C. trachomatis PCR Kit

Transcript

1 C. trachomatis PCR Kit ιαγνωστικό προϊόν in vitro ποσοτικού προσδιορισµού για χρήση σε συνδυασµό µε ABI PRISM Sequence Detection Systems (Applied Biosystems) Οδηγίες χρήσης Ιούλιος 2004

2 Πίνακας περιεχοµένων 1. Περιεχόµενο Αποθήκευση Πρόσθετα απαιτούµενα υλικά και συσκευές Γενικά µέτρα ασφαλείας Πληροφορίες σχετικά µε τους παθογόνους παράγοντες Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR Περιγραφή προϊόντος Πρωτόκολλο Προκαταρκτική ανάλυση: λήψη, φύλαξη και µεταφορά των δειγµάτων ειγµατοληψία Φύλαξη δειγµάτων Μεταφορά δειγµάτων Αποµόνωση DNA Συστάσεις για τον καθαρισµό των δειγµάτων ούρου και επιχρίσµατος µε QIAamp Viral RNA Mini Kit Συστάσεις για τον καθαρισµό των δειγµάτων επιχρίσµατος και σπέρµατος µε το QIAamp DNA Mini Kit Συστάσεις για τον καθαρισµό λυοφιλοποιηµένων δειγµάτων µε το QIAamp DNA Mini Kit Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Ποσοτικοποίηση Προετοιµασία της PCR Προγραµµατισµός του ABI PRISM SDS Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7000 SDS Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR...24 EL041028

3 ηµιουργία/επιλογή των ανιχνευτών Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Έναρξη της διαδικασίας PCR Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7700 SDS Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR Επιλογή των φθορίζουσων χρωστικών ουσιών και αντιστοίχιση του τύπου δείγµατος Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Σηµαντικές πρόσθετες ρυθµίσεις Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Έναρξη της διαδικασίας PCR Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7900HT SDS Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR ηµιουργία/επιλογή των ανιχνευτών Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Έναρξη της διαδικασίας PCR Αξιολόγηση Αντιµετώπιση προβληµάτων Ειδικά χαρακτηριστικά Ευαισθησία Ειδικότητα Ακρίβεια Ανθεκτικότητα Επαναληψιµότητα... 59

4 11.6 ιαγνωστική αξιόλογηση Ειδικές υποδείξεις για τη χρήση του προϊόντος Βιβλιογραφία Ερµηνεία των συµβόλων... 61

5 για τη χρήση σε συνδυασµό µε το ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT Sequence Detection Systems (Applied Biosystems). Λάβετε υπόψη: Το µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε συνδυασµό µε το GeneAmp 5700 SDS καθώς και µε την πλάκα 384 βοθρίων του ABI PRISM 7900HT SDS. 1. Περιεχόµενο Ονοµασία και περιεχόµενο List No. 3K αντιδράσεις List No. 3K αντιδράσεις Μπλε C. trachomatis Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο Κόκκινο C. trachomatis QS 1 1 x 10 4 cop/µl C. trachomatis QS 2 1 x 10 3 cop/µl C. trachomatis QS 3 1 x 10 2 cop/µl C. trachomatis QS 4 1 x 10 1 cop/µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl 1 x 200 µl Πράσινο C. trachomatis IC 1 x 1000 µl 1 x 1000 µl Λευκό Water (PCR grade) 1 x 1000 µl 1 x 1000 µl QS IC = Πρότυπο ποσοτικοποίησης = Ππρότυπο εσωτερικού ελέγχου Η επωνυµία Applied Biosystems είναι σήµα κατατεθέν και το ABI PRISM είναι εµπορικό σήµα της εταιρίας Applera Corporation στις ΗΠΑ και/ή σε ορισµένες άλλες χώρες. 1

6 2. Αποθήκευση Τα υλικά του αποθηκεύονται στους -20 C και διατηρούνται µέχρι την ηµεροµηνία που αναγράφεται στην ετικέτα. Η επανειληµµένη ψύξη/απόψυξη (> 2 x) θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί µε αυτό τον τρόπο µειώνεται η ευαισθησία. Για το λόγο αυτό, εάν η χρήση δεν είναι τακτική, θα πρέπει να γίνεται επιµεροσµός των αντιδραστηρίων. Εάν παραστεί ανάγκη αποθήκευσης των υλικών στους +4 C, το χρονικό διάστηµα αποθήκευσης δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τις πέντε ώρες. 3. Πρόσθετα απαιτούµενα υλικά και συσκευές Γάντια εργαστηρίου χωρίς πούδρα Κιτ αποµόνωσης DNA (βλέπε 8.2 Αποµόνωση DNA) Πιπέτες (ρυθµιζόµενες) Στείρα ρύγχη πιπετών µε φίλτρο Αναδευτήρας τύπου Vortex Επιτραπέζια φυγόκεντρος µε κεφαλή για σωληνάρια 2 ml Φυγόκεντρος µε κεφαλή για πλάκες µικροτιτλοποίησης (προαιρετικά) Πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων/σωληνάρια αντίδρασης για οπτικές µετρήσεις µε αντίστοιχα οπτικά υλικά σφράγισης (βλέπε 8.5 Προετοιµασία της PCR) Πλαίσιο υποστήριξης 96 βοθρίων δύο τεµαχίων για χρήση οπτικών σωληναρίων αντίδρασης (96-Well Tray/Retainer Set, Αρ. Κατ , Applied Biosystems), βλέπε 8.5 Προετοιµασία της PCR Επιφάνεια συµπίεσης για χρήση σε συνδυασµό µε οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα (Optical Cover Compression Pads, Αρ. Κατ , Applied Biosystems), βλέπε 8.5 Προετοιµασία της PCR Η χρήση σωληναρίων για οπτικές µετρήσεις µε θολωτά καλύµµατα επιτρέπεται µόνο για το ABI PRISM 7700 SDS και απαιτεί τροποποίηση του χρόνου έκθεσης (βλέπε Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7700 SDS, Σηµαντικές πρόσθετες ρυθµίσεις). 2

7 Εξάρτηµα για τη σφράγιση των πλακών αντίδρασης µε χρήση οπτικών αυτοκόλλητων φύλλων (Adhesive Seal Applicator Kit, Αρ. Κατ , Applied Biosystems) ABI PRISM 7000, 7700 ή 7900HT SDS (Applied Biosystems) Λάβετε υπόψη: Κατά την έναρξη λειτουργίας των συσκευών, απαιτείται οπωσδήποτε µία υπάρχουσα έγκυρη βαθµονόµηση των χρωστικών ουσιών (Pure Spectra Component File) και του υπόβαθρου (Background Component File). 4. Γενικά µέτρα ασφαλείας Ο χρήστης πρέπει πάντοτε να λαµβάνει υπόψη του τα ακόλουθα σηµεία: Χρησιµοποιείτε στείρα ρύγχη πιπέτας µε φίλτρο. Το θετικό υλικό (δείγµατα, πρότυπα ελέγχου, προϊόντα πολλαπλασιασµού) πρέπει να καθαρίζεται, αποθηκεύεται και να προστίθεται στην αντίδραση σε διαφορετικό χώρο από τα υπόλοιπα αντιδραστήρια. Αποψύξτε πλήρως όλα τα υλικά σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη χρήση. Στη συνέχεια αναµίξτε καλά τα υλικά και εκτελέστε µια σύντοµη φυγοκέντρηση. H εργασία πρέπει να γίνεται µεθοδικά και γρήγορα, σε πάγο ή µονάδα ψύξης. 5. Πληροφορίες σχετικά µε τους παθογόνους παράγοντες Τα βακτηρίδια του γένους Chlamydia (C.) έχουν παγκοσµίως µεγάλη επιδηµιολογική σηµασία. Το είδος Chlamydia trachomatis (ορότυποι D - L) ανήκει διεθνώς στους συνηθέστερους παθογόνους παράγοντες των σεξουαλικώς µεταδιδόµενων νοσηµάτων (STD - sexually transmitted diseases). Οι 16 ορότυποι της C. trachomatis προκαλούν διάφορες ασθένειες: Οι ορότυποι A, B, Ba και C προκαλούν το τράχωµα, µια διαδεδοµένη στις 3

8 τροπικές χώρες χρόνια υποτροπιάζουσα νόσος του επιπεφυκότος και του κερατοειδούς. Οι ορότυποι D - K προκαλούν σεξουαλικώς µεταδιδόµενες λοιµώξεις του ουροποιογεννητικού συστήµατος και οφθαλµικές λοιµώξεις καθώς και µολύνσεις των νεογνών µετά από περιγεννητική µετάδοση. Οι ορότυποι LGV I - III προκαλούν το αφροδίσιο λεµφοκοκκίωµα, µια σεξουαλικώς µεταδιδόµενη νόσος, η οποία εµφανίζεται ως επί το πλείστον στις τροπικές χώρες. Το τράχωµα εµφανίζεται σχεδόν αποκλειστικά σε τροπικές χώρες µε κακές συνθήκες υγιεινής. Είναι η πιο διαδεδοµένη πάθηση των οφθαλµών στον κόσµο και µετά από τον καταρράκτη αποτελεί τη δεύτερη βασικότερη αιτία τύφλωσης. Υπολογίζεται ότι υπάρχουν περίπου 150 εκατοµµύρια άτοµα που έχουν µολυνθεί. Γύρω στα 6 εκατοµµύρια από αυτά έχουν ήδη τυφλωθεί. Στις βιοµηχανικές χώρες, οι χλαµύδιες αποτελούν τους συχνότερους παθογόνους παράγοντες που προκαλούν λοιµώξεις του ουροποιογεννητικού συστήµατος. Στη Γερµανία, ο ετήσιος αριθµός των νέων λοιµώξεων των γεννητικών οργάνων υπολογίζεται σε περίπου. Η συχνότητα εµφάνισης του αφροδίσιου λεµφοκοκκιώµατος (βουβωνικό λεµφοκοκκίωµα, νόσος Durand-Nicolas-Favre) παρουσιάζει µείωση σε όλο τον κόσµο. Ωστόσο, αυτή η σεξουαλικώς µεταδιδόµενη νόσος είναι ακόµη ενδηµική στην Ασία, την Αφρική και τη Νότια Αµερική και σε περιοχές της Καραϊβικής. 6. Αρχή της αντίδρασης Real-Time PCR Η διάγνωση παθογόνων οργανισµών µε τη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) βασίζεται στον πολλαπλασιασµό (ενίσχυση) συγκεκριµένων περιοχών του γονιδιώµατος του παθογόνου παράγοντα. Στην αντίδραση PCR πραγµατικού χρόνου η ανίχνευση γίνεται µε τη βοήθεια φθορίζουσων χρωστικών ουσιών. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως συνδεδεµένες σε ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές, οι οποίοι προσκολλώνται ειδικά στο προϊόν του πολλαπλασιασµού της PCR. Η παρακολούθηση των εντάσεων φθορισµού κατά την εξέλιξη της PCR πραγµατικού χρόνου επιτρέπει την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων, χωρίς να 4

9 χρειάζεται να ανοιχθούν και πάλι τα σωληνάρια των δειγµάτων µετά την πραγµατοποίηση της αντίδρασης PCR. 7. Περιγραφή προϊόντος Το είναι ένα έτοιµο σύστηµα προς χρήση για την ανίχνευση του DΝΑ της C. trachomatis, µέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) στο ABI PRISM 7000, 7700 και το 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Το C. trachomatis Master περιέχει αντιδραστήρια και ένζυµα για τον ειδικό πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος µεγέθους 100 bp του γονιδιώµατος της C. trachomatis. Η ανίχνευση του προϊόντος πολλαπλασιασµού επιτυγχάνεται µέσω της µέτρησης φθορισµού FAM στο ABI PRISM SDS. Πέραν αυτού, το περιέχει, για την ανίχνευση µιας πιθανής αναστολής της PCR, ένα δεύτερο ετερόλογο σύστηµα πολλαπλασιασµού. Αυτό ανιχνεύεται ως πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (IC) µε τη µέτρηση φθορισµού VIC. Επιπλέον δεν επηρεάζεται αρνητικά το όριο ανίχνευσης της αναλυτικής PCR της C. trachomatis (11.1 Ευαισθησία). Παρέχονται µαζί εξωτερικά θετικά πρότυπα ελέγχου (C. trachomatis QS 1-4), µε τη βοήθεια των οποίων µπορεί να πραγµατοποιηθεί προσδιορισµός του φορτίου του παθογόνου παράγοντα. Ανατρέξτε σχετικά στο κεφάλαιο 8.4 Ποσοτικοποίηση. 5

10 8. Πρωτόκολλο 8.1 Προκαταρκτική ανάλυση: λήψη, φύλαξη και µεταφορά των δειγµάτων Λάβετε υπόψη: Όλα τα δείγµατα να χειρίζονται ως δυνητικώς µολυσµατικά. Επιτρέπονται µόνο τα ακόλουθα υλικά δειγµάτων, για τα οποία πρέπει να λαµβάνονται οπωσδήποτε υπ' όψιν οι ακόλουθοι επεξηγηµατικοί κανόνες και προδιαγραφές για τη λήψη, φύλαξη και µεταφορά τους: 1. Ούρo (Γυναίκες και άνδρες). 2. Eπιχρίσµατα από τους οφθαλµούς, τον τράχηλο της µήτρας και την ουρήθρα. 3. Σπέρµα. Για να εξασφαλιστεί µια υψηλή ποιότητα των δειγµάτων, θα πρέπει η µεταφορά τους στο ερευνητικό εργαστήριο, να γίνεται όσο το δυνατόν συντοµότερα. Τα δείγµατα πρέπει να µεταφέρονται υπό δεδοµένες συνθήκες θερµοκρασίας ειγµατοληψία 1. είγµατα ούρων Ο/Η ασθενής δεν επιτρέπεται να έχει ουρήσει κατά τις προηγούµενες δύο ώρες! Συλλέξτε ml από τα αρχικά ούρα σε ένα καθαρό δοχείο από πολυπροπυλαίνιο χωρίς συντηρητικά. Μη χρησιµοποιείτε δείγµατα ούρων, που συλλέχθηκαν σε δοχεία µε συντηρητικά! Κλείστε τα δοχεία µε τα δείγµατα και βάλτε τους ετικέτα. Ακολουθήστε τις προδιαγραφές σχετικά µε την φύλαξη και τη µεταφορά. 6

11 2. είγµατα επιχρίσµατος Για τη λήψη δειγµάτων επιχρίσµατος απο τους οφθαλµούς, τον τράχηλο της µήτρας και την ουρήθρα χρησιµοποιήστε τα ακόλουθα υλικά: Χρησιµοποιήστε µόνο στειλεό επιχρίσµατος µε κεφαλή από Dacron, rayon ή αλγινικό ασβέστιο, και λαβή από συνθετικό ή άλλο υλικό εκτός από αλουµίνιο. Μην χρησιµοποιείτε στειλεό επιχρίσµατος µε λαβή από ξύλο ή αλουµίνιο! είγµατα από τους οφθαλµούς, τον τράχηλο της µήτρας και την ουρήθρα µπορούν να συλλεχθούν και να µεταφερθούν σε 1-3 ml των ακόλουθων υλικών. AMPLICOR STM (Specimen Transportmedium, Roche, Inc.) Swab Specimen Collection Kit (Digene Corporation) Cervical Sampler (Digene Corporation) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) Venturi Transystem (κατάλληλο για αερόβια και αναερόβια), αποστειρωµένα σωληνάρια µεταφοράς για επιχρίσµατα (SARSTEDT AG & Co.) SPG CTM (Chlamydia Transport Medium, MicroTest, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Inc.) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ClamTrans CTM (Bartels, Inc.) Σειλεός Chlamydia (MAST DIAGNOSTICA) Αφήστε τον στειλεό στο υλικό καλλιέργειας µεταφοράς. Κλείστε τα δοχεία µε τα δείγµατα και βάλτε τους ετικέτα. Προσέξτε τις προδιαγραφές φύλαξης και µεταφοράς. Χρησιµοποιήστε την προτεινόµενη διαδικασία για λήψη κυλινδρικών και επίπεδων κυττάρων του επιθηλίου, µετά την αποµάκρυνση της βλέννας του τραχήλου της µήτρας. Biosafety in Microbiological Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC)

12 3. είγµατα σπέρµατος Η λήψη δείγµατος πρέπει να γίνεται δύο µέχρι τρείς ηµέρες µετά την τελευταία εξπερµάτωση. Το δείγµα του σπέρµατος πρέπει να λαµβάνεται την ίδια ηµέρα που θα σταλεί στο ερευνητικό εργαστήριο. Η λήψη του δείγµατος του σπέρµατος µπορεί να γίνει µε ένα από τους ακόλουθους τρόπους, σύµφωνα µε µεθόδους του εργαστηρίου: µε αυνανισµό κατευθείαν σε ένα αποστειρωµένο, καθαρό και στεγνό δοχείο δείγµατος. Σιγουρευθείτε ότι όλο το δείγµα παραλαµβάνεται κατευθείαν στο δοχείο. Εάν µια ποσότητα του δείγµατος χαθεί, αυτό πρέπει να σηµειωθεί στο πρωτόκολλο λήψης δείγµατος. µε αυνανισµό µε τη χρήση προφυλακτικού. Μετά την εξπερµάτωση αποµακρίνετε το προφυλακτικό. Είναι σηµαντικό να κλείσετε το άνοιγµα του προφυλακτικού µε ένα λάστιχο, για την σίγουρη παραµονή του δείγµατος εντός του προφυλακτικού. Στο τέλος, τοποθετείστε το προφυλακτικό σε ένα δοχείο µεταφοράς. Σηµαντικό: Χρησιµοποιείστε δοχεία δειγµάτων χωρίς συντηρητικά και προφυλακτικά χωρίς αντισπερµατικές και µη φυσικές ουσίες (π. χ. χρωστικές ουσίες). Τοποθετείστε το δείγµα σπέρµατος σε σκοτινό µέρος για 30 έως 45 λεπτά (π. χ. σε ένα συρτάρι ή ένα ντουλάπι), µέχρι να ρευστοποιηθεί. Καταψύξτε το δείγµα κατευθείαν µετά τη ρευστοποίηση µέσα σε ειδικό σωληνάριο στους -20 C ή σε χαµηλότερες θερµοκρασίες. Εισηγήσεις: 1) Andrology Laboratory University of Utah School of Medicine ( 2) Andrology Institute of America ( 8

13 8.1.2 Φύλαξη δειγµάτων Το αποτέλεσµα της εξέτασης µπορεί να επηρεαστεί µέσω µέτριας κατάξυξης ή φύλαξης των δειγµάτων για µεγάλο χρονικό διάστηµα. 1. είγµατα ούρων Γίνεται η εξέταση των δειγµάτων ούρων µέσα σε 24 ώρες, αυτά µπορούν να φυλαχθούν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 C). Σε µια εξέταση µέσα σε επτά ηµέρες από τη λήψη, πρέπει τα δείγµατα να φυλάγονται στο ψυγείο στους 2-8 C. είγµατα ούρων, των οποίων η επεξεργασία δεν µπορεί να γίνει µέσα σε επτά ηµέρες, µπορούν να φυλαχθούν στους -20 C ή και χαµηλότερη θερµοκρασία, µέχρι 30 ηµέρες. 2. είγµατα επιχρίσµατος Η φύλαξη των δειγµάτων γίνεται στους 2-8 C. ( Οταν τα δείγµατα επιχρίσµατος πρέπει να αποσταλλούν σε ερευνητικό εργαστήριο, να σταλούν όσο το δυνατόν συντοµότερα µετά τη λήψη, σύµφωνα µε τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για µεταφορά των δειγµάτων χλαµυδίων.) είγµατα επιχρίσµατος, που δεν εξετάστηκαν αµέσως µετά την είσοδο τους στο εργαστήριο, πρέπει να φυλαχθούν στους 2-8 C και να γίνει η επεξεργασία τους µέσα σε επτά ηµέρες. είγµατα επιχρίσµατος, η επεξεργασία των οποίων δεν είναι δυνατή µέσα σε επτά ηµέρες από τη λήψη τους, πρέπει να φυλάσσονται στους -20 C ή χαµηλότερες θερµοκρασίες και να εξετάζονται µέσα σε 30 ηµέρες από την ηµεροµηνία παραλαβής. 3. είγµατα σπέρµατος Η φύλαξη των δειγµάτων γίνεται στους -20 C ή σε χαµηλότερες θερµοκρασίες είγµατα σπέρµατος, που δεν εξετάστηκαν αµέσως µετά την είσοδο τους στο εργαστήριο, πρέπει να φυλαχθούν στους -20 C ή χαµηλότερες θερµοκρασίες και να εξετάζονται µέσα σε 30 ηµέρες από την ηµεροµηνία παραλαβής. 9

14 8.1.3 Μεταφορά δειγµάτων 1. είγµατα ούρων Αποστελλόµενα ειδικά δείγµατα ούρων, πρέπει µέχρι την αποστολή τους να φυλάσσονται σε ψυγείο στους 2-8 C. Τα δείγµατα πρέπει να αποστέλλονται σύµφωνα µε τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά µε τη µεταφορά ουσιών που προκαλούν ασθένειες. 2. είγµατα επιχρίσµατος είγµατα επιχρίσµατος πρέπει να φυλάγονται υπό ψύξη. Εάν τα δείγµατα επιχρίσµατος πρέπει να αποσταλλούν στο εργαστήριο, θα πρέπει να σταλούν υπό ψύξη όσο το δυνατόν συντοµότερα µετά τη λήψη, σύµφωνα µε τις προδιαγραφές του εργαστηρίου για µεταφορά. Τα δείγµατα πρέπει να αποστέλλονται σύµφωνα µε τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά µε τη µεταφορά ουσιών που προκαλούν ασθένειες. 3. είγµατα σπέρµατος Εάν τα δείγµατα σπέρµατος πρέπει να αποσταλλούν στο εργαστήριο, θα πρέπει να εξετάζονται την ίδια ηµέρα µε αυτή που έγινε η λήψη τους, σύµφωνα µε τις προδιαγραφές του εργαστηρίου σχετικά µε τη µεταφορά τωνδειγµάτων χλαµύδιας. Εκτός αυτού λάβετε υπόψη ότι τα δείγµατα σπέρµατος πρέπει να στέλνονται υπό ψύξη. Τα δείγµατα πρέπει να αποστέλλονται σύµφωνα µε τις ισχύουσες τοπικές και κρατικές προδιαγραφές, σχετικά µε τη µεταφορά ουσιών που προκαλούν ασθένειες. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition,

15 8.2 Αποµόνωση DNA Κιτ αποµόνωσης DNA διατίθενται από διάφορους κατασκευαστές. Ανάλογα µε το πρωτόκολλο του επιλεγµένου κατασκευαστή, τοποθετήστε την καθορισµένη ποσότητα δείγµατος για αποµόνωση και εκτελέστε την αποµόνωση DNA σύµφωνα µε τις οδηγίες. Συνιστώνται τα ακόλουθα κιτ αποµόνωσης: Υλικό δείγµατος Ούρο, επιχρίσµατα Σπέρµα, επιχρίσµατα Κιτ αποµόνωσης Αρ. καταλόγου Κατασκευαστής Φορέας RNA PureArt Viral RNA Mini Kit (50) artus περιέχεται QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAGEN περιέχεται PureArt DNA Mini Kit (50) artus δεν περιέχεται QIAamp DNA Mini Kit (50) QIAGEN δεν περιέχεται Σε περίπτωση που το χρησιµοποιούµενο κιτ αποµόνωσης δεν περιέχει φορέα RNA, παρακαλούµε λάβετε υπόψη ότι για την αποµόνωση νουκλεϊκών οξέων από µη κυτταρούχα σωµατικά υγρά ή υλικά µε µικρή περιεκτικότητα σε DNA/RNA συνιστάται ιδιαίτερα η προσθήκη φορέα RNA (RNA-Homopolymer Poly(A), Amersham Biosciences), σε συγκέντρωση 10 µg/ml ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης στο µίγµα δείγµατος/ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης. Απο την περιοχή του αυτόµατου καθαρισµού, συνιστάται το ακόλουθο σύστηµα. Παράγεται µέσω της QIAGEN GmbH, D Hilden, για την artus GmbH. Νόµιµος κατασκευαστής: artus GmbH, D Hamburg. 11

16 Υλικό δείγµατος Σύστηµα καθαρισµού Κιτ καθαρισµού Κατασκευαστής Ούρο, επιχρίσµατα ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Για την παραλαβή ενός καταλόγου των απαραιτήτων υλικών και του έγκυρου πρωτοκόλλου καθαρισµού, επικοινωνήστε µε την τεχνική υποστήριξη στη διεύθυνση Applied Biosystems, Foster City, U.S.A. Σε διαδικασίες αποµόνωσης, στις οποίες χρησιµοποιείται ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης που περιέχει αιθανόλη, βεβαιωθείτε οπωσδήποτε ότι πριν από την έκλουση εκτελείται ένα επιπλέον βήµα φυγοκέντρησης για την αποµάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Αυτό εµποδίζει τις πιθανές αναστολές της PCR. Το δεν είναι κατάλληλο για διαδικασίες αποµόνωσης που λειτουργούν µε βάση τη φαινόλη. Σηµαντικό: Το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου του µπορεί να εισαχθεί κατευθείαν στη διαδικασία της αποµόνωσης (βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου) Συστάσεις για τον καθαρισµό των δειγµάτων ούρου και επιχρίσµατος µε QIAamp Viral RNA Mini Kit Το ρυθµιστικό διάλυµα AVL, που περιέχεται στο QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN), παρήχθηκε ειδικά για την αδρανοποίηση των αναστολέων που υπάρχουν σε µεγάλο αριθµό στο ούρο. Για το λόγο αυτό προτείνουµε ρητά την χρήση του πρωτοκόλλου QIAamp Viral RNA Mini Kit, για την εκχύλιση του βακτηριακού DΝΑ από το ούρο. Αφήστε τα δείγµατα σε θερµοκρασία δωµατίου (15-25 C). Επειδή στα δείγµατα ούρου περιέχονται συχνά πολύ µικρές ποσότητες βακτηρίων, προτείνουµε τη συµπύκνωση του εξεταστικού υλικού Για τον λόγο αυτό τα εξεταζόµενα δείγµατα ούρου (10-30 ml) φυγοκεντούνται για λεπτά στις x g. Το υπερκείµενο υγρό χύνεται και το ίζηµα 12

17 αναµειγνύεται πλήρως ξανά, µέσω επαναλαµβανοµένων αναδεύσεων (15-30 δευτ.) µε µl 1 x PBS. Ο όγκος του αιωρήµατος εξαρτάται από την χρησιµοποιούµενη ποσότητα. Κατά την χρησιµοποίηση αποξηραµένων στειλεών, αναµείξτε αυτά µε 500 µl 1 x PBS τουλάχιστον για µια ώρα σε θερµοκασία δωµατίου. είγµατα επιχρίσµατος, τα οποία διατηρούνται σε υλικό µεταφοράς, πρέπει να αναµειχθούν πλήρως, µέσω του αναδευτήρα Vortex. Ανοίξτε προσεκτικά το καπάκι των σωληναρίων που περιέχουν τα δείγµατα και προσέξτε να µην µολυνθούν τα γάντια. Μολυσµένα γάντια πρέπει να αντικαταθίστανται µε καινούργια, πριν από την επεξεργασία του εποµένου δείγµατος. Πιέστε τον στειλεό κατά του τοιχώµατος του δοχείου για να εξέλθει το υγρό. Παραλάβετε µε τον στειλεό πιθανά υπάρχοντα υπόλοιπα βλέννας. Πιέστε από τον στειλεό το υπόλοιπο υγρό της βλέννας κατά του τοιχώµατος του δοχείου. Αποµακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό µε τα υπόλοιπα βλέννας. Για την αποµόνωση DNA θα πρέπει να χρησιµοποιήσετε 140 µl του προυπάρχοντος δείγµατος. Ακολουθείστε τις οδηγίες του πρωτοκόλλου QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Kit Handbook, 01/99) από το βήµα 1. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήµα 9a του πρωτοκόλλου, για την αποµάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Προτείνεται ένας όγκος έκλουσης 60 µl. 13

18 8.2.2 Συστάσεις για τον καθαρισµό των δειγµάτων επιχρίσµατος και σπέρµατος µε το QIAamp DNA Mini Kit Αφήνετε τα δείγµατα σε θερµοκρασία δωµατίου (15-25 C). είγµατα επιχρίσµατος, τα οποία διατηρούνται σε υλικό µεταφοράς, πρέπει να αναµειχθούν πλήρως µέσω του αναδευτήρα Vortex. Ανοίξτε προσεκτικά το καπάκι των σωληναρίων που περιέχουν τα δείγµατα και προσέξτε να µην µολυνθούν τα γάντια. Μολυσµένα γάντια πρέπει να αντικαθίστανται µε καινούργια, πριν από την επεξεργασία του εποµένου δείγµατος. Πιέστε τον στειλεό κατά του τοιχώµατος του δοχείου για να εξέλθει το υγρό. Παραλάβετε µε τον στειλεό πιθανά υπάρχοντα υπόλοιπα βλέννας. Πιέστε από τον στειλεό το υπόλοιπο υγρό της βλέννας κατά του τοιχώµατος του δοχείου. Αποµακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό (µε τα υπόλοιπα βλέννας). Ιζηµατοποιήστε τα βακτήρια µέσω φυγοκέντρησης για 10 λεπτά στις 5000 x g (7500 στρ./λεπτό). Αναµείξτε το βακτηριακό ίζηµα µε 180 µl ρυθµιστικού διαλύµατος AΤL (QIAamp DNA Mini Kit). Αποξηραµένοι στειλεοί τοποθετούνται κατευθείαν σε ένα 1,5 ml σωληνάριο µικροφυγοκέντρησης και αναµειγνύονται µε 180 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ATL για 15 δευτ. Για την παραλαβή του DNA από τα δείγµατα σπέρµατος αραιώστε 60 µl δείγµατος µε 80 µl 1 x PBS σε ένα 1,5 ml σωληνάριο µικροφυγοκέντρησης. Μετά από µια πλήρη ανάµειξη µε τον αναδευτήρα Vortex, µεταφέρετε µε την πιπέτα 100 µl του αραιωµένου δείγµατος σε 180 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ATL. Αναµείξτε το διάλυµα µε τον αναδευτήρα Vortex επανειληµµένα για δευτ. Προσθέστε στο δείγµα 20 µl προτεïνάσης K. Aναµείξτε τα µε τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το διάλυµα σε 56 C για für 1-12 ώρες. Αναδεύσετε κατά καιρούς το δείγµα κατά την διάρκεια της επωάσεως ή τοποθετείστε το σε θερµοµίξερ. Λάβετε υπόψη 14

19 ότι πρέπει να χρησιµοποιηθεί προτεïνάση K. Η προτεάση QIAGEN παρουσιάζει µια µειωµένη δραστηριότητα κατα την παρουσία του ρυθµιστικού διαλύµατος ATL. Κατά την χρησιµοποίηση αποξηραµένων στειλεών προσέξτε να πιέσετε το υγρό από το στειλεό κατά του τοιχώµατος του δοχείου. Τελικά αποµακρύνετε και καταστρέψετε το στειλεό. Ακολουθείστε το Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit, 02/2003, σελίδα 34) από το βήµα 3. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήµα 7a του πρωτοκόλλου, για την αποµάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Προτείνεται ένας όγκος έκλουσης 50 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ΑΕ Συστάσεις για τον καθαρισµό λυοφιλοποιηµένων δειγµάτων µε το QIAamp DNA Mini Kit Αφήνετε τα δείγµατα σε θερµοκρασία δωµατίου (15-25 C). Αναµείξτε το λυοφιλοποιηµένο δείγµα ακριβώς µε 500 µl 1 x PBS µε προσεκτικές κινήσεις µε το χέρι. Τελικά αναµείξτε το δείγµα τουλάχιστον 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, για να διαλυθεί αυτό τελείως. Εισάγετε µε πιπέτα 200 µl του διαλυµένου δείγµατος σε 360 µl ρυθµιστικού διαλύµατος ATL σε ένα 1,5 ml σωληνάριο µικροφυγοκέντρησης και αναµείξτε το διάλυµα µε τον αναδευτήρα Vortex. Προσθέστε στο δείγµα 20 µl προτεïνάσης K, αναµείξτε τα µε τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το διάλυµα σε 56 C για 1-12 ώρες. Αναδεύσετε κατά καιρούς το δείγµα κατά την διάρκεια της επωάσεως ή τοποθετείστε το σε θερµοµίξερ. Λάβετε υπόψη ότι πρέπει να χρησιµοποιηθεί προτεïνάση K. Η προτεάση QIAGEN παρουσιάζει µια µειωµένη δραστηριότητα κατα την παρουσία του ρυθµιστικού διαλύµατος ATL. Φυγοκεντρίστε τα 1,5 ml σωληνάρια για µικρό χρονικό διάστηµα, για να αποφύγετε µολύνσεις µέσω των σταγονιδίων του υγρού 15

20 δείγµατος στο εσωτερικό του καλύµµατος κατά το άνοιγµα των σωληναρίων. Προσθέστε 400 µl ρυθµιστικού διαλύµατος AL στο δείγµα, αναµείξτε πλήρως για 15 δευτ. µε τον αναδευτήρα Vortex και επωάσετε το δείγµα για 10 λεπτά στους 70 C. Προσθέστε στο δείγµα 400 µl αιθανόλης ( %) και αναµείξτε πάλι µε ένα αναδευτήρα Vortex για 15 δευτ. Μεταφέρετε προσεκτικά το µίγµα (µαζί µε το ίζηµα) χωρίς να έρθει σε επαφή µε τα χείλη στην στήλη QIAamp Spin (σε ένα 2 ml Collection Tube). Κλείστε το καπάκι και φυγοκεντρίστε για ένα λεπτό στους 6000 x g (8000 στρ./λεπτό). Στο τέλος τοποθετείστε την στήλη QIAamp Spin σε ένα καθαρό 2 ml Collection Tube (περιέχεται στο κιτ) και καταστρέψτε το χρησιµοποιηµένο Collection Tube µαζί µε το διήθηµα. Επαναλάβετε αυτό το βήµα, µε το να µεταφέρετε το υπόλοιπο διάλυµα του µίγµατος του δεiγµατος στην στήλη. Ακολουθείστε το Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Kit και QIAamp DNA Blood Mini Kit, 02/2003, σελίδα 35) από το βήµα 6. Βεβαιωθείτε ότι έχει εκτελεσθεί το προαιρετικό βήµα 7a του πρωτοκόλλου, για την αποµάκρυνση των καταλοίπων αιθανόλης. Προτείνεται ένας όγκος έκλουσης 50 µl ρυθµιστικού διαλύµατος AE. 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου Μαζί παραδίδεται και ένα πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis IC). Με αυτό έχετε τη δυνατότητα να ελέγξετε τόσο την αποµόνωση, όσο και µια ενδεχοµένη αναστολή της PCR (βλέπε Εικ. 1). Για την εφαρµογή αυτή, προσθέστε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου στη διαδικασία της αποµόνωσης σε αναλογία 0,1 µl ανά 1 µl όγκου έκλουσης. Χρησιµοποιήστε, για παράδειγµα, το QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) και εκτελέστε την έκλουση του DNA σε 200 µl ρυθµιστικού διαλύµατος AE και στη συνέχεια προσθέστε 20 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου. Εάν π.χ. η έκλουση γίνεται σε 100 µl, τότε προσθέστε αντίστοιχα 10 µl. Η ποσότητα του προστιθέµενου 16

21 πρoτύπου εσωτερικού ελέγχου εξαρτάται µόνο από τον όγκο έκλουσης. Συγχρόνως λάβετε υπόψη ότι το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου προστίθεται στο µίγµα ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης και υλικού δείγµατος. Μην εισάγετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου µε την πιπέτα απευθείας στο ρυθµιστικό διάλυµα λύσης ή στο υλικό δείγµατος! Για µια επιτυχή αξιολόγηση της αποµόνωσης, πρέπει η τιµή του Ct του προτύπου εσωτερικού ελέγχου να κυµαίνεται στο ABI PRISM 7000, 7700 και 7900ΗΤ SDS στους Ct = 22 ± 3 (threshold: 0,05). Η δεδοµένη διασπορά προκαθορίζεται λόγω µιας παραλλαγής του οργάνου και της αποµόνωσης. Μια υψηλότερη απόκλιση παραπέµπει σε προβλήµατα µε την αποµόνωση. Στην περίπτωση αυτή να ελεγχθεί και στην ανάγκη να επιβεβαιωθεί απο την αρχή. Εάν παρουσιασθούν άλλες ερωτήσεις ή προβλήµατα, επικοινωνήστε µε τη διεύθυνση techsupport@artus-biotech.com. Προαιρετικά το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου µπορεί να χρησιµοποιηθεί αποκλειστικά για τον έλεγχο µιας ενδεχοµένης αναστολής της PCR (βλέπε Εικ. 2). Για το σκοπό αυτό, προσθέστε σε κάθε ανάλυση 0,5 µl του προτύπου εσωτερικού ελέγχου απευθείας σε 15 µl C. trachomatis Master. Χρησιµοποιήστε για κάθε αντίδραση της PCR 15 µl του όπως αναφέρεται παρασκευαζόµενου Master Mix και στη συνέχεια προσθέστε 10 µl του καθαρισµένου δείγµατος. Εάν θέλετε να εκτελέσετε µια ανάλυση για πολλά δείγµατα, αυξήστε τις απαραίτητες ποσότητες του C. trachomatis Master και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, ανάλογα µε τον αριθµό δειγµάτων (βλέπε 8.5 Προετοιµασία της PCR). Η αύξηση όγκου µέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά τη ρύθµηση της αντίδρασης PCR, είναι αµελητέα. Η ευαισθησία του συστήµατος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 17

22 8.4 Ποσοτικοποίηση Τα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) χρησιµοποιούνται όπως τα δείγµατα που έχουν ήδη υποστεί καθαρισµό και προστίθενται στον ίδιο όγκο (10 µl). Για τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης σε ένα ABI PRISM Sequence Detection System, τοποθετήστε όλα τα τέσσερα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης και ορίστε τα ως πρότυπα, σύµφωνα µε τα στοιχεία των αντίστοιχων συγκεντρώσεων (βλέπε 8.6 Προγραµµατισµός της ABI PRISM SDS). εν είναι εφικτή η εισαγωγή πρότυπων καµπυλών µε βάση προηγούµενες διαδικασίες από το λογισµικό ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS. Λάβετε υπόψη: Τα πρότυπα ποσοτικοποίησης ορίζονται ως αντίγραφα/µl. Για τη µετατροπή των τιµών, που έχουν καθοριστεί µε βάση την πρότυπη καµπύλη, σε αντίγραφα/ml υλικού δείγµατος, πρέπει να εφαρµόζεται ο ακόλουθος τύπος: Αποτέλεσµα (αντίγρ/ml) = Αποτέλεσµα (αντίγρ/µl) x Όγκος έκλουσης (µl) Όγκος δείγµατος (ml) Εάν το υλικό δείγµατος έχει ήδη συµπυκνωθεί, π.χ. µέσω φυγοκέντρησης, πριν την αποµόνωση µε νουκλεϊκά οξέα, παρακαλούµε να τοποθετείστε στον παραπάνω αναφερόµενο τύπο τον αρχικό όγκο δείγµατος. Σηµαντικό: Για την απλούστευση της ποσοτικής αξιολόγησης συστηµάτων στο όργανο ABI PRISM 7000 SDS θα βρείτε στην ιστοσελίδα τις σχετικές κατευθύνσεις (Technical Note for quantitation on the ABI PRISM 7000 SDS). 18

23 8.5 Προετοιµασία της PCR Προετοιµάστε τον απαιτούµενο αριθµό, για τις προγραµµατισµένες αντιδράσεις, σε σωληνάρια αντίδρασης ή σε πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων. Στον ακόλουθο πίνακα παρατίθενται τα συνιστώµενα υλικά: Είδος Χαρακτηρισµός Αρ. καταλόγου Κατασκευαστής Πλαίσιο υποστήριξης Επιφάνεια συµπίεσης Οπτική πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων 96-Well Optical Reaction Plate Applied Biosystems όχι - Οπτικό αυτοκόλλητο φύλλο Optical Adhesive Covers Applied Biosystems - ναι Οπτικά σωληνάρια αντίδρασης ABI PRISM Optical Tubes, 8 Tubes/Strip Applied Biosystems ναι - Οπτικά σωληνάρια αντίδρασης MicroAmp Optical Tubes N Applied Biosystems ναι - Οπτικό κάλυµµα (επίπεδο) ABI PRISM Optical Caps, 8 Caps/Strip Applied Biosystems - όχι Λάβετε υπόψη: Η χρήση σωληναρίων αντίδρασης, για οπτικές µετρήσεις µε θολωτά καλύµµατα, είναι επιτρεπτή µόνο για το όργανο ABI PRISM 7700 SDS και προϋποθέτει τροποποίηση του χρόνου έκθεσης (βλέπε Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7700 SDS, Σηµαντικές πρόσθετες ρυθµίσεις). Φροντίστε, κατά τη προετοιµασία της PCR, ώστε σε κάθε διαδικασία PCR να υπάρχει τουλάχιστον ένα πρότυπο ποσοτικοποίησης και ένα αρνητικό πρότυπο ελέγχου (Water, PCR grade). Για τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης, χρησιµοποιήστε για κάθε διαδικασία PCR όλα τα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αποψύχονται πλήρως πριν από την έναρξη της εξέτασης σε θερµοκρασία δωµατίου, να αναµειγνύονται καλά (µε επανειληµµένη Κατά τη χρήση του πλαισίου υποστήριξης δύο τεµαχίων πρέπει να ανοίγετε τα σωληνάρια κατά την εισαγωγή και την εξαγωγή. Για την αποφυγή των µολύνσεων χρησιµοποιείτε αποκλειστικά το κάτω µέρος του πλαισίου υποστήριξης. 19

24 αναρρόφηση και έγχυση µε πιπέτα ή µε σύντοµο στροβιλισµό) και στη συνέχεια να φυγοκεντρούνται για µικρό χρονικό διάστηµα. Για την περίπτωση που µε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου θέλετε να ελέγξετε τόσο την αποµόνωση, όσο και µια ενδεχοµένη αναστολή της PCR, το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου έχει ήδη προστεθεί για την αποµόνωση (βλέπε 8.3 Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου). Στην περίπτωση αυτή, χρησιµοποιήστε το ακόλουθο σχήµα επεξεργασίας µε πιπέτα (βλ. επίσης σχηµατική επισκόπηση στην εικόνα Εικ. 1): 1. Προετοιµασία του Master Mix 2. Προετοιµασία της αντίδρασης Αριθµός δειγµάτων 1 12 C. trachomatis Master 15 µl 180 µl C. trachomatis IC 0 µl 0 µl Συνολικός όγκος 15 µl 180 µl Master Mix 15 µl ανά 15 µl είγµα 10 µl ανά 10 µl PCR Συνολικός όγκος 25 µl ανά 25 µl Εάν θέλετε να χρησιµοποιήσετε το πρότυπο εσωτερικού ελέγχου αποκλειστικά για τον έλεγχο αναστολής της PCR, θα πρέπει αυτό να προστεθεί απευθείας στο C. trachomatis Master. Στην περίπτωση αυτή, χρησιµοποιήστε το ακόλουθο σχήµα επεξεργασίας µε πιπέτα (βλ. επίσης και τη σχηµατική επισκόπηση στην Εικ. 2): 1. Προετοιµασία του Master Mix 2. Προετοιµασία της αντίδρασης Αριθµός δειγµάτων 1 12 C. trachomatis Master 15 µl 180 µl C. trachomatis IC 0,5 µl 6 µl Συνολικός όγκος 15,5 µl 186 µl Master Mix 15 µl ανά 15 µl είγµα 10 µl ανά 10 µl PCR Συνολικός όγκος 25 µl ανά 25 µl Η αύξηση όγκου µέσω της προσθήκης του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, κατά τη προετοιµασία της αντίδρασης PCR, είναι αµελητέα. Η ευαισθησία του συστήµατος ανίχνευσης δεν επηρεάζεται. 20

25 Εισάγετε µε πιπέτα, σε κάθε σωληνάριο αντίδρασης ή σε κάθε απαιτούµενη κοιλότητα της πλάκας αντίδρασης 96 βοθρίων, 15 µl του Master Mix. Στη συνέχεια προσθέστε 10 µl του εκλούµατος από την αποµόνωση του DNA. Φροντίστε να αναµειγνύονται καλά και τα δύο διαλύµατα, µε επανειληµµένη αναρρόφηση και έγχυση µε πιπέτα. Σφραγίστε τα σωληνάρια µε τα αντίστοιχα καλύµµατα ή εναλλακτικά, κατά τη χρήση µιας πλάκας αντίδρασης 96 βοθρίων, µέσω ενός οπτικού φύλλου σφράγισης (optical adhesive covers, Applied Biosystems). Για τη συλλογή του όγκου αντίδρασης στον πυθµένα των σωληναρίων ή πλακών, φυγοκεντρίστε τα σωληνάρια (στον υποδοχέα φύλαξης που προβλέπεται για τα σωληνάρια της ΡCR) ή την πλάκα αντίδρασης 96 βοθρίων σε συσκευή φυγοκέντρησης µε κεφαλή πλάκας µικροτιτλοποίησης, για 30 δευτερόλεπτα σε 1780 x g (4000 στρ./λεπτό). Σε περίπτωση που δεν διαθέτετε µια τέτοια συσκευή φυγοκέντρησης, τότε φροντίστε κατά τη προετοιµασία των αντιδράσεων της PCR να εισάγετε µε πιπέτα τόσο το Master Mix, όσο και τον όγκο δειγµάτων στον πυθµένα των σωληναρίων ή των βοθρίων. Αποθηκεύστε τα µίγµατα αντίδρασης σε +4 C, µέχρι να προγραµµατιστεί το όργανο ABI PRISM SDS (βλέπε 8.6 Προγραµµατισµός του ABI PRISM SDS) και µεταφέρετέ τα στη συνέχεια στη συσκευή. Λάβετε υπόψη: Κατά τη χρήση οπτικών σωληναρίων αντίδρασης σε συνδυασµό µε οπτικά καλύµµατα, να τοποθετείτε πάντα ένα πλαίσιο υποστήριξης (96-Well Tray/Retainer Set, Applied Biosystems) στο όργανο (ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT SDS). Κατά τη χρήση του πλαισίου υποστήριξης δύο τεµαχίων, είναι απαραίτητο να ανοίγετε τα σωληνάρια, κατά την εισαγωγή και την εξαγωγή. Για την αποφυγή των µολύνσεων, χρησιµοποιείτε αποκλειστικά το κάτω µέρος του πλαισίου υποστήριξης. Η χρήση οπτικών πλακών αντίδρασης 96 βοθρίων σε συνδυασµό µε οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα, απαιτεί την τοποθέτηση µιας επιφάνειας συµπίεσης (Optical Cover Compression Pads, Applied Biosystems). 21

26 Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στην αποµόνωση καθαρισµός µίγµα ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης/υλικού δείγµατος + 0,1 µl IC* ανά 1 µl όγκου έκλουσης 10 µl καθαρού δείγµατος* 15 µl Master* οπτικές/ά πλάκες/σωληνάρια αντίδρασης ABI PRISM SDS Εικ. 1: Σχηµατική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της αποµόνωσης και της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήµα της επεξεργασίας µε πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάµιξη και τη σύντοµη φυγοκέντρηση των διαλυµάτων που θα χρησιµοποιηθούν. 22

27 Προσθήκη του προτύπου εσωτερικού ελέγχου στο Master 0,5 µl IC* 15 µl Master* καθαρισµός 15,5 µl Master Mix* 10 µl καθαρού δείγµατος* 15 µl Master Mix* οπτικές/ά πλάκες/σωληνάρια αντίδρασης ABI PRISM SDS Εικ. 2: Σχηµατική απεικόνιση της ροής εργασιών για τον έλεγχο της αναστολής της PCR. * Σε κάθε βήµα της επεξεργασίας µε πιπέτα πρέπει οπωσδήποτε να φροντίσετε για την πλήρη απόψυξη, την καλή ανάµιξη και τη σύντοµη φυγοκέντρηση των διαλυµάτων που θα χρησιµοποιηθούν. 23

28 8.6 Προγραµµατισµός του ABI PRISM SDS Το λογισµικό του ABI PRISM 7000, 7700 και 7900HT Sequence Detection Systems (SDS) απαιτεί, πριν από την έναρξη της διαδικασίας PCR, ορισµένες πρόσθετες πληροφορίες. Ωστόσο, υπάρχουν σηµαντικές αποκλίσεις στους τρόπους διαδικασίας κατά τον προγραµµατισµό των συσκευών, για τους οποίους ακουλουθεί περιγραφή σε ξεχωριστά κεφάλαια Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7000 SDS Για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis δηµιουργήστε στο ABI PRISM 7000 SDS ένα προφίλ, σύµφωνα µε τα ακόλουθα έξι στάδια εργασίας ( ). Όλα τα στοιχεία αναφέρονται στην ABI PRISM 7000 SDS Software Version Λεπτοµέρειες για τον προγραµµατισµό του ABI PRISM 7000 SDS µπορείτε να βρείτε στο εγχειρίδιο ABI PRISM 7000 SDS User Guide. Για την καλύτερη επισκόπηση, οι απαραίτητες ρυθµίσεις επισηµαίνονται στις απεικονίσεις µε µαύρα πλαίσια Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR Επιλέξτε, στο ABI PRISM 7000 SDS, από το File (Αρχείο) την επιλογή µενού New (Νέο) και ορίστε τις ακόλουθες βασικές ρυθµίσεις για το νέο έγγραφο (Εικ. 3). Στη διάθεσή σας υπάρχει ένα προηγούµενο αποθηκευµένο πρότυπο, (SDS Template [*.sdt]) στη λίστα Template (Πρότυπο) ή επιλέγοντας τη λειτουργία Browse (Αναζήτηση) (βλέπε Αποθήκευση της διαδικασίας PCR). Επιβεβαιώστε την ενέργειά σας (OK). 24

29 Εικ. 3: Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR (New Document) ηµιουργία/επιλογή των ανιχνευτών Με τη βοήθεα του υποµενού Detector Manager ( ιαχειριστής ανιχνευτών), που βρίσκεται στην επιλογή Tools (Εργαλεία), αντιστοιχίστε στο έγγραφο τις κατάλληλες χρωστικές ουσίες ανιχνευτών. Για την ανίχνευση του DΝΑ της C. trachomatis καθώς και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, µέσω του, πρέπει να προσδιορίζονται οι Reporter/Quencher (Ανιχνευτής φθορισµού/αναστολέας φθορισµού) που παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Ανίχνευση Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis IC) VIC none Για τη δηµιουργία αυτών των ανιχνευτών, επιλέξτε από το Detector Manager κάτω αριστερά την προσαρµοσµένη επιλογή File και στη συνέχεια την επιλογή New. 25

30 Εικ. 4: ηµιουργία του ειδικού ανιχνευτή της C. trachomatis (Detector Manager). Εικ. 5: ηµιουργία του ειδικού ανιχνευτή του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (Detector Manager). Στο παράθυρο που εµφανίζεται τώρα ορίστε (σύµφωνα µε τις Εικ. 4 και Εικ. 5), για την ανίχνευση του DΝΑ της C. trachomatis, το συνδυασµό Reporter/Quencher FAM/TAMRA, ενώ για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου επιλέξτε το συνδυασµό VIC/none. Με την επιβεβαίωση της ενέργειας (OK) επιστρέφετε στο Detector Manager. Επισηµάνετε τους ανιχνευτές που δηµιουργήθηκαν και µεταφέρετε αυτό που επιλέξατε µε την επιλογή Add to Plate Document (Προσθήκη στο έγγραφο πλάκας) στην επιλογή Well Inspector (Ελεγκτής βοθρίου) (βλέπε Εικ. 6). Κλείστε το παράθυρο (Done). Εικ. 6: Επιλογή των ανιχνευτών (Detector Manager). 26

31 Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών Από το µενού View (Προβολή) ανοίξτε τώρα την επιλογή Well Inspector, για να βρείτε εκεί ξανά τους ανιχνευτές που έχετε επιλέξει (βλέπε Εικ. 7). Εικ. 7: Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών (Well Inspector). Επισηµάνετε τις ενδεικτικές θέσεις πλάκας, για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis. Αντιστοιχίστε στις θέσεις αυτές τους επιλεγµένους ανιχνευτές, ενεργοποιώντας την επιλογή Use (Χρήση) και των δύο ανιχνευτών. Εµφανίζεται ένα άγκιστρο. Για την ονοµασία των επιµέρους µιγµάτων αντίδρασης επιλέξτε την αντίστοιχη θέση από την πλάκα και καταχωρήστε το όνοµα στην επιλογή Sample Name (Όνοµα δείγµατος). Λάβετε υπόψη σας ότι τα µίγµατα µε ίδιο Sample Name και ίδια αντιστοίχιση ανιχνευτών αναγνωρίζονται από το λογισµικό ως επαναλήψεις και προσδιορίζονται αναφορικά µε το ποσοτικοποιηµένο φορτίο του παθογόνου παράγοντά τους. Επιλέξτε τότε για κάθε τύπο δείγµατος την ανάλογη λειτουργία (Task), σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα: 27

32 Τύπος δείγµατος Λειτουργία (Task) Συγκέντρωση (Quantity) Reporter Quencher είγµα Unknown - FAM TAMRA Αρνητικό πρότυπο ελέγχου Πρότυπο NTC - FAM TAMRA Standard βλέπε 1. Περιεχόµενο FAM TAMRA Για τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιήστε, σε κάθε διαδικασία PCR, όλα τα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) και καταχωρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις (βλ. 1. Περιεχόµενο) για κάθε επιµέρους πρότυπο (Quantity). Λάβετε υπόψη σας ότι για µια διαδικασία PCR µε το, η ένδειξη ROX πρέπει να ρυθµίζεται ως αναφορά παθητικού (Passive). Η οµοιόµορφη κατανοµή της χρωστικής ουσίας ROX σε όλα τα µίγµατα PCR µιας παρτίδας, µέσω της ανάµιξης του C. trachomatis Master, διασφαλίζει την αναγνώριση και τον υπολογισµό των tube-to-tube (σωλήνα προς σωλήνα) αποκλίσεων (διαφορές φθορισµού µεταξύ διαφόρων µιγµάτων PCR), µε βάση το λογισµικό Sequence Detection Software (Kανονικοποίηση) ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Για την καταχώρηση του προφίλ θερµοκρασίας, µεταβείτε από το επίπεδο Setup (Ρύθµιση) στο επίπεδο Instrument (Όργανο) του λογισµικού. Καταχωρήστε το αυθεντικό προφίλ θερµοκρασίας για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis, σύµφωνα µε την Εικ. 8. Για την αποµάκρυνση του σταδίου 50 C, που αποθηκεύτηκε στις προκαταρκτικές ρυθµίσεις, επισηµάνετε αυτό µε το αριστερό πλήκτρο του ποντικιού κρατώντας παράλληλα πατηµένο το πλήκτρο Shift και στη συνέχεια διαγράψτε το, χρησιµοποιώντας το πλήκτρο Backspace. Ελέγξτε αν ο όγκος αντίδρασης είναι ρυθµισµένος σε 25 µl. Η επιλογή 9600 Εmulation πρέπει να είναι ενεργοποιηµένη και οι προκαταρκτικές ρυθµίσεις Auto Increment (Αυτόµατη επαύξηση) να παραµένουν αµετάβλητες (Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 28

33 Εικ. 8: ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Στη θέση αυτή µπορείτε να αποθηκεύσετε τις ήδη καταχωρηµένες ρυθµίσεις (Setup) ως πρότυπο, για να τις χρησιµοποιήσετε εκ νέου σε επόµενες εφαρµογές σε τροποποιηµένη ή µη τροποποιηµένη µορφή. Με την αποθήκευση των ρυθµίσεων ως SDS Template (*.sdt) στον κατάλογο Template Directory (Κατάλογος προτύπου) (Local Disk [C:]\Program Files\ABI PRISM 7000\Templates, του λογισµικού Applied Biosystems), το αρχείο αυτό µπορεί να επιλέγεται απευθείας από την αναπτυσσόµενη λίστα Template στο παράθυρο New Document (Νέο έγγραφο). Τα πρότυπα που είναι ασφαλισµένα σε άλλους καταλόγους πρέπει να επιλέγονται µέσω της επιλογής Browse. Πριν από την έναρξη της διαδικασίας PCR, φροντίστε να αποθηκεύσετε εκ νέου το πρότυπο ως SDS Document (*.sds). Έτσι διασφαλίζετε την αποθήκευση των δεδοµένων που συλλέγονται κατά την εξέλιξη της PCR. 29

34 Έναρξη της διαδικασίας PCR Ξεκινήστε τη διαδικασία PCR, διαλέγοντας την επιλογή Start (Έναρξη) από την επιλογή µενού Instrument ή το πεδίο Start στο επίπεδο Instrument. 30

35 8.6.2 Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7700 SDS Για την ανίχνευση του DΝΑ της C. trachomatis, δηµιουργήστε στο ABI PRISM 7700 SDS ένα προφίλ, σύµφωνα µε τα ακόλουθα επτά στάδια εργασίας ( ). Όλα τα στοιχεία αναφέρονται στην ABI PRISM 7700 SDS Software Version Λεπτοµέρειες για τον προγραµµατισµό του ABI PRISM 7700 SDS, µπορείτε να βρείτε στο εγχειρίδιο ABI PRISM 7700 SDS User s Manual. Για την καλύτερη επισκόπηση, οι απαραίτητες ρυθµίσεις επισηµαίνονται στις απεικονίσεις µε µαύρα πλαίσια Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR Επιλέξτε στο ABI PRISM 7700 SDS από το File (Αρχείο) την επιλογή µενού New Plate (Νέα πλάκα) και ορίστε τις ακόλουθες βασικές ρυθµίσεις για το νέο έγγραφο (Εικ. 9). Επιβεβαιώστε την ενέργειά σας (OK). Εικ. 9: Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR (New Plate). 31

36 Επιλογή των φθορίζουσων χρωστικών ουσιών και αντιστοίχιση του τύπου δείγµατος Μέσω του Sample Type Setup (Setup: Sample Type/Sample Type Setup, Εγκατάσταση: Τύπος δείγµατος/εγκατάσταση τύπου δείγµατος) αντιστοιχίστε στο έγγραφο τις κατάλληλες χρωστικές ουσίες ανιχνευτών και τον κατάλληλο τύπο δείγµατος. Για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis καθώς και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, µέσω του, πρέπει να προσδιορίζονται τα Reporter/Quencher (Ανιχνευτής φθορισµού/αναστολέας φθορισµού) που παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Ανίχνευση Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis IC) VIC TAMRA Για τη µέτρηση του DΝΑ της C. trachomatis, µέσω του, επιλέξτε αναλογικά προς τον πίνακα τη χρωστική ουσία του Reporter FAM. Αυτό ισχύει τόσο για τα πρότυπα (STND), τα δείγµατα (UNKN) όσο και για τα αρνητικά πρότυπα ελέγχου (UNKN). Για τη µέτρηση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IPC+) ορίστε ως Reporter το VIC. Ως Quencher ορίστε το TAMRA. Η αντιστοίχιση των χρωστικών ουσιών και των τύπων δειγµάτων στο παράθυρο Sample Type Setup εµφανίζεται στην Εικ

37 Εικ. 10: Επιλογή των φθορίζουσων χρωστικών ουσιών και αντιστοίχιση του τύπου δείγµατος (Sample Type Setup). Η αντιστοίχιση του τύπου δείγµατος σε µια κατάλληλη λειτουργία (Acronym) επιτυγχάνεται σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα: Τύπος δείγµατος Λειτουργία (Acronym) Συγκέντρωση (Quantity) Reporter Quencher είγµα UNKN - FAM TAMRA Αρνητικό πρότυπο ελέγχου Πρότυπο UNKN - FAM TAMRA STND βλέπε 1. Περιεχόµενο FAM TAMRA Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών Για την αντιστοίχιση των ανιχνευτών και των τύπων δειγµάτων στις επιµέρους θέσεις πλακών, επιλέξτε τα αντίστοιχα πεδία. Στη συνέχεια ανοίξτε στο επίπεδο Setup το παράθυρο διαλόγου Dye Layer (Στρώµα χρωστικής) και αντιστοιχίστε τον κατάλληλο Reporter. Ενεργοποιήστε τώρα το αναδυόµενο µενού Sample Type, έτσι βρίσκετε ξανά, στην εµφανιζόµενη λίστα, τους τύπους δείγµατος που έχουν αντιστοιχιστεί στον Reporter στην επιλογή Sample Type Setup (βλέπε Εικ. 11). Επιλέξτε τον κατάλληλο τύπο δείγµατος (βλέπε πίνακα στα πλαίσια του ) και καθορίστε τώρα µέσω της επιλογής Dye Layer και του µενού Sample Type την αντιστοίχιση προς τις 33

38 υπόλοιπες θέσεις πλακών. Στο πεδίο Sample Name (Όνοµα δείγµατος) είναι δυνατή η αντιστοίχιση κάθε δείγµατος σε ένα όνοµα. Τα πεδία που καθορίζονται ως Replicate (Αντίγραφο) (καταχώρηση του ονόµατος του δείγµατος αναφοράς στη στήλη Replicate) προσδιορίζονται από το λογισµικό αναφορικά µε το ποσοτικοποιηµένο φορτίο παθογόνου παράγοντά τους και υπολογίζεται η τυπική απόκλισή τους. Εικ. 11/12: Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών. Για τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιήστε, σε κάθε διαδικασία PCR, όλα τα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) και καταχωρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις (βλ. 1. Περιεχόµενο) για κάθε επιµέρους πρότυπο (Quantity, βλέπε Εικ. 12). Οµως, αυτό είναι µόνο εφικτό, όταν οι θέσεις που καταλαµβάνονται µε πρότυπα έχουν καθοριστεί προηγούµενα ως πρότυπες, µέσω του µενού Sample Type ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Για την καταχώρηση του προφίλ θερµοκρασίας, κάντε την εναλλαγή από το µενού Thermal Cycler Conditions (Συνθήκες θερµικού κυκλοποιητή) στο επίπεδο Setup. Καταχωρήστε το αυθεντικό προφίλ θερµοκρασίας για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis, σύµφωνα µε την Εικ. 13 Ελέγξτε αν ο όγκος αντίδρασης είναι ρυθµισµένος σε 25 µl. Οι προκαταρκτικές ρυθµίσεις των χρονικών διαστηµάτων Ramp ( ιαβάθµιση) και της επιλογής Auto Increment (Αυτόµατη επαύξηση) παραµένουν αµετάβλητες (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 34

39 Εικ. 13: ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας. Επιπλέον, στο µενού Thermal Cycler Conditions βρίσκεται η επιλογή Show Data Collection (Εµφάνιση συλλογής δεδοµένων). Αν προβείτε σε αυτή την επιλογή, µεταβαίνετε στο παράθυρο που εµφανίζεται στην Εικ. 14. Κάθε θερµοκρασία Ramp και Plateau (Επίπεδο) διαθέτει ένα εικονίδιο συλλογής δεδοµένων (Data Collection Icon), που απεικονίζει τη συλλογή των δεδοµένων στη συγκεκριµένη χρονική στιγµή της διαδικασίας. Αποµακρύνετε όλα τα σύµβολα µέχρι το τρέχον χρονικό σηµείο του Annealing-Extension (Υβριδισµός-Επέκταση) βήµατος (Stage2/Step2, Επίπεδο2/Βήµα2), προκειµένου να εξοικονοµήσετε περιττές µετρήσεις φθορισµού. Έτσι ο συνολικός χρόνος διαδικασίας και ο όγκος δεδοµένων είναι ο ελάχιστος δυνατός. 35

40 Εικ. 14: Συλλογή δεδοµένων (Data Collection) Σηµαντικές πρόσθετες ρυθµίσεις Για τη ρύθµιση του χρόνου έκθεσης (διέγερση των φθοριοχρωµάτων), καθώς και για την επιλογή των αρχείων Pure Spectra/Background (Καθαρό φάσµα/υπόβαθρο) µεταβείτε από το επίπεδο Setup στο επίπεδο Analysis (Ανάλυση). Επιλέξτε την ήδη ενεργοποιηµένη δευτερεύουσα επιλογή Advanced Options (Προχωρηµένες επιλογές) που βρίσκεται στο στοιχείο Diagnostics ( ιαγνωστικός έλεγχος) στο µενού Instrument. Πραγµατοποιήστε τις ρυθµίσεις σύµφωνα µε την Εικ. 15. Με την αδρανοποίηση της λειτουργίας επιλογής Spectra Components (Analysis) (Υλικά φάσµατος), κατά την νέα αξιολόγηση, οι ήδη αναλυµένες διαδικασίες, κατά τη στιγµή της δηµιουργίας των δεδοµένων, χρησιµοποιούνται αυτόµατα στα τρέχοντα αρχεία βαθµονόµησης, που είναι αποθηκευµένα στον κατάλογο Spectra Components. Για την ανάλυση προηγούµενων διαδικασιών µε τη χρήση των νέων αναγνωσµένων Spectra Components, ενεργοποιήστε και τα δύο αυτά πεδία. Λάβετε υπόψη σας ότι για µια διαδικασία PCR, µε το, η ένδειξη ROX πρέπει να ρυθµίζεται ως αναφορά παθητικού (Reference). Η οµοιόµορφη κατανοµή της χρωστικής ουσίας ROX σε όλα τα µίγµατα PCR µιας παρτίδας, µέσω της ανάµιξης του 36

41 C. trachomatis Master, διασφαλίζει την αναγνώριση και τον υπολογισµό των tube-to-tube (σωλήνα προς σωλήνα) αποκλίσεων (διαφορές φθορισµού µεταξύ διαφόρων µιγµάτων PCR) µε βάση το λογισµικό Sequence Detection Software (Kανονικοποίηση). Λάβετε υπόψη: Ο χρόνος έκθεσης (Exposure Time), κατά τη χρήση των πλακών αντίδρασης 96 βοθρίων, για οπτικές µετρήσεις, σε συνδυασµό µε οπτικά αυτοκόλλητα φύλλα (optical adhesive covers) ή οπτικά σωληνάρια µε επίπεδα καλύµµατα, ανέρχεται σε δέκα χιλιοστά του δευτερολέπτου. Σε περίπτωση που χρησιµοποιήσετε οπτικά σωληνάρια µε θολωτά καλύµµατα, τότε ρυθµίστε αυτά τα στοιχεία χρόνου σε 25 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Εικ. 15: Σηµαντικές πρόσθετες ρυθµίσεις (Advanced Options). 37

42 Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Στη θέση αυτή µπορείτε να αποθηκεύσετε τις ήδη καταχωρηµένες ρυθµίσεις (Setup) ως µάσκα, για να τις χρησιµοποιήσετε εκ νέου σε επόµενες εφαρµογές σε τροποποιηµένη ή µη τροποποιηµένη µορφή. Για το λόγο αυτό αποθηκεύστε τα αρχεία αυτά σε Stationary File Format (Μορφή στατικού αρχείου). Πριν από την έναρξη της τρέχουσας προγραµµατισµένης διαδικασίας PCR, φροντίστε να τα αποθηκεύσετε εκ νέου σε µορφή Normal File Format (Μορφή κανονικού αρχείου). Έτσι διασφαλίζετε την αποθήκευση των δεδοµένων που συλλέγονται κατά την εξέλιξη της PCR Έναρξη της διαδικασίας PCR Ξεκινήστε τη διαδικασία PCR διαλέγοντας την επιλογή Run (Εκτέλεση) από την επιλογή µενού Instrument ή το πεδίο Run στο επίπεδο Analysis. 38

43 8.6.3 Προγραµµατισµός του ABI PRISM 7900HT SDS Για την ανίχνευση του DΝΑ της C. trachomatis, δηµιουργήστε στο ABI PRISM 7900HT SDS ένα προφίλ, σύµφωνα µε τα ακόλουθα έξι στάδια εργασίας ( ). Όλα τα στοιχεία αναφέρονται στην ABI PRISM 7900HT SDS Software Version 2.1. Λεπτοµέρειες για τον προγραµµατισµό του ABI PRISM 7900HT SDS µπορείτε να βρείτε στο εγχειρίδιο ABI PRISM 7900HT SDS User Guide. Για την καλύτερη επισκόπηση, οι απαραίτητες ρυθµίσεις επισηµαίνονται στις απεικονίσεις µε µαύρα πλαίσια Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR Επιλέξτε στο ABI PRISM 7900HT SDS από το File (Αρχείο) την επιλογή µενού New (Νέο) και ορίστε τις ακόλουθες βασικές ρυθµίσεις για το νέο έγγραφο (Εικ. 16). Στη διάθεσή σας υπάρχει ένα προηγούµενο αποθηκευµένο πρότυπο (ABI PRISM SDS Template Document [*.sdt]) στη λίστα Template (Πρότυπο) ή επιλέγοντας τη λειτουργία Browse (Αναζήτηση) (βλέπε Αποθήκευση της διαδικασίας PCR). Επιβεβαιώστε την ενέργειά σας (OK). Λάβετε υπόψη: Το δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί σε συνδυασµό µε την πλάκα 384 βοθρίων του ABI PRISM 7900HT SDS. 39

44 Εικ. 16: Προκαταρκτικές ρυθµίσεις για τη δηµιουργία µιας νέας διαδικασίας PCR (New Document) ηµιουργία/επιλογή των ανιχνευτών Μέ τη βοήθεια υποµενού Detector Manager ( ιαχειριστής ανιχνευτών) που βρίσκεται στην επιλογή Tools (Εργαλεία), [επιλέξτε εναλλακτικά: επίπεδο Setup (Ρύθµιση)/λειτουργία Add Detector (Προσθήκη ανιχνευτή)], αντιστοιχίστε στο έγγραφο τις κατάλληλες χρωστικές ουσίες ανιχνευτών. Για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis καθώς και του προτύπου εσωτερικού ελέγχου, µέσω του, πρέπει να προσδιορίζονται οι Reporter/Quencher (Ανιχνευτής φθορισµού/αναστολέας φθορισµού) που παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Ανίχνευση Reporter Quencher C. trachomatis DNA FAM TAMRA Πρότυπο εσωτερικού ελέγχου (C. trachomatis IC) VIC Non Fluorescent Για τη δηµιουργία αυτών των ανιχνευτών, επιλέξτε από το Detector Manager κάτω αριστερά την προσαρµοσµένη επιλογή New. 40

45 Εικ. 17: ηµιουργία του ειδικού ανιχνευτή της C. trachomatis (Detector Manager). Εικ. 18: ηµιουργία του ειδικού ανιχνευτή του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (Detector Manager). Στο παράθυρο που εµφανίζεται τώρα, ορίστε (σύµφωνα µε τις Εικ. 17 και Εικ. 18) για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis το συνδυασµό Reporter/Quencher FAM/TAMRA, ενώ για την ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου επιλέξτε το συνδυασµό VIC/Non Fluorescent. Με την επιβεβαίωση της ενέργειας (OK) επιστρέφετε στο Detector Manager. Επισηµάνετε τους ανιχνευτές που δηµιουργήθηκαν και µεταφέρετε αυτό που επιλέξατε µε την επιλογή Copy to Plate Document (Αντίγραφο στο έγγραφο πλάκας) στην επιλογή Setup-Ebene (Επίπεδο ρύθµησης) (βλέπε Εικ. 19). Κλείστε το παράθυρο (Done). Εικ. 19: Επιλογή των ανιχνευτών (Detector Manager). 41

46 Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών Μετά από το κλείσιµο του Detector Manager (Done) µπορείτε να βρείτε ξανά τους ανιχνευτές που έχετε επιλέξει στα πλαίσια του στο επίπεδο Setup (Well Inspector) (Ελεγκτής βοθρίου), όπου παρατίθενται στον πίνακα (βλέπε Εικ. 20). Εικ. 20: Αντιστοίχιση των απαραίτητων πληροφοριών στις θέσεις πλακών. Επιλέξτε τις κατειληµµένες θέσεις πλάκας για την ανίχνευση του DNA της C. trachomatis. Αντιστοιχίστε στις θέσεις αυτές τους επιλεγµένους ανιχνευτές, ενεργοποιώντας την επιλογή Use (Χρήση) και των δύο ανιχνευτών. Εµφανίζεται ένας σταυρός. Για την ονοµασία των επιµέρους µιγµάτων αντίδρασης, επιλέξτε την αντίστοιχη θέση από την πλάκα και καταχωρήστε το όνοµα στην επιλογή Sample Name (Όνοµα δείγµατος). Λάβετε υπόψη σας ότι τα µίγµατα µε ίδιο Sample Name και ίδια αντιστοίχιση ανιχνευτών αναγνωρίζονται από το λογισµικό ως επαναλήψεις και προσδιορίζονται αναφορικά µε το ποσοτικοποιηµένο φορτίο του παθογόνου παράγοντά τους. Επιλέξτε τότε για κάθε τύπο δείγµατος την ανάλογη λειτουργία (Task), σύµφωνα µε τον ακόλουθο πίνακα: Τύπος δείγµατος Λειτουργία (Task) Συγκέντρωση (Quantity) Reporter Quencher είγµα Unknown - FAM TAMRA Αρνητικό πρότυπο ελέγχου Πρότυπο NTC - FAM TAMRA Standard βλέπε 1. Περιεχόµενο FAM TAMRA 42

47 Για τη δηµιουργία µιας πρότυπης καµπύλης χρησιµοποιήστε, σε κάθε διαδικασία PCR, όλα τα παρεχόµενα πρότυπα ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) και καταχωρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις (βλ. 1. Περιεχόµενο) για κάθε επιµέρους πρότυπο (Quantity). Λάβετε υπόψη σας ότι για µια διαδικασία PCR µε το, η ένδειξη ROX πρέπει να ρυθµίζεται ως αναφορά παθητικού (Passive Reference). Η οµοιόµορφη κατανοµή της χρωστικής ουσίας ROX σε όλα τα µίγµατα PCR µιας παρτίδας, µέσω της ανάµιξης του C. trachomatis Master, διασφαλίζει την αναγνώριση και τον υπολογισµό των tube-to-tube (σωλήνα προς σωλήνα) αποκλίσεων (διαφορές φθορισµού µεταξύ διαφόρων µιγµάτων PCR), µε βάση το λογισµικό Sequence Detection Software (Kανονικοποίηση) ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας Για την καταχώρηση του προφίλ θερµοκρασίας, µεταβείτε από το επίπεδο Setup (Ρύθµιση) στο επίπεδο Instrument (Όργανο) του λογισµικού. Καταχωρήστε το αυθεντικό προφίλ θερµοκρασίας για την ανίχνευση του DNA τηςου C. trachomatis, σύµφωνα µε την Εικ. 21. Ελέγξτε αν ο όγκος αντίδρασης είναι ρυθµισµένος σε 25 µl. Η επιλογή 9600 Emulation πρέπει να είναι ενεργοποιηµένη και οι προκαταρκτικές ρυθµίσεις των χρονικών διαστηµάτων Ramp ( ιαβάθµιση) και της επιλογής Auto Increment (Αυτόµατη επαύξηση) να παραµένουν αµετάβλητες (Ramp Time: 0:00, Auto Increment: 0.0 C, 0.0 Seconds). 43

48 Εικ. 21: ηµιουργία του προφίλ θερµοκρασίας. Επιπλέον στο επίπεδο Instrument βρίσκεται η επιλογή Data Collection (Συλλογή δεδοµένων). Αν προβείτε σε αυτή την επιλογή µεταβαίνετε στο παράθυρο που εµφανίζεται στην Εικ. 22. Κάθε θερµοκρασία Ramp και Plateau (Επίπεδο) διαθέτει ένα εικονίδιο συλλογής δεδοµένων (Data Collection Icon), που επεξηγεί τη λήψη των δεδοµένων στη συγκεκριµένη χρονική στιγµή της διαδικασίας. Αποµακρύνετε όλα τα σύµβολα µέχρι το τρέχον χρονικό σηµείο του Annealing-Extension (Υβριδισµός-Επέκταση) βήµατος (Stage2/Step2, Επίπεδο2/Βήµα2), προκειµένου να εξοικονοµήσετε περιττές µετρήσεις φθορισµού. Έτσι ο συνολικός χρόνος διαδικασίας και ο όγκος δεδοµένων είναι ο ελάχιστος δυνατός. 44

49 Εικ. 22: Συλλογή δεδοµένων (Data Collection) Αποθήκευση της διαδικασίας PCR Στη θέση αυτή µπορείτε να αποθηκεύσετε τις ήδη καταχωρηµένες ρυθµίσεις (Setup) ως πρότυπο, για να τις χρησιµοποιήσετε εκ νέου σε επόµενες εφαρµογές σε τροποποιηµένη ή µη τροποποιηµένη µορφή. Με την αποθήκευση των ρυθµίσεων ως ABI PRISM SDS Template Document (*.sdt) στον κατάλογο Template Directory (Κατάλογος προτύπου) ([D:]\Program Files\Applied Biosystems\SDS 2.1\Templates, του λογισµικού Applied Biosystems), το αρχείο αυτό µπορεί να επιλέγεται απευθείας από τη λίστα Template στο παράθυρο New Document (Νέο έγγραφο). Τα πρότυπα που είναι αποθηκευµένα σε άλλους καταλόγους πρέπει να επιλέγονται µέσω της επιλογής Browse. Πριν από την έναρξη της τρέχουσας διαδικασίας PCR, φροντίστε να αποθηκεύσετε εκ νέου το πρότυπο ως ABI PRISM SDS Document (*.sds). Έτσι διασφαλίζετε την αποθήκευση των δεδοµένων που συλλέγονται κατά την εξέλιξη της PCR. 45

50 Έναρξη της διαδικασίας PCR Ξεκινήστε τη διαδικασία PCR διαλέγοντας την επιλογή Start (Έναρξη) από την επιλογή µενού Instrument ή το πεδίο Start στο επίπεδο Analysis. 46

51 9. Αξιολόγηση Μία υπάρχουσα έγκυρη βαθµονόµηση των χρωστικών ουσιών (Pure Spectra Component File) και του υπόβαθρου (Background Component File) απαιτείται οπωσδήποτε κατά την έναρξη λειτουργίας των συσκευών. Αυτά τα αρχεία βαθµονόµησης χρειάζονται, όπως αναφέρεται παρακάτω, στον ακριβή υπολογισµό των αποτελεσµάτων: Οι παρεµβολές που εκπέµπονται από τη συσκευή και επηρεάζουν τη συνολική µέτρηση εξαλείφονται από το λογισµικό Sequence Detection Software του ABI PRISM Sequence Detection Systems, µέσω του Background Component Files. Επιπλέον, κατά τις αναλύσεις πολλαπλών χρωµάτων εκδηλώνονται παρεµβολές µεταξύ των φασµάτων εκποµπών των επιµέρους φθορίζουσων χρωστικών. Το λογισµικό του ABI PRISM SDS αντισταθµίζει αυτές τις παρεµβολές µέσω του υπολογισµού µε τα δεδοµένα φάσµατος των µεµονωµένων χρωστικών ουσιών που είναι αποθηκευµένα στο Pure Spectra Component File. Το λογισµικό πραγµατοποιεί επίσης την αντιστοίχιση των δεδοµένων φθορισµού, που συλλέγονται µέσω του συνολικού µετρήσιµου φάσµατος κατά την εξέλιξη της PCR, προς τους προγραµµατισµένους ανιχνευτές, µέσω της επιλογής Pure Spectra Components. Στη συνέχεια τα µεταδιδόµενα δεδοµένα φθορισµού των επιµέρους χρωστικών ουσιών διαχωρίζονται, για τον υπολογισµό των αποκλίσεων tube-to-tube (διαφορές φθορισµού µεταξύ των διαφόρων µιγµάτων της, PCR), µέσω του σήµατος παθητικής αναφοράς (ROX). Τα σήµατα που κανονικοποιούνται κατά αυτό τον τρόπο µπορούν να αξιολογηθούν µέσω της επιλογής Amplification Plots. Τα αρχεία βαθµονόµησης, που χρησιµοποιήθηκαν κατά την αξιολόγηση µιας διαδικασίας PCR, ασφαλίζονται αυτόµατα κατά την αποθήκευση. Σε περίπτωση που δεν υπάρχουν εγκατεστηµένα αρχεία βαθµονόµησης, δηµιουργήστε τα αρχεία αυτά λαµβάνοντας υπόψη τις οδηγίες στο εγχειρίδιο ABI PRISM SDS User Guide/Manual. Σε περίπτωση που έχετε ενσωµατωµένα περισσότερα από ένα συστήµατα PCR στη διαδικασία PCR (λάβετε υπόψη το προφίλ θερµοκρασίας!), τότε 47

52 παρακαλούµε να διεξάγετε τις αναλύσεις των συστηµάτων εξέτασης ξεχωριστά. Τα δείγµατα µε ίδιο όνοµα (Sample Name) και αντιστοίχιση ανιχνευτών αναγνωρίζονται αυτόµατα από το ABI PRISM 7000 και το λογισµικό 7900HT SDS ως επαναλήψεις και προσδιορίζονται αναφορικά µε το ποσοτικοποιηµένο φορτίο του παθογόνου παράγοντά τους. Ενδέχεται να προκύψουν τα εξής αποτελέσµατα: 1. Ανιχνεύται ένα σήµα φθορισµού FAM. Το αποτέλεσµα της ανάλυσης είναι θετικό: Το δείγµα περιέχει DNA της C. trachomatis. Στην περίπτωση αυτή η ανίχνευση ενός σήµατος φθορισµού VIC (πρότυπο εσωτερικού ελέγχου) είναι άνευ σηµασίας, δεδοµένου ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις εκκίνησης του DNA της C. trachomatis (θετικό σήµα φθορισµού FAM) ενδέχεται να οδηγήσουν σε µειωµένο ως ανύπαρκτο σήµα φθορισµού του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (Ανταγωνισµός). Εάν εµφανισθεί ένα θετικό σήµα µετά τον κύκλο 40, προτείνουµε την επανάληψη της PCR. Σε περίπτωση νέου θετικού αποτελέσµατος, θεωρείται το δείγµα θετικό. Σε αρνητικό αποτέλεσµα δεν µπορεί να δοθεί καθαρή δήλωση. Στην περίπτωση αυτή προτείνεται ένας νέος καθαρισµός του δείγµατος. 2. εν ανιχνεύεται κανένα σήµα φθορισµού FAM, αλλά µόνο ένα σήµα φθορισµού VIC (σήµα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου). Στο δείγµα δεν υπάρχει ανιχνεύσιµο DNA της C. trachomatis. Συνεπώς, το δείγµα µπορεί να θεωρηθεί αρνητικό. Όταν η PCR της C. trachomatis είναι αρνητική, το ανιχνευµένο σήµα του προτύπου εσωτερικού ελέγχου αποκλείει την πιθανότητα αναστολής της PCR. 3. εν ανιχνεύεται σήµα φθορισµού FAM ούτε σήµα φθορισµού VIC. εν υπάρχει η δυνατότητα διαγνωστικής δήλωσης. Υποδείξεις σχετικά µε τις πηγές σφαλµάτων και την εξάλειψή τους παρατίθενται στο κεφάλαιο 10. Αντιµετώπιση προβληµάτων. Παραδείγµατα για θετικές και αρνητικές αντιδράσεις της PCR παρατίθενται επίσης στις εικόνες 23 / 24 (ABI PRISM 7000 SDS), 25 / 26 (ABI PRISM 7700 SDS) και 27 / 28 (ABI PRISM 7900HT SDS). 48

53 Εικ. 23: Ανίχνευση του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού FAM (ABI PRISM 7000 SDS). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). Εικ. 24: Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού VIC (ABI PRISM 7000 SDS) µε ταυτόχρονο πολλαπλασιασµό του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4). NTC: nontemplate control (αρνητικό πρότυπο). 49

54 Εικ. 25: Ανίχνευση του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού FAM (ABI PRISM 7700 SDS). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). Εικ. 26: Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού VIC (ABI PRISM 7700 SDS) µε ταυτόχρονο πολλαπλασιασµό του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4). NTC: nontemplate control (αρνητικό πρότυπο). 50

55 Εικ. 27: Ανίχνευση του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού FAM (ABI PRISM 7900HT SDS). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). Εικ. 28: Ανίχνευση του προτύπου εσωτερικού ελέγχου (IC) µέσω της ανίχνευσης ενός σήµατος φθορισµού VIC (ABI PRISM 7900HT SDS) µε ταυτόχρονο πολλαπλασιασµό του προτύπου ποσοτικοποίησης (C. trachomatis QS 1-4). NTC: non-template control (αρνητικό πρότυπο). 51