Η ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΑΥΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΑ ΜΟΡΙΑ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΧΩΡΟΥ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ Β ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΠΡΟΠΑΙΔΕΥΤΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ Κ. ΣΑΚΑΝΤΑΜΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ Η ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΤΟΥ ΤΡΑΥΜΑΤΟΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΑ ΜΟΡΙΑ ΤΟΥ ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟΥ ΧΩΡΟΥ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ Σ. ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2009

2

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΣΑΚΑΝΤΑΜΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ.- ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ 2. ΚΑΡΒΟΥΝΑΡΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. 3. ΜΑΝΘΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΣΑΚΑΝΤΑΜΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. - ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ 2. ΚΑΡΒΟΥΝΑΡΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. 3. ΜΑΝΘΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. 4. ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α.Π.Θ. 5. ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΕΛΕΝΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α.Π.Θ. 6. ΔΕΜΙΡΗ ΕΥΤΕΡΠΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α.Π.Θ. 7. ΣΙΟΓΚΑ-ΡΑΠΤΗ ΑΝΤΩΝΙΑ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α.Π.Θ.

4 «Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδυλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα» (Νόμος 5343/32, άρθρ και Ν. 1268/82, άρθρ. 50 8) 4

5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ

6

7 Στους πολυαγαπημένους μου γονείς, στην οικογένειά μου Στους Δασκάλους μου Στην Έλλη

8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Κυριότερες συντμήσεις. 15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ 17 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. TO ΔΕΡΜΑ Α.1.H επιδερμίδα Α.1.1.Βασική ή βλαστική στιβάδα Α.1.2.Ακανθωτή στιβάδα.. 30 Α.1.3.Kοκκώδης στιβάδα Α.1.4.Διαυγής στιβάδα.. 32 Α.1.5.Κερατίνη στιβάδα Α.1.6.Άλλοι τύποι κυττάρων της επιδερμίδας...33 Α Κύτταρα Langerhans..33 Α Κύτταρα Merkel.. 34 Α Μελανινοκύτταρα Α.2.Το χόριο ή δερμίδα 36 Α.2.1.Θηλώδης στιβάδα 36 Α.2.2.Δικτυωτή στιβάδα Α.2.3.Ινοβλάστες Α.2.4.H εξωκυττάρια ουσία.. 39 Α Ο ρόλος της εξωκυττάριας ουσίας.. 41 Α Τα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας.. 43 Α α. Κολλαγόνο Α β. Ελαστίνη 46 Α γ. Γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες Οι γλυκοζαμινογλυκάνες Το υαλουρονικό οξύ Η θειϊκή δερματάνη Θειϊκές χονδροιϊτίνες Θειϊκή ηπαράνη Οι πρωτεογλυκάνες.. 53 Α δ. Προσκολλητικές (συγκολλητικές) πρωτεΐνες Η ινονεκτίνη ή φιμπρονεκτίνη. ή ινοσυνεκτίνη ή ινωδονεκτίνη

10 - Η λαμινίνη Οι ιντεγκρίνες. 59 Α ε. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 59 - Κριτήρια ένταξης στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών (MMPs Μοριακή δομή των μεταλλοπρωτεϊνασών Ταξινόμηση των μεταλλοπρωτεϊνασών με βάση τη δομή τους Ταξινόμηση των μεταλλοπρωτεϊνασών με βάση το υπόστρωμά τους Ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών Λειτουργία των μεταλλοπρωτεϊνασών Ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και οι ειδικοί ιστικοί αναστολείς τους στο δέρμα και τη νοσολογία του Η σύγχρονη θεραπευτική σε συνάρτηση με τις μεταλλοπρωτεϊνάσες και τους ειδικούς ιστικούς αναστολείς τους στο δέρμα και τη νοσολογία του Α.3.Ο υποδόριος ιστός ή υποδερμάτιο πέταλο Α.4.Εξαρτήματα του δέρματος Α.4.1.Οι τρίχες Α Τριχοθυλάκια Α.4.2.Σμηγματογόνοι αδένες Α.4.3.Εκκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες Α.4.4.Αποκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες. 78 Β. Η ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Β.1.Φάση της φλεγμονής. 81 Β.2.Παραγωγική φάση 86 Β.3.Φάση της αναδιαμόρφωσης του τραύματος.. 88 Γ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Γ.1.Γενικά χαρακτηριστικά και ιδιότητες in vitrο Γ.2.Ανακαλλιέργεια κυττάρων που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα 93 Γ.3.Τροφοδότηση και συντήρηση των κυττάρων μέσα καλλιέργειας κυττάρων in vitro

11 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ Α. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ.101 Α.1. Κυτταρικές καλλιέργειες.101 Α.1.1.Εισαγωγή 101 Α.1.2.Στειρότητα του χώρου Α.1.3.Στείροι χειρισμοί Α.1.4.Θάλαμος νηματικής ροής του αέρα (Laminar Air Flow Cabinet) Α.1.5.Επιφάνεια εργασίας. 103 Α.1.6.Προσωπική υγιεινή Α.1.7.Aποστείρωση οργάνων-σκευών-υλικών Α.1.8.Εξοπλισμός του εργαστηρίου Α.2. Υλικά 107 Α.2.1.Υλικά καλλιέργειας κυττάρων Α.2.2.Συνθέσεις μέσων καλλιέργειας κυττάρων Α.3. Μέθοδοι καλλιέργειας κυττάρων. 112 Α.3.1.Μέθοδος απόψυξης των κυττάρων ( Cell Thawing Assay) Α.3.2.Μέθοδος καταμέτρησης των κυττάρων. Τεστ βιωσιμότητας (Viability Test) Α.3.3.Μέθοδος καλλιέργειας αποψυχθέντων κυττάρων Α.3.4.Μέθοδος αποκόλλησης καλλιεργηθέντων κυττάρων Α.3.5.Μέθοδος ανακαλλιέργειας ινοβλαστών Α.3.6.Μέθοδος κατάψυξης των ινοβλαστών Α.3.7.Έλεγχος βιωσιμότητας 120 Α.4. Πλέγματα ή ικριώματα Α.4.1.Εισαγωγή Α.4.2.Παραγωγή της πορώδους χιτίνης, κυτταρίνης και συνθέτων πηκτής χιτίνης-υδροξυαπατίτη μέσω της απομάκρυνσης αδιάλυτων στο νερό σωματιδίων Α.4.3.Παραγωγή πολυ(υδροξυ-βουτυρικού εστέρα) (ΡΗΒ) και οξικής κυτταρίνης μέσω της ηλεκτροστατικής ινοποίησης Α.5. Καλλιέργειες κυττάρων. 124 Α.5.1.Πρωτογενείς καλλιέργειες εμβρυϊκών ινοβλαστών μυών Α.5.2.Καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. 125 Α Κυτταρική σειρά ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών 142BR Α Πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών

12 Α Ταυτοποίηση των πρωτογενών καλλιεργειών ανθρώπινων ινοβλαστών με ανοσοϊστοχημεία Α.6. Πειραματικά μοντέλα επούλωσης τραύματος Α.6.1.Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. 127 Α.6.2.Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών με τη χρήση πλεγμάτων ικριωμάτων (porous scaffolds) 128 Α.6.3.Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωα. 129 Α.7. Ιστολογική ανάλυση με οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο 135 Α.7.1. Οπτικό μικροσκόπιο (ΟΜ) Α.7.2. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΗΜ). 136 Α.8. Απομόνωση, κλασματοποίηση και ταυτοποίηση γλυκοζαμινογλυκανών.137 Α.8.1.Ομογενοποίηση των δειγμάτων Α.8.2.Απολιπίδωση των δειγμάτων. 137 Α.8.3.Ενζυμική διάσπαση πρωτεϊνών Α.8.4.Ενζυμική διάσπαση νουκλεϊνικών οξέων Α.8.5.Β-απόσπαση τελικού αμινοξέος Α.8.6.Απομόνωση των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών Α.8.7.Ποσοτικός προσδιορισμός των απομονωμένων ολικών γλυκοζαμινογλυκανών Α.8.8.Ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης. 139 Α.8.9.Ταυτοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών με ειδικά ένζυμα Α.9. Ποσοτικός προσδιορισμός του υαλουρονικού οξέος με ενζυμοανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) Α.10. Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για την ανίχνευση της MMP Α.11. RT-PCR 143 Α.11.1.Απομόνωση RNA από πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Α.11.2.Αντίστροφη μεταγραφή Α.11.3.Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Α.11.4.Ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης Α.12. Προσδιορισμός δραστικότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών του συνδετικού ιστού (ΜΜPs) με ζυμογραφία ζελατίνης Α.13. Προσδιορισμός πρωτεϊνών Α.14.Στατιστική ανάλυση

13 Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 151 Β.1. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες 151 Β.1.1.Χαρακτηρισμός καλλιεργειών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. 151 Β.1.2.Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Β.1.3.Επίδραση μορίων του εξωκυττάριου χώρου στη σύγκλειση του τραύματος 154 Β.1.4.Μελέτη της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στη ζελατινολυτική δραστηριότητα πρωτογενών καλλιεργειών ανθρώπινων ινοβλαστών Β.1.5.Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στην έκκριση ενζυμικής δραστηριότητας από ινοβλάστες κατά τη διάρκεια της επούλωσης Β.1.6.Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στα πρωτεϊνικά επίπεδα της ΜΜΡ Β.1.7.Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στη γονιδιακή έκφραση της ΜΜΡ-2 και του ΤΙΜΡ Β.2. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος με τη χρήση πλεγμάτων σε κυτταρικές καλλιέργειες Β.3. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωα Β.3.1. Μακροσκοπική εκτίμηση της επούλωσης τραύματος Β.3.2. Ιστολογική εκτίμηση της επούλωσης τραύματος. 178 Β Οπτικό μικροσκόπιο Β Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Β.3.3. Μελέτη της επούλωσης σε μοριακό επίπεδο 227 Β Μελέτη της έκφρασης γλυκοζαμινογλυκανών κατά τη διάρκεια της επούλωσης Απομόνωση και ταυτοποίηση γλυκοζαμινογλυκανών από ιστοτεμάχια δέρματος μυός Ταυτοποίηση γλυκοζαμινογλυκανών με ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης Διαφορική έκφραση του υαλουρονικού οξέος κατά τη διάρκεια της επούλωσης Μέτρηση της σχετικής περιεκτικότητας του υαλουρονικού οξέος στις ολικές γλυκοζαμινογλυκάνες με ELISA Επίδραση της χρήσης πλεγμάτων χιτίνης και PHB στην έκφραση του υαλουρονικού οξέος κατά τη διάρκεια της επούλωσης

14 - Μέτρηση της σχετικής περιεκτικότητας του υαλουρονικού οξέος στις ολικές γλυκοζαμινογλυκάνες με ELISA παρουσία πλεγμάτων 231 Β Μελέτη της έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών κατά τη διάρκεια της επούλωσης Μελέτη της ενζυμικής δραστηριότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών 2 και 9 με ζυμογραφία ζελατίνης κατά τη διάρκεια της επούλωσης Επίδραση των πλεγμάτων χιτίνης και PHB στην ενζυμική δραστηριότητα των MMP-2 και MMP Γ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 239 Γ.1.Εισαγωγή. 239 Γ.2.Κυτταρικές καλλιέργειες και μοντέλο κυτταρικής επούλωσης Γ.3.Προσθήκη πλεγμάτων στις κυτταρικές καλλιέργειες και μελέτη των κυτταρικών καλλιεργειών Γ.4.Μελέτη της επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωα με την προσθήκη πλεγμάτων Δ. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ε. ABSTRACT CONCLUSIONS ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

15 ΚΥΡΙΟΤΕΡΕΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ChS: DS: ECM: Chondroitin Sulphate, θειϊκή χονδροϊτίνη Dermatan Sulphate, θειϊκή δερματάνη Extracellular Matrix, εξωκυττάρια θεμέλια ουσία EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid, αιθυλενοδιάμινο τετραοξικό οξύ EGF: Epidermal Growth Factor, επιδερμικός αυξητικός παράγοντας ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος FBS: FGF: GAG: HA: HS: IL-: Fetal Bovine Serum, ορός εμβρύου βοός Fibroblast Growth Factor, αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών Glycosaminoglycans, γλυκοζαμινογλυκάνες Hyaluronic Acid, υαλουρονικό οξύ Heparan Sulphate, θειϊκή ηπαράνη Interleukin, ιντερλευκίνη m-rna: messenger-ribo Nucleic Acid, αγγελιοφόρο ριβονουκλεϊκό οξύ MMPs: Matrix Metalloproteinases, μεταλλοπρωτεϊνάσες του συνδετικού ιστού MTT: PBS: PCR: PHB: PGs: δοκιμασία αναγωγής άλατος τετραζολίου Phosphate Buffer Saline, ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών με χλωριούχο νάτριο Polymerase Chain Reaction, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Polyhydroxy Βutyrate, πολυ-υδροξυ-βουτυρικός εστέρας Proteoglycans, πρωτεογλυκάνες TIMPs: Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases, ιστικοί αναστολείς των TGF: μεταλλοπρωτεϊνασών Transforming Growth Factor, μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας TNF-a: Tumor Necrosis Factor-a, ογκονεκρωτικός παράγοντας-α 15

16

17 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η επούλωση του τραύματος του ανθρώπινου δέρματος είναι μία απαραίτητη για κάθε οργανισμό, σύνθετη και πολύπλοκη διαδικασία, μέσω της οποίας επιτυγχάνεται η ανατομική, δομική και λειτουργική αποκατάσταση των ιστών που έχουν υποστεί βλάβες. Επιτελείται με αλληλένδετα και αλληλοεξαρτώμενα πολλαπλά φαινόμενα τα οποία ενεργοποιούνται με συγκεκριμένη σειρά, από τη χρονική στιγμή της πρόκλησης ενός τραύματος και διαρκούν για μακρό χρονικό διάστημα. Ένα τραύμα θεωρείται επουλωμένο όταν έχει γίνει η κατάλληλη επικάλυψη, η αποκατάσταση της συνέχειας του ιστού κατά μήκος της βλάβης και όταν οι ιστοί, που έχουν υποστεί τραυματισμό, τείνουν να γίνουν φυσιολογικοί. Οι διαδικασίες της επούλωσης εξαρτώνται από το μέγεθος, τη μορφή, το βάθος και την εντόπιση του τραύματος. Είναι πολύμορφες και εξελίσσονται ταυτόχρονα και παράλληλα σε πολλές κατευθύνσεις, αποτελούν όμως ένα ενιαίο σύνολο που έχει κοινό στόχο και αποβλέπει στο ίδιο αποτέλεσμα. Οι διεργασίες της επούλωσης αρχίζουν από τη χρονική στιγμή που θα προκληθεί ο ιστικός τραυματισμός και ολοκληρώνονται σε βάθος χρόνου. Σήμερα θεωρούμε ότι οι διεργασίες αυτές διαχωρίζονται σε τρεις φάσεις, δηλαδή τη φάση της φλεγμονής, την παραγωγική φάση και τη φάση του επανασχηματισμού και αναδιαμόρφωσης του τραύματος. Στην παρούσα διατριβή αναλύσαμε τη σχέση που έχουν οι τρεις αυτές διεργασίες στη φάση της επούλωσης, με τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, που απαντώνται στο δέρμα. Το δέρμα είναι το μεγαλύτερο όργανο του ανθρώπινου σώματος που καταλαμβάνει έκταση m 2 και παρουσιάζει πολλές παθητικές και ενεργητικές λειτουργίες, γεγονός που το καθιστά όργανο υψηλής διαφοροποίησης. Αποτελείται από δύο στιβάδες. Την επιδερμίδα εξωτερικά, με πολύστιβο πλακώδες κερατινοποιημένο επιθήλιο και το χόριο εσωτερικά, από ελαστικό κολλαγονώδες στρώμα με ινοβλάστες, το οποίο περιέχει παράλληλα τα εξαρτήματα του δέρματος, τα αγγεία, τα νεύρα και τις νευρικές απολήξεις. Το χόριο στηρίζει την επιδερμίδα και είναι πλούσιο σε εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία είναι ένα δυναμικό σύμπλεγμα, που συντίθεται τοπικά και αναδιαμορφώνεται συνεχώς. Συμβάλλει καθοριστικά στην ανάπτυξη, μεταβολισμό, πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των κυττάρων, διεργασίες σημαντικές για την επούλωση κάθε τραύματος. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελείται 17

18 από δίκτυα ελαστικών ινών, μακροφάγα, αιμοφόρα αγγεία, λεμφοκύτταρα και σιτευτικά κύτταρα, κυρίως όμως από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες. Οι πολυσακχαρίτες ονομάζονται γλυκοζαμινογλυκάνες (GAGs) και συνδέονται με τις πρωτεΐνες, για να σχηματίζουν τις πρωτεογλυκάνες (PGs). Εκτός από τις γλυκοζαμινογλυκάνες και τις πρωτεογλυκάνες, στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία υπάρχει και μία τρίτη κατηγορία μορίων που ονομάζονται μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs), που αποτελούν μία πολυμελή οικογένεια δομικά παρόμοιων ενδοπεπτιδασών, με ρόλο να ανασχηματίζουν τα στοιχεία των ιστών προκαλώντας πρωτεολυτική αποδόμηση των μορίων του εξωκυττάριου χώρου. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες συμμετέχουν τόσο σε παθολογικές διαδικασίες αναδόμησης ιστών, όσο και σε φυσιολογικές, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη και η επούλωση των τραυμάτων. Η αναστολή των ενεργοποιημένων μεταλλοπρωτεϊνασών γίνεται από τέσσερις ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs), οι οποίοι παρουσιάζουν και άλλες ανεξάρτητες ιδιότητες. Η παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματεύεται τη μελέτη των παραπάνω μορίων του εξωκυττάριου χώρου, τις γλυκοζαμινογλυκάνες, τις πρωτεογλυκάνες, τις μεταλλο-πρωτεϊνάσες και τους ιστικούς αναστολείς τους, σε σχέση με τις διαδικασίες της επούλωσης του ανθρώπινου δέρματος. Για τον λόγο αυτό σχεδιάσαμε και πραγματοποιήσαμε μία σειρά πειραμάτων, τόσο in vitro όσο και in vivo. Χρησιμοποιήσαμε διάφορες σειρές κυττάρων και αναπτύξαμε κυτταροκαλλιέργειες πάνω στις οποίες εφαρμόσαμε και μελετήσαμε το πειραματικό μας μοντέλο επούλωσης. Δοκιμάσαμε τη λειτουργικότητα και συμβατότητα διαφόρων πλεγμάτων στις κυτταροκαλλιέργειες και παράλληλα χρησιμοποιήσαμε πειραματόζωα και μελετήσαμε την επούλωση σε αυτά, παρουσία και απουσία πλεγμάτων. Προσπαθώντας να παρουσιάσουμε μία σφαιρική και ολοκληρωμένη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τη μακροσκοπική παρατήρηση, τη φωτογράφηση, το οπτικό και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως, μοριακές μεθόδους και μεθόδους ανοσοϊστοχημείας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή μου ανατέθηκε με μεγάλη εμπιστοσύνη από τον Τομέα Χειρουργικής και τον Διευθυντή της Β Προπαιδευτικής Χειρουργικής Κλινικής του Α.Π.Θ.. Η εκπόνησή της ξεκίνησε από το Τμήμα Κυτταροκαλλιεργειών του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας του Α.Π.Θ., συνεχίστηκε στο Τμήμα Πειραματοζώων του ίδιου Εργαστηρίου και ολοκληρώθηκε στο Β Εργαστήριο Φαρμακολογίας του Α.Π.Θ. Στο δημιουργικό και συνάμα δύσκολο αυτό μονοπάτι που διήρκησε πέντε χρόνια, είχα την τύχη και τιμή να συνεργαστώ με αξιόλογους επιστήμονες, Καθηγητές της Ιατρικής, δημιουργικούς και υπομονετικούς δασκάλους, οι οποίοι με βοήθησαν, εμψύχωσαν, ανέχτηκαν και μου συμπαραστάθηκαν στο να ολοκληρωθεί επιτυχώς η έρευνα αυτή. 18

19 Για τη συμβολή τους στην εκπόνηση της διδακτορικής αυτής διατριβής θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς και θερμές μου ευχαριστίες και την απέραντη ευγνωμοσύνη μου: Στον Καθηγητή Χειρουργικής κ. Αθανάσιο Σακαντάμη, Διευθυντή της Β Προπαιδευτικής Χειρουργικής Κλινικής Α.Π.Θ., ο οποίος μου εμπιστεύθηκε το συγκεκριμένο θέμα και με παρότρυνε από τα πρώτα στάδια να είμαι διερευνητικός, αποτελεσματικός και να μην παρεκκλίνω από τον αρχικό μου στόχο. Ήταν πάντα παρών και διαθέσιμος σε κάθε μου απορία και δυσκολία. Η αμέριστη υποστήριξη, το ειλικρινές ενδιαφέρον του και οι πολύτιμες συμβουλές που μου παρείχε σε όλες τις μακροχρόνιες συναντήσεις μας ήταν ουσιώδεις στη συνέχιση της προσπάθειας. Η καθοδήγηση και ενθάρρυνσή του ήταν καθοριστική ώστε η παρούσα διατριβή να ολοκληρωθεί επιτυχώς. Στον Καθηγητή Χειρουργικής Α.Π.Θ. κ. Δημήτριο Καρβουνάρη, για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή και την παρακολούθηση της προόδου της παρούσας διδακτορικής διατριβής. Στον Καθηγητή Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ., Διευθυντή του Εργαστηρίου και Πρύτανη του Α.Π.Θ., κ. Αναστάσιο Μάνθο, για την αμέριστη συμπαράσταση που μου έδειξε από την πρώτη στιγμή που του ζητήθηκε να συμμετέχει στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή καθώς και για τη επιστημονική του καθοδήγηση στην πορεία της έρευνας. Ο κ. Μάνθος μου επέτρεψε την ελεύθερη χρήση του Τμήματος Κυτταροκαλλιεργειών του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ. για την πραγματοποίηση του πρώτου σταδίου των πειραμάτων μου. Το τμήμα καλλιέργειας κυττάρων οργανώθηκε από τον ίδιο τον Καθηγητή, διαθέτει σύγχρονες εγκαταστάσεις και είναι εξοπλισμένο με τα τελευταία όργανα και υλικά, έτσι ώστε να πραγματοποιήσω απρόσκοπτα το σύνολο των πειραμάτων μου in vitro. Στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ., κ. Αντωνία Σιόγκα, για την πολύτιμη, ουσιαστική και αμέριστη βοήθεια που μου παρείχε τα τελευταία πέντε χρόνια, για την καθημερινή της ενασχόληση στην πορεία των πειραμάτων, για την καθοριστική της συμμετοχή στις έρευνες, που αφορούν τις κυτταροκαλλιέργειες και τα πειραματόζωα, για την οπτική και ηλεκτρονική μικροσκόπηση των ιστοτεμαχίων δέρματος και συνολικά για την προσφορά της από την έναρξη της συνεργασίας μας. Η αμεσότητα και η μεταδοτικότητα που τη χαρακτηρίζουν ως α- καδημαϊκό δάσκαλο είναι αρετές ενός άρτια καταρτισμένου επιστήμονα και αποτελούν έμπνευση για μένα. Κανένα ευχαριστώ δεν είναι αρκετό για να ξεπληρώσω την υποστήριξή της στο πρόσωπό μου. Στάθηκε στο πλάι μου με ακαδημαϊκό ήθος, άρτια επιστημονική γνώση, ανιδιοτέλεια και πάνω από όλα υπομονή και αγάπη. Τη νιώθω ειλικρινά σαν μέλος της οικογένειάς μου. Στον Καθηγητή Φαρμακολογίας, Διευθυντή του Β Εργαστηρίου Φαρμακολογίας Α.Π.Θ., κ. Γεώργιο Καρακιουλάκη, για την καθοριστική συμβολή του στην επιλογή του θέματος, για τη βοήθεια στη διαμόρφωση του ερευνητικού πρωτοκόλλου, 19

20 για την επιστημονική καθοδήγηση από την πρώτη μέχρι την τελευταία ημέρα, για την ευγενή παραχώρηση των εγκαταστάσεων του Εργαστηρίου Φαρμακολογίας, όπου ολοκληρώθηκαν και επεξεργάστηκαν τα αποτελέσματα των πειραμάτων αλλά και γενικά για την οξυδερκή κριτική ματιά του που ήταν οδηγός στη δύσκολη φάση της έρευνας. Στην Επίκουρη Καθηγήτρια Φαρμακολογίας Α.Π.Θ., κ. Ελένη Παπακωνσταντίνου, για τη διενέργεια μέρους της μοριακής και ανοσοϊστοχημικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων, για τη δύσκολη επεξεργασία των αποτελεσμάτων, για τις αμέτρητες ώρες που αφιέρωσε δίπλα μου τόσο κατά τη διάρκεια της έρευνας όσο και κατά τη διάρκεια της συγγραφής, για τις ατελείωτες και κουραστικές επιστημονικές μας συναντήσεις, για την οξυδέρκεια που επέδειξε στην αντιμετώπιση των δυσκολιών που συνάντησα, για την υπομονή που έδειξε στο πρόσωπό μου, για την ηθική συμπαράσταση όταν προέκυψαν προβλήματα, για τη λεπτομερή διόρθωση των κειμένων και γενικά για τη συνολική συμβολή της από την αρχή μέχρι το τέλος της διδακτορικής αυτής διατριβής. Η μακροχρόνια ενασχόλησή της με τα μόρια του ε- ξωκυττάριου χώρου και η διάθεση που έδειξε στο να με εισαγάγει στον μαγικό κόσμο τους, μου έδωσε κουράγιο και όρεξη να μελετήσω το αντικείμενο σφαιρικά και δομημένα. Δεν έχω λόγια για να εκφράσω όλα μου τα συναισθήματα και τις ευχαριστίες μου στο πρόσωπό της. Η ακαδημαϊκή κοινότητα πρέπει να είναι περήφανη που έχει στους κόλπους της έναν τέτοιο άξιο επιστήμονα, πετυχημένο ερευνητή και συνάμα υπέροχο άνθρωπο. Στην Επίκουρη Καθηγήτρια Πλαστικής Χειρουργικής, Διευθύντρια της Κλινικής Πλαστικής Χειρουργικής Α.Π.Θ., κ. Ευτέρπη Δεμίρη, για τη συμμετοχή της στην επταμελή εξεταστική επιτροπή, για τις υποδείξεις της στην επεξεργασία του κειμένου και για την τιμή που μου κάνει να με συμβουλεύει σε θέματα ειδικότητας όποτε αυτό μου είναι αναγκαίο. Στον Καθηγητή του Τμήματος Χημικών Μηχανικών της Πολυτεχνικής Σχολής Α.Π.Θ., κ. Κωνσταντίνο Παναγιώτου για την ευγενική παραχώρηση των πλεγμάτων-ικριωμάτων- για τη μελέτη τους στα πειραματικά μας μοντέλα, και ιδιαιτέρως στο μέλος της ομάδας του τον κ. Κωνσταντίνο Τσιόπτσια, για τη ευγενική συνεισφορά του σε βιβλιογραφία, πληροφορίες και φωτογραφίες. Στον Καθηγητή Παιδοχειρουργικής, Διευθυντή της Κλινικής Παιδοχειρουργικής Α.Π.Θ., κ. Αθανάσιο Ζαβιτσανάκη για την ευγενική παραχώρηση των δειγμάτων ακροποσθίας, ώστε να γίνει εφικτή η απομόνωση, ανάπτυξη και καλλιέργεια πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. Στη Βιολόγο, κ Λίζα Βαρίνου, για την καθοριστική συμβολή της ιδιαίτερα στα πρώτα στάδια των πειραμάτων, για την υπομονή που έδειξε στην εκπαίδευση μου στις μεθόδους καλλιέργειας κυττάρων, για την επιμονή της να παρουσιάσουμε μία ολοκληρωμένη έρευνα, για τις ώρες που αφιέρωσε δίπλα μου, επιλύοντας όλες τις 20

21 απορίες μου και για την εμψύχωση που μου παρείχε σε όλες τις δυσκολίες του πειραματικού μέρους. Στην Ιατρό, Επιστημονικό Συνεργάτη του Β Εργαστηρίου Φαρμακολογίας Α.Π.Θ., κ. Χρύσα Πουρζιτάκη για τη βοήθειά της στην πραγματοποίηση των πειραμάτων των πειραματοζώων, τη στατιστική ανάλυση, καθώς και για τη διενέργεια μέρους της μοριακής και ανοσοϊστοχημικής επεξεργασίας των ιστοτεμαχίων των πειραματοζώων. Στην Τεχνολόγο του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ., κ. Όλγα Παπουτσάκη, για την άρτια προετοιμασία των παρασκευασμάτων του οπτικού μικροσκοπίου. Στην Τεχνολόγο του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ., κ. Όλγα Μουλά για την άρτια προετοιμασία των παρασκευασμάτων του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Στο μέλος Ε.Τ.Ε.Π. του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ. κ. Στέλιο Τουπαδάκη για την επιμέλεια των φωτογραφιών και γενικά για τη βοήθεια που μου παρείχε. Σε όλο το προσωπικό του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας Α.Π.Θ., το οποίο με περιέλαβε με αγάπη, φροντίδα και εμπιστοσύνη, όλα αυτά τα χρόνια των πειραμάτων και των εργασιών μου εκεί. Καθένας με τον τρόπο του συνέβαλε στο να αισθάνομαι οικεία και να μπορώ να εργάζομαι απερίσκεπτα σε ένα ευχάριστο και φιλικό περιβάλλον. Στον Υπεύθυνο του Εργαστηρίου Σαρωτικού Μικροσκοπίου Α.Π.Θ. Καθηγητή κ. Σπύρο Σκλαβούνο, για την ευγενική παραχώρηση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σαρώσεως ώστε να ερευνηθούν και φωτογραφηθούν τα πλέγματαικριώματα. Στην οικογένειά μου, που όλα αυτά τα χρόνια ήταν δίπλα μου σωματικά, ηθικά, συναισθηματικά και ψυχολογικά, στα καλά και στα άσχημα, στις εύκολες και δύσκολες στιγμές. Η ηθική τους συμπαράσταση και εμψύχωση ήταν καταλυτική για να ολοκληρωθεί η διατριβή αυτή. Στον πατέρα μου, που πάντα ήταν το πρότυπο μου, ο ιατρός που θαυμάζω και θέλω να μοιάσω, στοργικός και καλοσυνάτος, πιστός φίλος και αρωγός της προσπάθειάς μου σε όλους τους τομείς, σύμβουλός μου στο να πορεύομαι πάντα με σεμνότητα, τιμιότητα και εργατικότητα. Στη μητέρα μου που δεν έλειψε στιγμή από το πλευρό μου. Είναι πάντα παρούσα, μητέρα,φίλη, σύμβουλος, επιστήμονας, δάσκαλος. Η ακαδημαϊκή της βοήθεια, η επιστημονική της κατάρτιση και η δυναμική της παρουσία στο πλευρό μου με πλάθουν μέρα με τη μέρα καλύτερο γιατρό, καλύτερο επιστήμονα, καλύτερο άνθρωπο. Μέσα από τη καρδιά και την ψυχή μου σε ευχαριστώ θερμά. Στη σύντροφο της ζωής μου, που με χαμόγελο και κατανόηση με ενθάρρυνε στις ατελείωτες ώρες ενασχόλησης κατά την εκπόνηση και συγγραφή της διδακτορικής μου διατριβής. 21

22

23 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 23

24

25 Α. TO ΔΕΡΜΑ Το δέρμα, αποτελούμενο από το καθαυτό δέρμα και τα προσαρτήματά του, τους ιδρωτοποιούς και σμηγματογόνους αδένες, τις τρίχες και τους όνυχες, αποτελεί το μεγαλύτερο όργανο του ανθρωπίνου σώματος, με έκταση στον ενήλικα περίπου m 2. Καλύπτει την εξωτερική επιφάνεια του σώματος, μεταπίπτοντας στους βλεννογόνους του πεπτικού συστήματος στην περιοχή των χειλέων και του πρωκτού, του αναπνευστικού συστήματος στη μύτη και του ουρογεννητικού συστήματος εκεί όπου αυτό εκβάλλει στην επιφάνεια. Επιπρόσθετα, το δέρμα των βλεφάρων μεταπίπτει στον επιπεφυκότα, που επενδύει το πρόσθιο τμήμα του οφθαλμικού βολβού και στον έξω ακουστικό πόρο που καλύπτει την έξω επιφάνεια του τυμπανικού υμένα. [1,2] Το δέρμα αντιπροσωπεύει το 16% του σωματικού βάρους του νεογνού και το 7% του ενήλικα και παρουσιάζει πολλές παθητικές και ενεργητικές λειτουργίες, γι αυτό άλλωστε θεωρείται σαν παρεγχυματώδες όργανο υψηλής διαφοροποίησης. Στις παθητικές του λειτουργίες συγκαταλέγονται διάφορες φυσικές του ιδιότητες, όπως η ελαστικότητα, η διατατότητα και η ανθεκτικότητα, που συμβάλλουν στην αντιμετώπιση των εξωγενών βλαπτικών παραγόντων. Σαν μεμβράνη έχει την ιδιότητα της ημιδιαπερατής μεμβράνης για τις διάφορες ουσίες. Έτσι για το νερό είναι μεν διαπερατό σαν μεμβράνη προς τα έξω, αδιαπέραστο όμως προς τα έσω. [3] Για την προστασία του οργανισμού από άλλους βλαπτικούς παράγοντες το δέρμα χρησιμοποιεί και τους ενεργητικούς του μηχανισμούς. Έτσι αντιδρά στην ε- πίδραση της υπεριώδους ακτινοβολίας με την υπερπαραγωγή μελανίνης, που είναι ανάλογη προς την ένταση της ακτινοβολίας. Για να εμποδίσει την εισβολή μικροβίων, το δέρμα διαθέτει τρεις διαφορετικούς μηχανισμούς σε τρία διαφορετικά επίπεδα. Έχει ένα όξινο ph που δεν ευνοεί την ανάπτυξη μικροβίων, η κερατίνη στιβάδα του έχει τέτοια υφή που δρα σαν φίλτρο και δεν επιτρέπει την είσοδο μικροβίων και τέλος η αγγειοβρίθειά του αποτελεί φραγμό για την αναχαίτιση της εισβολής των μικροοργανισμών, ενώ κινητοποιεί τους πλέον τέλειους ανοσοβιολογικούς μηχανισμούς του σώματος για την καταπολέμηση μικροοργανισμών ή άλλων βλαπτικών ουσιών, που κατόρθωσαν να διεισδύσουν σ αυτό. [1] Στις εξειδικευμένες λειτουργίες του περιλαμβάνεται η εξυπηρέτηση των αισθήσεων (αφή, αίσθηση θερμούψυχρού, πίεσης, πόνου), η έκκριση λιπιδίων με προστατευτική λειτουργία και η α- πέκκριση από τους ιδρωτοποιούς αδένες. 25

26 Εμβρυολογικά, το δέρμα προέρχεται από το έξω και το μέσο βλαστικό δέρμα. [2,3,4] Από το πρώτο προέρχεται η επιδερμίδα, οι αδένες και τα εξαρτήματα του δέρματος, ενώ από το δεύτερο, το χόριο και το υποδερμάτιο πέταλο ή υποδόριο λίπος. Έτσι εξηγείται και η σχέση του δέρματος, σαν αισθητήριο όργανο, προς το νευρικό σύστημα, που προέρχεται επίσης από το έξω βλαστικό δέρμα. Η μεσοδερμική προέλευση του χορίου εξηγεί και την αγγειοβρίθειά του σε αντίθεση προς την επιδερμίδα, που στερείται αγγείων. Η εναπόθεση μελανίνης στο χόριο αρχίζει από τον 4 ο μήνα της κύησης στους θύλακες των τριχών και επεκτείνεται στο υπόλοιπο δέρμα μετά τη γέννηση. [4,5] Εικόνα 1: Σχηματική απεικόνιση λεπτού δέρματος. Αριστερά: Παχύ δέρμα. (Από Gartner- Hiatt, Color Textbook of Histology) Ιστολογικά, το δέρμα αποτελείται από δύο κύριες στιβάδες: μία εξωτερική, την επιδερμίδα και μία βαθύτερη στιβάδα από συνδετικό ιστό, το χόριο ή δερμίδα, (Εικ.1) αλλά και από μία τρίτη μεταβλητή στιβάδα, την υποδερμίδα ή υποδόριο λίπος. [6] Η επιδερμίδα είναι η επιφανειακή στιβάδα, σε άμεση επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον, αποτελούμενη από ένα εξωδερματικής προέλευσης πολύστιβο 26

27 πλακώδες κερατινοποιημένο επιθήλιο, οι καταδύσεις της οποίας δημιουργούν τους ιδρωτοποιούς αδένες, τα τριχοθυλάκια και άλλα επιδερμικά εξαρτήματα. Αμέσως κάτω από την επιδερμίδα και αλληλοδιαπλεκόμενο μαζί της βρίσκεται το χόριο ή δερμίδα, μεσοδερματικής προέλευσης, που περιέχει τα εξαρτήματα, τα αγγεία, τα νεύρα και τις νευρικές απολήξεις μέσα σε ένα ελαστικό στρώμα με ινοβλάστες και άφθονα κολλαγόνα ινίδια. Η επιφάνεια επαφής μεταξύ της επιδερμίδας και του χορίου σχηματίζεται από επηρμένες ακρολοφίες του χορίου (θηλές), οι οποίες διαπλέκονται με καταδυόμενες προεκβολές της επιδερμίδας, τις επιδερμικές καταδύσεις. [6,7] Στο σύνολό τους οι δύο τύποι προεκβολών είναι γνωστοί ως συσκευή ακρολοφιών. Η υποδερμίδα ή υποδόριος ιστός είναι η βαθύτερη στιβάδα. Ποικίλλει σε μέγεθος και περιεχόμενο, αποτελούμενη από χαλαρό συνδετικό ιστό με διαφορετική ποσότητα λίπους. Κατ άλλους η υποδερμίδα δεν ανήκει στο δέρμα, αλλά αποτελεί την επιπολής περιτονία της μακροσκοπικής ανατομικής, η οποία καλύπτει ολόκληρο το σώμα, αμέσως κάτω από το δέρμα. Τα άτομα που υπερσιτίζονται ή που ζουν σε ψυχρά κλίματα διαθέτουν μεγαλύτερη ποσότητα λίπους, αποθηκευμένη στην ε- πιπολής περιτονία (υποδόριο λίπος). Το εν λόγω λίπος ονομάζεται υποδόριος λιπώδης ιστός. [6,7] Το δέρμα είναι γενικά λεπτότερο κατά την παιδική ηλικία και μετά το 5 ο έτος αποκτά το πάχος που έχει κατά περιοχές και στην ενήλικη ζωή. [4,5] Σε ορισμένες περιοχές του σώματος, παρουσιάζει διαφορετική υφή και πάχος, ανάλογα με το πάχος της επιδερμίδας και του χορίου. Για παράδειγμα, το δέρμα των βλεφάρων είναι μαλακό και λεπτό και διαθέτει λεπτές τρίχες, ενώ σε μικρή απόσταση από αυτό, στους όφρυς, είναι παχύ και παρουσιάζει αδρές τρίχες. Το δέρμα του μετώπου παράγει λιπαρό έκκριμα, ενώ το δέρμα του πώγωνα στερείται λιπαρών εκκρίσεων αλλά διαθέτει πολλές τρίχες. Οι παλάμες και τα πέλματα καλύπτονται από παχύ δέρμα χωρίς τρίχες, αλλά με πολλούς ιδρωτοποιούς αδένες. Επιπρόσθετα, οι υπεγερμένες επιφάνειες των δακτύλων των άκρων χειρών και ποδών, διαθέτουν εναλλασσόμενες ακρολοφίες και αύλακες, οι οποίες σχηματίζουν αγκύλες, τόξα, σπείρες και στροβίλους, τα καλούμενα δερματογλυφικά (δακτυλικά αποτυπώματα) που α- ναπτύσσονται κατά την εμβρυϊκή ζωή και παραμένουν αμετάβλητα εφ όρου ζωής. Είναι τόσο εξατομικευμένα ώστε χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση προσώπων στην ιατροδικαστική και εγκληματολογία. Αν και καθορίζονται γενετικά, πιθανόν από πολλαπλά γονίδια, άλλες αύλακες και πτυχώσεις περί τα γόνατα, τους αγκώνες και τους καρπούς των άκρων χειρών, σχετίζονται ως επί το πλείστον με τη χρήση και τη φυσική καταπόνησή τους. [6,7] Α.1. H επιδερμίδα Η επιδερμίδα αποτελεί την προστατευτική στιβάδα του δέρματος που βρίσκεται σε επαφή με το εξωτερικό περιβάλλον. Έχει πάχος από 0,07 έως 0,12mm στη μεγαλύτερη έκταση του σώματος, με εντοπισμένη πάχυνση στις παλάμες και 27

28 στα πέλματα (όπου μπορεί να έχει πάχος μέχρι 0,8mm και 1,4mm αντίστοιχα). Η ύπαρξη παχύτερου δέρματος στις παλάμες και στα πέλματα παρατηρείται και στο έμβρυο, αλλά η χρήση, η εφαρμογή πιέσεων και τριβών, έχει ως αποτέλεσμα, με την πάροδο του χρόνου, τη συνεχή αύξηση του πάχους του δέρματος σ αυτές τις περιοχές [1] Το δέρμα διακρίνεται σε παχύ και λεπτό αναλόγως του πάχους της επιδερμίδας. Εντούτοις, αυτοί οι δύο τύποι διακρίνονται και αναλόγως της παρουσίας ή απουσίας ορισμένων στιβάδων της επιδερμίδας και της παρουσίας ή της απουσίας τριχών. (Εικ.1) Το παχύ δέρμα καλύπτει τις παλάμες και τα πέλματα, δεν διαθέτει τριχοθυλάκια, ορθωτήρες μυς των τριχών ή σμηγματογόνους αδένες, αλλά έχει ιδρωτοποιούς αδένες. Η επιδερμίδα του παχέος δέρματος η οποία έχει πάχος 400 έως 600μm, χαρακτηρίζεται από την παρουσία και των πέντε στιβάδων. Το λεπτό δέρμα καλύπτει μεγάλο μέρος του υπολοίπου σώματος, διαθέτει τριχοθυλάκια, ορθωτήρες μυς των τριχών, σμηγματογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες. Η επιδερμίδα του λεπτού δέρματος η οποία κυμαίνεται σε πάχος από 75 έως 150μm, διαθέτει λεπτή κερατίνη στιβάδα, ενώ στερείται διακριτής διαυγούς και κοκκώδους στιβάδας. [6,7,8] Η επιδερμίδα αποτελείται από πολύστιβο πλακώδες επιθήλιο, του οποίου η ελεύθερη επιφάνεια καλύπτεται από στενά διατεταγμένα και πεπλατυσμένα πέταλα πρωτεΐνης (κερατίνης), που σχηματίζουν μία ανθεκτική αδιάβροχη στιβάδα (κερατίνη στιβάδα), που φέρει τέσσερις πληθυσμούς κυττάρων: επιθηλιακά κύτταρα, κύτταρα Langerhans, κύτταρα Merkel και μελανινοκύτταρα. [1,3] Τα επιθηλιακά κύτταρα που αποτελούν τον πολυπληθέστερο πληθυσμό κυττάρων και παράγουν την κερατίνη, διατάσσονται σε πέντε διακριτές στιβάδες που από μέσα προς τα έξω είναι: α) H βασική ή βλαστική στιβάδα, β) η ακανθωτή στιβάδα, γ)η κοκκώδης στιβάδα, δ) η διαυγής στιβάδα και ε) η κερατίνη στιβάδα. [3] Οι εναπομείναντες τρεις τύποι κυττάρων βρίσκονται διάσπαρτοι ανάμεσα στα επιθηλιακά κύτταρα σε ειδικές θέσεις. Η κερατίνη στιβάδα είναι κυτταρική, αλλά αποτελείται αποκλειστικά από ενδοκυτταροπλασματικά υπολείμματα κερατίνης που εναποτίθενται στην επιφάνεια της επιδερμίδας, μετά τον θάνατο των επιθηλιακών κυττάρων που τα έχουν παράγει. Έτσι το σχήμα κάθε πετάλου κερατίνης αποτυπώνει αδρά το σχήμα του επιθηλιακού κυττάρου, από το οποίο προήλθε. Τα επιφανειακά πέταλα κερατίνης, όπως και τα υποκείμενα αποπλατυσμένα νεκροβιωτικά επιθηλιακά κύτταρα, είναι γνωστά ως φολίδες (λέπια), προερχόμενα από την ωρίμανση των υπολοίπων στιβάδων των επιθηλιακών κυττάρων που αποτελούν την επιδερμίδα. Επειδή τα επιθηλιακά κύτταρα απολεπίζονται από την επιφάνεια της επιδερμίδας, αυτός ο κυτταρικός πληθυσμός πρέπει συνεχώς να ανανεώνεται. Η ανανέωση επιτυγχάνεται με μιτωτική δραστηριότητα των επιθηλιακών κυττάρων στη βασική στιβάδα της επιδερμίδας. Τα επιθηλιακά κύτταρα υφίστανται μιτώσεις κατά τη διάρκεια 28

29 της νύκτας και καθώς σχηματίζονται τα νέα κύτταρα, τα υπερκείμενα κύτταρα συνεχίζουν να ωθούνται προς την επιφάνεια. Κατά την πορεία τους προς την επιφάνεια, τα κύτταρα διαφοροποιούνται και αρχίζουν να συσσωρεύουν νημάτια κερατίνης στο κυτταρόπλασμά τους (κερατινοκύτταρα). Τελικά, καθώς προσεγγίζουν την επιφάνεια, τα κύτταρα πεθαίνουν και απολεπίζονται, μία διεργασία που διαρκεί συνήθως 20 έως 30 ημέρες και η οποία ποικίλλει ανάλογα με την περιοχή. Έτσι είναι ταχύτερη (25-30) ημέρες σε περιοχές συχνού τραυματισμού (πέλματα), ενώ σε άλλες περιοχές είναι βραδύτερη (40-50 ημέρες). Ο χρόνος ανανέωσης της επιδερμίδας ελαττώνεται σημαντικά σε ορισμένα νοσήματα του δέρματος και ειδικά στην ψωρίαση. [6,7,9] Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα επιθηλιακά κύτταρα παράγουν ανοσογόνες ουσίες, συμμετέχοντας πιθανόν στην ανοσιακή λειτουργία, είναι ικανά να παράγουν ιντερλευκίνες, παράγοντες που διεγείρουν το σχηματισμό αποικιών, ιντερφερόνες, παράγοντες νέκρωσης των όγκων και αυξητικούς παράγοντες που διεγείρουν τους ινοβλάστες και τα αιμοπετάλια. Α.1.1. Βασική ή βλαστική στιβάδα Αποτελεί τη βαθύτερη στιβάδα της επιδερμίδας, (Εικ.1) υφίσταται μιτώσεις, είναι υπεύθυνη για τη συνεχή παραγωγή των επιθηλιακών κυττάρων και σχηματίζει αλληλοπροσεκβολές με το χόριο από το οποίο χωρίζεται με βασική μεμβράνη. Η περιοχή στην οποία το χόριο (δερμίδα) συμβάλλει με την επιδερμίδα είναι σημαντική, λόγω του ότι συγκρατεί αυτές τις δύο στιβάδες μεταξύ τους. Η δομή αυτής της περιοχής είναι τέτοια ώστε ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο δερμο-επιδερμικού διαχωρισμού από δυνάμεις τριβής. Προσφυτικές ίνες κολλαγόνου συνδέουν το χόριο (δερμίδα) και την επιδερμίδα με τη βασική μεμβράνη, η οποία παρεμβάλλεται ανάμεσά τους. Τόσο η κυτταρική μεμβράνη των βασικών κυττάρων, όσο και η ίδια η βασική μεμβράνη, έχουν ελικοειδή διαμόρφωση. Η βασική μεμβράνη στη χόριο-επιδερμική συμβολή (σύνδεση) αποτελείται από τρία κύρια πέταλα: ένα ηλεκτρονικά διαυγές πέταλο προς την πλευρά της επιδερμίδας ένα ηλεκτρονικά σκοτεινό πέταλο στο μέσο μία ασαφή δικτυωτή στιβάδα, προς την πλευρά του χορίου. [10] Τα βασικά κύτταρα της βλαστικής στιβάδας προσφύονται στον πυκνό υμένα, με ημιδεσμοσώματα, από τα οποία πρωτεΐνες πρόσδεσης διασχίζουν το διαυγή υ- μένα. Προς την πλευρά του χορίου (δερμίδας), λεπτά ινίδια πρόσδεσης (ινίδια α- γκυροβολίας) και κολλαγόνο τύπου VII, προσδένουν την κατώτερη επιφάνεια του πυκνού υμένα με τις κολλαγόνες ίνες της δερμίδας, ενώ μικροϊνίδια φιμπριλλίνης προσδένουν τον πυκνό υμένα με τις ελαστικές ίνες. Επίσης, η ζώνη αμέσως κάτω από τον πυκνό υμένα περιέχει άφθονη ινονεκτίνη. Τα κύτταρα της βασικής στιβά- 29

30 δας έχουν σχήμα κυβοειδές ή χαμηλό κυλινδρικό, σε μονήρη στιβάδα με υποστρόγγυλους ή ωοειδείς ευμεγέθεις πυρήνες με ευδιάκριτα πυρήνια. Το κυτταρόπλασμά τους είναι βασεόφιλο, πλούσιο σε ριβοσώματα, λυσοσώματα, μικρή συσκευή Golgi, καθώς και μικρό αριθμό κοκκίων μελανίνης. Από τις πλάκες των πλαγίως κειμένων δεσμοσωμάτων διέρχονται πολυάριθμες δέσμες, καθώς και μονήρη, πάχους 10nm, ενδιάμεσα ινίδια (τονοϊνίδια), που καταλήγουν στις πλάκες των ημιδεσμοσωμάτων. Ανάμεσά τους βρίσκονται διάσπαρτα μη κερατινοκύτταρα, όπως μελανινοκύτταρα και κύτταρα Merkel. [1,6,7,10,11] Οι μιτώσεις είναι συνήθεις στη βασική στιβάδα επειδή είναι εν μέρει επιφορτισμένη με την ανανέωση των κυττάρων της επιδερμίδας. Εν τούτοις, οι μιτώσεις πραγματοποιούνται κατεξοχήν κατά τη διάρκεια της νύκτας, ενώ τα ιστολογικά παρασκευάσματα λαμβάνονται κατά τη διάρκεια της ημέρας. Ως εκ τούτου, σπανίως διακρίνονται μιτώσεις στις ιστολογικές τομές δέρματος. Όταν σχηματίζονται νέα κύτταρα με μίτωση, η προηγούμενη στιβάδα κυττάρων ωθείται προς την επιφάνεια και ενσωματώνεται στην επόμενη στιβάδα της επιδερμίδας, την ακανθωτή στιβάδα. Α.1.2.Ακανθωτή στιβάδα Η ακανθωτή στιβάδα (Εικ.1) αποτελείται από αρκετά στρώματα πολύμορφων κυττάρων, των οποίων οι πολυάριθμες προεκβολές προσδίδουν σε αυτή τη στιβάδα ακανθώδη όψη. Είναι η παχύτερη στιβάδα της επιδερμίδας, αποτελούμενη από πολυεδρικά έως αποπεπλατυσμένα κύτταρα με κεντρικό στρογγυλό πυρήνα και ροδόχροο κυτταρόπλασμα και διαθέτουν τον ίδιο πληθυσμό οργανιδίων που περιγράφηκε για τη βασική στιβάδα. [12] Εν τούτοις, τα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας είναι πιο πλούσια σε δέσμες ενδιάμεσων νηματίων (τονοϊνιδίων), που α- ποτελούνται από κυτταροκερατίνη, σε σχέση με τα κύτταρα της βασικής στιβάδας. (Εικ.2) Στα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας οι εν λόγω δέσμες έχουν κατεύθυνση από την περιπυρηνική περιοχή προς τις έντονα αλληλοδιαπλεκόμενες κυτταρικές προεκβολές, οι οποίες συνάπτουν με δεσμοσώματα παρακείμενα κύτταρα μεταξύ τους. Οι εν λόγω προεκβολές, που αποκαλούνταν «μεσοκυττάριες γέφυρες» από τους πρώτους ιστολόγους, προσδίδουν στα κύτταρα αυτά τη χαρακτηριστική ακανθώδη όψη. Καθώς τα κερατινοκύτταρα κινούνται προς την επιφάνεια μέσω της α- κανθωτής στιβάδας, συνεχίζουν να παράγουν τονοϊνίδια, τα οποία συγκροτούνται σε δέσμες και προσδίδουν στο κυτταρόπλασμα ηωσινόφιλη χροιά. Τα κύτταρα της στιβάδας αυτής περιέχουν επίσης κυτταροπλασματικά εκκριτικά κοκκία, διαμέτρου 0,1 έως 0,4μm, αφοριζόμενα από μεμβράνη, (πεταλιώδη σωμάτια) που περιέχουν λιπιδικής φύσεως ουσία, σε πυκνά συσκευασμένη πεταλιώδη μορφή. 30

31 Εικόνα 2: Φωτογραφία ηλεκτρονικού μικροσκοπίου ακανθωτής στιβάδας της επιδερμίδας. Π.πυρήνες επιθηλιακών κυττάρων. Τονοϊνίδια (αστερίσκος), δεσμοσωμάτιο (βέλος) x8000 Τα επιθηλιακά κύτταρα στη βάση της στιβάδας αυτής είναι επίσης μιτωτικά ενεργά, κατά τη διάρκεια της νύκτας και οι δύο στιβάδες μαζί βασική και ακανθωτή που συχνά αναφέρονται ως μαλπιγειανή στιβάδα, είναι επιφορτισμένες με την ανανέωση των επιθηλιακών κυττάρων της επιδερμίδας. Στη συνεχή μιτωτική δραστηριότητα των κυττάρων αυτών οφείλεται η συνεχής μετανάστευση στην επόμενη στιβάδα που ονομάζεται κοκκώδης. Τα στενά διάκενα μεταξύ των ακανθωτών κυττάρων, καταλαμβάνονται εν μέρει από τις κυτταροπλασματικές προεκβολές των μελανινοκυττάρων και των κυττάρων Langerhans. [1,6,7] Α.1.3. Kοκκώδης στιβάδα Αποτελείται από τρία έως πέντε στρώματα αποπλατυσμένων επιθηλιακών κυττάρων και είναι η πλέον επιφανειακή στιβάδα της επιδερμίδας, της οποίας τα κύτταρα εξακολουθούν να διαθέτουν πυρήνες. (Εικ.1) Το κυτταρόπλασμα αυτών των κυττάρων περιέχει μικρά ή ωοειδή βασίφιλα κοκκία κερατοϋαλίνης που δεν α- φορίζονται από μεμβράνη και αποτελούνται από πρωτεϊνικό υλικό, το οποίο περιέχει άφθονα αμινοξέα, πλούσια σε θείο (π.χ. κυστεΐνη). Περιέχουν επίσης άφθονα τονοϊνίδια και μικρά στρογγυλά πεταλιώδη κερατινοσώματα ή σωμάτια Odland. [14] 31

32 Στα ανώτερα στρώματα, το μεγαλύτερο μέρος του κυτταροπλάσματος των κοκκωδών επιθηλιακών κυττάρων αποτελείται από αθροίσεις κερατοϋαλίνης και στενά διαταγμένα τονοϊνίδια, με λίγα κυτταροπλασματικά οργανίδια. Τα κοκκία κερατοϋαλίνης υπερπληρούν τα κύτταρα, καταστρέφοντας τους πυρήνες και τα οργανίδιά τους. Τα κερατινοσώματα παράγουν ένα σύμπλοκο υδροφοβικού φωσφολιπιδίου το οποίο απελευθερώνεται κατά τη νέκρωση των επιφανειακών κοκκωδών επιθηλιακών κυττάρων. Το υλικό αυτό δρα πιθανώς ως συγκολλητική ουσία των φολίδων της κερατίνης. Το φωσφολιπίδιο καθιστά επίσης την επιφάνεια του δέρματος σχετικά αδιαπέραστη στο νερό. Αυτή η ουσία όμως απομακρύνεται σε παρατεταμένη διαβροχή του δέρματος, επιτρέποντας τελικά την απορρόφηση ύδατος από την κερατίνη, η οποία έτσι διογκώνεται και γίνεται μαλακή, γεγονός εμφανές στο δέρμα των χεριών μετά μακρά παραμονή στο νερό, ιδίως όταν είναι ζεστό και περιέχει κάποια μορφή λιποδιαλυτικού απορρυπαντικού. [1,6,7] Α.1.4. Διαυγής στιβάδα Είναι σχετικά λεπτή, ομοιογενής και δεν διακρίνεται πάντοτε. (Εικ.1) Παρούσα μόνο στο παχύ δέρμα (δέρμα των παλαμών και των πελμάτων), συνήθως έχει την όψη μιας λεπτής διαφανούς ζώνης που παρεμβάλλεται μεταξύ της κοκκώδους και της κερατίνης στιβάδας. Τα κύτταρά της δεν έχουν πυρήνες ή οργανίδια αλλά πυκνά διατεταγμένα νημάτια κερατίνης, μιας σκληροπρωτεΐνης αποτελούμενης από ινίδια πάχους 10nm, πλούσια σε ρίζες λυσίνης καθώς και ελαιοειδίνης, προϊόν μετατροπής της κερατοϋαλίνης. Επιπλέον, οι κυτταροπλασματικές όψεις των κυτταρικών μεμβρανών των επιθηλιακών κυττάρων, είναι εγκάρσια συνδεόμενες με ινβολουκρίνη, μία ινώδη πρωτεΐνη που σχηματίζει ένα εγκάρσιο πλέγμα του οποίου τα επιμέρους στοιχεία έχουν διάμετρο 12nm. Λυσοσωμικά ένζυμα που απελευθερώνονται στην κυτοσόλη των κυττάρων της κοκκώδους και της διαυγούς στιβάδας, πέπτουν τα οργανίδια των κυττάρων, τα οποία όταν πια φτάσουν στην κερατίνη στιβάδα έχουν καταστεί νεκρές φολίδες, γεμάτες από κερατίνη. [1,10] Α.1.5. Κερατίνη στιβάδα Είναι η πλέον επιφανειακή στιβάδα που αποτελείται από αρκετά στρώματα αποπλατυσμένων νεκρών κυττάρων που περιέχουν κερατίνη και είναι γνωστά ως φολίδες. (Εικ.1) Τα κύτταρα αυτά δεν διαθέτουν πυρήνα ούτε οργανίδια, αλλά είναι γεμάτα με νημάτια κερατίνης εμβυθισμένα σε άμορφη ουσία. Εκείνα τα κύτταρα που απέχουν από την επιφάνεια του δέρματος παρουσιάζουν δεσμοσώματα, ενώ τα κύτταρα κοντά στην επιφάνεια του δέρματος, τα οποία ονομάζονται φολίδες ή κερατινοποιημένα κύτταρα χάνουν τα δεσμοσώματά τους και καθίστανται απολεπισμένα (αποφολιδωμένα). Τα κύτταρα αυτά απολεπίζονται με τον ίδιο ρυθμό που αναπληρώνονται, χάρη στη μιτωτική δραστηριότητα της βασικής και της ακανθωτής στιβάδας. 32

33 Η δομική πρωτεΐνη που παράγεται από τα επιθηλιακά κύτταρα είναι η κερατίνη, η οποία σχηματίζει κατ αυτόν τον τρόπο ένα ισχυρό στρώμα από νημάτια πάχους 10nm, στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων. [11] Έχουν ταυτοποιηθεί διαφορετικά είδη κερατίνης, τέσσερα δε από αυτά απαντώνται στην επιδερμίδα. Τα κύτταρα της βασικής στιβάδας συνθέτουν δύο από τις τέσσερις πρωτεΐνες, ενώ τα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδας συνθέτουν όχι μόνο τα άλλα δύο, που σχηματίζουν αδρότερες θέσεις νηματίων, αλλά παράγουν και αποθηκεύουν την πρωτεΐνη ινβολουκρίνη καθώς και περιβαλλόμενα από μεμβράνη κοκκία τα οποία αργότερα διοχετεύουν το πλούσιο σε λιπίδια περιεχόμενό τους στα μεσοκυττάρια διαστήματα, σχηματίζοντας έτσι φραγμό διαπερατότητας. [11,14] Η διεργασία της κερατινοποίησης στις τρίχες και στο δέρμα, αν και σε γενικές γραμμές είναι όμοια, διαφέρει σε κάποια σημεία. Οι επιφανειακές στιβάδες κυττάρων της επιδερμίδας του δέρματος σχηματίζουν μαλακή κερατίνη, αποτελούμενη από ινίδια κερατίνης εμβυθισμένα σε φιλαγκρίνη, τα δε επιθηλιακά κύτταρα απολεπίζονται συνεχώς. Αντίθετα, η κερατινοποίηση της τρίχας όχι μόνο σχηματίζει σκληρή κερατίνη, αποτελούμενη από ινίδια κερατίνης εμβυθισμένα σε τριχοϋαλίνη, αλλά τα κερατινοποιημένα κύτταρα δεν απολεπίζονται. Αντίθετα, συσσωρεύονται και γίνονται συμπιεσμένα και σκληρά. [15] Η σύνθεση κερατίνης παύει μετά την είσοδο των επιθηλιακών κυττάρων στην κοκκώδη στιβάδα, τα κύτταρα της οποίας παράγουν φιλαγκρίνη, μία πρωτεΐνη που πιστεύεται ότι συμβάλλει στο σχηματισμό περισσότερο αδρών νηματίων κερατίνης. Όταν τα επιθηλιακά κύτταρα φθάσουν σ αυτή τη στιβάδα, καθίστανται διαβατά στα ιόντα ασβεστίου, γεγονός που βοηθά στη διασταυρούμενη σύνδεση της ινβολουκρίνης με άλλες πρωτεΐνες, σχηματίζοντας κατ αυτόν τον τρόπο ένα ισχυρό στρώμα υπό την κυτταρική μεμβράνη. Καθώς τα επιθηλιακά κύτταρα διέρχονται από την κοκκώδη στη διαυγή στιβάδα, ένζυμα που εκκρίνονται από τα λυσοσώματα, πέπτουν τα οργανίδια και τον πυρήνα. Όταν τα κύτταρα εισέλθουν τελικά στην κερατίνη στιβάδα, αποτελούν νεκρά, χωρίς οργανίδια σκληρά περιβλήματα, γεμάτα με δέσμες νηματίων κερατίνης. [1,6,7,15] Ο επιδερμικός αυξητικός παράγων (EGF) και η ιντερλευκίνη (IL) επηρεάζουν την αύξηση και την ανάπτυξη των επιθηλιακών κυττάρων, τουλάχιστον σε καλλιέργειες ιστών. Αντίθετα, ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας (TGF) καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων. Α.1.6. Άλλοι τύποι κυττάρων της επιδερμίδας Α Κύτταρα Langerhans Αν και υπάρχουν διάσπαρτα σ όλη την επιδερμίδα, όπου ο αριθμός τους μπορεί να φθάσει τα 800/mm 2, αποτελώντας υπό κανονικές συνθήκες το 2% έως το 4% του πληθυσμού των επιδερμικών κυττάρων, λόγω των πολυάριθμων μακρών αποφυάδων τους εντοπίζονται κυρίως στην ακανθωτή στιβάδα. (Εικ.1) Τα εν λόγω 33

34 κύτταρα μπορεί επίσης να ανευρεθούν στο χόριο, καθώς και στα πολύστιβα πλακώδη επιθήλια της στοματικής κοιλότητας, του οισοφάγου και του κόλπου. Βρίσκονται σε μικρό αριθμό στο υγιές δέρμα, αλλά σε πολλά χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα του δέρματος ειδικά σε αυτά ανοσολογικής ή αλλεργικής αιτιολογίας, όπως η χρόνια ατοπική δερματίτιδα (αλλεργικό έκζεμα) αυξάνουν σε αριθμό, έκταση και πολυπλοκότητα, όσον αφορά τις δενδριτικές τους αποφυάδες. [1,3,6,7] Αν και ο ακανόνιστου σχήματος πυρήνας και η απουσία τονοϊνιδίων διακρίνει τα κύτταρα Langerhans από τα περιβάλλοντα επιθηλιακά κύτταρα, το πλέον χαρακτηριστικό τους γνώρισμα είναι τα κοκκία του Birbeck ή κορυνοειδή κοκκία που α- ποτελούν ραβδόμορφες δομές με περιοδικά εγκάρσια γράμμωση και είναι πιο άφθονα κοντά στη συσκευή Golgi. Το μήκος τους είναι 15 έως 50nm και το πλάτος τους 4nm. Μερικές φορές το ένα άκρο της ράβδου διογκώνεται, σχηματίζοντας ένα σφαιρικό κυστίδιο, έτσι ώστε όλη η δομή να έχει την εμφάνιση ρακέτας του τένις. [11,16] Τα κύτταρα του Langerhans, τα οποία παλαιότερα πίστευαν ότι προέρχονταν από κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, σήμερα είναι γνωστό ότι κατάγονται από πρόδρομα κύτταρα εντοπιζόμενα στον μυελό των οστών και αποτελούν μέρος του μονοπυρηνικού φαγοκυτταρικού συστήματος. Αν και είναι ικανά να προβούν σε μίτωση, η δραστηριότητά τους αυτή είναι κατεσταλμένη. Ως εκ τούτου, αντικαθίστανται συνεχώς από πρόδρομα κύτταρα, τα οποία εγκαταλείπουν το αίμα για να μεταναστεύσουν στην επιδερμίδα όπου διαφοροποιούνται σε κύτταρα Langerhans. Ε- πίσης λαμβάνουν μέρος στην ανοσολογική απάντηση, αφού διαθέτουν τόσο επιφανειακούς Fc (αντισώματα) και C3 (του συμπληρώματος) όσο και άλλους υποδοχείς, ενώ φαγοκυτταρώνουν και επεξεργάζονται ξένα αντιγόνα. Α Κύτταρα Merkel Τα κύτταρα Merkel (Εικ.1) τα οποία διαφοροποιούνται από επιθηλιακά κύτταρα της επιδερμίδας του πρώιμου εμβρύου, απαντώνται διάσπαρτα ανάμεσα στα επιθηλιακά κύτταρα της βασικής στιβάδας και είναι ιδιαίτερα άφθονα στις κορυφές των δακτύλων, στον βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας καθώς και στη βάση των τριχοθυλακίων. Το χαρακτηριστικό γνώρισμα των κυττάρων Merkel είναι τα στρογγυλά, νευροενδοκρινικού τύπου κυτταροπλασματικά κοκκία με σκούρο περιεχόμενο, που περιβάλλονται από μεμβράνη και εντοπίζονται στην περιπυρηνική περιοχή. Τα κύτταρα Merkel σχηματίζουν συναπτικές συνδέσεις με τις απολήξεις περιφερικών νεύρων στη βάση του κυττάρου και αναπτύσσονται μεμονωμένα ή σε αθροίσματα, τα οποία είναι συνδεδεμένα με αμύελες ίνες, σχηματίζοντας εξειδικευμένες δομές που ονομάζονται τριχοειδείς δίσκοι και βρίσκονται ακριβώς κάτω από 34

35 τη βασική μεμβράνη. Τέτοια αθροίσματα θεωρείται ότι σχηματίζουν τους υποδοχείς της αφής (μηχανοϋποδοχείς-απτικά σωμάτια). [1,6,7,10] Α Μελανινοκύτταρα Τα μελανινοκύτταρα (Εικ.1) παράγουν την προστατευτική χρωστική μελανίνη, κυρίως υπεύθυνη ουσία για το χρώμα του δέρματος, που ελαχιστοποιεί την ιστική καταστροφή από την υπεριώδη ακτινοβολία. Κατάγονται από τη νευρική ακρολοφία και εντοπίζονται ανάμεσα στα κύτταρα της βασικής στιβάδας, εφαπτόμενα της βασικής μεμβράνης, αν και μπορεί να απαντούν και στις επιπολής περιοχές του χορίου. Το κυτταρόπλασμα των μελανινοκυττάρων περιέχει χαρακτηριστικά ωοειδή κοκκία, τα μελανινοσωμάτια, που περιέχουν μία ηλεκτρονικά πυκνή περιοχή, εμφανή στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, με εγκάρσιες γραμμώσεις και παράγουν μελανίνη.tα κοκκία αυτά προέρχονται από την τυροσινάση που παράγεται από το αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο των μελανινοκυττάρων, συσκευάζεται στη συσκευή Golgi και μεταφέρεται στα μελανινοσωμάτια. [3,17] Υπάρχουν δύο τύποι μελανίνης: η ευμελανίνη, μία χρωστική αποτελούμενη από πολυμερή υδροξυϊνδόλης και η φαιομελανίνη, μία ουσία αποτελούμενη από πολυμερή κυστεϊνυλικής ντοπαμίνης. Και οι δύο τύποι μελανίνης προέρχονται από το αμινοξύ τυροσίνη που μεταφέρεται κατά προτίμηση στα μελανινοσωμάτια, όπου η τυροσινάση τη μετατρέπει σε μελανίνη, διαμέσου μιας σειράς αντιδράσεων, με ενδιάμεσους σταθμούς την 3,4-διϋδροξυφαινυλαλανίνη (ντόπα, μεθυλ-ντόπα) και ντοπακινόνη. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι το ένζυμο τυροσινάση ενεργοποιείται από την υπεριώδη ακτινοβολία. Η αιτία της πιο σκοτεινόχρωμης χροιάς δεν οφείλεται στον πραγματικό αριθμό των μελανινοκυττάρων αλλά σε αύξηση της δραστηριότητας της τυροσινάσης τους. [1,6,7] Τα μελανινοσωμάτια εγκαταλείπουν το σώμα του μελανινοκυττάρου και ο- δεύουν προς τις κορυφές των μακρών αποφυάδων του. Μόλις φτάσουν εκεί, οι κορυφές των αποφυάδων του μελανινοκυττάρου εισδύουν στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων της ακανθωτής στιβάδας και αποκόπτονται με μία ειδική εκκριτική διεργασία που ονομάζεται κυτταροκρινής έκκριση. Κάθε αποφυάδα που έχει αποκοπεί, επιμηκύνεται και δέχεται νέα μελανινοσωμάτια, επαναλαμβανομένου του κύκλου. Κάθε συγκεκριμένο μελανινοκύτταρο εξυπηρετεί έναν αριθμό επιθηλιακών κυττάρων με τα οποία συνδέεται, αποτελώντας μαζί τους μία επιδερμιδομελανική μονάδα. Οι υπεριώδεις ακτίνες όχι μόνον αυξάνουν την ταχύτητα παραγωγής μελανίνης, καθώς και την ταχύτητα με την οποία επιτελείται η ενδοκυττάρωση των άκρων των αποφυάδων των μελανινοκυττάρων, αλλά επιπλέον ενισχύουν τη δράση της τυροσινάσης και ως εκ τούτου προάγουν την παραγωγή μελανίνης. Τελικά τα κοκκία με- 35

36 λανίνης αποδομούνται από λυσοσώματα του επιθηλιακού κυττάρου, διεργασία η οποία διαρκεί μερικές ημέρες. Ο αριθμός των μελανινοκυττάρων παραμένει περίπου σταθερός, αλλά ο βαθμός της επίδρασής τους ποικίλλει γενετικά, γεγονός που επηρεάζει το χρώμα του δέρματος στις διάφορες φυλές αλλά και μεμονωμένα σε κάθε άτομο. Ποικίλλει επίσης ανά τετραγωνικό χιλιοστό, στις διάφορες περιοχές του δέρματος του ατόμου, από 800 έως 2.300/mm 2. Α.2. Το χόριο ή δερμίδα Το χόριο, (Εικ.1) η στιβάδα του δέρματος που αποτελεί τον στηρικτικό ιστό της επιδερμίδας, κατάγεται από το μεσέγχυμα. Εντοπίζεται αμέσως κάτω από την επιδερμίδα, αποτελούμενο από μία χαλαρή θηλώδη στιβάδα και μία βαθύτερα κείμενη πυκνή δικτυωτή στιβάδα. Αποτελείται από πυκνό, ακανόνιστο συνδετικό ιστό με κολλαγόνες ίνες τύπου Ι, ινοβλάστες, ινοκύτταρα και τα εξωκυττάρια προϊόντα τους, εξωκυττάρια θεμέλια ουσία με γλυκοζαμινογλυκάνες, μικρό αριθμό μακροφάγων, λεμφοκυττάρων και σιτευτικών κυττάρων, αιμοφόρα αγγεία και δίκτυα ελαστικών ινών που στηρίζουν την επιδερμίδα και καθηλώνουν το δέρμα στον υποκείμενο υποδόριο ιστό. Το πάχος του χορίου κυμαίνεται από 0,6mm στα βλέφαρα έως 3mm περίπου στις παλάμες και στα πέλματα. Εντούτοις, δεν υπάρχει σαφής αφοριστική γραμμή με τον υποκείμενο υποδόριο ιστό. Κανονικά το χόριο στους άνδρες είναι παχύτερο από ότι στις γυναίκες, καθώς επίσης στις ραχιαίες από ότι στις πρόσθιες επιφάνειες του σώματος. Α.2.1. Θηλώδης στιβάδα Η αραιοχρωματική αυτή στιβάδα είναι ανισοπαχύς εκεί όπου διαπλέκεται με την επιδερμίδα (χοριο-επιδερμική συμβολή), σχηματίζοντας τις ακρολοφίες (θηλές) του χορίου Αποτελείται από χαλαρό συνδετικό ιστό με ινοβλάστες, μακροφάγα, πλασμοκύτταρα, σιτευτικά κύτταρα και άλλα κύτταρα του συνδετικού ιστού, καθώς και λεπτές κολλαγόνες ίνες τύπου ΙΙΙ που είναι διατεταγμένες σε χαλαρά πλέγματα. Ινίδια αγκυροβολίας, αποτελούμενα από κολλαγόνο τύπου VII, εκτείνονται από τον βασικό υμένα στη θηλώδη στιβάδα, προσφύοντας την επιδερμίδα στο χόριο. [10,11] Η θηλώδης στιβάδα διαθέτει επίσης πολλές αγκύλες τριχοειδών, οι οποίες εκτείνονται μέχρι το χοριοεπιδερμικό όριο. Τα εν λόγω τριχοειδή ρυθμίζουν τη θερμοκρασία του σώματος και τρέφουν τα κύτταρα της στερούμενης αγγείων επιδερμίδας. Σε μερικές θηλές του χορίου κατασκηνώνουν απιοειδούς σχήματος, περιβαλλόμενα από κάψα σωμάτια του Meissner, μηχανοϋποδοχείς εξειδικευμένοι να αντιδρούν σε ελαφρές παραμορφώσεις της επιδερμίδας. [3] Οι εν λόγω υποδοχείς είναι συνηθέστεροι σε περιοχές του δέρματος που είναι συνήθως ευαίσθητες σε απτικά 36

37 ερεθίσματα (π.χ τα χείλη, έξω γεννητικά όργανα και θηλές). Άλλος μηχανοϋποδοχέας που περιβάλλεται από κάψα και υπάρχει στη θηλώδη στιβάδα είναι η κορύνη του Krause. Παλαιότερα πίστευαν ότι ο υποδοχέας αυτός αντιδρά στο ψυχρό, σήμερα όμως η λειτουργία του παραμένει ασαφής. Α.2.2. Δικτυωτή στιβάδα Η στιβάδα αυτή είναι το μεγαλύτερο τμήμα του χορίου και αποτελείται από πυκνό ακανόνιστο συνδετικό ιστό με εμφανείς παχιές δεσμίδες κολλαγόνου τύπου Ι, που πορεύονται παράλληλα προς την επιφάνεια του δέρματος. Με τις κολλαγόνες ίνες διαπλέκονται πλέγματα παχέων ελαστικών ινών, που είναι ιδιαίτερα άφθονα κοντά σε σμηγματογόνους και ιδρωτοποιούς αδένες. Τα μεσοδιαστήματα της δικτυωτής στιβάδας γεμίζουν με πρωτεογλυκάνες πλούσιες σε θεϊκή δερματάνη. Τα κύτταρα είναι πολύ λιγότερα σε σχέση με τη θηλώδη στιβάδα και αφορούν ινοβλάστες, σιτευτικά, λεμφοκύτταρα, μακροφάγα και αρκετές φορές λιποκύτταρα στις βαθύτερες θέσεις της δικτυωτής στιβάδας. Όλοι οι ιδρωτοποιοί αδένες, οι σμηγματογόνοι αδένες και τα τριχοθυλάκια κατάγονται από την επιδερμίδα, εισδύουν στο χόριο και στον υποδόριο ιστό κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, όπου πλέον παραμένουν μόνιμα. [4,5] Σε συγκεκριμένα σημεία στις εν τω βάθει περιοχές της δικτυωτής στιβάδας, π.χ στο πέος, στο ό- σχεο, και στη θηλαία άλω, υπάρχουν ομάδες λείων μυϊκών κυττάρων, η συστολή των οποίων προκαλεί ρυτίδωση του δέρματος στις περιοχές αυτές. Άλλες ομάδες λείων μυϊκών κυττάρων, οι ορθωτήρες μύες των τριχών καταφύονται στα τριχοθυλάκια. Η συστολή των μυών ανορθώνει τις τρίχες όταν το σώμα είναι ψυχρό ή εκτίθεται ξαφνικά σε κρύο περιβάλλον, προσδίδοντας στο δέρμα όψη όμοια με εκείνη του δέρματος μαδημένης χήνας «χήνειο δέρμα». Στις εν τω βάθει περιοχές του χορίου εντοπίζονται δύο τουλάχιστον τύποι περιβαλλόμενων από κάψα μηχανοϋποδοχέων: α) τα σωμάτια του Pacini, τα οποία αντιδρούν σε πιέσεις και δονήσεις και β) τα σωμάτια του Ruffini τα οποία αντιδρούν σε δυνάμεις τάσεως. Τα σωμάτια του Ruffini είναι ιδιαίτερα άφθονα στο χόριο των πελμάτων. [18] Α.2.3. Ινοβλάστες Οι ινοβλάστες (Εικ.3) συνθέτουν το κολλαγόνο, την ελαστίνη, τις γλυκοζαμινογλυκάνες, τις πρωτεογλυκάνες και τις προσκολλητικές πρωτεΐνες. Αποτελούν τα συχνότερα απαντώμενα κύτταρα του συνδετικού ιστού. [10] 37

38 Εικόνα 3: Τομή δέρματος αρουραίου. Ένα στρώμα συνδετικού ιστού (δερμίδα, χόριο) δείχνει αρκετούς ινοβλάστες(ι), οι οποίοι είναι επιμήκη κύτταρα. Χρώση Ε&Α. Μεσαία μεγέθυνση. (Από L. Junqueira - J. Carneiro, Basic Histology) Στα κύτταρα αυτά παρατηρούνται δύο στάδια λειτουργικής δραστηριότητας, η έντονη πρωτεϊνοσύνθεση (ενεργό κύτταρο) και η χαμηλή συνθετική δραστηριότητα (αδρανές, ώριμο σχετικά κύτταρο σε φάση ηρεμίας). Τα κύτταρα με έντονη συνθετική δραστηριότητα διαφέρουν μορφολογικά από τους ινοβλάστες που παρουσιάζουν χαμηλή συνθετική δραστηριότητα και οι οποίοι είναι διασκορπισμένοι μέσα στη θεμέλια ουσία που έχουν ήδη συνθέσει. Οι ενεργοί ινοβλάστες (Εικ.4) έχουν άφθονο και ακανόνιστα διακλαδιζόμενο βασεόφιλο κυτταρόπλασμα το οποίο αποτελεί μορφολογικό χαρακτηριστικό κυττάρων με έντονη πρωτεϊνοσύνθεση και κωνοειδή διπολική ατρακτοειδή μορφολογία με μικρές πρόσθετες κυτταρικές προσεκβολές. [11] Χαρακτηρίζονται από πυρήνα ωοειδή, μεγάλο και αραιοχρωματικό, με λεπτό δίκτυο χρωματίνης και ευδιάκριτο πυρήνιο. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποκαλύπτεται ότι οι ινοβλάστες έχουν καλά ανεπτυγμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο και συσκευή Golgi, καθώς επίσης και εκκριτικά κυστίδια που υποδηλώνουν την έντονη έκκριση τροποκολλαγόνου. [6,7] Ο ώριμος, σχετικά αδρανής ινοβλάστης ή ινοκύτταρο (Εικ.4) είναι μικρότερος από τον ενεργό ινοβλάστη και τείνει να έχει ατρακτοειδές σχήμα. Έχει λιγότερες κυτταρικές προσεκβολές, ένα μικρότερο πιο πυκνοχρωματικό συρρικνωμένο πυρήνα, λόγω μη μεταγραφής του DNA, οξεόφιλο κυτταρόπλασμα και μικρό ποσό αδρού ενδοπλασματικού δικτύου. Οι ινοβλάστες συνθέτουν πρωτεΐνες, όπως είναι το τροποκολλαγόνο και η τροποελαστίνη που σχηματίζουν τις κολλαγόνες, τις ελαστικές και τις δικτυωτές ίνες καθώς και τις γλυκοζαμινογλυκάνες, τις πρωτεογλυκάνες και τις γλυκοπρωτεϊνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, ενώ συμμετέχουν και στην παραγωγή των αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι επηρεάζουν την αύξηση και τη διαφοροποίηση. Είναι εξαιρετικά ανθεκτικά κύτταρα σε ερεθίσματα, τα οποία προκαλούν καταστρο- 38

39 φή και σκοτώνουν τα περισσότερα άλλα είδη κυττάρων, όπως τα νευρικά, τα επιθηλιακά ή τα μυϊκά κύτταρα. Επίσης, παίζουν σπουδαίο ρόλο στην επανόρθωση του αλλοιωμένου ιστού, παίζοντας πρωταρχικό και κυρίαρχο ρόλο στην επούλωση του τραύματος. [3] Εικόνα 4: Ενεργός ινοβλάστης (αριστερά) και ινοβλάστης σε φάση ηρεμίας (δεξιά). Παρουσιάζονται τα εξωτερικά μορφολογικά χαρακτηριστικά και η υπερμικροσκοπική δομή κάθε κυττάρου. Οι ενεργοί ινοβλάστες που παρουσιάζουν έντονη πρωτεϊνοσύνθεση είναι πλουσιότεροι σε μιτοχόνδρια, σταγονίδια λιπιδίων, συσκευή Golgi και αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, σε σύγκριση με τους ινοβλάστες που βρίσκονται σε φάση ηρεμίας. (Από L. Junqueira - J.Carneiro, Basic Histology) Α.2.4. H εξωκυττάρια ουσία Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία εξωκυττάριο στρώμα (ECM ή extracellular matrix), αποτελεί δυναμικό, συνεχώς αναδιαμορφούμενο μακρομοριακό σύμπλεγμα που συντίθεται τοπικά και συνεισφέρει στη δομή και τη λειτουργία του δέρματος. Αποτελείται κυρίως από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες. Οι πολυσακχαρίτες που κυρίως βρίσκονται στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία είναι οι γλυκοζαμινογλυκάνες, οι οποίες συνδέονται με πρωτεΐνες για να σχηματίσουν πρωτεογλυκάνες. Οι πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας χωρίζονται σε δομικές και πρωτεΐνες που έχουν ρόλο σύνδεσης με άλλα μόρια. Οι δομικές πρωτεΐνες είναι κατά κύριο λόγο το κολλαγόνο, η ελαστίνη και οι δικτυωτές ίνες, ενώ από τις πρωτεΐνες σύνδεσης ανευρίσκονται η ινονεκτίνη (ινωδονεκτίνη ή φιμπρονεκτίνη ή ινοσυνεκτίνη), η λαμινίνη και μικρές γλυκοπρωτεΐνες, όπως οι σελεκτίνες και οι καντχερίνες. 39

40 Οι πρωτεΐνες σύνδεσης είναι απαραίτητες για την αλληλεπίδραση των κυττάρων μεταξύ τους, την αλληλεπίδραση κυττάρου-εξωκυττάριου στρώματος και τη λειτουργική σύνδεση δέρματος και βασικής μεμβράνης. [10] Η σύσταση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας έχει επίδραση στη μετανάστευση, το σχήμα, στην απόπτωση, στη σύνδεση και στην πολικότητα των κυττάρων. Η σύνδεση του δέρματος με τη βασική μεμβράνη είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη νοσολογία του δέρματος και έχει μεγάλη σημασία και για τη γήρανσή του. Στη σύνδεση αυτή και στον σχηματισμό της βασικής μεμβράνης έχουν μεγάλη εμπλοκή και τα μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όπως φαίνεται στην Εικ.5. Εικόνα 5: Σχηματική απεικόνιση των μηχανισμών με τους οποίους οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και αυξητικών παραγόντων μπορούν να ε- πηρεάσουν την ανάπτυξη, την κινητικότητα, τη διαφοροποίηση και την πρωτεϊνοσύνθεση των κυττάρων. (Από Robbins. Basic Pathology.) 40

41 Η σύσταση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας έχει επίδραση στη μετανάστευση, το σχήμα, στην απόπτωση, στη σύνδεση και στην πολικότητα των κυττάρων. Η σύνδεση του δέρματος με τη βασική μεμβράνη είναι ιδιαίτερα σημαντική για τη νοσολογία του δέρματος και έχει μεγάλη σημασία και για τη γήρανσή του. Στη σύνδεση αυτή και στον σχηματισμό της βασικής μεμβράνης έχουν μεγάλη εμπλοκή και τα μόρια της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας όπως φαίνεται στην Εικ.5. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία στην περιοχή του τραύματος έχει διαφορετική σύσταση από αυτήν του φυσιολογικού συνδετικού ιστού. Αρχικά σχηματίζεται από ινική και ινονεκτίνη, ουσίες που είναι αποτέλεσμα της αιμόστασης ή προέρχονται από τα μακροφάγα. [19] Στη συνέχεια, παράγονται από τους ινοβλάστες στην περιοχή του τραύματος, δομικές και συγκολλητικές πρωτεΐνες, καθώς και πολυσακχαρίτες. Η εξωκυττάρια ουσία, εκτός του ότι αποτελεί υποστηρικτικό υπόστρωμα, τροποποιεί τη συμπεριφορά των κυττάρων που έρχονται σε επαφή με αυτή και ενισχύει τη διάχυση θρεπτικών και μεταβολικών παραγόντων. Η συμβολή της στην ανάπτυξη, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και τον μεταβολισμό των κυττάρων είναι καθοριστική για την επούλωση του τραύματος. Α Ο ρόλος της εξωκυττάριας ουσίας Οι λειτουργίες της εξωκυττάριας ουσίας εκτείνονται πολύ πέρα από την πλήρωση του κενού χώρου γύρω από τα κύτταρα και περιλαμβάνουν: [19,20,21] Mηχανική υποστήριξη για την καθήλωση των κυττάρων. Όταν δεν υπάρχει προσκόλληση, οι περισσότεροι ιστοί πεθαίνουν. Καθορισμό του προσανατολισμού του κυττάρου (πολικότητα). Η διάκριση της πλαγιοβασικής (κάτω) από την κορυφαία (άνω) επιφάνεια είναι σημαντική για τα περισσότερα κύτταρα, από άποψης λειτουργίας (π.χ απορρόφηση θρεπτικών συστατικών από το γαστρεντερικό σωλήνα ή απελευθέρωση πεπτικών ενζύμων στο πάγκρεας). Ελεγχο της αύξησης των κυττάρων. Η αύξηση και η διαφοροποίηση ρυθμίζονται από την προσκόλληση και το σχήμα των κυττάρων. Σε γενικές γραμμές, όσο μεγαλύτερη είναι η ικανότητα προσκόλλησης ενός κυττάρου, τόσο ταχύτερος είναι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού του. Διατήρηση της διαφοροποίησης των κυττάρων. [22] Ο τύπος των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας επηρεάζει επίσης τον βαθμό διαφοροποίησης. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η ίδια, από άποψης σύνθεσης εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, μπορεί να έχει διαφορετικές επιδράσεις, ανάλογα με το μηχανικό πλαίσιο στο οποίο παρουσιάζεται (δηλαδή εύκαμπτο ή άκαμπτο). 41

42 Παροχή σκελετού μηχανικής υποστήριξης για την αναγέννηση των ιστών. Όλοι οι ιστοί αποτελούν δυναμικά ανανεούμενες δομές και η διατήρηση της φυσιολογικής δομής απαιτεί την παρουσία σκελετού από βασική μεμβράνη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρόλο που και τα ασταθή και τα σταθερά κύτταρα διαθέτουν ικανότητα αναγέννησης, ο τραυματισμός αυτών δεν οδηγεί πάντοτε στην αποκατάσταση της φυσιολογικής δομής. Η ακεραιότητα των υποκείμενων στρωματικών και παρεγχυματικών κυττάρων και ι- διαίτερα της βασικής μεμβράνης, είναι απαραίτητη για την οργανωμένη αναγέννηση των ιστών. Στις περιπτώσεις διάσπασης της βασικής μεμβράνης, τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται με τυχαίο τρόπο, με αποτέλεσμα τη δημιουργία αποδιοργανωμένου, μη λειτουργικού ιστού. Εκτεταμένη βλάβη ασταθών ή σταθερών ιστών έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ουλής, λόγω επέκτασης ινοβλαστικών (μεσεγχυματικών) πληθυσμών. Εικόνα 6: Σχηματική παρουσίαση των κύριων συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM), περιλαμβανομένων των διαφόρων τύπων κολλαγόνου, των πρωτεογλυκανών και των προσκολλητικών γλυκοπρωτεϊνών. (Από Robbins Basic Pathology.) Καθορισμό του μικροπεριβάλλοντος των ιστών. Η βασική μεμβράνη δρα ως φραγμός μεταξύ του επιθηλίου και του υποκείμενου συνδετικού ιστού, ενώ παράλληλα αποτελεί μέρος της συσκευής διήθησης του νεφρού. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία αποτελεί επίσης τον σκελετό που χρησιμοποιούν τα φλεγμονώδη κύτταρα για τη μετακίνησή τους, με σκοπό την αναζήτηση λοιμωδών παραγόντων. 42

43 Αποθήκευση και παρουσίαση ρυθμιστικών μορίων. Για παράδειγμα, ο παράγοντας αύξησης των ινοβλαστών (FGF) εκκρίνεται και αποθηκεύεται στη βασική μεμβράνη σε φυσιολογικούς ιστούς. Αυτό επιτρέπει την ταχεία διαθεσιμότητά του με σκοπό τη διέγερση της κυτταρικής αύξησης σε περιπτώσεις εντοπισμένης ιστικής βλάβης. Επιπλέον η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία λαμβάνει μέρος στον κυτταρικό θάνατο [23] καθώς και στην υποβοήθηση της αύξησης και της ωρίμανσης των νευραξόνων. [24] Ένας αριθμός αλληλεπιδράσεων μεταξύ της ECM και των κυττάρων, αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την ομοιόσταση. [25] Α Τα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας Τα βασικά συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας περιλαμβάνουν: ινώδεις δομικές πρωτεΐνες (κολλαγόνο, ελαστίνη) οι οποίες προσδίδουν στους ιστούς ανθεκτικότητα σε δυνάμεις τάσης και ελαστικότητα, ενυδατωμένες γέλες πολυσακχαρίτες (γλυκοζαμινογλυκάνες, πρωτεογλυκάνες) που προσδίδουν παραμορφωσιμότητα, λιπαντικές ιδιότητες, προσκολλητικές γλυκοπρωτεΐνες (ινονεκτίνη, λαμινίνη), οι οποίες συνδέουν τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μεταξύ τους, αλλά και με κύτταρα και πρωτεολυτικά ένζυμα, δηλαδή τις μεταλλοπρωτεϊνάσες. (Εικ.6) Α α. Κολλαγόνο Tα κολλαγόνα είναι μία μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών που συνδέονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ινίδια, μικροϊνίδια ή δίκτυα τα ο- ποία στη συνέχεια συνεργάζονται με άλλες πρωτεΐνες για να προσφέρουν στήριξη στην εξωκυττάρια ουσία. (Εικ.7) Αποτελούν δομικές πρωτεΐνες που προσδίδουν ανθεκτικότητα σε δυνάμεις τάσης και αποτελούν μείζον συστατικό του συνδετικού ιστού που σχηματίζεται κατά την επούλωση του τραύματος. [1,6,11] Το κολλαγόνο παράγεται από τους ινοβλάστες και το μόριό του χαρακτηρίζεται από την παρουσία της σταθερά επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας γλυκίνης (33%) προλίνης (12%) υδροξυπρολίνης (10%), τριών διαφορετικών πεπτιδικών αλυσίδων, οι οποίες διαπλέκονται, σχηματίζοντας σχοινοειδή έλικα. Οι επιμέρους αλυσίδες διαθέτουν την ικανότητα ισχυρής σύνδεσης μεταξύ τους λόγω της παρουσίας γλυκίνης σε κάθε τρίτη θέση αμινοξέος. Μεταλλάξεις που οδηγούν σε αντικατάσταση της γλυκίνης από άλλα αμινοξέα ή οποιαδήποτε άλλη διαταραχή που απολήγει σε ελαττωματική σύζευξη των πεπτιδικών αλυσίδων, έχουν ως αποτέλεσμα την ελαττωματική σύνδεση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, με καταστροφικές συνέπειες για τα οστά, το δέρμα, την αορτή και άλλους ιστούς. [7,10] Η σύνθεση του κολλαγόνου γίνεται ως εξής: [26,27] 1. Oι πολυπεπτιδικές αλυσίδες του πρωτοκολλαγόνου συναρμολογούνται 43

44 στα πολυριβοσωμάτια του ενδοπλασματικού δικτύου των μεμβρανών των ινοβλαστών. 2. Γίνεται υδροξυλίωση της προλίνης και της λυσίνης, όταν τα αμινοξέα αυτά βρίσκονται στην πολυπεπτιδική-πρόδρομη μορφή του κολλαγόνου, το προκολλαγόνο. Ελεύθερες υδροξυπρολίνη και υδροξυλυσίνη δεν συνδέονται απευθείας στις αλυσίδες του κολλαγόνου. Τα ένζυμα που προάγουν την υδροξυλίωση είναι η υδροξυλάση της προλίνης και η υδροξυλάση της λυσίνης, ενώ καθοριστικός είναι και ο ρόλος της βιταμίνης C. 3. Η προσθήκη των υδατανθράκων στην υδροξυλυσίνη γίνεται με την υδροξυλίωσή της. Όλοι οι τύποι κολλαγόνου έχουν διάφορα ποσά από υδατάνθρακες, ενωμένα με υδροξυλυσίνη. 4. Δημιουργούνται δισουλφιδικοί δεσμοί ανάμεσα στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες. 5. Δημιουργείται η διπλή άλυσος από δύο α 1 και μία α 2 πεπτιδικές αλύσους. Έτσι σχηματίζεται το τροποκολλαγόνο, το οποίο συγκεντρώνεται σε κυστίδια και δια των μικροσωληναρίων μεταφέρεται στην επιφάνεια του κυττάρου. 6. Στον εξωκυττάριο χώρο το τροποκολλαγόνο μετατρέπεται σε κολλαγόνο με τη δράση των καρβοξυ και αμινο-προπεπτιδασών. Η πρωτεϊνική ομάδα που αυτοπολυμερίζεται και σχηματίζει κολλαγόνα μικροϊνίδια, είναι ένα μακρομόριο που ονομάζεται τροποκολλαγόνο και έχει μήκος 280 nm και πλάτος 1,5 nm. Το τροποκολλαγόνο αποτελείται από τρεις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, δύο α 1 και μία α 2.Τα μικροϊνίδια του κολλαγόνου ενώνονται πρώτα σε ινίδια και μετά με μία συγκολλητική ουσία που περιέχει υδατάνθρακες και ενώνει τις ίνες, σε δεσμίδες κολλαγόνου Περισσότερες από 30 διακριτές αλυσίδες σχηματίζουν περίπου 18 διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου, κάποιοι από τους οποίους είναι μοναδικοί για ορισμένα κύτταρα και ιστούς. Παράγονται από διαφορετικά γονίδια και συνδεόμενες μεταξύ τους δημιουργούν τους διαφορετικούς τύπους κολλαγόνου. Τα κολλαγόνα μπορούν να διαιρεθούν σε διάφορες οικογένειες ανάλογα με τους τύπους δομών που σχηματίζουν: Iνιδικά κολλαγόνα: Τύποι I, II, III, V, XI Κολλαγόνα συνδεδεμένα με ινίδια με διακεκομμένη τριπλή έλικα: Tύποι IX, XII, XIV Κολλαγόνα βραχείας αλύσου : Τύποι VIII, X Κολλαγόνα βασικής μεμβράνης: Τύπος IV Αλλά κολλαγόνα: Τύποι VI, VII, XIII. 44

45 Εικόνα 7: Σχηματική απεικόνιση της συνδέσεως μορίων αγγρεκάνης με κολλαγόνες ίνες. Η ένθετη εικόνα παριστάνει σε μεγαλύτερη μεγέθυνση το μόριο της αγγρεκάνης, δείχνοντας την αξονική πρωτεΐνη του πρωτεογλυκανικού μορίου στην οποία προσφύονται οι γλυκοζαμινογλυκάνες. Η αξονική πρωτεΐνη προσφύεται στο υαλουρονικό οξύ μέσω των συνδετικών πρωτεϊνών. (Τροποποιημένο σχέδιο από το βιβλίο του Fawcett DW: Bloom and Fawcett s A textbook of Histology.) Τα κολλαγόνα τύπου Ι, ΙΙ και ΙΙΙ σχηματίζουν σχοινιοειδή ινίδια και αποτελούν την κύρια μορφή του ινιδικού κολλαγόνου. Στο φυσιολογικό δέρμα επικρατεί ο τύπος Ι (80-90%) έναντι του τύπου ΙΙΙ (10-20%). Κατά τη διάρκεια της επούλωσης στον κοκκιώδη ιστό ο τύπος ΙΙΙ απαντάται σε αναλογία 30%, ενώ στην ώριμη ουλή σε ποσοστό 10%. Κατά τη διάρκεια της επούλωσης συμβαίνει τόσο σύνθεση κολλαγόνου, όσο και αποδόμησή του, σε μία δυναμική ισορροπία. Για την αποδόμηση του κολλαγόνου είναι υπεύθυνες οι κολλαγενάσες, ένζυμα που εκκρίνονται από τα μακροφάγα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες. Ο έλεγχος της παραπάνω διαδικασίας γίνεται από τους αυξητικούς παράγοντες που σχετίζονται με τη διαδικασία της ε- πούλωσης. [28] Ο παράγοντας TGF-β1 προάγει τη σύνθεση κολλαγόνου από τους 45

46 ινοβλάστες, ενώ παράλληλα ελαττώνει τη δράση της κολλαγενάσης που ταυτόχρονα με την αποδόμηση του κολλαγόνου «καθαρίζει» την περιοχή του τραύματος από τις κατεστραμμένες ή άχρηστες ίνες του κολλαγόνου. Καθώς η διαδικασία της ε- πούλωσης προχωρά, υπερισχύει η εναπόθεση του κολλαγόνου έναντι της αποσύνθεσής του, ενώ γίνεται και αντικατάσταση του κολλαγόνου τύπου ΙΙΙ από κολλαγόνο τύπου Ι. Μερικοί τύποι κολλαγόνου (π.χ οι τύποι Ι, ΙΙΙ και V) σχηματίζουν ινίδια με πλάγια διασταυρούμενη σύνδεση των τριπλών ελίκων, ενώ άλλοι (π.χ ο τύπος ΙV) δεν σχηματίζουν ινίδια (μη ινώδεις), αθροίζονται υπό τη μορφή πολυγωνικού πλέγματος και αποτελούν συστατικό των βασικών μεμβρανών. Το κολλαγόνο τύπου VIII σχηματίζει ένα εξάγωνο πλέγμα στη μεμβράνη του Descemet στον κερατοειδή χιτώνα του οφθαλμού. Η ανθεκτικότητα του ινιδικού τύπου κολλαγόνου σε δυνάμεις τάσης απορρέει από τη διασταυρούμενη σύνδεση μεταξύ των συστατικών τους, διεργασία που ε- ξαρτάται από τη βιταμίνη C. Έτσι, παιδιά με ανεπάρκεια ασκορβικού οξέος, αιμορραγούν εύκολα λόγω δομικών διαταραχών της βασικής μεμβράνης των αγγειακών τοιχωμάτων τους και εμφανίζουν μειωμένη ικανότητα επούλωσης. Α β. Ελαστίνη Παρά το γεγονός ότι η ανθεκτικότητα σε δυνάμεις τάσης προέρχεται από τα ινώδη κολλαγόνα, η ελαστικότητα των ιστών, που έχει ως αποτέλεσμα την επάνοδο στη βασική τους θέση έπειτα από την επίδραση φυσικών παραγόντων, οφείλεται στην παρουσία ελαστικού ιστού. Ο ιστός αυτός, κύριο συστατικό των ελαστικών ινών, αποτελεί ουσιώδες συστατικό των τοιχωμάτων των μεγάλων αγγείων (που πρέπει να διαθέτουν την ικανότητα προσαρμογής στην επαναλαμβανόμενη σφύζουσα ροή), αλλά και της μήτρας, του δέρματος και των συνδέσμων. [1,6,7] Εικόνα 8: Σχηματική απεικόνιση της ελαστικής ίνας. Η άμορφη ελαστίνη περιβάλλεται από μικροϊνίδια. (Από Gartner-Hiatt, Color Textbook of Histology) 46

47 Η ελαστίνη είναι μία υδρόφοβη πρωτεΐνη, τα μόρια της οποίας είναι συνδεδεμένα ομοιοπολικά, διατάσσονται σε στίχους, οι οποίοι μπορούν να εκπτυχθούν και να επανασυσπειρωθούν και διασυνδέονται διαμέσου εγκάρσιων δεσμών σχηματίζοντας ίνες και έλυτρα. Η ελαστίνη η οποία εμφανίζει μία τυχαία σπειροειδή διάταξη σε κατάσταση χάλασης εκπτύσσεται μετά από έκταση. Σε μία όμως εκ νέου χάλαση σχηματίζεται ένα διαφορετικό σπείραμα. Παράγεται από τους ινοβλάστες στο δέρμα, ενώ στους τένοντες και στα αγγεία παράγεται από τις λείες μυϊκές ίνες. [29] Η ελαστικότητα των ιστών οφείλεται στην αλληλεπίδραση ελαστίνης-φιμπριλλίνης, μιας πρόσφατα αναγνωρισμένης γλυκοπρωτεΐνης που σχηματίζει ινίδια. Τα μικροϊνίδια φιμπριλλίνης, διαμέτρου 6-12nm, είναι υπεύθυνα για την οργάνωση της εκκρινόμενης ελαστίνης, έτσι ώστε η τελευταία να αποτελεί τον κεντρικό πυρήνα που περιβάλλεται από τα μικροϊνίδια της φιμπριλλίνης. (Εικ.8) Όπως και στην περίπτωση του κολλαγόνου, οι ελαστίνες απαιτούν την παρουσία γλυκίνης σε κάθε τρίτη θέση αμινοξέος, διαφέρουν όμως από τα κολλαγόνα, λόγω της παρουσίας μικρότερου αριθμού διασταυρούμενων συνδέσεων. Μεταλλάξεις στα γονίδια της φιμπριλλίνης οδηγούν σε σκελετικές ανωμαλίες και εξασθένηση των τοιχωμάτων της αορτής (σύνδρομο Marfan). Α γ. Γλυκοζαμινογλυκάνες και πρωτεογλυκάνες Τα μόρια αυτά σχηματίζουν συμπιέσιμες γέλες, με υψηλό βαθμό ενυδάτωσης, προσφέροντας στους ιστούς την ικανότητα παραμόρφωσης και λιπαντικές ιδιότητες (όπως στην περίπτωση του αρθρικού χόνδρου). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες (glycosaminoglycans, GAGs) είναι όξινοι, γραμμικοί ετεροπολυσακχαρίτες, που περιέχουν μία επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα, η οποία αποτελείται από μία Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη ή ακετυλογαλακτοζαμίνη και από ένα γλυκουρονικό ή ιδουρονικό οξύ. (Εικ.9) ~1 nm ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΟ/ ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛΟΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ/ ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΙΝΗ Εικόνα 9: Η επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα από την οποία αποτελούνται οι γλυκοζαμινογλυκάνες. 47

48 Εξαιτίας του καρβοξυλικού οξέος και των σουλφυδρυλικών ομάδων, οι GAGs είναι ιδιαίτερα αρνητικά φορτισμένες, ιδιότητα που προσδίδει σ αυτές την ικανότητα να ελκύουν κατιόντα, κυρίως νατρίου και να τις επιτρέπουν να κατακρατούν μεγάλες ποσότητες ύδατος. Αυτό προσδίδει στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία τη δυνατότητα αντοχής σε συμπιεστικές δυνάμεις, σε αντίθεση με το κολλαγόνο που προσδίδει α- ντοχή σε εκτατικές δυνάμεις. Οι GAGs ανάλογα με τη σύστασή τους, τον τύπο του δεσμού μεταξύ των σακχάρων, το μήκος τους, τον αριθμό και τη θέση των σουλφυδρυλικών ομάδων, διακρίνονται στο υαλουρονικό οξύ, την ηπαρίνη/θειϊκή ηπαράνη, τη θειϊκή χονδροϊτίνη, τη θειϊκή δερματάνη και τη θειϊκή κερατάνη. (Εικ.10) Τα πολυμερή των GAGs είναι ιδιαίτερα μεγάλα με μοριακή μάζα από Da σε σύγκριση με το κολλαγόνο με μοριακή μάζα Da. 6 ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ ΗΠΑΡΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ Εικόνα 10: Δομή γλυκοζαμινογλυκανών. Oι GAGs αποτελούν τους πιο άφθονους πολυσακχαρίτες στον οργανισμό. Είναι μόρια τα οποία εμφανίζουν εξαιρετική ποικιλομορφία λόγω του εκλεκτικού ε- πιμερισμού τους, των σουλφυδριλικών ομάδων που περιέχουν αλλά και του διαφορετικού μεγέθους του τελικού πολυσακχαρίτη και ανιχνεύονται στους ιστούς με διαφορετική κατανομή. (Πίνακας 1) Ο ρόλος τους είναι πολλαπλός και σχετίζεται άμεσα με τον ιστό στον οποίο ανιχνεύονται. Για παράδειγμα, λόγω της πυκνότητας του αρνητικού τους φορτίου, 48

49 σχηματίζουν ένα ιδιαίτερα ενυδατωμένο κολλοειδές υπόστρωμα, που απορροφά δυνάμεις πιέσεως προσδίδοντας έτσι το χαρακτηριστικό της αντοχής σε πίεση και διαμορφώνοντας τις μηχανικές ιδιότητες του συνδετικού ιστού. Βοηθούν επίσης, στην οργάνωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, συνδέοντας μεταξύ τους βασικά συστατικά όπως το κολλαγόνο, τη λαμινίνη και την ινονεκτίνη. GAGs ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ (Da) ΕΠΑΝΑΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΟΣ ΔΙΣΑΚΧΑΡΙΤΗΣ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΣΤΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ 4-ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ 6-ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ Χ ΗΠΑΡΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D-ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D-ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΙΝΗ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D-ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΙΝΗ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D-ΓΑΛΑΚΤΟΖΑΜΙΝΗ ή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΌ ΟΞΥ - N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ ή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ D-ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ N-ΑΚΕΤΥΛ-D- ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ ή L-ΙΔΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ D-ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ N-ΑΚΕΤΥΛ-D-ΓΛΥΚΟΖΑΜΙΝΗ ΔΕΡΜΑ, ΑΡΘΡΙΚΟ ΥΓΡΟ, ΥΑΛΟΕΙΔΕΣ, ΧΟΝΔΡΟΣ ΔΕΡΜΑ, ΟΣΤΑ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ ΔΕΡΜΑ, ΟΣΤΑ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ ΔΕΡΜΑ, ΑΓΓΕΙΑ, ΚΑΡΔΙΑ, ΚΑΡΔΙΑΚΕΣ ΒΑΛΒΙΔΕΣ ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ, ΑΡΤΗΡΙΕΣ, ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ, ΗΠΑΡ, ΔΕΡΜΑ, ΜΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ ΧΟΝΔΡΟΣ, ΚΕΡΑΤΟΕΙΔΗΣ, ΟΣΤΑ Πίνακας 1: Οι GAGs με τα χαρακτηριστικά και την ιστική κατανομή τους Ελέγχουν επίσης τη διάχυση των θρεπτικών ουσιών, των μεταβολιτών, των ορμονών και των παραγόντων αύξησης, ενώ συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων με άλλα κύτταρα και με την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, ρυθμίζοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική μετανάστευση και την κυτταρική διαφοροποίηση. [30,31] Οι κυριότερες γλυκοζαμινογλυκάνες στο δέρμα είναι το υαλουρονικό οξύ, η θειϊκή δερματάνη και οι θειϊκές χονδροϊτίνες. Το υαλουρονικό οξύ. Η πιο απλή γλυκοζαμινογλυκάνη σε δομή, είναι ένα τεράστιο μόριο αποτελούμενο από επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα γλυκουρονικού οξέος και Ν-ακετυλο-γλυκοζαμίνης και αποτελεί τη μοναδική γλυκοζαμινογλυκάνη η οποία δεν περιέχει θειϊκές ομάδες. Επίσης είναι η μοναδική γλυκοζαμινογλυκάνη που εντοπίζεται ελεύθερη και δεν συνδέεται με πρωτεϊνικό κορμό σχηματίζοντας πρωτεογλυκάνες, έχει όμως την ικανότητα να συνδέει μεταξύ τους 49

50 πολλά μόρια πρωτεογλυκανών, σχηματίζοντας χαρακτηριστικά συσσωματώματα πρωτεογλυκανών με τεράστιο μοριακό βάρος. (Εικ.11) Εικόνα 11: Το μοντέλο της δομής του υαλουρονικού οξέος στο εξωκυττάριο στρώμα. Αποτελείται από πολλαπλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες δισακχαριτών. Το υαλουρονικό οξύ είναι κύριο συστατικό της βασικής μεμβράνης και εντοπίζεται τυπικά ως υψηλού μοριακού μεγέθους πολυμερές της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Τα πολυμερή του συνδέονται με μεγάλο όγκο νερού, ιδιότητα που το καθιστά εξαιρετικό λιπαντικό και ιδανικό για την απορρόφηση κραδασμών, ενώ συμβάλλει και στην ενυδάτωση των ιστών καθώς και στην ομοιόσταση του νερού. Εξαιτίας των φυσικοχημικών του ιδιοτήτων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση, ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων και κατ επέκταση στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και μορφογένεση των ιστών. Επιπλέον μικρού μοριακού βάρους υαλουρονικό οξύ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της φλεγμονής. Πρωταρχικά συντίθεται από μεσεγχυματικά κύτταρα, καθώς είναι απαραίτητο συστατικό για τη συγκρότηση του στρώματος του συνδετικού ιστού. Συμμετέχει στην ενυδάτωση [32] και στην επιδιόρθωση των ιστών, καθώς και στην προστασία απέναντι σε μολύνσεις και στα πρωτεολυτικά ένζυμα των κοκκιοκυττάρων. [33] Σε αντίθεση με τις άλλες GAGs που συντίθενται στη συσκευή Golgi, το υαλουρονικό οξύ συντίθεται στην εσωτερική επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης [34] από τις τρεις συνθετάσες του υαλουρονικού οξέος (HAS1, HAS2, HAS3) που εμφανίζουν διαφορετικές ενζυμικές ιδιότητες και συνθέτουν μόρια υαλουρονικού ο- ξέος διαφορετικού μεγέθους [35] και αποδομείται από ειδικά ένζυμα, τις υαλουρονιδάσες. Το υαλουρονικό οξύ μετά τη σύνθεσή του, αλλά και κατά τη διάρκεια της σύνθεσής του, λόγω του μεγάλου μεγέθους του εξωθείται στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. [36] Μετά την αποδέσμευσή του από τις συνθετάσες, συνδέεται ειδικά με υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και με μεγάλη ποικιλία πρωτεϊνών, όπως οι πρωτεΐνες σύνδεσης, η βερσικάνη και ο ΤΝF-6 (tumor necrosis factor-induced gene-6). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές υαλουρονικού οξέος - πρωτεϊνών επιτρέπουν τη δημιουργία του δικτύου της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. [37] Πολλές μελέτες α- πέδειξαν πως η βιολογική δράση του υαλουρονικού οξέος διαφέρει ανάλογα με τη μοριακή του μάζα. [32,38] Σε φυσιολογικές συνθήκες το υαλουρονικό οξύ έχει υψηλή μοριακή μάζα της τάξης των 1000kDa. Μετά όμως από τραυματισμό των ιστών παρατηρείται ενδο- 50

51 κυτταρική ή εξωκυτταρική αποδόμησή του [39] που οδηγεί στη δημιουργία μικρότερης μοριακής μάζας τμημάτων υαλουρονικού οξέος της τάξης των 250kDa, τα ο- ποία μπορούν να επάγουν τη μεταγραφή RNA διαφόρων κυτταροκινών από ενεργοποιημένα μακροφάγα, [40] ενώ τα υψηλού μοριακού βάρους μόρια υαλουρονικού οξέος έχουν ακριβώς το αντίθετο αποτέλεσμα. Η αποδόμηση της μεγάλης μοριακής μάζας μορίων υαλουρονικού οξέος σε μικρότερης μοριακής μάζας σε συνθήκες φλεγμονής, ανάπτυξης όγκου ή ιστικού τραυματισμού, συντελείται μέσω δράσης των υαλουρονιδασών ή οξειδωτικής αποδόμησης. [41] Η θειϊκή δερματάνη αποτελεί άλλη μία γλυκοζαμινογλυκάνη της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που ονομάζεται και θειϊκή χονδροϊτίνη Β. Σχηματίζεται από μια επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα ιδουρονικού οξέος και Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνης, η οποία φέρει θειϊκές ομάδες. (Εικ. 12) Η θειϊκή δερματάνη έχει την ικανότητα να συνδέεται με πολλές πρωτεογλυκάνες, όπως επίσης και να επιδρά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τρόπο εξειδικευμένο.[42,43] Εικόνα 12: Το μοντέλο της δομής της θειϊκής δερματάνης στο εξωκυττάριο στρώμα. Αποτελείται από ε- παναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα ιδουρονικού οξέος και Ν-ακετυλο-γαλακτοζαμίνης. Η θειϊκή δερματάνη μπορεί και σχηματίζει την πρωτεογλυκάνη ντεκορίνη ό- ταν συνδεθεί με ένα μικρό πρωτεϊνικό κορμό. Η ντεκορίνη ρυθμίζει τη συνάθροιση του κολλαγόνου στον εξωκυττάριο χώρο. Ίνες κολλαγόνου συνδέονται με τη ντεκορίνη και ανάλογα με το μήκος της θειϊκής δερματάνης ρυθμίζεται η απόσταση μεταξύ των ινών του κολλαγόνου. Είναι γνωστό ότι το μήκος της αλυσίδας της θειϊκής δερματάνης μειώνεται με τη γήρανση. [44] Έτσι η θειϊκή δερματάνη γεφυρώνει το χάσμα μεταξύ των ινών κολλαγόνου, σταθεροποιώντας τον εξωκυττάριο χώρο ενάντια στο μηχανικό stress. [45] Τέλος το μόριο της θειϊκής δερματάνης ρυθμίζει τη λειτουργία των μεταγραφικών παραγόντων, ενώ λειτουργεί και ως μόριο συγκόλλησης στον ανθρώπινο οργανισμό για πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς. [46] Θειϊκές χονδροϊτίνες. Είναι μία ομάδα γλυκοζαμινογλυκανών που αποτελούνται από επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα γλυκουρονικού οξέος και Ν- ακετυλο-γαλακτοζαμίνης, η οποία φέρει θειϊκές ομάδες. Ανάλογα με τη θέση της θειϊκής ομάδας καθορίζεται η δομή και η λειτουργία τους μέσω των διαφορετικών μοτίβων σύνδεσης που δημιουργούνται με άλλα μακρομόρια. Οι θειϊκές χονδροϊτίνες ενεργοποιούν αποδομητικά ένζυμα της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως εί- 51

52 ναι οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, αποτελώντας ρυθμιστικό παράγοντα στην ενεργοποίηση και αποδόμηση των πρωτεϊνών. [47,48] Η λειτουργία τους εξαρτάται από τη θέση των θειϊκών ομάδων που προσδιορίζει τη δομή τους και τα χαρακτηριστικά σύνδεσής τους με άλλα μόρια. Αξίζει ακόμα να αναφερθεί πως παίζουν ε- νεργό ρόλο στην αναδόμηση των ιστών, στην ανάπτυξη των όγκων και στη μετάστασή τους, [49] ενώ σημαντική είναι και η συμβολή τους στη λίπανση των αρθρώσεων. [50,51,52,53] (Εικ 13) Εικόνα 13: Το μοντέλο της δομής της θειϊκής χονδροϊτίνης στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Αποτελείται από επαναλαμβανόμενη δισακχαριτική μονάδα γλυκουρονικού οξέος και Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνης, η οποία φέρει θειϊκές ομάδες. Θειϊκή ηπαράνη Εντοπίζεται σε όλο τον οργανισμό, στην επιφάνεια των κυττάρων, στη βασική μεμβράνη και στο εξωκυττάριο στρώμα. (Εικ.14) Η σύνδεσή της με την ενδοστατίνη είναι σημαντική για την αντιαγγειογενετική της δράση. [54] Σε σχέση με την ηπαρίνη εμφανίζει διαφορετικό ποσοστό θειϊκών ομάδων σε κάθε μόριο (λιγότερο από 30%, ενώ η ηπαρίνη Ν-θειωμένη περισσότερο από 70%). [54,55] Εικόνα 14: Το μοντέλο της δομής της θειϊκής ηπαράνης στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Ο πολυσακχαρίτης αυτός αλληλεπιδρά ειδικά μη ομοιοπολικά με διάφορες πρωτεΐνες, επηρεάζοντας τον τοπογραφικό προορισμό, τη διάρκεια ζωής και τη βιοενεργότητα της πρωτεΐνης. Ακόμα δρα στη μορφογένεση, ανάπτυξη και οργανογένεση. Τέλος συμμετέχει σε βιολογικές διαδικασίες, όπως αλληλεπιδράσεις κυττάρων με τον εξωκυττάριο χώρο, ενώ ενεργοποιεί χημοκίνες, ένζυμα και αυξητικούς παράγοντες. [56,57] Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση του FGF, καθώς διευκολύνει και σταθεροποιεί τη σύνδεσή του με τον υποδοχέα του. [58] 52

53 Επιπρόσθετα, συνδέεται με τον FGF στην εξωκυττάρια ουσία, διατηρώντας τη σε ανενεργή μορφή, μέχρις ότου χρειαστεί, ρυθμίζοντας έτσι την άμεση απάντηση σε κάποιο ερέθισμα. Αλληλεπιδρά με κυτοκίνες (IL -5, -6, -8, -10, TNF-a, παράγοντας αιμοπεταλίων-4) [59,60,61] και με πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, δηλαδή ινονεκτίνη, κολλαγόνο, λαμινίνη με τις οποίες παίζει σημαντικό ρόλο για την ακεραιότητα της βασικής μεμβράνης. [54,55,56,57,58,59,60,61] Οι πρωτεογλυκάνες. Αποτελούν μία υπεροικογένεια που μέχρι τώρα αριθμεί πάνω από 30 μέλη με μία πληθώρα βιολογικών δράσεων. Είναι μακρομόρια που αποτελούνται από αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών, ομοιοπολικά δεσμευμένων σε μία πρωτεΐνη. Η σύνδεση γίνεται μέσω ενός ειδικού τρισακχαρίτη που περιέχει 2 γαλακτόζες και μία ξυλόζη και συνδέει τις γλυκοζαμινογλυκάνες με Ο-γλυκοσιδικό δεσμό σε μία σερίνη ή θρεονίνη της πρωτεϊνικής αλυσίδας. [62,63] (Εικ.15) ΣΕΡΙΝΗ ΞΥΛΟΖΗ ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ ΓΑΛΑΚΤΟΖΗ ΓΛΥΚΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΚΟΡΜΟΣ ΤΡΙΣΑΚΧΑΡΙΤΙΔΙΚΟΣ ΔΕΣΜΟΣ Εικόνα 15: Σχηματικό μοντέλο της σύνδεσης GAG και πρωτεΐνης. Διακρίνεται ο τρισακχαριτιδικός ειδικός δεσμός. Για τον λόγο αυτό οι πρωτεΐνες στις οποίες συνδέονται οι GAGs είναι πλούσιες σε σερίνη και θρεονίνη, γεγονός που επιτρέπει τη σύνδεση των GAGs σε πολλαπλά σημεία του πρωτεϊνικού κορμού. Έτσι, οι πρωτεογλυκάνες αποτελούνται από ένα πρωτεϊνικό κορμό από τον οποίο εκτείνονται κάθετα οι GAGs. (Εικ.16) 53

54 1 μm ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΗ ΚΟΡΜΟΣ ΣΥΝΔΕΤΙΚΕΣ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΥΑΛΟΥΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΘΕΙΙΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ (GAG) ΘΕΙΙΚΗ ΧΟΝΔΡΟΙΤΙΝΗ (GAG) Εικόνα 16: Χαρακτηριστική δομή των πρωτεογλυκανών αλλά και η δυνατότητα του υαλουρονικού οξέος να συνδέει μεταξύ τους πολλά μόρια πρωτεογλυκανών, σχηματίζοντας χαρακτηριστικά συσσωματώματα πρωτεογλυκανών. ΒΕΡΣΙΚΑΝΗ ΣΕΡΓΛΥΚΙΝΗ ΓΕΝΙΚΗ ΔΟΜΗ ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΗΣ ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ ΣΥΝΔΕΚΑΝΗ Εικόνα 17: Δομή ορισμένων από τις πιο κοινές πρωτεογλυκάνες του δέρματος, καθώς και η γενική δομή μιας πρωτεογλυκάνης για συγκριτικούς λόγους. Διακρίνεται η συνδεκάνη να είναι συνδεδεμένη με την κυτταρική μεμβράνη. 54

55 Στο δέρμα υπάρχουν διάφορες πρωτεογλυκάνες με διαφορετικά μοριακά βάρη που αποτελούνται από διάφορες γλυκοζαμινογλυκάνες. (Εικ. 17) Οι κύριες πρωτεογλυκάνες που εντοπίζονται στο ανθρώπινο δέρμα είναι η ντεκορίνη και η βερσικάνη. Αν και οι πρωτεογλυκάνες της δερμίδας βρίσκονται σε πολύ μικρές ποσότητες σε σχέση με το κολλαγόνο, όλα τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι είναι σημαντικά μόρια για τη φυσιολογία του δέρματος. Η μικρή πρωτεογλυκάνη ντεκορίνη συνδέεται με το κολλαγόνο Ι [64] και η διαταραχή της έχει ως αποτέλεσμα την παθολογική διαμόρφωση των κολλαγόνων ινών και τη μείωση της αντοχής του δέρματος. [65] Συγκεκριμένα η ντεκορίνη φαίνεται να αποτελεί ένα λειτουργικό συνδέτη, που επιτρέπει την αλληλεπίδραση μεταξύ των διαφόρων τύπων κολλαγόνου. [66] Σε αντίθεση με τις ίνες της ελαστίνης, το κολλαγόνο Ι και η ντεκορίνη φαίνεται να μειώνονται δραματικά στο φωτογηρασμένο δέρμα. [67,68] Επίσης μία αποδομημένη μορφή της ντεκορίνης, που φαίνεται να αποτελεί ένα καταβολικό προϊόν της, αυξάνεται συνεχώς στη δερμίδα με την πάροδο της ηλικίας αλλά και στη φωτογήρανση. Το καταβολικό αυτό προϊόν έχει εξαιρετικά μειωμένη ικανότητα να συνδέεται με το κολλαγόνο τύπου Ι. [69] Η βερσικάνη, μία μεγάλου μοριακού βάρους πρωτεογλυκάνη, φαίνεται να ρυθμίζεται ταυτόχρονα με τη δυστροφική ελαστίνη, με αποτέλεσμα μία σχετική αύξηση στο φωτογηρασμένο δέρμα. [69] Πέραν της παροχής συμπιεσιμότητας στους ιστούς, οι πρωτεογλυκάνες χρησιμεύουν επίσης και ως δεξαμενές αυξητικών παραγόντων που απελευθερώνονται στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (π.χ bfgf). (Εικ.18) Οποιαδήποτε βλάβη στην ECM προκαλεί απελευθέρωση του δεσμευμένου αυξητικού παράγοντα, ο ο- ποίος με τη σειρά του ενεργοποιεί τις διεργασίες επούλωσης, με την επιστράτευση φλεγμονωδών κυττάρων, ενεργοποιημένων ινοβλαστών και τον σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων. [69] Για παράδειγμα, έχει δειχθεί ότι η μικρή πρωτεογλυκάνη ντεκορίνη δρα ως εξωκυττάριος δεξαμενή για τον TGF-β ρυθμίζοντας έτσι την ενεργότητά του. Η ντεκορίνη αντιδρά με τον υποδοχέα του EGF και ενεργοποιεί με αυτό τον τρόπο τη μετάδοση σήματος από μιτογόνα, οδηγώντας σε μία ενδοκυττάρια αύξηση των επιπέδων της p21. H p21 με τη σειρά της, είναι ισχυρός αναστολέας της ενεργότητας των κινασών που εξαρτώνται από την κυκλίνη με τελικό αποτέλεσμα τη διακοπή της κυτταρικής ανάπτυξης. [70] Οι πρωτεογλυκάνες μπορεί επίσης να αποτελούν ενδογενείς πρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης, με ικανότητες τροποποίησης του δυναμικού αύξησης και διαφοροποίησης του κυττάρου. Για παράδειγμα, στη διαμεμβρανική πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής επιφάνειας, τη συνδεκάνη, προσφύονται αλυσίδες υαλουρονικού οξέος με ικανότητα σύνδεσης αυξητικών παραγόντων της θεμέλιας ουσίας, όπως 55

56 bfgf. Η σύνδεση αυτή διευκολύνει την αλληλεπίδραση του bfgf με τους αντίστοιχους κυτταρικούς υποδοχείς. (Εικ.18) Η συνδεκάνη συνδέεται επίσης με την ακτίνη του σκελετού του κυττάρου, συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της φυσιολογικής μορφολογίας των επιθηλίων. (Εικ.18) Εικόνα 18: Οι πρωτεογλυκάνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των κυττάρων χρησιμεύουν ως δεξαμενές αυξητικών παραγόντων. Η θειϊκή ηπαράνη δεσμεύεται στον βασικό αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (bfgf) που εκκρίνεται στην ECM. Επομένως, κάθε επακόλουθος τραυματισμός της ECM οδηγεί σε απελευθέρωση bfgf, ο οποίος με τη σειρά του διεγείρει την επιστράτευση φλεγμονωδών κυττάρων, την ενεργοποίηση των ινοβλαστών και τον σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων. Η συνδεκάνη αποτελεί πρωτεογλυκάνη της κυτταρικής επιφάνειας με διαμεμβρανικό πρωτεϊνικό πυρήνα και προσκολλημένες ε- ξωκυττάριες αλυσίδες γλυκοζαμινογλυκανών. (Από Robbins, Basic Pathology.) 56

57 Ο ρόλος των GAGs και των πρωτεογλυκανών αποτέλεσε πεδίο έρευνας σε σχέση με την παθοφυσιολογία του δέρματος. Εντούτοις, είναι διαθέσιμες πολύ λίγες πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο των GAGs και των πρωτεογλυκανών στις διαδικασίες επούλωσης του δέρματος. Στον Πίνακα 2 καταγράφονται κάποιες κοινές πρωτεογλυκάνες με τις ιδιότητές τους, όπως το μοριακό τους βάρος και την τοπογραφία τους. [71,72] ΠΡΩΤΕΟΓΛΥΚΑΝΗ Μ.Β. ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ ΚΟΡΜΟΥ ΤΥΠΟΣ GAGs ΑΡΙΘΜΟΣ GAG ΑΛΥΣΩΝ ΤΟΠΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΓΓΡΕΚΑΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΚΕΡΑΤΑΝΗ 130 ΧΟΝΔΡΟΣ, ΔΕΡΜΑ ΜΗΧΑΝΙΚΗ ΣΤΗΡΙΞΗ ΒΗΤΑ ΓΛΥΚΑΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ 1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΚΑΙ ΣΤΡΩΜΑ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕ TGF-β ΝΤΕΚΟΡΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΔΕΡΜΑΤΑΝΗ 1 ΔΙΑΣΠΑΡΤΗ ΣΤΟ ΣΥΝΔΕΤΙΚΟ ΙΣΤΟ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΜΕ TGF-β ΚΑΙ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟ Ι ΠΕΡΛΕΚΑΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ 2-15 ΒΑΣΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΔΟΜΙΚΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ ΜΕ ΔΙΗΘΗΤΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΣΥΝΔΕΚΑΝΗ ΘΕΙΪΚΗ ΧΟΝΔΡΟΪΤΙΝΗ ΘΕΙΙΚΗ ΗΠΑΡΑΝΗ 1-3 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗ ΚΥΤΤΑΡΩΝ, ΣΥΝΔΕΣΗ ΜΕ FGF Πίνακας 2: Κοινές πρωτεογλυκάνες με τις ιδιότητές τους Α δ. Προσκολλητικές (συγκολλητικές) πρωτεΐνες Αποτελούν διαφορετικές από δομική άποψη πρωτεΐνες, των οποίων ο κύριος ρόλος συνίσταται στη σύνδεση των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μεταξύ τους αλλά και με τα κύτταρα, μέσω ιντεγκρινών της κυτταρικής επιφάνειας. Περιλαμβάνουν την ινονεκτίνη (κύριο συστατικό της ενδιάμεσης εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας) και τη λαμινίνη (κύριο συστατικό των βασικών μεμβρανών). (Εικ.19) 57

58 Εικόνα 19: Προσκολλητικές γλυκοπρωτεΐνες της ECM. Α. Το μόριο της ινονεκτίνης συνίσταται από ένα συνδεδεμένο με δισουλφιδικούς δεσμούς διμερές, που διαθέτει ποικίλες περιοχές σύνδεσης με συστατικά της ECM, καθώς και περιοχή σύνδεσης με ιντεγκρίνες που περιέχει την αλληλουχία Arg-Gly-Asp (RGD). B. Η λαμινίνη αποτελεί μόριο με σχήμα σταυρού, που διαθέτει περιοχές με ικανότητα σύνδεσης με συστατικά της ECM και της επιφάνειας του κυττάρου. (Από Robbins, Basic Pathology.) Η ινονεκτίνη ή φιμπρονεκτίνη ή ινοσυνεκτίνη ή ινωδονεκτίνη αποτελεί ευμέγεθες (450-kD) ετεροδιμερές, τα συστατικά του οποίου συνδέονται με δισουλφιδικούς δεσμούς. (Εικ.5, Εικ.19) Συντίθεται από διάφορους τύπους κυττάρων, περιλαμβανομένων των ινοβλαστών, των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων και συσχετίζεται με επιφάνειες κυττάρων, βασικές μεμβράνες και την εξωκυττάρια ουσία. Διαθέτει ειδικές περιοχές που συνδέονται με ευρύ φάσμα συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (π.χ κολλαγόνο, ινώδες, ηπαρίνη και πρωτεογλυκάνες), ενώ διαθέτει επίσης την ικανότητα προσκόλλησης σε ιντεγκρίνες κυττάρων με τη μεσολάβηση τριπεπτιδίου από αργινίνη-γλυκίνη-ασπαρτικό οξύ. Η συγκεκριμένη αλληλουχία αναγνώρισης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση κυττάρων στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Με την ενεργοποίηση ενδοκυττάριων οδών σηματοδότησης, η ινονεκτίνη ενισχύει επίσης την ευαισθησία ορισμένων τύπων κυττάρων (π.χ ενδοθηλιακών) στην επίδραση αυξητικών παραγόντων. Κατά τα αρχικά στάδια της επούλωσης τραυμάτων του δέρματος, σημαντικά ποσά ινονεκτίνης προερχόμενα από το πλάσμα, αθροίζονται στην εξωκυττάρια ουσία και επι- 58

59 δρούν ως αρχικός σκελετός για την ανάπτυξη ενδοθηλίου και ινοβλαστών. Έπειτα από 2 ή 3 ημέρες, η ινονεκτίνη συντίθεται πλέον ενεργητικά από πολλαπλασιαζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο παράγοντας TGF-b1 προάγει την παραγωγή ινονεκτίνης από τους ινοβλάστες, ενώ η ίδια αποτελεί ισχυρό χημειοτακτικό παράγοντα για τα μονοκύτταρα και προάγει τη διαφοροποίησή τους σε μακροφάγα. [73] Η λαμινίνη είναι μία θειωμένη γλυκοπρωτεΐνη που αποτελεί το κύριο συστατικό των βασικών μεμβρανών. Παράγεται από τα περισσότερα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Αποτελεί ετεροδιμερές μοριακού βάρους 820-kD, με σχήμα σταυρού, το οποίο διαθέτει περιοχές σύνδεσης για ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς (ιντεγκρίνες), τη θειϊκή ηπαράνη, το κολλαγόνο τύπου IV και την εντακτίνη. Επειδή υπάρχουν πολλαπλές θέσεις για την πρόσδεση διαφόρων συνδετών στο μόριο της λαμινίνης, αυτή αποτελεί το κύριο εξωκυττάριο συνδετικό μόριο μεταξύ των κυττάρων και της εξωκυττάριας ουσίας. (Εικ.5, Εικ.19) Πέραν της μεσολάβησης για την προσκόλληση σε βασικές μεμβράνες, η λαμινίνη επηρεάζει ακόμη την ικανότητα επιβίωσης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, καθώς και την κινητικότητα των κυττάρων. [6,7,10] Οι ιντεγκρίνες αποτελούν μία ομάδα μορίων προσκόλλησης των κυττάρων, κάθε μία από τις οποίες αποτελείται από δύο πρωτεϊνικές υπομονάδες, τις αλυσίδες α και β. Ο υποδοχέας της ινονεκτίνης (Εικ.5, Εικ.19) αποτελεί την πιο γνωστή πρωτεΐνη της οικογένειας των ιντεγκρινών και περιέχει ένα κυτταροπλασματικό τμήμα, που ενώνεται με την ακτίνη (διαμέσου της ταλίνης), ένα διαμεμβρανικό τμήμα και εξωκυττάρια τμήματα που ενώνονται με την ινονεκτίνη. Έτσι, το μόριο αυτό συνδέει το ενδοκυττάριο δίκτυο της ακτίνης με την εξωκυττάρια ουσία στις θέσεις εστιακής επαφής. Στην οικογένεια των ιντεγκρινών ανήκει και ο υποδοχέας της λαμινίνης. Οι ιντεγκρίνες ενώνονται και με άλλες πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας, λειτουργώντας έτσι σαν μεσοκυττάρια προσκολλητικά μόρια. Επιπρόσθετα, οι ιντεγκρίνες των επιθηλιακών ή μεσεγχυματικών κυττάρων συνδέονται επίσης με την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία μέσω αλληλεπιδράσεων οι οποίες σηματοδοτούν την προσκόλληση του κυττάρου και επηρεάζουν τη μετακίνηση, τον πολλαπλασιασμό ή τη διαφοροποίησή του, χρησιμοποιώντας τις ίδιες ενδοκυττάριες οδούς σηματοδότησης που χρησιμοποιούνται και από τους υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. [10,11] Α ε. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας αποτελούν μία πολυμελή οικογένεια δομικά παρόμοιων ενδοπεπτιδασών, που εξαρτώνται από την ύπαρξη ψευδαργύρου [74] και αριθμούν 28 συγγενούς δομής ένζυμα, το γονίδιο των οποίων έχει ταυτοποιηθεί. Είναι σε θέση να ανασχηματίζουν στοιχεία των ι- στών προκαλώντας την πρωτεολυτική αποδόμηση των μορίων του εξωκυττάριου χώρου και των στοιχείων της βασικής μεμβράνης, σε φυσιολογικό pη. [75] Συμβολίζονται με το σύμβολο ΜΜΡ και έναν αριθμό και ομαδοποιούνται ανάλογα με τη δομή τους, το μοριακό τους βάρος, τα υποστρώματα τα οποία αποδομούν και την 59

60 προέλευσή τους. [76] Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες παράγονται από μία ποικιλία κυττάρων, όπως λευκοκύτταρα (κυρίως πολυμορφοπύρηνα) αλλά και μακροφάγα ιστών, ινοβλάστες, επιθηλιακά κύτταρα, ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και αστροκύτταρα. [77,78,79] Ο ρόλος τους είναι σημαντικός σε φυσιολογικές διαδικασίες, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, η επούλωση των τραυμάτων και η αναδόμηση των ιστών, τόσο στο δέρμα, όσο και σε όλα τα υπόλοιπα σημεία του οργανισμού, (Πίνακας 3) καθώς καθορίζουν την ισορροπία μεταξύ κολλαγονόλυσης και κολλαγονογένεσης. Συγκεκριμένα, στο τέλος της δεύτερης φάσης της διαδικασίας της επούλωσης, διασπούν μεταβολικά πεπτίδια και ρυθμίζουν διαδικασίες όπου συμμετέχουν σημαντικές ουσίες του εξωκυττάριου χώρου, όπως οι κυτοκίνες, οι αυξητικοί παράγοντες και τα μόρια σύμφυσης μεταξύ των κυττάρων. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι σε θέση να αποδομούν in vitro και in vivo όλα τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, όπως κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες, ινωδονεκτίνη και λαμινίνη, συμμετέχοντας έτσι στην αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού. Σε φυσιολογικές συνθήκες, η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών ελέγχεται από τους λεγόμενους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue Inhibitors of Metalloproteinases -ΤΙΜΡs). [80] Διαταραχές της φυσιολογικής δραστηριότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών οδηγεί σε παθολογικές διεργασίες, όπως η καταστροφή των ιστών στη ρευματοειδή αρθρίτιδα και οστεοαρθρίτιδα, περιοδοντίτιδα, εξέλκωση του κερατοειδούς, σπειραματονεφρίτιδα, αθηροσκλήρωση, ίνωση, μετάσταση, νεοαγγειογένεση όγκων, πομφολυγώδη επιδερμόλυση, ερπητοειδή δερματίτιδα. [81,82,83,84,85] Η θεραπευτική παρέμβαση μέσω αναστολής των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι μία ελπιδοφόρος προσέγγιση για τη θεραπεία αυτών των παθήσεων αφού οι μεταλλοπρωτεϊνάσες φαντάζουν ελκυστικοί στόχοι για την ανάπτυξη αναστολέων. [86,87] Κριτήρια ένταξης στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών( MMPs) Ο αριθμός των ανακαλυφθέντων μεταλλοπρωτεϊνασών έχει αυξηθεί σημαντικά τα τελευταία χρόνια. Για τον λόγο αυτό έχουν θεσπιστεί ορισμένα κριτήρια για την ένταξη ενός συγκεκριμένου ενζύμου στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών, τα σπουδαιότερα των οποίων είναι: α) Ύπαρξη μορίου ψευδαργύρου στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου. β) Αναστολή από τους ΤΙΜΡs. γ) Αποδόμηση τουλάχιστον ενός συστατικού της μεσοκυττάριας ουσίας. δ) Έκκριση σε πρόδρομη ανενεργό μορφή ε) Αλληλουχία cdna ομόλογη με αυτή της κολλαγονάσης. 60

61 Μοριακή δομή των μεταλλοπρωτεϊνασών Όλες οι ΜΜΡs έχουν μία βασική κοινή πολυτμηματική δομή αλλά παρουσιάζουν και διαφορές που φαίνεται να έχουν άμεση σχέση με την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα, τη δράση τους και την ενεργότητά τους. [88] (Εικ.20) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες συντίθενται ως προ-προ-ένζυμα και εκκρίνονται ως ανενεργείς μεταλλοπρωτεϊνάσες, [89] οι οποίες αποτελούνται από τα εξής τμήματα: Pre-domain: ανάρρους περιοχή προ της κυρίως πρωτεΐνης (upstream) που σηματοδοτεί την έκκριση της πρωτεϊνάσης από το κύτταρο. [90] Εικόνα 20: Τρισδιάστατο μοντέλο της γενικής δομής των προ-mmps. Απεικονίζονται τα τρία κύρια δομικά τμήματα καθώς και οι 4 λεπιδωτές β-δομές του C-τελικού τμήματος που έχει ομολογία προς την αιμοπηξίνη (Ι, ΙΙ, ΙΙΙ, ΙV). Pro-domain: περιοχή στο Ν-άκρο της πρωτεϊνάσης, μήκους περίπου 80 με 90 αμινοξέων που περιέχει και ένα μόριο κυστεΐνης. Το τμήμα αυτό έχει σχήμα ωοειδές και αποτελείται από 3 κάθετες α-έλικες και ένα τμήμα που συνδέεται με την καταλυτική περιοχή. (Εικ.21) Η κυστεΐνη συνδέεται με τον ψευδάργυρο του καταλυτικού τμήματος ώστε να διατηρείται η ανενεργότητα των προ-μεταλλοπρωτεϊνασών. [91,92] H περιοχή αυτή παίζει αυτό-ανασταλτικό ρόλο, αφού συνδέεται με το άτομο ψευδαργύρου (Zη) της καταλυτικής περιοχής που είναι υπεύθυνο για τη δράση του ενζύμου. [90,93] Παρά τη σύνδεση αυτή, η ενεργός περιοχή του καταλυτικού τμή- 61

62 ματος σ αυτή την προ-ενεργό μορφή είναι εκπληκτικά όμοια σε δομή με αυτή του ώριμου ενζύμου. Εικόνα 21: Τα δομικά τμήματα των μεταλλοπρωτεϊνασών. Διακρίνονται σχηματικά τα τρία κύρια τμήματα καθώς και επιμέρους τμήματα που συνεισφέρουν στη σύνδεση των κύριων μερών ή αποτελούν μοναδικά τμήματα ορισμένων μόνο μεταλλοπρωτεϊνασών (π.χ. GPI άγκυρα). Catalytic domain: Καταλυτική περιοχή αποτελούμενη από περίπου 170 αμινοξέα. Έχει σχήμα ελλειψοειδές, ελαφρώς αποπεπλατυσμένο στους πόλους. Αποτελείται από 5 β-πτυχές, 3 α-έλικες και αγκύλες που συνδέουν τα τμήματα αυτά, ένα άτομο ψευδαργύρου (Zη), απαραίτητο για την 62

63 καταλυτική δράση και 2 ή 3 ιόντα ασβεστίου που είναι απαραίτητα για τη σταθερότητα και έκφραση της ενζυμικής δραστηριότητας. Μία περιοχή που περιέχει μεθειονίνη ονομάζεται «Met-στροφή» και είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της δομής γύρω από τον καταλυτικό Ζη. [94] Στις ΜΜΡ- 2 και ΜΜΡ-3 υπάρχουν ακόμη 3 περιοχές ινωδονεκτίνης τύπου 2. [95] Ηemopexin-like domain: Περιοχή στο C άκρο της πρωτεϊνάσης με ομολογία προς την πρωτεΐνη αιμοπηξίνη που υπάρχει σε όλες τις μεταλλοπρωτεϊνάσες εκτός της ΜΜΡ-7. Αποτελείται από 210 αμινοξέα περίπου και έχει ένα ελλειψοειδές, δισκοειδές σχήμα με 4 λεπιδωτές β-δομές που η κάθε μία αποτελείται από 4 αντιπαράλληλες β-πτυχές και μία έλικα. [96] Το τμήμα αυτό φαίνεται να έχει άμεση σχέση με την ειδικότητα ως προς το υπόστρωμα [97] και την αλληλεπίδραση με τους ΤΙΜΡs. [78,98,99] Transmembrane domain: Περιοχή χαρακτηριστική των μεμβρανικού τύπου μεταλλοπρωτεϊνασών (ΜΤ-ΜΜΡs), απαραίτητη για την εγκατάσταση ενός συγκεκριμένου τμήματος της μεταλλοπρωτεϊνάσης στην κυτταρική μεμβράνη. [100] Cysteine switch: Στο πρόδρομο πεδίο βρίσκεται ένα υπόλειμμα κυστεΐνης που έχει τη δυνατότητα να συνδέεται με τον καταλυτικό Ζη και να καθιστά το ένζυμο ανενεργό. Η ενεργοποίηση των προ-μεταλλοπρωτεϊνασών από άλλες πρωτεϊνάσες φαίνεται να εμπλέκει μηχανισμούς που έχουν ως τελικό αποτέλεσμα την καταστροφή του δεσμού κυστεΐνης-καταλυτικού ψευδαργύρου. [90,98] Αυτή είναι η θεωρία του «διακόπτη της κυστεΐνης». [101,102] Cytoplasmic tail: Περιοχή μήκους 25 αμινοξέων που χρησιμοποιείται για τη σύνδεση του ενζύμου στην αντίστοιχη περιοχή της κυτταρικής μεμβράνης (για τις μεμβρανικές μεταλλοπρωτεϊνάσες). [103] Σημαντική δομική διαφοροποίηση παρατηρείται στις μεταλλοπρωτεϊνάσες μεμβρανικού τύπου (ΜΤ-ΜΜΡs) οι οποίες, σε αντίθεση με τις υπόλοιπες μεταλλοπρωτεϊνάσες, είναι συνδεδεμένες με την κυτταρική μεμβράνη διαθέτοντας ένα επιπλέον διαμεμβρανικό και ενδοκυτταροπλασματικό τμήμα, το οποίο είναι χαρακτηριστικό γι αυτές. [104] Ταξινόμηση των μεταλλοπρωτεϊνασών με βάση τη δομή τους Όλα τα παραπάνω δεδομένα σχετικά με τη δομή των μεταλλοπρωτεϊνασών δείχνουν ότι αυτές ακολουθούν ένα κοινό δομικό μοτίβο, αλλά έχουν και σημαντικές δομικές διαφορές που έχουν άμεσο αντίκτυπο στη λειτουργία, τη δραστικότητα και την ειδικότητά τους με το υπόστρωμα. Με βάση λοιπόν τις πληροφορίες για τη δομή τους ταξινομούνται σε κατηγορίες, (Εικ.22) με την κατηγοριοποίηση να βασίζεται στις παρακάτω παρατηρήσεις. 63

64 Εικόνα 22: Σχηματική αναπαράσταση των δομικών τμημάτων των μεταλλοπρωτεϊνασών καθώς και η ταξινόμησή τους με βάση τη δομή. Oι περισσότερες μεταλλοπρωτεϊνάσες (εκτός των ΜΜΡ-7, -23, -26) έχουν ένα C-τελικό τμήμα αιμοπηξίνης και μία συνδετήρια περιοχή του τμήματος αυτού με το καταλυτικό τμήμα. Άλλες μεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν μοναδικές-χαρακτηριστικές δομές, όπως 64

65 το διαμεμβρανικό τμήμα, η κυτταροπλασματική ουρά και η μεμβρανικού τύπου α- γκύλη (ΜΤ-loop) που παρατηρούνται στις ΜΤ-ΜΜΡs (ΜΤ1-, ΜΤ2-, ΜΤ3- και ΜΤ5, γνωστές και ως ΜΜΡs και -24 αντίστοιχα). Επίσης στις ΜΤ-4ΜΜΡ και ΜΤ-6ΜΜΡ παρατηρείται μία δομή γνωστή ως GPI anchor, δηλαδή «άγκυρα» γλυκοζυλοφωσφατιδυλινοσιτόλης. Ένα σημείο αναγνώρισης-φουρίνης μεταξύ προπεπτιδικού και καταλυτικού τμήματος παρατηρείται σε όλες τις ΜΤ-ΜΜΡs καθώς και στις ΜΜΡs-5,-11,-21,-23,-28. Τέλος, παρατηρούνται: μία αλληλουχία ινονεκτίνης τύπου ΙΙ στις ΜΜΡs-2,-9, μία τελική «άγκυρα» - «σήμα», μία διάταξη κυστεΐνης και ένα Ιg-προσομοιάζον τμήμα στις ΜΜΡs-23Α και -23Β. Ταξινόμηση των μεταλλοπρωτεϊνασών με βάση το υπόστρωμά τους Η οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών όσον αφορά στον άνθρωπο αποτελείται μέχρι στιγμής από τουλάχιστον 28 μέλη. [105] Από τότε που πρωτομελετήθηκαν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, είχε προταθεί πως η κάθε μία έχει το δικό της συγκεκριμένο υπόστρωμα. [106] Η αρχή αυτή αποτέλεσε τη βάση για τη δημιουργία μιας ταξινόμησης και ονοματολογίας ταυτόχρονα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες, που να βασίζεται στο υπόστρωμά τους. Έτσι οι κολλαγονάσες για παράδειγμα, διασπούν άθικτους ινώδεις σχηματισμούς με τελικό προϊόν αποικοδομημένο και μετουσιωμένο κολλαγόνο, ενώ η μεταλλοελαστάση διασπά την ελαστίνη. Σήμερα έχει καταδειχθεί πως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν πολλαπλά υποστρώματα και με σημαντική αλληλοεπικάλυψη μεταξύ τους ως προς τα υποστρώματα. Η ΜΜΡ-1 π.χ έχει τη δυνατότητα διάσπασης της καζεΐνης, της ζελατίνης, της α-1 αντιθρυψίνης, [107] της βασικής πρωτεΐνης της μυελίνης, της L- σελεκτίνης και έχει και τη δυνατότητα ενεργοποίησης της προ-μμρ-2-9, ενώ η ΜΜΡ-2 διασπά το ινώδες κολλαγόνο[108] και την ελαστίνη και ενεργοποιεί τις προ-μμρ-5,-1,-9,-13. Συνεπώς, σε μία προσπάθεια αποσύνδεσης του ονόματος των μεταλλοπρωτεϊνασών από τη δράση τους, λόγω της αλληλοεπικάλυψής τους ως προς τα υποστρώματα στα οποία δρουν, δόθηκαν αριθμοί για την κάθε μία. Στην αριθμοδότηση αυτή υπάρχουν κενά, καθώς δεν υπάρχουν οι ΜΜΡs-4, 5, 6. Στον παρακάτω πίνακα παραθέτουμε όλες τις μεταλλοπρωτεϊνάσες με τους αριθμούς τους, τα ενζυμικά τους ονόματα και τα υποστρώματά τους,[109] οι οποίες ταξινομούνται σε 5 κατηγορίες: α) κολλαγονάσες, β) ζελατινάσες Α και Β, γ) στρωμαλυσίνες 1 και 2, δ) μία πιο ετερογενής ομάδα που περιλαμβάνει τη ΜΜΡ-7, ΜΜΡ-12 και ΜΜΡ-19 και ε) τις μεμβρανικού τύπου ΜΜΡs. 65

66 Στον Πίνακα 3 φαίνεται η ταξινόμηση αυτή, οι επιμέρους ομάδες, (τα μέλη αυτών), η χρωμοσωμική τοποθεσία των γονιδίων των μεταλλοπρωτεϊνασών στον άνθρωπο, τα υποστρώματα και τα ειδικά χαρακτηριστικά της κάθε ομάδας. [79,110,111,112,113] Πρωτεάση Αρίθμηση Θέση χρωμοσώματος (στον άνθρωπο) Υπόστρωμα εξωκυττάριου χώρου Ενεργοποίηση προ-mmp Κολλαγονάσες Κολλαγονάση-1 (κολλαγονάση των ιστών, interstitial collagenase) ΜΜΡ-1 11q22-q23 Κολλαγόνο τύπου: III > I > II, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, τενασίνη, περλεκάνη Προ-MMP-1 Προ-MMP-2 Κολλαγονάση-2 (κολλαγονάση των ουδετερόφιλων) ΜΜΡ-8 11 q21 -q22 Κολλαγόνο τύπου: Ι > II > III, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, τενασίνη Προ-MMP-8 Κολλαγονάση-3 ΜΜΡ-13 11q22.3 Κολλαγόνο τύπου: II > III > Ι, VII, Χ, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, τενασίνη Προ-MMP-9 Προ-MMP-13 Κολλαγονάση-4, xcol4 (Xenopus) (δεν υπάρχει ανάλογο στον άνθρωπο) ΜΜΡ-18 Κολλαγόνο τύπου: Ι, II, III, ζελατίνη Ζελατινάσες Ζελατινάση Α, (72-kDa ζελατινάση, 72-kDa κολλαγονάση τύπου IV) ΜΜΡ-2 16q13 Αποδομημένο κολλαγόνο (ζελατίνη), κολλαγόνο τύπου: Ι, IV, V, VII, Χ, XI, ελαστίνη, ινονεκτίνη (fibronectin), λαμινίνη-5, αγγρεκάνη, μπρεβικάνη, νευροκάνη, ντεκορίνη, υαλοσυνδετίνη Προ-MMP-1 Προ-MMP-2 Προ-MMP-13 Ζελατινάση Β, (92-kDa ζελατινάση) ΜΜΡ-9 20q11.2-q13.1 Αποδομημένο κολλαγόνο (ζελατίνη), κολλαγόνο τύπου: Ι, IV, V, VII, Χ, XI, ελαστίνη, ινονεκτίνη, λαμινίνη-5, αγγρεκάνη, υαλονεκτίνη Προ-MMP-2 Προ-MMP-9 Προ-MMP-13 66

67 Πρωτεάση Αρίθμηση Θέση χρωμοσώματος (στον άνθρωπο) Υπόστρωμα εξωκυττάριου χώρου Ενεργοποίηση προ-mmp Μεμβρανικού τύπου ΜΤ1-ΜΜΡ ΜΜΡ-14 14q11-q12 Κολλαγόνο τύπου: Ι, II, III, ζελατίνη, ινονεκτίνη, υαλονεκτίνη, αγγρεκάνη Προ-MMP-2 Προ-ΜΜΡ-13 ΜΤ2-ΜΜΡ ΜΜΡ-15 16q13-q21 Πρωτεογλυκάνες Προ-MMP-2 ΜΤ3-ΜΜΡ ΜΜΡ-16 8q21 Κολλαγόνο τύπου: III, ινονεκτίνη Προ-MMP-2 ΜΤ4-ΜΜΡ ΜΜΡ-17 12q24.3 Ζελατίνη, ινώδες / ινωδογόνο Προ-MMP-2 ΜΤ5-ΜΜΡ ΜΜΡ-24 20q11.2 Ινονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες, ζελατίνη Προ-MMP-2 ΜΤ6-ΜΜΡ, Λευκολυσίνη (Leukolysin) ΜΜΡ-25 16p13.3 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, ινονεκτίνη, λαμινίνη-1, πρωτεογλυκάνες θειϊκής δερματάνης και κερατάνης ινώδες / ινωδογόνο Προ-MMP-2 Προ-MMP-9 Στρωμαλυσίνες Στρωμαλυσίνη-1 (πρωτεογλυκανάση,proteoglycanase) ΜΜΡ-3 11q23 Αγγρεκάνη, λαμινίνη, ινονεκτίνη, περιοχές χωρίς τριπλή έλικα φυσιολογικών κολλαγόνων τύπου: II, III, IV, V, IX, Χ, XI, ζελατίνη, εντακτίνη, περλεκάνη, ντεκορίνη, τενασκίνη υαλονεκτίνη, ινώδες/ινωδογόνο, ελαστίνη Προ-MMP-1 προ-mmp-3 προ-mmp-7 προ-mmp-8 προ-mmp-9 προ-mmp-13 Στρωμαλυσίνη-2 ΜΜΡ-10 11q22.3-q23 Ζελατίνη, κολλαγόνο τύπου: I, III IV, V, ινονεκτίνη, πρωτεογλυκάνες Προ-MMP-1 προ-mmp-8 προ-mmp-10 Στρωμαλυσίνη-3 ΜΜΡ-11 22q11.2 ινονεκτίνη, λαμινίνη, αγγρεκάνη Ματριλυσίνες Ματριλυσίνη (PUMP-1) ΜΜΡ-7 11q21-q22 ινονεκτίνη, λαμινίνη, περιοχές χωρίς τριπλή έλικα φυσιολογικών κολλαγόνων τύπου: IV, V, IX, Χ, XI, ζελατίνη, αγγρεκάνη, εντακτίνη, τενασκίνη, υαλονεκτίνη, ινώδες/ινωδογόνο Προ-MMP-1 προ-mmp-2 προ-mmp-7 προ-mmp-9 Ματριλυσίνη-2, (Endometase) ΜΜΡ-26 11p15 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, ινονεκτίνη, ινώδες / ινωδογόνο Προ-MMP-9 67

68 Πρωτεάση Άλλες ΜΜΡ Αρίθμηση Θέση χρωμοσώματος (στον άνθρωπο) Υπόστρωμα εξωκυττάριου χώρου Ενεργοποίηση προ-mmp Μεταλλοελαστάση (ελαστάση των μακροφάγων) ΜΜΡ-12 11q22.2-q22.3 Ελαστίνη, ινονεκτίνη, λαμινίνη, πρωτεογλυκάνες, ινώδες / ινωδογόνο Στρωμαλυσίνη-4 (RASI) ΜΜΡ-19 12q14 Κολλαγόνο τύπου IV, ζελατίνη, λαμινίνη, ινονεκτίνη, τενασκίνη, εντακτίνη, αγγρεκάνη, ινώδες/ ινωδογόνο Εναμελυσίνη (Enamelysin) ΜΜΡ-20 11q22.3 Αδαμαντινίνη (amelogenin), αγγρεκάνη ΧΜΜΡ (Xenopus) ΜΜΡ-21 Δεν έχει διευκρινισθεί CMMP (όρνιθα) -ανάλογο ανθρώπου ΜΜΡ-22a,b/ ΜΜΡ-27 11q24 Δεν έχει διευκρινισθεί CA-MMP ΜΜΡ-23 1p36.3 Ζελατίνη Επιλυσίνη (Epilysin) ΜΜΡ-28 17q11.2 Δεν έχει διευκρινισθεί Πίνακας 3: Μεταλλοπρωτεϊνάσες των θηλαστικών και υποστρώματα Ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών Είναι γνωστό ότι όλες οι μεταλλοπρωτεϊνάσες παράγονται σε ανενεργό μορφή, απολύτως ανίκανη να διασπάσει οποιοδήποτε μόριο πρωτεΐνης. Είναι αναγκαία λοιπόν η ενεργοποίησή τους ώστε να αποκτήσουν πρωτεολυτική ικανότητα. Η ε- νεργοποίηση αυτή μπορεί να επιτευχθεί με πρωτεϊνάσες, ή in vitro με διάφορους παράγοντες, όπως χημικές ουσίες, [102] π.χ. οξειδωμένη γλουταθειόνη, χαοτροπικά ιόντα, άλατα χρυσού, απορρυπαντικά SOS, [114,115,116,117] συμπεριλαμβανομένης της κατεργασίας με οργανικές υδραργυρικές ενώσεις (π.χ p-αminophenylmercuric acetate, APMA) και πρωτεολυτικό διαχωρισμό με τρυψίνη και πλασμίνη. Το χαμηλό ph και η θέρμανση μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε ενεργοποίηση. Η ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη βήμα προς βήμα α) εξωκυττάρια ενεργοποίηση, β) την ενεργοποίηση στην κυτταρική επιφάνεια και γ) την ενδοκυττάρια ενεργοποίηση. [113] Η ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών επέρχεται με τη διάσπαση της ανενεργού πρόδρομης μορφής τους. [118] Η διαδικασία αυτή λαμβά- 68

69 νει χώρα στον εξωκυττάριο χώρο (με την εξαίρεση της ΜΜΡ-1 και των μεταλλοπρωτεϊνασών μεμβρανικού τύπου οι οποίες ενεργοποιούνται πριν από την έκκρισή τους) και αφορά τις περισσότερες μεταλλοπρωτεϊνάσες. [78] Οι ενεργέs μορφές είναι περισσότερο ασταθείς από τις πρόδρομες μορφές. [118] Όπως έχει αποδειχθεί, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και κυρίως οι μεμβρανικού τύπου παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση άλλων μελών της οικογενείας τους. Παράλληλα με την εξωκυττάρια ενεργοποίηση, παρατηρείται ενεργοποίηση και στην κυτταρική επιφάνεια. Έτσι για παράδειγμα, η ΜΜΡ-14 σε συνδυασμό με τον ΤΙΜΡ-2 ενεργοποιούν την prommp-2, [119] η ΜΜΡ-3 ενεργοποιεί την prommp-9[98] και το σύμπλεγμα prommp-9/timp-1 σε συνδυασμό με τη ΜΜΡ-3 ενεργοποιεί τη ΜΜΡ-9. [120] Η ενδοκυττάρια ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών αφορά κυρίως τις ΜΤ-ΜΜPs και τη ΜΜΡ-11. Μετά τη συγκεκριμένη διαδικασία και με την ενεργό μορφή τους τα ένζυμα αυτά ανέρχονται στην κυτταρική επιφάνεια επιτρέποντας την ενεργοποίηση άλλων μεταλλοπρωτεϊνασών. Η ε- νεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών στην επιφάνεια του κυττάρου, σε συνδυασμό με την εξωκυττάρια ενεργοποίησή τους, έχει το πλεονέκτημα ότι μεγιστοποιεί την πρωτεολυτική δράση του κυττάρου στο άμεσο περιβάλλον του. [78] Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και κυρίως οι κολλαγονάσες και ζελατινάσες έχουν την ιδιότητα να ενεργοποιούν άλλες ανενεργές μεταλλοπρωτεϊνάσες. Για παράδειγμα η ΜΤ-1ΜΜΡ ενεργοποιεί τη ΜΜΡ-13 και η ΜΜΡ-2 ενισχύει την παραπάνω ενεργοποίηση. Η ΜΤ-1ΜΜΡ ενεργοποιεί επίσης τη ΜΜΡ-2, η ΜΜΡ -10 την prommp-8, ενώ η ΜΜΡ-3 φαίνεται ότι διασπά τις πρόδρομες μορφές των ΜΜΡ 1, 7, 9, 13. Η ενεργοποιημένη ΜΜΡ-7 μπορεί να ενεργοποιήσει τόσο τη ΜΜΡ-1 όσο και τη ΜΜΡ- 9. Από τα προαναφερθέντα παραδείγματα καταδεικνύεται η πολυπλοκότητα των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στη σύνθεση και την ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών. Η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των μεταλλοπρωτεϊνασών και των TIMPs έχει ως άμεσο αποτέλεσμα την ομοιόσταση των ιστών. Όλοι οι παράγοντες που αναφέρθηκαν πιο πάνω, για να επιτύχουν ενεργοποίηση προκαλούν διαταραχή της αλληλεπίδρασης κυστεΐνης-ψευδαργύρου και «άνοιγμα» του «διακόπτη της κυστεΐνης». [101,102] Ειδικότερα, όλα τα μόρια των MMPs περιέχουν στο ένα τους άκρο (αμινοτελικό), ένα καλά προστατευόμενο τμήμα 9 αμινοξέων. Αυτό το τμήμα περιέχει ένα μόριο κυστεΐνης. Στην ανενεργό μορφή, τμήμα του μορίου που περιέχει την κυστεΐνη διπλώνει και η κυστεΐνη αντιδρά με το ιόν του μετάλλου (Ζη ++ ) στο ενεργό κέντρο του ενζύμου. Όταν το ενεργό κέντρο είναι μπλοκαρισμένο μ αυτό τον τρόπο, το ένζυμο είναι ανίκανο να προσβάλλει την πρωτεάση στόχο. [121,117] Eπομένως, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι κατασκευασμένες με ενσωματωμένο τον αναστολέα τους και ενεργοποιούνται όταν το πεπτίδιο που περιέχει την κυστεΐνη απομακρύνεται από το ενεργό κέντρο. Μετά την αποκοπή του πεπτιδίου που περιέχει την κυστεΐνη, η μεταλλοπρωτεϊνάση καθίσταται 69

70 μονίμως ενεργή. Η πρακτική σημασία του γεγονότος αυτού, έγκειται στο ότι ένα φάρμακο που θα είχε παρόμοια δράση με το πεπτίδιο που περιέχει την κυστεΐνη, θα μπορούσε να παρεμποδίσει τη δράση της μεταλλοπρωτεϊνάσης και να αναστείλει τη διηθητική και μεταστατική συμπεριφορά του καρκινικού κυττάρου. Η μέχρι σήμερα αποκτηθείσα γνώση για τη δομή και τη λειτουργικότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών, θα οδηγήσει στην ανάπτυξη τέτοιων φαρμάκων που θα μπορούσαν να προλάβουν, ή και να σταματήσουν τη διηθητική και μεταστατική διαδικασία. Σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, ο μηχανισμός ενεργοποίησης των μεταλλοπρωτεϊνασών σε in vivo συνθήκες δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Σύμφωνα με την επικρατούσα άποψη, άλλοι τύποι λυτικών ενζύμων, όπως π.χ το πλασμινογόνο, το tpa και το upa ή άλλες μεταλλοπρωτεϊνάσες (Εικ.23) μπορούν να ενεργοποιήσουν μία ανενεργό μεταλλοπρωτεϊνάση, αποκόπτοντας το ανασταλτικό της πεπτίδιο. Μία δεύτερη υπόθεση είναι ότι προσκολλημένες πρωτεάσες στην κυτταρική μεμβράνη των νεοπλασματικών κυττάρων προκαλούν ενεργοποίηση των ενζύμων. Το γεγονός αυτό μπορεί να αποδώσει στα νεοπλασματικά κύτταρα εξαιρετικές ικανότητες σχετιζόμενες με τον έλεγχο της τοπικής δραστικότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών. ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ Πρωτεινάσες ΜΜP ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΗΤΕΣ ΠΡΟ ΜΜP ΧΗΜΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΜΜP ΔΙΑΜΕΣΟΛΑΒΗΤΕΣ ΕΝΕΡΓΟΣ MMP XHMIKH ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ Εικόνα 23: Οι δύο οδοί ενεργοποίησης των μεταλλοπρωτεϊνασών. Διακρίνεται ο «διακόπτης κυστεΐνης». Και οι δύο οδοί καταλήγουν σε τελική ενεργοποίηση από μεταλλοπρωτεϊνάσες διαμεσολαβητές. 70

71 Λειτουργία των μεταλλοπρωτεϊνασών Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες εμπλέκονται σε μία πληθώρα φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων. Γενικά παίζουν ρόλο στην αναδιαμόρφωση (remodeling) της βασικής μεμβράνης και του συνδετικού ιστού, στη σύσπαση των ιστών εξαιτίας της βλάβης, στη νεοαγγείωση [77] αλλά και στην αγγειογένεση γενικότερα, [99] στην αύξηση του μεγέθους των νεοπλασιών και σε πιθανή μετάστασή τους. [105,122] Η δράση των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα στην παθογένεση πληθώρας ασθενειών, όπως αθηροσκλήρωση, αρθρίτιδα, καρδιακή ανεπάρκεια, οζώδης σκλήρυνση. [123] (Πίνακας 4) Σε κυτταρικό επίπεδο, η δράση τους συνίσταται στην αποδόμηση συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και των βασικών μεμβρανών καθώς και την αναδιαμόρφωσή τους. [118] Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες χαρακτηρίζονται από αλληλοεπικαλυπτόμενα υποστρώματα, ενώ θεωρείται πιθανό η δράση (πολλών απ αυτές) να αντισταθμίζει την απώλεια ή τη μη παραγωγή ενός μέλους της οικογένειας. [77,78,99] Συγχρόνως, αποτρέπουν την εναπόθεση περίσσειας θεμέλιας ουσίας που είναι αποτέλεσμα αυτής της αναδιαμόρφωσης. [111] Η αυξημένη παραγωγή MMPs μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη αποδόμηση σε πρώτο στάδιο αλλά και αυξημένη παραγωγή και εναπόθεση της θεμέλιας ουσίας μεταγενέστερα. [124] Οι παραπάνω δράσεις σε συνδυασμό με αυτή των αναστολέων τους είναι ενδεικτικές του σημαντικού ρόλου που παίζουν στη διατήρηση της ομοιόστασης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. [125] Επιπλέον ως ένζυμα με πρωτεολυτικές ιδιότητες συμμετέχουν στην αποδόμηση άλλων πρωτεϊνασών, κυτταροκινών και πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας. Μία ακόμη λειτουργία των μεταλλοπρωτεϊνασών αποτελεί και η πρωτεολυτική ενεργοποίηση παραγόντων, όπως του TGF-β από την MMP-9 ή του TNF-α. [77,78] H πρωτεολυτική αυτή δραστηριότητα εξαρτάται από τις διαθέσιμες συγκεντρώσεις των μεταλλοπρωτεϊνασών αλλά και από τη σχέση αυτών με τις αντίστοιχες των ΤΙΜΡ. [78,126] Οι πρωτεολυτικοί μηχανισμοί ενεργοποίησης των αυξητικών παραγόντων διευκολύνουν κρίσιμες αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων, καθώς και μεταξύ κυττάρων και μεσοκυττάριας ουσίας. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις αποκαλύπτουν περιοχές των συγκεκριμένων μορίων οι οποίες δεν ήταν προηγουμένως προσβάσιμες. [78] Τα προϊόντα αυτής της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι ενεργοποιημένα μόρια και έχουν ιδιότητες που το αρχικό μόριο δεν διαθέτει. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες συμμετέχουν στη μετάδοση μηνυμάτων με την ενεργοποίηση ενδοκυττάριων καταρρακτών μετάδοσης σημάτων (intracellular transduction cascades). [77,78] Τέλος, λαμβάνουν μέρος στη σύσπαση των κολλαγόνων, ιδιότητα που εξηγεί την εμπλοκή τους στη διαδικασία επούλωσης. [127] 71

72 Φυσιολογικές Ανάπτυξη Ανάπτυξη νεύρων Σκελετός, ανάπτυξη οστών Ωρίμανση αδαμαντίνης Απορρόφηση πρωτογενών δοντιών Αναπαραγωγή Ενδομήτριος κύκλος Μορφογένεση και ανάπτυξη μαστικού αδένα Διατήρηση ομοιόστασης ιστών Ανάπλαση οστών Επούλωση τραυμάτων Αγγειογένεση Απόπτωση Αναγέννηση νεύρων Λειτουργία μακροφάγων Λειτουργία ουδετερόφιλων Παθολογικές Καταστροφή ιστού Ρευματοειδής αρθρίτιδα Οστεοαρθρίτιδα Πρωτογενής καρκίνος Μεταστατικός καρκίνος Έλκος δωδεκαδακτύλου Γαστρικό έλκος Έλκος κερατοειδούς Περιοδοντική ασθένεια Ινώδεις ασθένειες Κίρρωση ήπατος Πνευμονική ίνωση Ωτοσκλήρυνση Εξασθένηση μεμβρανών Διατατική μυοκαρδιοπάθεια Ανεύρυσμα αορτής Πίνακας 4. Φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες που συμμετέχουν οι μεταλλοπρωτεϊνάσες Γενικότερα οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι σημαντικές για τη διατήρηση ενός φυσιολογικού ισοζυγίου παραγωγής και αποδόμησης της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Το γεγονός αυτό επιτυγχάνεται με την ύπαρξη ισορροπίας παραγωγής, ε- νεργοποίησης και αναστολής μεταξύ των μεταλλοπρωτεϊνασών και των αναστολέων τους. [78] Αυτή η ισορροπία καθορίζει την τελική μορφολογία και ποσότητα συστατικών της θεμέλιας ουσίας, όπως το κολλαγόνο και η ελαστίνη. [128] Από τα παραπάνω είναι προφανές ότι η διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ μεταλλοπρωτεϊνασών και TIMPs είναι καθοριστική για την ομοιόσταση του κυττάρου και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και ότι πιθανή περίσσεια μεταλλοπρωτεϊνασών έναντι των α- ναστολέων τους είναι δυνατόν να οδηγήσει σε εκτεταμένη καταστροφή ιστών. [118] Ο ακριβής χρόνος της δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών δεν είναι επακριβώς καθορισμένος. Φαίνεται όμως ότι η δράση τους εκδηλώνεται στα πρώιμα στάδια μιας νόσου, αλλά οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι πιθανόν να λαμβάνουν μέρος και σε μεταγενέστερο στάδιο στη διαδικασία της επούλωσης. Συνεπώς η ενδογενής αναστολή τους γίνεται κατά τη διάρκεια αυτών ακριβώς των πρώιμων σταδίων. [78] Αυτή η απώλεια ισορροπίας έχει συνδεθεί με παθολογικές καταστάσεις, όπως η δημιουργία ιστικών βλαβών, [128] η μετάσταση νεοπλασμάτων [122], η φλεγμονή, [129] η διαδικασία επούλωσης, [130] και η αγγειογένεση. [131] 72

73 Όπως περιγράφηκε πιο πάνω, βασική λειτουργία των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι η αποδόμηση των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και η απομάκρυνση των προϊόντων αυτής της αποδόμησης. Η θεμέλια ουσία όμως, δεν είναι απλά ένας εξωκυττάριος σκελετός, αφού αποτελεί και δεξαμενή βιολογικά ενεργών μορίων, όπως αυξητικών παραγόντων. [132] Κάποια συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μπορεί να εκφράσουν σε πρώτο στάδιο μη εκδηλωθείσες βιολογικές λειτουργίες κατά τη διάρκεια της πρωτεόλυσης. Κατά συνέπεια, η αποδόμηση των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας μπορεί να μεταβάλει κυτταρικές συμπεριφορές, αλλά και κλινικές εκδηλώσεις. [113] Η πληθώρα βιολογικών λειτουργιών των μεταλλοπρωτεϊνασών οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η δράση τους είναι πολύ πιο πολύπλοκη και έμμεση από απλή αποδόμηση. Τα παραπάνω σε συνδυασμό με τον συνεχώς αυξανόμενο αριθμό πρωτεϊνών που δεν είναι συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, αλλά αποτελούν υπόστρωμα των μεταλλοπρωτεϊνασών, καθιστούν φανερή την πολυπλοκότητα του ρόλου τους σε φυσιολογικές αλλά και παθολογικές καταστάσεις. [133] Ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs) Οι ενεργοποιημένες μεταλλοπρωτεϊνάσες αναστέλλονται από διάφορους α- ναστολείς, από τους οποίους εκτενέστερα έχει μελετηθεί ο ιστικός αναστολέας των μεταλλοπρωτεϊνασών (tissue inhibitor of metalloproteinases, ΤΙΜΡ) [134] Μέχρι σήμερα, έχουν ανακαλυφθεί 4 ιστικοί αναστολείς: ο TIMP-1, [135] ο TIMP-2, [114] ο TIMP-3 [136] και ο TIMP-4. [137] Οι ΤΙΜPs αναστέλλουν όλες τις μεταλλοπρωτεϊνάσες σχηματίζοντας υψηλής συγγένειας, 1:1 σύμπλοκα. Η παραγωγή τους προάγεται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες όπως ο FGF, ο PDGF, η IL-10 και η IL-6. Μια σημαντική φαρμακοκινητική ιδιότητά τους είναι ότι ο χρόνος ημίσειας ζωής τους είναι μικρός. Οι ΤΙΜΡs παρουσιάζουν διαφορετικές χρωματογραφικές ιδιότητες, αντιγονικότητα, ΜΒ και αμινοτελικό τμήμα. Παράγονται σε φυσιολογικούς ιστούς, όπως οι χόνδροι, τα οστά, τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών, αναγνωρίζονται ως εκκριτικό προϊόν των αιμοπεταλίων και των μακροφάγων κυττάρων και απομονώνονται από το αμνιακό υγρό, τον ορό και το σάλιο. [138,139,140,141] Ο ΤΙΜΡ-1 αναστέλλει εκλεκτικά όλες τις γνωστές μεταλλοπρωτεϊνάσες, σχηματίζοντας κατά ένα μη αντιστρεπτό τρόπο στοιχειομετρικό σύμπλοκο 1:1 με τις ενεργείς μεταλλοπρωτεϊνάσες. [142,143] Oι TIMPs δεν επηρεάζουν τη δραστικότητα άλλων πρωτεασών, συμπεριλαμβανομένων των βακτηριδιακών κολλαγoνασών, της θερμολυσίνης και τις πρωτεάσες σερίνης, θειόλης και ασπαρτικού οξέος. Ο ΤΙΜΡ-2 συνίσταται από 126 αμινοξέα και στον άνθρωπο έχει ΜΒ kd. Σε αντίθεση με τον ΤΙΜΡ-1, ο ΤΙΜΡ-2 παρουσιάζει ιστική συγγένεια και με την ανενεργό μορφής της ΜΜΡ-2. Α- ναστολή ενός μορίου ανενεργού ΜΜΡ-2 απαιτεί δύο μόρια ΤΙΜΡ-2. Επίσης, πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι και ο ΤΙΜΡ-1 σχηματίζει ετεροπολικά 1:1 μοριακά σύμπλο- 73

74 κα με ανενεργό ΜΜΡ-9. Η λειτουργικότητα και φυσιολογική σημασία της σύνδεσης των ΤΙΜΡs με τις ανενεργές μορφές των ζελατινασών δεν είναι ξεκαθαρισμένη. Πιθανόν οι ΤΙΜΡs ελαττώνουν την ενζυμική δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών, είτε προλαμβάνοντας την πλήρη ενεργοποίησή τους, είτε εμποδίζοντας μερικά τη δραστικότητα των πλήρως ενεργοποιημένων ενζύμων. Ο ΤΙΜΡ-1 εκκρίνεται με ΜΒ 28,5 kd, φέροντας 2 ολιγοσακχαριτικές αλυσίδες σε κάθε Ν-γλυκοζυλιωμένο άκρο, οι οποίες όμως δεν είναι απαραίτητες για την ανασταλτική τους δράση. Επίσης, ο ΤΙΜΡ-1 περιέχει 6 δισουλφιδικούς δεσμούς, οι οποίοι είναι εξαιρετικά ανθεκτικοί σε ακραίες τιμές ph και θερμοκρασίας. Το σύμπλοκο ΤΙΜΡ-1- κολλαγονάσης δεν ενεργοποιείται από το ΑΡΜΑ, τη θρυψίνη, ή την πλασμίνη. Οι TIMPs έχουν και δράσεις ανεξάρτητες από τις μεταλλοπρωτεϊνάσες. Για παράδειγμα, λειτουργούν και ως αποπτωτικοί παράγοντες ή ως αυξητικοί παράγοντες διάφορων κυτταρικών σειρών. Ο πιο σημαντικός ρόλος τους όμως, είναι η ρύθμιση της δράσης των ΜΜΡs και η πρωτεολυτική δραστηριότητα των μεταλλοπρωτεϊνασών εξαρτάται από την ισορροπία τους με τους ΤΙΜPs. Οι TIMPs είναι εκλεκτικοί για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες γενικά και όχι για κάποια συγκεκριμένη μεταλλοπρωτεϊνάση. Η βιολογική εκλεκτικότητα τους προκαλείται από άλλους παράγοντες. Για παράδειγμα, ο TIMP-1 είναι μία επαγόμενη, ενώ ο TIMP-2 αποτελεί μη-επαγόμενη πρωτεΐνη. Και οι δύο είναι διαλυτοί και έχουν ευρεία κατανομή. Ο TIMP-3 βρίσκεται αποκλειστικά στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, ενώ ο TIMP-4 βρίσκεται κυρίως στον καρδιακό ιστό. Από τους ΤΙΜΡs διαδραματίζουν κυρίαρχο ρόλο οι TIMP-1 και ΤΙΜP-2. [144,145,146,147,148] Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και οι ειδικοί ιστικοί αναστολείς τους στο δέρμα και τη νοσολογία του Ο ρόλος των μεταλλοπρωτεϊνασών και των ΤΙΜΡs στη νοσολογία του δέρματος είναι ιδιαίτερα σημαντικός. Το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα του δέρματος (BCC) είναι ο πιο συχνός δερματικός όγκος στους ανθρώπους, κυρίως τους ηλικιωμένους και έχει άμεση αιτιολογική σχέση με την αθροιστική έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία και κυρίως στη UVB ακτινοβολία. [149] Το ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC) είναι κακοήθης όγκος των κερατινοκυττάρων της ακανθωτής στιβάδας της επιδερμίδας. Είναι ο δεύτερος σε συχνότητα δερματικός όγκος και έχει αποδεδειγμένα άμεση αιτιολογική σχέση με την αθροιστική έκθεση στην ηλιακή ακτινοβολία. [150,151] Οι μέχρι τώρα μελέτες έχουν αποδείξει την εκτεταμένη καταστροφή μορίων του εξωκυττάριου στρώματος, όπως της ινονεκτίνης και της λαμινίνης κατά τη διάρκεια της επιθηλιακής κυτταρικής διείσδυσης του όγκου. [152] Επίσης έχει διαπιστωθεί η καταστροφή του φυσιολογικού στρώματος του κολλαγόνου και η αποδιοργάνωσή του από τις κολλαγονάσες, φαινόμενο που έχει ιδιαίτερη σημασία για τη διεισδυτική ικανότητα του όγκου. [153] Οι ΜΜΡ-1 και ΜΜΡ-3 είναι αυξημένες και συγκεκριμένα, οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 δείχνουν αυξημένη έκφραση στο 74

75 βασικοκυτταρικό καρκίνωμα. [153] Επίσης οι αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών, οι ΤΙΜΡs, έχουν βρεθεί αυξημένες στο βασικοκυτταρικό καρκίνωμα. Εικόνα 24: Τρισδιάστατο μοντέλο της αναστολής των μεταλλοπρωτεϊνασών από TIMPs. Απεικονίζεται ο TIMP-2 και το καταλυτικό τμήμα της MT1-MMP. Αριστερά επάνω απεικονίζεται ο TIMP-2 ενώ αριστερά κάτω το καταλυτικό τμήμα της MT1- MMP. Οι β-πτυχές ονομάζονται από A J και οι α-έλικες από 1-4. Το σημείο της αλληλεπίδρασης με το καταλυτικό τμήμα απεικονίζεται μέσα στο τετράγωνο. Ο καταλυτικός Zn απεικονίζεται ως μια ροζ σφαίρα. Τα καταλυτικά μόρια κυστεΐνης απεικονίζονται με Cys. Στα δεξιά της εικόνας φαίνεται το τελικό σύμπλοκο που σχηματίζεται με στοιχειομετρία 1:1. Σύμφωνα με πρόσφατη μελέτη, η κύρια αναστολή των μεταλλοπρωτεϊνασών οφείλεται στην αυξημένη έκφραση του ΤΙΜΡ-2. (Εικ.24) Στατιστικώς σημαντικά υ- ψηλότερα επίπεδα του ΤΙΜΡ-2 έχουν βρεθεί σε λιγότερο διεισδυτικά BCC σε σύγκριση με διεισδυτικά BCC και SCC. [154] Στο SCC σε όλα τα όργανα εκφράζονται πολλές μεταλλοπρωτεϊνάσες. [155] Το επίπεδο της ενεργούς ΜΜΡ-2 μπορεί να ε- ξυπηρετήσει ως προγνωστικός παράγοντας της μεταστατικής δύναμης του όγκου 75

76 στο SCC της στοματικής κοιλότητας. [156] Επίσης, η αυξημένη ενεργότητα των ΜΜΡ-2 και MMP-9 έχει συσχετιστεί με αυξημένη διεισδυτικότητα στο SCC και μικρότερο διάστημα ελεύθερο νόσου, [157,158] ενώ το επίπεδο των ΜΜΡ-2 και MMP-9 είχε στατιστικώς σημαντικά αυξημένη έκφραση στο δερματικό SCC σε σύγκριση με το BCC. [159] Γενικά οι ΤΙΜΡs δείχνουν μία δραστηριότητα αυξητικών παραγόντων και αναστέλλουν τον ογκογενετικό και μεταστατικό φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων. [160] Το μελάνωμα είναι ένα άλλο χαρακτηριστικό παράδειγμα. Μεταναστευτικά ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν μεταλλοπρωτεϊνάσες που φαίνονται να είναι απαραίτητες για τον κατακερματισμό της βασικής μεμβράνης και του εξωκυττάριου στρώματος.[161] Αναστολή της ενδογενούς ΜΜΡ-2 σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική συνοχή. [162] Η σύγχρονη θεραπευτική σε συνάρτηση με τις μεταλλοπρωτεϊνάσες και τους ειδικούς ιστικούς αναστολείς τους στο δέρμα και τη νοσολογία του Ο σχεδιασμός συνθετικών ειδικών αναστολέων για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι στόχος τόσο του παρόντος όσο και του μέλλοντος. [163] Η δημιουργία συνθετικών αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών τα τελευταία χρόνια έχει πραγματοποιηθεί και οι αναστολείς αυτοί βρίσκονται σε ποικίλα στάδια κλινικών δοκιμών. Δύο από αυτούς τους αναστολείς, η μπατιμαστάτη και η μαριμαστάτη, έφτασαν μέχρι το 3 ο στάδιο των κλινικών δοκιμών, αλλά τελικά απέτυχαν. Η μπατιμαστάτη είναι ένας χαμηλού ΜΒ αναστολέας της δραστηριότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών. Φαίνεται να αναστέλλει την αύξηση του όγκου σε ποντίκια χωρίς θύμο, με μελάνωμα. [164] Η μαριμαστάτη ανήκει στη δεύτερη γενιά των χαμηλού ΜΒ αναστολέων της δραστηριότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών. Φαίνεται ότι και αυτή αναστέλλει την ανάπτυξη του μελανώματος στο προαναφερθέν ζωικό μοντέλο. [165] Οι κλινικές δομές και η προσπάθεια για την ανάπτυξη ειδικότερων αναστολέων είναι κάτι που θα απασχολήσει τη σύγχρονη φαρμακολογία στο μέλλον. Α.3. Ο υποδόριος ιστός ή υποδερμάτιο πέταλο Ο υποδόριος ιστός αποτελείται κυρίως από λιπώδη ιστό και περιέχει τα κύρια αιμοφόρα αγγεία και νεύρα, με τα οποία εφοδιάζεται το υπερκείμενο χόριο (Εικ. 1). Λειτουργεί ως θερμομονωτικό υλικό, ως διαμέρισμα αποθήκευσης θρεπτικών ουσιών, ως απορροφητικό των δονήσεων υλικό και σε αυτόν επεκτείνονται συνήθως διάφορα εξαρτήματα του δέρματος. [2] 76

77 Α.4. Εξαρτήματα του δέρματος Εξαρτήματα του δέρματος αποτελούν οι τρίχες, οι σμηγματογόνοι αδένες, οι εκκρίνεις και αποκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες και οι μαστικοί αδένες. Α.4.1. Οι τρίχες Οι τρίχες αποτελούν νηματώδεις, κερατινοποιημένες δομές, οι οποίες προβάλλουν από την επιδερμίδα. Καλύπτουν σχεδόν όλη την επιφάνεια του σώματος, με εξαίρεση το ερυθρό κράσπεδο των χειλέων, τις παλάμες, τα πέλματα και τις πλάγιες επιφάνειές τους, τη ραχιαία επιφάνεια των πρώτων φαλάγγων των δακτύλων των άκρων χειρών και ποδών, τη βάλανο του πέους και της κλειτορίδας, τα μικρά χείλη του αιδοίου και την προδομική όψη των μεγάλων χειλέων του αιδοίου. [2,6,7] Α Τριχοθυλάκια Τα τριχοθυλάκια, είναι τα όργανα από τα οποία προέρχονται οι τρίχες, αναπτύσσονται από επιδερμικές καταδύσεις που εισδύουν στο χόριο, στον υποδόριο ιστό ή και στα δύο και περιβάλλονται από πυκνές συναθροίσεις ινώδους συνδετικού ιστού που ανήκει στο χόριο (Εικ.1). Το διευρυσμένο άκρο του τριχοθυλακίου, η ρίζα της τρίχας, παρουσιάζει εγκόλπωση, η οποία περιέχει χόριο, ονομάζεται θηλή της τρίχας και περιέχει άφθονα τριχοειδή, αμύελες και εμμύελες νευρικές απολήξεις. Οι εξωτερικές στιβάδες του επιθηλίου του τριχοθυλακίου σχηματίζουν το έξω έλυτρο της ρίζας που περιβάλει το έσω έλυτρο, το οποίο αποτελείται από τρία επιμέρους στοιχεία: α) τη μονήρη στιβάδα των κυττάρων του Henle, β) την παχύτερη στιβάδα του Huxley από μία ή δύο στιβάδες αποπεπλατυσμένων κυττάρων και γ) το περιτρίχιο ή επιδερμίδιο, αποτελούμενο από αλληλοεπικαλυπτόμενα πέταλα κερατίνης. [166,167] Το στέλεχος της τρίχας είναι η επιμήκης λεπτή νηματώδης δομή που προβάλλει από την επιφάνεια της επιδερμίδας. (Εικ.1) Από τη μεσότητα του τριχοθυλακίου μέχρι τη θηλώδη στιβάδα του χορίου εκτείνονται υπό λοξή γωνία οι ορθωτήρες μυς των τριχών, από λείες μυϊκές ίνες. Οι μυς αυτοί συμβάλλουν στην υποστήριξη του τριχοθυλακίου και του στελέχους της τρίχας, ενώ παράλληλα η συστολή τους ανορθώνει τις τρίχες, προσδίδοντας σ αυτές μία κατακόρυφη θέση και τη χαρακτηριστική εμφάνιση του «χήνειου δέρματος», όταν κάποιος κρυώνει ή τρομάζει ξαφνικά. Α.4.2. Σμηγματογόνοι αδένες Απαντούν στο χόριο και τον υποδόριο ιστό ολόκληρου του σώματος, πλην των παλαμών και των πελμάτων. Είναι αφθονότεροι στο πρόσωπο, το τριχωτό της 77

78 κεφαλής, στον πρωκτό και γύρω από το αιδοίο. Αποτελούνται από λόβια με μεγάλα διαυγή κύτταρα με άφθονα λιποσταγονίδια και μικρούς πυρήνες. Το έκκριμά τους, το σμήγμα, αποτελεί κηρώδες, λιπαρό μίγμα χοληστερόλης, τριγλυκεριδίων, υπολειμμάτων εκκριτικών κυττάρων και πιστεύεται ότι προάγει τη διατήρηση της δομής του δέρματος και της ευκαμψίας των τριχών. Οι αδένες βρίσκονται υπό την επίδραση φυλετικών ορμονών και αυξάνουν έντονα τη δραστηριότητά τους μετά την έναρξη της ήβης. [168] Α.4.3. Εκκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες Ο αριθμός αυτών των απλών πολυέλικτων σωληνοειδών αδένων ανέρχεται σε 3 έως 4 εκατομμύρια και αποτελούν σημαντικά θερμορυθμιστικά όργανα. Αφθονούν σε όλο το δέρμα, ιδιαίτερα στο μέτωπο, το τριχωτό της κεφαλής, στις μασχάλες, στις παλάμες και στα πέλματα, εκκρίνουν το προϊόν τους, τον ιδρώτα, ένα υποτονικό υδαρές διάλυμα με ουδέτερο και ελαφρά όξινο ph που περιέχει διάφορα ιόντα, όπως Na +, K+, Cl - και νευρώνονται από μεταγαγγλιακές ίνες του συμπαθητικού νευρικού συστήματος. Το εκκριτικό τμήμα τους εκβάλλει σε λεπτό πολυέλικτο πόρο που διασχίζει το χόριο και την επιδερμίδα και εκβάλλει στην επιφάνεια του δέρματος. [1,2,3] Α.4.4. Αποκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες Οι αποκρινείς ιδρωτοποιοί αδένες, πολύ μεγαλύτεροι από τους εκκρινείς ι- δρωτοποιούς αδένες, κατασκηνούν στα βαθύτερα στρώματα του χορίου και στον υποδόριο ιστό. Αναπτύσσονται κυρίως στην περινεϊκή χώρα, γύρω από τον πρωκτό και τα γεννητικά όργανα, καθώς και στη μασχαλιαία περιοχή. Η έκκρισή τους, χαρακτηριστικής οσμής, βρίσκεται υπό την επίδραση ορμονών και δεν αρχίζει πριν την ήβη. [1,2,3] 78

79 Β. Η ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΕΠΟΥΛΩΣΗΣ ΤΟΥ ΔΕΡΜΑΤΟΣ Τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως οι μεταλλοπρωτεϊνάσες, οι γλυκοζαμινογλυκάνες και οι πρωτεογλυκάνες, καθώς και κάποια αμινοξέα, όπως η αργινίνη, διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στις διαδικασίες επούλωσης των τραυμάτων. Η επούλωση του τραύματος που επιτελείται από αλληλένδετα και αλληλοεξαρτώμενα πολλαπλά φαινόμενα, είναι μία σύνθετη και πολύπλοκη διαδικασία, α- παραίτητη για κάθε οργανισμό, με σκοπό τη δομική, λειτουργική και ανατομική α- ποκατάσταση των ιστών που έχουν υποστεί βλάβες. Ένα τραύμα θεωρείται επουλωμένο όταν έχει γίνει η κατάλληλη επικάλυψη, η αποκατάσταση της συνέχειας του ιστού κατά μήκος της βλάβης και όταν έχει επιτελεστεί η σταθερότητα των ιστών η οποία πρέπει να πλησιάζει τη φυσιολογική. Η επικάλυψη κατορθώνεται με την επανεπιθηλιοποίηση και τη ρίκνωση του τραύματος και η αποκατάσταση της συνέχειας του ιστού με την παραγωγή νέου κολλαγόνου. Η δύναμη ελκισμού επιτυγχάνεται με την εναπόθεση αρκετού νεοσύστατου και κατάλληλα αναδιαμορφωμένου κολλαγόνου. Οι μηχανισμοί της επούλωσης, εξαρτώμενοι από την εντόπιση, το βάθος, το μέγεθος και τη μορφή του τραύματος, είναι πολύμορφοι και εξελίσσονται παράλληλα και ταυτόχρονα σε αρκετές κατευθύνσεις, αποτελώντας όμως τελικά ένα ενιαίο σύνολο διεργασιών, με κοινό στόχο και αποτέλεσμα. Για περιγραφικούς λόγους και σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία [169,170] μπορούμε να διακρίνουμε τρεις (κάποιοι αναφέρουν τέσσερις) φάσεις στη διαδικασία της επούλωσης: Α. Φάση της φλεγμονής (inflammatory) Β. Παραγωγική φάση (proliferative), φάση σχηματισμού του κοκκιώδους ι- στού, παραγωγής κολλαγόνου και αγγειογένεσης Γ. Φάση επανασχηματισμού (remodeling) και αναδιαμόρφωσης του τραύματος. Τα στάδια αυτά ακολουθούνται στην επούλωση όλων σχεδόν των ιστών, εμφανίζοντας μικρές διαφορές ανάλογα με τον ιστό και τη φύση της ιστικής κάκωσης, ιδιαίτερα δε η διαδικασία της επούλωσης έχει περιγραφεί εκτενέστερα για το δέρμα, γι αυτό και θα παρατεθούν οι αρχές της επούλωσης αυτού. (Εικ.25) 79

80 Εικόνα 25: Στάδια της επούλωσης κατά πρώτο (αριστερά) και κατά δεύτερο σκοπό (δεξιά). Στην τελευταία περίπτωση, η προκύπτουσα ουλή είναι κατά πολύ μικρότερη από το αρχικό τραύμα, λόγω της συστολής του τραύματος. (Από Robbins, Basic Pathology.) Η διεργασία της επούλωσης ξεκινά εντός 24 ωρών από την εγκατάσταση της βλάβης και περιλαμβάνει μετανάστευση ινοβλαστών και επαγωγή του πολλαπλασιασμού ινοβλαστών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε 3-5 ημέρες, ένας εξειδικευμένος τύπος ιστού, χαρακτηριστικός των διεργασιών επούλωσης, που καλείται κοκκιώδης ιστός, έχει ήδη εγκατασταθεί. Η ιστολογική του εικόνα χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό ινοβλαστών και νεοσχηματιζόμενα λεπτοτοιχωματικά τριχοειδή αγγεία, εντός χαλαρής εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Στη συνέχεια, στον κοκκιώδη ιστό αθροίζεται, προοδευτικά, θεμέλια ουσία συνδετικού ιστού, με τελικό αποτέλεσμα τον σχηματισμό ινώδους ιστού (ουλοποίηση), ο οποίος υφίσταται περαιτέρω αναδιαμόρφωση σε βάθος χρόνου. 80

81 Β.1. Φάση της φλεγμονής Η έναρξη της φλεγμονώδους φάσης είναι το πρώτο στάδιο της διαδικασίας της επούλωσης και προκαλείται μετά από εγχείρηση ή τραυματική κάκωση, ανεξαρτήτως του μηχανισμού της βλάβης, δηλαδή αν προκλήθηκε από ισχαιμία, έγκαυμα ή κάκωση από πλήξη. Η αρχική αντίδραση στην περιοχή της βλάβης είναι η αιμορραγία, [171] λόγω διατομής και καταστροφής των αγγείων στο σημείο επίδρασης του βλαπτικού παράγοντα. Κάθε λύση της συνέχειας του δέρματος επιτρέπει την είσοδο των μικροβίων, με αποτέλεσμα να ενεργοποιούνται αμυντικοί μηχανισμοί και να αρχίζει έτσι η διεργασία της επούλωσης. (Εικ.26) Εικόνα 26: Στάδια της διεργασίας αγγειογένεσης. Το μητρικό ώριμο αγγείο απεικονίζεται στο αριστερό μέρος της εικόνας. (1) Αποδόμηση της βασικής μεμβράνης και της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ECM), (2) μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, (3) πολλαπλασιασμός ενδοθηλιακών κυττάρων (μίτωση), (4) οργάνωση και ωρίμανση, που περιλαμβάνουν επιστράτευση αγγειακών περικυττάρων ή λείων μυϊκών κυττάρων. Με τον αριθμό 5 καταδεικνύεται η αυξημένη διαπερατότητα, λόγω των μεσοκυττάριων χασμάτων και της αυξημένης διακύτωσης. Η αυξημένη αυτή διαπερατότητα επιτρέπει την εναπόθεση πρωτεϊνών του πλάσματος (π.χ. ινωδογόνου) στην εξωκυττάρια ουσία και παρέχει το στρώμα για την ανάπτυξη ινοβλαστών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Επίσης, ευθύνεται για το οίδημα που παρατηρείται στον κοκκιώδη ιστό (Τροποποιημένο από Motamed K, Sage EH: Regulation of vascular morphogenesis by SPARC. Kidney Int 51:1383, 1997). (Από Robbins, Basic Pathology.) Αμέσως μετά την αιμορραγία ακολουθεί η αγγειοσύσπαση των αρτηριδίων, διάρκειας περίπου 5-20 λόγω της απελευθέρωσης και της επίδρασης κατεχολαμινών, θρομβοξάνης, σεροτονίνης και αιμοπεταλίων. [172] Η αγγειοσύσπαση αυτή 81

82 κατά μεγάλο μέρος αποδίδεται σε αντανακλαστικούς νευρογενείς μηχανισμούς και ενισχύεται από τοπική έκκριση παραγόντων, όπως η ενδοθηλίνη (ισχυρή αγγειοσυσταλτική ουσία προερχόμενη από το ενδοθήλιο). Ωστόσο, η επίδρασή της είναι πρόσκαιρη και η αιμορραγία θα συνεχιζόταν εάν δεν συνέβαινε η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και το σύστημα πήξης του αίματος. Η ενδοθηλιακή βλάβη εκθέτει την ιδιαίτερα θρομβογόνο εξωκυττάρια ουσία επιτρέποντας τα αιμοπετάλια (τα κύτταρα που έρχονται σε επαφή με το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο) να προσκολληθούν και να ενεργοποιηθούν, δηλαδή να μεταβάλλουν το σχήμα τους και να απελευθερώσουν το περιεχόμενο των κοκκίων τους. Μέσα σε λίγα λεπτά, οι εκκρινόμενες ουσίες επιστρατεύουν επιπλέον αιμοπετάλια τα οποία συσσωρεύονται στο συγκεκριμένο σημείο, με αποτέλεσμα το σχηματισμό θρόμβου και τη διακοπή της αιμορραγίας. Στη συνέχεια, παρατηρείται αγγειοδιαστολή και οίδημα τοπικά, εξαιτίας της ισταμίνης που απελευθερώνεται από τα βασεόφιλα και τα σιτευτικά κύτταρα καθώς και τα εκτός των αγγείων αιμοπετάλια, [173] τα οποία είναι τα πρώτα κύτταρα που λαμβάνουν μέρος στη διαδικασία της επούλωσης. Έτσι, από τη λύση αυτών των κυττάρων απελευθερώνονται συστατικά τους, όπως: α) α-κοκκία που περιέχουν αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι προκαλούν χημειοτακτική δράση στα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα, τα μακροφάγα και έχουν αγγειογενετική δράση.[174] Κυριώτεροι από τους αυξητικούς παράγοντες είναι: ο παράγοντας του Von Willebrand, ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF), ο αιμοπεταλιακός παράγοντας 4, ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας α και β (TGF-α και -β) β) σεροτονίνη γ) λυσοσωμάτια, που περιέχουν ελαστάση, κολλαγενάση και όξινες υδρολάσες. Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων προκαλεί ενεργοποίηση του καταρράκτη της πήξης, και των δύο οδών αυτού, της ενδογενούς και της εξωγενούς. [175,176] Ο καταρράκτης της πήξης ουσιαστικά συνίσταται σε μία σειρά από μετατροπές μη δραστικών προενζύμων σε ενεργοποιημένα ένζυμα και κορυφώνεται με την παραγωγή της θρομβίνης. Η θρομβοκινάση που απελευθερώνεται από τα αιμοπετάλια και τους ιστούς μετατρέπει την προθρομβίνη σε θρομβίνη. Στη συνέχεια η θρομβίνη μετατρέπει τη διαλυτή πρωτεΐνη του πλάσματος, ινωδογόνο, στην αδιάλυτη πρωτεΐνη ινώδες, που αποτελεί τον ισχυρό θρόμβο και όταν αποξηρανθεί σχηματίζει την εσχάρα του τραύματος. Έναυσμα για τον καταρράκτη της ενδογενούς οδού [177] είναι η επαφή του εξαγγειωμένου αίματος με το υπενδοθηλιακό κολλαγόνο, που ε- νεργοποιεί τον παράγοντα ΧΙΙ (Hageman). Aντίθετα, κινητήριο μοχλό για την ενεργοποίηση της εξωγενούς οδού [177] αποτελεί ο ιστικός παράγοντας θρομβοπλαστίνη, μία λιποπρωτεΐνη που απελευθερώνεται από τους ιστούς που υφίστανται κάκωση. [178] Αποτέλεσμα της ενεργοποίησης των δύο αυτών οδών είναι τελικά ο σχηματισμός ινικής, [179,180] ενώ παράλληλα ο ενεργοποιημένος παράγοντας ΧΙΙ 82

83 ενεργοποιεί τον μηχανισμό του συμπληρώματος, το σύστημα βραδικινίνης, ισταμίνης, σεροτονίνης και την παραγωγή πλασμίνης. Ταυτόχρονα, ενεργοποιείται και η αλυσίδα του συμπληρώματος από την παρουσία IgM και IgG ανοσοσφαιρινών (κλασική οδός), ή ενδοτοξινών (εναλλακτική οδός). Η ενεργοποίηση του συμπληρώματος οδηγεί στον σχηματισμό των παραγόντων C5α και C3α. Οι παράγοντες αυτοί προκαλούν απελευθέρωση ισταμίνης από τα σιτευτικά κύτταρα, ενώ ασκούν και χημειοτακτική δράση στα πολυμορφοπύρηνα και προάγουν τη φαγοκυττάρωση. [181,182] Αποτέλεσμα της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων και του πηκτικού μηχανισμού είναι η δημιουργία ενός λειτουργικά πολύτιμου πλέγματος ινικής, που αφενός περιορίζει την αιμορραγία στην περιοχή της βλάβης και αφετέρου συγκρατεί τα τραυματικά χείλη, έχοντας μάλιστα την τάση να τα συμπλησιάζει. Δευτερογενώς, θα αποτελέσει και το υπόστρωμα για τη μετανάστευση, εγκατάσταση και πολλαπλασιασμό των κυττάρων που θα ολοκληρώσουν τη διαδικασία της επούλωσης. Τέτοια κύτταρα είναι τα πολυμορφοπύρηνα, τα μακροφάγα, οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των νεόπλαστων αγγείων. [179,180] Tα ουδετερόφιλα πολυμορφοπύρηνα είναι τα πρώτα κύτταρα που μεταναστεύουν στο σημείο της βλάβης. Η παρουσία τους, αν και δεν θεωρείται απαραίτητη, εξασφαλίζει την ολοκλήρωση της διαδικασίας της επούλωσης χωρίς τον κίνδυνο των λοιμώξεων. Τα πολυμορφοπύρηνα συγκεντρώνονται στο σημείο της βλάβης ήδη από τα πρώτα λεπτά μετά την ιστική κάκωση, ενώ ο αριθμός τους προσεγγίζει τον μέγιστο κατά τις πρώτες ώρες. [183] Το κατεστραμμένο ενδοθήλιο των τραυματισμένων αγγείων, η αυξημένη διαπερατότητα αυτών και οι χημειοτακτικοί παράγοντες που εκλύονται τοπικά, βοηθούν τη συγκέντρωση των πολυμορφοπυρήνων. Χημειοτακτικοί παράγοντες που δρουν τοπικά είναι οι παράγοντες C5α και C3α του συμπληρώματος, η ιντερλευκίνη-1, ο αιμοπεταλιακός παράγων 4, προϊόντα αποδόμησης μικροβίων, οι TNF-α και TNF-β. Η σελεκτίνη είναι μόριο προσκόλλησης και δρα με τη μορφή υποδοχέα στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων, προάγοντας την προσκόλληση των πολυμορφοπυρήνων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. [184] Η ιντεγκρίνη, ένα ακόμα μόριο προσκόλλησης, είναι υποδοχέας των πολυμορφοπυρήνων προάγοντας την προσκόλλησή τους στη θεμέλια ουσία. [185] Η αλληλεπίδραση και αθροιστική δράση των δύο αυτών μορίων είναι σημαντική για τη μετανάστευση των πολυμορφοπυρήνων και τη διαπίδυσή τους μέσω της ενδοθηλιακής μεμβράνης. Η αποστολή των κυττάρων αυτών είναι να αποτελέσουν την πρώτη αμυντική γραμμή του οργανισμού έναντι των λοιμώξεων στην περιοχή της βλάβης. [186] Αυτό επιτυγχάνεται με τη φαγοκυττάρωση των βακτηριδίων εισβολέων στην περιοχή της βλάβης με την επίδραση των οψωνινών. Παράγουν μικροβιοκτόνες ουσίες, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου, τις ρίζες υδροξυλίου και το ιόν του υδροξυλίου, ενώ με τη βοήθεια πρωτεολυτικών ενζύμων, όπως η ελαστάση και η κολλαγενάση, καταστρέφουν τους 83

84 δυνητικά λοιμογόνους παράγοντες. Τα πολυμορφοπύρηνα δεν έχουν την ικανότητα να ανασυνθέτουν τα ένζυμα, γι αυτό και νεκρώνονται, αποσυντίθενται και αντικαθίστανται από μακροφάγα μετά το τέλος της φαγοκυτταρικής διαδικασίας. [187] Ο α- ριθμός και ο χρόνος παραμονής τους, είναι συνάρτηση του αριθμού των βακτηριδίων που επιμολύνουν την περιοχή του τραύματος. [188] Η παρουσία μακροφάγων από την άλλη είναι απαραίτητη για τη διαδικασία της επούλωσης, σε βαθμό που αυτή είναι αδύνατο να επιτευχθεί χωρίς αυτά. [189] Σε φυσιολογικές συνθήκες οι ιστοί συγκεντρώνουν μικρό αριθμό μακροφάγων, με την έναρξη όμως της φλεγμονώδους φάσης, αυτά πολλαπλασιάζονται με ταχείς ρυθμούς, ως αποτέλεσμα της απελευθέρωσης χημειοτακτικών και αυξητικών παραγόντων, οι οποίοι με τη σειρά τους προσελκύουν και ενεργοποιούν τα μονοπύρηνα, τα οποία τελικά θα μετατραπούν σε μακροφάγα. [190] Η διαδικασία της χημειοταξίας τους αρχίζει 24 περίπου ώρες μετά την ιστική κάκωση και κορυφώνεται σε τρεις περίπου ημέρες. Κινητήριο μοχλό για την ενεργοποίηση των μακροφάγων αποτελούν οι αυξητικοί παράγοντες που απελευθερώνονται από τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. [185] Η ενεργοποίηση των μακροφάγων προκαλεί την έναρξη μιας σειράς αντιδράσεων και λειτουργιών που είναι απαραίτητες για τη διαδικασία της επούλωσης, όπως για παράδειγμα η φαγοκυττάρωση. Τα μακροφάγα έχουν την ικανότητα μέσω αυτής της λειτουργίας να καταστρέφουν βακτηρίδια, νεκρωμένα κύτταρα και ανενεργά πολυμορφοπύρηνα. [191,192] Σε αντίθεση με τα τελευταία μάλιστα, έχουν την ικανότητα να ανασυνθέτουν τα κυτταρικά τους ένζυμα, ώστε να παραμένουν στην περιοχή της βλάβης ενεργά και αποτελεσματικά ως αμυντικός μηχανισμός για πολύ μακρύτερο χρονικό διάστημα. Προϋπόθεση για την αποτελεσματική φαγοκυττάρωση είναι η επαρκής οξυγόνωση, αφού η πρώτη επιτυγχάνεται με την απελευθέρωση ελεύθερων ριζών οξυγόνου, διαδικασία που απαιτεί συγκεντρώσεις οξυγόνου στους ιστούς σε φυσιολογικά επίπεδα, ή τουλάχιστον μεγαλύτερες των mmhg. [189] H αμυντική ικανότητα των μακροφάγων εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό και από την παραγωγή οξειδίου του αζώτου (ΝΟ), μορίου που ασκεί μικροβιοκτόνο δράση. [190,193,194] Η παραγωγή αυτού του μορίου οφείλεται σε ένα βαθμό στα πολυμορφοπύρηνα, η κύρια πηγή του όμως είναι τα μακροφάγα. Σχηματίζεται με την επαγωγική συνθάση του ΝΟ και έχει κυτταροτοξική, μικροβιοκτόνο και αγγειοδιασταλτική δράση, ενώ αναστέλλει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων και προάγει την εναπόθεση του κολλαγόνου και της θεμέλιας ουσίας. Η ενεργοποίηση των μακροφάγων προκαλεί με τη σειρά της, απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων (PDGF, FGF, TGF-b1) [195] και κυτταροκινών (TNF-α, IL-1B, IL-2, IL-6). [196,197,198,199,200] Ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) παρά το γεγονός ότι απελευθερώνεται από τα κοκκία α των αιμοπεταλίων έπειτα από ε- νεργοποίηση, παράγεται επίσης από ενεργοποιημένα μακροφάγα, ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα, καθώς και από διάφορα καρκινικά κύτταρα. Ο παράγοντας ε- πάγει τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών, των λείων μυϊ- 84

85 κών κυττάρων και των μονοκυττάρων, αλλά διαθέτει και άλλες αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες. Οι αυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών (FGF), που παράγονται από μακροφάγα και άλλα κύτταρα, αποτελούν οικογένεια πολυπεπτιδίων, τα οποία συνδέονται ισχυρά με την ηπαρίνη και άλλα ανιοντικά μόρια και συνεπώς εμφανίζουν ισχυρή χημική συγγένεια προς τις βασικές μεμβράνες. Εκτός από τη διέγερση της αύξησης, εμφανίζουν και διάφορες άλλες δραστηριότητες. Ιδιαίτερα ο βασικός FGF επιστρατεύει μακροφάγα και ινοβλάστες σε θέσεις βλάβης και έχει την ικανότητα να επάγει όλα τα στάδια που απαιτούνται για την αγγειογένεση. Ο TGF-β παράγεται σε ανενεργό μορφή από διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοπεταλίων, ενδοθηλιακών κυττάρων, Τ-λεμφοκυττάρων και ενεργοποιημένων μακροφάγων, απαιτείται δε πρωτεολυτική διάσπαση (π.χ από πλασμίνη) προκειμένου να καταστεί λειτουργικός. Διεγείρει τη χημειοταξία των ινοβλαστών και την παραγωγή κολλαγόνου και ινονεκτίνης από αυτά, ενώ παράλληλα αναστέλλει τη διάσπαση της εξωκυττάριας ουσίας από μεταλλοπρωτεϊνάσες. Οι αυξητικοί παράγοντες και οι κυτταροκίνες με τη σειρά τους προάγουν την παραγωγή κολλαγόνου και την αγγειογένεση [201,202,203,204,205,206] ενώ διεγείρουν τα επιθηλιακά κύτταρα αλλά και τα λεμφοκύτταρα. Αξίζει να σημειώσουμε ότι η παραγωγή των αγγειογενετικών παραγόντων εξαρτάται από την παρουσία υψηλών συγκεντρώσεων γαλακτικού οξέος. [207,208] Τα ενεργοποιημένα μακροφάγα προκαλούν με τη σειρά τους ενεργοποίηση άλλων ανοσοεργών κυττάρων, όπως τα Τ-λεμφοκύτταρα, [209,210,211,212] τα οποία μεταναστεύουν στο σημείο της βλάβης μαζί με τα μακροφάγα και σε αντίθεση με τα Β-λεμφοκύτταρα δεν λείπουν ποτέ από αυτή τη διαδικασία. Τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα παράγουν τον χημειοτακτικό παράγοντα των μακροφάγων (Macrophage Chemotactic Factor, MCF), τον ανασταλτικό παράγοντα των μακροφάγων (Macrophage Inhibiting Factor, MIF), ιντερλευκίνες, ιντερφερόνες και ενεργοποιητικούς παράγοντες των αποικιών της αιμοποιητικής σειράς (Colony Stimulating Factors, MCSF). [213,214, 215,216] Τα Τ-λεμφοκύτταρα εμφανίζονται στην περιοχή της βλάβης μαζί με τα μακροφάγα, αρχικά είναι λίγα σε αριθμό, ενώ ο αριθμός τους φθάνει στη μέγιστη τιμή του 7-8 ημέρες μετά την κάκωση και διατηρείται για μακρύτερο χρονικό διάστημα. Διαδραματίζουν έτσι σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της χρόνιας φλεγμονής, παρά στα αρχικά στάδια της επούλωσης. [213] Μακροφάγα και λεμφοκύτταρα απομακρύνονται από το τραύμα καθώς προχωρά η διαδικασία της επούλωσης. Οι μηχανισμοί που τροποποιούν τη συμπεριφορά αυτή των κυττάρων είναι ουσιαστικά μέχρι στιγμής άγνωστοι και έχουν διατυπωθεί θεωρίες που τη συνδέουν με την τοπική υποξία και την αυξημένη συγκέντρωση του γαλακτικού οξέος. Αργότερα, όταν η οξυγόνωση βελτιωθεί, σταματά η παραγωγή των αυξητικών παραγόντων, ώστε τελικά να είναι πολύ μικρότερα τα ε- ρεθίσματα πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων και σταδιακά να απομακρυν- 85

86 θούν ακόμα και τα τελευταία μακροφάγα και λεμφοκύτταρα. Σε περιπτώσεις χρόνιων φλεγμονών και υπερτροφικών ουλών έχουν παρατηρηθεί αυξημένες συγκεντρώσεις τόσο μακροφάγων όσο και λεμφοκυττάρων για μεγάλα χρονικά διαστήματα, που σε ορισμένες περιπτώσεις ξεπερνούν τους 4-5 μήνες μετά την ιστική βλάβη. [217, 218,219] Είναι βέβαια αυτονόητο, ότι τα επιθηλιακά κύτταρα διαδραματίζουν έναν από τους σπουδαιότερους ρόλους στη διαδικασία της επούλωσης των τραυμάτωνκακώσεων. Προερχόμενα από τη βασική στιβάδα του δέρματος, όπου αυτή βέβαια δεν έχει καταστραφεί, πολλαπλασιάζονται, με στόχο να καλύψουν το έλλειμμα των κατεστραμμένων ιστών και τελικά την αποκατάσταση της συνέχειας και της ακεραιότητας του ιστού που υπέστη την κάκωση. Με τη βοήθεια των ψευδοποδίων, που έχουν την ιδιότητα να προεκβάλλουν, προσεγγίζουν και προσκολλώνται στους υποδοχείς της ιντεγκρίνης στη διάμεση ουσία [220] ενώ παραμένουν στο σημείο του τραύματος μέχρι να σχηματισθεί μία πλήρης στιβάδα από επιθηλιακά κύτταρα. Παράγοντες, όπως η ανάπτυξη βακτηριδίων, η παρουσία νεκρωμάτων και η άφθονη παραγωγή εξιδρωμάτων, καθυστερούν και μπορεί ακόμα και να αναστείλουν την επιθηλιοποίηση, επιμηκύνοντας τη φλεγμονώδη φάση και καταλήγουν στη δημιουργία ανεπαρκούς ουλής και επούλωσης. Στα χειρουργικά τραύματα η μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων αρχίζει από το πρώτο 24ωρο και ολοκληρώνεται σε 72 ώρες. [221,222,223] Παράλληλα με την επιθηλιακή κάλυψη του τραύματος, τα επιθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν και μία σειρά από αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες, όπως TGF-a, TGF-b, TNF-a, IL-1, IL-3 και παράγοντες ενεργοποίησης αποικιών κοκκιοκυττάρων /μακροφάγων. [224,225,226] Η ιντερλευκίνη-1 προάγει τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και την παραγωγή κολλαγόνου τύπου Ι και ΙΙΙ, προετοιμάζοντας την επόμενη φάση και η ιντερλευκίνη-6 διεγείρει τη σύνθεση των πρωτεϊνών του ήπατος που αναστέλλουν τη συνέχιση της φλεγμονώδους φάσης. [227,228] Β.2. Παραγωγική φάση Οι ινοβλάστες και τα ενδοθηλιακά κύτταρα παίζουν κύριο ρόλο στη φάση αυτή, κατά την οποία γίνεται εναπόθεση κολλαγόνου, αγγειογένεση και σχηματισμός κοκκιώδους ιστού. Το στάδιο αυτό αρχίζει την 3 η ημέρα και ολοκληρώνεται την 14 η ημέρα μετά την ιστική βλάβη. [229,230,231,232,233,234,235] Τα κυριότερα φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα είναι η αγγειογένεση, η εναπόθεση κολλαγόνου και η δημιουργία κοκκιώδους ιστού. (Εικ. 27) 86

87 Εικόνα 27: Κοκκιώδης ιστός, στον οποίο παρατηρούνται πολυάριθμα αγγεία, οίδημα και χαλαρή ECM που περιέχει διάσπαρτα φλεγμονώδη κύτταρα. Πρόκειται για τρίχρωμη χρώση που χρωματίζει το κολλαγόνο κυανό. Στο παρασκεύασμα φαίνεται ελάχιστη ποσότητα ώριμου κολλαγόνου. (Από Robbins, Basic Pathology.) Οι ινοβλάστες μεταναστεύουν στην περιοχή του τραύματος από τους γύρω ιστούς, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα προέρχονται από τα υγιή τριχοειδή γύρω από τη βλάβη. Σχηματίζονται νέα τριχοειδή μέσα στο χαλαρό ιστό του τραύματος, που συγχρόνως παράγει κολλαγόνο και στηρίζει τα νεοσχηματισμένα αγγεία. Ο ιστός αυτός ονομάζεται κοκκιώδης και αποτελείται από υπόστρωμα ινικής, ινονεκτίνης, κολλαγόνου, γλυκοζαμινογλυκανών και υαλουρονικού οξέος. Η ονομασία του οφείλεται στην κοκκιώδη υφή, επειδή σε τραύματα με μεγάλη απώλεια ιστών και ε- πούλωση κατά δεύτερο σκοπό, από τα στοιχεία του ιστού αυτού, δίνεται τελικά κοκκιώδης υφή στο τραύμα. Σε κάθε κοκκιώδη σχηματισμό του νεόπλαστου ι- στού αντιστοιχεί ένα νεόπλαστο αγγείο, το οποίο έχει την ιδιότητα να αιμορραγεί πολύ και εύκολα. Επιπλέον περιέχει μακροφάγα, ινοβλάστες και νεοσχηματισμένα αγγεία. [236,237,238] Παράγοντες που προάγουν τον πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι αυτοί που εκκρίνονται από τα αιμοπετάλια και τα μακροφάγα. [227] Οι ινοβλάστες που παραμένουν στους ιστούς σε αδρανή κατάσταση, ενεργοποιούνται από τους αυξητικούς παράγοντες, όπως οι PDGF, TGFb1 και EGF, πολλαπλασιάζονται και μετακινούνται στην περιοχή της βλάβης, ενώ ταυτόχρονα παράγουν τη διάμεση ουσία. [239] Αρχικά, εγκαθίστανται στις άκρες της προσβεβλημένης περιοχής και εκτίθενται έτσι σε ένα περιβάλλον πλούσιο σε αυξητικούς παράγοντες και σε συνθήκες σχετικής υποξίας (ΡΟ2 40), γεγονός που εξασφαλίζει την αθρόα παραγωγή κολλαγόνου, ελαστίνης και κολλαγενάσης, ενζύμου απαραίτητου για τη μεταγενέστερη αποδόμηση του κολλαγόνου. [212,240,241] Καθ όλη τη διάρκεια της επούλωσης η σύνθεση και η αποδόμηση του κολλαγόνου είναι διαδικασίες που συμβαίνουν ταυτόχρονα και σε αρμονική ισορροπία, ώστε να εξασφαλίζεται η παραγωγή του κολλαγόνου που είναι απαραίτητο. Η σύνθεση του κολλαγόνου λαμβάνει χώρα αρχικά ενδοκυττάρια με την παραγωγή τροποκολλαγόνου, που πολυμερίζεται αργότερα στον εξωκυττάριο χώρο και μετατρέπεται σε κολλαγόνο. Ένας μηχανισμός αρνητικής παλίνδρομης ρύθμισης ελέγχει τη μετατροπή αυτή, 87

88 που είναι εντονότερη στα αρχικά στάδια της παραγωγικής φάσης. [242,243] Η ανεπάρκεια αυτού του μηχανισμού οδηγεί σε ανεξέλεγκτη παραγωγή κολλαγόνου και σχηματισμό εκτεταμένης ουλής. Η αγγειογένεση κατά τα αρχικά στάδια προάγεται κυρίως από την ιστική υ- ποξία, ενώ οι σημαντικότεροι παράγοντες που έχουν αγγειοενεργό δράση είναι οι FGF και TGF-a. [244,245,246] Η διαδικασία αυτή αρχίζει την 6 η -7η ημέρα μετά τη βλάβη και ολοκληρώνεται περίπου μετά από 14 με 18 ημέρες. [247] Τα ενδοθηλιακά κύτταρα, με την επίδραση των παραπάνω παραγόντων, εμφανίζουν έντονη μιτωτική δραστηριότητα και εισβάλλουν στην περιοχή της βλάβης. [248,249] Σχηματίζονται έτσι σωληνώδη μορφώματα αποτελούμενα από ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία αποτελούν τα πρωτογενή τριχοειδή που εξασφαλίζουν την αρχική αιμάτωση της περιοχής. Η διαδικασία της αγγειογένεσης θα διακοπεί όταν εξασφαλισθεί ε- παρκής οξυγόνωση και δεν υπάρχουν τα ερεθίσματα της τοπικής υποξίας και της αυξημένης συγκέντρωσης γαλακτικού οξέος. Η συρρίκνωση του τραύματος αρχίζει 6-10 ημέρες μετά τον τραυματισμό και έχει ως σκοπό τη συμπλησίαση των χειλέων του τραύματος, την ταχύτερη επούλωσή του και τον σχηματισμό μικρότερης ουλής. Για την εξήγηση της συρρίκνωσης του τραύματος έχουν προταθεί δύο θεωρίες. [250] Η πρώτη υποστηρίζει ότι η συρρίκνωση είναι αποτέλεσμα της παρουσίας και δράσης των μυοϊνοβλαστών, ενώ η δεύτερη ότι αυτή οφείλεται στην κίνηση των μυοϊνοβλαστών και στην αναδιοργάνωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Οι μυοϊνοβλάστες υπάρχουν στην περιοχή του τραύματος και διαφέρουν από τους ινοβλάστες στο ότι περιέχουν ινίδια ακτίνης, τα οποία τους επιτρέπουν καθώς συσπώνται να ασκούν έλξη στα χείλη του τραύματος και να ελαττώνουν το εμβαδόν της τραυματικής επιφάνειας μέχρι και 90%, ανάλογα με την εντόπιση του τραύματος. [251,252,253,254,255] Νεότερες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ινοβλάστες μπορούν τελικά να προκαλέσουν συρρίκνωση του τραύματος, ακόμη και όταν δεν υπάρχουν ινίδια ακτίνης, μέσω εναλλακτικών μηχανισμών. [256,257] Β.3. Φάση της αναδιαμόρφωσης του τραύματος Η παραγωγή και εναπόθεση του κολλαγόνου είναι κύρια διεργασία της ε- πούλωσης ενός τραύματος και χαρακτηριστικό της φάσης αυτής. [258] Η σύνθεση του κολλαγόνου αρχίζει την 7 η -8 η ημέρα μετά την κάκωση και διαρκεί από λίγες ε- βδομάδες έως και 3 μήνες. [259,260,261,262,263] Για τον κλινικό ιατρό η φάση αυτή είναι η πιο σημαντική, αφού η ποιότητα, η ποσότητα και ο ρυθμός του νεοσχηματιζόμενου κολλαγόνου είναι οι παράμετροι που θα καθορίσουν τελικά την ισχύ και τη μορφολογία της ουλής. Ενώ η παραγωγή του κολλαγόνου διαρκεί μερικές εβδομάδες, η αναδιαμόρφωση του τραύματος μπορεί να διαρκέσει μέχρι και δύο χρόνια. Οι ουσίες που αποτελούν τον κοκκιώδη ιστό σε συνδυασμό με τις ίνες του κολλαγόνου, που διαπλέκονται μεταξύ τους, οργανώνονται και προσδίδουν ελαστικότητα, 88

89 ανθεκτικότητα και ακεραιότητα στο τραύμα. Κατά το στάδιο αυτό αποδομείται ο κοκκιώδης ιστός και προοδευτικά το κολλαγόνο τύπου ΙΙΙ αντικαθίσταται από κολλαγόνο τύπου Ι, ώστε τελικά να σχηματισθεί ο ουλώδης συνδετικός ιστός. [264,265, 266,267] Οι ίνες του κολλαγόνου θα λάβουν επιμήκη διάταξη αναλόγως της τάσης που ασκείται στα τραυματικά χείλη και ο αριθμός των νεόπλαστων τριχοειδών θα μειωθεί σταδιακά, όπως και των ινοβλαστών, ώστε η περιοχή της ουλής να χάσει προοδευτικά το κοκκινωπό χρώμα της. Στη φάση της αναδιαμόρφωσης του τραύματος η κολλαγονόλυση προοδευτικά μειώνεται και υπερισχύει η παραγωγή και εναπόθεση του κολλαγόνου, ελεγχόμενη από τους αντίστοιχους αυξητικούς παράγοντες. [268,269] Η σύνθεση του κολλαγόνου αυξάνει με την επίδραση του TGF-β1, ενώ η σύνθεση της κολλαγενάσης στους ινοβλάστες βρίσκεται υπό τον έλεγχο του PDGF. [270] Η κολλαγενάση, που βρίσκεται με τη μορφή προενζύμου, ενεργοποιείται υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων και αποδομεί το ώριμο κολλαγόνο το οποίο στη συνέχεια μπορεί να απορροφηθεί και με φαγοκυττάρωση. [271,272, 273,274] 89

90 Γ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ Η κυτταροκαλλιέργεια είναι η ανάπτυξη κυττάρων in vitro συμπεριλαμβανομένης και της καλλιέργειας μεμονωμένων κυττάρων όπου τα κύτταρα δεν είναι πλέον οργανωμένα σε ιστούς. Αναπτύχθηκε εντελώς φυσιολογικά, από τη μεθοδολογία που χρησιμοποιείτο στην εμβρυολογία, τον περασμένο αιώνα. Ο Wilhelm Roux είχε κατορθώσει να διατηρήσει το έμβρυο ωού όρνιθας, σε φυσιολογικό ορό επιτυχώς το Τον ίδιο περίπου καιρό και ο Arnold παρατήρησε ότι λεμφοκύτταρα από βατράχους μπορούσαν να ζήσουν σε τριβλία Petri με φυσιολογικό ορό, για λίγο χρονικό διάστημα. Το 1898 ο Ljunggren έδειξε ότι ανθρώπινο δέρμα μπορούσε να διατηρηθεί in vitro, για πολλές ημέρες, μέσα σε ασκιτικό υγρό. Το 1903 ο Jolly ανακοίνωσε πειράματα στα οποία περιγράφονταν για πρώτη φορά με λεπτομέρεια παρατηρήσεις επιβίωσης κυττάρων και διαίρεση αυτών in vitro. Τρία χρόνια αργότερα οι Bebe και Ewing περιέγραψαν την καλλιέργεια λεμφοσαρκώματος σκύλου σε αίμα. Τα πειράματα αυτά ήταν πράγματι δύσκολο να επαναληφθούν αφού τα καλλιεργητικά μέσα που χρησιμοποιούνταν, δεν ήταν ικανοποιητικά και διατυπώθηκαν αμφιβολίες εάν πράγματι υπήρχε επιβίωση ή απλώς παρατεταμένος θάνατος. Η αρχή πράγματι της ιστοκαλλιέργειας έγινε το 1907 και από τότε αναπτύχθηκε πολύ γρήγορα, με τα πειράματα του Ross Harrisson, ο οποίος αφού πήρε μικρά τεμάχια ιστού από τη μυελική περιοχή εμβρύου βατράχου, τα τοποθέτησε σε θρόμβο λέμφου. Ο Burrow και ο Harrison εισήγαγαν στη συνέχεια τη χρήση πλάσματος αντί λέμφου. Η τεχνική ανάπτυξης ιστών σε θρόμβο πλάσματος εφοδιασμένου και με εκχύλισμα εμβρύου είχε καλά αποτελέσματα στην ανάπτυξη ορισμένων κυττάρων. H μεγάλη δυσκολία όμως εκείνη την εποχή ήταν η επιμόλυνση με βακτήρια. Ο Alexis Carrel χρησιμοποίησε τις γνώσεις άσηπτης τεχνικής και κατόρθωσε να διατηρήσει κυτταροκαλλιέργειες στείρες για μακρό χρονικό διάστημα και χωρίς τη χρήση αντιβιοτικών. Τα πειράματα του Carrel απέδειξαν χωρίς αμφιβολία ότι τα κύτταρα μπορούσαν να διατηρηθούν επ αόριστον in vitro. H τελειοποίηση των μεθόδων κυτταροκαλλιέργειας οφείλεται κατά πολύ στον Wilton Earle και τους συνεργάτες του, οι οποίοι πρώτοι ανέπτυξαν απευθείας κύτταρα σε επιφάνεια γυαλιού και σε μεγάλη κλίμακα καθώς είναι οι πρώτοι που δημιούργησαν καλλιέργειες από μεμονωμένα κύτταρα. Ένα διαφορετικό τρόπο ανάπτυξης κυττάρων χρησιμοποίησε ο Thomson το 1914 και ο Fell λίγο αργότερα. Η προσπάθειά τους στράφηκε στη διατήρηση μικρών τεμαχίων ιστού σε μία κατάστα- 90

91 ση τέτοια ώστε να πλησιάζει αυτή της in vitro. Στην αρχή της ανάπτυξης της μεθόδου των κυτταροκαλλιεργειών o Lewis άρχισε να μελετά τους παράγοντες στα μέσα καλλιέργειας που ήταν απαραίτητα για την ανάπτυξη και επιβίωση των κυττάρων. Η εργασία του Lewis καθώς και του Baker που στόχευε στην ανάλυση των μέσων καλλιέργειας και την αναγνώριση των συστατικών που συμβάλλουν στην ανάπτυξη των κυττάρων, συνεχίστηκε από τους Fisher, Parker και Eagle και τελικά είχε σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη των σημερινών μέσων καλλιέργειας. Μία μεγάλη ποικιλία τεχνικών αναπτύχθηκε στη συνέχεια καθώς και οι διάφοροι ερευνητές τροποποιώντας προηγούμενες μεθόδους για τα δικά τους πειράματα, τελειοποιούσαν περισσότερο τις τεχνικές. Οι Israeli και Lambert είχαν δείξει από το 1913, ότι ο ιός της ευλογιάς μπορούσε να διατηρηθεί σε μόσχευμα κερατοειδούς για μερικές εβδομάδες. Χρειάσθηκε περισσότερο από δέκα χρόνια για να αποδείξει κατόπιν ο Parker ότι ο ιός αναπτύσσεται σε κυτταροκαλλιέργειες κυττάρων όρχεων κουνελιού. Το 1928, ο Maintland ανέπτυξε μία πιο απλή μέθοδο ιστοκαλλιέργειας για τον πολλαπλασιασμό των ιών με τη χρήση τεμαχίων ιστού σε καλλιεργητικό υγρό. Το 1948 ο Enders απέδειξε χωρίς αμφιβολία ότι ο ιός της πολιομυελίτιδας μπορούσε να αναπτυχθεί σε κύτταρα Hela in vitro. Αρχικά όλες οι προσπάθειες ιστοκαλλιεργειών αφορούσαν την ανάπτυξη ιστών in vitro, αλλά από το 1940 και μετέπειτα υπήρξε μεγάλο ενδιαφέρον και στη μεταμόσχευση, δηλαδή καλλιέργεια ιστών και in vivo, ειδικά στην έρευνα του καρκίνου. Οι μεταμοσχεύσεις είχαν πολλά κοινά με την ανάπτυξη ιστών in vitro, όπως αυτό είχε επιτευχθεί από τους εμβρυολόγους Harrisson και Morgan το Οι δυνατότητες που προσέφερε η καλλιέργεια κυττάρων σε θέματα όπως η μορφογένεση, η έρευνα του καρκίνου, η ιολογία κ.ά, αναγνωρίστηκαν αμέσως, με μόνη απογοήτευση στη δυσκολία της τεχνικής. Στην ιολογία ειδικότερα, παρ όλη την προσπάθεια για τη συλλογή πληροφοριών από καλλιεργητικό υλικό, οι τεχνικές δυσκολίες δεν επέτρεψαν μεγάλες προόδους και μόνο το 1950 με την ανάπτυξη και εφαρμογή της τεχνικής, φάνηκαν τα πρώτα ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Η κυτταρική καλλιέργεια έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη μελέτη του μεταβολισμού φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων, στην ανεύρεση και εξέλιξη νέων φαρμάκων καθώς και στη μελέτη παρασίτων που αναπτύσσονται μόνο μέσα σε κύτταρα. Στην κυτταρογενετική έρευνα, ο καθορισμός του ανθρώπινου καρυότυπου (ο αριθμός και η μορφολογία των χρωμοσωμάτων ενός ατόμου) επιτυγχάνεται με τη βραχείας διαρκείας καλλιέργεια λεμφοκυττάρων του αίματος ή ινοβλαστών του δέρματος. Επιπλέον η κυτταρική καλλιέργεια έχει κεντρική θέση στις σύγχρονες τεχνικές της μοριακής βιολογίας και της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA. 91

92 Γ.1. Γενικά χαρακτηριστικά και ιδιότητες in vitro Όπως ήδη ελέχθη, ζωντανά κύτταρα και ιστοί είναι δυνατόν να διατηρηθούν και να μελετηθούν εκτός του σώματος. Η καλλιέργεια κυττάρων και ιστών έχει προσφέρει μεγάλη βοήθεια στην καταγραφή της δράσης ενός μορίου σε ένα συγκεκριμένο τύπο κυττάρου ή ιστού. Επίσης επιτρέπει την άμεση παρατήρηση της συμπεριφοράς ενός ζώντος κυττάρου, με τη βοήθεια του μικροσκοπίου. Πολλά πειράματα που δεν μπορούν να γίνουν επί ζώντων ζώων, είναι δυνατόν να αναπαραχθούν in vitro. Γενικά υπάρχουν τρεις μέθοδοι καλλιέργειας in vitro. Η καλλιέργεια οργάνων, ιστών και κυττάρων. Στην καλλιέργεια οργάνων και ιστών, μικρά τεμάχια τοποθετούνται και αφήνονται να αναπτυχθούν μέσα σε καλλιεργητικά μέσα, δηλαδή πολύπλοκα διαλύματα γνωστής σύνθεσης (άλατα, αμινοξέα, βιταμίνες), στα οποία συχνά προστίθενται συστατικά από ορό. Κατά την προετοιμασία καλλιεργειών ενός ιστού ή οργάνου, τα κύτταρα πρέπει να διαχωρισθούν αρχικά από τους ιστούς με μηχανικό τρόπο ή με ενζυμική επεξεργασία του ιστού. Μετά την απομόνωσή τους, είναι δυνατόν να καλλιεργηθούν μέσα σε εναιώρημα ή να αφεθούν για να εξαπλωθούν επάνω σε ένα τριβλίο Petri ή σε αντικειμενοφόρο πλάκα, επί των οποίων και προσκολλώνται, δημιουργώντας συνήθως μία μονοκυτταρική στιβάδα. Καλλιέργειες κυττάρων που απομονώνονται με αυτόν τον τρόπο ονομάζονται πρωτογενείς καλλιέργειες. H επιβίωση των κυττάρων αυτών διαφέρει πάρα πολύ. Πολλά από αυτά ζουν για πολύ μικρό χρονικό διάστημα, όπως τα κύτταρα του αίματος, αλλά παραμένουν στην καλλιέργεια για μήνες χωρίς διαίρεση και στη συνέχεια πεθαίνουν. Υ- πάρχουν άλλα δε που αρχίζουν να διαφοροποιούνται γρήγορα και συνεχίζουν έτσι για πολύ χρόνο. Αν τα κύτταρα συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται επί μακρόν, τότε μπορούν να ανακαλλιεργηθούν με τη μεταφορά τους σε νέο δοχείο και με νέο καλλιεργητικό υλικό. Από τη στιγμή που γίνει η ανακαλλιέργεια, αυτή ονομάζεται πρωτογενής κυτταρική σειρά. Οι σειρές αυτές μπορεί να εξακολουθήσουν να αναπτύσσονται για μεγάλο χρονικό διάστημα ή μπορεί και να πεθάνουν μετά από ορισμένες ανακαλλιέργειες. Αυτές που τελικά μπορεί να καλλιεργηθούν επ αόριστον in vitro, ονομάζονται συνεχείς σειρές. Για να πάρει μία κυτταρική σειρά το όνομα της συνεχούς, πρέπει να υποστεί τουλάχιστον 70 ανακαλλιέργειες με χρονικό διάστημα τριών ημερών μεταξύ ανακαλλιεργειών. Ο χρόνος μετατροπής μιας σειράς από πρωτογενή σε συνεχή, διαφέρει και δεν είναι προκαθορισμένος. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να είναι μικρός, σε άλλες μεγάλος, ενώ σε εξαιρετικές περιπτώσεις μία σειρά μπορεί να γίνει συνεχής σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα, λόγω ε- ξαλλαγής. Η εξαλλαγή, η οποία μπορεί να αποτελεί το πρώτο βήμα για τη μετατροπή ενός φυσιολογικού κυττάρου σε καρκινικό, μπορεί να παρατηρηθεί σε μία πρωτογενή καλλιέργεια που αναπτύσσεται με αργό ρυθμό. Ξαφνικά, μερικές εστίες κυττάρων που φαίνεται να έχουν υποστεί κάποια εξαλλαγή, αναπτύσσονται γρηγορότερα από τις άλλες και επικρατούν στην καλλιέργεια. Οι καλλιέργειες που δημιουργούνται κατ αυτό τον τρόπο διαφέρουν συνήθως από την πρωτογενή από την οποία 92

93 προήλθαν. Όλες οι πρωτογενείς καλλιέργειες έχουν στην αρχή τον ίδιο αριθμό χρωμοσωμάτων, ενώ συνεχείς κυτταρικές σειρές έχουν συνήθως ακαθόριστο αριθμό. Υπάρχουν διαφορές στη σταθερότητα μεταβολής των κυττάρων από είδος σε είδος. Για παράδειγμα, οι ανθρώπινοι ινοβλάστες είναι σταθεροί σε πρωτογενείς καλλιέργειες και ποτέ δεν υφίστανται αυτόματη εξαλλαγή σε συνεχή καλλιέργεια. Οι ινοβλάστες μυός όμως υφίστανται μικρή αλλαγή ώστε να δημιουργούν συνεχείς κυτταρικές σειρές. Αν εξετάσουμε τις δύο αυτές περιπτώσεις βλέπουμε ότι οι ανθρώπινοι ινοβλάστες αναπτύσσονται εύκολα από ένα μεγάλο αριθμό ιστών, πολλαπλασιάζονται γρήγορα με χρόνο αναδιπλασιασμού 2-3 ημέρες, είναι διπλοειδείς και έχουν μορφολογία λεπτή και επιμήκη. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν το φαινόμενο αναστολής εξ επαφής που τα κάνει να πολλαπλασιάζονται σε παράλληλους σχηματισμούς έως ότου φθάσουν στη μεγαλύτερη πυκνότητα. Μετά από αυτό σταματούν να πολλαπλασιάζονται ακόμα και όταν γίνεται αλλαγή του καλλιεργητικού μέσου, εκτός εάν μεταφερθούν σε άλλη φιάλη και σε μικρότερη πυκνότητα. Η ανακαλλιέργεια των κυττάρων αυτών μπορεί να γίνει για μεγάλο χρονικό διάστημα, αλλά μελέτες έχουν δείξει ότι και αυτά τα κύτταρα δεν μπορεί να αναπτυχθούν επ' αόριστο, διότι εισέρχονται σε «γεροντική φάση», οπότε η ανάπτυξή τους υπολείπεται και τελικά σε λίγες ακόμη εβδομάδες όλα τα κύτταρα πεθαίνουν. Η συμπεριφορά των ινοβλαστών του μυός είναι διαφορετική. Ο βαθμός πολλαπλασιασμού αυτών των κυττάρων αρχίζει να ελαττώνεται σχεδόν αμέσως, αλλά μετά από τρεις μήνες περίπου σε καλλιέργεια παρουσιάζουν χαρακτηριστικά αυτόματης εξαλλαγής. Αρχίζουν να πολλαπλασιάζονται με ταχύ ρυθμό μέχρις ότου φθάσουν σε ένα βαθμό ανάπτυξης σταθερό. Τα χρωμοσώματα αρχικά είναι φυσιολογικά αλλά διπλασιάζονται σε αριθμό μετά από μερικές ανακαλλιέργειες και στη συνέχεια γίνονται ανευπλοειδή. Οι διαφορές αυτές δείχνουν τη χαρακτηριστική συμπεριφορά που παρατηρείται μεταξύ ινοβλαστών από δύο διαφορετικές πηγές. Κύτταρα σε καλλιέργειες παρουσιάζουν τον ίδιο περίπου τύπο ανάπτυξης όπως και οι μικροοργανισμοί. Όταν τα κύτταρα ληφθούν από μία σταθερή καλλιέργεια, αρχικά δείχνουν μία φάση καθυστέρησης που κυμαίνεται από μερικές ώρες μέχρι και μερικές ημέρες πριν αρχίσει η ανάπτυξή τους. Η ανάπτυξη όταν αρχίσει προχωρά σταθερά με διπλασιασμό του πληθυσμού ανά ώρες. Αυτή είναι η λογαριθμική φάση, στο τέλος της οποίας ο πληθυσμός φθάνει στο ανώτατο όριο και τα κύτταρα εισέρχονται στη σταθερή φάση. Γ.2. Ανακαλλιέργεια κυττάρων που αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα Κύτταρα τα οποία αναπτύσσονται σε μονοστιβάδα μπορεί να ανακαλλιεργηθούν αφού πρώτα επανέλθουν σε μορφή εναιωρήματος, γεγονός που μπορεί να επιτευχθεί είτε με φυσικές μεθόδους, δηλαδή με δυνατές ανακινήσεις ή με απόξεση, ή με χημικές μεθόδους, όπως τη χρήση ενζύμων. Μερικές κυτταρικές σειρές δεν επικολλώνται σταθερά επάνω στην επιφάνεια της φιάλης που αναπτύσσονται και μπορεί εύκολα να γίνει η αποκόλλησή τους με 93

94 μία ανακίνηση του σκεύους. Με τη μέθοδο όμως αυτή δεν είναι δυνατή η αποκόλληση όλων των κυττάρων, οπότε εάν πράγματι υπάρχει ανάγκη τέλειας συλλογής, τότε μπορεί να γίνει απόξεση με ένα πλαστικό ή λαστιχένιο πτερύγιο. Όταν τα κύτταρα αποκολληθούν με αυτό τον τρόπο δεν είναι συνήθως μεμονωμένα αλλά συσσωματώματα που μπορεί να διαλυθούν με τη βοήθεια πιπέτας. Η μέθοδος που προτιμάται συχνά στην ανακαλλιέργεια κυττάρων για την αποκόλλησή τους από την επιφάνεια που αναπτύσσονται είναι η ενζυματική. Με τη χρήση θρυψίνης ή άλλων πρωτεολυτικών ενζύμων τα κύτταρα αποκολλώνται από την επιφάνεια, δημιουργώντας απευθείας εναιώρημα μεμονωμένων κυττάρων. Η θρυψίνη που χρησιμοποιείται συνήθως είναι 0,1-0,5%, αλλά πρέπει να σημειωθεί ότι πολλοί ερευνητές θεωρούν ότι μικρότερη συγκέντρωση θρυψίνης (0,025%) είναι προτιμότερη και πλέον ασφαλής. Το σωστό ph είναι σημαντικός και πολύ σπουδαίος παράγοντας κατά τη θρυψινοποίηση, διότι εάν το ph είναι χαμηλό (<7) τότε η θρυψίνη είναι αδρανής, ενώ όταν το ph είναι (>8) μπορεί να προκαλέσει βλάβη στα κύτταρα. Μετά την αποκόλληση των κυττάρων εάν υπάρχει ανάγκη συμπύκνωσής των ή και την απαλλαγή τους από κάθε ίχνος θρυψίνης, τότε τα κύτταρα πρέπει να φυγοκεντρηθούν. Η ταχύτητα φυγοκέντρησης των κυττάρων πρέπει να ελέγχεται με την απαραίτητη προσοχή διότι υπάρχει περίπτωση τραυματισμού των, ειδικά όταν είναι μέσα σε υγρό σε χαμηλό ποσοστό πρωτεΐνης, οπότε και η ταχύτητα φυγοκέντρησης δεν πρέπει να υπερβαίνει τις 1000rpm. Στα ευαίσθητα κύτταρα πρέπει να αποφεύγεται και ο έντονος διασκορπισμός διότι προκαλείται τραυματισμός και στη συνέχεια τα κύτταρα δεν αναπτύσσονται. Άλλες ουσίες που μπορεί να χρησιμοποιηθούν με τα ίδια αποτελέσματα είναι οι χηλιωτικοί παράγοντες. Οι ουσίες αυτές είναι συνήθως οργανικά σκευάσματα τα οποία δεσμεύουν δισθενή κατιόντα. Έτσι μία τέτοια ουσία δεσμεύει ασβέστιο και μαγνήσιο και πιθανόν η λειτουργία τους αυτή να προκαλεί τη σφαιρικότητα στα κύτταρα και να τα υποχρεώνει σε αποκόλληση. Μία από τις ουσίες αυτές που χρησιμοποιείται ευρέως είναι το αιθυλένιο-διαμινο-τετραοξεικό νάτριο (EDTA). Όταν γίνεται μεταφορά των κυττάρων με τη χρήση θρυψίνης ή EDTA χρειάζεται ιδιαίτερη προσοχή ώστε να μην εκτίθενται τα κύτταρα στις ουσίες αυτές επί μακρό χρονικό διάστημα, διότι υπάρχει φόβος βλάβης με αποτέλεσμα να μην κολλήσουν κατά τη μεταφορά. Για τον λόγο αυτό πρέπει να αφαιρείται όλη η θρυψίνη από τα κύτταρα με φυγοκέντρηση εκτός εάν η ποσότητα είναι μικρή και αραιωθεί, με την προσθήκη του καλλιεργητικού υλικού μέσου σε τέτοιο σημείο ώστε να αδρανοποιηθεί τελείως. Η θρυψίνη αδρανοποιείται επίσης και με τον ορό που υπάρχει στο υγρό καλλιέργειας, ενώ το EDTA με το ασβέστιο και το μαγνήσιο που είναι επίσης παρόντα. Πρέπει να σημειωθεί ότι δεν επηρεάζονται όλα τα κύτταρα με τη θρυψίνη και το EDTA το ίδιο. Π.χ οι ινοβλάστες αποκολλώνται δύσκολα με EDTA και γι αυτό πρέ- 94

95 πει να χρησιμοποιείται θρυψίνη, κάτι που δεν συμβαίνει με τα επιθηλιακά κύτταρα που ανταποκρίνονται εξίσου καλά και στα δύο. Αφού ληφθούν τα κύτταρα σε εναιώρημα και πριν μεταφερθούν σε νέο σκεύος είναι απαραίτητο να γίνει καταμέτρησή τους. Στη συνέχεια αραιώνονται στην ε- πιθυμητή αραίωση, με καλλιεργητικό υγρό, ώστε μία ποσότητα υλικού να περιέχει ένα λογικό αριθμό κυττάρων. Συνήθως κύτταρα ανά κ.ε. είναι αρκετός α- ριθμός για τις περισσότερες των περιπτώσεων, ενώ με πολύ ευαίσθητα κύτταρα ο αριθμός μπορεί να αυξηθεί σε ανά κ.ε. Κατά τη μεταφορά και για πιο ακριβή διασπορά των κυττάρων είναι ανάγκη: Να γίνει ακριβής μέτρηση Να διατηρούνται τα κύτταρα στο εναιώρημα μεμονωμένα και όχι σε συσσωματώματα Να μετράται ακριβώς ο όγκος που μεταφέρεται σε κάθε σκεύος. Τα περισσότερα είδη κυττάρων έχουν την τάση να σχηματίζουν συσσωματώματα και να καθιζάνουν γρήγορα, γι αυτό και κατά τη μεταφορά πρέπει τα κύτταρα αυτά να βρίσκονται πάντοτε σε εναιώρημα. Γ.3. Τροφοδότηση και συντήρηση των κυττάρων μέσα καλλιέργειας κυττάρων in vitro Η τροφοδότηση των κυττάρων που αναπτύσσονται σε γυάλινη ή πλαστική επιφάνεια είναι πολύ απλή. Σαν κανόνας, το καλλιεργητικό μέσο αδειάζεται από το δοχείο ή αναρροφάται με μία πιπέτα που είναι συνδεδεμένη με αντλία νερού. Η α- φαίρεση του υγρού είναι καθολική σε κάθε τροφοδότηση και σε καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε επιφάνεια. Η ταχύτητα ανάπτυξης μιας καλλιέργειας μπορεί να ελεγχθεί ρυθμίζοντας τον αριθμό των κυττάρων κατά την αρχική διασπορά. Τούτο δε επειδή τα κύτταρα αναπτύσσονται όσο υπάρχει χώρος σε ένα δεδομένο δοχείο και μετά σταματούν, άσχετα από τη συχνότητα αλλαγής του μέσου καλλιέργειας. Έτσι εάν ο αριθμός ελαττωθεί στο μισό, κάθε εβδομάδα ο αριθμός θα διπλασιάζεται σε αυτό τον χρόνο. Γρήγορα αναπτυσσόμενα κύτταρα θα αυξηθούν περίπου 100 φορές σε μία εβδομάδα, γι αυτό είναι καλό να τοποθετείται σε κάθε σκεύος το 1/20 έως το 1/50 του τελικού πληθυσμού. Ένας κατάλληλος τρόπος για τη διατήρηση των κυττάρων είναι να γίνεται ο χειρισμός τους δύο έως τρεις φορές την εβδομάδα, δηλαδή τη μία να τροφοδοτούνται, την άλλη να μεταφέρονται. Το μέσο που χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια ενός είδους κυττάρων είναι ο βασικότερος παράγοντας για την επιτυχία της καλλιέργειας. Η χρησιμότητα του μέσου είναι να διατηρήσει τα κύτταρα σε φυσιολογικό ph, οσμωτική πίεση κ.ά. που 95

96 απαιτούνται για την επιβίωσή τους και να τα εφοδιάσει με τις πολύπλοκες χημικές ουσίες που χρειάζονται και που δεν μπορούν να τις συνθέσουν τα ίδια. Έτσι η σύνθεση του μέσου καλλιέργειας, ο τύπος υποστρώματος, ο τρόπος διαχωρισμού, η πυκνότητα και ο τύπος του κυτταρικού πληθυσμού είναι μεταξύ των παραγόντων που μπορούν να επηρεάσουν τη ζωή των κυττάρων in vitro και να τροποποιήσουν τη συμπεριφορά των κυτταρικών συστατικών. Το πλέον σημαντικό από όλα είναι το μέσο καλλιέργειας που χρησιμοποιείται. Τα καλλιεργητικά μέσα εξαρτώνται κυρίως από το είδος των κυττάρων. Κύτταρα π.χ που αναπτύσσονται σε εναιώρημα απαιτούν διαφορετικό μέσο από τα κύτταρα που αναπτύσσονται σε στιβάδα. [275,276,277,278,279,280,281,282] 96

97 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 97

98

99 ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της παρούσης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της επούλωσης των μηχανισμών του τραύματος σε σχέση με τα μόρια του εξωκυττάριου χώρου, και πιο συγκεκριμένα με τις γλυκοζαμινογλυκάνες, τις πρωτεογλυκάνες, τις μεταλλοπρωτεϊνάσες και με τους ιστικούς αναστολείς των τελευταίων. Για τον λόγο αυτό οργανώθηκαν και δοκιμάστηκαν στην πράξη τρία πειραματικά μοντέλα μελέτης της επούλωσης του τραύματος. Το πρώτο, in vitro, με την ανάπτυξη πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών από ακροποσθία ασθενών σε κυτταροκαλλιέργεια, με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης των μορίων της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας κατά την επούλωση. Το δεύτερο, επίσης in vitro, με τη χρήση πλεγμάτων ικριωμάτων, χρησιμοποιώντας τις παραπάνω καλλιέργειες και μελετώντας την αλληλεπίδρασή τους με τους ινοβλάστες και την επιρροή τους στους μηχανισμούς του τραύματος. Και το τρίτο, in vivo, όπου μεταφέρθηκε ο έλεγχος των πλεγμάτων-ικριωμάτων σε πειραματόζωα, μυς, και ελέγχθηκε η συμπεριφορά και η επίδρασή τους στην επούλωση του τραύματος, μακροσκοπικά, μικροσκοπικά, υπερμικροσκοπικά, ανοσοϊστοχημικά και μοριακά. 99

100

101 Α.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Α.1. Κυτταρικές καλλιέργειες Α.1.1. Εισαγωγή Το κύριο χαρακτηριστικό που διακρίνει ένα εργαστήριο κυτταροκαλλιεργειών από ένα οποιοδήποτε ερευνητικό εργαστήριο, είναι η ανάγκη διατήρησης άσηπτων συνθηκών εργασίας. Η ανάγκη αυτή καθίσταται επιτακτικότερη, λαμβάνοντας υπόψη τον πολύ χαμηλότερο ρυθμό αύξησης των περισσότερων επιμολυντικών παραγόντων. Πολύ σημαντική θεωρήθηκε η εισαγωγή στον χώρο των κυτταροκαλλιεργειών, των θαλάμων νηματώδους ροής του αέρα, γεγονός που απλοποίησε πολύ το πρόβλημα και επέτρεψε την επιτέλεση μη εξειδικευμένων προσαρμογών στο εργαστήριο. Οι βασικές λειτουργίες που πρέπει να ακολουθούνται στον άσηπτο χώρο των κυτταροκαλλιεργειών, είναι: στείροι χειρισμοί επώαση κυττάρων παρασκευή θρεπτικών υλικών πλύσιμο σκευών αποστείρωση σκευών αποθήκευση σκευών και υλικών. Τηρείται γενικά μία «διαβάθμιση στειρότητας» στην τοποθέτηση στον χώρο των σχετικών οργάνων που εξυπηρετούν τη λειτουργία αυτών των προσαρμογών. O θάλαμος νηματώδους ροής πρέπει να τοποθετείται στο ένα άκρο του εργαστηρίου, στο άλλο άκρο τα όργανα για το πλύσιμο και την αποστείρωση των σκευών, ενώ ενδιάμεσα τοποθετούνται οι κλίβανοι επώασης, τα όργανα και τα σκεύη παρασκευής και αποθήκευσης των διαφόρων θρεπτικών υλικών. Α.1.2. Στειρότητα του χώρου Μία από τις κύριες συνθήκες λειτουργίας, η στειρότητα του περιβάλλοντος χώρου, επιτυγχάνεται με τη χρήση λυχνίας υπεριώδους ακτινοβολίας (Ultra Violet, UV lamp, τύπος TUV 15W, PHILLIPS). Είναι γνωστή η απολυμαντική δράση της UV ακτινοβολίας. Μικροοργανισμοί όπως βακτήρια, ιοί, μύκητες και πρωτόζωα μπορούν να καταστραφούν με φυσικές, βιολογικές και χημικές μεθόδους. Η φωτοχημική δράση του μικρού μήκους κύματος της υπεριώδους ακτινοβολίας έχει ως αποτέλεσμα την καταστροφή ή την αδρανοποίηση των μικροοργανισμών. Η πυρηνική μάζα των κυττάρων υφίσταται βλάβες λόγω φωτολυτικών διαδικασιών σε τέτοιο βαθμό, ώστε η κυτταρική διαίρεση και συνεπώς ο πολλαπλασιασμός δεν μπορεί να λάβει χώρα. Αυτές οι επιδράσεις επενεργούν όταν το μήκος κύματος της UV ακτινοβολίας είναι μικρότερο των 320mm. Έτσι οι μικροοργανισμοί που αιωρούνται ελεύθερα στον αέρα του εργαστηρίου, όταν επιδράσει επάνω τους η 101

102 UV ακτινοβολία, υφίστανται σοβαρή βλάβη, με συνέπεια να ελαττώνεται το μικροβιακό φορτίο του αέρα και η πιθανότητα επιμόλυνσης μέσω αυτού. Το φάσμα της υπεριώδους ακτινοβολίας υποδιαιρείται σε τρεις ομάδες: α) UV-A μακρού μήκους κύματος από 400nm μέχρι 320nm, β) UV-B μεσαίου μήκους κύματος από 320nm μέχρι 380nm, γ) UV-C βραχέος μήκους κύματος από 280nm μέχρι 100nm. Ακτινοβολία μήκους κύματος κάτω των 240nm σχηματίζει όζον στον περιβάλλοντα αέρα του εργαστηρίου, το οποίο είναι τοξικό και πρέπει να αποφεύγεται η επί μακρόν έκθεση σε τέτοιους χώρους. Ο τύπος της χρησιμοποιούμενης λυχνίας στο εργαστήριο δεν παράγει όζον, καθόσον λόγω ειδικού εσωτερικού προστατευτικού καλύμματος, η εκπομπή της UV-C ακτινοβολίας (που συντελεί στην παραγωγή όζοντος) περιορίζεται σε πολύ χαμηλά επίπεδα. Την πιο ισχυρή σποριοκτόνο δράση παρουσιάζει η UV-C ακτινοβολία. Η υπεριώδης ακτινοβολία προκαλεί επιφανειακό ερύθημα του δέρματος και επιπεφυκίτιδες. Για την αποφυγή όλων των ανεπιθύμητων επιδράσεων και την επίτευξη του επιθυμητού απολυμαντικού αποτελέσματος του χώρου, λειτουργεί το σύστημα υπεριώδους ακτινοβόλησης του αέρα στον χώρο των κυτταροκαλλιεργειών, κατά χρονικά διαστήματα (με τη χρήση χρονοδιακόπτη). Έτσι συνολικό χρονικό διάστημα 14 ωρών λειτουργίας το 24ωρο κρίθηκε ικανοποιητικό για την επαρκή απολύμανση του αέρα. Α.1.3. Στείροι χειρισμοί Παρά την προσθήκη αντιβιοτικών στα θρεπτικά υλικά, οι επιμολύνσεις με μικροοργανισμούς παραμένουν ένα σημαντικό πρόβλημα των κυτταροκαλλιεργειών. Βακτήρια, ζύμες και σποριομύκητες μπορεί να μεταφέρονται μέσα στις καλλιέργειες από τον χειριστή, τον περιβάλλοντα αέρα, τις επιφάνειες εργασίες και άλλες πηγές. Ως εκ τούτου η εφαρμογή άσηπτων τεχνικών εργασίας αποτελεί φραγμό μεταξύ των μικροοργανισμών του περιβάλλοντος και της μη επιμολυνθείσας καλλιέργειας στη φλάσκα ή στο τριβλίο. Όλα επομένως τα υλικά και σκεύη που θα έλθουν σε άμεση επαφή με τα καλλιεργούμενα κύτταρα πρέπει να είναι στείρα, οι δε χειρισμοί να είναι τέτοιοι που να μην επιτρέπουν την άμεση επαφή της καλλιέργειας με το μη στείρο περιβάλλον. Α.1.4. Θάλαμος νηματικής ροής του αέρα (Laminar Air Flow Cabinet) Η χρήση του θαλάμου νηματικής ροής του αέρα, που εμφυσάται στείρος στην κύρια επιφάνεια εργασίας, δίνει τη δυνατότητα μεγαλύτερου ελέγχου της στειρότητας και με μικρότερο λειτουργικό κόστος, απ ό,τι απαιτεί η δημιουργία 102

103 ενός ξεχωριστού στείρου χώρου. Το κύριο πλεονέκτημά του είναι ότι το περιβάλλον της εργασίας προστατεύεται από τη σκόνη και τις επιμολύνσεις λόγω της συνεχούς ροής του αέρα, που φιλτραρισμένος διέρχεται από την επιφάνεια εργασίας. Υπάρχουν δύο κατηγορίες θαλάμων νηματικής ροής, ο οριζόντιος και ο κάθετος. Ο θάλαμος που χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας ανήκει στη δεύτερη κατηγορία (Τύπος Laninar: VSC121 της εταιρείας ADS LAMINAIRE ). Κατ αυτήν, ο αέρας εμφυσάται με δύναμη από την οροφή του θαλάμου στην επιφάνεια εργασίας, αφού πρώτα περάσει μέσω φίλτρου ΗΕΡΑ για αποστείρωση. Εν συνεχεία ε- πανέρχεται από το πίσω τοίχωμα του θαλάμου στην οροφή του για επανακυκλοφορία. Ποσοστό 20% του αέρα επιστροφής διαφεύγει στο περιβάλλον του εργαστηρίου, αφού πρώτα φιλτραρισθεί με ειδικό φίλτρο, και αναπληρώνεται από ισάριθμο όγκο αέρα που εισέρχεται στο σύστημα νηματικής ροής από το πρόσθιο τμήμα της επιφάνειας εργασίας λόγω της δημιουργούμενης αρνητικής διαφοράς πιέσεως. Ο τύπος αυτός της νηματικής ροής του αέρα είναι σχεδιασμένος για να παρέχει μεγαλύτερη προστασία στον χειριστή. Η λειτουργία λυχνίας υπεριώδους ακτινοβολίας (επί μισή ώρα) για την αποστείρωση του αέρα και όλων των επιφανειών του θαλάμου νηματικής ροής στα μεσοδιαστήματα των πειραμάτων, παρέχει μία επιπλέον εγγύηση στειρότητας του χώρου εργασίας. Α.1.5. Επιφάνεια εργασίας Έχει διαπιστωθεί ότι από τα πιο συχνά παραδείγματα κακής τεχνικής στις καλλιέργειες, αποτελεί η αποτυχία διατήρησης της επιφάνειας εργασίας σε καθαρή κατάσταση. Πριν από κάθε εργασία ακολουθείται η εξής πορεία: α) Απομάκρυνση κάθε υλικού από την επιφάνεια εργασίας. β) Επιμελής καθαρισμός της με αλκοόλη 70 ο και τεμάχιο αποστειρωμένης γάζας. γ) Τοποθέτηση στον θάλαμο νηματικής ροής μόνον όσων σκευών, υλικών, κ.λ.π χρειάζονται για ένα συγκεκριμένο πείραμα. δ) Όσα εξ αυτών δεν ήταν αποστειρωμένα, καθαρίζονταν με τον προαναφερθέντα τρόπο, με αλκοόλη 70 ο. ε) Διευθέτηση των υλικών και σκευών καλλιέργειας (φιαλίδια, πιπέτες, φλάσκες, κ.λ.π) σε τέτοια διάταξη ώστε να είναι ευχερής ο χειρισμός τους χωρίς να υπάρχει κίνδυνος επιμόλυνσής τους. στ) Τυχόν σταγόνες θρεπτικού υλικού που χύθηκαν κατά λάθος, απομακρύνονταν αμέσως με αλκοόλη 70 ο. ζ) Απομάκρυνση όλων των υλικών από την επιφάνεια εργασίας μετά το πέρας των πειραμάτων και καθαρισμός με αλκοόλη 70 ο. η) Λειτουργία της υπεριώδους λυχνίας του θαλάμου νηματικής ροής. 103

104 Α.1.6. Προσωπική υγιεινή Αρχικά, είναι απαραίτητο το πλύσιμο των χεριών με σαπούνι για την απομάκρυνση μικροοργανισμών του δέρματος, που αποτελούν τον μεγαλύτερο κίνδυνο επιμόλυνσης των καλλιεργειών και χρήση αποστειρωμένων χειρουργικών γαντιών μιας χρήσης και ιατρικής ποδιάς. Απαραίτητη είναι η μάσκα προσώπου επί κρυολογήματος, ή η αποφυγή εκτέλεσης πειραμάτων κατά τη διάρκειά του. Α.1.7. Aποστείρωση οργάνων σκευών υλικών Οι διάφορες μέθοδοι αποστειρώσεως σχεδιάζονται όχι μόνον για να φονεύουν τον όγκο των μικροοργανισμών, αλλά και να ελαχιστοποιούν τον αριθμό των σπόρων τους, που ενδεχομένως να είναι ιδιαίτερα ανθεκτικοί. Όλα τα αποστειρωμένα σκεύη φυλάσσονταν επιμελώς σε κλεισμένα συρτάρια και υφίσταντο προσεκτικούς χειρισμούς μέχρι τη χρησιμοποίησή τους προς αποφυγή καταστροφής της συσκευασίας. [283] Α.1.8. Εξοπλισμός του εργαστηρίου Πλην του θαλάμου νηματικής ροής και του κλιβάνου, στον οποίο ελάμβανε χώρα ο κύριος όγκος των πειραμάτων και τη χρήση του ξηρού κλιβάνου για την αποστείρωση, χρησιμοποιήθηκαν επίσης: Κλίβανος επώασης (incubator) Χρησιμοποιήθηκε ο κλίβανος δύο αερίων (μίγμα 95% αέρα και 5% CO 2, Model 3194 της εταιρείας FORMA SCIENTIFIC). Στο δάπεδο του κλιβάνου υπήρχε ειδικό δοχείο υγρασίας γεμάτο με αποστειρωμένο-απεσταγμένο-απιονισμένο νερό, στο οποίο προστίθετο ποσότητα απολυμαντικού υγρού και περιοδικά γινόταν αντικατάσταση με νέα ποσότητα νερού για την πρόληψη ανάπτυξης μυκήτων. Η παρουσία του νερού είναι απαραίτητη για τη δημιουργία ατμόσφαιρας κεκορεσμένης υδρατμών. Η κεκορεσμένη σε υδρατμούς ατμόσφαιρα ήταν θεμελιώδους σημασίας για την περιεκτικότητα του αέρα σε 5% CO 2, καθόσον ο «αισθητήρας» του CO 2 επηρεάζεται από τον βαθμό υγρασίας του περιβάλλοντος. Η συγκέντρωση των αερίων του κλιβάνου ελέγχονταν από το ηλεκτρονικό κύκλωμά τους. Κάθε φορά πριν από τη λειτουργία του, ο κλίβανος απολυμαίνονταν εσωτερικά και κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του η διάνοιξή του περιορίζονταν στο ελάχιστο δυνατόν. Η εσωτερική θερμοκρασία διατηρούνταν σταθερή, χάρη στο θερμαινόμενο νερό που πληρούσε το περιφερικό σύστημα σωληνώσεών τους. Ο αέρας κυκλοφορούσε εσωτερικά για επίτευξη ομοιόμορφης κατανομής της θερμοκρασίας του χώρου και των επιπέδων των προστιθεμένων αερίων. 104

105 Ανάστροφο μικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως (Phase-contrast inverted mιcroscope). Mετά τον θάλαμο νηματικής ροής και τον κλίβανο επώασης, τρίτο σε χρήση και λειτουργικότητα όργανο, ήταν το ανάστροφο μικροσκόπιο αντιθέτου φάσεως. Το μικροσκόπιο είναι απαραίτητο αφενός μεν για την περιοδική εξέταση των καλλιεργούμενων κυττάρων, αφετέρου δε για το σημάδι φθοράς που θα δει κανείς σε μια καλλιέργεια καθώς και για τη μικροβιακή επιμόλυνση που θα αναγνωρισθεί εύκολα με αυτό. Η παρακολούθηση των καλλιεργειών γινόταν με ανάστροφο μικροσκόπιο NIKON (τύπος Diaphot) στο οποίο προσαρμόσθηκαν φακοί με υψηλής ποιότητας οπτική, καθώς και πυκνωτής αντιθέτου φάσεως, για την ευκρινέστερη φωτογράφηση και παρακολούθηση των κυττάρων. Η φωτογράφηση γινόταν με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή τύπου ΝΙΚΟΝ (Μodel D70) προσαρμοσμένη στο πρόσθιο μέρος του μικροσκοπίου. Κλειστό κύκλωμα τηλεόρασης Η χρήση κάμερας και οθόνης έχει καταστεί ένα πολύτιμο βοήθημα για την παρακολούθηση των κυτταροκαλλιεργειών. Προσαρμόσθηκε στο ΝΙΚΟΝ μικροσκόπιο μία έγχρωμη βιντεοκάμερα CCD-IRIS της SONY (Model: SSC-C370P) με υψηλή διακριτικότητα και με μη υψηλή ευαισθησία, επειδή η συνήθης ευαισθησία μιας κάμερας είναι κατά κανόνα επαρκής και η υψηλή ευαισθησία δημιουργεί προβλήματα υπερφωτισμού. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε ασπρόμαυρη κάμερα τύπου SONY (Model SSC-M350-CE) που παρέχει υψηλότερη διακριτικότητα της εικόνας και θεωρείται ικανοποιητική για αντιθέτου φάσεως παρατήρηση ζωντανών καλλιεργειών. Η έγχρωμη κάμερα προτιμάται για την παρατήρηση μονιμοποιημένων και βαμμένων παρασκευασμάτων. Αναλόγως της περίπτωσης χρησιμοποιήθηκε ασπρόμαυρο μόνιτορ SONY (Model PVM-91 CE) ή έγχρωμο μόνιτορ SONY TRINITRON (Model SSM-14N5E). Στο όλο κύκλωμα συνδέθηκε βίντεο για καταγραφή εικόνων. Οπτικό μικροσκόπιο Εκτός από το ανάστροφο μικροσκόπιο, χρησιμοποιήθηκε οπτικό μικροσκόπιο τύπου Zeiss κυρίως για την καταμέτρηση των κυττάρων με την τεχνική Newbauer. Ψυγειοκαταψύκτης Όλα τα θρεπτικά υλικά των κυτταροκαλλιεργειών φυλάσσονταν σε θερμοκρασία ψυγείου και για περιορισμό των επιμολύνσεων εφαρμόσθηκε η τακτική του επιμερισμού των υλικών σε μικρές ποσότητες. Κατά κανόνα ο μέγιστος χρόνος 105

106 διαφύλαξής τους στο ψυγείο κυμαίνονταν από 1-2 εβδομάδες. Για αποθήκευση υλικών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, λόγω των περιεχομένων πρωτεϊνών ή άλλων ευαίσθητων ουσιών (π.χ L-γλουταμίνη), αυτά τοποθετούνταν στον καταψύκτη (-20 ο C) και ο μέγιστος χρόνος παραμονής τους ήταν περίπου 2 χρόνια από την ημέρα της παρασκευής τους. Βαθιά κατάψυξη Χρησιμοποιήθηκε για την κατάψυξη κυτταρικών σειρών πριν την τοποθέτησή τους στο υγρό άζωτο. Συσκευή υγρού αζώτου Η διατήρηση στο υγρό άζωτο είναι η πιο ασφαλής μέθοδος για την επί μακρόν συντήρηση καλλιεργούμενων κυττάρων. Ενώ η διαδικασία της κατάψυξης των κυττάρων είναι μία απλή σχετικά τεχνική και δεν απαιτεί εξειδικευμένα όργανα, η αποθήκευση των κυττάρων γίνεται σε ειδικά δοχεία υγρού αζώτου με μονωμένα τοιχώματα. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν τοποθετούνταν υπό μορφή εναιωρήματος σε κρυοσωληνάρια των 2ml, τα οποία στη συνέχεια εισάγονταν στο δοχείο υγρού αζώτου. (τύπος CDB10-LERY, χωρητικότητας 10lit υγρού αζώτου). Ανά χρονικά διαστήματα ημερών το δοχείο επαναπληρούνταν, λόγω βαθμιαίας εξάτμισης του υγρού αζώτου. Με τον τρόπο αυτό διατηρούνταν οι κυτταρικές σειρές για τον επιθυμητό χρόνο και κάθε φορά που προγραμματίζονταν πειραματική καλλιέργεια παίρνονταν ένα κρυοσωληνάριο από το υγρό άζωτο και μετά την απόψυξη καλλιεργούνταν τα κύτταρα. Ένα από τα πλεονεκτήματα της χρήσης του υγρού αζώτου είναι ότι στη θερμοκρασία του (-196 ο C) σταματά το βιολογικό ρολόι και η αποσύνθεση των κυττάρων είναι αμελητέα. Κατά τη χρήση της συσκευής λαμβάνονταν ιδιαίτερα μέτρα προφύλαξης (ειδικά γάντια και διατήρηση απόστασης από το δοχείο κατά το άνοιγμά του), επειδή το υγρό άζωτο είναι επικίνδυνο λόγω του ότι οι υδρατμοί του προκαλούν εύκολα εγκαύματα. Διάφορα όργανα-σκεύη Φυγόκεντρος. (Model 1601 της εταιρείας HETTICH). Τοποθετήθηκε σε χώρο σταθερό για την αποφυγή κραδασμών λόγω των μεγάλων πιέσεων που αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια της λειτουργίας της και εκτός του στείρου χώρου καλλιέργειας. Υδατόλουτρο. Συσκευή πολύ χρήσιμη, διότι όπως αναφέρθηκε, τα υλικά των καλλιεργειών φυλάσσονταν σε θερμοκρασίες κάτω των 4 ο C (πολλά σε -20 ο C). 106

107 Με δεδομένη τη θερμοκρασία των 37 ο C, ως τη βέλτιστη λειτουργική θερμοκρασία των κυττάρων, όλα τα βιολογικά υλικά προθερμαίνονταν σ αυτή τη θερμοκρασία. Χρησιμοποιήθηκε η συσκευή τύπου WB7 της MEMMERT χωρητικότητας 10lit νερού. Το χρησιμοποιούμενο νερό ήταν αποστειρωμένο απιονισμένο, προστίθετο ποσότητα απολυμαντικού υγρού και περιοδικά αντικαθίστατο (μέτρα αποφυγής ανάπτυξης μικροοργανισμών). Αναδευτής. (Vortex). (Model G-560E της εταιρείας SCIENTIFIC INDUS- TRIES), που βρήκε εφαρμογή στην ανάδευση κυτταρικών εναιωρημάτων και ιζημάτων για την ομογενοποίησή τους. Τέλος όργανα, όπως, οσμώμετρο, μετρητής ph, μαγνητική θερμαινόμενη πλάκα, κ.λ.π με τα οποία είναι εξοπλισμένο το εργαστήριο, χρησιμοποιήθηκαν, όταν απαιτούνταν. Λοιπά υλικά. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων και αναλόγως της φύσης αυτών, χρησιμοποιήθηκαν διάφορα «αναλώσιμα» αποστειρωμένα υλικά μιας χρήσης, όπως φλάσκες 25cm 2, 75cm 2, οι οποίες έκλειναν αεροστεγώς για την αποφυγή επιμολύνσεων και οι οποίες έφεραν στο πώμα τους οπές καλυπτόμενες με ειδικό προστατευτικό φίλτρο. Επίσης σωληνάκια 15ml και 50ml για φυγοκέντρηση, σύριγγες, δισκία με 12, 24 ή 48 θήκες (12, 24, 48 well-plates), πιπέτες πλαστικές και γυάλινες 2ml, 5ml, 10ml καθώς και πλάκες Neubauer για μέτρηση των κυττάρων. Α.2. Υλικά Α.2.1. Υλικά καλλιέργειας κυττάρων FBS (Fetal Bovine Serum, ορός εμβρύου βοός) 20% Η διατήρηση του ορού γινόταν στους 20 ο C και πριν τη χρήση του προθερμαίνονταν στους 37 ο C. Για την αποφυγή καθίζησης των πρωτεϊνών προτιμούνταν αρχικά η τοποθέτησή του στους +4 ο C.Στα κύρια συστατικά του ορού περιλαμβάνονται πρωτεΐνες (αλβουμίνη, σφαιρίνες, φιμπρονεκτίνη, τρανσφερρίνη, κ.λ.π), πολυπεπτίδια (αυξητικοί παράγοντες), ορμόνες (ινσουλίνη, αυξητική ορμόνη, υδροκορτιζόνη κ.λ.π), μέταλλα (σίδηρος, χαλκός, ψευδάργυρος), μεταβολίτες (αμινοξέα, γλυκόζη, κετονοξέα, νουκλεοτίδια κ.λ.π), αναστολείς αύξησης κυττάρων, κ.λ.π. L- Γλουταμίνη 2mM Το τρίτο συστατικό του θρεπτικού υλικού είναι ένα αμινοξύ που θεωρείται απαραίτητο συστατικό, καθόσον χρησιμοποιείται από τα καλλιεργούμενα κύτταρα σαν πηγή ενέργειας και άνθρακα. Ταυτόχρονα είναι το πιο ασταθές από τα συνήθη χρησιμοποιούμενα υλικά των κυτταροκαλλιεργειών και αποσυντίθεται αυτόμα- 107

108 τα σε υδατικά-ουδέτερα διαλύματα. Ο χρόνος ημιζωής της στο θρεπτικό υλικό είναι περίπου 3 εβδομάδες. Ορός ρυθμισμένος με φωσφορικά ιόντα (Phosphate Buffered Saline, PBS) Πρόκειται για διάλυμα ανόργανων αλάτων, με ph =7,2 και θερμοκρασία διατήρησης 15 o C - 30 o C, των οποίων οι συγκεντρώσεις είναι σχεδόν ίσες με τις α- ντίστοιχες φυσιολογικές, έτσι ώστε να είναι ισότονα με τα φυσιολογικά κύτταρα. Η σύστασή του είναι: KH2PO4 ---0,21g/l Na2HPO H2O ----0,726 g/l Nacl ---9 g/l Δεν περιέχονται ιόντα μαγνησίου και ασβεστίου διότι αυτά συμμετέχουν σε μηχανισμούς συσσωμάτωσης και προσκόλλησης των κυττάρων μεταξύ των και ως εκ τούτου στον σχηματισμό κυτταρικών συσσωμάτων. Διάλυμα Τρυψίνης 0,05% EDTA 0,02% (1x) Τα διαλύματα του ενζύμου τρυψίνης χρησιμοποιούνται ευρέως για την α- ποσυσσωμάτωση ιστών και τη διάσπαση κυτταρικών μονο- ή πολυ- στιβάδων, γιατί προάγουν αποτελεσματικά την απομάκρυνση των κυττάρων μεταξύ τους χωρίς να επηρεάζουν τον δείκτη βιωσιμότητας των. Χρησιμοποιήθηκε το βιολογικό παρασκεύασμα Trypsin-EDTA (1x) σε φιαλίδιο των 100 ml που περιέχει τρυψίνη σε τροποποιημένο PBS (ορός Puck s). Διατηρούνταν στους 20 ο C και πριν την κατάψυξή του κατανέμονταν σε κλάσματα (aliquots) μιας χρήσης. Η σύστασή του είναι: NaCL mg/l KCL mg/l Oρός Puck s } NaHCO mg/l EDTA mg/l Trypsin 1: mg/l Φυσικά δεν περιέχονται ιόντα ασβεστίου και μαγνησίου, ενώ ο παράγοντας 1:250 υποδηλώνει την ειδική δραστικότητα του ενζύμου. Υγρό κατάψυξης κυττάρων (Cell Culture Freezing Medium) Είναι μίγμα 93% Complete Medium ή ορού FBS και 7% DMSO (Διμεθυλοσουλφοξείδιο). Παρασκευάζονταν προ της χρήσης του, προσθέτοντας στον ορό το DMSO φιλτραρισμένο με φίλτρο 0,22μm και διατηρούνταν σε θερμοκρασία δωματίου. Το DMSO είναι μία οργανική χημική ένωση με ισχυρή διαλυτική ικανότητα. Κατά τη χρήση του επιβάλλονται μέτρα προστασίας διότι διατρυπά τα λαστιχένια 108

109 γάντια και προκαλεί εγκαύματα στο δέρμα. Στις κυτταροκαλλιέργειες χρησιμοποιείται ως προστατευτικό των κυττάρων κατά τη διαδικασία βαθιάς κατάψυξης στο υγρό άζωτο. Κατά τη χρήση του ψυκτικού υλικού και μέχρι μισή ώρα παραμονής σε θερμοκρασία δωματίου, δεν παρατηρείται βλάβη των κυττάρων, μεγαλύτερη όμως παραμονή εγκυμονεί κινδύνους, γι αυτό και το κυτταρικό μας εναιώρημα τοποθετούνταν το συντομότερο σε βαθιά κατάψυξη. Ο μηχανισμός της κυτταροπροστατευτικής δράσης του DMSO φαίνεται ότι σχετίζεται με τις μεταβολές που προκαλεί στις φυσικές ιδιότητες του πάγου και του διαλύματος που περιβάλλει τα κύτταρα. Σε θερμοκρασίες κάτω του O o C, το εξωκυτταρικό υγρό παγώνει εν μέρει αυξάνοντας τη συγκέντρωση των διαλελυμένων ουσιών του θρεπτικού υλικού. Ως αποτέλεσμα, το ενδοκυττάριο υγρό εξέρχεται από τα κύτταρα λόγω της δημιουργηθείσας διαφοράς στην ωσμωτική πίεση και αρχίζει η βαθμιαία αλλά και επιθυμητή αφυδάτωση των κυττάρων. Ο ρυθμός κατάψυξης πρέπει να είναι αρκετά αργός για να προλάβει να βγει όλο το ενδοκυττάριο υγρό. Στο σημείο αυτό δρα το DMSO (αλλά και ο κάθε κρυοπροστατευτικός παράγοντας), παρεμποδίζοντας την πλήρη ωσμωτική αφυδάτωση και συρρίκνωση των κυττάρων. Ζωτικές χρωστικές Κρυσταλλικό ιώδες (Cristal violet ) 1% υδατικό διάλυμα. Χρησιμοποιήθηκε στα πειράματα για την καλύτερη παρατήρηση και μέτρηση των κυττάρων. Αντιβίωση-Αντιμετώπιση επιμολύνσεων Ένα σοβαρό πρόβλημα στις κυτταροκαλλιέργειες είναι οι μικροβιακές επιμολύνσεις, για την αποφυγή των οποίων λαμβάνεται μία σειρά μέτρων που εφαρμόζονται στα διάφορα πρωτόκολλα. Το καλύτερο μέσο για την εξάλειψη της μόλυνσης είναι η εξιχνίαση της αιτίας, η καταστροφή όλων των χρησιμοποιημένων υλικών, η γενική αποστείρωση και η καλλιέργεια των κυττάρων απ αρχής. Κάθε παρτίδα υλικού πρέπει να ελέγχεται σε ειδικό άγαρ. Στους χώρους εργασίας καλό είναι να εκτίθενται τριβλία με άγαρ για 30min δύο φορές την εβδομάδα. Είναι δυνατόν οι μολύνσεις να οφείλονται στον αέρα, λόγω σκόνης από τα ρούχα, τα μαλλιά, το πάτωμα, κ.λ.π. Επωαστήρες με υψηλή υγρασία ευνοούν την ανάπτυξη μυκήτων. Το νερό στα υδατόλουτρα είναι συχνά μολυσμένο. Τα υγρά καλλιέργειας μπορεί να μην έχουν καλά διηθηθεί. Πολλές φορές συμβαίνει και τα κύτταρα από πρωτογενείς καλλιέργειες να είναι μολυσμένα από μόνα τους γιατί το ζώο δεν ήταν υγιές. Όπως ήδη ελέχθη, ο χώρος των κυτταρικών καλλιεργειών μας αποστειρώνονταν με υπεριώδη ακτινοβολία και οι εργασίες γινόταν στον στείρο χώρο του Laminar Air Flow. Χρησιμοποιούνταν αποστειρωμένα σκεύη (φλάσκες, πιπέτες) και ποτέ δεν χρησιμοποιήθηκε η ίδια πιπέτα σε δύο διαφορετικές φλάσκες καλλι- 109

110 εργειών. Τα πώματα στις φλάσκες έχουν μικροβιοκρατές φίλτρο και τα υλικά φιλτράρονταν πριν από τη χρήση τους. Τα υγρά υλικά κλασματοποιούνταν σε όγκους για εργασία μιας ημέρας και το περίσσευμα απορρίπτονταν (μ αυτό τον τρόπο αποφεύγονταν και η διαδοχική κατάψυξη-απόψυξη των υλικών). Επιπλέον προστίθετο αντιβίωση στο καλλιεργητικό μέσο. Παρ όλα αυτά, μία μόνον αμελής κίνηση (π.χ να ακουμπήσει το άκρο της αποστειρωμένης πιπέτας στο δάπεδο του θαλάμου νηματικής ροής, πριν τη χρήση της), ήταν αρκετή για την ανάπτυξη μυκήτων μετά από μία εβδομάδα επώασης και φυσικά την καταστροφή της καλλιέργειας. Χρησιμοποιήσαμε στείρο διάλυμα νατριούχου πενικιλίνης G και θειϊκής στρεπτομυκίνης (5000 IU/ml 7& 5000 μg/ml αντίστοιχα) που είναι δραστικό έναντι Gram θετικών και αρνητικών βακτηρίων. Η μεν πενικιλίνη αναστέλλει τη βιοσύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος και έτσι σταματά τον πολλαπλασιασμό των Gram θετικών βακτηρίων, η δε στρεπτομυκίνη αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση των Gram θετικών και αρνητικών βακτηρίων. Το διάλυμα φυλάσσονταν στους - 20 ο C και προστίθετο στο μέσον σε τελική συγκέντρωση 100IU & 100μg/ml λίγο πριν από τη χρήση του (2ml αντιβίωση σε 100ml διαλύματος μέσου). Η συνιστώμενη τελική συγκέντρωση για πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη είναι αντίστοιχα IU/ml και μg/ml. Η σποραδική εμφάνιση ανάπτυξης μυκήτων θα μπορούσε να αντιμετωπισθεί με χρήση κατάλληλου μυκητοκτόνου π.χ αμφοτερικίνη Β, αλλά αποφεύχθηκε διότι τα μυκητοκτόνα είναι κατά κανόνα τοξικά για τα κύτταρα. Τέλος ο χρόνος σταθερότητας των δύο χρησιμοποιηθέντων αντιβιοτικών σε συνθήκες επώασης (37 ο C) είναι τρεις ημέρες. Α.2.2. Συνθέσεις μέσων καλλιέργειας κυττάρων 2 PMJ 1640 Formulation (in mg/l) References: 1. Moore, G.E. et al; 1967; JAMA 199, Moore, G.E. et al; 1976; TCA Manual3, Moore, G.E. et al; 1967; ΧΧI, Ann. Symp. Fand. Canc. Res. Feb Moore, G.E. et al; 1968; NV. State J. Med. 68, Ham, R.G. et al; 1979; Meth. Enzymol. 53,

111 NaCI 6000 L-methionine 15 KCΙ 400 Ι -phenylalanine 15 Na 2 HPO 4 7H 2 O 1512 L-proline 20 MgSO 4 7H 2 O 100 L-serine 30 Ca(NO 3 ) 2 4H 2 O 100 L-threonine 20 D-glucose 2000 Ι -tryptophane 5 Phenol red* 5 L-tyrosine 20 NaHCO L-valine 20 L-arginine 200 Glutathione 1 L-asparagine 50 Biotine 0.2 L-aspartic acid 20 Vitamin Β L-cystine 50 D-Ca-pantothenate 0.25 L-glutamine 300 Choline chloride 3 L-glutamic acid 20 Folic acid 1 Glycine 10 Myo-inositol 35 L-histidine 15 Nictoninamide 1 L-hydroxyproline 20 p-amino-benzoic-acid 1 L-isoleucine 50 Pyridoxin HCI 1 L-Ieucine 50 Riboflavin 0.2 L-lysine HCI 40 Thiamine HCΙ 1 * (1Χ) liquid medium contains 10 mg/l phenol red MEM Basal Formulation (in mg/l) Reference: Eagle, Η., Science 130, 432 (1959) Ι arginine HCI 126 L-tyrosine 36 L-cystine 24 L-valine 46 L-glutamine 292 L-histidine HCI H 2 O 42 Folic acid 1 L-isoleucine 52 Choline chloride 1 L-leucine 52 Nicotinamide 1 L-lysine HCI 73 D-Ca-pantothenate 1 L-methionine 15 Pyridoxal HCI 1 L phenylalanine 32 Thiamine HCI 1 L-threonine 48 Riboflavin 0.1 L tryptophane 10 Myo-inositol 2 111

112 DMEM Advanced Formulation (in mg/l) References: 1. Dulbecco, R. and Freeman, G. Virology 8, 396 (1959) 2. Smith, J.D. et al. Virology 12, 185 (1960) NaCl 6400 L-methionine 30 KCl 400 L-ρhenylalanine 66 CaCl L-threonine 95 MgSO 4 7H 2 O 200 L-tryρtoρhane 16 NaH 2 PO L-tyrosine 72 D-glucose 1000 L-valine 94 Fe(NO 3 ) 3 9H 2 O 0.1 Glycine 30 Phenol red 15 L-serine 42 NaHCO Cholin chloride 4 Folic acid 4 L-arginine HCl 84 Myo-inositol 7.2 L-cystine 48 Nicotinamide 4 L-glutamine 580 D-Ca-pantothenate 4 L-histidine HCl H 2 O 42 Pyridoxal HCl 4 L-isoleucine 105 Riboflavin 0.4 L-leucine 105 Thiamine HCl 4 L-lysine HCl 146 Α.3. Μέθοδοι καλλιέργειας κυττάρων Α.3.1. Μέθοδος απόψυξης των κυττάρων (Cell Thawing Assay) Λαμβάναμε από το δοχείο του υγρού αζώτου, ένα φιαλίδιο που περιείχε μέγιστο όγκο κυτταρικού εναιωρήματος 1,5ml. Αμέσως εμβαπτίζονταν σε υ- δατόλουτρο 37 ο C. Υπό συνεχή ανάδευση και σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα (40-60sec) έλιωνε το στερεό περιεχόμενο μέχρις ότου ο στερεός πυρήνας του να μπορεί να χυθεί σε αποστειρωμένο σωληνάριο φυγοκέντρου 15ml. Το φιαλίδιο ξεπλένονταν με μικρή ποσότητα μέσου για την πλήρη παραλαβή των κυττάρων. Όλη η μετέπειτα εργασία γινόταν σε στείρες συνθήκες. Δουλεύοντας πάνω σε πάγο, προστίθονταν στο κυτταρικό εναιώρημα σταγόνα-σταγόνα 5ml κρύου θρεπτικού υγρού μέσου υπό συνεχή ανάδευση σε χρόνο 2min. Η βαθμιαία α- ραίωση του κυτταρικού εναιωρήματος και του περιεχομένου κρυοσυντηρητικού DMSO είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθόσον απότομη αραίωση μπορεί να προξενήσει σοβαρή ωσμωτική βλάβη των κυττάρων και να μειώσει τη βιωσιμότητά τους 112

113 στο ήμισυ. Τα νεοαποψυχθέντα κύτταρα είναι ευαίσθητα και δεν μπορούν να προσαρμοστούν σε γρήγορη αύξηση του ενδοκυττάριου νερού. Επίσης πολύ σημαντικό είναι το γεγονός της άμεσης απόψυξης των κυττάρων στους 37 ο C. Η τυχόν καθυστέρηση μπορεί να οδηγήσει στη μετατροπή του νεοεισελθόντος νερού στο εσωτερικό των κυττάρων (επανυδάτωση) σε ενδοκυττάριους κρυστάλλους πάγου, με αποτέλεσμα την πρόκληση βλαβών. Ο συνολικός όγκος του εναιωρήματος γινόταν 10ml με προσθήκη περίσσειας πλήρους θρεπτικού υγρού. Το όλο σύστημα παρέμενε επί 10min σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια φυγοκεντρούνταν για 9min στα 125g (περίπου 930 στροφές/min). H φυγοκέντρηση δεν ήταν απαραίτητη. Το υπερκείμενο θρεπτικό υγρό μετά τη φυγοκέντρηση απορρίπτονταν, προστίθεντο 1-2ml πλήρους μέσου και αναδεύονταν ελαφρά στη συσκευή Vortex για εναιώρηση του κυτταρικού ιζήματος. Α.3.2. Μέθοδος καταμέτρησης των κυττάρων. Τεστ βιωσιμότητας (Viability Test) Πριν από τη διανομή των κυττάρων στα δοχεία καλλιέργειας πρέπει να γίνει η κατάλληλη αραίωση η οποία βοηθά στην ανάπτυξή τους. Γι αυτό είναι ανάγκη να γνωρίζουμε πρώτα απ όλα τον αριθμό των κυττάρων που έχουμε. Ο έ- λεγχος της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίζεται από τον δείκτη της βιωσιμότητας αυτών και αποτελεί τον δείκτη της ορθής εκτέλεσης των μεθόδων κατάψυξης-απόψυξης. Η κυτταρική μεμβράνη ενός ζωντανού κυττάρου δεν επιτρέπει την είσοδο στο κυτταρόπλασμα μη ηλεκτρολυτικών χρωστικών (π.χ trypan blue), ενώ των νεκρών τις επιτρέπει. Αντίθετα οι χρωστικές που ηλεκτρολύονται (π.χ εωσίνη), εισέρχονται στα ζωντανά κύτταρα και όχι στα νεκρά. Η δοκιμασία αποκλεισμού χρωστικής χρησιμεύει για την αναγνώριση νεκρών κυττάρων ανάμεσα σε ζωντανά. Πολλοί ωστόσο προτιμούν να χρησιμοποιούν χρωστικές που βάφουν όλα τα ζωντανά κύτταρα. Στην ανωτέρω αρχή στηρίζεται ο έλεγχος βιωσιμότητας (ή ζωτικότητας) των κυττάρων. Η διαδικασία έχει ως εξής: Tοποθετείται η ειδική καλυπτρίδα πάνω από τη χαρακωμένη περιοχή του αιματοκυτταρομέτρου. Αφαιρείται ποσότητα 0,5ml εναιωρήματος κυττάρων με πιπέτα και τοποθετείται σε σωληνάριο eppendorf. Με άλλη πιπέτα προστίθεται 1ml χρωστικής trypan blue. Αναμιγνύεται το περιεχόμενο με πιπέτα. Λαμβάνεται δείγμα 0,5ml και τοποθετείται στο αιματοκυτταρόμετρο. Η 113

114 ποσότητα που θα τοποθετηθεί είναι κανονισμένη όπως ρυθμίζεται από την καλυπτρίδα και πρέπει να αποφεύγεται η υπερχείλιση. Παρατηρούμε μία περιχαρακωμένη περιοχή στο οπτικό μικροσκόπιο. Το αιματοκυτταρόμετρο έχει δύο χαρακωμένες περιοχές. Συνήθως χρησιμοποιείται η μία. Η προσοχή εστιάζεται στα τέσσερα γωνιακά τετράγωνα (1, 2, 3, 4). Κάθε ένα από αυτά χωρίζεται σε 16 μικρότερα τετράγωνα. Με την καλυπτρίδα στη θέση της, ο όγκος πάνω από ένα μεγάλο τετράγωνο είναι 0,1mm 3. Μετρούνται τα κύτταρα στα τέσσερα μεγάλα τετράγωνα και υπολογίζεται ο μέσος αριθμός των κυττάρων ανά μεγάλο γωνιακό τετράγωνο. Τα κύτταρα μετρούνται μόνο στα τέσσερα μεγάλα γωνιακά τετράγωνα. Προσδιορίζεται ο μέσος αριθμός των κυττάρων ανά μεγάλο τετράγωνο, όπως στο παράδειγμα: Tετράγωνα Αριθμός κυττάρων / τετράγωνο `41 =152 /4 = 38 Μέσος αριθμός κυττάρων Υπολογίζεται ο βαθμός αραίωσης. Στην προκειμένη περίπτωση έγινε ανάμειξη 0,5ml κυτταρικού εναιωρήματος με 0,1 ml χρωστικής (1+2 ή 1:3 ή 3Χ). Ο μέσος αριθμός των κυττάρων ανά τετράγωνο πολλαπλασιάζεται με τον βαθμό αραίωσης ( 38 Χ 3= 114). Ο αριθμός αυτός πολλαπλασιάζεται επί για να μας δώσει τον αριθμό των κυττάρων ανά ml εναιωρήματος (1ml έχει 10 Χ 10 Χ10mm = =1.000mm 3 ). Η μέτρηση του μέσου αριθμού κυττάρων ανά τετράγωνο βασίστηκε στον όγκο αυτού του τετράγωνου που είναι 0,1mm 3. Για να φέρουμε την τιμή του 1cm στην τιμή του 1ml πολλαπλασιάζουμε με 1000 ή συνδυάζοντας τα δύο, πολλαπλασιάζουμε τον μέσο αριθμό των κυττάρων ανά τετράγωνο επί Ο μέσος αριθμός κυττάρων ανά τετράγωνο επί τους παράγοντες της αραίωσης επί δίνει τον αριθμό των κυττάρων ανά ml εναιωρήματος (μέσος αριθμός ανά τετράγωνο Χ παράγοντες αραίωσης Χ αριθμός/ml). Μετρούνται τα κύτταρα με ευδιάκριτο πυρήνα και πρωτόπλασμα. Συσσωματώματα κυττάρων μετρούνται σαν συσσωματώματα μεμονωμένων κυττάρων και μετρείται κάθε κύτταρο χωριστά εάν είναι ευδιάκριτος ο πυρήνας και το κυτταρόπλασμα. Όταν δεν διακρίνονται μεμονωμένα κύτταρα, τα συσσωματώματα υ- πολογίζονται σαν ένα κύτταρο. Η μέτρηση γίνεται από αριστερά προς τα δεξιά στην πρώτη σειρά, από δεξιά προς αριστερά στη δεύτερη σειρά, από αριστερά προς δεξιά στην τρίτη σειρά και από δεξιά προς αριστερά στην τέταρτη. Στη μέτρηση συμπεριλαμβάνονται τα κύτταρα που εφάπτονται στην εσωτερική γραμμή, 114

115 στην κορυφή και στη δεξιά πλευρά της πρώτης και τρίτης σειράς και στην κορυφή και αριστερή πλευρά της δεύτερης και τέταρτης σειράς. Αφού γίνει μέτρηση των κυττάρων γίνεται αραίωση με καλλιεργητικό υγρό στην τελική συγκέντρωση 1Χ10 6 /ml και τα κύτταρα τοποθετούνται στο κατάλληλο δοχείο. Προς τον σκοπό αυτό λαμβάνονταν μικρή ποσότητα κυτταρικού εναιωρήματος, π.χ 50ml (σε σωληνάριο eppendorf) που αναμιγνύονταν με ίσο όγκο διαλύματος 0,2% trypan blue. Το προκύπτον εναιώρημα παρέμεινε για περίπου 5min σε θερμοκρασία δωματίου και κατόπιν λαμβάνονταν μικρή ποσότητα (περίπου 15ml ) αυτού και τοποθετούνταν στο αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Σε κοινό ο- πτικό μικροσκόπιο με τον αντικειμενικό φακό (40χ) γινόταν καταμέτρηση του α- ριθμού των ζωντανών κυττάρων (άχροα) και των νεκρών (μαύρα, λόγω του trypan blue) στα τέσσερα γωνιακά τετράγωνα και στο κεντρικό τετράγωνο της πλάκας Newbauer. Εκτιμούνταν ο μέσος όρος (Μ.Ο) των μετρήσεων και στη συνέχεια υπολογίζονταν ο αριθμός ζωντανών- νεκρών κυττάρων ανά ml εναιωρήματος, από τον τύπο: C (αριθμ. κυττ. / ml = 10 χ Μ.Ο.χ αραίωση Το ποσοστό ανάκτησης (R.R) είναι το επί τοις εκατό πηλίκον του ολικού αριθμού των ληφθέντων κυττάρων κατά την απόψυξη (ζωντανών και νεκρών) προς τον συνολικό αριθμό των κυττάρων του εναιωρήματος που καταψύχθηκε. Στα πειράματά μας ο δείκτης R.R των κυττάρων ανέρχονταν κατά κανόνα άνω του 70% (70-95%). Ο δείκτης βιωσιμότητας είναι το επί τοις εκατό πηλίκον του αριθμού των ζωντανών κυττάρων προς τον συνολικό αριθμό των ληφθέντων αποψυχθέντων κυττάρων. Στα πειράματά μας υπήρχε υψηλός δείκτης βιωσιμότητας (70-97%). Εάν η διαδικασία κατάψυξης-απόψυξης δεν γινόταν lege artis (π.χ εάν η απόψυξη στους 37 ο C γινόταν αργά ή αν το πλήρες θρεπτικό υγρό προστίθετο γρήγορα ή εάν η κατάψυξη των κυττάρων γινόταν με τον μη ενδεδειγμένο ρυθμό, κ.λ.π) η τιμή του δείκτη βιωσιμότητας ελαττώνονταν κάτω του 70% καθόσον αυξάνονταν ο αριθμός των νεκρών κυττάρων. [277,278,279,280,283] Α.3.3. Μέθοδος καλλιέργειας αποψυχθέντων κυττάρων Σε φλάσκα 25cm 2 προστίθονταν 3x10 6 4,5x10 6 κύτταρα με συνολικό όγκο 10 ml πλήρους θρεπτικού υγρού. Η φλάσκα τοποθετούνταν σε κλίβανο 37 ο C με υγρασία >95% και με 5% CO 2 σε αέρα. Η προσθήκη του CO 2 κρίνεται απαραίτητη για την αναπλήρωση του διαλελυμένου ποσού CO 2 στο θρεπτικό υγρό. Την επομένη ημέρα γινόταν αλλαγή του θρεπτικού υλικού με νέο, για απομάκρυνση του κρυοπροστατευτικού υλικού DMSO (εάν κατά τη διαδικασία απόψυξης δεν είχε γίνει φυγοκέντρηση) παρόλο που η χρησιμοποιηθείσα αναλογία του 7% δεν αποτελεί σοβαρό κίνδυνο για κυτταρική βλάβη. Με την πλήρη αλλαγή του θρεπτικού 115

116 υγρού απομακρύνονταν και τα νεκρά κύτταρα που υπήρχαν στην καλλιέργεια, ε- πιπλέον δε επιταχύνονταν ο ρυθμός πολλαπλασιασμού. Η καλλιέργεια παρακολουθούνταν καθημερινά για τον ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων που εκφράζονταν σε βαθμό συρροής της στρωματικής στιβάδας. Συνήθως κατά το τρίτο 24ωρο (το πολύ τέταρτο 24ωρο) είχαμε πλήρη συρροή της καλλιέργειας, δηλαδή τα κύτταρα κάλυπταν το 100% της επιφάνειας της βάσης της φλάσκας. Πριν την πλήρη συρροή και όταν το ποσοστό αυτής ανέρχονταν σε 80%-90%, προχωρούσαμε σε ανακαλλιέργεια των κυττάρων. Α.3.4. Μέθοδος αποκόλλησης καλλιεργηθέντων κυττάρων Της ανακαλλιέργειας των ινοβλαστών προηγούνταν η αποκόλλησή τους και η δημιουργία μονοκυτταρικού εναιωρήματος με τη χρήση διαλύματος τρυψίνης- EDTA. Αρχικά απορρίπτονταν ο συνολικός όγκος του θρεπτικού υγρού και προσκολλημένη κυτταρική στιβάδα πλένονταν προσεκτικά δύο φορές με PBS. Με την πλύση γινόταν απομάκρυνση τυχόν νεκρών κυττάρων και ιχνών του θρεπτικού υγρού που περιέχει ορό ο οποίος αδρανοποιεί την τρυψίνη. Προστίθετο 1,5ml διαλύματος τρυψίνης-edta επαρκές για την κάλυψη μόνον της βάσης της φλάσκας των 25cm 2. Γινόταν επώαση στους 37 ο C για 1-1,5min για να δράσει η τρυψίνη. Περισσότερος χρόνος αποφεύγονταν διότι εγκυμονούσε κίνδυνο κυτταρικής βλάβης. Στη συνέχεια η φλάσκα τοποθετούνταν σε ορθή θέση για τη συλλογή των κυττάρων στη βάση της και προστίθετο περίσσεια όγκου 7 ml πλήρους θρεπτικού υγρού για αδρανοποίηση της τρυψίνης. Ο συνιστώμενος όγκος FBS για αδρανοποίηση του διαλύματος της τρυψίνης ισοδυναμεί με το 25% του όγκου αυτής. Ταυτόχρονα ελέγχονταν στο μικροσκόπιο ο βαθμός αποκόλλησης των κυττάρων και η δημιουργία του εναιωρήματος. Αν υπήρχαν κυτταρικά συσσωματώματα, διαχωρίζονταν με επανειλημμένες διελεύσεις από πιπέτα. Κατόπιν το εναιώρημα φυγοκεντρούνταν για 6min στα 400g (στις 1670 στροφές), λαμβάνονταν ένα λευκό κυτταρικό ίζημα, προστίθεντο 1-2ml πλήρους θρεπτικού υγρού, καταμετρούνταν τα κύτταρα στο αιμοκυτταρόμετρο Newbauer και υπολογίζονταν η κυτταρική συγκέντρωση. Η φυγοκέντρηση δεν ήταν απαραίτητη εάν η συγκέντρωση του εναιωρήματος ήταν μεγάλη. [283] Α.3.5. Μέθοδος ανακαλλιέργειας ινοβλαστών Λαμβάνονταν 3x10 6 έως 4,5x10 6 κύτταρα από το ανωτέρω εναιώρημα και τοποθετούνταν σε φλάσκα 25cm 3 με 10ml φρέσκου πλήρους θρεπτικού υγρού. Παρατηρήθηκε ότι ο ρυθμός αύξησης των ανακαλλιεργημένων κυττάρων ήταν πολύ μεγαλύτερος (3-4 φορές) του ρυθμού αύξησης των αποψυχθέντων κυττάρων. Έτσι για αρχικό κυτταρικό εναιώρημα, περίπου 4x10 6 κυττάρων, πλήρης συρροή επέρχονταν ταχύτατα, σε ένα 24ωρο. Ένας από τους βασικότερους παράγοντες που σχετίζονται με τη δημιουρ- 116

117 γία συρρέοντος, λειτουργικού στρώματος είναι η γνώση του κύκλου αύξησης των ινοβλαστών, καθόσον η ανακαλλιέργεια αυτών τροφοδοτεί την επανάληψη του αυξητικού κύκλου. Είναι ουσιώδης η αναγνώριση των φάσεων αυτού του κύκλου γενικότερα για κάθε κυτταρική σειρά, διότι ο κύκλος ελέγχει: α) την αρχική κυτταρική συγκέντρωση ανακαλλιέργειας, β) τη διάρκεια αύξησης των κυττάρων πριν την ανακαλλιέργεια, γ) τη διάρκεια των πειραμάτων και δ) τους κατάλληλους χρόνους λήψεως κυτταρικών δειγμάτων. Η συμπεριφορά των κυττάρων στις διάφορες φάσεις του αυξητικού κύκλου διαφέρει όσον αφορά την ταχύτητα του πολλαπλασιασμού, την ενζυμική δραστηριότητα, τη γλυκόλυση και αναπνοή, τη σύνθεση ειδικών μορίων και άλλες ιδιότητές τους. Ο αυξητικός κύκλος των καλλιεργούμενων κυττάρων συμβατικά διαιρείται σε τρεις φάσεις: α) Η φάση lag (lag phase): Είναι το χρονικό διάστημα που αρχίζει με την τροφοδότηση της καλλιέργειας με κυτταρικό εναιώρημα. Κατ αυτή τη φάση υπάρχει πολύ μικρή αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού. Είναι ουσιαστικά χρόνος προσαρμογής των κυττάρων στις νέες συνθήκες (αναπαραγωγή στοιχείων που έχασε λόγω έκθεσης στην τρυψίνη προσκόλληση στο έδαφος της φλάσκας επέκταση των κυττάρων- σύνθεση νέου DNA και δομικών πρωτεϊνών). β) Η λογαριθμική φάση (log phase): Είναι η χρονική περίοδος της εκθετικής αύξησης του αριθμού των κυττάρων, έπεται της προηγούμενης φάσης και παύει με έναν ή δύο κυτταρικούς διπλασιασμούς μετά την επίτευξη της πλήρους συρροής. Η διάρκειά της εξαρτάται από 3 παράγοντες: Αρχική πυκνότητα κυττάρων, ρυθμός αύξησης κυττάρων, πυκνότητα κυττάρων που δρα ανασταλτικά στον περαιτέρω πολλαπλασιασμό. Το κλάσμα αύξησης είναι πολύ υψηλό, % και η καλλιέργεια είναι στην πιο παραγωγική της περίοδο. Είναι ο καλύτερος χρόνος για τη λήψη κυτταρικού δείγματος, καθόσον ο πληθυσμός είναι στην πιο ο- μοιόμορφη κατάσταση και ο δείκτης βιωσιμότητας είναι ο υψηλότερος. Στα πειράματά μας σταματούσαμε τις καλλιέργειες των ινοβλαστών (με χρήση τρυψίνης) όταν το ποσοστό συρροής έφθανε στο 80-90%, δηλαδή προς το τέλος της λογαριθμικής φάσης. γ) Η φάση πλατώ. (Plateau ή Stationary Phase): Είναι η τρίτη φάση του αυξητικού κύκλου, όπου το κλάσμα αύξησης των κυττάρων κυμαίνεται από 0-10%. Συνήθως υπάρχει μία σταθερή κατάσταση όπου η κυτταρική διαίρεση εξισορροπείται από την κυτταρική απώλεια. Στη φάση αυτή έχουμε τη μέγιστη κυτταρική συγκέντρωση στην καλλιέργεια. 117

118 Τα λαμβανόμενα κυτταρικά δείγματα χρησιμοποιούνταν αναλόγως των πειραματικών μας αναγκών, είτε για κατάψυξη σε υγρό άζωτο, είτε για περαιτέρω ανακαλλιέργεια. Πλην της αναγνώρισης των 3 φάσεων του αυξητικού κύκλου των ανακαλλιεργούμενων κυττάρων, άλλοι παράγοντες που παίζουν ρόλο στη δημιουργία λειτουργικού στρώματος είναι: 1) Ο τρόπος ανάμιξης του κυτταρικού εναιωρήματος που συντελεί στην ομαλή κατανομή των κυττάρων/cm 2 επιφάνειας. Αποφεύγονταν η έντονη κυκλική κίνηση της φλάσκας, διότι η πλειοψηφία των κυττάρων λόγω της φυγοκέντρου δυνάμεως συγκεντρώνεται στο κέντρο αυτής. Ως συνέπεια υπήρχε υπεραύξηση των κυττάρων στο κέντρο, πλήρης συρροή σε σύντομο χρονικό διάστημα με πιθανή ρήξη και αποκόλληση της πολυστιβάδας, ενώ ταυτόχρονα η περιφέρεια της φλάσκας ήταν ελάχιστα συρρέουσα. Προτιμητέα ήταν η πολύ ελαφρά κυκλική κίνηση. Αποφεύγονταν επίσης ανατάραξη της φλάσκας που θα ωθούσε τα κύτταρα στην περιφέρεια. Η περιφερική υπεραύξηση οδηγούσε σε αποκόλληση του στρώματος και διακοπή της καλλιέργειας. 2) Χρήση φρέσκου πλήρους θρεπτικού υγρού. Για να αποφεύγεται το ε- πανειλημμένο ζέσταμα στους 37 ο C κάναμε κλάσματα υλικού για μία η- μέρα. Από τη στιγμή που ανοίγονταν νέο μπουκάλι, χρησιμοποιούνταν το πολύ σε μία εβδομάδα. (+ 4 ο C). 3) Ο τύπος της φλάσκας. Η επιφάνεια της φλάσκας στην οποία θα προσκολληθούν τα κύτταρα να είναι κατάλληλη για την αποτελεσματικότερη προσκόλληση του στρώματος. 4) Ο χρόνος παραμονής των καλλιεργειών στον χώρο εργασίας του θαλάμου νηματικής ροής. Πρέπει να είναι ο ελάχιστος δυνατός, καθόσον οι συνεχείς μικροδονήσεις του οργάνου συνιστούν άμεσο κίνδυνο για τις καλλιέργειες. Μετά μερικές ημέρες ήταν εμφανής η αποκόλληση του στρώματος (μερική ή ολική) εάν οι φλάσκες παρέμειναν πάνω από 2-3 λεπτά. 5) Τέλος άλλοι παράγοντες που έπρεπε να ληφθούν υπόψιν ήταν οι διάφορες επιμολύνσεις (που αποτελούσαν πρόβλημα για όσο χρονικό διάστημα διαρκούσε μία καλλιέργεια), ο ήρεμος χειρισμός των φλασκών, η αποφυγή δηλαδή απότομων κινήσεων, η πλήρης αποφυγή επαφής της πιπέτας με το στρώμα, καθώς και η αποφυγή προσθήκης θρεπτικού υγρού άμεσα πάνω στη στρωματική στιβάδα (δηλαδή προσθήκη αργά και έγχυση στο πλάι της φλάσκας). [281,282,283] 118

119 Α.3.6. Μέθοδος κατάψυξης των ινοβλαστών Καλλιέργειες που βρίσκονταν προς το τέλος της λογαριθμικής φάσης αύξησης (συρροή 80-90%), είχαν κυτταρικό πληθυσμό κατάλληλο για κατάψυξη. Τα πλεονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι: Ελαχιστοποιείται ο κίνδυνος γενετικής απόκλισης σε συνεχείς κυτταρικές σειρές Διαφυλάσσεται η σειρά από απώλεια λόγω επιμολύνσεων στις συνθήκες καλλιέργειας ή λόγω βλάβης του κλιβάνου επώασης Είναι πρόσφορη ανά πάσα στιγμή που θα χρειασθεί για κάποιο πείραμα Αποφεύγεται η γήρανση των κυττάρων με τις διαδοχικές ανακαλλιέργειες. Για τον σκοπό αυτό κάναμε αλλαγή του πλήρους θρεπτικού υλικού την προηγούμενη ημέρα. Την επομένη απορρίπτονταν το θρεπτικό υγρό και με τη χρήση τρυψίνης παίρνονταν το κυτταρικό εναιώρημα. Γινόταν κυτταρική καταμέτρηση και με φυγοκέντρηση στα 400g/6min (περίπου στις 1670 στροφές/min) λαμβάνονταν το λευκό ίζημα των ινοβλαστών. Απορρίπτονταν το υπερκείμενο υ- γρό και το ίζημα εναιωρείτο στο ψυκτικό υγρό το οποίο ήταν μείγμα 93% FBS και 7% DMSO. Ο συνολικός αριθμός των προστιθεμένων κυττάρων ανέρχεται από 1-2Χ10 6 κύτταρα ανά κρυοφιαλίδιο και ο όγκος του ψυκτικού υγρού από 1,5-1,8ml. Τα φιαλίδια ασφαλίζονταν ερμητικά και προσεκτικά διότι το πλημμελές ή χαλαρό κλείσιμό τους σήμαινε εισροή υγρού αζώτου κατά τη βύθισή τους σ αυτό (λόγω της μεγάλης διαφοράς πίεσης), με κίνδυνο έκρηξης κατά την απόψυξη στο υδατόλουτρο. Τυλίγονταν με παχύ στρώμα βαμβακιού και φύλλο αλουμινίου (για μόνωση), στη συνέχεια τοποθετούνταν σε ειδικό μονωμένο κουτί ερμητικά κλεισμένο και τοποθετούνταν για μία ώρα σε βαθιά κατάψυξη 70 ο C. Αμέσως μετά έμπαινε στη συσκευή υγρού αζώτου. Το υγρό άζωτο έχει θερμοκρασία -196 ο C και ο υπερκείμενος ατμός σε καλά μονωμένο δοχείο έχει θερμοκρασία 180 ο C. Στο δοχείο του υγρού αζώτου υπάρχουν ειδικά κάνιστρα που φέρουν υποδοχές για τις αμπούλες. Είναι απαραίτητο να κρατείται ακριβές αρχείο των αποθηκευμένων στο άζωτο κρυοφιαλιδίων. Ως γνωστόν, το νερό είναι το κύριο συστατικό όλων των ζωντανών κυττάρων και είναι απαραίτητο για την επιτέλεση των βιοχημικών αντιδράσεων. Κατά τη διάρκεια της κρυοσυντήρησης, το νερό μεταβάλλεται σε πάγο και ο κυτταρικός μεταβολισμός σταματάει. Στους 196 ο C δεν συμβαίνει καμία βιοχημική αντίδραση και έτσι τα κύτταρα διατηρούνται επί μακρόν. Αρχική ψύξη από τη θερμοκρασία δωματίου στους 0 ο C επιβραδύνει τον κυτταρικό μεταβολισμό, αποδιοργανώνοντας τις ιονικές αντλίες. Επειδή το θρεπτικό υγρό των κυττάρων είναι ωσμωτικά ισορροπημένο δεν παρατηρείται κυτταρική βλάβη. Καθώς η ψύξη συνεχίζεται από τους 0 o C μέχρι τους 70 o C, αρχίζουν να σχηματίζονται κρύσταλλοι πάγου στο ε- ξωκυττάριο περιβάλλον. Η συγκέντρωση των διαλελυμένων ουσιών αυξάνει και λόγω της δημιουργηθείσας διαφοράς ωσμωτικής πίεσης, το ενδοκυττάριο νερό αρχίζει να εξέρχεται. Έτσι παρατηρείται η αρχόμενη κυτταρική αφυδάτωση και συρρίκνωση. Αν ο ρυθμός κατάψυξης είναι πολύ γρήγορος, το ενδοκυττάριο νερό 119

120 δεν προλαβαίνει να βγει και μετατρέπεται σε κρυστάλλους πάγου που καταστρέφουν τα ενδοκυττάρια οργανίδια και τις αντίστοιχες μεμβράνες (τα κύτταρα κατά την απόψυξη είναι νεκρά). Εάν πάλι είναι πολύ αργός, υπάρχει πλήρης αφυδάτωση και συρρίκνωση των κυττάρων, που και αυτό οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο. Επομένως ο ρυθμός κατάψυξης πρέπει να είναι επαρκώς αργός για να μπορούν να αφυδατωθούν τα κύτταρα και αρκετά ταχύς ώστε να παρεμποδισθεί η πλήρης αφυδάτωσή τους. Το περιεχόμενο στο ψυκτικό υγρό DMSO προστατεύει τα κύτταρα από βλάβες λόγω αργής κατάψυξης (αφυδάτωση-συρρίκνωση) και όχι λόγω ταχείας κατάψυξης. Ο τρόπος μόνωσης των φιαλιδίων που περιγράψαμε πιο πάνω, δημιουργούσε τον επιθυμητό ρυθμό αργής κατάψυξης και η βιωσιμότητα των κυττάρων ανέρχονταν σε υψηλά επίπεδα κατά την απόψυξη. Η ταχεία επίσης είσοδός τους στο υγρό άζωτο αμέσως μετά την έξοδό τους από τη βαθιά κατάψυξη ήταν επιβεβλημένη, για την αποφυγή ενδιάμεσης απόψυξης λόγω παραμονής τους σε θερμοκρασία δωματίου. [275,276,277,278,279,280,281,282,283] Α.3.7. Έλεγχος βιωσιμότητας Ο έλεγχος βιωσιμότητας των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με διάλυμα ΜΤΤ. Χρησιμοποιήθηκε αποθεματικό διάλυμα ΜΤΤ και διάλυμα διάλυσης ΜΤΤ. Το διάλυμα διάλυσης MTT παραγόταν από Sec. Butanol 64%, Isopropanol 32% και HCl 1N 4%. Το αποθεματικό διάλυμα ΜΤΤ παραγόταν από 5mg/ml MTT, το οποίο διαλύονταν σε φυσιολογικό φωσφορικό buffer διάλυμα και φιλτράρονταν για να αποστειρωθεί. Τα κύτταρα των κυτταρικών καλλιεργειών επωάζονταν από 20 ώ- ρες μέχρι 7 ημέρες στους 37 ο C με 0.5ml αποστειρωμένο μέσο (DMEM + FCS 10%) το οποίο περιέχει τα συστατικά ελέγχου. Μετά την επώαση, 100μl από το παραχθέν διάλυμα MTT προστίθετο στα τριβλία των κυτταρικών καλλιεργειών. Τα τριβλία επωάζονταν για ακόμη 4 ώρες στους 37 ο C. Στη συνέχεια 500μl από το διάλυμα διάλυσης ΜΤΤ προστίθετο στα τριβλία με σκοπό τη διάλυση των σκούρων μπλε κρυστάλλων, οι οποίοι είχαν δημιουργηθεί μέσα στα ζώντα κύτταρα. Το περιεχόμενο των τριβλίων αναρροφούνταν με μία πιπέτα και μεταφέρονταν σε πολυεστερικά σωληνάρια των 5ml. Τα σωληνάρια τοποθετούνταν μέσα σε ένα Elgasonic υδατόλουτρο υπερήχων για 10 λεπτά ώστε να διασφαλιστεί πλήρως η διάλυση των κρυστάλλων. Η οπτική απορρόφηση μετρούνταν με ένα Kontron Visikon 600 σπεκτοφωτόμετρο, χρησιμοποιώντας μήκος κύματος των 570nm. Τα τριβλία αξιολογούνταν μέσα σε 1 ώρα από την τοποθέτηση του διαλύματος διάλυσης ΜΤΤ, αφού το διάλυμα ήταν φωτοευαίσθητο. (Εικ.28) 120

121 Εικόνα 28: Χρώση ινοβλαστών σε καλλιέργεια κυττάρων με ΜΤΤ. Στα ζώντα κύτταρα η χρωστική ενσωματώνεται στα μιτοχόνδρια και δημιουργεί χαρακτηριστικούς μπλε κρυστάλλους. Α.4. Πλέγματα ή ικριώματα Α.4.1. Εισαγωγή Η μηχανική των ιστών ορίζεται πιο συχνά ως η εφαρμογή των αρχών της μηχανικής και της ιατρικής επιστήμης, στον σχεδιασμό, την κατασκευή, τη μετατροπή, την ανάπτυξη και τη διατήρηση των ζωντανών ιστών. Μπορεί να διαχωριστεί σε δύο ευρείες κατηγορίες: α) in vitro κατασκευή συνθετικών ιστών και β) in vivo εναλλαγή της κυτταρικής ανάπτυξης και λειτουργίας. Συνήθως, μία τρισδιάστατη κατασκευή, η οποία ονομάζεται πλέγμα (scaffold), είναι απαραίτητη στις εφαρμογές της μηχανικής των ιστών αφού οι συνθετικοί ιστοί συμπεριλαμβάνουν τρισδιάστατες κατασκευές κυτταρικών μαζών, οι οποίες είναι αποτέλεσμα μεγέθυνσης μεγαλύτερης από εκείνες που χρησιμοποιούνται στις παραδοσιακές δισδιάστατες τεχνικές κυτταρικών καλλιεργειών. Το πλέγμα, είναι μία προσωρινή τεχνητή εξωκυττάρια ουσία οι οποία βοηθά την τρισδιάστατη σύνθεση ιστών. Η ανάπτυξη του χώρου της μηχανικής των ιστών προχωρά παράλληλα με τη συνεχή ζήτηση για νέα υλικά πλεγμάτων με συγκεκριμένες ιδιότητες, όπως το ελεγχόμενο πορώδες και ο διαμερισμός του μεγέθους των πόρων, η βιοαποδόμηση, η βιοσυμβατότητα και κατάλληλες μηχανικές ιδιότητες. Ανάμεσα σε αυτά τα νέα υλικά, τα φυσικά πολυμερή προσελκύουν ενδιαφέρον λόγω της βιοσυμβατότητας, της βιοαποδόμησης και της ποικιλίας τους. Μία μεγάλη κατηγορία από φυσικά πολυμερή είναι οι πολυσακχαρίτες, στους οποίους ανήκει η κυτταρίνη, η χιτίνη και το άμυλο. Η κυτταρίνη και η χιτίνη είναι οι πιο άφθονοι πολυσακχαρίτες που βρίσκονται στη γη. [284,285,286,287] Ένας βασικός περιοριστικός παράγοντας για τη χρήση και τη διαχείριση αυτών των δύο υλικών είναι η φτωχή διαλυτότητα στο νερό ή στους κοινούς οργανικούς διαλύτες, λόγω της κρυσταλλικής τους δομής και του σχηματισμού των εσωμοριακών και ενδομοριακών δεσμών υδρογόνου ενδιάμεσα και μεταξύ των μορίων τους. Τα διαλύματά τους είναι παχύρρευστα (ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις) και παρουσιάζουν ιδιότητες σχηματισμού γέλης (gel). 121

122 Η κυτταρίνη (polymer of β-(1 4) linked D-glycopyranose) και η χιτίνη (polymer of β-(1 4) linked 2-acetamido-2-deoxy-D-glycopyranose) έχουν παρόμοια δομή. Η χιτίνη υπάρχει σε τρεις διαφορετικές δομές (α-χιτίνη, β-χιτίνη, γ- χιτίνη) ανάλογα με την προέλευσή της. Η α-χιτίνη μπορεί να βρεθεί στα αρθρόποδα και στους μύκητες ενώ η β-χιτίνη και η γ-χιτίνη μπορούν να βρεθούν σε πολύ λίγες και συγκεκριμένες πηγές (π.χ. στο καλαμάρι Loligo) μόνο που έχουν διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες από την α-χιτίνη, όπως για παράδειγμα η β-χιτίνη που είναι διαλυτή στο μυρμηκικό οξύ. Οι διαφορές πηγάζουν από τη διάταξη των αλύσων, οι οποίες είναι αντιπαράλληλες στην α-χιτίνη (δυνατοί έσω- και ενδο- μοριακοί δεσμοί υδρογόνου). Η γ-χιτίνη θεωρείται ότι έχει και παράλληλη και αντιπαράλληλη δομή. [288,289] Η κοινή γραμμή για τη διαχείριση αυτών των υλικών είναι να χρησιμοποιηθούν τα παράγωγά τους που προέρχονται από τη χημική τους τροποποίηση. Η χιτοζάνη (chitosan) (που είναι το αποκετυλιωμένο προϊόν της χιτίνης) και η οξική κυτταρίνη είναι ίσως τα πιο συχνά χρησιμοποιημένα παράγωγα της χιτίνης και της κυτταρίνης αντίστοιχα. Αυτές οι μορφές είναι πλήρως βιοσυμβατές και βιοαποδομήσημες και παρουσιάζουν καλύτερη διαλυτότητα και μεγαλύτερη αντιδραστικότητα (πλεονεκτήματα για τη μεταχείριση-διαχείριση του ακατέργαστου υλικού, αλλά μειονεκτήματα για το τελικό προϊόν). Η χρησιμοποίηση της αναγεννημένης χιτίνης και κυτταρίνης είναι μία εναλλακτική οδός. Το μειονέκτημα αυτής της οδού είναι ότι πριν την αναγέννηση είναι απαραίτητη η χημική διασταύρωση με σκοπό την προστασία και διατήρηση της παραγόμενης δομής. Στη διεθνή βιβλιογραφία πληθώρα εργασιών αφορούν τη χιτίνη και τις διαφοροποιήσεις της σε χιτοζάνη καθώς και τις διαφορές μεταξύ των δύο. Η επαυξανόμενη διαλυτότητα της χιτοζάνης επιτρέπει την προετοιμασία βιοϋλικών διαφορετικών μορφών και λειτουργιών. Για παράδειγμα, η χιτοζάνη επεξεργάστηκε σε πορώδη πλεγμάτων με διάφορες μεθόδους, όπως η απομάκρυνση των σωματιδίων και η κρυοξήρανση. Επίσης τα νανοϊνώδη πλέγματα έχουν παραχθεί μέσω της τεχνικής της ηλεκτροστατικής ινοποίησης (electrospinning). Αυτές οι μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί στη χιτίνη. Η μέθοδος της κρυοξήρανσης έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή πλεγμάτων με χαμηλό πορώδες, ενώ η μέθοδος της απομάκρυνσης σωματιδίων παράγει πλέγματα με πολύ μεγάλο διαμερισμό πόρων ή με σχετικά χαμηλή διασύνδεση των πόρων. Επιπρόσθετα ένα μικροϊνώδες πλέγμα έχει παραχθεί μέσω ηλεκτροστατικής ινοποίησης (electrospinning) χιτίνης τροποποιημένο μέσω ακτινοβολίας. [290,291] Η παρακάτω μεθοδολογία περιγράφει την παραγωγή σύνθετων υλικών χιτίνης, χιτίνης-υδροξυαπατίτη και πορώδεις δομές κυτταρίνης με ελεγχόμενο μέγεθος πόρων και δυνατότητα εφαρμογής των πλεγμάτων στη μηχανική των ιστών. 122

123 Α.4.2. Παραγωγή της πορώδους χιτίνης, κυτταρίνης και συνθέτων πηκτής χιτίνης-υδροξυαπατίτη μέσω της απομάκρυνσης αδιάλυτων στο νερό σωματιδίων Διαλύματα χιτίνης, κυτταρίνης και χιτίνης με διασκορπισμένα μόρια αναμείχθηκαν με μόρια PPMA (poly methyl methacrylate) σε μεγάλη αναλογία 1:2. Μετά από 24 ώρες ξεπλένονταν με δισαπεσταγμένο νερό πολλές φορές για 48 ώρες, με σκοπό να εξασφαλιστεί η πλήρης απομάκρυνση του διαλύτη. Τα προϊόντα αυτής της διαδικασίας ήταν υδροπηκτές με διάσπαρτα PMMA σωματίδια. Αυτές είναι ευαίσθητες υδροπηκτές και το μακροσκοπικό τους σχήμα δυνατόν να επηρεάζεται από τη διαδικασία αεροξήρανσης αλλά μπορούν και να διαλυθούν. Με σκοπό την αποφυγή αυτών των προβλημάτων μπορεί να εφαρμοστεί η μέθοδος της κρυοξήρανσης ή εκχύλισης με έναν κακό διαλύτη. Λόγω του γεγονότος ότι η ακετόνη διαλύει το PMMA, η μεθανόλη επιλέχθηκε ως ο κακός διαλύτης. Η μεθανόλη είναι ο κακός διαλύτης για της ξηρές πηκτές χιτίνης και κυτταρίνης, ενώ είναι υδατοδιαλυτή και δεν διαλύει το PMMA. Οι υδροπηκτές εμβαπτίζονταν και ξεπλένονταν με μεθανόλη πολλές φορές και στη συνέχεια αφήνονταν να στεγνώσουν για 24 ώρες στους 40 o C. Με τη μέθοδο αυτή το μακροσκοπικό σχήμα των πηκτών διατηρούνταν και δεν παρουσιαζόταν κανένα φαινόμενο συρρίκνωσης. Μετά το στέγνωμα, τα δείγματα εμβαπτίζονταν σε διχλωρομεθάνη για την απομάκρυνση των σωματιδίων PMMA και τελικώς επιτυγχάνονταν το στέγνωμα με αναρρόφηση στους 40 o C για 24 ώρες. [292] Όλα τα δείγματα κόβονταν με ξυράφι, επιστρώνονταν με άνθρακα σε υγρό άζωτο και εξετάζονταν με ηλεντρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως (SEM). Α.4.3. Παραγωγή πολυ(υδροξυ-βουτυρικού εστέρα) (ΡΗΒ) και οξικής κυτταρίνης μέσω της ηλεκτροστατικής ινοποίησης Τα πλέγματα της οξικής κυτταρίνης και του πολυ(υδροξυ-βουτυρικού εστέρα) (ΡΗΒ) παράγονται με την τεχνική της ηλεκτροστατικής ινοποίησης (electrospinning).η οξική κυτταρίνη και ο πολυ(υδροξυ-βουτυρικός) εστέρας (PHB) διαλύονται σε ακετόνη ή άλλο οργανικό διαλύτη. Το διάλυμα ρέει μέσω μίας βελόνας. Υψηλή τάση εφαρμόζεται ανάμεσα στη βελόνα και τον χώρο συλλογής. Από την άκρη της βελόνας παράγονται ίνες με ταυτόχρονη εξάτμιση του διαλύτη, οι οποίες συλλέγονται στον χώρο συλλογής. Οι δομές που προκύπτουν έχουν μέση διάμετρο ινών μεταξύ 0,6 και 3μm. Στα ινώδη ικριώματα ΡΗΒ έγινε εγκλεισμός πυροξικάμης ενώ στις ίνες οξικής κυτταρίνης έγινε εγκλεισμός αμοξικιλλίνης. Και στις δύο περιπτώσεις το ποσοστό ε- γκλεισμού ήταν μικρό. Βρέθηκε ότι αύξηση της συγκέντρωσης φαρμάκου στο αρχικό διάλυμα δεν οδηγεί απαραίτητα σε αύξηση του ποσοστού εγκλεισμού. [292] 123

124 Με τις παραπάνω μεθόδους παρήχθησαν τα πλέγματα χιτίνης και PHB. Οι παρακάτω φωτογραφίες απεικονίζουν μακροσκοπικά και υπερμικροσκοπικά τα δύο είδη πλεγμάτων. (Εικ.29, Εικ.30) Εικόνα 29: Πλέγμα χιτίνης, όπως φαίνεται μακροσκοπικά (αριστερά) και υπερμικροσκοπικά (δεξιά) Εικόνα 30: Πλέγμα PHB.( πολυ-υδροξυ-βουτυρικού εστέρα ή Polyhydroxy butyrate) Μακροσκοπική (αριστερά) και υπερμικροσκοπική (δεξιά), εμφάνιση των πλεγμάτων. Α.5. Καλλιέργειες κυττάρων Α.5.1. Πρωτογενείς καλλιέργειες εμβρυϊκών ινοβλαστών μυών Οι πρωτογενείς εμβρυϊκοί ινοβλάστες μυών αναπτύχθηκαν για τους ακόλουθους λόγους: η δημιουργία τους από έμβρυα μυών ήταν σχετικά εύκολη και προσβάσιμη, υπήρχε η τεχνογνωσία και προσφέρονταν για τεχνική εκπαίδευση η οποία ήταν μακροχρόνια και επίπονη λόγω των λεπτών χειρισμών και της έμφασης στη λεπτομέρεια των τεχνικών των κυτταροκαλλιεργειών. Τέλος δε, είχαν μικρό χρόνο ανακαλλιέργειας, σε σχέση με τους ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες οι οποίοι έχουν χρόνο ανακαλλιέργειας μεγάλο (8-10 ημέρες). 124

125 Για τη δημιουργία των πρωτογενών εμβρυϊκών ινοβλαστών χρησιμοποιήθηκαν θηλυκοί μυς της σειράς BalbC οι οποίοι βρίσκονταν στην 11 η με 12 η ημέρα της κύησης. Η ημέρα κύησης προσδιορίζονταν με κολπικό επίχρισμα. Οι μυς αρχικά ναρκώνονταν με αιθέρα και στη συνέχεια μετά τον θάνατό τους, τα έμβρυα απομονώνονταν από τη μήτρα των θηλυκών μυών με καισαρική τομή και αφού ξεπλένονταν σε PBS αφαιρούνταν ο πλακούντας και ο εμβρυϊκός σάκος. Κατόπιν τοποθετούνταν σε τριβλίο με PBS και τεμαχίζονταν. Τα εμβρυϊκά αυτά τεμάχια ομογενοποιούνταν αδρά κατά το πέρασμά τους μέσα από μια σύριγγα 18G. Το ομογενοποίημα κάθε εμβρύου μοιράζονταν σε δύο πιάτα καλλιέργειας στα οποία τοποθετούνταν θρεπτικό μέσο DMEM, 10% FBS, 10000U Pen/Strep και επωάζονταν για ώρες σε κλίβανο επώασης σε ατμόσφαιρα 5% CO 2. Mετά τις πρώτες 24 ώρες σχηματίζονταν οι πρώτες αποικίες εμβρυϊκών ινοβλαστών οι οποίες αφήνονταν να αναπτυχθούν για τις επόμενες 48 ώρες και διαμοιράζονταν σε νέα πιάτα καλλιέργειας. Για την ανακαλλιέργεια, τα κύτταρα αυτά, αφού απομακρύνονταν το καλλιεργητικό μέσο, ξεπλένονταν με PBS και επωάζονταν με διάλυμα 1% Trypsin /EDTA στους 37 o C για λίγα λεπτά. Για να σταματήσει η δράση του διαλύματος Trypsin/EDTA στα τριβλία, προσθέταμε θρεπτικό μέσο και οι αποικίες ινοβλαστών αποδιοργανώνονταν περαιτέρω με ανάδευση, χρησιμοποιώντας το ρύγχος της πιπέτας του 1ml. Το ομοιογενές εναιώρημα κυττάρων που σχηματιζόταν, αραιώνονταν σε αναλογία 1:2 και μοιράζονταν σε νέα τριβλία καλλιέργειας. Α.5.2. Καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Α Κυτταρική σειρά ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών 142BR Η κυτταρική σειρά ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών 142BR προμηθεύτηκε από την εταιρεία Antisel S.A. Πρόκειται για κυτταρική σειρά του εμπορίου, με ECACC No που δημιουργήθηκε από βιοψία υγιούς άρρενος 51 ετών. Λόγω της γενετικής τροποποίησης που είχε υποστεί από τον κατασκευαστή της, έχει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί για 23 ανακαλλιέργειες. Η καλλιέργεια των κυττάρων της σειράς 142BR έγινε χρησιμοποιώντας επωαστικό μέσο EMEM (EBSS) με την προσθήκη 2mM Γλουταμίνης, 1% Non Essential Amino Acids (NEAA) + 15% Foetal Bovine Serum (FBS). Η περιγραφή της μεθοδολογίας της καλλιέργειας κυτταρικών σειρών, όπως η 142BR, προηγήθηκε στο Ειδικό Μέρος. 125

126 Α Πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Οι ιστοί από τους οποίους απομονώθηκαν οι ινοβλάστες προέρχονταν από την ακροποσθία τεσσάρων παιδιών ηλικίας 4, 5, 6 και 9,5 ετών τα οποία υπεβλήθησαν σε επέμβαση φίμωσης, στην Παιδοχειρουργική κλινική του Νοσοκομείου Γ. Γεννηματάς και μεταφέρθηκαν στο Εργαστήριο Ιστολογίας-Εμβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής. Το παρασκεύασμα τοποθετήθηκε αμέσως σε κρύο ΡΒS και μεταφέρθηκε στο εργαστήριο όπου και ακολούθησε η περαιτέρω διαδικασία στον θάλαμο νηματικής ροής με πλήρη αποστείρωση των χρησιμοποιούμενων εργαλείων. Το δέρμα κάθε ακροποσθίας μέσα σε μία σταγόνα καλλιεργητικού μέσου (Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM)/Ham s F12, 10% fetal calf serum, 100UI/ml penicillium/streptomycin, 1ml CaCl2) κόπηκε σε μικρά τεμάχια (4x4mm), αφού απομακρύνθηκε το λίπος, όπου ήταν εφικτό καθώς και η επιδερμίδα και τοποθετήθηκαν σε τριβλία (μικρά και μεγάλα) με το χόριο προς τα κάτω και σε απόσταση μεταξύ τους. Τα τριβλία που είχαν επιστρωθεί με καθαρό (αποστειρωμένο) ορό από την προηγούμενη ημέρα και διατηρούνταν στο ψυγείο, τοποθετήθηκαν για 45 λεπτά στους 37 o C (στον κλίβανο) και στη συνέχεια προστέθηκε σ αυτά 2 ή 4 ml καλλιεργητικό μέσο με προσοχή έτσι ώστε να μη μετακινηθούν τα ιστοτεμάχια και επιπλέουν. Μερικά ιστοτεμάχια, πριν μπουν στο ορό, τοποθετήθηκαν σε 0,25% τρυψίνη όλο το βράδυ στο ψυγείο και την επομένη μπήκαν για 2,5 ώρες στους 37 ο C. Δεν παρατηρήθηκαν όμως διαφορές στην εξέλιξη τους σε σχέση με την προηγούμενη διαδικασία. Η αλλαγή του καλλιεργητικού μέσου γινόταν με προσοχή κάθε 2 ημέρες. Σε 5 ημέρες άρχισαν να αποχωρίζονται οι ινοβλάστες και να εξαπλώνονται γύρω από τα ιστοτεμάχια του δέρματος. Αφέθηκαν όμως να αναπτυχθούν και να προσκολληθούν στο τριβλίο για 2,5 εβδομάδες, μετά την πάροδο των οποίων, συλλέγονταν με πιπέτα και μεταφέρονταν σε φλάσκα 75cm 2. Κάθε 4-6 ημέρες γινόταν διαχωρισμός έτσι ώστε τα κύτταρα να είναι ενεργά. Οι ινοβλάστες που χρησιμοποιήθηκαν για τα πειράματα ήταν μεταξύ 3 ης και 5 ης σειράς. Α Ταυτοποίηση των πρωτογενών καλλιεργειών ινοβλαστών με ανοσοϊστοχημεία Ο φαινότυπος των ινοβλαστών προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για την ακτίνη των λείων μυϊκών κυττάρων, την κυτταροκερατίνη, την ινονεκτίνη, τη λαμινίνη και τον παράγοντα von Willebrand (Roche Applied Science, Indianapolis, IN; or Santa Cruz Βiotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στα Lab-Tek τριβλία καλλιέργειας ιστών (Bayer Corporation, Elkhart, IN) μέχρι τα τριβλία να πληρωθούν σε κύτταρα και να μονιμοποιηθούν, με 4% παραφορμαλδεΰδη. Η μη ειδική σύνδεση πρωτεϊνών αποτράπηκε με επώαση των κυττάρων σε PBS 126

127 (Seromed, Berlin, Germany) παρουσία 0.5% (w/v) αλβουμίνης βόειου ορού (Fluka Chemie, Buchs, Switzerland) για 20 λεπτά. Τα παρασκευάσματα στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα από τα παραπάνω αναφερόμενα αντισώματα για 60 λεπτά. Ακολούθησε πλύση τρεις φορές με PBS και επώαση των παρασκευασμάτων με φλουοροσίνη ή rhodamine-linked anti-rabbit or anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Τα παρασκευάσματα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS και τροποποιήθηκαν με Fluorosave reagent (Calbiochem-Novabiochem, San Diego, CA). Στη συνέχεια μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού εφοδιασμένο με ειδικά φίλτρα (Axiophot; Carl Zeiss, Inc., Oberkochem, Germany). Ως μάρτυρας της μη ειδικής σύνδεσης της φλουορεσίνης ή του rhodamine-linked αντισώματος χρησιμοποιήθηκε το δεύτερο αντίσωμα μόνο. Α.6. Πειραματικά μοντέλα επούλωσης τραύματος Α.6.1. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Όπως ήδη έχει αναφερθεί στη μεθοδολογία της ανάπτυξης πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών, ο διαχωρισμός των κυττάρων της καλλιέργειας γινόταν κάθε 4-6 ημέρες, έτσι ώστε τα κύτταρα να είναι ενεργά. Στο πειραματικό μας μοντέλο χρησιμοποιήθηκαν οι ινοβλάστες μεταξύ 3 ης και 5 ης σειράς. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ποσοστό συρροής 80% μέσα σε ειδικά τριβλία με 24 θήκες. Μετά την 3 η σειρά, το κυτταρικό ίζημα από 2 φλάσκες διαλύθηκε σε 11 ml μέσου και μοιράσθηκε σε 11 μεγάλα τριβλία (1ml = περίπου κύτταρα/cm 2 ) σε κάθε ένα από τα οποία προστέθηκε 9ml μέσου. Το ίζημα μιας φλάσκας διαλύθηκε σε 10ml μέσου από τα οποία τα 3ml τοποθετήθηκαν μαζί με 7ml μέσου σε φλάσκα για περαιτέρω καλλιέργεια. Στα υπόλοιπα 7ml μέσου προστέθηκαν 17ml μέσου και μπήκε 1ml ανά θήκη σε τριβλίο 12 θέσεων, δηλαδή συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 24 θήκες. Την 6 η ημέρα, έγινε αλλαγή του μέσου με ορό 0,25% και τα κύτταρα που είχαν σχεδόν πλήρως καλύψει το τριβλίο, παρέμειναν σε αυτό για 24 ώρες, με μία αλλαγή του ορού στις 12 ώρες, έτσι ώστε ο πολλαπλασιασμός όλων των κυττάρων να αρχίσει ταυτόχρονα. Μετά από παραμονή 24ωρών, δημιουργήθηκε με τη βοήθεια αποστειρωμένου ρύγχους, μία απόξεση του κυτταρικού στρώματος, ομοιόμορφου μεγέθους, κατά μήκος της διαμέτρου κάθε τριβλίου, καταβάλλοντας ιδιαίτερη προσοχή έτσι ώστε να μειωθεί κατά το δυνατόν ο τραυματισμός των κυττάρων 127

128 που απέμειναν. Με τον τρόπο αυτό δημιουργείται ένα «τραύμα» πλάτους περίπου μm. Το επωαστικό υλικό απομακρύνθηκε, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS για να απομακρυνθούν τα εναπομείναντα κυτταρικά θραύσματα και το επωαστικό υλικό αντικαταστάθηκε με νέο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν περαιτέρω για 48 ώρες απουσία και παρουσία 1μg/ml υαλουρονικού οξέος, θειϊκής δερματάνης, θειικής χονδροϊτίνης και θειϊκής ηπαράνης. Οι παραπάνω ουσίες είχαν ζυγιστεί, αποστειρωθεί στο UB και διαλυθεί σε καλλιεργητικό μέσο. Επίσης είχε προηγηθεί έλεγχος της τοξικότητας των ουσιών σε συγκεντρώσεις από 1μg/ml έως 50μg/ml με τη μέθοδο ΜΤΤ, μετρώντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 48 ώρες επώασης. Στο πείραμα χρησιμοποιήθηκε η συγκέντρωση του 1μg/ml, διότι η συγκέντρωση αυτή βρίσκεται πιο κοντά στα φυσιολογικά επίπεδα των γλυκοζαμινογλυκανών στο τραύμα. Καθορισμένα πεδία της περιοχής του τραύματος κάθε θήκης φωτογραφήθηκαν στο μικροσκόπιο σε χρόνο ώρα 0. Σε μεσοδιαστήματα 4, 12, 24 και 48 ωρών τα ίδια καθορισμένα πεδία φωτογραφήθηκαν ξανά και δείγματα 50μl ελήφθησαν από το επωαστικό υλικό για τη μέτρηση των MMPs με ζυμογραφία ζελατίνης και ανάλυση RNA. Το πείραμα επαναλήφθηκε 3 φορές. Α.6.2. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών με τη χρήση πλεγμάτων ικριωμάτων (porous scaffolds) Σκοπός αυτού του πειραματικού μοντέλου ήταν η μελέτη της επίδρασης πλεγμάτων porous scaffolds σε κυτταρικές καλλιέργειες πρωτογενών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. Έτσι οι δερματικοί ινοβλάστες ανακαλλιεργήθηκαν μέχρι την 3 η σειρά τους και ήταν πλέον σε θέση να χρησιμοποιηθούν για το πείραμά μας. Τα πλέγματα (χιτίνης και PHB) που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη, παρελήφθησαν σε άσηπτες συνθήκες από το Τμήμα Χημικών Μηχανικών, της Πολυτεχνικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Για την αποφυγή οποιασδήποτε επιμόλυνσης των ευαίσθητων κυτταροκαλλιεργειών μας, τα πλέγματα αποστειρώθηκαν με υπεριώδη ακτινοβολία για 24 ώρες στον θάλαμο νηματικής ροής (4 φορές για κάθε πλέγμα). Τα δύο πλέγματα τοποθετήθηκαν σε τριβλία 48 θέσεων. Ο λόγος που επιλέχθηκαν τριβλία με μικρή διάμετρο θηκών ήταν για την ελαχιστοποίηση του πε- 128

129 ριθωρίου μετακίνησης των πλεγμάτων μέσα στις θήκες. Το κυτταρικό ίζημα δερματικών ινοβλαστών από 2 φλάσκες, αφού είχαν αναπτυχθεί σε ποσοστό συρροής 80%, διαλύθηκε σε θρεπτικό μέσο και μοιράσθηκε στα τριβλία. Στις θήκες τοποθετήθηκε με προσοχή, για να μην ανασηκωθούν τα πλέγματα, 2ml θρεπτικού υλικού με 10 6 κύτταρα και επωάσθηκαν στον κλίβανο, στους 37 ο C με 5% CO 2. Η αρχική μας πρόθεση ήταν η επαλήθευση ότι οι δερματικοί ινοβλάστες θα μπορούσαν να πολλαπλασιαστούν με την παρουσία πλέγματος μέσα στα τριβλία, έτσι ώστε να επαναλάβουμε το προηγούμενο πειραματικό μοντέλο με τη δημιουργία τραύματος και μελέτης της επούλωσης κάτω από το οπτικό μικροσκόπιο, αλλά και με ανοσοϊστοχημεία. Δυστυχώς όμως η παρουσία του πλέγματος μέσα στη θήκη του τριβλίου εμπόδιζε και τη μελέτη των καλλιεργειών αλλά και τη φωτογράφησή τους, για τον λόγο ότι ήταν αδύνατη η μικροσκόπηση της κυτταροκαλλιέργειας παρουσία πλέγματος. Έτσι αποφασίστηκε η τροποποίηση του αρχικού μοντέλου και η μελέτη των πλεγμάτων χιτίνης και PHB κάτω από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM), με σκοπό τη διερεύνηση της διεισδυτικότητας των ινοβλαστών στη δομή των πλεγμάτων. Την 1 η,3 η, 5 η και 7 η ημέρα λοιπόν αφαιρούνταν ένα πλέγμα μέσα από την κυτταροκαλλιέργεια, τοποθετούνταν σε μικρό τριβλίο, πάντα στον θάλαμο νηματικής ροής και αφού ξεπλένονταν με PBS, μονιμοποιούνταν αρχικά με γλουταραλδεΰδη 3% σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα με ph 7,4 για 15 λεπτά και μετά με OsO 4 για 20 λεπτά. Τα πλέγματα ξεπλένονταν με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα, ακολουθούσε η αφυδάτωση με αυξανόμενης πυκνότητας αλκοόλες (30%, 50%, 70%, 90% και 6x100% ) για 15 λεπτά έκαστο και τέλος τοποθετούνταν σε απόλυτη ακετόνη και στεγανοποιούνταν με ταινία εργαστηρίου μέχρι την επανθράκωσή τους. Στη συνέχεια τοποθετούνταν σε διάλυμα διχλωρομεθάνης για 24 ώρες στους 40 ο C, κόβονταν με ξυράφι σε υγρό άζωτο, στερεώνονταν σε ειδικές βάσεις αλουμινίου και καλύπτονταν με άνθρακα (σε ειδική συσκευή). Η παρατήρηση τους και η ψηφιακή φωτογράφησή τους γινόταν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM), Jeol JSM 840A. Α.6.3. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωα H πειραματική μελέτη διεξήχθη στις εγκαταστάσεις του Τμήματος Πειραματοζώων του Εργαστηρίου Ιστολογίας-Εμβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ (κωδικός ΕΛ54Bio38-19EΠΟ9) και εκτελέσθηκαν με τις προβλεπόμενες διατάξεις της Ευρωπαϊκής Σύμβασης για τα πειραματόζωα (Ν.1197/81 Άρθρο 4,Ν. 2015/92 ΠΔ160/91). Η μελέτη πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη και τη συμβολή της κτηνιάτρου Αναστασίας Τζιγκοζίδου, Λέκτορος της Κτηνιατρικής Σχολής 129

130 του Α.Π.Θ., η οποία έχει την ευθύνη για την τήρηση των κανόνων υγιεινής και προστασίας των ζώων του Τμήματος Πειραματοζώων. Χρησιμοποιήθηκαν 32 μυς καθαρής φυλής Balb/c που αποτελούν την καλλιέργεια-αποικία του εργαστηρίου και προέρχονται από το Πειραματικό-Ερευνητικό Τμήμα του Θεαγενείου-Αντικαρκινικού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Οι μυς διατηρούνταν σε πλαστικούς κλωβούς με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό και παρέμειναν κάτω από εναλλασσόμενο 12ωρο κύκλο φωτός/σκότους σε ελεγχόμενο περιβάλλον θερμοκρασίας δωματίου, περίπου ο C. Η τροφή των πειραματοζώων (κροκέτες 21Μ) προέρχονταν από την εταιρεία Agrovet όπως και το ροκανίδι Raff Naturella Compact 60L, σε πεπιεσμένη, αποστειρωμένη συσκευασία, το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την επίστρωση των κλωβών. [293,294,295] Για την αναισθησία χρησιμοποιούνταν κώδωνας με διαιθυλαιθέρα, από τον οποίο έβγαιναν μόλις αναισθητοποιούνταν, έτσι ώστε να αποφεύγεται η θανάτωση. Κατά τη διάρκεια του πειράματος υπήρχε πάντα διαθέσιμο βαμβάκι με διαιθυλαιθέρα κοντά στη μύτη του μυός για να διατηρείται η αναισθησία. [296,297,298,299] Κατά τη διάρκεια του πειράματος κάθε μυς ξυρίζονταν επιμελώς σε τρία σημεία (αριστερά και δεξιά της ράχης και πίσω στο κέντρο) Σε κάθε περιοχή γινόταν μία τομή με αποστειρωμένο νυστέρι μέχρι και τον υποδόριο ιστό. Στην αριστερή τομή ( σε σχέση με τη ράχη ) τοποθετούνταν υποδορίως με μία λαβίδα το πλέγμα χιτίνης (170±40 μm), στη δεξιά τομή το πλέγμα PHB (9% MMJ-PCL) ενώ στην πίσω κεντρική τομή δεν τοποθετήθηκε κανένα πλέγμα (περιοχή μάρτυρας). Γινόταν συρραφή της τομής με αποστειρωμένο ράμμα 3.0. Μετά το πείραμα κάθε μυς τοποθετούνταν σε ατομικό κλωβό με ελεύθερη πρόσβαση σε τροφή και νερό με σταθερές συνθήκες διαβίωσης ενώ παρακολουθούνταν το βάρος του σώματος και η εν γένει κατάστασή τους.[300,301,302] Όλοι οι μύες ανένηψαν σύντομα και ήταν σε πολύ καλή κατάσταση. Θυσιάστηκαν ανά τέσσερις την 1 η, 2 η, 3 η, 5 η, 7 η, 10 η, 14 η και 21 η ημέρα. Από κάθε τομή παίρνονταν δείγματα, ιστοτεμάχια δέρματος για το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε γλουταραλδεΰδη 3%, για το οπτικό μικροσκόπιο και για την ανοσοϊστοχημεία σε φορμόλη 10% και τέλος για απομόνωση RNA σε ειδικό διάλυμα RNA-later και γλυκοζαμινογλυκανών. (Εικ.31-38) 130

131 Εικόνα 31: Έναρξη πειράματος. Προετοιμασία πειραματοζώου. Ξύρισμα ράχης μυός. Εικόνα 32: Δημιουργία τομής στη ράχη του μυός. 131

132 Εικόνα 33: Τοποθέτηση πλέγματος μέσα στην τομή Εικόνα 34:Συρραφή της τομής 132

133 Εικόνα 35: Συρραφή της τομής Εικόνα 36: Τοποθέτηση του πρώτου πλέγματος και συρραφή της τομής 133

134 Εικόνα 37: Ολοκλήρωση της συρραφής και των τριών τομών Εικόνα 38: Σταβλισμός των πειραματοζώων κατά τη διάρκεια του πειράματος. 134

135 Α.7. Ιστολογική ανάλυση με οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Α.7.1. Οπτικό μικροσκόπιο (ΟΜ) Τα δείγματα για την εξέταση τους στο ΟΜ μετά τη μονιμοποίησή τους στη φορμόλη 10%, αφυδατώνονταν με την εξής διαδικασία: Έκπλυση σε τρεχούμενο νερό (3-5 ώρες) 70% αιθυλική αλκοόλη (20-24 ώρες) 96% αιθυλική αλκοόλη (18-20 ώρες) 100% αιθυλική αλκοόλη (περίπου 3 ώρες) Τολουόλη (6 λεπτά) Α παραφίνη (περίπου λεπτά στον κλίβανο) Β παραφίνη (περίπου 3 ώρες στον κλίβανο) Μετά την αφυδάτωση ακολουθούσε η σκήνωση και ο εγκιβωτισμός των παρασκευασμάτων σε παραφίνη. Από τα παρασκευάσματα λαμβάνονταν τομές πάχους 6μm, οι οποίες προετοιμάζονταν για χρώση με συμβατικές χρωστικές. Η παρατήρηση των τομών πραγματοποιήθηκε στο οπτικό μικροσκόπιο Zeiss Primo Star (Carl Zeiss Ltd, UK) και η φωτογράφησή τους έγινε με ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Canon Europe Ltd) Οι εν σειρά τομές τοποθετούνταν σε συμβατικές αντικειμενοφόρες πλάκες και προετοιμάζονταν για μελέτη μετά από χρώση με χρωστική αιματοξυλίνηςεωσίνης και Mallory. Για τη χρώση αιμοτοξυλίνης-εωσίνης ακολουθήθηκε το εξής πρωτόκολλο: 1. Αποπαραφίνωση. Τα παρασκευάσματα εμβαπτίζονται 2 φορές σε ξυλόλη, 2 φορές σε απόλυτη αλκοόλη, 2 φορές σε αλκοόλη 96% και μία φορά σε αλκοόλη 70% (5-7λεπτά σε κάθε δοχείο, χωρίς ενδιάμεση έκπλυση) 2. Έκπλυση (εμβάπτιση 2-3 φορές σε νερό βρύσης) 3. Διάλυμα αιματοξυλίνης. Εμβάπτιση σε τυποποιημένο διάλυμα αιματοξυλίνης Harris (5-10 λεπτά) 4. Έκπλυση (εμβάπτιση σε τρεχούμενο νερό βρύσης για 10 λεπτά περίπου) 5. Διαφοροποίηση. Εμβάπτιση 2-3 φορές σε αλκοολούχο διάλυμα υδροχλωρικού οξέος (1% HCl σε αλκοόλη 70%) 6. Έκπλυση (εμβάπτιση σε τρεχούμενο νερό βρύσης για λεπτά περίπου) 135

136 7. Διάλυμα εωσίνης. Εμβάπτιση σε υδατικό διάλυμα εωσίνης 1% (5-10 λεπτά) 8. Έκπλυση. Εμβάπτιση σε νερό βρύσης μέχρις αποχρωματισμού. 9. Αφυδάτωση. Εμβάπτιση σε αλκοόλη 70%, 2 φορές σε αλκοόλη 96%, 2 φορές σε απόλυτη αλκοόλη και τέλος 2 φορές σε ξυλόλη. 10.Τοποθέτηση μίας σταγόνας βάλσαμου του Καναδά, κάλυψη με καλυπτρίδα και μικροσκόπιση. Για τη χρώση Mallory ακολουθήθηκε το εξής πρωτόκολλο: 1. Αποπαραφίνωση. Τα παρασκευάσματα εμβαπτίζονται 2 φορές σε ξυλόλη, 2 φορές σε απόλυτη αλκοόλη, 2 φορές σε αλκοόλη 96% και μία φορά σε αλκοόλη 70% (5-7λεπτά σε κάθε δοχείο, χωρίς ενδιάμεση έκπλυση) 2. Έκπλυση (εμβάπτιση 2-3 φορές σε νερό βρύσης) 3. Διάλυμα 1 ο. Εμβάπτιση σε sulfate d aluminium, A.D., Kernechtrot (7 λεπτά) 4. Έκπλυση με A.D. (βουτιές) 5. Διάλυμα 2 ο. Εμβάπτιση σε Fuchine acide, A.D. 6. Έκπλυση με A.D. (βουτιές) 7. Διάλυμα 3 ο. Εμβάπτιση σε acide phosphomoliblique, A.D. (8 λεπτά) 8. Έκπλυση με A.D. (βουτιές) 9. Διάλυμα 4 ο. Εμβάπτιση σε blue de methylene, Orange G, Acide oxalique, A.b. (45 λεπτά) 10. Έκπλυση με A.D. (βουτιές) 11. Αφυδάτωση. Εμβάπτιση σε αλκοόλη 70%, 2 φορές σε αλκοόλη 96%, 2 φορές σε απόλυτη αλκοόλη 100% και τέλος 2 φορές σε ξυλόλη. 12. Ενστάλαξη μίας σταγόνας βάλσαμου του Καναδά, τοποθέτηση καλυπτρίδας σ αυτήν και μικροσκόπηση. Α.7.2 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (ΗΜ) Η λήψη των ιστοτεμαχίων για την εξέταση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο γινόταν ταυτόχρονα με τη λήψη των ιστοτεμαχίων για το οπτικό μικροσκόπιο, δηλαδή όταν τα πειραματόζωα ήταν αναισθητοποιημένα αλλά εν ζωή. Το τμήμα δέρματος αφού τεμαχίζονταν (1mm 3 το καθένα) μέσα σε γλουταραλδεΰδη 3%, μονιμοποιούνταν άμεσα σε διάλυμα γλουταραλδεΰδης 3% σε φωσφορικό διάλυμα με ph 7,4 για 2 ώρες, κατόπιν σε διάλυμα τετροξειδίου του οσμίου 2% για μιάμιση 136

137 ώρα και ακολουθούσε «in tissue» χρώση σε 1% υδατικό διάλυμα οξικού ουρανυλίου για 14 έως 16 ώρες. Στη συνέχεια υποβάλλονταν σε αφυδάτωση με αλκοολικά διαλύματα αυξανόμενης πυκνότητας (30%, 50%, 70%, 90% και έξι φορές απόλυτη αλκοόλη 100%), διήθηση με διαλύματα ρητίνης-αιθανόλης 1:2 για 2 λεπτά έκαστο και τελικά έγκλειση σε καθαρή ρητίνη μετά από φυγοκέντρηση σε EPON 812 για 20 λεπτά στις 2000 στροφές/λεπτό. Σε ημίλεπτες τομές (1,5-3μ) γινόταν ο ακριβής εντοπισμός του τραύματος και ακολουθούσε η λήψη λεπτών τομών του σημείου αυτού, χρώση τους με οξείδιο του μολύβδου (Reynold s) και μικροσκόπησή τους με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο τύπου JEOL TEM 2000 FX 11 σε 80KV. Α.8. Απομόνωση, κλασματοποίηση και ταυτοποίηση γλυκοζαμινογλυκανών Οι γλυκοζαμινογλυκάνες απομονώθηκαν, κλασματοποιήθηκαν και ταυτοποιήθηκαν από ιστοτεμάχια δέρματος μυών που ελήφθησαν σε διαφορετικά στάδια επούλωσης, ακολουθώντας την παρακάτω μεθοδολογία Α.8.1. Ομογενοποίηση των δειγμάτων Tα δείγματα τοποθετήθηκαν σε 10ml ρυθμιστικού διαλύματος 25mM Tris- HCl, ph 7,6, που περιείχε 5 mm CaCl 2 και ομογενοποιήθηκαν με τη χρήση ομογενοποιητή Polytron για 10 sec, διαδικασία που επαναλήφθηκε 5 φορές με ενδιάμεσα διαλείμματα 1 λεπτού, σε πάγο. Α.8.2. Απολιπίδωση των δειγμάτων Το πρώτο βήμα στην πορεία της απομόνωσης των γλυκοζαμινογλυκανών ήταν η απομάκρυνση των λιπιδίων και γλυκολιπιδίων από τα δείγματα με την προσθήκη 4 όγκων διαλύματος χλωροφορμίου/μεθανόλης (1:2) (PANREAC, MERCK), ανάδευση και επώαση στους 4 ο C για 18 h. Κατά τη διαδικασία αυτή α- πενεργοποιούνται όλα τα υδρολυτικά ένζυμα και έτσι ελαχιστοποιείται η διάσπαση των γλυκοζαμινογλυκανών. Ακολούθησε φυγοκέντρηση των δειγμάτων σε 3.200xg, για 20 min, στους 4 ο C και απόρριψη του υπερκείμενου διαλύματος. Το ίζημα ξεπλύθηκε με 10 ml αιθανόλη (PANREAC), με στόχο την απομάκρυνση των οργανικών διαλυτών, και φυγοκεντρήθηκε στις ίδιες συνθήκες (3.200xg, 20 min, 4 ο C). Το ίζημα που προέκυψε αποξηράνθηκε σε θερμοκρασία 37 ο C για 4-6h. 137

138 Α.8.3. Ενζυμική διάσπαση πρωτεϊνών Ακολούθησε πλήρης ενζυμική διάσπαση των πρωτεϊνών των δειγμάτων. Για τον σκοπό αυτό το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 1ml ρυθμιστικού διαλύματος προνάσης (0.1M Tris-HCl, ph 7,4, που περιείχε 1mM CaCl 2 ) και υποβλήθηκε σε πρωτεϊνική πέψη με την προσθήκη 30 μl διαλύματος προνάσης (Streptomyces griseus, Calbiochem, Lucerne, Switzerland) 30mg/mL, το οποίο είχε προεπωαστεί για 30min, στους 37 ο C, προκειμένου να αδρανοποιηθούν οι γλυκοσιδάσες που ενδεχόμενα υπήρχαν ως προσμίξεις στο παρασκεύασμα της προνάσης. Η τελική συγκέντρωση της προνάσης στο διάλυμα ήταν 0.1 KU. Ακολούθησε ε- πώαση για 72h, στους 37 ο C, προσθέτοντας την ίδια ποσότητα προνάσης σε διαστήματα 24h. Α.8.4. Ενζυμική διάσπαση νουκλεϊνικών οξέων Το επόμενο στάδιο ήταν η ενζυμική διάσπαση των νουκλεϊνικών οξέων. Για τον σκοπό αυτό η συγκέντρωση των δειγμάτων ρυθμίστηκε με 150mM NaCl και 10mM MgCl 2 και η ενζυμική διάσπαση του DNA επιτεύχθηκε με την προσθήκη 400 KU DNase I (EC , Calbiochem) και επώαση για 16h, στους 37 ο C. Στο τέλος της επώασης, η συγκέντρωση του CaCl 2 ρυθμίστηκε σε 1mM και ακολούθησε προσθήκη προνάσης σε τελική συγκέντρωση 0.1 KU και επώαση του μίγματος στους 37 ο C, για 24h έτσι ώστε να απενεργοποιηθεί η DNase. Α.8.5. Β-απόσπαση τελικού αμινοξέος Στο στάδιο αυτό, στόχος είναι να απομακρυνθεί από τις γλυκοζαμινογλυκάνες το τελευταίο αμινοξύ που συνδέει τα μόρια αυτά στον πρωτεϊνικό κορμό. Για τον λόγο αυτό, το ph των δειγμάτων ρυθμίστηκε σε με την προσθήκη 10mM NaOH, και τα δείγματα υποβλήθηκαν σε β-απόσπαση παρουσία 1M NaBH 4 (Merck) για 16 h, στους 45 ο C, απουσία οξυγόνου, σε περιβάλλον αζώτου. Μετά το πέρας της επώασης τα δείγματα εξουδετερώθηκαν με τη στάγδην προσθήκη πυκνού οξικού οξέος, σε όγκο 1/10 του συνολικού όγκου του κάθε δείγματος, στους 4 C. Α.8.6. Απομόνωση των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών Ακολούθησε καταβύθιση των GAGs με προσθήκη 4 όγκων διαλύματος αιθανόλης 95% (v/v) που περιείχε 2.5% (w/v) οξικό νάτριο και παραμονή των δειγμάτων στους 4 ο C για 18h. Στη συνέχεια, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν (3.200xg, 20min, 4 ο C), απορρίφθηκε το υπερκείμενο και το ίζημα αποξηράνθηκε για 4-6h στους 37 ο C. Τέλος, το ίζημα που περιείχε το σύνολο των απομονωμένων γλυκοζαμινογλυκανών διαλυτοποιήθηκε σε 300μL ddh 2 O, και αποθηκεύτηκε στους 4 C. 138

139 Α.8.7. Ποσοτικός προσδιορισμός των απομονωμένων ολικών γλυκοζα-μινογλυκανών Η ποσοτικοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών πραγματοποιήθηκε με μέτρηση των ουρονικών οξέων στα δείγματα των απομονωμένων ολικών γλυκοζαμινογλυκανών, φασματοφωτομετρικά, σύμφωνα με τη μέθοδο των Bitter και Muir. [303] Για τον σκοπό αυτό, 20μL από το διάλυμα των ολικών γλυκοζαμινογλυκανών που απομονώθηκαν από το δέρμα μυών, αραιώθηκαν μέχρι τα 250μL. Ακολούθησε προσθήκη 1.25mL παγωμένου διαλύματος 0.025Μ Na 2 B 4 O 7 (Mallinckrodt) διαλυμένου σε πυκνό θειικό οξύ (Merck), με μεγάλη προσοχή και αφού τα δείγματα είχαν τοποθετηθεί σε πάγο. Τα δείγματα αναδεύτηκαν με προσοχή και τοποθετήθηκαν για 10 λεπτά σε βράζον υδατόλουτρο. Αμέσως μετά τοποθετήθηκαν σε πάγο και προστέθηκαν 50μL φρέσκου διαλύματος 0.125% w/v καρβαζόλης (Merck) διαλυμένης σε 100% αιθανόλη (Merck). Ακολούθησε ανάδευση και μεταφορά των δειγμάτων για 15 λεπτά σε βράζον υδατόλουτρο. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύτηκαν και μετρήθηκε η απορρόφηση του ροζ χρώματος που αναπτύχθηκε στα 530nm σε φασματοφωτόμετρο (Shimazdu Corporation, Japan, UV ). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και η συγκέντρωση των ουρονικών οξέων στα δείγματα υπολογίστηκε με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης που δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ως πρότυπο, διάλυμα γλυκουρονικού οξέος (0.5-20μg) (Fluka). Α.8.8. Ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης Η κλασματοποίηση και η ταυτοποίηση των επιμέρους γλυκοζαμινογλυκανών των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης (M.A.L.T.A. Chemetron SRL, Milano, Italy). Για τον λόγο αυτό, από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε όγκος διαλύματος που να περιέχει 4μg ουρονικών οξέων. Τα δείγματα συμπυκνώθηκαν με φυγοκέντρηση σε κενό (Speed Vac Plus, SC110A, Refrigerator Vapor Trap-RVT4104, Savant Instrumments Inc., Holbrook, NY) και επαναδιαλύθηκαν σε 4μL ddh 2 O. Ακολούθησε τοποθέτηση των δειγμάτων σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης οι οποίες είχαν πρώτα ξεπλυθεί αρχικά με απεσταγμένο νερό και στη συνέχεια είχαν παραμείνει για τουλάχιστον 20 λεπτά στο ρυθμιστικό διάλυμα της ηλεκτροφόρησης. Η τοποθέτηση των δειγμάτων έγινε σε απόσταση 10mm από την αρχή της κυτταρίνης. Χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα 100mM πυριδίνης (Carlo Erba)/ 470mM φορμικού οξέος (Merck), ph 3.0 για την ηλεκτροφόρηση που πραγματοποιήθηκε σε ειδική συσκευή ηλεκτροφόρησης (Apelex, France) υπό συνεχές ρεύμα 100V σε θερμοκρασία δωματίου για 70min. Να σημειωθεί ότι καθώς οι γλυκοζαμινογλυκάνες έχουν όλες αρνητικό φορτίο, η τοποθέτηση των δειγμάτων έγινε έτσι ώστε η κίνηση των δειγμάτων να γίνεται από την κάθοδο προς την άνοδο της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Επίσης, σε κάθε μεμβράνη οξικής κυτταρίνης τοπο- 139

140 θετήθηκαν τα εξής πρότυπα διαλύματα γλυκοζαμινογλυκανών: Υαλουρονικό οξύ (από βόειο τραχεία), θειϊκή ηπαράνη (από βόειο εντερικό βλεννογόνο), θειϊκή χονδροϊτίνη (από χόνδρο καρχαρία) και θειϊκή δερματάνη (από χοίρειο δέρμα) (όλα από Sigma-Aldrich), έτσι ώστε να γίνει ο χαρακτηρισμός των γλυκοζαμινογλυκανών που υπάρχουν σε κάθε δείγμα. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης οι μεμβράνες οξικής κυτταρίνης χρωματίσθηκαν με διάλυμα 0.2% (w/v) Alcian blue (Sigma), σε 0.1% (v/v) οξικό οξύ (Mallinckrodt U.S.P), για 10 min, και ξεπλύθηκαν με 0.1% (v/v) οξικό οξύ για 20min. Η ένταση της χρώσης υπολογίσθηκε με τη βοήθεια προγράμματος επεξεργασίας εικόνας σε ηλεκτρονικό υπολογιστή (1D Image Analysis Software, version 3.0 of Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, New York). Α.8.9. Ταυτοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών με ειδικά ένζυμα Η ταυτοποίηση των γλυκοζαμινογλυκανών πραγματοποιήθηκε με πέψη των δειγμάτων με ειδικά ένζυμα που διασπούν τις γλυκοζαμινογλυκάνες. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε ποσότητα διαλύματος ολικών γλυκοζαμινογλυκανών που περιείχε 4μg ουρονικών οξέων, αφού προηγουμένως αποξηράνθηκε με φυγοκέντρηση σε κενό. Τα δείγματα επωάστηκαν σε τελικό όγκο 10μl όπως περιγράφεται παρακάτω. Υαλουρονιδάση (Hyaluronidase) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 20mM οξικού νατρίου/οξικού οξέος, ph 6.0 που περιείχε 0.15Μ NaCl και επωάστηκαν με 5U υαλουρονιδάσης (hyaluronate lyase, EC , Streptomyces hyalurolyticus, Seikagaku, Tokyo, Japan), για 17 h, στους 60 C. Χονδροϊτινάση ABC (Chondroitinase ABC) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100mM Tris-HCl, ph 8.0, που περιείχε 50 mm οξικό νάτριο και επωάστηκαν με 5x10-3 U χονδροϊτινάσης ABC (chondroitin ABC lyase, EC , Proteus vulgaris, Sigma-Aldrich) για 17h, στους 37 ο C. Χονδροϊτινάση B (Chondroitinase B) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 0.05M Tris-HCl, ph 8.0 και επωάστηκαν με 1.5x10-3 U χονδροϊτινάσης B (chondroitinase B, Flavobacterium heparinum, Seikagaku, Tokyo, Japan), για 17h, στους 30 ο C. 140

141 Ηπαρινάση (Heparinase) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100mM Tris-HCl, ph 7.0, που περιείχε 3mM CaCl 2 και επωάστηκαν με 4x10-4 U ηπαρινάσης (heparin lyase I, EC , Flavobacterium heparinum, Seikagaku, Tokyo), για 17h, στους 30 ο C. Ηπαριτινάση (Heparitinase) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 100mM οξικού νατρίου/οξικού οξέος, ph 7.0, που περιείχε 3mΜ CaCl 2 και επωάστηκαν με 1.5x10-3 U ηπαριτινάσης (heparan sulfate lyase, heparitinase, EC , Flavobacterium heparinum, Seikagaku, Tokyo), για 17h, στους 43 ο C. Κερατανάση (keratanase) Τα δείγματα διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-HCl, ph 7.4, και επωάστηκαν με 0.05 U κερατανάσης (keratan sulphate Endo-β-Dgalactosidase, EC , Pseudomonas species, Sigma-Aldrich), για 17h, στους 37 ο C. Οι χρόνοι επώασης καθώς και οι συγκεντρώσεις των ενζύμων που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν αυτοί που χρειάστηκαν για πλήρη πέψη των αντίστοιχων υ- ποστρωμάτων τους, όπως προσδιορίστηκε από μία προκαταρκτική μελέτη. Στις αρχικές αυτές μελέτες, 10μg θειϊκής δερματάνης (από χοίρειο δέρμα), θειϊκής χονδροϊτίνης C (από χόνδρο καρχαρία), υαλουρονικού οξέος (από βόειο τραχεία) και θειϊκής ηπαράνης (από βόειο εντερικό βλεννογόνο) επωάστηκαν με τα προαναφερθέντα ένζυμα στις κατάλληλες συνθήκες επώασης. Υποστρώματα που επωάσθηκαν με τα αντίστοιχα ρυθμιστικά διαλύματα χωρίς την παρουσία ενζύμου αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου. Ο βαθμός πέψης εκτιμήθηκε ύστερα από ηλεκτροφόρηση σε μεμβράνες οξικής κυτταρίνης, σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου καθώς και σε πηκτές αγαρόζης και υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman. Kodak, Rochester, NY). Α.9. Ποσοτικός προσδιορισμός του υαλουρονικού οξέος με ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο (ELISA) Ο ποσοτικός προσδιορισμός του υαλουρονικού οξέος στα δείγματα ολικών γλυκοζαμινογλυκανών που απομονώθηκαν από ιστοτεμάχια δέρματος μυών πραγματοποιήθηκε με ένζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδο ELISA (Corgenix, Inc, Broomfield, Colorado 80020, USA). Τα δείγματα καθώς και πρότυπα διαλύματα 141

142 υαλουρονικού οξέος, αραιώθηκαν με το ρυθμιστικό διάλυμα της αντίδρασης (Reaction Buffer) ώστε ο όγκος τους να είναι 100μl και τοποθετήθηκαν σε πλακίδια μικροτιτλοποίησης που ήταν επικαλυμμένα με την προσδένουσα πρωτεΐνη του υαλουρονικού οξέος (Hyaluronic Acid Binding Protein, HABP). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. Τα πλακίδια μικροτιτλοποίησης αφέθηκαν για επώαση για 1h σε θερμοκρασία δωματίου, έτσι ώστε τα μόρια του υαλουρονικού οξέος που υπήρχαν στα δείγματα να μπορέσουν να συνδεθούν με την HABP. Κατόπιν, τα πλακίδια μικροτιτλοποίησης ξεπλύθηκαν 4 φορές με PBS και στη συνέχεια, προστέθηκαν 100μl διαλύματος υπεροξειδάσης ραπανιού συνδεδεμένης με HABP με στόχο να δημιουργηθούν σύμπλοκα με τα ήδη δεσμευμένα στα πλακίδια μόρια υαλουρονικού οξέος. Tα δείγματα επωάστηκαν για 30 min σε θερμοκρασία δωματίου, ξεπλύθηκαν 4 φορές με PBS και προστέθηκαν 100 μl διαλύματος χρωμογόνου υποστρώματος (τετραμεθυλβενζινιδίνη και υπεροξείδιο του υδρογόνου). Μετά την προσθήκη, τα δείγματα επωάστηκαν για 30min σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια, προστέθηκαν 100μl 0.36 N θειικού οξέος ώστε να σταματήσει η αντίδραση. Οι μετρήσεις της απορρόφησης πραγματοποιήθηκαν στα 450nm (με μήκος κύματος αναφοράς τα 650 nm) σε κατάλληλη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακιδίων ELISA (ELISA Reader, das SRL, Roma, ITALY). Με τις μετρήσεις των πρότυπων διαλυμάτων του υαλουρονικού οξέος κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη με τη βοήθεια της οποίας υπολογίστηκε η ποσότητα του υαλουρονικού οξέος που υπήρχε σε κάθε δείγμα. Α.10. Ενζυμο-ανοσοπροσροφητική μέθοδος για την ανίχνευση της MMP-2 Η MMP-2 προσδιορίσθηκε στα υπερκείμενα των κυτταρικών καλλιεργειών μετά την ομογενοποίηση ιστοτεμαχίων δέρματος μυός με ποσοτική μέθοδο σταθερής φάσης συναγωνιστικής ELISA (Quantikin ). Χρησιμοποιήθηκαν πλακίδια μικροτιτλοποίησης καλυμμένα με πολυκλωνικό αντίσωμα μυός έναντι της MMP-2. Η μέθοδος ανιχνεύει ολική MMP-2 (prommp-2 και MMP-2). Τα πρότυπα δείγματα MMP-2 καθώς και ποσότητα δείγματος που περιείχε την ίδια ποσότητα πρωτεΐνης προστέθηκαν στα πλακίδια και επωάσθηκαν, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25ºC). Για την πρότυπη καμπύλη χρησιμοποιήθηκαν συγκεντρώσεις ανασυνδυασμένης ανθρώπινης MMP-2 (R&D Systems): 0, 0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50 και 100ng/ml PBS-T (10mM phosphate buffer ph 7,2/0,14 M NaCl/0,05% Tween 20). Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντίσωμα του μυός δεσμεύει την ποσότητα της prommp-2 και MMP-2 (αντιγόνο) που υπάρχει στα δείγματα. Ακολούθησε απόπλυσή των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0,1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία 142

143 απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Ακολούθως προστέθηκε στα φρεάτια 200μl από ένα δεύτερο πολυκλωνικό αντίσωμα αιγών έναντι του ανθρώπινου MMP-2 συζευγμένο με υπεροξειδάση και διαλυμένο σε PBS-T, το οποίο επίσης δεσμεύει το ήδη δεσμευμένο με το πρώτο αντίσωμα αντιγόνο MMP-2 των δειγμάτων. Τα πλακίδια επωάσθηκαν περαιτέρω, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου (20-25ºC). Ακολούθησε απόπλυσή των σε περίσσεια μη-δεσμευθέντων αντισωμάτων με PBS-T, που περιείχε 0,1% BSA για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας ειδικό εξοπλισμό απόπλυσης και αφαίρεση των σταγονιδίων χτυπώντας το πλακίδιο 4-5 φορές πάνω σε απορροφητικό χαρτί. Η διαδικασία απόπλυσης επαναλήφθηκε 3 ακόμη φορές. Στη συνέχεια προστέθηκαν 200 μl ενός υποστρώματος υπεροξειδάσης (2mg/ml τετραμεθυλοβενζιδίνης, 0,03% Η 2 Ο 2, σε 0,1M κιτρικού, ph 5,0) στα φρεάτια και ακολούθησε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (20-25ºC) στο σκοτάδι. Η επακόλουθη αντίδραση υπεροξειδάσης/υποστρώματος δημιούργησε ένα μπλε διάλυμα. Ακολούθως προστέθηκε H 2 SO 4 (2M), το οποίο σταματά την αντίδραση και μετατρέπει το χρώμα του διαλύματος σε κίτρινο, μετρήθηκε σε φασματοφωτόμετρο ELISA reader, στα 450nm και 540nm και υπολογίσθηκε η διαφορά μεταξύ των 2 καταγραφών. Α.11. RT-PCR Ο προσδιορισμός της γονιδιακής έκφρασης των ενζύμων που συνθέτουν (HAS-1, HAS-2 και HAS-3) και αποδομούν (HYAL-1, HYAL-2 και HYAL-3) το υαλουρονικό οξύ και των υποδοχέων του υαλουρονικού οξέος, CD44 και RHAMM, πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Α.11.1 Απομόνωση RNA από πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Tα κύτταρα καλλιεργήθηκαν μέχρι πυκνότητα cells/cm 2 σε φλάσκες των 25cm 2. Ξεπλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, αποκολλήθηκαν από τον πυθμένα με τη βοήθεια πλαστικού στυλεού και συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση σε 900xg για 10min. Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini kit (Qiagen, Basel, Switzerland). Εν συντομία ακολουθήθηκαν τα ε- ξής βήματα: 1. Διάσπαση κυττάρων με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρων (RLT) που περιέχει β-μερκαπτοαιθανόλη (Genaxis Biotechnology) 2. Φυγοκέντρηση για 3min στις 14,000 rpm 3. Μεταφορά υπερκείμενου και προσθήκη 1 όγκου αιθανόλης 70% (v/v) 4. Μεταφορά του διαλύματος σε μία RNeasy mini στήλη 5. Φυγοκέντρηση για 15sec στις 10,000rpm 143

144 6. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RW1 για ξέπλυμα της στήλης 7. Φυγοκέντρηση για 15sec στις 10,000rpm 8. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RPE για ξέπλυμα της στήλης 9. Φυγοκέντρηση για 15sec στις 10,000rpm 10. Απόρριψη διηθήματος και προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος RPE για επανάληψη σταδίου Φυγοκέντρηση για 2min στις 10,000rpm, για να ξηρανθεί η στήλη 12. Προσθήκη ddh 2 O ελεύθερο RNασών πάνω στη στήλη για έκλυση του mrna 13. Φυγοκέντρηση για 1 min στις 10,000rpm. 14. Συλλογή του mrna και αποθήκευσή του στους 80 ο C. Η ποιότητα του απομονωμένου RNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.0 % (w/v) Α Αντίστροφη μεταγραφή 2μg από το ολικό RNA που απομονώθηκε, υποβλήθηκαν σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας M-MLV Reverse Transcriptase σύμφωνα με το παρακάτω πρωτόκολλο (Promega, Madison, WI, USA): 1. Σε αποστειρωμένο, ελεύθερο RNασών, σωληνάκι κατάλληλο για PCR προστέθηκε το ολικό RNA και οι εκκινητές της αντίδρασης, oligo(dt) 15 σε αναλογία 0.5μg εκκινητών για κάθε μg RNA. Ο όγκος συμπληρώθηκε μέχρι 15μl με ddh 2 O ελεύθερο RNασών. 2. Το μίγμα θερμάνθηκε για 5 min στους 70 o C ώστε να αναδιαταχθεί η δευτεροταγής δομή του RNA-καλουπιού και τοποθετήθηκε άμεσα σε πάγο για να μην επαναδημιουργηθεί η δευτεροταγής δομή. 3. Προστέθηκαν 5μl M-MLV 5X Reaction Buffer (250mM Tris-HCl, ph:8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl 2, 50mM DTT), 1.25μl 10mM datp, 1.25μl 10mM dctp, 1.25μl 10mM dgtp, 1.25μl 10mM dttp, 25U ανασυνδυασμένου αναστολέα ριβονουκλεάσης RNasin (για απενεργοποίηση των RNασών) και τέλος 200U M-MLV RT. 4. Το μίγμα αναδεύτηκε ήπια και επωάστηκε για 60 min στους 42 o C. 5. Ακολούθησε απενεργοποίηση των ενζύμων με επώαση στους 70 o C για 15min και το cdna αποθηκεύτηκε στους 80 o C. 144

145 Α.11.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μία μέθοδος που χρησιμοποιεί cdna ως εκμαγείο και με τη βοήθεια μιας σειράς νουκλεοτιδίων κατάλληλων αλληλουχιών, τους εκκινητές (primers), επιμηκύνεται το γονίδιο ενδιαφέροντος. Για να πραγματοποιηθεί η επιμήκυνση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη του ενζύμου DNA πολυμεράση καθώς και περίσσεια νουκλεοτιδίων (datp, dttp, dctp, dgtp). Χρησιμοποιήθηκε η Go Taq Flexi DNA polymerase (Promega). Τα βήματα που ακολουθήθηκαν για την PCR συνοπτικά ήταν τα ακόλουθα: 1. Σε θερμοάντοχο αποστειρωμένο πλαστικό σωληνάκι για PCR προστέθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια: 5μl 5X Green GoTaq Flexi Buffer, ph 8.5, 1.5μl διαλύματος 25mM MgCl 2, 0.5μl διαλύματος 40mM dntps (10mM από κάθε datp, dttp, dctp, dgtp ), 0.5μl 50pM από κάθε εκκινητή (εμπρόσθιο και αντίστροφο), κατάλληλη ποσότητα cdna (1-2 μl), 0.2μl DNA πολυμεράση και συμπληρώθηκε ο όγκος έως 25μl με ddh 2 O (ελεύθερο RNασών). 2. Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στη συσκευή PTC-100 Thermal Controller (MJ Research Inc., Watertown, MA) με τις ακόλουθες ρυθμίσεις: α) μετουσίωση δειγμάτων για 2 min στους 95 ο C, β) μετουσίωση δειγμάτων για 30 sec στους 95 ο C γ) αναδιάταξη των εκκινητών σε θερμοκρασίες από 55 έως 65 ο C, ανάλογα με το γονίδιο που θέλουμε να μελετήσουμε, για 30sec δ) επιμήκυνση του εκάστοτε DNA κομματιού στους 72 ο C για 1min ε) επανάληψη των σταδίων 4, 5 και 6 για 17 έως 42 κύκλους ανάλογα με το κομμάτι του DNA που θέλουμε να αναπαραχθεί, στ) τελική επιμήκυνση και απενεργοποίηση αντίδρασης στους 72 ο C για 10min. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 1.0 έως 2.0 % (w/v), ανάλογα με το μέγεθος του προϊόντος και έγιναν ορατά με τη βοήθεια βρωμιούχου αιθιδίου στο υπεριώδες φως. Η ένταση κάθε ζώνης ποσοτικοποιήθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY) και σταθμίστηκε βάσει της έκφρασης του γονιδίου της β-ακτίνης. Οι συνθήκες των αντιδράσεων ρυθμίστηκαν έτσι ώστε η συγκέντρωση των τελικών προϊόντων να βρίσκεται στην εκθετική φάση παραγωγής τους και χαμηλότερα από το σημείο κορεσμού τους. 145

146 Α Ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης Για την ανάλυση των προϊόντων της PCR παρασκευάστηκαν πηκτές αγαρόζης, % (w/v) σε ρυθμιστικό διάλυμα TAE 1x (40mM Tris-οξικού οξέος, 1mM EDTA, ph 8.3). Το διάλυμα θερμάνθηκε στους 100 ο C για όση ώρα χρειάστηκε ώστε η αγαρόζη να διαλυτοποιηθεί πλήρως. Στη συνέχεια αφέθηκε να ψυχθεί και λίγο πριν αρχίσει να πήζει, προστέθηκαν 5μl διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου [1% (w/v) σε 50% αιθανόλη] σε 100ml διαλύματος αγαρόζης και τοποθετήθηκε στη συσκευή ηλεκτροφόρησης (Horizontal Gel Electrophoresis Apparatus, Horizon 11-14, GIBCO BRL, Life Technologies, USA)], όπου είχαν τοποθετηθεί ειδικά πλαστικά εξαρτήματα με σχήμα χτένας ώστε να διαμορφωθούν κατάλληλες κοιλότητες μέσα στην πηκτή για την τοποθέτηση των δειγμάτων. (Πίνακας 5) Εκκινητές Αλληλουχία Κύκλοι MMP-2 TIMP-1 β-ακτίνη For:GTGCTGAAGGACACACTAAAGAAGA Rev:TTCTTCAA AACAGCATCAATCTT For:CAGGGATCCCTGCACACCTGTGTCCCC Rev:CGGGGGATCAGGCTATCTGGGACC For: ACACTGTGCCCATCTACGAGG Rev: AGGGGCCGGACTCGTCATACT Πίνακας 5: Λεπτομέρειες εκκινητών για την RT-PCR 20 Θερμοκρασία Αναδιάταξης Μέγεθος προϊόντος (bp) 58 o C o C oC 621 Αφού η πηκτή στερεοποιήθηκε, προστέθηκαν 900ml του ρυθμιστικού διαλύματος της ηλεκτροφόρησης ΤΑΕ 1Χ στο οποίο είχαν προστεθεί 45μl διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου (Sigma) και αφαιρέθηκαν τα ειδικά πλαστικά εξαρτήματα που διαμόρφωσαν τους χώρους τοποθέτησης των δειγμάτων. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκε σε αυτά 15μl από το ολικό προϊόν της κάθε PCR αντίδρασης καθώς και κατάλληλη ποσότητα από πρότυπο διάλυμα DNA (Promega, DNA ladder, 1kb και 100bp) που περιείχε κομμάτια DNA διαφόρων μεγεθών (bp) και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση με σταθερή τάση 120V για 40 λεπτά. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης οι πηκτές τοποθετήθηκαν σε τράπεζα υπεριώδους φωτός (UV) (UV Transilluminator, TFX-35M, GIBCO BRL, Life Technologies, USA) όπου η ένταση της φωτεινότητας των προϊόντων της PCR υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY). 146

147 Α.12. Προσδιορισμός δραστικότητας των μεταλλοπρωτεϊνασών του συνδετικού ιστού (ΜΜPs) με ζυμογραφία ζελατίνης Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται η ύπαρξη των ζελατινασών τόσο σε μορφή προενζύμου, όσο και σε ενεργοποιημένη μορφή. Χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 2μg πρωτεΐνης από το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών, καθώς και από τα δείγματα των ομογενοποιημένων ιστών. Παρασκευάστηκαν πηκτές πολυακρυλαμιδίου, συγκέντρωσης 8% (w/v) σε α- κρυλαμίδιο όπως περιγράφηκε παραπάνω, με τη διαφορά ότι προστέθηκε επιπλέον 1mg/ml ζελατίνης, που αποτελεί υπόστρωμα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-2 και MMP-9. Αρχικά, παρασκευάστηκε το διάλυμα της πηκτής διαχωρισμού (separating gel) σύμφωνα με τον Πίνακα 6 και τοποθετήθηκε στην ειδική συσκευή παρασκευής πηκτών πολυακρυλαμιδίου της BioRad. Πηκτή Διαχωρισμού (8%) Πηκτή Στοίβαξης (4%) V Τ =5 ml V Τ =10 ml V Τ =2.5 ml V Τ =5 ml 30% ακρυλαμίδιο ml ml ml ml Η 2Ο ml ml ml ml Ζελατίνη 2% (w/v) ml ml LGB ml ml UGB ml ml APS 10% 25 μl 50 μl 50 μl 100 μl TEMED 4 μl 8 μl 5 μl 10 μl Πίνακας 6: V T : τελικός όγκος, LGB: ρυθμιστικό διάλυμα 0.5Μ Tris-HCl, 0.4% SDS, ph 6.8, UGB: ρυθμιστικό διάλυμα 1.5Μ Tris-HCl, 0.4% SDS, ph 8.8, APS: υπερθεϊικό αμμώνιο, T.E.M.E.D: N,N,N N -τετραμεθυλενεδιαμίνη Στη συνέχεια, αφού στερεοποιήθηκε η πηκτή διαχωρισμού, παρασκευάστηκε η πηκτή στοίβαξης των δειγμάτων (stacking gel) και τοποθετήθηκε πάνω στη στερεοποιημένη πηκτή διαχωρισμού. Για να δημιουργηθούν κατάλληλες υποδοχές (wells) για την τοποθέτηση των δειγμάτων στην πηκτή στοίβαξης, χρησιμοποιήθηκε ένα κομμάτι ειδικού πλαστικού με σχήμα χτένας ώστε όταν στερεοποιηθεί η πηκτή στοίβαξης να διαμορφωθούν οι κατάλληλες υποδοχές για την τοποθέτηση των δειγμάτων. Ποσότητα που να περιέχει 2μg ολικής πρωτεΐνης από το υπερκείμενο θρεπτικό υλικό των κυτταροκαλλιεργειών ή από τα ομογενοποιημένα δείγματα ιστών, αναμείχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα (0.0625Μ Tris-HCl, ph 6.8, % (w/v) SDS, 30% γλυκερόλη και 0.025% (w/v) μπλε της βρωμοφαινόλης) και τοποθετήθηκαν με προσοχή στις κατάλληλες υποδοχές της πηκτής στοίβαξης (wells). Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιώντας κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα (25mM Tris, 192mM γλυκίνη, 0.05% SDS, ph 8.0) με σταθερή 147

148 τάση 150V για 2h. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης, απομακρύνθηκε η πηκτή στοίβαξης και για την απομάκρυνση του SDS, η πηκτή ξεπλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα 50 mm Tris-HCl, 5 mm CaCl 2, 200 mm NaCl, ph 7.5, το οποίο περιέχει 2.5% Τriton X-100. Στη συνέχεια, η πηκτή επωάστηκε για 20 h στους 37 ο C στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει 0.1 % Triton X-100 (Sigma). Μετά την επώαση, η πηκτή χρωματίστηκε με διάλυμα 0.5% (w/v) Coomasie Brilliant Blue G-250 (Sigma) σε 25% (v/v) ισοπροπυλικής αλκοόλης και 2.5% (v/v) οξικού οξέος, για 12h. Διάλυμα 30% (v/v) ισοπροπυλικής αλκοόλης και 10% (v/v) οξικού οξέος, χρησιμοποιήθηκε για τον αποχρωματισμό της πηκτής. Στις θέσεις που είχαν ηλεκτροφορηθεί οι μεταλλοπρωτεϊνάσες MMP-2 και MMP-9, λόγω τοπικής αποδόμησης του υποστρώματος της ζελατίνης, εμφανίστηκαν διαφανείς ζώνες λύσεως. Το μοριακό βάρος που αντιστοιχεί στις διαφανείς ζώνες λύσης λόγω ενζυμικής δραστηριότητας, υπολογίσθηκε με σύγκριση με καθαρή μορφή prommp-2 (72.0kDa), ενεργό MMP-2 (64.0 kda), prommp-9 (92.0kDa) και ενεργό MMP-9 (78.0kDa) του εμπορίου (Anawa Trading, Wangen), καθώς και με ηλεκτροφόρηση δειγμάτων πρωτεϊνών αναφοράς γνωστού μοριακού βάρους: μυοσίνη (250kDa), φωσφορυλάση (148kDa), αλβουμίνη βόειου ορού (98kDa), αφυδρογονάση του L- γλουταμινικού (64kDa), αλκοολική δεϋδρογονάση (50kDa), καρβονική ανυδράση (36kDa), μυογλοβίνη (22kDa), λυσοζύμη (16kDa), απροτινίνη (6kDa), ινσουλίνη β- αλυσίδα (4 kda)( SeeBlue Plus2 Prestained, Invitrogen, USA). Η ένταση της λύσης των διαφανών ζωνών που δημιουργήθηκαν υπολογίσθηκε με πυκνομετρία σάρωσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα υπολογιστή 1D Image Analysis Software, version 3.0 (Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY). Α.13. Προσδιορισμός πρωτεϊνών Το περιεχόμενο των πρωτεϊνών κάθε δείγματος μετρήθηκε με τη μέθοδο Bradford (Bio-Rad, Glattbrugg, Switzerland), χρησιμοποιώντας αλβουμίνη από βόειο ορό (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Germany) για τον καθορισμό της πρότυπης καμπύλης. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκαν 10μL από κάθε δείγμα και αραιώθηκαν μέχρι 800μL με ddh 2 O. Τα δείγματα αναδεύτηκαν και προστέθηκαν 200μL αντιδραστηρίου Bradford. Ακολούθησε ανάδευση και μέτρηση της απορρόφησης των δειγμάτων στα 595nm. Παράλληλα κατασκευάστηκε πρότυπη καμπύλη εύρους 1μg έως 20μg πρωτεΐνης (αλβουμίνης), με τη βοήθεια της οποίας προσδιορίστηκε το ποσό της ολικής πρωτεΐνης σε κάθε δείγμα. Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν. 148

149 Α.14. Στατιστική ανάλυση Τα αποτελέσματα ανάλυσης των δειγμάτων μεταφέρθηκαν σε πακέτο φύλλων εργασίας (spreadsheet) του λογισμικού Microsoft Excel Office 10 for Windows ΧP. Ακολούθως, έγινε έλεγχος της κανονικότητας των κατανομών (normal distribution), όλων των ποσοτικών μεταβλητών (quantitative variables), με τη χρήση της μη παραμετρικής δοκιμασίας Kolmogorov-Smirnov. Για τη βιοστατιστική ανάλυση των στοιχείων χρησιμοποιήθηκαν τα προγράμματα στατιστικής ανάλυσης και επεξεργασίας δεδομένων (statistical package) SPSS 16.0 edition (SPSS for Windows), Primer Biostatistics 4.0 for Windows, McGraw-Hill και STATΑ Intercooled Stata 6.0 for Windows. Για την περιγραφή του υλικού χρησιμοποιήθηκαν ο μέσος όρος (mean) για το δείγμα (sample) και η αντίστοιχη δειγματική έκφραση για την τυπική απόκλιση (standard deviation). Από την τυπική απόκλιση υπολογίστηκε το τυπικό σφάλμα (standard error) το οποίο και απεικονίζεται στις γραφικές παραστάσεις κατά υποομάδα περιστατικών. Ο μέσος όρος (mean) για δείγμα (sample) υπολογίσθηκε σύμφωνα με τη γνωστή μαθηματική διατύπωση: _ x = n Όπου Σ=άθροισμα, xi=τιμές της μεταβλητής, n=σύνολο των περιστατικών κατά μεταβλητή, ενώ η αντίστοιχη δειγματική έκφραση για την τυπική απόκλιση (standard deviation) ορίζεται ως εξής: s = i x i n(x x) i n 1 Ο τύπος για το τυπικό σφάλμα s x είναι ο παρακάτω: s _ x = Για τον έλεγχο βιοστατιστικών υποθέσεων (hypothesis tests) εφαρμόσθηκε, ανάλογα με τη φύση των συγκρίσεων, η παραμετρική μέθοδος student t-test για ανεξάρτητα δείγματα (t-test for independent samples), με υπολογισμό της τιμής του t (t value), σύμφωνα με τον τύπο: s n 2 149

150 x μ x μ x1 x2 s s 2 2 s s x n + n1 n2 t = = = όπου t= τιμή του στατιστικού student t-test και η δοκιμασία χ 2. Επιπλέον, υπολογίσθηκαν οι συντελεστές μεταβλητότητας (correlation coefficients) σύμφωνα με τον τύπο: ( x)( y) (x x)(y y) xy r = = n ( x) 2 ( y) [ (x x) ] [ (y y) ] [ x ] [ y ] n n όπου χ, ψ μεταβλητές. Ακόμη, ελέγχθηκε η στατιστική σημαντικότητα των συντελεστών r, κατά περίπτωση, με βάση την αντίστοιχη διατύπωση: t = r n r Επιπρόσθετα, υπολογίσθηκαν οι συντελεστές μεταβλητότητας (correlation coefficients) και ελέγχθηκε η στατιστική σημαντικότητα των συντελεστών r κατά περίπτωση, τόσο για τους μάρτυρες, όσο και για τα περιστατικά. Η στατιστική επεξεργασία των παραμετρικών δεδομένων έγινε με τη δοκιμασία t-test μεταξύ δύο ομάδων και την ανάλυση διακύμανσης (ANOVA-Analysis of Variance). Η επεξεργασία των μη παραμετρικών δεδομένων πραγματοποιήθηκε με την κατά Friedman ανάλυση διακύμανσης σε συνδυασμό με τις δοκιμασίες signed rank Wilcoxon και Kruskal Wallis. Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων έγινε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Mann Whitney U. Όπου βρέθηκε στατιστικώς σημαντική διαφορά έγινε πολλαπλή σύγκριση με Neuman Keulls και Dunett post hoc analysis. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως Μέσος όρος±τυπικό Σφάλμα, ως σχετικές τιμές σε σύγκριση με τις τιμές στην αρχή του πειράματος (baseline). 150

151 Β. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Β.1. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε κυτταρικές καλλιέργειες Τα πειράματα που αναφέρονται παρακάτω πραγματοποιήθηκαν αρχικά σε πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών μυών, οι οποίες αναπτύχθηκαν στο εργαστήριο. Στις καλλιέργειες αυτές έγινε αρχικά ο έλεγχος λειτουργίας του πειραματικού μοντέλου επούλωσης τραύματος που θα χρησιμοποιούσαμε στη μελέτη της διδακτορικής αυτής διατριβής. Μετά την επιβεβαίωση της ορθότητας της επιλογής του μοντέλου μελέτης προχωρήσαμε στη χρησιμοποίηση ανθρώπινης σειράς δερματικών ινοβλαστών (142BR) του εμπορίου, μία σειρά τροποποιημένη γενετικά. Και στα πειράματα αυτά αποδείχθηκε η σωστή λειτουργία του μοντέλου μελέτης. Το γεγονός αυτό επέτρεψε την απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενούς σειράς ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών. Τα αποτελέσματα των τελευταίων πειραμάτων παραθέτονται και αναλύονται παρακάτω. Β.1.1. Χαρακτηρισμός καλλιεργειών ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Οι καλλιέργειες των ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών απομονώθηκαν από την ακροποσθία τεσσάρων παιδιών ηλικίας 4, 5, 6 και 9,5 ετών τα οποία υπεβλήθησαν σε επέμβαση φίμωσης. Μετά από μία ακολουθία 2-3 ανακαλλιεργειών μέχρι τη σειρά 6, όλα τα κύτταρα παρουσίασαν τυπική ατρακτοειδή μορφολογία κάτω από το οπτικό μικροσκόπιο. Η ανοσοϊστοχημική χρώση έδειξε ότι τα κύτταρα βάφονταν θετικά για ινονεκτίνη και λαμινίνη. (Εικ.39 Α&Β), ενώ δεν υπήρχε χρώση για τον παράγοντα Von Willebrand, (Εικ.39Γ), για την ακτίνη λείων μυϊκών κυττάρων, την κερατίνη ή τον Παράγοντα VIII (δεν παρατείθονται αποτελέσματα), αποδεικνύοντας ότι σε καμία από τις χρησιμοποιούμενες καλλιέργειες ινοβλαστών δεν υπήρχε ανάμειξη με άλλα κύτταρα, όπως για παράδειγμα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα ή ενδοθηλιακά κύτταρα. 151

152 (Α) (Β) (Γ) Εικόνα 39: Ανοσοϊστοχημικός χαρακτηρισμός ανθρώπινων πρωτογενών ινοβλαστών χρησιμο-ποιώντας μονοκλωνικά αντισώματα για (Α) ινονεκτίνη, (Β) λαμινίνη και (Γ) παράγοντα von Willebrand. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε αντικειμενοφόρους πλάκες (Lab-Tek) και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Οι πλάκες επωάστηκαν με τα ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα και στη συνέχεια με φθορίζον αντίσωμα έναντι ανοσοσφαιρίνης (ΙgG) κονίκλου ή επίμυος. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ειδικό μικροσκόπιο για ανοσοφθορισμό εφοδιασμένο με ειδικά φίλτρα (560 nm; Axiophot, Carl Zeiss Inc., Oberkochem, Germany). Β.1.2. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πρωτογενείς καλλιέργειες ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ποσοστό συρροής 80% μέσα σε ειδικά τριβλία με 24 θήκες-«πηγαδάκια», όπως αναφέρθηκε στο ειδικό μέρος. Με τη βοήθεια α- ποστειρωμένου ρύγχους δημιουργήθηκε μία απόξεση «scratch» του κυτταρικού στρώματος ομοιόμορφου μεγέθους και κατά μήκος της διαμέτρου του τριβλίου, ό- πως φαίνεται στην Εικόνα 40. Εικόνα 40: Τριβλίο 24 θέσεων. Αποστειρωμένα ρύγχη διαφόρων μεγεθών (μπλε και κίτρινο). Το τραύμα στο κυτταρικό στρώμα προκλήθηκε κατά μήκος της διαμέτρου του τριβλίου και μαρκάρεται για να διευκολύνεται η ανεύρεσή του κάτω από το μικροσκόπιο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 72 ώρες. Καθορισμένα πεδία της περιοχής του τραύματος φωτογραφήθηκαν στο μικροσκόπιο τις χρονικές στιγμές 0, 4, 12, 24, 48 και 72 ώρες μετά τη δημιουργία του τραύματος. (Εικ.41) 152

153 0 ώρες Επούλωση 0% 12 ώρες Επούλωση 15% 24 ώρες Επούλωση 23% 36 ώρες Επούλωση 40% 72 ώρες Επούλωση 60% Εικόνα 41: Επούλωση τραύματος στο τριβλίο χωρίς την επίδραση ουσίας- τριβλίο μάρτυρας 100 Επούλωση τραύματος (%) Χρόνος επώασης Σχήμα 1: Σύγκλειση του τραύματος ( x % του αρχικού) στο πειραματικό μοντέλο επούλωσης με τη χρήση κυτταρικών καλλιεργειών Διαπιστώθηκε χρονοεξαρτώμενη σύγκλειση του «τραύματος» από 4 έως 72 ώρες, όπου η σύγκλειση έφτασε στο 60%. Η πειραματική διαδικασία τερματίστηκε στις 72 ώρες διότι από τη χρονική αυτή στιγμή και μετέπειτα έπρεπε να γίνει αλλαγή του επωαστικού μέσου των κυττάρων, κάτι που θα προκαλούσε διαταραχή στο πειραματικό μοντέλο της επούλωσης. (Σχήμα 1) 153

154 Β.1.3. Επίδραση μορίων του εξωκυττάριου χώρου στη σύγκλιση του τραύματος Είναι γνωστό από τη διεθνή βιβλιογραφία ότι οι γλυκοζαμινογλυκάνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην επούλωση του τραύματος. Για τον λόγο αυτό δοκιμάσαμε την επίδραση των γλυκοζαμινογλυκανών, θειϊκή δερματάνη, θειϊκή χονδροϊτίνη, θειϊκή ηπαράνη και υαλουρονικού οξέος στο πειραματικό μοντέλο επούλωσης, χρησιμοποιώντας πρωτογενείς καλλιέργειες δερματικών ινοβλαστών. Εικόνα 42: Χαρακτηριστική απεικόνιση της συσσώρευσης του ΜΤΤ στα μιτοχόνδρια ζώντων κυττάρων. Προηγήθηκε έλεγχος της τοξικότητας των γλυκοζαμινογλυκανών σε συγκεντρώσεις 1μg/ml έως 50μg/ml με τη μέθοδο ΜΤΤ, όπως περιγράφηκε στο Ειδικό Μέρος, μετρώντας τη βιωσιμότητα των κυττάρων μετά από 48 ώρες επώασης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 43 και στο Σχήμα 2 καμία από τις γλυκοζαμινογλυκάνες που δοκιμάστηκαν δεν ήταν τοξική ακόμα και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση των 50μg/ml. Παρ όλα αυτά χρησιμοποιήθηκε στο πειραματικό μας μοντέλο η συγκέντρωση του 1μg/ml, για τον λόγο ότι η συγκέντρωση αυτή βρίσκεται πιο κοντά στα φυσιολογικά επίπεδα των γλυκοζαμινογλυκανών στο τραύμα. Βιωσιμότητα κυττάρων 1,0 0,8 OD (570 nm) 0,6 0,4 0,2 0,0 Μάρτυρας Υαλουρονικό οξύ Θειϊκή Δερματάνη Θειϊκή Χονδροϊτίνη Θειϊκή ηπαράνη Σχήμα 2: Γραμμική απεικόνιση της οπτικής απορρόφησης ύστερα από διαλυτοποίηση του ΜΤΤ. Απεικονίζεται η επίδραση γλυκοζαμινογλυκανών σε συγκέντρωση 50 μg/ml 154

155 Εικόνα 43: Υαλουρονικό Οξύ Ποσοστό Επούλωσης Τραύματος (%) 0 ώρες 0% 12 ώρες 40% 24 ώρες 70% 48 ώρες 90% Όσον αφορά την επίδραση του υαλουρονικού οξέος στην επούλωση του τραύματος, διαπιστώθηκε ότι αυτή η γλυκοζαμινογλυκάνη προκαλεί σημαντική επαγωγή της επούλωσης του τραύματος σε ποσοστό 40%, 70% και 90 % αντίστοιχα για 12, 24 και 48 ώρες σε σχέση με τον μάρτυρα (15%, 23%, και 40% αντίστοιχα για 12, 24 και 48 ώρες) (Εικ.43) 155

156 Εικόνα 44: Θειϊκή δερματάνη Ποσοστό Επούλωσης Τραύματος (%) 0 ώρες 0% 12 ώρες 35% 24ώρες 50% 48 ώρες 70% Όπως φαίνεται στην Εικόνα 44 η θειϊκή δερματάνη επάγει την επούλωση του τραύματος σε ποσοστά 35%, 50%, 70% αντίστοιχα για 12, 24 και 48 ώρες, ποσοστά διπλάσια από αυτά που παρατηρούνται απουσία θειϊκής δερματάνης (μάρτυρας). 156

157 Εικόνα 45: Θειϊκή χονδροϊτίνη Ποσοστό Επούλωσης Τραύματος (%) 0 ώρες 0% 12 ώρες 20% 24 ώρες 30% 48 ώρες 50% Η θειϊκή χονδροϊτίνη προκάλεσε σύγκλειση του τραύματος κατά 20%, 30% και 50% αντίστοιχα για 12, 24 και 48 ώρες. (Εικ.45) Η παρουσία της θεϊκής χονδροϊτίνης δεν φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά τη σύγκλειση του τραύματος. 157

158 Εικόνα 46: Θειϊκή Ηπαράνη Ποσοστό Επούλωσης Τραύματος (%) 0 ώρες 0% 12 ώρες 18% 24 ώρες 25% 48ώρες 42% Ανάλογα αποτελέσματα με τη θειϊκή χονδροϊτίνη διαπιστώθηκαν και με τη θεϊκή ηπαράνη, η οποία προκάλεσε σύγκλειση του τραύματος κατά 18%, 25% και 42% αντίστοιχα σε 12, 24 και 48 ώρες. (Εικ.46) 158

159 Συμπερασματικά φαίνεται πως το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη επάγουν σε σημαντικό ποσοστό (90% και 70% αντίστοιχα) την επούλωση του τραύματος σε σχέση με τον μάρτυρα (40%) Αντίθετα η θειϊκή χονδροϊτίνη και θειϊκή ηπαράνη δεν φαίνεται να επηρεάζουν σημαντικά τη σύγκλειση του τραύματος. (Σχήμα 3) 100 Επούλωση τραύματος (%) Χρόνος Επώασης Υαλουρονικό Οξύ Θειϊκή Δερματάνη Θεϊκή Χονδροϊτίνη Θειϊκή Ηπαράνη Μάρτυρας Σχήμα 3: Ποσοτικοποίηση της επούλωσης του τραύματος Β.1.4. Μελέτη της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στη ζελατινολυτική δραστηριότητα πρωτογενών καλλιεργειών ανθρώπινων ινοβλαστών Στη συνέχεια, προκειμένου να μελετήσουμε με πιο μηχανισμό το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη προκαλούν επαγωγή στη σύγκλειση του τραύματος, μελετήσαμε την επίδρασή τους στη ζελατινολυτική δραστηριότητα των ινοβλαστών. Για τον λόγο αυτό τα κύτταρα επωάστηκαν με ποσότητα γλυκοζαμινογλυκανών ίση με 1μg/ml για 24ώρες και 48 ώρες και μετρήθηκε η ζελατινολυτική δραστηριότητα σε δείγματα από το μέσο επώασης με ζυμογραφία ζελατίνης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α,Β οι ινοβλάστες εκκρίνουν κατά κύριο λόγο ΜΜΡ-2, με τη μορφή προενζύμου. Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων με ειδικό πρόγραμμα ανάλυσης της εικόνας έδειξε ότι το υαλουρονικό οξύ επάγει σημαντικά την έκκριση ζελατινολυτικής δραστηριότητας από τους ινοβλάστες περίπου 3 φορές περισσότερο σε 48 ώρες. (Σχήμα 5) Η θειϊκή δερματάνη επάγει επίσης σε μικρότερο όμως ποσοστό από το υαλουρονικό οξύ την έκκριση ζελατινολυτικής δραστηριότητας από τους ινοβλάστες. 159

160 0h 24h 48h Α) prommp kda Β) prommp kda Σχήμα 4 Α,Β: Αντιπροσωπευτική ανάλυση με ζυμογραφία ζελατίνης δειγμάτων από το μέσο επώασης ανθρώπινων ινοβλαστών που περιείχε το ίδιο ποσό πρωτεϊνών (3μg). Τα κύτταρα επωάστηκαν παρουσία υαλουρονικού οξέος 1μg/ml (Α) και θειϊκής δερματάνης 1μg/ml (Β) για 24 και για 48 ώρες. Τα βέλη στα αριστερά υποδεικνύουν τη θέση μετατόπισης καθαρής ανθρώπινης pro-mmp-2 (66.2kDa). Υαλουρονικό Οξύ Θειϊκή Δερματάνη Έκκριση MMP-2 (Αυθαίρετες μονάδες) Ώρες επούλωσης τραύματος Σχήμα 5: Ποσοτικοποίηση της ζελατινολυτικής δραστηριότητας χρησιμοποιώντας ειδικό πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας (1D Image Analysis Software, version 3.0 of Kodak Digital Science, Eastman Kodak, Rochester, NY). Β.1.5. Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στην έκκριση ενζυμικής δραστηριότητας από ινοβλάστες κατά τη διάρκεια της επούλωσης Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση των γλυκοζαμινογλυκανών στην έκκριση ενζυμικής δραστηριότητας από ινοβλάστες κατά τη διάρκεια της επούλωσης. Για τον σκοπό αυτό, στο πειραματικό μοντέλο της επούλωσης, μετά την πρόκληση του 160

161 τραύματος, τα κύτταρα επωάστηκαν παρουσία 1μg/ml υαλουρονικού οξέος, θειϊκής δερματάνης, θειϊκής χονδροϊτίνης και θειϊκής ηπαράνης. Η ενζυμική δραστηριότητα μετρήθηκε σε ποσότητα υπερκείμενου επωαστικού υλικού που περιείχε την ίδια ποσότητα πρωτεΐνης (3μg). Σχήμα 6Α: Μάρτυρας ΗΑ DS ChS ΗS NS S NS S NS S NS S NS S MMP-2 24ώρες MMP-2 48ώρες HA: Υαλουρονικό οξύ DS: Θειϊκή δερματάνη ChS: Θειϊκή χονδροϊτίνη HS: Θειϊκή ηπαράνη ΝS: No Scratch (Χωρίς τραύμα) S: Scratch (Με τραύμα) Σχήμα 6Β: 45 Χωρίς Τραύμα ΜΜΡ-2 (pg/μg πρωτεΐνης) Με Τραύμα 0 Μάρτυρας Υαλουρονικό οξύ Θειϊκή Δερματάνη Θειϊκή Χονδροϊτίνη Θειϊκή ηπαράνη Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, οι ινοβλάστες παρουσία και απουσία τραύματος εκκρίνουν ΜΜΡ-2, με τη μορφή προενζύμου (66.2κDa). Ποσοτικοποίηση των ζωνών λύσης έδειξε ότι το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη προκαλούν σημαντική αύξηση της ενζυμικής δραστηριότητας μετά από 24 και 48 ώρες επώασης, με την επίδραση του υαλουρονικού οξέος να υπερέχει της θειϊκής δερματάνης. Α- ντίθετα, η θειϊκή χονδροϊτίνη και η θειϊκή ηπαράνη δεν επηρεάζουν την έκκριση της 161

162 ΜΜΡ-2. (Σχήμα 6Β) Τα ίδια αποτελέσματα ελήφθησαν παρουσία και απουσία τραύματος για όλες τις γλυκοζαμινογλυκάνες που δοκιμάστηκαν. Β.1.6. Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στα πρωτεϊνικά επίπεδα της ΜΜΡ-2 Ακολουθώντας το ίδιο πρωτόκολλο όπως παραπάνω, μελετήσαμε την επίδραση των γλυκοζαμινογλυκανών στην πρωτεϊνική έκκριση της ΜΜΡ-2 με ELISA, μετά από 48 ώρες επώασης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη επάγουν σημαντικά την πρωτεϊνική έκκριση ΜΜΡ-2 ενώ η θειϊκή χονδροϊτίνη και η θειϊκή ηπαράνη δεν την επηρεάζουν. Και σε αυτή την περίπτωση, η επαγωγή που προκαλεί το υαλουρονικό οξύ είναι μεγαλύτερη από αυτή που προκαλεί η θειική χονδροϊτίνη, ενώ δεν υπήρχε διαφορά στα αποτελέσματα παρουσία τραύματος (Σχήμα 7) Σχήμα 7: 45 Χωρίς Τραύμα ΜΜΡ-2 (pg/μg πρωτεΐνης) Με Τραύμα 0 Μάρτυρας Υαλουρονικό οξύ Θειϊκή Δερματάνη Θειϊκή Χονδροϊτίνη Θειϊκή ηπαράνη Β.1.7. Μέτρηση της επίδρασης των γλυκοζαμινογλυκανών στη γονιδιακή έκφραση της ΜΜΡ-2 και του ΤΙΜΡ-1 Στη συνέχεια, μελετήσαμε την επίδραση των γλυκοζαμινογλυκανών στη γονιδιακή έκφραση της ΜΜΡ-2 με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς πριμοδότες. Οι ανθρώπινοι ινοβλάστες εκφράζουν το γονίδιο της ΜΜΡ-2 (Σχήμα 8Α). Ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων έδειξε πως το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη ε- πάγουν σημαντικά τη γονιδιακή έκφραση της ΜΜΡ-2 παρουσία και απουσία τραύματος, ενώ η θειϊκή χονδροϊτίνη και η θειϊκή ηπαράνη δεν την επηρεάζουν. Και σε 162

163 αυτή την περίπτωση, η επαγωγή που προκαλεί το υαλουρονικό οξύ είναι μεγαλύτερη από αυτή που προκαλεί η θειϊκή χονδροϊτίνη, ενώ δεν υπήρχε διαφορά στα αποτελέσματα παρουσία και απουσία τραύματος. (Σχήμα 8Β) Σχήμα 8Α: Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC ΗS MMP-2 MMP-2 NS S NS S NS S NS S NS S 24 hours 48 hours β-ακτίνη Σχήμα 8Β: HA: Υαλουρονικό οξύ DS: Θειϊκή δερματάνη ChS: Θειϊκή χονδροϊτίνη HS: Θειϊκή ηπαράνη ΝS: No Scratch (Χωρίς τραύμα) S: Scratch (Με τραύμα) 1,8 1,6 1,4 24 ώρες 48 ώρες Χωρίς Τραύμα Με Τραύμα Τυχαίες μονάδες 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC HS Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC HS 163

164 Ακολούθως, μελετήσαμε τη γονιδιακή έκφραση του ΤΙΜΡ-1, ο οποίος εκφράζεται στους ινοβλάστες.(σχήμα 9Α) Καμία από τις γλυκοζαμινογλυκάνες που μελετήθηκαν δεν προκάλεσε μεταβολή στην έκφραση του ΤΙΜΡ-1 παρουσία ή απουσία τραύματος.(σχήμα 9Β) Σχήμα 9Α: Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC ΗS NS S NS S NS S NS S NS S ΤΙΜΡ-1 24 hours ΤΙΜP-1 48 hours β-ακτίνη Σχήμα 9Β: HA: Υαλουρονικό οξύ DS: Θειϊκή δερματάνη ChS: Θειϊκή χονδροϊτίνη HS: Θειϊκή ηπαράνη ΝS: No Scratch (Χωρίς τραύμα) S: Scratch (Με τραύμα) 2,5 2,0 24 ώρες 48 ώρες Χωρίς Τραύμα Με Τραύμα Με Τραύμα Τυχαίες μονάδες 1,5 1,0 0,5 0,0 Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC HS Μάρτυρας ΗΑ DS ChSC HS 164

165 Β.2. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος με τη χρήση πλεγμάτων σε κυτταρικές καλλιέργειες Για τη μελέτη της επίδρασης πλεγμάτων porous scaffolds στην επούλωση, χρησιμοποιήθηκε το ίδιο πειραματικό μοντέλο, με τους δερματικούς ανθρώπινους ινοβλάστες. Τα κύτταρα επωάστηκαν παρουσία δύο διαφορετικών πλεγμάτων, χιτίνης και PHB, για 7 ημέρες. Η εισχώρηση κυττάρων και εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας στα πλέγματα μελετήθηκε με SEM (ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως) 1, 2, 3, 5 και 7 ημέρες μετά την επώαση. Διαπιστώθηκε ότι στο πλέγμα χιτίνης, λόγω της πυκνής δομής του, δεν κατέστη δυνατή η εισχώρηση αρκετών ινοβλαστών, με έντονη εκκριτική λειτουργία, μέχρι την 7 η ημέρα που εξετάστηκε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σαρώσεως. Παρ όλα αυτά φαίνεται να εισχωρεί μικρή ποσότητα εξωκυττάριας ουσίας μεταξύ των συστατικών της δομής του. (Εικ.47,48,49,50,51) Εικόνα 47: Πλέγμα χιτίνης 24 ώρες μετά την καλλιέργεια, που φαίνεται ότι δεν έχουν εισχωρήσει καθόλου ινοβλάστες (SEM). 165

166 Εικόνα 48: Πλέγμα χιτίνης 48 ώρες μετά την καλλιέργεια, όπου φαίνονται κάποια κυτταρικά υπολείμματα (βέλη) (SEM). Εικόνα 49; Πλέγμα χιτίνης την 3 η ημέρα μετά την καλλιέργεια, όπου φαίνεται μερική σύνθεση εξωκυττάριας ουσίας (βέλος) (SEM). 166

167 Εικόνα 50: Πλέγμα χιτίνης την 5 η ημέρα μετά την καλλιέργεια, όπου φαίνεται η αδυναμία των ινοβλαστών να εισχωρήσουν στο πλέγμα λόγω της σύστασής του (SEM). Εικόνα 51: Πλέγμα χιτίνης την 7 η ημέρα μετά την καλλιέργεια, όπου φαίνονται κυτταρικά υπολείμματα και θάνατος ινοβλαστών (βέλος) (SEM). 167

168 Αντίθετα με το πλέγμα χιτίνης, στο πλέγμα PHB (Polyhydroxy butyrate), διαπιστώθηκε η εισχώρηση αρκετών κυττάρων με εκτεταμένες αποφυάδες και άφθονη μεσοκυττάρια ουσία από την πρώτη ημέρα της καλλιέργειας. (Εικ.52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61) Εικόνα 52: Πλέγμα PHB 24 ώρες μετά την καλλιέργεια, όπου έχουν αρχίσει να εισχωρούν ινοβλάστες (βέλη) (SEM). Εικόνα 53: Πλέγμα PHB 24 ώρες μετά την καλλιέργεια, όπου έχουν αρχίσει να εισχωρούν ινοβλάστες (βέλη) (SEM). Μεγαλύτερη μεγέθυνση της προηγούμενης εικόνας. 168

169 Εικόνα 54: Πλέγμα PHB 48 ώρες μετά την καλλιέργεια. Ινοβλάστες σε μεγάλη μεγέθυνση (βέλος) (SEM). Εικόνα 55: Πλέγμα PHB την 3 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας (βέλος) (SEM). 169

170 Εικόνα 56: Πλέγμα PHB την 5 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας ουσίας (SEM). Εικόνα 57: Πλέγμα PHB την 5 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας ουσίας. Ινοβλάστες (βέλος) (SEM). 170

171 Εικόνα 58: Πλέγμα PHB την 7 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας ουσίας (βέλος) (SEM). Εικόνα 59: Πλέγμα PHB την 7 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση ινοβλαστών (SEM). 171

172 Εικόνα 60: Πλέγμα PHB την 7 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας ουσίας (βέλος) (SEM). Εικόνα 61: Πλέγμα PHB την 7 η ημέρα μετά την καλλιέργεια. Αύξηση της παραγωγής της εξωκυττάριας ουσίας (SEM). Συμπερασματικά, φαίνεται πως το πλέγμα χιτίνης λόγω της πυκνής δομής του, δεν ευνοεί την εισχώρηση κυττάρων και την επακόλουθη εναπόθεση εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας σε αυτό, γεγονός που το καθιστά ακατάλληλο για την κλινική του εφαρμογή. Αντίθετα το πλέγμα PHB φαίνεται πως παρέχει της απαραίτητες 172

173 προϋποθέσεις για την εισχώρηση, πολλαπλασιασμό και ανάπτυξη των ινοβλαστών, καθώς και την παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας από τα κύτταρα αυτά. Για τον λόγο αυτό το πλέγμα PHB αποτελεί ελκυστικό στόχο θεραπευτικής εφαρμογής στην κλινική πράξη. Β.3. Πειραματικό μοντέλο επούλωσης τραύματος σε πειραματόζωα Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στο πειραματικό μοντέλο επούλωσης των κυτταρικών καλλιεργειών προκύπτει πως οι γλυκοζαμινογλυκάνες και ιδιαίτερα το υαλουρονικό οξύ και η θειϊκή δερματάνη, αλλά και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της επούλωσης. Για τον λόγο αυτό διερευνήσαμε την έκφραση αυτών των μορίων σε πειραματικό μοντέλο επούλωσης in vivo. Χρησιμοποιήσαμε 32 μυς καθαρής φυλής Balb/c. Στη ράχη των πειραματοζώων προκλήθηκαν τομές τραύματα και μελετήθηκε η επούλωση των τραυμάτων αυτών μετά από 1, 2, 5, 7, 10, 14 και 21 ημέρες, απουσία και παρουσία πλεγμάτων χιτίνης και PHB με τους εξής τρόπους: 1) μακροσκοπικά 2) ιστολογικά (οπτικό και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο) και 3) σε μοριακό επίπεδο, μελετώντας την έκφραση μορίων του εξωκυττάριου χώρου και των γονιδίων που τα εκφράζουν Β.3.1. Μακροσκοπική εκτίμηση της επούλωσης τραύματος Καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος δεν υπήρξε θάνατος πειραματοζώου ή οποιαδήποτε επιπλοκή όπως, επιμόλυνση ή διάσπαση του τραύματος. Μακροσκοπικά διαπιστώθηκε ότι η έναρξη της επούλωσης άρχισε μετά την 1 η ημέρα μετατραυματικά. Η επούλωση ολοκληρώθηκε μέχρι την 7 η ημέρα και η παρατήρηση συνεχίσθηκε μέχρι και την 21 η ημέρα. Τοποθετώντας τα πλέγματα της χιτίνης και του PHB, αριστερά και δεξιά α- ντίστοιχα της μέσης γραμμής της ράχης των πειραματοζώων, δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά στη χρονική περίοδο που απαιτήθηκε για την επούλωση των τραυμάτων. Την 1 η και 2 η ημέρα μακροσκοπικά, δεν εμφανίσθηκε καμία διαφορά σε σχέση με την έναρξη της διαδικασίας του πειράματος. (Εικ.62,63)Την 3 η ημέρα γίνεται εμφανής η επούλωση με τη συμπλησίαση των χειλέων του τραύματος (Εικ.64),που ήταν πλέον αισθητή την 5 η ημέρα, όπως επίσης και η τριχοφυΐα στη ράχη των πειραματοζώων. (Εικ.65) Την 7 η ημέρα η συνέχεια του τραύματος είχε πλήρως αποκατασταθεί και τα περισσότερα ράμματα είχαν αποπέσει.(εικ.66) Στη 10 η ημέρα είχε αποπέσει το σύνολο των ραμμάτων και η τριχοφυΐα ήταν αυξημένη. (Εικ.67) 173

174 Τη 14 η (Εικ.68) όπως και την 21 η ημέρα, η αποκατάσταση ήταν πλήρης και η ανεύρεση του τραύματος δύσκολη, λόγω της αύξησης της τριχοφυΐας των πειραματοζώων. (Εικ.69 ) Εικόνα 62: Ημέρα 1 η Παρατηρούνται τρεις τομές -τραύματα- δεξιά, αριστερά και πίσω, στη ράχη του πειραματοζώου. Κάθε τομή έχει συρραφεί με δύο ράμματα. Εικόνα 63: Ημέρα 2 η. Παρουσία ραμμάτων στα σημεία των τομών. 174

175 Εικόνα 64: Ημέρα 3 η. Καμία μακροσκοπική διαφορά στα σημεία των τομών από τη 2 η ημέρα. Εικόνα 65: Ημέρα 5 η. Εμφανής η έναρξη της τριχοφυΐας στη ράχη του πειραματοζώου. 175

176 Εικόνα 66: Ημέρα 7 η. Εμφανής η επούλωση των τραυμάτων στη ράχη του πειραματοζώου και στις τρεις τομές. Εικόνα 67: Ημέρα 10 η. Επούλωση των τραυμάτων και απόπτωση των ραμμάτων της αριστεράς τομής. 176

177 Εικόνα 68: Ημέρα 14 η. Επούλωση όλων των τομών. Παραμονή ενός ράμματος σε μία τομή. Εικόνα 69: Ημέρα 21 η. Απόπτωση των ραμμάτων και πλήρης επούλωση των τραυμάτων. 177

178 Β.3.2. Ιστολογική εκτίμηση της επούλωσης τραύματος Κατά τη μελέτη των ιστοτεμαχίων του δέρματος τόσο στο οπτικό όσο και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διαπιστώθηκε ότι το πλέγμα της χιτίνης που τοποθετήθηκε στην τομή Α των πειραματοζώων δεν απορροφήθηκε ούτε αφομοιώθηκε με τους γειτονικούς ιστούς. Το πλέγμα χιτίνης βρέθηκε να παραμένει αυτούσιο, στη θέση όπου τοποθετήθηκε όταν ελήφθησαν τα ιστοτεμάχια από τη ράχη των πειραματοζώων, ακόμα και την 21 η ημέρα. Παρόλα αυτά τα ιστοτεμάχια δέρματος της τομής Α μελετήθηκαν μικροσκοπικά και υπερμικροσκοπικά και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα του μάρτυρα (περιοχή τραύματος χωρίς πλέγμα). Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι δεν υπάρχει καμία ιστολογική διαφορά τόσο στο οπτικό όσο και στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Για τον λόγο αυτό το πλέγμα της χιτίνης που χρησιμοποιήθηκε με την παρούσα δομή του, δεν φαίνεται να επηρεάζει την επούλωση του τραύματος. Τα παρακάτω ευρήματα λοιπόν αφορούν μόνο τα ιστοτεμάχια του δέρματος, τα οποία ε- λήφθησαν από την τομή Β, στην οποία είχε τοποθετηθεί το πλέγμα PHB. Β Οπτικό μικροσκόπιο Την 1 η ημέρα παρατηρείται πλησίον της τομής φλεγμονώδης αντίδραση με θρομβωμένα αγγεία, (Εικ.70,71) καταστροφή του επιθηλίου στο σημείο της τομής, καθώς και λύση της συνεχείας του δέρματος με εμφανή την παρουσία ραμμάτων στο συγκεκριμένο σημείο. (Εικ.72,73) Την 2 η ημέρα παραμένει η φλεγμονώδης αντίδραση στο σημείο της τομής. (Εικ.74) Την 3 η ημέρα παρατηρήθηκε παραγωγή εξωκυττάριας ουσίας η οποία αρχίζει να καλύπτει το χάσμα του χορίου του τραυματισμένου δέρματος. (Εικ.75) Το πλέγμα ΡΗΒ αρχίζει να ενσωματώνεται στο χόριο και να εισχωρούν σ αυτό κύτταρα, κυρίως ινοβλάστες και κολλαγόνα ινίδια, (Εικ.76,77,79,79) ενώ εμφανής είναι και η αναγέννηση του επιθηλίου. (Εικ.80) Την 5 η ημέρα συνεχίζεται η ανάπλαση του επιθηλίου και του χορίου με τη σταδιακή εμφάνιση τριχών και αδένων. (Εικ.81) Το πλέγμα παρουσιάζει μεγαλύτερη κυτταροβρίθεια και αύξηση των κολλαγόνων ινών που στην περιφέρεια αρχίζουν να δημιουργούν δεσμίδες, (Εικ.82) ενώ τα μεσοδιαστήματά του πληρεί εξωκυττάρια ουσία. (Εικ.83) Την 7 η ημέρα εμφανής είναι η ανάπλαση του επιθηλίου και η παραγωγή της εξωκυττάριας ουσίας του χορίου που έχει καλύψει πλήρως το κενό του τραύματος (επούλωση). (Εικ.84) Το πλέγμα έχει ενσωματωθεί εξ ολοκλήρου με τους ινοβλάστες και τις κολλαγόνες ίνες να καλύπτουν τα διάκενα αυτού. (Εικ.85, 86) 178

179 Την 10 η ημέρα παρατηρείται κυρίως ανακατασκευή του παραγόμενου χορίου που είναι πυκνός ακανόνιστος συνδετικός ιστός. (Εικ.87) Οι δεσμίδες των κολλαγόνων ινών με τη θεμέλια ουσία καλύπτουν όλο το πλέγμα του οποίου η δομή έχει απορροφηθεί. (Εικ.88) Τη 14 η ημέρα το αναγεννηθέν δέρμα φέρει τρίχες και αδένες σε όλη την έ- κταση του χορίου και τον υποκείμενο υποδόριο ιστό. (Εικ.89) Η θέση του πλέγματος έχει καταληφθεί από το νεοσχηματισθέν χόριο του οποίου οι δεσμίδες των κολλαγόνων ινών εμφανίζουν κανονική διάταξη. (Εικ.90) Την 21 η ημέρα η εικόνα του δέρματος είναι φυσιολογική. (Εικ.91 ) Εικόνα 70: Ημέρα 1 η. Φλεγμονώδης αντίδραση πλησίον της τομής (αστερίσκος) και διάσπαση του επιθηλίου (λευκό βέλος). Αναγνωρίζονται επίσης θρομβωμένα αγγεία (μαύρα βέλη) x160 Χρώση Ε&Α. 179

180 Εικόνα 71: Ημέρα 1 η. Ράμματα (λευκό βέλος) και καταστροφή του επιθηλίου στο σημείο της τομής (μαύρο βέλος) x160 Χρώση Ε&Α. Εικόνα 72: Ημέρα 1 η. Καταστροφή του επιθηλίου και λύση της συνεχείας του δέρματος (μαύρο βέλος), ράμματα (λευκό βέλος) x 64 Χρώση Mallory. 180

181 Εικόνα 73: Ημέρα 1 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της προηγούμενης εικόνας x 260 Χρώση Mallory. Εικόνα 74: Ημέρα 2 η. Παραμονή της φλεγμονώδους αντίδρασης στο σημείο της τομής (αστερίσκος) x 160 Χρώση Ε&Α. 181

182 Εικόνα 75: Ημέρα 2 η. Επικάλυψη του κενού του χορίου (βέλος). Φλεγμονώδης αντίδραση (αστερίσκος) x 400 Χρώση Mallory. Εικόνα 76: Ημέρα 3 η. Πλ. Ενσωμάτωση του πλέγματος στο χόριο. Κύτταρα και κολλαγόνα ινίδια στα μεσοδιαστήματά του (βέλη) Υι. Υποδόριος ιστός x 200 Χρώση Mallory. 182

183 Εικόνα 77: Ημέρα 3 η. Κύτταρα και κολλαγόνα ινίδια στα μεσοδιαστήματα του πλέγματος (βέλη) x 64 Χρώση Ε&Α. Εικόνα 78: Ημέρα 3 η. Μεγέθυνση του ένθετου της προηγούμενης εικόνας. Εμφάνιση κολλαγόνων ινιδίων (λευκό βέλος) και ινοβλαστών (μαύρο βέλος) στα διάκενα του πλέγματος, x 260 Χρώση Ε&Α. 183

184 Εικόνα 79: Ημέρα 3 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της Εικόνας 78. Ινοβλάστες (βέλη). κι. Κολλαγόνα ινίδια Πλ. Πλέγμα x 640 Χρώση Ε&Α. Εικόνα 80: Ημέρα 3 η. Αρχόμενη αναγέννηση του επιθηλίου (βέλος) x 64 Χρώση Ε&Α. 184

185 Εικόνα 81: Ημέρα 5 η. Ανάπλαση του δέρματος (βέλος). Παρουσία πλέγματος ΡΗΒ (αστερίσκος) x 64 Χρώση Mallory. Εικόνα 82: Ημέρα 5 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση του πλέγματος. Παρατηρείται αυξημένη κυτταροβρίθεια (βέλη) και παραγωγή κολλαγόνων ινών οι οποίες αρχίζουν να δημιουργούν δεσμίδες κολλαγόνων ινών (κι) x 640 Χρώση Mallory. 185

186 Εικόνα 83: Ημέρα 5 η. Περιοχή πλέγματος με αύξηση κυττάρων (βέλη) και κολλαγόνων ινιδίων (κι), ενώ τα μεσοδιαστήματα του πλέγματος φαίνονται να καλύπτονται από εξωκυττάρια ουσία (αστερίσκος) x 260 Χρώση Ε&Α. Εικόνα 84: Ημέρα 7 η. Εκτεταμένη ανάπλαση επιθηλίου (βέλος) και χορίου (αστερίσκος) x 64 Χρώση Ε&Α. 186

187 Εικόνα 85: Ημέρα 7 η. Πλήρης ενσωμάτωση του πλέγματος που καλύπτεται από δεσμίδες κολλαγόνων ινών και ινοβλάστες (βέλη) x 64 Χρώση Mallory. Εικόνα 86: Ημέρα 7 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της προηγούμενης εικόνας. Εμφανής η ακανόνιστη διάταξη των δεσμίδων των κολλαγόνων ινών (βέλη) x 260 Χρώση Mallory. 187

188 Εικόνα 87: Ημέρα 10 η. Συνεχιζόμενη ανάπλαση του επιθηλίου (βέλος). Ανακατασκευή του παραγόμενου χορίου (αστερίσκος) x 64 Χρώση Mallory. Εικόνα 88: Ημέρα 10 η. Πλήρης ενσωμάτωση του πλέγματος. Κολλαγόνες ίνες (βέλη) και θεμέλια ουσία (αστερίσκοι) καλύπτουν όλο το πλέγμα του οποίου η δομή έχει απορροφηθεί. x 240 Χρώση Mallory. 188

189 Εικόνα 89: Ημέρα 14 η. Εμφάνιση τριχών και αδένων στο αναγεννηθέν δέρμα (βέλη) x 260 Χρώση Ε&Α. Εικόνα 90: Ημέρα 14 η. Η θέση του πλέγματος έχει καταληφθεί από το νεοσχηματισθέν χόριο με κανονική διάταξη των δεσμίδων των κολλαγόνων ινών x 240 Χρώση Ε&Α. 189

190 Εικόνα 91: Ημέρα 21 η. Πλήρης αναγέννηση του δέρματος x 160 Χρώση Mallory. Β Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο 1 η ημέρα Η καταστροφή του επιθηλίου και η ιστική αντίδραση χαρακτηρίζουν την πρώτη ημέρα. Ειδικότερα, τα εναπομείναντα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζουν δεσμοσωμάτια και τονοϊνίδια. (Εικ.92) Στο χόριο οι κολλαγόνες ίνες διακόπτονται και ανάμεσά τους παρουσιάζονται μεγάλοι κενοτοπιώδεις χώροι (Εικ.93,94,95) εντός των οποίων παρατηρούνται μακροφάγα με έντονη φαγοκυτταρική ικανότητα, πολυμορφοπύρηνα και εωσινόφιλα κύτταρα. (Εικ.96,97,98,99) Καθώς αρχίζει η ιστική νέκρωση, αισθητή είναι η παρουσία της κυτταρικής λύσης (Εικ.100) και κυττάρων με νεκρωτικούς πυρήνες. (Εικ.101) Σε απόσταση από την τομή το επιθήλιο παρουσιάζει αύξηση των μεσοκυττάριων χώρων και διάσπαση του βασικού υμένα, ενώ στο χόριο παρακείμενα της τομής εμφανίζεται αποδιοργάνωση των κολλαγόνων ινιδίων. (Εικ.102,103,104,105) 190

191 Εικόνα 92: Ημέρα 1 η. Καταστροφή του επιθηλίου. Εναπομείναντα επιθηλιακά κύτταρα. Π. Πυρήνας. x Εικόνα 93: Ημέρα 1 η. Κενοτοπιώδεις χώροι του χορίου (βέλη), Π. Πυρήνας μακροφάγου, κ. κολλαγόνα ινίδια. x

192 Εικόνα 94: Ημέρα 1 η. Χόριο. Κενοτοπιώδεις χώροι (βέλη), Π. πυρήνας ινοβλάστου, κ. κολλαγόνα ινίδια, Τ. Ερυθρό αιμοσφαίριο σε τριχοειδές αγγείο. x Εικόνα 95: Ημέρα 1 η. Χόριο. Κολλαγόνα ινίδια (κ). Μεγάλοι αποδιοργανωμένοι χώροι (βέλη), Π. Πυρήνας. x

193 Εικόνα 96: Ημέρα 1 η. Χόριο. Στους κενοτοπιώδεις χώρους (βέλη) βρίσκουμε μακροφάγα (Μ) και πολυμορφοπύρηνα (π) x Εικόνα 97: Ημέρα 1 η. Χόριο. Μακροφάγα (Μ), Π. πυρήνας μακροφάγου x

194 Εικόνα 98: Ημέρα 1 η. Χόριο. Μ. Μακροφάγα, Π. πυρήνας μακροφάγου, κυ. Κυστίδια x Εικόνα 99: Ημέρα 1 η. Χόριο. Εωσινόφιλο κύτταρο x

195 Εικόνα 100: Ημέρα 1 η. Χόριο. Κυτταρική λύση (βέλος), κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 101: Ημέρα 1 η. Κύτταρα με πυκνωτικούς πυρήνες (βέλη) x

196 Εικόνα 102: Ημέρα 1 η. Επιθήλιο παρακείμενο της τομής. Αύξηση μεσοκυττάριων χώρων (βέλη), Π. πυρήνες επιθηλιακών κυττάρων x Εικόνα 103: Ημέρα 1 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της Εικόνας 102 x

197 Εικόνα 104: Ημέρα 1 η. Βασική στιβάδα επιθηλίου και χόριο παρακείμενο της τομής. Αποδιοργάνωση των κολλαγόνων ινιδίων (κ) Διάσπαση του βασικού υμένα (βέλη) Π. πυρήνας επιθηλιακού κυττάρου. x Εικόνα 105: Ημέρα 1 η. Βασική στιβάδα επιθηλίου και χόριο παρακείμενο της τομής. Αποδιοργάνωση των κολλαγόνων ινιδίων. Διάσπαση του βασικού υμένα (βέλος) x

198 2 η ημέρα Η λύση του επιθηλίου πλησίον της τομής εμφανίζει επιθηλιακά κύτταρα με καταστροφή ή παραμονή λίγων δεσμοσωματίων, παρουσία λιποσταγονιδίων σε αυτά, μελανινοκύτταρα καθώς και μεγάλους μεσοκυττάριους χώρους ανάμεσά τους. (Εικ. 106,107,108) Το χόριο εμφανίζει αποδιοργάνωση των στοιχείων του, με αποδόμηση των δεσμίδων κολλαγόνων ινιδίων, (Εικ.109) ύπαρξη μεγάλων κενοτοπιωδών χώρων, ενώ το ελαφρά διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο χαρακτηρίζει τους ινοβλάστες που βρίσκονται στην περιοχή και δεν έχουν καταστραφεί. (Εικ.110) Μεταξύ των κυτταρικών θραυσμάτων έντονη φαίνεται η παρουσία διαφόρων κυττάρων, όπως μακροφάγων, μονοπύρηνων (στοιχείο φαγοκυττάρωσης λόγω της φλεγμονής) και πολυμορφοπύρηνων. (Εικ.111,112) Σε βαθύτερα στρώματα του χορίου, προς τον μυϊκό χιτώνα, παρατηρείται εκτεταμένη καταστροφή των δεσμίδων των κολλαγόνων ινών και κύτταρα με νεκρωτικούς πυρήνες μεταξύ αυτών. (Εικ.113,114) Χαρακτηριστικής μορφολογίας κατεστραμμένα κύτταρα με κατακερματισμό των πυρήνων τους εμφανίζονται ανάμεσα στις ακανόνιστα φερόμενες κολλαγόνες ίνες. (Εικ.115) Εικόνα 106: Ημέρα 2 η. Λύση του επιθηλίου (αστερίσκοι), καταστροφή των δεσμοσωματίων (βέλη). Π. πυρήνες επιθηλιακών κυττάρων x

199 Εικόνα 107: Ημέρα 2 η. Καταστροφή του επιθηλίου με παραμονή λίγων δεσμοσωματίων (βέλη), Λ. λεμφοκύτταρο μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων x Εικόνα 108: Ημέρα 2 η. Καταστροφή επιθηλίου. Π. Πυρήνας μελανινοκυττάρου, κοκκία μελανίνης (άσπρο βέλος), λι. Λιποσταγονίδια σε επιθηλιακά κύτταρα, κατεστραμμένο δεσμοσωμάτιο (μαύρο βέλος) x

200 Εικόνα 109: Ημέρα 2 η. Χόριο. Αποδόμηση των δεσμίδων των κολλαγόνων ινιδίων (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 110: Ημέρα 2 η. Χόριο παρακείμενης περιοχής της τομής. Κενοτοπιώδεις χώροι (αστερίσκοι), Μο. μονοπύρηνο, Ι. Ινοβλάστης με σχετική διεύρυνση του α- δρού ενδοπλασματικού δικτύου (μαύρα βέλη), Νεκρωτικό κύτταρο (λευκό βέλος) x

201 Εικόνα 111: Ημέρα 2 η. Χόριο παρακείμενης περιοχής της τομής. Κυτταρική λύση (βέλη), Ι. Ινοβλάστης. Π.πυρήνας μακροφάγου x Εικόνα 112: Ημέρα 2 η. Χόριο. Πο. πολυμορφοπύρηνο, Μο. Μονοπύρηνο. Λ. Λεμφοκύτταρο x

202 Εικόνα 113: Ημέρα 2 η. Χόριο. Εκτεταμένη καταστροφή των κολλαγόνων δεσμίδων (αστερίσκοι), κύτταρα με νεκρωτικούς πυρήνες (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 114: Ημέρα 2 η. Κύτταρα με νεκρωτικούς πυρήνες (βέλη) x

203 Εικόνα 115: Ημέρα 2 η. Χόριο παρακείμενης περιοχής της τομής. Καταστροφή των πυρήνων (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια x η ημέρα Η δομή του χορίου που αναγεννάται παρουσιάζεται άναρχη με αποδιοργανωμένα κύτταρα, (Εικ.116) υπολείμματα κατεστραμμένων κυττάρων με νεκρωτικούς πυρήνες και αποπροσανατολισμένες κολλαγόνες ίνες. (Εικ.117,118) Παρόλα αυτά, εμφανής είναι η παρουσία ινοβλαστών με μεγάλη διεύρυνση του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου (σημείο έντονης παραγωγής κολλαγόνου). (Εικ.119,120) Στα διάκενα μεταξύ των κολλαγόνων ινών στη θέση πλησίον της τομής εμφανίζεται θεμέλια ουσία, (Εικ.121,122) ενώ εμφανής είναι και η αναγέννηση του επιθηλίου. (Εικ.123) Η διαμόρφωση της αρχιτεκτονικής του χορίου διευκολύνεται με τη βοήθεια πλέγματος, εντός του οποίου παρατηρείται η είσοδος ινοβλαστών καθώς και η αυξημένη παραγωγή κολλαγόνων ινών που δείχνουν να ακολουθούν τη διαμόρφωση του πλέγματος. Τα διάκενα μεταξύ των κολλαγόνων ινών και του πλέγματος γεμίζουν από τη νεοπαραγόμενη θεμέλια ουσία του συνδετικού ιστού του χορίου. Οι ι- νοβλάστες παρουσιάζουν χαρακτηριστικά εκκριτικών κυττάρων. (Εικ.124,125,126) 203

204 Εικόνα 116: Ημέρα 3 η. Χόριο. Αποδιοργανωμένα κύτταρα (βέλη) x Εικόνα 117: Ημέρα 3 η. Άναρχη δομή του χορίου που αναγεννάται, Π. πυρήνας κατεστραμμένου κυττάρου x

205 Εικόνα 118: Ημέρα 3η. Υπολείμματα του κατεστραμμένου χορίου (αστερίσκοι). Κύτταρα με νεκρωτικούς πυρήνες (βέλη) x Εικόνα 119: Ημέρα 3 η. Μεγάλη μεγέθυνση κυττάρων με νεκρωτικούς πυρήνες (Π), Νεοπαραχθέντα κολλαγόνα ινίδια (κ) x

206 Εικόνα 120: Ημέρα 3 η. Χόριο. Ι. Ινοβλάστης με διεύρυνση του α.ε.δ (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 121: Ημέρα 3 η. Χόριο. Τμήμα ινοβλάστου (Ι) με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο (βέλη). Κατεστραμμένο μελανινοκύτταρο (αστερίσκος) x

207 Εικόνα 122: Ημέρα 3 η. Χόριο. Παρουσία ινοβλαστών και αύξηση κολλαγόνων ινιδίων (κ). Π. πυρήνες ινοβλαστών x Εικόνα 123; Ημέρα 3 η. Αναγέννηση χορίου. Χαρακτηριστική διαμόρφωση των κολλαγόνων ινιδίων (βέλη), λι. Λιποσταγονίδια x

208 Εικόνα 124; Ημέρα 3 η. Ανάπλαση του επιθηλίου. Χόριο με παρουσία ινοβλαστών και κολλαγόνων ινών, Π. Πυρήνες ινοβλαστών, κ. κολλαγόνα ινίδια, Ε. Επιθηλιακά κύτταρα x Εικόνα 125: Ημέρα 3 η. Χόριο. Διευκόλυνση της διαμόρφωσης της αρχιτεκτονικής του χορίου με τη βοήθεια πλέγματος. Πλ. Πλέγμα, κ. κολλαγόνα ινίδια x

209 Εικόνα 126: Ημέρα 3 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της προηγούμενης εικόνας. Π. πυρήνας ινοβλάστου που εισχώρησε στο πλέγμα, εξωκυττάρια ουσία (αστερίσκος). Κολλαγόνες ίνες (βέλη) x η ημέρα Το επιθήλιο στο σημείο της τομής αναγεννάται και πολλαπλασιάζει τα κύτταρά του για την επούλωση και αποκατάσταση της συνέχειάς του.(εικ.127,128) Στα επιθηλιακά κύτταρα εμφανίζονται ημιδεσμοσωμάτια και τονικά ινίδια, ενώ διαμορφώνεται και ο βασικός υμένας της εν τω βάθει (βασικής) στιβάδας του επιθηλίου. (Εικ.129,130) Αν και η ανάπλαση είναι εμφανής, εντούτοις στο χόριο εμφανίζονται, μεταξύ των αραιών δεσμίδων των κολλαγόνων ινιδίων, κάποια νεκρωτικά κύτταρα, (Εικ.131) ενώ παραμένουν και διάφορα κύτταρα σε διευρυσμένα διαστήματα, όπως για παράδειγμα λεμφοκύτταρα, μονοπύρηνα, ινοβλάστες και άφθονα μακροφάγα. (Εικ.131,132,133,134,135,136,137) 209

210 Εικόνα 127: Ημέρα 5 η. Ανάπλαση χορίου. Ι. ινοβλάστης, κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 128: Ημέρα 5 η. Μεγαλύτερη μεγέθυνση της προηγούμενης εικόνας. Ι. ινοβλάστης, κ. κολλαγόνα ινίδια x

211 Εικόνα 129: Ημέρα 5 η. Αναγέννηση του επιθηλίου. Π. πυρήνας επιθηλιακού κυττάρου, δεσμίδες τονικών ινιδίων (βέλη) x Εικόνα 130: Ημέρα 5 η. Εμφάνιση ημιδεσμοσωματίων και σχηματισμός βασικού υμένα (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια, Π. πυρήνας επιθηλιακού κυττάρου της βασικής στιβάδας, Εξωκυττάρια ουσία (αστερίσκοι) x

212 Εικόνα 131: Ημέρα 5 η. Χόριο. Κύτταρα με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. (άσπρο βέλος) Νεκρωτικό κύτταρο (μαύρο βέλος). κ. Σχετικά αραιές δεσμίδες κολλαγόνων ινιδίων Εξωκυττάρια ουσία (αστερίσκοι) x Εικόνα 132: Ημέρα 5 η. Χόριο. Λ. Λεμφοκύτταρο, Π. πυρήνας λεμφοκυττάρου x

213 Εικόνα 133: Ημέρα 5 η. Χόριο. Μο. μονοκύτταρο, Π. πυρήνας μονοκυττάρου x Εικόνα 134: Ημέρα 5 η. Χόριο. Ι. Ινοβλάστης με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, Π. πυρήνας ινοβλάστου, δεσμίδες κολλαγόνων ινιδίων (κ) x

214 Εικόνα 135: Ημέρα 5 η. Χόριο. Μ. μακροφάγο, Π. πυρήνας μακροφάγου, λυσοσώματα (βέλη) x Εικόνα 136: Ημέρα 5 η. Χόριο. Μ. μακροφάγο x

215 Εικόνα 137: Ημέρα 5 η. Χόριο. Μ. μακροφάγο. Π. πυρήνας μακροφάγου x η ημέρα Παρατηρείται αναγέννηση του επιθηλίου στην περιοχή του τραύματος με αποκάσταση της βασικής στιβάδας του, δημιουργία βασικού υμένα καθώς και του χορίου. (Εικ.138) Η θέση του πλέγματος καταλαμβάνεται στο μεγαλύτερο μέρος του από δεσμίδες κολλαγόνων ινών, (Εικ.139,140,141) από ινοβλάστες, ενώ παρατηρείται άφθονη θεμέλια ουσία ανάμεσα στα ελάχιστα υπολείμματά του. (Εικ.142) Οι ινοβλάστες εμφανίζονται με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο και η βασική στιβάδα του επιθηλίου συνεχίζει να αναγεννάται και να αποκαθίσταται. Στο αναγεννηθέν χόριο, εμφανίζονται πολυμορφοπύρηνα (Εικ.143) καθώς και άφθονες δεσμίδες κολλαγόνου με χαρακτηριστική διάταξη. 215

216 Εικόνα 138: Ημέρα 7 η. Αναγέννηση επιθηλίου (Ε). Δημιουργία βασικού υμένα (βέλος) Χ. Χόριο, x Εικόνα 139: Ημέρα 7 η. Αναγεννημένο χόριο στην περιοχή του πλέγματος. Π. Πυρήνες πολυμορφοπύρηνων, Πυ. Πυρήνας ινοβλάστου x

217 Εικόνα 140: Ημέρα 7 η. Αναγέννηση χορίου στο πλέγμα. κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 141: Ημέρα 7 η. Κολλαγόνα ινίδια με σχεδόν κανονική διάταξη στο χόριο που αναγεννάται κ. κολλαγόνα ινίδια. Ινοβλάστες (βέλη) x

218 Εικόνα 142: Ημέρα 7 η. Χόριο. Παρατηρείται σε μεγάλη μεγέθυνση στην περιοχή του πλέγματος ινοβλάστης με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο. Άφθονη θεμέλια ουσία ανάμεσα στα υπολείμματα του πλέγματος. Π. πυρήνας ινοβλάστου x Εικόνα 143: Ημέρα 7 η. Χόριο. Πο. πολυμορφοπύρηνο. κ. Κολλαγόνα ινίδια x

219 10 η ημέρα Συνεχής η αναδιοργάνωση του χορίου με την παρουσία άφθονων ινοβλαστών με διεύρυνση του αδρού ενδοπλασματικού δικτύου τους και παραγωγή πολλών κολλαγόνων ινών (Εικ.144,145) Εντούτοις μεταξύ των κολλαγόνων ινών, κατά θέσεις, υ- πάρχουν κενοτοπιώδεις χώροι με παρουσία νεκρωτικών κυττάρων. (Εικ.146,147) Α- νάμεσα στα κύτταρα αυτά εμφανίζονται εωσινόφιλα και μακροφάγα. (Εικ.148) Εικόνα 144: Ημέρα 10η. Χόριο. Ι. Ινοβλάστης με διευρυσμένο αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο (βέλος), Π. πυρήνες ινοβλαστών κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 145: Ημέρα 10 η. Αναγέννηση χορίου. Π. πυρήνες ινοβλαστών, Πο. πολυμορφοπύρηνο, Ι. ινοβλάστης, κ. δεσμίδες κολλαγόνων ινιδίων x

220 Εικόνα 146: Ημέρα 10 η. Ύπαρξη μερικών κενοτοπιωδών χώρων (αστερίσκοι) με παρουσία κυττάρων στο χόριο. Π. πυρήνας ινοβλάστου, κ. κολλαγόνα ινίδια x Εικόνα 147: Ημέρα 10 η. Εωσινόφιλο κύτταρο στο χόριο. Κοκκία (βέλη), κ. κολλαγόνα ινίδια x