολύ χαμηλότερη ακρίβεια (AUC) των άλλων βαθμολογικών συστημάτων πρόβλεψης NASH, σε σχέση με την ακρίβεια της ορθής πρόβλεψής της με το Nice Model. (Πίνακας 19). ΠΙΝΑΚΑΣ 19 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΝΤΕΛΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΜΕ ΤΟ Nice Model ΜΕΘΟΔΟΣ AUROC (αρχικής μελέτης) AUROC (στην μελέτη με Ν = 436 Anty et al) Dixon et al( HAIR Index) (279) 0,90 0,77 Gholam et al (ΣΔ ΙΙ, 0,82 0,79 ASΤ) (108) Palekar et al (284) 0,74 0,44 Nice Model Anty et al (283) 0,88 Βλέποντας ότι η διαγνωστική ορθότητα άλλων συνδυαστικών μοντέλων έχει πολύ χαμηλή ακρίβεια (AUC) σε σχέση με την AUC του NICE Model, στην μελέτη των 464 ασθενών με νοσογόνο παχυσαρκία και γνωρίζοντας επίσης ότι η AUC για την μη επεμβατική πρόβλεψη της NASH, χρησιμοποιώντας μόνο τα «θραύσματα» CK-18, είναι 0,74, θα μπορούσαμε να θεωρήσουμε το NICE Model ως μία εναλλακτική αξιόπιστο (AUC: 0,88) λύση, αντί της βιοψίας, για την πρόβλεψη NASH (NAS score 5) σε παχύσαρκους ασθενείς καθώς και για την παρακολούθηση της ανταπόκρισης σε θεραπείες. Συνδυαστικό Βαθμολογικό Μοντέλο των: ΗΟΜΑ-IR, Αδιπονεκτίνη ορού Οι Hui et al (143) αναφέρουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα αδιπονεκτίνης και σημαντικά υψηλότερα επίπεδα HOMA-IR σε NASH ασθενείς συγκρινόμενους με αυτούς που έχουν απλή στεάτωση. Ο συνδυασμός HOMA-IR>3 με Αδιπονεκτίνη ορού 10 microg/ml, δημιουργεί έναν αλγόριθμο που το βαθμολογικό του αποτέλεσμα έχει ακρίβεια με (AUC) 0,79, για τη διάκριση ανάμεσα σε στεατοηπατίτιδα από απλή στεάτωση μη επεμβατικά. (Πίνακας 20). Συνδυαστικό Βαθμολογικό Μοντέλο των: AST, AST/ALT αναλογία (AAR:AST/ALT Ratio), ΗΑ ορού, BMI,, Ηλικία ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΣ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ AST 45 IU/L 1 AST/ALT αναλογία 0,8 (AAR) 1 ΗΑ ορού 55 mcg/l 1 BMI 30 Kg/m Hλικία > 50 έτη 1 ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase, HA: hyaluronic acid, ΒΜΙ:Body Mass Index. O Palekar et al (284) δημιούργησαν έναν βαθμολογικό πίνακα με τις παραπάνω παραμέτρους για την μη επεμβατική πρόβλεψη της NASH, εξετάζοντας μία ομάδα 80 ιστολογικά επιβεβαιωμένων NAFLD ασθενών.κάθε παράμετρος ελάμβανε έναν βαθμό (Score 0-6). Η 62 Σ ελίδα

67 παρουσία 3 ή περισσοτέρων παραμέτρων (score 3) έχει μια AUC 0,76 πρόβλεψης της NASH εκφραζόμενη με μια με ευαισθησία 74% ειδικότητα 66%, PPV 68% και NPV 71%. Ομάδα επικύρωσης δεν έχει μελετηθεί (Πίνακας 20). Συνδυαστικό Βαθμολογικό Μοντέλο των: Aδιπονεκτίνη ορού, HOMA-IR, τύπου IV κολλαγόνο 7S ορού Ο συνδυασμός αυτών των παραμέτρων δίνει μία ειδικότητα 74%, ευαισθησία 94%, NPV: 74% και PPV: 94% για την πρόβλεψη της ύπαρξης πρώιμου σταδίου NASH ( grading 1-2 κατά Brunt s) σε μία ομάδα 85 ασθενών με επιβεβαιωμένη ιστολογικά NAFLD που εξετάσθηκαν σε μία μελέτη των Shimada et al (238) (Πίνακας 20). Συνδυαστικός βαθμολογικό Μοντέλο των: HOMA-IR, Αδιπονεκτίνη / Λεπτίνη Ο Lemoine et al (244) διαπίστωσαν ότι HOMA-IR>3 σε συνδυασμό με λόγο Αδιπονεκτίνης/Λεπτίνη < 1,4103 έδινε μια βαθμολογία που είχε ακρίβεια (AUC) 0,82 αξιόπιστης διάκρισης απλής ηπατικής στεάτωσης από NASH, σε 84 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD. (Πίνακας 20). ΝΑSH Διαγνωστικό Panel Οι μεταβλητές του NASH διαγνωστικού πίνακα (Panel) είναι: ΣΔ ΙΙ, φύλο, ΒΜΙ, τριγλυκερίδια νηστείας ορού, Μ30Ag CK-18 «θραυσμάτων» M65Ag CK-18 ολικής. Ο Younossi et al (282) σε μια μελέτη που συμπεριελάμβανε 79 ασθενείς με NAFLD από τους οποίους οι 40 είχαν βιοψιακά αποδεδειγμένη NASH (NAS score 5) και οι 39 δεν είχαν βιοψιακά αποδεδειγμένη NASH (NAS score 0-2), έδειξε ότι ο συνδυασμός των παραπάνω παραμέτρων έδινε ένα βαθμολογικό αποτέλεσμα που μπορούσε να προβλέψει τη NASH με ακρίβεια (AUC) 0,81 (95% CI: 0,70-0,89) (Πίνακας 20). Η αξιοπιστία (AUC) αυτού του μοντέλου συγκρίθηκε με την αξιοπιστία των CK-18 θραυσμάτων (ως μονομερής βιοδείκτης πρόβλεψης NASH) και του NASH Διαγνωστικού Test στους 79 ασθενείς της μελέτης. (Πίνακας 21). ΠΙΝΑΚΑΣ 21 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΔΕΙΚΤΩΝ ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΗΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΜΕΘΟΔΟΣ AUROC AUROC Sense Sense Spec Spec NASH Διαγνωστικό Panel (282) Αρχικής μελέτης Παρούσας μελέτης n=79 Αρχικής μελέτης Παρούσας μελέτης n = 79 Αρχικής μελέτης Παρούσας μελέτης n=79 0,81 79% 74% NASH Διαγνωστικό Test (270) 0,91 0,70 96% 60% 70,21% 69% Μ30Ag CK-18 0,711 0,71 70% 72% 84% 64% (270) Στον παραπάνω συγκριτικό πίνακα φαίνεται ότι η αξιοπιστία (AUROC), ευαισθησία (Sense%) και ειδικότητα (Spec%) του NASH διαγνωστικού Panel υπερέχει των (AUROC, Sense%, Spec%) του NASH διαγνωστικού Test και της καλά επικυρωμένης εξέτασης του μονομερούς βιοδείκτη CK-18 θραυσμάτων. 63 Σ ελίδα

68 ΟΧ-NASH ( Oxidized NASH) (Δείκτης Κινδύνου για NASH) To Οξειδωτικό stress (ΟS) αναγνωρίζεται ως ένας μηχανισμός που συμβάλλει στην ανάπτυξη ηπατοκυτταρικής βλάβης και εξελικτικής πορείας στη NAFLD. Ταυτοποίηση μη επεμβατικών δεικτών που αντανακλούν το μέγεθος του OS στο ήπαρ και επομένως την παρουσία NASH, είναι ένας ελκυστικός στόχος. Σε μία μελέτη των Feldstein et al το 2010 (285), χρησιμοποιήθηκε ένα υψηλής ευαισθησίας υγρό χρωματογραφίας - φασματομετρίας προσέγγισης μάζας, στο πλάσμα 112 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, μέσω του οποίου οι ερευνητές ήταν σε θέση να καθορίσουν το προφίλ των κυκλοφορούντων βιοδραστικών προϊόντων λιπιδιακής Υπεροξείδωσης που είναι χαρακτηριστική στη NASH. Επίσης μέσω αυτής της μεθόδου μπορούσε να προσδιορισθεί και ο ρόλος των ελευθέρων ριζών (ROS) στη διαδικασία της γένεσης των προϊόντων λιπιδιακής υπεροξείδωσης. Σε αυτή τη μελέτη φάνηκε το απροσδόκητο εύρημα ότι από τα κυκλοφορούντα επίπεδα υπεροξειδίων λιπιδίων, μόνο ένα δομικό υποσύνολο ειδικών οξειδωμένων λιπαρών οξέων (OXFFAS: Oxidized Fatty Acids) χρησιμεύουν σαν δείκτης ηπατικής φλεγμονής, στεάτωσης και ίνωσης σε NASH ασθενείς.στην μελέτη συμμετείχαν 73 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD ως ομάδα κατάρτισης και 49 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD ως ομάδα επικύρωσης. Με βάση τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης, αναπτύχθηκε ένας δείκτης κινδύνου για NASH (OX-NASH): OX-NASH: (13-HODE: 13-hydroxyl-octadecadenοιc acid), ηλικία, ΒΜΙ, AST LA: Linoleic Acid Ο ανωτέρω τύπος αποτελεί έναν λογαριθμικό τύπο και η μεθοδολογία προσδιορισμού του είναι μοντέλο πολυμεταβλητής λογιστικής παλινδρόμησης. To 13-HODE αποτελεί υποσύνολο του συνόλου των δομικών ειδικών οξειδωμένων λιπαρών οξέων (OXFFAs), που προκύπτουν ως προϊόντα λιπιδιακής υπεροξείδωσης λόγω του OS στη NASH. Συγκεκριμένα το 13-HODE αποτελεί προϊόν υπεροξείδωσης του λινολεϊκού οξέως (LA) από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου (ROS). Η εξίσωση που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό του OX-NASH είναι: Z= -10, ,0463 x Ηλικία (έτη) + 0,147 x ΒΜΙ (Kg/m 2 ) + 0,0293 X AST (IU/L) + 2,658 x 13- HODE /LA (mmol/mol) Σε αυτό το αλγοριθμικό μοντέλο πρόβλεψης NASH, μια κατά 0,5 mmol/mol αύξηση της αναλογίας 13-HODE/LA συνδεόταν με μια αύξηση κατά 3,8 φορές της πιθανότητας ύπαρξης ιστολογικά NASH. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη (AUROC) για OX-NASH, έδινε ακρίβεια (AUC) στο 0,83 στην ομάδα κατάρτισης που βρέθηκε ότι είναι σημαντικά υψηλότερη από την ακρίβεια πρόβλεψης NASH με βάση την τιμή ALT ορού (AUC) 0,56 ή της AST ορού (AUC) 0,69. Το OX-NASH (κίνδυνος για NASH) ήταν σημαντικά αυξημένο σε ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH (NAS score>5) έναντι αυτών με απλή στεάτωση (NAS score: 0-2). Η ακρίβεια του μοντέλου OX-NASH για την πρόβλεψης NASH, εξετάστηκε σε μια ανεξάρτητη ομάδα 49 ασθενών (ομάδα επικύρωσης). Η AUROC καμπύλη στην ομάδα επικύρωσης έδινε ακρίβεια(auc) 0,74 για την πρόβλεψη NASH. Η δοκιμασία OX-NASH είχε ευαισθησία 81% και ειδικότητα 97% στην ομάδα κατάρτισης προς μη επεμβατική διάγνωση NASH. Ενώ στην ομάδα επικύρωσης είχε ευαισθησία 84% και ειδικότητα 63% προς πρόβλεψη NASH μη επεμβατικά (Πίνακας 20). Αυτή η απλή βαθμολογία κινδύνου ιστολογικής ύπαρξης NASH, φαίνεται να είναι κλινικά χρήσιμη προς καθορισμό της παρουσίας και της σοβαρότητας της NASH και μελλοντικές μελέτες είναι δικαιολογημένες. 64 Σ ελίδα

69 ΠΙΝΑΚΑΣ 20 ΣΥΝΔΥΑΣΤΙΚΟΙ ΠΙΝΑΚΕΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NASH ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΔΕΙΚΤΕΣ Ν AUROC Sense Spec PPV NPV Cut off (HOMA-IR >3 Αδιπονεκτίνη 10 μg/ml) (Hui et al) (143) 109 0,79 (Ηλικία 50,, AST 45 IU/L AST/ALT 0,8 BMI 30 Kg/m 2 HA 55 mcg/l) (Palekar et al) (284) 80 0,76 74% 66% 71% 68% 3 (Αδιπονεκτίνη, HOMA-IR, τύπος IV κολλαγόνο 7s ) (Shimada et al) ( % 74% 74% 94% (HOMA-IR>3 Αδιπονεκτίνη/Λεπτίνη < 1,410) (Lemoine et al) (244) 84 0,82 NASH DIAGNOSTIC Panel (φύλο, ΒΜΙ, ΣΔ ΙΙ, τριγλυκερίδια, M30Ag CK-18, M65Ag CK-18) (Younosis et al) (282) 79 0,81 79% 74% OX-NASH (Ηλικία, ΒΜΙ, AST, 13-HODE/LA) (Feldstein et al) (285) 73 (ομάδα κατάρτισης) 49 (ομάδα επικύρωσης) 0,83 0,74 HOMA-IR:homeostasis model assessment of insulin resistance, ΣΔ ΙΙ:Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2, ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase, HA: hyaluronic acid, ΒΜΙ:Body Mass Index, 13-HODE: 13-hydroxyl-octadecadenοιc acid, LA: Linoleic Acid, ΟΧ-NASH:Oxidized NASH 81% 84% 97% 63% 65 Σ ελίδα

70 Μονομερείς βιοδείκτες ίνωσης στη NAFLD υπό έρευνα Η ηπατική ίνωση είναι μία δυναμική διαδικασία που εμπλέκει σύνθετη αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ένζυμα που συμμετέχουν στη σύνθεση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και της καταστροφής της. Συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όπως το Υαλουρονικό οξύ (ΗΑ: Hyaluronic Acid), τα συστατικά του κολλαγόνου όπως προκολλαγόνο τύπου ΙΙΙ, τύπος IV κολλαγόνου και η 7S περιοχή του τύπου IV κολλαγόνου, καθώς και η Λαμινίνη ορού έχει φανεί να συσχετίζονται μονομερώς ή σε συνδυασμό, με την παρουσία ηπατικής ίνωσης σε ενήλικες ή παιδιά με NAFLD (11,27). HA (Hyaluronic Acid) Η απόπτωση αποτελεί μία μορφή κυτταρικού θανάτου και φαίνεται να εμπλέκεται ιδιαίτερα στην παθοφυσιολογία της NASH. Η απόπτωση έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων (HSCs: Hepatic Stellate cells), που προκαλούν παραγωγή συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM: extra cellular matrix). Στις παραμέτρους του κυτταρικού θανάτου μέσω απόπτωσης υπολογίζεται η παραγωγή ΗΑ που έχει συνδεθεί με την κίρρωση και την παραγωγή κολλαγόνου (286). Αυτό ταιριάζει με τις τρέχουσες θεωρίες περί ηπατοκυτταρικού θανάτου και επακόλουθης ενεργοποίησης των μη παρεγχυματικών HSCs κυττάρων σαν ένα ουσιαστικό γεγονός ινογένεσης και εξέλιξης προς κίρρωση, στις χρόνιες ηπατικές νόσους αλλά επίσης και στην οξεία ηπατική βλάβη (287). (Εικόνα 12). Επομένως τα επίπεδα του ΗΑ (ως συστατικό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας) είναι αυξημένα στην ηπατική ίνωση, αντανακλώντας την αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου και την ελαττωμένη κάθαρση κολλαγόνου από τα κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα του ήπατος. Αρκετές μελέτες όπως και η δική μας (11,31, ) χρησιμοποιώντας ποικίλα cutoff τιμών ΗΑ στο αίμα, έχουν δείξει ότι το ΗΑ μπορεί να προβλέψει γεφυροποιό ηπατική ίνωση ή κίρρωση σε NAFLD ασθενείς με μια ακρίβεια, εκφραζόμενη με AUROCs καμπύλες, από 0,80-0,97. Ωστόσο, φαίνεται ότι το ΗΑ είναι λιγότερο αξιόπιστος δείκτης για την ανίχνευση μικρότερου βαθμού ίνωσης (F0-F2) με ακρίβεια κυμαινόμενη από 0,67-0,73 για κάθε βαθμό ίνωσης. Ο Suzukie et al (287) εκτίμησαν την αξιοπιστία των επιπέδων ΗΑ ορού, ως προς την πρόβλεψη της σοβαρότητας της ηπατικής ίνωσης (Staging), σε 79 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD. Τιμή ΗΑ ελήφθη κατά την ώρα της βιοψίας. Ο λογάριθμος του ΗΑ ορού έδειξε μια σημαντική θετική συσχέτιση με το στάδιο ίνωσης και αυτή η σύνδεση παρέμενε και μετά την προσαρμογή για την ηλικία και τη λευκωματίνη ορού. Η δοκιμασία βρέθηκε να είναι χρήσιμη για την πρόβλεψη της σοβαρότητας της ίνωσης (stage 2-4) με ακρίβεια της μεθόδου (AUC) 0,90(95%CI:0,83-0,97). Η μελέτη δεν μπορούσε να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα της μεθόδου για μέτρια ίνωση (F2) ίσως λόγω του μικρού αριθμού των ασθενών με αυτό το στάδιο ίνωσης και έδειξε χαμηλή ακρίβεια για ήπια ίνωση (F1) (Πίνακας 22). Στη μελέτη μας Lydatakis et al (288), 50 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH εξετάσθηκαν ως προς συσχέτιση των επιπέδων ΗΑ, Λαμινίνης και Λεπτίνης με την ιστολογική παρουσία και βαθμού (Staging) ίνωσης. Η διακριτική ικανότητα κάθε μεταβλητής εκτιμήθηκε με βάση την ευαισθησία, την ειδικότητα, τη θετική προγνωστική αξία (PPV), την αρνητική προγνωστική αξία (NPV) και την ακρίβεια (AUC), με τον καθορισμό των ορίων cut off της περιοχής υπό την καμπύλη (ROC ανάλυση). Η τιμή cutoff HA ορού 148,8 ng/ml, παρουσίαζε την καλύτερη ακρίβεια για την αναγνώριση των ασθενών με NAFLD-ίνωσης (AUC: 0,96) με ευαισθησία 95,7%, ειδικότητα 96,3%, PPV 95,7% και NPV 96,3% (Πίνακας 22). Η μέση τιμή ΗΑ βρέθηκε να είναι σημαντικά διαφορετική ανάμεσα σε ασθενείς διαφορετικού σταδίου ίνωσης και γενικά η μέση τιμή ΗΑ ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με NAFLD-ίνωση απ ότι σε ασθενείς χωρίς ίνωση. Ο Sakugawa et al (289) σε μια άλλη μελέτη που περιελάμβανε 112 άτομα με NAFLD ιστολογικά αποδεδειγμένη, έδειξε ότι η τιμή ΗΑ ορού αποτελεί έναν χρήσιμο βιοδείκτη μη επεμβατικής διάκρισης NASH από απλή στεάτωση, καθώς και διάκρισης ασθενών με σοβαρή ίνωση (F3, F4) από ασθενείς με ήπια ή μέτρια ίνωση (F1, F2). Συγκεκριμένα φάνηκε ότι με cut off τιμής ΗΑ ορού > 43 ng/ml, χρησιμοποιώντας ROC ανάλυση, η θετική προγνωστική αξία (PPV) πρόβλεψης NASH ήταν 92% με ακρίβεια (AUC) 0,80. Μια τιμή cut off, επιπέδων ΗΑ ορού > 50 ng/ml απέκλειε την ιστολογική παρουσία σοβαρής ηπατικής ίνωσης (NPV) σε ποσοστό 78% των ασθενών (Πίνακας 22). 66 Σ ελίδα

71 Ο Yoneda et al (290) σε μια ξεχωριστή ομάδα 72 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, έδειξε ότι χρησιμοποιώντας την τιμή ΗΑ ορού μπορούσε να προβλεφθεί η προχωρημένη ίνωση (F3, F4) μη επεμβατικά με ακρίβεια (AUC) 0,754 (Πίνακας 22). Ο Kaneda et al (294) έδειξαν ότι μια τιμή cutoff επιπέδων ΗΑ ορού 42 ng/ml μπορούσε να διακρίνει 100% τη παρουσία προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) από την απουσία ίνωσης σε 148 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD και συνδεόταν με έναν ιδανικό συνδυασμό της ευαισθησίας (Sense: 100%, 95% CI: %) και ειδικότητας (Spec: 89%, 95% CI: 80-94%) (Πίνακας 22). Ο Lesmana et al (27) σε μία ομάδα 30 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, ανέδειξε ότι η μέση συγκέντρωση ΗΑ ορού ήταν σημαντικά υψηλότερη σε NAFLD ασθενείς με προχωρημένη ίνωση (F3, F4), σε σχέση με τους NAFLD ασθενείς με ήπια ή μέτρια ίνωση (F1- F2) (543,6 +/-360,45 ng/ml έναντι 180,8+/-49,63) (p<0,05) (Πίνακας 22). Ο Palekar et al(291) εξετάζοντας 80 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD (39 με απλή στεάτωση και 41 με ιστολογικές αποδείξεις NASH) έδειξε ότι τιμή cutoff επιπέδων ΗΑ ορού 45,3 ng/ml, είχε μια καλή ακρίβεια πρόβλεψης προχωρημένης ίνωσης (AUC 0,88) με Sense 85,7%, Spec 80,3% (Πίνακας 22). Ο Nobil et al (291) παρομοίως, εξετάζοντας μια ομάδα 100 παιδιών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, εκ των οποίων ιστολογικά είχαν ίνωση το 65%, έδειξε ότι τιμές ΗΑ ορού ng/ml έκαναν την απουσία ίνωσης (F0) απίθανη 7% (95% CI: 1-14%) δοθέντος ότι τιμές ΗΑ ορού ng/ml συνδεόταν με πιθανότητα 89%( 95% CI: %) παρουσίας σταδίου ίνωσης F2, F3 ή F4 (Πίνακας 22). Ο Santos et al (293) εξέτασε 30 υπέρβαρους (ΒΜΙ 25) ασθενείς με ιστολογικά αποδεδειγμένη NAFLD (19 χωρίς ίνωση και 11 με ίνωση). Τιμές cut off επιπέδων ΗΑ ορού > 24,6 ng/ml, έδιναν μια AUC 0,73 πρόβλεψης προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) με Sens 82% και Spec 68% (Πίνακας 22). ΠΙΝΑΚΑΣ 22 ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΗΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ Ν AUROC καμπύλη Sense Spec PPV NPV cutoff ΗΑ (Suzuki et al) (287) 79 0,89 85% 80% 51% 96% 46,1 ng/ml ΗΑ (Lydatakis et al) (288) 50 0,96 95,7% 96,3% 95,7% 96,3% 148,8 ng/ml HA (Sakugawa et al) (289) 112 0,80 0,80 ΗΑ (Yoneda et al) (290) 72 0,754 65,7% 68,8 90,5% 82,8% 92% 75% 61,3% 78% 43ng/ml (F1, F2, F3, F4) 50 ng/ml (F3, F4 ίνωση) ΗΑ (Kaneda et al) (294) 148 0,97 100% 89% HA (Lesmana et al) (27) 30 HA (Palekar et al) (291) 80 0,88 85,7% 80,3% - - HA (Nobil et al) (292) 100 0,89 89% HA (Santos et al)(293) 30 0,73 82% 68% HA :Hyaluronic Acid > 42 ng/ml (F3, F4) 543,6 +/- 360,45 ng/ml, (F3, F4) 45,3 ng/ml ng/ml (F2, F3, F4) > 24,6 ng/ml (F3, F4) 67 Σ ελίδα

72 Κολλαγόνο τύπου IV περιοχή 7S Το κολλαγόνο IV περιοχής 7S είναι ένας δείκτης ινόλυσης. Τα επίπεδα της περιοχής 7S στον ορό ασθενών με σοβαρή NAFLD ίνωση, φαίνεται να είναι σημαντικά αυξημένα (4,27,289,290,293,294). Επίσης έχει φανεί ότι αυξημένα επίπεδα 7S κολλαγόνου IV στο αίμα, φαίνεται να σχετίζονται με το ποσόν του κολλαγόνου στο ήπαρ ασθενών με χρόνια HBV (27). O Sakugawa et al, στην ακολουθία των 112 ασθενών με NAFLD (289) που εκτιμήθηκε η αξία του ΗΑ για την πρόβλεψη NASH-ίνωσης, εκτίμησαν παρομοίως και την αξία της τιμής (cutoff) των επιπέδων του 7S κολλαγόνου IV για την πρόβλεψη της προχωρημένης ίνωσης. Ένα cutoff 5,0 ng/ml παρείχε ακρίβεια AUC: 0,82 για τον αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης με μία NPV 84% και PPV 68%. Επομένως τιμές επιπέδων του 7S κολλαγόνου IV ορού < 5,0 ng/ml απέκλειαν την παρουσία προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) στο 84% των ασθενών. Συνεπώς οι 94 από τους 112 ασθενείς της μελέτης δεν θα χρειαζόταν βιοψία ήπατος και χρειαζόταν, προς το παρών, μόνο τροποποίηση του τρόπου ζωής (διατροφή άσκηση) και έλεγχος των παραγόντων του μεταβολικού συνδρόμου (ΣΒ, ΑΠ, ΣΔ ΙΙ) (Πίνακας 23). Επίσης αυτός ο βιοδείκτης έδειξε μία PPV 86% με AUC 0,83 για την ακριβή διάκριση της NASH από την απλή ηπατική στεάτωση. Ο Yoneda et al (290) εξετάζοντας τους 72 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, εκτός από τη τιμή ΗΑ ορού προς ανίχνευση σοβαρής ίνωσης (F3, F4), εκτίμησαν και τα επίπεδα του 7S κολλαγόνου IV στον ορό. Η AUROC καμπύλη έδινε ακρίβεια 0,767 για την ανίχνευση NASH με F3, F4 ίνωση. Αναλύσεις πολλαπλής παλινδρόμησης ανέδειξαν ότι μόνο τα επίπεδα ορού του 7S κολλαγόνου IV και όχι τα επίπεδα ΗΑ ορού, ήταν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με προχωρημένη ίνωση ακόμα και μετά την προσαρμογή για το ΒΜΙ, ηλικία, φύλο, αριθμό PLT, χρόνο προθρομβίνης (ΧΠ), αναλογία AST/ALT και παρουσία ΣΔ ΙΙ. Μεταβλητές που έχει αναφερθεί ότι σχετίζονται με την προχωρημένη ίνωση σε NASH-ασθενείς (Πίνακας 23). Ο Kaneda et al (294) στους 148 ασθενείς της μελέτης του με την επιβεβαιωμένη ιστολογικά NAFLD, εκτός από τα επίπεδα ΗΑ εξέτασαν και τα επίπεδα 7S κολλαγόνου IV στον ορό, προς εκτίμηση της δυνατότητας πρόβλεψης F3, F4 ίνωσης. Μια ακρίβεια (AUC) 0,87 αναδείχθη χρησιμοποιώντας την τιμή κολλαγόνου 7S τύπου ΙΙΙ στον ορό των NAFLD ασθενών (Πίνακας 23). Ο Lesmana et al (27) επίσης χρησιμοποιώντας τα επίπεδα 7S κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ ορού, κατέληξε ότι αποτελούν έναν αξιόπιστο δείκτη πρόβλεψης της προχωρημένης ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Συγκεκριμένα στη μελέτη των 30 ασθενών με NAFLD ιστολογικά επιβεβαιωμένης, ανέδειξε ότι εκτός από τη μέση τιμή ΗΑ ορού και μέση τιμή 7S κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ:288,0+/- 171,22 ng/ml μπορούσε να προβλέψει την προχωρημένη ίνωση (F3, F4), ενώ μέση τιμή 125,3+/-32,11 μπορούσε να προβλέψει την ήπια (F1) ή μέτρια (F2) ίνωση p=0,010 (Πίνακας 23). Ο Santos et al (293) στην ομάδα των υπέρβαρων NAFLD ασθενών, εκτός από τα επίπεδα ΗΑ εκτίμησε και τα επίπεδα 7S κολλαγόνου ΙΙΙ ορού για την πρόβλεψη ίνωσης σε NAFLD. Τιμές cut off επιπέδων 7S κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ > 145 ng/ml, μπορούσαν να προβλέψουν την παρουσία F3,F4 σταδίων ίνωσης με AUC 0,80 ευαισθησία 64% και ειδικότητα 89% (Πίνακας 23). Προκολλαγόνο τύπου ΙΙ Έχει φανεί κάποια ιδιαίτερη σχέση του ποσού του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ με το ποσό του κολλαγόνου στο ήπαρ ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β ((ΗΒV) και NAFLD (4). Λαμινίνη Η Λαμινίνη είναι ένα συστατικό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που υφίσταται κάθαρση από τα ηπατικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Μία μικρή μελέτη 30 ασθενών από τους Santos et al (293) έδειξε ότι τιμές λαμινίνης ορού > 282 ng/ml είχαν την καλύτερη ακρίβεια (AUC) 0,87 σε σχέση με τις τιμές ΗΑ ορού (AUC: 0,73) και επιπέδων 75 κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ (AUC: 0,80) για την πρόβλεψη ίνωσης στη NAFLD. Η μέτρηση των επιπέδων Λαμινίνης ορού είχε Sense 82%, Spec 89% με PPV 82% και NPV 89% για την πρόβλεψη της NASH ίνωσης F3, F4 (Πίνακας 23). Ο συνδυασμός επιπέδων Λαμινίνης με ΗΑ ορού, έδινε μια ακρίβεια (AUC) 0,87 με Sense: 73%, Spec: 95%, PPV: 89% και NPV: 86% για την αναγνώριση της ιστολογικής ύπαρξης ίνωσης σε NAFLD υπέρβαρους (ΒΜΙ 25 Kg/m 2 ). O συνδυασμός τιμών Λαμινίνης με τύπο IV κολλαγόνο είχε μια παρόμοια ακρίβεια (AUC: 0,87) με μεγαλύτερη όμως ειδικότητα (Spec: 100%) και PPV: 100% για τη διάγνωση ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Στη μελέτη μας, Lydatakis et al (288) παρατηρήθηκε ότι η μέση τιμή των επιπέδων Λαμινίνης ορού ήταν στατιστικώς υψηλότερη (482,26 ± 395,90) στην ομάδα των ασθενών με NASH-ίνωση 68 Σ ελίδα

73 (n=23) σε σχέση με την ομάδα των ασθενών με NASH χωρίς ίνωση (n = 27) (p< 0,001). Όμως εν αντιθέσει με το ΗΑ ορού, τα επίπεδα Λαμινίνης ορού δεν συσχετιζόταν με το στάδιο NASHίνωσης. Επομένως ενώ η μέτρηση των επιπέδων ΗΑ ορού θα μπορούσε να λειτουργήσει για σταδιοποίηση NASH-ίνωσης, η τιμή Λαμινίνης ορού συσχετίζεται μόνο με την παρουσία ίνωσης ή όχι σε NAFLD ασθενείς. Η ακρίβεια (AUC) της πρόβλεψης NASH-ίνωσης, με τιμή cut off Λαμινίνης ορού 292,50, ήταν 0,74 με Sense: 73,9%, Spec: 74,1%, PPV: 70,8%, NPV: 76,0%. (Πίνακας 23). YKL-40 Η YKL-40 είναι μια γλυκοπρωτεΐνη εκκρινόμενη από διάφορους τύπους κυττάρων περιλαμβανομένων και των HSCs (Εικόνα 12) που παράγουν κολλαγόνο (4,11).Τιμή cutoff YKL micro/l στον ορό NAFLD ασθενών, έχει προταθεί ως δείκτης ίνωσης σε μια μελέτη που δεν επικυρώθηκε (11). Ωστόσο, άλλες μελέτες δεν έχουν δείξει τη σύνδεση YKL-40 με ίνωση σε NAFLD ασθενείς (11). Φερριτίνη Τα επίπεδα φερριτίνης ορού είναι αυξημένα στο 21-40% των NAFLD ασθενών και φαίνεται να συσχετίζονται με την αντίσταση στην Ins και την ηπατική βλάβη περισσότερο, αντί να αντανακλούν αυξημένες αποθήκες Fe (11).Η φερριτίνη έχει βρεθεί να είναι ανεξάρτητος σημαντικός παράγοντας ηπατικής ίνωσης σε 167 ασθενείς από την Ιταλία με NAFLD (295). Αν και αρκετές μελέτες έχουν αποτύχει να αναπαραγάγουν αυτό το αποτέλεσμα, μια πρόσφατη μεγάλη μελέτη έδειξε ότι τιμές φερριτίνης ορού > 1,5% από τα ανώτερα φυσιολογικά όρια, συνδέονται με προχωρημένη ηπατική ίνωση σε μια ομάδα 628 ασθενών με NAFLD (296).Ο ακριβής ρόλος της μεμονωμένης τιμής φερριτίνης ορού ως δείκτης ηπατικής ίνωσης είναι ακόμα αδιευκρίνιστος. Η Manousou et al (297) έχουν πρόσφατα δείξει ότι η Φερριτίνη ορού όταν συνδυάζεται με το BMI (>30 Kg/m 2 ), αποτελεί ένα χρήσιμο δείκτη διάκρισης ηπατικής ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Αυτός ο συνδυασμός μπορεί να οδηγήσει στην απόφαση λήψης βιοψίας προς προσδιορισμό της σοβαρότητας της ίνωσης (Πίνακας 23). γ-gt Αυξημένα επίπεδα γ-gt φαίνεται να συνδέονται με προχωρημένη ίνωση σε NAFLD ασθενείς. Σε μια μελέτη 30 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD, φάνηκε ότι τα επίπεδα γ-gt ορού έδιναν μια AUC: 0,74 για την ακριβή πρόβλεψη της προχωρημένης ίνωσης (298). Χρησιμοποιώντας ένα cutoff τιμών γ-gt ορού 96,5 U/l, η γ-gt προέβλεπε την προχωρημένη ίνωση με Sense 83% και Spec 69%. (Πίνακας 23). 69 Σ ελίδα

74 ΠΙΝΑΚΑΣ 23 ΒΙΟΔΕΙΚΤΕΣ Κολλαγόνο τύπου - IV 7S περιοχή (Sakugawa et al) (289) Κολλαγόνο τύπου IV 7S περιοχή (Yoneda et al) (290) ΜΟΝΟΜΕΡΕΙΣ ΒΙΟΔΕΙΚΤΗΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΙΝΩΣΗΣ ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ Ν AUROC καμπύλη Sense% Spec% PPV NPV Cutoff 112 0,817 81,3 71,4 68% 84% 5 ng/ml 72 0,767 Κολλαγόνο τύπου IV 7S περιοχή (Kaneda et al) (294) Κολλαγόνο τύπου IV 7S περιοχή (Lesmana et al) (27) 148 0, ,0+/- 171,22 ng/ml Κολλαγόνο τύπου IV 7S περιοχή (Santos et al) (293) 30 0,80 64% 89% 78% 81% > 145 ng/ml Λαμινίνη (Santos et al) (293) 30 0,87 82% 89% 82% 89% > 282 ng/ml, Λαμινίνη (Lydatahis et al) (288) Φερριτίνη (Kowdley et al) (296) ,74 73,9% 74% 70,8% 76,9 292,50 ng/ml > 300 ng/ml σε (F3, F4) > 450 ng/ml σε (F3, F4) Φερριτίνη (Manousou et al) 111 0,87 (297) γ-gt (Tahan et al) (298) 50 0,74 83% 69% 96,5 U/l 70 Σ ελίδα

75 Συνδιαστικά μοντέλα (Αλγόριθμοι) πρόβλεψης NASH-ίνωσης σε NAFLD ασθενείς υπό έρευνα Αρκετοί διαγνωστικοί αλγοριθμικοί πίνακες έχουν αναπτυχθεί προς διευκόλυνση της μη επεμβατικής εκτίμησης της ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD καθώς και των σταδίων της. Αυτοί γενικά βασίζονται σε ένα αριθμό εργαστηριακών μετρήσεων συχνά σε συνδυασμό με κλινικές παραμέτρους όπως η ηλικία, το φύλο, το ΒΜΙ. Αυτά τα βαθμολογικά συστήματα έχουν γενικά φανεί πιο χρήσιμα στην ανίχνευση προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) απ ότι στα ενδιάμεσα (F1, F2) και πρώιμα (F0, F1) στάδια ίνωσης. Όμως βοηθούν στην μη επεμβατική πρόβλεψη ίνωσης σε μια μεγάλη ομάδα ασθενών που πιθανώς δύνανται να ωφεληθούν από θεραπευτικές παρεμβάσεις. H άνιση κατανομή της ίνωσης σε όλο το ήπαρ σε ασθενείς με NAFLD, δείχνει ότι τέτοια βαθμολογικά μοντέλα μπορεί δυνητικά να αντιπροσωπεύουν μία πιο σφαιρική εικόνα της βαρύτητας της ηπατικής ίνωσης επί NAFLD, απ ότι αυτή επιτρέπεται με τον μέχρι σήμερα «χρυσό κανόνα» της βιοψίας ήπατος. Με τη βιοψία ήπατος λαμβάνεται δείγμα ίσο με το 1/ χιλιάδες του συνόλου του ήπατος και έτσι υπάρχει σημαντικό δειγματοληπτικό σφάλμα (211,224,225). BARD score Το BARD score είναι ένα απλό βαθμολογικό σύστημα που δημιουργήθηκε προς αναγνώριση NAFLD ασθενών με χαμηλό κίνδυνο για προχωρημένη νόσο. Αποτελεί το σταθμισμένο άθροισμα 3 μεταβλητών: ΒΜΙ > 28 (Kg/m2) = 1 βαθμός AST/ALT αναλογία (ΑΑR) 0,8 = 2 βαθμοί ΣΔ ΙΙ = 1 βαθμός Έτσι δημιουργείται ένα βαθμολογικό σύστημα 0-4. Το BARD score δημιουργήθηκε από την ανάλυση δεδομένων που συλλέχθηκαν αναδρομικά από μία ομάδα 827 ασθενών με NAFLD. Ένα score 2 συνδεόταν με πιθανή αναλογία για προχωρημένη ίνωση (PPV) 17% και πιθανότητα απουσίας ίνωσης (NPV) 96% όταν score < 2. Το BARD score αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε από τους Harrison et al (299) (Πίνακας 24). Το BARD score επικυρώθηκε και διασταυρώθηκε επίσης σε έναν πληθυσμό 104 Πολωνών με NAFLD από τους Raszeja-Wyszomirska et al (300) το Ένα BARD score 2-4 έδινε NPV 97% για F3 και F4 στάδιο ίνωσης. Λόγω της μεγάλης αρνητικής προγνωστικής του αξίας (ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα 3%) το 97% των NAFLD ασθενών που υποβλήθηκαν σε βιοψία ήπατος για εκτίμηση προχωρημένης ίνωσης (F3, F4), θα μπορούσαν να την αποφύγουν αν το BARD score εισαχθεί ευρέως στα Νοσοκομεία. Η ακρίβεια της μεθόδου (AUC) για την πρόβλεψη της προχωρημένης ίνωσης, εκφραζόμενη με την AUROC καμπύλη, ήταν 0,821 (p<0,001). H PPV ήταν 31,5% (υψηλό ποσοστό ψευδώς, θετικών αποτελεσμάτων) με πολύ μεγάλη ευαισθησία της μεθόδου (Sense: 86,7%) και ειδικότητα (Spec: 72,7%) όταν 2 βαθμοί τίθεντο ως cutoff τιμής της μεθόδου (Πίνακας 24). Μια επιπλέον μελέτη από τους Ruffilo et al (301) σε 138 ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη NAFLD, ανέδειξε μια ακρίβεια (AUC) 0,67 με Sense, Spec, NPV, PPV 51%, 77%, 81%, 45% αντιστοίχως για την πρόβλεψη της προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) με τιμή cutoff της μεθόδου 2 (Πίνακας 24). Μια άλλη μελέτη από τους McPherson et al (26) το 2010 συνέκρινε κάποια διαγνωστικά βαθμολογικά μοντέλα όπως και το BARD score, σε 145 ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη NAFLD. Το BARD score όπως και όλα τα υπόλοιπα (AST/ALT αναλογία, Fib-4 score, APRI score, NAFLD fibrosis score), που θα αναφερθούν παρακάτω, είχαν σημαντικά υψηλότερη βαθμολογία cutoff στην ομάδα των ασθενών που είχαν βιοψιακά αποδεδειγμένα προχωρημένη ίνωση (F3, F4) (p<0,001)(πίνακας 30). H ακρίβεια (AUC) που προέκυπτε με ROC ανάλυση ήταν για το BARD score 0,77 με Sense, Spec, PPV και NPV 89%, 44%, 27%, 95% με τιμή cutoff 2 (Πίνακας 24). Το BARD score σε αυτή τη μελέτη είχε από τις πιο υψηλές NPV. To BARD score με τιμή cut off <2, λόγω της υψηλής NPV (95%), μπορούσε να οδηγήσει σε αποφυγή της βιοψίας σε 55 από τους 145 ασθενείς (38%). Τέλος μια ιαπωνική μελέτη από τους Fujii et al (302) έδινε μια ακρίβεια AUC: 0,73 με NPV: 77% για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης με cutoff BARD score >2 (Πίνακας 24). 71 Σ ελίδα

76 Συμπερασματικά οι διάφορες μελέτες δείχνουν ότι γενικά το BARD score είναι ένα εύκολα υπολογίσιμο βαθμολογικό μοντέλο και έτσι αντιπροσωπεύει ένα απλό εργαλείο για τον αποκλεισμό της προχωρημένης ίνωσης περίπου στο 38% των NAFLD ασθενών στους οποίους θα μπορούσε να αποφευχθεί η βιοψία ήπατος. ΠΙΝΑΚΑΣ 24 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ BARD SCOR ΜΕΛΕΤΕΣ Ν AUROC Cutoff PPV NPV Sense Spec Harrison et al (299) 827 <2 96% Raszeja- Wyszomirska et al (300) 104 0, ,5% 97% 86,7% 72,7% Ruffilo et al (301) McPherson et al (26) Fujii et al (302) Shah et al (228) 138 0, % 81% 51% 77% 145 0, % 95% 89% 44% 0,73 >2 77% 541 0,70 APRI score: AST to Platelet Ratio Index (11,26) APRI score: [AST/PLT (x10 9 /l)] x 100 To APRI score είναι ένας δείκτης της αναλογίας AST ορού/αριθμό αιμοπεταλίων ορού x 100, που έχει προταθεί ως ένας απλός αλγόριθμος πρόβλεψης προχωρημένης ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Ο δείκτης αυτός είχε αρχικά προταθεί ως δείκτης ίνωσης σε χρόνια C ηπατίτιδα (HCV) αλλά επικυρώθηκε σε μια ομάδα 111 ασθενών με NAFLD (303) από τους Kruger et al, που έδειξαν ότι το APRI score ήταν σημαντικά υψηλότερο σε NASH ασθενείς με προχωρημένη ίνωση. Η AUROC καμπύλη για το APRI έδινε ακρίβεια (AUC) 0,85 με ιδανικό cutoff το 0,98, οδηγώντας σε μια ευαισθησία (Sense: 75%) και ειδικότητα (Spec: 86%). H PPV ήταν μόνο 54% με μια NPV 93%. Βάση αυτής της μελέτης φάνηκε ότι το APRI score μπορεί να είναι χρήσιμο για την αναγνώριση ασθενών που είναι απίθανο να έχουν ίνωση (NPV: 93%), αλλά είναι λιγότερο χρήσιμο προς πρόβλεψη παρουσίας προχωρημένης ίνωσης (PPV: 54%). Η ίδια μελέτη έδειξε ότι το APRI score έχει παρόμοια αποτελέσματα με τον αλγόριθμο της αναλογίας AST/ALT (AAR), και είναι πιο ειδικό από το NAFLD fibrosis score (NFS) για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης (Πίνακες 25, 31). Στη μελέτη των McPherson et al (26) (Πίνακας 30) και (Εικόνα 13) βλέπουμε ότι το APRI score, όταν συγκρίνεται με κάποιους άλλους αλγόριθμους πρόβλεψης ίνωσης στη NAFLD, έχει τη μικρότερη ακρίβεια (AUC) 0,67, με ιδανικό cutoff το 1 οδηγώντας σε μια ευαισθησία (Sense: 27%) με ικανοποιητική όμως ειδικότητα (Spec: 89%), χαμηλή PPV: 37%, αλλά ικανοποιητική NPV: 84%. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης συμφωνούν με την προαναφερθείσα μελέτη των Kruger et al (303) στο ότι ο δείκτης APRI score μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο για τον κλινικό αποκλεισμό ασθενών από το να υποστούν βιοψία ήπατος, ενώ θα ήταν απίθανο να έχουν NAFLD προχωρημένη ίνωση (F3, F4) (Πίνακας 31). Σε μια μελέτη σε 235 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD από δύο διαφορετικά κέντρα, ο Cales et al (304) συνέκρινε κάποιους πιο ειδικούς αλγόριθμους πρόβλεψης ίνωσης σε NAFLD ασθενείς όπως τα Fibro Meter και το NAFLD Fibrosis score (NFs), που θα αναφερθούν αργότερα, με τον μη ειδικό αλγόριθμο ή λιγότερο ειδικό του APRI score (Πίνακας 32). Δημιουργήθηκαν 2 ομάδες μιας κατάρτισης 121 ατόμων και μια επικύρωσης 114 ατόμων. Η ακρίβεια (AUC) πρόβλεψης ύπαρξης ίνωσης σε NAFLD ασθενείς ήταν για το APRI score 0,866, πολύ μικρότερη από την AUC του Fibro Meter και ελαφρώς μικρότερη του NFS (Πίνακας 32, Πίνακας 25), καθώς επίσης και το συνολικό ποσοστό λανθασμένης 72 Σ ελίδα

77 πρόβλεψης με το APRI score (ψευδώς θετικά ή αρνητικά αποτελέσματα) ήταν 16%, σημαντικά μεγαλύτερο από τα ποσοστά λανθασμένης πρόβλεψης που λαμβάνετε από τη χρήση των άλλων αλγόριθμων. Σε αυτή τη μελέτη φάνηκε ότι το APRI score είναι μη ειδικό για την πρόβλεψη NAFLD - ίνωσης αλλά είχε υψηλή NPV 93% για τον αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης. Παρομοίως σημαντικά χαμηλές τιμές ακρίβειας (AUC) για την πρόβλεψη της NAFLDίνωσης με τη ROC ανάλυση (AUROCς καμπύλες) διαπιστώθηκαν για το APRI score και σε άλλες μελέτες. Συγκεκριμένα οι Loaeza-del-Castillo et al (305) σε μια ομάδα 30 ασθενών με επιβεβαιωμένη ιστολογικά NAFLD, ανέδειξαν μια AUC: 0,564 για την ακριβή πρόβλεψη αρχομένης ίνωσης (F1, F2), AUC:0,568 για προχωρημένη ίνωση (F3,F4), και AUC: 0,786 για πρόβλεψη κίρρωσης (F4) χρησιμοποιώντας το APRI score. Τιμές cutoff APRI score 0,3 και 0,5 απέκλειαν σημαντική ίνωση και κίρρωση αντιστοίχως, ενώ τιμή cutoff APRI score 1,5 ήταν ενδεικτική ύπαρξης σημαντικής ίνωσης. Γενικά οι τιμές cutoff APRI score, είχαν την τάση να αυξάνονται με το βαθμό της ίνωσης προτείνοντας ότι εντέλει το APRI score μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη του βαθμού ηπατικής ίνωσης σε NAFLD ασθενείς (Πίνακας 25). Ο Fujji et al (306) σε μια ομάδα 50 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH διαπίστωσε μια AUC 0,786 για την ακριβή πρόβλεψη κίρρωσης με το APRI score, ενώ για την πρόβλεψη κίρρωσης σε ασθενείς με HCV η ακρίβεια της μεθόδου έδινε AUC: 0,761. Λόγω της υψηλής αρνητικής προγνωστικής αξίας (NPV: 80%), σχεδόν σε όλες τις μελέτες, θεωρήθηκε ότι το APRI score μπορεί να είναι χρήσιμο για την αναγνώριση ασθενών που είναι απίθανο να έχουν προχωρημένη ίνωση αλλά λιγότερο χρήσιμο για την πρόβλεψη της παρουσίας προχωρημένης ίνωσης (PPV 45% κατά μέσο όρο σχεδόν σε όλες τις μελέτες). ΠΙΝΑΚΑΣ 25 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ) ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ APRI SCORE : AST to Platelet Ratio Index Score ΜΕΛΕΤΕΣ Ν AUROC Cut off PPV NPV Sense Spec Kruger et al (303) Mc Pherson et al (26) 111 0,85 0,98 75% 86% 54% 93% 145 0, % 89% 37% 84% Cales et al (304) 235 Loaeza-del Castillo et al (305) 30 0,866 (F2-F3) 0,861 (F3, F4) 0,842 (F4) 93% 0,564(F1-F2) <0, (F3,F4) <0, (F4) 1,5 Shah et al( 278) 541 0,73 (F3-F4) Fujji et al (306) 50 0,786 (F4) AST/ALT RATIO: AAR (AST/ALT Αναλογία) (11,26) AST/ALT Ratio 0,8 To AAR score υπολογίζεται χρησιμοποιώντας δυο ευρέως διαθέσιμες εργαστηριακές εξετάσεις της λειτουργικότητας του ήπατος (AST & ALT αμινοτρανσφεράσες). Μελέτες δείχνουν ότι υπάρχει προοδευτική αύξηση του λόγου AST/ALT ανάλογα με το βαθμό ίνωσης σε πολλές χρόνιες ηπατοπάθειες, καθώς και ότι λόγος AST /ALT 0,8 συσχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο ύπαρξης προχωρημένης ίνωσης σε NAFLD ασθενείς (4,10,11,15,26,307).Φυσιολογικά πριν την εμφάνιση ίνωσης σε κάποια χρόνια ηπατοπάθεια, η ALT είναι υψηλότερη από την AST. 73 Σ ελίδα

78 Επομένως ο λόγος AST/ALT είναι πολύ μικρότερος του 0,8. Όμως καθώς εξελίσσεται η ίνωση μειώνεται η κάθαρση της AST από τα κολποειδή κύτταρα του ήπατος και έτσι προοδευτικά ο λόγος AST/ALT αυξάνει (307). Έτσι μεταξύ των ασθενών που έχουν NAFLD χωρίς προχωρημένη ίνωση, η αναλογία AST/ALT είναι συνήθως πολύ < 1 αλλά καθώς εξελίσσεται η ίνωση η αναλογία AST/ ALT τείνει να αντιστραφεί ιδίως σε ανάπτυξη γεφυροποιού ίνωσης ή κίρρωσης. Ο Mc Pherson et al (26), στη μελέτη των 145 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD όπου συνέκρινε την αξιοπιστία διαφόρων αλγόριθμων πρόβλεψης NAFLD ίνωσης, ανέδειξε ακρίβεια του AAR score (AUC) 0,83 με Sense: 74%, Spec: 78%, NPV: 93% & PPV: 44% με cutoff 0,8 (Πίνακας 26) για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης. Η βιοψία ήπατος (λόγω της υψηλής NPV) θα μπορούσε να αποφευχθεί στο 69% των NAFLD ασθενών αυτής της μελέτης (100/145). Μάλιστα φάνηκε ότι όταν ο λογάριθμος είχε τιμή cutoff 1 η ειδικότητα της μεθόδου ήταν πολύ υψηλή (Spec: 90%) σε σχέση με τη χρήση άλλων αλγόριθμων πρόβλεψης NAFLD-ίνωσης που εκτιμήθηκαν στη μελέτη (Πίνακας 30), (Εικόνα 13). Η ομάδα κλινικής έρευνας για τη NASH (CRN-NASH: Clinical Research Network NASH) στις ΗΠΑ (308), πρόσφατα το 2010, ερεύνησε τη χρησιμότητα των άμεσα διαθέσιμων κλινικών & εργαστηριακών μεταβλητών για την πρόβλεψη της ιστολογικής σοβαρότητας της NASH σε περισσότερους από 600 ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη ύπαρξη NAFLD. Σε αυτή τη μελέτη ο συνδυασμός AST, ALT, AAR score, είχε μέτρια ακρίβεια για την πρόβλεψη στεάτωσης (AUC: 0,59)(πίνακας 4) αλλά ήταν σε θέση να προβλέψει την κίρρωση (AUC: 0,81) (Πίνακας 26). Ωστόσο η προσθήκη δημογραφικών δεδομένων όπως η ηλικία, το φύλο, συνοδά νοσήματα, καθώς και διαφόρων άλλων συνηθισμένων εργαστηριακών εξετάσεων αύξησαν την ακρίβεια (AUC) στο 0,79 για την πρόβλεψη NASH και στο 0,96 για πρόβλεψη κίρρωσης. Επομένως το AAR score, εκτός από ένας μεμονωμένος αλγόριθμος πρόβλεψης NAFLDίνωσης, μπορεί να αποτελέσει και μία μεταβλητή πολλών άλλων συστημάτων βαθμολόγησης ίνωσης συμπεριλαμβανόμενων και του BARD score, καθώς και του NAFLD Fibrosis score (NFS) που θα αναφερθεί κατόπιν. Αυτό επιβεβαιώνεται και από τη μελέτη των Angulo et al (202) πολύ πρώιμα το 1999, όπου εξετάζοντας 144 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD βρήκαν ότι ΑΑR score > 1 παρέμενε σημαντικά συνδεδεμένο με προχωρημένη ίνωση (AUROC καμπύλη ακρίβειας: 0,91-0,96) όταν προστίθεντο πολλοί άλλοι παράγοντες όπως το φύλο, η ηλικία κ.λπ. (Πίνακας 26). Στη μελέτη αυτή το 82% των NASH ασθενών, που είχαν AST/ALT score < 1, δεν είχαν ίνωση (NPV για ίνωση:82%) ενώ το 47% των ασθενών, που είχαν AST/ALT score > 1, είχαν προχωρημένη ίνωση (PPV για F3,F4:47%). Επομένως η αναλογία AST/ALT δύναται να χρησιμοποιηθεί σαν κλινικό συμπλήρωμα για την πρόβλεψη ή την εξαίρεση προχωρημένης ίνωσης σε NASH ασθενείς. Μάλιστα φάνηκε ότι σε ασθενείς με AAR score >1, όταν προστίθεντο άλλες μεταβλητές όπως παχυσαρκία, ΣΔ ΙΙ, ηλικία 45, η πρόβλεψη γεφυροποιού ίνωσης έφτανε στο 66% (PPV: 66%) (Πίνακας 26). Γενικά φαίνεται ότι χρησιμοποιώντας το λόγο AST/ALT αναλογίας (AAR score) όταν AAR score < 0,8, θα μπορούσαμε να αποκλείσουμε την προχωρημένη ίνωση και επομένως η βιοψία ήπατος θα μπορούσε να αποφευχθεί στο 69% των ασθενών και το 93% των ασθενών θα ταξινομούνταν σωστά (26). Το σημαντικότερο είναι ότι οι γενικοί γιατροί θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν την τιμή του λόγου AST/ALT > 0,8 σαν εργαλείο που θα καθορίζει ποια άτομα με NAFLD θα πρέπει να οδηγηθούν σε δευτεροβάθμια φροντίδα ειδικών ηπατολόγων προς αξιολόγηση. 74 Σ ελίδα

79 ΠΙΝΑΚΑΣ 26 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ) ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ AST/ALT Ratio (AAR score ) ΜΕΛΕΤΕΣ Ν AUROC Cutoff Sense Spec PPV NPV Μc Pherson et al (26) (AAR score) 145 0,83 0,8 1 74% 78% 90% 44% 93% CRN-NASH (308) (AST, ALT, AAR score) Angulo et al (202) (AAR score >1 + BMI > 30 kg/m 2 + ΣΔ ΙΙ + Ηλικία 45 έτη) Shah et al (278) 600 0,81 (F4) ,91-0,96 (F3-F4) 541 0,742 >1 <1 AAR score >1 47% 66% 82% CRN-NASH: Clinical Research Network NASH ΣΔ ΙΙ:Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 ΒΜΙ:Body Mass Index ALT:Alanine transaminase AST:aspartate aminotransferase AUROC: area under the receiver operating characteristic curve PPV: positive predictive value (θετική προγνωστική αξία) NPV: negative predictive value (αρνητική προγνωστική αξία) SENSE :Sensitivity (%) (Ευαισθησία) SPEC : Specificity (%) (Ειδικότητα) Cutoff : όριο τιμής FIB-4 score To FIB-4 score συνδυάζει ηλικία με 3 τυπικές βιοχημικές παραμέτρους: PLT (αιμοπετάλια), AST και ALT AST (IU/l) FiB-4 score: Ηλικία (έτη) x x ALT (IU/l) (11,26) PLT (x10 9 /lt) O Mc Pherson et al (26) στη μελέτη των 145 NAFLD ασθενών που συνέκρινε την αξιοπιστία διαφόρων αλγόριθμων πρόβλεψης ηπατικής ίνωσης σε NAFLD ασθενείς, διαπίστωσε ότι η ακρίβεια (AUC) του FIB-4 score για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης έδινε τιμή 0,86 με ένα cutoff του 1,3 με Sense: 85%, Spec: 65%, PPV: 36% και NPV: 95%, δηλαδή παρόμοια αποτελέσματα με το AAR score (Πίνακας 30), (Εικόνα 13). Όταν το cut off ανέβαινε στο 3,25 τότε η ειδικότητα και η PPV της μεθόδου, για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης, αυξανόταν στις τιμές Spec: 98% & PPV: 75% (Πίνακες 30,27). Έτσι η βιοψία ήπατος θα μπορούσε να αποφευχθεί ενδεχομένως στο 62% των NAFLD ασθενών με F3 και F4 ίνωση (90 στους 145) με τιμή cut off 1,30. To FIB-4 score αναπτύχθηκε αρχικά για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης σε ασθενείς με HIV και HCV συνλοίμωξη (11). Όμως οι Shah et al το επικύρωσαν το 2009 σε μια βάση δεδομένων 541 ασθενών με NAFLD (278), συγκρίνοντας την αξιοπιστία του FIB-4 score με άλλους αλγορίθμους πρόβλεψης της ηπατικής ίνωσης στη NAFLD. Μια τιμή cut off 1,1 για αποκλεισμό F3, F4 έδινε ακρίβεια (AUC) 0,802 για τη μέθοδο, με Sense: 74%, Spec: 71%, PPV: 43% & NPV: 90% και συνολικά δεν είχαν προχωρημένη ίνωση οι 294 ασθενείς. Χρησιμοποιώντας ένα cut off 2,67 για την παρουσία προχωρημένης ίνωσης (F3, F4), είχαμε Sense: 33%, Spec: 98%, PPV: 80%, NPV: 87% και δεν είχαν προχωρημένη ίνωση οι 10 ασθενείς (Πίνακας 27). Συνολικά φάνηκε ότι χρησιμοποιώντας το ανώτερο και κατώτερο όριο cutoff δεν είχαν προχωρημένη ίνωση και επομένως μπορούσαν να αποφύγουν τη βιοψία 75 Σ ελίδα

80 ήπατος οι 416 από τους 541 ασθενείς. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει ότι το FIB-4 score μπορεί να είναι χρήσιμο σε ασθενείς χωρίς προχωρημένη ίνωση. Μάλιστα φάνηκε ότι τιμή AUC 0,802 υπερείχε των τιμών ακρίβειας (AUC) όσον αφορά την ορθότητα του NFS: 0,768, του AAR score:0,742, του APRI: 0,730, της αναλογίας AST/PLT: 0,70 και του BARD score: 0,70. Το FIB-4 score επικυρώθηκε επίσης σε μια ομάδα 576 Ιαπώνων με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD από τους Sumida et al to 2012 (308). Στην ιαπωνική μελέτη το κατώτερο όριο cutoff που χρησιμοποιήθηκε ήταν < 1,45. Με αυτό το όριο τιμής cutoff, η ακρίβεια της μεθόδου για τον αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης έδινε Sense: 90%, Spec: 64%, PPV: 24%, NPV: 98% με AUC 0,871. Με τιμή cut off > 3,25 η μέθοδος είχε Sense: 48%, Spec: 95%, PPV: 53% & NPV: 94% για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης (Πίνακας 27).Χρησιμοποιώντας αυτά τα όρια cutoff το 91% των 395 Ιαπώνων ασθενών με FIB-4 score σε τιμές έξω από τα όρια 1,45-3,25, θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σωστά και επομένως με την εφαρμογή του FIB-4 score στον Ιαπωνικό πληθυσμό, θα μπορούσε να αποφευχθεί η βιοψία ήπατος στο 58% των NAFLD ασθενών. Στη μελέτη αυτή επικύρωσης ποικίλων αλγόριθμων πρόβλεψης NAFLD με F3, F4 ίνωση, η ακρίβεια (AUC) των αλγορίθμων εκφραζόμενη με ROC καμπύλες (AUROCs), ήταν πολύ μεγαλύτερη για το FIB-4 score: 0,871 ακολουθούμενη από NFS: 0,863, APRI: 0,823, AAR: 0,788, BARD score: 0,765. Καθώς η NPV, για όλους αυτούς τους αλγορίθμους, ήταν > 95% θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν τα χαμηλά cut offs προς αποκλεισμό κλινικά της προχωρημένης ίνωσης και επομένως να αποφευχθεί η βιοψία σε ένα μεγάλο αριθμό ασθενών (Πίνακας 33). ΠΙΝΑΚΑΣ 27 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ) ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ FIB-4 SCORE ΜΕΛΕΤΕΣ Ν AUROC Cut off Sense Spec PPV NPV Mc Pherson et al (26) Shah et al (278) ,86 1,3 85% 65% 36% 95% 3,25 26% 98% 75% 85% 0,802 1,11 74% 71% 43% 90% F3-F4 2,67 33% 98% 80% 87% Sumida et al (308) 576 0,871 <1,45 90% 64% 24% 98% >3,25 48% 95% 53% 94% Fibro - Meter (4) To Fibro Meter είναι ένας πίνακας που συνδυάζει ορολογικούς δείκτες και αναπτύχθηκε για την μη επεμβατική σταδιοποίηση της ίνωσης σε HCV ασθενείς (359). Ωστόσο το Fibro Meter έχει δείξει έκτοτε μία καλή ακρίβεια της σταδιοποίησης της ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Αυτός ο αλγόριθμος συνδυάζει 7 μεταβλητές: Ηλικία (έτη), Βάρος (Kg), Γλυκόζη νηστείας (mmol/l), AST (U/l), ALT (U/l), Φερριτίνη ορού ng/ml, αριθμός PLT (x10 9 /l). Σε μία μελέτη 235 ασθενών με NAFLD από τους Cales et al (304), φάνηκε ότι το Fibro Meter έδινε ακρίβεια (AUC) από 0,943 για τη σημαντική ίνωση (F2-F3, F4), 0,937 για τη σοβαρή ίνωση (F3, F4) και 0,904 για την κίρρωση (F4). Χρησιμοποιώντας την ουδό του 90% για προγνωστική αξία, η ηπατική βιοψία θα είχε αποφευχθεί στους περισσότερους ασθενείς (NPV: 97,4%) για το Fibro Meter, έναντι NPV: 86,8% για το NFS και NPV: 80% για το APRI score. Η AUC για ίνωση F2 ήταν 0,943, ενώ του NFS ήταν 0,884 & του APRI: 0,866 στο συνολικό πληθυσμό (Πίνακας 32). Μια νέα ταξινόμηση που παρέχει τρία αξιόπιστα ιστολογικά διαγνωστικά διαστήματα: F0/1, F0/1/2, F2/3/4 δίνει μια AUC 91,4% ακριβείας για το Fibro Meter αποφεύγοντας τη βιοψία ήπατος σε όλους τους ασθενείς. Η ευαισθησία, η ειδικότητα, η PPV και η NPV του Fibro Meter για τη διάγνωση σημαντικής ίνωσης (F2, F3, F4) ήταν: 78,5%, 95,1%, 87,9% και 92,1% αντιστοίχως (Πίνακας 28). 76 Σ ελίδα

81 ΠΙΝΑΚΑΣ 28 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ) ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ ( F2) FIBRO-METER ΜΕΛΕTH Ν AUROC Cut off Sense Spec PPV NPV Calles et al (304) 235 0,943 (F2, F3,F4) 0,611 92,1% 0,715 78,7% 95,9% 87,9% NAFLD Fibrosis score: NFS (NAFLD ίνωσης score) To NFS είναι ένας βαθμολογικός πίνακας (αλγόριθμος) 6 μεταβλητών που θεωρούνται σημαντικές για την ανάπτυξη ηπατικής ίνωσης. Εξίσωση NAFLD score : -1, ,037 x ηλικία (έτη) + 0,094 x BMI (Kg/m 2 ) + 1,13 x (υπεργλυκαιμία νηστείας: ναι = 1, όχι = 0) + 0,99 x AST/ALT - 0,013 x PLT (x10 9 /l) 0,66 x λευκωματίνη ορού (g/dl). To NFS καταρτίστηκε χρησιμοποιώντας τα δεδομένα από 733 ασθενείς με αποδεδειγμένη ιστολογικά NAFLD από πολλά ερευνητικά κέντρα όλου του κόσμου (309). Οι Angulo et al κατάρτισαν και επικύρωσαν το NFS με σκοπό να δημιουργηθεί (με τον συνδυασμό απλών εργαστηριακών και κλινικών παραμέτρων) ένα απλό βαθμολογικό σύστημα που αξιόπιστα θα μπορούσε να διακρίνει τους ασθενείς με NAFLD με ή χωρίς προχωρημένη (F3, F4) ίνωση. Η ομάδα κατάρτισης απαρτιζόταν από n=480 ασθενείς και η ομάδα επικύρωσης από n=253 ασθενείς. H AUROC καμπύλη ακρίβειας για την πρόβλεψη ίνωσης έδινε τιμή 0,88 για την ομάδα κατάρτισης και 0,82 για την ομάδα επικύρωσης εφαρμόζοντας μια χαμηλή τιμή cutoff :1,455 & προχωρημένη ίνωση μπορούσε να αποκλεισθεί με υψηλή ακρίβεια (NPV) 93% και 88% στην ομάδα κατάρτισης και επικύρωσης αντιστοίχως. Εφαρμόζοντας μια υψηλή τιμή cutoff 0,676 η παρουσία προχωρημένης ίνωσης μπορούσε να διαγνωσθεί με υψηλή ακρίβεια (PPV) 90% και 82% στην ομάδα κατάρτισης και επικύρωσης αντιστοίχως. Εφαρμόζοντας αυτό το μοντέλο, μια βιοψία ήπατος θα μπορούσε να αποφευχθεί αξιόπιστα σε 549 (75%) από τους 733 ασθενείς της μελέτης. Έτσι θα είχε πραγματοποιηθεί βιοψία μόνο στο 25% των 733 NAFLD ασθενών που έπεφταν μέσα στο απροσδιόριστο εύρος της καμπύλης (Πίνακας 29). Από τότε αρκετές μελέτες σε ανεξάρτητους πληθυσμούς-έχουν αναπαραγάγει την υψηλή ακρίβεια του NFS προς διάκριση ασθενών με ή χωρίς προχωρημένη ίνωση. Συγκεκριμένα μια πρόσφατη μελέτη από τους Mc Pherson et al (26) σύγκρινε την ακρίβεια απλών βαθμολογικών συστημάτων NAFLD-ίνωσης, σε 145 ασθενείς με επιβεβαιωμένη ιστολογικά NAFLD. Η ακρίβεια (AUC) του NFS έδινε τιμή 0,81. Με κατώτερη τιμή cutoff 1,455 η προχωρημένη ίνωση μπορούσε να αποκλεισθεί με ακρίβεια (NPV) 92%, ενώ με ανώτερη τιμή cutoff 0,676 η παρουσία F3, F4 σταδίου ίνωσης μπορούσε να διαγνωσθεί με ακρίβεια (PPV) 79%. Η ηπατική βιοψία θα μπορούσε να αποφευχθεί στο 52% των ασθενών ή αλλιώς στους 75 από τους 145 ασθενείς με τιμή cutoff -1,455 (Πίνακες 29,30),(Εικόνα 13). O Cales et al (304) στη μελέτη σύγκρισης διαφόρων αιματολογικών βαθμολογικών πινάκων πρόβλεψης ηπατικής ίνωσης σε 235 NAFLD ασθενείς, έδειξε μια ακρίβεια (AUC) 0,884 για το NFS όσον αφορά την πρόβλεψη σημαντικής ίνωσης (F2, F3), 0,932 για σοβαρή ίνωση (F3, F4) και 0,902 για πρόβλεψη κίρρωσης (Πίνακας 29). Χρησιμοποιώντας μια ιδανική ουδό προγνωστικής αξίας 90%, η ηπατική βιοψία θα μπορούσε να αποφευχθεί στους περισσότερους ασθενείς (86,8%) (Πίνακας 32). Μια μελέτη σε ασιατικό πληθυσμό από τους Fujji et al (302) κατέδειξε επίσης υψηλή ακρίβεια για τον αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης με NPVs 89% και 91% σε ιαπωνικές και κινέζικες ομάδες ασθενών αντιστοίχως με επιβεβαιωμένη NAFLD (Πίνακας 29). Μια άλλη μελέτη από τους Qureshi et al (310) διερεύνησε τη χρησιμότητας και αξιοπιστία του NFS σε 401 παχύσαρκους (ΒΜΙ > 35 Kg/m 2 ) ασθενείς, που υπέστησαν βαριατρικό χειρουργείο για νοσογόνο παχυσαρκία και είχαν ιστολογικές αποδείξεις NAFLD. Η χαμηλότερη τιμή cutoff μπορούσε να αποκλείσει την προχωρημένη ίνωση (F3, F4) με υψηλή ακρίβεια (NPV>98%). Στην ίδια μελέτη η NPV για τον αποκλεισμό σημαντικής ίνωσης (F2, F3, F4) και οποιαδήποτε ίνωσης (F0-4) ήταν 87% και 88% αντίστοιχα με εξίσου χαμηλή τιμή cutoff (Πίνακας 77 Σ ελίδα

82 29). Μια υψηλή τιμή cutoff είχε PPV 88% για την παρουσία F3, F4 ίνωσης και PPV 98%για F0- F4 ίνωση. O Wong et al (311) στοχεύοντας στην επικύρωση του NFS σε Κινέζους, εξέτασε 162 ασθενείς με NAFLD επιβεβαιωμένη ιστολογικά. Με μια χαμηλή τιμή cutoff < -1,455 μπορούσε να αποκλειστεί η προχωρημένη ίνωση με ακρίβεια (NPV) 91%. Μόνο 11 ασθενείς χρειάζονταν βιοψία ήπατος. Αν το NFS υλοποιηθεί στον κινέζικο πληθυσμό, η βιοψία ήπατος σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτής της μελέτη, θα μπορούσε να αποφευχθεί στο 79% των ασθενών. Επειδή στο σύνολο των ασθενών υπήρχαν λίγες περιπτώσεις προχωρημένης ίνωσης (11/162), η μελέτη αυτή έχει περιορισμένη ισχύ για την επικύρωση ενός υψηλού cutoff (Πίνακας 29). Ο Kruger et al (303) σε μια μελέτη 111 ασθενών με ιστολογικές αποδείξεις NAFLD, συγκρίνοντας το APRI score με άλλα βαθμολογικά μοντέλα πρόβλεψης NAFLD ίνωσης, έδειξε ότι το NFS με κατώτερη τιμή cutoff:1-3 έδινε μια AUC: 0,77 προς αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης, με Sense: 76% και Spec: 69%, PPV: 34% & NPV: 94%. (Πίνακας 29). Τέλος οι Musso et al (272), κάνοντας μία μετα-ανάλυση σε 32 άρθρα της Παγκόσμιας Ιατρικής Βιβλιογραφίας (MEDLINE, Cochrane Library, EMBASE, PubMed) abstracts διεθνή που είχαν δημοσιευθεί ως τον Ιούλιο του 2010 και αφορούσαν τη διαγνωστική ακρίβεια μη επεμβατικών εξετάσεων σε σχέση με την ηπατική βιοψία, διαπίστωσαν ότι οι συγκεντρωμένες AUROCs καμπύλες ακρίβειας, η ευαισθησία και ειδικότητα για το NFS έδιναν τιμές : 0,85 (0,80-0,93), 90% (82-99%), 97% (94-99%) (Πίνακας 29). 78 Σ ελίδα

83 ΠΙΝΑΚΑΣ 29 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ (ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ) ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ NAFLD Fibrosis score: NFS ΜΕΛΕΤH Ν AUROC Cutoff Sense Spec PPV NPV Angulo et al (309) Μc Pherson et al (26) 145 0,88 0,82 (F3, F4) 0,81 (F3, F4) -1,455 0,676-1,455 0,676 78% 33% 58% 98% 56% 90% 82% 30% 79% 93% 88% 85% 92% 86% Cales et al (304) 235 Fujji et al (302) 0,884 (F2, F3,F4) 0,932 (F3, F4) 0,902 (F4) 90% Ιάπωνες Κινέζοι Qureshi et al (310) % 91% Χαμηλό Cutoff 98%(F3- F4) 87%(F2-F4) 88%(F0-F4) Υψηλό Cutoff 88% (F0-F4) Wong et al (311) Kruger et al (303) Shah et al (278) Musso et al (272) 162-1,455 91% 111 0,77-1,3 76% 69% 34% 94% 541 0, Άρθρα (μετά-αναλύσεις) 0,85 90% 97% 79 Σ ελίδα

84 Εικόνα 13 (Μελέτη McPherson et al, Gut 2010; 59: )(26) ΠΙΝΑΚΑΣ 30 ΜΕΛΕΤΗ Mc Pherson (26) n = 145 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ (F3, F4) ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ AUROC (95% CI) Cutoff Sense Spec PPV NPV AST/ALT ratio 0,83 0,8 74% 78% 44% 93% (AAR) (0,74-0,91) 1 52% 90% 55% 89% APRI score 0, % 89% 37% 84% (0,54-0,8) BARD score 0, % 44% 27% 95% (0,68-0,87) FIB-4 score 0,86 (0,78-0,94) ,25 85% 26% 65% 98% 36% 75% 95% 85% 0,81-1,455 78% 58% 30% 92% ΝAFLD Fibrosis score (NFS) (0,71-0,91) 0,676 33% 98% 79% 66% ALT: alanine aminotransferase APRI: AST-to-Platelet ratio Index AST: aspartate aminotransferase AUROC: area under the receiver operating characteristic curve PPV: positive predictive value NPV: negative predictive value Sense: Sensitivity Spec: Specificity CI:confidence interval Στη Μελέτη McPherson et al φαίνεται ότι από τους ποικίλους αλγορίθμους πρόβλεψης της ίνωσης, το FIB-4 score και το NFS έχουν επικυρωθεί πιο ευρέως γιατί υπερέχουν στη μη επεμβατική πρόβλεψη NAFLD. 80 Σ ελίδα

85 ΠΙΝΑΚΑΣ 31 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ Μελέτη Kruger(303) n=111 ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ AUROC Cutoff Sense Spec PPV NPV (95% CI) APRI score 0,85 0,98 75% 86% 54% 93% NAFLD Fibrosis score (NFS) CI:confidence interval 0,77-1,3 76% 69% 34% 94% ΠΙΝΑΚΑΣ 32 ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ NAFLD - ΙΝΩΣΗΣ F2, F3, F4 Μελέτη Cales et al (304) n=235 ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ AUROC NPV Λανθασμένη ταξινόμηση Ασυμφωνία Κέντρων Fibro Meter 0,943 97,4% 9% 7% NFS 0,884 86,8% 14% 9% APRI 0,866 80% 16% 11% Η ακρίβεια της απόδοσης του Fibro Meter είναι υψηλή και η αξιοπιστία του ως προς τη διάγνωση σημαντικής ίνωσης (F2, F3, F4) ξεπερνά κατά πολύ αυτή του NFS και APRI score. ΠΙΝΑΚΑΣ 33 ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΤΩΝ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ F3-F4 ΙΝΩΣΗΣ ΣΕ NAFLD ΑΣΘΕΝΕΙΣ. ΜΕΛΕΤΗ Sumida (308) ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΙΝΩΣΗΣ AUROC Cutoff Sense % Spec % PPV % NPV % AAR score 0,788 0, APRI score 0, Age-PLT Index (AP Index) 0, NAFLD Fibrosis score 0,863-1, BARD score 0, FIB-4 score 0,871 1, Σ ελίδα

86 ΠΙΝΑΚΑΣ 34 Αναλογία ασθενών που θα μπορούσαν να αποφύγουν τη βιοψία χρησιμοποιώντας μη επεμβατικό αλγόριθμο ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ Μελέτη Mc Pherson et al (26) Aσθενείς που cutoff αποφεύγουν βιοψία ήπατος* Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα AST/ALT ratio (AAR) score < 0,8 100/145 (69%) 7 (7%) BARD score < 2 55/145 (38%) 3 (5%) FIB-4 score < /145 (62%) 4 (5%) NAFLD Fibrosis score (NFS) < -1,455 75/145 (52%) 6 (8%) * Ασθενείς με μία τιμή score < του οριζόμενου cutoff FIBRO TEST (Bio predictive Paris France) To Fibro test είναι το πρώτο που δημιουργήθηκε από τη γαλλική ερευνητική ομάδα των Poynard et al (16) στην προσπάθειά τους να αναπτύξουν μη επεμβατικούς βαθμολογικούς πίνακες πρόβλεψης του σταδίου ίνωσης στις χρόνιες ηπατοπάθειες. Κατόπιν αναπτύξανε το Steato Test προς αναγνώριση του ποσοστού της ηπατικής στεάτωσης και τέλος το NASH Test προς αναγνώριση του βαθμού φλεγμονής και νέκρωσης των ηπατοκυττάρων. Έτσι ολοκληρώσανε ένα μη επεμβατικό δείκτη (Fibro Max) προς σφαιρική μη επεμβατική εκτίμηση της ιστολογικής κατάστασης του ήπατος ασθενών με NAFLD (228). Οι βιοδείκτες που συνδυάζονται στο Fibro Test είναι: Ηλικία Φύλο Α 2 μακροσφαιρίνη (A 2 M) (g/l) Απτοσφαιρίνη (g/l) Απολιποπρωτεΐνη Α 1 (Apo A1) (g/l) Ολική χολερυθρίνη (μmol/l) γgt(iu/l) To Fibro test συνδυάζει 5 μεταβλητές προσαρμοσμένες στην ηλικία και το φύλο. Κατόπιν προσθέτοντας και άλλες 5 μεταβλητές (σύνολο 10 βιοχημικές απλές εξετάσεις) προσαρμοσμένες για την ηλικία, το φύλο και το ΒΜΙ δημιούργησαν τον αλγόριθμο του Steato test και του NASH test (Fibro Max) (Πίνακας 2 Steato test). ΠΙΝΑΚΑΣ 35 ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ FIBRO TEST (0-1) ΓΙΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΙΝΩΣΗΣ (METAVIR ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΚΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ) (16) Fibro Test (0-1) ΣΤΑΔΙΟ ΙΝΩΣΗΣ 0,75-1,00 F4 0,73-0,74 F3 - F4 0,59-0,72 F3 0,49-0,58 F2 0,32-0,48 F1 - F2 0,28-0,31 F1 0,22-0,27 F0 - F1 0,00-0,21 F0 82 Σ ελίδα

87 To Fibro test είναι ένας βιοδείκτης ποσοτικής εκτίμησης της ηπατικής ίνωσης που αρχικά επικυρώθηκε σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C (HCV) και στη συνέχεια σε άλλες 3 χρόνιες ινωτικές ασθένειες το ήπατος: HBV, ALD (Alcoholic Liver Disease) και τέλος στη NAFLD. O πληθυσμός που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία και επικύρωση του Fibro test ήταν ο ίδιος που αργότερα χρησιμοποιήθηκε για τα Steato test και NASH test. 170 ασθενείς με υποψία NAFLD αποτέλεσαν την ομάδα κατάρτισης και 97 ασθενείς, μιας πολυκεντρικής μελέτης, την ομάδα επικύρωσης. Η ίνωση εκτιμήθηκε ιστολογικά σύμφωνα με το βαθμολογικό σύστημα του Kleiner(220). F0=καμία ίνωση, F1=περικολποειδική ή περιπυλαία με 3 διαφορετικές υποομάδες 1Α: ήπια, ζώνη 3 περικολποειδική, 1Β: μέτρια, ζώνη 3 περικολποειδική, 1C: πυλαία περιπυλαία ίνωση. F2=περικολποειδική και περιπυλαία/πυλαία, F3=γεφυροποιός, F4= κίρρωση. Η περιοχή κάτω από τις καμπύλες ROC (AUROC), η ευαισθησία (Sense), η ειδικότητα (Spec) η θετική και αρνητική προγνωστική αξία (PPV και NPV) αξιολογήθηκαν (Πίνακες 36, 37,38). Ως ομάδα ελέγχου περιλήφθησαν 954 αιμοδότες. ΠΙΝΑΚΑΣ 36 FIBRO TEST (FT) (16) ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΣΤΑΔΙΟΥ ΙΝΩΣΗΣ ΣΤΙΣ 2 ΟΜΑΔΕΣ ΟΜΑΔΑ ΚΑΤΑΡΤΙΣΗΣ Ν = 170 ΟΜΑΔΑ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗΣ Ν = 97 Cutoff Fibro Test Sense Spec PPV NPV Sense Spec PPV NPV Stage F2, F3, F4 Επικράτηση 24% (40/170) Επικράτηση 32% (31/97) 0,30 83% 78% 53% 94% 71% 74% 56% 84% (33/40) (101/130) (33/62) (101/108) (22/31) (49/66) (22/39) (49/58) 0,70 18% 98% 78% 80% 13% 98% 80% 71% (7/40) (128/130) (7/9) (128/161) (4/31) (65/66) (4/5) (65/92) Stage F3, F4 Eπικράτηση = 0,12 (20/170) Επικράτηση = 0,16 (16/97) 0,30 95% 71% 31% 99% 88% 69% 36% 97% (9/20) (107/150) (19/62) (107/108) (14/16) (56/81) (14/39) (56/58) 0,70 25% 97% 56% 91% 25% 99% 80% 87% (5/20) (146/150) (5/9) (146/161) (4/16) (80/81) (4/5) (80/92) % Ασθενείς με FT ανάμεσα στο 0,30-0,70: % ασθενείς ανάμεσα στο 0,30-0,70: 32% (54/170) 35% (34/97) ΠΙΝΑΚΑΣ 37 FIBRO TEST (FT) (16) ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΣΤΑΔΙΟΥ ΙΝΩΣΗΣ ΣΕ ΟΛΟΥΣ (Ν = 267) Cutoff Fibro Test AUROC Sense Spec PPV NPV Stage F2, F3, F4 0,81 Επικράτηση 27% 0,30 77%(55/71) 77%(150/196) 54%(55/101) 90% (150/166) 0,70 15%(11/71) 98%(192/196) 73%(11/15) 76%(192/252) Stage F3, F4 0,88 Επικράτηση 13% 0,30 92%(33/36) 71% (163/231) 33% (33/101) 98% (163/162) 0,70 25% (9/36) 97% (225/252) 60% (9/15) 89% (225/252) % Ασθενείς με FT ανάμεσα στο 0,30-0,70: 33% (88/267) 83 Σ ελίδα

88 ΠΙΝΑΚΑΣ 38 Εκτίμηση της αξιοπιστίας του Fibro Test με AUROC καμπύλες Ν AUROC για F2, F3, F4 AUROC για F3, F ,86 0,92 (95% CI: 0,77-0,91) (95% CI: 0,83-0,96) 97 0,75 0,81 (95% CI: 0,61-0,83) (95% CI: 0,64-0,91) 267 0,81 0,88 Στους παραπάνω πίνακες φαίνεται αρχικά ότι η ακρίβεια (AUC) του FT, για τη διάκριση προχωρημένης (F2, F3, F4) ίνωσης σε NAFLD ασθενείς, είναι 0,86 στην ομάδα κατάρτισης (Ν = 170) με NPV: 94% και sense: 80% όταν το cutoff του FT είναι στην κατώτερη τιμή 0,30 (Πίνακες 36, 38). Παρομοίως στην ομάδα κατάρτισης τιμή Cut off > 0,70 δίνει AUC: 0,86 για προχωρημένη ίνωση (F2, F3, F4) με PPV: 78% και Spec: 98%. (Πίνακες: 36,38). Μία τιμή cutoff FT < 0,30 δίνει NPV: 99%, με Sense 95% για αποκλεισμό F3, F4 σοβαρής ίνωσης ενώ μιά τιμή cut off FT> 0,70 δίνει PPV: 56% με Spec: 97% για παρουσία F3, F4 ίνωσης με AUC:0,92 (Πίνακες 36,38). Η χαμηλή τιμή ακριβούς πρόβλεψης F3, F4 ίνωσης με το FT (χαμηλή PPV) μπορεί να οφείλεται στο μικρό αριθμό ασθενών που είχαν ιστολογικά F3, F4 ίνωση σε αυτήν την ομάδα (Ν = 170). Στην ομάδα επικύρωσης (Ν = 97) μια τιμή cut off FT < 0,30 απέκλειε την παρουσία προχωρημένης ίνωσης με ακρίβεια 84% (NPV) και Sense: 71% ενώ μια τιμή cut off > 0,70 έδινε ακρίβεια πρόβλεψης της προχωρημένης ίνωσης (F2, F3, F4) 80% (PPV) και Spec: 98%. Η AUROC καμπύλη έδινε ακρίβεια της μεθόδου: 0,75. Στην ίδια ομάδα (Ν = 97) μια τιμή cut off < 0,30 απέκλειε με ακρίβεια την ύπαρξη σοβαρής ίνωσης (F3, F4) στο 97% των ασθενών (NPV) με Sense: 88% ενώ μια τιμή cut off FT > 0,70 προέβλεπε με ακρίβεια την παρουσία F3, F4 ίνωσης σε ποσοστό 80% (PPV) με Spec: 99% και AUC: 0,81. (Πίνακες 36, 38).Όταν όλοι οι ασθενείς συμπεριλήφθησαν σε μια ομάδα (Ν = 267) μια τιμή cut off 0,30, για αποκλεισμό F2, F3, F4 ίνωσης είχε ακρίβεια 90% (NPV) με Sence: 77% ενώ μια τιμή cut off 0,70 είχε ακρίβεια πρόβλεψης F2, F3, F4 ίνωσης 73% (PPV) με Spec: 98%. Προς αποκλεισμό σοβαρής ίνωσης (F3, F4) μια τιμή cut off 0,30 είχε ακρίβεια 98% (NPV) με Sense: 92%. Προς επιβεβαίωση ύπαρξης F3, F4 ίνωσης μια τιμή cut off 0,70 είχε ακρίβεια 60% (PPV) με Spec: 97% και η AUROC καμπύλη έδινε ακρίβεια της μεθόδου 0,75 (Πίνακες 37, 38). Γενικά στη μελέτη δημιουργίας & επικύρωσης του FT από τους Poynard et al (16), παρατηρήθηκε ασυμφωνία ευρημάτων όσον αφορά την μη επεμβατική σταδιοποίηση της ίνωσης σε ποσοστό 5%, λόγω FT αποτυχίας, έναντι 4% ασυμφωνίας ευρημάτων που οφείλονται σε αποτυχία της βιοψίας. Όταν εξετάζονται διάφοροι δείκτες ορού για ηπατική ίνωση, είναι κατανοητό ότι η διαγνωστική αποδοχή τους που συνδέεται με τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις στατιστικές αναλύσεις AUROCs (που σημαίνει ότι η περιοχή κάτω από την καμπύλη πετυχαίνει με ακρίβεια το βαθμό ίνωσης), απέχει πολύ από το να είναι η μόνη πτυχή που πρέπει να εξετασθεί (312). Για την επιτυχία μίας μεθόδου εξίσου σημαντικό είναι η περιγραφή των αναλυτικών όρων για μετρήσεις ορού, συμπεριλαμβανόμενων ασθενών εντός ή εκτός δείγματος μεταβλητότητας, η περιγραφή των προφυλάξεων κατά τη χρήση και η αναγνώριση των περιπτώσεων με αντικρουόμενα αποτελέσματα ανάμεσα σε ορολογικούς δείκτες και ηπατικές βιοψίες, καθώς επίσης και η αναγνώριση των παραγόντων κινδύνου γι αυτές τις ασυμφωνίες ( ). Στη μελέτη των 267 ασθενών, ένα cut off < 0,30 είχε μια υψηλή ακρίβεια για τον αποκλεισμό F3 (γεφυροποιού ίνωσης) ή F4 (κίρρωσης) (NPV: 98%), ενώ ένα cut off > 0,70 είχε υψηλή ακρίβεια για την παρουσία F3, F4 ίνωσης (PPV: 60%). Ωστόσο ένα 33% των ασθενών είχαν FT score 0,3-0,7 υποδεικνύοντας ότι το FT δεν μπορεί να προβλέψει τη σοβαρότητα της ηπατικής ίνωσης στους 88/267 ασθενείς (33%)(16). Οι πιο συχνές αιτίες της FT ανεπάρκειας περιλαμβάνουν το σ. Gilberte, χολόσταση και οξεία φλεγμονή που καταλήγουν σε αύξηση της χολερυθρίνης και απτοσφαιρίνης ορού αντίστοιχα. Μια άλλη αιτία FT ανεπάρκειας σε NAFLD ασθενείς, που δεν είχε αναγνωρισθεί παλαιότερα σε άλλους πληθυσμούς, αποτελεί μια ανώμαλη συγκέντρωση της Apo A1 που μπορεί να συσχετίζεται με ανωμαλίες λιπιδίων που παρατηρήθηκαν σε αυτούς τους ασθενείς (228) (Συσχέτιση Apo A1 με HDL ορού). H Apo A1 μπορεί να αυξάνει σε άτομα με υψηλή HDL (high-density lipoprotein) ορού και έτσι να δίνει ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα στο FT score. Αν και τα αντικρουόμενα αποτελέσματα σε ένα ή περισσότερα στάδια ηπατικής ίνωσης, μεταξύ βιοψίας και FT, κυμαίνονται στο 41% εν τούτοις η αξιοπιστία του είναι υπολογίσιμη. Μάλιστα επειδή στο FT χρησιμοποιούνται ορολογικοί δείκτες υπάρχει το πλεονέκτημα να αντιπροσωπεύει μια πιο σφαιρική εκτίμηση της ηπατικής ίνωσης που αφορά όλο το ηπατικό παρέγχυμα, ενώ λόγω της ακανόνιστης κατανομής της ηπατικής 84 Σ ελίδα

89 ίνωσης στη NAFLD (περικολποειδική μέσα στο ηπατικό παρέγχυμα) τα αποτελέσματα μιας ηπατικής βιοψίας μπορεί να μην είναι ενδεικτικά της ιστολογικής ηπατικής κατάστασης σε NAFLD ασθενείς. Σε μια περίπτωση εκτιμήθηκαν τα ελαττώματα κάθε βιοψίας 20 mm. Ένας ασθενής είχε σοβαρή ίνωση (F3) στην 1 η βιοψία, F0 στη 2 η βιοψία και μέσου βαθμού ίνωση (F1- F2) χρησιμοποιώντας το FT (16). Αντιθέτως προς τα ιστολογικά βαθμολογικά συστήματα που είναι ημιποσοτικά, ένας ορολογικός βιοχημικός δείκτης εξασφαλίζει μία συνεχή ποσοτική εκτίμηση της ηπατικής ίνωσης στο 100% των ασθενών χωρίς απροσδιόριστες περιπτώσεις (16,317). Επομένως είναι προτιμότερο να προηγείται της βιοψίας το FT score διότι με αυτόν τον τρόπο υπάρχουν ισχυρές πιθανότητες να μην χρειαστεί στον υποψήφιο NAFLD ασθενή η βιοψία. Εξάλλου με το FT score θα ωφεληθούν και πολλοί ασθενείς με ενδείξεις NAFLD ή NASH που έχουν φυσιολογικές αμινοτρανσφεράσες ορού (AST, ALT) οι οποίες αποτρέπουν τον κλινικό γιατρό, λανθασμένα πολλές φορές, να αποφασίσει τη βιοψία ήπατος παρά τις ισχυρές ενδείξεις σοβαρής NAFLD (ιστορικό/us), (16,201). To FT θα μπορούσε να επιτρέψει τη διάγνωση της προχωρημένης ηπατικής ίνωσης ακόμα και σε ασθενείς με ALT < 50 IU/l ή φυσιολογικές τιμές όπως φάνηκε στις στατιστικές αναλύσεις. Ένα FT score < 0,30 υποδηλώνει πολύ μικρή πιθανότητα κίρρωσης. Αυτοί οι ασθενείς δεν χρειάζονται περαιτέρω έλεγχο με υπέρηχο ή ενδοσκόπηση. FT score 0,30-0,70 αποτελεί ένδειξη ότι αυτοί οι ασθενείς θα πρέπει να περιορίσουν όλους τους μεταβολικούς παράγοντες που προάγουν τη NAFLD (υπέρβαροι, διαβητικοί, με δυσλιπιδαιμία και πλήρη αποχή από το αλκοόλ), έστω και αν έχουν φυσιολογικές τιμές τρανσαμινασών και μπαίνει η σκέψη της βιοψίας. FT score > 0,70, ακόμα και με φυσιολογικές τρανσαμινάσες, θα πρέπει να οδηγήσει στην απόφαση αντιμετώπισης του ασθενούς ως κιρρωτικό. Δηλαδή θα πρέπει να επιτηρείται με υπέρηχο και ενδοσκόπηση προκειμένου να αποφευχθούν τυχόν σοβαρές επιπλοκές κίρρωσης. Επομένως το Fibro-Test ή Fibro SURE στις ΗΠΑ, αποτελεί μία απλή, μη επεμβατική μέθοδο ποσοτικής εκτίμησης της ηπατικής λειτουργίας σε NAFLD ασθενείς, που μπορεί να προβλέψει αξιόπιστα την ηπατική ίνωση παρά του ότι καμία από τις μεταβλητές του δεν αποτελεί έναν άμεσο δείκτη της ηπατικής εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Η Α2Μ (α2 μακροσφαιρίνη) αποτελεί μία από τις μεταβλητές (παραμέτρους) του FT score που τελευταίες μελέτες δείχνουν ότι μπορεί να συμμετάσχει άμεσα τόσο στους ηπατικούς μηχανισμούς αντίστασης στην Ins όσο και στην ινογένεση (16,318). Συγκεκριμένα η Α 2 Μ συνδέεται με αρκετούς παράγοντες ανάπτυξης όπως: των ινοβλαστών, του αγγειακού ενδοθηλίου, της επιδερμίδας, παράγοντες που προέρχονται από την ανάπτυξη και μετατροπή των αιμοπεταλίων (PLT) (Transforming and Platelet derived growth factors). Είναι ενδιαφέρον ότι σε μελέτες φαίνεται ότι ασθενείς με NAFLD έχουν μία πολύ σημαντική συσχέτιση μεταξύ Α 2 Μ και επιπέδων Ins ορού (16). Μια σφραγίδα της αντίστασης στην Ins. Οι σχέσεις μεταξύ Α2Μ και επιπέδων Ins ορού έχουν περιγραφεί για περισσότερο από 40 χρόνια (16,319). Μερικές μελέτες έχουν δείξει Α2Μ σε διαβητικούς ασθενείς (320). Η Ins συνδέεται στο πλάσμα ομοιοπολικά με την Α2Μ και η Α2Μ είναι μια πρωτεΐνη δέσμευσης του ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα σύνδεσης πρωτεϊνών (IG FBP-1: Insulin like Growth factor Binding Protein-1) που τροποποιεί την αλληλεπίδραση IGFBP-1/IGF. Για το FT score οι τελευταίες μετα-αναλύσεις δείξανε μια ακρίβεια (AUC) πρόβλεψης F2, F3, F4 ίνωσης 0,84 (95% CI: 0,76-0,92) χωρίς διάφορες ανάμεσα στο αίτιο της χρόνιας ηπατικής νόσου. Το FT score βρέθηκε να έχει την ίδια αξία για τη διάγνωση τόσο της σοβαρής (F3, F4) όσο και της σημαντικής (F2, F3, F4) ίνωσης, χωρίς σημαντικές διαφορές ανάμεσα στις AUROCs καμπύλες ακρίβειας μεταξύ F2 σταδίου ίνωσης έναντι F1 (AUC: 0,66) και παρομοίως μεταξύ F3 και F4 σταδίου ίνωσης (AUC: 0,69)(321,322). To FT score συγκρίθηκε με το NAFLD fibrosis score (NFS). To FT score απέδειξε μία καλύτερη τιμή ακρίβειας για την πρόβλεψη της F2, F3, ίνωσης και κίρρωσης (F4) σε δύο διαφορετικές αναδρομικές αναλύσεις AUC: 0,891 (95% CI: 0,81-0,94) έναντι AUC: 0,76 (95% CI: 0,59-0,86) για NF score στην πρώτη ομάδα ανάλυσης και AUC: 0,80 (95% CI: 0,71-0,88) έναντι AUC: 0,70 (95% CI: 0,60-0,78) για NF score (p = 0,01) στην ομάδα θεραπευτικής προσέγγισης. Συμπερασματικά το Fibro Test αποτελεί έναν παγκόσμια χρησιμοποιούμενο δείκτη πλήρως επικυρωμένο για την πρόβλεψη του σταδίου ηπατικής ίνωσης στις περισσότερες χρόνιες ηπατοπάθειες όπως: NAFLD, ALD, χρόνιες ιογενείς ηπατίτιδες (HBV, HCV και HCV με HIV συνλοίμωξη). Το FT χρησιμοποιείται ευρέως ως μία μη επεμβατική εναλλακτική λύση για βιοψία με δοκιμές από το (31). Ωστόσο, 2 κυρίως επικρίσεις γίνονται συχνά από εμπειρογνώμονες: 1) Το FT έχει μελετηθεί κυρίως στην χρόνια HCV ηπατίτιδα και 2) η διαγνωστική αξία του FT είναι χαμηλότερη για ενδιάμεσα στάδια ίνωσης (F1, F2 έναντι F3) απ ότι στα ακραία στάδια (F0 ή F4). Το FT score είναι διαθέσιμο σε περισσότερες από 50 χώρες και το κόστος του κυμαίνεται από (321,322). 85 Σ ελίδα

90 ΠΙΝΑΚΑΣ 39 ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΑΞΙΟΠΙΣΤΙΑΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ(31) ΕΞΕΤΑΣΗ Σύστημα σταδιοποίησης ίνωσης (Staging) n AUC (F2, F3, F4) BAAT score Metavir 93 0,84 Fibro Test (FT) NAFLD fibrosis score (NFS) ELF HA ορού + *CDT/ Tf ορού Τροποποιημένα Brunt (Κleiner) 267 0,86 Τροποποιημένα Brunt(Κleiner) 733 0,88 (Kleiner) 61 0,87 Metavir 173 0,81 * ECM: extracellular Matrix. Carbohydrate Deficient Transferrin ορού * CDT/Τf: Τf: Transferrin (τρανσφερρίνη) ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Ηλικία - ΒΜΙ - ALT, Τριγλυκερίδια ορού Α2 Μακροσφαιρίνη, απολιποπρωτεΐνη Α1, Απτοσφαιρίνη, ολική χολερυθρίνη,γgt Ηλικία, ΒΜΙ, PLT, AST/ALT, τιμή γλυκόζης νηστείας ορού ή ΣΔ ΙΙ Συνδυασμός πολλαπλών πρωτεϊνών και πρωτεϊνασών του *ECM Συνδυασμός αναλογίας πρωτεϊνών ορού και ΗΑ ορού αποκλειστικά σε άτομα με: AST ή ALT 2X από ανώτερα φυσιολογικά όρια και παρουσία ενός ή περισσότερων χαρακτηριστικών του ΜΣ Αδιάφορος η κατανάλωση αλκοόλ BAAT score: (BMI, Age, ALT, Triglycerides) O Ratziu et al συνδύασε 4 κλινικές μεταβλητές για να δημιουργήσει το BAAT score (323): BMI 28 Kg/m 2 Ηλικία 50 (έτη) ALT 2x από τα ανώτερα φυσιολογικά όρια Τριγλυκερίδια 1,7 mmol/l. BAAT score: 0-4 Η παρουσία κάθε μεταβλητής λαμβάνει 1 βαθμό στη συνδυαστική βαθμολογία. Το BAAT score καταρτίσθηκε σε μία ομάδα 93 Γάλλων ασθενών με παχυσαρκία, που είχαν παθολογικές εξετάσεις ηπατικής βιοχημείας. Κανείς ασθενής αυτής της ομάδος που είχε BAAT score: 0-1 δεν είχε F3 ή F4 ίνωση, δοθέντος ότι 4 ασθενείς που είχαν BAAT score: 4 είχαν F3 στάδιο ίνωσης. Επομένως: BAAT score: 0-1: NPV 100% για αποκλεισμό ίνωσης ΒΑΑΤ score: 4: Spec: 100%, Sense: 14% για ανίχνευση διαφραγματικής (F3) ίνωσης. Η ακρίβεια της μεθόδου είχε AUC: 0, Σ ελίδα

91 ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΟΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΤΩΝ: ΗΑ ορού και CDT: Carbohydrate Deficient Transferring ορού Tf: (Transferring ορού) Σε ασθενείς με αυξημένα επίπεδα αμινοτρανσφερασών ορού (AST ή ALT 2x από ανώτερα φυσιολογικά όρια) που έχουν ένα ή περισσότερα από τα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου Ο ανώτερος συνδυασμός αποτελεί έναν απλό αλγόριθμο πρόβλεψης του σταδίου(staging) ίνωσης ήπατος με μεταβλητές τα επίπεδα του ΗΑ ορού και την τιμή που μας δίνει η αναλογία τρανσφερρίνης ορού επί ανεπάρκειας υδατανθράκων (CDT: Carbohydrate Deficient Transferrin) προς τρανσφερρίνη ορού (Tf) σε ασθενείς με αυξημένα επίπεδα αμινοτρανσφερασών ορού (AST ή ALT 2x από ανώτερα φυσιολογικά όρια) που έχουν ένα ή περισσότερα από τα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου. Η βαθμολογία (score) αυτού του αλγορίθμου επιτρέπει, στους συγκεκριμένους ασθενείς, την μη επεμβατική σταδιοποίηση της ίνωσης του ήπατος ανεξάρτητα από το ποσό αλκοόλ που καταναλώνουν (324). Ο Laine et al (324) σχεδίασαν αυτή τη μελέτη με στόχο να μπορούν να προβλέψουν το βαθμό ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με αυξημένες τιμές αμινοτρανσφερασών ορού, που δεν μπορούσαν να λάβουν αξιόπιστες πληροφορίες όσον αφορά την ποσότητα αλκοόλ που κατανάλωναν και είχαν ταυτόχρονα κάποιο από τα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου: Κοιλιακή παχυσαρκία (περίμετρος μέσης > 102 cm για και 88 cm για ) Σάκχαρο νηστείας > 110 mg/dl ή ΣΔ ΙΙ Αρτηριακή υπέρταση (ΑΠ >130/85 mmhg) ή λήψη αντιϋπερτασικών Τριγλυκερίδια ορού > 150 mg/dl HDL (high-density lipoprotein) ορού < 40 mg/dl για και < 50 mg/dl για. Οι ασθενείς που συμπεριλήφθησαν για το σκοπό αυτό στη μελέτη ήταν συνολικού αριθμού 173, είχαν όλοι τα ανώτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά τις τιμές ALT ή AST ορού και κάποια από τα κριτήρια του μεταβολικού συνδρόμου. Δεν υπήρχε άλλη εμφανής αιτία παθολογικής αύξησης των αμινοτρανσφερασών ορού και είχαν όλοι ηπατική βιοψία >1 cm. Το αλκοόλ δεν ήταν κριτήριο αποκλεισμού τους από τη μελέτη. Για τη σταδιοποίηση της ίνωσης χρησιμοποιήθηκε το METAVIR SCORE στα δείγματα των ηπατικών βιοψιών. Σημαντική ίνωση καθορίστηκε σαν METAVIR score F2, F3, F4 και παρατηρήθηκε στους 42 από τους 173 ασθενείς (24%). Η μέση τιμή ΗΑ ορού ήταν 188 μg/l και η μέση τιμή αναλογίας CDT/Transferrin ορού (Τf) ήταν 1,09. Οι 71 από τους 173 ασθενείς έκαναν εκσεσημασμένη κατανάλωση αλκοόλ. Ένα cutoff τιμής ΗΑ ορού < 35 μg/l και ένα cutoff < 0,9 αναλογίας CDT/τf ορού, έδινε ακρίβεια (AUC) 0,81 με Sense: 93%, Spec: 77%, PPV: 57%, NPV: 97% για αποκλεισμό ηπατικής ίνωσης ΠΙΝΑΚΑΣ 40 Αλγόριθμος πρόβλεψης σημαντικής ηπατικής ίνωσης (F2, F3, F4) σε άτομα με ALT ή AST ορού + χαρακτηριστικά μεταβολικού συνδρόμου ανεξάρτητα λήψης αλκοόλ (324) AUROC ΔΕΙΚΤΗΣ Ν Cut off Sense Spec PPV NPV 95% CI *HA ορού ΗΑ < 35 μg/l 0,81 (75-87) 93% 77% 57% 97% * CDT/tf ορού CDT/Tf ορού - <0,9 *HA :Hyaluronic Acid Carbohydrate Deficient Transferrin ορού * CDT/Τf: Τf: Transferrin (τρανσφερρίνη) Από τον παραπάνω πίνακα φαίνεται ότι σε ασθενείς με αυξημένες αμινοτρανσφεράσες ορού και χαρακτηριστικά του Μεταβολικού Συνδρόμου (ΜΣ), ένας απλός αλγόριθμος επιτρέπει τον αποκλεισμό σημαντικής ίνωσης σε ποσοστό 97% (NPV) ανεξάρτητα από την κατανάλωση αλκοόλ. Αυτό είναι πολύ σημαντικό, διότι κατανάλωση αλκοόλ και ΜΣ συνδέονται αρκετά συχνά στην καθ ημέρα πράξη των κλινικών γιατρών και τους προβληματίζουν κατά πόσον η βλάβη (ιστολογική) 87 Σ ελίδα

92 του ήπατος, θα μπορούσε να οφείλεται περισσότερο ή λιγότερο σε ένας από τους δύο παράγοντες. Επιπλέον η κατανάλωση αλκοόλ είναι πάντα δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί ειδικά για μια ζωή. Η τρανσφερρίνη ορού είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που δρα ως μεταφορέας Fe (σιδήρου). Συντίθεται στο ήπαρ και έτσι εξηγείται και η πτώση των επιπέδων της στον ορό ασθενών με ηπατική ανεπάρκεια. Η τρανσφερρίνη περιλαμβάνει τερματικά (τελικά) υπολείμματα σιαλικού οξέος, διακλαδιζόμενα σε 2 πολυζαχαριδικές αλύσους. Υπάρχουν τουλάχιστον 6 ισομορφές της τρανσφερρίνης ανάλογα με το βαθμό σιαλυλίωσης. Η CDT αποτελείται από διμερή - μονομερή και asialyled κλάσματα τρανσφερρίνης. Χρησιμοποιείται συνήθως ως δείκτης κατανάλωσης αλκοόλ. Η ημερήσια πρόσληψη > 60 gr αιθανόλης για > 2 εβδομάδες οδηγεί σε CDT ορού εμμένουσα για 2-4 εβδομάδες μετά τη διακοπή του αλκοόλ. Οι DiMartini et al (325) αναφέρουν επίπεδα CDT στον ορό ασθενών με κίρρωση, ακόμα και αν είναι εγκρατείς στο αλκοόλ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η CDT μπορεί επίσης να είναι ένας έμμεσος δείκτης ηπατικής ίνωσης. Ενδιαφέρον είναι ότι τα επίπεδα CDT ορού δεν επηρεάζονται από ΣΔ, Δυσλιπιδαιμία, παχυσαρκία, αρτηριακή υπέρταση. Στην μελέτη των Laine et al (324) ένα cutoff τιμής λόγου CDT/Τf ορού < 0,9, έδινε ισχυρή αξιοπιστία για τον αποκλεισμό σημαντικής ηπατικής ίνωσης για δύο λόγους: Πρώτον γιατί κανείς από τους ασθενείς της μελέτης με τιμή ΗΑ ορού 35 microgr/l δεν είχε ιστολογικά ίνωση F3 και F4 όταν ο λόγος CDT/Τf ορού ήταν < 0,9 και δεύτερον και σημαντικότερο γιατί έπρεπε να επιλεχθούν πολύ χαμηλές τιμές τόσο για τη CDT ορού (αυξάνει επί κατανάλωσης αλκοόλ ή επί ηπατοκυτταρικής ίνωσης) όσο και για την τρανσφερρίνη ορού ( επί ηπατικής ανεπάρκειας). Άνοδος αριθμητή και μείωση παρανομαστή μειώνουν την ειδικότητα της μεθόδου. Μάλιστα για τους ίδιους λόγους, στην παρούσα μελέτη, δεν επιλέχθηκαν μόνες τους οι τιμές CDT ή Τf ορού προς σχηματισμό του αλγορίθμου αλλά επιλέχθηκε η αναλογία CDT/Τf ως πιο ακριβής δείκτης της ηπατικής ίνωσης επειδή, όπως προαναφέραμε, αντανακλάται τόσο η ηπατοκυτταρική ανεπάρκεια ( Τf ορού) όσο και η ίνωση ( CDT ορού). Συμπερασματικά επειδή ο πληθυσμός που μελετήθηκε είναι αντιπροσωπευτικός των ασθενών που επισκέπτονται τα τακτικά εξωτερικά ιατρεία των Νοσοκομείων ( αμινοτρανσφεράσες, χαρακτηριστικά ΜΣ, μέτρια λήψη αλκοόλ ή αδιευκρίνιστη) ο αλγόριθμος αυτός θα πρέπει να είναι χρήσιμος στην καθ ημέρα πράξη (πίνακες 39,40). ELF panel (Enhanced Liver Fibrosis Panel) (ενισχυμένο Panel ηπατικής ίνωσης) Η Ευρωπαϊκή ομάδα ηπατικής ίνωσης (Rosenberg et al) (326) εξέτασε το συνδυασμό πολλαπλών συστατικών της θεμέλιας ουσίας, που εκφράζονται στον ορό, σε ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο ιστολογικά σταδιοποιημένη, προς δημιουργία ενός βαθμολογικού αλγόριθμου πρόβλεψης της ηπατικής ίνωσης μη επεμβατικά σε πολλές χρόνιες ηπατοπάθειες. Ξεχωριστές αναλύσεις, ενός συνόλου εξετάσεων των δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκαν προς ταυτοποίηση ενός αλγόριθμου που συνδυάζει: - Ηλικία (έτη) - Επίπεδα ΗΑ ορού (ng/ml) ELF - P III NP ή P3 NP: Amino-Terminal Propeptide of Type IIΙ Aλγόριθμος Collagen (Αμινοτελικό προπεπτίδιο κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ) (ng/ml) - ΤΙΜΡ-1: Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase-1(ιστικός αναστολέας Μεταλλοπρωτεϊνάσης -1) (ng/ml) Ο αλγόριθμος αυτός ονομάστηκε ELF και στη συνέχεια αξιολογήθηκε και επικυρώθηκε συγκρίνοντας ένα σύνολο 921 δειγμάτων ηπατικών βιοψιών των ασθενών με τα αντίστοιχα δείγματα ορού. Ο ELF ανιχνεύει την ηπατική ίνωση με Sense: 90% και με ακρίβεια εντοπίζει την απουσία ηπατικής ίνωσης (NPV για σημαντική ίνωση F2, F3, F4: 92%) με αξιοπιστία της μεθόδου (AUC) 0,804. Οι επιδόσεις του ELF Panel ήταν εξαιρετικές για την ALD και την NAFLD. Όμως σε αυτή τη μελέτη μόνο 61 ασθενείς από τους 921, που είχαν δείγματα ηπατικής βιοψίας, έπασχαν από NAFLD. Παρ όλα αυτά εξετάζοντας ξεχωριστά τους 61 ασθενείς με NAFLD, η απόδοση του ELF panel έδινε μια ακρίβεια (AUC) 0,87 πρόβλεψης σημαντικής ίνωσης (F2, F3, F4) με (95% CI: 0,666-1,000), (πίνακας 41) παρόμοια με την AUC του Fibro Test (16) (πίνακας 39). Συγκεκριμένα για NAFLD στάδιο ίνωσης F3, F4 μια τιμή cutoff 0,375 έδινε Sense: 89%, Spec: 96%, PPV: 80% και NPV: 98%. Δηλαδή με το ELF panel μπορεί να αποκλεισθεί η F3, F4 ίνωση στο 98% των NAFLD ασθενών και έτσι να μη χρειασθεί βιοψία. Όμως ο αριθμός των NAFLD ασθενών της μελέτης ήταν μικρός και παρά του ότι η μέθοδος είχε καλή ευαισθησία και 88 Σ ελίδα

93 ειδικότητα, που παρέχουν αποδείξεις καλής εκτέλεσης της δοκιμασίας, η μέθοδος έπρεπε να επικυρωθεί σε μεγαλύτερες αριθμητικά μελέτες NAFLD ασθενών (πίνακας 41).Γεγονός που έπραξαν Ο Guha et al το 2008 (327) σε μία ανεξάρτητη ομάδα 192 ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD από 2 πανεπιστημιακά κέντρα της Αγγλίας. Στη μελέτη επικύρωσης η ακρίβεια του ELF panel έδινε AUC 0,90 για τη διάκριση σοβαρής ίνωσης (F3, F4), AUC 0,82 για μέτρια ίνωση (F1, F2, ) και AUC 0,76 για ανυπαρξία ίνωσης (F0) σύμφωνα με την ιστολογική σταδιοποίηση κατά Kleiner. Η ακρίβεια(auc) της μεθόδου ήταν παρόμοια χρησιμοποιώντας ή όχι την ηλικία των ασθενών ως μία μεταβλητή όπως όριζε ο αρχικός αλγόριθμος στη μελέτη σχεδιασμού (Originals ELF) (326). Ως εκ τούτου για να απλοποιηθεί ο αλγόριθμος αφαιρέθηκε η ηλικία & το ELF panel χρησιμοποιήθηκε χωρίς την ηλικία για το υπόλοιπο της ανάλυσης. Η μέθοδος είχε εξαιρετική ακρίβεια (AUC) 0,90 (95% CI: 0,84-0,96) για την πρόβλεψη σοβαρής ίνωσης (F3, F4).Το cutoff της ανώτερης τιμής 0,357 είχε Sense: 80%, Spec: 90%, PPV: 71%, NPV: 94%. Για τη διάκριση μέτριας ίνωσης (F1, F2) η μέθοδος έδινε συνολική ακρίβεια (AUC) 0,82 (95% CI: 0,75-0,88). Το ανώτατο όριο cutoff: - 0,1068 συνδέθηκε με Sense: 70%, Spec: 80%, PPV: 70%, NPV: 80%. Για τη διάκριση F0 σταδίου ίνωσης η συνολική AUC ήταν 0,76 (95% CI: 0,69-0,83). To ανώτερο όριο τιμής Cutoff: - 0,2070 συνδέθηκε με Sense: 61%, Spec: 80%, PPV: 81%, NPV: 79% (πίνακας 41). Χρησιμοποιώντας ένα ανώτατο όριο cutoff: 0,2112 και κατώτατο cutoff: -1,0281 τα οποία μας δίνουν αντίστοιχα ειδικότητα και ευαισθησία 90% στην ομάδα των ασθενών με F3, F4 ίνωση, θα είχε αποφευχθεί η βιοψία στο 86%των ασθενών με 76% των ασθενών να έχουν ορθή ταξινόμηση του σταδίου ίνωσης μη επεμβατικά και 14% θα είχαν ακαθόριστο κατάταξη (τιμές μεταξύ των ορίων) και θα χρειάζονταν βιοψία ήπατος. Για την ανίχνευση της μέτριας ίνωσης (F1, F2) χρησιμοποιώντας cutoffs με ευαισθησία και ειδικότητα 90% (χαμηλό όριο και υψηλό όριο cutoff αντίστοιχα) 62% των ασθενών θα είχαν αποφύγει τη βιοψία με 52% αυτών να έχουν ταξινομηθεί σωστά και 38% θα είχαν ακαθόριστο όριο που απαιτείται βιοψία. Τέλος αν το ELF χρησιμοποιείτο για καθορισμό οποιουδήποτε σταδίου ίνωσης (F0 - F4), χρησιμοποιώντας cut offs με ευαισθησία και ειδικότητα 90% αντίστοιχα, το 48% θα είχαν αποφύγει τη βιοψία, το 38% θα είχαν ταξινομηθεί σωστά και το 52% θα είχε ένα ακαθόριστο όριο κατάταξης. Εάν μια ευαισθησία και ειδικότητα 80% επιλέγεται για την ανίχνευση οποιασδήποτε ίνωσης, 79% θα είχαν αποφύγει τη βιοψία με το 59% να ταξινομούνται σωστά και το 21% θα είχαν ακαθόριστο όριο κατάταξης. Επομένως ορίζοντας ένα ανώτατο και κατώτατο όριο cutoff τιμής για το ELF panel, μπορούμε να έχουμε σημαντική εκτίμηση της κλινικής χρησιμότητας αυτού του μη επεμβατικού δείκτη πρόβλεψης ηπατικής ίνωσης και σε NAFLD ασθενείς. Εάν το ELF panel συνδυαστεί και με άλλους απλούς δημογραφικούς ή βιοχημικούς δείκτες φαίνεται να η ακρίβεια (AUC) της μεθόδου σε διάφορα στάδια ίνωσης & αυτό αν πραγματικά ισχύει θα επιτρέψει δυνητικά ανώτερη διαστρωμάτωση των ασθενών με NAFLD για τις αναδυόμενες θεραπευτικές στρατηγικές (πίνακας 42). Το ELF panel έχει καλύτερη ακρίβεια (AUC: 0,93) έναντι NFS (AUC: 0,84) για την πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης. Όμως είναι σχετικά ακριβότερο, γιατί εμπλέκει τη μέτρηση δεικτών του κύκλου εργασιών της θεμέλιας ουσίας (matrix) (26). Λαμβάνοντας όμως υπόψη ότι το ELF δεν απαιτεί δοκιμασία νηστείας (Gly νηστείας) και επίσης ότι δεν απαιτεί δημογραφικά ή ανθρωπομετρικά δεδομένα και τέλος ότι μπορεί να αξιολογήσει όλα τα στάδια NAFLD ίνωσης ενώ το NFS όπως και άλλοι απλοί αλγόριθμοι (BARD score, Fibro Meter) μας δίνουν ουσιαστικά πληροφορίες μόνο για τη σοβαρή (F3, F4) NAFLD ίνωση, το οικονομικό κόστος της κάθε εμπορικής δοκιμασίας θα πρέπει να σταθμιστεί σε σχέση με οποιοδήποτε πρακτικό ή διαγνωστικό όφελος (327). O Nobil et al (328) εκτίμησαν την αξία του ELF panel για την πρόβλεψη σταδίου ίνωσης σε 112 παιδιά με NAFLD. Η καμπύλη AUROC προς διαχωρισμό ανάμεσα στα στάδια ίνωσης είχε ποικίλου βαθμού ακρίβεια στην απόδοσή της από 0,90-0,99. Τιμές cutoff από 9,28-10,51 είχαν Sens: % και Spec: 76-98% για τη διάκριση ανάμεσα στα στάδια ίνωσης (ΠΙΝΑΚΑΣ 41). Ο Parkers et al (322) σε μια μελέτη του 2010 έδειξαν ότι το ELF panel μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα χρήσιμο εργαλείο πρόγνωσης της εξέλιξης της NAFLD. Αυτό το παρατήρησαν όταν με μια μόνο αλλαγή κατά μία μονάδα στη βαθμολογία του ELF panel διπλασιαζόταν το ποσοστό θνησιμότητας που σχετίζεται με το ήπαρ & το ποσοστό νοσηρότητας στα 6 χρόνια παρακολούθησης των NAFLD ασθενών. 89 Σ ελίδα

94 ΠΙΝΑΚΑΣ 41 ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΣΤΑΔΙΟΥ (F0, F1, F2, F3) NAFLD ΙΝΩΣΗΣ ΜΕΛΕΤΗ (OELF Algorithm) Resenberg et al (326) Ν AUROC καμπύλη ELF Panel 61 0,87 0,375 (F3,F4) Cutoff Sense Spec PPV NPV 89% 96% 80% 98% (ELF Algorithm) Guha et al (327) 192 0,90 0,3576 (F3, F4) 80% 90% 71% 94% 0,82-0,1068 (F1, F2) 70% 80% 70% 80% (ELF Algorithm) Nobil et al (328) 0, ,90-0,96-0,2070 (F1, F2) 9,28-10,51 (F0,F1,F2,F3, F4) 61% 80% 81% 79% % 76-98% OELF Algorithm:Original ELF (Rosenberg et al) Εξίσωση OELF Algorithm : Ds = -6,38 (In (age)* 0,14) +(In(HA)* 0,616) + (In(P3NP)* 0,586) + (In (TIMP)* 0,472) Εξίσωση ELF Algorithm: Ds = (In (HA)* 0,681) + (In (P3 NP)* 0,775) + (In (TIMP1)* 0,494) Σύμβολο* : Αλγόριθμος ELF panel: Enhanced Liver Fibrosis Panel ΠΙΝΑΚΑΣ 42 ΕΠΙΔΟΣΕΙΣ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΥ ELF PANEL ΜΕ ΑΠΛΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ (BMI, ΣΔ ΙΙ, Gly νηστείας, AST/ALT) ΠΡΟΣ ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΩΝ ΣΤΑΔΙΩΝ NAFLD ΙΝΩΣΗΣ F0/F1, F2, F3 (οποιαδήποτε ίνωση) Mελέτη Guha et al(327) (N = 91) Απλοί δείκτες 0,79 (0,69-0,88) ELF 0,82 (0,73-0,90) Άλλοι δείκτες + ELF Algorithm* F0, F1/F2, F3, F4 (μέτρια ίνωση) F0, F1, F2/F3, F4 (σοβαρή ίνωση) AUROC AUROC AUROC 0,84 (0,76-0,92) 0,86 (0,78-0,94) 0,90 (0,84-0,96) 0,93 (0,88-0,99) * ELF Algorithm (Guha et al): Ds = (In (HA)* 0,681) + (In (P3 NP)* 0,775) + (In (TIMP1)* 0,494), Σύμβολο* : Αλγόριθμος 0,89 (0, ) 0,93 (0,88-0,98) 0,98 (0,96-1) 90 Σ ελίδα

95 Απεικονιστικές μη επεμβατικές τεχνικές ανίχνευσης σταδίων NAFLD υπό έρευνα Η έγκαιρη ανίχνευση της NASH-ίνωσης μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για μια θεραπευτική προσέγγιση αντιμετώπισης της εξέλιξης της ίνωσης. Όπως φαίνεται από την μέχρι τώρα έρευνα μεμονωμένοι βιοδείκτες ή συστήματα βαθμολόγησης (αλγόριθμοι) που συνδυάζουν ρουτίνας κλινικές και εργαστηριακές μεταβλητές, καθώς και κάποιοι «ιδιόκτητοι» πίνακες, μπορούν να βοηθήσουν στην πρόβλεψη της σοβαρότητας της NAFLD αλλά χρειάζεται ακόμα μεγαλύτερη έρευνα προς επικύρωσή τους. Στην ερευνητική προσπάθεια αναγνώρισης των σταδίων NAFLD (NAFL, NASH, NASH- ίνωση, κίρρωση) έχουν εισαχθεί και μη επεμβατικές απεικονιστικές μέθοδοι είτε σαν μονομερείς είτε σε συνδυασμό με αιματολογικές εξετάσεις και δημογραφικούς παράγοντες προς καλύτερη και πρωϊμότερη αναγνώριση των σταδίων NAFLD μη επεμβατικά. Μη επεμβατικοί μέθοδοι απεικόνισης που συμμετέχουν στην ερευνητική προσπάθεια σταδιοποίησης της NAFLD αποτελούν: Το Υπερηχογράφημα που βασίζεται στην παροδική ελαστογραφία (transient elastograpy: Fibro scan). Ο Μαγνητικός Συντονισμός (Magnetic Resonance: MR) βασιζόμενος στην ελαστογραφία (MRE). O Μαγνητικός Συντονισμός (MR) που βασίζεται στη φασματομετρία (Magnetic Resonance Spectroscopy: MRS). H Υπερμαγνητική Απεικόνιση με τη χρήση οξειδίων του σιδήρου (Fe) (SP10 enhanced MRI). Η Μαγνητική Τομογραφία (ΜR) διάχυσης. Τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (Positron Emission Tomography - PET). Κ. άλλες Όλες οι ανωτέρω απεικονιστικές τεχνικές είναι αρκετά ακριβή διαθέσιμα εργαλεία για τον προσδιορισμό της βαρύτητας της ίνωσης στη NAFLD αλλά κανένα από αυτά δεν μπορεί ακόμα να αντικαταστήσει τη βιοψία ήπατος. US αντίθεσης με χρήση Levovist (Shering, Berlin, Germany). Είναι μια ελάχιστα επεμβατική τεχνική (ενδοφλέβια έγχυση 2,5 gr του παράγοντα Levovist). Μετά την έγχυση της σκιαγραφικής ουσίας το ήπαρ σαρώνεται κάθε 5 έως τα 50 min και αλλαγές στη συσσώρευση μικροφυσσαλίδων αξιολογούνται απεικονιστικά. Η ένταση του σήματος από τις περιοχές που ενδιαφέρουν παρουσιάζει απεικονιστικές αντιθέσεις και αφού συγκεντρωθούν όλες οι εικόνες γίνεται μέτρηση και υπολογισμός των απεικονιστικών αντιθέσεων χρησιμοποιώντας χρονικής έντασης καμπύλες (TICs: Time Intensity Curves). Σε μια μελέτη από τους Lijima et al (329) 21 ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH, 33 ασθενείς με NAFLD και 10 υγιείς αιμοδότες εκτιμήθηκαν με αυτή τη μέθοδο. Η ένταση του σήματος μετρήθηκε ποσοτικά σε 5 και 20 λεπτά μετά την έγχυση. Υπήρξε μια στατιστικά σημαντική μείωση της έντασης του σήματος σε NASH ασθενείς σε σχέση με αυτούς με NAFLD ή τους υγιείς αιμοδότες. Αυτές οι αλλαγές στην ένταση του σήματος δεν σχετιζόταν με το βαθμό ίνωσης και στεάτωσης που υπήρχε στην ιστολογική μελέτη. Η ευαισθησία (Sense), η ειδικότητα (Spec) και συνολική ακρίβεια (AUC) που λαμβάνονταν με ROC ανάλυση ήταν: 100% όταν ως cutoff ορίστηκε τιμή 43,6 της έντασης του σήματος στα 20 λεπτά. Βάση αυτής της μελέτης του 2007, φαίνεται ότι το US αντίθεσης με Levovist είναι μια χρήσιμη εξέταση προ-συμπτωματικού ελέγχου διάγνωσης NASH ανάμεσα σε NAFLD ασθενείς. Χρειάζεται επικύρωση με πολυπληθυσμιακές μελέτες. Όμως προς το παρόν αποτελεί ένα πρώιμο πολλά υποσχόμενο εργαλείο για τη διάγνωση της NASH επί NAFLD ασθενών. Ultra Soud elastography ή Fibro Scan (Υπέρηχο-ελαστογραφία) Το Fibro scan είναι μία τεχνική που βασίζεται στην τεχνολογία των υπερήχων για τη μέτρηση της ιστικής ελαστικότητας (4,11,15) ή αλλιώς μετρά τη σκληρία (Stiffness) του ήπατος. Στο Fibro scan τα κύματα διάτμησης (διανέμοντα κύματα) σε μια χαμηλή συχνότητα των 50 Hz, 91 Σ ελίδα

96 δημιουργούνται από ένα παλλόμενο αισθητήριο καθετήρα που εφαρμόζεται στο δέρμα πάνω στο ήπαρ. Η ταχύτητα του αναπαραγόμενου παλμικού κύματος συσχετίζεται με την σκληρία (Stiffness) ή ελαστικότητα του υποκείμενου ήπατος. Απλοϊκά το αναπαραγόμενο κύμα ταξιδεύει ταχύτερα με την αύξηση της ηπατικής ίνωσης. Ένα παλμού ήχου υπερηχογράφημα, επιτρέπει τη μέτρηση της ταχύτητας του κύματος και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε Kilopascals (KPa). Πρέπει να λαμβάνονται τουλάχιστον 10 έγκυρες μετρήσεις. Η εγκυρότητα των μετρήσεων αξιολογείται από το διατεταρτημοριακό εύρος και την αναλογία των επιτυχημένων προς αποτυχημένες μετρήσεις που θα πρέπει να είναι πάνω από το 60% (4,11,15). Το Fibro scan μετρά την ηπατική σκληρία ή ακαμψία μέσα σε έναν κύλινδρο 1 cm πλάτους και 4 cm μήκους, παράγοντας μια εκτιμώμενη περιοχή δειγματοληψίας που είναι 100 x μεγαλύτερη απ ότι το δείγμα ηπατικής βιοψίας. Αν και ακόμα η αναλογία του ηπατικού δείγματος που μετράται με το Fibro scan θεωρείται μικρή, εντούτοις είναι πολύ μεγαλύτερη από αυτή που μετράται με την ηπατική βιοψία ( 1-2 cm). Η επαναληψιμότητα της τεχνικής έχει αξιολογηθεί σε μία μεγάλη μελέτη που περιελάμβανε 800 εξετάσεις σε 200 ασθενείς που είχαν ετερογενή ηπατική νόσο (330). Ο εσωτερικός συντελεστής συσχέτισης ήταν 0,98 από δύο χειριστές. Η εξέταση είναι φτηνή αλλά απαιτείται ένα κόστος κεφαλαίου. Το κατώτερο όριο για την ανίχνευση σημαντικής ηπατικής ίνωσης ποικίλει από 4-9 ΚPa σε τέσσερις επιλεγμένες μελέτες που συμπεριέλαβαν ασθενείς με μεικτές αιτίες χρόνιας ηπατικής νόσου συμπεριλαμβανομένης και της NAFLD ( ). Καλή απόδοση της εξέτασης (AUROC) εμφανιζόταν πάνω από αυτά τα κρίσιμα όρια. Η καμπύλη AUROC έδινε ακρίβεια από 0,74-0,86 με μία ευαισθησία (Sense) και ειδικότητα (Spec), του επιλεγμένου κατώτερου ορίου KPa, από 68-94% και από 33-85% αντιστοίχως. Συγκρινόμενο με τις αιματολογικές εργαστηριακές εξετάσεις, το Fibro scan παρουσίαζε καλύτερες διαγνωστικές επιδόσεις στην ανίχνευση κιρρωτικού σταδίου της νόσου. Λίγες μελέτες έχουν αξιολογήσει την απόδοση της ελαστογραφίας με υπερήχους (fibro scan) στη σταδιοποίηση της ηπατικής ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. Μέχρι σήμερα η μεγαλύτερη μελέτη περιλαμβάνει 274 ασθενείς με NAFLD που υπέστησαν Fibro scan και βιοψία ήπατος για την εκτίμηση της ηπατικής ακαμψίας (ίνωσης) (334). Η μελέτη αυτή έγινε το 2010 από τους Wong et al και η βιοψία ήπατος αποτελούσε το «χρυσό» πρότυπο σύγκρισης της εγκυρότητας των αποτελεσμάτων του Fibro scan. Η μέθοδος έδινε με AUROC καμπύλη τιμή ακρίβειας (AUC) 0,84 για σημαντική ίνωση (F 2), τιμή 0,93 για προχωρημένη ίνωση (F 3) και τιμή 0,95 για κίρρωση (F = 4) (ιστολογική ταξινόμηση κατά Kleiner). Μια τιμή cut off 3,9 KPa με fibro scan, ήταν ακριβής για αποκλεισμό F3, F4 ίνωσης με μια σχετική Sense: 91%, Spec: 75%, PPV: 52% και NPV 97% (πίνακας 46). Ωστόσο το fibro scan δεν κατάφερε να πετύχει τις 10 έγκυρες μετρήσεις που απαιτούνται για την εκτίμηση της ηπατικής σκληρίας στους 28 από τους 274 ασθενείς (10,2% των ασθενών). Αυτοί ήταν ασθενείς με ΒΜΙ 35 Kg/m 2 και περίμετρο μέσης 111 cm ± 14 cm.παρ όλα αυτά η καμπύλη AUROC, ορθής απόδοσης της ακρίβειας του fibro scan, ήταν σημαντικά υψηλότερη απ ότι της AST/ALT αναλογίας (AAR), του δείκτη APRI, του FIB-4, του NFS και BARD score για την αξιόπιστη πρόβλεψη F3 ίνωσης και F4 κίρρωσης (πίνακας 44). 92 Σ ελίδα

97 ΠΙΝΑΚΑΣ 44 Μελέτη Wong et al (334) AUROC ΚΑΜΠΥΛΕΣ AΚΡΙΒΕΙΑΣ ΓΙΑ FIBROSCAN ΚΑΙ ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΥΣ ΑΛΓΟΡΙΘΜΟΥΣ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ F3, F4 ΙΝΩΣΗΣ ΣΤΟΥΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΕΠΙΤΥΧΕΙΣ *LSMs 10 ΜΕΘΟΔΟΣ N AUROC (95% *CI) AST/ALT ratio (AAR) F3 AUROC fibro scan (95% *CI) AUROC (95% *CI) F4 AUROC fibro scan (95% *CI) 245 0,66 0,93 0,66 0,95 (0,58-0,74) (0,89-0,96) (0,55-0,77) (0,91-0,99) APRI score 245 0,74 0,93 0,75 0,95 (0,67-0,82) (0,89-0,96) (0,64-0,85) (0,91-0,99) FIB-4 score 245 0,80 0,93 0,81 0,95 (0,74-0,87) (0,89-0,96) (0,73-0,89) (0,91-9,99) NAFLD Fibrosis score (NFs) 228 0,75 0,92 0,80 0,95 (0,67-0,83) (0,89-0,96) (0,69-0,92) (0,91-0,99) BARD score 244 0,69 0,93 0,62 0,95 (0,61-0,77) (0,89-0,96) (0,50-0,75) (0,91-0,99) *LSMs: Liver stiffness Measurements (Μετρήσεις ηπατικής σκληρίας) *CI: confidence interval Σε μια «πρόθεση» για θεραπεία όλοι οι 274 ασθενείς που υπέστησαν fibro scan και ηπατική βιοψία αναλύθηκαν, ακόμα και οι 28 ασθενείς στους οποίους το fibro scan δεν μπόρεσε να πετύχει τις 10 έγκυρες μετρήσεις ακαμψίας του ήπατος (LSM: Liver Stiffness measurement: μέτρηση ακαμψίας του ήπατος). Παρατηρήθηκε ότι σε μια τιμή cutoff 8,7 KPa η NPV για το fibro scan προς αποκλεισμό προχωρημένης ίνωσης (F3, F4) ήταν υψηλή (89,3%). Ωστόσο η PPV παρουσία προχωρημένης ίνωσης ήταν μέτρια (48,5%). 93 Σ ελίδα

98 ΠΙΝΑΚΑΣ 45 Συγκριτική απόδοση των μη επεμβατικών δοκιμασιών για τη διάγνωση σοβαρής ίνωσης (F3-F4) σε 274 NAFLD ασθενείς. Μελέτη Wong et al (334) Μη επεμβατική δοκιμασία Cutoff Sense Spec PPV NPV Fibro scan (KPa) 7,9 77,3% 68,8% 44% 90,5% (Αποτυχία n = 28) 8,7 71,2% 76% 48,5% 89,3% 9,6 63,6% 83,7% 55,3% 87,9% AST/ALT ratio (AAR) 0,8 39,7% 79,7% 37,9% 80,9% 1,0 20,6% 90,1% 39,4% 78,4% APRI 0,5 65,1% 72,3% 42,3% 86,9% 1,5 63% 97% 40,0% 76,9% FIB-4 score 1,30 65,1% 80,2% 50,6% 88,0% 2,67 20,6% 95,5% 59,1% 79,4% NAFLD fibrosis score (NFS) -1,455 73,3% 69,5% 43,6% 89,0% 0,676 18,3% 96,3% 61,1% 78,6% BARD score 2 61,9% 65,8% 36,1% 84,7% Σε αυτή τη μεγάλη μελέτη προοπτικής, φάνηκε ότι το fibro scan έχει σημαντική ακρίβεια στην πρόβλεψη προχωρημένης ίνωσης και κίρρωσης. Επιτυχείς μετρήσεις θα μπορούσαν να αποκτηθούν στο 97% και πλέον, των ασθενών με ΒΜΙ < 30 Kg/m 2 και στο 75% των παχύσαρκων (ΒΜΙ 30 Kg/m 2 ) ασθενών. Οι περισσότερες ασυμφωνίες μεταξύ Fibro scan & ιστολογικών ευρημάτων εμφανίζονταν σε ασθενείς με μικρό μήκος βιοψίας (< 15 mm) και σε αυτούς με στάδιο ίνωσης F0-F2. Επιπλέον η US ελαστογραφία φάνηκε να υπερέχει των άλλων μη επεμβατικών βιοχημικών μεθόδων για τη διάγνωση προχωρημένης ίνωσης και κίρρωση (πίνακας 45). Ένα cutoff των 8,7 KPa έδινε NPV 89,3% προς αποκλεισμό F3, F4 ίνωσης, που δεν διαφοροποιείται από τη NPV που λάβαμε από άλλους προαναφερθέντες απλούς εργαστηριακούς δείκτες ηπατικής ίνωσης. Η υιοθέτηση της US ελαστογραφίας θα μπορούσε δυνητικά να οδηγήσει σε αποφυγή της βιοψίας ήπατος στα 2/3 των NAFLD ασθενών. Αντίθετα, όπως και στις άλλες μη επεμβατικές αιματολογικές μεθόδους πρόβλεψης ηπατικής ίνωσης, η PPV πρόβλεψης προχωρημένης ίνωσης παραμένει μέτρια στους NAFLD ασθενείς. Επομένως η κύρια αξία αυτών των δοκιμών είναι να αποκλείσουν την προχωρημένη ίνωση. Βιοψία ήπατος με βάση αυτή τη μελέτη θα πρέπει να κάνουν όλοι οι NAFLD ασθενείς με LMS 7,4 KPa. Σε μια άλλη μελέτη από τους Yoned et al σε 97 Ιάπωνες με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD (335) η ακρίβεια (AUC) του fibro scan έδινε τιμές: 0,87,0,90 και 0,99 για την πρόβλεψη F2, F3 και F4 σταδίου ίνωσης αντιστοίχως (πίνακας 46). Παρόμοια επίπεδα ακρίβειας της μεθόδου διαπιστώθηκαν από μια άλλη ιταλική μελέτη από τους Nobile et al (336) (πίνακας 46) που εκτίμησαν την ακρίβεια του Fibro scan σε 52 παιδιά που είχαν υποστεί βιοψία ήπατος και είχαν αποδεδειγμένα NAFLD. Η ακρίβεια της εξέτασης ήταν 0,977, 0,992 και 1 για την πρόβλεψη οποιουδήποτε ( F1), σημαντικού ( F2) και σοβαρού ( F3) σταδίου ίνωσης αντιστοίχως. Cutoffs < 5, < 7 και <9 KPa υποδήλωναν την απουσία F1, F2, F3 σταδίου ίνωσης αντιστοίχως. Τιμές cutoff 9 KPa συνδέονταν με την παρουσία F3, F4 ίνωσης (πίνακας 46) ενώ τιμές LSM μεταξύ 7-9 KPa συνδέονταν με την παρουσία σημαντικής F2 ίνωσης. Και σε αυτήν τη μελέτη φάνηκε ότι σε παιδιά και εφήβους με ΒΜΙ 30 Kg/m 2, το Fibro scan δεν δίνει εξίσου καλά αποτελέσματα πρόβλεψης της ιστολογικής κατάστασης ίνωσης του ήπατος. Οι ομοιότητες των τιμών LSMs cutoffs του Fibro scan σε ενήλικες και παιδιά, υποδηλώνουν ότι η διαγνωστική ακρίβεια του Fibro scan είναι ανεξάρτητη ηλικίας ασθενών. Μια πρόσφατη μελέτη από τη Γαλλία (337) που αξιολόγησε τα αποτελέσματα του Fibro scan σε περισσότερους από ασθενείς, κυρίως με χρόνιες ιογενείς ηπατίτιδες (ποσοστό < 4% είχαν NAFLD), έδειξε ότι ο μόνος ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου αποτυχίας της δοκιμασίας ήταν το ΒΜΙ> 28 Kg/m 2, ένα κοινό χαρακτηριστικό των NAFLD ασθενών. Μια άλλη μελέτη των Tomeno et al (338) του 2013 έδειξε ότι το Fibro scan δεν μπορεί να προβλέψει ικανοποιητικά την ιστολογική παρουσία ίνωσης σε NAFLD ασθενείς, ενώ μπορεί αξιόπιστα να προβλέψει το Staging της ίνωσης σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη σύγκρισης της κλινικής χρησιμότητας του Fibro scan, σαν ένας μη επεμβατικός 94 Σ ελίδα

99 δείκτης εκτίμησης της ηπατικής ίνωσης, ανάμεσα σε ασθενείς με χρόνια C ηπατίτιδα & NAFLD. Κάποιοι μπορούν να υποθέσουν ότι είτε η εναπόθεση λίπους στο ήπαρ, είτε Σ.Βάρους η (υπέρβαροι) μπορεί να αλληλεπιδρούν με τις μετρήσεις της ελαστογραφίας στο ήπαρ στη NAFLD. Σε κάθε περίπτωση US ελαστογραφία θα πρέπει να ερμηνεύεται με προσοχή στη NAFLD. Σε αυτό το πρόσφατο συμπέρασμα, της αναξιοπιστίας του Fibro scan σε NAFLD ασθενείς, είχαν καταλήξει λίγο ενωρίτερα (2010) και οι Castera et al (339). Συγκεκριμένα ο Castera και οι συνεργάτες του, σε μια μελέτη που σκοπό είχε να διευκρινίσει τη συχνότητα και τις αιτίες αποτυχίας και αναξιοπιστίας των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται κατά τη μέτρηση της ηπατικής ακαμψίας (LSMs) με Fibro scan σε χρόνιες ηπατικές νόσους, μελέτησε σε μια χρονική περίοδο μεγαλύτερη των 5 ετών εξετάσεις Fibro scan ( LSMs μετρήσεις). Αναξιόπιστα αποτελέσματα LSMs μετρήσεων (λιγότερες από 10 έγκυρες βολές / Fibro scan), ελήφθησαν σε ένα σύνολο Fibro scan (15,8% ασθενών). Οι παράγοντες που συσχετίσθηκαν με την αναξιοπιστία των αποτελεσμάτων φαίνεται να ήταν η εμπειρία του χειριστή (< 500 εξετάσεις), καθώς και χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου όπως: ΒΜΙ > 30 Kg/m 2, ηλικία 52 έτη, φύλο, αρτηριακή υπέρταση (ΑΠ > 130/85) και ΣΔ ΙΙ. Όταν το μεταβολικό σύνδρομο και η περίμετρος μέσης ελήφθησαν υπόψη, σε μια υποομάδα ασθενών, η περίμετρος μέσης ήταν ο πιο σημαντικός παράγοντας που καθόριζε την αναξιοπιστία και αποτυχία των LSMs αποτελεσμάτων. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι μετρήσεις ηπατικής ακαμψίας (LSMs) με Fibro scan ήταν μη ερμηνεύσιμες σε 1 στις 5 περιπτώσεις (19%). Κύρια αιτία της αποτυχίας φαίνεται να ήταν η παχυσαρκία, ιδιαίτερα η αυξημένη περίμετρος μέσης και η εμπειρία του χειριστή. Τα αποτελέσματα αυτά υπογράμμισαν την ανάγκη για τεχνολογικές βελτιώσεις του Fibro scan καθετήρα σε συγκεκριμένες πληθυσμιακές ομάδες ασθενών με χρόνια ηπατική νόσο όπως NAFLD ασθενείς. Πράγματι βρέθηκε ότι σε υπέρβαρα/παχύσαρκα άτομα ο πρωταρχικός Μ καθετήρας, που χρησιμοποιείτο για την πρόκληση παλμικού κύματος επιδερμικά στο Fibro scan, ήταν αναξιόπιστος για την ανίχνευση ηπατικής ίνωσης (337,339). Έτσι ένας νέος XL καθετήρας αναπτύχθηκε πρόσφατα και εκτιμήθηκε σε 2 μελέτες. Στην πρώτη μελέτη από τους Myers et al (340) 276 ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο διαφορετικής αιτιολογίας και ΒΜΙ 28 Kg/m 2 εκτιμήθηκαν με βιοψία ήπατος καθώς και με Fibro scan με τον πρωταρχικό Μ καθετήρα και με το νέο XL καθετήρα που ήταν ειδικός για παχύσαρκα / υπέρβαρα άτομα. Ο XL καθετήρας απέδειξε αξιόπιστες μετρήσεις της ηπατικής σκληρίας στο 73% (138/276) των ασθενών σε σύγκριση με το ότι μόνο το 50% (138/276) ασθενών με Μ καθετήρα είχαν αξιόπιστες μετρήσεις. Παρά την καλύτερη αξιοπιστία του XL καθετήρα στο σύνολο των 276 ασθενών της μελέτης, ο XL καθετήρας φάνηκε να παρέχει αξιόπιστες LSMs μετρήσεις σε 1 από τους 4 παχύσαρκους ασθενείς. Η αξιοπιστία της εξέτασης με XL καθετήρα έδινε ακρίβεια AUC: 0,90 και με Μ καθετήρα AUC: 0,87 προς διάκριση F3-F4 ίνωσης από F0-F2 ίνωση στους 75 NAFLD ασθενείς της μελέτης. Παρομοίως ένα ιδανικό cut off 7,8 KPa στους 75 NAFLD ασθενείς είχε Sense: 84%, Spec: 79%, PPV: 75%, NPV: 87% προς διάκριση F2-F4 ίνωση από F0-F1 με τον Μ καθετήρα, ενώ ένα ιδανικό cutoff 6,4 είχε Sense: 81%, Spec: 66%, PPV: 61% και NPV: 84% με τον XL καθετήρα. Η απόδοση της μεθόδου στο σύνολο των 276 ασθενών με ΒΜΙ 28 Kg/m 2 έδινε ακρίβεια (AUC) 0,88 με τον Μ καθετήρα και AUC: 0,91 με τον XL καθετήρα προς διάκριση F3-F4 ίνωσης από F0-F2 ίνωση (πίνακας46). Το τελικό συμπέρασμα αυτής της ενδιαφέρουσας μελέτης ήταν ότι US ελαστογραφία (Fibro scan) με XL καθετήρα διευκολύνει σε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό παχύσαρκων ατόμων από ότι ο πρωταρχικός Μ καθετήρας ενώ διατηρεί συγκρίσιμη ορθότητα. Τα στοιχεία της μελέτης προτείνουν ότι χαμηλότερα cutoffs ηπατικής σκληρίας είναι απαραίτητα όταν χρησιμοποιείται XL καθετήρας. Ωστόσο απαιτούνται μεγάλες πληθυσμιακές μελέτες προοπτικής, προσαρμοζόμενες για σημαντικές μεταβλητές που σχετίζονται με την αιτιολογία της ηπατικής νόσου και το ΒΜΙ, προς επικύρωση των βέλτιστων cutoffs. Παρόμοια μελέτη του 2012 από τους de Ledinghen et al (341) εκτίμησε την ακρίβεια του Fibro scan τόσο με Μ όσο και με XL καθετήρα προς πρόβλεψη του Staging ηπατικής ίνωσης σε 286 ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο. Και εδώ παρατηρήθηκε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των τιμών που έδιναν ο Μ και ο XL καθετήρας ανεξάρτητα του ΒΜΙ. Οι χρησιμοποιούμενες τιμές ιδανικών cutoffs ήταν σημαντικά μικρότερες όταν η εξέταση γινόταν με τον XL καθετήρα. Από την πολυπαραγοντική ανάλυση ανεπιτυχή αποτελέσματα μέτρησης της ηπατικής ακαμψίας (LSM) με Μ καθετήρα συσχετίσθηκαν ανεξάρτητα με ηλικία > 50 έτη και ΒΜΙ >30 Kg/m 2. Με μονοπαραγοντική ανάλυση μόνο ΒΜΙ > 30 Kg/m 2 συνδεόταν με ανεπιτυχή LSM με XL καθετήρα. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των καθετήρων Μ και XL για τη διάγνωση της ηπατικής ίνωσης. Επομένως η μέτρηση της ηπατικής σκληρίας είτε με Μ είτε με XL καθετήρα στο Fibro scan έχει παρόμοια αξιοπιστία. Στην κλινική πρακτική ο Μ καθετήρας θα 95 Σ ελίδα

100 μπορούσε να χρησιμοποιηθεί πρωταρχικά. Σε περίπτωση ανεπιτυχούς Fibro scan (< 10 επιτυχείς LSMs) θα μπορούσε κατόπιν να χρησιμοποιηθεί Fibro scan με XL καθετήρα ιδίως για άτομα με NAFLD και στους παχύσαρκους που υποψιαζόμαστε ηπατική ίνωση. Συμπερασματικά οι μέχρι τώρα μελέτες δείχνουν ότι σε άτομα που υποψιαζόμαστε NAFLD το Fibro scan είναι μια απεικονιστική δοκιμασία που μπορεί να αποκλείσει την F3, F4 προχωρημένη ίνωση τόσο με Μ όσο και με XL καθετήρα με παρόμοια ακρίβεια. Όμως, προς το παρόν το Fibro scan, όπως και οι άλλοι μη επεμβατικοί αιματολογικοί δείκτες, δεν μπορεί να αποτελεί εργαλείο της καθημερινής κλινικής πράξης για την πρόβλεψη ηπατικής ίνωσης. Ίσως ο συνδυασμός Fibro scan με XL καθετήρα, με μη επεμβατικούς βιοχημικούς αλγόριθμους να έχει καλύτερες διαγνωστικές επιδόσεις για το staging της ηπατικής ίνωσης σε NAFLD ασθενείς. ΠΙΝΑΚΑΣ 46 Πρόβλεψη NAFLD ίνωσης με Fibro scan Μελέτη Ν AUROC Cutoff Sense Spec PPV NPV Yoned et al (335) 97 F1 (0,881) F2 (0,876) F3 (0,914) F4 5,60 KPa 6,65 KPa 8,00 KPa 17,00 KPa 82,7% 81,8% 87,5% 100% 81,3% 91,2% 84,3% 98,4% 93,5% 90% 63,6% 83,3% 59,1% 87,8% 95,6% 100% (0,997) Wong et al (334) 246 F2 (0,84) F3 7,9 KPa 91% 75% 52% 97% (0,93) F4 (0,95) 10,3 KPa 92% 88% Nobil et al (336) 52 F1 5,1 KPa 97% 91% 97% 91% (0,977) F2 (0,992) 7,4 KPa 100% 92% 80% 100% F3 (1) 10,2 KPa 100% 100% 100% 100% Myers et al (340) 75 Μ καθετήρας F2,3,4/F0-2 (0,87) 7,8 KPa 84% 79% 75% 87% XL- καθετήρας F2,3,4/F0-1 (0,90) Lupsor et al(342) 72 F 2 (0,78) F 3 (0,98) Petta et al (343) 169 F 2 0,79) F 3 (0,87) 6,4 KPa 6,8 KPa 10,4 KPa 7,25 KPa 8,75 KPa 81% 67% 100% 69% 76% 66% 84% 97% 70% 78% 61% 69% 71% 67% 50% 84% 88% 100% 72% 92% 96 Σ ελίδα

101 MRE: Magnetic Resonance Elastography (Mαγνητική ελαστογραφία) Σε αντίθεση με το Fibro scan που εκτιμά την ηπατική ακαμψία ενός μικρού ηπατικού κλάσματος, η MRE υπολογίζει το μέσο βαθμό ηπατικής ίνωσης στο μεγαλύτερο μέρος του ηπατικού παρεγχύματος, αξιολογώντας τη διάδοση των κυμάτων διαμέσου του ιστού. Η συσκευή αποτελείται από έναν ενεργό οδηγό που βρίσκεται έξω από το δωμάτιο του μαγνήτη και δημιουργεί συνεχόμενες χαμηλής συχνότητας δονήσεις που μεταδίδονται μέσω ενός εύκαμπτου σωλήνα σε έναν παθητικό οδηγό που μοιάζει με τύμπανο και είναι προσκολλημένος σε άμεση επαφή με το δέρμα της περιοχής πάνω από το ήπαρ (Εικόνα 14). Μετά την αναγνώριση της περιοχής του ήπατος που μας ενδιαφέρει, τα κύματα που παράγονται στο ηπατικό παρέγχυμα λόγω των δονήσεων απεικονίζονται με τη μορφή εικόνων μαγνητικού συντονισμού. Αυτές οι εικόνες απεικονίζουν τα πολλαπλασιαζόμενα διανέμοντα κύματα και τέλος οι εικόνες των διανεμόντων κυμάτων αναλύονται και χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία ποσοτικών χαρτών της ηπατικής ακαμψίας του ιστού που αναφέρονται ως ελαστογραφήματα (elastograms) (4,11,15,344). Τα ελαστογραφήματα μετρούν την ηπατική σκληρία με KPas (Kilopascals) (Εικόνες 15,16) (345). Εικόνα 14 Περιγραφή λειτουργίας MRE απεικόνισης [ Mariappan YK Clin Anat. 2010;23(5): ](345). Εξωτερικό σύστημα οδήγησης (a) (ενεργός οδηγός/γεννήτρια) δημιουργεί συνεχόμενες χαμηλής συχνότητας δονήσεις που κατόπιν με (b) ηλεκτρομηχανικό οδηγό και (c) με οδηγούς που ενεργοποιούνται με πίεση και (d) ακουστική ενίσχυση, μεταδίδει τα κύματα των δονήσεων μέσω ενός εύκαμπτου σωλήνα σε ένα παθητικό οδηγό (passive driver) που είναι προσκολλημένος σε άμεση επαφή με το δέρμα πάνω από το ήπαρ. 97 Σ ελίδα

102 Εικόνα 15 Ανάλυση της μετατροπής των κυμάτων που λαμβάνονται από τον εξωτερικό οδηγό της MRE τεχνικής σε εικόνες μαγνητικής ελαστογραφίας. [Mariappan YK, Clin Anat. 2010;23(5): ](345). (a) MR μαγνητική εικόνα που περιλαμβάνει μία μαλακή (υπέρπυκνη περιοχή) και μία σκληρή υπόπυκνη περιοχή. (b) μία ενιαία εικόνα MRE προκαλούμενη από συχνότητα κύματος 100 Hz.Υπάρχει προφανής διαφορά στα μήκη κύματος/περιοχή ιστού.(c) ένα ελαστόγραμμα αποκτώμενο από MRE που απεικονίζει την άκαμπτη σκληρή περιοχή (κόκκινη) & την μαλακή περιοχή (μπλε) στον ιστό. Δεδομένου ότι μπορεί να προσδιορισθεί το σύνολο της ηπατικής αλληλουχίας, η περιοχή δειγματοληψίας αυξάνεται και η ανομοιογενής κατανομή της ίνωσης μπορεί να εκτιμηθεί πιο συχνά. Σε μια μελέτη από τους Huwat et al (346) η MRE έδωσε καλύτερα αποτελέσματα από το Fibro scan και τον δείκτη του λόγου AST/PLT (APRI score) σε 141 ασθενείς με χρόνια ηπατική νόσο διαφόρων αιτίων. Οι καμπύλες AUROCs, προς ορθή διάγνωση κάθε σταδίου ίνωσης, ήταν σημαντικά μεγαλύτερες για τη ΜRE απ ότι εκείνες του Fibro scan, APRI score και του συνδυασμού Fibro scan με APRI score. Η MRE έδινε AUC: 0,994 για F 2, 0,985 για F 3, 0,998 για F=4. H μελέτη συμπερασματικά έδειξε ότι η MRE έχει ένα υψηλότερο ποσοστό τεχνικής επιτυχίας από το Fibro scan και μεγαλύτερη ακρίβεια για την πρόβλεψη του staging ίνωσης σε σχέση με Fibro scan και APRI score. Σε ένα τριτοβάθμιο κέντρο στην Ασία, η MRE έδειξε να αυξάνει τη διαγνωστική αποτελεσματικότητά της με την του σταδίου ίνωσης σε μια ομάδα 60 ασθενών από τους οποίους οι 55 είχαν χρόνιες ασθένειες ήπατος / χοληφόρων (347). Σε ένα cutoff διατμητικής δυσκαμψίας της τάξεως των 3,5 ΚPa, η προβλεπόμενη Sense και Spec για διαφοροποίηση σταδίων ίνωσης (F 2 από F1) ήταν 89,7% και 87,1% αντιστοίχως. Εντυπωσιακό ήταν ότι η MRE ήταν σε θέση να διακρίνει ασθενείς με σοβαρή ίνωση (F3) από εκείνους με κίρρωση (F4) με Sense: 100%, Spec: 92,9% σε μία τιμή cutoff ακαμψίας: 5,32 KPa. Μάλλον ενδιαφέροντα είναι κάποια πρόσφατα ευρήματα που δείχνουν ότι η MRE είναι χρήσιμη στην αναγνώριση ασθενών με NASH ακόμα και πριν την έναρξη της ίνωσης (11). Σε αναδρομική μελέτη 58 ασθενών με NASH, η μέτρηση της ηπατικής ακαμψίας με MRE είχε υψηλή ακρίβεια στη διάκριση ασθενών με NASH από εκείνους με απλή στεάτωση (AUC: 0,93), Sense: 94%, Spec: 73% με cutoff τα 2,7 KPa. Ασθενείς με NASH χωρίς ίνωση έχουν μικρότερη ηπατική ελαστικότητα απ ότι αυτοί με απλό NAFL και μεγαλύτερη ηπατική ελαστικότητα απ ότι αυτοί με NASH-ίνωση(11). Παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα εξακολουθούν να υπάρχουν προβλήματα σε σχέση με τις MRE τεχνικές. Στα προβλήματα αυτά περιλαμβάνονται ο αυξημένος χρόνος απόκτησης της σάρωσης, το κόστος εξοπλισμού, η εμπειρία, η ανάλυση, καθώς και η ταυτοποίηση των ορίων (cutoffs) μέτρησης. Παρ όλα αυτά η MRE κρατά μια μεγάλη υπόσχεση σαν μία μη επεμβατική εναλλακτική λύση για τη βιοψία ήπατος προς σταδιοποίηση της ίνωσης στη NASH αλλά απαιτούνται περισσότερες μελέτες προς διευκρίνιση του ρόλου της MRE όσον αφορά τη διάκριση της απλής στεάτωσης από τη NASH. 98 Σ ελίδα

103 Εικόνα 16 Σχήμα μέσης ηπατικής ακαμψίας μετρούμενο με MRE(345)..Η συχνότητα του παλμικού κύματος είναι 60 Hz..Η ακαμψία σταδιακά με την εξέλιξη της ίνωσης..μια τιμή cut off των 2,93 KPa διαφοροποιεί το υγιές από το ινωτικό ήπαρ. 99 Σ ελίδα

104 Εικόνα 17 ΗΠΑΤΙΚΗ MRE(345) Οι εικόνες απεικονίζουν MRE εξέταση ενός φυσιολογικού ήπατος (Εικόνες: a, b, c) και ενός κιρρωτικού ήπατος (Εικόνες: d, e, f). Εικόνες συμβατικής MR δεν δείχνουν σημαντικές διαφορές στα δύο ήπατα (a, d), εικόνες MRE κυμάτων 60 Hz, έδειξαν διανέμοντα κύματα με ένα μικρού μήκους κύμα στον 1 ο ασθενή ( b) και ένα ουσιαστικά μεγαλύτερο κύμα στον 2 ο ασθενή (e). Μπορεί να φανεί ότι τα κύματα που μοιράζονται στο κιρρωτικό ήπαρ είναι μεγαλύτερα απ ότι αυτά του φυσιολογικού ήπατος. Η αντιστοιχία εκτιμώμενης ηπατικής σκληρίας φαίνεται στις εικόνες c και f και απεικονιστικά είναι εμφανής η ηπατική σκληρία του κιρρωτικού ήπατος (f). Όσο πιο σκληρό είναι το ήπαρ τόσο μεγαλύτερη η παρουσία των κυμάτων. Η μέτρηση της ηπατικής ακαμψίας με MRE έδειξε ότι το φυσιολογικό ήπαρ είχε MRE σκληρία: 1,7 KPa και το κιρρωτικό ήπαρ είχε MRE σκληρία: 18,83 KPa (f). ARFI: Acoustic Radiation forces Impulse (Aκουστική ακτινοβολία ενισχυμένων παλμών) Η ARFI απεικόνιση είναι μια νέα τεχνική που βασίζεται σε μια συσκευή που ερευνά τις ελαστικές ιδιότητες της περιοχής που μας ενδιαφέρει ενώ πραγματοποιεί σε πραγματικό χρόνο απεικόνιση B-mode. Ο ηπατικός ιστός στην ARFI ερεθίζεται μηχανικά με τη χρήση μικρής διάρκειας ηχητικών παλμών ισχύος 2,67 MHΖ. Ο ιστός κατόπιν παράγει με την κίνησή του κύματα των οποίων η ταχύτητα υπολογίζεται σε m/sec και είναι ανάλογη προς την ελαστικότητα του ιστού. Το πλεονέκτημα αυτής της συσκευής είναι ότι μπορεί να τοποθετηθεί ελεύθερα σε διαφορετικά βάθη και μέρη του ήπατος και έτσι μπορεί να αξιολογήσει μεγάλες περιοχές του ήπατος σε μία εξέταση (15). Επιπλέον η εξέταση δεν επηρεάζεται από το πάχος του λιπώδους ιστού ( υποδόριο λίπος) όπως συμβαίνει στην US ελαστογραφία (15). Υπάρχει μόνο μία μελέτη που αναλύει τη διαγνωστική απόδοση της ARFI απεικόνισης σε σύγκριση με το Fibro scan για την αξιολόγηση της ηπατικής ίνωσης σε έναν πληθυσμό ασθενών με NAFLD (348). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά κατά τη σύγκριση της ορθής απόδοσης της ακρίβειας (AUC) ανάμεσα σε Fibro scan με Μ ή XL καθετήρα και APRI απεικόνισης δεξιού και αριστερού ηπατικού λοβού για τη διάγνωση της σημαντικής ίνωσης (F2, F3, F4), σοβαρής ίνωσης (F3, F4) και κίρρωσης. Επιπλέον η συσχέτιση με τον ιστολογικό βαθμό της ηπατικής ίνωσης ήταν στατιστικά σημαντική για το Fibro scan αλλά όχι για την ARFI απεικόνιση. Οι πιθανοί περιορισμοί της APRI απεικόνισης είναι η ακριβής θέση και το βάθος των μετρήσεων καθώς και ο απαιτούμενος αριθμός μετρήσεων επειδή η μέθοδος δεν είναι 100 Σ ελίδα

105 τυποποιημένη. Επιπλέον οι παράμετροι που καθορίζουν την ARFI αποτυχία δεν έχουν ακόμα διερευνηθεί. Εκτός των άλλων η απεικόνιση ARFI έχει ένα πολύ στενό εύρος τιμών που χωρίζει τα cutoffs για F2, F3, F4 ίνωση και F4 κίρρωση και έτσι είναι λιγότερο ακριβής από το Fibro scan στην ανίχνευση σημαντικής ίνωσης (349). Τέλος η ARFI απεικόνιση δεν έχει ακόμα λάβει έγκριση από το FDA (Food and Drug Administration) στις Η.Π.Α. 101 Σ ελίδα

106 «Σύγχρονη τακτική» για τη διάγνωση των σταδίων της NAFLD ΒΗΜΑ 1 ο (Σχήμα Α) Επιβεβαίωση ύπαρξης NAFLD Επανάληψη εξετάσεων ελέγχου ηπατικής λειτουργίας (ALT > 30 > 18) Εμμονή των ανωτέρω τιμών ALT Έλεγχος ηπατικής παθολογίας (HBV, HCV ορολογικά Tests, Φερριτίνη ορού, κορεσμός τρανσφερρίνης, ηπατικά αυτοαντισώματα (ΑΜΑ, ASMA, ANA), άλφα-1 αντιθρυψίνη ορού, σερουλοπλασμίνη ορού < 40) + USS Έλεγχος Ηπατικής Παθολογίας ΘΕΤΙΚΟΣ (Πράξεις ανάλογα με τη διάγνωση) USS: UlraSound Scan AMA:Antimitochondrial Antibody ASMA:Anti-smooth muscle antibody ANA:Anti-nuclear antibody HBV:Hepatitis B virus HCV:Hepatitis C virus ALT:Alanine transaminase Έλεγχος Ηπατικής Παθολογίας ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ Φυσιολογικό USS ΑΙΤΙΑ? Έλεγχος Ηπατικής Παθολογίας ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ Λιπώδες ήπαρ στο USS NAFLD/NASH ΒΗΜΑ 2 Ο (Σχήμα Β) Σταδιοποίηση NAFLD (Εκτίμηση NASH και εκτίμηση ίνωσης) «Λιγότερο» επεμβατικά Ίνωση NASH Fibro scan NAFLD fibrosis score/bard score/ Fibro test/elf score/ Fibro Meter CK-18 NASH Test (Fibro Μax) USS-Levovist «Περισσότερο» επεμβατικά Ηπατική βιοψία Ηπατική βιοψία ELF panel : Enhanced Liver Fibrosis Panel, USS: UlraSound Scan, CK-18: Cytokeratin Σ ελίδα

107 ΣΧΗΜΑ Γ «Προτεινόμενος»αλγόριθμος για τη διαχείριση NAFLD ασθενών (4) ΒΗΜΑ 1 ο NAFLD ΕΠΙΒΕΒΑΙΩΣΗ (ΣΧΗΜΑ Α) ΒΗΜΑ 2 Ο Εκτίμηση ΙΝΩΣΗΣ NAFLD fibrosis score (NFS) -2,5-2,5 έως -1,455-1,455 έως 0,676 > 0,676 ΟΜΑΔΑ ΧΑΜΗΛΟΥ ΚΙΝΔΥΝΟΥ ΑΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ ΥΨΗΛΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ Καθησυχασμός επανάληψη NFS σε: ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ/ΕΠΙΠΛΕΟΝ ΕΡΕΥΝΑ ΜΕ ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΟΥΣ ΔΕΙΚΤΕΣ και fibro scan 3,5 έτη 1 έτος < 7,5 KPa 7,9-9,6 KPa > 9,6 KPa NAS (Non-Alcoholic Steatosis) ΑΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΤΟΣ ΚΙΝΔΥΝΟΣ για NASH - Υποψία ίνωσης F2 NASH -ίνωση F3 ΕΠΙΣΤΡΟΦΗ ΣΤΗΝ Α ΒΑΘΜΙΑ ΠΕΡΙΘΑΛΨΗ Σύσταση για Ηπατική βιοψία NAS NASH grading > 2 ή staging F2 ίνωση KPa:kilopascal Διαχείριση NASH ή NASH ίνωσης και παραγόντων κινδύνου 103 Σ ελίδα

108 ΣΧΗΜΑ Δ «Προτεινόμενος» αλγόριθμος για τη διαχείριση NAFLD ασθενών (15) Ανίχνευση Ηπατικής Στεάτωσης (Steato Test ή FLI & US κοιλίας Εκτίμηση παρουσίας Σημαντικής ( F2) ίνωσης με Fibro Meter score για NAFLD 0,611 Χαμηλός Κίνδυνος για F2 ίνωση (NPV: 92,1%) 0,612-0,714 Απροσδιόριστος κίνδυνος Επιβεβαίωση Διαγνωστικής υποψίας με Fibro scan 0,715 Υψηλός κίνδυνος για F2 ίνωση (PPV: 87,9%) Κατεύθυνση ασθενών στην Πρωτοβάθμια περίθαλψη & Follow-up < 7,9 KPa 7,9 9,6 KPa > 9,6 KPa Αποκλεισμός F2 ίνωσης (ΝPV: 97%) ΗΠΑΤΙΚΗ ΒΙΟΨΙΑ Επιβεβαίωση F2 ίνωσης (PPV: 72%) FLI: Fatty Liver Index US: UlraSound PPV:positive predictive value NPV:negative predictive value KPa:kilopascal Παρουσία ίνωσης F2 ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΑΣΘΕΝΩΝ ΓΙΑ ΕΙΔΙΚΗ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΤΗΣ NASH- ΙΝΩΣΗΣ 104 Σ ελίδα

109 Προς το παρόν δεν υπάρχουν τεκμηριωμένες κατευθυντήριες γραμμές για τη διαχείριση/σταδιοποίηση ενός ασθενούς με NAFLD. Κάποιοι προτεινόμενοι αλγόριθμοι για τη διαχείριση των ασθενών με NAFLD απεικονίζονται στα ΣΧΗΜΑΤΑ Γ & Δ. Αυτοί συνδυάζουν μη επεμβατικούς αλγόριθμους χαμηλού κόστους επιτρέποντας τη λεπτομερή εξέταση του ασθενούς, μη επεμβατικά, ώστε αφενός να μη γίνεται προσφυγή σε βιοψία ήπατος προς τακτική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και αφετέρου να είναι δυνατόν ένας μεγάλος αριθμός ασθενών με NAFLD να παρακολουθείται στην πρωτοβάθμια περίθαλψη με ένα αποδοτικό και αποτελεσματικό τρόπο χωρίς να υφίσταται αναίτια μια βιοψία ήπατος που έχει επικινδυνότητα και ανεβάζει το κόστος έναντι του αποτελέσματος. Στα ΣΧΗΜΑΤΑ Γ και Δ της διαχείρισης ασθενών με NAFLD, φαίνεται ότι ασθενείς με μια τιμή κάτω από το χαμηλότερο όριο cutoff έχουν έναν χαμηλό κίνδυνο για σημαντική ίνωση και συνακολουθούμενη εξελικτική ηπατική νόσο και μπορούν ασφαλώς να διαχειρισθούν στην πρωτοβάθμια περίθαλψη Παραπομπή σε εξειδικευμένη περίθαλψη ενδείκνυται εάν η εξέλιξη της νόσου είναι ύποπτη βάση κλινικών και εργαστηριακών παραμέτρων. Μία τιμή cutoff στο απροσδιόριστο εύρος ή παραπάνω χρήζει επιπλέον διερεύνηση με τη χρήση εναλλακτικών τρόπων όπως άλλους βιοχημικούς δείκτες ίνωσης [μονομερείς: ΗΑ ή συνδυαστικά μοντέλα : Fibro test] και απεικονιστικές εξετάσεις (fibro scan). Βιοψία ήπατος θα πρέπει να συστήνεται όταν και αυτές οι μη επεμβατικές δοκιμασίες έχουν απροσδιόριστο εύρος ή δεν είναι πειστικές. Η χρήση του fibro scan σε αυτούς τους αλγόριθμους, μπορεί αργότερα να αντικατασταθεί από άλλους ορολογικούς συνδυαστικούς πίνακες όπως το ELF panel ή ακόμα και από άλλες απεικονιστικές τεχνικές (MRE, ARFI κ.λπ.). 105 Σ ελίδα

110 ΣΧΗΜΑ Ε Αλγόριθμος «Σχεδιάζοντας» τη διάγνωση NAFLD/NASH ΔΙΑΓΝΩΣΗ Υποψήφιοι Ασθενείς: Παχύσαρκοι ασθενείς Διαβητικοί ασθενείς Ασθενείς με χαρακτηριστικά Μεταβολικού Συνδρόμου ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟ ΗΠΑΡ NAFLD ΣΤΑΔΙΟΠΟΙΗΣΗ Mη επεμβατική: NFS: αποκλεισμός προχωρημένης ίνωσης Fibro Meter: επιβεβαίωση προχωρημένης ίνωσης Fibro scan: καθορισμός σταδίου ίνωσης Βήματα για Διάγνωση: Έλεγχος για δευτεροπαθείς αιτίες NAFLD Εξετάσεις ηπατικής λειτουργίας: ALT, AST, αναλογία ALT/AST US ήπατος ή FLI NASH/NASH-ίνωση Επεμβατική: Ηπατική βιοψία: ο «χρυσούς κανών» προς καθορισμό του σταδίου ηπατικής ίνωσης NFS:NAFLD fibrosis score FLI: Fatty Liver Index US: UlraSound ALT:Alanine transaminase AST:aspartate aminotransferase 106 Σ ελίδα

111 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο Διαχείριση ασθενούς με NAFLD Ο στόχος στη διαχείριση NAFLD ασθενών με NAFLD είναι να βελτιωθεί η στεάτωση και να γίνει πρόληψη της ίνωσης. Προς το παρόν δεν υπάρχει τυπική θεραπεία ωστόσο προσπάθεια πρόληψης και θεραπείας των παραγόντων κινδύνου όπως είναι η παχυσαρκία και η αντίσταση στην ινσουλίνη (IR), παραμένει το επίκεντρο της διαχείρισης των ασθενών με NAFLD. Επί του παρόντος εφαρμόζονται παρεμβάσεις βελτίωσης του τρόπου ζωής, ιατρικές θεραπείες, εναλλακτικές θεραπείες και χειρουργικές παρεμβάσεις προς μείωση των παραγόντων κινδύνου που συνδέονται με NAFLD (350). Παρεμβάσεις στον τρόπο ζωής Όπως έχει προαναφερθεί, η παχυσαρκία και η IR (insulin resistance) αυξάνουν τον κίνδυνο ανάπτυξης NAFLD και είναι καθοριστικές στην εξέλιξη της NAFLD. Στη σημερινή κοινωνία η παχυσαρκία και η IR έχουν συνδεθεί με κακές διατροφικές επιλογές όπως και με καθιστικό τρόπο ζωής. Διαχείριση του βάρους, μέσω βελτίωσης της διατροφής και αύξησης της σωματικής άσκησης, μπορεί να βοηθήσουν στη βελτίωση της ηπατικής ιστολογίας καθώς και στην επιβράδυνση της εξέλιξης της νόσου (Πίνακας47). Οι ασθενείς με NAFLD φαίνεται να έχουν μια αυξημένη πρόσληψη ενέργειας σε σχέση με τα υγιή άτομα (351). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η απώλεια βάρους πετυχαίνει τη βελτίωση των ηπατικών ενζύμων, αυξάνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη, μειώνει την ιστολογική ηπατική φλεγμονή ( ). Σε μια τυχαιοποιημένη ελεγχόμενη μελέτη ο Promrat et al (352) χρησιμοποίησαν έναν συνδυασμό δίαιτας, φυσικής δραστηριότητας και τροποποίησης του τρόπου ζωής με στόχο να προκαλέσουν 7-10% απώλεια σωματικού βάρους (ΣΒ) σε παχύσαρκους ασθενείς με NASH. Εκείνοι που πέτυχαν τουλάχιστον 7% απώλεια ΣΒ παρουσίασαν βελτίωση της ηπατικής ιστολογίας. Μια παρόμοια μελέτη χρησιμοποίησε NAFLD ασθενείς με αυξημένα ηπατικά ένζυμα και κεντρικού τύπου παχυσαρκία προς εκτίμηση της αποτελεσματικότητας των παρεμβάσεων στον τρόπο ζωής. Οι ασθενείς τυχαιοποιήθηκαν είτε σε χαμηλή (3 συνεδρίες/4 εβδομάδες) ή μέτρια (6 συνεδρίες/10 εβδομάδες) φυσική δραστηριότητα και συγκρίθηκαν με την ομάδα ελέγχου. Οι παρεμβάσεις που περιλαμβάνοντα στον τρόπο ζωής, εκτός από τη φυσική δραστηριότητα, ήταν οι διατροφικές συνήθειες και η αλλαγή της συμπεριφοράς. Οι St George et al (357) διαπίστωσαν ότι υπήρχε μια μείωση των ηπατικών ενζύμων που ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα μέτριας φυσικής δραστηριότητας σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Πίνακας47). Μόνη η σωματική δραστηριότητα έχει βρεθεί ότι μειώνει την ηπατική στεάτωση ανεξάρτητα από την ελάττωση ΣΒ. Μια μελέτη εξέτασε της επίδρασης των επίμονων φυσικών ασκήσεων επί των επιπέδων των ηπατικών λιπιδίων. O Hallsworth et al (358) διαπίστωσαν ότι μετά από 8 εβδομάδες (3 φορές / εβδομάδα/45-60 εμμένουσας σωματικής δραστηριότητας) υπήρξε μείωση των επιπέδων των ηπατικών λιπιδίων και βελτίωση της οξείδωσης των λιπιδίων του υποστρώματος, έλεγχος γλυκόζης ορού και μείωση της IR (Πίνακας 47). Τα επίπεδα ηπατικών λιπιδίων μετρήθηκαν με MRS (Magnetic Resonance Spectroscopy:Μαγνητική φασματομετρία) και η IR με τη μέθοδο HOMA-IR. Η οξείδωση των λιπιδίων μετρήθηκε με μια μέθοδο ανάλυσης των αερίων του εκπνεόμενου αέρα μέσω μιας μάσκας Hans Rudolf (αναπνευστικό πηλίκο καταναλωθέντος Ο 2 / αποβαλλόμενο CO2). Μια έρευνα που έγινε από τους Thoma et al (353) ανέλυσε 23 μελέτες που χρησιμοποιούν την τροποποίηση της διατροφής ή τη σωματική άσκηση ή και τα δύο μαζί. Διαπιστώθηκε ότι η τροποποίηση του τρόπου ζωής που οδηγεί ΣΒ, σε καθώς και η σωματικής δραστηριότητας, περιορίζει σημαντικά την ηπατική συγκέντρωση λίπους και βελτιώνει την IR. Συνολικά από τα αποτελέσματα των μέχρι τώρα ερευνών, φαίνεται ότι η τροποποίηση της καθημερινότητας (αύξηση σωματικής άσκησης & δίαιτα) καταλήγει σε: ΣΒ, μείωση στις τιμές ηπατικών ενζύμων στον ορό, μείωση της ηπατική ιστολογικής φλεγμονής, έλεγχο της γλυκόζης ορού, αύξηση της ευαισθησίας της ινσουλίνης και τέλος σε περιορισμό της λιπιδιακής ηπατικής οξείδωσης. 107 Σ ελίδα

112 Επομένως κατά την ανάπτυξη ενός σχεδίου θεραπείας σε NAFLD ασθενείς, η αλλαγή του τρόπου ζωής πρέπει να χρησιμοποιείται ως το πρώτο βήμα στην κλινική πρακτική. Ιατρικές θεραπείες Παρεμβάσεις στον τρόπο ζωής μπορεί να μην είναι αποτελεσματικές σε κάποιες περιπτώσεις και έτσι άλλες θεραπευτικές προσεγγίσεις θα πρέπει να εφαρμόζονται (Πίνακας 48).Η φαρμακολογική θεραπεία έχει ειδικά μελετηθεί στον NAFLD πληθυσμό. Ειδικά παράγοντες που αυξάνουν την ευαισθησία στην ινσουλίνη. Δυο παράγοντες που ευαισθητοποιούν την ινσουλίνη: Μετφορμίνη και θειαζολιδιναιδιόνες (TZD) έχουν ερευνηθεί ειδικά σε αυτόν τον πληθυσμό ωστόσο υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Επιπλέον η βιταμίνη Ε έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία της NAFLD καθώς αναστέλλει το οξειδωτικό στρες και μειώνει την προαγωγή της ηπατικής ίνωσης (359). Η ΜΕΤΦΟΡΜΙΝΗ χρησιμοποιείται στη θεραπεία για το ΣΔ ΙΙ καθώς μειώνει τη γλυκόζη αίματος με μείωση της γλυκονεογένεσης στο ήπαρ όπως και με μείωση της εντερικής απορρόφησης γλυκόζης, διέγερση της πρόσληψης γλυκόζης από τους μυς και αύξηση της οξείδωσης των λιπαρών οξέων, καταλήγοντας σε βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη ( ). Κλινικές μελέτες έχουν διερευνήσει τη χρήση της μετφορμίνης στη θεραπεία της NAFLD ειδικά εξετάζοντας την ηπατική ιστολογία και τις αμινοτρανσφεράσες ορού. Οι Nair et al (363) διεξήγαγαν μια πιλοτική μελέτη προς διερεύνηση της αποτελεσματικότητας και ασφάλειας της μετφορμίνης στη NAFLD. Ασθενείς ελάμβαναν 20 mg/kg/ημέρα μετφορμίνη για ένα έτος και συγκρίθηκε η ηπατική ιστολογία πριν και μετά τη θεραπεία. Τρεις μήνες μετά την έναρξη της θεραπείας οι τιμές αμινοτρανσφερασών ορού μειώθηκαν πράγμα που συσχετιζόταν με βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη. Ωστόσο αυτή η βελτίωση δεν διατηρήθηκε για όλη τη διάρκεια της θεραπείας (Πίνακας 48). Επόμενος ο Nair και οι συνεργάτες του κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η μετφορμίνη δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της NAFLD. Πιο πρόσφατα μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε σε παιδιά με NAFLD, χρησιμοποίησε αλλαγή του τρόπο ζωής τους σε συνδυασμό με μετφορμίνη (1,5 gr/ημέρα για 1 χρόνο) προς καθορισμό της επίδρασης στα ηπατικά ένζυμα. Οι Nobili et al (364) διαπίστωσαν ότι η μετφορμίνη δεν είναι περισσότερο αποτελεσματική απ ότι η μεταβολή του τρόπου ζωής προς βελτίωση των ηπατικών ενζύμων και της ηπατικής ιστολογίας (Πίνακας 48). Επιπλέον άλλες μελέτες έχουν επίσης αποτύχει να αποδείξουν τα οφέλη από τη χρήση μετφορμίνης για τη βελτίωση της ηπατικής ιστολογίας (350,365). Εν κατακλείδι, η μετφορμίνη δεν πρέπει να χρησιμοποιείται στη θεραπεία της NAFLD καθώς η έρευνα έχει δείξει ότι είναι αναποτελεσματική στη διαχείριση της NAFLD. TZDs:Thiazolidinediones (Θειαζολιδιναιδιόνες). Είναι μια ομάδα ουσιών που δρουν ως αγωνιστές των PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) και έτσι βελτιώνουν σημαντικά την ευαισθησία της ινσουλίνης και το μεταβολισμό της γλυκόζης και των λιπιδίων, ενώ διαθέτουν επίσης αντιφλεγμονώδη και αντιϊνωτική δράση. Χρησιμοποιούνται κυρίως στον ΣΔ ΙΙ επειδή βελτιώνουν την ευαισθησία της ινσουλίνης στο ήπαρ, τους μύες και το λιπώδη ιστό, προωθούν την ηπατική οξείδωση λιπαρών οξέων και μειώνουν την ηπατική λιπονεογένεση (286,419). Οι TΖDs χρησιμοποιούνται σε ασθενείς με NAFLD. Ειδικά τα αποτελέσματα της πιογλιταζόνης και η ροσιγλιταζόνη έχουν αποδείξει ότι μειώνουν το ηπατικό λίπος και την κυτταρική βλάβη ωστόσο αυτά τα φάρμακα έχουν δείξει ότι ευθύνονται για αύξηση του ΣΒ (366,367). Οι Ratziu et al (368) μελέτησαν τη θεραπεία και την ασφάλεια της ροσιγλιταζόνης σε ασθενείς με NASH. Η ομάδα θεραπείας έλαβε 4 mg/ημέρα για τον πρώτο μήνα και στη συνέχεια 8 mg/ημέρα για 11 μήνες. Βρέθηκε ότι η ροσιγλιταζόνη βελτιώνει μόνο τη στεάτωση και τα επίπεδα ALT, AST ορού και οδηγεί σε αύξηση Σ.Βάρους (μέση αύξηση ΣΒ: 1,5 Κg) (Πίνακας48) Οι Berfort et al (369) μελέτησαν τις επιπτώσεις μιας υποθερμιδικής δίαιτας (500 Kcal μείωση) σε συνδυασμό με χορήγηση 45 mg πιογλιταζόνης/ημέρα σε 47 NASH ασθενείς με παθολογική ανοχή γλυκόζης ή ΣΔ ΙΙ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός δίαιτας με πιογλιταζόνη βελτιώνει το γλυκαιμικό προφίλ, την ανοχή γλυκόζης, τις τιμές αμινοτρανσφερασών ορού και αυξάνει την ηπατική ευαισθησία στην ινσουλίνη (Πίνακας 48). Αντίθετα οι Lutchman et al (370) έδειξαν ότι η διακοπή της θεραπείας με πιογλιταζόνη, σε NASH ασθενείς, οδηγεί σε υποτροπή της νόσου υποδεικνύοντας ότι η μακροχρόνια χρήση είναι 108 Σ ελίδα

113 απαραίτητη για επιτυχή θεραπεία (Πίνακας 48). Επιπλέον η μακροχρόνια χρήση TZDs μπορεί να οδηγήσει σε ιατρικές επιπλοκές όπως οίδημα, συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, οστεοπόρωση και αύξηση του σωματικού βάρους (370,371). Συνολικά η πιογλιταζόνη χρησιμοποιείται στην ιατρική κοινότητα ως θεραπεία στη NASH ωστόσο προσεκτική εξέταση είναι απαραίτητη κατά τη συνταγογράφηση της φαρμακευτικής θεραπείας. Η βιταμίνη Ε είναι ένα αντιοξειδωτικό που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της NAFLD χάρη στη δυνατότητά της να αναστέλλει το οξειδωτικό στρες. Οι αντιοξειδωτικές δυνατότητες της βιταμίνης Ε προκύπτουν από την ευκολία να χορηγεί υδρογόνο (Η 2 ) που αδρανοποιεί τις ελεύθερες ρίζες και προλαβαίνει την υπεροξείδωση του λίπους (350). Αρκετές μελέτες έχουν διεξαχθεί για την περαιτέρω ανάλυση των οφελών από τη χορήγηση υψηλών δόσεων βιταμίνης Ε στους ασθενείς με NASH. Μια αξιοσημείωτη μελέτη είναι η PIVENS κλινική δοκιμή, όπου δόθηκαν υψηλές δόσεις βιταμίνης Ε (800 U/ημέρα για 96 ημέρες), σε μη διαβητικούς ασθενείς (372). Οι Sanyal et al διαπίστωσαν μια μείωση της ηπατικής φλεγμονής και στεάτωσης καθώς και βελτίωση της ηπατικής λειτουργίας (αμινοτρανσφεράσες ορού) (Πίνακας 48). Έτσι κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η βιταμίνη Ε είναι μια αποτελεσματική θεραπεία για ασθενείς με NASH χωρίς ΣΔ ΙΙ. Οι Harrison et al (373) ερεύνησαν επίσης τα αποτελέσματα ενός συνδυασμού βιταμίνη Ε (1000IU/ημέρα) και βιταμίνης C (1000 mg/ημέρα) όσον αφορά την ηπατική ιστολογία σε 45 NASH ασθενείς για μια χρονική περίοδο πέραν των 6 μηνών. Τα ευρήματα έδειξαν ότι ο συνδυασμός βιταμινών Ε και C ήταν αποτελεσματικός στη βελτίωση βαθμολογικών scores ίνωσης αν και δεν αναφέρεται καμία βελτίωση στη φλεγμονή και στις δοκιμασίες ηπατικής λειτουργίας (Πίνακας 48) (Μελετήθηκε το ιστολογικό score ίνωσης σύμφωνα με τους Brunt et al Am. J. Gastroenterol 1999; 94: και για την φλεγμονή τα τροποποιημένα κατά Brunt κριτήρια των Kleiner s et al: Hepatology 2005). Προσοχή πρέπει να ληφθεί όταν συνταγογραφείται βιταμίνη Ε καθώς μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει πιθανή βλάβη για τους ασθενείς. Μια μετα-ανάλυση ατόμων, που έλαβαν βιταμίνη Ε 400 IU/ημέρα, διαπίστωσε ότι υπάρχει μια αύξηση όλων των αιτιών θνησιμότητας και έτσι η χρήση της θα πρέπει να αποφεύγεται (374). Επιπλέον μια μελέτη που διεξήχθη από τους Klein et al (375) εξέτασε τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις της βιταμίνης Ε (400 IU/ημέρα). Η μελέτη διαπίστωσε ότι τα συμπληρώματα βιταμίνης E αυξάνουν σημαντικά τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη στους άνδρες που ήταν υγιής. Συνολική προσοχή χρειάζεται κατά τη συνταγογράφηση βιταμίνης Ε, ιδιαίτερα σε διαβητικούς με NASH, καθώς δεν υπάρχει καμία έρευνα που να υποστηρίζει αυτή τη στιγμή ότι η χορήγηση βιταμίνης Ε είναι φάρμακο επιλογής για τους NAFLD ασθενείς. Επομένως TZDs και βιταμίνης Ε θα πρέπει να εξετάζονται προσεκτικά όταν αναπτύσσεται ένα σχέδιο θεραπείας για τους ασθενείς με NAFLD/NASH. Άλλες θεραπείες Λόγω της αύξησης των περιπτώσεων NAFLD έχουν ερευνηθεί και άλλες θεραπείες και χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική όπως το Αρκτοδεοξυχολικό οξύ (Ursodeoxycholic acid: UDCA), ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (omega-3 polyunsaturated acids: N-3PUFAs), στατίνες και πρέ και προβιοτικά. Αυτές οι θεραπείες στοχεύουν στους παράγοντες κινδύνου της NAFLD, όπως η παχυσαρκία, δυσλιπιδαιμία, καρδιαγγειακή νόσος, IR (insulin resistance) και εντερική μικροχλωρίδα (Intestinal microbiotica: IM). Το UDCA (Αρκτοδεοξυχολικό οξύ) έχει μελετηθεί σε κλινικές δοκιμές για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητά του σε NAFLD πληθυσμούς. Το UDCA είναι ένα φυσικό δευτερογενές χολικό οξύ που έχει εγκριθεί σαν θεραπεία εκλογής σε ασθενείς με PBC (Primary biliary cirrhosis:πρωτοπαθή χολική κίρρωση) με πολύ καλά αποτελέσματα και χωρίς ιδιαίτερες παρενέργειες. Είναι ένας κυτταροπροστατευτικός παράγοντας, που ασκεί δράση μέσω της προστασίας και πρόληψης των βλαβών στις μεμβράνες. Δρα μειώνοντας το ποσοστό των υδρόφοβων χολικών οξέων που συμβάλλουν στο οξειδωτικό στρες (376). Έχει χρησιμοποιηθεί 109 Σ ελίδα

114 σε κλινικές δοκιμές για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητά του για τη θεραπεία ασθενών με NAFLD/NASH (376). Μια τυχαιοποιημένη διπλή-τυφλή μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας UDCA (10 mg/kg/ημέρα) σε παχύσαρκους NAFLD ασθενείς για μια χρονική περίοδο > 3 μηνών (377). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι UDCA ήταν σε θέση να ελαττώσει τα επίπεδα ηπατικών ενζύμων στον ορό αν και δεν υπήρχαν επιδράσεις στην περιεκτικότητα του λίπους στο ήπαρ όπως αυτή μετρήθηκε με CT κοιλίας. Οι Lindor et al (376) πραγματοποίησαν μια μεγάλη τυχαιοποιημένη δοκιμή χρησιμοποιώντας UDCA (13-15 mg/kg/ημέρα) σε NASH διαγνωσμένους ασθενείς και βρήκαν ότι δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές ανάμεσα στο placebo και στην ομάδα UDCA. Το UDCA δεν συνιστάται για τη θεραπεία της NAFLD. Ν-3PUFAs (ωμέγα-3 λιπαρά οξέα) έχουν χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία της υπερλιπιδαιμίας και την καρδιαγγειακή νόσο και πιο πρόσφατα στη θεραπεία της NAFLD (378). Μελέτες έχουν αναδείξει τη συσχέτιση μεταξύ IR (insulin resistance) και αλλαγές στα λιπαρά οξέα, ειδικά μια ανεπάρκεια σε Ν-3PUFAs.Οι Capanni et al (379) ερεύνησαν τις επιπτώσεις των N-3PUFAs συμπληρωμάτων (1gr/ημέρα για 12 μήνες) σε 56 NAFLD ασθενείς. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ν-3PUFAs βελτιώνουν τις βιοχημικές πτυχές της NAFLD καθώς επίσης και την ηπατική στεάτωση. Ομοίως σε μια βιβλιογραφική ανασκόπηση που έγινε από τους Masterton et al (378) φάνηκε ότι σε μελέτες σε ζώα τα N-3PUFAs περιορίζουν την ηπατική στεάτωση, βελτιώνουν την ευαισθησία της ινσουλίνης και τους βιοχημικούς δείκτες φλεγμονής. Ανθρώπινες μελέτες έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα. Οι Masterton et al συμπέραναν ότι τα Ν-3 PUFA είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση σε NAFLD ασθενείς. Οι στατίνες που χρησιμοποιούνται στον ιατρικό τομέα για τη διαχείριση της δυσλιπιδαιμίας, συνήθως σε καρδιαγγειακούς ασθενείς, έχουν δοκιμασθεί στη NAFLD. Ασθενείς με NAFLD συχνά έχουν δυσλιπιδαιμία μαζί με άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου (380). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η χρήση στατίνων σε NAFLD ασθενείς με δυσλιπιδαιμία, μπορεί να βελτιώσει τις δοκιμασίες ηπατικής λειτουργίας καθώς επίσης και τη στεάτωση ( ). Επιπλέον αυτές οι μελέτες διαπίστωσαν ότι η χρήση στατίνων σπάνια προκαλεί ηπατική βλάβη και ότι οι στατίνες είναι ασφαλείς για χρήση σε NAFLD ασθενείς με δυσλιπιδαιμία. Ωστόσο υπάρχει μια έλλειψη στοιχείων όσον αφορά τη χρήση στατίνων σε NAFLD ασθενείς χωρίς δυσλιπιδαιμία (385). Η χρήση στατίνης θα πρέπει να εξετάζεται για NAFLD/NASH ασθενείς με δυσλιπιδαιμία, αλλά αυτή τη στιγμή δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται για την ειδική μεταχείριση των NAFLD/NASH ασθενών. Εντερική χλωρίδα (Intestinal microbiota: IM). Έχει φανεί ότι η εντερική χλωρίδα (ΙΜ) είναι ευεργετική για την υγεία του ανθρώπου. Έρευνες έχουν δείξει ότι η ΙΜ ρυθμίζει την ενεργειακή ομοιόσταση και την έκτοπη εναπόθεση λίπους (386) που συσχετίζεται με μεταβολικές νόσους. Επειδή η NAFLD συσχετίζεται με το μεταβολικό σύνδρομο, η ΙΜ υπήρξε το επίκεντρο του ενδιαφέροντος πρόσφατης έρευνας για πρε και προβιοτικά στη θεραπεία της NAFLD. Τα πρεβιοτικά είναι άπεπτοι υδατάνθρακες που διεγείρουν την ανάπτυξη και ενεργοποίηση βακτηρίων στο παχύ έντερο (387). Η πλειοψηφία των ερευνών έχει γίνει χρησιμοποιώντας ποντίκια-μοντέλα. Ωστόσο έχει γίνει ένας περιορισμένος αριθμός από κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους. Ο Parnell et al (387) διεξήγανε μια τυχαιοποιημένη διπλή - τυφλή μελέτη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο, με σκοπό να εξετάσουν τις επιπτώσεις της ολιγοφρουκτόζης (oligofructose) (21gr/ημέρα για 12 εβδομάδες) σε 48 παχύσαρκους (ΒΜΙ 30 Kg/m 2 ) και υπέρβαρους (ΒΜΙ 25 Kg/m 2 ) ενήλικες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ολιγοφρουκτόζη προάγει την απώλεια βάρους και βελτιώνει τη ρύθμιση της γλυκόζης (μεταβολισμός γλυκόζης). Ο Daubioul et al (388) χρησιμοποίησαν επίσης ολιγοφρουκτόζη (16 gr/ημέρα για 8 εβδομάδες) σε μια τυχαιοποιημένη διπλή-τυφλή crossover μελέτη και ερεύνησαν τις επιπτώσεις της ολιγοφρουκτόζης επί του μεταβολισμού της γλυκόζης και των λιπιδίων σε 7 ασθενείς με NASH. Σε σύγκριση με το εικονικό φάρμακο AST και ALT μειώθηκαν μετά τις 8 εβδομάδες και 110 Σ ελίδα

115 τα επίπεδα ινσουλίνης μετά από 4 εβδομάδες. Έτσι υποστήριξαν τη χρήση πρεβιοτικών στη θεραπευτική διαχείριση ηπατικής νόσου. Υπάρχει μεγάλη ανάγκη για μελέτες αξιολόγησης της χρήσης πρεβιοτικών σε ασθενείς με ιστολογικά πολύ προχωρημένη NAFLD. Τα προβιοτικά (ζώντες μικροοργανισμοί) έχει φανεί να βελτιώνουν τα ηπατικά ένζυμα και την ηπατική ιστολογία σε NAFLD ασθενείς (146). Μια ανοιχτή πιλοτική μελέτη που διεξήχθη από τους Loguercio et al (181) χρησιμοποίησε το προβιοτικό VSL#3 [περιέχει 450 δισεκατομμύρια βακτήρια σε διαφορετικές ποικιλίες (στελέχη)] για 3 μήνες. Αυτή η μελέτη είχε 78 συμμετέχοντες εκ των οποίων 22 είχαν βιοψία με αποδεδειγμένη NAFLD. Στην ομάδα NAFLD τα επίπεδα ALT, AST πλάσματος και οι δείκτες λιπιδιακής υπεροξείδωσης (malondialdehyde και 4- hydroxynonenal) βελτιώθηκαν. Μια άλλη μελέτη που χρησιμοποίησε το ίδιο προβιοτικό, βρήκε ότι το VSL#3 δεν είχε ωφέλιμες επιδράσεις επί ηπατικής νόσου (389). Ο Solga et al (389) μελέτησαν την επίδραση του VSL#3 σε 4 NAFLD ενήλικες σε μια ανοιχτή πιλοτική μελέτη για μια χρονική περίοδο > 4 μήνες. Και τα 4 άτομα είχαν σημαντική αύξηση της περιεκτικότητας του ήπατος σε λίπος και δεν παρουσίαζαν σημαντικές διαφορές σε βιοχημικές και κλινικές παραμέτρους. Όπως τόνισαν και οι ίδιοι οι ερευνητές, ο μικρός αριθμός ασθενών του δείγματος ήταν ένας σημαντικός περιορισμός για την εξαγωγή συμπερασμάτων. Μια άλλη μελέτη χρησιμοποιώντας μια άλλη διπλή τυφλή κλινική δοκιμή, αξιολόγησε τα αποτελέσματα ενός διαφορετικού προβιοτικού (390). Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τις επιδράσεις του Lactobacillu: bulgarius και του Lactobacillu Streptococcus thermopholus (1 tabl/ημέρα) σε 28 NAFLD ασθενείς σε χορήγηση πέραν των 3 μηνών. Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση ALT, AST, γgt. Πρε και προβιοτικά φαίνεται να είναι χρήσιμα στον πληθυσμό NAFLD ασθενών. Υπάρχει ανάγκη μεγαλύτερων κλινικών δοκιμών προς καθορισμό της ιδανικής δόσης αυτών των σκευασμάτων. Βαριατρική χειρουργική επέμβαση Η παχυσαρκία βρίσκεται σε άνοδο στη σημερινή κοινωνία αυξάνοντας το «φόρτο» της υγειονομικής περίθαλψης. Όπως έχουμε προαναφέρει, η παχυσαρκία συνδέεται με το μεταβολικό σύνδρομο, καρδιαγγειακή νόσο, IR (insulin resistance) και ΣΔ2, καταλήγοντας σε ένα αυξημένο κίνδυνο αύξησης της συχνότητας NAFLD. Η NAFLD είναι πολύ συχνή σε άτομα με νοσογόνο παχυσαρκία (BMI 35 Kg/m 2 ). Στην πραγματικότητα ο επιπολασμός της NAFLD σε αυτήν την ομάδα πληθυσμού μπορεί να φθάσει μεταξύ % (102). Βαριατρική χειρουργική πράξη προκαλεί απώλεια βάρους περιορίζοντας το μέγεθος του στομάχου του ασθενούς είτε με τη χρήση γαστρικών δακτυλίων είτε με γαστρική παράκαμψη (by gastric bypass) (391) και γίνεται σε ασθενείς με ΒΜΙ > 40 Kg/m 2 και με ΒΜΙ > 35 Kg/m 2 που έχουν παχυσαρκία και συνοδά νοσήματα (392). Αναδρομικές και προοπτικές μελέτες έχουν δείξει ότι η χειρουργική επέμβαση βελτιώνει την IR, τη στεάτωση και την ιστολογική φλεγμονή (393,394). Κάποιοι ερευνητές διαπίστωσαν ότι μακροπρόθεσμα (χρόνια μετά το βαριατρικό χειρουργείο) υποστρέφει και η ίνωση (395). Ωστόσο μια πρόσφατη ανασκόπηση Cochrane, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα λόγω έλλειψης καλά σχεδιασμένων τυχαιοποιημένων μελετών ή δοκιμών προς καθορισμό εάν η βαριατρική χειρουργική επέμβαση είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία της NAFLD (396). Συνολικά η χρησιμότητα της βαριατρικής χειρουργικής επέμβασης για τις Txs της NAFLD και ιδιαίτερα για τη φλεγμονή και ίνωση δεν είναι σαφής και πρέπει να διεξαχθούν μελλοντικές καλά σχεδιασμένες μελέτες. Συμπερασματικά: Η αύξηση της NAFLD έχει και θα συνεχίσει να επιβαρύνει το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης κάθε χώρας ιδίως λόγω της σύνδεσής της με την παχυσαρκία, IR και το μεταβολικό σύνδρομο. Επί του παρόντος οι συνεχείς νέες πληροφορίες που έρχονται, στην προσπάθεια κατανόησης της παθογένειάς της, αλλάζουν διαρκώς και τις κατευθυντήριες θεραπευτικές οδηγίες. Όμως η αντιμετώπιση των παραγόντων κινδύνου που σχετίζονται με NAFLD όπως η IR, το αυξημένο ΣΒ, τα υψηλά επίπεδα λιπιδίων ορού, παραμένει ο 111 Σ ελίδα

116 πρωταρχικός θεραπευτικός τρόπος για να βελτιωθεί η NAFLD. Ωστόσο η χειρουργική επέμβαση, παράγοντες ευαισθητοποίησης της ινσουλίνης, αντιοξειδωτικά και ιχθυέλαια, μπορεί επίσης να εξετασθούν ως θεραπευτικοί τρόποι παρέμβασης αν αυτό απαιτείται. Όμως χρειάζεται περαιτέρω έρευνα για να τεκμηριωθεί με σαφήνεια το αποτέλεσμά τους. (Σχήμα ΣΤ) Επί του παρόντος η απώλεια βάρους και η αλλαγή στον τρόπο ζωής θα πρέπει να χρησιμοποιείται ως θεραπεία πρώτης γραμμής. 112 Σ ελίδα

117 Σχήμα ΣΤ «Προτινόμενος» διαγνωστικός και θεραπευτικός αλγόριθμος για τη NAFLD/NASH (Βάση των ισχυόντων δεδομένων): ΗΠΑΤΙΚΗ ΒΙΟΨΙΑ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟΥ ΣΥΝΔΡΟΜΟΥ NFScore > 0,67 ή ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ και ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΠΡΟΤΕΙΝΟΥΝ NASH ή NASH-ίνωση NAFLD/NASH ΔΙΑΙΤΑ: (1.500 Kcal/ημέρα) ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΗ ΔΡΑΣΤΗΡΙΟΤΗΤΑ: (175 min/εβδομάδα) ή (25 min/ημέρα) ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΣΒ: > 7% Αντίσταση στην ινσουλίνη (ΙR) Οξειδωτικό στρες Νοσογόνος παχυσαρκία TZDs: Πιογλιταζόνη 30 mg/ημέρα NFScore : NAFLD Fibrosis score IR : insulin resistance TZDs:Thiazolidinediones Βιταμίνη Ε: 800 IU/ημέρα (Προσοχή στους διαβητικούς ασθενείς Βαριατρικό χειρουργείο 113 Σ ελίδα

118 ΠΙΝΑΚΑΣ 47 Αναφορά Βιβλιογραφική Lazo M (355) Kantartzis K (356) Promrat K (352) St George A (357) Hallsworth K (358) Περίληψη των Μελετών Παρέμβασης στον τρόπο ζωής- Διατροφή ή/και στη σωματική δραστηριότητα ασθενών με NAFLD Πληθυσμός, Σχεδιασμός Παρέμβαση Αποτελέσματα Μελέτης n = μήνες παρέμβαση σε ενήλικες με ηπατική στεάτωση και ΣΔ ΙΙ n = 50. Διαχρονική Μελέτη παρέμβασης στον τρόπο ζωής ενηλίκων με NAFLD n = 28. Τυχαιοποιημένη δοκιμή σε ενήλικες με ALT ή AST και ΒΜΙ: Kg/m 2 n = 152. Τυχαιοποιημένη δοκιμή σε ενήλικες με ALT ή AST, κεντρική παχυσαρκία, και Μεταβολικούς παράγοντες κινδύνου n = 19. Μελέτη παρέμβασης με 8 εβδομάδες σωματική άσκηση σε ενήλικες με NAFLD Δίαιτα ( Kcal/ημέρα) και Άσκηση: 75 /εβδομάδα 10 διαιτητικές συνεδρίες με διαιτολόγο και Άσκηση 3h/εβδομάδα Δίαιτα: Kcal/ημέρα και Άσκηση 200 /εβδομάδα και τροποποίηση συνηθειών Μέτρια Σωματική Άσκηση (6 συνεδρίες/10 εβδομάδες) ή Χαμηλή Σωματική Άσκηση (3 συνεδρίες/4 εβδομάδες) Διάρκεια Συνεδρίας: 150 /εβδομάδα Δίαιτα ( Kcal/ημέρα) Σωματική Άσκηση /3 φορές/ εβδομάδα ΒΜΙ, ΣΒ, Περίμετρος Μέσης % ποσοστό ηπατικού λίπους HbA1c Σωματικού λίπους Ηπατικού λίπους Επίλυση NAFLD σε 20 συμμετέχοντες 9,3% ΣΒ Βελτίωση NASH > 7% Ηπατικής Στεάτωσης Μέτρια σωματική δραστηριότητα: ΣΒ, AST, ALT IR 13% των επιπέδων ηπατικών λιπιδίων οξείδωσης ηπατικών λιπιδίων Γλυκόζης ορού IR Καμιά επίδραση στο σωματικό βάρος ή λίπος HbA1c: hemoglobin A1c, BMI: Body Mass Index, ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase IR : insulin resistance, ΣΒ : Σωματικό Βάρος 114 Σ ελίδα

119 ΠΙΝΑΚΑΣ 48 Αναφορά Nair S (363) Nobili V (364) ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΑΡΕΜΒΑΣΕΩΝ ΣΕ NAFLD Πληθυσμός/ Σχεδιασμός Μελέτης n = 15. Ανοικτή μελέτη ενηλίκων ασθενών με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NAFLD n = 57. Μελέτη παιδιών με NAFLD/NASH λόγω ΣΒ ή παχυσαρκίας Παρέμβαση Μετφορμίνη 20 mg/kg/ημέρα για 48 εβδομάδες n = 57 Μετφορμίνη mg/ημέρα/3 φορές την εβδομάδα + Υποθερμιδική δίαιτα + Σωματική Δραστηριότητα: 45 /ημέρα ή n = 30 Μόνο: Σωματική δραστηριότητα + Υποθερμιδική δίαιτα Αποτελέσματα ALT, AST, IR τους πρώτους 3 μήνες μετά Στάσιμος κατάσταση n = 57 ΣΒ, ALT, NAS score απουσία βελτίωσης ίνωσης n = 30 ΣΒ, ALT NAS score απουσία βελτίωσης ίνωσης Ratziu V (368) Belfort R (369) Lutchman G (370) Sanyal AJ (372) n = 63. Τυχαιοποιημένη. Διπλή - τυφλή μελέτη σε ενήλικες με NASH n = 47. Τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη σε ενήλικες με διαταραχή ανοχής γλυκόζης ή ΣΔ ΙΙ με NASH n = 13. Ενήλικες με NASH n = 247. Τυχαιοποιημένοι ενήλικες με NASH χωρίς ΣΔ ΙΙ (ΜΕΛΕΤΗ PIVENS) n = 32 Ροσιγλιταζόνη (4 mg/ημ.) για 1 μήνα Ροσιγλιταζόνη (8mg/ημ/για 11 μήνες n = 31 Εικονικό φάρμακο n = 26 Υποθερμιδική δίαιτα + Πιογλιταζόνη: 45 mg/ημ/6 μήνες ή n = 21 μόνο Υποθερμιδική Δίαιτα για 6 μήνες Πιογλιταζόνη: 30 mg/ημ./48 εβδομάδες Διακοπή Πιογλιταζόνης για άλλες 48 εβδομάδες n = 84. Βιταμίνη Ε (800 IU/ημ.) για 96 ημέρες n = 80. Πιογλυκατζόνη 30 mg/ημ./96 εβδομ. n = 32 AST, ALT, IR ηπατικής στεάτωσης στο ½ των n = 32 και ΣΒ n = 26 Δίαιτα + Πιογλιταζόνη: ALT, IR, βελτίωση ανοχής γλυκόζης, NAS score Η διακοπή Πιογλιταζόνης προκαλεί: ALT, Αδιπονεκτίνης, IR, ηπατικού λίπους, όχι αλλαγές σε ηπατική ίνωση AST, ALT Ηπατικής Στεάτωσης AST, ALT ηπατικής στεάτωσης Harrison SA (373) n = 45. Μελέτη προοπτικής Διπλή - Τυφλή, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο σε NASH ασθενείς n = 83. Εικονικό φάρμακο n = 23. Βιταμίνη Ε: (1000 IU/ημ.) Βιταμίνη C: (1000 IU/ημ.) Διάστημα > 6 μήνες + Δίαιτα + Σ. άσκηση n = 22 εικονικό φάρμακο Καμία βελτίωση ίνωσης και στις 2 ομάδες n = 23. ίνωσης ήπατος ουδεμία βελτίωση ηπατικής φλεγμονής (NAS score) ή Αμινοτρανσφερασών ορού NAS score: ΝΑFLD Activity Score, BMI: Body Mass Index, ALT:Alanine transaminase, AST:aspartate aminotransferase IR : insulin resistance, ΣΒ : Σωματικό Βάρος 115 Σ ελίδα

120 Θεραπευτικές παρεμβάσεις υπό έρευνα Η αυξανόμενη επικράτηση της NASH έχει οδηγήσει σε μεγάλη ζήτηση για ιατρική θεραπεία Ωστόσο όπως προαναφέραμε καμμία φαρμακολογική θεραπεία δεν έχει αποδειχθεί αποτελεσματική σε μακροχρόνια χρήση (397). Ένας σημαντικός περιορισμός στο σχεδιασμό κλινικών δοκιμών για τη θεραπεία της NASH ήταν η έλλειψη ενδεδειγμένων μη επεμβατικών δοκιμασιών που θα μπορούν να προβλέπουν το στάδιο της νόσου και επομένως τις επιπτώσεις της θεραπείας. Με την εξέλιξη της έρευνας, νέοι βιοδείκτες πολλά υποσχόμενοι όσον αφορά τη σταδιοποίηση της ίνωσης ή τη βαθμολογία της φλεγμονής, αναδεικνύονται καθημερινά. Έτσι αυξάνεται και το ενδιαφέρον για τη δημιουργία μελετών που αφορούν την έρευνα νέων θεραπευτικών στόχων με βάση την παθοφυσιολογία της νόσου NAFLD/NASH(Εικόνα 18). Εικόνα 18 Παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί και πιθανοί θεραπευτικοί στόχοι στην NASH (Journal of Gastroenterology and Hepatology Volume 28, Issue Supplement S1, pages 68 76, August 2013)(116) Ερμηνεία εικόνας 18: Συσχέτιση παθοφυσιολογικών μηχανισμών με πιθανούς θεραπευτικούς στόχους στην NASH: Επέκταση του λιπώδους ιστού με χαμηλού βαθμού φλεγμονή, καταλήγει σε μια αυξημένη λιπόλυση και απελευθέρωση παραγόντων που μειώνουν την ευαισθησία της ινσουλίνης. Η αυξημένη ροή FFAs (free fatty acids), στα πλαίσια αντίστασης στην ινσουλίνη (IR:insulin resistance), οδηγεί σε αναστολή της σηματοδότησης του υποστρώματος του υποδοχέα ινσουλίνης-1 (IRS-1:insulin receptor substrate-1), επεκτείνοντας την αποθήκευση τριγλυκεριδίων στο ήπαρ και σε συνδυασμό με μείωση της σύνθεσης της ApoB, ελαττώνεται η έξοδος ηπατικών λιπιδίων δια μέσου της πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνη (VLDL: very low density lipoprotein) και έτσι αυξάνεται η παρουσία ηπατικού λίπους πέραν από τις δυνατότητες του ήπατος να το μεταβολίσει με μη τοξικούς μηχανισμούς (εξάντληση μηχανισμών ηπατικής αποτοξίνωσης) που καταλήγει σε: μιτοχονδριακή δυσλειτουργία, αυξημένο οξειδωτικό στρες, αυξημένος ηπατοκυτταρικός θάνατος (απόπτωση, νέκρωση), με τελικό αποτέλεσμα κυτταρική βλάβη ίνωση του ήπατος. Θεραπευτικές παρεμβάσεις για να αντιμετωπισθούν αυτοί οι παθογενετικοί μηχανισμοί, θα δώσουν μεγάλο όφελος σε αυτήν την «σύγχρονη» ηπατική νόσο. (Τα βέλη σηματοδοτούν τα σημεία στόχους θεραπευτικής εμπλοκής στην παθοφυσιολογία της NASH). [(CB1R: peripheral cannabinoid 1 receptor, DPP IV: dipeptidylpeptidase IV, FXR: farnesoid X receptor, GLP: glucagon like peptide, PPAR: peroxisome proliferator activated receptor, SGLT-2: sodium glucose transporter 2]. Αναστολείς των κασπάσων και της φλεγμονής: Ο αποπτωτικός κυτταρικός θάνατος που εμπλέκεται στη NASH/φλεγμονή οδηγεί σε ενεργοποίηση των κασπάσων. Οι κασπάσες αποτελούν μία οικογένεια πρωτεασών με υψηλή ομολογία και είναι όλες κυστεϊνικές πρωτεάσες, εξειδικευμένες να υδρολύουν πεπτίδια σε σημεία που υπάρχουν κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος και έτσι να δρουν στο τελικό στάδιο της απόπτωσης των κυττάρων (398,399) αποδομώντας δομικές πρωτεΐνες απαραίτητες για την 116 Σ ελίδα

121 κυτταρική επιβίωση. Η αναστολή της δραστηριότητας των κασπασών αποτελεί έναν νέο θεραπευτικό στόχο για τους ασθενείς με NASH (399). Σε ποντίκια με μία μεθειονίνης-χολίνης ανεπαρκή δίαιτα (methionine-choline-deficient: MCD), ένα ζωικό μοντέλο στεατοηπατίτιδας χωρίς όμως χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου αλλά με χαρακτηριστικά «λιποαπόπτωσης» (lipoaportosis) των ηπαττοκυττάρων που παρατηρούνται στη NASH, η ειδική για τα ηπατοκύτταρα διαγραφή της κασπάσης-8, βελτιώνει την ηπατική φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και την ηπατική βλάβη (400). Επίσης σε ποντίκια με μετάλλαξη στους υποδοχείς λεπτίνης (db/db) και με MCD δίαιτα, η ηπατοκυτταρική απόπτωση και φλεγμονή καταστέλλονται όταν τους χορηγηθεί αναστολέας παν-κασπάσης vx-166 (401). Σε μια διπλή τυφλή τυχαιοποιημένη μελέτη φάσης ΙΙ 124 ασθενών με NASH, (402) η χορήγηση GS-9450 που είναι ένας αναστολέας των κασπάσων 1,8 και 9, περιόριζε τα επίπεδα ALT και «θραυσμάτων» CK-18 στο πλάσμα σε 4 εβδομάδες από την έναρξη της θεραπείας (Tx). Ωστόσο αποσύρθηκε ο παράγοντας αυτός λόγω παρενεργειών σε ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C που είχε χρησιμοποιηθεί. Ωστόσο ο περιορισμός της «νεκρό-απόπτωσης» σε NASH ασθενείς, παραμένει ένας ελκυστικός στόχος βελτίωσης της NASH/φλεγμονής. Από την άλλη πλευρά όμως η αύξηση της κυτταρικής βιωσιμότητας, κατά τη διάρκεια της φλεγμονής, εγείρει επίσης ανησυχίες για ανάπτυξη κακοηθειών. Έτσι η χρήση αντιαποπτωτικών παραγόντων στη NASH θεραπεία πρέπει να έχει ένα μικρό θεραπευτικό παράθυρο. Η αδενοσίνη: Είναι ένας φυσιολογικός ρυθμιστής της απάντησης του ιστού σε τραυματική βλάβη και ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση, την ανοσο-φλεγμονώδη κυτταρική απάντηση και την επισκευή των ιστών, εμπλέκοντας 4 υποδοχείς αδενοσίνης (Α1, Α2Α, Α2Β και Α3) με έναν αυτόματο και παρακρινικό τρόπο (403)). Σε αρουραίους που είναι σε MCD δίαιτα, η ενεργοποίηση του Α2Α υποδοχέα (Α2Α R: adenosine A2A receptor), που εκφράζεται σε φλεγμονώδη κύτταρα και στα HSCs (hepatic stellate cells), μέσω του αγωνιστή CGS21680, περιορίζει τη φλεγμονώδη κυτταρική ενεργοποίηση, την επακόλουθη ενεργοποίηση του καταρράκτη των JNK κινασών στα ηπατοκύτταρα και την ίνωση, χωρίς να επηρεάζεται η ηπατική στεάτωση (403,404). Ενδιαφέρον είναι ότι υπάρχουν διαφορετικές επιδράσεις των A1R και A2BR υποδοχέων αδενοσίνης στα πλαίσια της προκαλούμενης από αλκοόλ ηπατικής λιπογένεσης. Ενώ η έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στη σύνθεση των λιπαρών οξέων αποτράπηκε με αποκλεισμό των A1R, μειωμένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό των λιπαρών οξέων αποτράπηκε με αποκλεισμό τωνa2br υποδοχέων (403,404). Έτσι ανάλογα με τα κύτταρα και τους κυτταρικούς υποδοχείς, η αδενοσίνη μπορεί να προκαλέσει αντίθετες επιδράσεις επί της κυτταρικής βλάβης με πρόκληση ίνωσης ή στεάτωσης (ενεργοποίηση λιποκυττάρων). Η πολυπλοκότητα της σηματοδότησης της αδενοσίνης απαιτεί περαιτέρω έλεγχο των ειδικών αγωνιστών και ανταγωνιστών του υποδοχέα. Διπεπτιδυλοπεπτιδάση IV (Dipeptidylpeptidase-IV: DPP-IV) και Γλυκαγόνης-πεπτίδιο-1 (Glucagon-like peptide-1: GLP-1) Η ρύθμιση της ενεργειακής ισορροπίας σε περιφερειακούς ιστούς (συμπεριλαμβανομένων μυϊκού, λιπώδη και ηπατικού ιστού), εμπλέκει το κεντρικό και το περιφερικό νευρικό σύστημα και επηρεάζεται από χημικούς παράγοντες που ελέγχουν την όρεξη και τη σωματική δραστηριότητα. Η σηματοδότηση μέσω ορμονών (405) και ενδοκανναβινοειδών (406) που προκαλούν κορεσμό, έχει βρεθεί ότι είναι μειωμένη σε NASH συμβάλλοντας στην επέκταση του λιπώδους ιστού και στην ηπατική φλεγμονή. GLP-1 και το γαστρικό ανασταλτικό πολυπεπτίδιο, ανήκουν στην κατηγορία των ινκρετίνων που απελευθερώνονται από τα εντερικά κύτταρα ως απάντηση στην πρόσληψη θρεπτικών συστατικών. Ειδικά το GLP-1 ρυθμίζει τη μεταγευματική απελευθέρωση ινσουλίνης, αναστέλλει τη γλυκολυτική γλυκαγόνη και έτσι καταστέλλει την όρεξη (407). Τοπικά και στο αίμα, ταχεία αποικοδόμηση του GLP-1 προκαλείται από ένζυμο που είναι «αγκυροβολημένο» στην κυτταρική μεμβράνη και λέγεται DPP-IV. Το DPP-IV εκφράζεται πρωτίστως σε επιθηλιακά και 117 Σ ελίδα

122 ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και σε λεμφοκύτταρα. Ενώ άμεσοι και έμμεσοι Glp-1 αγωνιστές έχουν εισαχθεί στη θεραπεία του διαβήτη, η δυναμικότητά τους στη NASH είναι ασαφής. Η DPP-IV δραστηριότητα φαίνεται να είναι αυξημένη στη NASH (408) και οι DPP-IV αναστολείς βιλνταγλιπτίνη (vidagliptin) και λιναγλιπτίνη (linagliptin) βελτιώνουν την ηπατική στεάτωση, τη φλεγμονή του λιπώδους ιστού και την ευαισθησία στην ινσουλίνη σε παχύσαρκους και διαβητικούς αρουραίους Zucker και σε ένα μοντέλο ποντικών υψηλής διατροφικής αξίας σε λιπαρά (409,410). Οι αγωνιστές του GLP-1 που είναι ανθεκτικοί σε πρωτεάσες και έχουν άμεσο δράση είναι η εξενατίδη και η λιραγλουτίδη. Φαίνεται ότι αυτοί οι αγωνιστές του GLP-1 (exenatide και liraglutide) έχουν παρόμοια, αν όχι και καλύτερη, θεραπευτική δράση στη NAFLD από τους ανταγωνιστές DPPV-IV (βιλνταγλιπτίνη και λιναγλιπτίνη). H λιραγλουτίδη, φαίνεται να διορθώνει την εξασθενημένη β-οξείδωση σε ένα μοντέλο αρουραίων με δίαιτα υψηλής περιεκτικότητας σε κεκορεσμένα λιπαρά οξέα και φρουκτόζη (411). Σε ένα τέτοιο μοντέλο, η χρησιμοποίηση του ανάλογου εξενατίδης ΑC3174 μείωσε την αύξηση του βάρους και μετρίασε την άνοδο AST, ALT και ηπατικών τριγλυκεριδίων (412). Η εξενατίδη μείωσε επίσης το ER στρες (endoplasmic reticulum stress: στρες του ενδοπλασματικού δικτύου) που σχετίζεται με τον κυτταρικό θάνατο των ηπατοκυττάρων και την κυτταρική απόπτωση (413). Έτσι η ενίσχυση του σήματος των ορμονών: ινκρετίνων έδειξε μια σχετική βελτίωση της NASH in vitro και σε ζωικά μοντέλα. Δεδομένου ότι αυτά τα φάρμακα έχουν δείξει ασφάλεια σε ασθενείς με ΣΔ ΙΙ, είναι δικαιολογημένες οι κλινικές μελέτες για τη NAFLD. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) alpha and delta: Ενεργοποιημένοι υποδοχείς του αυξητικού παράγοντα των υπεροξυσωμάτων α και δ. (PPARs) α και δ: Οι PPARs ανήκουν στην κατηγορία των πυρηνικών υποδοχέων που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην ομοιόσταση του λίπους και της γλυκόζης αλλά επίσης ρυθμίζουν ή αλλιώς τροποποιούν την ηπατική φλεγμονή και ίνωση. Διάφορες PPARs ισομορφές έχουν εμπλακεί σε μεταβολικές προστατευτικές οδούς όπως μία βελτίωση στην οξείδωση των λιπαρών οξέων, την κατανομή, αποθήκευση και εναπόθεση αδρανών αβλαβών τριγλυκεριδίων (PPAR-α), αντι-φλεγμονώδη σηματοδότηση και βελτίωση της ευαισθησίας στην ινσουλίνη (PPARγ), βελτίωση των μεταβολικών επιδόσεων μέσω μεταβολών της δυσλιπιδαιμίας και αυξημένης οξείδωσης του λίπους στο μυϊκό σύστημα (PPAR-δ). Σε μοντέλο ποντικών με υψηλή σε κεκορεσμένα λιπαρά οξέα δίαιτα ή MCD δίαιτα, ένας παν-αγωνιστής των PPARs berafibrate, όπως και ένας PPARδ/β (GM ) και ένας PPARa (Wy14643) αγωνιστής, βελτιώνουν την ηπατική στεάτωση και φλεγμονή (414,415). Επιπλέον η αντίσταση των ηπατοκυττάρων στην ινσουλίνη, λόγω φλεγμονωδών κυτταροκινών, βελτιώνεται με GW (416). Η ροζιγλιταζόνη και η πιογλυταζόνη, που όπως προαναφέραμε ανήκουν στις TZDs, αποτελούν αγωνιστές των PPARγ (ροζιγλιταζόνη) και των PPARγ/α (πιογλυταζόνη) και χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς σε κλινικές δοκιμές προς βελτίωση των ιστολογικών χαρακτηριστικών της NASH. Όμως δεν φάνηκε να είναι αποτελεσματικές στην ίνωση και πιθανώς επιδεινώνουν τον καρδιαγγειακό κίνδυνο και ΣΒ ( 372,417). Σε δύο τυχαιοποιημένες, ελεγχόμενες με εικονικό φάρμακο μελέτες, με συνολικά 53 ασθενείς η χορήγηση του GFT505 αγωνιστή των PPARα/δ, βελτίωνε τη δυσλιπιδαιμία και την ΙR (116,418). Υπάρχουν τρέχουσες μελέτες αξιολόγησης των δυνητικών αποτελεσμάτων του αγωνιστή των PPARα/δ, σε NASH ασθενείς. Βελτίωση Υπεργλυκαιμίας: Νεφρικός αλατούχος Μεταφορέας Γλυκόζης-2 (Renal sodium Glucose transporter-2 (SGLT-2): Αναστολή της σηματοδότησης του SGLT-1 στο νεφρό, βελτιώνει την υπεργλυκαιμία μπλοκάροντας την επαναρρόφηση γλυκόζης και έτσι αυξάνεται η γλυκοζουρία. Αυτό βελτιώνει την ευαισθησία στην ινσουλίνη, και θα πρέπει να μειώνει τη φλεγμονή στο λιπώδη και τον ηπατικό ιστό μέσω ρύθμισης χημοκινών, κυττοκινών, ινκρετίνης, και αντιπονεκτίνων (116). Σε μοντέλο KK-A(y) ποντικών, που παρουσιάζουν αυθόρμητα διαβήτη και λιπώδες ήπαρ, η θεραπεία με sergliflozin etabonate, βελτιώνει το μεταβολισμό της γλυκόζης και την ηπατική στεάτωση (419). 118 Σ ελίδα

123 Δικαιολογούνται επιπλέον μελέτες με αναστολείς του SGTL-2 στη NASH προς διευκρίνιση του ρόλου τους. Περιφερειακοί Ανταγωνιστές των υποδοχέων κανναβιδοειδών-1 (Peripheral cannabinoid 1 receptor (CB1R) antagonists). Ανταγωνιστές των CB1R έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για τη βελτίωση του μεταβολικού φαινοτύπου στη NASH. Η ανακάλυψη των αναστολέων των υποδοχέων κανναβιδοειδών (CB1) του εγκεφάλου και (CB2) του γαστρεντερικού, στις αρχές του 90 προκάλεσε μεγάλο ενδιαφέρον στους ερευνητές. Οι CB1, που ανευρίσκονται κυρίως στο Κ.Ν.Σ, επηρεάζουν αρκετά νευρολογικά και ψυχολογικά φαινόμενα όπως την όρεξη, τη διάθεση και τον μυϊκό τόνο (420). Αντιθέτως οι CB2 ανιχνεύονται κυρίως στα περιφερικά κύτταρα του ανοσοποιητικού όπως τα λεμφοκύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα και έχουν επίσης δράση στο έντερο όπου αναστέλλουν την κινητικότητα και στα αγγεία που προκαλούν αγγειοδιαστολή (420,421). Μελέτες σε πειραματόζωα έδειξαν ότι η ενεργοποίηση του ενδοκαναβιδοειδούς συστήματος, οδηγεί μερικώς στην ανάπτυξη πυλαίας υπέρτασης και περιφερικής αρτηριακής υπότασης μέσω ενεργοποίησης των μακροφάγων και των αιμοπεταλίων από βακτηριδιακούς λιποπολυσακχαρίτες (422,423). Η αμανταμίνη ένας ενδογενής συνδέτης των CB υποδοχέων, αυξάνεται σε τοξικό σοκ από ενδοτοξίνες (423). Η αμανταμίνη έχει συνδέσει τη δράση της με την απόπτωση των ηπατοκυττάρων και με την αλληλεπίδραση λιπιδίων της μεμβράνης με λιπίδια του πλάσματος, που καταλήγει σε αυξημένη ευαισθησία στο οξειδωτικό στρες (424). Επίσης η ενεργοποίηση του συστήματος των CB ίσως έχει επίδραση στην ηπατική εγκεφαλοπάθεια (425). Σε ανθρώπους τα ενδοκανναβιδοειδή έχουν χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία τριών ασθενών με εμμένοντα κνησμό και χολόσταση (426). Η ριμοναμπάτη είναι ένας αναστολέας των περιφερικών και κεντρικών υποδοχέων κανναβιδοειδών, που βελτίωσε τις μεταβολικές ανωμαλίες σε μελέτες με παχύσαρκους (427,428). Σε fa/fa ποντίκια, η ριμοναμπάτη μείωσε το λίπος του ήπατος και σχεδόν ομαλοποίησε δείκτες ηπατοκυτταρικής καταστροφής όπως τις τρανσαμινάσες, την εστιακή έκκριση TNF-α στο ήπαρ, και τα επίπεδα αδιπονεκτίνης ορού, ενώ μείωσε και την ηπατομεγαλία (429). Σε ανθρώπους επιτυγχάνει απώλεια βάρους και βελτιώνει το λιπιδαιμικό προφίλ και το μεταβολικό σύνδρομο ( ). Δυστυχώς, αυτό το φάρμακο έχει εγκαταλειφθεί το 2008 λόγω παρενεργειών από την ψυχιατρική σφαίρα κυρίως. Η ανάπτυξη φαρμάκων δραστικών στο κανναβινοειδές σύστημα και ασφαλών, που να μειώνουν την όρεξη αλλά να βελτιώνουν και την αιμοδυναμική επιβάρυνση του ήπατος καθώς και τη φλεγμονή και το μεταβολικό σύνδρομο, είναι αντικείμενο έρευνας. Η Κονδουκτάνη είναι συνθετικό μη ψυχοτρόπο κανναβινοειδές που πιθανώς να δώσει θεραπευτική διέξοδο σε NASH ασθενείς (433,434). Αγωνιστές υποδοχέων Farnesoid X. (FXR): Τα χολικά οξέα εκκρίνονται ως απόκριση στην πρόσληψη τροφής, υφίστανται εντεροηπατική κυκλοφορία και δρουν σαν ένας ενδογενής σύνδεσμος προς μια κατηγορία πυρηνικών υποδοχέων ορμόνης, οι οποίοι πυρηνικοί υποδοχείς, λειτουργούν σαν σύνδεσμοι ενεργοποιημένων παραγόντων μεταγραφής προς ρύθμιση πολυάριθμων φυσιολογικών διαδικασιών. Αυτοί οι υποδοχείς περιλαμβάνουν τον FXR πρεγνανίου (pregnane x) υποδοχέα και τον ιδιοσυγκρασιακό υποδοχέα ανδροστάνιου. Ο FXR, ένας υποδοχέας για υδρόφοβα χολικά οξέα, έχει μελετηθεί πιο πολύ (116). Πέρα από τη ρύθμιση της σύνθεσης χολικών οξέων, ο FXR βελτιώνει την ευαισθησία της ινσουλίνης και την πρόσληψη γλυκόζης στο λιπώδη ιστό, στο ήπαρ, και στους σκελετικούς μυς, ρυθμίζοντας μεταβολικά γονίδια όπως PEPCK, G6Pase και FBP1 (435). Επιπλέον ο FXR καταστέλλει προφλεγμονώδη γονίδια και επομένως καταστέλλει την έκφραση ιντερφερόνης-γ, TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-6 (interleukin-6), επηρεάζοντας τη μεταγραφική δραστηριότητα του πυρηνικού μεταγραφικού παράγοντα NFκ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells). Ωστόσο αυτό το ευρύ φάσμα δράσης των FXRs αγωνιστών, μπορεί να καταλήγει σε ανεπιθύμητες παρενέργειες και εκλεκτικοί FXRs αγωνιστές απαιτούνται που πρωτίστως να μπορούν να μεταβάλλουν τη γονιδιακή έκφραση μόνο των γονιδίων που σχετίζονται με NASH και IR. Στο μοντέλο ποντικών MCD με στεατοηπατίτιδα, WAY (ένα συνθετικό του FXR συνδέσμου) τα προστατεύει από την ηπατική φλεγμονή και ίνωση, χωρίς να αναστέλλει την 119 Σ ελίδα

124 ηπατική συνάθροιση τριγλυκεριδίων (436). Πρόσφατα ομπετιχολικό οξύ (obeticholic acid), ένα ημισυνθετικό παράγωγο χολικού οξέος, εξετάσθηκε σε ασθενείς με βιοψιακά αποδεδειγμένη NASH (435). Μια απροσδόκητη ανεπιθύμητη παρενέργειά του ήταν η επιδείνωση του κνησμού. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η NAFLD και ιδίως η NASH αποτελεί μια σημαντική απειλή για την παγκόσμια υγεία. Με την αύξηση της παχυσαρκίας αναμένεται περαιτέρω αύξηση των ατόμων με NAFLD και άρα αύξηση του μελλοντικού αριθμού μεταμοσχεύσεων ήπατος. Ο παθοφυσιολογικός μηχανισμός είναι αντικείμενο μελέτης παγκοσμίως, οδηγώντας σε ένα συνεχές κύμα νέων δεδομένων και περισσότερης γνώσης των σύνθετων μηχανισμών που βρίσκονται πίσω από την παθογένεια της νόσου. Ταυτοχρόνως, νέες διαγνωστικές μέθοδοι αναπτύσσονται όπως η 1 H-μαγνητική φασματοσκοπία για ακριβή ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του λίπους στο ήπαρ, καθώς και μη επεμβατικά εργαλεία ανίχνευσης της ίνωσης ή της φλεγμονής στο λιπώδες ήπαρ. Οι θεραπευτικές επιλογές είναι περισσότερες: η μείωση του βάρους και η δίαιτα είναι η βάση της παρέμβασης, αλλά ενθαρρυντικά αποτελέσματα έχουν δώσει οι θειαζολιδιναιδιόνες (κυρίως η πιογλιταζόνη) αν και υπάρχουν επιφυλάξεις λόγω παρενεργειών όπως της ροσιγλιταζόνης. 120 Σ ελίδα

125 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ο Βιβλιογραφία: 1 Neuschwander-Tetri BA, Caldwell SH. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference.Hepatology. 2003;37: Balkau B, Charles MA. Comment on the provisional report from the WHO consultation. European Group for the Study of Insulin Resistance (EGIR) Diabet Med. 1999;16: Reynolds K, He J. Epidemiology of the metabolic syndrome. Am J Med Sci. 2005;330: Dowman J K, Tomlinson JW, Newsome P N. Systematic review: the diagnosis and staging of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis. Aliment Pharmacol Ther. Mar 2011; 33(5): Dowman JK, Tomlinson JW, Newsome PN. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. QJM. 2010;103: Ratziu V, Giral P, Munteanu M, et al. Screening for liver disease using non-invasive biomarkers (FibroTest, SteatoTest and NashTest) in patients with hyperlipidaemia. Aliment Pharmacol Ther 2007; 25: Adams LA, Feldstein A, Lindor KD, Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease among patients with hypothalamic and pituitary dysfunction. Hepatology. 2004;39: Loria P, Carulli L, Bertolotti M, Lonardo A. Endocrine and liver interaction: the role of endocrine pathways in NASH. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2009;6: Stefan N, Kantartzis K, Haring HU. Causes and metabolic consequences of fatty liver. Endocr Rev. 2008;29: ADAMS L, FELDSTEIN A. Non-invasive diagnosis of nonalcoholic fatty liver and nonalcoholic steatohepatitis. Journal of Digestive Diseases 2011; 12(1): Grandison G A, Angulo P. CAN NASH BE DIAGNOSED, GRADED AND STAGED NON- INVASIVELY?. Clin Liver Dis. Aug 2012; 16(3): Cusi K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 2012;142: Younossi ZM, et al. Changes in the prevalence of the most common causes of chronic liver diseases in the United States from 1988 to Clin Gastroenterol Hepatol. 2011;9(6): Clinical Research Network, Nathan M. B, Brunt E. M, Clark J.M. Clinical, laboratory and histological associations in adults with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. Sep 2010; 52(3): Festi D, Schiumerini R,. Marzi L, et al. Review article: the diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease availability and accuracy of non-invasive methods. Alimentary Pharmacology & Therapeutics 2013; 37 (4) : Ratziu V, Massard J, Charlotte F,et al. Diagnostic value of biochemical markers (FibroTest-FibroSURE) for the prediction of liver fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol. 2006; 6: Petta S, Muratore C, Craxi A. Non-alcoholic fatty liver disease pathogenesis: the present and the future. Dig Liver Dis. 2009;41: Day CP. Natural history of NAFLD: remarkably benign in the absence of cirrhosis. Gastroenterology. 2005;129: Day CP. From fat to inflammation. Gastroenterology.2006;130: Σ ελίδα

126 20 Vuppalanchi R, Chalasani N. Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis: selected practical issues in their evaluation and management. Hepatology. 2009;49: Lewis GF, Carpentier A, Adeli K, Giacca A. Disordered fat storage and mobilization in the pathogenesis of insulin resistance and type 2 diabetes. Endocr Rev. 2002;23: Donnelly KL, Smith CI, Schwarzenberg SJ, Jessurun J, Boldt MD, Parks EJ. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Invest. 2005;115: Feldstein AE, Werneburg NW, Canbay A, et al. Free fatty acids promote hepatic lipotoxicity by stimulating TNF-alpha expression via a lysosomal pathway. Hepatology. 2004;40: Sanyal AJ, Campbell-Sargent C, Mirshahi F, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: association of insulin resistance and mitochondrial abnormalities. Gastroenterology. 2001;120: Yamaguchi K, Yang L, McCall S, et al. Inhibiting triglyceride synthesis improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fibrosis in obese mice with nonalcoholic steatohepatitis.hepatology. 2007;45: McPherson S, Stewart SF, Henderson E, Burt AD, Day CP. Simple non-invasive fibrosis scoring systems can reliably exclude advanced fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Gut.2010;59: Lesmana CR, Hasan I, Budihusodo U, et al. Diagnostic value of a group of biochemical markers of liver fibrosis in patients with non-alcoholic steatohepatitis. J Dig Dis. 2009;10: Bhala N, Angulo P, van der Poorten D, Lee E, Hui JM, Saracco G, Adams LA, Charatcharoenwitthaya P, Topping JH, Bugianesi E, Day CP, George J. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease with advanced fibrosis or cirrhosis: an international collaborative study. Hepatology. 2011;54: Sowa J P, Heider D, Bechmann LP, Gerken G, Hoffmann D, Canbay A. Novel Algorithm for Non-Invasive Assessment of Fibrosis in NAFLD. PLoS One. 2013; 8(4): e Ekstedt M, Franzen LE, Mathiesen UL, et al. Long-term follow-up of patients with NAFLD and elevated liver enzymes. Hepatology.2006;44: Feldstein A, McCullough A, Wieckowska A. Noninvasive diagnosis and monitoring of nonalcoholic steatohepatitis: Present and future. HEPATOLOGY 2007; 46: Suzuki A, Angulo P, Lymp J, et al. Chronological development of elevated aminotransferases in a nonalcoholic population. Hepatology 2005; 41: Hamaguchi M, Kojima T, Takeda N, et al. The metabolic syndrome as a predictor of nonalcoholic fatty liver disease. Ann Intern Med 2005; 143: Vernon G, Baranova A, Younossi Z. M. Systematic review: the epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in adults. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. Volume 34, Issue 3, pages , August Marcos A, Fisher RA, Ham JM, et al. Selection and outcome of living donors for adult to adult right lobe transplantation. Transplantation 2000; 69: Lee JY, Kim KM, Lee SG, et al. Prevalence and risk factors of non-alcoholic fatty liver disease in potential living liver donors in Korea: a review of 589 consecutive liver biopsies in a single center. J Hepatol 2007; 47: Ground KE. Liver pathology in aircrew. Aviat Space Environ Med 1982; 53: Σ ελίδα

127 38 Amarapurkar A, Ghansar T. Fatty liver: experience from western India. Ann Hepatol 2007; 6: Wanless IR, Lentz JS. Fatty liver hepatitis (steatohepatitis) and obesity: an autopsy study with analysis of risk factors. Hepatology 1990; 12: Zois CD, Baltayiannis GH, Bekiari A, et al. Steatosis and steatohepatitis in postmortem material from Northwestern Greece. World J Gastroenterol 2010; 16: Caballería L, Pera G, Auladell MA, et al. Prevalence and factors associated with the presence of nonalcoholic fatty liver disease in an adult population in Spain. Eur J Gastroenterol Hepatol 2010; 22: Bedogni G, Miglioli L, Masutti F, Tiribelli C, Marchesini G, Bellentani S. Prevalence of and risk factors for nonalcoholic fatty liver disease: the Dionysos nutrition and liver study. Hepatology 2005; 42: Kojima S, Watanabe N, Numata M, et al. Increase in the prevalence of fatty liver in Japan over the past 12 years: analysis of clinical background. J Gastroenterol 2003; 38: Amarapurkar D, Kamani P, Patel N, et al. Prevalence of non-alcoholic fatty liver disease: population based study. Ann Hepatol 2007; 6: Williams CD, Stengel J, Asike MI, et al. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis among a largely middle-aged population utilizing ultrasound and liver biopsy: a prospective study. Gastroenterology 2011; 140: Browning JD, Szczepaniak LS, Dobbins R, et al. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: impact of ethnicity. Hepatology 2004; 40: Ioannou GN, Boyko EJ, Lee SP. The prevalence and predictors of elevated serum aminotransferase activity in the United States in Am J Gastroenterol 2006; 101: Ruhl CE, Everhart JE. Determinants of the association of overweight with elevated serum alanine aminotransferase activity in the United States. Gastroenterology 2003; 124: Patt CH, Yoo HY, Dibadj K, Flynn J, Thuluvath PJ. Prevalence of transaminase abnormalities in asymptomatic, healthy subjects participating in an executive healthscreening program. Dig Dis Sci 2003; 48: Clark JM, Brancati FL, Diehl AM. The prevalence and etiology of elevated aminotransferase levels in the United States. Am J Gastroenterol 2003; 98: Piton A, Poynard T, Imbert-Bismut F, et al. Factors associated with serum alanine transaminase activity in healthy subjects: consequences for the definition of normal values, for selection of blood donors, and for patients with chronic hepatitis C. MULTIVIRC Group. Hepatology 1998; 27: Kariv R, Leshno M, Beth-Or A, et al. Re-evaluation of serum alanine aminotransferase upper normal limit and its modulating factors in a large-scale population study. Liver Int 2006; 26: Amarapurkar DN, Patel ND. Clinical spectrum and natural history of non-alcoholic steatohepatitis with normal alanine aminotransferase values. Trop Gastroenterol 2004; 25: Browning JD, et al. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States: impact of ethnicity. Hepatology. 2004;40(6): Σ ελίδα

128 55 Targher G, Bertolini L, Padovani R, et al. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease and its association with cardiovascular disease among type 2 diabetic patients. Diabetes Care.2007;30: Machado M, Marques-Vidal P, Cortez-Pinto H. Hepatic histology in obese patients undergoing bariatric surgery. J Hepatol.2006;45: [PubMed] 57 Tominaga K, Kurata JH, Chen YK, et al. Prevalence of fatty liver in Japanese children and relationship to obesity. An epidemiological ultrasonographic survey. Dig Dis Sci. 1995;40: [PubMed] 58 Franzese A, Vajro P, Argenziano A, et al. Liver involvement in obese children. Ultrasonography and liver enzyme levels at diagnosis and during follow-up in an Italian population. Dig Dis Sci.1997;42: Bedogni G, Bellentani S, Miglioli L, Masutti F, Passalacqua M, Castiglione A, Tiribelli C. The Fatty Liver Index: a simple and accurate predictor of hepatic steatosis in the general population. BMC Gastroenterol Nov 2;6: Bedogni G, Kahn HS, Bellentani S, Tiribelli C. A simple index of lipid overaccumulation is a good marker of liver steatosis. BMC Gastroenterol 2010; 10: Karnikowski M, Córdova C, Oliveira RJ, Karnikowski MG, Nóbrega Ode T. Non-alcoholic fatty liver disease and metabolic syndrome in Brazilian middle-aged and older adults. Sao Paulo Med J 2007; 125: Das K, Das K, Mukherjee PS, et al. Nonobese population in a developing country has a high prevalence of nonalcoholic fatty liver and significant liver disease. Hepatology 2010; 51: Li H, Wang YJ, Tan K, et al. Prevalence and risk factors of fatty liver disease in Chengdu, Southwest China. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2009; 8: Bajaj S, Nigam P, Luthra A, et al. A case-control study on insulin resistance, metabolic co-variates & prediction score in non-alcoholic fatty liver disease. Indian J Med Res 2009; 129: Dassanayake AS, Kasturiratne A, Rajindrajith S, et al. Prevalence and risk factors for non-alcoholic fatty liver disease among adults in an urban Sri Lankan population. J Gastroenterol Hepatol 2009; 24: Mohan V, Farooq S, Deepa M, Ravikumar R, Pitchumoni CS. Prevalence of non-alcoholic fatty liver disease in urban south Indians in relation to different grades of glucose intolerance and metabolic syndrome. Diabetes Res Clin Pract 2009; 84: Zhou YJ, Li YY, Nie YQ, et al. Prevalence of fatty liver disease and its risk factors in the population of South China. World J Gastroenterol 2007; 13: Chen CH, Huang MH, Yang JC, et al. Prevalence and risk factors of nonalcoholic fatty liver disease in an adult population of taiwan: metabolic significance of nonalcoholic fatty liver disease in nonobese adults. J Clin Gastroenterol 2006; 40: Zelber-Sagi S, Nitzan-Kaluski D, Halpern Z, Oren R. Prevalence of primary non-alcoholic fatty liver disease in a population-based study and its association with biochemical and anthropometric measures. Liver Int 2006; 26: Park SH, Jeon WK, Kim SH, et al. Prevalence and risk factors of non-alcoholic fatty liver disease among Korean adults. J Gastroenterol Hepatol 2006; 21(1 Pt 1): Jimba S, Nakagami T, Takahashi M, et al. Prevalence of non-alcoholic fatty liver disease and its association with impaired glucose metabolism in Japanese adults. Diabet Med 2005; 22: Σ ελίδα

129 72 Fan JG, Zhu J, Li XJ, et al. Prevalence of and risk factors for fatty liver in a general population of Shanghai, China. J Hepatol 2005; 43: Singh SP, Nayak S, Swain M, et al. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease in coastal eastern India: a preliminary ultrasonographic survey. Trop Gastroenterol 2004; 25: Omagari K, Kadokawa Y, Masuda J, et al. Fatty liver in non-alcoholic non-overweight Japanese adults: incidence and clinical characteristics. J Gastroenterol Hepatol 2002; 17: Romeo S, Kozlitina J, Xing C, et al. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet.2008;40: Ludwig J, Viggiano TR, McGill DB, Oh BJ. Nonalcoholic steatohepatitis: mayo Clinic experiences with a hitherto unnamed disease. Mayo Clin Proc. 1980;55: Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, McCullough AJ. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology 1999; 116: Lonardo A, Lombardini S, Scaglioni F, et al. Fatty liver, carotid disease and gallstones: a study of age-related associations. World J Gastroenterol 2006; 12: Kim HJ, Kim HJ, Lee KE, et al. Metabolic significance of nonalcoholic fatty liver disease in nonobese, nondiabetic adults. Arch Intern Med 2004; 164: Ong JP, Pitts A, Younossi ZM. Increased overall mortality and liver-related mortality in non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol 2008; 49: Ascha MS, Hanouneh IA, Lopez R, Tamimi TA, Feldstein AF, Zein NN. The incidence and risk factors of hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2010; 51: Hashimoto E, Yatsuji S, Tobari M, et al. Hepatocellular carcinoma in patients with nonalcoholic steatohepatitis. J Gastroenterol 2009; 44(Suppl. 19): Caldwell SH, Oelsner DH, Iezzoni JC, Hespenheide EE, Battle EH, Driscoll CJ. Cryptogenic cirrhosis: clinical characterization and risk factors for underlying disease. Hepatology 1999; 29: Liangpunsakul S, Chalasani N. Unexplained elevations in alanine aminotransferase in individuals with the metabolic syndrome: results from the third National Health and Nutrition Survey (NHANES III). Am J Med Sci 2005; 329: Hui AY, Wong VW, Chan HL, et al. Histological progression of non-alcoholic fatty liver disease in Chinese patients. Aliment Pharmacol Ther 2005; 21: Hashimoto E, Yatsuji S, Kaneda H, et al. The characteristics and natural history of Japanese patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatol Res 2005; 33: Sorrentino P, Tarantino G, Conca P, et al. Silent non-alcoholic fatty liver disease-a clinical-histological study. J Hepatol 2004; 41: Kallwitz ER, Kumar M, Aggarwal R, et al. Ethnicity and nonalcoholic fatty liver disease in an obesity clinic: the impact of triglycerides. Dig Dis Sci 2008; 53: Papatheodoridis GV, Goulis J, Christodoulou D, et al. High prevalence of elevated liver enzymes in blood donors: associations with male gender and central adiposity. Eur J Gastroenterol Hepatol 2007; 19: Kunde SS, Lazenby AJ, Clements RH, Abrams GA. Spectrum of NAFLD and diagnostic implications of the proposed new normal range for serum ALT in obese women. Hepatology 2005; 42: Σ ελίδα

130 91 Adams LA, Lymp JF, St Sauver J, et al. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a population-based cohort study. Gastroenterology 2005; 129: Speliotes EK, Yerges-Armstrong LM, Wu J, et al. Genome-wide association analysis identifies variants associated with nonalcoholic fatty liver disease that have distinct effects on metabolic traits. PLoS Genet 2011; 7: e Schwimmer JB, Celedon MA, Lavine JE, et al. Heritability of nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2009; 136: Sookoian S, Pirola CJ. Meta-analysis of the influence of I148M variant of patatin-like phospholipase domain containing 3 gene (PNPLA3) on the susceptibility and histological severity of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2011; 53: Yang Z, Wen J, Tao X, et al. Genetic variation in the GCKR gene is associated with nonalcoholic fatty liver disease in Chinese people. Mol Biol Rep 2011; 38: Leite NC, Salles GF, Araujo AL, Villela-Nogueira CA, Cardoso CR. Prevalence and associated factors of non-alcoholic fatty liver disease in patients with type-2 diabetes mellitus. Liver Int 2009; 29: Prashanth M, Ganesh HK, Vima MV, et al. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease in patients with type 2 diabetes mellitus. J Assoc Physicians India 2009; 57: Baranova A, Tran TP, Birerdinc A, Younossi ZM. Systematic review: association of polycystic ovary syndrome with metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease. Aliment Pharmacol Ther 2011; 33: Gambarin-Gelwan M, Kinkhabwala SV, Schiano TD, Bodian C, Yeh HC, Futterweit W. Prevalence of nonalcoholic fatty liver disease in women with polycystic ovary syndrome. Clin Gastroenterol Hepatol 2007; 5: Cerda C, Pérez-Ayuso RM, Riquelme A, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in women with polycystic ovary syndrome. J Hepatol 2007; 47: Hossain N, Stepanova M, Afendy A, et al. Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in patients with polycystic ovarian syndrome (PCOS). Scand J Gastroenterol 2011; 46: Bellentani S, Saccoccio G, Masutti F, et al. Prevalence of and risk factors for hepatic steatosis in Northern Italy. Ann Intern Med 2000; 132: Boza C, Riquelme A, Ibañez L, et al. Predictors of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in obese patients undergoing gastric bypass. Obes Surg 2005; 15: Abrams GA, Kunde SS, Lazenby AJ, Clements RH. Portal fibrosis and hepatic steatosis in morbidly obese subjects: A spectrum of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 2004; 40: Colicchio P, Tarantino G, del Genio F, et al. Non-alcoholic fatty liver disease in young adult severely obese non-diabetic patients in South Italy. Ann Nutr Metab 2005; 49: Beymer C, Kowdley KV, Larson A, Edmonson P, Dellinger EP, Flum DR. Prevalence and predictors of asymptomatic liver disease in patients undergoing gastric bypass surgery. Arch Surg 2003; 138: Dolce CJ, Russo M, Keller JE, et al. Does liver appearance predict histopathologic findings: prospective analysis of routine liver biopsies during bariatric surgery. Surg Obes Relat Dis 2009; 5: Gholam PM, Flancbaum L, Machan JT, Charney DA, Kotler DP. Nonalcoholic fatty liver disease in severely obese subjects. Am J Gastroenterol 2007; 102: Σ ελίδα

131 109 Harnois F, Msika S, Sabaté JM, et al. Prevalence and predictive factors of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in morbidly obese patients undergoing bariatric surgery. Obes Surg 2006; 16: Spaulding L, Trainer T, Janiec D. Prevalence of non-alcoholic steatohepatitis in morbidly obese subjects undergoing gastric bypass. Obes Surg 2003; 13: Sanyal AJ, Contos MJ, Sterling RK, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in patients with hepatitis C is associated with features of the metabolic syndrome. Am J Gastroenterol 2003; 98: Crum-Cianflone N, Dilay A, Collins G, et al. Nonalcoholic fatty liver disease among HIVinfected persons. J Acquir Immune Defic Syndr 2009; 50: Guaraldi G, Squillace N, Stentarelli C, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in HIVinfected patients referred to a metabolic clinic: prevalence, characteristics, and predictors. Clin Infect Dis 2008; 47: Fallo F, Dalla Pozza A, Tecchio M, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in primary aldosteronism: a pilot study. Am J Hypertens 2010; 23: Shieh K, Gilchrist JM, Promrat K. Frequency and predictors of nonalcoholic fatty liver disease in myotonic dystrophy. Muscle Nerve 2010; 41: Schuppan D, Schattenberg J. M. Non-alcoholic steatohepatitis: Pathogenesis and novel therapeutic approaches. Journal of Gastroenterology and Hepatology 2013;28 ( S1): Pais R, Pascale A, Fedchuck L, Charlotte F, Poynard T, Ratziu V. Progression from isolated steatosis to steatohepatitis and fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterol Clin Biol 2011; 35: Wong VW, Wong GL, Choi PC, et al. Disease progression of non-alcoholic fatty liver disease: a prospective study with paired liver biopsies at 3 years. Gut 2010; 59: Fassio E, Alvarez E, Domínguez N, Landeira G, Longo C. Natural history of nonalcoholic steatohepatitis: a longitudinal study of repeat liver biopsies. Hepatology 2004; 40: Harrison SA, Torgerson S, Hayashi PH. The natural history of nonalcoholic fatty liver disease: a clinical histopathological study. Am J Gastroenterol 2003; 98: Hamaguchi E, Takamura T, Sakurai M, et al. Histological course of nonalcoholic fatty liver disease in Japanese patients: tight glycemic control, rather than weight reduction, ameliorates liver fibrosis. Diabetes Care 2010; 33: Rafiq N, Bai C, Fang Y, et al. Long-term follow-up of patients with nonalcoholic fatty liver. Clin Gastroenterol Hepatol 2009; 7: Silverman EM, Sapala JA, Appelman HD. Regression of hepatic steatosis in morbidly obese persons after gastric bypass. Am J Clin Pathol 1995; 104: Mottin CC, Moretto M, Padoin AV, et al. Histological behavior of hepatic steatosis in morbidly obese 125 Söderberg C, Stål P, Askling J, et al. Decreased survival of subjects with elevated liver function tests during a 28-year follow-up. Hepatology 2010; 51: Caldwell SH, Crespo DM. The spectrum expanded: cryptogenic cirrhosis and the natural history of non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol 2004; 40: Bugianesi E, Leone N, Vanni E, et al. Expanding the natural history of nonalcoholic steatohepatitis: from cryptogenic cirrhosis to hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2002; 123: Σ ελίδα

132 128 Tellez-Avila FI, Sanchez-Avila F, García-Saenz-de-Sicilia M, et al. Prevalence of metabolic syndrome, obesity and diabetes type 2 in cryptogenic cirrhosis. World J Gastroenterol 2008; 14: Duseja A, Nanda M, Das A, Das R, Bhansali A, Chawla Y. Prevalence of obesity, diabetes mellitus and hyperlipidaemia in patients with cryptogenic liver cirrhosis. Trop Gastroenterol 2004; 25: Serfaty L, Lemoine M. Definition and natural history of metabolic steatosis: clinical aspects of NAFLD, NASH and cirrhosis. Diabetes Metab 2008; 34(6 Pt 2): Smedile A, Bugianesi E. Steatosis and hepatocellular carcinoma risk. Eur Rev Med Pharmacol Sci 2005; 9: Takuma Y, Nouso K. Nonalcoholic steatohepatitis-associated hepatocellular carcinoma: our case series and literature review. World J Gastroenterol 2010; 16: Jou J, Choi SS, Diehl AM. Mechanisms of disease progression in nonalcoholic fatty liver disease. Semin Liver Dis. 2008;28: Day CP, James OF. Steatohepatitis: a tale of two hits? Gastroenterology. 1998;114: Roskams T, Yang SQ, Koteish A, Durnez A, DeVos R, Huang X, et al. Oxidative stress and oval cell accumulation in mice and humans with alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease. Am J Pathol. 2003;163: McCullough AJ. Pathophysiology of nonalcoholic steatohepatitis. J Clin Gastroenterol. 2006;40(3 Suppl. 1):S Parks EJ. Dietary carbohydrate's effects on lipogenesis and the relationship of lipogenesis to blood insulin and glucose concentrations. Br J Nutr. 2002;87(Suppl. 2):S Adams LA, Angulo P, Lindor KD. Nonalcoholic fatty liver disease. CMAJ. 2005;172: Charlton M, Sreekumar R, Rasmussen D, Lindor K, Nair KS. Apolipoprotein synthesis in nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2002;35: Postic C, Girard J. Contribution of de novo fatty acid synthesis to hepatic steatosis and insulin resistance: lessons from genetically engineered mice. J Clin Invest. 2008;118: Cai D, Yuan M, Frantz DF, Melendez PA, Hansen L, Lee J, et al. Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKK-beta and NF-kappaB. Nat Med. 2005;11: Choi CS, Savage DB, Kulkarni A, Yu XX, Liu ZX, Morino K, et al. Suppression of diacylglycerol acyltransferase-2 (DGAT2), but not DGAT1, with antisense oligonucleotides reverses diet-induced hepatic steatosis and insulin resistance. J Biol Chem. 2007;3; 282: Hui JM, Hodge A, Farrell GC, Kench JG, Kriketos A, George J. Beyond insulin resistance in NASH: TNF-alpha or adiponectin? Hepatology. 2004;40: Crespo J, Cayon A, Fernandez-Gil P, Hernandez-Guerra M, Mayorga M, Dominguez- Diez A, et al. Gene expression of tumor necrosis factor alpha and TNF-receptors, p55 and p75, in nonalcoholic steatohepatitis patients. Hepatology. 2001;34: Tomita K, Tamiya G, Ando S, Ohsumi K, Chiyo T, Mizutani A, et al. Tumour necrosis factor alpha signalling through activation of Kupffer cells plays an essential role in liver fibrosis of non-alcoholic steatohepatitis in mice. Gut. 2006;55: Σ ελίδα

133 146 Li Z, Yang S, Lin H, Huang J, Watkins PA, Moser AB, et al. Probiotics and antibodies to TNF inhibit inflammatory activity and improve nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2003;37: Klover PJ, Clementi AH, Mooney RA. Interleukin-6 depletion selectively improves hepatic insulin action in obesity. Endocrinology. 2005;146: Tarantino G, Conca P, Pasanisi F, Ariello M, Mastrolia M, Arena A, et al. Could inflammatory markers help diagnose nonalcoholic steatohepatitis? Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21: Mantzoros CS. The role of leptin in human obesity and disease: a review of current evidence. Ann Intern Med. 1999;130: Lord G. Role of leptin in immunology. Nutr Rev. 2002;60(10 Pt 2):S Matarese G, Moschos S, Mantzoros CS. Leptin in immunology. J Immunol. 2005;174: Saxena NK, Ikeda K, Rockey DC, Friedman SL, Anania FA. Leptin in hepatic fibrosis: evidence for increased collagen production in stellate cells and lean littermates of ob/ob mice. Hepatology. 2002;35: Friedman J, Halaas J. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature 1998;395: Huang XD, Fan Y, Zhang H, Wang P, Yuan JP, Li MJ, et al. Serum leptin and soluble leptin receptor in non-alcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2008;14: Uygun A, Kadayifci A, Yesilova Z, Erdil A, Yaman H, Saka M, et al. Serum leptin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol. 2000;95: Chitturi S, Farrell G, Frost L, Kriketos A, Lin R, Fung C, et al. Serum leptin in NASH correlates with hepatic steatosis but not fibrosis: a manifestation of lipotoxicity? Hepatology. 2002;36: Whitehead JP, Richards AA, Hickman IJ, Macdonald GA, Prins JB. Adiponectin a key adipokine in the metabolic syndrome. Diabetes Obes Metab. 2006;8: Bugianesi E, Pagotto U, Manini R, Vanni E, Gastaldelli A, de Iasio R, et al. Plasma adiponectin in nonalcoholic fatty liver is related to hepatic insulin resistance and hepatic fat content, not to liver disease severity. J Clin Endocrinol Metab. 2005;90: Tomita K, Oike Y, Teratani T, Taguchi T, Noguchi M, Suzuki T, et al. Hepatic AdipoR2 signaling plays a protective role against progression of nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 2008;48: Kaser S, Moschen A, Cayon A, Kaser A, Crespo J, Pons-Romero F, et al. Adiponectin and its receptors in non-alcoholic steatohepatitis. Gut. 2005;54: [PMC free article] 161 Lemoine M, Ratziu V, Kim M, Maachi M, Wendum D, Paye F, et al. Serum adipokine levels predictive of liver injury in non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2009; Rosenson R. Effects of peroxisome proliferator-activated receptors on lipoprotein metabolism and glucose control in type 2 diabetes mellitus. Am J Cardiol 2007;99:96B- 104B. 163 Ip E, Farrell G, Hall P, Robertson G, Leclercq I. Administration of the potent PPARalpha agonist, Wy-14,643, reverses nutritional fibrosis and steatohepatitis in mice. Hepatology 2004;39: Kahn C, Chen L, Cohen S. Unraveling the mechanism of action of thiazolidinediones. J Clin Invest 2000;106: Σ ελίδα

134 165 Yki-Järvinen H. Thiazolidinediones. N Engl J Med 2004;351: Chtioui H, Semela D, Ledermann M, Zimmermann A, Dufour J. Expression and activity of the cytochrome P450 2E1 in patients with nonalcoholic steatosis and steatohepatitis. Liver Int 2007;27: Kathirvel E, Morgan K, French SW, Morgan TR. Overexpression of liver-specific cytochrome P4502E1 impairs hepatic insulin signaling in a transgenic mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2009;21: Rutkowski, D.T., and Hegde, R.S. Regulation of basal cellular physiology by the homeostatic unfolded protein response. J Cell Biol 189, Shen, J., Chen, X., Hendershot, L., and Prywes, R. (2002). ER stress regulation of ATF6 localization by dissociation of BiP/GRP78 binding and unmasking of Golgi localization signals. Dev Cell 3, H-Bertolotti, A., Zhang, Y., Hendershot, L.M., Harding, H.P., and Ron, D. (2000). Dynamic interaction of BiP and ER stress transducers in the unfolded-protein response. Nat Cell Biol 2, Rao, R.V., Ellerby, H.M., and Bredesen, D.E. (2004). Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program. Cell Death Differ 11, Ron D. Translational control in the endoplasmic reticulum stress response. J Clin Invest. 2002;110: Puri P, Mirshahi F, Cheung O, Natarajan R, Maher J, Kellum J, Sanyal A. Activation and dysregulation of the unfolded protein response in nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2008;134: Cope K, Risby T, Diehl AM. Increased gastrointestinal ethanol production in obese mice: implications for fatty liver disease pathogenesis. Gastroenterology JID ;119: Solga SF, Diehl AM. Non-alcoholic fatty liver disease: lumen-liver interactions and possible role for probiotics. J Hepatol. 2003;38: Wigg AJ, Roberts-Thomson IC, Dymock RB, McCarthy PJ, Grose RH, Cummins AG. The role of small intestinal bacterial overgrowth, intestinal permeability, endotoxaemia, and tumour necrosis factor alpha in the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis. Gut. 2001;48: Miele L, Valenza V, La Torre G, Montalto M, Cammarota G, Ricci R, et al. Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2009;49: Hocking MP, Davis GL, Franzini DA, Woodward ER. Long-term consequences after jejunoileal bypass for morbid obesity. Dig Dis Sci. 1998;43: Drenick EJ, Fisler J, Johnson D. Hepatic steatosis after intestinal bypass prevention and reversal by metronidazole, irrespective of protein-calorie malnutrition. Gastroenterology. 1982;82: Lichtman SN, Keku J, Schwab JH, Sartor RB. Hepatic injury associated with small bowel bacterial overgrowth in rats is prevented by metronidazole and tetracycline. Gastroenterology. 1991;100: Loguercio C, Federico A, Tuccillo C, Terracciano F, D'Auria MV, De Simone C, et al. Beneficial effects of a probiotic VSL #3 on parameters of liver dysfunction in chronic liver diseases. J Clin Gastroenterol. 2005;39: Σ ελίδα

135 182 Esposito E, Iacono A, Bianco G, Autore G, Cuzzocrea S, Vajro P, et al. Probiotics reduce the inflammatory response induced by a high-fat diet in the liver of young rats. J Nutr. 2009;139: Rockall AG, Sohaib SA, Evans D, Kaltsas G, Isidori AM, Monson JP, et al. Hepatic steatosis in Cushing's syndrome: a radiological assessment using computed tomography. Eur J Endocrinol. 2003;149: Tomlinson JW, Finney J, Gay C, Hughes BA, Hughes SV, Stewart PM. Impaired glucose tolerance and insulin resistance are associated with increased adipose 11betahydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression and elevated hepatic 5alpha-reductase activity. Diabetes. 2008;57: Konopelska S, Kienitz T, Hughes B, Pirlich M, Bauditz J, Lochs H, et al. Hepatic 11beta- HSD1 mrna expression in fatty liver and nonalcoholic steatohepatitis. Clin Endocrinol (Oxf) 2009;70: Livingstone D, Walker B, Andrews R. Susceptibility to hyperinsulinaemia and fatty liver with loss of 5alpha-reductase 1 occurs in rats and mice and is not androgen dependent. Endocrine Abstracts Iredale JP. Models of liver fibrosis: exploring the dynamic nature of inflammation and repair in a solid organ. J Clin Invest. 2007;117: Sell S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 2001;33: Roskams TA, Theise ND, Balabaud C, Bhagat G, Bhathal PS, Bioulac-Sage P, et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 2004;39: Richardson MM, Jonsson JR, Powell EE, Brunt EM, Neuschwander-Tetri BA, Bhathal PS, et al. Progressive fibrosis in nonalcoholic steatohepatitis: association with altered regeneration and a ductular reaction. Gastroenterology. 2007;133: Svegliati-Baroni G, De Minicis S, Marzioni M. Hepatic fibrogenesis in response to chronic liver injury: novel insights on the role of cell-to-cell interaction and transition. Liver Int. 2008;28: Xia JL, Dai C, Michalopoulos GK, Liu Y. Hepatocyte growth factor attenuates liver fibrosis induced by bile duct ligation. Am J Pathol. 2006;168: Van Hul NK, Abarca-Quinones J, Sempoux C, Horsmans Y, Leclercq IA. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDEinduced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 2009;49: Clouston AD, Jonsson JR, Powell EE. Hepatic progenitor cell-mediated regeneration and fibrosis: chicken or egg? Hepatology. 2009;49: Wilfred de Alwis NM, Day CP. Genetics of alcoholic liver disease and nonalcoholic fatty liver disease. Semin Liver Dis. 2007;27: Sermasathanasawadi R, Kato N, Muroyama R, Dharel N, Shao RX, Chang JH, et al. Association of interferon regulatory factor-7 gene polymorphism with liver cirrhosis in chronic hepatitis C patients. Liver Int. 2008;28: Okamoto K, Mimura K, Murawaki Y, Yuasa I. Association of functional gene polymorphisms of matrix metalloproteinase (MMP)-1, MMP-3 and MMP-9 with the progression of chronic liver disease. J Gastroenterol Hepatol. 2005;20: Guo J, Loke J, Zheng F, Hong F, Yea S, Fukata M, et al. Functional linkage of cirrhosispredictive single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptor 4 to hepatic stellate cell responses. Hepatology. 2009;49: Σ ελίδα

136 199 Dixon JB, Bhathal PS, Jonsson JR, Dixon AF, Powell EE, O'Brien PE. Pro-fibrotic polymorphisms predictive of advanced liver fibrosis in the severely obese. J Hepatol. 2003;39: Yoneda M, Hotta K, Nozaki Y, Endo H, Uchiyama T, Mawatari H, et al. Association between angiotensin II type 1 receptor polymorphisms and the occurrence of nonalcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2009;29: Mofrad P, et al. Clinical and histologic spectrum of nonalcoholic fatty liver disease associated with normal ALT values. Hepatology. 2003;37(6): Angulo P, Keach JC, Batts KP, Lindor KD. Independent predictors of liver fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 1999;30: Haring R, Wallaschofski H, Nauck M, Dorr M, Baumeister SE, Volzke H. Ultrasonographic hepatic steatosis increases prediction of mortality risk from elevated serum gammaglutamyl transpeptidase levels. Hepatology. 2009;50: Chitturi S, et al. HFE mutations, hepatic iron, and fibrosis: ethnic-specific association of NASH with C282Y but not with fibrotic severity. Hepatology. 2002;36(1): Sumida Y, Yoshikawa T, Okanoue T. Role of hepatic iron in non-alcoholic steatohepatitis. Hepatol Res. 2009;39: Loria P, Lonardo A, Leonardi F, Fontana C, Carulli L, Verrone AM, et al. Non-organspecific autoantibodies in nonalcoholic fatty liver disease: prevalence and correlates. Dig Dis Sci. 2003;48: Cotler SJ, Kanji K, Keshavarzian A, Jensen DM, Jakate S. Prevalence and significance of autoantibodies in patients with non-alcoholic steatohepatitis. J Clin Gastroenterol. 2004;38: Adams LA, Lindor KD, Angulo P. The prevalence of autoantibodies and autoimmune hepatitis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Am J Gastroenterol. 2004;99: Ghouri N, Preiss D, Sattar N. Liver enzymes, nonalcoholic fatty liver disease, and incident cardiovascular disease: a narrative review and clinical perspective of prospective data. Hepatology.2010;52: Wieckowska A, Feldstein AE. Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive. Semin Liver Dis. 2008;28: Wieckowska A, McCullough AJ, Feldstein AE. Noninvasive diagnosis and monitoring of nonalcoholic steatohepatitis: present and future. Hepatology. 2007;46: Palmentieri B, de Sio I, La Mura V, et al. The role of bright liver echo pattern on ultrasound B-mode examination in the diagnosis of liver steatosis. Dig Liver Dis. 2006;38: Saadeh S, Younossi ZM, Remer EM, et al. The utility of radiological imaging in nonalcoholic fatty liver disease.gastroenterology. 2002;123: Strauss S, Gavish E, Gottlieb P, Katsnelson L. Interobserver and intraobserver variability in the sonographic assessment of fatty liver.ajr Am J Roentgenol. 2007;189:W Johnston RJ, Stamm ER, Lewin JM, Hendrick RE, Archer PG. Diagnosis of fatty infiltration of the liver on contrast enhanced CT: limitations of liver-minus-spleen attenuation difference measurements. Abdom Imaging. 1998;23: Jacobs JE, Birnbaum BA, Shapiro MA, et al. Diagnostic criteria for fatty infiltration of the liver on contrast-enhanced helical CT. AJR. 1998;171: Σ ελίδα

137 217 Oliva MR, Mortele KJ, Segatto E, et al. Computed tomography features of nonalcoholic steatohepatitis with histopathologic correlation. J Comput Assist Tomogr. 2006;30: Mazhar SM, Shiehmorteza M, Sirlin CB. Noninvasive assessment of hepatic steatosis. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7: Reeder SB, Cruite I, Hamilton G, Sirlin CB. Quantitative assessment of liver fat with magnetic resonance imaging and spectroscopy. J Magn Reson Imaging. 2011;34: Kleiner DE, et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2005;41(6): Brunt EM1, Janney CG, Di Bisceglie AM, Neuschwander-Tetri BA, Bacon BR. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol Sep;94(9): Brunt EM1, Kleiner DE, Wilson LA, Belt P, Neuschwander-Tetri BA; NASH Clinical Research Network (CRN). Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) activity score and the histopathologic diagnosis in NAFLD: distinct clinicopathologic meanings. Hepatology Mar;53(3): Ratziu V, Charlotte F, Heurtier A, et al. Sampling variability of liver biopsy in nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology.2005;128: [PubMed] 224 Janiec DJ, Jacobson ER, Freeth A, Spaulding L, Blaszyk H. Histologic variation of grade and stage of non-alcoholic fatty liver disease in liver biopsies. Obes Surg. 2005;15: Vuppalanchi R, Unalp A, Van Natta ML, Cummings OW, Sandrasegaran KE, Hameed T, Tonascia J, Chalasani N. Effects of liver biopsy sample length and number of readings on sampling variability in nonalcoholic Fatty liver disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7: Fukusato T, Fukushima J, Shiga J, Takahashi Y, Nakano T, Maeyama S, Masayuki U, Ohbu M, Matsumoto T, Matsumoto K, Hano H, Sakamoto M, Kondo F, Komatsu A, Ishikawa T, Ohtake H, Takikawa H, Yoshimura K. Liver Disease Working Group-Kanto. Interobserver variation in the histopathological assessment of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatol Res. 2005;33: Piccinino F, et al. Complications following percutaneous liver biopsy. A multicentre retrospective study on 68,276 biopsies. J Hepatol. 1986;2(2): DxMunteanu M, Ratziu V, Morra R,etal. Noninvasive Biomarkers for the Screening of Fibrosis, Steatosis and Steatohepatitis in Patients with Metabolic Risk Factors: FibroTest- FibroMax Experience. J Gastrointestin Liver Dis June 2008; 17(2): Poynard T, Ratziu V, Naveau S, Thabut D, Charlotte F, Messous D, Capron D, Abella A, Massard J, Ngo Y, Munteanu M, Mercadier A, Manns M, Albrecht J. Comp Hepatol Dec 23;4: Poynard T, Ratziu V, Charlotte F, et al. Diagnostic value of biochemical markers (NashTest) for the prediction of non alcoholo steato hepatitis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. BMC Gastroenterol 2006;6: Zelber-Sagi S, Webb M, Ratziu V, et al. Comparison between SteatoTest and a computerized Hepatorenal index for ultrasonographic quantification of liver steatosis. J Hepatol 2008; 48: S368 (Abstr) 232 Gastaldelli A, Kozakova M, Hojlund K, et al. Fatty liver is associated with insulin resistance, risk of coronary heart disease, and early atherosclerosis in a large European population. Hepatology.2009;49: [PubMed] 133 Σ ελίδα

138 233 de Andrade AR, Cotrim HP, Alves E, et al. Nonalcoholic fatty liver disease in severely obese individuals: the influence of bariatric surgery. Ann Hepatol. 2008;7: [PubMed] 234 Balkau B, Lange C, Vol S, Fumeron F, Bonnet F. Nine-year incident diabetes is predicted by fatty liver indices: the French D.E.S.I.R. study. BMC Gastroenterol. 2010;10: Box GEP, Tidwell PW. Transformation of the Independent Variables. Technometrics. 1962;4: Sanyl AJ. AGA technical review on nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2002;123: Musso G, Gambino R, Biroli G, Carello M, Faga E, Pacini G, et al. Hypoadiponectinemia predicts the severity of hepatic fibrosis and pancreatic Beta-cell dysfunction in nondiabetic nonobese patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol 2005; 100: Shimada M, Kawahara H, Ozaki K, et al. Usefulness of a combined evaluation of the serum adiponectin level, HOMA-IR, and serum type IV collagen 7S level to predict the early stage of nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol. 2007;102: Argentou M, Tiniakos DG, Karanikolas M, et al. Adipokine serum levels are related to liver histology in severely obese patients undergoing bariatric surgery. Obes Surg. 2009;19: [PubMed] 240 Arvaniti VA, Thomopoulos KC, Tsamandas A, et al. Serum adiponectin levels in different types of non-alcoholic liver disease. Correlation with steatosis, necroinflammation and fibrosis. Acta Gastroenterol Belg. 2008;71: Diehl AM, Li ZP, Lin HZ, Yang SQ. Cytokines and the pathogenesis of non-alcoholic steatohepatitis. Gut 2005; 54: Abiru S, Migita K, Maeda Y, Daikoku M, Ito M, Ohata K, et al. Serum cytokine and soluble cytokine receptor levels in patients with non-alcoholic steatohepatitis. Liver Int 2006; 26: Wieckowska A, Papouchado BG, Li Z, Lopez R, Zein NN, Feldstein AE. Increased hepatic and circulating interleukin-6 levels in human nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol.2008;103: Lemoine M, Ratziu V, Kim M, et al. Serum adipokine levels predictive of liver injury in non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int.2009;29: Kayadibi H, Gultepe M, Yasar B, et al. Diagnostic value of serum prolidase enzyme activity to predict the liver histological lesions in non-alcoholic fatty liver disease: a surrogate marker to distinguish steatohepatitis from simple steatosis. Dig Dis Sci. 2009;54: Yilmaz Y, Ulukaya E, Gul OO et al. Decreased plasma levels of soluble receptor for advanced glycation endproducts (srage) in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Clin Biochem 2009; 42: Yoneda M, Mawatari H, Fujita K, et al. High-sensitivity C-reactive protein is an independent clinical feature of nonalcoholic steatohepatitis (NASH) and also of the severity of fibrosis in NASH. J Gastroenterol. 2007;42: Targher G. Relationship between high-sensitivity C-reactive protein levels and liver histology in subjects with non-alcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2006;45: Hui JM, Farrell GC, Kench JG, George J. High sensitivity C-reactive protein values do not reliably predict the severity of histological changes in NAFLD. HEPATOLOGY 2004; 39: Σ ελίδα

139 250 Haukeland JW, Damas JK, Konopski Z, Loberg EM, Haaland T, Goverud I, et al. Systemic inflammation in nonalcoholic fatty liver disease is characterized by elevated levels of CCL2. J Hepatol. 2006;44: Fukuhara A, Matsuda M, Nishizawa M, Segawa K, Tanaka M, Kishimoto K, et al. Visfatin: a protein secreted by visceral fat that mimics the effects of insulin. Science 2005; 307: Yang Q, Graham TE, Mody N, Preitner F, Peroni OD, Zabolotny JM, et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. N253 Horoz M, Bolukbas C, Bolukbas FF, Sabuncu T, Aslan M, Sarifakiogullari S, et al. Measurement of the total antioxidant response using a novel automated method in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. BMC Gastroenterol 2005; 5: 35.ature 2005; 436: Horoz M, Bolukbas C, Bolukbas FF, Sabuncu T, Aslan M, Sarifakiogullari S, et al. Measurement of the total antioxidant response using a novel automated method in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. BMC Gastroenterol 2005; 5: Bonnefont-Rousselot D, Ratziu V, Giral P, Charlotte F, Beucler I, Poynard T. Blood oxidative stress markers are unreliable markers of hepatic steatosis. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23: Chalasani N, Deeg MA, Crabb DW. Systemic levels of lipid peroxidation and its metabolic and dietary correlates in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol. 2004;99: [PubMed] 256 Yesilova Z, Yaman H, Oktenli C, Ozcan A, Uygun A, Cakir E, et al. Systemic markers of lipid peroxidation and antioxidants in patients with nonalcoholic Fatty liver disease. Am J Gastroenterol. 2005;100: [PubMed] 257 Seki S, Kitada T, Yamada T, Sakaguchi H, Nakatani K, Wakasa K. In situ detection of lipid peroxidation and oxidative DNA damage in non-alcoholic fatty liver diseases. J Hepatol. 2002;37: Solga SF, Alkhuraishe A, Cope K, Tabesh A, Clark JM, Torbenson M, et al. Breath biomarkers and non-alcoholic fatty liver disease: preliminary observations. Biomarkers 2006; 11: Sumida Y, Nakashima T, Yoh T, et al. Serum thioredoxin levels as a predictor of steatohepatitis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2003;38:32 8. [PubMed] 260 Nakashima T, Sumida Y, Furutani M, et al. Elevation of serum thioredoxin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis.hepatol Res. 2005;33: Feldstein A, Gores GJ. Steatohepatitis and apoptosis: therapeutic implications. Am J Gastroenterol 2004; 99: Feldstein AE, Gores GJ. Apoptosis in alcoholic and nonalcoholic steatohepatitis. Front Biosci 2005; 10: Feldstein AE, Canbay A, Angulo P, Taniai M, Burgart LJ, Lindor KD, et al. Hepatocyte apoptosis and fas expression are prominent features of human nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 2003; 125: Malik R. The clinical utility of biomarkers and the nonalcoholic steatohepatitis CRN liver biopsy scoring system in patients with nonalcoholic fatty liver disease. J Gastroenterol Hepatol.2009;24: Mitry RR. Noninvasive diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease using serum biomarkers. Hepatology. 2007;46: Σ ελίδα

140 266 Papatheodoridis GV. Serum apoptotic caspase activity in chronic hepatitis C and nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Gastroenterol.2010;44:e Wieckowska A. In vivo assessment of liver cell apoptosis as a novel biomarker of disease severity in nonalcoholic fatty liver disease.hepatology. 2006;44: Yilmaz Y. Soluble forms of extracellular cytokeratin 18 may differentiate simple steatosis from nonalcoholic steatohepatitis. World J Gastroenterol. 2007;13: Diab DL, Yerian L, Schauer P, et al. Cytokeratin 18 fragment levels as a noninvasive biomarker for nonalcoholic steatohepatitis in bariatric surgery patients. Clin Gastroenterol Hepatol. 2008;6: Younossi ZM, Jarrar M, Nugent C, et al. A novel diagnostic biomarker panel for obesityrelated nonalcoholic steatohepatitis (NASH) Obes Surg. 2008;18: Feldstein AE, Wieckowska A, Lopez AR, Liu YC, Zein NN, McCullough AJ. Cytokeratin- 18 fragment levels as noninvasive biomarkers for nonalcoholic steatohepatitis: a multicenter validation study. Hepatology. 2009;50: Musso G, Gambino R, Cassader M, Pagano G. Meta-analysis: Natural history of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and diagnostic accuracy of non-invasive tests for liver disease severity.ann Med Epub ahead of print.gastroenterology 2003; 125: Feldstein AE, Canbay A, Guicciardi ME, Higuchi H, Bronk SF, Gores GJ. Diet associated hepatic steatosis sensitizes to Fas mediated liver injury in mice. J Hepatol 2003; 39: Gulsen M, Yesilova Z, Bagci S, et al. Elevated plasma homocysteine concentrations as a predictor of steatohepatitis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. J Gastroenterol Hepatol. 2005;20: Thabut D, Naveau S, Frederic Charlotte F, Massard J, Ratziu V, Imbert-Bismut F, Cazals-Hatem D, Abella A, Messous D, Beuzen F, Munteanu M, Taieb J, Moreau R, Lebrec D, Poynard T. The diagnostic value of biomarkers (AshTest) for the prediction of alcoholic steato hepatitis in patients with chronic alcoholic liver disease. J Hepatol. 2006;52: Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 1985; 28: Levy JC, Matthews DR, Hermans MP. Correct homeostasis model assessment (HOMA) evaluation uses the computer program. Diabetes Care 1998; 21: Shah AG, Lydecker A, Murray K, Tetri BN, Contos MJ, Sanyal AJ. Nash Clinical Research Network. Comparison of noninvasive markers of fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7(10): Dixon JB, Bhathal PS, O'Brien PE. Nonalcoholic fatty liver disease: predictors of nonalcoholic steatohepatitis and liver fibrosis in the severely obese. Gastroenterology 2001; 121: Campos GM, Bambha K, Vittinghoff E et al. A clinical scoring system for predicting nonalcoholic steatohepatitis in morbidly obese patients. Hepatology 2008; 47: Ulitsky A, Ananthakrishnan AN, Komorowski R et al. A noninvasive clinical scoring model predicts risk of nonalcoholic steatohepatitis in morbidly obese patients. Obes Surg 2010; 20: Younossi ZM, Page S, Rafiq N et al. A biomarker panel for non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and NASH-related fibrosis. Obes Surg 2010; 8 June 136 Σ ελίδα

141 283 Anty R, Iannelli A, Patouraux S, et al. A new composite model including metabolic syndrome, alanine aminotransferase and cytokeratin-18 for the diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis in morbidly obese patients. Aliment Pharmacol Ther. 2010;32: Palekar NA, Naus R, Larson SP, Ward J, Harrison SA. Clinical model for distinguishing nonalcoholic steatohepatitis from simple steatosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2006;26: Feldstein AE, Lopez R, Abu-Rajab Tamimi T et al. Mass spectrometric profiling of oxidized lipid products in human nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. J Lipid Res 2010;51: Dechêne A, Sowa J-P, Gieseler RK, Jochum C, Bechmann LP, et al. (2010) Acute liver failure is associated with elevated liver stiffness and hepatic stellate cell activation. Hepatology 52: Suzuki A, Angulo P, Lymp J, Li D, Satomura S, Lindor K. Hyaluronic acid, an accurate serum marker for severe hepatic fibrosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int.2005;25: Lydatakis H, Hager IP, Kostadelou E, Mpousmpoulas S, Pappas S, Diamantis I. Noninvasive markers to predict the liver fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int 2006; 26: Sakugawa H, et al. Clinical usefulness of biochemical markers of liver fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 2005;11(2): Yoneda M, Mawatari H, Fujita K, et al. Type IV collagen 7s domain is an independent clinical marker of the severity of fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis before the cirrhotic stage. J Gastroenterol. 2007;42: Palekar NA, et al. Clinical model for distinguishing nonalcoholic steatohepatitis from simple steatosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Liver Int. 2006;26(2): Nobili V, Alisi A, Torre G, De Vito R, Pietrobattista A, et al. (2010) Hyaluronic acid predicts hepatic fibrosis in children with nonalcoholic fatty liver disease. Transl Res 156: Santos VN, et al. Serum laminin, type IV collagen and hyaluronan as fibrosis markers in nonalcoholic fatty liver disease. Braz J Med Biol Res. 2005;38(5): Kaneda H, Hashimoto E, Yatsuji S, Tokushige K, Shiratori K. Hyaluronic acid levels can predict severe fibrosis and platelet counts can predict cirrhosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease.j Gastroenterol Hepatol. 2006;21: Bugianesi E, et al. Relative contribution of iron burden, HFE mutations, and insulin resistance to fibrosis in nonalcoholic fatty liver. Hepatology. 2004;39(1): Kowdley KV, et al. Serum ferritin is an independent predictor of histologic severity and advanced fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2012;55(1): Manousou P, et al. Serum ferritin is a discriminant marker for both fibrosis and inflammation in histologically proven non-alcoholic fatty liver disease patients. Liver Int. 2011;31(5): Tahan V, Canbakan B, Balci H, et al. Serum gamma-glutamyltranspeptidase distinguishes non-alcoholic fatty liver disease at high risk. Hepatogastroenterology. 2008;55: Σ ελίδα

142 299 Harrison SA, Oliver D, Arnold HL, et al. Development and validation of a simple NAFLD clinical scoring system for identifying patients without advanced disease. Gut 2008;57: Raszeja-Wyszomirska J, et al. Validation of the BARD scoring system in Polish patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) BMC Gastroenterol. 2010;10: Ruffillo G, Fassio E, Alvarez E, et al. Comparison of NAFLD fibrosis score and BARD score in predicting fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease. J Hepatol. 2011;54: Fujii H, Enomoto M, Fukushima W, Tamori A, Sakaguchi H, Kawada N. Applicability of BARD score to Japanese patients with NAFLD. Gut. 2009;58: Kruger FC, et al. APRI: a simple bedside marker for advanced fibrosis that can avoid liver biopsy in patients with NAFLD/NASH. S Afr Med J. 2011;101(7): Cales P, Laine F, Boursier J, et al. Comparison of blood tests for liver fibrosis specific or not to NAFLD. J Hepatol. 2009;50: Loaeza-del-Castillo A, Paz-Pineda F, Oviedo-Cardenas E, Sanchez-Avila F, Vargas- Vorackova F. AST to platelet ratio index (APRI) for the noninvasive evaluation of liver fibrosis. Ann Hepatol.2008;7: Fujii H, Enomoto M, Fukushima W, et al. Noninvasive laboratory tests proposed for predicting cirrhosis in patients with chronic hepatitis C are also useful in patients with nonalcoholic steatohepatitis. J Gastroenterol. 2009;44: Sheth SG, et al. AST/ALT ratio predicts cirrhosis in patients with chronic hepatitis C virus infection. Am J Gastroenterol. 1998;93(1): Sumida Y, et al. Validation of the FIB4 index in a Japanese nonalcoholic fatty liver disease population. BMC Gastroenterol. 2012;12(1): Angulo P, Hui JM, Marchesini G, et al. The NAFLD fibrosis score: a noninvasive system that identifies liver fibrosis in patients with NAFLD. Hepatology. 2007;45: Qureshi K, Clements RH, Abrams GA. The utility of the NAFLD fibrosis score in morbidly obese subjects with NAFLD. Obes Surg. 2008;18(3): Wong VW, et al. Validation of the NAFLD fibrosis score in a Chinese population with low prevalence of advanced fibrosis. Am J Gastroenterol. 2008;103(7): Poynard T, Ratziu V, Benhamou Y, Thabut D, Moussalli J. Biomarkers as a first-line estimate of injury in chronic liver diseases: time for a moratorium on liver biopsy? Gastroenterology. 2005;128: Halfon P, Imbert-Bismut F, Messous D, Antoniotti G, Benchetrit D, Cart-Lamy P, Delaporte G, Doutheau D, Klump T, Sala M, Thibaud D, Trepo E, Thabut D, Myers RP, Poynard T. A prospective assessment of the inter-laboratory variability of biochemical markers of fibrosis (FibroTest) and activity (ActiTest) in patients with chronic liver disease. Comp Hepatol. 2002;1: Imbert-Bismut F, Messous D, Thibaut V, Myers RB, Piton A, Thabut D, Devers L, Hainque B, Mercadier A, Poynard T. Intra-laboratory analytical variability of biochemical markers of fibrosis (Fibrotest) and activity (Actitest) and reference ranges in healthy blood donors. Clin Chem Lab Med. 2004;42: Poynard T, Munteanu M, Imbert-Bismut F, Charlotte F, Thabut D, Le Calvez S, Messous D, Thibault V, Benhamou Y, Moussalli J, Ratziu V. Prospective Analysis of Discordant Results between Biochemical Markers and Biopsy in Patients with Chronic Hepatitis C. Clin Chem. 2004;50: Σ ελίδα

143 316 Munteanu M, Messous D, Thabut D, Imbert-Bismut F, Jouys M, Massard J, Piton A, Bonyhay L, Ratziu V, Hainque B, Poynard T. Intra-individual fasting versus postprandial variation of biochemical markers of liver fibrosis (FibroTest) and activity (ActiTest) Comp Hepatol. 2004;3: Poynard T, Imbert-Bismut F, Munteanu M, Messous D, Myers RP, Thabut D, Ratziu V, Mercadier A, Benhamou Y, Hainque B. Overview of the diagnostic value of biochemical markers of liver fibrosis (FibroTest, HCV FibroSure) and necrosis (ActiTest) in patients with chronic hepatitis C. Comp Hepatol. 2004;3: Westwood M, Aplin JD, Collinge IA, Gill A, White A, Gibson JM. alpha 2-Macroglobulin: a new component in the insulin-like growth factor/insulin-like growth factor binding protein-1 axis. J Biol Chem. 2001;276: Zahnd GR, Scheidegger JJ. Role of alpha-2-macroglobulin of human serum in the fixation in vitro of iodine-131 labeled bovine insulin. Helv Med Acta. 1963;30: Gray RS, James K, Merriman J, Starkey IR, Elton RA, Clarke BF, Duncan LJ. Alpha 2- macroglobulin and proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Horm Metab Res. 1982;14: Poynard T, Morra R, Halfon P, et al. Meta-analyses of FibroTest diagnostic value in chronic liver disease. BMC Gastroenterol.2007;7: Parkes J, Roderick P, Harris S, et al. Enhanced liver fibrosis test can predict clinical outcomes in patients with chronic liver disease.gut. 2010;59: Ratziu V, Giral P, Charlotte F, Bruckert E, Thibault V, Theodorou I, et al. Liver fibrosis in overweight patients. Gastroenterology 2000; 118: Laine F, Bendavid C, Moirand R, Tessier S, Perrin M, Guillygomarc'h A, Guyader D, Calon E, Renault A, Brissot P, Turlin B, Deugnier Y. Prediction of liver fibrosis in patients with features of the metabolic syndrome regardless of alcohol consumption. Hepatology. 2004;39: DiMartini A, Day N, Lane T, Beisler AT, Dew MA, Anton R. Carbohydrate deficient transferrin in abstaining patients with end-stage liver disease. Alcohol Clin Exp Res Dec;25(12): Rosenberg WMC, Voelker M, Thiel R, Becka M, Burt A, Schuppan D, Hubscher S, Roskams T, Pinzani M, Arthur MJP, on behalf of the European Liver Fibrosis Group Serum Markers Detect the Presence of Liver Fibrosis: A Cohort Study. Gastroenterology. 2004;127: Guha IN, et al. Noninvasive markers of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease: Validating the European Liver Fibrosis Panel and exploring simple markers. Hepatology. 2008;47(2): Nobili V, et al. Performance of ELF serum markers in predicting fibrosis stage in pediatric nonalcoholic fatty liver disease. Gastroenterology. 2009;136(1): Iijima, H., Moriyasu, F., Tsuchiya, K. et al. Decrease in accumulation of ultrasound contrast microbubbles in non-alcoholic steatohepatitis. Hepatol Res. 2007; 37: Fraquelli M, et al. Reproducibility of transient elastography in the evaluation of liver fibrosis in patients with chronic liver disease. Gut. 2007;56(7): Gomez-Dominguez E, et al. Transient elastography: a valid alternative to biopsy in patients with chronic liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 2006;24(3): Chang PE, et al. Prospective evaluation of transient elastography for the diagnosis of hepatic fibrosis in Asians: comparison with liver biopsy and aspartate transaminase platelet ratio index. Aliment Pharmacol Ther. 2008;28(1): Σ ελίδα

144 333 Myers RP, et al. Transient elastography for the noninvasive assessment of liver fibrosis: a multicentre Canadian study. Can J Gastroenterol. 2010;24(11): Wong VW, et al. Diagnosis of fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 2010;51(2): Yoneda M, Yoneda M, Fujita K, et al. Transient elastography in patients with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) Gut.2007;56: Nobili V, et al. Accuracy and reproducibility of transient elastography for the diagnosis of fibrosis in pediatric nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2008;48(2): Foucher J, et al. Prevalence and factors associated with failure of liver stiffness measurement using FibroScan in a prospective study of 2114 examinations. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2006;18(4): Tomeno W, Yoneda M, Imajo K, Suzuki K, Ogawa Y, et al. Evaluation of the Liver Fibrosis Index calculated by using real-time tissue elastography for the non-invasive assessment of liver fibrosis in chronic liver diseases. Hepatol. Res Castera L, Foucher J, Bernard PH, Carvalho F, Allaix D, Merrouche W, Couzigou P, de Ledinghen V. Pitfalls of liver stiffness measurement: a 5-year prospective study of 13,369 examinations. Hepatology. 2010;51: Myers RP, et al. Feasibility and diagnostic performance of the FibroScan XL probe for liver stiffness measurement in overweight and obese patients. Hepatology. 2012;55(1): de Ledinghen V, Wong VWS, Vergniol J, Wong GLH, Foucher J, Chu SHT, et al. Diagnosis of liver fibrosis and cirrhosis using liver stiffness measurement: comparison between M and XL probe of FibroScan. J Hepatol. 2012;56: Lupsor M, Badea R, Stefanescu H, et al. Performance of unidimensional transient elastography in staging non-alcoholic steatohepatitis. J Gastrointestin Liver Dis 2010; 19: Petta S, Di Marco V, Cammà C, Butera G, Cabibi D, Craxì A. Reliability of liver stiffness measurement in non-alcoholic fatty liver disease: the effects of body mass index. Aliment Pharmacol Ther 2011; 33: Romero-Gomez M, et al. Optical analysis of computed tomography images of the liver predicts fibrosis stage and distribution in chronic hepatitis C. Hepatology. 2008;47(3): Mariappan YK, Glaser KJ, Ehman RL. Magnetic resonance elastography: a review. Clin Anat. 2010;23(5): Huwart L, et al. Magnetic resonance elastography for the noninvasive staging of liver fibrosis. Gastroenterology. 2008;135(1): Kim BH, et al. MR elastography for noninvasive assessment of hepatic fibrosis: experience from a tertiary center in Asia. J Magn Reson Imaging. 2011;34(5): Friedrich-Rust M, Romen D, Vermehren J, et al. Acoustic radiation force impulse-imaging and transient elastography for non-invasive assessment of liver fibrosis and steatosis in NAFLD. Eur J Radiol 2012; 81: Colombo S, Buonocore M, Del Poggio A, et al. Head-to-head comparison of transient e lastography (TE), real-time tissue elastography (RTE), and acoustic radiation force impulse (ARFI) imaging in the diagnosis of liver fibrosis. J Gastroenterol 2012; 47: Schwenge K JP, AllardWorld JP. Clinical approaches to non-alcoholic fatty liver disease J Gastroenterol 2014; 20(7): Σ ελίδα

145 351 Capristo E, Miele L, Forgione A, Vero V, Farnetti S, Mingrone G, Greco AV, Gasbarrini G, Grieco A. Nutritional aspects in patients with non-alcoholic steatohepatitis (NASH) Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2005;9: Promrat K, Kleiner DE, Niemeier HM, Jackvony E, Kearns M, Wands JR, Fava JL, Wing RR. Randomized controlled trial testing the effects of weight loss on nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2010;51: Thoma C, Day CP, Trenell MI. Lifestyle interventions for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease in adults: a systematic review. J Hepatol. 2012;56: Zelber-Sagi S, Ratziu V, Oren R. Nutrition and physical activity in NAFLD: an overview of the epidemiological evidence. World J Gastroenterol. 2011;17: Lazo M, Solga SF, Horska A, Bonekamp S, Diehl AM, Brancati FL, Wagenknecht LE, Pi- Sunyer FX, Kahn SE, Clark JM. Effect of a 12-month intensive lifestyle intervention on hepatic steatosis in adults with type 2 diabetes. Diabetes Care. 2010;33: Kantartzis K, Thamer C, Peter A, Machann J, Schick F, Schraml C, Königsrainer A, Königsrainer I, Kröber S, Niess A, et al. High cardiorespiratory fitness is an independent predictor of the reduction in liver fat during a lifestyle intervention in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 2009;58: St George A, Bauman A, Johnston A, Farrell G, Chey T, George J. Effect of a lifestyle intervention in patients with abnormal liver enzymes and metabolic risk factors. J Gastroenterol Hepatol. 2009;24: Hallsworth K, Fattakhova G, Hollingsworth KG, Thoma C, Moore S, Taylor R, Day CP, Trenell MI. Resistance exercise reduces liver fat and its mediators in non-alcoholic fatty liver disease independent of weight loss. Gut. 2011;60: Attar BM, Van Thiel DH. Current concepts and management approaches in nonalcoholic fatty liver disease. ScientificWorldJournal. 2013;2013: Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, et al. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J Clin Invest. 2001;108: Stumvoll M, Nurjhan N, Perriello G, Dailey G, Gerich JE. Metabolic effects of metformin in non-insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 1995;333: Mazza A, Fruci B, Garinis GA, Giuliano S, Malaguarnera R, Belfiore A. The role of metformin in the management of NAFLD. Exp Diabetes Res. 2012;2012: Nair S, Diehl AM, Wiseman M, Farr GH, Perrillo RP. Metformin in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis: a pilot open label trial. Aliment Pharmacol Ther. 2004;20: Nobili V, Manco M, Ciampalini P, Alisi A, Devito R, Bugianesi E, Marcellini M, Marchesini G. Metformin use in children with nonalcoholic fatty liver disease: an open-label, 24- month, observational pilot study. Clin Ther. 2008;30: Haukeland JW, Konopski Z, Eggesbø HB, von Volkmann HL, Raschpichler G, Bjøro K, Haaland T, Løberg EM, Birkeland K. Metformin in patients with non-alcoholic fatty liver disease: a randomized, controlled trial. Scand J Gastroenterol. 2009;44: Van Wagner LB, Rinella ME. The role of insulin-sensitizing agents in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Therap Adv Gastroenterol. 2011;4: Caldwell SH, Argo CK, Al-Osaimi AM. Therapy of NAFLD: insulin sensitizing agents. J Clin Gastroenterol. 2006;40 Suppl 1:S61 S Ratziu V, Giral P, Jacqueminet S, Charlotte F, Hartemann-Heurtier A, Serfaty L, Podevin P, Lacorte JM, Bernhardt C, Bruckert E, et al. Rosiglitazone for nonalcoholic steatohepatitis: one-year results of the randomized placebo-controlled Fatty Liver 141 Σ ελίδα

146 Improvement with Rosiglitazone Therapy (FLIRT) Trial. Gastroenterology. 2008;135: Belfort R, Harrison SA, Brown K, Darland C, Finch J, Hardies J, Balas B, Gastaldelli A, Tio F, Pulcini J, et al. A placebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. N Engl J Med. 2006;355: Lutchman G, Modi A, Kleiner DE, Promrat K, Heller T, Ghany M, Borg B, Loomba R, Liang TJ, Premkumar A, et al. The effects of discontinuing pioglitazone in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 2007;46: Aithal GP, Thomas JA, Kaye PV, Lawson A, Ryder SD, Spendlove I, Austin AS, Freeman JG, Morgan L, Webber J. Randomized, placebo-controlled trial of pioglitazone in nondiabetic subjects with nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 2008;135: Sanyal AJ, Chalasani N, Kowdley KV, McCullough A, Diehl AM, Bass NM, Neuschwander-Tetri BA, Lavine JE, Tonascia J, Unalp A, et al. Pioglitazone, vitamin E, or placebo for nonalcoholic steatohepatitis. N Engl J Med. 2010;362: Harrison SA, Torgerson S, Hayashi P, Ward J, Schenker S. Vitamin E and vitamin C treatment improves fibrosis in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Am J Gastroenterol. 2003;98: Miller ER, Pastor-Barriuso R, Dalal D, Riemersma RA, Appel LJ, Guallar E. Metaanalysis: high-dosage vitamin E supplementation may increase all-cause mortality. Ann Intern Med. 2005;142: Klein EA, Thompson IM, Tangen CM, Crowley JJ, Lucia MS, Goodman PJ, Minasian LM, Ford LG, Parnes HL, Gaziano JM, et al. Vitamin E and the risk of prostate cancer: the Selenium and Vitamin E Cancer Prevention Trial (SELECT) JAMA. 2011;306: Lindor KD, Kowdley KV, Heathcote EJ, Harrison ME, Jorgensen R, Angulo P, Lymp JF, Burgart L, Colin P. Ursodeoxycholic acid for treatment of nonalcoholic steatohepatitis: results of a randomized trial. Hepatology. 2004;39: Santos VN, Lanzoni VP, Szejnfeld J, Shigueoka D, Parise ER. A randomized double-blind study of the short-time treatment of obese patients with nonalcoholic fatty liver disease with ursodeoxycholic acid. Braz J Med Biol Res. 2003;36: Masterton GS, Plevris JN, Hayes PC. Review article: omega-3 fatty acids - a promising novel therapy for non-alcoholic fatty liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 2010;31: Capanni M, Calella F, Biagini MR, Genise S, Raimondi L, Bedogni G, Svegliati-Baroni G, Sofi F, Milani S, Abbate R, et al. Prolonged n-3 polyunsaturated fatty acid supplementation ameliorates hepatic steatosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease: a pilot study. Aliment Pharmacol Ther. 2006;23: Chatrath H, Vuppalanchi R, Chalasani N. Dyslipidemia in patients with nonalcoholic fatty liver disease. Semin Liver Dis. 2012;32: Athyros VG, Mikhailidis DP, Papageorgiou AA, Symeonidis AN, Pehlivanidis AN, Bouloukos VI, Elisaf M. The effect of statins versus untreated dyslipidaemia on renal function in patients with coronary heart disease. A subgroup analysis of the Greek atorvastatin and coronary heart disease evaluation (GREACE) study. J Clin Pathol. 2004;57: Maroni L, Guasti L, Castiglioni L, Marino F, Contini S, Macchi V, De Leo A, Gaudio G, Tozzi M, Grandi AM, et al. Lipid targets during statin treatment in dyslipidemic patients affected by nonalcoholic fatty liver disease. Am J Med Sci. 2011;342: Σ ελίδα

147 383 Ekstedt M, Franzén LE, Mathiesen UL, Holmqvist M, Bodemar G, Kechagias S. Statins in non-alcoholic fatty liver disease and chronically elevated liver enzymes: a histopathological follow-up study. J Hepatol. 2007;47: Tandra S, Vuppalanchi R. Use of statins in patients with liver disease. Curr Treat Options Cardiovasc Med. 2009;11: Chalasani N, Younossi Z, Lavine JE, Diehl AM, Brunt EM, Cusi K, Charlton M, Sanyal AJ. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases, American College of Gastroenterology, and the American Gastroenterological Association. Hepatology. 2012;55: Iacono A, Raso GM, Canani RB, Calignano A, Meli R. Probiotics as an emerging therapeutic strategy to treat NAFLD: focus on molecular and biochemical mechanisms. J Nutr Biochem. 2011;22: Parnell JA, Raman M, Rioux KP, Reimer RA. The potential role of prebiotic fibre for treatment and management of non-alcoholic fatty liver disease and associated obesity and insulin resistance. Liver Int. 2012;32: Daubioul CA, Horsmans Y, Lambert P, Danse E, Delzenne NM. Effects of oligofructose on glucose and lipid metabolism in patients with nonalcoholic steatohepatitis: results of a pilot study. Eur J Clin Nutr. 2005;59: Solga SF, Buckley G, Clark JM, Horska A, Diehl AM. The effect of a probiotic on hepatic steatosis. J Clin Gastroenterol. 2008;42: Aller R, De Luis DA, Izaola O, Conde R, Gonzalez Sagrado M, Primo D, De La Fuente B, Gonzalez J. Effect of a probiotic on liver aminotransferases in nonalcoholic fatty liver disease patients: a double blind randomized clinical trial. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2011;15: Cotrim HP, Daltro C. Liver: Does bariatric surgery reduce the severity of NAFLD? Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2010;7: NIH conference. Gastrointestinal surgery for severe obesity. Consensus Development Conference Panel. Ann Intern Med. 1991;115: Baker MK, Byrne TK, Feldmann ME. Surgical treatment of obesity. Prim Care. 2009;36: Moschen AR, Molnar C, Wolf AM, Weiss H, Graziadei I, Kaser S, Ebenbichler CF, Stadlmann S, Moser PL, Tilg H. Effects of weight loss induced by bariatric surgery on hepatic adipocytokine expression. J Hepatol. 2009;51: Furuya CK, de Oliveira CP, de Mello ES, Faintuch J, Raskovski A, Matsuda M, Vezozzo DC, Halpern A, Garrido AB, Alves VA, et al. Effects of bariatric surgery on nonalcoholic fatty liver disease: preliminary findings after 2 years. J Gastroenterol Hepatol. 2007;22: Chavez-Tapia NC, Tellez-Avila FI, Barrientos-Gutierrez T, Mendez-Sanchez N, Lizardi- Cervera J, Uribe M. Bariatric surgery for non-alcoholic steatohepatitis in obese patients. Cochrane Database Syst Rev. 2010;(1):CD Schattenberg JM, Schuppan D. Nonalcoholic steatohepatitis: the therapeutic challenge of a global epidemic. Curr. Opin. Lipidol. 2011; 22: Kornek M, Lynch M, Mehta SH et al. Circulating microparticles as disease-specific biomarkers of severity of inflammation in patients with hepatitis C or nonalcoholic steatohepatitis. Gastroenterology 2012; 143: Σ ελίδα

148 399 MacKenzie SH, Schipper JL, Clark AC. The potential for caspases in drug discovery. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2010; 13: Hatting M, Zhao G, Schumacher F et al. Hepatocyte caspase-8 is an essential modulator of steatohepatitis in mice. Hepatology 2013(in press). 401 Anstee QM, Concas D, Kudo H et al. Impact of pan-caspase inhibition in animal models of established steatosis and non-alcoholic steatohepatitis. J. Hepatol. 2010; 53: Ratziu V, Sheikh MY, Sanyal AJ et al. A phase 2, randomized, double-blind, placebocontrolled study of GS-9450 in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2012; 55: Robson SC, Schuppan D. Adenosine: tipping the balance towards hepatic steatosis and fibrosis. J. Hepatol. 2010; 52: Imarisio C, Alchera E, Sutti S et al. Adenosine A(2a) receptor stimulation prevents hepatocyte lipotoxicity and non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in rats. Clin. Sci. (Lond) 2012; 123: Stensel D. Exercise, appetite and appetite-regulating hormones: implications for food intake and weight control. Ann. Nutr. Metab.2010; 57 (Suppl. 2): Massa F, Mancini G, Schmidt H et al. Alterations in the hippocampal endocannabinoid system in diet-induced obese mice. J. Neurosci. 2010; 30: Holst JJ. Incretin hormones and the satiation signal. Int. J. Obes. (Lond) 2013; DOI: /ijo Balaban YH, Korkusuz P, Simsek H et al. Dipeptidyl peptidase IV (DDP IV) in NASH patients. Ann. Hepatol. 2007; 6: Miura K, Kitahara Y, Yamagishi S. Combination therapy with nateglinide and vildagliptin improves postprandial metabolic derangements in Zucker fatty rats. Horm. Metab. Res. 2010; 42: Kern M, Kloting N, Niessen HG et al. Linagliptin improves insulin sensitivity and hepatic steatosis in diet-induced obesity. PLoS ONE2012; 7: e Mells JE, Fu PP, Sharma S et al. Glp-1 analog, liraglutide, ameliorates hepatic steatosis and cardiac hypertrophy in C57BL/6J mice fed a Western diet. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2012; 302: G Trevaskis JL, Griffin PS, Wittmer C et al. Glucagon-like peptide-1 receptor agonism improves metabolic, biochemical, and histopathological indices of nonalcoholic steatohepatitis in mice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2012; 302: G Sharma S, Mells JE, Fu PP, Saxena NK, Anania FA. GLP-1 analogs reduce hepatocyte steatosis and improve survival by enhancing the unfolded protein response and promoting macroautophagy. PLoS ONE 2011; 6: e Nagasawa T, Inada Y, Nakano S et al. Effects of bezafibrate, PPAR pan-agonist, and GW501516, PPARdelta agonist, on development of steatohepatitis in mice fed a methionine- and choline-deficient diet. Eur. J. Pharmacol. 2006; 536: Larter CZ, Yeh MM, Van Rooyen DM, Brooling J, Ghatora K, Farrell GC. Peroxisome proliferator-activated receptor-alpha agonist, Wy , improves metabolic indices, steatosis and ballooning in diabetic mice with non-alcoholic steatohepatitis. J. Gastroenterol. Hepatol. 2012; 27: Serrano-Marco L, Barroso E, El K I et al. The peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) beta/delta agonist GW inhibits IL-6-induced signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) activation and insulin resistance in human liver cells.diabetologia 2012; 55: Σ ελίδα

149 417 Ratziu V, Giral P, Jacqueminet S et al. Rosiglitazone for nonalcoholic steatohepatitis: one-year results of the randomized placebo-controlled fatty liver improvement with rosiglitazone therapy (FLIRT) trial. Gastroenterology 2008; 135: Cariou B, Zair Y, Staels B, Bruckert E. Effects of the new dualppar alpha/delta agonist GFT505 on lipid and glucose homeostasisin abdominally obese patients with combined dyslipidemia orimpaired glucose metabolism. Diabetes Care 2011; 34: Katsuno K, Fujimori Y, Ishikawa-Takemura Y, Isaji M. Long-termtreatment with sergliflozin etabonate improves disturbed glucosemetabolism in KK-A(y) mice. Eur. J. Pharmacol. 2009; 618: Goutopoulos A, Makriyannis A. From cannabis to cannabinergics: new therapeutic opportunities. Pharmacol Ther 95: , Gallily R, Breuer A, Mechoulam R. 2-Arachidonylglycerol, an endogenous cannabinoid, inhibits tumor necrosis factor-alpha production in murine macrophages, and in mice. Eur J Pharmacol 2000; 406: R5-R7, Varga K, Wagner JA, Bridgen DT, Kunos G. Platelet- and macrophage-derived endogenous cannabinoids are involved in endotoxin-induced hypotension. FASEB J 12: , Batkai S, Jarai Z, Wagner JA, Goparaju SK, Varga K, Liu J, Wang L, Mirshahi F, Khanolkar AD, Makriyannis A, Urbaschek R, Garcia N, Jr., Sanyal AJ, Kunos G. Endocannabinoids acting at vascular CB1 receptors mediate the vasodilated state in advanced liver cirrhosis. Nat Med 7: , Wang Y, Liu Y, Ito Y, Hashiguchi T, Kitajima I, Yamakuchi M, Shimizu H, Matsuo S, Imaizumi H, Maruyama I. Simultaneous measurement of anandamide and 2- arachidonoylglycerol by polymyxin B-selective adsorption and subsequent highperformance liquid chromatography analysis: increase in endogenous cannabinoids in the sera of patients with endotoxic shock. Anal Biochem 294: 73-82, Gabbay E. Endocannabinoids and liver disease - review. Liver int 25: , Neff GW, O'Brien CB, Reddy KR, Bergasa NV, Regev A, Molina E, Amaro R, Rodriguez MJ, Chase V, Jeffers L, Schiff E. Preliminary observation with dronabinol in patients with intractable pruritus secondary to cholestatic liver disease. Am J Gastroenterol 97: , Pi-Sunyer F, Aronne L, Heshmati H, Devin J, Rosenstock J. Effect of rimonabant, a cannabinoid-1 receptor blocker, on weight and cardiometabolic risk factors in overweight or obese patients: RIONorth America: a randomized controlled trial. JAMA 2006;295: Van Gaal L, Rissanen A, Scheen A, Ziegler O, Rössner S. Effects of the cannabinoid-1 receptor blocker rimonabant on weight reduction and cardiovascular risk factors in overweight patients: 1-year experience from the RIO-Europe study. Lancet 2005;365: Gary-Bobo M, Elachouri G, Gallas JF, Janiak P, Marini P, Ravinet-Trillou C, Chabbert M, Cruccioli N, Pfersdorff C, Roque C, Arnone M, Croci T, Soubrie P, Oury-Donat F, Maffrand JP, Scatton B, Lacheretz F, Le FG, Herbert JM, Bensaid M. Rimonabant reduces obesity-associated hepatic steatosis and features of metabolic syndrome in obese Zucker fa/fa rats. Hepatology 46: , Van Gaal LF, Rissanen AM, Scheen AJ, Ziegler O, Rossner S. Effects of the cannabinoid-1 receptor blocker rimonabant on weight reduction and cardiovascular risk factors in overweight patients: 1-year experience from the RIO-Europe study. Lancet 365: , Σ ελίδα

150 431 Cleland JG, Ghosh J, Freemantle N, Kaye GC, Nasir M, Clark AL, Coletta AP. Clinical trials update and cumulative meta-analyses from the American College of Cardiology: WATCH, SCD-HeFT, DINAMIT, CASINO, INSPIRE, STRATUS-US, RIO-Lipids and cardiac resynchronisation therapy in heart failure. Eur J Heart Fail 6: , Black SC. Cannabinoid receptor antagonists and obesity. Curr Opin Investig Drugs 5: , Janero DR, Lindsley L, Vemuri VK, Makriyannis A. Cannabinoid 1G protein-coupled receptor (periphero-)neutral antagonists: emerging therapeutics for treating obesity-driven metabolic disease and reducing cardiovascular risk. Expert Opin. Drug Discov. 2011; 6: Pagotto U, Pasquali R. Fighting obesity and associated risk factors by antagonising cannabinoid type 1 receptors. Lancet 2005; 365: Adorini L, Pruzanski M, Shapiro D. Farnesoid X receptor targeting to treat nonalcoholic steatohepatitis. Drug Discov. Today 2012; 17: Zhang S, Wang J, Liu Q, Harnish DC. Farnesoid X receptor agonist WAY attenuates liver inflammation and fibrosis in murine model of non-alcoholic steatohepatitis. 146 Σ ελίδα

151 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 147 Σ ελίδα

152 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ο Εισαγωγή Η μη αλκοολική λιπώδης νόσος του ήπατος (non-alcoholic fatty liver disease NAFLD) είναι μια ολοένα αυξανόμενα αναγνωριζόμενη νόσος η οποία εξελίσσεται μέσω ίνωσης, σε κλινική εικόνα μη αντιρροπούμενης κίρρωσης, ηπατικής ανεπάρκειας και ΗΚΚ (1,2).Η NAFLD αποτελεί σήμερα μία από τις πιο συχνές ασθένειες του ήπατος παγκοσμίως και την συχνότερη χρόνια ηπατοπάθεια στον Δυτικό κόσμο (2,3.4). Τα δεδομένα από την Εθνική έρευνα υγείας και διατροφής στην Αμερική, στο χρονικό διάστημα , δείχνουν ότι η επικράτηση των κοινών χρόνιων ηπατικών νοσημάτων παραμένει σταθερή εκτός από την NAFLD που αυξάνει συνεχώς (4). Η παθολογοανατομική εικόνα αντιπροσωπεύει ένα φάσμα καταστάσεων που χαρακτηρίζονται ιστολογικά από υπερβολική συσσώρευση λίπους (κυρίως τριγλυκεριδίων) στα ηπατοκύτταρα απουσίας κατανάλωσης αλκοόλ.(5,6) Η NAFLD αφορά ένα ευρύ φάσμα κλινικοπαθολογοανατομικών εικόνων που κυμαίνεται από την απλή λιπώδη διήθηση μέχρι τη μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (non-alcoholic steatohepatitis NASH) με ή χωρίς ίνωση. (7,8) Θεωρείται δε το ηπατικό μανιφέστο του μεταβολικού συνδρόμου γιατί οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ανάπτυξή της συνδυάζονται με χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου ή με την αντίσταση στην ινσουλίνη. Επομένως η NAFLD είναι στενά συνδεδεμένη με: Δυσανεξία στην γλυκόζη, Σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ 2), υπέρταση, δυσλιπιδαιμία (κυρίως υπερτριγλυκεριδαιμία) και στεφανιαία νόσο.(9.10,11) Ο πραγματικός επιπολασμός της NAFLD στο γενικό πληθυσμό είναι δύσκολο να καθοριστεί λόγω εμπλοκής πολλών παραγόντων όπως η ένταση των κλινικών συμπτωμάτων που ποικίλλει, η έλλειψη επιβεβαιωτικών εργαστηριακών εξετάσεων, η απροθυμία των ιατρών να υποβάλλουν τους ασθενείς σε βιοψία ήπατος όταν υπάρχουν λίγα ή καθόλου κλινικά σημεία και συμπτώματα και η έλλειψη ειδικής απεικονιστικής εξέτασης που να προσφέρει ομοιόμορφη και αντικειμενική ταξινόμηση(8, 12, 13). Εν τούτοις, οι νεότερες μελέτες, που χρησιμοποιούν μη επεμβατικές μεθόδους ανίχνευσης πληθυσμού, είναι ενδεικτικές ότι στο γενικό πληθυσμό ο επιπολασμός της NAFLD και NASH είναι περίπου 20% και 3%, αντιστοίχως(13, 14,15). Πιο σύγχρονες μελέτες αναφέρουν ότι όλο το φάσμα της NAFLD από την απλή ηπατική στεάτωση έως την NASH με τις ιστολογικές αλλαγές της ηπατικής φλεγμονής/νέκρωσης/ηπατοκυτταρικής βλάβης με ίνωση, επηρεάζει συνολικά το 30%-9% των ανθρώπων στις ανεπτυγμένες και αναπτυσσόμενες χώρες αντιστοίχως καθιστώντας την NAFLD ως την συχνότερη πάθηση του ήπατος στον κόσμο (15,16). Στην Ελλάδα υπολογίζεται ότι ο επιπολασμός της NAFLD κυμαίνεται στο 15-20% του πληθυσμού (17,8% σε μελέτες αιμοδοτών) (17). Ο επιπολασμός της NAFLD αυξάνεται όμως σε ειδικές υποομάδες του γενικού πληθυσμού οι οποίες έχουν ως κοινό παρανομαστή την υπερινσουλιναιμία και την αντίσταση στην ινσουλίνη. Τέτοιοι πληθυσμοί είναι οι παχύσαρκοι με επιπολασμό 60 95%, ασθενείς με σακχαρώδη διαβήτη τύπου II (ΣΔ2) με επιπολασμό 28 75% και ασθενείς με υπερλιπιδαιμία, του τύπου της υπερτριγλυκεριδαιμία κυρίως και λιγότερο της υπερχοληστερολαιμίας με επιπολασμό 20 92% (5,18, 19,20,21,22). Η παρουσία αυτών των καταστάσεων που αποτελούν συστατικά στοιχεία του μεταβολικού συνδρόμου, συνδέεται επίσης και με τριπλάσιο κίνδυνο ανάπτυξης NASH μεταξύ των ατόμων που έχουν NAFLD. Αυτό έχει επιβεβαιωθεί και με πρόσφατες μελέτες που συνδέουν την παθογένεια της λιπώδους βλάβης του ήπατος με μεταβολικές διαταραχές του τύπου της αντίστασης στην ινσουλίνη (12,20,23). Συγκεκριμένα, το μεταβολικό σύνδρομο σχετίζεται με υψηλότερο κίνδυνο γεφυροποιού ίνωσης που είναι το αρχικό στάδιο της κίρρωσης, χωρίς διαφορές στο βαθμό της στεάτωσης και της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητος (24). Περίπου το 33% των ασθενών με NASH αναπτύσσουν ίνωση (1). Η κίρρωση και η θνητότητα από αυτή, συμβαίνουν αντίστοιχα στο 26% και 8% των ασθενών με NASH σε διάστημα 10-ετίας. (12,21,22,25,26 27). Νεώτερες μελέτες σε NAFLD ασθενείς που υπέστησαν 148 Σ ελίδα

153 επαναλαμβανόμενες βιοψίες ήπατος με την πάροδο του χρόνου, δείχνουν ότι οι ασθενείς με ιστολογική παρουσία Nash, σε ποσοστό 30-53% αναπτύσσουν Nash-ίνωση μέσα σε μία χρονική διάρκεια 3-6,5 ετών(15,16). Αρκετοί ερευνητές έχουν αποδείξει ότι η NASH είναι το κύριο αίτιο της κρυψιγενoύς κιρρώσεως(28,29). Η κρυψιγενής κίρρωση θεωρείται πλέον αποτέλεσμα της εξέλιξης της NASH σε προχωρημένη ίνωση-κίρρωση («καμένη» NASH). Φαίνεται ότι ασθενείς με κρυψιγενή κίρρωση είχαν στο παρελθόν σε ποσοστό >70% NASHίνωση γιατί είναι ασθενείς παχύσαρκοι, με ΣΔ2 ή με άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου (15,16).Το ποσοστό της ολικής επικράτησης του ΗΚΚ που αποδίδεται σε κρυψιγενή κίρρωση είναι 7%.(15,16) Εκτός από τους ασθενείς με κρυψιγενή κίρρωση που έχουν ΗΚΚ και που πιθανότατα το συνολικό πρόβλημα οφείλεται στην «καμένη» NASH, οι ασθενείς με NASHκίρρωση, φαίνεται να έχουν αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης ΗΚΚ.(15,16) Η 5ετής αθροιστική επίπτωση του ΗΚΚ σε ασθενείς με NASH-σοβαρή ίνωση (F3,F4) φαίνεται να είναι περίπου στο 20%. (15,16) Η NAFLD είναι μία "σιωπηλή" νόσος. Επομένως για την διάγνωσή της, σε κάποιον ασθενή που στο υπέρηχο άνω κοιλίας εμφανίζει ηπατική στεάτωση, θα πρέπει να έχει αποκλεισθεί η κατάχρηση αλκοόλ (<20gr/ημέρα), να υπάρχουν από το ιστορικό ενδείξεις χαρακτηριστικών του μεταβολικού συνδρόμου και να έχουν αποκλεισθεί τα δευτεροπαθή αίτια της ηπατικής στεάτωσης. Στα δευτεροπαθή αίτια ηπατικής στεάτωσης περιλαμβάνονται : διατροφικές αιτίες (ταχεία απώλεια βάρους ή ολική παρεντερική διατροφή), σπάνιες μεταβολικές διαταραχές (καχεξία, λιποδυστροφία, αβηταλιποπρωτεϊναιμία), χρήση ναρκωτικών ουσιών, ενδοκρινικές διαταραχές (υποθυρεοειδισμός, υπεραλδοστερινισμός, σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, υποφυσισμός), φάρμακα (μεθοτρεξάτη, ταμοξυφαίνη, βαλπροϊκό, τιλτιαζέμη, οιστρογόνα, αμιοδαρόνη, κορτικοειδή, αντιρετροϊκά), τοξίνες (χλωριούχο βινύλιο), εντερική χειρουργική παράκαμψη για την παχυσαρκία, HIV λοίμωξη, HCV λοίμωξη συνήθως γονότυπος 3, αιμοχρωμάτωση, αυτοάνοσος ηπατοπάθεια, ανεπάρκεια α1-αντιθρυψίνης, ν. Wilson s. Επομένως η υποψία της NAFLD διάγνωσης τίθεται συνήθως σε ασυμπτωματικά άτομα που σε εξέταση ρουτίνας, έχουν τις απλές βιοχημικές δοκιμασίες της ηπατικής λειτουργίας φυσιολογικές ή ελαφρά αυξημένες και ηπατική στεάτωση στον υπέρηχο άνω κοιλίας και ο έλεγχος για άλλη πάθηση, υπεύθυνη για τις διαταραχές αυτές, είναι αρνητικός. Προς το παρών δεν υπάρχει κάποια μη επεμβατική εξέταση ρουτίνας που να μπορεί να διακρίνει την απλή ηπατική στεάτωση από την στεατοηπατίτιδα (NASH), όπως επίσης την στεατοηπατίτιδα(nash) από την NASH-ίνωση σε αυτούς τους "φαινομενικά" υγιείς ασθενείς με NAFLD. Έτσι η βιοψία ήπατος παραμένει ο "χρυσούς κανών" διαγνωστικής εξέτασης προς αναγνώριση τόσο του βαθμού ηπατικής φλεγμονής όσο και του σταδίου ηπατικής ίνωσης. Το κύριο ιστολογικό χαρακτηριστικό της NAFLD είναι η μακροφυσσαλιδώδης στεάτωση που αφορά κυρίως τις περιφλεβικές-περικολποειδικές περιοχές (acinar zone 3). Σε σοβαρότερες περιπτώσεις επεκτείνεται σε όλο το ηπατικό λοβίο (Εικόνες 1,2). Δεν υπάρχει σαφής οριακή τιμή για το πόσες φυσαλίδες λίπους είναι ορατές στην οπτική μικροσκόπηση, πάνω από την οποία θεωρείται παθολογική η βιοψία. Το συμβατικό όριο είναι 5% των ηπατοκυττάρων να διηθούνται(30). Εν τούτοις αυτό δε στηρίζεται σε ακλόνητα πειραματικά δεδομένα. Όταν η ηπατική στεάτωση συνοδεύεται από ιστολογικά χαρακτηριστικά νεκρωτικής φλεγμονής, τίθεται η διάγνωση της NASH. Το κύριο χαρακτηριστικό της νεκρωτικής φλεγμονής και της ηπατοκυτταρικής βλάβης στη NAFLD είναι η διόγκωση (ballooning) των ηπατοκυττάρων, η οποία μερικές φορές σχετίζεται με σχηματισμό σωματιδίων υαλίνης Mallory. Τα σωμάτια Mallory στη NAFLD είναι μικρά και όχι καλά ανεπτυγμένα. Μερικές φορές χρειάζονται ανοσοϊστοχημικές μέθοδοι για να ανιχνεύσουμε αυτό το ιστολογικό χαρακτηριστικό. Λοβιδιακή φλεγμονή με μικτή διήθηση από ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα και μακροφάγα είναι δυνατόν να ανιχνεύεται, αν και συνήθως είναι ήπια(31). Η ίνωση μερικές φορές είναι εύρημα της στεατοηπατίτιδας και χρησιμεύει για τη σταδιοποίηση της νόσου. Το τυπικό μοντέλο ίνωσης στη NAFLD είναι περικολποειδικής ή περικυτταρικής κατανομής(εικόνα 3). Τελικά αναπτύσσεται «γεφύρωση» και ανάπτυξη κίρρωσης (Εικόνα 4). Αφού αναπτυχθεί η κίρρωση τα χαρακτηριστικά της στεατοηπατίτιδας 149 Σ ελίδα

154 υποχωρούν(32).η τριχοειδοποίηση των κολποειδών και η ανάπτυξη πυλαιοσυστηματικής επικοινωνίας έχουν προταθεί για να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο (33). Εικόνα 1: Έντονη panacinar μακροφυσσαλιδώδης στεάτωση (Αιματοξυλίνη & Ηωσίνη). Εικόνα 2: Σφηνοειδής βιοψία ληφθείσα σε βαριατρικό χειρουργείο. Ένα πυλαίο αγγείο φαίνεται στο κέντρο. Έντονη περιπυλαία μακροφυσσαλιδώδης στεάτωση (acinar zone 3) ή (περιλοβιδιακή ζώνη 3)(Αιματοξυλίνη& Ηωσίνη). 150 Σ ελίδα

155 Εικόνα 3: Περιαγγειακή ίνωση σε NAFLD. Η στεάτωση και η διόγκωση (ballooning) των ηπατοκυττάρων υποχωρούν σε προχωρημένα στάδια ίνωσης (van Gieson). Εικόνα 4: Κίρρωση σε NAFLD. Γεφυροποιός ίνωση και αναγεννητικοί όζοι συνυπάρχουν με ήπια στεάτωση (Van Gieson). 151 Σ ελίδα

156 Ο παθολογοανατομικός ορισμός των διαφόρων σταδίων της νόσου, δεν είχε καθοριστεί επακριβώς και διαφορετικοί ορισμοί χρησιμοποιούνταν από διαφορετικούς συγγραφείς(34.35). Έτσι το σύστημα διαβάθμισης της NAFLD (Πίνακας 1) που ανέπτυξαν οι Brunt και συν. το 1999 έγινε ευρέως αποδεκτό. Αυτή η βαθμολογία ενοποιεί τις βλάβες της στεάτωσης και της νεκρωτικής φλεγμονής σε ένα βαθμό (grade) και της ίνωσης σε ένα στάδιο (stage)(36) Πίνακας 1: βαθμοί και στάδια ιστοπαθολογικών βλαβών της NAFLD κατά Brunt [36] Βαθμός (Grade) νέκρωσης και φλεγμονής Βαθμός 1 Ήπιος Στεάτωση (κυρίως μακροφυσσαλιδώδης) στο ως 60% του βιοπτικού υλικού Ενίοτε κενοτοπιώδη εκφύλιση ηπατοκυττάρων ζώνης 3 (ballooning ηπατοκύτταρα) Μικρή διήθηση από πολυμορφοπύρηνα κύτταρα στη ζώνη 3 (περικολποειδική ή περιλοβιδιακή) Καθόλου ή πολύ ήπια χρόνια πυλαία φλεγμονή Βαθμός 2 Μέτριος Οποιουδήποτε βαθμού στεάτωση με εμφανή κενοτοπιώδη εκφύλιση των ηπατοκυττάρων, (κυρίως στη ζώνη 3 ballooning) Διήθηση ζώνης 3 από πολυμορφοπύρηνα και συσχέτιση αυτής με περικυτταρική ίνωση στη ζώνη 3 Ήπια προς μέτρια χρόνια φλεγμονή στη ζώνη 3 καθώς και περιπυλαία Βαθμός 3 Σοβαρός Στεάτωση όλης της ζώνης (πανλοβιδιακή) Εμφανής κενοτοπιώδης εκφύλιση ballooning και αποδιοργάνωση αρχιτεκτονικής κυρίως στη ζώνη 3 Φλεγμονή εντός της ζώνης (ενδολοβιδιακά) με σκόρπια πολυμοφοπύρηνα, πολυμορφοπύρηνα σχετιζόμενα με «ballooning» ηπατοκύτταρα Ήπια ή μέτρια χρόνια περιπυλαία/πυλαία φλεγμονή Στάδιο (stage) ίνωσης Στάδιο 1 Περικολποειδική / περικυτταρική ίνωση στη ζώνη 3 εστίες ή διάχυτα Στάδιο 2 Περικολποειδική / περικυτταρική ίνωση ζώνης 3 με εστιακή ή διάχυτη περιπυλαία ίνωση Στάδιο 3 Περικολποειδική / περικυτταρική ίνωση και πυλαία ίνωση με εστιακή ή διάχυτη γεφυροποιό ίνωση Στάδιο 4 Κίρρωση Αν και αυτό το σύστημα βαθμολόγησης είναι ελκυστικό,δεν είναι άμεσα εφαρμόσιμο σε όλο το φάσμα της NAFLD. Έτσι η πολυκεντρική συνεργασία «Clinical Research Network for NASH» (37) ανέπτυξε ένα ιστοπαθολογικό σύστημα βαθμολόγησης που αφορά όλο το φάσμα της δραστηριότητας της NASH. Σε αυτό περιλαμβάνονται 14 ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά 152 Σ ελίδα

157 και χρησιμοποιεί πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση (multiple logistic regression) για να δημιουργήσει το «NAFLD activity score» (NAS). Το NAS είναι το άθροισμα της στεάτωσης, της λοβιδιακής φλεγμονής και του ηπατοκυτταρικού «ballooning». Με NAS 5 τίθεται η διάγνωση της NASH, NAS 3 ή 4 της οριακής (borderline) NASH, και NAS < 3 της μη NASH (38).Το NAS score είναι απλό και επομένως ελκυστικό για την βαθμολόγηση της σοβαρότητας της NASH, αλλά οι συγγραφείς αναφέρουν ότι οι αριθμητικές αξίες δεν υποκαθιστούν τη διαγνωστική εμπειρία του παθολογοανατόμου. Κάνοντας κάποιες μικρές τροποποιήσεις της ταξινόμησης της ίνωσης κατά Brunt και συν, προέκυψε η ιστολογική ταξινόμηση της NASH-ίνωσης κατά Kleiner. Σε μια μελέτη των Matteoni και συν. το 1999, (34) προτάθηκε μια νέα ιστολογική ταξινόμηση της NAFLD που είναι "ευκολόχρηστο" εργαλείο κατά την διεξαγωγή ερευνητικών μελετών. Σύμφωνα με αυτή η NAFLD διακρίνεται σε τέσσερεις τύπους: απλή λιπώδης διήθηση (τύπος 1), λιπώδης διήθηση με λοβιδιακή φλεγμονή (τύπος 2), λιπώδης διήθηση με κενοτοπιώδη εκφύλιση (ballooning) των ηπατοκυττάρων (τύπος 3) και λιπώδης διήθηση μαζί με κενοτοπιώδη εκφύλιση, σε συνδυασμό με σωμάτια υαλίνης του Mallory ή ίνωση (τύπος 4). Οι δύο τελευταίοι τύποι θεωρούνται ότι συνθέτουν τη NASH. Η ταξινόμηση αυτή έχει κλινική σημασία καθώς η ύπαρξη νέκρωσης (κενοτοπιώδης εκφύλιση) και ίνωσης, σχετίζονται με την προοδευτική εξέλιξη σε κίρρωση. Η ταξινόμηση αυτή στηρίζεται στην παθολογοανατομική διάγνωση της στεατονέκρωσης με τα σωμάτια Mallory και την ίνωση. Η βιοψία ήπατος παρέχει σημαντικές προγνωστικές πληροφορίες και παραμένει κεφαλαιώδης στην ανάπτυξη θεραπευτικών πρωτοκόλλων για ορισμένες μορφές της NAFLD. Επειδή όμως η βιοψία ήπατος έχει δυνητικές επιπλοκές και αποτελεί μια επεμβατική μέθοδο που έχει και άλλα μειονεκτήματα πλην των επιπλοκών, όπως δειγματοληπτικό σφάλμα και μεταβλητότητα του παρατηρητή, δεν είναι άμεσα εφαρμόσιμη σε όλους τους ασθενείς, ούτε είναι εφικτό να υφίστανται επαναλαμβανόμενες βιοψίες για παρακολούθηση της πορείας και της επιτυχίας ή μη της θεραπείας (2). Υπάρχει λοιπόν μεγάλη ανάγκη ανευρέσεως μη επεμβατικών μεθόδων παρακολούθησης της βαρύτητας της ηπατικής ίνωσης. Πολλές κλινικές παράμετροι έχουν προταθεί σαν προγνωστικοί δείκτες της ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD: η μεγάλη ηλικία, ο ΣΔ2, η παχυσαρκία, οι τρανσαμινάσες ορού, τα αιμοπετάλια αίματος, και άλλοι (1,2,12,13,14,18,22,25 ). Σημαντική πρόοδος έχει γίνει και στο πεδίο των απεικονιστικών τεχνικών. Πολυάριθμες μελέτες έχουν επίσης εκτιμήσει διάφορους δείκτες του ορού σαν προγνωστικούς δείκτες ίνωσης σε άλλες καταστάσεις όπως η ηπατίτιδα C (39-42). Παρόλα αυτά, τα δεδομένα για τη χρησιμότητα τέτοιων δεικτών δεν επαρκούν για την καθιέρωσή τους στην εκτίμηση του βαθμού της ίνωσης και στη διάκριση μεταξύ ήπιας NAFLD και NASH (1,2,14). Η καλύτερη κατανόηση της παθοφυσιολογίας της ίνωσης στη NASH και η αναγνώριση νέων παθογενετικών μηχανισμών, σχετικά με την λιποτοξικότητα και την NAFLD / NASH/ίνωσης, δίνει νέες προοπτικές στην ανεύρεση ορολογικών δεικτών του μεταβολισμού της διάμεσης ουσίας στο ήπαρ όπως το υαλουρονικό οξύ, η λαμινίνη, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες-2, το αμινοτελικό-προπεπτίδιο του προκολλαγόνου τύπου ΙΙΙ, ιστικοί αναστολείς της μεταλλοπρωτεϊνάσης-1, φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και ορμόνες. Οι δείκτες αυτοί εμπλέκονται με την παραγωγή κολλαγόνου στο λιπώδες ήπαρ και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν μη επεμβατικοί βιοχημικοί δείκτες ηπατικής ίνωσης στη NASH (1,2,11,14,43). Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αναγνωρίσουμε μη επεμβατικούς αξιόπιστους βιοχημικούς δείκτες όπως συστατικά του εξωκυττάριου διάμεσου ιστού ή ορμόνες που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν εναλλακτικοί της ηπατικής βιοψίας, για τη διάγνωση και την παρακολούθηση της NASH και της σχετιζόμενης με αυτήν ίνωσης. Ιδανικά οι δείκτες αυτοί θα πρέπει να απαντάνε σε δύο ερωτήματα: πρώτον, ποιο είναι το στάδιο της ινωτικής βλάβης του οργάνου (δηλαδή το ποσό του εναποτιθέμενου εξωκυττάριου διάμεσου ιστού και η διαταραχή της ηπατικής μικρο-αρχιτεκτονικής) και δεύτερον, ποια είναι η ισορροπία μεταξύ εναπόθεσης και αποδόμησης της εξωκυττάριου διάμεσης ουσίας (δηλαδή η δυναμική του μεταβολισμού της εξωκυττάριου ουσίας). Επιπροσθέτως, οι δείκτες αυτοί θα πρέπει να είναι απλοί, άμεσα διαθέσιμοι, οικονομικοί, ακριβείς στην πρόγνωση του πλήρους φάσματος της ηπατικής νόσου, αναπαραγώγιμοι και χρήσιμοι όχι μόνο για τη διάγνωση αλλά 153 Σ ελίδα

158 και για την παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου. Τέλος, αυτοί οι μη επεμβατικοί δείκτες ίνωσης θα πρέπει να μην έχουν στενή συσχέτιση με τη φλεγμονώδη δραστηριότητα (grading) της NASH, ώστε να περιορίζεται η αξία τους στην ορθή εκτίμηση του βαθμού ίνωσης (staging) και να μην χάνουν από τη θετική προγνωστική τους αξία. Στην προσπάθεια ανεύρεσης μη επεμβατικών αξιόπιστων βιοχημικών δεικτών μεταβολισμού της εξωκυττάριου ουσίας, που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σαν εναλλακτικοί της ηπατικής βιοψίας για τη διάγνωση της NASH, μελετήσαμε τα επίπεδα ορού του υαλουρονικού οξέος (Hyaluronic acid :HA), της λαμινίνης (ΛΜ) και της λεπτίνης (ΛΠ) για την εκτίμηση της ύπαρξης και του βαθμού της ίνωσης σε ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένη NASH. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πληθυσμός της μελέτης Από το 2000 ως το 2004 συνολικά 115 ασθενείς εξετάσθηκαν για πιθανή είσοδο στη μελέτη και τελικά περιελήφθησαν 50 άτομα. Οι ασθενείς αυτοί είχαν δείκτη μάζας σώματος (body mass index BMI) >25 kg/m2, ηλικία μεταξύ 27 και 74 ετών, και διακρίνονταν σε 23 γυναίκες και 27 άντρες. Όλοι έπασχαν από NASH, η οποία είχε αποδειχθεί από το ιατρικό ιστορικό, τις εργαστηριακές εξετάσεις και με ηπατική βιοψία. Συγκεκριμένα, ο πληθυσμός της μελέτης είχε τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: όλοι είχαν BMI > 25 Kg/m2 και ήταν ασυμπτωματικοί, με μέση τιμή AST 106,94 (εύρος ) και ALT 98,96 (εύρος ). Είχαν επίσης ένα ή περισσότερα από τα συστατικά του μεταβολικού συνδρόμου ή της αντίστασης στην ινσουλίνη: ΣΔ2, κεντρική παχυσαρκία ( BMI > 30kg/m2), υπερτριγλυκεριδαιμία (triglyceride > 1,7 mmol/l). Η υπερηχογραφία ήπατος κατέδειξε λιπώδη διήθηση σε όλους. Άλλες αιτίες ηπατικής νόσου αποκλείσθηκαν όπως : η κατανάλωση αλκοόλ περισσότερου από 20 gr/ημέρα, η λήψη ηπατοτοξικών φαρμάκων κατά το τελευταίο έτος, η ηπατίτιδα Β και C (ορολογικοί δείκτες για HBV και HCV αρνητικοί), αυτοάνοσα νοσήματα (ανοσολογικοί δείκτες αρνητικοί), μεταβολικά νοσήματα του ήπατος και δη η νόσος Wilson, η νόσος Weber-Christian, η αιμοχρωμάτωση και η ανεπάρκεια α1-αντιθρυψίνης και τέλος αποκλείσθηκαν ασθενείς με ιστορικό παρεντερικής διατροφής και χειρουργικών επεμβάσεων όπως η νηστιδοειλεϊκή παράκαμψη και η εκτομή λεπτού εντέρου. Ανθρωπομετρικά χαρακτηριστικά των ασθενών φαίνονται στον πίνακα 2. Ασθενείς με BMI μεταξύ kg/m2 ορίστηκαν ως υπέρβαροι, ενώ αυτοί με BMI > 30 kg/m2 ορίστηκαν σαν παχύσαρκοι (43). Ιστολογικά χαρακτηριστικά Ιστολογικά δείγματα με βιοψία ήπατος, ελήφθησαν και από τους 50 ασθενείς της μελέτης. Το υλικό μονιμοποιήθηκε σε ουδέτερη φορμόλη και ετέθη σε κύβους παραφίνης. Τα δείγματα προς εξέταση χρωματίσθηκαν με αιματοξυλίνη ηωσίνη για ανάλυση της μορφολογίας και τρίχρωμη Masson's για εκτίμηση της ίνωσης. Τα δείγματα εξετάσθηκαν από τον ίδιο παθολογοανατόμο με τη χρήση της συστηματικής ταξινόμησης του Matteoni που περιγράφηκε προηγουμένως (21). 154 Σ ελίδα

159 Ορολογικοί δείκτες Κατά την είσοδο στη μελέτη μετρήθηκαν η ηπατική βιοχημεία {τρανσαμινάσες [AST και ALT], γ-γλουταρυλτρανσφεράση [γgt], αλκαλική φωσφατάση [ALP], και χολερυθρίνη}, λιπίδια ορού (χοληστερόλη και εστέρες αυτής, τριγλυκερίδια νηστείας), γλυκόζη και ινσουλίνη. Δείγματα αίματος ελήφθησαν από όλους τους ασθενείς μετά από ολονύχτια νηστεία, φυγοκεντρήθηκαν και αποθηκεύτηκαν στους 80 o C μέχρι την εξέταση. Η λεπτίνη ορού αναλύθηκε με 2πλή ανοσοραδιομετρική μέθοδο (IRMA) όπως περιγράφηκε αρχικά από τους Miles και συν. (44) σε ειδικό αναλυτή (Human Leptin IRMA DSL 23100i). Η IRMA είναι μια μη ανταγωνιστική μέθοδος στην οποία η υπό μελέτη ουσία γίνεται «σάντουιτς» ανάμεσα σε δύο αντισώματα. Το ελάχιστο όριο ανίχνευσης είναι 0,10 ng/ml. Για να καθορίσουμε τις φυσιολογικές τιμές εξετάσαμε αίμα από 100 υγιείς εθελοντές. Τα επίπεδα αυτά υπολογίστηκαν στα 3,7 12,3 ng/ml. Οι μεταβλητές ποικιλότητας (coefficients of variation) της μεθόδου, εσωτερικώς (intra-assay) και εξωτερικώς (inter-assay) ήταν < 4,9% και < 6,6%, αντίστοιχα (n=12). Όλες οι δοκιμασίες έγιναν εις διπλούν. Η λαμινίνη ορού αναλύθηκε με εμπορικά διαθέσιμη ανταγωνιστική ενζυμική, ανοσολογική μέθοδο (EIA) (κιτ της TAKARA BIO Inc). Το EIA κιτ της λαμινίνης είναι μια ανοσοενζυμική μέθοδος που επιτρέπει την ποσοτική μέτρηση της λαμινίνης στο πλάσμα, στον ορό, στα ούρα, σε υλικό από κυτταροκαλλιέργειες και άλλα βιολογικά υγρά(45). Πρόκειται για κιτ συμπαγούς φάσης EIA, βασιζόμενο στη μέθοδο «σάντουιτς» που χρησιμοποιεί δύο μονοκλωνικά αντισώματα επίμυος σε δύο στάδια. Και εδώ τα φυσιολογικά όρια καθορίστηκαν μετά την εξέταση 100 υγιών εθελοντών και ήταν ng/ml. Οι μεταβλητές ποικιλότητας (coefficients of variation) της μεθόδου εσωτερικά (intra-assay) και εξωτερικά (inter-assay) ήταν 5,7% και 5,1%, αντίστοιχα (n=16). Όλες οι δοκιμασίες διενεργήθηκαν εις διπλούν. Το υαλουρονικό οξύ (ΗA: Hyaluronic Acid ) μετρήθηκε με μια μέθοδο ενζυμικής σύνδεσης πρωτεϊνών (enzyme-linked binding protein assay) στον ορό και στο πλάσμα (Corgenix; Colorado USA). Η μέθοδος HA της Corgenix, είναι μια δοκιμασία ενζυμικής σύνδεσης πρωτεϊνών που χρησιμοποιεί δίσκο με 96 μικρο-πηγάδια και μια φυσικώς παραγόμενη πρωτεΐνη σύνδεσης υαλουρονικού οξέος (hyaluronic acid binding protein HABP) που συνδέει ειδικά το HA και μια συνδεδεμένη με ένζυμα εκδοχή της HABP, ώστε να ανιχνευθεί και να μετρηθεί το HA από τα δείγματα των ασθενών(46).οι φυσιολογικές τιμές του HA ήταν ng/ml όπως υπολογίσθηκαν από τη μέτρηση των 100 υγιών εθελοντών. Οι μεταβλητές ποικιλότητας (coefficients of variation) της μεθόδου εσωτερικός (intra-assay) και εξωτερικός (inter-assay) ήταν 4,2% και 6,3%, αντίστοιχα (n=16). Στατιστική ανάλυση Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σαν μέσες τιμές ± σταθερές αποκλίσεις (SD). Ανάλογα με την κατανομή των δεδομένων οι συγκρίσεις μεταξύ των ποσοτικών μεταβλητών έγιναν με τη δοκιμασία Student t-test ή τη δοκιμασία Mann-Whitney. Οι συσχετίσεις μεταξύ ποιοτικών μεταβλητών έγιναν με τη δοκιμασία Pearson Χ-τετράγωνο. Για την ανάλυση μεταβλητότητας των βιοχημικών δεικτών ΗΑ, ΛΜ και ΛΠ, ανάμεσα στις διάφορες ομάδες, έγινε ανάλυση κατά Kruskal-Wallis. Τέλος, η δοκιμασία Spearman s rank correlation χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της συσχέτισης των ΗΑ, ΛΜ και ΛΠ με την ηλικία. Η διακριτική ικανότητα κάθε μεταβλητής εκτιμήθηκε με βάση την ευαισθησία, την ειδικότητα, τη θετική προγνωστική αξία, την αρνητική προγνωστική αξία και την ακρίβεια, με τον καθορισμό των ορίων cut-off της περιοχής υπό την καμπύλη (ROC) (47). Οι αναλύσεις έγιναν με το πρόγραμμα SPSS v.12 για Windows και κάθε p αξία < 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. 155 Σ ελίδα

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Χαρακτηριστικά ασθενών Οι 50 ασθενείς της μελέτης με NASH, χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με το αν ανήκαν στον τύπο 3 & 4 της ιστολογικής ταξινόμησης των Matteoni και συν (21). Οι 23 από τους 50 ασθενείς, που ονομάσθηκαν ομάδα 1, ανήκαν στον τύπο 4 και είχαν ίνωση του ήπατος. Οι υπόλοιποι 27 ασθενείς, που ονομάσθηκαν ομάδα 2, ανήκαν στον τύπο 3 και δεν είχαν ίνωση. Οι δύο ομάδες είχαν παρόμοιες μέσες τιμές ηλικίας, AST, ALT, BMI, ινσουλίνης νηστείας, γλυκόζης και τριγλυκεριδίων, καθώς και παρόμοια ποσοστά ανδρών και γυναικών (Πίνακας 2). Από την ομάδα 1, 10 ασθενείς και από την ομάδα 2, 11 ασθενείς είχαν ΣΔ2 αλλά δεν ελάμβαναν φαρμακευτική αγωγή γι αυτό. Πέντε ασθενείς από την ομάδα 1 και επτά από την ομάδα 2 είχαν υπερτριγλυκεριδαιμία. Οκτώ ασθενείς της ομάδος 1 και 9 ασθενείς της ομάδος 2 είχαν παχυσαρκία. Προφανώς δεν υπήρχαν διαφορές στη συχνότητα αυτών των παραγόντων ανάμεσα στις δύο ομάδες (Πίνακας 2). Δημογραφικά, ανθρωπομετρικά και εργαστηριακά δεδομένα (AST, ALT, γλυκόζη νηστείας, ινσουλίνη και τριγλυκερίδια νηστείας) των δύο ομάδων φαίνονται στον πίνακα 1, ενώ οι συγκρίσεις δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων. Ιστολογία Σε κάθε ένα από τα ιστολογικά δείγματα των 50 ασθενών της μελέτης αποδόθηκε ένας βαθμός του «grading» της στεάτωσης και της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας. Στα δείγματα της ομάδος 1 αποδόθηκε και ένας βαθμός του «staging» της ίνωσης σύμφωνα με το σύστημα των Brunt και συν.(36), οι οποίοι -όπως προαναφέραμε- πρότειναν ένα σύστημα βαθμολόγησης για τη μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα το Σύμφωνα με αυτό, οι ιστολογικές βλάβες της στεάτωσης και της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας βαθμολογούνται από το 0 έως το 3 και αποτελούν το «grading» και αυτές της ίνωσης από το 0 έως το 4 και αποτελούν το «staging» της NAFLD. Grade 0 σημαίνει απουσία στεάτωσης και φλεγμονής, grade 1 σημαίνει ήπιες βλάβες, grade 2 μέτριες βλάβες και grade 3 σοβαρές. Stage 0 σημαίνει απουσία ίνωσης, stage 1 σημαίνει ίνωση στη ζώνη 3, πέριξ των φλεβιδίων, περικολποειδικά και περικυτταρικά, εστιακή ή διάχυτη, stage 2 σημαίνει ότι και στο stage 1 συν εστιακή ή διάχυτη πυλαία ίνωση, stage 3 σημαίνει γεφυροποιό ίνωση εστιακή ή διάχυτη και stage 4 σημαίνει κίρρωση. Στη μελέτη μας από τους 23 ασθενείς της ομάδος 1 με NAFLD τύπου 4, οι 3 είχαν ήπια νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα και ηπατοκυτταρική στεάτωση (grade 1 NASH), οι 14 είχαν μέτρια στεάτωση και νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα (grade 2 NASH) και άλλοι 6 είχαν σοβαρή στεάτωση και νεκροφλεγμονώδη δραστηριότητα (grade 3 NASH). Όσον αφορά την ίνωση, οι 5 από τους 23 είχαν stage 1 NASH, οι 7 είχαν stage 2 NASH, οι 6 είχαν stage 3 NASH και οι υπόλοιποι 5 είχαν stage 4 NASH, δηλαδή κίρρωση. Από τους 27 ασθενείς της ομάδας 2 με NAFLD τύπου 3, όλοι είχαν staging 0 NASH, δηλαδή απουσία ίνωσης, ενώ οι 14 είχαν grade 1 NASH, οι 10 είχαν grade 2 NASH, και 3 είχαν grade 3 NASH. Τα ανωτέρω αποτελέσματα απεικονίζονται στον πίνακα 3. Βιοχημικοί δείκτες Η λεπτίνη, η λαμινίνη και το υαλουρονικό οξύ των ασθενών των δύο ομάδων, φαίνονται στον πίνακα 4. Ασθενείς με NASH και ίνωση, δηλαδή η ομάδα 1 είχαν σημαντικά υψηλοτέρα επίπεδα ΗΑ στον ορό συγκριτικά με αυτούς της ομάδος 2 με NASH χωρίς ίνωση (332,65 ± 223,28 έναντι 55,07 ± 57,93, αντίστοιχα, p < 0,001) (Εικόνα 5). Παρόμοια, τα επίπεδα λαμινίνης ορού ήταν 156 Σ ελίδα

161 σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς της ομάδος 1 συγκριτικά με αυτούς της ομάδος 2 (482,26 ± 395,90 έναντι 270,07 ± 57,04, αντίστοιχα, p < 0,001) (Εικόνα 6). Αντιθέτως, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων όσον αφορά τα επίπεδα λεπτίνης (23,66 ± 8,46 στην ομάδα 1 έναντι 26,13 ± 7,63 στην ομάδα 2, p = NS) (Εικόνα 7). Για να αποκλείσουμε την πιθανότητα τα επίπεδα του ΗΑ και της ΛΜ να επηρεάζονταν από την παρουσία και το βαθμό της νεκροφλεγμονώδους δραστηριότητας και της στεάτωσης, δηλαδή το grade της NASH, οι τιμές των ΗΑ και ΛΜ συγκρίθηκαν με το grade της NASH στις δύο ομάδες. Όπως φαίνεται στον πίνακα 5, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά της μέσης τιμής της συγκέντρωσης των ΗΑ, ΛΜ και ΛΠ ανάμεσα στα διάφορα grade της φλεγμονής και στις δύο ομάδες. Για να εκτιμήσουμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ των επιπέδων ΗΑ και ΛΜ και του stage της ίνωσης, οι τιμές αυτών αναλύθηκαν για κάθε επίπεδο stage στην ομάδα 1 (Πίνακας 6). Σημαντική διαφορά των τιμών του ΗΑ, μεταξύ των διαφόρων stage της ίνωσης, ανευρέθηκε (p < 0,001) με τη χρήση της δοκιμασίας Mann-Whitney για κάθε ζεύγος (stage 1: 167,20 ± 20,55, stage 2: 230,42 ± 55,40, stage 3: 287,33 ± 68,50, stage 4: 695,60 ± 207,51, p=0,05) (Εικόνα 8). Εν αντιθέσει, δεν ανευρεθεί στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των διαφόρων stage της ίνωσης όσον αφορά τα επίπεδα της ΛΜ (Εικόνα 9). Υπήρχε όμως σημαντική διαφορά μεταξύ των επιπέδων ΛΜ στο stage 4 (κίρρωση) και σε όλα τα υπόλοιπα stage (1 ως 3 συλλήβδην) (Πίνακας 7). Δεν ανιχνεύθηκε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των υπό μελέτη βιοχημικών δεικτών και της αιτίας της αντίστασης στην ινσουλίνη (Πίνακας 8), ούτε του φύλου των ασθενών (Πίνακας 9). Τέλος με τη χρήση της μεθόδου συσχέτισης κατά Spearman, δεν ανιχνεύθηκε συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και των επιπέδων του ΗΑ (p = 0,20), της ΛN (p = 0,19) και της ΛΠ (p = 0,64). Καθώς ανιχνεύθηκε σημαντική σχέση των επιπέδων ΗΑ και ΛΜ και της παρουσίας της ηπατικής ίνωσης, η ακρίβεια αυτών των δεικτών για την αναγνώριση των ασθενών με NASH και ίνωση εξετάσθηκε με τη χρήση της ROC ανάλυσης(47). Μετά τον υπολογισμό των διακριτικών αξιών του κάθε δείκτη, παρατηρήθηκε ότι σύμφωνα με την καμπύλη ROC την καλύτερη ακρίβεια για την αναγνώριση των ασθενών με NAFLD και ίνωση παρείχε η cut-off τιμή του ΗΑ των 148,8 ng/ml (ευαισθησία 95,7%, ειδικότητα 96,3%, θετική προγνωστική αξία 95,7%, αρνητική προγνωστική αξία 96,3%, ακρίβεια 96%). Αντίστοιχα για τα επίπεδα ΛΜ μια cut-off τιμή των 292,5 ng/ml είχε ευαισθησία 73,9%, ειδικότητα 74,1%, θετική προγνωστική αξία 70,8%, αρνητική προγνωστική αξία 76,9%, και ακρίβεια 74%), ενώ μια cut-off τιμή των 354,5 ng/ml έδινε ευαισθησία 56,5%, αλλά ειδικότητα 92,6%, θετική προγνωστική αξία 86,6%, αρνητική προγνωστική αξία 71,4%, και ακρίβεια 76%) (Πίνακας 10). 157 Σ ελίδα

162 Πίνακας 2: Δημογραφικά, ανθρωπομετρικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά των δύο ομάδων ασθενών. Ομάδα 1 (n=23) Ομάδα 2 (n=27) p Ηλικία (έτη) 52,48±14,04 51,41±13,38 NS Φύλο Άρρεν 14 (60,8%) 13 (48,1%) NS Θήλυ 9 (39,2%) 14 (51,9%) AST (IU//l) 110,17±40,68 104,19±49,07 NS ALT (IU//l) 108,39±38,47 90,93±34,60 NS Γλυκόζη νηστείας (mg/dl) 135,22±53,20 129,52±50,55 NS Τριγλυκερίδια νηστείας (mg/dl) 175,83±36,01 185,00±42,27 NS BMI (kg/m 2 ) 29,65±2,65 30,63±3,06 NS Ινσουλίνη νηστείας (μu/ml) 16,81±5,54 18,38±5,35 NS * Μέσες τιμές ± SD Πίνακας 3: Αποτελέσματα του grade και stage σε βιοψίες ασθενών με NASH των ομάδων 1 & 2. Ομάδα Grade φλεγμονής και στεάτωσης σε NASH Stage ίνωσης σε NASH Ήπια (1) Μέτρια (2) Σοβαρή (3) Περικολπο ειδική (1) Πυλαία (2) Γεφύρωση (3) Κίρρωση (4) Ομάδα 1 (n=23) Ομάδα 2 (n=27) Πίνακας 4: Μέσες συγκεντρώσεις υαλουρονικού οξέος, λαμινίνης και λεπτίνης σε κάθε ομάδα. Ομάδα 1 (n=23) Ομάδα 2 (n=27) p** Υαλουρονικό 332,65±223,28 55,07±57,93 <0,001 Λαμινίνη 482,26±395,90 270,07±57,04 <0,001 Λεπτίνη 23,66±8,46 26,13±7,63 NS * Μέσες τιμές ± SD (ng/ml), NS: statistically not significant ** δοκιμασία Mann-Whitney 158 Σ ελίδα

163 Πίνακας 5: Μέσες τιμές συγκεντρώσεων υαλουρονικού οξέος, λαμινίνης και λεπτίνης σύμφωνα με το grade σε κάθε ομάδα. Ομάδα 1 (n=23) Grade 1 (n=3) Grade 2 (n=14) Grade 3 (n=6) p Υαλουρονικό 438,00±418,72 333,00±226,29 279,16±77,42 NS Λαμινίνη 335,66±169,54 552,71±492,03 391,16±109,38 NS Λεπτίνη 25,00±12,16 21,50±7,62 28,05±8,24 NS Group 2 (n=27) Grade 1 (n=14) Grade 2 (n=10) Grade 3 (n=3) p Υαλουρονικό 46,64±24,35 61,70±91,50 72,33±30,59 NS Λαμινίνη 286,50±52,72 249,70±65,50 261,33±29,09 NS Λεπτίνη 26,10±7,81 25,05±7,33 29,93±9,60 NS * Μέσες συγκεντρώσεις ± SD (ng/ml), NS: statistically not significant ** Kruskal-Wallis ANOVA Πίνακας 6: Επίπεδα υαλουρονικού, λεπτίνης, λαμινίνης για κάθε stage της ίνωσης στην ομάδα 1 (n=23). Stage 1 (n=5) Stage 2 (n=7) Stage 3 (n=6) Stage 4 (n=5) p Υαλουρονικό 167,20±20,55 230,42±55,40 287,33±68,50 695,60±207,51 <0,001 Λαμινίνη 391,00±94,22 333,42±70,96 357,83±122,34 931,20±708,94 NS Λεπτίνη 22,88±11,07 24,10±9,29 26,81±8,71 20,06±3,90 NS * Μέσες τιμές±sd (ng/ml), NS: statistically not significant ** Kruskal-Wallis ANOVA Πίνακας 7: Μέσα επίπεδα Λαμινίνης σε ασθενείς με NASH και stage 1-3 συγκριτικά με stage 4. Stage 1-3 (n=18) Stage 4 (n=5) p Λαμινίνη 357,55±94,01 931,20±708,94 0,002 * μέσες συγκεντρώσεις±sd (ng/ml) ** Independent sample t-test 159 Σ ελίδα

164 Πίνακας 8: Σύγκριση επιπέδων υαλουρονικού, λαμινίνης και λεπτίνης ανάλογα με το αίτιο της ινσουλινοαντοχής στις δύο ομάδες (n=50). NIDDM & ΥΒ (n=15) NIDDM & ΠΣ (n=2) NIDDM, ΠΣ & ΥΤΓ (n=4) ΠΣ & ΥΤΓ (n=16) ΠΣ (n=13) p ΗΑ 145,86±101,64 255,00±63,63 56,00±25,13 224,62±273,18 201,69±248,86 0,63 ΛΜ 321,73±93,41 309,50±64,34 330,00±56,42 480,00±484,46 303,00±106,20 0,84 ΛΠ 25,47±7,95 36,65±3,74 27,62±8,26 24,50±8,12 22,46±7,55 0,19 * ΗΑ:υαλουρονικό(Hyaluronic), ΛΜ:λαμινίνη, ΛΠ:Λεπτίνη, NIDDM:Non Insulin-Dependent Diabetes Mellitus, ΥΒ:υπέρβαροι (BMI kg/m 2 ) ΠΣ:παχύσαρκοι (BMI>30 kg/m 2 ), ΥΤΓ: Υπερτριγλυκεριδαιμία (TG>170 mg/dl) ** μέσες τιμές±sd (ng/ml) *** Kruskal-Wallis ANOVA Πίνακας 9: σύγκριση επιπέδων υαλουρονικού, λεπτίνης και λαμινίνης ανάλογα με το φύλο στις δύο ομάδες (n=50). Άρρενες (n=27) Θήλεα (n=23) p Υαλουρονικό 203,07±236,38 158,91±173,72 0,46 Λαμινίνη 389,18±340,25 342,43±218,96 0,57 Λεπτίνη 24,32±7,73 25,79±8,50 0,52 * μέσες συγκεντρώσεις±sd (ng/ml) ** Student t-test Πίνακας 10: Διαγνωστική ακρίβεια των δεικτών ηπατικής ίνωσης στη NASH. Ανάλυση ROC Δείκτης Τιμή Ευ ΘΠΑ P Ει (%) ΑΠΑ (%) AUC (95% CI) cutoff (%) (%) value Ακρ (%) ΗΑ 0,975 (0,926-1,024) ΛΜ 0,789 (0,662-0,916) 0, ,50 95,7 96,3 95,7 96,3 96,0 0, ,50 73,9 74,1 70,8 76,9 74,0 354,50 56,5 92,6 86,6 71,4 76,0 ΗΑ:υαλουρονικό, ΛΜ:λαμινίνη, ROC:receiver operating characteristic, AUC:area under the curve, CI:confidence interval; Ευ:ευαισθησία, Ει;ειδικότητα, ΘΠΑ:θετική προγνωστική αξία, ΑΠΑ: αρνητική προγνωστική αξία, Ακρ:ακρίβεια. 160 Σ ελίδα

165 0,00 200,00 400,00 600,00 800, ,00 Group 2 1 Laminin (ng/ml) Group 1 2 0,00 500, , , ,00 Εικόνα 5 Hyaluronan (ng/ml) Εικόνα Σ ελίδα

166 300,00 400,00 500,00 600,00 700,00 Leptin (ng/ml) 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 Group 2 1 Εικόνα 7 Εικόνα 8 Mean of Hyaluronan (ng/ml) 162 Σ ελίδα

167 Firbosis stage ,00 400,00 500,00 600,00 700,00 800,00 900, ,00 Εικόνα 9 Mean of Laminin (ng/ml) Εικόνα 5. Τα επίπεδα Υαλουρονικού οξέως (ng/ml) σε ασθενείς με ίνωση (ομάδα 1) και χωρίς ίνωση (ομάδα 2) (Γράφημα με 95% όριο αξιοπιστίας). Εικόνα 6. Τα επίπεδα Λαμινίνης (ng/ml) σε ασθενείς με ίνωση (ομάδα 1) και χωρίς ίνωση (ομάδα 2) (Γράφημα με 95% όριο αξιοπιστίας). Εικόνα 7. Τα επίπεδα Λεπτίνης (ng/ml) σε ασθενείς με ίνωση (ομάδα 1) και χωρίς ίνωση (ομάδα 2) (Γράφημα με 95% όριο αξιοπιστίας). Εικόνα 8. Τα μέσα επίπεδα Υαλουρονικού οξέως ορού (ng/ml) σε ασθενείς με ίνωση (ομάδα 1) σε κάθε στάδιο της ίνωσης. Εικόνα 9. Τα μέσα επίπεδα Λαμινίνης ορού (ng/ml) σε ασθενείς με ίνωση (ομάδα 1) σε κάθε στάδιο της ίνωσης. 163 Σ ελίδα

168 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η ηπατική ίνωση είναι μια διαδικασία επούλωσης πληγών σε απόκριση προς μια οξεία ή χρόνια ηπατική βλάβη σε παρεγχυματικά κύτταρα. Κίρρωση θεωρείται το τελικό στάδιο της χρόνιας ηπατικής νόσου και είναι σε θέση να επηρεάσει τη ροή του αίματος και την ηπατική λειτουργία (48,49). Διαφορετικές ασθένειες του ήπατος μπορούν να δημιουργήσουν διαφορετικά πρότυπα ίνωσης (48,49). Η διαδικασία της αλλαγής από ίνωση σε κίρρωση και η εμφάνιση των κλινικών συμπτωμάτων μπορεί να εμφανίζονται συνήθως μετά από μια δεκαετία. Εξέλιξη της ίνωσης σε κίρρωση είναι ταχεία σε ορισμένες συνθήκες. Αυτό το φαινόμενο είναι κοινό σε ηπατική νόσος των νεογνών, σε επαναμόλυνση από ηπατίτιδα C μετά από μεταμόσχευση ήπατος, σε HIV και HCV συνλοίμωξη (48,49). Στην NASH αναφέρεται ότι εξέλιξη προς κίρρωση μπορεί να συμβεί και μέσα σε μία πενταετία εάν συνυπάρχουν χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου όπως σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 και αντίσταση στην ινσουλίνη ή παχυσαρκία. Πρόσφατα πειραματικά δεδομένα in vitro, έδειξαν ότι η υψηλή γλυκόζη και η υπερινσουλιναιμία αυξάνουν την παραγωγή των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όπως του κολλαγόνου τύπου Ι και τύπου IV,της λαμινίνης, του υαλουρονικού οξέως και της ινωδονεκτίνης, συνηγορώντας έτσι για τον θεμέλιο ρόλο της υπερινσουλιναιμίας στην παθογένεια της ίνωσης στην NASH (50,51). Το ένα τρίτο των μη παρεγχυματικών κυττάρων στο ήπαρ είναι ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (HSCs: Hepatic stellate cells) που υπάρχουν στον υποενδοθηλιακό χώρο του Disse (49,52). Σε χρόνια ηπατική βλάβη, HSCs υποβάλλονται σε μια σειρά από αλλαγές που είναι γνωστές ως «ενεργοποίηση», κατά την οποία τα HSCs διαφοροποιούνται σε μυοϊνοβλάστες που είναι σε θέση να πολλαπλασιάζονται, να προκαλούν ινογένεση, και να συστέλλονται (49). Ενεργοποίηση HSCs είναι το αποτέλεσμα μιας ανισορροπίας μεταξύ σύνθεσης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (Extracellula Matrix:ECM) και αποικοδόμησής της και της επίδρασης άλλων κυτταρικών παραγόντων όπως οι κυτταροκίνες. Μπορούμε να χωρίσουμε το φαινόμενο αυτό σε δύο φάσεις: έναρξη και διαιώνιση. Στην έναρξη ή προ-φλεγμονώδη φάση, αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση θα συμβούν και τα κύτταρα θα γίνουν ευπαθή σε κυτοκίνες και ερεθίσματα. Στη φάση διαιώνισης, ινογένεση θα συμβεί. Άλλα κύτταρα όπως ηπατοκύτταρα και κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα είναι επίσης παρόντα στο χώρο του Disse (49,52). Τα ηπατικά κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα είναι λειτουργικά και σημαντικά κύτταρα στην ηπατική ίνωση. Αυτά τα κύτταρα είναι ικανά να συνθέσουν φιμπρονεκτίνη σε πολύ πρώιμη φάση της ηπατικής βλάβης και να ενεργοποιήσουν τα HSCs. Αυτά τα κύτταρα είναι επίσης σε θέση να παράγουν κολλαγόνο τύπου IV, πρωτεογλυκάνη και ορισμένους παράγοντες που ενεργοποιούν τον TGF-b (Transforming growth factor beta) που είναι ένας ινογενετικός παράγοντας που παράγεται από πολλές πηγές, αλλά το μεγαλύτερο μέρος του εκφράζεται με αυτοκρινή τρόπο (49). Σε μια φυσιολογική κατάσταση, μη-ινώδη κολλαγόνο (τύπου IV και VI) όπως πρωτεογλυκάνες, θειική ηπαρίνη, και γλυκοπρωτεΐνες είναι τα κύρια συστατικά του ECM. Σε μια παθολογική κατάσταση, λόγω των επιπτώσεων των ινογενετικών παραγόντων όπως οι τύποι I και III κολλαγόνου που παράγουν ινώδη συνδετικό ιστό, μη κολλαγονικών γλυκοπρωτεϊνών όπως λαμινίνη, ινωδονεκτίνη, ουντουλίνη (undulin), εντακτίνη, βιτρονεκτίνη, τενασκίνη, οστεονεκτίνη και ελαστίνη, πρωτεογλυκάνες όπως η ηπαρίνη, δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη και διαφόρων γλυκοζαμινογλυκάνων όπως υαλουρονικό οξύ, αντικαθίσταται ο φυσιολογικός ηπατικός ιστός από ινώδη συνδετικό ιστό (53,54). Γενικά, η ηπατική εξωκυττάρια ουσία είναι ένα περίπλοκο σύστημα που χαρακτηρίζεται από πολυάριθμα συστατικά που πηγάζουν από αρκετές βιομοριακές οικογένειες. Η σύστασή της διαφέρει ανάλογα με την ανατομική εντόπιση. Η ίνωση σχετίζεται με αύξηση της συνολικής ποσότητας της εξωκυττάριας ουσίας, αλλαγή της κατανομής αυτής και μεταβολή στην σύνθεσή της. Βιοψία ήπατος είναι ακόμα και σήμερα, «το χρυσό πρότυπο» για την περιγραφή της ιστολογίας του ήπατος και τη λήψη αποφάσεων σχετικά με τις θεραπευτικές επιλογές 164 Σ ελίδα

169 (48,49,55). Αυτή η τεχνική είναι μια πολύτιμη μέθοδος, αλλά έχει κάποιες σημαντικές παρενέργειες, η πιο κοινή είναι η αιμορραγία στο ήπαρ και ο πόνος γύρω από την περιοχή της βιοψίας. Άλλα μειονεκτήματα περιλαμβάνουν δειγματοληψία από ένα μικρό ηπατικό τμήμα, τα ποσοστά θνησιμότητας και την υποκειμενική εκτίμηση της ίνωσης μεταξύ των παθολογοανατόμων (1,2,14,55). Παθολογοανατόμοι, αξιολογούν δείγματα βιοψίας από μία ποικιλία συστημάτων. Ishak, Metavir και Knodell συστήματα, είναι τα κατεξοχήν βαθμολογικά συστήματα αξιολόγησης του βαθμού φλεγμονής στο ήπαρ (grading) και του σταδίου ίνωσης (staging) (55).Όσον αφορά την NAFLD, στο τυπικό μοντέλο ίνωσης, υπάρχει περικολποειδική ή περικυτταρική κατανομή της ίνωσης που τελικά καταλήγει σε "γεφύρωση" και ανάπτυξη κίρρωσης. Η τριχοειδοποίηση των κολποειδών και η ανάπτυξη πυλαιοσυστηματικής επικοινωνίας έχουν προταθεί για να εξηγήσουν αυτό το φαινόμενο (32). Μέχρι το 2005 ίσχυε το βαθμολογικό σύστημα διαβάθμισης της NASH που ανέπτυξαν η Brunt και οι συνεργάτες της το 1999 (36). Η πολυκεντρική συνεργασία της ομάδας κλινικής έρευνας για την NASH "Clinical Research Network for NASH", ανέπτυξε το 2005 ένα σύστημα βαθμολόγησης που περιελάμβανε 14 ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της NAFLD και χρησιμοποιόντας πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση( multiple logistic regression) δημιούργησε το NAFLD activity score (NAS), για την εκτίμηση της φλεγμονώδους δραστηριότητας της NASH σε κλινικές μελέτες (38). Αυτή η νέα ιστοπαθολογική ταξινόμηση από τον Kleiner και τους συνεργάτες του, τροποποιεί λίγο την ιστολογική ταξινόμηση της ίνωσης από την Brunt et al δίνοντας μεγαλύτερη σημασία στον βαθμό της περικολποειδικής ίνωσης που είναι χαρακτηριστικό της NAFLD. Στην έρευνά μας χρησιμοποιήσαμε την ιστολογική ταξινόμηση της ίνωσης κατά Brunt et al γιατί ακόμα δεν είχαν δημοσιευθεί τα τροποποιημένα κατά Kleiner κριτήρια. Όμως μία μετέπειτα επαναξιολόγηση των ιστολογικών παρασκευασμάτων με τα κατά Kleiner κριτήρια, δεν επέφερε διαφορές στα αποτελέσματά μας. Την τελευταία δεκαετία, μια μεγάλη ποικιλία από μη επεμβατικές μεθόδους για την σταδιοποίηση της ίνωσης έχει μελετηθεί. Αυτές είναι ασφαλείς, εύκολες και επί του παρόντος κάποιες από αυτές έχουν επικυρωθεί για τη διάγνωση της ίνωσης και της κίρρωση του ήπατος σε αρκετές χρόνιες ηπατοπάθειες συμπεριλαμβάνουσας και την NAFLD. Περιλαμβάνουν διάφορες απεικονιστικές εξετάσεις, αιματολογικούς και βιοχημικούς δείκτες και συνδυαστικά μοντέλα απεικονιστικών με ορολογικές εξετάσεις. Απεικονιστικές εξετάσεις που περιλαμβάνουν αξονική τομογραφία, μαγνητική τομογραφία (MRI), υπερηχογράφημα, τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (PET-scan) και υπέρηχο-ελαστογραφία (Fibroscan), θεωρούνται σήμερα οι πιο ενδιαφέρουσες ακτινολογικές τεχνικές διερεύνησης ηπατικής βλάβης. Οι δοκιμές αυτές μπορούν να παρέχουν στοιχεία για την εκτίμηση της ηπατικής ίνωσης και πυλαίας υπέρτασης. Υπέρηχο-elastography (Fibroscan) μετρά την δυσκαμψία του ήπατος και προβλέπει το στάδιο της ίνωσης. Αυτή η μέθοδος είναι ικανή να μετρήσει την ακαμψίας σε όγκο του ήπατος που είναι 100 φορές μεγαλύτερος από τον όγκο του ήπατος δείγματος βιοψίας και έχει μια θετική προγνωστική αξία του 90% περίπου για την άμεση μέτρηση της προχωρημένη ίνωση. Η αξιοπιστία του Fibroscan ωστόσο, μπορεί να επηρεαστεί από διαφόρους παράγοντες όπως είναι τα επίπεδα αμινοτρανσφερασών (ALT,ΑST) ορού, η περίμετρος μέσης, ΒΜΙ κ.ά. Έτσι μια συμπληρωματική μη επεμβατική δοκιμασία μπορεί να είναι χρήσιμη στη διάγνωση και ιδίως στην διάγνωση της NAFLD που, όπως προαναφέραμε, αφορά κυρίως ασθενείς με ΒΜΙ>28 Kg/m2 ή περίμετρο μέσης αυξημένη λόγω μεταβολικού συνδρόμου(11,49,55-57). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως στο γενικό μέρος και στην εισαγωγή του ειδικού μέρους, οι ιατροί και οι ασθενείς προτιμούν να αποφεύγουν μια βιοψία ήπατος και τείνουν να επιλέγουν μη επεμβατικές μεθόδους προς αξιολόγηση της ηπατικής ίνωσης (57). Μελέτες, σχετικά με την αξιολόγηση της ηπατικής νόσου από τους δείκτες του ορού χρονολογούνται από το Αμινο-τελικό προπεπτίδιο του κολλαγόνου τύπου III (N-terminal propeptide of type III collagen: ΡΙΙΙΝΡ) ήταν ο πρώτος δείκτης ορού που προτάθηκε για την ταξινόμηση της ηπατικής ίνωσης σε χρόνιες ηπατοπάθειες (48). Ο κατάλογος των δεικτών του ορού είναι μεγάλος, οι πιο κοινοί ορολογικοί δείκτες που έχουν εξετασθεί συμπεριλαμβάνουν : AST, ALT, χολερυθρίνη, 165 Σ ελίδα

170 αλκαλική φωσφατάση, λευκωματίνη, χρόνος προθρομβίνης, γάμα-γλουταμυλτρανσφεράση (γ- GT), απτοσφαιρίνη, απολιποπρωτεΐνη Α1, α-2-μακροσφαιρίνη, δείκτες κολλαγόνου τύπου Ι, τύπου II, τύπου III, προκολλαγόνου Ι καρβοξύλιο τερματικό πεπτίδιο (procollagen I carboxyl terminal peptide:picp), C-πεπτίδιο προκολλαγόνου IV, Ν-πεπτίδιο προκολλαγόνου IV (περιοχής 7-S κολλαγόνου), κολλαγόνο IV, κολλαγενάσες (μεταλλοπρωτεϊνάσες) και οι αναστολείς τους (αναστολείς ιστικής μεταλλοπρωτεϊνάσης), γλυκοπρωτεΐνες όπως η ανθρώπινη γλυκοπρωτεΐνη χόνδρου (YKL-40), ινονεκτίνη, λαμινίνη, οστεονεκτίνη, τενασκίνη, γλυκοζαμινογλυκάνες όπως περλεκάνη, υαλουρονικό οξύ, ντεκορίνη, αγγρεκάνη, λουμικάνη, και ινωδομοντουλίνη (48,55,57). Μέχρι σήμερα για την διάγνωση και την σταδιοποίηση της NAFLD- Ίνωσης, έχουν χρησιμοποιηθεί ως μονομερείς βιοδείκτες : Υαλουρονικό οξύ (Hyaluronic acid: HA), το κολλαγόνο τύπου IV περιοχή 7- S, προκολλαγόνο τύπου ΙΙΙ, η Λαμινίνη, η γλυκοπρωτεΐνη YKL- 40, η φερριτίνη και η γ-gt. Όμως κανένας από τους παραπάνω βιοδείκτες δεν αποτελεί, προς το παρών από μόνος του, μία απολύτως ακριβή μέθοδο πρόβλεψης της παρουσίας και του σταδίου ηπατικής ίνωσης στην NAFLD αν και το ΗΑ έχει μία διαγνωστική απόδοση με υψηλή ακρίβεια (από 0,73-0,97) για την πρόβλεψη της προχωρημένης ίνωσης και κίρρωσης (F3, F4), σύμφωνα με τις μελέτες που αναγράφονται αναλυτικά στο γενικό μέρος [πίνακας 22 γενικού μέρους κεφαλαίο 5 ο ]. Οι ερευνητές έχουν συνδυάσει επίσης τα αποτελέσματα των επιμέρους δεικτών, προτείνοντας διάφορους αλγόριθμους (συνδυαστικά μοντέλα αλγοριθμικών πινάκων) για την πρόβλεψη της ύπαρξης και του βαθμού ηπατικής ίνωσης στις χρόνιες ηπατοπάθειες. Μερικά από τα πιο κοινά αλγοριθμικά μοντέλα περιλαμβάνουν : AST/ALT αναλογία (AST/ALT ratio:aar score), δείκτης αναλογίας AST ορού προς αιμοπετάλια (APRI score), δείκτης PGA, δείκτης FibroSpect, ενισχυμένο πάνελ ηπατικής ίνωσης (Enhanced Liver Fibrosis Panel:ELF panel), Fibrometer, Hepascore, SHASTA Index, FIB-4 score, Fibro test, NAFLD Ίνωσης σκορ (NAFLD fibrosis score: NFS), σκορ διάκρισης κίρρωσης, σκορ BARD, Hui μοντέλο, Fibrometer NAFLD, Δείκτης Πιθανότητας Ίνωσης, Δείκτης Lok, και Fibro Q (48,57,58). Ο συνδυασμός ποικίλλων βιοδεικτών που σχετίζονται με την ηπατική ίνωση, έγινε στην προσπάθεια της μη επεμβατικής αναγνώρισης του σταδίου ίνωσης για τις χρόνιες ηπατοπάθειες και με την λογική ότι ο συνδυασμός πολλών παραμέτρων που σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της ίνωσης θα μπορούσε να αποδώσει με μεγαλύτερη ορθότητα την παρουσία και τον βαθμό ίνωσης. Όπως για τις χρόνιες ιογενείς ηπατίτιδες, την αλκοολική ηπατική νόσο και την συνλοίμωξη HCV με HIV έτσι και για την NAFLD, που αποτελεί την σύγχρονη ραγδαίως αυξανόμενη χρόνια ηπατοπάθεια, κάποιοι από τους παραπάνω αλγοριθμικούς συνδυαστικούς πίνακες εφαρμόσθηκαν. Συγκεκριμένα στην NAFLD, στην προσπάθεια σταδιοποίησης μη επεμβατικά της ηπατικής ίνωσης, εφαρμόσθηκαν τα εξής συνδυαστικά μοντέλα : BAARD score, APRI score, AST/ALT αναλογία (AAR score), FIB-4 score, Fibro-Meter score, NAFLD fibrosis score (NFS), FIBRO Test (FT), ELF panel, BAAT score, συνδιασμός HA με CDT (Carbohydratedeficient-Transferrin) ορού/tf (Transferrin) ορού ((1,2,13,14). Οι περισσότεροι από αυτούς τους πίνακες περιλαμβάνουν δημογραφικά στοιχεία όπως το φύλο και η ηλικία, στοιχεία από το ιστορικό των ασθενών όπως η ύπαρξη ΣΔ τύπου 2 και από τον σωματότυπό τους (ΒΜΙ, περίμετρος μέσης), σε συνδυασμό με ορολογικούς δείκτες ίνωσης όπως το ΗΑ, PIIINP, ΤΙΜΡ-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1: ιστικό αναστολέα Μεταλοπρωτεϊνάσης-1), τρανσφερρίνη ορού, φερριτίνη, λευκωματίνη, χολερυθρίνη, αιμοπετάλια ορού, απτοσφαιρίνη, Α2 μακροσφαιρίνη, απολιποπρωτεϊνη Α1 και άλλα χαρακτηριστικά του μεταβολικού συνδρόμου. Είναι εύκολοι στην πραγματοποίηση των μετρήσεων και έχουν μία ακρίβεια (AUC), για την πρόβλεψη της σημαντικής ίνωσης (F 2, 3, 4), που κυμαίνεται από 0,78-0,94, με την καλύτερη ακρίβεια για το Fibro Meter 0,94 ακολουθούμενη από το ELF panel:0,90. Η μεγαλύτερη αξία τόσο των μονομερών βιοδεικτών όσο και των συνδυαστικών μοντέλων, έγκειται στο ότι μπορούν με μεγάλη ακρίβεια να αποκλείσουν την ύπαρξη ίνωσης κάτω από μία συγκεκριμένοι τιμή cut-off. Αυτό όμως δεν καλύπτει διαγνωστικά το σύνολο των ασθενών με NAFLD και ιδίως αυτούς που έχουν τιμές πάνω από το κατώτερο όριο cut-off (χαμηλή ειδικότητα). Λεπτομερώς οι 166 Σ ελίδα

171 συνδυαστικοί πίνακες μη επεμβατικής πρόβλεψης τη NAFLD ίνωσης και του σταδίου της, αναγράφονται στο γενικό μέρος (κεφάλαιο 5 ο ). Επειδή τα συστατικά της εξωκυττάριου ουσίας και ειδικά η ΛΜ και το ΗΑ, έχουν χρησιμοποιηθεί ως έμμεσοι δείκτες της ίνωσης σε διάφορες χρόνιες καταστάσεις του ήπατος όπως η αιμοχρωμάτωση, οι ιογενείς ηπατίτιδες και η αλκοολική νόσος του ήπατος, αποφασίσαμε να εξετάσουμε την πιθανότητα η ΛΜ και το ΗΑ να χρησιμεύουν ως δείκτες που μπορούν να διακρίνουν την παρουσία ίνωσης στη NASH (41,42,48,59-63). Άλλοι λόγοι που επελέγησαν η ΛΜ και το ΗΑ για την παρούσα μελέτη, ήταν ότι έχουν την υψηλότερη συσχέτιση με την παρεγχυματική και περικολποειδική ίνωση όπως ακριβώς συμβαίνει και στη NASH και διότι μαζί με το κολλαγόνο τύπου IV, τα επίπεδα ορού αυξάνονται νωρίς στην ηπατική ίνωση και άρα υπάρχει δυνατότητα συσχέτισης των τιμών των επιπέδων αυτών με το ιστολογικό στάδιο της NASH (39,64-66). Επιπλέον η αποβολή τους από τα χοληφόρα και τα ούρα, που μειώνεται παρουσία κιρρώσεως, δε φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδά τους στο αίμα. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα αυτών στα χοληφόρα είναι συνήθως χαμηλά και ότι η νεφρική τους κάθαρση παραμένει σταθερή ακόμα και σε ασθενείς με προχωρημένη νεφρική ανεπάρκεια (59). Η λαμινίνη είναι μια γλυκοπρωτεΐνη η οποία έχει έναν σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό της ινογένεση και επομένως σχετίζεται και με ηπατική ίνωση. Αυξημένα επίπεδα λαμινίνης έχουν επίσης παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους νεοπλασιών. Η λαμινίνη αρχικά προσδιορίστηκε από τους Timpl και MARTIN το 1979 (67) από ένα ινοσάρκωμα ποντικού. Το μόριό της είναι ένα μεγάλο σύμπλοκο (περίπου 850 kilodaltons) που αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες που ονομάζονται α1 (με περίπου 440 kda), β1 και γ1 (το καθένα με περίπου 200 kda). Αυτές οι αλυσίδες συνυφασμένες με δισουλφιδικές γέφυρες, σχηματίζουν ένα χαρακτηριστικό σχήμα σταυρού (asymmet-rical δομή) (67-69).Η λαμινίνη είναι μια από τις κύριες γλυκοπρωτεΐνες των νεοσυντιθέμενων βασικών μεμβρανών και συμμετέχει σε μια σειρά βιολογικών φαινομένων όπως κυτταρική προσκόλληση, μετανάστευση, κυτταρική διαφοροποίηση και ανάπτυξη, φλεγμονώδη απόκριση και συντήρηση του κυτταροσκελετού κατά τη δέσμευσή του σε διάφορα συστατικά της θεμέλιας ουσίας όπως κολλαγόνο τύπου IV, θειική ηπαράνη και entacin (70). Υποδοχείς λαμινίνης βρίσκονται επίσης επί της επιφανείας ενός ευρέως φάσματος κυττάρων όπως τα αιμοπετάλια, μυϊκά κύτταρα, ουδετερόφιλα, ενδοθηλιακά κύτταρα και ηπατοκύτταρα. Πρόσφατα η ύπαρξη μιας κατηγορίας διαμεμβρανικών υποδοχέων για λαμινίνη γνωστές ως ιντεγκρίνες έχει αποδειχθεί. Αυτές οι ιντεγκρίνες συμμετέχουν στους μηχανισμούς αντίδρασης κυττάρου-κυττάρου, κυττάρου-μήτρας και πιο πρόσφατα, στην προσκόλληση των κυττάρων κάποιων παθογόνων μικροοργανισμών. Οι πρωτεΐνες συνδέσεως λαμινίνης (ιντεγκρίνες) έχουν περιγραφεί σε έναν αριθμό τέτοιων παθογόνων παραγόντων όπως Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori (H pylori) και Candida albicans (69-74). Λαμινίνη στο ήπαρ Σε φυσιολογικό ήπαρ λαμινίνη βρίσκεται γύρω από τα αγγεία και τα χοληφόρα όπου εντοπίζονται βασικές μεμβράνες. Σιωπηλή ή μόνο μια μικρή αντισωματική αντίδραση ενάντια λαμινίνη μπορεί να παρατηρηθεί στα ηπατικά κολποειδή. Στο ήπαρ, η γλυκοπρωτεΐνη Λαμινίνη εμπλέκεται επίσης σε ενδοκυτταρικές δραστηριότητες όπως η φυσιολογική διαφοροποίηση των χοληφόρων οδών,οι γενετικές εκφράσεις για το αγγελιοφόρο (messenger) RNA λευκωματίνης σε ηπατοκύτταρα και η ηπατική αναγέννηση με φυσιολογική λοβιδιακή οργάνωση μετά από μερική ηπατεκτομή. Λαμινίνη πιστεύεται ότι συντίθεται στα ηπατοκύτταρα και στα κύτταρα των κολποειδών. Μεταξύ όλων των κυτταρικών τύπων, στα ηπατικά κολποειδή, πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στα αστεροειδή κύτταρα ή λιποκύτταρα του ito (HSCς:Hepatic stellate cells) που παράγουν το μεγαλύτερο ποσό της λαμινίνης ορού(70). Με την ανάπτυξη της ηπατικής κίρρωσης, λαμινίνη και κολλαγόνο αποθηκεύονται κατά μήκος των ινών (νηματίων) της γεφυροποιού ή διαφραγματικής ίνωση και στα υποενδοθηλιακά κολποειδή ή χώρο Disse. Στον χώρο Disse, η απόθεση λαμινίνης μαζί με την εναπόθεση κολλαγόνου, καθορίζουν το σχηματισμό μιας πραγματικής βασικής μεμβράνης κατά μήκος των 167 Σ ελίδα

172 κολποειδών. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται νέο-τριχοειδοποίηση του χώρου του Disse (75). Εκτός από την αυξημένη παραγωγή της λαμινίνης στο ήπαρ, θα πρέπει επίσης να ληφθεί υπόψη μία πρόσθετη επίδραση που οφείλεται στην έλλειψη της αποδόμησής της από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του ήπατος. Όπως καταδεικνύεται από Smedsrod και συν (76) σε ένα πειραματικό μοντέλο, εκτός από μια αύξηση στην απόθεση ιστού υπάρχει και μια μείωση στην ικανότητα του ήπατος να υποβαθμίσει αυτήν την πρωτεΐνη. Με την ανάπτυξη των αντι-λαμινίνης αντισωμάτων, που κατευθύνονται έναντι του τμήματος Ρ1 της λαμινίνης, αυξημένα επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης στην κυκλοφορία παρατηρήθηκαν σε πιο προχωρημένα στάδια της ίνωσης σε ασθενείς με ηπατική νόσο και όπως αναμενόταν αυτά τα επίπεδα στον ορό είχαν θετική συσχέτιση με πυλαία υπέρταση (77-81). Ο Kropf et al (78) πρότειναν ότι η συγκέντρωση λαμινίνης στον ορό αποτελεί μια ευαίσθητη ορολογική δοκιμασία αναγνώρισης της ίνωσης και της πυλαία υπέρτασης σε ηπατική νόσο όταν η δοκιμασία γίνεται σε συνδυασμό με εκτίμηση της τιμής ΗΑ (υαλουρονικό οξύ). Λαμινίνη, ως μεμονωμένη παράμετρος, βρέθηκε να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη αλλά με χαμηλή ειδικότητα για την ανίχνευση πυλαίας πίεση πάνω από 5 mmhg (77,78). Η χαμηλή εξειδίκευση του προσδιορισμού λαμινίνης ορού για αναγνώριση πυλαίας υπέρτασης, θα μπορούσε να σχετίζεται με το γεγονός ότι τα επίπεδα λαμινίνης αντανακλούν μόνο τις δομικές αλλαγές του ηπατικού ιστού και δεν συμπεριλαμβάνουν αλλαγές στη συστηματική και πυλαία ροή του αίματος που συμβάλλουν σημαντικά στην πυλαία υπέρταση. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να ερμηνευθεί είτε από την μειωμένη ηπατική απέκκριση αυτής της πρωτεΐνης, λόγω ίνωσης των ηπατικών κολποειδών, είτε από μία αύξηση στη σύνθεση λαμινίνης σε άλλα όργανα της σπλαχνικής κυκλοφορίας δευτερογενώς προς την φλεβική συμφόρηση του ήπατος Μία σημαντική συμμετοχή εξω-ηπατικής πηγής, για τα αυξημένα επίπεδα λαμινίνης ορού, φαίνεται σε ασθενείς με αλκοολικής αιτίας ηπατική ίνωση καθώς και σε ασθενείς με έξω-ηπατική πυλαία υπέρταση (προκολποειδική) λόγω προσβολής από Schistosoma mansoni (82-84). Σε αυτούς τους ασθενείς, η ηπατοσπληνική συμφόρηση οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση της βασικής μεμβράνης στον σπλήνα και επομένως αυξημένη παραγωγή λαμινίνης και κολλαγόνου από τον σπλήνα. Έτσι όχι μόνο θα μπορούσαν τα κυκλοφορούντα επίπεδα της λαμινίνης να αντανακλούν τις ηπατικές διαδικασίες της σύνθεσης και αποδόμησής της, αλλά επίσης την αύξηση της σύνθεσης των βασικών μεμβρανών ως αποτέλεσμα της συμφόρησης που παρατηρείται σε άλλα σπλαχνική όργανα. Ως εκ τούτου η χρησιμοποίηση της τιμής λαμινίνης ορού, ως μεμονωμένου δείκτη της πυλαίας υπέρτασης για κλινική χρήση, επηρεάζεται από άλλους εξω-ηπατικούς παράγοντες που θα μπορούσαν να μεταβάλλουν τη συγκέντρωσή της στο αίμα. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες με Fibroscan έχουν βρει ευαισθησία και ειδικότητα, για τη διάγνωση της ηπατικής ίνωσης, πολύ υψηλότερες από εκείνες που μας δίνει ο προσδιορισμός της λαμινίνης ορού (γενικό μέρος κεφάλαο Ε πίνακας 23). Επομένως, λόγω της σχέσης μεταξύ της ιστικής εναπόθεσης λαμινίνης και προχωρημένης ίνωσης (εναπόθεση λαμινίνης κατά μήκος των νηματίων της γεφυροποιού ίνωσης), υπάρχει χαμηλή ακρίβεια της ειδικότητας των επιπέδων λαμινίνης ορού για την πρόβλεψη πυλαίας υπέρτασης. Ανεξάρτητα όμως από αυτό το γεγονός, τα επίπεδα της λαμινίνης στον ορό έχουν χρησιμοποιηθεί από αρκετούς συγγραφείς ως μια μη επεμβατική παράμετρος για την αξιολόγηση της ηπατικής ίνωσης σε αλκοολικούς ασθενείς καθώς και σε εκείνους με ιογενή ηπατίτιδα και αιμοχρωμάτωση (70,85,86). Αυτές οι μελέτες,έχουν δείξει ευαισθησία από 59-88% και ειδικότητα από 78-85% σε άλλες χρόνιες ηπατοπάθειες πλην NASH.Τέτοιος προσδιορισμός όμως, σταδιακά περιορίζεται δεδομένου ότι δεν απέδειξε να είναι ανώτερος από τον προσδιορισμό άλλων συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όπως ΤΙΜΡ και υαλουρονικού οξέος. Ωστόσο, σε πρόσφατες μελέτες προσδιορισμός λαμινίνης έχει συμπεριληφθεί σε ένα συνδυαστικό δείκτη μαζί με ΡΙΙΙΝΡ, υδροξυπρολίνη, δραστικότητα της προθρομβίνης, και AST / ALT αναλογία για την διάγνωση της προχωρημένης ίνωσης (F3,F4) στη χρόνια ηπατίτιδα C (70,86). Σε μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος (NAFLD) όμως, τα επίπεδα λαμινίνης στον ορό θα πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω. Στην (NAFLD), επειδή η ινογενετική διέγερση 168 Σ ελίδα

173 εντοπίζεται αρχικά στην περικολποειδική- περικυτταρικής περιοχή που αποτελεί την περιοχή σύνθεσης λαμινίνης (λόγω του ότι είναι συστατικό των νεοσυντιθέμενων βασικών μεμβρανών στα κολποειδή του χώρου του Disse), μπορεί η λαμινίνη ορού να αυξάνει νωρίς σε πρώιμη φάση ίνωσης (F1, F2) (70,87). Στη μελέτη μας υπολογίσαμε τα επίπεδα της ΛΜ με μια νέα τεχνική σάντουιτς που χρησιμοποιεί δύο μονοκλωνικά αντι-λμ αντισώματα από ποντίκια. Το νέο αυτό ΛΜ-EIA κιτ, παρέχει μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα για τα ηπατικά νοσήματα(45). Η μέση τιμή της ΛΜ στην ομάδα 1 (ασθενείς με NASH και ίνωση) ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά στην ομάδα 2 (ασθενείς με NASH χωρίς ίνωση), (Πίνακας 4 και Εικόνα 6), (p<0,001). Σύμφωνα με τη ROC ανάλυση, η τιμή cut-off των 354,50 διέθετε τη μεγαλύτερη ακρίβεια με ποσοστό ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων στο 7,4% των περιπτώσεων. Στην προσπάθειά μας να εκτιμήσουμε εάν υπήρξε σταδιακή αύξηση της ΛΜ ορού ανάλογα με τη βαρύτητα της ηπατικής ίνωσης στη NASH, εξετάσαμε χωριστά τις μέσες τιμές της ΛΜ σε ασθενείς της ομάδος 1 με stage 1 (n=5), stage 2 (n=7), stage 3 (n=6) και stage 4 (n=5) ίνωση και NASH. Αν και ο αριθμός ασθενών σε κάθε ομάδα ήταν σχετικά μικρός, εν τούτοις δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα ΛΜ μεταξύ των υποομάδων αυτών. (Πίνακας 6). Επομένως στους ασθενείς με NASH τα επίπεδα ΛΜ ορού μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν μη επεμβατικός δείκτης για την ύπαρξη της ίνωσης, αλλά όχι για την εκτίμηση του βαθμού της ίνωσης. Με τον τρόπο αυτό, ο προσδιορισμός των τιμών λαμινίνης ορού μπορεί να παίξει ένα χρήσιμο ρόλο στη διάκριση μεταξύ ασθενών με απλή στεάτωση και εκείνων με μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) με ίνωση. Από τα αποτελέσματά μας, είναι κατανοητό ότι ο προσδιορισμός των τιμών λαμινίνης ορού θα μπορούσε να γίνει μια παράμετρος επιλογής των ασθενών για την ένδειξη της ίνωσης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι στους ασθενείς με κίρρωση (stage 4 NASH), παρά το μικρό δείγμα,τα επίπεδα ΛΜ ήταν πολύ αυξημένα συγκριτικά με αυτά των ασθενών που ταξινομήθηκαν στα υπόλοιπα stage της ίνωσης (Πίνακας 7). Τα δεδομένα αυτά, ίσως συνηγορούν για τη χρήση της ΛΜ στη διάγνωσης της κίρρωσης σε ασθενείς με NASH. Για να επιβεβαιώσουμε την ένδειξη αυτή βέβαια απαιτούνται περισσότερες μελέτες που να περιλαμβάνουν ασθενείς με NASH/ίνωση και NASH/κίρρωση. Να τονισθεί επίσης ότι στη μελέτη μας δεν προέκυψε διαφορά στα επίπεδα ΛΜ μεταξύ των διαφόρων νεκρωτικών/φλεγμονωδών grades στις δύο ομάδες των ασθενών (Πίνακας 5). Δηλαδή σε ασθενείς με NASH τα επίπεδα της ΛΜ δε φαίνονται να επηρεάζονται από τη φλεγμονώδη δραστηριότητα της νόσου και άρα ίσως αποτελούν αξιόπιστο δείκτη της ίνωσης Το υαλουρονικό οξύ (Ηyaluronic Acid: ΗΑ) είναι μια υψηλού μοριακού βάρους γλυκοζαμινογλυκάνη επίσης γνωστή ως βλεννοπολυσακχαρίτης. Αυτό το μόριο είναι παρόν σε εξωκυτταρικές, περικυτταρικές και ενδοκυτταρικές θέσεις. Αποτελείται από μια επαναλαμβανόμενη αλληλουχία εξουρονικού και αμινοσακχάρου με ακετυλομάδες [(1 3) -β-d- ΟΙοΝΑο-(1 4) - β-d-glca] (Σχήμα 1) (48). Ο αριθμός των δισακχαριτών σε κάθε μόριο είναι έτσι το μοριακό του βάρος μπορεί να είναι Da. Το μόριο ΗΑ είναι μία γλυκοζαμινογλυκάνη ανιονικής αλυσίδας (88). Αυτή η γλυκοζαμινογλυκάνη είναι ένα σημαντικό συστατικό του συνδετικού ιστού όπως του ομφάλιου λώρου, του αρθρικού υγρού, του δέρματος και του υαλώδες σώματος (89). ΗΑ υπάρχει σε διάφορα μέρη του σώματος σε διάφορα σχήματα μεγέθη και συγκεντρώσεις ελεύθερα στο λεμφικό σύστημα, στο αίμα και στην ECM (εξωκυττάρια θεμέλια ουσία) και δεσμευμένο επίσης σε ειδικούς υποδοχείς επί των κυτταρικών επιφανειών (90). Σχεδόν το μισό ποσοστό του ΗΑ είναι παρών στη δομή του δέρματος και το ένα τέταρτο του συνολικού ποσοστού του στον σκελετό, τις αρθρώσεις και τους συνδέσμους. Το υπόλοιπο κατανέμεται μεταξύ άλλων οργάνων, π.χ. μυών, πνεύμονα, εγκεφάλου, ήπατος και νεφρών (89,90). 169 Σ ελίδα

174 Σχήμα 1 Δομή του ΗΑ. Όπως είναι σαφές, υπάρχει ένας Γλυκοσιδικός δεσμός μεταξύ μορίων Γλυκουρονικού οξέως και Ν-Acetylglucosamine (Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη) (48). Το HA έχει κάποια ειδικά χαρακτηριστικά που το διαφοροποιούν από άλλα μόρια της θεμέλιας ουσίας. Οι διαφορές αυτές περιλαμβάνουν την παρουσία θειικής ομάδας, μικρά μεγέθη των μοριακών αλυσίδων, και την οδό βιοσύνθεσης. Οι περισσότερες γλυκοζαμινογλυκάνες συντίθενται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και στα σωμάτια Golgi, αλλά το ΗΑ συντίθεται μέσω ειδικών ενζύμων που βρίσκονται στις εσωτερικές επιφάνειες των κυτταροπλασματικών μεμβρανών σε κάποιους ιστούς όπως τα κύτταρα που επενδύουν την αρθρική επιφάνεια ή τα ηπατικά αστεροειδή κύτταρα (ΗSCs). Αυτά τα ένζυμα ονομάζονται συνθετάσες υαλουρονικού οξέως και έχουν τρεις διαφορετικές ισόμορφες, 1, 2, 3 (48,88,89). Τα ένζυμα αυτά είναι σε θέση να συνθέσουν το μόριο του ΗΑ με την προσθήκη της ενεργοποιημένης μορφής των υποστρωμάτων, δηλαδή UDP-γλυκουρονικό οξύ και UDP-Νακετυλογλυκοζαμίνη στην αυξανόμενη ανιονική αλυσίδα. Τα προκύπτοντα μόρια ΗΑ διέρχονται μέσω της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και τελικά εκκρίνονται εντός του εξωκυτταρικού χώρου. Μεσεγχυματικά κύτταρα (ινοβλάστες και αστεροειδή ηπατικά κύτταρα) είναι τα πιο σημαντικά υπεύθυνα κύτταρα για τη σύνθεση και έκκριση ΗΑ στη κυκλοφορία του αίματος. Το ήπαρ είναι το κύριο όργανο τόσο για την απομάκρυνση όσο και για τη σύνθεση αυτού του μακρομορίου. Στο ήπαρ, ΗΑ συντίθεται από τα κύτταρα Ito (ηπατικά αστεροειδή κύτταρα:hscs) και αποικοδομείτε από τα κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα. Κατόπιν απομακρύνεται από την κυκλοφορία μέσω ειδικών υποδοχέων που βρίσκονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα των κολποειδών του ήπατος. Η ποσότητα της λεμφικής ροής του ΗΑ στο θωρακικό πόρο είναι υψηλότερη από τη ροή του κυκλοφορούντος αίματος επειδή η ανακύκλωσή του είναι πολύ γρήγορη δηλαδή η κάθαρση και η αποικοδόμησή του συμβαίνουν ταχέως. Αποικοδόμηση ΗΑ μπορεί να συμβεί και τοπικά, για παράδειγμα στο δέρμα και τις αρθρώσεις % της ανακύκλωσης του ΗΑ συμβαίνει επί τόπου και το λεμφικό σύστημα παροχετεύει «στραγγίζει» το υπόλοιπο. Θα πρέπει να θεωρούμε ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής του ΗΑ ποικίλλει μεταξύ των οργάνων, καθώς το ΗΑ έχει ημίσεια-ζωή 2-5 λεπτά στο αίμα, <1 ημέρα στο δέρμα, και 2-3 εβδομάδες σε χόνδρους(48,91-93). 170 Σ ελίδα

175 Υαλουρονικό οξύ και ήπαρ. Μεταξύ των διαφόρων οργάνων που εμπλέκονται στην αποδόμηση του ΗΑ, το ήπαρ είναι ένα από τα πιο σημαντικά. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, κολποειδή ενδοθηλιακά κύτταρα είναι μία σημαντική κατηγορία κυττάρων που εμπλέκονται σε διάφορες αντιδράσεις μεταβολισμού στο ήπαρ. Αυτά τα κύτταρα συμβάλλουν επίσης στην ταχεία απομάκρυνση του ΗΑ από τη ροή του αίματος (89). Κατά τη διάρκεια ενός τραυματισμού των κυττάρων του ήπατος, τα επίπεδα HA ορού αυξάνονται. Μετασχηματισμός των αστεροειδών κυττάρων σε μυοϊνοβλάστες και απελευθέρωση των διαφόρων συστατικών ECM όπως η ελαστίνη, κολλαγόνα, γλυκοπρωτεΐνες πρωτεογλυκάνες και ΗΑ είναι μεταγενέστερα γεγονότα (Σχήμα 2) (48). Αρχικά η πίεση στην πυλαία φλέβα, το επίπεδο των τριχοειδών στα κολποειδή, η ροή αίματος στα κολποειδή, καθώς και άλλοι παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα ΗΑ ορού υφίστανται ενδοηπατικές μετατροπές. Εκτός από το ήπαρ αποβολή ΗΑ γίνεται στο νεφρό και σπλήνα. Υαλουρονιδάση (hyaluronoglucosaminidase), β-d-γλυκουρονιδάση, και β-ν-ακετυλοεξοζαμινιδάσης, είναι τα κύρια ένζυμα που εμπλέκονται σε καταβολισμό ΗΑ. Η υαλουρονιδάση υδρολύει το δεσμό β 1-4 γλυκοζίτη μεταξύ Ν-ακετυλ-D-γλυκοζαμίνης και D-γλυκουρονικού οξέος και δημιουργεί "θραύσματα" διαφορετικών μεγεθών (91,94). Σχήμα 2. Ένα απλό μοντέλο για την εξήγηση της αύξησης των διαφόρων συστατικών της ενδογενούς θεμέλιας ουσίας συμπεριλαμβανομένου και του ΗΑ, στην ηπατική ίνωση. (48) ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ HSCs TGF-B Μυοϊνοβλάστες Φλεγμονώδης Αντίδραση ΗΠΑΤΙΚΗ Κυτταρική βλάβη Απελευθέρωση ποικίλων Εξωκυτταρικών συστατικών όπως Γλυκοπρωτεΐνες, κολλαγόνο, Πρωτεογλυκάνες και Υαλουρονικό Οξύ Καταστροφή εξωκυττάριας Θεμέλιας Ουσίας (ECM) HBV HCV Αυτοάνοσος Ηπατίτιδα Φάρμακα/Τοξίνες Ποικίλες Μεταβολικές Διαταραχές Κατανάλωση Αλκοόλ Άλλες νόσοι Αύξηση Ηπατικής Ινογένεσης Ηπατική ίνωση Κίρρωση TGF-B:Transforming growth factor beta (μεταμορφωτικός αυξητικός παράγωντας-β) Συμπερασματικά, το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ) είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού μοριακού βάρους που διανέμεται σε όλους τους ιστούς του σώματος και υγρά. Το ήπαρ είναι το σημαντικότερο όργανο που εμπλέκονται στη σύνθεση και την αποδόμηση του ΗΑ. Η έρευνα έχει δείξει ότι η βλάβη των κυττάρων του ήπατος μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα ΗΑ ορού. Σε χρόνιες παθήσεις του ήπατος, τα κύτταρα Kupffer (που είναι τα εξειδικευμένα μακροφάγα του ήπατος) ενεργοποιούνται από την παρουσία τοξικών παραγόντων όπως χημικές ουσίες, ιοί και βακτηριακοί πολυσακχαρίτες. Σαν απάντηση τα κύτταρα Kupffer εκκρίνουν διαλυτούς μεσολαβητές της φλεγμονής (κυτταροκίνες, παράγωγα του αραχιδονικού οξέος, ενεργές ρίζες οξυγόνου, προϊόντα οξείδωσης των λιπιδίων)(91). Αυτοί οι μεσολαβητές ενεργοποιούν τα αστεροειδή κύτταρα που παράγουν και αποθηκεύουν εξωκυττάριες πρωτεΐνες 171 Σ ελίδα

176 όπως το ΗΑ στο χώρο του Disse s. Επιπλέον, αυτοί οι μεσολαβητές επάγουν λειτουργικές αλλαγές του ενδοθηλίου των κολποειδών δηλαδή μείωση των υποδοχέων του ΗΑ, μείωση της ικανότητάς τους να καθαιρούν το κυκλοφορούν ΗΑ με συνέπεια αύξηση των επιπέδων ορού του ΗΑ. Έτσι η συγκέντρωση του ΗΑ στον ορό αυξάνει σημαντικά σε χρόνιες παθήσεις του ήπατος και λόγω αυξημένης παραγωγής από τα αστεροειδή κύτταρα αλλά και λόγω μείωσης της αποδόμησής του από τα ενδοθηλιακά κύτταρα(48,91,95). Με αυτό το σημείο εκκίνησης, αρκετοί ερευνητές τα τελευταία έτη έχουν ερευνήσει πιθανή συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων ΗΑ και της βαρύτητας της ηπατικής βλάβης(46,60,96-108). Πράγματι, από τις μελέτες αυτές που διεξήχθησαν κυρίως με ασθενείς πάσχοντες από χρόνια ιογενή ηπατίτιδα, αλκοολική νόσο και κίρρωση από διάφορες αιτιολογίες βρέθηκε ότι τα αυξημένα επίπεδα ΗΑ σχετίζονται με το βαθμό της ηπατικής φλεγμονής. Εξάλλου μερικές από αυτές τις μελέτες αναφέρουν στενή σχέση με το ιστολογικό stage της ίνωσης (συντελεστές συσχέτισης μέχρι 0,79). Η ευαισθησία κυμαίνονταν από 75 έως 90% και η ειδικότητα από 59 έως 80% με τη χρήση τιμών cut-off μεταξύ 30 και 60 μg/l.το γεγονός ότι η αύξηση των επιπέδων ΗΑ αποτελεί αξιόπιστο ορολογικό δείκτη της ηπατικής ίνωσης και όχι της ηπατικής φλεγμονής, μπορεί να αποδοθεί στο ότι το ΗΑ παράγεται από τα ενεργοποιημένα αστεροειδή κύτταρα τα οποία παράγουν και απελευθερώνουν πρωτεΐνες της εξωκυττάριου ουσίας και το κολλαγόνο της ίνωσης, καθώς και στο ότι η περίσσεια του ΗΑ δεν μπορεί να απομακρυνθεί από το ήπαρ λόγω δυσλειτουργίας του ενδοθηλίου των κολποειδών κυττάρων από τη συσσώρευση κολλαγόνου στην ηπατική ίνωση (48). Σε καταστάσεις που χαρακτηρίζουν το μεταβολικό σύνδρομο παρατηρείται αυξημένος ερεθισμός των ηπατικών αστεροειδών κυττάρων για σύνθεση πρωτεϊνών της εξωκυττάριου ουσίας. Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να ερευνήσουμε αν υπήρχε σχέση μεταξύ των επιπέδων ΗΑ και της παρουσίας αλλά και της βαρύτητα της ηπατικής ίνωσης στη NASH που εξελίσσεται σε ίνωση και κίρρωση. Τα επίπεδα ΗΑ στην ομάδα 1 με NASH και ίνωση, ήταν σημαντικά μεγαλύτερα από αυτά των ασθενών της ομάδας 2 με NASH χωρίς ίνωση (Πίνακας4). Στατιστικά σημαντικά μεγαλύτερη μέση τιμή ΗΑ παρατηρήθηκε εν γένει σε ασθενείς με NASH και ίνωση, συγκριτικά με αυτά σε ασθενείς χωρίς ίνωση (εικόνα 5). Στην πραγματικότητα, φαίνεται ότι η μέση τιμή των επιπέδων του ΗΑ σε ασθενείς με NASH χωρίς ίνωση, είναι συγκρίσιμη με αυτή του υγιούς γενικού πληθυσμού. Αυτό συνηγορεί υπέρ της υποθέσεως ότι ακόμα και αν η παρουσία της κενοτοπιώδους εκφύλισης των ηπατοκυττάρων, σύμφωνα με την ταξινόμηση του Matteoni, προδιαθέτει στην εξέλιξη της NASH προς ίνωση/κίρρωση(21) δε σηματοδοτεί εντούτοις την εγκατεστημένη ίνωση καθώς τα επίπεδα του ΗΑ σε αυτούς τους ασθενείς κυμαίνονταν εντός των φυσιολογικών τιμών. Επιπλέον, με τη χρήση της ανάλυσης ROC, μια κατώτερη τιμή cut-off περί τα 148,50 ng/ml παρείχε την καλύτερη ακρίβεια (96%) με υψηλή ευαισθησία (95,7%), ειδικότητα (96,3%) αρνητική προγνωστική αξία 96,3%, και θετική προγνωστική αξία 95,7% για την πρόβλεψη της παρουσίας ίνωσης. Όπως αναφέρθηκε ήδη, πολλές μελέτες έδειξαν ότι ανάμεσα στους γνωστούς ορολογικούς δείκτες της ηπατικής ίνωσης, το ΗΑ συνιστά τον πλέον αξιόπιστο για τις χρόνιες ηπατικές νόσους όπως η χρόνιες ηπατίτιδες και η αλκοολική νόσος. Στην προσπάθειά μας να δούμε εάν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του ΗΑ και της βαρύτητας της ηπατικής ίνωσης στη NASH, συγκρίναμε τη μέση τιμή αυτού σε κάθε stage της ίνωσης (Πίνακας 6). Οι μέσες τιμές έβαιναν αυξανόμενες σε κάθε stage από το 1 έως το 4, με στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ του 4 (κίρρωση) και των υπολοίπων. Η μελέτη μας δείχνει ότι το ΗΑ μπορεί να εκτιμήσει τη βαρύτητα της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με NASH. Αρχικά, με τη χρήση της δοκιμασίας Kruskal-Wallis ANOVA, φάνηκε ότι υπήρχε στατιστικά σημαντική διακύμανση των μέσων τιμών του ΗΑ σε ασθενείς με διάφορα stage ηπατικής ίνωσης. Σε επόμενο στάδιο συγκρίναμε κάθε stage με το επόμενό του όσον αφορά τη μέση τιμή του ΗΑ. Η ανάλυση αυτή με τη χρήση της δοκιμασίας Mann-Whitney για κάθε ζεύγος, έδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση του ΗΑ με την αύξηση του stage της ίνωσης (p = 0,005) (Πίνακας 6, Εικόνα 8 ). Το γεγονός ότι οι δύο ομάδες είχαν παρόμοια δημογραφικά, ανθρωπομετρικά και εργαστηριακά ευρήματα και παρόμοιο ποσοστό ασθενών με ΣΔ2, υπερτριγλυκεριδαιμία και 172 Σ ελίδα

177 παχυσαρκία, αυξάνει τη αξιοπιστία του ΗΑ σαν δείκτη ύπαρξης αλλά και βαρύτητας της ηπατικής ίνωσης ανεξάρτητα από την παρουσία φλεγμονής σε ασθενείς με NASH. Στη διεθνή βιβλιογραφία, ανευρέθηκαν δύο μελέτες με παρόμοιο σχεδιασμό (87,109).Σε αυτές τα επίπεδα ΗΑ και ΛΜ σχετίστηκαν με το βαθμό της ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD. Στη μελέτη των V.N. dos Santos και συν.(109), 30 παχύσαρκοι άρρενες με BMI >25 που είχαν τα κριτήρια για NAFLD, υπέστησαν βιοψία ήπατος η οποία απέδειξε την παρουσία ίνωσης στους 11 από τους 30. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σύμφωνα και με τα δικά μας στο ότι τα επίπεδα ΗΑ και ΛΜ σχετίζονταν με την ύπαρξη ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD αλλά ενώ η μελέτη μας έδειξε ότι τα επίπεδα ΗΑ σχετίζονται και με το βαθμό της ηπατικής ίνωσης (stage της NASH), η αναφερόμενη μελέτη έδειξε ότι όχι μόνο τα επίπεδα ΗΑ αλλά και τα επίπεδα ΛΜ σχετίζονται με το stage της NASH. Και μάλιστα, σε αντίθεση με τη δική μας μελέτη, τα επίπεδα ΛΜ έδειξαν περισσότερο σημαντική συσχέτιση με το stage της ίνωσης (rs = 0,65) και καλύτερη διαγνωστική απόδοση με ακρίβεια 87% σε σχέση με το ΗΑ (Πίνακες 22, 23 Γενικό μέρος Κεφάλαιο 5). Όταν δε οι τιμές ΛΜ ορού συγκρίνονταν με το BAAT score (Ratziu et al) (110), οι τιμές λαμινίνης παρουσίαζαν καλύτερη ακρίβεια της μεθόδου (AUC:83%) για την πρόβλεψη της διαφραγματικής ίνωσης και (AUC:70%) για την παρουσία οποιασδήποτε ίνωσης. Ειδικότερα, οι V.N. dos Santos και συν., μέσω ανάλυσης της καμπύλης, έδειξαν ότι τιμές ΛΜ μεγαλύτερες από 282 ng/ml είχαν την καλύτερη αξιοπιστία, με 87% ακρίβεια (AUC), ενώ τιμές ΗΑ μεγαλύτερες από 24,6 ng/ml είχαν 73% ακρίβεια (AUC) για την ανίχνευση του stage της ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD. Επιπλέον, και πάλι αντίθετα από τη μελέτη μας που δεν έδειξε σχέση ούτε του ΗΑ ούτε της ΛΜ με το grade της φλεγμονώδους αντίδρασης στη NASH, η μελέτη των V.N. Santos και συν. έδειξε ότι και το ΗΑ και η ΛΜ αυξάνονται σημαντικά σε ασθενείς με NAFLD τύπου III (κενοτοπιώδης εκφύλιση των ηπατοκυττάρων). Τα αντικρουόμενα αποτελέσματα στις δύο μελέτες μπορεί να οφείλονται στο γεγονός ότι οι 50 ασθενείς της μελέτης μας δεν έπασχαν μόνο από παχυσαρκία όπως οι 30 στη μελέτη των V.N. dos Santos και συν. Επίσης ο αριθμός των ασθενών με ίνωση ήταν σημαντικά διαφορετικός στις δύο μελέτες, 23 στη δική μας μελέτη και 11 στη μελέτη των V.N. dos Santos et al. Έπειτα, υπήρχαν διαφορές στις μεθόδους μέτρησης των ΗΑ και ΛΜ στις δύο μελέτες. Στη μελέτη των Sakugawa και συν.(87), εξετάσθηκε το αν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του ΗΑ και της παρουσίας και του βαθμού ηπατικής ίνωσης σε 112 ασθενείς με NAFLD. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι οι 70 από τους 112 ασθενείς που είχαν έστω και 1-βαθμό ίνωσης, είχαν αυξημένα επίπεδα ΗΑ που σχετιζόταν και με τη διάγνωση της ίνωσης και με τη βαρύτητα αυτής. Συνεπώς, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης συμφωνούν με αυτά της δικής μας. Ειδικότερα, στη μελέτη των Sakugawa και συν., η ακρίβεια του ΗΑ για την παρουσία και το stage της ηπατικής ίνωσης στη NASH, εκτιμήθηκε μέσω της ROC ανάλυσης και έδειξε ότι τιμές ΗΑ μεγαλύτερες από 43 ng/ml είχαν ευαισθησία 65,7% και ειδικότητα 90,5% για την αναγνώριση της ηπατικής ίνωσης στη NASH, ενώ τιμές ΗΑ μεγαλύτερες από 50 ng/ml, είχαν ευαισθησία 68,8% και ειδικότητα 82,8% για το stage της της NASH. Στη μελέτη των Sakugawa et al, τα επίπεδα ΗΑ στον ορό φάνηκε να είναι σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με κίρρωση σε σύγκριση με τους άλλους βαθμούς ίνωσης (Πίνακας 22, Γενικό μέρος Κεφάλαιο Ε). Είναι σημαντικό να ληφθεί υπόψη ότι διαφορές στα αποτελέσματα της μελέτης μας, σε σχέση με τις προαναφερθείσες μελέτες αλλά και με άλλες παρόμοιες μελέτες που σχεδιάστηκαν αργότερα, πιθανώς να οφείλονται στον μικρό αριθμό των ατόμων της κάθε μελέτης, στην διαφορετική μέθοδο εξέτασης των βιοδεικτών ορού και στην μέθοδο επιλογής των ατόμων που συμμετέχουν σε κάθε μελέτη. Γενικά προς το παρόν, παραμένει μικρός ο αριθμός των μελετών σχετικά με τους μονομερείς βιοδείκτες NASH- ίνωσης με έμμεση μέθοδο. Σύμφωνα με πρόσφατα δημοσιευμένα άρθρα, υπάρχουν μερικές αμφιλεγόμενες αναφορές που σχετίζονται με την δυνατότητα κλινικής εφαρμογής των τιμών ΗΑ ορού σε διάφορες ασθένειες του ήπατος συμπεριλαμβανομένης της αυτοάνοσης ηπατίτιδας, αλκοολικής ή μη αλκοολικής στεατοηπατίτιδας (ASH ή NASH), χρόνιας ηπατίτιδας Β και C και αλλού (48). Πολλές ομάδες ερευνητών μετά και την δική μας μελέτη, χρησιμοποιώντας ποικίλα cutoff τιμών ΗΑ ορού, κατέληξαν σε παρόμοια συμπεράσματα ότι δηλαδή η μέτρηση των επιπέδων 173 Σ ελίδα

178 ΗΑ στον ορό θα μπορούσε να προβλέψει γεφυροποιό ηπατική ίνωση ή κίρρωση σε NAFLD ασθενείς με μία ακρίβεια της μεθόδου (AUC) κυμαινόμενη από 0,80-0,97. Ωστόσο φαίνεται ότι το ΗΑ είναι λιγότερο ακριβής δείκτης για την ανίχνευση μικρότερου βαθμού ίνωσης (F0-F2) με AUROCs κυμαινόμενες από 0,67-0,73 (48). Suzuki et al (111), πρότεινε ότι η μέτρηση του ΗΑ ορού σε ασθενείς με NAFLD είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για την εκτίμηση σημαντικής (F2, F3, F4) ηπατικής ίνωσης. Ο λογάριθμος του ΗΑ ορού έδειξε μία σημαντική θετική συσχέτιση με το στάδιο ίνωσης και αυτή η σύνδεση παρέμενε και μετά την προσαρμογή για την ηλικία και την λευκωματίνη ορού. Όλες αυτές οι μελέτες αναγράφονται στο γενικό μέρος (πίνακας 22, Κεφάλαιο Ε). Επίσης, μερικές μελέτες πρότειναν ότι ένας συνδυασμός κάποιων από τους παρακάτω δείκτες ηπατικής ίνωσης όπως απτοσφαιρίνης, απολιποπρωτεΐνη Α1, α-2- μακροσφαιρίνης, AST/ALT αναλογίας, τιμής αιμοπεταλίων ορού, λευκωματίνη ορού, ολική χολερυθρίνη ορού, γ-gt,τρανσφερίνη ορού, τιμή ΗΑ ορού, κολλαγόνο τύπου Ι, τύπου II, τύπου III, ΡΙΙΙΝΡ, πεπτίδιο Ν προκολλαγόνου IV (7-S κολλαγόνου), κολλαγόνο IV, κολλαγενάσες (μεταλλοπρωτεϊνάσες) και οι αναστολείς τους, είναι πιο χρήσιμο μη επεμβατικό εργαλείο από ένα μονομερή δείκτη για την εκτίμηση της ηπατικής ίνωσης σε NAFLD γιατί δημιουργούν αλγοριθμικά μοντέλα πιο αξιόπιστα επειδή περιλαμβάνουν πολλούς «ινωτικούς» δείκτες. (κεφάλαιο Ε γενικό μέρος). Για παράδειγμα, προτείνεται ότι η κυττοκερατίνη 18 σε συνδυασμό με τα επίπεδα ορού ΗΑ θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της εξέλιξης της ηπατικής νόσου (112). Σε μια άλλη μελέτη από Nobili et αl (113), αναφέρθηκε ότι ο συνδυασμός του ΗΑ, ΡΙΙΙΝΡ και TIMP1 (γνωστό ως δείκτης ELF) είναι ένα χρήσιμο μοντέλο για την εκτίμηση των σταδίων της ηπατικής ίνωσης σε ασθενείς με NAFLD (Γενικό μέρος,κεφάλαιο Ε, πίνακες 20,39,40,43). Αδιποκίνες ή Αντιποκίνες είναι πολυπεπτίδια που εκκρίνονται στο λιπώδη ιστό με ρυθμισμένο τρόπο. Ενώ μερικά από αυτά τα μόρια εκφράζονται μόνο από τα λιποκύτταρα όπου διαμένουν, τα διηθητικά μακροφάγα και τα συστατικά του αγγειακού στρώματος αισθητά συμβάλλουν στην έκφραση άλλων αντιποκινών. Ως αποτέλεσμα, λιπώδης φλεγμονή των ιστών συνδέεται με μία τροποποίηση στο πρότυπο της έκκρισης αδιποκίνων (114). Λεπτίνη, αδιπονεκτίνη και ρεζιστίνη, είναι τα καλύτερα μελετημένα μόρια σε αυτή την κατηγορία. Λεπτίνη - το προϊόν του γονιδίου ob (obesity mice) - είναι μία κυκλοφορούσα ορμόνη πεπτίδιο 16-kDa που εκκρίνεται κυρίως από τα λιποκύτταρα του λευκού λιπώδους ιστού. Η σύνθεση λεπτίνης στα λιποκύτταρα ρυθμίζεται από διάφορες ορμόνες. Η έκκριση της λεπτίνης από τα λιποκύτταρα, είναι ανάλογη προς τη μάζα λίπους και παρέχει σήματα κατά της παχυσαρκίας, που ρυθμίζουν την πρόσληψη τροφής, τον συμπαθητικό τόνο, και την ενεργειακή δαπάνη σε συνθήκες περίσσειας ενέργειας μέσω οδών του υποθαλάμου(114) (Πίνακας 11). Αυτή η ενέργεια της λεπτίνης κατά της παχυσαρκίας, αντανακλάται από τον φαινότυπο των ob / ob ποντικών τα οποία στερούνται λειτουργικής λεπτίνης και είναι παχύσαρκα και έχουν αυξημένη όρεξη. Ωστόσο οι παχύσαρκοι ασθενείς έχουν αυξημένα επίπεδα της λεπτίνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι είναι ανθεκτικοί στη δράση αυτής της αδιποκίνης. Η έκφραση λεπτίνης σηματοδοτεί επίσης τις δράσεις της ινσουλίνης, την θερμογένεση, επάγει την αγγειογένεση, και τη διαμόρφωση του ανοσοποιητικού συστήματος (Πίνακας 11). (114) 174 Σ ελίδα

179 Πίνακα 11. Μεταβολικές Δράσεις της αντιποκίνης Λεπτίνης(114). Αναστολή της πρόσληψης τροφής Διέγερση των ενεργειακών δαπανών Καταστολή της ηπατικής παραγωγής γλυκόζης Καταστολή της βιοσύνθεσης λιπαρού οξέος (αναστολή της στεαροϋλσυνενζύμου Α δεσατουράσης-1 [stearoyl coenzyme A desaturase-1 :SCD-1]) Διέγερση της οξείδωσης λιπαρών οξέων στο ήπαρ και στους σκελετικούς μύες Διέγερση της πρόσληψης γλυκόζης στους σκελετικούς μύες Διέγερση της έκκρισης ινσουλίνης Διέγερση της έκφρασης αδιπονεκτίνης Διέγερση των προφλεγμονωδών κυτταροκινών (π.χ., IL-6 και TNFa) Καταστολή της έκφρασης ρεζιστίνης Καταστολή της έκφρασης RBP4 (Retinol-binding protein-4) που είναι μια πρωτεΐνη μεταφορέας για τη βιταμίνη Α Τα αποτελέσματα αναγράφονται ανεξάρτητα από τον επικρατούντα χώρο όπου δρουν οι αδιποκίνες. Η δράση της λεπτίνης σε περιφερικούς ιστούς περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση με ειδικούς διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Ο υποδοχέας λεπτίνης (soluble leptin receptor:sob-r), είναι ένα μέλος της οικογένειας υποδοχέων κυτοκίνης τάξης-1 και μπορεί να είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας λεπτίνης. Ο SOB-R αρχικά αποδείχθηκε στους νευρώνες του υποθαλάμου, μέσω των οποίων η λεπτίνη ρυθμίζει την πρόσληψη τροφής και το σωματικό βάρος(114,115). Έξι ισομορφές υποδοχέων λεπτίνης έχουν ταυτοποιηθεί (SOBRα- SObRf) και εκφράζονται στo κεντρική νευρικό σύστημα και σε ένα ευρύ φάσμα των περιφερικών ιστών συμπεριλαμβανομένου του ήπατος.ο SOB-Rb αποτελεί τον κυρίαρχο διαμεσολαβητή στις βιολογικές επιδράσεις της λεπτίνης μέσω ενεργοποίησης της κινάσης Janus 2 (Jak2) / μετατροπέα σήματος λεπτίνης και ενεργοποίησης της μεταγραφικής 3 (Stat3) οδού. SOR-Re είναι ένας διαλυτός υποδοχέας που σχηματίζει σύμπλοκα με την κυκλοφορούσα λεπτίνη. Η αναλογία ελεύθερης λεπτίνης προς δεσμευμένη, ρυθμίζει τη βιολογική δραστικότητα της και υψηλά επίπεδα κυκλοφορούντων SOB-Re σχετίζονται με ελαττωμένη δράση της λεπτίνης(116,117). Η ισορροπία ανάμεσα στην ελεύθερη μορφή, τη ραγδαίως βιοδιαθέσιμη μορφή, και την δεσμευμένη λεπτίνη, ρυθμίζει την βιοδιαθεσιμότητα της λεπτίνης (118). Ωστόσο ο ακριβής παθοφυσιολογικός ρόλος των SOB-R δεν έχει ακόμη οριστεί. Οι μηχανισμοί αντίστασης λεπτίνης είναι ουσιαστικά κεντρικοί και σχετίζονται με την ελαττωματική μεταφορά λεπτίνης και μεταβολές στην SOB-Rb σηματοδότησης περιλαμβανομένων υπερέκφραση του καταστολέα της σηματοδότησης κυτοκίνη-3 (suppressor of cytokine signaling-3 :SOCS3), ένα μόριο που αναστέλλει σηματοδότηση της λεπτίνης (Εικ. 10). 175 Σ ελίδα

180 Εικόνα 10. Οδοί μεταγωγής σήματος αδιποκίνων: Μείωση της έκφρασης υποδοχέων αδιποκίνης προκαλεί αντίσταση στην ινσουλίνη και την λεπτίνη. Οι υποδοχείς για διαφορετικές κυτοκίνες που βρίσκονται επί της μεμβράνης μπορούν να αλληλεπιδρούν με συγγενή μόρια. Η ενεργοποίηση των μορίων σηματοδότησης που βρίσκονται μετά τον υποδοχέα παρεμβαίνει με σηματοδότηση του υποδοχέα ινσουλίνης ή / και του υποδοχέα της λεπτίνης. Τα βέλη δείχνουν διέγερση, οι μπάρες δείχνουν αναστολή. ΙκΒ κινάσες (ΙΚΚ), το υπόστρωμα-1 υποδοχέα ινσουλίνης (Insulin Receptor Substrate-1:IRS-1), c-jun Ν- τερματικής κινάσης (c-jun terminal kinase:c-jnk), πυρηνικός παράγοντας-κβ(nuclear Factor-kB: ΝF-κΒ), υποδοχέαs της λεπτίνης-b (SOB-Rb), σηματοδότης μετατροπής και ενεργοποιητής της μεταγραφής-3 (Signal transducer and activator of transcription-3 : STAT3)(114). Η σήμανση στεάτωσης παρατηρήθηκε σε λεπτίνη ανεπαρκή ob/ob ποντίκια. Αυτό δείχνει ότι η λεπτίνη αποτρέπει το λιπώδες ήπαρ τόσο έμμεσα, μέσω κεντρικών νευρικών οδών, όσο και άμεσα, μέσω ενεργοποίησης της ηπατικής πρωτεΐνικής κινάσηςμονοφωσφορικής αδενοσίνης (Adenosin monophosphate-activated protein Kinase:ΑΜΡΚ) (119,120). Ομοίως σε γενικευμένη λιποδυστροφία, η οποία είναι μια άλλη κατάσταση της ανεπάρκειας λεπτίνης, η αντικατάσταση λεπτίνης βελτιώνει το λιπώδες ήπαρ (121). Σε αντίθεση η παρατήρηση ότι οι ασθενείς με παχυσαρκία έχουν λιπώδες ήπαρ παρά τα αυξημένα επίπεδα λεπτίνης, προτείνει την παρουσία της ηπατικής αντίστασης λεπτίνης. Ένας ρόλος για τα θρεπτικά συστατικά έχει προταθεί πρόσφατα στη διαταραχή αυτή επειδή η φρουκτόζη προκαλεί υπερλεπτιναιμία και ηπατική αντίσταση στη λεπτίνη παρεμβαίνοντας με Stat3 σηματοδότησης (122). Άλλοι μηχανισμοί αντίστασης λεπτίνης, σε αυτό το μοντέλο, περιλαμβάνουν αυξημένα επίπεδα SOCS3 πράγμα που δυσχεραίνει τη σηματοδότησης μετά τον υποδοχέα και οδηγεί σε μειωμένη ενεργοποίηση ΑΜΡΚ (123). Ενεργοποίηση του CB1 υποδοχέα κανναβινοειδούς είναι μια πρόσθετη οδός που εμπλέκεται στην παθογένεση της αντίστασης λεπτίνης (124). Το ήπαρ επίσης εμπλέκεται στη ρύθμιση των διαφόρων ισομορφών του υποδοχέα της λεπτίνης. Ο διαλυτός υποδοχέας της λεπτίνης (SOB-R) εκφράζεται από το ήπαρ κάτω από τον έλεγχο της ινσουλίνης όπως φαίνεται από την αύξηση του διαλυτού υποδοχέα της λεπτίνης που παρατηρείται σε ποντικούς με ειδική για το ήπαρ ανεπάρκεια για τον υποδοχέα της ινσουλίνης, αν και σε αυτό το μοντέλο η ευαισθησία στη λεπτίνη διατηρείται (125). Σε αντίθεση, αντίσταση λεπτίνης παρατηρείται στη διατροφή που σχετίζεται με την παχυσαρκία σε συνδυασμό με μειωμένη έκφραση των ηπατικών υποδοχέων λεπτίνης (126). Η λεπτίνη εμπλέκεται επίσης στην έμφυτη και προσαρμοστική ανοσία. Τα ποντίκια ob/ob με περίσσεια λεπτίνης,προστατεύονται από τραυματισμούς σε μοντέλα αυτοάνοσης νόσου και από την εκ Τ-κυττάρων προκαλούμενη ηπατίτιδα που επάγεται από ένεση 176 Σ ελίδα