ΚΕΦ. 8B ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ UV-Vis Μ. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ ΠΑΡΑΔΟΣΕΙΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΙΙ

Transcript

1 ΚΕΦ. 8B ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ ΟΡΑΤΟΥ UV-Vis

2 Μεταβλητές που Επηρεάζουν τα Φάσματα Καταγραφόμενες Πληροφορίες 1. Τύπος οργάνου που χρησιμοποιήθηκε 2. Ταχύτητα σάρωσης 3. Πάχος κυψελίδας 4. Ενεργό εύρος ταινίας μονοχρωμάτορα 5. Χημικά δεδομένα 1. Διαλύτης 2. Συγκέντρωση ουσίας 3. ph 4. Θερμοκρασία

3 Στάδια Φασματοφωτομετρικής Ανάλυσης 1. Επιλογή απορροφούσας ουσίας -Λήψη φάσματος απορροφήσεως ουσίας (εάν δεν είναι γνωστό) 2. Επιλογή καταλληλότερου μήκους κύματος 3. Κατασκευή καμπύλης αναφοράς 4. Μέτρηση απορροφήσεως διαλύματος αγνώστου και υπολογισμός συγκεντρώσεως από την καμπύλη αναφοράς

4 Επιλογή Απορροφούσας Ουσίας (1) Εάν ηπρος προσδιορισμό ουσία Α απορροφά επαρκώς στις χρησιμοποιούμενες περιοχές φάσματος, προσδιορίζεται ως έχει Διαφορετικά ηουσία Αμετατρέπεται με κατάλληλα αντιδραστήρια σε παράγωγο Ψ που απορροφά ισχυρά

5 Επιλογή Απορροφούσας Ουσίας (2) Παραδείγματα έγχρωμων παραγώγων Fe(II) + 1,10-φαινανθρολίνη [Fe(C 12 H 8 N 2 ) 3 ] 2+ λ μεγ = 510 nm Αμίνη + NaNO 2 /HCl Διαζωνικό άλας αζώχρωμα (λ = 520 nm)

6 Ι. Επιλογή και Χρησιμοποίηση Αντίδραση Σχηματισμού Παραγώγων Σταθερό σχηματιζόμενο παράγωγο Εκλεκτική κατά το δυνατόν αντίδραση Ποσοτική αντίδραση Καθορισμένης στοιχειομετρίας, κατά προτίμηση Αντιδραστήρια να μην απορροφούν στην περιοχή απορροφήσεως προϊόντος Μη σχηματισμός παρεμποδιζουσών ουσιών

7 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών ph (1) Μετρείται ηαπορρόφηση του προϊόντος Ψσε διάφορα ph και από τη γραφική απεικόνιση Α ph και επιλέγεται το «πλατώ» της καμπύλης Συγκέντρωση αντιδραστηρίων Επιλογή βέλτιστης γιατί ανεπάρκεια ή περίσσεια μπορεί να προκαλέσει αποκλίσεις από το νόμο Beer και να μειώσει την ευαισθησία

8 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών Διαλύτης (2) Επηρεάζει το φάσμα, την απορροφητικότητα και τη διαλυτότητα των ουσιών και των αντιδραστηρίων Είναι δυνατή ηεκχύλιση του παραγώγου με οργανικό διαλύτη, οπότε αυξάνεται η ευαισθησία και ηεκλεκτικότητα

9 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών (3) Ενδιαφέροντα παραδείγματα εκχύλισης: Σχηματισμός συμπλόκων μεταλλοϊόντων, εκχύλιση με οργανικό διαλύτη και μέτρηση απορρόφησης Σχηματισμός λιπόφιλων ιοντικών ζευγών (ionpair) ιοντικών οργανικών μορίων (φαρμάκων) με ιόντα χρωστικών, εκχύλιση με οργανικό διαλύτη και μέτρηση απορρόφησης (ion-pair extraction photometry)

10 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών Χρόνος Ταχείες αντιδράσεις Σταθερά προϊόντα (4) Αναμονή για πλήρη ανάπτυξη προϊόντος Εάν πολύ αρχή αντίδραση, εφαρμογή κινητικής μεθόδου ανάλυσης

11 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών Σταθερότητα (5) Κατασκευή διαγράμματος Α tκαι επιλογή χρόνου μέτρησης στο πλατώ Εάν το προϊόν είναι ασταθές, μέτρηση σε καθορισμένο χρόνο ήχρήση αυτοματοποιημένου συστήματος ροής Εάν προϊόν φωτοευαίσθητο, αποφυγή έκθεσης στο άμεσο ηλιακό φως

12 ΙΙ. Επιλογή Βέλτιστων Συνθηκών Θερμοκρασία (6) Πειραματική εύρεση βέλτιστης θερμοκρασίας Μερικές φορές υψηλή θερμοκρασία για επιτάχυνση αντίδρασης παραγωγοποίησης Μερικές φορές χαμηλή θερμοκρασία για αύξηση σταθερότητας παραγώγου

13 ΙΙΙ. Μοριακή Απορροφητικότητα (1) Επιλογή παραγώγου με μεγάλη μοριακή απορροφητικότητα Μεγάλη ευαισθησία μεθόδου Προσδιορισμός χαμηλών συγκεντρώσεων ουσίας Ηεκαθορίζει την ελάχιστη μετρούμενη συγκέντρωση C ελ C ελ = Α ελ / εb = 0,1 / ε. 1

14 ΙΙΙ. Μοριακή Απορροφητικότητα (2) Παράδειγμα προσδιορισμού Fe(II) με σχηματισμό συμπλόκου με FerroZine και μέτρηση απορρόφησης στα 593 nm ε = 2,26 x 10 5 A ελ = 0,1 b = 1 C ελ = 0,1 / (2,26x10 5 x 1) = 4 x 10-7 M Ιδεώδης απορροφούσα ουσία: Μια ταινία απορροφήσεως Πλατώ στο μέγιστο Μεγάλη απορροφητικότητα

15 Επιλογή Μήκους Κύματος (1) Αναλυτικό μήκος κύματος Να απορροφά μόνο ηπροσδιοριζόμενη ουσία Χήπαράγωγό της Ψκαι όχι συνυπάρχουσες ουσίες Αποφεύγεται μήκος κύματος που απορροφά ισχυρά το αντιδραστήριο Επιλέγεται λ μεγ στο πλατώ μέγιστης απορρόφησης για μέγιστη ευαισθησία και καλύτερη υπακοή νόμου Beer

16 Επιλογή Μήκους Κύματος (2) Εάν το δείγμα περιέχει προσμείξεις που απορροφούν στο λ μεγ ήηαπορρόφηση είναι πολύ μεγάλη επιλέγεται πλατώ ελάχιστης απορρόφησης ήκατά ανάγκη στις πλευρές της ταινίας Αποφεύγεται λστο απότομα ανερχόμενο ή κατερχόμενο τμήμα του φάσματος

17 Μέτρηση Ασε πλατώ φάσματος

18 Επιλογή Μήκους Κύματος (3) Κατά την ανάλυση στο UV, παρουσία παρεμποδιζόντων με πλατιές ασθενείς ζώνες απορρόφησης, π.χ φάρμακα παρουσία εκδόχων, προτιμάται ημέτρηση σε δύο γειτονικά μήκη κύματος (προτιμούνται δύο πλατώ) και κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς ΔΑ ως προς C Π.χ για προσδιορισμό χλωροπρομαζίνης σε σκευάσματα λαμβάνεται ηδα σε λ254 και 277 nm

19 Μέτρηση Απορρόφησης σε Δύο Μήκη Κύματoς

20 Μέθοδος Allen (γραμμής βάσεως) για τον προσδιορισμό φαρμάκου παρουσία μεγαλομορίου

21 Επιλογή Μήκους Κύματος (4) Για συστήματα που επηρεάζονται από το ph και υπάρχει ισοσβεστικό σημείο, αυτό προτιμάται Ισοσβεστικό σημείο Μήκος κύματος όπου οι απορροφητικότητες των σωματιδίων της ουσίας (HA, A - ) είναι ίδιες

22 Ισοσβεστικό Σημείο Πράσινου Βρωμοκρεσόλης Α λσε διάφορα ph

23 Επιλογή Ισοσβεστικού Σημείου ως Αναλυτικού Μήκους Κύματος

24 Κατασκευή Καμπύλης Αναφοράς (1) Εάν για ένα χημικό σύστημα ισχύει ονόμος του Beer, και ηκαμπύλη αναφοράς διέρχεται στατιστικά από το μηδέν, εφαρμόζεται ημέθοδος ποσοτικοποίησης ενός σημείου Σύγκριση απορροφήσεως αγνώστου A u με απορρόφηση Α s προτύπου συγκεντρώσεως C s Για μεθόδους ρουτίνας Φαρμακοποιίας αναφέρεται σταθερά k για τον υπολογισμό της ποσότητας φαρμάκου W u απευθείας στην ποσότητα σκευάσματος που ζυγίσθηκε

25 Υπολογισμός Συγκεντρώσεως με Μέθοδο Ενός Προτύπου - Η σχέση (3) υπολογίζει το βάρος φαρμάκου σε ποσότητα σκευάσματος A A C W u s u u εbc = ε bc = A A = k u s A A u s u s C s _(1) _(2) _(3)

26 Κατασκευή Καμπύλης Αναφοράς (2) Για μεγαλύτερη ακρίβεια ησυγκέντρωση αγνώστου βρίσκεται από καμπύλη αναφοράς, που κατασκευάζεται από σειρά προτύπων Σύσταση προτύπων διαλυμάτων να προσομοιάζει με τη σύσταση του δείγματος, εκτός εάν αποδειχθεί κατά την επικύρωση της μεθόδου δεν υπάρχει επίδραση μήτρας (matrix effect)

27 Κατασκευή Καμπύλης Αναφοράς (3) Εάν το παραπάνω δεν είναι εφικτό εφαρμόζεται ημέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας Ησυγκέντρωση προτύπων πρέπει να βρίσκεται στην περιοχή ισχύος Νόμου Beer και να δίνει απορρόφηση Α = 0,1 1 (0,1 1,5 για φασματοφωτόμετρα με ψηφιακή ανάγνωση)

28 Μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας στη Φασματοφωτομετρία Σε άγνωστο διάλυμα όγκου V 1 και συγκεντρώσεως C u μετρείται απορρόφηση Α 1 Προστίθεται όγκος V 2 προτύπου διαλύματος συγκεντρώσεως C s και μετρείται απορρόφηση Α 2 Εάν V 2 << V 1 τότε V 1 + V 2 V 1 και οτύπος απλοποιείται C C u u = = A A 2 2 ( V A 1 1 AV 1 2Cs + V ) A 1 2 AV 1 1 C, C u = V2C V 1 s

29 Προετοιμασία Δείγματος (1) Χρήση αραιών διαλυμάτων (Α = 0,1 1) Χρησιμοποιούνται διαλύτες, κυρίως οργανικοί για τα μη υδατοδιαλυτά φάρμακα Οδιαλύτης δεν πρέπει να απορροφά στην περιοχή φάσματος που μετρείται η απορρόφηση δείγματος

30 Προετοιμασία Δείγματος (2) Για κάθε διαλύτη προσδιορίσθηκε το κατώτερο όριο διαπερατότητας (σημείο αποκοπής) Μήκος κύματος στο οποίο οδιαλύτης παρουσιάζει Α = 1 σε b = 1 cm Μη χρήση διαλύτη κάτω από το σημείο αποκοπής Οδιαλύτης μπορεί να επηρεάσει το φάσμα της ουσίας Πολικοί διαλύτες αυξάνουν το εύρος ταινίας και μετατοπίζουν το λ μεγ Οξύτητα του διαλύτη (ρύθμιση με προσθήκη οξέος ή βάσεως) επηρεάζει δραστικά το φάσμα πολλών ουσιών

31 Κατώτερα Όρια Διαπερατότητας Διαλυτών στο UV-Vis

32 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (1) Όργανα Προσωπικά σφάλματα Ακαθαρσίες (προσμείξεις) Απορροφούσες παρεμποδίζουσες ουσίες Χημικές παρεμποδίσεις

33 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (2) Όργανα Στα όργανα απλής δέσμης, σφάλματα από: Μεταβολές ισχύος πηγής ακτινοβολίας Μεταβολές απόκρισης (ευαισθησίας) ανιχνευτή Ηλεκτρικό θόρυβο Τοποθέτηση κυψελίδας Τοποθέτηση μήκους κύματος Τα περισσότερα σφάλματα αίρονται με όργανα διπλής δέσμης και την περιοδική διακρίβωση των οργάνων

34 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (3) Όργανα Χρήση ίδιου οργάνου για πρότυπα και άγνωστα Αθροιστικό σφάλμα 0,3 1% Συχνός έλεγχος καμπύλης αναφοράς ήενός προτύπου Ηθερμοκρασία επηρεάζει τον όγκο των οργανικών διαλυμάτων (κυψελίδες με πώμα) Παρατεταμένη παραμονή δείγματος στην κυψελίδα δημιουργεί φυσσαλίδες και φωτοδιάσπαση (επίδραση ακτινοβολίας)

35 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (4) Όργανα Φωτομετρικό Σφάλμα (1) Τα παλαιότερα ΑΝΑΛΟΓΙΚΑ φασματοφωτόμετρα παρέχουν ένδειξη διαπερατότητας σε κλίμακα με βελόνα ή καταγραφέα Το σφάλμα ανάγνωσης ΔΤ (εύρος βελόνας οργάνου ήπάχος γραμμής στον καταγραφέα) προκαλεί απόλυτο σφάλμα συγκέντρωσης Δc

36 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (5) Όργανα Φωτομετρικό Σφάλμα (2) Το σχετικό σφάλμα συγκέντρωσης ΔC/C υπολογίζεται από διαφόριση της εξισώσεως C = -log T/εb ως προς T ΔT = 0,002 0,01 (απόλυτο φωτομετρικό σφάλμα) C C = 0,4343 T logt T

37 Γραφική Παράσταση Φωτομετρικού Σφάλματος Αναλογικών Φασματοφωτομέτρων Ελάχιστο σφάλμα σε Τ= 0,368 (Α = 0,434) Ρύθμιση συνθηκών C και b έτσι ώστε Α= 0,1 1,0

38 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (6) Προσωπικά Σφάλματα Κακός χειρισμός οργάνων Απόλυτο καθαρό εσωτερικό και εξωτερικό των κυψελίδων Διαλύματα απαλλαγμένα αιωρημάτων Προκαλούν σκέδαση ακτινοβολίας Διήθηση διαλυμάτων

39 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (7) Ακαθαρσίες (προσμείξεις) Ακαθαρσίες αντιδραστηρίων και διαλύτη πιθανόν να προκαλέσουν μεγάλα σχετικά σφάλματα Αρχική ρύθμιση %Τ με χρήση λευκού Περιέχει ότι και τα άγνωστα χωρίς προσδιοριζόμενης ουσίας Παρασκευή προτύπων όπως τα άγνωστα Μέθοδος προσθήκης

40 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (8) Απορροφούσες Παρεμποδίζουσες Ουσίες Συνύπαρξη ουσιών που απορροφούν στην ίδια περιοχή μηκών κύματος Απομακρύνονται πριν από τη μέτρηση (τεχνικές διαχωρισμού) Δεσμεύονται με καλυπτικά αντιδραστήρια

41 Σφάλματα Φασματοφωτομετρίας (9) Χημικές Παρεμποδίσεις Δευτερεύουσες αντιδράσεις Υδρόλυση Διάσπαση Αντίδραση με αέρα Συμμετοχή σε χημικές ισορροπίες Διατήρηση σταθερών των παραγόντων που επηρεάζουν την ισορροπία Θερμοκρασία Ιοντική ισχύς ph

42 Διαφορική Φασματοφωτομετρία Χρησιμοποιείται μόνο στα παλαιά αναλογικά φασματοφωτόμετρα που έχουν περιοχή εργασίας Α= 0,1 1 Εάν ηαπορρόφηση του δείγματος Α>1 (και δεν είναι επιθυμητή αραίωση) για τη ρύθμιση του %Τ (Α = 0) αντί λευκού χρησιμοποιείται πρότυπο με απορρόφηση Α 0 Έτσι ηκλίμακα γίνεται Α 0 (1+Α 0 ), π.χ 0,5 1,5 Εάν ηα< 0,1 Ρυθμίζεται το 0 %Τ όχι με πέτασμα, αλλά με πρότυπο απορροφήσεως Α 1, οπότε ηκλίμακα γίνεται 0 Α 1,, π.χ 0 0,1

43 Φασματοφωτομετρία Παραγώγων (1) Συχνά λαμβάνονται φάσματα με πλατιές ζώνες αλληλεπικαλυπτόμενα Χρήση φασματοφωτομετρίας παραγώγων Ηπαράσταση Α λ(φάσμα μηδενικής παραγώγου) μετατρέπεται σε: Φάσματα 1 ης παραγώγου da/dλ ως προς λ Φάσματα 2 ης παραγώγου d 2 A/dλ 2 ωςπρος λ Φάσματα n παραγώγου d n A/dλ n

44 Φασματοφωτομετρία Παραγώγων (2) Ενίσχυση διαχωριστικότητας (αύξηση αριθμού λεπτομερειών) Αύξηση διαφοράς μικρότερων φασματικών λεπτομερειών Λήψη περισσότερων πληροφοριών στη διευκρίνηση της δομής

45 Φάσματα παραγώγων

46 Φάσματα Απορρόφησης Σουλφαθειαζόλης

47 Φασματοφωτομετρία παραγώγων στην Ποσοτική Ανάλυση (1) Αυξάνει την ευαισθησία Μειώνει την παρεμπόδιση συναπορροφουσών ουσιών Βρίσκει εφαρμογή σε Προσδιορισμό φαρμάκων παρουσία εκδόχων Προσδιορισμό φαρμάκων σε βιολογικά υγρά Κλινική, βιοχημική, περιβαλλοντική ανάλυση και ανάλυση τροφίμων

48 Φασματοφωτομετρία παραγώγων στην Ποσοτική Ανάλυση (2) Ηευαισθησία ενός προσδιορισμού εξαρτάται περισσότερο από την ταχύτητα μεταβολής του εμε το μήκος κύματος dε/dλ, παρά την τιμή ε Στην πράξη συνήθως χρησιμοποιείται η απόσταση μεγίστου ελαχίστου της 2 ης παραγώγου

49 Πλεονεκτήματα Φασματοφωτομετρίας Μεγάλη ευαισθησία Προσδιορισμοί στην περιοχή M Προσδιορισμός ιχνοστοιχείων (ppm) Προσδιορισμός κύριων συστατικών σε πολύ μικρή ποσότητα δείγματος Ταχύτητα Εκλεκτικότητα Δυνατότητα αυτοματοποίησης (από το πρώτο στάδιο ανάλυσης, πολλών συστατικών)

50 Μειονεκτήμτα Φασματοφωτομετρίας Μικρότερη ακρίβεια έναντι των κλασικών υγροχημικών μεθόδων Απαίτηση υπάρξεως προτύπων ουσιών / διαλυμάτων

51 Εφαρμογές Φασματοφωτομετρίας UV Vis στον Προσδιορισμό Δομής και Ποιοτική Ανάλυση Διαπίστωση ύπαρξης δραστικών ομάδων Διάκριση ανάμεσα σε συζυγιακά συστήματα Αύξηση συζυγίας συστήματος αυξάνεται το μήκος κύματος Αποκλεισμός ύπαρξης χρωμοφόρων Έλλειψη απορροφήσεως στα αποτελεί ένδειξη απουσίας βενζολικού πυρήνα

52 Χαρακτηριστικά Μήκη Κύματος και Εντάσεις Απορροφήσεως Απλών Χρωμοφόρων

53 Ταυτοποίηση Ουσιών Από Φάσματα UV - Vis Παραβολή φάσματος απορροφήσεως άγνωστης ουσίας με φάσμα πρότυπης ουσίας με ίδιες συνθήκες λήψεως Ευκολότερη σύγκριση απεικονίσεων loga ως προς λ Ολόγος απορροφήσεων σε δύο μήκη κύματος κριτήριο ταυτότητας ήκαθαρότητας φαρμάκων Καθαρότητα κυανοκοβαλαμίνης (βιταμίνη Β 12 ) ελέγχεται από το λόγο Α 278 /Α 361 = 0,57 και Α 550 / Α 361 = 0,3

54 Λοιπές Εφαρμογές Φασματοφωτομετρίας UV-Vis στην Ποιοτική Ανάλυση Ανίχνευση ιχνοποσοτήτων ακαθαρσιών που απορροφούν ισχυρά Μικρή εφαρμογή στην ποιοτική ανάλυση μειγμάτων, απαιτεί διαχωρισμός

55 Εφαρμογές φασματοφωτομετρίας UV-Vis στην Ποσοτική Ανάλυση (1) Κύρια χρήση με βάση Νόμο Beer Ευρεία εφαρμογή Κλινική ανάλυση Φαρμακευτική ανάλυση Ανάλυση τροφίμων Χημεία περιβάλλοντος Μεταλλουργία, προσδιορισμός ιχνοποσοτήτων προσμείξεων σε μέταλλα υψηλής καθαρότητας Γεωργική Χημεία

56 Εφαρμογές φασματοφωτομετρίας UV-Vis στην Ποσοτική Ανάλυση (2) Δυνατότητα προσδιορισμού των περισσότερων οργανικών φαρμακευτικών ουσιών (απορροφούν έντονα στο UV) Μεγάλος αριθμός επίσημων μεθόδων στη Φαρμακοποιία

57 Εφαρμογές φασματοφωτομετρίας UV-Vis στην Ποσοτική Ανάλυση (3) Στον έλεγχο σκευασμάτων πρόβλημα απορροφήσεως από έκδοχα. Επίλυση προβλήματος: Υπολογισμός απορρόφησης υποβάθρου και διόρθωση Σχηματισμός παραγώγου που απορροφά στο ορατό Αλλαγή διαλύτη, όπου τα έκδοχα είναι αδιάλυτα (Κυρίως) με εφαρμογή φασματορωτομετρίας παραγώγων

58 Παραδείγματα Προσδιορισμού Οργανικών Ουσιών με Φασματοφωτομετρία Vis με Σχηματισμό Παραγώγων

59 Παραδείγματα Προσδιορισμού Φαρμακευτικών Ουσιών με Φασματοφωτομετρία Vis με Σχηματισμό Παραγώγων

60 Αρχές Φασματοφωτομετρικών Προσδιορισμών Ανοργάνων Ιόντων (1)

61 Αρχές Φασματοφωτομετρικών Προσδιορισμών Ανοργάνων Ιόντων (2)

62 Κινητική Μελέτη Αντιδράσεων (1) Εάν σε μια αντίδραση το φάσμα απορροφήσεως αντιδρώντων είναι διαφορετικό προϊόντων, η απορρόφηση του μείγματος μεταβάλλεται με την πρόοδο της αντίδρασης, επιτρέποντας τη φασματοφωτομετρική κινητική μελέτη Ευρεία εφαρμογή στη μελέτη σταθερότητας φαρμακευτικών ουσιών στις διάφορες μορφές τους

63 Κινητική Μελέτη Αντιδράσεων (2) Για τον προσδιορισμό της σταθεράς ταχύτητας αντίδρασης χρησιμοποιούνται τεχνικές: Αρχικών κλίσεων ΔΑ/Δt Άπειρου χρόνου, Α ο, Α t, A Guggenheim Μη γραμμική προσαρμογή Τεχνική απείρου χρόνου, για αντίδραση πρώτης ήψευδοπρώτης τάξεως R P, μετρείται ηαρχική απορρόφηση Α ο του αντιδρώντος R, οι ενδιάμεσες τιμές A t του μείγματος R + P και ητελική Α του τελικού προϊόντος P

64 Κινητική Μελέτη Αντιδράσεων (3) Τεχνική Απείρου Χρόνου

65 Κινητική Μελέτη Υδρόλυσης Ασπιρίνης (Ακετυλοσαλικυλικό Οξύ)

66 Φάσματα Απορροφήσεως Ασπιρίνης και Σαλικυλικού Οξέος σε ph 5,0

67 Φασματοφωτομετρική Κινητική Μελέτη Υδρόλυσης Ασπιρίνης k = 1,42x10-3 s -1

68 Φασματοφωτομετρικός Προσδιορισμός Σταθερών Ισορροπίας Εάν φάσματα απορροφήσεως σωματιδίων που συμμετέχουν στην ισορροπία είναι αρκετά διαφορετικά είναι δυνατός ο προσδιορισμός της σταθεράς Κμε βάση νόμο Beer

69 Προσδιορισμός Σταθεράς Ιονισμού Ασθενούς Οξέος Επιλέγεται μήκος κύματος λ μεγ,α- ήλ μεγ,ηα στο οποίο οι απορροφητικότητες έχουν μέγιστη διαφορά. Μετρείται ηαπορρόφηση ενός αλκαλικού διαλύματος (μόνο Α - ), ενός όξινου (μόνο ΗΑ) και σε ένα ph = pka±1 pk για pk για ' a ' a = _ λ = _ λ ph µεγ, Α ph µεγ, ΗΑ [ A ] log [ HA] log A HA A A = A A ph log A AHA A A A

70 Φάσματα Απορροφήσεως Δείκτη Κυανού Βρωμοκρεσόλης για Προσδιορισμό pka

71 Προσδιορισμός Πρωτεϊνικής Σύνδεσης Φαρμάκων Ησύνδεση φαρμάκων με πρωτεϊνες διαφοροποιεί σε πολλές περιπτώσεις τα φάσματα απορρόφησής τους Ηφασματοφωτομετρία χρησιμοποιείται για τη μελέτη πρωτεϊνικής σύνδεσης Εύρεση αριθμού σύνδεσης n Εύρεση σταθερών σύνδεσης

72 Φάσματα Αμιτρυπτιλίνης και Ιμιπραμίνης Παρουσία Συγκεντρώσεων BSA για Μελέτη Πρωτεϊνικής Σύνδεσης

73 Προσδιορισμός Τύπου Συμπλόκου Ιόντος και Σταθεράς Αστάθειάς του Χρησιμοποιείται ημέθοδος γραμμομοριακού λόγου και μέθοδος συνεχών μεταβολών (μέθοδος Job) Μέθοδος γραμμομοριακού λόγου Παρασκευάζεται σειρά διαλυμάτων με σταθερή συγκέντρωση του ενός αντιδραστηρίου (μέταλλο Μ) και μεταβαλλόμενη του άλλου (συμπλεκτικού L) δημιουργώντας λόγους [L]/[M] = s/r 0,1 10 Μετρούνται οι απορροφήσεις του συμπλόκου M r L s

74 Φασματοφωτομετρική Μελέτη Συμπλόκων Φαρμάκων - Μετάλλων

75 Προσδιορισμός Στοιχειομετρίας Συμπλόκου Quinol NH 4 +

76 Φασματοφωτομετρικές Ογκομετρήσεις Προστίθεται τιτλοδότης (Τ) σε διάλυμα ογκομετρούμενης ουσίας (Ο) και μετρείται ηαπορρόφηση μετά από κάθε προσθήκη Ηκαμπύλη ογκομέτρησης Α V εμφανίζει δύο ευθύγραμμα τμήματα των οποίων η τομή είναι το ΤΣ Επιλέγεται λμε βάσει τα φάσματα Ο, Τ, Π

77 Φασματοφωτομετρικές Ογκομετρήσεις

78 Πλεονεκτήματα Φασματοφωτομετρικών Ογκομετρήσεων Καλύτερη ακρίβεια από άμεση φασματοφωτομετρία 0,1 0,2% έναντι 1-2% Δυνατότητα ογκομετρήσεως πολύ αραιών διαλυμάτων Δυνατότητα ογκομετρήσεων θολών και έγχρωμων διαλυμάτων (παρακολουθείται μεταβολή Α) Δυνατότητα προσδιορισμού ουσιών που δεν απορροφούν (αρκεί να απορροφά Τ, Π, ή δείκτης

79 Μειονεκτήματα Φασματοφωτομετρικών Ογκομετρήσεων Μεγαλύτερη διάρκεια προσδιορισμού Ανάγκη πρόσθετων οργάνων (προχοϊδα, κλπ) Ηχρήση οπτικών ινών έκανε ευκολότερη τη χρήση φασματοφωτομετρικών ογκομετρήσεων Οφωτομετρικός αισθητήρας μοιάζει με ένα ηλεκτρόδιο εμβαπτισμένο στο ογκομετρούμενο διάλυμα

80 Σύγκριση Φασματοφωτομετρικών Ογκομετρήσεων με Άλλες Ενόργανες Ογκομετρήσεις (1) Πλεονεκτούν έναντι ποτενσιομετρικών στην ευαισθησία, λόγω γραμμικής σχέσης Α C (γραμμική καμπύλη ογκομέτρησης) έναντι λογαριθμικής καμπύλης στις ποτενσιομετρικές Αυξομείωση ευαισθησίας, ανάλογα με μήκος κύματος και πάχος κυψελίδας (δεν υπάρχει αυτή ηδυνατότητα στις ποτενσιομετρικές)

81 Σύγκριση Φασματοφωτομετρικών Ογκομετρήσεων με Άλλες Ενόργανες Ογκομετρήσεις (2) Ταχύτερες από αμπερομετρικές Πλέον εύχρηστες από ποτενσιομετρικές (μόλυνση ηλεκτροδίων) και αμπερομετρικές (εκδίωξη οξυγόνου) Εφαρμογή σε όλους τους τύπους ογκομετρήσεων Ιδιαίτερο ενδιαφέρον στις συμπλοκομετρικές (δύσκολος εντοπισμός αλλαγής χρώματος δείκτη σε αραιές συγκεντρώσεις)

82 Καμπύλη Ογκομετρήσεως Αποτετρασφερρίνης Ορού με Fe(II)

83 Σύστημα Φασματοφωτομετρικών Ογκομετρήσεων Α: φασματοφωτόμετρο, Β: Προσθήκη τιτλοδότη, C: φωτομετρικός αισθητήρας οπτικής ίνας D: αυτόματη προχοϊδα

84 Πυκνομετρία (Densitometry) (1) Χρησιμοποιείται στην τεχνική ποσοτικής χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας, όπου οι ουσίες διαχωρίζονται και εμφανίζονται ως έγχρωμες κηλίδες Χρήση ειδικού φασματοφωτομέτρου (πυκνομέτρου) Μονοχρωματική ακτινοβολία από πηγή φωτός (ΠΦ), κάθετη προς τη χρωματογραφική πλάκα (Π), ισχύος P o, προσπίπτει πάνω στην υάλινη πλάκα

85 Πυκνομετρία (Densitometry) (2) Από την ακτινοβολία: Ένα μέρος διέρχεται από την πλάκα (P t ) και ανιχνεύεται, Ένα μέρος απορροφάται (P a ) από την προσδιοριζόμενη ουσία στην κηλίδα σε ποσοστό ανάλογο με τη συγκέντρωση (πυκνότητα) Ένα μέρος ανακλάται (P r ) σε ποσοστό αντιστρόφως ανάλογο με τη συγκέντρωση της ουσίας και μπορεί να ανιχνευθεί από ανιχνευτή Ένα μέρος χάνεται λόγω σκέδασης (P x )

86 Πυκνομετρία (Densitometry) (3) Ηεπιλογή του μήκους κύματος ακτινοβολίας καθορίζεται από τα φάσματα απορροφήσεως των έγχρωμων κηλίδων Ισχύει ησχέση P o = P t + P a + P r + P x Είναι δυνατή ηανίχνευση / μέτρηση Της P t διερχόμενης ακτινοβολίας από ανιχνευτή στην ίδια ευθεία γραμμή με ΠΦ και υπολογισμός Α= log (P t /P o ) εάν P r + P x σταθερό (ομοιόμορφη επίστρωση πλάκας) Της P r ανακλώμενης ακτινοβολίας από ανιχνευτή σε γωνία 45 ο μετην πλάκα

87 Πυκνομετρία (Densitometry) (4) Υπάρχει μηχανισμός σάρωσης της πλάκας μπροστά από το πυκνόμετρο Ημετρούμενη παράμετρος (P r ή A) καταγράφεται αυτομάτως και λαμβάνεται χρωματογράφημα με κορυφές κατά μήκος της πλάκας Επιτρέπεται οποσοτικός προσδιορισμός με χρήση προτύπων και κατασκευής καμπύλης αναφοράς Εάν μεττείται ηp r υπάρχει γραμμική σχέση τετραγώνου εμβαδού κορυφής και λογαρίθμου συγκέντρωσης.

88 Αρχή Λειτουργίας Πυκνομετρίας (α) και Ανακλαστικής Φασματοφωτομετρίας (β)

89 Σύστημα Πυκνομετρίας για HPTLC

90 Ανακλαστική Φασματοφωτομετρία (1) Μετρείται το ποσοστό ακτινοβολίας που ανακλάται από την επιφάνεια του δείγματος Χρησιμοποιείται στην τεχνική αποξηραμένων αντιδραστηρίων, όπου αναπτύσσονται έγχρωμες κηλίδες με εκλεκτικά αντιδραστήρια ακινητοποιημένα σε φορέα Μονοχρωματική ακτινοβολία ισχύος P o προσπίπτει υπό γωνία επί του μη διαπερατού φορέα

91 Ανακλαστική Φασματοφωτομετρία (2) Από την ακτινοβολία Ένα μέρος απορροφάται από τον όγκο του δείγματος, σε ποσοστό ανάλογα με τη συγκέντρωση της ουσίας Ένα μέρος (P r ) ανακλάται με διάχυτη ανάκλαση (Pπαρατηρείται σε ανώμαλες (ματ) επιφάνειες, από όλο τον όγκο του συστήματος) Μετρείται ηp r μεανιχνευτή και συσχετίζεται με τη συγκέντρωση της ουσίας με τη βοήθεια προτύπων