Συμβολή στη μελέτη της φυλογεωγραφίας στην Ανατολική Μεσόγειο: η περίπτωση του εδαφόβιου φιδιού Typhlops vermicularis Merrem, 1820

Transcript

1 Συμβολή στη μελέτη της φυλογεωγραφίας στην Ανατολική Μεσόγειο: η περίπτωση του εδαφόβιου φιδιού Typhlops vermicularis Merrem, 1820 Κορνήλιος Παναγιώτης Βιολόγος Διδακτορική Διατριβή ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Τμήμα Βιολογίας Τομέας Βιολογίας Ζωϊκών Οργανισμών 2012

2 Συμβολή στη μελέτη της φυλογεωγραφίας στην Ανατολική Μεσόγειο: η περίπτωση του εδαφόβιου φιδιού Typhlops vermicularis Merrem, 1820 Κορνήλιος Παναγιώτης Βιολόγος Διδακτορική Διατριβή ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ Τμήμα Βιολογίας Τομέας Βιολογίας Ζωϊκών Οργανισμών 2012

3 Contribution to the study of phylogeography in the Eastern Mediterranean: the case of the fossorial snake Typhlops vermicularis Merrem, 1820 Kornilios Panagiotis Biologist PhD Thesis UNIVERSITY OF PATRAS Department of Biology Faculty of Animal Biology 2012

4 Μέλη Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Βασίλειος Χονδρόπουλος (Αναπληρωτής Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Σ. Φραγγεδάκη-Τσώλη (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Σίνος Γκιώκας (Επίκουρος Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Κίλιας Γεώργιος (Αναπληρωτής Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Κλώσσα-Κίλια Ελένη (Επίκουρη Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Πουλακάκης Νικόλαος (Επίκουρος Καθηγητής Παν/μίου Κρήτης) Παρμακέλης Αριστείδης (Λέκτορας Παν/μίου Αθηνών) Μέλη Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Βασίλειος Χονδρόπουλος (Αναπληρωτής Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Σ. Φραγγεδάκη-Τσώλη (Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παν/μίου Πατρών) Σίνος Γκιώκας (Επίκουρος Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Επιβλέπων Καθηγητής Βασίλειος Χονδρόπουλος (Αναπληρωτής Καθηγητής Παν/μίου Πατρών) Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Διδακτορικής Διατριβής από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202.

5 Η διατριβή που ακολουθεί είναι βασισμένη σε πραγματικά γεγονότα...

6 Η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβή χρηματοδοτήθηκε μερικώς από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (I.K.Y.), με υποτροφία μεταπτυχιακών σπουδών Β Κύκλου, για το χρονικό διάστημα

7 Περίληψη Περιεχόμενα Περίληψη 3 Abstract 6 Κεφάλαιο 1 Εισαγωγή - Φυλογεωγραφία Ο επιστημονικός κλάδος της φυλογεωγραφίας Συγκριτική φυλογεωγραφία και διαχείριση της βιοποικιλότητας Σημαντικοί όροι της φυλογένεσης και της φυλογεωγραφίας Μοριακά δεδομένα και μιτοχονδριακό DNA Φυλογεωγραφία, είδος και ειδογένεση Μοριακό ρολόι 17 Κεφάλαιο 2 Εισαγωγή Ο οργανισμός μελέτης, Typhlops vermicularis Η αξία των ερπετών Εξέλιξη και βιογεωγραφία των φιδιών Scolecophidia Typhlopidae Typhlops vermicularis (Merrem, 1820) 29 Κεφάλαιο 3 Εισαγωγή Η περιοχή μελέτης, Ανατολική Μεσόγειος Παλαιογεωγραφία Ανάγλυφο Παλαιοκλίμα Η ανθρώπινη παρουσία 48 Κεφάλαιο 4 Σκοπός & ερωτήματα της διατριβής Σκοπός και ερωτήματα της διατριβής 51 Κεφάλαιο 5 Υλικά και Μέθοδοι Συλλογή δειγμάτων Πειραματική πορεία Στοίχιση και αρχική επεξεργασία των αλληλουχιών 61 1

8 Περίληψη 5.4. Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων Φυλογενετικές αναλύσεις Πολυτομίες Αναλύσεις δικτύων και δημογραφικές αναλύσεις Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Βιογεωγραφικές αναλύσεις 72 Κεφάλαιο 6 Αποτελέσματα Μιτοχονδριακό DNA Πυρηνικό DNA 85 Κεφάλαιο 7 Συζήτηση Σύγκριση των προτύπων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA Φυλογενετικές σχέσεις, πολυτομίες και γενετική δομή Προέλευση και αρχική διαφοροποίηση Ιστορική βιογεωγραφία Η σημασία της Ανατολίας ως καταφύγιο βιοποικιλότητας Διατήρηση Συστηματική Βασικά συμπεράσματα 121 Βιβλιογραφία 124 Παραρτήματα Ι Κατάλογος των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν 146 ΙΙ - Κατάλογος δημοσιεύσεων που σχετίζονται με τη διδακτορική διατριβή 165 2

9 Περίληψη Περίληψη Η φυλογεωγραφία είναι η επιστημονική περιοχή που ασχολείται με τη μελέτη της γεωγραφικής εξάπλωσης των γενεαλογικών γραμμών εντός ενός είδους ή μεταξύ στενά συγγενικών ειδών. Περιλαμβάνει τον προσδιορισμό των φυλογενετικών συγγενειών και τη γεωγραφική τους αποτύπωση, ώστε να αναδειχθεί η εξελικτική προέλευση και η βιογεωγραφική ιστορία των μελετώμενων πληθυσμών, υποειδών ή ειδών. Στην παρούσα διατριβή εξετάζεται για πρώτη φορά η ενδοειδική γενεαλογία του μικρού εδαφόβιου φιδιού Typhlops vermicularis σε μια φυλογεωγραφική προσέγγιση. Το T. vermicularis είναι ο μοναδικός ευρωπαϊκός αντιπρόσωπος της υπεροικογένειας Solecophidia και εξαπλώνεται στην ανατολική Μεσόγειο. Αυτή η περιοχή χαρακτηρίζεται από μια πολύπλοκη γεωλογική και κλιματική ιστορία, η οποία έχει επηρεάσει ή διαμορφώσει τη φυλογένεση και τη βιογεωγραφία πολλών οργανισμών, και ιδιαίτερα των ερπετών και των αμφιβίων που είναι ευαίσθητοι δείκτες παλαιογεωγραφικών και παλαιοκλιματικών γεγονότων. Σκοπός της διατριβής ήταν να αποσαφηνιστούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών του εξεταζόμενου είδους, με τη χρήση μοριακών δεικτών του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA, και να προσεγγιστούν βασικά ερωτήματα που αφορούν τόσο στη φυλογένεση και βιογεωγραφία του είδους, όσο και στις διεργασίες που καθόρισαν ή επηρέασαν την εξελικτική και βιογεωγραφική ιστορία των ζωικών οργανισμών της ανατολικής Μεσογείου. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 130 δείγματα, ενώ ως μοριακοί δείκτες επιλέχθηκαν τα μιτοχονδριακά γονίδια 12S και ND2 και το πυρηνικό γονίδιο PRLR, τα οποία πολλαπλασιάστηκαν μέσω της αλυσσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Ακολουθήθηκαν βασικές μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης (Σύνδεση Γειτόνων, Μέγιστη Πιθανοφάνεια και Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία), ενώ οι γενεαλογικές σχέσεις μεταξύ των μιτοχονδριακών και πυρηνικών απλοτύπων προσεγγίστηκαν μέσω δικτύων απλοτύπων που κατασκευάστηκαν με τον αλγόριθμο της στατιστικής φειδωλότητας. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των απλοτύπων του ίδιου δικτύου υπολογίστηκε με τη στατιστική παράμετρο Snn του Hudson. Εξάλλου, ελέγχθηκε η υπόθεση ταχείας επέκτασης με τις δοκιμασίες ουδετερότητας των παραμέτρων Fs του Fu και R 2. Οι χρόνοι απόσχισης των φυλογενετικών κλάδων του μιτοχονδριακού DNA εκτιμήθηκαν με την προσέγγιση του αυστηρού μοριακού 3

10 Περίληψη ρολογιού και με σημείο βαθμονόμησης την απομόνωση του κλάδου της Κύπρου μετά τη λήξη της Κρίσης Αλατότητας του Μεσσηνίου, πριν 5,3 εκατομύρια χρόνια. Τέλος, για την καλύτερη κατανόηση της βιογεωγραφικής ιστορίας του T. vermicularis εφαρμόστηκε η στατιστική προσέγγιση της Διασποράς-Βικαριανισμού. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, παρατηρείται μια αδυναμία του πυρηνικού δείκτη να διακρίνει τις εξελικτικές γραμμές που αναδεικνύονται από τον μιτοχονδριακό δείκτη, εκτός από την περίπτωση του γενετικά πιο διαφοροποιημένου κλάδου Α (για το μιτοχονδριακό DNA) ή na (για το πυρηνικό DNA) που κατανέμεται γεωγραφικά στην περιοχή της Ιορδανίας και της νότιας Συρίας. Σε αυτήν την ασυμφωνία μπορεί να συμβάλουν παράγοντες της αναπαραγωγής, της γενεαλογικής ιστορίας και του τρόπου διασποράς των ατόμων του είδους, καθώς επίσης και του τρόπου κληρονομικότητας του μιτοχονδριακού DNA και της πίεσης της φυσικής επιλογής. Το T. vermicularis περιλαμβάνει δέκα μιτοχονδριακούς κλάδους, οι οποίοι αντιστοιχούν σε ισάριθμες Εξελικτικά Σημαντικές Μονάδες. Η γενετική διαφοροποίηση στο εσωτερικό κάθε κλάδου είναι πολύ μικρή, ενώ είναι ιδιαίτερα μεγάλη μεταξύ των κλάδων, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή ύπαρξη ενός ή περισσοτέρων φαινομένων γενετικής στενωπού ή ιδρύσεως. Το γενικό φυλογεωγραφικό πρότυπο αντιστοιχεί στην Κατηγορία Ι του Avise (2000), η οποία αφορά βαθιά γενεαλογικά δένδρα µε τις κύριες γενεαλογικές γραμμές σε αλλοπατρία και που παρατηρείται μεταξύ πληθυσμών που έχουν χωριστεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Το γενικό αυτό πρότυπο συνοδεύεται, στην περίπτωση του T. vermicularis, από την παρουσία πολυτομιών, δηλαδή σχέσεων που δεν είναι αποσαφηνισμένες. Αυτές οι πολυτομίες μπορεί να είναι αποτέλεσμα ενός συνδυασμού έλλειψης δεδομένων και πιθανών παράλληλων κλαδογενετικών γεγονότων. Με βάση την εκτίμηση των χρόνων κατά τους οποίους συνέβησαν τα βασικά φυλογενετικά γεγονότα για το T. vermicularis, καθώς και τα παλαιογεωγραφικά και, κυρίως, τα παλαιοκλιματικά γεγονότα που πραγματοποιήθηκαν στην περιοχή μελέτης κατά τους χρόνους αυτούς, μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι κατά το Ύστερο Νεογενές η κατανομή του T. vermicularis ακολούθησε πολλούς κύκλους επέκτασης και συρρίκνωσης. Οι απότομες και έντονες μεταβάσεις από πιο υγρές σε πιο ξηρές συνθήκες σε αυτήν την περίοδο, είναι πολύ πιθανό να προκάλεσαν κατακερματισμό της γεωγραφικής κατανομής του ζώου και να έδρασαν ως βικαριανιστικός παράγοντας. Κατά τη διάρκεια των μη ευνοϊκών περιόδων (ξηρών 4

11 Περίληψη και ψυχρών), πολλές περιοχές κυρίως στην Ανατολία, λειτούργησαν ως θύλακες βιοποικιλότητας για το T. vermicularis, λόγω των γεωμορφολογικών και οικολογικών χαρακτηριστικών τους. Για είδη, όπως το T. vermicularis, τα οποία έχουν μια ενιαία γεωγραφική κατανομή που καλύπτει ολόκληρη την Ανατολία, αποκαλύπτεται η ύπαρξη γενετικών «ποικιλιών», με τη βοήθεια μοριακών δεικτών, σε αυτές τις περιοχές που θεωρούνται καταφύγια. Σε άλλες περιπτώσεις ειδών ερπετών, οι γεωγραφικές εξαπλώσεις είναι πολύ πιο περιορισμένες ή κατακερματισμένες και συμπίπτουν σε μεγάλο βαθμό με τις περιοχές που λειτούργησαν ως καταφύγια για το T. vermicularis, λειτουργώντας και ως κέντρα ενδημισμού. Τόσο οι εξελικτικές γραμμές εντός του T. vermicularis, όσο και οι περιοχές οι οποίες διαδραμάτισαν στο παρελθόν σπουδαίο ρόλο στη διατήρηση της βιοποικιλότητας, είναι σημαντικές από διαχειριστικής απόψεως και χρήζουν ιδιαίτερης προστασίας. Μεταξύ των Εξελικτικά Σημαντικών Μονάδων του T. vermicularis, ο κλάδος A είναι γενετικά πολύ διαφοροποιημένος από τους υπόλοιπους κλάδους (μιτοχονδριακό και πυρηνικό DNA), ενώ ο χρόνος του φυλογενετικού διαχωρισμού του από τους άλλους κλάδους είναι πολύ μεγάλος (~ 10 εκατ. χρόνια πριν), συγκρινόμενος με χρόνους απόσχισης μεταξύ αναγνωρισμένων ειδών των οικογενειών Typhlopidae και Leptotyphlopidae. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, ο κλάδος αυτός θα μπορούσε να θεωρηθεί ότι αποτελεί ένα ξεχωριστό είδος. 5

12 Abstract Abstract Phylogeography is the scientific field that studies the geographical distribution of genealogical lineages within a species or closely related ones. Phylogenies are reconstructed and plotted geographically to display their spatial relationships and deduce the evolutionary origins and biogeographic history of populations, subspecies and species. The current study represents a phylogeographical approach of the intraspecific genealogy of the small fossorial snake Typhlops vermicularis. Typhlops vermicularis is the only extant representative of the superfamily Solecophidia and it is distributed in the eastern Mediterranean region. This area is characterized by a complex geological and climatic history that has affected or formed the phylogeny and biogeography of several organisms, and especially reptiles and amphibians which are sensitive indicators of palaeogeographic and palaeoclimatic events. The scope of the current study was to assess the phylogenetic relationships among the populations of the studied species, with the use of mitochondrial and nuclear molecular markers, and to answer questions regarding the phylogeny and biogeography of this species and the processes that affected the evolutionary and biogeographic history of animal taxa in the eastern Mediterranean. In total, 130 specimens were used, while the mitochondrial genes 12S and ND2, and the nuclear gene PRLR were chosen as markers, and were amplified via the polymerase chain reaction (PCR). Basic methods of phylogenetic analysis were followed (Neighbour-Joining, Maximum Likelihood and Bayesian Inferrence), and the genealogical relationships among the mitochondrial and nuclear haplotypes were approached through haplotype-networks with the use of the statistical parsimony algorithm. Genetic differentiation among the haplotypes of the same network was calculated with the use of Hudson s Snn parameter. Moreover, the rapid expansion hypothesis was tested with the neutrality tests of Fu s Fs and R 2. Divergence times for the mitochondrial clades were estimated with a strict molecular-clock approach and the use of the phylogenetic split of the Cypriot lineage at the end of the Messinian Salinity Crisis (5.3 Mya) as a calibration point. Finally, a Dispersal- Vicariance analysis was performed, in order to better understand the biogeographic history of T. vermicularis. 6

13 Abstract According to the results of the present study, the nuclear-marker phylogeny does not distinguish the evolutionary lineages that resulted from the phylogenetic analysis of the mitochondrial marker, except for the strongly differentiated clade A (mitochondrial DNA) or na (nuclear DNA), which is distributed in Jordan and south Syria. This incongruence could be a result of reproduction, genealogical and dispersal factors, but also the mitochondrial-dna inheritance and natural selection. Typhlops vermicularis includes ten mitochondrial clades, which represent ten Evolutionary Significant Units. Genetic divergence within each clade is very small, while it is significantly higher among the clades, implying one or more genetic bottleneck or founder effects. The general phylogeographical pattern agrees with Avise s (2000) Category I, which concerns deep phylogenetic trees with the genealogical lineages in allopatry, and is observed among populations that have been isolated for a long period. In T. vermicularis, this pattern is also combined with the presence of polytomies, i.e. unresolved relationship, s a result of lack in data and possible parallel cladogenetic events. Based on the estimated times of diversification events within T. vermicularis, and the palaeogeographic and, most importantly, the palaeoclimatic events that occurred during those times in the area, it seems that, during the Late Neogene, T. vermicularis distribution followed many circles of expansion and shrinkage. The sudden and intense transitions from wetter to more arid conditions during that period possibly induced fragmentations in the geographic distribution of this animal and acted as a vicariant agent. During the non-favourable periods (arid and cold), several regions, especially in Anatolia, acted as biodiversity pockets for T. vermicularis, due to their geomorphological and ecological characteristics. For species, such as T. vermicularis, that present a continuous distribution throughout Anatolia, the existence of genetic varieties is exposed with the use of molecular markers, in areas considered as refugia. For other reptile species, geographic distributions are more confined or patchy, and coincide with the areas that acted as refugia for T. vermicularis, also acting as endemism centers. The identified T. vermicularis evolutionary lineages and the areas that played an essential role in sustaining biodiversity in the past are important in terms of management and protection. Among the T. vermicularis Evolutionary significant Units, clade A is genetically differentiated from the others (mitochondrial and nuclear DNA), while its divergence time is very old (~ 10 mya), compared to that of other recognized 7

14 Abstract Typhlopidae and Leptotyphlopidae species. According to these results, this clade could represent a separate species. 8

15 Εισαγωγή Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή Φυλογεωγραφία 9

16 Εισαγωγή 1.1 Ο επιστημονικός κλάδος της φυλογεωγραφίας Η φυλογεωγραφία είναι μια σχετικά νέα και ραγδαία εξελισσόμενη επιστημονική περιοχή, που ασχολείται με τη μελέτη της γεωγραφικής εξάπλωσης των γενεαλογικών γραμμών εντός ενός είδους ή μεταξύ στενά συγγενικών ειδών (Avise et al. 1987). Περιλαμβάνει τον προσδιορισμό των φυλογενετικών συγγενειών και, στη συνέχεια, τη γεωγραφική τους αποτύπωση, ώστε να αναδειχθεί η εξελικτική προέλευση και η βιογεωγραφική ιστορία των μελετώμενων πληθυσμών, υποειδών ή ειδών (Avise 2000, Hewitt 2001). Ο όρος φυλογεωγραφία αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τον Avise και τους συνεργάτες του το 1987, προκειμένου να ενοποιήσουν τα επιστημονικά πεδία της φυλογένεσης και της γενετικής πληθυσμών. Στην εργασία τους, οι Avise et al. (1987) αναγνώρισαν ότι «οι μικροεξελικτικές διαδικασίες που συμβαίνουν εντός ενός είδους (που μελετούνται από τους επιστημονικούς κλάδους της ηθολογίας, δημογραφίας, πληθυσμιακή γενετικής κλπ.) μπορούν να εξηγήσουν τις μακροεξελικτικές διαφορές μεταξύ ειδών ή ανώτερων τάξων (που μελετούνται από τους επιστημονικούς κλάδους της ιστορικής βιογεωγραφίας, παλαιοντολογίας, φυλογένεσης κλπ.)». Η μέχρι τότε έλλειψη ιστορικής διάστασης των αναλύσεων γενετικής πληθυσμών άλλαξε ριζικά στα επόμενα χρόνια κυρίως χάρη στην έκδοση του βιβλίου «Φυλογεωγραφία» από τον Avise το 2000 και στην ανάπτυξη της θεωρίας της σύμφυσης των γενεαλογικών γραμμών (coalescent theory)*. Η φυλογεωγραφία έχει πλέον γίνει ένα από τα πιο συνδυαστικά αλλά και σημαντικά πεδία της εξελικτικής βιολογίας, καθώς τα διαφορετικά αναλυτικά εργαλεία που έχουν αναπτυχθεί είναι πολλά αλλά και οι υποθέσεις που εξετάζονται είναι περισσότερο πολύπλοκες. * Η θεωρία της γενετικής πληθυσμών είχε αρχικά βασιστεί σε εξισώσεις που προέβλεπαν συχνότητες αλληλομόρφων σε μελλοντικές γενιές, προσομοιώνοντας ολόκληρους πληθυσμούς (Ewens 1979). Από την άλλη πλευρά, η θεωρία της σύμφυσης των γενεαλογικών γραμμών (coalescent theory) μπορεί να εκτιμήσει φυλογεωγραφικές παραμέτρους του παρελθόντος (π.χ. μέγεθος πληθυσμού, χρόνος απόσχισης, ρυθμός μετανάστευσης), χρησιμοποιώντας γενετικά δεδομένα του παρόντος, ώστε οι γενετικές γενεαλογίες να προσομοιώνονται πίσω στο χρόνο υπό οποιοδήποτε δημογραφικό μοντέλο (Wakeley 2008). Με δεδομένο ότι η δομή των γενεαλογιών των πληθυσμών επηρεάζεται από τη δημογραφική τους ιστορία, οι φυλογεωγράφοι, με προσεκτική δειγματοληψία και 10

17 Εισαγωγή κατάλληλη επιλογή γενετικών δεικτών, μπορούν να διερευνήσουν τις ιστορικές αλλαγές που συντελούνται στο φυσικό περιβάλλον των πληθυσμών, χρησιμοποιώντας τη σημερινή γενετική τους πληροφορία (Beheregaray 2008). Για αυτούς τους λόγους, η φυλογεωγραφία έχει συνεισφέρει σημαντικά σε πολλά πεδία της βιολογίας και των γεωεπιστημών, όπως στην ειδογένεση, στην ιστορική βιογεωγραφία, στην ανθρώπινη εξέλιξη, στην εξελικτική βιολογία, στη μελέτη της Εικόνα 1.1. Αριθμός δημοσιευμένων άρθρων σχετικών με τη φυλογεωγραφία ( ) και αντίστοιχες αναφορές τους στη βιβλιογραφία (Beheregaray 2008). βιοποικιλότητας, στην ταξινόμηση, στην παλαιοοικολογία, στην παλαιοκλιματολογία και στην ηφαιστειολογία (Beheregaray 2008 και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Ο αριθμός των επιστημονικών δημοσιεύσεων που σχετίζονται με φυλογεωγραφικά ερωτήματα έχει αυξηθεί σημαντικά τις τελευταίες δεκαετίες (Εικόνα 1.1), ενώ οι δημοσιεύσεις που αφορούν σε οργανισμούς που εξαπλώνονται στην Ευρώπη κατέχουν το μεγαλύτερο ποσοστό (Εικόνα 1.2). 1.2 Συγκριτική φυλογεωγραφία και διαχείριση της βιοποικιλότητας Οι Avise et al. (1987) θεώρησαν ότι γενετικά δεδομένα από τάξα που κατανέμονται γεωγραφικά στον ίδιο ευρύτερο χώρο μπορούν να δώσουν απαντήσεις σε ερωτήματα, τα οποία αφορούν σε γεωγραφικά, γεωλογικά ή/και κλιματικά 11

18 Εισαγωγή φαινόμενα ή και διεργασίες που οδήγησαν στην παρατηρούμενη κατανομή της βιοποικιλότητας. Αυτή η προσέγγιση δίνει τη δυνατότητα να μελετηθούν οργανισμοί που έχουν υποστεί ανεξάρτητα την επίδραση των ίδιων «φυσικών» εξελικτικών παραγόντων. Συγκρίνοντας τα πρότυπα γενετικής ροής ή/και διαφοροποίησης μεταξύ ειδών που συνυπάρχουν χρονικά και χωρικά, η συγκριτική φυλογεωγραφία αποκαλύπτει την επίδραση των ιστορικών παραγόντων στα πρότυπα της βιοποικιλότητας που παρατηρούμε σήμερα. Εικόνα 1.2. Προέλευση δημοσιευμένων άρθρων που σχετίζονται με τη φυλογεωγραφία ( ), με βάση τις περιοχές προέλευσης των οργανισμών μελέτης (Beheregaray 2008). Ακολουθώντας την ίδια λογική, οι φυλογεωγράφοι πλέον μπορούν να «προβλέψουν» αλλαγές στη γεωγραφική εξάπλωση ειδών, όπως αυτές μπορεί να προκύψουν από ενδεχόμενες μελλοντικές κλιματικές αλλαγές (Hewitt 1996, 2000). Οι μελέτες συγκριτικής φυλογεωγραφίας βοηθούν στον προσδιορισμό γεωγραφικών περιοχών που έχουν διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην εξελικτική ιστορία διαφόρων οργανισμών και που, συνεπώς, αποκτούν ιδιαίτερη αξία από διαχειριστικής σκοπιάς. Μέχρι το πρόσφατο παρελθόν, τα κριτήρια για τον ορισμό περιοχών διαχείρισης ήταν ο αριθμός των ειδών, ο ενδημισμός και η φυλογενετική ποικιλότητα (Brooks et al. 2002, Orme et al. 2005, Lamoreux et al. 2006, Spathelf & Waite 2007). Όμως σήμερα, γνωρίζοντας «πού» και «πώς» διαδραματίστηκαν σημαντικά εξελικτικά γεγονότα, είμαστε σε θέση να προστατεύσουμε όχι μόνο την ίδια τη βιοποικιλότητα, αλλά και τις διεργασίες που τη δημιουργούν (Moritz & Faith 1998). 12

19 Εισαγωγή 1.3 Σημαντικοί όροι της φυλογένεσης και της φυλογεωγραφίας Πρότυπα ειδογένεσης Έχουν περιγραφεί τέσσερα πρότυπα φυσικής ειδογένεσης: η αλλοπάτρια, η περιπάτρια, η παραπάτρια και η συμπάτρια, που περιγράφονται σχηματικά στην Εικόνα 1.3. Παρόλα αυτά, περιπτώσεις ειδογένεσης έχουν παρατηρηθεί και εξαιτίας φαινομένων υβριδισμού και πολυπλοειδίας. Εικόνα 1.3. Πρότυπα ειδογένεσης: Αλλοπάτρια Φυσικός φραγμός διαχωρίζει τον πληθυσμό Περιπάτρια Μικρός ιδρυτικός υποπληθυσμός εισέρχεται σε νεό απομονωμένο θώκο (π.χ. γεωγραφική περιοχή) Παραπάτρια Νέος θώκος ιδρύεται γειτονικά στον πρώτο Συμπάτρια Ειδογένεση που λαμβάνει χώρα χωρίς φυσικό διαχωρισμό Φυλογενετικά πρότυπα Όταν ένας πληθυσμός χωρίζεται σε δύο απομονωμένους υποπληθυσμούς, τότε οι απλότυποι του αρχικού πληθυσμού (που έχουν συγκεκριμένες φυλογενετικές σχέσεις) μοιράζονται στους υποπληθυσμούς με σχετικά τυχαίο τρόπο. Σε μια τέτοια περίπτωση τα πιθανά παρατηρούμενα φυλογενετικά πρότυπα, που διαφέρουν ανάλογα με τη χρονική στιγμή της παρατήρησης σε σχέση με τη στιγμή που διαχωρίστηκαν από τον αρχικό πληθυσμό, είναι η αμοιβαία μονοφυλετικότητα, η παραφυλετικότητα, και η πολυφυλετικότητα (Εικόνα 1.4) (Avise et al. 1983). Το ιδεατό σε όλες τις φυλογεωγραφικές και φυλογενετικές μελέτες είναι οι γενεαλογικές γραμμές των πληθυσμών και των ειδών να ακολουθούν τον κανόνα της μονοφυλετικότητας. 13

20 Εισαγωγή Ομοπλασία - Συναπομορφία Το πρόβλημα των φυλογενετικών συμπερασμάτων είναι το πώς θα συνδέσουμε τα είδη σε μονοφυλετικές ομάδες που να αντικατοπτρίζουν την κοινή τους προγονική προέλευση, χωρίς να παραπλανηθούμε από τις ομοπλασίες και τους διαφορετικούς εξελικτικούς ρυθμούς. Με τον όρο ομοπλασία εννοούμε την κατάσταση στην οποία δύο ή περισσότερα είδη διαθέτουν παρόμοιους ή Εικόνα 1.4. Σχηματική περιγραφή των φυλογενετικών προτύπων της παραφυλετικότητας, πολυφυλετικότητας και μονοφυλετικότητας των τάξων Παραφυλετική ομάδα περιλαμβάνει έναν κοινό πρόγονο αλλά όχι όλους τους φυλογενετικούς απόγονους του. Πολυφυλετική ομάδα δεν περιλαμβάνει τον κοινό πρόγονο των μελών της. Μονοφυλετική ομάδα - περιλαμβάνει έναν κοινό πρόγονο και όλους τους φυλογενετικούς απόγονους του. ταυτόσημους χαρακτήρες, τους οποίους όμως δεν έχουν κληρονομήσει από τον κοινό τους πρόγονο. Ο Hennig ήταν μεταξύ των πρώτων που έδειξαν ότι το κλειδί για να αναγνωριστεί μια μονοφυλετική ομάδα είναι η παρουσία σε όλα τα μέλη της μοναδικών παράγωγων καταστάσεων χαρακτήρων, δηλαδή συναπομορφιών, που έχουν δημιουργηθεί μία και μόνο φορά. Βικαριανισμός και διασπορά Ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι δύο παράγοντες που καθορίζουν, ο καθένας με τον δικό του τρόπο την προέλευση του χωρικού διαχωρισμού των ταξινομικών μονάδων. Υπό βικαριανιστικές συνθήκες, οι πληθυσμοί διαχωρίζονται όταν η συνεχής κατανομή της προγονικής μορφής κατακερματίζεται από περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως φαινόμενα ορογένεσης, διαρρήξεις ηπειρωτικών μαζών, ευστατικά φαινόμενα (Croizat et al. 1974, Nelson & Platnick 1981, Nelson & Rosen 1981, Humphries & Parenti 1986, Myers & Giller 1988). Κατά τη διασπορά, μια ταξινομική μονάδα αποκτά τη σημερινή της κατανομή μέσω 14

21 Εισαγωγή ενεργητικής ή παθητικής διασποράς από ένα ή περισσότερα προγονικά κέντρα προέλευσης (Briggs 1974). Ο βικαριανισμός και η διασπορά είναι ιστορικά φαινόμενα, ο σχετικός ρόλος των οποίων στις διάφορες περιπτώσεις μπορεί να σταθμιστεί στο πλαίσιο της φυλογενετικής ανάλυσης. 1.4 Μοριακά δεδομένα και μιτοχονδριακό DNA Το πιο χρήσιμο εργαλείο στη διερεύνηση φυλογενετικών σχέσεων, έχει αποδειχθεί ότι είναι η σύγκριση τμήματος ή ολόκληρης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας συγκεκριμένων γενετικών τόπων. Η προσέγγιση αυτή εξετάζει τις σχέσεις των τάξων μέσα από συναπομορφίες και όχι με βάση τη συνολική ομοιότητα, όπως ισχύει στις φαινετικές μορφολογικές προσεγγίσεις που στηρίζονται σε ποσοτικούς χαρακτήρες. Σύμφωνα με τους Graur και Li (2000), οι λόγοι για τους οποίους τα μοριακά δεδομένα είναι καταλληλότερα για εξελικτικές μελέτες σε σχέση με δεδομένα προερχόμενα από τη μορφολογία ή τη φυσιολογία είναι οι ακόλουθοι: α) οι αλληλουχίες του DNA και των πρωτεϊνών είναι αυστηρά κληρονομούμενες οντότητες, κάτι που δεν ισχύει για πολλά χαρακτηριστικά της μορφολογίας και της φυσιολογίας, που επηρεάζονται σε μικρό ή μεγάλο βαθμό και από περιβαλλοντικούς παράγοντες, β) η περιγραφή των μοριακών δεδομένων δεν χαρακτηρίζεται από υποκειμενικούς και ταυτόχρονα αμφίβολους όρους, γ) η εξέλιξη στο επίπεδο των μορίων χαρακτηρίζεται από κανονικότητα, σε αντίθεση με τα μορφολογικά/φυσιολογικά χαρακτηριστικά, και συνεπώς τα μόρια παρέχουν μια πιο ξεκάθαρη εικόνα των σχέσεων μεταξύ των μελετούμενων τάξων, δ) τα μοριακά δεδομένα ενδείκνυνται για ποσοτικές αναλύσεις και για αυτό τον λόγο έχουν αναπτυχθεί πολλές στατιστικές και μαθηματικές θεωρίες για την ανάλυσή τους, σε αντίθεση με τα μορφολογικά δεδομένα που σε ορισμένες περιπτώσεις εξετάζονται μέσα από μεθόδους ποιοτικών αναλύσεων, ε) η εξαγωγή απόμορφων καταστάσεων χαρακτήρων είναι ευκολότερη στα μοριακά δεδομένα σε σύγκριση με τα μορφολογικά/φυσιολογικά δεδομένα, στ) τα μοριακά δεδομένα επιτρέπουν τη μελέτη των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ αρκετά απομακρυσμένων εξελικτικά οργανισμών, κάτι που λίγοι μορφολογικοί χαρακτήρες μπορούν να προσφέρουν, και ζ) τα μοριακά δεδομένα είναι άφθονα σε σχέση με τα μορφολογικά/φυσιολογικά. Η ανάλυση δεδομένων μιτοχονδριακού DNA (mtdna) ήταν, και είναι, θεμελιώδης για την ανάπτυξη του κλάδου της φυλογεωγραφίας. Μοριακοί δείκτες 15

22 Εισαγωγή του μιτοχονδριακού DNA επιλέγονται πολύ συχνά σε μελέτες που αφορούν ζωϊκούς οργανισμούς εξαιτίας των πλεονεκτημάτων της έλλειψης ανασυνδυασμού (είναι απλοειδές και με μητρική κληρονομικότητα), της θεωρούμενης ουδετερότητάς του ως δείκτη και του γεγονότος ότι εξελίσσεται σχετικά γρήγορα (5-10 φορές ταχύτερα συγκρινόμενο µε το μοναδικό - µη επαναλαµβανόµενο - πυρηνικό DNA). Παρόλα αυτά, ένα από τα συμπεράσματα που προέκυψαν από τη σύγχρονη φυλογεωγραφία είναι ότι τα δεδομένα που συλλέγονταν κατά τη δεκαετία του 1990 και αφορούσαν συνήθως σε ένα μόνο γενετικό τόπο του μιτοχονδριακού DNA, ήταν συχνά ανεπαρκή και ότι, αντιθέτως, δεδομένα από πολλούς γενετικούς τόπους μπορούσαν να βελτιώσουν σημαντικά την απόδοση των αναλυτικών μεθόδων (Edwards & Beerli 2000, Felsenstein 2006, Hickerson et al. 2006, Carling & Brunfield 2007). Έτσι, η φυλογεωγραφία σήμερα εστιάζει στην ανάλυση πολλών γενετικών μαρτύρων του μιτοχονδριακού DNA αλλά και μαρτύρων του πυρηνικού DNA (Hickerson et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Από την άλλη πλευρά, η χρήση μοριακών δεδομένων για τη διερεύνηση φυλογενετικών σχέσεων περιλαμβάνει και μια σειρά αδυναμιών, όπως προβλήματα που σχετίζονται με την επιλογή των κατάλληλων δεικτών, την ανεπαρκή ή μη αντιπροσωπευτική δειγματοληψία σε επίπεδο πληθυσμών ή τάξων, την ομοπλασία και των κορεσμό (Philippe et al. 2011). Μια σημαντική αδυναμία της προσέγγισης με μοριακούς δείκτες είναι το γεγονός ότι συχνά ένα δέντρο βασισμένο σε ένα γονίδιο δεν αντιστοιχεί στο πραγματικό δέντρο των ειδών. Ένα δέντρο γονιδίου (gene tree) αποτυπώνει την εξελικτική πορεία/ιστορία αυτού του γονιδίου. Συνεπώς, μελετώντας ένα είδος μπορούν να προκύψουν πολλά γονιδιακά δέντρα και, επομένως, το δέντρο του είδους (species tree), που αποτυπώνει την εξελικτική ιστορία του είδους, περιλαμβάνει όλα αυτά τα γονιδιακά δέντρα (Maddison 1997). Τα γονιδιακά δέντρα μπορεί να διαφέρουν τόσο μεταξύ τους όσο και με το δέντρο του είδους, και τέτοιες διαφορές μπορεί να οφείλονται είτε σε στοχαστικά φαινόμενα που σχετίζονται με τα δεδομένα και τις μεθόδους που ακολουθήθηκαν είτε σε πραγματικές εξελικτικές διεργασίες (Philippe et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). 16

23 Εισαγωγή 1.5 Φυλογεωγραφία, είδος και ειδογένεση Ίσως μία από τις σημαντικότερες συνεισφορές της φυλογεωγραφίας αφορά ένα από τα πιο βασικά βιολογικά ερωτήματα: τι είναι το είδος; Οι ορισμοί του είδους είναι πολλοί και ποικίλοι, αλλά οι περισσότεροι από αυτούς που χρησιμοποιούνται σήμερα, με τον έναν ή τον άλλο τρόπο, έχουν κάποια φυλογεωγραφική χροιά (Avise & Ball 1990, Templeton 2001, De Queiroz 2007). Σήμερα, αποτελέσματα φυλογεωγραφικών αναλύσεων χρησιμοποιούνται μαζί με δεδομένα από άλλες προσεγγίσεις για την οριοθέτηση ειδών (Morando et al. 2003, Sites & Marshall 2004, Leavitt et al. 2007). Οι φυλογεωγραφικές προσεγγίσεις μπορούν επίσης να αναγνωρίσουν ιστορικά φαινόμενα υβριδισμού και γενετικής ροής (Hewitt 2001, Gonzalez- Rodriguez et al. 2004, Swenson & Howard 2005), αλλά και τους γεωγραφικούς παράγοντες που δρουν σε περιπτώσεις φραγμών απομόνωσης. Μέσα από τέτοιες μελέτες μπορούν να διατυπωθούν υποθέσεις αλλοπάτριας ειδογένεσης, οι οποίες ελέγχονται με γενετικά δεδομένα από οργανισμούς που κατανέμονται στην περιοχή του υποτιθέμενου απομονωτικού φραγμού. 1.6 Μοριακό ρολόι Η υπόθεση του μοριακού ρολογιού, που έχει γίνει αντικείμενο έντονων αντιπαραθέσεων*, υποδεικνύει την ύπαρξη ενός ρυθμού εξέλιξης (ρυθμός νουκλεοτιδικών ή αμινοξικών υποκαταστάσεων) που είναι μεν σταθερός για κάθε γονίδιο μεταξύ διαφορετικών φυλογενετικών γραμμών, αλλά μπορεί να είναι πιο γρήγορος ή πιο αργός ανάλογα με τα μελετώμενα γονίδια. Εάν το μοριακό ρολόι υπάρχει και ο ρυθμός εξέλιξης ενός γονιδίου μπορεί να υπολογιστεί, τότε είναι πιθανή η χρονολόγηση άγνωστων χρονικά αποσχίσεων δύο γενεαλογικών γραμμών μέσω σύγκρισης των πρωτεϊνικών ή των νουκλεοτιδικών τους αλληλουχιών. Αντιστρόφως, εάν ο χρόνος απόκλισης δύο ειδών είναι γνωστός, τότε μπορεί να συναχθεί και ο ρυθμός μοριακής εξέλιξης ενός γονιδίου, ενώ δεν πρέπει να αμφισβητείται ότι η ανασύσταση μιας φυλογένεσης είναι ευκολότερη και πιο ακριβής λαμβάνοντας υπόψη το μοριακό ρολόι (Posada 2003). Στην πιο ακραία της εκδοχή, η υπόθεση του μοριακού ρολογιού απαιτεί την παραδοχή ότι οι ομόλογες αλληλουχίες DNA εξελίσσονται με τον ίδιο ρυθμό κατά 17

24 Εισαγωγή μήκος όλων των γενεαλογικών γραμμών, εφόσον αυτές διατηρούν την αρχική τους λειτουργία (Wilson et al. 1985). Πράγματι, ο ρυθμός υποκατάστασης μεταξύ εξελικτικά απομακρυσμένων ειδών εμφανίζει μεγάλες διαφορές (Graur & Li 2000). Αυτό, ωστόσο, δεν αποτελεί απόδειξη ότι δεν υπάρχει μοριακό ρολόι. Στην πραγματικότητα, δεν υπάρχει ένα «παγκόσμιο» ρολόι, όμως μπορούμε να αναφερθούμε σε ένα μοριακό ρολόι που χτυπάει αμερόληπτα για μία ομάδα συγγενικών ειδών. Το ρολόι αυτό που ονομάζεται «τοπικό», θα μπορούσε να εφαρμοσθεί μόνο στην ομάδα των οργανισμών που μελετώνται. Η εκτίμηση της ταχύτητας ενός μοριακού ρολογιού εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον προσδιορισμό του χρόνου απόκλισης ανάμεσα στις εξεταζόμενες ταξινομικές μονάδες. Ο προσδιορισμός αυτός στηρίζεται κατά κανόνα σε παλαιοντολογικά δεδομένα ή παλαιογεωγραφικά συμβάντα, τα οποία όμως συχνά είναι ελλιπή. Το καλύτερο μέσο προσδιορισμού της μοριακής απόκλισης μεταξύ των οργανισμών είναι ο χρόνος που μεσολάβησε από την κοινή προγονική μορφή έως σήμερα. Ο ρυθμός απόκλισης σε μοριακό επίπεδο είναι ανεξάρτητος από τον ρυθμό απόκλισης στο επίπεδο της μορφολογίας και άλλων φαινοτυπικών προσεγγίσεων, για τις οποίες είναι καθοριστική η επίδραση της φυσικής επιλογής. Σε γενικές γραμμές θα μπορούσε να υποθέσει κανείς ότι παρά την ετερογένεια στο ρυθμό υποκατάστασης του DNA και την αβεβαιότητα στην εκτίμηση του μοριακού ρολογιού, το τελευταίο αποτελεί μία από τις παραμέτρους της μοριακής φυλογένεσης που έχουν μάλλον «τοπική» παρά «γενική» ισχύ (Avise 1994). Η εφαρμογή ενός τοπικού ρολογιού, παρά τις όποιες ατέλειες, επιτρέπει τον συσχετισμό της φυλογενετικής και βιογεωγραφικής ιστορίας με την κλίμακα του χρόνου, παρέχοντας εξελικτική πληροφορία που σε άλλη περίπτωση θα έμενε ανεκμετάλλευτη. Συνεπώς, η χρονολόγηση των γεγονότων απόκλισης είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως κριτήριο ελέγχου ανεξάρτητων βιογεωγραφικών (και παλαιογεωγραφικών) υποθέσεων και να βοηθήσει στην ερμηνεία των σημερινών κατανομών και στην κατανόηση των ιστορικών προτύπων εξάπλωσης. * Η υπόθεση του μοριακού ρολογιού έχει γίνει αντικείμενο έντονων αντιπαραθέσεων. Πολλοί εξελικτικοί βιολόγοι επιχειρηματολογούν ενάντια στην υπόθεση, επειδή η εισήγηση του σταθερού ρυθμού δεν φαίνεται να ταιριάζει με τον ακανόνιστο ρυθμό εξέλιξης σε μορφολογικό και φυσιολογικό επίπεδο (π.χ. Kimura 1969, Goodman 1981). Αν και η θεωρία του σταθερού ρυθμού εξέλιξης έχει υποστεί έντονη κριτική και εξακολουθεί ακόμα και σήμερα να αποτελεί ένα από τα πλέον αμφιλεγόμενα θέματα της μοριακής εξέλιξης, έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα στην εκτίμηση του χρόνου απόσχισης γενεαλογικών γραμμών, αλλά και στην κατασκευή φυλογενετικών δέντρων. 18

25 Εισαγωγή Κεφάλαιο 2: Εισαγωγή Ο οργανισμός μελέτης, Typhlops vermicularis 19

26 Εισαγωγή 2.1 Η αξία των ερπετών «Ως ομάδα οργανισμών, τα ερπετά δεν είναι ούτε καλά ούτε κακά : είναι ενδιαφέροντα και ασυνήθιστα, αν και μικρής σπουδαιότητας. Αν ποτέ εξαφανιστούν, δεν θα υπάρξει σημαντική αλλαγή με τον έναν ή με τον άλλον τρόπο» (Zim & Smith 1953). Ευτυχώς η άποψη αυτή δεν υποστηρίζεται σήμερα, καθώς οι περισσότεροι επιστήμονες αναγνωρίζουν πλέον τα ερπετά ως σημαντικό και αναπόσπαστο κομμάτι των φυσικών οικοσυστημάτων και «αγγελιαφόρους» της περιβαλλοντικής ποιότητας (Gibbons & Stangel 1999). Τελευταία, με την αυξανόμενη γνώση και ευαισθητοποίηση γύρω από τα περιβαλλοντικά ζητήματα, επιστήμονες και κοινό άρχισαν να ενδιαφέρονται για την οικολογική αξία των ερπετών και των ενδιαιτημάτων τους, πιθανότατα εξαιτίας της καλύτερης κατανόησης των κινδύνων που πλέον απειλούν την ποικιλότητα των ερπετών και ολόκληρη τη βιοποικιλότητα (Kellert & Wilson, 1993). Τα ερπετά πλήττονται άμεσα από τις ανθρώπινες δραστηριότητες (Gibbons et al. 2000). Οι κυριότεροι παράγοντες που συντελούν στη φθίνουσα πορεία της αφθονίας και εξάπλωσής τους είναι η υποβάθμιση και καταστροφή των ενδιαιτημάτων τους, η εισαγωγή ξενικών ειδών, η περιβαλλοντική ρύπανση και οι παγκόσμιες κλιματικές αλλαγές που επηρεάζουν τα ενδιαιτήματά τους (Poiani & Johnson 1991, Guertin et al. 1997, Still et al. 1999). Μπορεί, επομένως, να γίνει κατανοητό για ποιους λόγους τα τελευταία χρόνια επιχειρείται πιο εντατικά η καταγραφή και διεξοδική μελέτη των ερπετών και της ποικιλότητάς τους. Εξάλλου, τα ερπετά αποτελούν άριστο υλικό για μελέτες φυλογεωγραφικών και εξελικτικών διαδικασιών, λόγω της περιορισμένης ικανότητας διασποράς και της θερμοκρασιακής «εξάρτησής» τους, που τα καθιστούν ευαίσθητους δείκτες παλαιοκλιματικών, παλαιοοικολογικών και παλαιογεωγραφικών γεγονότων. Ιδιαίτερης ερευνητικής αξίας είναι τα εδαφόβια ερπετά, που λόγω του τρόπου διαβίωσης τους έχουν ακόμα μικρότερες ικανότητες διασποράς και είναι ιδιαιτέρως ευαίσθητα στις οικολογικές και περιβαλλοντικές παραμέτρους (Lenk et al. 1999). Στην παρούσα διατριβή ο οργανισμός μελέτης είναι ένα εδαφόβιο ερπετό, και μάλιστα ένα φίδι, το Typhlops vermicularis Merrem, Πριν αναφερθούν κάποια στοιχεία για το είδος αυτό, θα γίνει μια σύντομη επισκόπηση της οικογένειας στην οποία ανήκει (Typhlopidae), αλλά και της υπόταξης των φιδιών (Ophidia), αναφορικά με την εξέλιξη και τη βιογεωγραφία τους. 20

27 Εισαγωγή 2.2 Εξέλιξη και βιογεωγραφία των φιδιών Τα φίδια αποτελούν μια από τις πιο επιτυχημένες ομάδες ερπετών με περίπου 3378 αναγνωρισμένα είδη (Uetz et al. 2011) και διαβιούν σε όλες τις ηπείρους, με εξαίρεση την Ανταρκτική, και σε πολύ διαφορετικά ενδιαιτήματα. Τα φίδια χαρακτηρίζονται από επιμήκη, άποδη μορφή σώματος, αλλά αυτός ο μορφότυπος παρατηρείται και σε άλλους αντιπροσώπους των Φολιδωτών (π.χ. στις σαύρες των οικογενειών Scincidae και Anguidae). Παρόλα αυτά, τα φίδια παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλία μορφών και μεγεθών, που αντικατοπτρίζει την ηθολογική, οικολογική και φυσιολογική τους ποικιλότητα. Ως ομάδα, τα φίδια είναι σαρκοφάγα και συχνά η διατροφή τους είναι πολύ εξειδικευμένη. Όλα τα αρτίγονα είδη φιδιών ανήκουν στην υπόταξη Serpentes. Παρόλα αυτά, μερικές φορές αναφέρεται ότι ανήκουν στην υπόταξη Ophidia, που συμπεριλαμβάνει και εξαφανισμένα είδη τα οποία δεν συγκαταλέγονται στα Serpentes. Στην Εικόνα 2.1 περιγράφεται σχηματικά μια απλοποιημένη μορφή της ταξινόμησης των Serpentes (Rieppel 1988) και στην Εικόνα 2.2 φαίνονται φωτογραφίες χαρακτηριστικών αντιπροσώπων. Η υπόταξη Serpentes υποδιαιρείται σε δύο ανθυποτάξεις: τα Scolecophidia (σκουληκόφιδα ή τυφλά φίδια) και τα Alethinophidia (αληθινά, γνήσια φίδια). Τα Scolecophidia περιλαμβάνουν τρεις οικογένειες μικρών φιδιών, εξειδικευμένων στην υπόγεια διαβίωση. Τα Alethinophidia περιλαμβάνουν όλα τα υπόλοιπα φίδια και υποδιαιρούνται στα Anilioidea και τα Macrostomata. Εικόνα 2.1. Σχηματική αναπαράσταση της βασικής ταξινόμησης μέσα στην υπόταξη Serpentes (Rieppel 1988). 21

28 Εισαγωγή Εικόνα 2.2. Αντιπρόσωποι των ομάδων (A) Scolecophidia (Ramphotyphlops australis), (B) Anilioidea (Anilius scytale), (Γ) Booidea (Eryx jaculus) και (Δ) Caenophidia (Malpolon insignitus). Τα εδαφόβια Scolecophidia είναι μικρού μεγέθους φίδια με περιορισμένο άνοιγμα στόματος, που τρέφονται με μικρά ασπόνδυλα σε πολύ συχνή βάση. Τα Αlethinophidia, είναι οικολογικά πιο ποικίλα και τα περισσότερα είδη τρέφονται με μεγαλύτερα θηράματα, κυρίως σπονδυλωτά, σε λιγότερο συχνή βάση (Greene 1997, Cundall & Greene 2000). Σύμφωνα με τις περισσότερες μορφολογικές μελέτες, ένα χαρακτηριστικό εξελικτικό πρότυπο μεταξύ των αρτίγονων φιδιών είναι η αύξηση του στοματικού ανοίγματος, από τα εδαφόβια Scolecophidia και τα εδαφόβια Αlethinophidia στα Μacrostomata (Cundall & Greene 2000). Φυλογενετικές μελέτες, βασισμένες σε αναλύσεις πυρηνικών δεικτών (Vidal et al. 2009) (Εικόνα 2.3), έχουν δείξει ότι τα φίδια πιθανότατα προέρχονται από την υπερήπειρο της Gondwana. Πιο συγκεκριμένα, η αρχική εξέλιξη των φιδιών φαίνεται ότι πραγματοποιήθηκε στη δυτική Gondwana (σημερινή νότια Αμερική και Αφρική) που αποχωρίστηκε από την ανατολική Gondwana (σημερινή Ανταρκτική, Μαδαγασκάρη, Ινδία και Αυστραλία) περίπου πριν από 150 εκατομμύρια χρόνια (Ali & Aitchison 2008) (η παλαιογεωγραφική εξέλιξη της Gondwana περιγράφεται στις Εικόνες 2.4, από Α έως Ζ, στο τέλος αυτού του κεφαλαίου). Η αρχική διαφοροποίηση μεταξύ των αρτίγονων κλάδων των φιδιών έγινε στο ανώτερο Ιουρασικό μεταξύ 140 και 160 εκατομμυρίων ετών (Εικόνα 2.3, Εικόνα 2.4 Α και Β). Εξάλλου, ο διαχωρισμός της ομάδας Aniliidae/Tropidophiidae (νότια Αμερική) και των υπόλοιπων Alethinophidia εκτιμάται ότι πραγματοποιήθηκε πριν 106 (97 116) 22

29 Εισαγωγή εκατομμύρια έτη (Εικόνα 2.3), εξαιτίας του βικαριανιστικού γεγονότος του αποχωρισμού της νότιας Αμερικής από την Αφρική, και της δημιουργίας του Ατλαντικού Ωκεανού στο μέσο Κρητιδικό (Vidal et al. 2007, 2009) (Εικόνες 2.4 Γ και Δ). Εικόνα 2.3. Χρονόγραμμα που απεικονίζει τις φυλογενετικές σχέσεις των αρτίγονων οικογενειών των φιδιών, καθώς και τις χρονικές περιόδους κατά τις οποίες πραγματοποιήθηκαν τα βασικότερα εξελικτικά βήματα (Vidal et al. 2009). 2.2 Scolecophidia Από τις δύο μεγάλες κατηγορίες των φιδιών, τα Scolecophidia* είναι τα λιγότερο μελετημένα σε ότι αφορά τη βιοποικιλότητα τους (π.χ. αριθμός ειδών), τη φυλογένεση τους, τη βιογεωγραφία τους και την οικολογία τους (Greene 1997). Εξαπλώνονται σε όλες τις ηπείρους εκτός της Ανταρκτικής, αλλά τα περισσότερα είδη 23

30 Εισαγωγή διαβιούν στο νότιο ημισφαίριο και σε νησιά των τροπικών περιοχών (Uetz et al. 2011). Τα Scolecophidia περιλαμβάνουν περίπου 400 είδη που, μέχρι πρόσφατα, διαιρούνταν σε τρεις οικογένειες: Anomalepididae (περίπου 18 είδη), Leptotyphlopidae (περίπου 114 είδη) και Typhlopidae (περίπου 336 είδη) (Adalsteinsson et al. 2009, Vidal et al. 2010, Uetz et al. 2011). Και οι τρεις οικογένειες βρίσκονται στην κεντρική και νότια Αμερική (τροπικές περιοχές), με τα Αnomalepididae να περιορίζονται εκεί (Εικόνα 2.5Α). Τα Leptotyphlopidae εξαπλώνονται επιπλέον στην Αφρική, την Αραβική Χερσόνησο και την νοτιοδυτική Ασία (Εικόνα 2.5Β), ενώ τα Typhlopidae έχουν ακόμα μεγαλύτερη γεωγραφική κατανομή, καθώς εξαπλώνονται στην Αφρική, τη Μαδαγασκάρη, τη νοτιοανατολική Ασία, την Αυστραλία και τη νοτιοανατολική Ευρώπη (νότια Βαλκανική Χερσόνησος) (Εικόνα 2.5Γ) (Adalsteinsson et al. 2009, Vitt & Caldwell 2009). Αξίζει να σημειωθεί ότι, παρότι τα χερσαία σπονδυλωτά είναι σε γενικές γραμμές ιδιαιτέρως μελετημένα, για τα Scolecophidia μόνο τρεις μελέτες που αφορούν στη φυλογένεση τους έχουν πραγματοποιηθεί. Η πρώτη είναι μια διδακτορική διατριβή που βασίστηκε σε δεδομένα μορφολογίας, και κυρίως εσωτερικής ανατομίας (Wallach 1998). Οι δύο επόμενες μελέτες πραγματοποιήθηκαν πολύ πρόσφατα, όταν η εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής είχε ήδη ξεκινήσει. Πρόκειται για μια φυλογενετική προσέγγιση των Leptotyphlopidae με τη χρήση μιτοχονδριακών και πυρηνικών δεικτών (Adalsteinsson et al. 2009), καθώς και για μια μελέτη προσδιορισμού των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των Typhlopidae, με την ανάλυση πυρηνικών δεικτών (Vidal et al. 2010). Όπως και τα φίδια ως ομάδα, έτσι και τα Scolecophidia έχουν προέλευση από την Gondwana (Vidal et al. 2009). Τόσο τα Leptotyphlopidae όσο και τα Αnomalepididae προέρχονται από τη δυτική Gondwana (Adalsteinsson et al. 2009). * Scolecophidia Περιλαμβάνουν τα μικρότερα σε μέγεθος φίδια, που πολύ σπάνια ξεπερνούν σε μήκος τα 30 εκατοστά (Hedges 2008). Τα περισσότερα είδη έχουν υποπλασμένα μάτια, περιορισμένη φολίδωση στο κεφάλι, κυλινδρικό σώμα με λείες φολίδες και είναι χρώματος ροζ ή καφετί. Πολύ συχνά αναγνωρίζονται λανθασμένα ως σκώληκες. Είναι εδαφόβιοι οργανισμοί και η παρουσία τους συνήθως συσχετίζεται με υπόγειες φωλιές κοινωνικών εντόμων (τερμίτες, μυρμήγκια), τα οποία, μαζί με τις προνύμφες τους αποτελούν την τροφή αυτών των φιδιών (Cundall & Greene 2000). Παρόλα αυτά, σπανίως έχουν βρεθεί ακόμα και σε δέντρα, προφανώς έχοντας ακολουθήσει κάποιο μονοπάτι τερμιτών ή μυρηγκιών. Γνωρίζουμε ελάχιστα για τη βιολογία και την αναπαραγωγή τους, κυρίως λόγω του κρυπτικού τρόπου διαβίωσης τους. 24

31 Εισαγωγή 2.4 Typhlopidae Η οικογένεια Typhlopidae περιλαμβάνει είδη, τα οποία διαβιούν σε μια ποικιλία ενδιαιτημάτων, από περιβάλλοντα τροπικού δάσους έως και σε περιοχές που μπορούν να χαρακτηριστούν ακόμα και ως έρημοι. Οι Vidal et al. (2010) έδειξαν ότι η οικογένεια Typhlopidae περιλαμβάνει τρεις εξελικτικούς κλάδους με πολύ υψηλή στατιστική υποστήριξη και με πολύ υψηλές τιμές γενετικής διαφοροποίησης μεταξύ τους (και μάλιστα μεγαλύτερες από αυτές μεταξύ των υπόλοιπων οικογενειών των αρτίγονων φιδιών) (Εικόνα 2.6). Για τους λόγους αυτούς, οι ίδιοι ερευνητές απέδωσαν ταξινομικό καθεστώς οικογένειας σε αυτούς τους τρεις κλάδους: (α) οικογένεια Gerrhopilidae (γένος Gerrhopilus, 15 είδη / ΝΑ Ασία και νησιά) (β) οικογένεια Xenotyphlopidae (γένος Xenotyphlops, δύο είδη / Μαδαγασκάρη) (γ) οικογένεια Typhlopidae (όλα τα υπόλοιπα γένη και είδη) Οι τρεις αυτές οικογένειες πλέον περιλαμβάνονται στην υπεροικογένεια Typhlopoidea. Από την ίδια μελέτη φαίνεται ότι τα Leptotyphlopidae και τα Typhlopoidea πρέπει να διαχωρίστηκαν εξελικτικά πριν από περίπου εκατομμύρια χρόνια, εξαιτίας του γεωλογικού αποχωρισμού δυτικής και ανατολικής Gondwana (Ali & Aitchison 2008) (Εικόνα 2.4Α και Β). Τα Typhlopoidea έχουν προέλευση από την ανατολική Gondwana, αφού οι βασικοί εξωτερικοί κλάδοι τους έχουν κατανομή στην παλαιοήπειρο της Indigascar (Ινδία και Μαδαγασκάρη) και κατά συνέπεια, η γεωλογική διάσπαση της Indigascar σε Ινδία και Μαδαγασκάρη (Εικόνα 2.4Ε) οδήγησε στους εξελικτικούς κλάδους των Gerrhopilidae και Xenotyphlopidae, αντιστοίχως. Typhlopidae Εικόνα 2.5. Η γεωγραφική εξάπλωση των τριών οικογενειών της υπόταξης Scolecophidia (Vitt & Caldwell 2009). Anomalepididae Leptotyphlopidae 25

32 Εισαγωγή Εικόνα 2.6. Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των μελών της οικογένειας Typhlopidae, όπως προέκυψε από την ανάλυση πέντε πυρηνικών δεικτών (Vidal et al., 2010) 26

33 Εισαγωγή Η νέα οικογένεια των Typhlopidae (sensu stricto) περιλαμβάνει τέσσερεις βασικούς κλάδους (Εικόνα 2.7): (α) Τον αφρικανικό κλάδο (β) Τον κλάδο της Μαδαγασκάρης (εκτός των Xenotyphlopidae) (γ) Τον κλάδο της νότιας Αμερικής (δ) Τον ευρασιατικό/αυστραλιανό κλάδο. Η διάσπαση σε αυτούς τους κλάδους πρέπει να πραγματοποιήθηκε εκατομμύρια χρόνια πριν, λίγο μετά τις μαζικές εξαφανίσεις ειδών κατά το τέλος του Κρητιδικού (Εικόνα 2.4 ΣΤ και Ζ). Σε εκείνη την περίοδο, η στάθμη της θάλασσας ήταν χαμηλότερη από τη σημερινή, με αποτέλεσμα τη δημιουργία χερσαίων συνδέσεων (Smith et al. 1994, Miller et al. 2005), που επέτρεπαν τη μετακίνηση οργανισμών μεταξύ ηπείρων και νησιών, τόσο μέσω χερσαίων γεφυρών όσο και με πλωτά μέσα (π.χ. κορμοί δέντρων) (Vidal et al. 2010). Ο κλάδος της Ευρασίας, που περιλαμβάνει και τα είδη της Αυστραλίας, πρέπει να προήλθε από κάποιο γεγονός διασποράς από την Gondwana προς τα βόρεια είτε (α) από την Αφρική προς την Ευρώπη και Ασία (Laurasia), είτε (β) από την Ινδία (Gheerbrant & Rage 2006, Ali & Aitchison 2008, Vidal et al. 2009). Εξάλλου, οι Vidal et al. (2010) συμπεραίνουν ότι τα Typhlopidae έφτασαν στη Νότια Αμερική με παθητική διασπορά από την Αφρική, διασχίζοντας τον Ατλαντικό Ωκεανό, όπως έχει συμβεί και για άλλους ζωικούς οργανισμούς, με τη βοήθεια θαλάσσιων ρευμάτων δυτικής κατεύθυνσης (Vidal et al. 2008, Adalsteinsson et al. 2009). Τέτοια «ταξίδια» πιστεύεται ότι θα διαρκούσαν κατά μέγιστο έξι μήνες (Houle 1999), γεγονός όχι ακατόρθωτο για σπονδυλωτά χαμηλών τροφικών αναγκών, που πιθανότατα «ταξίδευαν» μαζί με την τροφή τους (τερμίτες, μυρμήγκια σε κορμούς δέντρων). Με αντίστοιχο τρόπο τα Typhlopidae έφτασαν στην Αυστραλία από την νοτιοανατολική Ασία ή Ινδονησία. 27

34 Εισαγωγή Εικόνα 2.7. Οι τέσσερεις φυλογενετικοί κλάδοι της οικογένειας Typhlopidae, όπως αποτυπώνονται στο χρονόγραμμα των Vidal et al. (2010). 28

35 Εισαγωγή 2.5 Typhlops vermicularis (Merrem, 1820)* Κοινή ονομασία: Greek / Eurasian blindsnake, ανήλιαστος, σκουληκόφιδο, τυφλίτης (Εικόνα 2.8). Terra Typica: Ελληνικά νησιά (Mertens & Müller 1928). Εικόνα 2.8. Χαρακτηριστικός αντιπρόσωπος του T. vermicularis (Φωτογραφία: Φίλιππος Κατσιγιάννης). Εικόνα 2.9. Η γεωγραφική εξάπλωση του T. vermicularis (Zug et al. 2001). Γεωγραφική εξάπλωση: Η περιοχή εξάπλωσης του T. vermicularis (Εικόνα 2.9) περιλαμβάνει τη Βαλκανική Χερσόνησο (Ελλάδα, Αλβανία, Σερβία, Μαυροβούνιο, Βοσνία/Ερζεγοβίνη, Κροατία, FYROM), τη Μέση ανατολή (Τουρκία, Συρία, 29

36 Εισαγωγή Ιορδανία, Λίβανος, Ισραήλ), την Κύπρο, το Ιράκ, το Ιράν, την Αρμενία, τη Γεωργία, την κεντρική Ασία (Τουρκμενιστάν, Ουζμπεκιστάν, Τατζικιστάν, Αφγανιστάν) και τη βόρεια Αίγυπτο (δέλτα του Νείλου και βόρειο Sïnai) (Wallach 2002, Baha El Din 2006). * Typhlops vermicularis Πρόκειται για μικρο σκωληκόμορφο φίδι με μήκος σώματος από 14 έως 76 εκατοστά. Το κεφάλι καλύπτεται από μεγάλες φολίδες. Τα μάτια είναι έντονα υποπλασμένα. Η διάμετρος το σώματος είναι 20 με 90 φορές μικρότερη από το μήκος. Οι κοιλιακές φολίδες δεν διαφέρουν από τις ραχιαίες. Η ουρά έχει μικρό μήκος και στο άκρο της υπάρχει μια μυτερή άκανθα. Ο χρωματισμός ποικίλει από ανοιχτό καφέ ή ροζ, μέχρι σκούρο γκρί ή καφέ. Είναι ωοτόκο και τα θηλυκά γεννούν 2-10 επιμήκη αυγά (Ananjeva et al. 2006). Ενδιαίτημα και οικολογία: Το εδαφόβιο αυτό φίδι βρίσκεται συνήθως σε ανοιχτές περιοχές με χαμηλή βλάστηση και κάποια σχετική υγρασία, όπως σε λιβάδια και πλαγιές λόφων. Μπορεί να το βρει κανείς κάτω από πέτρες ή μέσα σε φωλιές τερμιτών ή μυρμηγκιών. Σπανίως μπορεί να βρεθεί στην επιφάνεια του εδάφους, κυρίως μετά από έντονη βροχόπτωση. Κατά τη διάρκεια της ξηράς περιόδου μετακινείται σε βαθύτερα και πιο υγρά στρώματα του εδάφους. Μπορεί να βρεθεί σε υψόμετρα από 0 έως 2000 μέτρα. Το είδος αυτό επιδεικνύει συμπεριφορά συνάθροισης (aggregation), είτε για λόγους αναπαραγωγής είτε, πιθανότερα, για διατήρηση της υγρασίας του (Disi 2002). Διατήρηση Είναι γενικά ένα κοινό είδος. Δεν χαρακτηρίζεται ως απειλούμενο, τουλάχιστον στο μεγαλύτερο μέρος της γεωγραφικής κατανομής του. Παρόλα αυτά, πλέον, σε ορισμένες περιοχές απειλείται εξαιτίας της καταστροφής των ενδιαιτημάτων του, κυρίως λόγω της εντατικής καλλιέργειας της γης και άλλων ανθρώπινων δραστηριοτήτων. Το T. vermicularis συγκαταλέγεται στο Παράρτημα III της Συνθήκης της Βέρνης, «περί της διατήρησης της ευρωπαϊκής άγριας ζωής και των φυσικών βιοτόπων», ενώ πολλές από τις περιοχές στις οποίες ζει είναι προστατευόμενες. Η IUCN (International Union for the Conservation of the Nature) το χαρακτηρίζει ως «Ελάχιστου Ενδιαφέροντος» (Least Concern - LC), κυρίως λόγω της ευρείας εξάπλωσής του, της ανοχής του σε μεγάλης κλίμακας διαφορετικές 30

37 Εισαγωγή συνθήκες διαβίωσης, του πιθανού μεγάλου μεγέθους των πληθυσμών του, και κυρίως της μάλλον μικρής πιθανότητας οι πληθυσμοί του να αρχίζουν να μειώνονται τόσο γρήγορα ώστε να μπορεί να θεωρηθεί ως σοβαρά απειλούμενο είδος μέσα στα επόμενα χρόνια. Σύμφωνα με την IUCN, ενώ έχουν ληφθεί διάφορα μέτρα για την προστασία του (που στηρίζονται σε εθνική και διεθνή νομοθεσία προστασίας συγκεκριμένων περιοχών), υπάρχει μεγάλη έλλειψη σε ερευνητικές ενέργειες που να αποσκοπούν κυρίως στη μελέτη της βιολογίας και οικολογίας του, αλλά και της εκτίμησης της αφθονίας και της γεωγραφικής του εξάπλωσης (Lymberakis et al. 2004). Απολιθώματα Τα απολιθώματα επιβεβαιώνουν την παρουσία του είδους αυτού, ή την παρουσία άλλων συγγενικών Scolecophidia, σε πολλά μέρη της Ευρώπης στο παρελθόν. Συγκεκριμένα, έχουν βρεθεί κατά το Ηώκαινο (56-34 εκατ. χρόνια) (Rage 1984), αλλά απουσιάζουν από όλο σχεδόν το Ολιγόκαινο (34-23 εκατ. χρόνια), πιθανότατα εξαιτίας δραματικών κλιματικών αλλαγών που μετέτρεψαν τροπικά δάση σε ανοιχτά περιβάλλοντα σε παγκόσμια κλίμακα (Badiola et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Τα Scolecophidia επανεμφανίζονται στο παλαιοντολογικό αρχείο κατά το τέλος του Ολιγοκαίνου, ενώ κατά το Μειόκαινο (23-5,3 εκατ. χρόνια) εξαπλώνονται από τη δυτική έως την ανατολική Ευρώπη (Szyndlar 1991). Κατά το Πλειόκαινο (5,3-2,6 εκατ. χρόνια) περιορίζονται στα νότια, από την Ισπανία έως την Ελλάδα (Szyndlar 1991). Τα απολιθώματα των Scolecophidia είναι κυρίως σπόνδυλοι, που έχουν ομοιογενή μορφολογία σε ολόκληρη την ομάδα, οπότε η αναγνώριση ακόμα και των οικογενειών είναι σχεδόν αδύνατη. Παρόλα αυτά, ο Szyndlar (1991), θεωρεί ότι τα πιο πρόσφατα απολιθώματα από την Ουκρανία (Ύστερο Μειόκαινο), την ηπειρωτική Ελλάδα (Ύστερο Πλειόκαινο και Μέσο Πλειστόκαινο) και από το νησί της Ρόδου (Πρώιμο Πλειόκαινο) δεν διαφέρουν ούτε μεταξύ τους ούτε με το μοναδικό ευρωπαϊκό αρτίγονο είδος, το T. vermicularis. Σύμφωνα με τον συγγραφέα, είναι πολύ πιθανό αυτά τα απολιθώματα να ανήκουν στο T. vermicularis ή σε ένα πολύ συγγενικό τάξο. Φυλογένεση και βιογεωγραφία Με βάση την εξωτερική μορφολογία και την ανατομία τους, τα είδη T. vermicularis και T. etheridgei (είδος που περιγράφηκε πρόσφατα από τη δυτική Μαυριτανία και τη βορειοδυτική Αφρική), σχηματίζουν το βασικό (εξωτερικό) κλάδο 31

38 Εισαγωγή μιας ομάδας που περιλαμβάνει όλους τους αφρικανικούς αντιπροσώπους των Typhlopidae (Wallach 2002). Εκτός από κάποια άτομα του T. vermicularis που βρέθηκαν στο δέλτα του Νείλου, το γένος Typhlops εξαπλώνεται μόνο στην υπο- Σαχάρια Αφρική (Wallach 2002). Ο Wallach (2002) προτείνει ότι το T. vermicularis ή ένας πολύ συγγενικός του πρόγονος, είχε μια μεγαλύτερη κατανομή στο παρελθόν, καλύπτοντας μεγάλο μέρος της σημερινής Ευρώπης και ότι δευτερογενώς μετανάστευσε στην Αφρική μέσω του Γιβραλτάρ κατά τη διάρκεια της κρίσης αλατότητας του Μεσσηνίου (5,33-5,96 εκατ. χρόνια). Μια εναλλακτική πρόταση του ίδιου ερευνητή προϋποθέτει ότι οι πρόγονοι του έζησαν στην Gondwana, οπότε η μετανάστευση συνέβη αντίστροφα, από την Αφρική στη δυτική Ευρώπη κατά την κρίσης αλατότητας του Μεσσηνίου. Στη δεύτερη περίπτωση, το T. vermicularis είναι απόγονος της εξελικτικής γραμμής του T. etheridgei και τα ευρωπαϊκά απολιθώματα των Scolecophidia μεγαλύτερης ηλικίας (δηλαδή πριν την κρίση αλατότητας του Μεσσηνίου) δεν ανήκουν, σε καμία περίπτωση, στο T. vermicularis. Όπως προέκυψε από την ανάλυση πυρηνικών γενετικών δεικτών (Εικόνα 2.7), το T. vermicularis βρίσκεται στη βάση του Ευρασιατικού κλάδου, ως ο πιο προγονικός υποκλάδος που διαχωρίστηκε εξελικτικά από τα υπόλοιπα ασιατικά είδη περίπου 57.9 εκατομμύρια χρόνια πριν (Vidal et al. 2010), παρότι μορφολογικά είναι πιο κοντά στα αφρικανικά Typhlopidae (Wallach 2002). 32

39 Εισαγωγή Δυτική Gondwana Ανατολική Gondwana A. Μέσο Ιουρασικό (170 εκατ. χρόνια) Δυτική Gondwana Ανατολική Gondwana B. Ύστερο Ιουρασικό (150 εκατ. χρόνια) Νότια Αμερική Αφρική Indigascar Γ. Πρώιμο Κρητιδικό (120 εκατ. χρόνια) Αυστραλία 33

40 Εισαγωγή Νότια Αμερική Αφρική Indigascar Δ. Ύστερο Κρητιδικό (105 εκατ. χρόνια) Αυστραλία Αφρική Ινδία Νότια Αμερική Ε. Ύστερο Κρητιδικό (90 εκατ. χρόνια) Μαδαγασκάρη Αυστραλία ΣΤ. Όριο μεταξυ Κρητιδικού και Τριτογενούς (65 εκατ. χρόνια) Νότια Αμερική Αφρική Μαδαγασκάρη Ινδία Αυστραλία 34

41 Εισαγωγή Αφρική Ινδία Νότια Αμερική Μαδαγασκάρη Ζ. Ηώκαινο (50 εκατ. χρόνια) Αυστραλία Εικόνα 2.4. Παλαιογεωγραφικοί χάρτες που απεικονίζουν τη γεωλογική ιστορία της Γης σε επτά «στιγμιότυπα» (Blakey 2011). 35

42 Εισαγωγή Κεφάλαιο 3: Εισαγωγή Η περιοχή μελέτης, ανατολική Μεσόγειος 36

43 Εισαγωγή 3.1 Παλαιογεωγραφία Η γεωγραφική κατανομή του T. vermicularis, δηλαδή η ευρύτερη περιοχή της ανατολικής Μεσογείου που περιλαμβάνει τη Βαλκανική Χερσόνησο, τη Μικρά Ασία, την κεντρική Ασία και τη Μέση Ανατολή, έχει μια πολύπλοκη γεωλογική ιστορία που επηρέασε σε μεγάλο βαθμό την εξέλιξη και τη βιογεωγραφία πολλών οργανισμών. Ιδιαίτερα για τα ερπετά και τα αμφίβια, έχουν γίνει πολλές μελέτες με την ανάλυση μοριακών δεικτών, οι οποίες έχουν υποδείξει την παλαιογεωγραφία της ανατολικής Μεσογείου ως τον παράγοντα που καθόρισε σε μεγάλο βαθμό τη φυλογεωγραφία αυτών των οργανισμών (π.χ. Plötner et al. 2001, Stöck et al. 2006, Fritz et al. 2007, Kapli et al. 2008, Kyriazi et al. 2008, Akın et al. 2010, Gvoždik et al. 2010β, Requero et al. 2012). Σε αυτήν την ενότητα παρουσιάζεται συνοπτικά η παλαιογεωγραφική εξέλιξη της περιοχής, με έμφαση στα γεγονότα που επηρέασαν την κατανομή και τη γεωγραφική διαφοροποίηση των οργανισμών. Οι γεωλογικές και παλαιοντολογικές πληροφορίες που υπάρχουν, μας παρέχουν μια γενική εικόνα της παλαιογεωγραφίας της περιοχής από το Ηώκαινο μέχρι σήμερα, αλλά δεν είναι επαρκείς ώστε να γνωρίζουμε με βεβαιότητα τις λεπτομέρειες στις συνδέσεις μεταξύ χερσαίων τμημάτων κατά τις διαδοχικές γεωλογικές περιόδους. Μέχρι σήμερα έχουν δημοσιευτεί αρκετοί παλαιογεωγραφικοί χάρτες για την περιοχή, οι οποίοι αναπαραστούν όσο το δυνατόν ακριβέστερα τη γεωγραφία του χώρου κατά το παρελθόν (Rögl 1999, Popov et al. 2004). Συνοπτικά, η παλαιογεωγραφική εξέλιξη της περιοχής περιγράφεται στο κεφάλαιο αυτό με μια σειρά παλαιογεωγραφικών χαρτών, όπως αυτοί έχουν κατά καιρούς δημοσιευτεί (Rögl 1999, Popov et al. 2004) ή με κάποιες τροποποιήσεις για τις ανάγκες αυτής της παρουσίασης (Εικόνες 3.1 έως 3.6). Η παλαιογεωγραφική ιστορία της περιοχής συσχετίζεται κυρίως με την προς τον βορρά κίνηση της αφρικανικής πλάκας προς τη δυτική Ευρασία κατά το Τεταρτογενές (Rögl 1999 και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Εξαιτίας της θέσης της, η ανατολική Μεσόγειος έδρασε κατά το παρελθόν τόσο ως «γέφυρα», όσο και ως φραγμός στη διασπορά των ειδών μεταξύ της Ασίας, της Ευρώπης και της Αφρικής, μέσω κυρίως της Μέσης Ανατολής. Με άλλα λόγια, σε άλλες περιόδους λειτούργησε ως φυσικό «μονοπάτι» για τη γεωγραφική εξάπλωση των ειδών, και σε άλλες αποτέλεσε βικαριανιστικό παράγοντα (Tchernov 1992). Η μακριά 37

44 Εισαγωγή παλαιογεωγραφική ιστορία είναι άμεσα συνυφασμένη με αυτήν των Θαλασσών της Τηθύος και της Παρατηθύος. Κατά το Παλαιόκαινο, η περιοχή που εξετάζεται ήταν ένα αρχιπέλαγος νησιών, σχεδόν εντελώς υποβυθισμένο κάτω από την Τηθύ (Εικόνα 3.1Α). Στο όριο μεταξύ Ηωκαίνου Ολιγοκαίνου (περίπου 34 εκατ. χρόνια πριν), αρχίζει ο σχηματισμός της Παρατηθύος (Εικόνες 3.1Β και Γ). Από το σημείο αυτό και μετά, τεκτονικά φαινόμενα είχαν σαν αποτέλεσμα τη σύνδεση και αποσύνδεση διαφόρων χερσαίων μαζών, γεγονότα που έπαιξαν σημαντικό ρόλο στη γεωγραφική κατανομή χερσαίων ζωικών οργανισμών, αλλά και στην εξέλιξή τους (δεδομένα από Rögl 1999, Koufos et al. 2005). Παρακάτω παρουσιάζονται αναλυτικότερα αυτά τα γεγονότα. Ύστερο Ηώκαινο Πρώιμο Ολιγόκαινο (περίπου εκατ. χρόνια πριν) (Εικόνα 3.1 Α, Β, Γ) Ο σχηματισμός της απομονωμένης Παρατηθύος ξεκίνησε περίπου στο όριο Ηωκαίνου - Ολιγοκαίνου (Baldi 1980). Από εκεί και πέρα, έντονη τεκτονική δραστηριότητα άλλαξε τη γεωμορφολογία της Ευρασίας. Η συνεχής κίνηση των ηπείρων, η διάσπαση της υπερηπείρου της Πανγαίας και η κίνηση της Ινδίας και της Αυστραλίας προς βορρά, έφεραν το τέλος της περιόδου του Ωκεανού της Τηθύος. Οι αλλαγές στη συσχέτιση χερσαίων και θαλάσσιων περιοχών αλλάζει τα πρότυπα των ωκεάνιων ρευμάτων, το κλίμα και τις πανιδικές ανταλλαγές σε όλες τις ηπείρους και στη θάλασσα. Μέχρι το τέλος του Ηωκαίνου, η Τηθύς είχε σχεδόν εξαφανιστεί. Το ακραίο δυτικό τμήμα της, δημιούργησε τη Μεσόγειο θάλασσα. Η Ευρώπη τότε αποτελούσε ένα αρχιπέλαγος και η ανταλλαγή πανιδικών στοιχείων μεταξύ Ασίας και Ευρώπης ήταν σχεδόν αδύνατη. Η Τηθύς τελικά εξαφανίστηκε με τη σύγκρουση της Ινδίας με την Ασία, ενώ η Παρατηθύς απομονώθηκε από τη Μεσόγειο. Ευρώπη Ασία Α. Ύστερο Ηώκαινο (33,9 37,2 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999) Αφρική Τυθής Ινδικός Ωκ. 38

45 Εισαγωγή Ευρώπη Παρατυθής Ασία Β. Πρώιμο Ολιγόκαινο (33,9 30 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Τυθής Αφρική Ινδικός Ωκ. Γ. Πρώιμο Ολιγόκαινο (30-28,4 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Ευρώπη Παρατυθής Ασία Τυθής (Μεσόγειος) Αφρική Ινδικός Ωκ. Εικόνα 3.1. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Ύστερο Ηώκαινο και Πρώιμο Ολιγόκαινο. Πρώιμο Μειόκαινο (περίπου εκατ. χρόνια πριν) (Εικόνα 3.2 Α, Β, Γ) Δύο θαλάσσιες δίοδοι σχηματίστηκαν τόσο μεταξύ του Ινδικού Ωκεανού και της θαλάσσιας λεκάνης βόρεια του Καυκάσου, όσο και μεταξύ του Ινδικού Ωκεανού και της Μεσογείου. Επίσης, ακόμα μια τέτοια δίοδος, κάπου στη σημερινή περιοχή της Θράκης, απέκοψε την Ανατολία και στα δυτικά. Η τεκτονική δραστηριότητα 39

46 Εισαγωγή αυξήθηκε στη Μεσόγειο. Αυτοί οι γεωλογικοί συσχετισμοί συνεχίστηκαν περίπου αμετάβλητοι μέχρι και το Πρώιμο Βουρδιγάλιο. Η αριστερόστροφη περιστροφή της Αφρικής και της Αραβίας είχαν ως αποτέλεσμα τη σύγκρουση τους με την πλάκα της Ανατολίας, κατά το Ύστερο Βουρδιγάλιο. Για πρώτη φορά η Μεσόγειος Θάλασσα αποκόπηκε από τον Ινδικό Ωκεανό. Μια χερσαία γέφυρα συνέδεε πλέον την Αφρική με την Ευρασία και επέτρεπε μια αξιοσημείωτη ανταλλαγή πανιδικών στοιχείων, και κυρίως θηλαστικών, όπως το Gomphotherium από το οποίο πήρε και το όνομα της η γέφυρα αυτή. Ευρώπη Παρατυθής Ασία Α. Πρώιμο Μειόκαινο (Ακουιτάνιο) (23-20,4 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. Ευρώπη Παρατυθής Ασία Β. Πρώιμο Μειόκαινο (Πρώιμο Βουρδιγάλιο) (20,4 18 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. 40

47 Εισαγωγή Ευρώπη Ασία Παρατυθής Γ. Πρώιμο Μειόκαινο (Ύστερο Βουρδιγάλιο) (18 16 εκάτ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. Εικόνα 3.2. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Πρώιμο Μειόκαινο. Μέσο Μειόκαινο (περίπου 16-11,6 εκατ. χρόνια πριν) (Εικόνα 3.3 Α, Β, Γ, Δ) Ένας θαλάσσιος φραγμός δημιουργήθηκε μεταξύ Αραβίας και νότιας Ανατολίας και ένα παρόμοιο γεγονός συνέβη στην ανατολική Ανατολία (Gelati 1975). Αυτοί οι φραγμοί διατηρήθηκαν για πολύ λίγο. Στην αρχή του Σερραβάλλιου πραγματοποιήθηκε μια ξαφνική πτώση της θαλάσσιας στάθμης (Haq et al. 1988) και συγχρόνως τεκτονικές κινήσεις απέκοψαν ξανά τη Μεσόγειο από τον Ινδικό Ωκεανό, επανασχηματίζοντας τη χερσαία γέφυρα μεταξύ Αφρικής και Ευρασίας. Από το Πρώιμο Σερραβάλλιο, διακόπηκε το ωκεάνιο ρεύμα μεταξύ Ινδικού και Ατλαντικού Ωκεανού, οδηγώντας σε μια παγκόσμια πτώση της θερμοκρασίας (Flower & Kennett 1993). Λίγο αργότερα, επίσης στο Πρώιμο Σερραβάλλιο, η Ανατολία αποκόπηκε και πάλι στα ανατολικά, ενώ στο Μέσο Σερραβάλλιο ένας νέος, μικρότερος, θαλάσσιος φραγμός στην περιοχή της σημερινής κοιλάδας του Ευφράτη απέκοψε την επικοινωνία μεταξύ της Αιγαιίδος (η ενιαία ξηρά που αποτελούνταν σε γενικές γραμμές από την Ανατολία, το Αιγαίο και τη νότια Βαλκανική Χερσόνησο) και της Ασίας (Chepalyga 1995). 41

48 Εισαγωγή Ευρώπη Παρατυθής Ασία Α. Μέσο Μειόκαινο (Λάγγιο) (16,0-13,7 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. Ευρώπη Μεσόγειος Παρατυθής Ασία Β. Μέσο Μειόκαινο (Πρώιμο Σερραβάλλιο) (13,7 13 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Αφρική Ινδικός Ωκ. 42

49 Εισαγωγή Ευρώπη Παρατυθής Ασία Γ. Μέσο Μειόκαινο (Πρώιμο Σερραβάλλιο) (13,7 13 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. Ευρώπη Παρατυθής Ασία Δ. Μέσο Μειόκαινο (Μέσο Σερραβάλλιο) 13 12,3 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999). Μεσόγειος Αφρική Ινδικός Ωκ. Εικόνα 3.3. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Μέσο Μειόκαινο. 43

50 Εισαγωγή Ύστερο Μειόκαινο (περίπου 11,6-5,3 εκατ. χρόνια πριν) (Εικόνες 3.4 Α, Β και 3.5 Α, Β) Στο Ύστερο Σερραβάλλιο - Πρώιμο Τορτόνιο (Μέσο με Ύστερο Μειόκαινο), η θάλασσα άρχισε να εισχωρεί στο χώρο μεταξύ της σημερινής Κρήτης και της Κάσου-Καρπάθου προς τον βορρά, έως την περιοχή του βόρειου Αιγαίου, εξαιτίας της βύθισης της ελληνικής ζώνης (Le Pichon & Angelier 1981, Meulenkamp et al. 1985). Η διαδικασία αυτή συνεχίστηκε μέχρι τα τέλη του Μειοκαίνου και τις αρχές του Πλειοκαίνου, ωθώντας τα νότια τμήματα της Αιγαιίδας και το ηφαιστειακό τόξο του Νoτίου Αιγαίου προς το νότο, ενώ ταυτόχρονα σχημάτισε το φράγμα του Αιγαίου. Ταυτόχρονα, σύμφωνα με κάποιες απόψεις (Popov et al. 2004), στο Ύστερο Σερραβάλλιο - Πρώιμο Τορτόνιο ένα θαλάσσιο φράγμα πιθανώς απέκοψε την Αφρική από την Ασία, περίπου στη σημερινή περιοχή της κοιλάδας του Ευφράτη (Εικόνα 3.4 Β). Ευρώπη Παρατυθής Α. Ύστερο Μειόκαινο (Τορτόνιο) (11,6 7,2 εκατ. χρόνια) (Rögl 1999) Μεσόγειος Ασία Αφρική Ινδικός Ωκ. Μεσόγειος Αφρική Ευρώπη Παρατυθής Ασία Β. Ύστερο Μειόκαινο (Σερραβάλλιο / Τορτόνιο) (12 11 εκατ. χρόνια) (Popov et al. 2004). Εικόνα 3.4. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Ύστερο Μειόκαινο. 44

51 Εισαγωγή Στο τέλος του Μειοκαίνου (6-5,5 εκατ. χρόνια πριν) συνέβησαν δύο άλλα σημαντικά γεγονότα που άλλαξαν την εξέλιξη της περιοχής. Η Αραβική μικροπλάκα συγκρούστηκε με την πλάκα της Ανατολίας, η οποία άρχισε να κινείται προς τα δυτικά με ταχύτητα 25mm/yr (Doglioni et al. 2002). Στα δυτικά, τα στενά του Γιβραλτάρ έκλεισαν, εξαιτίας της σύγκρουσης της Αφρικανικής πλάκας με την Ευρασιατική, προκαλώντας την κρίση αλατότητας της Μεσογείου κατά το Μεσσήνιο (Krijgsman et al., 2010 και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Η κρίση αλατότητας του Μεσσηνίου (Messinian Salinity Crisis - MSC) ( εκατ. χρόνια πριν) είναι ένα γεωλογικό γεγονός που επηρέασε την εξελικτική και βιογεωγραφική ιστορία πολλών οργανισμών της περιοχής γύρω από τη Μεσόγειο. Ευρώπη Παρατυθής Ασία Α. Ύστερο Μειόκαινο (Τορτόνιο) (8,5-7 εκατ. χρόνια) (Popov et al. 2004). Αφρική Μεσόγειος Ευρώπη Παρατυθής Ασία Β. Ύστερο Μειόκαινο (Μεσσήνιο) (6,1 5,7 εκατ. χρόνια) (Popov et al. 2004). Αφρική Μεσόγειος Εικόνα 3.5. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Ύστερο Μειόκαινο. 45

52 Εισαγωγή Πλειόκαινο - Πλειστόκαινο (περίπου 5,3 εκατ. χρόνια χρόνια πριν) (Εικόνα 3.6) Η έναρξη του Πλειοκαίνου σηματοδοτείται από την αποκατάσταση των θαλάσσιων συνθηκών σε ολόκληρη τη Μεσόγειο. Κατά τη διάρκεια του Πλειοκαίνου και εξαιτίας των έντονων τεκτονικών φαινομένων, η περιοχή του Αιγαίου κατακερματίζεται και αλλάζει σημαντικά ως προς της γεωγραφία της (Kuss 1975, Daams & Van der Weerd 1980, Meulenkamp, 1985, Dermitzakis 1989). Στο Πλειστόκαινο, οι βασικές αιτίες αλλαγής της γεωγραφίας της περιοχής ήταν ο ευστατισμός και ο τεκτονισμός. Οι ευστατικές κινήσεις, που ήταν αποτέλεσμα των παγετωδών και μεσοπαγετωδών περιόδων, προκαλούσαν επέκταση ή μείωση των χερσαίων περιοχών και μεταβολή των μεταξύ τους χερσαίων συνδέσεων. Οκτώ τέτοιοι κύκλοι παρατηρήθηκαν καθόλη τη διάρκεια του Πλειστοκαίνου σύμφωνα με τους Beard et al. (1982), η τελευταία εκ των οποίων, η Βούρμιος παγετώδης περίοδος, ξεκίνησε πριν από χρόνια και ολοκληρώθηκε πριν από χρόνια. Κατά τη διάρκεια του μέγιστου των παγετώδων περιόδων η στάθμη της θάλασσας ήταν 200 μέτρα χαμηλότερα από σήμερα (Beerli et al. 1996). Πρέπει να σημειωθεί ότι όλοι οι παλαιογεωγραφικοί χάρτες που παρουσιάζονται, στηρίζονται στη σημερινή γεωγραφία του χώρου, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι η θέση των περιοχών αυτών ήταν ίδια τότε και σήμερα (Meulankamp et al. 1994, Kreemer & Chamot-Rooke 2004). Ευρώπη Ασία Παρατυθής Πλειόκαινο και Πλειστόκαινο (1,8-3,4 εκατ. χρόνια) (Popov et al. 2004). Αφρική Μεσόγειος Εικόνα 3.6. Αναπαράσταση της γεωγραφίας της ανατολικής Μεσογείου κατά το Πλειόκαινο και Πλειστόκαινο. 46

53 Εισαγωγή 3.2 Ανάγλυφο Η συνεχής κίνηση της Αφρικανικής πλάκας προς το βορρά είχε ως αποτέλεσμα την έντονη ορογένεση που παρήγαγε μια ποικίλη γεωμορφολογία, με μεγάλες οροσειρές (Άλπεις, Δειναρίδες, Ελληνίδες και τα βουνά του Ταύρου) και πολυάριθμα νησιά. Ένας άλλος γεωλογικός παράγοντας που είχε σημαντική επίδραση στη βιοποικιλότητα της ανατολικής Μεσογείου ήταν η συστηματική αύξηση του τοπογραφικού ανάγλυφου κατά τον Υστερο Καινοζωικό, ως συνέπεια της επίδρασης του κλίματος στον ρυθμό των επιφανειακών διαδικασιών, όπως η διάβρωση (Westaway et al. 2009). 3.3 Παλαιοκλίμα Οι έντονες κλιματικές αλλαγές έπαιξαν πολύ σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της εξελικτικής και βιογεωγραφικής ιστορίας των οργανισμών της περιοχής μελέτης, καθώς κλιματικές περιοδικές μεταβολές μεταξύ υγρών και ξηρών συνθηκών προκάλεσαν επανειλημμένες αλλαγές σε ενδιαιτήματα και σε βιοκοινότητες (Prentice & Jolly 2000, Douady et al. 2003). Το Ύστερο Νεογενές αποτελεί μια σημαντική περίοδο της κλιματικής ιστορίας της Γης. Σε αυτό το διάστημα παρατηρείται μεγάλη επέκταση ξηρών ζωνών και αντικατάσταση δασών από λιβάδια, ιδιαίτερα στα μέσα γεωγραφικά πλάτη (Crowley & North 1991, Potts & Behrensmeyer 1992). Τα αίτια αυτού του παγκόσμιου φαινομένου «ερημοποίησης» (aridification) δεν είναι πλήρως κατανοητά, αλλά σε γενικές γραμμές πιστεύεται ότι το φαινόμενο αυτό συνδέεται με μια παγκόσμια κλιματική τάση προς χαμηλότερες θερμοκρασίες, αφού η ατμοσφαιρική υγρασία μειώνεται όσο μειώνεται η ατμοσφαιρική θερμοκρασία. Οι μεταβάσεις σε πιο ψυχρές και σε πιο ξηρές συνθήκες πραγματοποιούνται σχεδόν πάντα παράλληλα, με μερικές εξαιρέσεις που σχετίζονται με την παλαιοτοπογραφία και τη θέση των ηπείρων. Κατά το Ύστερο Μειόκαινο (11,6-5,3 εκατ. χρόνια πριν), παρατηρείται μια έντονη τάση προς πιο ξηρές καταστάσεις και ανοιχτά περιβάλλοντα. Σε αυτό το χρονικό διάστημα έχουν καταγραφεί δύο «περιστατικά» απότομης μετάβασης προς πιο ψυχρές (και ξηρές) συνθήκες, περίπου στα 10 και στα 5,5 εκατομμύρια χρόνια πριν. Παρόλα αυτά, τα δύο πιο σημαντικά «ψυχρά περιστατικά» του Ύστερου 47

54 Εισαγωγή Καινοζωικού έγιναν λίγο νωρίτερα και λίγο αργότερα, στα 14 και στα 2,5 εκατομμύρια χρόνια πριν (Frakes et al. 1992, Zachos et al. 2001, van Dam 2006). Τα τελευταία 3 εκατομμύρια χρόνια έχουν καταγραφεί περίπου 30 παγετώδεις περίοδοι, κατά τη διάρκεια των οποίων οι πάγοι κάλυπταν το μεγαλύτερο μέρος της Βόρειας Αμερικής και της Ευρασίας (van Andel 1994). Αν και οι σημερινές περιοχές που έχουν μεσογειακό κλίμα δεν καλύφθηκαν από πάγους, η μέση θερμοκρασία τους μειώθηκε από 2 έως 7 ο C (Dallman 1998). Οι περιοχές της ανατολικής Μεσογείου και της κεντρικής Ασίας διαδραμάτισαν ένα σημαντικό ρόλο ως καταφύγια βιοποικιλότητας κατά τους παγετώδεις κύκλους του Τεταρτογενούς. Περιοχές με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά γεωμορφολογίας, που διατηρούσαν ιδιαίτερο και ευνοϊκό, για κάποιους οργανισμούς, μικροκλίμα, συντηρούσαν κατά τις παγετώδεις περιόδους πληθυσμούς οι οποίοι μετακινούνταν από εκεί κατά τις μεσοπαγετώδεις περιόδους (Hewitt 2001). Αυτά τα χαρακτηριστικά καθιστούν την ανατολική Μεσόγειο μια περιοχή υψηλής βιοποικιλότητας που έπαιξε έναν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση και στην δημιουργία της ποικιλότητας σε φυτά και ζώα. 3.4 Η ανθρώπινη παρουσία Ένας σημαντικός παράγοντας που επηρέασε τη διαμόρφωση των οικοσυστημάτων της Μεσογείου, είναι η παρουσία του ανθρώπου (Μυλωνάς 2001, Blondel et al. 2010). Η ιστορία της περιοχής της Μεσογείου είναι μια ιστορία αλληλεπίδρασης πολιτισμών και ανθρώπων. Η Μεσόγειος αποτέλεσε έναν από τους σημαντικότερους δρόμους μετακίνησης, εμπορίου και πολιτισμικών ανταλλαγών μεταξύ διαφορετικών λαών. Η ιστορία της είναι σημαντική για την κατανόηση τόσο των πολιτισμών της Μεσοποταμίας, της Αιγύπτου, της Περσίας, των Φοινίκων, της Ελλάδας, των Αράβων, των Ρωμαίων, αλλά και του δυτικού πολιτισμού όπως τον ξέρουμε σήμερα. Η Μεσόγειος θάλασσα προσέφερε μια οδό που ένωνε διαφορετικά κέντρα με δεσμούς εμπορίου, δημιουργίας αποικιών και πολύ συχνά πολέμου, και καθόρισε τον τρόπο ζωής των Μεσογειακών λαών. Εκτός, όμως, από τον τρόπο που η Μεσόγειος επηρέασε και καθόρισε τη ζωή του μεσογειακού ανθρώπου, και ο άνθρωπος με τη σειρά του επηρέασε σε σημαντικό βαθμό το μεσογειακό τοπίο και τη ζωή σε αυτό. 48

55 Εισαγωγή Τα μεσογειακά οικοσυστήματα έχουν δεχθεί μεγάλη πίεση από τον ανθρώπινο παράγοντα. Συνοπτικά, οι άνθρωποι της Μεσογείου, πριν από τους ιστορικούς χρόνους, παρενέβησαν στα διάφορα οικοσυστήματα με τις λεγόμενες διαχρονικές επιδράσεις, όπως το κυνήγι, τη γεωργία, την κτηνοτροφία, την αποψίλωση δασών, συχνά και με τη χρήση φωτιάς, και την ενεργητική ή παθητική μεταφορά αριθμού φυτικών ή ζωικών ειδών (Μυλωνάς 2001). Πολύ συχνά συναντάται σε περιοχές της Μεσογείου το φαινόμενο του εποικισμού από είδη που καλούνται ανθρωπόφιλα ή συνάνθρωπα είδη. Πρόκειται για είδη που προϋπάρχουν στις συγκεκριμένες περιοχές και που η παρουσία του ανθρώπου ευνοεί την αύξηση του πληθυσμού τους ή για είδη που φτάνουν εκεί με τη βοήθεια του ανθρώπου (Μυλωνάς 2001). Η τεράστια εμπορική δραστηριότητα στη Μεσόγειο και η μεταφορά αγαθών μεταξύ εμπορικών κέντρων τα τελευταία 3000 χρόνια, αποτέλεσαν συχνά αιτία για τη μεταφορά ειδών σε περιοχές που δεν υπήρχαν πριν. Άλλες φορές, συγκεκριμένα είδη, που είχαν εμπορική σημασία, μεταφέρονταν εκούσια. 49

56 Εισαγωγή Κεφάλαιο 4: Σκοπός & ερωτήματα της διατριβής 50

57 Εισαγωγή 4.1 Σκοπός και ερωτήματα της διατριβής Στη παρούσα διατριβή εξετάζεται για πρώτη φορά η ενδοειδική φυλογένεση του είδους T. vermicularis. Συγκεκριμένα, σκοπός της διατριβής είναι να αποσαφηνιστούν οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των πληθυσμών του εξεταζόμενου είδους, από ολόκληρη την περιοχή εξάπλωσης του, με τη χρήση μοριακών δεικτών του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA. Από τα αποτελέσματα αυτής της ανάλυσης, και σε συνδυασμό με άλλες αναλύσεις επεξεργασίας μοριακών και γενετικών δεδομένων, θα προσεγγιστούν βασικά ερωτήματα που αφορούν τόσο στη φυλογένεση και βιογεωγραφία του είδους, όσο και στις διεργασίες που καθόρισαν ή επηρέασαν την εξελικτική και βιογεωγραφική ιστορία των ζωικών οργανισμών της ανατολικής Μεσογείου. Τα βασικά ερωτήματα στα οποία φιλοδοξεί να απαντήσει η παρούσα διατριβή είναι: (1) Βιοποικιλότητα: Μπορεί η διερεύνηση της φυλογενετικής δομής του είδους να αποκαλύψει κρυπτικές εξελικτικές γραμμές; Σε μια τέτοια περίπτωση, ποιά είναι τα συμπεράσματα που μπορεί να προκύψουν για την κατάσταση διατήρησης του είδους και τη συστηματική του; (2) Βιογεωγραφία: Μπορεί να εξηγηθεί η σύγχρονη γεωγραφική κατανομή του είδους και να προταθεί ένα βιογεωγραφικό σενάριο; Πώς επέδρασαν οι παράγοντες του βικαριανισμού και της διασποράς στη βιογεωγραφική ιστορία του; Μπορούν να χρονολογηθούν τα βασικά φυλογενετικά γεγονότα και να συνδυαστούν με τη γνώση της παλαιογεωγραφικής και παλαιοκλιματικής ιστορίας της περιοχής μελέτης; Υπάρχουν γεωγραφικές περιοχές που έπαιξαν σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της γενετικής ποικιλότητας του; Παράλληλα, τα αποτελέσματα και συμπεράσματα της παρούσας διατριβής θα συνδυαστούν με αυτά άλλων αντίστοιχων μελετών, κυρίως, ερπετών και αμφιβίων της ίδιας περιοχής μελέτης, προκειμένου να εξαχθούν συμπεράσματα γύρω από τους παράγοντες που έπαιξαν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της βιοποικιλότητας τους στην ανατολική Μεσόγειο. 51

58 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο 5: Υλικά και Μέθοδοι 52

59 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι 5.1. Συλλογή δειγμάτων Η επιλογή των δειγμάτων έγινε με τέτοιο τρόπο ώστε να καλυφθεί όσον το δυνατόν καλύτερα η περιοχή μελέτης, αλλά και να αντιπροσωπευθεί με τον καλύτερο δυνατό τρόπο η ενδοπληθυσμιακή και διαπληθυσμιακή γενετική ποικιλότητα του εξεταζόμενου είδους. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν βρίσκονται κατατεθειμένα σε διάφορες μουσειακές συλλογές (Παράρτημα Ι) ή συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής ( ). Εξάλλου, στις τελικές αναλύσεις συμπεριλήφθηκαν και αλληλουχίες από τη βάση μοριακών δεδομένων (GenBank) του διαδικτύου (NCBI - National Center of Biotechnology Information) ( που χρησιμοποιήθηκαν ως εξωομάδες. Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν και οι πληροφορίες που τα αφορούν εμφανίζονται στο Παράρτημα Ι. Στον Πίνακα 5.1 φαίνεται συγκεντρωτικά ο αριθμός των δειγμάτων, η ευρύτερη περιοχή προέλευσής τους και ο αριθμός των δειγμάτων από τα οποία τελικά ήταν εφικτό να πολλαπλασιαστούν οι μοριακοί δείκτες, και συνεπώς συμπεριλήφθηκαν στις μοριακές αναλύσεις. Στην Εικόνα 5.1 φαίνεται η γεωγραφική εξάπλωση του T. vermicularis και οι περιοχές δειγματοληψίας. Η συλλογή πραγματοποιήθηκε την άνοιξη (Απρίλιος - Μάιος) οπότε τα ζώα μπορούν να βρεθούν κάτω από πέτρες, καθώς κατά τη θερινή και χειμερινή περίοδο υποχωρούν σε βαθύτερα στρώματα του εδάφους, καθιστώντας σχεδόν αδύνατη τη σύλληψή τους (Arnold 2003). Μετά τη θανάτωσή τους (με ψύξη), συντηρήθηκαν σε αιθανόλη 95%, σε γυάλινα δοχεία, αφού πρώτα είχε ληφθεί ιστός (για την εξαγωγή του ολικού γονιδιώματος) που συντηρήθηκε στους -80 o C Πειραματική πορεία Η τυπική πειραματική διαδικασία που ακολουθεί μετά τη συλλογή των δειγμάτων, περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: Επεξεργασία των ιστών και εξαγωγή ολικού γονιδιωματικού DNA Πολλαπλασιασμός των τμημάτων-στόχων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Καθαρισμός του προϊόντος της PCR Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (Sequencing) 53

60 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 5.1. Οι περιοχές συλλογής και ο αριθμός των δειγμάτων του T. vermicularis που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη. Περιοχή Αριθμός δειγμάτων Αριθμός δειγμάτων που περιλαμβάνονται στις μοριακές αναλύσεις Ηπειρωτική Ελλάδα Νησιά 9 7 Ελλάδα (ΣΥΝΟΛΟ) Κύπρος 4 4 Συρία 6 5 Ιορδανία 2 2 Τουρκία Ιράν 60 7 Γεωργία 2 2 Αρμενία 6 6 Αζερμπαϊτζάν 4 1 ΣΥΝΟΛΟ Επεξεργασία των ιστών και εξαγωγή ολικού γονιδιωματικού DNA Όπως αναφέρθηκε, οι ιστοί των δειγμάτων που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης συντηρήθηκαν σε κατάψυξη -80 ο C. Τα μουσειακά δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συντηρήθηκαν είτε σε 95% αιθανόλη, είτε σε 70% αιθανόλη και. Τα δύο παραπάνω μέσα συντήρησης, δηλαδή η χρήση αλκοόλης και φορμόλης*, έκαναν αναγκαία μια προεργασία των ιστών πριν την εξαγωγή του DNA. Συγκεκριμένα, τα τμήματα των ιστών (βάρους ~ 20 mg) επωάστηκαν σε 800 μl διαλύματος TE9 (500 mm Tris, 20 mm EDTA, 10 mm NaCl, ph 9.0) καθόλη τη διάρκεια της νύχτας σε θερμοκρασία δωματίου και με συνεχή ανακίνηση. Κατά τη διάρκεια της επόμενης μέρας, γινόταν αντικατάσταση του διαλύματος κάθε 2-3 ώρες ενώ τα δείγματα βρίσκονταν σε συνεχή ανακίνηση. Τέλος, ακολουθούσε νέα επώαση για μία ακόμα νύχτα. Αυτή η διαδικασία έκπλυσης είναι πολύ αποτελεσματική στην αφαίρεση της αιθανόλης και της φορμόλης (Shiozawa et al. 1992, Chakraborty et al. 2006) * Αιθανόλη και φορμόλη Η αιθανόλη και η φορμόλη χρησιμοποιούνται ευρύτατα ως συντηρητικά μέσα για μουσειακά δείγματα. Η φορμόλη βοηθά στη συντήρηση των μορφολογικών στοιχείων των δειγμάτων (χρώμα, σχήμα κλπ) ενώ η αιθανόλη, μέσω της αφυδάτωσης που προκαλεί στους ιστούς, αποτρέπει την υδρόλυση και καταστροφή του DNA. Παρόλα αυτά, και οι δύο ουσίες λειτουργούν ως αναστολείς των ενζύμων, που ενώ είναι θετικό στοιχείο για τη συντήρηση των δειγμάτων, εμποδίζει τις ακόλουθες πειραματικές διαδικασίες που απαιτούν χρήση ενζύμων (πρωτεϊνάση, πολυμεράση). Για αυτό το λόγο η απομάκρυνση τους θεωρείται πολύ σημαντική. 54

61 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι 55

62 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 5.1. (A) Η γεωγραφική κατανομή του T. vermicularis (βλέπε Εισαγωγή). (B) Οι περιοχές προέλευσης των δειγμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διδακτορική διατριβή. Οι περιοχές δειγματοληψίας από την Ελλάδα και την Τουρκία φαίνονται σε χωριστά πλαίσια. Οι αριθμοί αφορούν τους κωδικούς των δειγμάτων, όπως αναγράφονται στο Παράρτημα Ι. Η εξαγωγή του ολικού γονιδιωματικού DNA έγινε με τη χρήση σειράς αντιδραστηρίων (kit) (NucleoSpin Tissue) της εταιρείας MACHEREY NAGEL, με κάποιες τροποποιήσεις. Συγκεκριμένα, ο ιστός επωαζόταν, για 6 ώρες, σε διάλυμα εξαγωγής (extraction buffer), που περιέχει κάποια απορρυπαντική ουσία, και στο οποίο έχει προστεθεί μικρή ποσότητα (20 μl) πρωτεϊνάσης Κ (10mg/ml). Στη φάση αυτή, η συνδυασμένη δράση του απορρυπαντικού και της πρωτεϊνάσης Κ προκαλεί ρήξη των μεμβρανών και των εσωτερικών δομών των κυττάρων. Μετά τις πρώτες 3 ώρες ακολουθούσε προσθήκη νέας ποσότητας (20 μl) πρωτεϊνάσης Κ, ώστε να ενισχυθεί η διάσπαση των συμπλόκων που σχηματίζονται ανάμεσα στη φορμόλη και τις πρωτεΐνες. Το προϊόν της λύσης επωαζόταν στους 90 C για 1 ώρα, αφού η θέρμανση σε διάλυμα αλκαλικού ph (όπως είναι το συγκεκριμένο διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε) φαίνεται να βελτιώνει την απόδοση της απομόνωσης του DNA από ιστούς που έχουν συντηρηθεί σε φορμόλη, ενισχύοντας τη διάσπαση των συμπλόκων (Shi et al. 2002). Στη συνέχεια, ακολουθούσε η διαδικασία εξαγωγής του DNA, όπως περιγράφεται στο αναλυτικό πρωτόκολλο του kit. H εφαρμοζόμενη μέθοδος στηρίζεται στη δέσμευση του DNA σε μεμβράνη πυριτίου και στην ακόλουθη απελευθέρωσή του με τη βοήθεια διαλύματος κατάλληλης ιοντικής ισχύος, προκειμένου να εξαχθεί η μεγαλύτερη δυνατή ποσότητα ολικού DNA στη μεγαλύτερη δυνατή συγκέντρωση. Ο έλεγχος της απόδοσης της εξαγωγής του DNA γινόταν χρησιμοποιώντας 3 μl από το τελικό διάλυμα για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% σε διάλυμα TBE 1 Χ, που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο (1g/dl). Η ηλεκτροφόρηση διαρκούσε 45 min σε τάση 90 Volt. Από τη φωτογραφία που λαμβανόταν (Εικόνα 5.2), με έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως, γινόταν η εκτίμηση της ποσότητας και της ποιότητας του DNA. Ανεξάρτητα από την ποιότητα και την ποσότητα του DNA, όλα τα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν στις επόμενες φάσεις της πειραματικής πορείας. 56

63 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 5.2. Φωτογραφία ατομικών δειγμάτων DNA μετά από ηλεκτροφόρησή τους σε πήκτωμα αγαρόζης και έκθεση σε υπεριώδες φως. Πολλαπλασιασμός των τμημάτων-στόχων του DNA μέσω της PCR Εξαιτίας της αποικοδόμησης του DNA, λόγω της συντήρησης πολλών δειγμάτων του T. vermicularis σε (η περιεκτικότητα 30% σε νερό για μεγάλο χρονικό διάστημα οδηγεί σε υδρόλυση των δεσμών), έκαναν υποχρεωτική την επιλογή μοριακών δεικτών σχετικά μικρού μήκους (<500 bp). Οι μοριακοί δείκτες που επιλέχθηκαν για την προσέγγιση των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των πληθυσμών του T. vermicularis, είναι: το γονίδιο του μιτοχονδριακού DNA (mtdna) που κωδικοποιεί τη 2 η υπομονάδα του ενζύμου NADH, ή αλλιώς ND2 (Εικόνα 5.3). Το γονίδιο αυτό επιλέχθηκε κυρίως γιατί έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα σε άλλες φυλογενετικές αναλύσεις ερπετών και αμφιβίων και αποτελεί ένα από τα σχετικά ταχέως εξελισσόμενα γονίδια του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. το γονίδιο του mtdna της μικρής ριβοσωμικής υπομονάδας 12S rrna, ή αλλιώς 12S (Εικόνα 5.3). Το γονίδιο αυτό επιλέχθηκε γιατί επίσης έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα σε άλλες φυλογενετικές αναλύσεις ερπετών και αμφιβίων και αποτελεί ένα από τα σχετικά βραδύτερα εξελισσόμενα γονίδια του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. το γονίδιο του πυρηνικού DNA (ndna) του υποδοχέα της προλακτίνης (prolactin receptor), ή αλλιώς PRLR. Ο δείκτης αυτός έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε πρόσφατες φυλογενετικές και φυλογεωγραφικές μελέτες ερπετών (Gvoždik et al. 2010α, Breitman et al. 2011, Stanley et al. 2011). Σύμφωνα με τους Townsend et al. (2008), αυτός ο δείκτης είναι ο πιο πολυμορφικός πυρηνικός δείκτης που κωδικοποιεί πρωτεΐνη, σε σχέση με όλους τους υπόλοιπους αντίστοιχους δείκτες που έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι τώρα σε Φολιδωτά. Αυτό το χαρακτηριστικό του τον κάνει πολύ πληροφοριακό σε φυλογενετικές μελέτες σε ενδοειδικό επίπεδο. 57

64 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Προκειμένου να πολλαπλασιαστούν οι συγκεκριμένοι μοριακοί δείκτες, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR), μια ενζυμική μέθοδος ενίσχυσης συγκεκριμένης ακολουθίας DNA, in vitro. Με τη διαδικασία αυτή μπορεί, μέσα σε λίγες ώρες, να παραχθεί ένας πολύ μεγάλος αριθμός αντιγράφων της επιθυμητής ακολουθίας DNA, με τη χρησιμοποίηση ειδικών ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών (primers) και της ειδικής θερμοάντοχης πολυμεράσης (Taq) του DNA. Οι δύο εκκινητές υβριδίζουν σε συμπληρωματικές θέσεις των δύο αλυσίδων στα άκρα του υπό ενίσχυση τμήματος DNA. Εικόνα 5.3. Σχηματική αναπαράσταση του κυκλικού μορίου του μιτοχονδριακού DNA των φιδιών, όπου φαίνονται οι θέσεις των γενετικών τόπων. Διακρίνονται τα γονίδια ND2 και 12S (Dong & Kumazawa 2005). Η διαδικασία της PCR ξεκινά με ένα στάδιο αρχικής αποδιάταξης (διάρκειας 5 min), ενώ ακολουθούν επαναλαμβανόμενοι κύκλοι αποδιάταξης (denaturation), υβριδοποίησης (annealing) και επιμήκυνσης (extension). Για τον πολλαπλασιασμό των μοριακών δεικτών που επιλέχθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν συγκεκριμένα ζεύγη εκκινητών, που έχουν στο παρελθόν χρησιμοποιηθεί για αντίστοιχες μελέτες ερπετών. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και το μέγεθος του προϊόντος που παράγουν δίνονται στον Πίνακα 5.2. Οι ακριβείς συνθήκες της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) που εφαρμόστηκαν για τον πολλαπλασιασμό των γονιδίων στόχων, δίνονται στον Πίνακα

65 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Η απόδοση της αντίδρασης PCR ελεγχόταν και πάλι χρησιμοποιώντας 1 μl από το τελικό προϊόν για ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγορόζης όπως και στην περίπτωση της εξαγωγής (ίδιες συγκεντρώσεις, χρόνος και τάση ρεύματος). Από τη φωτογραφία που λαμβανόταν (Εικόνα 5.4), με έκθεση του πηκτώματος σε υπεριώδες φως, γινόταν εκτίμηση της πραγματοποίησης ή μη της αντίδρασης, του μήκους του προϊόντος που πολλαπλασιάστηκε, της ποσότητας και της ποιότητας (καθαρότητα) του πολλαπλασιασμένου προϊόντος, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί στα επόμενα βήματα της πειραματικής πορείας. Πίνακας 5.2. Τα γονίδια στόχοι που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή, οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν, το μέγεθος των προϊόντων τους και η πηγή προέλευσής τους. Γονίδιο- Στόχος ND2 Όνομα εκκινητή rnd2-5l rnd2-2h Αλληλουχία εκκινητή TTACCCWCGAGCAACWGAAGC ATTGATGAGWAKGCTATRATTTTTCG Μέγεθος προϊόντος ~ 390 bp Βιβλιογραφική αναφορά Kumazawa & Endo S 12SaL 12SbH AAAAAGCTTCAAACTGGGATTAGATACCCCACTAT TGACTGCAGAGGGTGACGGGCGGTGTGT ~ 400 bp Köcher et al PRLR PRLR_f1 PRLR_r3 GACARYGARGACCAGCAACTRATGCC GACYTTGTGRACTTCYACRTAATCCAT ~ 580 bp Townsend et al Πίνακας 5.3. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR που εφαρμόστηκαν για τον πολλαπλασιασμό των γονιδίων-στόχων. Γονίδιο-Στόχος ND2 12S PRLR Συνθήκες Στάδιο Θ ο C Χρόνος (sec) Αποδιάταξη Υβριδοποίηση Επιμήκυνση Αποδιάταξη Υβριδοποίηση Επιμήκυνση Αποδιάταξη Υβριδοποίηση Επιμήκυνση Συγκέντρωση MgCl 2 (mm) 1,5 2,0 3,0 59

66 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 5.4. Φωτογραφία ατομικών δειγμάτων που προέκυψαν από την αντίδραση της PCR, μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και έκθεση σε υπεριώδες φως. Καθαρισμός του προϊόντος της PCR Προκειμένου το προϊόν της PCR να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, είναι απαραίτητο να απομακρυνθεί από αυτό η περίσσεια των εκκινητών, των νουκλεοτιδίων και της πολυμεράσης. Ο καθαρισμός των προϊόντων της PCR έγινε με τη μέθοδο της δέσμευσης και αποδέσμευσης του DNA σε μεμβράνη πυριτίου, χρησιμοποιώντας σειρά αντιδραστηρίων (NucleoSpin Extract II) της εταιρείας MACHEREY NAGEL, και ακολουθώντας το πρωτόκολλο που προτείνουν οι κατασκευαστές για καθαρισμό προϊόντων από πήκτωμα αγαρόζης. Ακολουθούσε νέα ηλεκτροφόρηση (βλ. πιο πάνω) προκειμένου να γίνει εκτίμηση της συγκέντρωσης του τελικού προϊόντος της PCR. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) Ο προσδιορισμός των αλληλουχιών έγινε από την εταιρεία VBC Biotech (Αυστρία) σε αυτοματοποιημένη συσκευή προσδιορισμού νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (ABI PRISM 3100 capillary sequencer), με κατάλληλη επεξεργασία των προϊόντων της PCR. Συγκεκριμένα, με μια διαδικασία γνωστή ως cycle sequencing, το προϊόν της PCR υπόκειται σε μια παραλλαγή της αντίδρασης PCR με χρήση εξειδικευμένης Taq πολυμεράσης (Big Dye), χρωματισμένων νουκλεοτιδίων και των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση της PCR. Με τη διαδικασία αυτή αντικαθίστανται τα νουκλεοτίδια της αλληλουχίας από «χρωματισμένα», που μπορούν να «διαβαστούν» από τη συσκευή, μετά την ηλεκτροφόρηση του προϊόντος της PCR σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. 60

67 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι 5.3 Στοίχιση και αρχική επεξεργασία των αλληλουχιών Μετά τη διαδικασία του προσδιορισμού των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (Εικόνα 5.5), έγινε επεξεργασία τους με ειδικά λογισμικά προγράμματα προκειμένου να επιτευχθεί η στοίχισή τους (alignment). Η στοίχιση αποσκοπεί στον προσδιορισμό των ομόλογων θέσεων των αλληλουχιών, αφού με βάση τις διαφορές σε αυτές τις θέσεις υπολογίζονται οι εξελικτικές σχέσεις των υπό μελέτη αλληλουχιών. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα ClustalX v (Larkin et al. 2007). Οι διορθώσεις, όπου ήταν απαραίτητο, έγιναν «με το μάτι». Οι φυλογενετικές και λοιπές αναλύσεις της παρούσας διατριβής δεν πραγματοποιήθηκαν για κάθε έναν μιτοχονδριακό δείκτη ξεχωριστά. Οι λόγοι για αυτήν την επιλογή ήταν: (α) Οι γενετικοί τόποι του μιτοχονδριακού DNA είναι συνδεδεμένοι (κληρονομούνται μαζί ως τμήματα του ίδιου μορίου DNA) συνεπώς μπορούν να θεωρηθούν ως ένας ενιαίος δείκτης. (β) Κάθε ένας από τους δείκτες είχε σχετικά μικρό μήκος ( 400 bp) και δεν περιείχε αρκετή φυλογενετική πληροφορία από μόνος του ώστε η ανεξάρτητη ανάλυση των μιτοχονδριακών δεικτών να έχει κάποια αξία ως προς αποτέλεσμα της. (γ) Ο έλεγχος για το εάν οι δύο μιτοχονδριακοί δείκτες μπορούν να συνδυαστούν ήταν θετικός, δηλαδή δεν υπήρχε ασυμβατότητα (incongruence) μεταξύ τους. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκε η στατιστική δοκιμασία ILD (Incongruence Length Test, Farris et al. 1994; Michkevich & Farris 1981) με ευρετικές αναζητήσεις (heuristic searches), αφού αφαιρέθηκαν όλοι οι αμετάβλητοι χαρακτήρες (Cunningham 1997). Ο έλεγχος αυτός έγινε με το πρόγραμμα PAUP v.4.0b10, (Swofford 2003), και βρέθηκε ότι οι δύο δείκτες (12S και ND2) ήταν κατάλληλοι να συνδυαστούν (P = 0.14). Οι αλληλουχίες των μιτοχονδριακών δεικτών συνδυάστηκαν για κάθε ένα άτομο και προσδιορίστηκαν οι διαφορετικοί απλότυποι με το πρόγραμμα DnaSP v (Librado & Rosas 2009). Οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (ND2 και PRLR) δεν εμφάνισαν κωδικόνια λήξης όταν μεταφράστηκαν σε αμινοξέα. Για το τμήμα της PRLR, τρεις αλληλουχίες ήταν ετερόζυγες σε μία θέση, οπότε τα δύο αλληλόμορφα προσδιορίστηκαν «με το μάτι» (Εικόνα 5.5). Ένα από αυτά τα άτομα που ήταν ετερόζυγα για τον συγκεκριμένο δείκτη ήταν η εξωομάδα R. simonii. Οι 61

68 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες κάθε μιτοχονδριακού και πυρηνικού απλοτύπου κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων της GenBank (Accession Numbers: JQ JQ045266, Παράρτημα Ι). Εικόνα 5.5. Παράδειγμα νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στη θέση 385 παρατηρείται ετεροζυγωτία ως «διπλή κορυφή» (T και G = K) Εκτίμηση γενετικών αποστάσεων Οι γενετικές αποστάσεις* (ανά ζεύγη) των αλληλουχιών εκτιμήθηκαν με βάση τo μοντέλο Tamura Nei (TrN) (Tamura & Nei 1993), με το πρόγραμμα MEGA5 (Tamura et al. 2011). Με τον ίδιο τρόπο εκτιμήθηκαν και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των κλάδων του φυλογενετικού δένδρου, τόσο για τους μιτοχονδριακούς όσο και για τον πυρηνικό δείκτη. Γενετικές αποστάσεις* Η πιο απλή μέτρηση του βαθμού της νουκλεοτιδικής διαφοροποίησης είναι το ποσοστό p των νουκλεοτιδικών θέσεων στις οποίες δύο αλληλουχίες διαφέρουν (απόσταση p, p-distance). Η απόσταση αυτή δίνεται από τον τύπο: p = n d/n όπου n d ο αριθµός των παρατηρούµενων διαφορών και n ο συνολικός αριθµός των νουκλεοτιδίων που συγκρίνονται. Συχνά, χρησιμοποιούνται μοντέλα για τη «διόρθωση» αυτών των γενετικών αποστάσεων (βλ. παρακάτω). 5.5 Φυλογενετικές αναλύσεις Τρεις διαφορετικές μέθοδοι φυλογενετικών αναλύσεων εφαρμόστηκαν, τόσο για την ομάδα απλοτύπων τόσο του mtdna όσο και του ndna ξεχωριστά: Σύνδεση Γειτόνων (Neighbor-Joining / NJ) (Saitou & Nei 1987) Μέγιστη Πιθανοφάνεια (Maximum Likelihood / ML) (Felsestein 1981) Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία (Bayesian Inference / BI) (Geyer 1991) 62

69 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου εξέλιξης Για τις αναλύσεις ML και BI έπρεπε να γίνει η επιλογή του καταλληλότερου μοντέλου νουκλεοτιδικής υποκατάστασης, για κάθε διαχωρισμό (partition). Η επιλογή αυτή έγινε με τη βοήθεια των προγραμμάτων jmodeltest v (Posada 2008) και PAUP*, με το κριτήριο BIC (Bayesian Information Criterion, Schwarz 1978), που έχει προταθεί ως το καταλληλότερο (Luo et al. 2010). Τα καταλληλότερα μοντέλα φαίνονται στον Πίνακα 4.4. Πίνακας 4.4. Τα καταλληλότερα μοντέλα, όπως επιλέχθηκαν με το πρόγραμμα jmodeltest (Posada, 2008) και με το κριτήριο BIC. Διαχωρισμός (partition) Καταλληλότερο μοντέλο (Βιβλιογραφική αναφορά) 12S HKY+G (Hasegawa et al. 1985) ND2 TrN+I+G (Tamura & Nei 1993) 12S+ND2 HKY+G (Hasegawa et al. 1985) ND2 1 η κωδική θέση HKY+G (Hasegawa et al. 1985) ND2 2 η κωδική θέση HKY+G (Hasegawa et al. 1985) ND2 3 η κωδική θέση K80+I (Kimura 1980) PRLR TPM1 (Kimura 1980) PRLR 1 η κωδική θέση JC (Jukes & Cantor 1969) PRLR 2 η κωδική θέση K80 (Kimura 1980) PRLR 3 η κωδική θέση K80 (Kimura 1980) Στρατηγική διαχωρισμού (partitioning strategy) Για το mtdna ελέγχθηκαν δύο διαφορετικές στρατηγικές διαχωρισμού: Στην πρώτη εφαρμόστηκαν διαφορετικά μοντέλα νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων* για κάθε μιτοχονδριακό τμήμα (12S και ND2). Στη δεύτερη εφαρμόστηκε ένα μοντέλο για το τμήμα του 12S και τρία μοντέλα για καθεμία από τις κωδικές θέσεις του δείκτη ND2 που κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Αντίστοιχα, για τον πυρηνικό δείκτη PRLR, που επίσης κωδικοποιεί πρωτεΐνη, ελέγχθηκαν δύο στρατηγικές διαχωρισμού: Στην πρώτη εφαρμόστηκε ένα μοντέλο για ολόκληρο το τμήμα του γονιδίου. Στη δεύτερη εφαρμόστηκαν τρία μοντέλα για καθεμία από τις κωδικές θέσεις. 63

70 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Μοντέλα νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων* Όταν ο αριθμός των νουκλεοτιδικών διαφορών είναι μεγάλος, η παράμετρος p υποεκτιμά τον πραγματικό αριθμό των διαφορών, γιατί δεν λαμβάνει υπόψη τις ανάστροφες και παράλληλες υποκαταστάσεις (Page & Holmes 1998). Για να εκτιµήσουµε τον αριθµό των νουκλεοτιδικών διαφορών είναι αναγκαία η χρήση µαθηµατικών µοντέλων νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, που λαµβάνουν υπόψη τους διαφορετικές παραµέτρους για την εκτίµηση και «διόρθωση» των διαφορών. Oι περισσότερες μέθοδοι διόρθωσης είναι αλληλοσυσχετισμένες και διαφέρουν μόνο στον αριθμό των παραμέτρων που προσπαθούν να συμπεριλάβουν. Τέτοιες παράμετροι είναι η ύπαρξη ή μη διαφορετικών νουκλεοτιδικών συχνοτήτων, η ύπαρξη διαφορετικών πιθανοτήτων πραγματοποίησης διαφορετικών τύπων νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων, ή η παρουσία διακύμανσης του ρυθμού υποκατάστασης μεταξύ διαφορετικών νουκλεοτιδικών θέσεων (Felsenstein 2004). Για να γίνουν αυτοί οι έλεγχοι και να επιλεγεί η καταλληλότερη στρατηγική διαχωρισμού, πραγματοποιήθηκε για κάθε σενάριο μια ΒΙ ανάλυση με το πρόγραμμα MrBayes v3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck 2003). Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε η μέθοδος των παραγόντων Bayes (μια αντίστοιχη προσέγγιση της δοκιμασίας του λόγου των πιθανοφανειών - Likelihood Ratio Test, LRT για τον έλεγχο υποθέσεων), για να εξακριβωθεί αν η χρήση διαφορετικών στρατηγικών διαχωρισμού και αντίστοιχων μοντέλων βελτιώνει την ερμηνεία που δίνουν τα δεδομένα (Brandley et al. 2005). Ακολουθώντας την προσέγγιση των Brandley et al. (2011), προσδιορίστηκε ο παράγοντας Bayes υπολογίζοντας τις περιθωριοποιημένες (marginal) πιθανοφάνειες για όλες τις αναλύσεις, με το πρόγραμμα TRACER v1.5.0 ( (Rambaut & Drummond 2007) και θεωρήθηκε ότι μια τιμή 2ln Bayes factor > 10 για μια υπόθεση, αποτελεί σοβαρή ένδειξη ισχύος της υπόθεσης αυτής (Brown & Lemmon 2007). Συμπερασματικά, οι αναλύσεις BI και ML έγιναν με βάση την καταλληλότερη στρατηγική διαχωρισμού, που για το mtdna ήταν η χρήση διαφορετικού μοντέλου για το 12S και για κάθε κωδική θέση του ND2 (2ln bayes factor = ), ενώ για το ndna η καταλληλότερη στρατηγική ήταν αυτή της εφαρμογής ενός μοντέλου για ολόκληρο το τμημα του PRLR (2ln bayes factor = 11.86). Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία (BI)* Η BI ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα MrBayes με 4 «τρεξίματα» (runs) και 8 ανεξάρτητες αλυσίδες (Markov chains) για κάθε τρέξιμο, και 64

71 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι με 5*10 6 και 10 6 «γενεές» (generations) για το mtdna και το ndna, αντίστοιχα. Κάθε 100 γενεές αποθηκευόταν το αντίστοιχο δένδρο και κατά τη διαδικασία της ανάλυσης πραγματοποιήθηκε πλήρης εκτίμηση των παραμέτρων για κάθε μοντέλο. Το πρόγραμμα TRACER χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι η ανάλυση έφτασε σε σταθερότητα (stationarity), όταν όλες οι παράμετροι είχαν τιμή ESS>200 (ESS = Effective Sample Size, Δραστικό Μέγεθος Δείγματος, μέτρο της σταθερότητας της ανάλυσης). Με το ίδιο πρόγραμμα αποφασίστηκε και ο αριθμός των δένδρων που αγνοήθηκαν ( burnin δένδρα), που ήταν 5*10 3 και 10 3 δένδρα, δηλαδή 10% για το mtdna και το ndna αντίστοιχα. Τέλος, ένα συναινετικό δένδρο πλειονότητας (majority-rule consensus tree) κατασκευάστηκε από τα υπόλοιπα δένδρα (post-burnin trees) και οι τιμές των εκ των υστέρων πιθανοτήτων (posterior probabilities, pp) της BI ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για τη στατιστική υποστήριξη του φυλογενετικού δέντρου (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Μέγιστη Πιθανοφάνεια (ML)* Η ML ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα RAxML (Stamatakis 2006), όπου κάθε διαχωρισμός (partition) είχε το δικό του μοντέλο GTRCAT. Το μοντέλο GTR είναι το μοναδικό μοντέλο που υποστηρίζεται από το συγκεκριμένο πρόγραμμα, καθώς όλα τα υπόλοιπα μοντέλα που έχουν περιγραφεί, συμπεριλαμβάνονται σε αυτό ως πιο απλά (Felsenstein 2004). Η στατιστική υποστήριξη των κόμβων του φυλογενετικού δέντρου έγινε με τη μέθοδο bootstrap, και την εφαρμογή επαναλήψεων (Felsenstein 1985). Σύνδεση Γειτόνων (NJ)* H NJ ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο πρόγραμμα MEGA5, βασισμένη στις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura Nei (TrN) (Tamura & Nei 1993). Η μέθοδος bootstrap εφαρμόσθηκε για την στατιστική υποστήριξη των κόμβων του φυλογενετικού δένδρου (1000 επαναλήψεις bootstrap). 65

72 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Μέγιστη Πιθανοφάνεια (ML)* και Μπεϊεσιανή Συμπερασματολογία (BI)* Οι μέθοδοι της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (Bayesian Inference, ΒΙ) ανήκουν στις μεθόδους διερεύνησης δένδρων (tree-searching methods) (Graur & Li 2000, Hall 2001, Felsenstein 2004) για την εύρεση της καλύτερης φυλογενετικής υπόθεσης. Αυτές οι μέθοδοι ορίζουν ένα κριτήριο βελτιστοποίησης βάσει του οποίου θα συγκριθούν τα διαφορετικά φυλογενετικά σενάρια και θα αποφασιστεί ποιο από αυτά είναι το πιο πιθανό. Στην ML υπολογίζεται η πιθανότητα που έχει το συγκεκριμένο σύνολο δεδομένων (αλληλουχιών) να παρατηρηθεί μέσα από τις σχέσεις που περιγράφει το αξιολογούμενο δένδρο, όταν οι αλληλουχίες εξελίσσονται σύμφωνα με ένα εξαρχής ορισμένο μοντέλο νουκλεοτιδικής υποκατάστασης (Nei & Kumar 2000). Το δένδρο με τη μεγαλύτερη τιμή πιθανοφάνειας (ο λογάριθμος της τιμής αυτής, lnl) είναι αυτό το οποίο τελικά προτείνεται ως το πλησιέστερο προς το πραγματικό. Η ΒΙ βασίζεται στην εκ των υστέρων πιθανότητα ενός φυλογενετικού δένδρου, η οποία δίνεται από τη μαθηματική εξίσωση του Bayes και ερμηνεύεται ως η πιθανότητα το δένδρο αυτό να είναι το «αληθινό» δένδρο με βάση τα δεδομένα που μελετώνται. Τελικά, το δένδρο με την υψηλότερη τιμή της εκ των υστέρων πιθανότητας, επιλέγεται ως το «καλύτερο» στην εκτίμηση των φυλογενετικών σχέσεων. Επομένως, η ΒΙ, σε αντίθεση με την ML, αναζητεί τα δένδρα με τις μεγαλύτερες πιθανοφάνειες βάσει των δεδομένων, αντί να αναζητεί το δένδρο που μεγιστοποιεί την πιθανότητα να παρατηρηθούν τα δεδομένα. Αντί να καταλήγει σε ένα και μόνο δένδρο, παράγει μια ομάδα δένδρων με περίπου ίσες πιθανοφάνειες. Τα δεδομένα της ανάλυσης είναι εύκολο να ερμηνευτούν γιατί η συχνότητα ενός κλάδου σε αυτήν την ομάδα των δένδρων είναι κατ ουσία ίδια με την πιθανότητα αυτού του κλάδου, και επομένως δεν χρειάζεται κάποια μέθοδος στατιστικής υποστήριξης (π.χ. bootstrap) για να εκτιμηθεί η αξιοπιστία των κόμβων του δένδρου, καθώς κάθε κόμβος χαρακτηρίζεται από μια τιμή εκ των υστέρων πιθανότητας (posterior probability, pp). Κατά καιρούς έχουν αναπτυχθεί διάφορες δειγματοληπτικές μέθοδοι που είναι σε θέση να εκτιμήσουν προσεγγιστικά τις εκ των υστέρων πιθανότητες των φυλογενετικών δένδρων, με ευρύτερα χρησιμοποιούμενη την προσομοίωση MCMC (Markov Chain Monte Carlo). Σύνδεση Γειτόνων (NJ)* Η μέθοδος της Σύνδεσης Γειτόνων (Neighbor-Joining, NJ) ανήκει στις αλγοριθμικές μεθόδους (algorithmic methods) φυλογενετικής ανάλυσης (Graur & Li 2000, Hall 2001, Felsenstein 2004). Αυτές οι μέθοδοι δεν χρησιμοποιούν κάποιο κριτήριο βελτιστοποίησης, αλλά ακολουθούν συγκεκριμένο αριθμό βημάτων για την κατασκευή ενός δένδρου, δηλ. έναν αλγόριθμο. Oι μέθοδοι αυτές στηρίζονται στην εκτίμηση της γενετικής απόστασης των αλληλουχιών ανά ζεύγη και είναι γνωστές και ως Μέθοδοι Αποστάσεων (Distance Methods). Αναμένεται το αποτέλεσμά τους να επηρεάζεται από τον τρόπο που υπολογίζεται η γενετική απόσταση. Οι αλγοριθμικές μέθοδοι προχωρούν συνήθως ομαδοποιώντας τις δύο πιο όμοιες αλληλουχίες και στη συνέχεια λαμβάνοντας αυτές τις δύο αλληλουχίες ως μια ομάδα εκτιμούν εκ νέου τις γενετικές αποστάσεις σε σχέση με τις υπόλοιπες αλληλουχίες και βρίσκουν το επόμενο πιο όμοιο γενετικά ζεύγος κ.ο.κ.. Οι διαφορές μεταξύ αυτών των μεθόδων έγκεινται στον τρόπο που εκτιμούν τις γενετικές αποστάσεις, αλλά και στον τρόπο που καθορίζουν τα ζεύγη των αλληλουχιών. 66

73 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Εξωομάδες Στις φυλογενετικές αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν ως εξωομάδες, αλληλουχίες των μιτοχονδριακών γονιδίων ND2 και 12S και του πυρηνικού γονιδίου PRLR συγγενικών ειδών της οικογένειας Typhlopidae. Οι διαθέσιμες αλληλουχίες στη βάση GenBank που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ήταν ελάχιστες. Συγκεκριμένα, ενώ για το δείκτη 12S υπάρχουν αλληλουχίες αρκετών αντιπροσώπων της οικογένειας, για το δείκτη ND2 υπάρχει μόνο για το είδος Ramphotyphlops braminus (Daudin, 1803) και για το δείκτη PRLR δεν υπάρχει καμία αλληλουχία για οποιονδήποτε αντιπρόσωπο της οικογένειας. Συνεπώς, για τις αναλύσεις των μιτοχονδριακών δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το είδος Ramphotyphlops braminus (από τη βάση GenBank) και το Rhinotyphlops simonii (Boettger, 1879) (από την παρούσα μελέτη) και για τον δείκτη PRLR χρησιμοποιήθηκε μόνο το είδος R. simonii. Πληροφορίες για τις αλληλουχίες των ειδών της εξωομάδας, αναγράφονται στο Παράρτημα Ι. 5.6 Πολυτομίες* Για να διακριθούν οι πραγματικές πολυτομίες ( hard polytomies) από αυτές που οφείλονται σε έλλειψη δεδομένων ( soft polytomies), ακολουθήθηκε η μέθοδος του Slowinski (2001) και χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχο του λόγου των πιθανοφανειών (LRT - likelihood ratio test): [-2(lnL Ha - lnl Ho)], όπου L Ha είναι η πιθανότητα της εναλλακτικής υπόθεσης (το μήκος του κλάδου δεν είναι μηδέν) και L Ho είναι η πιθανότητα της μηδενικής υπόθεσης (το μήκος του κλάδου είναι μηδέν). Η σημαντικότητα του ελέγχου αυτού για κάθε κλάδο του φυλογενετικού δένδρου καθορίστηκε με βάση τις τιμές που δίνουν οι Goldman και Whelan (2000) (ο πίνακας 2 της εργασίας τους). Χρησιμοποιήθηκε ένα συντηρητικό επίπεδο σημαντικότητας (a = 0.01) για να αποφευχθούν πιθανά σφάλματα Τύπου I (ψευδώς θετικά αποτελέσματα). 67

74 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι Πολυτομίες* Οι φυλογενετικές μελέτες στοχεύουν σε μια πλήρως επιλυμένη διχοτομική φυλογένεση. Η παρουσία πολυτομιών (μη επιλυμένων σχέσεων) πολύ συχνά αντιμετωπίζεται ως αποτυχία (Rokas & Carroll 2006). Υπάρχουν δύο τύποι πολυτομιών: οι «μαλακές» ( soft ) και οι «σκληρές» ( hard ) πολυτομίες. Οι πρώτες οφείλονται σε χαμηλή διακριτική ικανότητα των δεδομένων και μπορούν θεωρητικά να επιλυθούν με την προσθήκη περισσότερων δεδομένων και βελτιστοποίηση της διαδικασίας της ανάλυσης. Οι δεύτερες είναι πραγματικές πολυτομίες αντιπροσωπεύοντας σχεδόν ταυτόχρονο διαχωρισμό κάποιων ταξινομικών μονάδων, λόγω π.χ. κοινού βικαριανιστικού γεγονότος (Maddison 1989), και δεν μπορούν να αποσαφηνιστούν. Πολλές μέθοδοι έχουν προταθεί για τον προσδιορισμό του τύπου των πολυτομιών, και αρκετές από αυτές βασίζονται στα μήκη των κλάδων του παραγόμενου δένδρου. Μια τέτοια μέθοδος είναι αυτή του Slowinski (2001) που εξετάζει εαν το μήκος ενός εσωτερικού κλάδου (αυτού που οδηγεί σε μια πολυτομία) είναι μηδέν, αναφορικά με τις μεταλλάξεις που έχουν συμβεί κατά μήκος του, ή απλά πολύ μικρό. Η πρώτη περίπτωση μπορεί να αφορά μια πραγματική πολυτομία, δηλαδή πολλαπλά παράλληλα ειδογενετικά γεγονότα, ενώ η δεύτερη αφορά έλλειψη δεδομένων (π.χ. ελλιπής δειγματοληψία σε επίπεδο γενεαλογικών κλάδων ή μήκους νουκλεοτιδικών αλληλουχιών). 5.7 Αναλύσεις δικτύων και δημογραφικές αναλύσεις Οι αναλύσεις δικτύων* (networks) μπορούν να αποδειχθούν πιο αποτελεσματικές από τις κλασικές φυλογενετικές αναλύσεις σε περιπτώσεις ενδοειδικών μελετών (Posada & Crandall 2001). Με αυτό το σκεπτικό, προσεγγίστηκαν οι γενεαλογικές σχέσεις μεταξύ των μιτοχονδριακών και πυρηνικών απλοτύπων, μέσω δικτύων απλοτύπων που κατασκευάστηκαν με τον αλγόριθμο της στατιστικής φειδωλότητας* (statistical parsimony) του προγράμματος TCS v.1.21 (Clement et al. 2000), και με όριο συνδέσεων φειδωλότητας ίσο με 95%. Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των απλοτύπων του ίδιου δικτύου υπολογίστηκε με τη στατιστική παράμετρο Snn του Hudson (Νearest Νeighbor Statistics) (Hudson 2000) με το πρόγραμμα DnaSP. Το Snn είναι ένα μέτρο του πόσο συχνά οι «εγγύτεροι γείτονες» (nearest neighbors, nn - οι πιο όμοιοι απλότυποι), βρίσκονται στην ίδια γεωγραφική περιοχή. Όταν το Snn ισούται με 1, οι πληθυσμοί έχουν υψηλή εσωτερική γενετική διαφοροποίηση (ύπαρξη υποπληθυσμών) ενώ όταν το Snn έχει τιμή ίση με 0,5, τότε οι πληθυσμοί μπορούν να θεωρηθούν μέρη ενός παμμικτικού πληθυσμού. Για τον υπολογισμό της τιμής σημαντικότητας του Snn, πραγματοποιήθηκε ένας αντιμεταθετικός έλεγχος (permutation test) με ψευδοεπαναλήψεις (τυχαία ανακατανομή των αλληλουχιών σε γεωγραφικές τοποθεσίες, ώστε ο αριθμός των αλληλουχιών για κάθε τοποθεσία να είναι ο ίδιος με 68

75 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι το αρχικό δείγμα). Τα ανεξάρτητα δίκτυα αλλά και οι πληθυσμοί ενός δικτύου που εμφανίζουν υψηλές τιμές Snn, θεωρούνται διακριτές Εξελικτικά Σημαντικές Μονάδες (Evolutionarily Significant Units - ESU) (Fraser & Bernatchez 2001). Εξάλλου, ελέγχθηκε η υπόθεση ταχείας επέκτασης (rapid expansion) με τις παρακάτω δοκιμασίες ουδετερότητας (neutrality tests) με το πρόγραμμα DnaSP: Η παράμετρος Fs του Fu (Fu 1997) Η παράμετρος R 2 (Ramos-Onsins & Rozas 2002). Οι Ramos-Onsins και Rozas (2002) έδειξαν ότι αυτές οι στατιστικές παράμετροι έχουν τη μεγαλύτερη δυνατότητα ανίχνευσης ταχείας εξάπλωσης (για γενετικούς δείκτες χωρίς ανασυνδυασμό, π.χ. mtdna), είτε για μεγάλους πληθυσμούς (~50, Fs), είτε για μικρούς (~10, R 2). Σημαντικά αρνητικές τιμές του Fs και σημαντικά θετικές τιμές του R 2 μπορούν αν ερμηνευθούν ως σημάδια ταχείας εξάπλωσης. H σημαντικότητα αυτών των δεικτών διερευνήθηκε με προσομοιώσεις σύμφυσης (coalescent) αυτών των παραμέτρων στο πρόγραμμα DnaSP. Δίκτυα και Στατιστική Φειδωλότητα* Στο ενδοειδικό επίπεδο, η μικρή γενετική διαφοροποίηση μπορεί κάποιες φορές να οδηγήσει σε μη επιλυμένες φυλογενέσεις, και η διερεύνηση και παρουσίαση αυτής της αβεβαιότητας είναι πολύ σημαντική (Schierup & Hein 2000, Posada & Crandall 2002). Έτσι, διάφορες προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί για την παρουσίαση γενεαλογικών σχέσεων ως δίκτυα (Posada & Crandall 2001, Bakker 2005). Μια από αυτές είναι η στατιστική φειδωλότητα (statistical parsimony), της οποίας οι αρχές περιγράφονται επιγραμματικά ως εξής (Templeton et al. 1992): Αρχικά, εκτιμώνται τα όρια της φειδωλότητας, δηλαδή τα εξελικτικά βήματα (μεταλλάξεις) που μπορούν να υπολογιστούν με αξιόπιστο τρόπο (χωρίς να μπορούν να περιλαμβάνουν πολλαπλές υποκαταστάσεις). Στη συνέχεια, κατασκευάζονται τα κλαδογράμματα (δίκτυα) που συμφωνούν με αυτά τα όρια. Στις περισσότερες περιπτώσεις δεν είναι εφικτό να συνδεθούν όλοι οι απλότυποι σε ένα μόνο δίκτυο υπακούοντας σε αυτά τα όρια της φειδωλότητας, όμως μπορούν να αναγνωριστούν μικρότερα σύνολα απλοτύπων (ανεξάρτητα δίκτυα) για τα οποία να ισχύει η υπόθεση των φειδωλών αλλαγών. Με αυτό το σκεπτικό, τίθεται ως όριο (cutoff) η τιμή 0,95 για την πιθανότητα της φειδωλότητας. Εξάλλου, οι συχνότητες των απλοτύπων χρησιμοποιούνται προκειμένου να εκτιμηθεί η ρίζα του δικτύου, με τη λογική ότι ο απλότυπος με τη μεγαλύτερη συχνότητα είναι πιθανώς και ο πιο παλιός (Donnelly & Tavaré 1986, Castelloe & Templeton 1994). 69

76 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι 5.8 Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Βαθμονόμηση μοριακού ρολογιού Διάφορα γεωλογικά και παλαιογεωγραφικά γεγονότα έχουν χρησιμοποιηθεί προκείμενου να γίνει η βαθμονόμηση μοριακών ρολογιών (molecular clock calibration) σε πολλές βιογεωγραφικές μελέτες που αφορούν σε οργανισμούς της Μεσογείου. Μεταξύ αυτών των γεγονότων, η κρίση αλατότητας του Μεσσηνίου (MSC) ( εκατ. χρόνια πριν) έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα τόσο σε μελέτες της δυτικής Μεσογείου όσο και της ανατολικής. Κατά το Μεσσήνιο η Μεσογειακή λεκάνη απομονώθηκε σταδιακά από τον Ατλαντικό Ωκεανό, προκαλώντας μια δραματική πτώση της στάθμης της θάλασσας (Krijgsman et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Στην αρχή του Πλειοκαίνου (5.33 εκατ. χρόνια πριν) η κρίση αλατότητας έληξε με την αποκατάσταση της επικοινωνίας μεταξύ Μεσογείου και Ατλαντικού, και η Μεσογειακή λεκάνη ξαναγέμισε με νερό μέσα σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα (ίσως και σε λιγότερο από 1000 χρόνια) (Hsü et al. 1977, Krijgsman et al. 1999). Κατά τη διάρκεια της κρίσης αλατότητας, η πτώση της θαλάσσιας στάθμης άλλαξε τη μορφή των χερσαίων συνδέσεων, με αποτέλεσμα να είναι δυνατή η μετακίνηση ζώων προς και από τα νησιά της Μεσογείου (Akın et al. 2010). Η λήξη όμως αυτής της φάσης και η ανύψωση της στάθμης της θάλασσας που ακολούθησε, έχει περιγραφεί ως ένα γεγονός που απομόνωσε πληθυσμούς σε νησιά της Μεσογείου, μεταξύ των οποίων και σε δύο από τα μεγαλύτερα νησιά της, την Κρήτη και την Κύπρο. Αυτή η απομόνωση έχει χρησιμοποιηθεί για τη βαθμονόμηση μοριακών ρολογιών (Gantenbein & Keightley 2004, Kasapidis et al. 2005, Lymberakis et al. 2007, Akın et al. 2010). Συγκεκριμένα για την Κύπρο, έχει προταθεί ότι υπήρξαν χερσαίες συνδέσεις με την Ανατολία, που στη συνέχεια διασπάστηκαν (Sevgili et al. 2006, Simonato et al. 2007). Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε αυτό το γεγονός για τη βαθμονόμηση ενός μοριακού ρολογιού για το T. vermicularis. Προκαταρκτικές αναλύσεις Η εφαρμογή αυτής της βαθμονόμησης προϋποθέτει ότι ο φυλογενετικός διαχωρισμός μεταξύ των πληθυσμών της Κύπρου και της γειτονικής ηπειρωτικής μάζας συμπίπτει με το πραγματικό γεωλογικό γεγονός της απομόνωσης της Κύπρου. Για να ελεγχθεί η αξιοπιστία της στρατηγικής βαθμονόμησης που ακολουθήθηκε 70

77 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν δύο προκαταρκτικές αναλύσεις, με σκοπό να εκτιμηθεί ο χρόνος απόσχισης του κλάδου της Κύπρου. Σε αυτές τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκαν γνωστοί ρυθμοί νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (ανά κλάδο και ανά εκατ. χρόνια) για καθέναν από τους μιτοχονδριακούς δείκτες. Ο δείκτης ND2 έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλές αντίστοιχες μελέτες εξωθέρμων (Agamidae: Macey et al. 1998α, Urquhart et al / Anguidae: Gvoždik et al. 2010α / Gekkonidae: Macey et al / Strasburg & Kearny 2005 / Lacertidae: Brown et al / Scincidae: Liggins et al / Salamandridae: Weisrock et al / Bufonidae: Macey et al. 1998β) και έχει βρεθεί ότι εξελίσσεται με πολύ παρόμοιους ρυθμούς ( % διαφοροποίηση ανά κλάδο και ανά εκατ. χρόνια). Για τον δείκτη 12S, η αντίστοιχη τιμή, όπως προέκυψε από άλλες μελέτες (Lacertidae: Carranza et al. 2004, Harris et al. 2004α, Fonseca et al. 2009; / Scincidae: Carranza et al. 2008α, Poulakakis et al / Gekkonidae: Carranza et al. 2000, Carranza & Arnold 2006 / Salamandridae: Carranza & Arnold 2004 / Plethodontidae: Carranza et al. 2008β) είναι περίπου % διαφοροποίηση ανά κλάδο και ανά εκατ. χρόνια. Ανάλυση μοριακού ρολογιού Μετά από αυτές τις προκαταρκτικές αναλύσεις, οι χρόνοι απόσχισης εκτιμήθηκαν από τους 68 απλοτύπους του mtdna. Αρχικά, εξετάστηκε αν οι αλληλουχίες υπακούουν σε ένα σταθερό ρυθμό μοριακού ρολογιού. Για τον σκοπό αυτόν πραγματοποιήθηκε ο έλεγχος του λόγου των πιθανοτήτων (LRT), συγκρίνοντας την πιθανοφάνεια του φυλογενετικού δένδρου της ανάλυσης ML με αυτήν από ένα δένδρο που προέκυψε κάτω από την υπόθεση ενός σταθερού ρυθμού νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων (Felsenstein 1981), με τη βοήθεια του φυλογενετικού προγράμματος PAUP. Ο έλεγχος LRT ήταν θετικός για την υπόθεση του σταθερού ρυθμού μοριακού ρολογιού (LRT=2 [ ]=82.88, df=66, α=0.05, χ critical=85.96) (όπου df, βαθμοί ελευθερίας ίσοι με τον αριθμό των αλληλουχιών μείον 2). Έτσι, ακολουθήθηκε η προσέγγιση του αυστηρού (strict) μοριακού ρολογιού εκτιμώντας τους χρόνους απόσχισης με το πρόγραμμα BEAST V1.6.0 (Drummond & Rambaut 2007). Σε μια πρόσφατη εργασία, οι Akın et al. (2010) χρησιμοποίησαν μια κανονική κατανομή για να περιγράψουν το σημείο βαθμονόμησης, δηλαδή θεώρησαν ότι η απομόνωση του κλάδου της Κύπρου έγινε πριν 5,3 εκατ. χρόνια (λήξη κρίσης αλατότητας Μεσσηνίου) ως μέση τιμή και με μια τυπική απόκλιση 0,3 71

78 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι εκατ. χρόνια. Ως πιο ρεαλιστικό σενάριο χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη μια «περικομμένη» κανονική κατανομή (truncated-normal distribution), χρησιμοποιώντας ως μέση και μέγιστη τιμή τη λήξη της κρίσης αλατότητας και μια τυπική απόκλιση 0,3 εκατ. χρόνια, με το σκεπτικό ότι η απομόνωση αυτού του κλάδου δεν θα μπορούσε να συμβεί πριν από τη λήξη της κρίσης αλατότητας στα 5,3 εκατ. χρόνια. Οι διαφορές στις δύο αυτές υποθέσεις φαίνονται στην Εικόνα 5.6. Όλες οι αναλύσεις (προκαταρκτικές και τελικές) έγιναν με την εκ των προτέρων παράμετρο Yule (Yule prior), που προϋποθέτει ένα σταθερό ρυθμό ειδογένεσης ανά κλάδο και προτείνεται από το σχεδιαστή του προγράμματος ως η καλύτερη για αναλύσεις όπως η παρούσα. Η Μπεϊεσιανή ανάλυση του BEAST πραγματοποιήθηκε με 4 ανεξάρτητα «τρεξίματα» και με μήκος αλυσίδας επαναλήψεων, ενώ τελικά αγνοήθηκαν επαναλήψεις. Τα 4 «τρεξίματα» αναλύθηκαν στο πρόγραμμα Tracer για να ελεγχθεί η σταθερότητα της ανάλυσης και συνδυάστηκαν στο πρόγραμμα LogCombiner. Το πρόγραμμα TreeAnnotator χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του χρονογράμματος (δένδρο με μήκη κλάδων που αντιστοιχούν σε χρόνους απόσχισης). Εικόνα 5.6. Αριστερά: κανονική κατανομή του σημείου βαθμονόμησης του μοριακού ρολογιού με μέση τιμή 5,3 και τυπική απόκλιση 0,3. Δεξιά: «περικομμένη» κανονική κατανομή του σημείου βαθμονόμησης του μοριακού ρολογιού με μέση και μέγιστη τιμή 5,3 και τυπική απόκλιση 0, Βιογεωγραφικές αναλύσεις Για την καλύτερη κατανόηση της βιογεωγραφικής ιστορίας του T. vermicularis, και προκειμένου να βρεθούν οι περιοχές γεωγραφικής κατανομής των προγόνων, εφαρμόστηκε η στατιστική προσέγγιση της Διασποράς-Βικαριανισμού (Dispersal-Vicariance analysis DIVA, Ronquist 1997) με το πρόγραμμα S-DIVA v1.9b (Yu et al. 2010). Σε αυτήν την ανάλυση, με βάση τη γεωγραφική κατανομή των 72

79 Φυλογεωγραφια του Typhlops vermicularis Υλικά και Μέθοδοι αρτίγονων εξελικτικών ομάδων (οι τελικοί κλάδοι του παραγόμενου φυλογενετικού δένδρου), εκτιμώνται οι γεωγραφικές κατανομές των προγόνων (των κόμβων του δένδρου). Αυτή η προσέγγιση λαμβάνει υπόψη και την αβεβαιότητα της φυλογένεσης, υπολογίζοντας μια πιθανότητα P για κάθε προτεινόμενη προγονική κατανομή. Για την ανάλυση DIVA χρησιμοποιείται ένα απλοποιημένο, πλήρως διχοτομημένο, φυλογενετικό δένδρο, στο οποίο εκπροσωπούνται όλοι οι κλάδοι. Κάθε τελικός κλάδος αντιστοιχεί σε μια γεωγραφική περιοχή (σε αυτήν που κατανέμεται η συγκεκριμένη εξελικτική γραμμή). Οι γεωγραφικές περιοχές που ορίστηκαν φαίνονται στην Εικόνα 5.7., και ο ορισμός τους στηρίζεται στη σημερινή κατανομή του εξεταζόμενου είδους και των φυλογενετικών του κλάδων. Τέλος, αφού εκτιμηθούν οι περιοχές κατανομής των προγόνων εξάγονται συμπεράσματα για πιθανά φαινόμενα βικαριανισμού και διασποράς. Για τον υπολογισμό της αβεβαιότητας, δηλαδή της τιμής Ρ, χρησιμοποιήθηκαν δένδρα, που προέκυψαν από το πρόγραμμα BEAST. Οι προγονικές κατανομές θεωρήθηκε ότι δεν περιλαμβάνουν περισσότερες από τέσσερεις περιοχές, που είναι και ο μέγιστος αριθμός περιοχών που καταλαμβάνουν οι σύγχρονοι φυλογενετικοί κλάδοι του T. vermicularis, όπως προέκυψαν στην παρούσα μελέτη. Εικόνα 5.7. Οι γεωγραφικές περιοχές που ορίστηκαν για την ανάλυση Διασποράς-Βικαριανισμού. 73

80 Αποτελέσματα Κεφάλαιο 6: Αποτελέσματα 74

81 Αποτελέσματα 6.1 Μιτοχονδριακό DNA Γενικά στοιχεία Τα δεδομένα του συνδυασμένου mtdna περιλάμβαναν 130 αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε 66 απλοτύπους του T. vermicularis. Επιπλέον, προέκυψε ένας μιτοχονδριακός απλότυπος του R. braminus και ένας του R. simonii. Το συνολικό μήκος των συνδυασμένων αλληλουχιών του μιτοχονδριακού DNA ήταν 750 bps (392 bps για το 12S και 358 bps για το ND2). Για το σύνολο των αλληλουχιών του T. vermicularis, ο αριθμός των μεταβλητών θέσεων ήταν 130 (17.3%) και ο αριθμός των πληροφοριακών θέσεων, με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας, ήταν 110 (14.7%). Γενετικές αποστάσεις Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των αλληλουχιών του T. vermicularis, εκφρασμένη με τη μορφή γενετικών αποστάσεων με βάση το μοντέλο Tamura-Nei, κυμάνθηκαν από 0 έως 6.9% για το 12S, από 0 έως 14.1% για το ND2 και από 0 έως 9.9% για το συνδυασμό τους. Σε όλες τις περιπτώσεις οι μεγαλύτερες τιμές αφορούν αλληλουχίες από την Ιορδανία/νότια Συρία (κλάδος Α, βλ. παρακάτω) και την Κύπρο (κλάδος Δ, βλ. παρακάτω). Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων μεταξύ διακριτών ομάδων του T. vermicularis, καθώς και οι τιμές εντός κάθε ομάδας φαίνονται στον Πίνακα 6.1. Πίνακας 6.1. Μέσες γενετικές αποστάσεις (%) μεταξύ των βασικών φυλογενετικών κλάδων του mtdna. Πάνω από τη διαγώνιο: τιμές για το ND2. Κάτω από τη διαγώνιο: τιμές για το 12S. Οι τιμές στη διαγώνιο αφορούν στη γενετική διαφοροποίηση εντός κάθε κλάδου (12S/ND2). Οι κλάδοι από Α έως Ι, αντιστοιχούν στο φυλογενετικό δένδρο της Εικόνας 6.1. Κλάδοι Ι Θ H Ζ ΣΤ E Δ Γ B A R. simonii R. braminus Ι -/ Θ / H / Ζ / ΣΤ / E / Δ / Γ / B / A / R. simonii / R. braminus /- 75

82 Αποτελέσματα Φυλογενετικές αναλύσεις και περιγραφή του δένδρου Από όλες τις φυλογενετικές αναλύσεις (NJ, ML και BI) προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα. Συγκεκριμένα, η τοπολογία των παραγόμενων δέντρων είναι ίδια, διακρίνοντας τις ίδιες μονοφυλετικές ομάδες με πολύ μικρές διαφορές αναφορικά με τη στατιστική υποστήριξη των μεταξύ τους σχέσεων. Στις Εικόνες 6.1, 6.2 και 6.3 παρουσιάζονται τα φυλογενετικά δένδρα των αναλύσεων BI, NJ και ML, αντίστοιχα, ενώ στο δένδρο της ΒΙ (Εικόνα 6.1) παρουσιάζονται και τα αποτελέσματα του έλεγχου πολυτομιών για συγκεκριμένους κόμβους. Ακολουθεί μια σύντομη περιγραφή της τοπολογίας του δένδρου της ΒΙ (κλάδοι, σχέσεις, πολυτομίες), ενώ μια πιο εκτενής ανάλυση γίνεται στο κεφάλαιο της Συζήτησης. Στο φυλογενετικό δένδρο που προέκυψε, παρατηρούνται 10 κλάδοι του T. vermicularis (A-Ι). Η μονοφυλετικότητα κάθε κλάδου έχει πολύ υψηλή στατιστική υποστήριξη (τιμές bootstrap των αναλύσεων ML και NJ >86, και τιμές pp της ανάλυσης BI όλες ίσες με 1.0), όμως σε κάποιες περιπτώσεις οι σχέσεις μεταξύ αυτών των κλάδων δεν είναι επιλυμένες σχηματίζοντας πολυτομίες. Ο πιο βασικός (δηλαδή στη βάση του δένδρου) κλάδος της φυλογένεσης του T. vermicularis, ο κλάδος Α, περιλαμβάνει δείγματα από την Ιορδανία και τη νότια Συρία. Οι υπόλοιποι πληθυσμοί (όλοι οι υπόλοιποι κλάδοι) σχηματίζουν μια μονοφυλετική ομάδα, με υψηλή στατιστική υποστήριξη (τιμές bootstrap ML=73 και NJ =99, και τιμές pp της BI ίση με 1.0). Ο κλάδος B περιλαμβάνει δείγματα από τις νοτιοδυτικές περιοχές της Τουρκίας, ενώ ο κλάδος Γ περιλαμβάνει δείγματα από την οροσειρά του Nur (ή Amanos) στη κεντρική νότια Τουρκία. Οι πληθυσμοί της Κύπρου σχηματίζουν τον κλάδο Δ. Οι πληθυσμοί της περιοχής νότια του Καυκάσου (βορειοανατολική Τουρκία, Αρμενία, Γεωργία και Αζερμπαϊτζάν) περιλαμβάνονται στον κλάδο E, μαζί με πληθυσμούς του δυτικού Ιράν. Ο κλάδος ΣΤ περιλαμβάνει ένα και μόνο δείγμα από τη δυτική Συρία, και ίσως είναι αδελφός κλάδος του Ε, αν και αυτή η σχέση δεν έχει υψηλή στατιστική υποστήριξη. Οι κλάδοι Ζ και H περιλαμβάνουν δείγματα από τις περιοχές Mersin και Şırnak της Τουρκίας, αντίστοιχα. Ο κλάδος Θ, αδελφός κλάδος του H, περιλαμβάνει πληθυσμούς από μια γεωγραφική περιοχή μεγάλης έκτασης (ηπειρωτική Ελλάδα, νησιά του Αιγαίου και του Ιονίου, Τουρκία και Ιράν). Τέλος, ο κλάδος Ι περιλαμβάνει έναν απλότυπο που αντιστοιχεί σε δύο πληθυσμούς της βορειοδυτικής Συρίας. Σε ό,τι αφορά τις πολυτομίες, ο έλεγχος LRT έδειξε ότι τρεις από αυτές αντιστοιχούν σε «σκληρές» πολυτομίες και μία σε «μαλακή» (Εικόνα 6.1). 76

83 Αποτελέσματα Εικόνα 6.1. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση BI. Τα είδη Ramphotyphlops braminus και Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκαν ως εξωομάδες. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (Α1, Α2 κλπ) αντιστοιχούν στους μιτοχονδριακούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Οι αριθμοί μέσα στις παρενθέσεις δίπλα σε αυτούς τους απλοτύπους (1, 2, ) αντιστοιχούν στους κωδικούς αριθμούς κάθε δείγματος (Παράρτημα Ι, Εικόνα 5.1). Κάθε κλάδος χαρακτηρίζεται από ένα γράμμα (Α, Β,... Θ, Ι) και ένα σύμβολο κωδικοποίησης. Στους εσωτερικούς κόμβους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές posterior probabilities (pp) της ανάλυσης BI. Μόνο οι τιμές pp 0.50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές pp ίσες με 1.0. Τα σύμβολα «μαλακή» και «σκληρή» δίπλα σε κάποιους εσωτερικούς κλάδους χαρακτηρίζουν τις πολυτομίες με βάση τον έλεγχο πολυτομιών που πραγματοποιήθηκε. Για τους κλάδους E-Ι η «σκληρή» πολυτομία παρουσιάζεται ως μια πραγματική τοπολογικά πολυτομία. 77

84 Αποτελέσματα Εικόνα 6.2. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση NJ. Τα είδη Ramphotyphlops braminus και Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκαν ως εξωομάδες. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (Α1, Α2 κλπ) αντιστοιχούν στους μιτοχονδριακούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Οι αριθμοί μέσα στις παρενθέσεις δίπλα σε αυτούς τους απλοτύπους (1, 2, ) αντιστοιχούν στους κωδικούς αριθμούς κάθε δείγματος (Παράρτημα Ι, Εικόνα 5.1). Κάθε κλάδος χαρακτηρίζεται από ένα γράμμα (Α, Β,... Θ, Ι) και ένα σύμβολο κωδικοποίησης. Στους εσωτερικούς κόμβους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap της ανάλυσης NJ. Μόνο οι τιμές 50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές

85 Αποτελέσματα Εικόνα 6.3. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση ML. Τα είδη Ramphotyphlops braminus και Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκαν ως εξωομάδες. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (Α1, Α2 κλπ) αντιστοιχούν στους μιτοχονδριακούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Οι αριθμοί μέσα στις παρενθέσεις δίπλα σε αυτούς τους απλοτύπους (1, 2, ) αντιστοιχούν στους κωδικούς αριθμούς κάθε δείγματος (Παράρτημα Ι, Εικόνα 5.1). Κάθε κλάδος χαρακτηρίζεται από ένα γράμμα (Α, Β,... Θ, Ι) και ένα σύμβολο κωδικοποίησης. Στους εσωτερικούς κόμβους του δέντρου, οι αριθμοί αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap της ανάλυσης ML. Μόνο οι τιμές 50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές

86 Αποτελέσματα Εκτίμηση χρόνων απόσχισης Οι προκαταρκτικές αναλύσεις μοριακού ρολογιού, που βασίστηκαν σε κάθε έναν από τους μιτοχονδριακούς δείκτες ξεχωριστά, έδειξαν ότι ο φυλογενετικός κλάδος της Κύπρου απέκλινε χρονικά σχεδόν αμέσως μετά την Kρίση Aλατότητας του Μεσσηνίου, και επομένως το γεγονός αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη βαθμονόμηση ενός μοριακού ρολογιού. Συγκεκριμένα, οι χρόνοι απόσχισης που εκτιμήθηκαν ήταν 5,0 εκατ. χρόνια (95% διαστήματα εμπιστοσύνης: 2,8 7,0 εκατ. χρόνια) για το ND2 και 4,5 εκατ. χρόνια (2,7 8,8 εκατ. χρόνια) για το 12S. Και οι δύο εκτιμώμενοι χρόνοι αντιστοιχούν στην περίοδο που ακολούθησε μετά τη λήξη της Κρίσης Αλατότητας και βρίσκονται μέσα στα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης τόσο της «περικομμένης» κανονικής κατανομής (truncated-normal) όσο και της κανονικής κατανομής του χρόνου απομόνωσης της Κύπρου (Εικόνα 5.6). Το χρονόγραμμα που προέκυψε από την ανάλυση του μοριακού ρολογιού παρουσιάζεται στην Εικόνα 6.4. Ο παλαιότερος φυλογενετικός διαχωρισμός εντός του T. vermicularis φαίνεται να πραγματοποιήθηκε πριν 9,8 εκατ. χρόνια (7,7-14,2). Ο κλάδος B διαχωρίζεται στα 6,4 εκατ. χρόνια (4,7-8,0), ενώ οι κλάδοι Γ, Δ και Ζ αρχίζουν φαίνεται πως διαχωρίζονται στο τέλος του Μειοκαίνου ή στις αρχές του Πλειοκαίνου, στα 5,6 εκατ. χρόνια (4,6-6,5), 5,2 εκατ. χρόνια (4,7-5,3) και 4,6 εκατ. χρόνια (3,3-5,1), αντίστοιχα. Οι κλάδοι E, ΣΤ και Ι διαφοροποιούνται στο τέλος του Πλειοκαίνου ή στις αρχές του Πλειστοκαίνου στα 3,3 εκατ. χρόνια (2,5-4,4), 3,0 εκατ. χρόνια (2,4-4,3) και 2,9 εκατ. χρόνια (2,3-4,3), αντίστοιχα. Ο πιο πρόσφατος κοινός πρόγονος των κλάδων H και Θ πρέπει να έζησε πριν περίπου 2,0 εκατ. χρόνια (1,4-3,0). Η διαφοροποίηση στο εσωτερικό κάθε κλάδου (Α έως Ι) πρέπει να έγινε πολύ πρόσφατα, περίπου πριν 1,0 εκατ. χρόνια (μέσοι χρόνοι απόσχισης κυμαίνονται μεταξύ 0,7 και 1,3 εκατ. χρόνων). 80

87 Αποτελέσματα Εικόνα 6.4. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα BEAST, στο οποίο παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών του T. vermicularis. Οι αριθμοί στους κόμβους αντιστοιχούν σε χρόνους υπολογισμένους σε εκατ. χρόνια, ενώ οι ράβδοι δείχνουν τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Τα ονόματα και τα σύμβολα των κλάδων αντιστοιχούν σε αυτά των Εικόνων 6.1, 6.2 και

88 Αποτελέσματα Ανάλυση δικτύου και δημογραφικές αναλύσεις Από την ανάλυση δικτύου στατιστικής φειδωλότητας προέκυψαν οκτώ (8) ανεξάρτητα δίκτυα (Εικόνα 6.5). Επτά από αυτά αντιστοιχούν στους κλάδους Α έως Ζ, ενώ οι απλότυποι των κλάδων Η, Θ και Ι περιλαμβάνονται σε ένα κοινό δίκτυο. Παρόλα αυτά, οι τιμές της παραμέτρου Snn μεταξύ των τριών αυτών κλάδων είναι ίσες με 1, υποδεικνύοντας ότι παρουσιάζουν υψηλή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ τους και μπορούν να θεωρηθούν διακριτές Εξελικτικά Σημαντικές Μονάδες (Evolutionarily Significant Units - ESU). Επομένως, στο T. vermicularis μπορούν να διακριθούν συνολικά 10 ESU που αντιστοιχούν στους 10 κλάδους του φυλογενετικού δέντρου (Εικόνες 6.1, 6.2 και 6.3). Τα αποτελέσματα από τις δοκιμασίες ουδετερότητας (F s του Fu και R 2) παρουσιάζονται στον Πίνακα 6.2. Οι ESU Γ, Ε, Ζ και Θ παρουσιάζουν αρνητικές τιμές του δείκτη F s, αλλά μόνο για τη μονάδα Θ η τιμή αυτή είναι σημαντικά αρνητική και με υψηλή στατιστική υποστήριξη (P<0.01). Όλες οι τιμές της παραμέτρου R 2 είναι θετικές, με τις τιμές για τις μονάδες Ε και Θ να είναι στατιστικά σημαντικές (P<0.05 και P<0.001, αντίστοιχα). Συνεπώς για την ομάδα Θ και πιθανότατα για την Ε, υπάρχουν ενδείξεις ταχείας εξάπλωσης. Εικόνα 6.5. Τα δίκτυα της ανάλυσης στατιστικής φειδωλότητας που αφορούν στη διαφοροποίηση του mtdna, όπως προέκυψαν από το πρόγραμμα TCS και με όριο συνδέσεων ίσο με 95%. Κάθε γραμμή (το τμήμα μεταξύ 2 μικρών μαύρων κύκλων) αντιπροσωπεύει ένα εξελικτικό βήμα (μία μετάλλαξη), οι έγχρωμοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν απλοτύπους και οι μικρότεροι λευκοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν άγνωστους απλοτύπους. Το μέγεθος κάθε κύκλου είναι ανάλογο με τη συχνότητα του απλοτύπου (αριθμός 82

89 Αποτελέσματα ατόμων που έχουν αυτόν τον απλότυπο). Οι κωδικοί των απλοτύπων παρουσιάζονται επίσης στο Παράρτημα Ι και στις Εικόνες 6.1, 6.2 και 6.3. Τα γράμματα από Α έως Ι αντιστοιχούν στους κλάδους των φυλογενετικών δένδρων των Εικόνων 6.1, 6.2 και 6.3. Πίνακας 6.2. Τα αποτελέσματα των δοκιμών ουδετερότητας για το mtdna. Μονάδες: οι εξελικτικά σημαντικές μονάδες (ESU), n: αριθμός αλληλουχιών, F s: η παράμετρος του Fu, R 2: η παράμετρος των Ramos-Onsins και Rozas. Οι δύο αυτές παράμετροι μπορούν να υπολογιστούν μόνο σε ομάδες που έχουν n 4 και n 3, αντίστοιχα. Μονάδες n F s R 2 A B Γ Δ E (P<0.05) ΣΤ Ζ H Θ (P<0.01) (P<0.001) Ι Βιογεωγραφική ανάλυση Τα αποτελέσματα της ανάλυσης Διασποράς-Βικαριανισμού και οι προτεινόμενες γεωγραφικές εξαπλώσεις των προγόνων παρουσιάζονται στην Εικόνα 6.6. Σε 7 από τους 9 κόμβους, προτείνεται μόνο μία προγονική εξάπλωση, ενώ η στατιστική υποστήριξη των προτεινόμενων εξαπλώσεων είναι υψηλή σε 4 κόμβους (Ρ = 0,82-1,0) και χαμηλή σε επίσης 4 κόμβους (Ρ = 0,10-0,36). Από τις κατανομές των προγόνων και απογόνων, μπορούν να εξαχθούν συμπεράσματα για τη διεργασία που πιθανώς να είναι υπεύθυνη για κάθε φυλογενετικό γεγονός. Αυτή μπορεί να είναι (α) διασπορά (ο πρόγονος και ο απόγονος δεν έχουν κοινή γεωγραφική κατανομή), (β) βικαριανισμός (οι απόγονοι κατανέμονται σε διαφορετικές περιοχές, οι οποίες συνολικά αποτελούσαν την περιοχή κατανομής του προγόνου), (γ) διπλασιασμός (πρόγονος και απόγονοι έχουν την ίδια γεωγραφική κατανομή, άρα υπάρχει συμπάτρια ειδογένεση, με την ευρεία έννοια) και (δ) εξαφάνιση. Συνεπώς, η φυλογενετική ιστορία του T. vermicularis περιλαμβάνει μια σειρά από τις παραπάνω τέσσερεις διεργασίες, που θα συζητηθούν εκτενέστερα στο κεφάλαιο της Συζήτησης. 83

90 Αποτελέσματα Εικόνα 6.6. Το κλαδόγραμμα που προέκυψε από το πρόγραμμα S-DIVA. Τα μικρά γράμματα αντιστοιχούν σε γεωγραφικές περιοχές και τα κεφαλαία στους κλάδους του φυλογενετικού δένδρου των Εικόνων 6.1, 6.2 και

91 Αποτελέσματα 6.2 Πυρηνικό DNA Γενικά στοιχεία Τα επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης για τον πυρηνικό δείκτη PRLR ήταν πολύ χαμηλά. Η ανάλυση των 79 αλληλουχιών μήκους 580 bp ανέδειξε την ύπαρξη 13 απλοτύπων (11 για το T. vermicularis και δύο για το R. simonii). Οι μεταβλητές θέσεις για το T. vermicularis ήταν 22 (3,8%), ενώ οι πληροφορικές με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας ήταν μόλις 7 (1.2%). Γενετικές αποστάσεις Οι γενετικές αποστάσεις με βάση το μοντέλο Tamura-Nei κυμάνθηκαν για το T. vermicularis από 0 έως 3,0%, με τη μεγαλύτερη τιμή να αφορά στα δείγματα της Ιορδανίας/νότιας Συρίας και αυτά του απλοτύπου nb2 της δυτικής Τουρκίας (βλ. φυλογενετικά δένδρα παρακάτω). Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων μεταξύ συγκεκριμένων ομάδων του T. vermicularis, αλλά και μέσα σε αυτές, για το δείκτη PRLR φαίνονται στον Πίνακα 6.3. Πίνακας 6.3. Μέσες γενετικές αποστάσεις (%) μεταξύ ομάδων του T. vermicularis για τον πυρηνικό δείκτη PRLR. Οι τιμές στη διαγώνιο αντιστοιχούν στη γενετική διαφοροποίηση εντός κάθε ομάδας. Τα ονόματα των κλάδων και των απλοτύπων φαίνονται στην εικόνα 6.6 Κλάδοι nb nb εκτός nb2 nb2 na R. simonii nb - nb εκτός nb2-0.2 nb na R. simonii Φυλογενετικές αναλύσεις και περιγραφή του δέντρου Οι φυλογενετικές αναλύσεις BI, NJ και ML έδωσαν παρόμοια αποτελέσματα και διέκριναν δύο μονοφυλετικές ομάδες, τις na και nb, όπως φαίνεται στα φυλογενετικά δένδρα των Εικόνων 6.7, 6.8 και 6.9, αντίστοιχα. Ο κλάδος na αντιστοιχεί στον κλάδο Α του δέντρου του μιτοχονδριακού DNA (Εικόνες 6.1, 6.2 και 6.3) και περιλαμβάνει δείγματα από την Ιορδανία και τη νότια Συρία, ενώ ο κλάδος nb περιλαμβάνει όλους τους υπόλοιπους πληθυσμούς. 85

92 Αποτελέσματα Εικόνα 6.7. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των πυρηνικών απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση BI. Το είδος Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (nα1, nα2,...) αντιστοιχούν στους πυρηνικούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Στους εσωτερικούς κόμβους του δένδρου, οι αριθμοί πάνω από τους κλάδους αντιστοιχούν σε τιμές posterior probabilities (pp) της ανάλυσης BI. Μόνο οι τιμές pp 0.50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές pp ίσες με 1.0. Εικόνα 6.8. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των πυρηνικών απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση NJ. Το είδος Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (nα1, nα2,...) αντιστοιχούν στους πυρηνικούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Στους εσωτερικούς κόμβους του δένδρου, οι αριθμοί πάνω από τους κλάδους αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap της ανάλυσης NJ. Μόνο οι τιμές bootstrap 50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap ίσες με

93 Αποτελέσματα Εικόνα 6.9. Οι φυλεγενετικές σχέσεις των πυρηνικών απλοτύπων του T. vermicularis, όπως προκύπτουν από την ανάλυση ML. Το είδος Rhinotyphlops simonii χρησιμοποιήθηκε ως εξωομάδα. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (nα1, nα2,...) αντιστοιχούν στους πυρηνικούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Στους εσωτερικούς κόμβους του δένδρου, οι αριθμοί πάνω από τους κλάδους αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap της ανάλυσης ML. Μόνο οι τιμές bootstrap 50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές bootstrap ίσες με 100. Ανάλυση δικτύου Η ανάλυση δικτύου στατιστικής φειδωλότητας έδειξε ότι ο απλότυπος nb2, που αντιστοιχεί σε 4 δείγματα της δυτικής Τουρκίας, διαφοροποιείται κατά 9 μεταλλάξεις από τον πιο κοινό απλότυπο nb1 του κλάδου nb (Εικόνα 6.10). Από αυτές τις μεταλλάξεις, 6 είναι μη συνώνυμες. Ο απλότυπος nb1 εμφανίζεται σε πληθυσμούς σε ολόκληρη την περιοχή εξάπλωσης του T. vermicularis, ενώ οι υπόλοιποι απλότυποι (nb3-nb9) διαφέρουν κατά μία μετάλλαξη από αυτόν. Οι απλότυποι του κλάδου na διαφέρουν από τον απλότυπο nb1 κατά 7 μεταλλάξεις, 5 από τις οποίες είναι μη-συνώνυμες. 87

94 Αποτελέσματα Εικόνα Το δίκτυο της ανάλυσης στατιστικής φειδωλότητας που αφορά τη διαφοροποίηση του πυρηνικού DNA, όπως προέκυψε από το πρόγραμμα TCS και με όριο συνδέσων ίσο με 95%. Κάθε γραμμή (το τμήμα μεταξύ 2 μικρών μαύρων κύκλων) αντιπροσωπεύει ένα εξελικτικό βήμα (μία μετάλλαξη) και οι έγχρωμοι κύκλοι αντιπροσωπεύουν απλοτύπους. Το μέγεθος κάθε κύκλου είναι ανάλογο με τη συχνότητα του απλοτύπου (αριθμός ατόμων που έχουν αυτόν τον απλότυπο). Οι κωδικοί των απλοτύπων παρουσιάζονται επίσης στο Παράρτημα Ι και στις Εικόνες 6.7, 6.8 και 6.9. Τα διαφορετικά χρώματα αντιστοιχούν στους μιτοχονδριακούς απλοτύπους. Στον χάρτη φαίνεται η γεωγραφική κατανομή των βασικών ομάδων από την ανάλυση του πυρηνικού δείκτη. 88

95 Συζήτηση Κεφάλαιο 7: Συζήτηση 89

96 Συζήτηση 7.1 Σύγκριση των προτύπων του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού DNA Συγκρίνοντας τα πρότυπα φυλογένεσης των δύο ανεξάρτητων δεικτών, δηλαδή του mtdna και του ndna, παρατηρείται ένα κοινό χαρακτηριστικό: και οι δύο δείκτες διαχωρίζουν τον εξελικτικό κλάδο που περιλαμβάνει πληθυσμούς από την Ιορδανία και τη νότια Συρία (κλάδος A και na, αντίστοιχα), με τους υπόλοιπους πληθυσμούς να σχηματίζουν μια μονοφυλετική ομάδα (Εικόνα 7.1). Η γενετική διαφοροποίηση, και για τους δύο δείκτες, μεταξύ των πληθυσμών της Ιορδανίας/νότιας Συρίας και των υπόλοιπων μελετηθέντων πληθυσμών του T. vermicularis είναι πολύ υψηλή. Εκτός όμως αυτής της ομοιότητας, παρατηρούνται κάποιες σημαντικές διαφορές. Η φυλογένεση του mtdna κατέληξε, εκτός του κλάδου Α, σε εννιά ακόμα διακριτούς κλάδους, με υψηλή γενετική διαφοροποίηση μεταξύ τους. Αυτό δεν επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματα του πυρηνικού δείκτη, για τον οποίο προέκυψαν εννιά μόλις απλότυποι του κλάδου nb που διαφέρουν ελάχιστα σε αριθμό μεταλλάξεων. Τόσο οι φυλογενετικές αναλύσεις (Εικόνα 7.1) όσο και η ανάλυση δικτύου (Εικόνα 6.10) του πυρηνικού δείκτη δεν παρουσιάζουν κάποιο φυλογεωγραφικό πρότυπο για τον κλάδο nb, ενώ ο πιο κοινός απλότυπος nb1 εμφανίζεται σε άτομα που ανήκουν σε όλους τους κλάδους του μιτοχονδριακού δένδρου και από ολόκληρη τη γεωγραφική εξάπλωση του είδους. Με άλλα λόγια, παρατηρείται μια αδυναμία του πυρηνικού δείκτη να διακρίνει τις εξελικτικές γραμμές που αναδεικνύονται από τον μιτοχονδριακό δείκτη (incomplete lineage sorting). Αυτή η έλλειψη φυλογενετικής δομής στις γενεαλογίες πυρηνικών δεικτών είναι συνήθης και έχει αναφερθεί σε αρκετές περιπτώσεις ερπετών (π.χ. Pinho et al. 2007, 2008, Rato et al. 2009, 2010, 2011). Με μια πρώτη προσέγγιση, η πιο πιθανή εξήγηση αυτού του αποτελέσματος είναι ο χαμηλότερος ρυθμός εξέλιξης (νουκλεοτιδικών υποκαταστάσεων) του πυρηνικού DNA σε σύγκριση με το μιτοχονδριακό (Avise 2000). Παρόλα αυτά, το αποτέλεσμα αυτό δεν ήταν αναμενόμενο για τον συγκεκριμένο πυρηνικό δείκτη, τον PRLR, που έχει προταθεί ως ο πιο γρήγορα εξελισσόμενος, και κατ επέκταση πληροφοριακός, πυρηνικός τόπος στα Φολιδωτά (Townsend et al. 2008), και ο οποίος επιλέχθηκε για αυτήν ακριβώς την ιδιότητά του. Μάλιστα, οι Gvoždik et al. (2010α) χρησιμοποίησαν αυτόν τον δείκτη σε μια φυλογενετική μελέτη που αφορούσε στενά συγγενικά είδη και ενδοειδική διαφοροποίηση στο γένος Anguis. 90

97 Συζήτηση Εικόνα 7.1. Τα φυλογενετικά δένδρα του mtdna (κάτω δεξιά) και ndna (πάνω αριστερά). Τα δένδρα που παρουσιάζονται είναι αυτά της ανάλυσης ΒΙ, ενώ στους κόμβους παρουσιάζονται οι τιμές bootstrap της NJ και οι τιμές pp της ΒΙ (επάνω από τους κλάδους) και οι τιμές bootstrap της ΜL (κάτω από τους κλάδους). Μόνο οι τιμές pp 0.50 και bootstrap>50 παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι στους κόμβους αντιστοιχούν σε τιμές pp=1.0 και bootstrap=100. Οι αριθμοί στους τελικούς κόμβους (Α1, Α2 κλπ και na1, na2 κλπ) αντιστοιχούν στους μιτοχονδριακούς και πυρηνικούς απλοτύπους (Παράρτημα Ι). Οι αριθμοί μέσα στις παρενθέσεις δίπλα σε αυτούς τους απλοτύπους (1, 2, ) αντιστοιχούν στους κωδικούς αριθμούς κάθε δείγματος (Παράρτημα Ι, Εικόνα 5.1). Κάθε κλάδος χαρακτηρίζεται από ένα γράμμα (Α, Β,... Θ, Ι) και ένα σύμβολο κωδικοποίησης. Σε εκείνη τη μελέτη, οι αναλύσεις του PRLR κατέληξαν σε ένα φυλογενετικό δένδρο που διέκρινε όλους τους κλάδους που προέκυψαν από τις αναλύσεις του μιτοχονδριακού δείκτη (Εικόνα 7.2), ενώ η γενετική ποικιλότητα του PRLR ήταν σημαντικά υψηλότερη, παρότι η φυλογενετική ιστορία του Anguis εκτιμήθηκε ως πιο πρόσφατη από αυτή του T. vermicularis (5,7 εκατ. χρόνια πριν, σε σύγκριση με 9,8 91

98 Συζήτηση εκατ. χρόνια πριν). Συγκεκριμένα, στην εργασία των Gvoždik et al. (2010α) εμφανίστηκαν περισσότερα ετερόζυγα άτομα (και σε περισσότερες από μία θέσεις), περισσότεροι πληροφοριακοί χαρακτήρες με βάση το κριτήριο της φειδωλότητας (1.8%), και υψηλότερες τιμές γενετικών αποστάσεων μεταξύ των τεσσάρων κλάδων του Anguis ( %). Εικόνα 7.2. Φυλογενετικό δένδρο (ML) του γένους Anguis βασισμένο σε μιτοχονδριακούς δείκτες (επάνω) και στον πυρηνικό δείκτη PRLR (κάτω) (Gvoždik et al. 2010α). 92

99 Συζήτηση Μια άλλη εξήγηση που έχει προταθεί σε κάποιες περιπτώσεις ερπετών, στις οποίες παρατηρείται υψηλή γενετική διαφοροποίηση στο mtdna και χαμηλή στο ndna, είναι αυτή ενός ταχύτερου ρυθμού εξέλιξης του μιτοχονδριακού DNA. Σε μια τέτοια περίπτωση το πρότυπο του mtdna είναι «πλασματικό», παρουσιάζοντας υψηλότερα επίπεδα διαφοροποίησης λόγω κάποιας ιδιαιτερότητας της βιολογίας του εκάστοτε οργανισμού (Harris et al., 2004β, Jesus et al. 2005, 2006). Παρόλα αυτά, αυτή η εξήγηση είναι μάλλον απίθανη για την περίπτωση του T. vermicularis. Οι προκαταρκτικές αναλύσεις του μοριακού ρολογιού έδειξαν ότι και οι δύο μιτοχονδριακοί δείκτες παρουσιάζουν ρυθμούς εξέλιξης παρόμοιους με εκείνους άλλων εξωθέρμων, και όχι υψηλότερους. Επίσης, ο εκτιμώμενος χρόνος του πιο πρόσφατου κοινού προγόνου (MRCA) των R. braminus/t. vermicularis συμπίπτει σχεδόν απόλυτα, σε ότι αφορά τα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης και όχι τόσο τη μέση τιμή (95% διαστήματα εμπιστοσύνης: εκατ. χρόνια πριν), με τον χρόνο που εκτίμησαν οι Vidal et al. (2010) (95% διαστήματα εμπιστοσύνης: εκατ. χρόνια πριν), βασιζόμενοι σε πέντε πυρηνικούς δείκτες. Συνεπώς, είναι μάλλον απίθανος ένας υψηλότερος ρυθμός εξέλιξης του μιτοχονδριακού DNA του T. vermicularis. Επομένως, η παραπάνω αδυναμία του πυρηνικού δείκτη PRLR να επιβεβαιώσει τη φυλογένεση που προέκυψε από το μιτοχονδριακό DNA μπορεί να οφείλεται: (α) στο φαινόμενο της γενετικής «συμπαράσυρσης» (genetic hitch-hiking) (Maynard- Smith & Haigh 1974), κατά το οποίο κάποιο αλληλόμορφο ή κάποια αλληλόμορφα (στη συγκεκριμένη περίπτωση του T. vermicularis αφορά εκείνο του τόπου PRLR) αυξάνει έντονα τη συχνότητα του λόγω θετικής επιλογής. Σε αυτήν την περίπτωση το παρατηρούμενο αποτέλεσμα μπορεί να μην οφείλεται στο συγκεκριμένο τόπο (PRLR) αλλά σε κάποιον άλλον με τον οποίο να είναι συνδεδεμένος (να κληρονομείται μαζί, π.χ. στο ίδιο χρωμόσωμα). (β) σε γενετική ροή που καθορίζεται από τα αρσενικά άτομα (male-biased gene flow), με επαναλαμβανόμενες διασπορές αρσενικών και σπάνιες διασπορές θηλυκών ατόμων. Αυτή η κατάσταση, που δεν έχει παρατηρηθεί στο T. vermicularis, οδηγεί σε υψηλή διαφοροποίηση στο μιτοχονδριακό DNA, που κληρονομείται μόνο μητρικά, και χαμηλή στο πυρηνικό. Σε κάθε περίπτωση, αυτή η ασυμβατότητα μεταξύ του μιτοχονδριακού DNA και του πυρηνικού δείκτη PRLR δεν μπορεί να ερμηνευθεί πλήρως στην παρούσα 93

100 Συζήτηση μελέτη. Απαιτείται μεγαλύτερη διερεύνηση με την ανάλυση περισσότερων, ανεξάρτητων μεταξύ τους, πυρηνικών δεικτών. Πάντως, εξαιτίας των πολύ χαμηλών επιπέδων γενετικής διαφοροποίησης που επέδειξε ο πυρηνικός δείκτης PRLR, μια συνδυασμένη φυλογενετική ανάλυση των μιτοχονδριακών και πυρηνικών δεικτών δεν θα είχε νόημα, και για αυτό τον λόγο δεν πραγματοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη. Εκτός αυτής της διαφοράς στα πρότυπα του mtdna και ndna, παρατηρείται και ακόμα μια διαφοροποίηση που αφορά στον μιτοχονδριακό κλάδο Θ. Συγκεκριμένα, αυτός ο κλάδος περιλαμβάνει απλοτύπους από μια μεγάλη γεωγραφική περιοχή που καλύπτει την ηπειρωτική Ελλάδα, τα νησιά του Ιονίου και του Αιγαίου, την Τουρκία και το Ιράν. Η γενετική διαφοροποίηση μέσα σε αυτόν τον κλάδο είναι πολύ μικρή, ενώ τόσο οι φυλογενετικές αναλύσεις (Εικόνα 7.1), όσο και η ανάλυση δικτύου (Εικόνα 6.5) δεν παρουσιάζουν κάποιο γεωγραφικό πρότυπο. Οι δείκτες F s του Fu και R 2 δείχνουν μια πρόσφατη πληθυσμιακή επέκταση με υψηλή στατιστική υποστήριξη (Πίνακας 6.2). Από την άλλη πλευρά, οι αναλύσεις του πυρηνικού δείκτη αποκαλύπτουν έναν αρκετά διαφοροποιημένο απλότυπο, τον nb2, ο οποίος εντοπίζεται σε τέσσερα άτομα μιας περιοχής της δυτικής Τουρκίας. Ενώ οι υπόλοιποι πυρηνικοί απλότυποι του συγκεκριμένου κλάδου (δηλαδή οι απλότυποι nb3-nb9) διαφοροποιούνται κατά μία μετάλλαξη από τον πιο κοινό απλότυπο nb1, ο nb2 διαφοροποιείται κατά εννιά μεταλλάξεις (Εικόνα 6.10). Η γενετική απόσταση για τον δείκτη PRLR μεταξύ αυτού του απλοτύπου και των υπολοίπων του κλάδου nb είναι 1.8%, μεγαλύτερη ακόμα και από αυτήν μεταξύ των κλάδων nb και na (Πίνακας 6.3). Επομένως, για τον μιτοχονδριακό κλάδο Θ, ο πυρηνικός δείκτης είναι αυτός που εμφανίζει μεγαλύτερη (και γεωγραφικά ορισμένη) υψηλότερη γενετική ποικιλότητα σε σχέση με τον μιτοχονδριακό. Αυτό το αποτέλεσμα δεν είναι πλήρως συμβατό με την υπόθεση ότι ο κλάδος Θ είναι αποκλειστικά αποτέλεσμα πρόσφατης διασποράς. Σε αντίστοιχες μελέτες ερπετών (Rato et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί), οι οποίες κατέληξαν σε παρόμοια αποτελέσματα, οι πιθανές ερμηνείες που δόθηκαν ήταν: (α) το φαινόμενο του «allele surfing» (Klopfstein et al. 2006). Σύμφωνα με την ερμηνεία αυτή, κάποιο ή κάποια αλληλόμορφα (στη συγκεκριμένη περίπτωση αυτό αφορά στο mtdna) αυξάνουν σε μεγάλο βαθμό τη συχνότητά τους κατά τη διάρκεια μιας γρήγορης γεωγραφικής εξάπλωσης σε νέες περιοχές. 94

101 Συζήτηση (β) το φαινόμενο της γενετικής «συμπαράσυρσης» (genetic hitch-hiking) (Maynard- Smith & Haigh 1974), κατά το οποίο κάποιο αλληλόμορφο (στη συγκεκριμένη περίπτωση αυτό αφορά πάλι στο mtdna) αυξάνει τη συχνότητα του λόγω θετικής επιλογής. Σε πρόσφατες μελέτες φυλογεωγραφίας ερπετών (Rato et al. 2010, 2011), η δεύτερη από τις δύο προαναφερόμενες ερμηνείες έχει προταθεί ως η πιο πιθανή. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται στην περίπτωση του T. vermicularis από τα αποτελέσματα των δεικτών F s του Fu και R 2, που δείχνουν ότι το mtdna έχει υποστεί κάποια επιλογική πίεση (Πίνακας 6.2). Αν και αυτό το αποτέλεσμα υποδεικνύει πρόσφατη γεωγραφική επέκταση, μπορεί να εξηγηθεί και με την ταυτόχρονη παρουσία της γενετικής «συμπαράσυρσης» (Rato et al. 2010, 2011). Και στην περίπτωση αυτής της «διαφωνίας» μεταξύ των προτύπων του mtdna και του πυρηνικού δείκτη PRLR, είναι σημαντική η ανάλυση περισσότερων ανεξάρτητων πυρηνικών δεικτών. Με τον τρόπο αυτό θα μπορούσε να επαληθευθεί ή όχι αυτό το πρότυπο του συγκεκριμένου πυρηνικού δείκτη. Εξάλλου, περισσότερο πληροφοριακή θα ήταν η ανάλυση δεικτών με μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα, όπως του μικροδορυφορικού DNA. 95

102 Συζήτηση 7.2 Φυλογενετικές σχέσεις, πολυτομίες και γενετική δομή Το T. vermicularis εμφανίζεται ως ένα μονοφυλετικό τάξο με υψηλή στατιστική υποστήριξη, αναφορικά με τις εξωομάδες που χρησιμοποιήθηκαν (R. braminus και R. simonii) (Εικόνα 7.1). Οι φυλογενετικές αναλύσεις του mtdna κατέληξαν σε ένα φυλογενετικό δένδρο που περιλαμβάνει δέκα κλάδους, των οποίων η μονοφυλετικότητα επίσης υποστηρίζεται ισχυρά. Όμως, οι μεταξύ τους σχέσεις είναι σε κάποιες περιπτώσεις άγνωστες, σχηματίζοντας πολυτομίες. Αυτοί οι δέκα βασικοί κλάδοι του T. vermicularis αντιστοιχούν σε ισάριθμες Εξελικτικά Σημαντικές Μονάδες (ESU), όπως προκύπτει από την ανάλυση δικτύου και τον έλεγχο Snn. Ο κλάδος που βρίσκεται στη βάση του φυλογενετικού δέντρου, δηλαδή ο κλάδος Α, διαφοροποιείται ισχυρά από όλους τους υπόλοιπους. Περιλαμβάνει δείγματα από την βορειοδυτική Ιορδανία και τη νότια Συρία, περιοχές που βρίσκονται στο νοτιοδυτικότερο άκρο της γεωγραφικής εξάπλωσης του είδους μελέτης (βλ. Εικόνα 2.9 στην Εισαγωγή). Όλοι οι πληθυσμοί που αντιπροσωπεύουν την υπόλοιπη κατανομή του είδους σχηματίζουν μια μονοφυλετική ομάδα, όπως επιβεβαιώνεται και από τις αναλύσεις του πυρηνικού δείκτη (Εικόνα 7.1). Η γενετική διαφοροποίηση μεταξύ του κλάδου Α και των υπολοίπων είναι πολύ υψηλή, τόσο για τους μιτοχονδριακούς όσο και για τον πυρηνικό δείκτη, με τιμές που φτάνουν το 5.9%, 12.7% και 3.0% για το 12S, το ND2 και το PRLR, αντίστοιχα (Πίνακες 6.1 και 6.3). Ο επόμενος κλάδος που διαχωρίζεται είναι ο κλάδος Β, ο οποίος περιλαμβάνει δείγματα από τη νοτιοδυτική Τουρκία, μια απομακρυσμένη περιοχή σε σχέση με την Ιορδανία και νότια Συρία. Οι υπόλοιποι, όμως, κλάδοι δεν σχηματίζουν μια μονοφυλετική ομάδα, καθώς η στατιστική υποστήριξη αυτού του κόμβου είναι χαμηλή. Ο έλεγχος πολυτομιών έδειξε ότι αυτή η πολυτομία είναι πιθανότατα μια πραγματική «σκληρή» πολυτομία. Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων μεταξύ του κλάδου Β και των υπολοίπων ESU είναι επίσης υψηλές, φτάνοντας το 3.9% και 8.5% για το 12S και το ND2, αντίστοιχα (Πίνακας 6.1). Ο κλάδος Γ περιλαμβάνει δείγματα από την οροσειρά Nur (ή Amanos), στην κεντρική νότια Τουρκία. Και πάλι, οι σχέσεις των υπόλοιπων κλάδων σχηματίζουν μια πραγματική πολυτομία, με βάση τον έλεγχο των πολυτομιών, ενώ μετά το διαχωρισμό του κλάδου Δ (Κύπρος) οι υπόλοιποι κλάδοι σχηματίζουν μια «μαλακή» 96

103 Συζήτηση πολυτομία, δηλαδή μια μη επιλυμένη φυλογένεση που πιθανώς οφείλεται σε έλλειψη δεδομένων. Με βάση την ανάλυση του μοριακού ρολογιού και την εκτίμηση των χρόνων απόσχισης, ο επόμενος κλάδος που διαχωρίζεται είναι ο κλάδος Ζ, ο οποίος περιλαμβάνει πληθυσμούς από την περιοχή Mersin της κεντρική νότιας Τουρκίας, ενώ οι κλάδοι ΣΤ (δυτική Συρία), Ε (νότια του Καυκάσου και δυτικό Ιράν) και Ι (βορειοδυτική Συρία) αποσχίζονται σχεδόν ταυτόχρονα (περίπου πριν 3,0 εκατ. χρόνια). Όλες οι παραπάνω σχέσεις, σύμφωνα με τον έλεγχο πολυτομιών, αφορούν πιθανώς πραγματικές πολυτομίες και αντιστοιχούν σε γεγονότα διαφοροποίησης που έγιναν σχεδόν ταυτόχρονα. Τέλος, οι κλάδοι H (περιοχή Şırnak της νοτιοανατολικής Τουρκίας) και Θ (πληθυσμοί από την ηπειρωτική Ελλάδα, τα νησιά του Ιονίου και του Αιγαίου, την Τουρκία και το Ιράν) υποστηρίζονται στατιστικά ως αδελφοί κλάδοι. Οι μιτοχονδριακοί κλάδοι του T. vermicularis παρουσιάζουν σημαντική γενετική διαφοροποίηση. Οι τιμές των γενετικών αποστάσεων στο εσωτερικό κάθε κλάδου είναι πολύ μικρές, ιδιαίτερα εάν συγκριθούν με αυτές μεταξύ των κλάδων (Πίνακας 6.1). Αυτό μπορεί να ερμηνευθεί ως ένδειξη ενός υψηλού επιπέδου γονιδιακής ροής μεταξύ των πληθυσμών κάθε κλάδου ή/και της ύπαρξης ενός ή περισσοτέρων φαινομένων γενετικής στενωπού (genetic bottleneck). Παρόλα αυτά, θα πρέπει να αναφερθεί, ως πιθανή ερμηνεία, και η περιορισμένη δειγματοληψία. Το γενικό φυλογεωγραφικό πρότυπο που αποκαλύπτεται από τα δεδομένα της παρούσας μελέτης αντιστοιχεί στην Κατηγορία Ι του Avise (2000), η οποία αφορά βαθιά γενεαλογικά δένδρα µε τις κύριες γενεαλογικές γραμμές να βρίσκονται σε αλλοπατρία. Το πρότυπο αυτό παρατηρείται μεταξύ πληθυσμών που έχουν χωριστεί για μεγάλα χρονικά διαστήματα. Συνήθως αφορά σε είδη που εξαπλώνονται σε μεγάλες γεωγραφικές περιοχές και έχουν χαμηλή ικανότητα διασποράς και γονιδιακής ροής (π.χ. μικρά χερσαία θηλαστικά, ερπετά, αμφίβια και ψάρια των γλυκών νερών). Το γενικό αυτό πρότυπο για το T. vermicularis συνοδεύεται από την παρουσία πολυτομιών, δηλαδή σχέσεων που δεν είναι αποσαφηνισμένες. Αυτές οι πολυτομίες μπορεί να είναι αποτέλεσμα ενός συνδυασμού έλλειψης δεδομένων (π.χ. αλληλουχίες με μικρό μήκος ή φυλογενετικοί κλάδοι που δεν αντιπροσωπεύτηκαν) και πιθανών παράλληλων γεγονότων κλαδογένεσης. Σε κάθε περίπτωση, η φύση των πολυτομιών αυτών δεν μπορεί να αποδειχθεί από τον έλεγχο πολυτομιών, ο οποίος είναι 97

104 Συζήτηση ενδεικτικός. Πάντως, σε γενικές γραμμές, έχει αποδειχτεί ότι σε πολλές περιπτώσεις φυλογενετικών μελετών σε ερπετά και αμφίβια η ανάλυση δύο μιτοχονδριακών δεικτών, ακόμα και σχετικά μικρού μήκους, συνήθως παράγει φυλογενετικά δένδρα με σαφείς ενδοειδικές σχέσεις (π.χ. Poulakakis et al. 2005, Carranza et al. 2006, Lymberakis et al. 2007, Beukema et al. 2010, Rato et al. 2010, Vasconcelos et al. 2010). Τέλος, οι πολυτομίες σε ένα γονιδιακό δένδρο (gene tree) δεν αντιστοιχούν υποχρεωτικά και σε πολυτομίες στο δένδρο των ειδών (species tree). 98

105 Συζήτηση 7.3 Προέλευση και αρχική διαφοροποίηση Στην ενότητα αυτή γίνεται μια προσπάθεια να διερευνηθεί η προέλευση του T. vermicularis. Αυτό δεν μπορεί να φανεί άμεσα από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης που είχε ως στόχο τη διερεύνηση της ενδοειδικής διαφοροποίησης του είδους, και συνεπώς τα παρακάτω συμπεράσματα απαιτούν ιδιαίτερη προσοχή αναφορικά με τη βαρύτητά τους. Παρόλα αυτά, υπάρχουν σημαντικές ενδείξεις που ευνοούν την πιθανότητα η προέλευση του είδους να είναι από το νοτιότερο άκρο της σημερινής γεωγραφικής του εξάπλωσης (από την Αφρική), σε αντιδιαστολή με μια προέλευση ανατολική (από την ανατολική Ασία). Συγκεκριμένα, οι πληροφορίες που μπορούν να υποστηρίξουν αυτό το σενάριο είναι: (α) Το παλαιότερο φυλογενετικό γεγονός πραγματοποιήθηκε στην περιοχή του Levant (η παράκτια ζώνη της ανατολικής Μεσογείου μεταξύ Ανατολίας και Αιγύπτου) και ο βασικός κλάδος του T. vermicularis (κλάδος Α) κατανέμεται γεωγραφικά στην Ιορδανία, τη νότια Συρία, το Ισραήλ (Gvoždik προσωπική επικοινωνία) και πιθανότατα και σε νοτιότερες γειτονικές περιοχές (Αίγυπτος). Με άλλα λόγια, υπάρχει μια ένδειξη ότι η προγονική κατανομή του εξεταζόμενου είδους είναι στο νοτιότερο άκρο της σημερινής του κατανομής, στην περιοχή όπου η Ασία επικοινωνεί με την Αφρική. (β) Το T. vermicularis είναι μορφολογικά συγγενέστερο με τα αφρικανικά είδη (των γενών Typhlops και Rhinotyphlops) (Wallach, 2002). Συγκεκριμένα, τα είδη T. vermicularis και T. etheridgei (βορειοδυτική Αφρική), είναι μορφολογικά πολύ όμοια και σχηματίζουν τον εξωτερικό κλάδο μιας ομάδας που περιλαμβάνει όλους τους αφρικανικούς αντιπροσώπους των Typhlopidae (Wallach 2002). Συνεπώς, φαίνεται ότι υπάρχει μια σχέση προέλευσης του εξεταζόμενου είδους με την Αφρική, και μάλιστα θα μπορούσε κανείς να υποστηρίξει ότι το είδος αυτό ή κάποιος πρόγονος του αποίκησε την Ευρασία από τη βορειοανατολική Αφρική παρά από την βορειοδυτική. Εάν το παραπάνω σενάριο είναι αληθές, η υπόθεση του Wallach (2002) ότι το είδος αποίκησε την Ευρώπη στα δυτικά, από τη βορειοδυτική Αφρική κατά τη διάρκεια της Κρίσης Αλατότητας του Μεσσηνίου, είναι μάλλον απίθανη. Εναλλακτικά, ο Wallach (2002), πρότεινε ότι το T. vermicularis ή ο πρόγονός του είχε στο παρελθόν μια πολύ μεγαλύτερη γεωγραφική κατανομή στην Ευρώπη, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από τα απολιθώματα (Szyndlar, 99

106 Συζήτηση 1991), και ότι αργότερα απομονώθηκε σε περιοχές του ευρωπαϊκού νότου. Σε αυτήν την περίπτωση η προέλευση των ευρωπαϊκών πληθυσμών είδους δεν συζητείται από τον ερευνητή. Εξάλλου, ο Wallach (2002) προτείνει ότι σε κάποιο χρονικό σημείο, ίσως κατά την Κρίση Αλατότητας του Μεσσηνίου, μπορεί να εξαπλώθηκε μέσω του Γιβραλτάρ στη βορειοδυτική Αφρική, όπου σήμερα βρίσκεται το μορφολογικά αδελφό του είδος, T. etheridgei. Φυσικά, το τελευταίο σενάριο απαιτεί περισσότερη διερεύνηση. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι στην εργασία των Vidal et al. (2010), η ανάλυση πυρηνικών γενετικών δεικτών εμφανίζει το T. vermicularis μέσα στον ευρασιατικό/αυστραλιανό κλάδο και όχι στον αφρικανικό (Εικόνα 2.7). Οι υποθέσεις που προτείνουν οι συγγραφείς, αναφορικά με την αποίκηση της Ευρασίας από τα Typhlopidae, είναι είτε από την Αφρική προς την Ευρώπη/Ασία (από δυτικά), είτε από την Ινδία όταν αυτή αποχωρίστηκε από την Indigascar (από ανατολικά) (Εικόνες 2.4). Η θέση του T. vermicularis ως του πιο προγονικού υποκλάδου μιας ομάδας που κατανέμεται στην Ασία (Ινδία και ανατολικότερα) και στην Αυστραλία, υποδεικνύει μια δυτική προέλευση των ασιατικών Typhlopidae, δηλαδή από την Αφρική προς την Ευρασία. Αυτό πιθανώς να έγινε από κάποιον πρόγονο του T. vermicularis (εφόσον αυτό το είδος είναι ο πιο βασικός κλάδος της ομάδας αυτής), γεγονός που ενισχύει την υπόθεση των αφρικανικών του συγγενειών. Πάντως, σε κάθε περίπτωση και με επιφύλαξη σχετικά με τα παραπάνω συμπεράσματα, φαίνεται ότι το T. vermicularis κατέχει μια ιδιαίτερης σημασίας θέση σε ό,τι αφορά την εξελικτική και βιογεωγραφική ιστορία των Typhlopidae. 100

107 Συζήτηση 7.4 Ιστορική βιογεωγραφία Σε αυτήν την ενότητα γίνεται μια περιγραφή των βασικών γεγονότων που φαίνεται να καθόρισαν ή να επηρέασαν σημαντικά τη φυλογενετική και βιογεωγραφική ιστορία του T. vermicularis. Η περιγραφή αυτή γίνεται χρονολογικά, από τα παλαιότερα γεγονότα προς τα νεότερα, ακολουθώντας τα αποτελέσματα της ανάλυσης του μοριακού ρολογιού, όπως φαίνονται στο χρονόγραμμα της Εικόνας 7.3. Στην ίδια εικόνα παρουσιάζεται επίσης μια γραφική απεικόνιση των θερμοκρασιακών διακυμάνσεων, με βάση τις θαλάσσιες καταγραφές των ισοτόπων οξυγόνου (Zachos et al. 2001). Εικόνα 7.3. Το χρονόγραμμα που προέκυψε από την ανάλυση μοριακού ρολογιού, στο οποίο παρουσιάζονται οι φυλογενετικές σχέσεις και οι εκτιμώμενοι χρόνοι απόσχισης των εξελικτικών γραμμών του T. vermicularis (οι τιμές που αναγράφονται στους κόμβους). Επίσης, παρουσιάζεται μια γραφική απεικόνιση των θερμοκρασιακών διακυμάνσεων, με βάση τις θαλάσσιες καταγραφές των ισοτόπων οξυγόνου (Zachos et al. 2001) και μια καταγραφή των βασικών κλιματικών και γεωλογικών γεγονότων που αναφέρονται στο κείμενο. 101

108 Συζήτηση Βικαριανισμός στις αρχές του Ύστερου Μειοκαίνου Τα αποτελέσματα της ανάλυσης Διασποράς-Βικαριανισμού (Εικόνα 6.6) δείχνουν ότι ένα βικαριανιστικό γεγονός πρέπει να πραγματοποιήθηκε στη σημερινή Μέση Ανατολή, το οποίο οδήγησε στο διαχωρισμό του κλάδου A από τους υπόλοιπους πληθυσμούς του T. vermicularis. Αυτό το γεγονός πρέπει να έλαβε χώρα πριν περίπου 9,8 εκατ. χρόνια (7,7-14,2 εκατ. χρόνια πριν), κατά το Τορτόνιο (Εικόνα 7.3). Σε αυτήν την περίοδο δεν έχουν καταγραφεί γεωλογικά γεγονότα που να έδρασαν με βικαριανιστικό τρόπο σε αυτήν την περιοχή, αν και νωρίτερα, κατά το Μέσο Σερραβάλλιο (~12,5 εκατ. χρόνια πριν), πιθανότατα να υπήρχε ένα θαλάσσιο φράγμα (με κατεύθυνση δυτικά-ανατολικά) που ένωνε την Μεσόγειο με την κεντρική Παρατηθύ (Rögl, 1999). Η περίοδος που εκτιμάται ότι έγινε αυτό το βικαριανιστικό γεγονός συμπίπτει με ένα ξηρό και ψυχρό κλιματικό «βήμα», από τα σημαντικότερα του Καινοζωικού (van Dam 2006). Έχει αποδειχθεί ότι μια γενικότερη μετάβαση προς ψυχρότερες και ξηρότερες συνθήκες πραγματοποιήθηκε μεταξύ 12 και 10 9 εκατ. χρόνια πριν, όπως φαίνεται από την αντικατάσταση των τροπικών δασών από φυλλοβόλα δάση στην Ευρώπη και στις περιοχές βόρεια της Μεσογείου, αλλά και από την εξαφάνιση των θερμόφιλων μαγκρόβιων δασών (Suc et al. 1999, Kovar-Eder 2003). Επίσης, το χρονικό διάστημα μεταξύ 10 και 8 εκατ. ετών συμπίπτει με τη μετανάστευση δασόβιων θηλαστικών στην κεντρική Ευρώπη, που λειτούργησε ως καταφύγιο γι αυτές τις ομάδες (Franzen & Storch 1999), ενώ ένα σημαντικό γεγονός ερημοποίησης (aridification) που χρονολογείται πριν περίπου 9 εκατ. χρόνια έχει διαπιστωθεί στη Μεσόγειο, όπως προκύπτει από τα απολιθώματα των μυρηκαστικών (Köhler 1993). Αυτή η, μεγάλης κλίμακας, ερημοποίηση έχει ερμηνευθεί ως αποτέλεσμα του κλεισίματος του θαλάσσιου διαύλου μεταξύ βόρειας και νότιας Αμερικής (Maier-Reimer et al. 1990) και των αλλαγών στα θαλάσσια ρεύματα, αλλά κυρίως της ανύψωσης των οροπέδιων του Θιβέτ και των Ιμαλαΐων, που πραγματοποιήθηκε πριν 10 έως 8 εκατ. χρόνια (An et al. 2001). Τα δύο αυτά γεγονότα επηρέασαν σε μεγάλο βαθμό το παγκόσμιο κλίμα. Είναι πολύ πιθανό οι έντονα ξηρές συνθήκες ή/και η απότομη μετάβαση από πιο υγρές σε πιο ξηρές συνθήκες, να αποτελούν παράγοντες που δρουν αρνητικά στην αναπαραγωγή και την επιβίωση του T. vermicularis. Πρόκειται για ένα αυστηρά εδαφόβιο φίδι, του οποίου η παρουσία σχετίζεται με υγρές περιοχές σχετικά χαμηλής 102

109 Συζήτηση βλάστησης (Arnold & Ovenden 2002, Valakos et al. 2008, προσωπικές παρατηρήσεις). Πολύ συχνά, πολλά άτομα του είδους συναθροίζονται, είτε για λόγους αναπαραγωγής, είτε, πιθανότατα, για διατήρηση της υγρασίας (Disi 2002), ενώ κατά τη διάρκεια των θερινών μηνών υποχωρούν σε βαθύτερα στρώματα του εδάφους για να αποφύγουν τις υψηλές θερμοκρασίες και την ξηρασία. Ενώ τα επίπεδα της υγρασίας φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στον κύκλο ζωής του, οι χαμηλές θερμοκρασίες δεν φαίνεται να το επηρεάζουν ιδιαίτερα, τουλάχιστον μακροπρόθεσμα και συγκριτικά με άλλα ερπετά. Το T. vermicularis μπορεί να βρεθεί σε μεγάλα υψόμετρα (1700 μ) ή/και σε μεγάλα γεωγραφικά πλάτη, όπου οι χαμηλές θερμοκρασίες και η χιονοκάλυψη επικρατούν για μεγάλο χρονικό διάστημα κατά τη διάρκεια του έτους. Επομένως, μια απότομη και έντονη μετάβαση σε πιο ξηρές συνθήκες κατά το Τορτόνιο είναι πολύ πιθανό να προκάλεσε κατακερματισμό της γεωγραφικής κατανομής του ζώου και να έδρασε ως βικαριανιστικός παράγοντας. Περίπου την ίδια περίοδο και στην ίδια περιοχή (νοτιοδυτική Ασία), έχει εκτιμηθεί ότι πραγματοποιήθηκε ένα παρόμοιο φυλογενετικό γεγονός στις σαύρες του γένους Mesalina, από το οποίο προέκυψε η εξελικτική γραμμή της Mesalina olivieri (Kapli et al. 2008). Όπως αναφέρουν οι συγγραφείς αυτής της εργασίας, αυτό το γεγονός ειδογένεσης πιθανώς συσχετίζεται με την αλλαγή του κλίματος που συνέβη σε αυτήν την περιοχή (βόρεια Αφρική και νοτιοδυτική Ασία). Βικαριανισμός κατά το Ύστερο Μειόκαινο Οι πληθυσμοί της νοτιοδυτικής Τουρκίας (κλάδος B) διαχωρίστηκαν φυλογενετικά από τους υπόλοιπους στο Ύστερο Μειόκαινο, περίπου πριν 6,4 εκατ. χρόνια (4,7-8,0 εκατ. χρόνια πριν) (Εικόνα 7.3), ακολουθώντας ένα βικαριανιστικό πρότυπο (Εικόνα 6.6). Παλαιοντολογικά δεδομένα δείχνουν ότι μια μεγάλη ισόχρονη παλαιοκλιματική αλλαγή προς περισσότερο ξηρές συνθήκες επηρέασε ολόκληρη τη Μεσόγειο περίπου πριν από 6,8-6,7 εκατ. χρόνια, κατά τη μετάβαση από το Τορτόνιο στο Μεσσήνιο (Krijgsman et al. 2002, Eronen et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Αυτή η περίοδος συμπίπτει με αρκετά επεισόδια εξαφανίσεων ζωικών ειδών, όπως η δραστική μείωση της πανίδας των μεγάλων θηλαστικών της περιόδου του Τουρολίου (Turolian megafauna), γνωστή ως το «Πικέρμιο γεγονός» (Pikermian event), που εξελίχθηκε περίπου 6,9 εκατ. χρόνια πριν (Kostopoulos 2009). Επίσης, συσχετίζεται με τους πρώτους παγετώνες του Μεσσηνίου (7,0 6,9 εκατ. χρόνια πριν), που σηματοδότησαν μια παγκόσμια 103

110 Συζήτηση εξάπλωση των C4 οικοσυστημάτων (Quade et al. 1994, Cerling et al. 1997, Barry et al. 2002, Krijgsman et al. 2002, Strömberg et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Αυτό το απότομο γεγονός ερημοποίησης είναι πιθανό να επηρέασε την εξέλιξη και τη βιογεωγραφία άλλων εξώθερμων οργανισμών αυτής της περιοχής, όπως προκύπτει από αποτελέσματα χρονολόγησης αρκετών φυλογενετικών μελετών. Οι Kyriazi et al. (2008) έδειξαν ότι τα κύρια γεγονότα γενετικής διαφοροποίησης της σαύρας Ophisops elegans πραγματοποιήθηκαν στην ανατολική Μεσόγειο πριν από περίπου 7,65 7 εκατ. χρόνια, σχεδόν ταυτόχρονα μεταξύ τους. Σύμφωνα με τους συγγραφείς, αυτή η ακτινωτή διαφοροποίηση συσχετίζεται με την ερημοποίηση του Ύστερου Μειοκαίνου. Παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν και για τη διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών σαυρών Mesalina guttulata και M. brevirostris (Kapli et al. 2008). Επίσης, οι έξι φυλογενετικοί κλάδοι που αποκαλύφθηκαν εντός της σαλαμάνδρας Lyciasalamandra luschani (και που αργότερα αναγνωρίστηκαν ως ξεχωριστά είδη), διαφοροποιήθηκαν περίπου πριν από 5,9 με 7,9 εκατ. χρόνια στη νοτιοανατολική Τουρκία (Weisrock et al. 2001), ενώ το βασικό φυλογενετικό γεγονός μεταξύ των μιτοχονδριακών κλάδων των τριτώνων Triturus karelinii χρονολογήθηκε στα 7 εκατ. χρόνια πριν (Wielstra et al. 2010). Στις τελευταίες δύο περιπτώσεις, οι ερευνητές απέδωσαν τα βικαριανιστικά γεγονότα σε τεκτονική δραστηριότητα και ορογενετική απομόνωση εξαιτίας της σύγκρουσης της Αραβίας με την Ευρασία (5-10 εκατ. χρόνια πριν) (Weisrock et al. 2001, Wielstra et al. 2010). Αυτή η εξήγηση δεν μπορεί να απορριφθεί και στην περίπτωση του T. vermicularis. Παρόλα αυτά, το σενάριο που προτείνεται στην παρούσα διατριβή, αυτό της ερημοποίησης του Ύστερου Μειοκαίνου ως βικαριανιστικού παράγοντα, είναι επίσης ιδιαίτερα πιθανό και για τις περιπτώσεις των παραπάνω ουροδελών αμφιβίων, καθώς και αυτά εξαρτώνται έντονα από τα επίπεδα υγρασίας. Ύστερο Μειόκαινο Πρώιμο Πλειόκαινο Οι μιτοχονδριακοί κλάδοι Γ, Δ, και Ζ διαφοροποιήθηκαν στο τέλος του Μειοκαίνου ή στις αρχές του Πλειοκαίνου, ή πιθανώς και κατά τη μετάβαση από το Μειόκαινο στο Πλειόκαινο. Συγκεκριμένα, οι κλάδοι αυτοί διαχωρίζονται περίπου πριν 5,6 εκατ. χρόνια (4,6-6,5 εκατ. χρόνια πριν), 5,2 εκατ. χρόνια (4,7-5,3 εκατ. χρόνια πριν) και 4,6 εκατ. χρόνια (3,3-5,1 εκατ. χρόνια πριν), αντίστοιχα (Εικόνα 104

111 Συζήτηση 7.3). Οι μέσες τιμές των χρόνων απόσχισης διαφέρουν κατά 0,4 και 0,6 εκατ. χρόνια, και τα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης συμπίπτουν σε μεγάλο βαθμό. Αναφορικά με τα αποτελέσματα της ανάλυσης Διασποράς-Βικαριανισμού, η απόσχιση του κλάδου Γ αντιστοιχεί σε ένα γεγονός διπλασιασμού (συμπάτρια ειδογένεση) στην ανατολική Ανατολία και ένα γεγονός διασποράς προς την Κύπρο ή ακόμα και προς την δυτική Ανατολία (γεωγραφικές περιοχές όπως φαίνονται στην Εικόνα 6.6). Ο διαχωρισμός του κλάδου Δ (Κύπρος), αντιστοιχεί σε ένα βικαριανιστικό γεγονός, από το οποίο προκύπτει ο κυπριακός κλάδος, και μια πιθανή διασπορά από την ανατολική προς τη δυτική Ανατολία (Εικόνα 6.6). Τέλος, η διαφοροποίηση του κλάδου Ζ προκύπτει από βικαριανισμό μεταξύ ανατολικής και δυτικής Ανατολίας (Εικόνα 6.6). Όλα αυτά τα, σχεδόν ταυτόχρονα, γεγονότα πραγματοποιήθηκαν στην ευρύτερη περιοχή της Ανατολίας και πιθανώς να οφείλονται στον ίδιο παράγοντα. Πρέπει, όμως, να αναφερθεί ότι οι τιμές του P για αυτά τα γεγονότα (ειδικά τα τελευταία δύο) είναι αρκετά χαμηλές, υποδεικνύοντας υψηλή αβεβαιότητα αναφορικά με τις προγονικές γεωγραφικές κατανομές. Προς το τέλος του Μειοκαίνου συνέβησαν, για μια ακόμα φορά, σημαντικές κλιματικές αλλαγές από υγρότερες σε ξηρότερες συνθήκες (Janis 1993, Fortelius et al. 2002, 2006). Έχει διαπιστωθεί ένα σημαντικό «βήμα» ξηροποίησης στην ενδοχώρα της Ασίας κατά το τέλος του Μειοκαίνου (π.χ. Guo et al. 2004), ενώ στην Ευρώπη είναι γνωστό ως Κρίση Αλατότητας του Μεσσηνίου (π.χ. Hsü et al. 1977, Krijgsman et al. 1999). Εξάλλου, σε αρκετές μελέτες έχει καταγραφεί μια παγκόσμια τάση προς ψυχρότερες και ξηρότερες συνθήκες κατά τη μετάβαση από το Μειόκαινο προς το Πλειόκαινο (π.χ. García-Alix et al. 2008). Αυτή η κλιματική αλλαγή, και η μεταβολή στους τύπους βλάστησης που την ακολούθησε (Cerling et al. 1997), ίσως να αποτελεί μία από τις σημαντικότερες αιτίες για ένα κύμα ακτινωτών διαφοροποιήσεων που παρατηρείται σε πολλά είδη (He et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Τέτοιες περιπτώσεις, για ερπετά και αμφίβια της περιοχής μελέτης, μπορεί να είναι ο διαχωρισμός του κεντρικού και δυτικού κλάδου στην ομάδα των τριτώνων T. karelinii (Wielstra et al. 2010) και η διαφοροποίηση μεταξύ των ειδών του γένους Anguis (Gvoždík et al. 2010α), που έγιναν εκείνη την περίοδο στην ευρύτερη περιοχή της ανατολικής Μεσογείου. Όσον αφορά την περίπτωση του κλάδου Δ, ο οποίος περιλαμβάνει πληθυσμούς της Κύπρου, η ανάλυση S-DIVA (Εικόνα 6.6) δείχνει μια βικαριανιστικού τύπου διαφοροποίηση πιθανότερα μεταξύ Κύπρου και Συρίας, παρά μεταξύ Κύπρου και 105

112 Συζήτηση ανατολικής Τουρκίας, αν και το δεύτερο σενάριο δεν αποκλείεται εντελώς. Εξάλλου, η χαμηλότερη τιμή γενετικής απόστασης για τον κυπριακό κλάδο είναι αυτή μεταξύ αυτού και του κλάδου Ι (βορειοδυτική Συρία) (Πίνακας 6.1). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τη γενετική συγγένεια μεταξύ των πληθυσμών ερπετών της Κύπρου και της Συρίας, όπως έχει φανεί και σε φυλογενετικές μελέτες άλλων ερπετών της περιοχής, και συγκεκριμένα των σαυρών Ablepharus budaki (Poulakakis et al. 2005) και Ophisops elegans (Kyriazi et al. 2008). Ύστερο Πλειόκαινο και Πρώιμο Πλειστόκαινο Οι κλάδοι ΣΤ, Ε και Ι φαίνεται να διαχωρίζονται από τους υπόλοιπους πληθυσμούς του T. vermicularis σχεδόν ταυτόχρονα κατά το Ύστερο Πλειόκαινο ή Πρώιμο Πλειστόκαινο, στα 3,3 εκατ. χρόνια πριν (2,5-4,4 εκατ. χρόνια πριν), 3,0 εκατ. χρόνια πριν (2,4-4,3 εκατ. χρόνια πριν) και 2,9 εκατ. χρόνια πριν (2,3-4.3 εκατ. χρόνια πριν), αντίστοιχα (Εικόνα 7.3). Και πάλι, οι μέσες τιμές των χρόνων απόσχισης διαφέρουν μόνο κατά 0,3 και 0,1 εκατ. χρόνια, και τα 95% διαστήματα εμπιστοσύνης συμπίπτουν σε μεγάλο βαθμό. Η μετάβαση από το Πλειόκαινο στο Πλειστόκαινο συνοδεύτηκε από σημαντικές κλιματικές αλλαγές, οι οποίες ακολουθήθηκαν από εξαφανίσεις μεγάλης κλίμακας, εκτός από περιοχές όπου οι κλιματικές συνθήκες παρέμειναν ευνοϊκές και λειτούργησαν ως καταφύγια (Hewitt 1996, 2000). Το θερμότερο και υγρότερο κλίμα του Ύστερου Πλειοκαίνου (3,6 2,5 εκατ. χρόνια πριν) (Willis et al. 1999) έγινε ψυχρότερο και ξηρότερο κατά το Πρώιμο Πλειστόκαινο (2,5 1,8 εκατ. χρόνια πριν) (Webb & Bartlein 1992), προκαλώντας κατακερματισμό των περιοχών εξάπλωσης φυτών και ζώων (Bennett 1990). Αυτή η μετάβαση έχει ήδη χαρακτηρισθεί ως υπεύθυνη για τη γενετική διαφοροποίηση πολλών ειδών στην περιοχή γύρω από τη Μεσόγειο (π.χ. για είδη θηλαστικών, βλ. Mouline et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Συγκεκριμένα για τα ερπετά, τέτοιες περιπτώσεις αφορούν τη σαύρα Chalcides ocellatus (Kornilios et al. 2010), άλλα είδη του γένους Chalcides (Carranza et al. 2008α), τους φυλογενετικούς κλάδους της σαύρας Anguis colchica (Gvoždík et al. 2010α), ενώ για τα αμφίβια, στην ίδια περίοδο εκτιμάται ότι έγινε η διαφοροποίηση μεταξύ των Hyla savignyi και H. felixarabica (Gvoždík et al. 2010β), καθώς και μεταξύ κάποιων κλάδων των βατράχων του γένους Pelophylax (Akın et al. 2010). 106

113 Συζήτηση Σε ότι αφορά το T. vermicularis, τα αποτελέσματα της ανάλυσης Διασποράς- Βικαριανισμού (Εικόνα 6.6) έδειξαν ότι συνέβησαν: (α) Ένα γεγονός διπλασιασμού στην ανατολική Ανατολία (διαχωρισμός του κλάδου ΣΤ στη δυτική Συρία) με μια διασπορά προς τα δυτικά. (β) Ένα βικαριανιστικό γεγονός που είχε ως αποτέλεσμα να διαχωριστεί ο κλάδος Ε (δυτικό Ιράν και περιοχές νότια του Καυκάσου). (γ) Ένα ακόμα γεγονός διπλασιασμού στην ανατολική Ανατολία που δημιούργησε τον κλάδο Ι (βορειοδυτική Συρία). Θα πρέπει, όμως, να αναφερθεί ότι οι τιμές του P για το πρώτο και τρίτο γεγονός είναι αρκετά χαμηλές (Εικόνα 6.6). Ενδιαφέρον προκαλεί το γεγονός ότι οι πληθυσμοί του βορειοδυτικού Ιράν σχηματίζουν ένα μονοφυλετικό κλάδο (κλάδος E) με αυτούς της βορειοανατολικής Τουρκίας και της περιοχής νότια του Καυκάσου. Ένα σχεδόν πανομοιότυπο πρότυπο παρατηρείται και στην περίπτωση του είδους Ophisops elegans (Kyriazi et al. 2008). Τόσο για το O. elegans όσο και για T. vermicularis, οι τιμές των γενετικών αποστάσεων μεταξύ των απλοτύπων του βορειοδυτικού Ιράν και αυτών της βορειοανατολικής Τουρκίας και της περιοχής νότια του Καυκάσου είναι πολύ μικρές (Πίνακας 6.1). Εξάλλου, για το T. vermicularis οι τιμές των παραμέτρων F s του Fu και R 2 (Πίνακας 6.2) υποδεικνύουν μια μεγάλη πιθανότητα πρόσφατης εξάπλωσης, χωρίς όμως να είναι γνωστή η κατεύθυνση αυτής της διασποράς. Διαφοροποίηση στο Πλειστόκαινο Οι κλάδοι Η και Θ διαφοροποιήθηκαν περίπου 2,0 εκατ. χρόνια πριν (1,4-3,0 εκατ. χρόνια πριν) στο Πλειστόκαινο, ή ίσως και νωρίτερα, στο όριο μεταξύ Πλειοκαίνου-Πλειστοκαίνου (Εικόνα 7.3). Και πάλι, κλιματικές αλλαγές, που σχετίζονται με τους παγετώδεις κύκλους, πιθανώς να οδήγησαν σε αυτό το γεγονός. Το φυλογενετικό γεγονός ερμηνεύεται από την ανάλυση Διασποράς-Βικαριανισμού ως αποτέλεσμα ενός διπλασιασμού στην ανατολική Ανατολία και μιας διασποράς προς τα δυτικά (δυτική Τουρκία, ηπειρωτική Ελλάδα, νησιά Ιονίου και Αιγαίου) και προς τα ανατολικά (ανατολική Τουρκία και Ιράν) (Εικόνα 6.6). Η ανάλυση δικτύου στατιστικής φειδωλότητας παρουσιάζει ένα δίκτυο με αστεροειδή μορφή για τον κλάδο Θ (Εικόνα 6.5), γεγονός που αποτελεί ένδειξη μιας πρόσφατης εξάπλωσης και που συμφωνεί με τα αποτελέσματα ανάλυσης των παραμέτρων F s του Fu και R 2 (Πίνακας 6.2). Το δίκτυο αυτό δεν έχει κάποια γεωγραφική δομή και, συνεπώς, δεν 107

114 Συζήτηση επιτρέπει την εξαγωγή συμπερασμάτων αναφορικά με την πηγή και την κατεύθυνση αυτής της πρόσφατης και ταχείας διασποράς. Η εξάπλωση του κλάδου Θ, που φαίνεται να πραγματοποιήθηκε πολύ γρήγορα και πρόσφατα και σε μια μεγάλη γεωγραφική περιοχή, μπορεί να είναι ανθρωπόχωρη. Έχουν περιγραφεί έξι βασικοί τρόποι με τους οποίους μεταφέρονται πληθυσμοί αμφιβίων και ερπετών από τον άνθρωπο: στους «εσκεμμένους» συγκαταλέγονται οι εισαγωγές ειδών για λόγους διαχείρισης (βιοέλεγχος), για τροφή, για χρήση ως κατοικίδια (pet trade), και η απελευθέρωση ζώων για προσωπική ικανοποίηση, ενώ στους «τυχαίους» ανήκουν οι αποδράσεις ζώων από χώρους εκτροφής και οι «λαθρεπιβάτες φορτίων» (cargo stowaways) (Kraus 2003). Οι λαθρεπιβάτες σε υλικά θερμοκηπίων είναι μια υποκατηγορία της τελευταίας περίπτωσης. Ο υπόγειος τρόπος διαβίωσης του T. vermicularis μπορεί να είναι υπεύθυνος για τον παθητικό τρόπο μεταφοράς του από τον άνθρωπο, εάν ένα τέτοιο σενάριο αληθεύει. Κάτι τέτοιο έχει επαληθευθεί και σε άλλες περιπτώσεις αντιπροσώπων της οικογένειας Typhlopidae, και μάλιστα στην ίδια περίπου γεωγραφική περιοχή (Afroosheh et al. 2010), και δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς η ανθρώπινη παρουσία και η εμπορική δραστηριότητα είναι πολύ παλιά και έντονη στην περιοχή γύρω από τη Μεσόγειο και έχει επηρεάσει τη γεωγραφική εξάπλωση πολλών ζώων (Kornilios et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Διαφοροποίηση εντός των βασικών φυλογενετικών κλάδων Η γενετική διαφοροποίηση του T. vermicularis εντός των κλάδων του μιτοχονδριακού DNA φαίνεται ότι πραγματοποιήθηκε πρόσφατα, στο Πλειστόκαινο, γεγονός που συσχετίζεται με τους παγετώδεις κύκλους (Εικόνα 7.3). Το κλίμα της περιοχής μελέτης περιλάμβανε θερμές/υγρές μεσοπαγετώδεις περιόδους και ψυχρές/ξηρές παγετώδεις περιόδους (Joannin et al και βιβλιογραφία που παρατίθεται εκεί). Οι τελευταίες τέσσερεις παγετώδεις περίοδοι του Πλειστοκαίνου είχαν πιθανότατα τη μεγαλύτερη επίδραση στην πανιδική σύσταση της Ανατολίας και των γειτονικών περιοχών (Çiplak 2004). Η βιογεωγραφική ιστορία και η γενετική διαφοροποίηση του T. vermicularis φαίνεται ότι επηρεάστηκαν περισσότερο από τις παγετώδεις περιόδους, λόγω κυρίως της αύξησης της ξηρασίας, καθώς οι θερμές και υγρές μεσοπαγετώδεις περίοδοι μάλλον είχαν θετική επίδραση στην επιβίωση και τη γεωγραφική του εξάπλωση. 108

115 Συζήτηση 7.5 Η σημασία της Ανατολίας ως καταφύγιο βιοποικιλότητας Η Ανατολία είναι μια γεωγραφική περιοχή της δυτικής Ασίας, η οποία ορίζεται από το Αιγαίο Πέλαγος, τη Μεσόγειο Θάλασσα και τον Εύξεινο Πόντο στα δυτικά, νότια και βόρεια, αντίστοιχα. Στα βορειοανατολικά και ανατολικά περιορίζεται από την οροσειρά του Καυκάσου και τα οροπέδια της Αρμενίας. Είναι μια περιοχή που χαρακτηρίζεται από έντονη γεωμορφολογία και ανάγλυφο, με αποτέλεσμα να περιλαμβάνει πολλές υποπεριοχές με διαφορετικές κλιματικές συνθήκες και τύπους βλάστησης (Sindaco et al. 2000). Λόγω της θέσης της και της έντονης γεωλογικής της ιστορίας κατά το Τριτογενές και Τεταρτογενές, η Ανατολία έχει λειτουργήσει στο παρελθόν ως γέφυρα αλλά και φράγμα στην εξάπλωση των ειδών μεταξύ Ασίας, Ευρώπης και Αφρικής (μέσω της σημερινής Μέσης Ανατολής) (Tchernov 1992). Εξάλλου, κατά τη διάρκεια των έντονων κλιματικών αλλαγών που πραγματοποιήθηκαν από το Ολιγόκαινο μέχρι σήμερα, και κυρίως κατά τη διάρκεια των παγετωδών κύκλων, έπαιξε σημαντικό ρόλο ως καταφύγιο, συγκρατώντας πληθυσμούς σε περιοχές με ευνοϊκές συνθήκες. Σε πολλές περιπτώσεις, κατά τη διάρκεια των μεσοπαγετωδών περιόδων, οι πληθυσμοί μετακινούνταν από τις περιοχές αυτές προς την Ευρώπη ή την Ασία (Hewitt 2001). Οι επαναλαμβανόμενες κλιματικές αλλαγές ώθησαν επανειλημμένα τους πληθυσμούς των ζωικών ειδών της Ανατολίας από το νότο προς τον βορρά και αντίστροφα (Çıplak 2003), ενώ όλα τα παραπάνω χαρακτηριστικά κατέστησαν την Ανατολία μια σημαντική περιοχή για τη δημιουργία και τη διατήρηση της βιοποικιλότητας. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων του mtdna της παρούσας μελέτης αποκάλυψαν κρυπτικούς εξελικτικούς κλάδους οι οποίοι αντιστοιχούν σε περιοχές που έδρασαν ως καταφύγια για το T. vermicularis στην Ανατολία. Αυτά τα καταφύγια (Εικόνα 7.4) είναι δασώδεις περιοχές με μεγάλο υψόμετρο και υψηλή υγρασία. Μέχρι τώρα, οι φυλογενετικές μελέτες σε ενδοειδικό επίπεδο, που αφορούν σε ερπετά και αμφίβια με συνεχή κατανομή στην περιοχή της Ανατολίας, είναι λίγες. Σε κάποιες από αυτές επιβεβαιώθηκε η ύπαρξη κρυπτικών γενετικών γραμμών μέσα στην Ανατολία. Συγκεκριμένα, το Ophisops elegans περιλαμβάνει τουλάχιστον τέσσερις γενετικές γραμμές στην Ανατολία (Kyriazi et al. 2008) (Εικόνα 7.5), ενώ οι Fritz et al. (2007) παρουσίασαν την ύπαρξη αρκετών γενετικών ποικιλιών στις χελώνες του είδους Testudo graeca στην Ανατολία, οι οποίες επιβεβαιώθηκαν από μορφολογικά δεδομένα (Türkozan et al. 2010) (Εικόνα 7.6). Οι βάτραχοι του είδους 109

116 Συζήτηση Pelophylax ridibundus παρουσιάζουν ένα παρόμοιο πρότυπο με πολλές κρυπτικές γραμμές (Plötner et al. 2001, Akin et al. 2010) (Εικόνα 7.7). Παρόμοια γενετική δομή αποκαλύφθηκε για το βάτραχο Rana macrocnemis (Veith et al. 2003) (Εικόνα 7.8). Τέλος, συγκρίνοντας τη γεωγραφική κατανομή των εξελικτικών κλάδων των παραπάνω ειδών (Εικόνες ) με αυτή των κλάδων του T. vermicularis (Εικόνα 7.9) μπορεί κανείς να παρατηρήσει ότι σε πολλές περιπτώσεις οι περιοχές που φαίνεται να «συντηρούν» γενετική ποικιλότητα είναι κοινές. Εικόνα 7.4. Χάρτης της Ανατολίας, όπου διακρίνονται οι περιοχές που προτείνονται ως καταφύγια γενετικής ποικιλότητας για το T. vermicularis. Εικόνα 7.5. Η γεωγραφική κατανομή των εξελικτικών κλάδων (με σκίαση διαφορετικού χρώματος ο καθένας) του είδους Ophisops elegans (Kyriazi et al. 2008). Με διακεκκομένη γραμμή συνδέονται γεωγραφικές περιοχές που περιλαμβάνονται στον ίδιο κλάδο. 110

117 Συζήτηση Εικόνα 7.6. Η γεωγραφική κατανομή των εξελικτικών κλάδων (με σκίαση διαφορετικού χρώματος ο καθένας) του είδους Testudo graeca (Fritz et al. 2007). Εικόνα 7.7. Η γεωγραφική κατανομή των εξελικτικών κλάδων (με κύκλους διαφορετικού χρώματος ο καθένας) του είδους Pelophylax ridibundus (Akin et al. 2010). 111

118 Συζήτηση Εικόνα 7.8. Η γεωγραφική κατανομή των εξελικτικών κλάδων (με διαφορετικά σύμβολα ο καθένας) του είδους Rana macrocnemis (Veith et al. 2003). Εικόνα 7.9. Η γεωγραφική κατανομή των κλάδων του T. vermicularis (με διαφορετικά σύμβολα ο καθένας). Τα είδη που αναφέρθηκαν, όπως και το T. vermicularis, έχουν μια ενιαία γεωγραφική κατανομή που καλύπτει ολόκληρη την Ανατολία. Σε αυτά αποκαλύφθηκε η ύπαρξη γενετικών «ποικιλιών», με τη βοήθεια μοριακών δεικτών, σε συγκεκριμένες περιοχές που θεωρούνται καταφύγια. Υπάρχουν, όμως, περιπτώσεις ειδών ερπετών των οποίων οι γεωγραφικές εξαπλώσεις είναι πολύ πιο 112