Παρασκευασµένο υλικό καλλιέργειας σε τρυβλία BBL για την ανίχνευση εντερόκοκκων ανθεκτικών στη βανκοµυκίνη

Transcript

1 Παρασκευασµένο υλικό καλλιέργειας σε τρυβλία BBL για την ανίχνευση εντερόκοκκων ανθεκτικών στη βανκοµυκίνη Vancomycin Screen Agar είτε το γλωσσάριο των συµβόλων στο τέλος του ένθετου JAA 2004/07 ÏÏËÓÈÎ ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Το Vancomycin Screen Agar χρησιµοποιείται για την εξέταση εντερόκοκκων για ανθεκτικότητα στη βανκοµυκίνη, καθώς και για την πρόβλεψη της συνεργιστικής δραστικότητας αυτού του αντιµικροβιακού παράγοντα µε έναν αµινογλυκοσιδικό αντιµικροβιακό παράγοντα. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Οι εντερόκοκκοι είναι γνωστό ότι προκαλούν ευρεία ποικιλία λοιµώξεων. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, µολύνουν την ουροφόρο οδό, την κοιλία, την κυκλοφορία του αίµατος, το ενδοκάρδιο, τους χοληφόρους, τραύµατα εγκαυµάτων και µόνιµους καθετήρες. 1 Ο Enterococcus faecalis προκαλεί το 80 έως 90% των λοιµώξεων, ενώ ο E. faecium προκαλεί την πλειονότητα των υπολοίπων. 2 Σήµερα οι εντερόκοκκοι είναι η τέταρτη κύρια αιτία νοσοκοµειακής λοίµωξης και η τρίτη κύρια αιτία βακτηριαιµίας στις Η.Π.Α. 3 Τα ποσοστά περιπτώσεων/θνητότητας από εντεροκοκκική βακτηριαιµία κυµαίνονται από 12 έως 68% µε θάνατο λόγω σήψης στο 4 έως 50% των περιπτώσεων. 4 Η θεραπεία εντεροκοκκικών λοιµώξεων είτε µε πενικιλλίνη είτε µε βανκοµυκίνη µόνο δεν επιτυγχάνει τη φόνευση των εντερόκοκκων, µε αποτέλεσµα την υποτροπή της λοίµωξης. 5 Οι εντερόκοκκοι εδώ και έτη είναι γνωστό ότι έχουν χαµηλή ενδογενή ανθεκτικότητα σε ποικιλία β- λακταµικών, καθώς και αµινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών. 6 Η προσθήκη µιας αµινογλυκοσίδης στην οποία το αποµονωµένο στέλεχος έχει επιδείξει ευαισθησία, έχει ως αποτέλεσµα τόσο in vitro όσο και in vivo συνεργισµό, µε συνέπεια βακτηριοκτόνο αποτέλεσµα. 7 Αυτή η συνεργιστική επίδραση πιστεύεται ότι οφείλεται στη βλάβη που προκαλεί η πενικιλλίνη ή η βανκοµυκίνη στην ακεραιότητα του κυτταρικού τοιχώµατος, επιτρέποντας έτσι στην αµινογλυκοσίδη να διεισδύσει και να αναστείλει τη σύνθεση των βακτηριδιακών πρωτεϊνών. 8 Η εµφάνιση ανθεκτικότητας στη βανκοµυκίνη ( 6 µg/ml) 9 ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την αποτυχία των συνδυασµών βανκοµυκίνης-αµινογλυκοσίδης να εκριζώσουν τους µολυσµατικούς µικροοργανισµούς. Εποµένως, η εξέταση ανθεκτικότητας στη βανκοµυκίνη είναι σηµαντική. Για την εξέταση ανθεκτικότητας, η National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) συνιστά τη χρήση Brain Heart Infusion Agar (BHIA) που περιέχει βανκοµυκίνη (6 µg/ml). 10 ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Η βάση του Brain Heart Infusion Agar είναι ένα υλικό καλλιέργειας γενικής χρήσης, κατάλληλο για την καλλιέργεια ευρείας ποικιλίας µικροοργανισµών. Τα στερεά και οι πεπτόνες έγχυσης κρέατος είναι πηγές οργανικού αζώτου, άνθρακα, θείου, βιταµινών και ιχνοστοιχείων. Η δεξτρόζη αποτελεί πηγή υδατανθράκων. Το υλικό καλλιέργειας ρυθµίζεται µέσω της χρήσης όξινου φωσφορικού νατρίου. Για την ανίχνευση της ανθεκτικότητας στη βανκοµυκίνη χρησιµοποιείται βανκοµυκίνη σε συγκέντρωση 6 µg/ml. 10 Η χρωστική Food, Drug & Cosmetic (FD&C) είναι αδρανής και προστίθεται για εύκολη οπτική αναγνώριση αυτού του υλικού που περιέχει βανκοµυκίνη. ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Vancomycin Screen Agar Σύνθεση* κατά προσέγγιση ανά λίτρο κεκαθαρµένου νερού Προϊόν έγχυσης καρδιάς/εγκεφάλου (στερεά)... 8,0 g Πεπτικό αφοµοίωµα ζωικού ιστού... 5,0 g Παγκρεατικό αφοµοίωµα καζεΐνης... 16,0 g Χλωριούχο νάτριο... 5,0 g εξτρόζη... 2,0 g Όξινο φωσφορικό νάτριο... 2,5 g Άγαρ... 13,5 g Χρωστική FD&C Yellow #5... 0,56 g Βανκοµυκίνη... 6,0 mg

2 *Ρυθµισµένο ή/και συµπληρωµένο όπως απαιτείται, έτσι ώστε να πληρούνται τα κριτήρια απόδοσης. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις Για in vitro διαγνωστική χρήση. Εφαρµόζετε άσηπτες τεχνικές και καθιερωµένες προφυλάξεις από µικροβιολογικούς κινδύνους καθόλη την πορεία όλων των διαδικασιών. Μετά τη χρήση, τα παρασκευασµένα τρυβλία, τα δοχεία δείγµατος και άλλα µολυσµένα υλικά πρέπει να αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο πριν από την απόρριψη. Εάν παρατηρήσετε υπερβολική υγρασία, τοποθετήστε το κάτω τµήµα του τρυβλίου ανάποδα και έκκεντρα πάνω από ένα καπάκι και αφήστε το να στεγνώσει στον αέρα προκειµένου να αποτραπεί τυχόν σχηµατισµός στεγανοποίησης µεταξύ του άνω και του κάτω τµήµατος του τρυβλίου κατά τη διάρκεια της επώασης. Οδηγίες φύλαξης: Κατά την παραλαβή, φυλάσσετε τα τρυβλία στο σκότος στους 2 8 C. Αποφεύγετε την κατάψυξη και την υπερβολική θέρµανση. Μην ανοίγετε παρά µόνον όταν είστε έτοιµοι για χρήση. Ελαχιστοποιήστε την έκθεση στο φως. Τα παρασκευασµένα τρυβλία που φυλάσσονται στην αρχική συσκευασία τους στους 2 έως 8 C έως ακριβώς πριν από τη χρήση, είναι δυνατό να ενοφθαλµιστούν έως την ηµεροµηνία λήξης και να επωαστούν για τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. Αφήστε το υλικό καλλιέργειας να θερµανθεί σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τον ενοφθαλµισµό. Αλλοίωση του προϊόντος: Μη χρησιµοποιείτε τις πλάκες εάν παρουσιάζουν ενδείξεις µικροβιακής µόλυνσης, αποχρωµατισµό, ξηρότητα, ρωγµές ή άλλα σηµεία αλλοίωσης. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Αυτό το υλικό καλλιέργειας δεν προορίζεται για χρήση µε δείγµατα ή µεικτές καλλιέργειας. Ο µικροοργανισµός που θα εξεταστεί πρέπει πρώτα να είναι σε καθαρή καλλιέργεια και να ταυτοποιηθεί συµπερασµατικά ως είδος Enterococcus. ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Παρεχόµενο υλικό: s~ååçãóåáåpåêééå^ö~ê Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται: Βοηθητικά υλικά καλλιέργειας, αντιδραστήρια, µικροοργανισµοί ποιοτικού ελέγχου και εργαστηριακός εξοπλισµός, όπως απαιτείται για τη διαδικασία αυτή. ιαδικασία της εξέτασης: 1. Παρασκευάστε το ενοφθάλµισµα µε εναιώρηση διαφόρων καλά αποµονωµένων αποικιών του εντεροκοκκικού αποµονωµένου στελέχους από µια καλλιέργεια σε τρυβλίο διάρκειας 18 έως 24 h, σε σωληνάριο του Trypticase Soy Broth και επακόλουθη ρύθµιση της θολερότητας έτσι ώστε να είναι ισοδύναµη µε το πρότυπο θολερότητας McFarland 0,5. 2. Ενοφθαλµίστε σηµειακά το τρυβλίο µε 10 µl του ρυθµισµένου εναιωρήµατος Αφήστε το σηµειακό ενοφθάλµισµα να απορροφηθεί µέσα στην επιφάνεια του άγαρ. 4. Ενοφθαλµίστε ένα τρυβλίο ελέγχου ανάπτυξης, όπως το Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood (TSA II), µε τον ίδιο τρόπο. 5. Επωάστε τα τρυβλία στους 35 C ± 2 C υπό αερόβιες συνθήκες επί ένα ολόκληρο 24 h. Ποιοτικός έλεγχος χρήστη 1. Εξετάστε τα τρυβλία για τυχόν ενδείξεις αλλοίωσης, όπως περιγράφεται στην ενότητα Αλλοίωση του προϊόντος. 2. Ελέγξτε την απόδοση ενοφθαλµίζοντας ένα αντιπροσωπευτικό δείγµα τρυβλίων µε καθαρές καλλιέργειες σταθερών µικροοργανισµών ελέγχου, οι οποίες δίνουν γνωστές επιθυµητές αντιδράσεις. Συνιστώνται οι ακόλουθες καλλιέργειες. ΣΤΕΛΕΧΗ ΕΛΕΓΧΟΥ ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ båíéêçåçååìëñ~éå~äáë ^q``ovono båíéêçåçååìëñ~éå~äáë + ^q``rnovv + Ανάπτυξη > µία αποικία Καµία ανάπτυξη ή µία αποικία Πρέπει να τηρούνται οι απαιτήσεις ποιοτικού ελέγχου σύµφωνα µε τους ισχύοντες τοπικούς, πολιτειακούς ή/και οµοσπονδιακούς κανονισµούς ή τις απαιτήσεις πιστοποίησης και τις πρότυπες

3 διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου του εργαστηρίου σας. Συνιστάται ο χρήστης να ανατρέχει στις σχετικές κατευθυντήριες οδηγίες της NCCLS και τους κανονισµούς του CLIA για τις κατάλληλες πρακτικές ποιοτικού ελέγχου. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετά από επώαση επί ένα ολόκληρο 24 h, παρατηρήστε τα τρυβλία για τυχόν ανάπτυξη. Τρυβλίο ελέγχου ανάπτυξης: Τυχόν ανάπτυξη υποδηλώνει βιώσιµους µικροοργανισµούς εξέτασης στο εναιώρηµα του ζωµού ενοφθαλµίσµατος και εγκυρότητα της εξέτασης. Εάν δεν υπάρχει ανάπτυξη, η εξέταση δεν είναι έγκυρη και πρέπει να επαναληφθεί. Vancomycin Screen Agar: Τυχόν ανάπτυξη (> µία αποικία) υποδηλώνει ότι ο αντιµικροβιακός παράγοντας ενδέχεται να µην είναι συνεργιστικός σε θεραπεία συνδυασµού. Τυχόν απουσία ανάπτυξης ( µία αποικία) υποδηλώνει ότι ενδέχεται να προβλέπεται συνέργεια. 10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Το προϊόν αυτό προορίζεται για χρήση µε είδη Enterococcus. Ενίοτε, εντεροκοκκικά αποµονωµένα στελέχη µε οριακές MIC ευαισθησίας σε αντιµικροβιακούς παράγοντες ενδέχεται να εµφανίσουν ανάπτυξη. Το προϊόν αυτό παρέχει µια µέθοδο διερεύνησης για πρόβλεψη συνεργιστικών συνεισφορών της βανκοµυκίνης µε αµινογλυκοσίδες. Συνιστάται η διεξαγωγή µελετών συνέργειας µε τυχόν εντεροκοκκικά αποµονωµένα στελέχη που αναπτύσσονται στο άγαρ διερεύνησης, πριν από την έναρξη ή τον αποκλεισµό της θεραπείας συνδυασµού µε βανκοµυκίνη. Η τεχνική άβακα και οι εξετάσεις θανάτωσης σε συνάρτηση µε το χρόνο είναι οριστικές µέθοδοι για τον προσδιορισµό της συνέργειας. 11 Για τον προσδιορισµό της ακριβούς συγκέντρωσης της βανκοµυκίνης στην οποία ένα εντεροκοκκικό αποµονωµένο στέλεχος είναι ανθεκτικό, πρέπει να εκτελείται εξέταση ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης, όπως συνιστάται στο έγγραφο M7-A6 της NCCLS. 10 Για τη βελτιστοποίηση των µέτρων ελέγχου λοιµώξεων, συνιστάται προσδιορισµός του φαινοτυπικού τύπου ανθεκτικότητας στη βανκοµυκίνη (VanA, VanB ή VanC). 12,13 Το εντεροκοκκικό στέλεχος εξέτασης ενδέχεται να είναι ανθεκτικό στην πενικιλλίνη και την αµπικιλλίνη από την αλλοίωση των πρωτεϊνών δέσµευσης της πενικιλλίνης ή την παραγωγή της β-λακταµάσης. Συµβουλευτείτε το έγγραφο της NCCLS για τις κατάλληλες µεθόδους εξέτασης. 10 Η συνεργιστική δραστικότητα ενός συνδυασµού πενικιλλίνης και αµινογλυκοσίδης δεν είναι δυνατό να προβλεφθεί από τα αποτελέσµατα της βανκοµυκίνης. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟ ΟΣΗΣ Η διαδικασία εξέτασης διερεύνησης σε άγαρ για την ανίχνευση εντερόκοκκων ανθεκτικών στη βανκοµυκίνη που συνιστάται από την NCCLS εκτελέστηκε εσωτερικά µε 50 αποµονωµένα στελέχη Enterococcus µε χρήση υλικού διερεύνησης BBL που περιείχε BHIA µε βανκοµυκίνη 6 µg/ml. Τα 50 εντεροκοκκικά αποµονωµένα στελέχη αποτελούνταν από 21 E. faecalis, 19 E. faecium, 4 E. gallinarum, 2 E. raffinosus, 1 E. casseliflavus, 1 E. mundtii και 2 E. avium. Από αυτά τα 50 αποµονωµένα στελέχη, τα 28 (56%) ήταν ανθεκτικά στη βανκοµυκίνη. Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισµός περιελάµβανε αραίωση άγαρ ή/και ζωµού για την επίτευξη των MIC βανκοµυκίνης. ιαπιστώθηκε 100% συσχέτιση µεταξύ των αποτελεσµάτων εξέτασης και των αναµενόµενων αποτελεσµάτων. Πραγµατοποιήθηκαν µελέτες αναπαραγωγιµότητας (3x/ηµέρα επί 3 ηµέρες) σε δύο εργαστηριακά κέντρα µε 15 εντεροκοκκικά αποµονωµένα στελέχη. Τα 15 αποµονωµένα στελέχη αποτελούνταν από 7 E. faecalis, 4 E. faecium, 1 E. gallinarum, 1 E. avium, 1 E. casseliflavus και 1 E. raffinosus. Από αυτά τα αποµονωµένα στελέχη, τα 8 (53%) ήταν ανθεκτικά στη βανκοµυκίνη. Ο φαινοτυπικός χαρακτηρισµός περιελάµβανε αραίωση άγαρ ή/και ζωµού για την επίτευξη των MIC βανκοµυκίνης. Και στην περίπτωση αυτή, διαπιστώθηκε 100% συσχέτιση µεταξύ των αποτελεσµάτων της εξέτασης και των αναµενόµενων αποτελεσµάτων. ΙΑΘΕΣΙΜΟΤΗΤΑ Αρ. κατ. Περιγραφή BBL Vancomycin Screen Agar, συσκευασία των 10 τρυβλίων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ NK géííi_kakijkjkeìóåâéi~åçjkpkdáäãçêéknvvqksáêìäéååéçñéåíéêçåçååák`äáåkjáåêçäáçäkoéîktwqsojqtuk OK jçéääéêáåöiok`kigêknvvokbãéêöéååéçñbåíéêçåçåìë~ë~ëáöåáñáå~åíé~íüçöéåk`äáåkfåñéåíkaáëknqwnntpjnntuk PK bãçêáiqkdki~åçokmkd~óåéëknvvpk^åçîéêîáéïçñåçëçåçãá~äáåñéåíáçåëiáååäìçáåöíüéêçäéçñíüéãáåêçäáçäçöó ä~äçê~íçêók`äáåkjáåêçäáçäkoéîkswqoujqqok

4 QK i~åçêóipkikiakikh~áëéêi~åçokmktéåòéäknvuvkeçëéáí~äëí~ó~åçãçêí~äáíó~ííêáäìíéçíçåçëçåçãá~ä ÉåíÉêçÅçÅÅ~äÄ~ÅíÉêÉãá~W~ÅçåíêçääÉÇëíìÇóK^ãKgKfåÑÉÅíK`çåíêçäNTWPOPJPOVK RK jçääéêáåöiok`kigêkilkjkhçêòéåáçïëâáijk^kp~åçéi~åç`k_ktéååéêëíéåknvtvkpééåáéëjëééåáñáåêéëáëí~ååéíç ~åíáãáåêçäá~äëóåéêöáëãáåpíêééíçåçååìëñ~éåáìã~åçpíêééíçåçååìëñ~éå~äáëkgkfåñéåíkaáëknqmwompjomuk SK jìêê~ói_kbknvvmkqüéäáñé~åçíáãéëçñíüééåíéêçåçååìëk`äáåkjáåêçäáçäkoéîkpwqsjsrk TK j~åçéääidkiknvuqkbåáöã~íáåéåíéêçåçåå~äéåççå~êçáíáëk^ååkfåíéêåkjéçknmmwvmqjvmrk UK jçéääéêáåöiok`kigêki~åç^kkktéáåäéêöknvtnkpíìçáéëçå~åíáäáçíáåëóåéêöáëã~ö~áåëíéåíéêçåçååákffkbññéåíçñ î~êáçìë~åíáäáçíáåëçåíüéìéí~âéçñ NQ`Jä~ÄÉääÉÇëíêÉéíçãóÅáåÄóÉåíÉêçÅçÅÅáKgK`äáåKfåîÉëíKRMWORUMJORUQK VK gçüåëçåi^kmki^kek`krííäéóikktçççñçêçi~åçok`kdéçêöéknvvmkoéëáëí~ååéíçî~ååçãóåáå~åçíéáåçéä~åáåw~å ÉãÉêÖáåÖÅäáåáÅ~äéêçÄäÉãK`äáåKjáÅêçÄáçäKoÉîKPWOUMJOVNK NMKk~íáçå~ä`çããáííÉÉÑçê`äáåáÅ~äi~Äçê~íçêópí~åÇ~êÇëKOMMPK^ééêçîÉÇëí~åÇ~êÇWjTJ^SKjÉíÜçÇëÑçêÇáäìíáçå ~åíáãáåêçäá~äëìëåééíáäáäáíóíéëíëñçêä~åíéêá~íü~íöêçï~éêçäáå~ääóisíüéçkk~íáçå~ä`çããáííééñçê`äáåáå~ä i~äçê~íçêópí~åç~êçëit~óåéim~k NNKp~ÜãIaKcKI~åÇ`KqçêêÉëKNVUUKbÑÑÉÅíëçÑbÑÑÉÅíëçÑãÉÇáìã~åÇáåçÅìäìãî~êá~íáçåëçåëÅêÉÉåáåÖÑçêÜáÖÜJ äéîéä~ãáåçöäóåçëáçéêéëáëí~ååéáåbåíéêçåçååìëñ~éå~äáëkgk`äáåkjáåêçäáçäkoswormjorsk NOKcÉÇÉê~äoÉÖáëíÉêKNVVQKmêÉîÉåíáåÖíÜÉëéêÉ~ÇçÑî~åÅçãóÅáåêÉëáëí~åÅÉW~êÉéçêíÑêçãíÜÉeçëéáí~äfåÑÉÅíáçå `çåíêçämê~åíáåéë^çîáëçêó`çããáííéékcéçkoéöáëíkeé~êísfkrvwortrujortspk NPKtççÇÑçêÇIkKI^KmKgçÜåëçåIaKjçêêáëçåI~åÇaK`KbKpéÉääÉêKNVVRK`ìêêÉåíéÉêëéÉÅíáîÉëçåÖäóÅçéÉéíáÇÉ êéëáëí~ååék`äáåkjáåêçäáçäkoéîkuwrurjsnrk ^q``áë~íê~çéã~êâçñíüé^ãéêáå~åqóéé`ìäíìêé`çääéåíáçåk _ai_aiçöçi i~åçqêóéíáå~ëé~êéíê~çéã~êâëçñ_éåíçåiaáåâáåëçå~åç`çãé~åók«ommq_ak

5