ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ

Transcript

1 ΗΜΕΡΙΔΑ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ 24 ΙΑΝΟΥΑΡΙΟΥ 2009 ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ Ε. ΠΕΤΕΙΝΑΚΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ

2 ΣΤΟΧΟΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα λοίμωξης με σκοπό την εφαρμογή κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΥΤΟΜΑΤΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΤΗΣ ΑΝΤΟΧΗΣ Αξιόπιστη ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους Προσδιορισμό MIC Ερμηνεία του αντιβιογράμματος

4 Μοριακές τεχνικές α. ανίχνευση μηχανισμών αντοχής (γονίδια αντοχής,μεταλλάξεις κλπ) β. διευκρίνιση τρόπου διασποράς της αντοχής

5 ΑΝ και ΠΟΤΕ βοηθά η μοριακή ανίχνευση της αντοχής στο κλινικό μικροβιολογικό εργαστήριο

6 α. γρήγορη ανίχνευση της αντοχής β. ελλείματα φαινοτυπικών μεθόδων γ. επιδημιολογική επιτήρηση

7 Α. γρήγορη ανίχνευση αντοχής Γονίδια, προσδιορισμό μεταλλάξεων Βραδέως αναπτυσσόμενα βακτήρια, ιοί

8 Δυνατότητα ανίχνευσης γονιδίων άμεσα στο στέλεχος 3 ώρες / ώρες Μοριακές/ Κλασσικές

9 Εφαρμογές Βακτήρια (Mycobacterium tuberculosis, Helicobacter pylori) Ιοί (ηπατίτιδα Β, HIV)

10

11 Φυσική αντοχή σε πυραζιναμίδη Μycobacterium bovis Μycobacterium canettii μετατροπή σε πυραζινοικό οξύ (ΡΟΑ) λόγω παρουσίας της πυραζιναμιδάσης μετάλλαξη στο pnca (γονίδιο που κωδικοποιεί την πυραζιναμιδάση)

12 Μοριακή ανίχνευση αντοχής σε ισονιαζίδη και ριφαμπικίνη Μεταλλάξεις στο katg (αντοχή σε ισονιαζίδη) inha Μεταλλάξεις στο rpob (αντοχή σε ριφαμπικίνη) ΜΤΒDR plus assay (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)

13 ΜΕΘΟΔΟΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΔΥΝΑΤΟΤΗΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΑΜΕΣΑ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ ΣΤΟ ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΜΕΤΑ ΤΗΝ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΜΕΘΟΔΟΥ 4 ΩΡΕΣ

14

15

16 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΣΥΣΚΕΥΗ PCR ΦΟΥΡΝΟ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΥ ΔΙΑΘΕΣΙΜΟ ΜΑΖΙ ΜΕ ΤΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ

17 ΤΟ ΑΝΤΙΒΙΟΓΡΑΜΜΑ ΧΡΕΙΑΖΕΤΑΙ ΕΙΝΑΙ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΝΑ ΓΙΝΕΤΑΙ? ΣΠΑΝΙΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΠΟΣΟΣΤΟ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ ΤΗΣ HAIN 98.7% / 96.8% Ριφαμπικίνη 92 / 87.8% Ισονιαζίδη 2640 Doris Hillemann,* Sabine Ru sch-gerdes, and Elvira Richter, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2007, p. 2635

18 Helicobacter pylori Μεταλλάξεις σε φλουοροκινολόνες (gyra) και σε κλαριθρομυκίνη (23S) Εμπορική μέθοδος HAIN Εφαρμογή άμεσα σε γαστρική βιοψία

19

20 ΕΛΕΓΧΟΣ ΣΕ ΜΕΤΡΟΝΙΔΑΖΟΛΗ Μη διαθέσιμη εμπορική μέθοδος Μεταλλάξεις σε rdxa και frxa

21 Hπατίτιδα Β ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΦΑΡΜΑΚΑ L180M M204I/V DR Lamivudine A181V N236T DR Adefovir M250V T184G DR Entecavir KΛΙΝΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ

22 ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΛΟΓΩ ΑΔΥΝΑΜΙΑΣ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ

23 GRAM (+) κόκκοι Σταφυλόκοκκοι (αντοχή στην οξακιλλίνη) (μέτρια ευαισθησία σε γλυκοπεπτίδια) Εντερόκοκκοι (αντοχή σε γλυκοπεπτίδια, VRE) β-αιμολυτικός στρεπτόκοκκος ομάδας Α (αντοχή σε μακρολίδες, λινκοσαμίδες, στρεπτογραμίνη Β) Πνευμονιόκοκκος (αντοχή σε πενικιλλίνη, β-λακταμικά)

24 Gram-αρνητικά Ευρέως φάσματος β-λακταμάσες Μεταλλο-β-λακταμάσες

25 S. aureus Στελέχη της κοινότητας φαινοτυπικά ευαίσθητα (MIC: mg/l) PBP-2a (εξαιρετική ευαισθησία και ειδικότητα) Σπάνια ανίχνευση του meca γονιδίου Jones et al; J Clin Microbiol 1999, 37: 1591

26 Σταφυλόκοκκοι -γλυκοπεπτίδια Ετερογένεια Αλλαγή των τιμών της MICs Καμία βοήθεια από τις μοριακές τεχνικές

27 Εντερόκοκκοι-γλυκοπεπτίδια Κάλυψη από τον φαινότυπο (βανκομυκίνη) Αξιόπιστη ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους ( στελέχη van C) Η ταυτοποίηση των γονιδίων van μόνο για επιδημιολογικούς σκοπούς

28 Β-αιμολυτικός στρεπτόκοκκος ομάδας Α-MLS B Καμία ιδιαίτερη βοήθεια η μοριακή ανίχνευση Χρήση του διπλού δίσκου Ε-CC Ταυτοποίηση των erm γονιδίων έχει μόνο επιδημιολογικό ενδιαφέρον

29 Πνευμονιόκοκκος-β-λακταμικά Υπερτερούν οι φαινοτυπικές μέθοδοι Η ανίχνευση των μεταλλάξεων δεν βοηθά

30 Ευρέως φάσματος β-λακταμάσες Μεγάλη ευαισθησία των αυτόματων συστημάτων Διπλό E-test με το κλαβουλανικό Επιδημιολογικό ενδιαφέρον η ταυτοποίηση των γονιδίων

31 Μεταλλο-β-λακταμάσες Στελέχη οριακής αντοχής Klebsiella ( vim+) Acinetobacter (2/87 vim +) Giakkoupi et al J Clin Microbiol, 2005; Ikonomidis et al, J Clin Microbiol 2008; 346-9

32 Η εισαγωγή στην κλινική πράξη νέων αντιμικροβιακών φαρμάκων προκάλεσε τη δημιουργία, εκ μέρους των μικροοργανισμών, νέων μηχανισμών αντοχής, που συχνά διαφεύγουν από τις κλασσικές φαινοτυπικές μεθόδους (αυτόματα συστήματα, Κirby-Bauer)

33 Aρχόμενοι μηχανισμοί έκφραση αντοχής χαμηλού επιπέδου Α ΥΝΑΜΙΑ ΤΩΝ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΩΝ ΜΕΘΟ ΩΝ Κριτήρια NCCLS

34 Νέα αντιβιοτικά κατά των ανθεκτικών Gram θετικών κόκκων ΝΕΑ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Στρεπτογραμίνες στρεπτογραμίνη Β -στρεπτογραμίνη Α (30/70) Οξαζολιδόνες linezolid

35 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣΑΝΤΟΧΗΣ Αλλαγή στόχου δράσης G2576T (κλινική σημασία) ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ

36 ΑΝΤΟΧΗ ΚΑΤΑ ΤΗ ΙΑΡΚΕΙΑ ΤΗΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑΣ σταδιακή αλλαγή λόγω μετάλλαξης των θέσεων σύνδεσης(1 6) συσχέτιση αριθμού μεταλλάξεων και τιμή ΜΙC συσχέτιση χρόνου θεραπείας και αριθμού μεταλλάξεων

37 LINEZOLID MIC (mg/l) No of mutated genes 2 0/6 8 1/6 16 1/6 32 2/6 32 3/6 64 4/6 64 5/ /6

38 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ εύκολη και γρήγορη μέθοδος (4 h) απάντηση στο ερώτημα αν το στέλεχος έχει αρχίσει να αναπτύσσει αντοχή αλλαγή θεραπείας

39 Μοριακές μέθοδοι Συμβολή στη βελτιστοποίηση των φαινοτυπικών μεθόδων Όρια αντοχής, συμπληρωματικές μέθοδοι

40 Επιδημιολογική διερεύνηση της αντοχής (γονίδια, γενετικό περιβάλλον) Αποστολή σε κέντρα αναφοράς

41 ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΠΟΛΥ!