ΤΙΤΛΟΣ ΕΡΓΟΥ: TEΧΝΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΕΡΓΟΥ

Transcript

1 ΤΙΤΛΟΣ ΕΡΓΟΥ: «Βιώσιµη & ανταγωνιστική ιχθυοκαλλιέργεια: η αύξηση αντιστάθµισης ως καινοτόµος και φιλικότερη προς το περιβάλλον διαχειριστική πρακτική» TEΧΝΙΚΗ ΕΚΘΕΣΗ ΕΡΓΟΥ Επιστηµονική Υπεύθυνη: Παναγιώτα Παναγιωτάκη, Αν. Καθηγήτρια Κωδικός έργου: 4884 MIS: ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΙΧΘΥΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΙΝΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ 1

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή... 7 Το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης... 7 Είδη αντιστάθµισης Παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης Συγκριτική µελέτη πρωτοκόλλων µερικής ασιτίας επαναδιατροφής Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα ΜΕΤ75: ποσότητα τροφής 75% Μεθοδολογία Αποτελέσµατα Συζήτηση - Συµπεράσµατα Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα Β: 2 εβδοµάδες τάισµα-ασιτία, (εναλλάξ ανά ηµέρα) και 2 εβδοµάδες καθηµερινό τάισµα Μεθοδολογία Αποτελέσµατα Συζήτηση Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα Β: 4 Εβδοµάδες ασιτία και 8 εβδοµάδες επαναδιατροφή Μεθοδολογία Αποτελέσµατα Συζήτηση Συγκριτική µελέτη πρωτοκόλλων µερικής ασιτίας επαναδιατροφής σε πλωτούς ιχθυοκλωβούς Μεθοδολογία Δειγµατοληψίες Πειραµατικός σχεδιασµός Αποτελέσµατα Παράµετροι αύξησης

3 2.2.2 Χηµικές αναλύσεις µυϊκού ιστού Συµπεράσµατα Αύξηση αντιστάθµισης και έκφραση γονιδίων σχετιζόµενων µε το stress Εισαγωγή Μεθοδολογία Εξαγωγή ολικού RNA Αντίστροφη µεταγραφή mrna (RT-PCR) Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (qpcr) Σχετική γονιδιακή έκφραση Διατήρηση cdna βιβλιοθήκης Αποτελέσµατα Συναρµογή µεταγραφώµατος και επισηµείωση του Γονιδιακή έκφραση Μέτρηση Κορτιζόλης Συζήτηση Βλάβες DNA στο ήπαρ κατά την εφαρµογή πρωτοκόλλων αύξησηςαντιστάθµισης Εισαγωγή Μεθοδολογία Αποτελέσµατα Συµπεράσµατα Εκτίµηση Οικονοµικών δεικτών βάσει των αποτελεσµάτων Εισαγωγή Μεθοδολογία - Αποτελέσµατα Συµπεράσµατα Βιβλιογραφία Πρακτικά Συνεδρίων

4 Περίληψη Το συγκεκριµένο έργο είχε ως στόχο τη διερεύνηση της αύξησης αντιστάθµισης, στην εκτροφή της τσιπούρας (Sparus aurata), υπό διαφορετικά διαστήµατα ασιτίας επαναδιατροφής, ώστε να προκύψουν µεταχειριστικές πρακτικές εφαρµόσιµες από τους παραγωγούς, µε κύριο στόχο την εξοικονόµηση τροφής µε παράλληλη µείωση των επιπτώσεων των ιχθυοκαλλιεργειών στο περιβάλλον. Επιπλέον, σκοπός του έργου ήταν να µελετηθεί η επίδραση του πρωτοκόλλου σίτισης (διάρκεια ολικής-µερικής ασιτίας, διάρκεια επαναδιατροφής) στην αύξηση αντιστάθµισης σε συνθήκες πλωτών ιχθυοκλωβών, στα επίπεδα της έκφρασης γονιδίων σχετιζόµενων µε το stress και η εκτίµηση των επιπέδων καταπόνησης των οργανισµών στις περιόδους ασιτίας, τόσο σε βιοχηµικό όσο και σε µοριακό επίπεδο. Σύµφωνα µε την πρώτη φάση του έργου, τα πειράµατα της ασιτίας/ επαναδιατροφής έλαβαν χώρα στο εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας & Υδάτινου Περιβάλλοντος. Οι πειραµατικές διαδικασίες που ακολουθήθηκαν ήταν: µείωση των επιπέδων τροφής 75%, 50% και πλήρης ασιτία και επαναδιατροφή. Η πρώτη πειραµατική διαδικασία αφορούσε σε άτοµα τσιπούρας, τα οποία χωρίστηκαν σε δύο οµάδες (ΜΑ και ΜΕΤ75) των τριών επαναλήψεων, στα οποία χορηγήθηκε τροφή µε διαφορετικά ποσοστά. Συγκεκριµένα, στην οµάδα ΜΑ, χορηγούνταν καθηµερινά τροφή ποσότητας 100% και στην οµάδα ΜΕΤ75 ποσότητα τροφής 75%. Ύστερα από τον υπολογισµό παραµέτρων που αφορούν στην αύξηση και στην αξιοποίηση της τροφής, όπως η αύξηση βάρους (WG), ο ρυθµός αύξησης (GR), ο ειδικός ρυθµός αύξησης (SGR), ο ρυθµός µετατρεψιµότητας της τροφής (FCR) και η περιεκτικότητα λιπαρών οξέων στον µυϊκό ιστό των ψαριών, διαπιστώθηκε πως οι ρυθµοί αύξησης και των δύο οµάδων ήταν ίδιοι. Η δεύτερη πειραµατική διαδικασία της πρώτης φάσης, αφορούσε σε 260 νεαρά άτοµα τσιπούρας τα οποία χωρίστηκαν σε 2 οµάδες, αυτή του µάρτυρα Μ, η οποία ταΐζονταν καθηµερινά και αυτή των µεταχειρίσεων Β, µε δύο (2) εβδοµάδες τάισµα-ασιτία, εναλλάξ ανά ηµέρα (µια ηµέρα τάισµα µια ηµέρα ασιτία), και δύο (2) εβδοµάδες καθηµερινό τάισµα. Σε όλες τις πειραµατικές οµάδες, µετά το πέρας του πειράµατος, παρατηρήθηκε αύξηση του βάρους, χωρίς όµως να παρατηρηθεί καµία απώλεια βάρους στα άτοµα της µεταχείρισης που πέρασαν περιόδους 4

5 ασιτίας. Βέβαια, τα άτοµα των µαρτύρων που σιτίστηκαν σε καθηµερινή βάση έδειξαν ταχύτερους ρυθµούς ανάπτυξης από τα άτοµα της µεταχείρισης. Κατά την τρίτη πειραµατική διαδικασία της πρώτης φάσης, χρησιµοποιήθηκαν άτοµα τσιπούρας για τη µελέτη του φαινοµένου της αντιστάθµισης. Τα ψάρια χωρίστηκαν σε δύο οµάδες µε τρεις επαναλήψεις η κάθε µία. Η πρώτη οµάδα µάρτυρες σιτίζονταν ad libitum δύο φορές την ηµέρα και η δεύτερη υποβλήθηκε σε ασιτία για 4 εβδοµάδες. Την περίοδο της νηστείας παρατηρήθηκε µείωση του βάρους των ψαριών και στη συνέχεια, µε την εκ νέου χορήγηση τροφής, παρατηρήθηκε µερική αντιστάθµιση. Με την ολοκλήρωση του τρίτου πειράµατος της πρώτης φάσης, τα άτοµα που ανήκαν στη µεταχείριση του µάρτυρα παρουσίασαν τη µεγαλύτερη αύξηση σωµατικού βάρους. Για τις ανάγκες της δεύτερης φάσης του έργου, πραγµατοποιήθηκαν δειγµατοληψίες στις εγκαταστάσεις της εταιρείας Αφοί Μαντέ & ΣΙΑ Ο.Ε., µε σκοπό τη µελέτη του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης σε πραγµατικές συνθήκες εντατικής εκτροφής. Από τα αποτελέσµατα της παρούσας φάσης του έργου, διαφαίνεται ότι σε συνθήκες εφαρµοσµένης ιχθυοκαλλιέργειας, το επίπεδο σίτισης 75% είναι δυνατό να εφαρµοστεί σε άτοµα τσιπούρας µε µέσο βάρος 35gr και για χρονική διάρκεια 12 εβδοµάδων χωρίς να µειωθεί ο ρυθµός αύξησής τους. Στην τρίτη φάση υλοποίησης του έργου, σκοπός της πειραµατικής διαδικασίας ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο το πρωτόκολλο ταΐσµατος (διάρκεια ασιτίας) επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση των gcr, gpx, gr, igf-i και igf-ii γονιδίων, σχετιζόµενων µε το stress. Για τη µέτρηση της έκφρασης των παραπάνω γονιδίων πραγµατοποιήθηκε εξαγωγή ολικού RNA από το ήπαρ τσιπούρας, αντίστροφη µεταγραφή RT-PCR και ποσοτική PCR (qpcr). Η κατασκευή cdna βιβλιοθήκης έχει ολοκληρωθεί και διατηρείται στις εγκαταστάσεις του τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος. Με τον τρόπο αυτό, είναι δυνατό να ανατρέξουµε στην εξεύρεση γονιδίων από συγκεκριµένους ιστούς και συγκεκριµένους πειραµατικούς σχεδιασµούς. Για την ολοκλήρωση του συγκεκριµένου παραδοτέου, ολοκληρώθηκε η παροχή υπηρεσίας αλληλούχησης γονιδιώµατος (Illumina sequencing) στο εξωτερικό, ύστερα από τη διενέργεια δύο άγονων πρόχειρων µειοδοτικών διαγωνισµών, από τον ΕΛΚΕ του Πανεπιστήµιου Θεσσαλίας, για την εξεύρεση παρόχου υπηρεσίας αλληλούχησης, στην ηµεδαπή. Για την υλοποίηση του τέταρτου παραδοτέου του έργου, στις πειραµατικές µεταχειρίσεις, υπολογίστηκε το ποσοστό βλάβης του DNA µε τη µέθοδο 5

6 ηλεκτροφόρησης µεµονωµένων κυττάρων σε πήκτωµα αγαρόζης (Single Cell Gel Electrophoresis SCGE), γνωστή και ως comet assay. Επίσης, έγινε προσπάθεια εκτίµησης του stress λόγω ολικής/µερικής ασιτίας επαναδιατροφής, µε τη µέθοδο ELISA σε εντατικά εκτρεφόµενα ψάρια. Η ποσοτικοποίηση της βλάβης του DNA είναι δυνατό να προσφέρει µια εκτίµηση της ευρωστίας του οργανισµού. Τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι η βλάβη του γενετικού υλικού είναι ανάλογη των επιπέδων ασιτίας. Επιπλέον, η πιθανή παραγωγή ελεύθερων ριζών κατά τις πρώτες εβδοµάδες ασιτίας, λόγω διαταραχής του µεταβολισµού, ίσως ευθύνεται για τη βλάβη στο γενετικό υλικό. Τέλος, στην πέµπτη και τελευταία φάση του έργου, έγινε προσπάθεια να διερευνηθεί η επίδραση της µερικής ασιτίας (75%) στην αύξηση της τσιπούρας καθώς και η αποτίµηση του οικονοµικού οφέλους που προκύπτει από τη µειωµένη χορήγηση τροφής, µέσω υπολογισµού δεικτών χρηµατοοικονοµικής ανάλυσης. Υπολογίστηκαν ο δείκτης αποδοτικότητας, ο οικονοµικός δείκτης µετατρεψιµότητας και ο οικονοµικός δείκτης κέρδους. Στηριζόµενοι στα αποτελέσµατα, διαπιστώθηκε µια σηµαντική µείωση της τροφής που καταναλώθηκε, της τάξης του 33,7%. Η µείωση αυτή συνεπάγεται τη σηµαντική συµπίεση του κόστους εκτροφής και κατ επέκταση µια αξιοσηµείωτη αύξηση του καθαρού κέρδους. 6

7 Εισαγωγή Το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης Πολλοί ζωικοί οργανισµοί εκτρεφόµενοι ή µη, παρουσιάζουν ταχύτερη ανάπτυξη κατά τη διάρκεια της ανάκαµψης τους µετά από µια περίοδο ολικής ή µερικής ασιτίας απ ότι σε περιόδους που η προσφορά τροφής συνεχίζονταν κανονικά (Wilson & Osbourn, 1960, Jobling 1994, Ali et al., 2003). Το αποτέλεσµα είναι ότι, άτοµα που διανύουν µία τέτοια περίοδο ασιτίας και επαναδιατροφής να φτάνουν στο ίδιο µέγεθος µε άτοµα του ίδιου είδους που ζουν σε φυσιολογικές συνθήκες. Ο µηχανισµός που τείνει να επαναφέρει την αύξηση σε κανονική τροχιά ονοµάζεται αύξηση αντιστάθµισης και στην επιστηµονική βιβλιογραφία εµφανίζεται ως «growth compensation». Αρχικά, η µελέτη της αντισταθµιστικής αύξησης εφαρµόστηκε στα θηλαστικά και στη συνέχεια πειραµατικά σε µια οµάδα κατοικίδιων ζώων (Wilson&Osbourn 1960). Αργότερα, στις δεκαετίες του 1970 και του 1980 πραγµατοποιήθηκαν οι πρώτες εργασίες σε ψάρια, όπου τα αποτελέσµατα αυτών, δεν επιβεβαίωσαν τις προσδοκίες σχετικά µε τους ρυθµούς αύξησης, σε διαδοχικές περιόδους ασιτίας (Bilton & Robins 1973, Zivkov 1982). Αργότερα, πραγµατοποιήθηκαν πειράµατα πιο συγκροτηµένα και επιστηµονικά τεκµηριωµένα, σε είδη που σχετίζονται µε την ιχθυοκαλλιέργεια. Αυτό είχε ως αποτέλεσµα το φαινόµενο της αύξησης της αντιστάθµισης να τραβήξει την προσοχή των επιστηµόνων στο χώρο της υδατοκαλλιέργειας. Σήµερα, το συγκεκριµένο θέµα έχει µελετηθεί σε σηµαντικό αριθµό ειδών ψαριών, (Jobling et al. 1994, Zhu et al. 2001, Zhu et al. 2003, Ali et al. 2003, Πανταρίδης 2005, Μακρυβέλιος 2007). Ωστόσο, δεν είναι ακόµα εξακριβωµένο ποιος είναι ο ρόλος της αύξησης αντιστάθµισης σε φυσικούς πληθυσµούς ή το πώς µπορεί το φαινόµενο να χρησιµοποιηθεί στην ιχθυοκαλλιέργεια. Σχεδόν όλες οι πειραµατικές εφαρµογές έχουν πραγµατοποιηθεί σε εργαστήρια, µε συνέπεια να γνωρίζουµε ελάχιστα για την επίδραση του φαινοµένου σε φυσικούς πληθυσµούς. Η σπουδαιότητα της αύξησης αντιστάθµισης σε άτοµα ή οµάδες ατόµων που περνούν περιόδους ασιτίας, είναι η επίτευξη µεγέθους περίπου ίδιου µε του οργανισµού ο οποίος βρίσκεται πάντα σε περιβάλλον µε επάρκεια τροφής (Risca et al. 1984). 7

8 Η πιθανή θετική εφαρµογή του φαινοµένου της αντιστάθµισης στις ιχθυοκαλλιέργειες, εκτός της εξοικονόµησης της τροφής από τη διατροφή των ψαριών που συνεπάγεται σηµαντική µείωση του κόστους παραγωγής, έχει ως άµεσο αποτέλεσµα και τη µείωση των επιπτώσεων της εκτροφής στο υδάτινο περιβάλλον. Οι παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόµενο της αντιστάθµισης είναι τα πρωτόκολλα σίτισης (διάρκεια µερικής ή ολικής ασιτίας, διάρκεια επαναδιατροφής), διάφοροι περιβαλλοντικοί παράγοντες (θερµοκρασία, Maclean & Metcalfe 2001, αλατότητα, Damsgard & Arnesen 1998, οξυγόνο, Foss & Imsland 2002, ιχθυοφόρτιση και παραλλακτικότητα των µεγεθών, Jobling & Koskela 1996), οι επιπτώσεις επί των συστατικών και των οργάνων του σώµατος (Weatherley & Gill 1981, Quinton & Blake 1990) και η απώλεια βάρους. Η αύξηση της αντιστάθµισης είναι δυνατό να ευνοείται από τη µείωση του ρυθµού µεταβολισµού του ψαριού κατά τη διάρκεια στέρησης της τροφής. Υπάρχουν 4 φάσεις αντίδρασης στον περιορισµό τροφής και της επακόλουθης επανασίτισης: τη φάση της καταπόνησης, που χαρακτηρίζεται από ένα καθεστώς υπέρ-ενεργητικότητας (π.χ. αναζήτηση τροφής), τη φάση της αλλαγής µε τη συνεχιζόµενη στέρηση της τροφής, τη µείωση του κανονικού ρυθµού της αναπνοής όπως και της κινητικότητας, τη φάση της προσαρµογής µε τη σταθεροποίηση του µεταβολισµού σε χαµηλά επίπεδα και τη φάση της αποκατάστασης όπου γίνεται απότοµη αύξηση των επιπέδων κατανάλωσης οξυγόνου, αλλά και της αύξησης σε απόλυτη σχέση µε την περίοδο της ασιτίας. Η εποχική διακύµανση εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τον παράγοντα θερµοκρασία. Αποδείχτηκε ότι ο σολοµός, (Salmo salar) εµφάνισε µικρή αντιστάθµιση, στις χαµηλές θερµοκρασίες του φθινοπώρου, σε αντίθεση µε το καλοκαίρι, κατά το οποίο οι υψηλές θερµοκρασίες ευνόησαν την αύξηση (Maclean&Metcalfe 2001). Τα µέχρι τώρα στοιχεία από τη µελέτη του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης στα εκτρεφόµενα ψάρια, επικεντρώνονται στην επίδραση της θερµοκρασίας (Maclean & Metcalfe 2001), της ποσότητας της τροφής (Zhu et al. 2001) και της συχνότητας εναλλαγής ασιτίας - επαναδιατροφής (Quinton & Blake 1990). Το συγκεκριµένο φαινόµενο µελετά το τελικό βάρος των ψαριών, µετά την επαναδιατροφή τους, συγκριτικά µε αυτό των ατόµων τα οποία σιτίζονταν κανονικά. Το φαινόµενο δεν έχει µελετηθεί στην τσιπούρα εκτενώς, ούτε ως προς 8

9 την επίδραση της θερµοκρασίας, ούτε και ως προς την ποσότητα της προσφερόµενης τροφής. Επίσης, υπάρχουν ελάχιστες πληροφορίες σχετικά µε τα χρονικά διαστήµατα εναλλαγής ασιτίας ή περιορισµένης διατροφής - επαναδιατροφής. Η ανάγκη µείωσης του κόστους παραγωγής στις ιχθυοκαλλιέργειες, τόσο στη χώρα µας όσο και σε παγκόσµια κλίµακα, αποτέλεσε βασική ιδέα αυτής της πρότασης, δεδοµένου ότι η τσιπούρα αποτελεί το κυριότερο είδος που εκτρέφεται σε πλωτούς ιχθυοκλωβούς στη χώρα µας. Τα πειράµατα της ασιτίας/επαναδιατροφής έχουν υλοποιηθεί σε πειραµατική µικρο-κλίµακα (ελεγχόµενες συνθήκες στο εργαστήριο) και προγραµµατίζονται να υλοποιηθούν σε συνθήκες πραγµατικής παραγωγής (πλωτοί κλωβοί σε ιχθυοµονάδα). Επιπλέον, έρευνες σε εκτρεφόµενους ζωικούς οργανισµούς έχουν δείξει ότι η έκφραση γονιδίων µπορεί να µεταβληθεί ανάλογα µε τη διαθεσιµότητα θρεπτικών ουσιών. Από την σκοπιά της διατροφογενοµικής (nutrigenomics), τα θρεπτικά είναι διατροφικά σήµατα, τα οποία ανιχνεύονται από το κυτταρικό σύστηµα αισθητήρων και τα οποία επηρεάζουν την έκφραση των γονιδίων και των πρωτεϊνών. Κατά συνέπεια, µε τη µελέτη της γονιδιακής έκφρασης υπάρχει η δυνατότητα εκτίµησης της διατροφικής κατάστασης ενός ψαριού. Είναι γεγονός ότι η αύξηση αντιστάθµισης, µε κύριο σκοπό τη συµπίεση του κόστους παραγωγής εισάγει, λόγω της εφαρµοζόµενης ολικής ή µερικής ασιτίας, επιπλέον καταπόνηση (stress) στα ψάρια. Η εκτίµηση της εν λόγω καταπόνησης, µε σύγχρονες και ακριβείς τεχνικές (ELISA, alkaline comet assay), θεωρείται απαραίτητη για την εφαρµογή πρωτοκόλλων ολικής ή µερικής ασιτίαςεπαναδιατροφής. Για τη διατροφή των ψαριών απαιτούνται υψηλά ποσοστά ζωικών πρωτεϊνών, στις οποίες οφείλεται και το υψηλό κόστος των ιχθυοτροφών. Για το λόγο αυτό, η ποσότητα χορηγούµενης τροφής και οι πρακτικές εντατικής εκτροφής των ψαριών σε ιχθυοκλωβούς είναι πρωταρχικής σηµασίας για τη βιωσιµότητα και ανταγωνιστικότητα των ιχθυοκαλλιεργειών. Πρέπει επίσης να σηµειωθεί ότι η φθίνουσα πορεία των παγκόσµιων αλιευµάτων, επηρεάζει την υδατοκαλλιέργεια, λόγω του γεγονότος ότι τα ιχθυάλευρα και τα ιχθυέλαια αποτελούν τη βασικότερη πρώτη ύλη για την παραγωγή ιχθυοτροφών. Επιπλέον, τα ψάρια είναι εξαιρετική πηγή πρωτεϊνών και ο µυϊκός ιστός τους περιέχει ισορροπηµένη σύσταση αµινοξέων, καθιστώντας τα σηµαντικό κοµµάτι 9

10 της ανθρώπινης δίαιτας σε πολλές χώρες (Jobling 2001). Οι πρωτεΐνες της σάρκας των ιχθύων είναι υψηλής βιολογικής αξίας και περιέχουν όλα τα απαραίτητα αµινοξέα σε σηµαντική ποσότητα και ισορροπηµένη αναλογία, ενώ έχουν εξαιρετική πεπτικότητα. Επίσης, οι ιχθύες αποτελούν πηγή πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, των οποίων οι ευεργετικές ιδιότητες στην ανθρώπινη υγεία έχουν αναφερθεί εκτενώς σε πολλές έρευνες. Η λιποπεριεκτικότητα των ιχθύων διαφέρει ανάλογα µε το είδος. Είδη αντιστάθµισης Τα είδη αντιστάθµισης διακρίνονται: Στην πλήρη αντιστάθµιση κατά την οποία τα άτοµα που στερήθηκαν τροφής κατορθώνουν τελικά και φθάνουν το ίδιο µέγεθος µε αυτά στα οποία προσφέρονταν τροφή συνεχώς. Στη µερική αντιστάθµιση κατά την οποία παρατηρείται αποτυχία των ατόµων που πέρασαν περίοδο ασιτίας να φτάσουν στο µέγεθος τα άτοµα στα οποία η τροφή προσφέρονταν χωρίς διακοπή. Όµως, τα άτοµα αυτά ανέπτυξαν ταχύτερους ρυθµούς ανάπτυξης, γεγονός που ενδεχοµένως να οφείλεται στο ότι παρουσίασαν καλύτερη µετατρεψιµότητα τροφής κατά τη διάρκεια της επαναδιατροφής τους. Στην υπέρ-αντιστάθµιση κατά την οποία τα άτοµα που πέρασαν µία περίοδο ασιτίας κατορθώνουν και ξεπερνάνε σε µέγεθος τα αντίστοιχα άτοµα στα οποία η τροφή προσφέρονταν χωρίς διακοπή (Ali et al. 2003). Παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης Οι παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόµενο της αντιστάθµισης είναι: 1. Η επίδραση του πρωτοκόλλου ταΐσµατος (διάρκεια µερικής ή ολικής ασιτίας, διάρκεια επαναδιατροφής). 2. Η επίδραση των περιβαλλοντικών παραγόντων. Οι περιβαλλοντικοί παράγοντες παίζουν καθοριστικό ρόλο στην αύξηση αντιστάθµισης. Οι κυριότεροι εξ αυτών είναι: η θερµοκρασία, η αλατότητα, η παροχή οξυγόνου, η ιχθυοφόρτιση και η παραλλακτικότητα των µεγεθών. 3. Επιπτώσεις επί των συστατικών και των οργάνων του σώµατος 10

11 Ο τύπος της αύξησης αντιστάθµισης µπορεί να επηρεάσει διαφορετικά τα συστατικά του σώµατος (Weatherley & Gill 1981, Quinton & Blake 1990). 4. Απώλεια βάρους και αύξηση της αντιστάθµισης Η αύξηση της αντιστάθµισης είναι δυνατό να ευνοείται από τη µείωση του ρυθµού µεταβολισµού του ψαριού κατά τη διάρκεια στέρησης της τροφής. Οι Wieser et al. (1992) πρότειναν 4 φάσεις αντίδρασης στον περιορισµό τροφής και της επακόλουθης επανασίτισης: i) τη φάση της καταπόνησης, που χαρακτηρίζεται από ένα καθεστώς υπέρενεργητικότητας (π.χ. αναζήτηση τροφής), ii) τη φάση της αλλαγής µε τη συνεχιζόµενη στέρηση της τροφής, τη µείωση του κανονικού ρυθµού της αναπνοής όπως και της κινητικότητας, iii) τη φάση της προσαρµογής µε τη σταθεροποίηση του µεταβολισµού σε χαµηλά επίπεδα και iv) τη φάση της αποκατάστασης όπου γίνεται απότοµη αύξηση των επιπέδων κατανάλωσης οξυγόνου, αλλά και της αύξησης σε απόλυτη σχέση µε την περίοδο της ασιτίας. 5. Εποχική διακύµανση Η εποχική διακύµανση εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από τον παράγοντα θερµοκρασία. Έτσι, λοιπόν, ο σολοµός, (Salmon salar) στις χαµηλές θερµοκρασίες του φθινοπώρου εµφάνισε µικρή αντιστάθµιση, σε αντίθεση µε το καλοκαίρι, κατά το οποίο οι υψηλές θερµοκρασίες ευνόησαν την αύξηση της αντιστάθµισης (Maclean & Metcalfe 2001). 11

12 1 Συγκριτική µελέτη πρωτοκόλλων µερικής ασιτίας επαναδιατροφής 1.1 Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα ΜΕΤ75: ποσότητα τροφής 75% Μεθοδολογία Κατά την πρώτη φάση της πειραµατικής διαδικασίας, η οποία πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του Τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, µελετήθηκε το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης σε τσιπούρες υπό διαφορετικά διαστήµατα ασιτίας επαναδιατροφής. Παρακάτω παρατίθενται τα αποτελέσµατα του 1 ου από τα 3 πειράµατα µε διαφορετικούς χρόνους και διαφορετικά ποσοστά χορήγησης τροφής. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν νεαρά άτοµα τσιπούρας, τα οποία προήλθαν από τις ιχθυοκαλλιέργειες Αφοί Μαντέ και ΣΙΑ Ο.Ε. Η µεταφορά τους πραγµατοποιήθηκε µε ειδικές ισοθερµικές δεξαµενές µε οξυγόνο. Μετά την περίοδο εγκλιµατισµού τους, που διήρκησε 14 ηµέρες, τοποθετήθηκαν ισάριθµα τυχαία σε δεξαµενές χωρητικότητας 500L η καθεµία. Οι δεξαµενές που χρησιµοποιήθηκαν ήταν κυλινδρικές και κατασκευασµένες από πολυεστέρα. Η είσοδος του νερού γινόταν επιφανειακά υπό πίεση και περιφερειακά ώστε να προκαλεί κυκλική ροή του νερού. Το νερό ανακυκλωνόταν µέσω των αντλιών (Tetra DHP 4200) σε ειδικό σύστηµα διήθησης (Tetra Pond BP4000-UV) µε µέγιστη δυνατότητα ροής στα 15m 3 /h. Οι δεξαµενές διέθεταν κλειστό κύκλωµα κυκλοφορίας νερού. Επίσης υποστηριζόταν από σύστηµα µηχανικού-βιολογικού φίλτρου του νερού για την αποµάκρυνση της συνολικής αµµωνίας, των περιττωµάτων και υπολειµµάτων τροφής. Σε καθηµερινή βάση πραγµατοποιούνταν σιφωνισµός του πυθµένα και αντικατάσταση του νερού έως και 30%. Ο µάρτυρας σιτιζόταν µε συχνότητα 2 φορές ηµερησίως. Μετά την πλήρη προσαρµογή των ψαριών, τα ιχθύδια διαχωρίστηκαν σε 2 οµάδες (Μάρτυρας ΜΑ και Μεταχείριση ΜΕΤ75) µε 3 επαναλήψεις η κάθε µια. Κάθε οµάδα ελάµβανε διαφορετικό ποσοστό τροφής. Η οµάδα ΜΑ σιτιζόταν µε 100% τροφής και η οµάδα ΜΕΤ75 µε το 75% της τροφής που τους αντιστοιχούσε. Όλες οι δεξαµενές υποστηριζόταν από σύστηµα µηχανικού-βιολογικού φίλτρου του νερού για την αποµάκρυνση της συνολικής αµµωνίας, των περιττωµάτων και υπολειµµάτων 12

13 τροφής. Σε εβδοµαδιαία βάση πραγµατοποιούνταν σιφωνισµός του πυθµένα και αντικατάσταση του νερού έως και 30% του συνολικού όγκου. Οι φυσικοχηµικές παράµετροι του νερού ελέγχονταν καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος. Επίσης, σε εβδοµαδιαία βάση καταγράφονταν µετρήσεις για τη θερµοκρασία του νερού (22 ο C), το ph (8,00 ± 0,4), την αλατότητα (29 ± 0,5) και το διαλυµένο οξυγόνο (>6,5 mg/l) µε τη χρήση φορητών ηλεκτρονικών οργάνων. Η θερµοκρασία του νερού ρυθµιζόταν µε σύστηµα ψύξης θέρµανσης του περιβάλλοντος χώρου (airconditioning). Επίσης, σε τακτά χρονικά διαστήµατα προσδιοριζόταν η συγκέντρωση της ολικής αµµωνίας (<1 mg/l) µε την χρήση Salifert Ammonia, των νιτρικών µε τεστ τύπου API Nitrate NO 3 και νιτρωδών µε των βοήθεια Sera nitrite-test (NO 2 ). Η προαναφερθείσα πειραµατική διαδικασία πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση εµπορικής τροφής κατάλληλη για το συγκεκριµένο είδος ψαριού και ο υπολογισµός της, γινόταν µε βάση το µέγεθος των ψαριών, τη θερµοκρασία του νερού και τα προτεινόµενα ποσοστά διατροφής των πινάκων της εταιρείας BIOMAR Hellas Δειγµατοληψίες Κατά τη διάρκεια της περιόδου εκτροφής πραγµατοποιήθηκαν 5 µετρήσεις βάρους και σταθερού µήκους: στην έναρξη των πειραµάτων την 17η, την 32η, την 50η και την 64η ηµέρα. Η διαδικασία της µέτρησης ήταν η ακόλουθη. Αρχικά τα ψάρια εξαλιεύονταν από τις δεξαµενές µε απόχες. Στη συνέχεια τοποθετούνταν σε πλαστικό περιέκτη µε αναισθητικό φαινοξυαιθανόλης σε συγκέντρωση 0,10 ml/l. Μετά το στάδιο της αναισθησίας, κάθε ψάρι ζυγιζόταν σε ζυγό τύπου AE ADAM ACBPLUS MODEL ABB PLUS 3000, ακριβείας 2 δεκαδικών ψηφίων (0,01 g) και έπειτα µετρούνταν το σταθερό µήκος µε ιχθυόµετρο ακρίβειας 0,1 cm. Αµέσως µετά τοποθετούνταν σε περιέκτη µε καλά οξυγονωµένο θαλασσινό νερό για το στάδιο της ανάνηψης. Μετά την ολοκλήρωση του πειράµατος ελήφθη τυχαίο δείγµα ψαριών από κάθε δεξαµενή, τα οποία θανατώθηκαν παρατείνοντας την παραµονή τους στο αναισθητικό αυξηµένης δοσολογίας. Έπειτα το δείγµα κωδικοποιήθηκε και αποθηκεύτηκε στους -20 ο C µε σκοπό τη χηµική ανάλυση της θρεπτικής σύστασης του µυϊκού ιστού. 13

14 Υπολογίστηκε πλήθος παραµέτρων που αφορούν στην αύξηση και στην αξιοποίηση της τροφής, όπως η αύξηση βάρους (WG), ο ρυθµός αύξησης (GR), ο ειδικός ρυθµός αύξησης (SGR), ο ρυθµός µετατρεψιµότητας της τροφής (FCR) Αύξηση ολικού βάρους ψαριών Η αύξηση του ολικού βάρους είναι το καθαρό βάρος του σώµατος των ψαριών που αποκτήθηκε κατά τη διάρκεια του πειράµατος και υπολογίζεται από την παρακάτω σχέση: Αύξηση ολικού βάρους (g) = W t (τελικό βάρος) W a (αρχικό βάρος) Ποσοστό αύξησης του ολικού βάρους Το ποσοστό αύξησης του ολικού βάρους αντιπροσωπεύει την εκατοστιαία (%) αύξηση του βάρους σώµατος και υπολογίζεται ως εξής: Ποσοστό αύξησης βάρους (%) = [(W τελικό W αρχικό ) / W αρχικό ] * Ειδικός ρυθµός αύξησης Ο ηµερήσιος ειδικός ρυθµός αύξησης (specificgrowthrate, SGR) εκφράζει την ηµερήσια ποσοστιαία αύξηση του ολικού βάρους του ψαριού στο χρονικό διάστηµα που σιτίστηκε και δίνεται από τη σχέση: SGR (% / ηµέρα) = {100 [Ln (W 2 ) Ln (W 1 )] / ηµέρες σίτισης} Όπου, Ln (W 2 ) = o φυσικός λογάριθµος του τελικού ολικού βάρους Ln (W 1 ) = o φυσικός λογάριθµος του αρχικού ολικού βάρους Συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής Ο συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής (food conversion ratio, FCR) εκφράζει το βαθµό αξιοποίησης της τροφής από τα ψάρια και δίνεται από τον λόγο της ποσότητας της τροφής που χορηγήθηκε προς την αύξηση του ολικού βάρους τους. Ο συντελεστής µετατρεψιµότητας τροφής υπολογίζεται από τη σχέση: FCR = τροφή που χορηγήθηκε (g) / αύξηση βιοµάζας των ζωντανών ιχθύων (g). 14

15 Προσδιορισµός λιπαρών οξέων Μετά την ολοκλήρωση του πειράµατος, ελήφθη τυχαίο δείγµα ατόµων και από τις δύο οµάδες, έτσι ώστε να γίνει περαιτέρω χηµική ανάλυση του µυϊκού ιστού των ψαριών για τον προσδιορισµό των ολικών λιπαρών ουσιών. Ο προσδιορισµός των ολικών λιπαρών οξέων από το ολικό σώµα και τον µυϊκό ιστό των ψαριών πραγµατοποιήθηκε µε την µέθοδο Soxhlet (AOAC 1995). Σύµφωνα µε αυτή τη µέθοδο, ζυγίστηκε το βάρος κενών δοχείων µαζί µε 3 πέτρες βρασµού και καταγράφηκε το βάρος τους σε ζυγό ακριβείας 4 δεκαδικών ψηφίων. Στη συνέχεια, ειδικός χάρτινος ηθµός τοποθετήθηκε µέσα στο δοχείο ζέσεως, που βρίσκονταν εντός του ζυγού και µηδενίστηκε η ακόλουθη ένδειξη. Έπειτα, στον χάρτινο ηθµό προστέθηκε 1,5g ξηράς ουσίας δείγµατος. Τέλος, στα δείγµατα, πριν µεταφερθούν στην ειδική συσκευή εκχύλισης και απόσταξης του λίπους, προστέθηκαν 140 ml διαλύµατος πετρελαϊκού αιθέρα. Η διαδικασία απόσταξης του λίπους, στη συσκευή Soxhlet, πραγµατοποιήθηκε σε πέντε στάδια. Το πρώτο στάδιο περιλάµβανε τη θερµή εκχύλιση, όπου το δείγµα βυθίζεται στον υπό βρασµό διαλύτη στους 150 C για 25min και µία σηµαντική ποσότητα λίπους αρχίζει να απελευθερώνεται από το δείγµα. Στο δεύτερο στάδιο, έχουµε την πρώτη εξάτµιση, όπου ο διαλύτης, πετρελαϊκός αιθέρας, µειώνεται αισθητά από τα δοχεία εκχύλισης. Η ποσότητα του διαλύτη που περισσεύει, συλλέγεται στη δεξαµενή ανάκτησης, στο πίσω µέρος της συσκευής. Στο τρίτο στάδιο, η ποσότητα λίπους που περίσσεψε στα δείγµατα, εκχυλίστηκε για 1h και 30min, από την υγροποίηση των ατµών του διαλύτη. Στο στάδιο αυτό ο διαλύτης διερχόµενος από κάθε ηθµό που περιείχε δείγµα, συλλέγει το λίπος από το δοχείο ζέσεως. Με τη διαδικασία αυτή, εξασφαλίζεται η εκχύλιση όλων των λιπαρών ουσιών στα δείγµατα. Κατόπιν, ακολουθεί το τέταρτο στάδιο που περιλαµβάνει τη δεύτερη εξάτµιση του πετρελαϊκού αιθέρα σύµφωνα µε την οποία, ο περίσσιος όγκος του διαλύτη αποστάζεται στη δεξαµενή αποθήκευσης για µελλοντική επανάκτηση. Στο πέµπτο στάδιο, αφού εξατµιστεί ο διαλύτης, οι ολικές λιπαρές ουσίες βρίσκονται στον πάτο του δοχείου, οι οποίες ανυψώνονται αυτόµατα από τις εστίες θέρµανσης. Στο τέλος της εκχύλισης, τα δοχεία ζέσεως αφαιρούνται από την συσκευή και τοποθετούνται σε πυραντήριο για 30min στους 75 C, έτσι ώστε να εξατµιστεί και η παραµικρή ποσότητα πετρελαϊκού αιθέρα που µπορεί να υπάρχει στο δοχείο. Μετά 15

16 το πέρας των 30min, αφαιρούνται τα δοχεία από το πυραντήριο, προκειµένου να αποκτήσουν θερµοκρασία περιβάλλοντος, και αφαιρείται o χάρτινος ηθµός. Ακολουθεί η ζύγιση των δοχείων µαζί µε τις πέτρες. Η διαφορά του µικτού βάρους δοχείου µε το λίπος και το αρχικό βάρος του κενού δοχείου µε τις πέτρες, υπολογίζει το βάρος του λίπους στο δείγµα. Η περιεκτικότητα του κάθε δείγµατος σε ολικά λιπίδια υπολογίστηκε σύµφωνα µε τον τύπο: Ολικά λιπίδια % = (W(g) τελικό δοχείο εκχύλισης W(g) αρχικό δοχείου εκχύλισης ) * Στατιστική ανάλυση Τα δεδοµένα των παραµέτρων αύξησης των ψαριών και των µεταβολών στη χηµική σύσταση του µυϊκού ιστού επεξεργάσθηκαν µε τη µέθοδο της Ανάλυσης της Διακύµανσης Μονής Κατεύθυνσης (one-way ANOVA) και του t-test µε το στατιστικό πρόγραµµα SPSS Statistics 14 Multilanguage και οι διαφορές κρίθηκαν στατιστικά µη σηµαντικές για τιµές P > 0,05. Επίσης και το t κριτήριο για τη σύγκριση των κλίσεων των ευθειών µε τα λογισµικά Excel Αποτελέσµατα Κατά την έναρξη του πειράµατος, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των τριών επαναλήψεων και για τις δύο οµάδες τόσο για το µήκος όσο και για το βάρος και ως εκ τούτου, τα δεδοµένα οµογενοποιήθηκαν. Το αρχικό µέσο βάρος όλων των ιχθυδίων κατά την έναρξη του πειράµατος για τα άτοµα που τοποθετήθηκαν στις δεξαµενές µε τις τρεις επαναλήψεις της οµάδας MA ήταν 5,80± 0,05g και για τις δεξαµενές µε τις τρεις επαναλήψεις της οµάδας MET75 ήταν 5,84±0,05g. Παρόµοια ήταν και τα αποτελέσµατα για το µήκος. Το αρχικό µέσο σταθερό µήκος για την οµάδα του ΜΑ ήταν 6,26±0,05cm και 6,26±0,05cm για την οµάδα ΜΕΤ75. Δεν παρουσιάστηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές στο αρχικό µήκος των ατόµων (P>0,05) κατά την έναρξη του πειράµατος, µε αποτέλεσµα οι επαναλήψεις των δύο οµάδων σε κάθε περίπτωση να οµογενοποιηθούν. Στη δεύτερη µέτρηση που πραγµατοποιήθηκε, άρχισε να διαφαίνεται µικρή αριθµητική υπεροχή της οµάδας ΜΑ έναντι της οµάδας ΜΕΤ75. Έτσι, πιο αναλυτικά, τα µέσα ολικά βάρη που προέκυψαν ήταν 10,81±0,30g για τον ΜΑ και 16

17 9,75±0,27g για την οµάδα ΜΕΤ75, ενώ το µέσο σταθερό µήκος 7,03±0,06cm και 7,14±0,06cm αντίστοιχα. Ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά διαφορές (P>0.05) µεταξύ των επαναλήψεων της οµάδας ΜΑ και των επαναλήψεων της οµάδας ΜΕΤ75. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των µέσων όρων του µήκους της οµάδας ΜΑ και της οµάδας ΜΕΤ75 (P>0.05). Στην τρίτη µέτρηση που λήφθηκε, η οµάδα ΜΑ είχε φτάσει κατά µέσο όρο τα 16,00±0,46 g σε βάρος και τα 8,34±0,07 cm σε ολικό µήκος. Η οµάδα ΜΕΤ75 απέκτησε, κατά µέσο όρο, βάρος της τάξεως των 15,88±0,43 g και µήκος 8,31±0,08 cm, πράγµα που αποδεικνύει πως αν και σιτίστηκε σε καθηµερινή βάση µε λιγότερη τροφή (75% τροφή έναντι 100% τροφής) σε σχέση µε την οµάδα του ΜΑ, κατάφερε να πλησιάσει στην ανάπτυξη τους. Επιπλέον, από τις στατιστικές αναλύσεις φάνηκε ότι οι µέσοι όροι, τόσο του βάρους όσο και του µήκους της οµάδας του ΜΑ και της οµάδας της ΜΕΤ75, δεν διαφέρουν στατιστικά µεταξύ τους (P>0,05). Από την τέταρτη µέτρηση προέκυψε ότι τα άτοµα της ΜΕΤ75 είχαν σχεδόν τους ίδιους ρυθµούς αύξησης σε σχέση µε αυτά της οµάδας ΜΑ. Πιο συγκεκριµένα, το µέσο βάρος και το µέσο σταθερό µήκος της οµάδας ΜΑ ήταν 23,23±0,65g και 9,35±0,09cm αντίστοιχα, ενώ για την οµάδα ΜΕΤ75, το µέσο βάρος βρέθηκε να είναι 23,19±0,60g και το µέσο ολικό µήκος 9,4±0,08cm. Τέλος, πραγµατοποιήθηκε µέτρηση όλων των ψαριών του πειράµατος. Oι τρεις επαναλήψεις των οµάδων οµογενοποιήθηκαν αφού δεν προέκυψαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ούτε στο βάρος ούτε στο µήκος. Κατ επέκταση βρέθηκε το µέσο βάρος, 29,88±0,94g για την οµάδα ΜΑ και 27,70±0,82g για την οµάδα ΜΕΤ75, ενώ το µέσο µήκος για την οµάδα ΜΑ ήταν 10,19±0,10cm και για την οµάδα ΜΕΤ75 10,07±0,10cm. Ακόµη, οι επαναλήψεις των οµάδων του ΜΑ και της οµάδας ΜΕΤ75 δεν διέφεραν µεταξύ τους. (Ρ>0,05). 17

18 Πίνακας 1 Εξέλιξη στην αύξηση (µέσο ολικό σωµατικό βάρος και σταθερό µήκος) των ατόµων του µάρτυρα και της διαχείρισης (µέσος όρος (x) ± τυπικό σφάλµα (s.e.)), n:ο αριθµός των ατόµων 1η Μέτρηση 2η Μέτρηση 3η Μέτρηση 4η Μέτρηση 5η Μέτρηση Βάρος (g) x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n ΜΑ 5,80±0, ,81±0, ,00±0, ,23±0, ,21±0,94 45 ΜΕΤ75 5,84±0, ,75±0, ,88±0, ,19±0, ,83±0,82 63 Σταθερό x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n Μήκος (cm) ΜΑ 6,26±0, ,03 ±0, ,35±0, ,35±0, ,19±0,10 45 ΜΕΤ75 6,26±, ,14±0, ,31±0, ,40±0, ,07±0,10 63 Οι παράµετροι αύξησης που µελετήθηκαν ήταν το ολικό σωµατικό βάρος και το σταθερό µήκος των ψαριών. Γενικά τα άτοµα της ΜΕΤ75 δεν έδειξαν µείωση, ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΒΑΡΟΥΣ ΒΑΡΟΣ (gr) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΕΣ y = 2,99x + 1,55 R² = 0,99092 y = 3,15x + 1,53 R² = 0,99452 Διάγραµµα 1 Η µεταβολή του βάρους των πειραµατικών οµάδων σε σχέση µε τον χρόνο τόσο στο βάρος όσο και στο σταθερό µήκος τους. Η κατανοµή του βάρους και του 18

19 σταθερού µήκους των ψαριών καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος φαίνεται στα Διαγράµµατα 1 και 2. Μετά την ολοκλήρωση του πειράµατος, όσον αφορά στην σίτισή τους, υπολογίστηκε ο συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής (F.C.R) και ο ειδικός ρυθµός ανάπτυξης (S.G.R) των ψαριών, τα αποτελέσµατα των οποίων φαίνονται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2 F.C.R. και S.G.R. για όλες τις οµάδες (µέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.)) ΜA ΜΕΤ75 F.C.R. 1,85±0,05 1,30±0,15 S.G.R 2,23±0,15 2,28±0,12 (%/ηµέρα) Τέλος, διαπιστώθηκε πως η συγκέντρωση του λίπους στον µυϊκό ιστό των ψαριών της οµάδας ΜΕΤ75, η οποία πέρασε περιόδους µερικής σίτισης ξεπέρασε αυτή του ΜΑ, η οποία συγκέντρωσε ποσοστό λιπαρής ουσίας 18,67±0,005% έναντι 20,21±0,005% του ΜΕΤ Συζήτηση - Συµπεράσµατα Στην πειραµατική διαδικασία που πραγµατοποιήθηκε σε τσιπούρες, οι οποίες ΜΗΚΟΣ (cm) ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΜΗΚΟΥΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΕΣ ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ y = 0,94x + 5,46 R² = 0,99192 y = 1,02x + 5,18 R² = 0,99161 Διάγραµµα 2 Μεταβολή του µήκους στις δύο πειραµατικές οµάδες σε σχέση µε τον χρόνο 19

20 χωρίστηκαν σε δύο οµάδες (ΜΑ και ΜΕΤ75) των τριών επαναλήψεων, χορηγήθηκε τροφή µε διαφορετικά ποσοστά. Συγκεκριµένα, στην οµάδα ΜΑ, χορηγούνταν καθηµερινά τροφή ποσότητας 100% και στην οµάδα ΜΕΤ75 ποσότητα τροφής 75%. Τα τελικά αποτελέσµατα έδειξαν πως οι ρυθµοί αύξησης και των δύο οµάδων ήταν ίδιοι. Σύµφωνα µε τη βιβλιογραφία, για το φαινόµενο στην αύξηση αντιστάθµισης µε την µη χορήγηση τροφής, έχουν πραγµατοποιηθεί πολλές ερευνητικές µελέτες σε οµάδες ιχθύων ή σε µεµονωµένα ιχθύδια. Η µη χορήγηση της τροφής ή στέρηση της τροφής είναι είτε µερική, είτε ολική. Υπάρχει µια ή και περισσότερες περίοδοι στέρησης τροφής και η επανασίτιση εναλλάσσεται σε κύκλους όπως αναφέρουν οι Ali et al. (2003). Αυτή η ποικιλότητα που εµφανίζεται στις διάφορες πειραµατικές µεθόδους των ερευνητών έχει οδηγήσει σε διαφορετικά συµπεράσµατα. Οι Tian και Qin (2004) σε πείραµα µε µερική σίτιση που πραγµατοποίησαν σε Ασιατικό λαβράκι (Lates calcarifer), παρατήρησαν πλήρη αντιστάθµιση και ίδια αύξηση κατά την 2 η και 4 η εβδοµάδα του πειράµατος στις πειραµατικές οµάδες που ελάµβαναν καθηµερινά τροφή 50% και 75%. Από την άλλη, οι πειραµατικές οµάδες που ταΐζονταν µε 0% και µε 25% τροφή δεν εµφάνισαν καµία αντιστάθµιση καθώς επίσης και οι ρυθµοί αύξησής τους ήταν πολύ µικρότεροι σε σχέση µε τις δύο προηγούµενες οµάδες. Η επίδραση του πρωτοκόλλου ταΐσµατος και η διάρκεια της ασιτίας έχει ουσιαστικό ρόλο στη εµφάνιση του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Συγκεκριµένα, σε πείραµα που πραγµατοποίησε ο Πανταρίδης (2005) πέτυχε µερική αντιστάθµιση σε άτοµα τσιπούρας, που παρόλο που παρέµειναν άσιτα για πάνω από µία εβδοµάδα και παρουσίασαν απώλεια βάρους τις πρώτες µέρες της ασιτίας, στο τέλος κατάφεραν να προσεγγίσουν σε ανάπτυξη τους µάρτυρες που σιτίστηκαν κανονικά. Η αύξηση αντιστάθµισης είναι δυνατό να µην εκδηλώνεται, εάν ο περιορισµός της τροφής ξεπεράσει κάποιο όριο (Wilson & Osbourne 1960). Για παράδειγµα, ιχθύδια σολοµού που ήταν σε ασιτία για µία έως τρεις εβδοµάδες έφτασαν σε βάρος τους µάρτυρες, ενώ αυτά που παρέµειναν χωρίς τροφή για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα δεν έφτασαν την ίδια ανάπτυξη (Bilton & Robins 1973). Σχεδόν όλες οι εργασίες που αναφέρονται στην ποσότητα της προσφερόµενης τροφής κατέληξαν στο γεγονός ότι η υπερφαγία παρουσιάζει σηµαντική συµβολή στην επιτάχυνση της ανάπτυξης και φαίνεται να διαδραµατίζει 20

21 ίσως τον σηµαντικότερο ρόλο στην εµφάνιση του φαινοµένου της ανάπτυξης αντιστάθµισης, αν και κάποιο ρόλο µπορούν να παίξουν οι ελαττωµένες τιµές µετατρεψιµότητας της τροφής ή η προσαρµογή της συµπεριφοράς των οργανισµών στις περιβαλλοντικές συνθήκες (Πανταρίδης 2005). Συµπερασµατικά, οι αντισταθµιστικές αλλαγές στην όρεξη και στην αύξηση των ψαριών µετά από διάστηµα περιορισµού της τροφής φαίνεται να είναι σηµαντικός παράγοντας για την ανάπτυξη ενός βέλτιστου τρόπου ταΐσµατος στις εντατικές ιχθυοκαλλιέργειες, µε σκοπό την µείωση του κόστους παραγωγής και της περιβαλλοντικής ρύπανσης. Η επιβολή σταθερών περιόδων ασιτίας ή περιορισµού τροφής στα εκτρεφόµενα ψάρια µπορεί να οδηγήσει σε οφέλη, τόσο οικονοµικά όσο και περιβαλλοντικά, λόγω της εκδήλωσης του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Ωστόσο, δεν είναι ξεκάθαρο το πρωτόκολλο που θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί σε επίπεδο παραγωγής για το κάθε εκτρεφόµενο είδος. 1.2 Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα Β: 2 εβδοµάδες τάισµα-ασιτία, (εναλλάξ ανά ηµέρα) και 2 εβδοµάδες καθηµερινό τάισµα Μεθοδολογία Κατά το 2 ο πείραµα της πρώτης φάσης του έργου, το οποίο πραγµατοποιήθηκε επίσης στο Εργαστήριο Υδατοκαλλιεργειών του Τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, µελετήθηκε το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης σε τσιπούρες υπό διαφορετικά διαστήµατα ασιτίας επαναδιατροφής. Παρακάτω παρατίθενται τα αποτελέσµατα του 2 ου από τα 3 πειράµατα που πραγµατοποιήθηκαν, για τις ανάγκες του έργου, µε διαφορετικούς χρόνους και διαφορετικά ποσοστά χορήγησης τροφής. Η χρονική διάρκεια του πειράµατος ήταν περίπου επτά (7) εβδοµάδες (48 ηµέρες) και χρησιµοποιήθηκαν άτοµα τσιπούρας ηλικίας έξι (6) µηνών περίπου που µεταφέρθηκαν από τη µονάδα Αφοί Μαντέ και ΣΙΑ Ο.Ε. Τα ψάρια µεταφέρθηκαν µε ιδιωτικό αυτοκίνητο σε πλαστικές τετράγωνες δεξαµενές, όγκου 50 l. Κατόπιν διαχωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις (4) κυλινδροκωνικές δεξαµενές και παρέµειναν 21

22 εκεί για δέκα µέρες πριν την έναρξη του πειράµατος προκειµένου να εγκλιµατιστούν. Οι δεξαµενές ήταν µαύρου χρώµατος και χωρητικότητας 400l. Επιπροσθέτως, οι εν λόγο δεξαµενές περιείχαν θαλασσινό νερό και ήταν συνδεδεµένες στο ίδιο κύκλωµα µε άλλες 4 δεξαµενές οι οποίες περιείχαν µόνο νερό και βοηθούσαν στον καλύτερο καθαρισµό του νερού. Το κλειστό αυτό κύκλωµα διαχείρισης του νερού περιλάµβανε µηχανικό, χηµικό και βιολογικό φίλτρο τύπου Tetra Pond PF και UV Πειραµατικός σχεδιασµός Μια ηµέρα πριν ξεκινήσει το πείραµα, 260 ψάρια ζυγίστηκαν µε ακρίβεια δεύτερου δεκαδικού ψηφίου οπότε προέκυψε µέσο βάρος 2,55±0,01 g (µέσο βάρος ± τυπικό σφάλµα), (Εικ. 2.3.). Ταυτόχρονα µετρήθηκε το ολικό µήκος των ατόµων σε mm µε ακρίβεια δεύτερου δεκαδικού ψηφίου οπότε προέκυψε µέσο µήκος 56,51± 0,16 mm. Στη συνέχεια τα ψάρια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο (2) οµάδες: i) των µαρτύρων (Μ), η οποία σιτίζονταν καθηµερινά, ii) των µεταχειρίσεων (Β) η οποία σιτιζόταν µέρα παρά µέρα για τις πρώτες 12 ηµέρες, ενώ τις υπόλοιπες 12 ηµέρες θα σιτίζονταν καθηµερινώς. Οµοίως για τις επόµενες 24 ηµέρες (12+12). Η συνολική διάρκεια του πειράµατος ήταν 48 ηµέρες. Στα ψάρια προσφέρονταν τροφή 2 φορές την ηµέρα (10.00 και 17.00). Οι ιχθυοτροφές ήταν σύµπηκτα (pellets) της εταιρείας Biomar, τύπου INICIO PLUS. Η σύσταση των ιχθυοτροφών ήταν η ακόλουθη: 56% ολική πρωτεΐνη, 18% ολικά λίπη, 8,2% ελεύθερες αζώτου εκχυλισµατικές ουσίες (ENEO), 10,9% τέφρα, 0,2% ολική κυτταρίνη και 1,6% ολικός φώσφορος. Η προσφερόµενη ποσότητα τροφής ήταν αυτή που πρότεινε µέσα από τους πίνακες εκτροφής της η εταιρία ιχθυοτροφών (συναρτήσει της θερµοκρασίας και του µεγέθους των ψαριών) και αναπροσαρµοζόταν στη βιοµάζα της κάθε δεξαµενής όπως αυτή προέκυπτε µετά από κάθε εβδοµαδιαίο ζύγισµα όλων των ατόµων. Το νερό των δεξαµενών ανακυκλώνονταν κατά τη διάρκεια της ηµέρας (6,5 m3/h) περνώντας µε τη βοήθεια αντλιών από µηχανικό, χηµικό και βιολογικό φίλτρο και στη συνέχεια από υπεριώδη ακτινοβολία (U.V). Η ανανέωση νερού γίνονταν όταν αυτή κρινόταν σκόπιµη. Η µέση θερµοκρασία του νερού κατά τη διάρκεια του πειράµατος µετρήθηκε 20,4 o C (max 22,5 o C & min 18,3 o C). Οι τιµές του διαλυµένου οξυγόνου στο νερό οποίες καταγράφονταν ανά τακτά διαστήµατα 22

23 µε οξυγονόµετρο τύπου Hanna hi 9143 µετά το δεύτερο τάισµα, εµφανίζονταν πάντοτε πάνω από 5 ppm. Επίσης, για την παροχή του αέρα είχαν τεθεί σε λειτουργία δύο αεροαντλίες. Οι δύο αεροαντλίες δούλευαν εναλλάξ ανά µία ώρα, µε την βοήθεια χρονοδιακόπτη, µε σκοπό την καλή και ασφαλή τους λειτουργία. Η αλατότητα καθώς και το ph του νερού καταγράφονταν εβδοµαδιαίως (αλατόµετρο WTW LF 330 και ph-άµετρο Metrohm). Η αµµωνία κυµάνθηκε σε χαµηλές τιµές σύµφωνα µε τις ενδείξεις του τεστ NH3/NH4 TETRATEST. Οι µετρήσεις πραγµατοποιούνταν κάθε δώδεκα (12) ηµέρες µετά από κάθε µεταχείριση. Πιο συγκεκριµένα, εκτός την 1η µέτρηση όπου µετρήθηκαν όλα τα άτοµα, πραγµατοποιήθηκαν τέσσερις αντιπροσωπευτικές του πληθυσµού δειγµατοληψίες στις οποίες καταγράφηκαν µετρήσεις βάρους και ολικού µήκους των ψαριών, την 13η, 25η, 37η και 49η ηµέρα. Η διαδικασία της µέτρησης ήταν η ακόλουθη. Αρχικά τα ψάρια εξαλιεύονταν από τις δεξαµενές µε απόχες. Στην συνέχεια τοποθετούνταν σε πλαστικό κουβά µε αναισθητικό (φαινοξυαιθυλοαλκοόλη). Μετά το στάδιο της αναισθησίας, µετρούνταν το ολικό µήκος τους, µε τη χρήση ιχθυοµέτρου. Στην συνέχεια τοποθετούνταν σε πλαστικό δοχείο µε καλά οξυγονωµένο θαλασσινό νερό. Κατά το στάδιο αυτό τα ψάρια επανακτούσαν τις αισθήσεις τους και στο τέλος µε µικρή απόχη επανατοποθετούνταν στην αρχική τους δεξαµενή. Οι θνησιµότητες καταγράφονταν ηµερησίως Στατιστική επεξεργασία Η ανάλυση των παραµέτρων ανάπτυξης των ψαριών, αξιοποίησης της τροφής και των αναλύσεων της χηµικής σύστασης του σώµατος πραγµατοποιήθηκε µε το στατιστικό πρόγραµµα SPSS 14 και η επεξεργασία των δεδοµένων έγινε µε τη µέθοδο independent samples t-test. Ως επίπεδο σηµαντικότητας επελέγη το α=0,05 (Ρ<0,05). Επιπλέον, για την παράµετρο ανάπτυξης του βάρους µεταξύ των ατόµων του µάρτυρα και της µεταχείρισης χρησιµοποιήθηκε ανάλυση συνδιακύµανσης (ANCOVA) Αποτελέσµατα Αύξηση Οι παράµετροι αύξησης που µελετήθηκαν στην παρούσα εργασία ήταν το ολικό σωµατικό βάρος και το ολικό µήκος των ψαριών. Γενικά τα άτοµα της 23

24 ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΒΑΡΟΥΣ ΒΑΡΟΣ (gr) y = 0,1983x + 2,5417 R² = 0,99236 y = 0,15x + 1,95 R² = 0, ΗΜΕΡΑ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ ΜΑΡΤΥΡΑΣ Διάγραµµα 3 Μεταβολή βάρους πειραµατικών οµάδων σε σχέση µε τον χρόνο µεταχείρισης δεν έδειξαν καµία µείωση τόσο στο βάρος όσο και στο µήκος τους. Επιπροσθέτως τα άτοµα της µεταχείρισης, που πέρασαν περιόδους ασιτίας, δεν φαίνεται να κατάφεραν σε καµία περίπτωση να προσεγγίσουν την αύξηση των µαρτύρων και κυµάνθηκαν σε χαµηλότερα επίπεδα σε σχέση µε τους µε αυτούς, οι οποίοι ακολούθησαν µια πιο ανοδική πορεία στην ανάπτυξη. Η κατανοµή του βάρους και του µήκους των ψαριών καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος φαίνεται στα Διαγράµµατα 3 και 4, αντίστοιχα. Επιπλέον, µετά την ολοκλήρωση του πειράµατος και το πέρας των 49 ηµερών, υπολογίστηκε ο συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής (F.C.R) και ο ειδικός ρυθµός ανάπτυξης (S.G.R) των ψαριών, τα αποτελέσµατα των οποίων διαφαίνονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3 Παράµετροι ανάπτυξης ιχθύων, µέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.) Μάρτυρας Διαχείριση F.C.R 1,17±0,04 a 1,40±0,25 b S.G.R (%/ηµέρα) 2,74±0,14 a 2,47±0,14 b Τα διαφορετικά γράµµατα a,b στις τιµές σε οριζόντια διάταξη δείχνουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές (Ρ<0,05). 24

25 Κατά την έναρξη του πειράµατος Μετά την περίοδο προσαρµογής τους στις δεξαµενές, τα ψάρια µετρήθηκαν ως προς το ολικό σωµατικό βάρος και µήκος και προέκυψαν τα µέσα βάρη 2,51±0,83 g και 2,67±0,68 g για τους µάρτυρες 1 και 2 αντίστοιχα, και 2,69 ±0,38 g και 2,67±0,46 g για τα άτοµα της µεταχείρισης 1 και 2 αντίστοιχα. Κατόπιν αυτού, πραγµατοποιήθηκαν οι απαραίτητες στατιστικές αναλύσεις σε επίπεδο σηµαντικότητας (P>0,05) και προέκυψε ότι τόσο οι µάρτυρες µεταξύ τους όσο και οι µεταχειρίσεις δεν διέφεραν στατιστικά (Πίν.4) και συνεπώς οι οµάδες 1 και 2 των µαρτύρων θεωρήθηκαν ένα δείγµα και οµογενοποιήθηκαν, όπως έγινε και µε τις οµάδες 1 και 2 των µεταχειρίσεων οι οποίες οµογενοποιήθηκαν επίσης (Πίν.5). Παράλληλα αξίζει να σηµειωθεί ότι κατά την πρώτη µέτρηση, οι µάρτυρες και οι µεταχειρίσεις δεν διέφεραν στατιστικά ούτε µεταξύ τους όπως φαίνεται στον Πίν.4. Όσον αφορά στο ολικό σωµατικό µήκος, αυτό για τους µάρτυρες 1 και 2 ήταν 56,32±0,75 mm και 56,43±0,58 mm, αντίστοιχα, ενώ για τις µεταχειρίσεις 1 και 2 ήταν 57,15±0,69 mm και 56,14±0,78 mm, αντίστοιχα. Οι στατιστικές αναλύσεις του µήκους, µεταξύ των µαρτύρων καθώς και µεταξύ των µεταχειρίσεων δεν παρουσίασαν καµία στατιστική διαφορά, όπως συνέβη και ανάµεσα σε µάρτυρα και ΜΗΚΟΣ (cm) ΜΑΡΤΥΡΑΣ y = 0,5083x + 57,292 R² = 0, y = 0,6917x + 60,108 ΗΜΕΡΑ R² = 0,98246 µεταχείριση µε αποτέλεσµα οι δύο οµάδες σε κάθε περίπτωση να οµογενοποιηθούν και κατ επέκταση να µην εµφανίσουν µεταξύ τους στατιστικά σηµαντικές διαφορές κατά την αρχική µέτρηση. ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΜΗΚΟΥΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ Διάγραµµα 4 Εξέλιξη του ολικού µήκους καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος, των µεταχειρίσεων των ψαριών. 25

26 Κατά τη 13η ηµέρα πειράµατος Στη δεύτερη µέτρηση που πραγµατοποιήθηκε άρχισε να διαφαίνεται ήδη η υπεροχή των µαρτύρων έναντι των µεταχειρίσεων. Έτσι τα µέσα ολικά βάρη που προέκυψαν ήταν 5,03±0,19 g για τον µάρτυρα και 4,18±0,18 g και τη µεταχείριση ενώ το µέσο ολικό µήκος 71,00±0,96 mm και 67,15±0,86 mm αντίστοιχα (Πιν.5). Παράλληλα όµως, ενώ οι µάρτυρες 1 και 2 και αντίστοιχα οι µεταχειρίσεις 1 και 2 δεν παρουσίασαν στατιστικά σηµαντική διαφορά (Πιν.5), αυτό συνέβη στη µεταξύ τους ανάλυση, του µάρτυρα και της µεταχείρισης, οι οποίες εµφάνισαν επίπεδο σηµαντικότητας P<0, Κατά την 25η ηµέρα πειράµατος Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 4 στην τρίτη µέτρηση που λήφθηκε, η οµάδα των µαρτύρων είχε φτάσει κατά µέσο όρο τα 8,49±0,3 g σε βάρος και τα 83,38±0,91 mm σε ολικό µήκος. Από την άλλη µεριά, η οµάδα της µεταχείρισης απέκτησε, κατά µέσο όρο, βάρος της τάξεως των 6,27±0,27 g και µήκος 75,55±1,00 mm., πράγµα που αποδεικνύει πως αν και σιτίστηκε σε καθηµερινή βάση το διάστηµα που µεσολάβησε, δεν κατάφερε να πλησιάσει στην ανάπτυξη των µαρτύρων. Επιπλέον, από τις στατιστικές αναλύσεις φάνηκε ότι οι µέσοι όροι, τόσο του βάρους όσο και του µήκους των οµάδων του µάρτυρα και της µεταχείρισης, διέφεραν στατιστικά µεταξύ τους (P<0,05) Κατά τη 37η ηµέρα πειράµατος Από την τέταρτη µέτρηση στην 37 η ηµέρα πειράµατος, προέκυψε ότι τα άτοµα της µεταχείρισης ήταν ακόµη πίσω στους ρυθµούς ανάπτυξης σε σχέση µε αυτά των µαρτύρων. Πιο συγκεκριµένα, το µέσο βάρος και το µέσο ολικό µήκος της οµάδας των µαρτύρων ήταν 10,77±0,39 g και 89,81±1,07 mm αντίστοιχα, ενώ για την οµάδα των µεταχειρίσεων, το µέσο βάρος βρέθηκε να είναι 7,77±0,27 g και το µέσο ολικό µήκος 80,73±1,08 mm (Πίν.4). Επίσης, οι επακόλουθες στατιστικές αναλύσεις έδειξαν ότι µεταξύ των µαρτύρων και των µεταχειρίσεων υπήρχαν στατιστικές διαφορές, παρά το γεγονός ότι µεταξύ τους οι µάρτυρες και µεταξύ τους οι µεταχειρίσεις δε διέφεραν στατιστικά Κατά το τέλος του πειράµατος Την 49 η ηµέρα του πειράµατος πραγµατοποιήθηκε και η τελευταία µέτρηση στην οποία µετρήθηκαν όλα τα ψάρια του πειράµατος. Έτσι προέκυψε ότι οι µάρτυρες 1 και 2 έφτασαν σε βάρος τα 12,61±0,35 g και 12,24±0,33 g αντίστοιχα 26

27 και ολικό µήκος 94,52±0,93 mm και 94,10±0,87 mm αντίστοιχα, ενώ η διαχείριση 1 τα 10,15±0,22 g βάρος και 88,73±0,64 mm µήκος και η διαχείριση 2 τα 9,83±0,30 g και 87,55±0,84 mm (Πίν.5). Επιπροσθέτως, οι δύο οµάδες οµογενοποιήθηκαν, αφού δεν προέκυψαν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές ούτε στο βάρος ούτε στο µήκος. Κατ επέκταση βρέθηκε το µέσο βάρος, 12,43±0,24 g για την οµάδα των µαρτύρων και 9,99±0,19 g για την οµάδα των µεταχειρίσεων, ενώ το µέσο µήκος για τους µάρτυρες ήταν 94,31±0,63 mm και για τις µεταχειρίσεις 88,14±0,53 mm. Ακόµη, οι οµάδες των µαρτύρων και των µεταχειρίσεων αποδείχτηκε ότι διέφεραν στατιστικά µεταξύ τους (Πίν.4), πράγµα που αποδεικνύει και τη διαφορά στην ανάπτυξη µεταξύ των δύο µεταχειρίσεων. Τέλος, στην επεξεργασία των αποτελεσµάτων πραγµατοποιήθηκε στατιστική ανάλυση ANCOVA, όπως φαίνεται στο Διάγραµµα 5, για την συµµεταβολή των οµάδων του µάρτυρα και της µεταχείρισης σε σχέση µε το χρόνο, ώστε να διαπιστωθεί η εξέλιξη του βάρους των δύο µεταχειρίσεων. Από την συγκεκριµένη ανάλυση προέκυψε ότι οι κλίσεις ων ευθειών έχουν στατιστικά σηµαντική διαφορά και κατ επέκταση, αφού οι ρυθµοί αύξησης ήταν διαφορετικοί καταλήγουµε στη µη εµφάνιση του φαινοµένου της ανάπτυξης αντιστάθµισης στο συγκεκριµένο πείραµα. 27

28 ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΒΑΡΟΥΣ ΒΑΡΟΣ (gr) ΗΜΕΡΑ ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ y = 1,61x + 0,89 R² = 0,9898 y = 2,22x + 0,66 R² = 0,96469 Διάγραµµα 5 Συσχέτιση της εξέλιξης του βάρους µεταξύ όλων των πειραµατικών οµάδων των ιχθύων. Στον άξονα των y παρουσιάζεται το βάρος και στον άξονα των x οι ηµέρες που πραγµατοποιήθηκαν µετρήσεις. Πίνακας 4 Ανάπτυξη (ολικό σωµατικό βάρος και µήκος) των οµάδων των µεταχειρίσεων καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος (µέσος όρος (x) ± τυπικό σφάλµα (s.e.)), n: ο αριθµός των ατόµων. 1η Μέτρηση 2η Μέτρηση 3η Μέτρηση 4η Μέτρηση 5η Μέτρηση Βάρος (g) x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n Μάρτυρας 1 2,51±0,83 a 65 4,90±0,32 a 16 8,44±0,51 a 16 10,60±0,57 a 16 12,61±0,35 a 52 Μάρτυρας 2 2,67±0,68 a 65 5,17±0,22 a 16 8,55±0,32 a 16 10,94±0,54 a 16 12,24±0,33 a 52 Μεταχείριση 1 2,69 ±0,38 b 65 4,19±0,21 b 16 5,98±0,28 b 16 8,11±0,29 b 16 10,15±0,22 b 55 Μεταχείριση 2 2,67±0,46 b 65 4,37±0,31 b 16 6,56±0,48 b 16 7,41±0,42 b 16 9,83±0,30 b 55 Ολικό Μήκος(mm) x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n Μάρτυρας 1 56,32±0,75 a 65 70,16±1,54 a 16 82,51±1,53 a 16 89,28±1,46 a 16 94,52±0,93 a 52 Μάρτυρας 2 56,43±0,58 a 65 71,84±1,16 a 16 84,24±1 a 16 90,33±1,59 a 16 94,10±0,87 a 52 Μεταχείριση 1 57,15±0,69 b 65 67,02±0,83 b 16 74,86±1,09 b 16 82,02±1,11 b 16 88,73±0,64 b 55 Μεταχείριση 2 56,14±0,78 b 65 67,29±1,55 b 16 76,25±1,69 b 16 79,44±1,82 b 16 87,55±0,84 b 55 Τα διαφορετικά γράµµατα a,b στις τιµές σε κάθετη διάταξη δείχνουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές (Ρ<0,05). 28

29 Πίνακας 5 Ανάπτυξη (µέσο ολικό σωµατικό βάρος και µήκος) των ατόµων του µάρτυρα και της διαχείρισης µετά την οµογενοποίηση των µετρήσεων (µέσος όρος (x) ± τυπικό σφάλµα (s.e.)), n:ο αριθµός των ατόµων. 1η Μέτρηση 2η Μέτρηση 3η Μέτρηση 4η Μέτρηση 5η Μέτρηση Βάρος (g) x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n Μάρτυρας 2,59±0,05 a 130 5,03±0,19 a 32 8,49±0,3 a 32 10,77±0,39 a 32 12,43±0,24 a 104 Μεταχείριση 2,68±0,19 a 130 4,18±0,18 b 32 6,27±0,27 b 32 7,77±0,27 b 32 9,99±0,19 b 110 Ολικό Μήκος (mm) x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n x ± s.e. n Μάρτυρας 57,48±0,48 a ,00±0,96 a 32 83,38±0,91 a 32 89,81±1,07 a 32 94,31±0,63 a 104 Μεταχείριση 56,65±0,26 a ,15±0,86 b 32 75,55±1,00 b 32 80,73±1,08 b 32 88,14±0,53 b 110 Τα διαφορετικά γράµµατα a,b σε κάθετη διάταξη δείχνουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές (Ρ<0,05) Χηµική Σύσταση Μετά το πέρας του διατροφικού πειράµατος θανατώθηκε µέρος των ψαριών από κάθε µεταχείριση ώστε να πραγµατοποιηθούν οι χηµικές αναλύσεις για τον προσδιορισµό της υγρασίας, της πρωτεΐνης, του λίπους και της τέφρας, τόσο στο ολικό σώµα των ψαριών, όσο και στο µυϊκό ιστό αυτών. Λόγω του µικρού µεγέθους των ψαριών κρίθηκε απαραίτητο να γίνει οµογενοποίηση των δειγµάτων για να προκύψει η απαραίτητη ποσότητα δείγµατος ώστε να βγουν εις πέρας οι αναλύσεις. Έτσι για το ολικό σώµα επιλέχθηκαν τυχαία τρία (3) ψάρια από κάθε µεταχείριση και για το µυϊκό ιστό οχτώ (8). Αναλυτικά τα αποτελέσµατα για το ολικό σώµα φαίνονται στον Πίνακα 6 και για το µυϊκό ιστό στον Πίνακα Αναλύσεις στο ολικό σώµα Από τις αναλύσεις που έγιναν στο ολικό σώµα, το ποσοστό της υγρασίας σε ποσοστό επί τις εκατό (%) βρέθηκε να είναι 68,51±0,69 για τους µάρτυρες του πειράµατος και 69,38±1,65 για τις µεταχειρίσεις, χωρίς να υπάρχει στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ τους. Παράλληλα, τα άτοµα της διαχείρισης που πέρασαν περιόδους ασιτίας, αποδείχτηκε ότι συγκέντρωσαν στο ολικό σώµα λίγο χαµηλότερα ποσοστά πρωτεΐνης επί του νωπού τους βάρους απ ότι οι µάρτυρες 29

30 που σιτίστηκαν σε καθηµερινή βάση (16,43±0,84% έναντι 16,78±1,47%), αλλά η διαφορά ήταν ελάχιστη και δεν παρουσίασαν καµιά στατιστική διαφορά (P<0,05). Από τη άλλη µεριά, το αντίθετο συνέβη µε τα ποσοστά λίπους που συγκέντρωσαν τα ψάρια του πειράµατος καθώς οι οµάδες των µαρτύρων και των µεταχειρίσεων παρουσίασαν στατιστικά σηµαντική διαφορά (P>0,05). Έτσι, το ποσοστό λίπους των µαρτύρων ήταν 4,13±0,1% επί του νωπού τους βάρους, σε αντίθεση µε των µεταχειρίσεων, που άγγιξε το 4,54±0,61%. Όσον αφορά τα ποσοστά τις τέφρας, αυτά κυµάνθηκαν σε παρόµοια επίπεδα και χωρίς στατιστική διαφορά, µε τους µάρτυρες να φτάνουν το 3,82±0,37% και της µεταχείρισης το 3,85±0,52% επί του νωπού βάρους του δείγµατος. Πίνακας 6 Χηµική σύσταση του ολικού σώµατος των οµάδων ψαριών επί του νωπού βάρους των δειγµάτων Χηµική σύσταση (%) Μάρτυρας Διαχείριση Υγρασία 68,51±0,69 a 69,38±1,65 a Πρωτεΐνη 16,78±1,47 a 16,43±0,84 a Λίπος 4,13±0,1 a 4,54±0,61 b Τέφρα 3,82±0,37 a 3,85±0,52 a Μέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.). Τα διαφορετικά γράµµατα a,b σε οριζόντια διάταξη δείχνουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές (Ρ<0,05) Αναλύσεις στο µυϊκό ιστό Οι χηµικές αναλύσεις στο µυϊκό ιστό ξεκίνησαν µε τον προσδιορισµό του ποσοστού υγρασίας των ψαριών. Κατ επέκταση οι µάρτυρες εµφάνισαν λίγο υψηλότερα ποσοστά υγρασίας σε σχέση µε τις µεταχειρίσεις αλλά χωρίς να εµφανίσουν σηµαντικές στατιστικές διαφορές. Πιο συγκεκριµένα, η οµάδα των µαρτύρων συγκέντρωσε ποσοστό υγρασίας της τάξεως των 74,49±0,71% έναντι 30

31 73,59±2,10% που συγκέντρωσε η οµάδα της µεταχείρισης. Επιπλέον, οι µάρτυρες κυµάνθηκαν σε ελαφρώς µεγαλύτερα ποσοστά συγκέντρωσης πρωτεΐνης στον µυϊκό τους ιστό, φτάνοντας σε ποσοστό το 16,91±1,71% επί του νωπού βάρους του µυϊκού τους ιστού, έναντι του ποσοστού του 16,50±1,74 % που έφτασαν οι µεταχειρίσεις. Η στατιστική ανάλυση των επιπέδων της πρωτεΐνης δεν έδειξε στατιστική διαφορά και κυµάνθηκε σε Ρ<0,05. Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 7, η συγκέντρωση του λίπους στον µυϊκό ιστό των ψαριών της µεταχείρισης που πέρασαν περιόδους ασιτίας ξεπέρασε αυτή των µαρτύρων, οι οποίοι συγκέντρωσαν ποσοστό της τάξης του 2,83±0,14% έναντι 3,37±0,58% των µεταχειρίσεων. Βέβαια, οι δύο οµάδες των µεταχειρίσεων παρουσίασαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ τους (Πιν.7). Τέλος, το ποσοστό συγκέντρωσης της τέφρας των µαρτύρων εµφάνισε ελάχιστα µεγαλύτερα ποσοστά έναντι των µεταχειρίσεων και χωρίς στατιστικά σηµαντική διαφορά (1,39±0,03 % έναντι 1,35±0,15). Πίνακας 7: Χηµική σύσταση του ολικού σώµατος των οµάδων ψαριών επί του νωπού βάρους των δειγµάτων Χηµική σύσταση (%) Μάρτυρας Διαχείριση Υγρασία 74,49±0,71 a 73,59±2,10 a Πρωτεΐνη 16,91±1,71 a 16,50±1,74 a Λίπος 2,83±0,14 a 3,37±0,58 b Τέφρα 1,39±0,03 a 1,35±0,15 a Μέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.). Τα διαφορετικά γράµµατα a,b σε οριζόντια διάταξη δείχνουν στατιστικά σηµαντικές διαφορές (Ρ<0,05) Παραλλακτικότητα µεγεθών Για τον προσδιορισµό του φαινοµένου της ανοµοιοµορφίας των µεγεθών των εκτρεφόµενων ψαριών µελετήθηκε η παραλλακτικότητα µεγεθών των ψαριών του πειράµατος. Έτσι, όπως φαίνεται και στο Διάγραµµα 6, τα άτοµα της µεταχείρισης έδειξαν µια πιο οµοιόµορφη καµπύλη κατανοµής της παραλλακτικότητας σε όλη την έκταση του πειράµατος. 31

32 10 8 CV % Ημέρα Διάγραµµα 6 Εξέλιξη της παραλλακτικότητας των µεγεθών καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος, των µεταχειρίσεων των ψαριών. Ο µάρτυρας παρουσιάζεται µε συνεχή γραµµή και η µεταχείριση µε διακεκοµµένη Συζήτηση Στην παρούσα φάση του έργου, µελετήθηκε το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης και της παραλλακτικότητας των µεγεθών στην εντατική εκτροφή της τσιπούρας, καθώς πραγµατοποιήθηκαν και οι απαραίτητες χηµικές αναλύσεις τόσο στο ολικό σώµα των ιχθυδίων, όσο και στον µυϊκό ιστό αυτών. Το συγκεκριµένο πείραµα είχε διάρκεια 48 ηµέρες και τα νεαρά ψάρια ήταν χωρισµένα σε δύο οµάδες. Στην βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί, ωστόσο και πειράµατα στα οποία τα άτοµα ήταν µεµονωµένα. Έτσι, για να αναγνωριστεί η παραλλακτικότητα και να προσεγγιστεί το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης, οι παράµετροι ανάπτυξης που µελετήθηκαν ήταν το βάρος και το ολικό µήκος. Στην πρώτη κιόλας µέτρηση από την έναρξη του πειράµατος και το πέρας των πρώτων 12 ηµερών, τα άτοµα της µεταχείρισης που πέρασαν τις περιόδους ασιτίας, έδειξαν να µένουν αρκετά πίσω στην ανάπτυξη σε σχέση µε τους µάρτυρες οι οποίοι σιτίζονταν καθηµερινά. Αλλά και στην δεύτερη µέτρηση, όπου και τα άτοµα της µεταχείρισης σιτίστηκαν καθηµερινά στο διάστηµα που µεσολάβησε, δεν κατάφεραν ούτε ως προς το βάρος ούτε στο µήκος να προσεγγίσουν αυτό των µαρτύρων. Επιπροσθέτως, ακόµα και µετά τον δεύτερο κύκλο της µεταχείρισης και 32

33 την ολοκλήρωση του πειράµατος, οι µάρτυρες οι οποίοι σιτίζονταν σε καθηµερινή βάση έδειξαν να έχουν καλύτερη ανάπτυξη από τις µεταχειρίσεις και ως συνέπεια την µη εµφάνιση του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Επιπλέον, η παραλλακτικότητα µεγεθών των µαρτύρων στην αρχή του πειράµατος, είχε µεγαλύτερο ποσοστό έναντι αυτού των µεταχειρίσεων ( 9,31 % έναντι 7,82%). Στη διάρκεια όµως του πειράµατος, η πορεία της παραλλακτικότητας των µαρτύρων είχε πολλές και σηµαντικές αυξοµειώσεις σε αντίθεση µε αυτή των µεταχειρίσεων, η οποία εµφανίζεται ποιο σταθερή και οµαλή. Τελικά και οι δύο πορείες, των µαρτύρων και των µεταχειρίσεων φαίνεται να καταλήγουν στα ίδια επίπεδα µε το πέρας του πειράµατος (6,84 % και 6,27 % αντίστοιχα). Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι σηµαντικότεροι περιβαλλοντικοί παράγοντες, που επηρεάζουν την αύξηση της αντιστάθµισης είναι η θερµοκρασία, η αλατότητα, τα επίπεδα του διαλυµένου στο νερό οξυγόνου, οι ιχθυοφορτίσεις, καθώς και η παραλλακτικότητα των µεγεθών. Στην παρούσα εργασία οι εν λόγω περιβαλλοντικοί παράγοντες διατηρήθηκαν σταθεροί και δεν επηρέασαν σε καµία περίπτωση την µη εµφάνιση του φαινοµένου. Στην βιβλιογραφία αναφέρονται εργασίες οι οποίες οι περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρέασαν την εκδήλωση του φαινοµένου. Σε πείραµα που πραγµατοποιήθηκε σε άτοµα σολοµού (Salmo salar) (Nicieza & Metcalfe 1997, Maclean & Metcalfe 2001) και Gadus morhua (Purchase & Brown 2001), παρατηρήθηκε µερική αντιστάθµιση, έπειτα από µείωση της θερµοκρασίας. Σε πειράµατα που έγιναν σε ιχθύδια τιλάπιας Oreochromis niloticus, όταν αυτά τέθηκαν σε µεγάλες ιχθυοφορτίσεις τότε παρατηρήθηκε µια µείωση της αύξησης. Στην συνέχεια η µείωση αυτή εξαφανίστηκε µε το που επέστρεψαν τα ψάρια σε κανονικές ιχθυοφορτίσεις (Jobling & Koskela 1996). Ιχθύδια σολοµών του Ατλαντικού Salmo salar (Damsgard & Arnesen 1998), παρουσίασαν µερική αντιστάθµιση έπειτα από µετακίνησή τους από γλυκό σε θαλασσινό νερό. Το γατόψαρο (Anarhichas minor), εκδήλωσε αύξηση αντιστάθµισης, όταν ξαναγύρισε σε κανονικά οξυγονωµένο νερό, έπειτα από την παραµονή του για εβδοµήντα πέντε ηµέρες σε υποξικές συνθήκες (Foss & Imsland 2002). Το πείραµα διακόπηκε µετά από είκοσι µία ηµέρες παραµονής των ψαριών σε κανονικές 33

34 συνθήκες οξυγόνου και έτσι δεν έγινε ξεκάθαρο εάν η αύξηση αντιστάθµισης διαρκούσε και παραπέρα. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται πείραµα βάσει της παραλλακτικότητας των µεγεθών που πραγµατοποιήθηκε στην ιριδίζουσα πέστροφα (Jobling & Koskela 1996). Συγκεκριµένα σε οµάδες ιριδίζουσας πέστροφας που προσφέρονταν µειωµένες ποσότητες τροφής, η πρόσληψή της δε γίνονταν ισόποσα από όλα τα άτοµα. Η επικράτηση της ιεραρχίας πιθανόν να δηµιουργεί εντονότερη παραλλακτικότητα. Το αποτέλεσµα είναι µια εντελώς ασύµµετρη ανάπτυξη ανάµεσα στα ελλιπώς σιτιζόµενα ψάρια. Όταν στις πέστροφες προσφέρθηκε επαρκής ποσότητα τροφής, έγιναν υπερφαγικές. Η αύξηση αντιστάθµισης ήταν µεγαλύτερη σε πέστροφες µικρότερης ανάπτυξης στις παραπάνω συνθήκες. Αυτό αποδεικνύει ότι, σε συνθήκες ύπαρξης επαρκούς ποσότητας τροφής, η προϋπάρχουσα επικράτηση των µεγαλύτερων µεγεθών χαλαρώνει και τα άτοµα, µε τα µικρότερα µεγέθη στα οποία η ανάπτυξη τους είχε κατασταλεί, µπορούν να εµφανίσουν υψηλούς ρυθµούς πρόσληψης τροφής. Από την άλλη µεριά, πειράµατα που έγιναν σε µεµονωµένα άτοµα διαφόρων ειδών ψαριών, εµφάνισαν φαινόµενα πλήρους αλλά και υπέρ αντιστάθµισης και αποτελούν τρανταχτά παραδείγµατα για την ύπαρξη του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Σε µελέτη του υβριδίου Lepomis cyanellus x L. macrochirus ηλικίας 0+, καθορίστηκαν περίοδοι στέρησης δύο, τεσσάρων, έξι, δέκα ή δεκατεσσάρων ηµερών (Hayward et al. 1997). Με αυτό το πρωτόκολλο κάποιες οµάδες ψαριών που εκτέθηκαν σε κυκλικές φάσεις ταΐσµατος και στέρησης τροφής αναπτύχθηκαν περισσότερο, απ ότι οι µάρτυρες που ταΐζονταν καθηµερινά σε χρονικό διάστηµα εκατόν πέντε ηµερών. Η υπέρ αντιστάθµιση παρατηρήθηκε στα ψάρια της οµάδας µε τη διήµερη στέρηση. Η επίδραση του πρωτοκόλλου ταΐσµατος και η διάρκειας της ασιτίας διακατέχει ουσιαστικό ρόλο στην εµφάνιση του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Σε πείραµά του ο Πανταρίδης (2005) πέτυχε µερική αντιστάθµιση σε άτοµα τσιπούρας, που παρόλο που παρέµειναν άσιτα για πάνω από µία εβδοµάδες, και παρουσίασαν απώλεια βάρους τις πρώτες µέρες της ασιτίας, στο τέλος κατάφεραν να προσεγγίσουν σε ανάπτυξη τους µάρτυρες που σιτίστηκαν κανονικά. Βέβαια στην παρούσα φάση του έργου, λόγω του µικρού βάρους των ψαριών και της νεαρής ηλικίας, αυτονόητο είναι ότι δεν µπορούσαµε σε καµία 34

35 περίπτωση να αφήσουµε τα συγκεκριµένα ψάρια άσιτα για τόσο µεγάλο χρονικό διάστηµα και γι αυτό το λόγο περιορίσαµε το πείραµα σε ασιτία ανά ηµέρα. Επιπροσθέτως, η µικρή διάρκεια του πειράµατος (48 ηµέρες) ίσως να µην ευνόησε την εµφάνιση του φαινοµένου. Αν ενδεχοµένως υπήρχε η δυνατότητα να επιµηκυνθεί η διάρκεια του πειράµατος και να πραγµατοποιηθούν και άλλες επαναλήψεις του πρωτοκόλλου ταΐσµατος, τα τελικά αποτελέσµατα να ήταν διαφορετικά. Για παράδειγµα, άτοµα ιριδίζουσας πέστροφας αρχικού βάρους περίπου 10 g, παρουσίασαν αύξηση αντιστάθµισης, η οποία προέκυψε µετά από µια περίοδο δεκατριών εβδοµάδων ασιτίας (Weatherley & Gill 1981). Παρ όλα αυτά, οι Eroldogan et al. (2006b), σε πείραµα που πραγµατοποίησαν σε νεαρά άτοµα τσιπούρας Sparus aurata διάρκειας 40 ηµερών και µέσου αρχικού βάρους περίπου 14 g, απέδειξαν ανάπτυξη αντιστάθµισης σε µία από τις µεταχειρίσεις τους. Η συγκεκριµένη διαχείριση στερούνταν τροφής για µία εβδοµάδα και ταΐζονταν µέχρι το επίπεδο κορεσµού για τις υπόλοιπες δύο εβδοµάδες. Η αύξηση αντιστάθµισης µπορεί να µην εκδηλώνεται, εάν ο περιορισµός της τροφής ξεπεράσει κάποιο όριο (Wilson & Osbourne 1960, Ryan 1990). Για παράδειγµα ιχθύδια σολοµού που ήταν σε ασιτία για µία έως τρεις εβδοµάδες έφτασαν σε βάρος τους µάρτυρες, ενώ αυτά που παρέµειναν χωρίς τροφή για µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα (Bilton & Robins 1973). Σχεδόν όλες οι εργασίες που αναφέρονται στην ποσότητα της προσφερόµενης τροφής βρήκαν ότι η υπερφαγία έχει σηµαντική συµβολή στην επιτάχυνση της ανάπτυξης και φαίνεται να διαδραµατίζει ίσως τον σηµαντικότερο ρόλο στην εµφάνιση του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης, αν και κάποιο ρόλο µπορούν να παίξουν οι ελαττωµένες τιµές µετατρεψιµότητας της τροφής ή η προσαρµογή της συµπεριφοράς των οργανισµών στις περιβαλλοντικές συνθήκες (Πανταρίδης 2005). Όσον αφορά στο συντελεστή µετατρεψιµότητας της τροφής, στην παρούσα µελέτη οι µάρτυρες έδειξαν, µε πολύ µικρή διαφορά, καλύτερα αποτελέσµατα σε σχέση µε τη µεταχείριση. Φρόνιµο είναι να αναφερθεί ότι οι µικρές διαφορές που παρατηρήθηκαν στο F.C.R. µπορεί να οφείλονται στη µικρή διάρκεια του πειράµατος, καθώς είναι γνωστό ότι για να φανούν σαφή αποτελέσµατα απαιτείται και ο απαραίτητος χρόνος. Πρόσθετα, οι Dobson και Holmes (1984) πρότειναν, ότι η αύξηση αντιστάθµισης στα ψάρια µπορεί να είναι γνώρισµα αποτελεσµατικότερης χρήσης της τροφής. Στην ιριδίζουσα πέστροφα, έχει δειχθεί, ότι η αύξηση αντιστάθµισης προκλήθηκε ολοκληρωτικά από την αξιοποίηση της 35

36 προσφερόµενης τροφής (βελτίωση της πεπτικότητας), χωρίς υπερφαγική αντίδραση (Boujard et al. 2000). Επίσης, στην παρούσα µελέτη επιχειρήθηκε µια προσπάθεια προσέγγισης του φαινοµένου της αύξησης της αντιστάθµισης µε βάση την σύσταση του σώµατος. Για το λόγο αυτό πραγµατοποιήθηκαν οι αναλύσεις του ολικού σώµατος και του µυϊκού ιστού ως προς τις συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών, του λίπους, της υγρασίας και της τέφρας. Οι στατιστικές αναλύσεις που πραγµατοποιήθηκαν µε το πέρας του πειράµατος δεν έδειξαν διαφορές ανάµεσα σε µάρτυρα και µεταχείριση, γεγονός που µας οδηγεί στο συµπέρασµα ότι η ασιτία και επανασίτιση δεν επιδρά στα ποιοτικά χαρακτηριστικά των ψαριών. Σε παρόµοια αποτελέσµατα κατέληξαν και οι Eroldogan et al. (2008), σε πείραµα που πραγµατοποίησαν σε νεαρά άτοµα τσιπούρας. Συγκεκριµένα, οι δύο οµάδες µεταχειρίσεων που επέλεξαν, πέρασαν περιόδους µερικής ή ολικής στέρησης τροφής - επαναδιατροφής, µε άµεσο αποτέλεσµα οι µάρτυρες να συγκεντρώσουν ελαφρώς καλύτερα ποσοστά πρωτεΐνης, χωρίς όµως να παρουσιάσουν στατιστικώς σηµαντικές διαφορές µε τις µεταχειρίσεις. Επίσης, σε συναφή αποτελέσµατα έδειξαν και πειράµατα που εφαρµόστηκαν σε έξι διατροφικές οµάδες από νεαρά λαβράκια, οι οποίες ταΐζονταν για 60 ηµέρες µε τροφή που αποτελούσε το 2, 2.5, 3, 3.5, και 4 % του ζώντος βάρος τους, αντίστοιχα (Eroldogan et al. 2004). Έχοντας υπόψη την ανάγκη συµπίεσης του κόστους παραγωγής στις εντατικές µορφές ιχθυοκαλλιέργειας, η επιβολή σταθερών περιόδων ασιτίας ή περιορισµού τροφής στα εκτρεφόµενα ψάρια µπορεί να οδηγήσει σε οφέλη (οικονοµικά και περιβαλλοντικά) λόγω της εκδήλωσης του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Ωστόσο δεν είναι ξεκάθαρο το πρωτόκολλο που θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί σε επίπεδο παραγωγής για το κάθε εκτρεφόµενο είδος. Για να επιτευχθεί αυτό θα πρέπει να απαντήσει η έρευνα σε µια σειρά ερωτηµάτων πολύ σηµαντικών όπως π.χ. να προκαθοριστεί µέχρι ποιο σηµείο πρέπει να µειωθεί το βάρος του σώµατος (στην περίοδο του περιορισµού της τροφής), µέχρι να αρχίσει η επαναδιατροφή (Schwarz et al. 1985). Παράλληλα, η εκδήλωση αυτή εξαρτάται από διάφορους φυσικοχηµικούς παράγοντες, την ένταση και τη διάρκεια της ασιτίας, το στάδιο της ανάπτυξης που βρίσκεται το άτοµο κατά την έναρξη της ασιτίας, την ηλικία που ωριµάζει σεξουαλικά και τη µορφή της επαναδιατροφής. Γενικά, οι περισσότερες εργασίες µε θέµα την αύξηση αντιστάθµισης στα ψάρια, έχουν εξετάσει τις αντιδράσεις στον περιορισµό της τροφής, τη 36

37 θερµοκρασία ή την ιχθυοφόρτιση του πληθυσµού. Τα πρωτόκολλα θα πρέπει να καθορίζουν το εύρος της µείωσης της αύξησης, που προκαλεί την αύξηση αντιστάθµισης, καθώς και το βαθµό της αντιστάθµισης που θα επιτευχθεί. Σε κάθε περίπτωση πάντως, αν και έχει ερευνηθεί αρκετά ο συγκεκριµένος τοµέας, η περεταίρω και σε βάθος έρευνα στα διαφορετικά είδη και στους διαφορετικούς φυσικοχηµικούς παράγοντες που εµπλέκονται στην ανάπτυξη των ψαριών κρίνεται απαραίτητη. 1.3 Οµάδα ΜΑ: χορήγηση τροφής 100% και Οµάδα Β: 4 Εβδοµάδες ασιτία και 8 εβδοµάδες επαναδιατροφή Μεθοδολογία Κατά τo 3o πείραµα της πρώτης φάσης του έργου, το οποίο πραγµατοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις του Εργαστηρίου Υδατοκαλλιεργειών, του Τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος και το οποίο είχε διάρκεια 12 εβδοµάδες, µελετήθηκε το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης σε τσιπούρες υπό διαφορετικά διαστήµατα ασιτίας επαναδιατροφής. Παρακάτω παρατίθενται τα αποτελέσµατα του 3 ου πειράµατος, µε διαφορετικούς χρόνους και διαφορετικά ποσοστά χορήγησης τροφής. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκαν νεαρά άτοµα τσιπούρας, τα οποία προήλθαν από τις ιχθυοκαλλιέργειες Αφοί Μαντέ και ΣΙΑ Ο.Ε Πειραµατικός Σχεδιασµός Τα ψάρια χωρίστηκαν i) στην οµάδα των µαρτύρων Μ, η οποία ταΐζονταν δύο φορές την ηµέρα καθηµερινά (09:00 και 14:00), ii) στην οµάδα της µεταχείρισης Β, µε τέσσερις (4) εβδοµάδες ασιτία, κρατώντας όλους τους υπόλοιπους παράγοντες του περιβάλλοντος εκτροφής σταθερούς. Μετά το πέρας των εβδοµάδων ασιτίας, οι πλυθησµοί σιτίζονταν σε επίπεδα ίδια µε αυτά των µαρτύρων (ad libitum) για τις επόµενες 8 εβδοµάδες. Ανάµεσα στις περιόδους σίτισης επανασίτισης καθώς και στην έναρξη, πραγµατοποιήθηκε ζύγισµα των ιχθύων και καταγραφή του βάρους. Στο τέλος, οι ιχθύες θανατώθηκαν, ακολούθησε αιµοληψία και συλλέχθηκαν το ήπαρ και ο πεπτικός σωλήνας. 37

38 Στο τέλος της φάσης εκτροφής και πριν την θανάτωση για τη δειγµατοληψία καταγράφονταν τα σωµατοµετρικά στοιχεία των ιχθύων για τον υπολογισµό της αύξηση βάρους (WG, Weight Gain), τον ρυθµό αύξησης (GR, Growth rate), τον ειδικό ρυθµό αύξησης (SGR, Specific Growth Rate), τον ρυθµό µετατρεψιµότητας της τροφής (FCR), τον δείκτης ευρωστίας (Condition factor), του ηπατοσωµατικού δείκτη (HSI) αλλά και της προσλαµβανόµενης τροφής (DFI) Εγκαταστάσεις πειραµατισµού Το πείραµα πραγµατοποιήθηκε σε κλειστό κύκλωµα του εργαστηρίου, όπου ο πληθυσµός παρέµεινε κατά τη διάρκεια της πρώτης φάσης του πειράµατος µέχρι το επόµενο ζύγισµα. Το κύκλωµα αποτελούταν από 6 δεξαµενές µε γυάλινα τοιχώµατα, διαστάσεων 88cm x 68cm x 36cm και όγκου 215,5l η κάθε µία. Κάθε δεξαµενή διέθετε σύστηµα οξυγόνωσης, παροχής του νερού, αποχέτευσης και σύστηµα φίλτρων. Το σύστηµα οξυγόνωσης αποτελούταν από σωλήνες PVC που διοχετεύουν τον ατµοσφαιρικό αέρα µέσω πλαστικών εύκαµπτων σωληνίσκων 6mm σε κατασκευές οµοιόµορφης απελευθέρωσης αέρα (αερόπετρες). Η παροχή του νερού στις δεξαµενές πραγµατοποιούταν µέσω δικτύου που διαµοίραζε το θαλασσινό νερό στα κυκλώµατα του εργαστηρίου. Η παροχή ρυθµίστηκε στα 1,5L/min (ή 90L/h ). Το σύστηµα αποχέτευσης αποτελούταν από σωλήνα ενσωµατωµένος στην πλάτη της κάθε δεξαµενής και λειτουργούσε και σαν σηµείο στάθµης του νερού. Το σύστηµα του φίλτρου αποτελείτο από έναν συνδυασµό µηχανικών (σπόγγοι) και βιολογικών (χαλίκια) φίλτρων, συν τις λυχνίες υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) για τον έλεγχο των παθογόνων µικροοργανισµών. Στο κύκλωµα υπήρχε επίσης σύστηµα ψύξης του νερού. Η φωτοπερίοδος ήταν ρυθµισµένη όµοια σε όλους τους ιχθυοπληθυσµούς, µε 12 ώρες συνεχούς φωτός και 12 σκότους (07:00-19:00 και 19:00-07:00 αντίστοιχα) Το βιολογικό υλικό Για την υλοποίηση των σκοπών της συγκεκριµένης φάσης του πειράµατος, χρησιµοποιήθηκαν έξι οµοιογενείς πληθυσµοί των πέντε ατόµων έκαστος, µέσου αρχικού βάρους 262,99±58,16 gr αρχικής πυκνότητας εκτροφής. Τα άτοµα των πληθυσµών προέκυψαν από ζύγισµα του ήδη υπάρχοντος πληθυσµού που ήταν εγκλιµατισµένος στις συνθήκες του εργαστηρίου, καθώς είχε υποβληθεί σε πείραµα 38

39 που είχε λάβει χώρα στο εργαστήριο κάποιες εβδοµάδες πιο πριν. Το ζύγισµα έγινε µε ηλεκτρονικό ζυγό ακρίβειας 0,1g και στη συνέχεια οµαδοποιήθηκε µε τα άτοµα να τοποθετούνται εκ νέου στις δεξαµενές Χειρισµοί Σε καθηµερνή βάση πραγµατοποιούνταν χειρισµοί ρουτίνας σε προκαθορισµένα χρονικά διαστήµατα µε σκοπό την οµαλότητα και την εξάλειψη πιθανής απόκλισης από την προγραµµατισµένη διαδικασία που θα επέφεραν ενδεχόµενη εκδήλωση stress από του ιχθύες. Η εργαστηριακή ρουτίνα πραγµατοποιούνταν από Δευτέρα έως Παρασκευή Χορήγηση τροφής Τα ηµερήσια σιτηρέσια των ιχθυοπληθυσµών χωριζόταν σε δύο µέρη, ένα πρωινό (09:00) και ένα µεσηµεριανό (14:00). Η τροφή που χρησιµοποιήθηκε ήταν εµπορίου µεγέθους 4.5mm. Ο διαµοιρασµός της τροφής στις δεξαµενές πραγµατοποιούταν αφού πρώτα ζυγιζόταν σε ηλεκτρονικό ζυγό ακριβείας. Το ζυγισµένο βάρος της τροφής καταγραφόταν και οι ιχθύες ταΐζονταν ανά δεξαµενή. Η διαδικασία του διαµοιρασµού σταµατούσε όταν παρατηρούνταν ότι τα pellets δεν καταναλωνόντουσαν από τους εκτρεφόµενους οργανισµούς. Πέντε λεπτά αργότερα τα υπολειπόµενα pellets, συλλέγγονταν µε σιφονισµό και καταµετρούνταν έτσι ώστε να υπολογισθεί το βάρος της τροφής που περίσσεψε και κατ επέκταση αυτό εκείνης που καταναλώθηκε από τους ιχθύες. Καθηµερινά καταγράφονταν η κατανάλωση της τροφής για κάθε δεξαµενή του κάθε χειρισµού Καθαρισµοί Καθαρισµός των µηχανικών φίλτρων των κυκλωµάτων πραγµατοποιούνταν κάθε µέρα και των δεξαµενών µια φορά την εβδοµάδα µε σκοπό την αποµάκρυνση των αιρούµενων σωµατιδίων (περιττώµατα των ιχθύων) και την µείωση του οργανικού φορτίου. Ο καθαρισµός πραγµατοποιούταν µε σπόγγο εµπορίου, σιφώνισµο και ανανέωση του νερού εκτροφής κατά το ½ περίπου του όγκου κάθε δεξαµενής. Όπου κρίθηκε αναγκαίο γινόταν και καθαρισµός του βιολογικού φίλτρου του κυκλώµατος. 39

40 Λήψη φυσικοχηµικών χαρακτηριστικών του νερού εκτροφής Καθηµερινά πραγµατοποιούνταν µετρήσεις για την ποιότητα του νερού όσον αφορά στο ph, στην αλατότητα και στα επίπεδα οξυγόνου. Οι µετρήσεις πραγµατοποιούνταν κάθε πρωί 45 λεπτά πριν τον πρώτο διαµοιρασµό του σιτηρεσίου (08:15). Οι µετρήσεις για τα επίπεδα οξυγόνου πραγµατοποιούντο µε φορητή συσκευή µέτρησης Handygamma (Oxyguard). Το όργανο σταθµιζόταν πριν κάθε χρήση και τοποθετούταν στη δεξαµένη για την µέτρηση. Για τη µέτρηση του ph, χρησιµοποιήθηκε φορητή συσκευή τύπου handyph της Oxyguard. Το όργανο καλιµπραριζόταν πριν κάθε χρήση και τοποθετούταν στη δεξαµενή για την µέτρηση. Για την σταθεροποίηση του ph του νερού εκτροφής χρησιµοποιήθηκε όπου κρίθηκε αναγκαίο, διάλυµα CaCO 3. Η αλατότητα µετρούταν µε αλατόµετρο (refractometer) Signstek (ATC). Το όργανο σταθµιζόταν οµοίως. Σε εβδοµαδιαία βάση, δύο φορές την εβδοµάδα (Δευτέρα και Παρασκευή) γινόταν δειγµατοληψία νερού εκτροφής από όλες τις δεξαµενές για τον προσδιορισµό της ολκής αµµωνίας και των νιτρωδών ιόντων. Συγκεκριµένα στη µέση της ηµέρας, δύο ώρες πριν το µεσηµεριανό τάισµα (12:00) µε τη βοήθεια λεπτού σιφονιού συλλέγονταν νερό και µέσω διηθητικού χαρτιού για την αποµάκρυνση των αιωρούµενων σωµατιδίων, αποθηκεύοταν σε φιαλίδια των 100ml που στη συνέχεια θα κατεψύχοντο (-30 o C) Ζύγισµα των πληθυσµών Η διαδικασία αυτή πραγµατοποιούταν στο τέλος κάθε φάσης του πειράµατος, συνολικά τρείς φορές, στην έναρξη, στο τέλος της περιόδου ασιτίας και στο τέλος του πειράµατος. Ο πληθυσµός της κάθε δεξαµενής εξαλιευόταν και µετά την τοποθέτηση του σε δεξαµενή µε οξυγόνωση και διάλυµα αναισθησίας (2- φαινοξυαιθανόλη), τοποθετούταν κατ άτοµο σε ηλεκτρονικό ζυγό ακριβείας 0,1g όπου καταγραφόταν το βάρος του κάθε ατόµου και στη συνέχεια η συνολική βιοµάζα της δεξαµενής. Επίσης, από κάθε άτοµο καταγραφόταν το ολικό (TL), σταθερό (SL) και µεσουραίο (FL) µήκος του. Ακολουθούσε εκσπλαχνισµός και µετά από ζύγισµα, καταγραφόταν το βάρος του ήπατος και του πεπτικού σωλήνα. Στη συνέχεια ο πεπτικός σωλήνας και το συκώτι αποθηκεύτηκε στον καταψύκτη 40

41 ενώ το υπόλοιπο µέρος των ιχθύων οµογενοποιήθηκε και στη συνέχεια καταψύχθηκε Αποτελέσµατα Τα αποτελέσµατα της πειραµατικής διαδικασίας παρουσιάζονται στα διαγράµµατα 7 και 8. ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΒΑΡΟΥΣ ΒΑΡΟΣ (gr) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ 10,301x 238,38 y = 7,7308x R² = 0, , R² = 0,86869 ΕΒΔΟΜΑΔΑ Διάγραµµα 7 Μεταβολή βάρους των ατόµων στις δύο πειραµατικές οµάδες 20 ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΜΗΚΟΥΣ ΜΗΚΟΣ (cm) ΕΒΔΟΜΑΔΑ ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ y = 0,522x + 11,848 R² = 0,98997 y = 0,325x + 10,867 R² = 0,86696 Διάγραµµα 8 Μεταβολή σταθερού µήκους σε σχέση µε το χρόνο των δύο πειραµατικών οµάδων 41

42 1.3.3 Συζήτηση Στα ψάρια, ο όρος αύξηση αντιστάθµισης χρησιµοποιείται συχνά για να περιγράψει τη µεταβολή των ρυθµών αύξησης του µήκους και του βάρους. Η αντιστάθµιση µπορεί επίσης να εξετασθεί σε σχέση µε την ανάπτυξη διαφορετικών ιστών, οργάνων ή βασικών συστατικών του σώµατος. επίδραση των διατροφικών συνθηκών στη συγκρότηση του σώµατος και στη φυσιολογία των τελεόοστεων είναι αρκετά κατανοητή. Στην παρούσα φάση του έργου, παρόλο που παρατηρήθηκαν µεταβολές στο βάρος, το µήκος των οργανισµών δε φάνηκε να µεταβάλλεται σε συνάρτηση µε την ασιτία ή την επαναδιατροφή. αφού µείωση του βάρους συχνά δεν σχετίζεται καθόλου ή σχετίζεται αµελητέα µε τη µείωση του µήκους. (Διάγραµµα 8). Η επίδραση της περιορισµένης προσφοράς τροφής στη διαµόρφωση της αύξησης του βάρους και του µήκους µπορεί να διαφέρει σηµαντικά. Παρόµοια αποτελέσµατα έχουν αναφερθεί κι από άλλους ερευνητές (Ali et al, 2003). Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι το φαινόµενο της αύξησης αντιστάθµισης εκδηλώνεται στην εκτροφή της τσιπούρας µετά από διάστηµα πλήρους ασιτίας για τέσσερις εβδοµάδες. Επίσης παρατηρήθηκαν µεταβολές στις τιµές του συντελεστή µετατρεψιµότητας της τροφής (FCR) των ατόµων που έµειναν σε ασιτία. Τα αποτελέσµατα µιας περιόδου στέρησης τροφής σε οµαδοποιηµένα ψάρια ποικίλουν και ανάλογα µε το είδος του ψαριού. Ο κόκκινος σολοµός Oncorhynchus nerka, παρουσίασε αύξηση αντιστάθµισης έπειτα από µία έως τρεις εβδοµάδες ασιτίας και έφτασε σε παρόµοια βάρη µε τους µάρτυρες µετά από οκτώ εβδοµάδες ταΐσµατος ad libidum. Όταν ασιτία αυξήθηκε στις τέσσερις εβδοµάδες, οι ρυθµοί θνησιµότητας ήταν υψηλοί και τα επιζώντα ψάρια δεν ήταν σε θέση να φτάσουν σε βάρος τους µάρτυρες (Bilton and Robins, 1973). Η συχνότητα παροχής της τροφής µπορεί να έχει αποφασιστική επίδραση στην ανάπτυξη του ψαριού. Αν οι περίοδοι της ασιτίας είναι µικρές και υπάρχει επάρκεια τροφής ανάµεσα στις περιόδους ασιτίας, εκδηλώνεται µε την προσφορά τροφής µια υπερφαγική αντίδραση που µπορεί να εµποδίσει αξιόλογη µείωση της αύξησης. Έτσι, τύπος της αύξησης µε το συνεχόµενο τάισµα και την παροδική ασιτία είναι ουσιαστικά δυσδιάκριτος. Σε αυτήν την περίπτωση, λόγω συµπεριφοράς αντιστάθµιση συµβαίνει προτού περιορισµός της τροφής προκαλέσει µια αξιοπρόσεχτη ελάττωση της αύξησης. Αυτό είχε περιγραφεί σε ανήλικα άτοµα 42

43 Gasterosteus aculeatus µε περιόδους ασιτίας τριών ηµερών (Ali and Wootton, 1998). Καµία διαφορά δεν παρατηρήθηκε στην αύξηση, στη µετατρεψιµότητα της τροφής και στη σύνθεση του σώµατος σε µεταχειρίσεις οµάδων ιριδίζουσας πέστροφας, που κάποιες τρέφονταν καθηµερινά και κάποιες τρέφονταν τρεις φορές την εβδοµάδα. Αυτές όµως που ταΐζονταν µία ή δύο φορές την εβδοµάδα ήταν σαφώς µικρότερες από τους µάρτυρες. Η κατανάλωση της ενέργειας κατά τη διάρκεια της ασιτίας των ψαριών, µπορεί να µειωθεί µε την ελάττωση της κινητικότητας τους (Wieser et al, 1992). Ο περιορισµός της κινητικότητας, κατά την επανασίτιση, θα µπορούσε να συνεισφέρει στην αύξηση αντιστάθµισης, µε την αύξηση της αναλογίας της ενέργειας, που είναι διαθέσιµη για το σκοπό αυτό. Οι αντισταθµιστικές αλλαγές στην όρεξη και στην αύξηση των ψαριών µετά από διάστηµα περιορισµού της τροφής φαίνεται να είναι σηµαντικός µοχλός για την ανάπτυξη βελτιστοποιηµένου τρόπου ταΐσµατος στις ιχθυοκαλλιέργειες. Η επιβολή σταθερών περιόδων ασιτίας ή περιορισµού τροφής στα εκτρεφόµενα ψάρια µπορεί να οδηγήσει σε οφέλη (οικονοµικά και περιβαλλοντικά), λόγω της εκδήλωσης του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. 43

44 2 Συγκριτική µελέτη πρωτοκόλλων µερικής ασιτίας επαναδιατροφής σε πλωτούς ιχθυοκλωβούς 2.1 Μεθοδολογία Κατά τη δεύτερη φάση της πειραµατικής διαδικασίας, χρησιµοποιήθηκε το πρωτόκολλο ολικής/µερικής ασιτίας επαναδιατροφής το οποίο προέκυψε από τα αποτελέσµατα της Φάσης 1 του έργου. Δειγµατοληψίες ιχθύων πραγµατοποιήθηκαν στη µονάδα ιχθυοκαλλιέργειας Αφοί Μαντέ & ΣΙΑ Ο.Ε., για να µελετηθεί η επίδραση του πρωτοκόλλου ταΐσµατος (διάρκεια ολικής-µερικής ασιτίας, διάρκεια επαναδιατροφής) στην αύξηση αντιστάθµισης στην τσιπούρα σε συνθήκες πλωτών ιχθυοκλωβών Δειγµατοληψίες Η χρονική διάρκεια του πειράµατος ήταν 12 εβδοµάδες (84 ηµέρες) και χρησιµοποιήθηκαν άτοµα τσιπούρας, που µεταφέρθηκαν στον εργαστηριακό χώρο των εγκαταστάσεων του Τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος του Πανεπιστηµίου Θεσσαλίας, από τη µονάδα ιχθυοκαλλιέργειας Αφοί Μαντέ & Σία Ο.Ε., που βρίσκεται στη θαλάσσια περιοχή του διαύλου των Ωρεών και πιο συγκεκριµένα στην περιοχή Παληόλακα-Χελώνες του Ν. Φθιώτιδας Πειραµατικός σχεδιασµός Κατά την εκκίνηση του πειράµατος, ζυγίστηκαν µε ακρίβεια δεύτερου δεκαδικού ψηφίου 78 ψάρια µέσου βάρους 36,08g ±5,28. Ταυτόχρονα µετρήθηκε το ολικό µήκος των ατόµων σε mm µε ακρίβεια δεύτερου δεκαδικού ψηφίου οπότε προέκυψε µέσο σταθερό µήκος 11,22± 0,58 mm. Στη συνέχεια τα ψάρια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο (2) οµάδες οι οποίες ήταν: i) των µαρτύρων Μ, η οποία ταΐζονταν καθηµερινά, ii) των µεταχειρίσεων, η οποία διαµορφώθηκε ως εξής: Τέσσερεις εβδοµάδες 25% ασιτία, τέσσερις εβδοµάδες επαναδιατροφή στο 100%, δύο εβδοµάδες 25% ασιτία ακολουθούµενες από 2 εβδοµάδες επαναδιατροφή στο 100%. Στα ψάρια προσφέρονταν τροφή 2 φορές την ηµέρα (10.00 και 17.00). Οι ιχθυοτροφές ήταν σύµπηκτα (pellets) της εταιρείας Biomar, τύπου INICIO PLUS. 44

45 Η σύσταση των ιχθυοτροφών ήταν η ακόλουθη: 56% ολική πρωτεΐνη, 18% ολικά λίπη, 8,2% ελεύθερες αζώτου εκχυλισµατικές ουσίες (ENEO), 10,9% τέφρα, 0,2% ολική κυτταρίνη και 1,6% ολικός φώσφορος. Η προσφερόµενη ποσότητα τροφής ήταν αυτή που πρότεινε µέσα από τους πίνακες εκτροφής της η εταιρία ιχθυοτροφών (συναρτήσει της θερµοκρασίας και του µεγέθους των ψαριών). Σε εβδοµαδιαία βάση καταγράφονταν µετρήσεις για τη θερµοκρασία του νερού (22 οc) και το διαλυµένο οξυγόνο (>6,5 mg/l) µε τη χρήση φορητών ηλεκτρονικών οργάνων. Στη διάρκεια των µετρήσεων η προσφερόµενη τροφή διακόπτονταν µια µέρα πριν από κάθε ζύγισµα, ώστε σε κάθε ζύγισµα των ατόµων να προηγείται µία ηµέρα νηστείας. Τα ζυγίσµατα πραγµατοποιούνταν κάθε δεκατέσσερις (14) ηµέρες µετά από κάθε µεταχείριση. Αρχικά τα ψάρια εξαλιεύονταν µε απόχες. Μετά το στάδιο της αναισθησίας, µετρούνταν το ολικό και σταθερό µήκος τους, καθώς και το βάρος των ψαριών. Οι θνησιµότητες καταγράφονταν ηµερησίως. 2.2 Αποτελέσµατα Παράµετροι αύξησης Οι παράµετροι αύξησης που µελετήθηκαν στην παρούσα φάση του έργου, ήταν το ολικό σωµατικό βάρος και το σταθερό µήκος των ψαριών. Γενικά, τα άτοµα της οµάδας της µεταχείρισης δεν έδειξαν καµία µείωση τόσο στο βάρος όσο και στο σταθερό µήκος τους. Ειδικότερα τα άτοµα της οµάδας της µεταχείρισης, που σιτίστηκαν καθ όλη την διάρκεια του πειράµατος µε 75% τροφή, σε σχέση µε την οµάδα του Μάρτυρα που σιτίζονταν µε το 100%, φαίνεται να κατάφεραν να προσεγγίσουν την αύξηση της οµάδας του Μάρτυρα και κυµάνθηκαν στα ίδια σχετικά επίπεδα µεταξύ τους, δηλαδή και οι δύο οµάδες ακολούθησαν µια ανοδική πορεία στην αύξηση τους. 45

46 Πίνακας 8 Εξέλιξη στην αύξηση (µέσο ολικό σωµατικό βάρος και σταθερό µήκος) των ατόµων της οµάδας του Μάρτυρα και της οµάδας της Μεταχείρισης (µέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.)) 1η Μέτρηση 2η Μέτρηση 3η Μέτρηση 4 η Μέτρηση 5η Μέτρηση 6η Μέτρηση 7η Μέτρηση Βάρος (g) x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. Μάρτυρας 35,76±5,54 47,39±6,65 56,04±7,49 66,2±8,96 78,65±10,9 6 87,13±14,94 101,13±18,4 Μεταχείριση 36,39±5,06 46,57±5,96 53,26±7,05 63,11±8,74 75,06±10,5 85,82±12,39 100,42±14,8 2 Σταθερό Μήκος (cm) x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. x ± s.d. 4 Μάρτυρας 11,16±0,65 11,96±0,65 12,66±0,67 13,46±0,65 14,18±0,73 14,79±0,8 15,44±0,88 Μεταχείριση 11,27±0,49 12,03±0,63 12,58±0,59 13,25±0,64 14,07±0,69 14,77±0,74 15,47±0, ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΒΑΡΟΥΣ ΒΑΡΟΣ (gr) ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ y = 9,5x + 28,429 R² = 0,98954 y = 8,75x + 28,286 R² = 0,9909 ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ Διάγραµµα 9 Εξέλιξη της αύξησης (βάρος) στις οµάδες του µάρτυρα και της µεταχείρισης. 46

47 ΜΗΚΟΣ (cm) ΜΕΤΑΒΟΛΗ ΜΗΚΟΥΣ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΜΑΡΤΥΡΑΣ ΜΕΤΑΧΕΙΡΙΣΗ y = 0,7357x + 10,129 R² = 0,97815 y = 0,7679x + 10,029 R² = 0,95098 Διάγραµµα 10 Εξέλιξη της αύξησης του σταθερού µήκους στις οµάδες του µάρτυρα και της µεταχείρισης. Πίνακας 9 Συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής (F.C.R) και ο ειδικός ρυθµός αύξησης (S.G.R) (P=0,89) Μάρτυρας Μεταχείριση F.C.R. 2,2 1,4 S.G.R. (%/ηµέρα) 1,15±0,39 1,13±0, Χηµικές αναλύσεις µυϊκού ιστού. Οι χηµικές αναλύσεις στο µυϊκό ιστό ξεκίνησαν µε τον προσδιορισµό του ποσοστού υγρασίας και ξηράς ουσίας των ψαριών. Συγκεκριµένα τα ποσοστά υγρασίας της οµάδας του µάρτυρα και της οµάδας της µεταχείρισης κυµάνθηκαν σε ίδια σχετικά επίπεδα αλλά χωρίς να εµφανίσουν σηµαντικές στατιστικές διαφορές. 47

48 Αναλυτικότερα, η οµάδα του µάρτυρα συγκέντρωσε ποσοστό υγρασίας των 73,3±1,58 και η οµάδα της µεταχείρισης 72,44±0,49. Όπως φαίνεται και στον Πίνακας 10 η συγκέντρωση του λίπους στον µυϊκό ιστό των ψαριών της οµάδας της µεταχείρισης που πέρασαν περιόδους µερικής σίτισης ξεπέρασε αυτή της οµάδας του µάρτυρα, οι οποίοι συγκέντρωσαν ποσοστό λιπαρής ουσίας 16,21±5,21 έναντι 23,4±2,22 της οµάδας της µεταχείρισης. Πίνακας 10 Χηµική σύσταση του µυϊκού ιστού του σώµατος των οµάδων ψαριών επί του νωπού βάρους των δειγµάτων. Χηµική σύσταση (%) Μάρτυρας Μεταχείριση Υγρασία 73,3±1,58 72,44±0,49 Ξηρά ουσία 26,69±1,58 27,55±0,49 Πρωτεΐνη 77,08±4,39 71,48±2,47 Λίπος 16,21±5,21 23,4±2,22 Τέφρα 5,89±0,39 5,51±0,12 Σηµείωση: µέσος όρος (x) ± τυπική απόκλιση (s.d.). Συµπερασµατικά, µετά την διεξαγωγή της ανάλυσης της χηµικής σύστασης του µυϊκού ιστού, για την οµάδα του Μάρτυρα όσο και για την οµάδα της µεταχείρισης, τα αποτελέσµατα όσον αφορά στη µέθοδο της Soxhlet, της αποτέφρωσης και του προσδιορισµού της υγρασίας ήταν τα ίδια και για την οµάδα του µάρτυρα και για την οµάδα της µεταχείρισης. 2.3 Συµπεράσµατα Από τα αποτελέσµατα της παρούσας φάσης του έργου, φαίνεται ότι σε συνθήκες εφαρµοσµένης ιχθυοκαλλιέργειας το επίπεδο σίτισης 75% vs 100% µπορεί να εφαρµοστεί για τσιπούρα µέσο βάρος περίπου 35gr και για χρονική διάρκεια 12 εβδοµάδες χωρίς να µειωθεί ο ρυθµός αύξησης των ψαριών. Παρόλο που δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές στις τιµές FCR στης 48

49 οµάδας της Μεταχείρισης η µετατρεψιµότητα της τροφής φαίνεται να βελτιώνεται έναντι της οµάδας του Μάρτυρα, κάτι που ενδεχοµένως να µειώσει το κόστος της εκτροφής µέσου της συµπίεσης της χορηγούµενης τροφής. Επιπλέον, θα πρέπει να εντατικοποιηθεί η έρευνα σε διάφορα είδη ψαριών και ειδικότερα στη Μεσόγειο θάλασσα, προκειµένου να εντοπιστεί το κατάλληλο πρωτόκολλο ώστε να προσδιοριστεί η βέλτιστη ανάπτυξη και η αποδοτικότερη µεταβολική αξιοποίηση της τροφής, µε στόχο τη µείωση του κόστους και των αποβλήτων των τροφών, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η επιβάρυνση του θαλάσσιου περιβάλλοντος µε οργανικό φορτίο. Το φαινόµενο εξαρτάται από διάφορους φυσικοχηµικούς παράγοντες, την ένταση και τη διάρκεια της ασιτίας, το στάδιο της ανάπτυξης που βρίσκεται το άτοµο κατά την έναρξη της ασιτίας, την ηλικία που ωριµάζει σεξουαλικά και τη µορφή της επαναδιατροφής. Η επιβολή σταθερών περιόδων ασιτίας ή περιορισµού τροφής στα εκτρεφόµενα ψάρια µπορεί να οδηγήσει σε οφέλη, τόσο οικονοµικά όσο και περιβαλλοντικά. λόγω της εκδήλωσης του φαινοµένου της αύξησης αντιστάθµισης. Ωστόσο δεν είναι ακόµα ξεκάθαρο το πρωτόκολλο που θα πρέπει να χρησιµοποιηθεί σε επίπεδο παραγωγής για το κάθε εκτρεφόµενο είδος. Για να επιτευχθεί αυτό θα πρέπει στοχευόµενα ερευνητικά πρωτόκολλα να δώσουν απάντηση σε µια σειρά ερωτηµάτων. Για παράδειγµα αναγκαίο είναι να προκαθοριστεί µέχρι ποιο σηµείο πρέπει να µειωθεί το βάρος του σώµατος στην περίοδο του περιορισµού της τροφής, µέχρι να αρχίσει η επανασίτιση. Τα πρωτόκολλα θα πρέπει να καθορίζουν το εύρος της µείωσης της αύξησης, που προκαλεί την αύξηση αντιστάθµισης, καθώς και το βαθµό της αντιστάθµισης που θα επιτευχθεί (Schwarz et al. 1985). 49

50 3 Αύξηση αντιστάθµισης και έκφραση γονιδίων σχετιζόµενων µε το stress. 3.1 Εισαγωγή Η µελέτη της γονιδιακής έκφρασης, σε συνάρτηση µε την καταπόνηση που δέχονται τα ψάρια υπό συνθήκες εκτροφής, µπορεί να περιοριστεί σε συγκεκριµένα γονίδια-στόχους. To stress ανάλογα µε την ένταση και την έκτασή του διακρίνεται σε οξύ και χρόνιο. Το οξύ stress περιλαµβάνει παρενοχλήσεις σχετικά µικρής διάρκειας (λεπτών ή ωρών) και συνήθως υψηλής έντασης. Στην εντατική υδατοεκτροφή τα ψάρια υφίστανται οξύ stress κατά τη διαλογή, τον εµβολιασµό, το τάισµα και λοιπές µεταχειρίσεις. Από την άλλη, το χρόνιο stress είναι παρατεταµένο (ηµέρες ή εβδοµάδες) και συνήθως ηπιότερης έντασης. Συχνά προκαλείται από µεταβολές των περιβαλλοντικών συνθηκών, διακυµάνσεις της ποιότητας του νερού, µολύνσεις, εγκαθίδρυση κοινωνικής ιεραρχίας κ.α. Η ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης είναι ένας πολύπλοκος µηχανισµός, µε τον οποίο τα κύτταρα αντιδρούν σε διαφορετική φυσιολογικά ερεθίσµατα. Πρέπει να σηµειωθεί ότι, ενώ η γονιδιακή έκφραση είναι µια πολυδιάστατη διεργασία, πιθανώς η µεταγραφή είναι το πιο αντιπροσωπευτικό της στάδιο. Αυτό συµβαίνει διότι η µεταγραφή είναι µια ενεργοβόρος διαδικασία και στις περιπτώσεις που η γονιδιακή έκφραση ρυθµίζεται σε επόµενο επίπεδο (µετα-µεταγραφικό), δαπανάται ενέργεια άσκοπα (Watson, 1992). Για τη µελέτη των γονιδίων που σχετίζονται µε την καταπόνηση σε ψάρια χρησιµοποιείται συνήθως η ακόλουθη προσέγγιση: η µελέτη συγκεκριµένων γονιδίων υπό συνθήκες καταπόνησης. Στην ορθή µεθοδολογική προσέγγιση, αναζητούνται γονίδια τα οποία είναι γνωστό, µέσω της ολιστικής προσέγγισης, ότι επηρεάζονται υπό συνθήκες stress. Στη συνέχεια, αναζητούνται ορθόλογα γονίδια στο υπό εξέταση είδος, γίνεται γνωστή η αλληλουχία τους και πραγµατοποιείται η µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης. Η ποσοτικοποίηση της γονιδιακής έκφρασης µπορεί να αποδώσει χρήσιµους δείκτες για τη µελέτη της καταπόνησης και για τη βελτίωση της ποιότητας διαβίωσης των ψαριών (Gornati et al., 2004, Ribas et al., 2004). Υπό το πρίσµα αυτό, έχουν αλληλουχηθεί πολλά µετάγραφα γονιδίων σε ψάρια µε οικονοµικό και αλιευτικό ενδιαφέρον και έχουν εκτιµηθεί µε τη µέθοδο της ποσοτικής PCR. Στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax), για παράδειγµα, η 50

51 αύξηση της ιχθυοπυκνότητας έχει συνδεθεί µε την επαγωγή των γονιδίων HSP70, του κυτοχρώµατος P450 1Α (CYP4501A) και της µεταλλοθειονίνης (Mt) (Gornati et al., 2004). Αντιθέτως, η έκφραση του υποδοχέα της κορτιζόλης, ο οποίος είναι γνωστό ότι συνδέεται µε τη µεταβολή της κορτιζόλης (Vazzana et al., 2010), υποεκφράζεται υπό τις ίδιες συνθήκες (Terova et al., 2005). Είναι φανερό ότι οι καταπονήσεις που δέχονται τα ψάρια ως απόρροια των µεταχειριστικών δραστηριοτήτων, έχουν αντίκτυπο σε κυτταρικό επίπεδο, στο γένoµα και στο µεταγραφικό του δυναµικό. Στην παρούσα φάση υλοποίησης του έργου, σκοπός της πειραµατικής διαδικασίας ήταν να διερευνηθεί κατά πόσο το πρωτόκολλο ταΐσµατος (διάρκεια ασιτίας) επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση των gcr, gpx (1a, 1b, 4a, 4b), gr,igf-i και igf-iiγονιδίων, σχετιζόµενων µε το stress και κατά πόσο προκαλεί γενοτοξική δράση στο γενετικό υλικό. Η δράση της αυξητικής ορµόνης (GH) και του ινσουλινοδραστικού αυξητικού παράγοντα (IGF) είναι απαραίτητη για την αύξηση των υδρόβιων οργανισµών. Ο IGF παράγεται στο ήπαρ, µέσω επαγωγής του, από την GH. Τα αποτελέσµατα των επιπέδων του IGF-I σε σχέση µε οξείες καταπονήσεις στα πλαίσια διαχειριστικών πρακτικών, υπήρξαν αντικρουόµενα. Σε σολοµό του Ατλαντικού (Salmo salar) διαπιστώθηκε αύξηση των επιπέδων της IGF-I, 3 και 7h, µετά την πρόκληση stress (McCormick et al., 1998), ενώ στο φαγκρί (Pagrus auratus) και στο είδος Lates calcarifer παρατηρήθηκε µείωση των επιπέδων της (Dyer et al., 2004b). Οι διαφορές αυτές αποδίδονται στη διαφορετική φύση και ένταση του στρεσσογόνου παράγοντα. 3.2 Μεθοδολογία Στην παρούσα µελέτη, χρησιµοποιήθηκε η τσιπούρα (Sparus aurata), η οποία αποτελεί το βασικότερο είδος της Μεσογειακής υδατοκαλλιέργειας. Ποσοτικοποιήθηκε η γονιδιακή έκφραση σε γονίδια που ελέγχουν ποικίλες φυσιολογικές διεργασίες. Πιο συγκεκριµένα, η µηδενική υπόθεση που τέθηκε στην παρούσα φάση της πρότασης, αφορούσε στην εκτίµηση των επιπέδων καταπόνησης των οργανισµών στις περιόδους ασιτίας, τόσο σε βιοχηµικό όσο και σε µοριακό επίπεδο. Για την επιρροή του πρωτοκόλλου ταΐσµατος (διάρκεια ολικής-µερικής ασιτίας, διάρκεια επαναδιατροφής) στην έκφραση των γονιδίων, το ήπαρ 51

52 επιλέχθηκε ως όργανο στόχος και η δειγµατοληψία πραγµατοποιήθηκε µε χτύπηµα στο κεφάλι και άµεση αφαίρεση του ήπατος. Έπειτα ακολούθησε εξαγωγή ολικού RNA, αντίστροφη µεταγραφή RT-PCR και ποσοτική PCR (qpcr) Εξαγωγή ολικού RNA Για την εξαγωγή του RNA, ελήφθησαν όλες οι απαραίτητες προφυλάξεις, ώστε να εξουδετερωθούν οι ριβονουκλεάσες και να µην υποβαθµιστεί το RNA. Η επιλογή της µεθόδου αποµόνωσης του RNA εξαρτάται από την προέλευση, το είδος, τη διαθεσιµότητά του και την ποσότητα του αρχικού δείγµατος. Το RNA είναι επιρρεπές στην αποικοδόµηση και πρέπει να λαµβάνονται πολλές προφυλάξεις κατά την αποµόνωσή του. Όλες οι µέθοδοι αποµόνωσης RNA χρησιµοποιούν ισχυρά µετουσιωτικά για να παρεµποδίσουν τις ενδογενείς RΝΑses και να ληφθεί ανέπαφο το RNA.Η καθαρότητα και ακεραιότητα του RNA που αποµονώνεται από τα κύτταρα είναι σηµαντικοί παράγοντες για τη χρήση του σε διάφορες τεχνικές. Η απενεργοποίηση των ριβονουκλεασών (RNΑses) είναι εξαιρετικά δύσκολη. Μεγάλη προσοχή πρέπει να δίνεται στη µη επιθυµητή εισαγωγή ριβονουκλεασών στο RNA που αποµονώνεται, κατά τη διάρκεια της διαδικασίας, ή και µετά από αυτήν, από εξωγενείς παράγοντες. Οι παραπάνω προφυλάξεις λαµβάνονταν ώστε να εξουδετερωθούν οι ριβονουκλεάσες. Τα τµήµατα των ιστών οµογενοποιήθηκαν σε κυβέτα που περιείχε 1mL TRIzol και φυγοκεντρήθηκαν (12.000g, 10min, 4 ο C). Μετά την αφαίρεση του ιζήµατος, επωάστηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου (25 ο C, 5min) για την αποδιάταξη των νουκλεοπρωτεϊνικών συµπλόκων. Πραγµατοποιήθηκε καθίζηση των πρωτεϊνών και του DNA, µε την προσθήκη 0,2mL χλωροφορµίου και φυγοκέντρηση (12.000g, 15 min, 4 C). Το ολικό υπερκείµενο RNA καταβυθίστηκε ως πελέτα µε τη χρήση 500mL 2-προπανόλης και ακολούθησε φυγοκέντρηση (12.000g, 10 min, 4 C). Η υπόλευκη πελέτα RNA εκλούστηκε µε προσθήκη υδατικού διαλύµατος αιθανόλης (75%) και ακολούθησε φυγοκέντρηση (7.500g, 5min, 4oC). Τέλος, η εξάτµιση της αιθανόλης πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση αντλίας κενού για 10min.Το RNA διαλύθηκε σε DEPC νερό και αποθηκεύτηκε στους -80οC για περαιτέρω ανάλυση. Η µέτρηση της συγκέντρωσης του RNA πραγµατοποιήθηκε σε φασµατοφωτόµετρο τύπου Nanodrop (ND-1000, Thermo Scientific), µια σύγχρονη συσκευή που αξιολογεί την απορρόφηση της υπεριώδους ακτινοβολίας UV από το δείγµα κατά 52

53 µήκος ενός φάσµατος απορρόφησης 220 nm έως 750 nm, ενώ εκτιµήθηκε και η καθαρότητά του Αντίστροφη µεταγραφή mrna (RT-PCR) Xρησιµοποιήθηκε η αντίστροφη µεταγραφάση Superscript III, η οποία θεωρείται η αποδοτικότερη των ανάλογων εµπορικών προϊόντων και περιλαµβάνεται στο σύστηµα SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qrt-pcr (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Η αντίδραση περιείχε 1µg ολικού RNA, το οποίο είχε ήδη υποστεί επώαση µε DNAse I Amplification Grade (Invitrogen), 10µL 2X RT Reaction Mix και 2µL RT Enzyme Mix. Η επώαση έγινε διαδοχικά σε τρία στάδια: στους 25 ο C για 10min, στους 50 o C για 30min και τερµατισµός της αντίδρασης στους 85 o C για 5min. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε πέψη της περίσσειας των ριβονοκλεϊκών οξέων µε E. coli RNAse H στους 37 ο C για 20min. Το εναιώρηµα του cdna αποθηκεύτηκε στους - 20 ο C, για περαιτέρω χρήση Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (qpcr) Η ποσοτική PCR, η οποία χρησιµοποιήθηκε για τη µέτρηση της γονιδιακής έκφρασης. πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση του SybrGreener qpcr Supermix Universal και αποτελούνταν από τα παρακάτω στάδια: α) Αρχική επώαση στους 50οC για 5 λεπτά, ώστε µε τη δράση της ουρακίλης DNA γλυκοσυλάσης (UDG) να αποµακρυνθεί το υπόλοιπο RNA, β) Επώαση αποδιάταξης και ενεργοποίησης του ενζύµου της πολυµεράσης στους 95 ο C για 10min, γ) 40 θερµοκρασιακοί κύκλοι αποδιάταξης των 30sec στους 95 ο C και υβριδοποίησης επιµήκυνσης ανάλογα µε τη θερµοκρασία υβριδοποίησης κάθε εκκινητή Σχετική γονιδιακή έκφραση Για την RT-qPCR ανάλυση αποµονώθηκε ολικό RNA από ήπαρ ατόµων τσιπούρας και µεταγράφηκε αντιστρόφως σε cdna, όπως περιγράφεται παραπάνω. Η ακτίνη (actb) χρησιµοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Ο στατιστικός έλεγχος των δεδοµένων πραγµατοποιήθηκε µε το λογισµικό REST 2009 (Pfaffl et al., 2002), το 53

54 οποίο χρησιµοποιεί έλεγχο τυχαιοποίησης (randomization), ενώ για κάθε έλεγχο πραγµατοποιήθηκαν επαναλήψεις Διατήρηση cdna βιβλιοθήκης Εισαγωγή Το cdna (complementary DNA-συµπληρωµατικό DNA), είναι ένα µόριο DNA που έχει συντεθεί από ώριµο mrna, δηλαδή RNA που έχει υποστεί τις απαραίτητες αποκοπές και επεξεργασίες, ώστε να είναι έτοιµο προς µετάφραση. Η σύνθεση του cdna γίνεται από το ένζυµο, την αντίστροφη µεταγραφάση. Είναι γνωστό πως για να κατασκευαστεί µια cdna βιβλιοθήκη, αποµονώνεται το ολικό «ώριµο» mrna από κύτταρα που εκφράζουν το συγκεκριµένο γονίδιο. To mrna χρησιµοποιείται σαν καλούπι για τη σύνθεση µιας συµπληρωµατικής αλυσίδας DNA (cdna: complementary DNA). Η σύνθεση του cdna γίνεται από το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση. Για τη διατήρηση λοιπόν µιας cdna βιβλιοθήκης, απαραίτητη είναι η εξαγωγή ώριµου αγγελιοφόρου RNA (mrna) και η αντίστροφη µεταγραφή του. Με τον τρόπο αυτό, µπορούµε να ανασύρουµε στο µέλλον µετάγραφα γονιδίων ενός οργανισµού και να τα χρησιµοποιήσουµε ανάλογα µε τις ερευνητικές µας ανάγκες Μεθοδολογία Τµήµατα cdna ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζης (1%) µε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ (1Χ), χρώση βρωµιούχου αιθιδίου (1µΜ) και δείκτη DNA 100bp (NipponGeneticsEurope, Germany). Η ανάλογη ζώνη κάθε φορά αποµονωνόταν από την πηκτή µε τη χρήση του συστήµατος PureLink Quick Gel Extraction (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. H ένθεση του τµήµατος DNA στον πλασµιδιακό φορέα pcr II-TOPO πραγµατοποιήθηκε µέσω αντίδρασης συνένωσης και επακολούθησε ο µετασχηµατισµός ηλεκτροδεκτικών βακτηριακών κυττάρων E. coli (TOP10 electrocompetent cells). H ηλεκτροδιάτρηση πραγµατοποιήθηκε σε ηλεκτροδιατρητή Eppendorf 2510, υπό τάση 1800V µε κυβέτα 1mm. Σε ορισµένες περιπτώσεις χρησιµοποιήθηκε και χηµικός µετασχηµατισµός κυττάρων E. coli (TOP10 chemically competent cells), που περιλάµβανε επώαση των κυττάρων και 54

55 του πλασµιδίου για 5min σε πάγο (~0οC) και σύντοµο θερµικό σοκ για 30sec στους 42 o C. Τα µετασχηµατισµένα κύτταρα εµβολιάστηκαν σε θρεπτικό µέσο SOC (Invitrogen) και επωάστηκαν στους 37 o C (200rpm) για 1h, ώστε να εκφραστούν τα γονίδια ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά. Στη συνέχεια, επιστρώθηκαν σε τρυβλία petri (LB agar) µε καναµυκίνη (50 ng/ml) και 40µL X-gal (40 mg/ml) και επωάστηκαν για 16h στους 37 ο C. Βακτήρια που έχουν µετασχηµατισθεί, αλλά το πλασµίδιο δεν είναι ανασυνδυασµένο, έχουν µπλε χρώµα, διότι παράγουν την β- γαλακτοσιδάση και υδρολύουν X-gal (blue-white screening). Από τις λευκές αποικίες, επιλέχθηκαν µε PCR (colony PCR) οι θετικές. Έπειτα από εµβολιασµό των θετικών αποικιών και επώασή τους σε θρεπτικό µέσο LB (37 ο C, 200rpm, 8h), πραγµατοποιήθηκε εξαγωγή πλασµιδιακού DNA µε τη χρήση του συστήµατος Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel, Germany) Αλληλούχηση Illumina Τρία δείγµατα RNA από κάθε µεταχείριση εστάλησαν στην εταιρία Service XS - GenomeScan (Leiden, the Netherlands) για παρασκευή βιβλιοθήκης και αλληλούχηση νέας γενιάς. Οι συγκεντρώσεις των δειγµάτων επανελέγχθηκαν µε φασµατοφωτόµετρο φθορισµού Qubit (Life Technologies). Η ακεραιότητα του RNA εκτιµήθηκε µε αναλυτή Agilent Bioanalyzer ενώ το mrna αποµονώθηκε µε µαγνητικά σφαιρίδια oligo-dt magnetic beads. Μετά τον χηµικό κερµατισµό του mrna, πραγµατοποιήθηκε σύνθεση cdna και αντίδραση συνδετάσης (ligation) µε τους εκκινητές και τους δείκτες της αλληλούχησης. Στη συνέχεια οι βιβλιοθήκες αξιολογήθηκαν µε το σύστηµα DNA 1000 Lab-on-a-Chip. H οµαδοποίηση (clustering) σε κύτταρα ροής (flowcells) πραγµατοποιήθηκε µε Illumina cbot και η αλληλούχηση (sequencing) µε αλληλουχητή νέας γενιάς Illumina HiSeq Προετοιµασία υπολογιστή και λογισµικού Ο εξυπηρετητής HP ProLiant ML350e Gen8 περιείχε δύο φυσικούς επεξεργαστές CPU Intel 1,9 GHz 6 cores µε µνήµες 96GB (8GB Modules - DDR3L 1333MHz), σκληρούς δίσκους 3TB HDD και 256GB SSD. Στην εξυπηρετητή αυτόν έγινε εγκατάσταση λειτουργικού προγράµµατος Windows Server 2012 R2 και εγκαταστάθηκε εικονική µηχανή (Virtual Machine) µε Linux Ubuntu LTS Το συγκεκριµένο λειτουργικό σύστηµα είναι UNIX-based και 55

56 για το οποίο υπάρχει πληθώρα ανοιχτού λογισµικού (open source software). Για την απρόσκοπτη λειτουργία του συστήµατος εγκαταστάθηκαν τα παρακάτω προγράµµατα: 1.FastQC( #fastqc). Είναι απαραίτητο για την παρακολούθηση της ποιότητας της αλληλούχησης της περιεκτικότητα σε GC, την υπολλειµατικότητα απο primers/indexes κλπ. 2.PRINSEQ( tar.gz/download). Χρησιµοποιείται για την αποµάκρυνση αλληλουχιών µε χαµηλή βαθµολογία ποιότητας (quality score), περικοπή άκρων (end trimming), αποµάκρυνση αλληλουχιών χαµηλής πολυπλοκότητας (low complexity regions) κλπ. 3.Cutadapt( Χρησιµοποιείται για την αποµάκρυνση αλληλουχιών εκκινητών, δεικτών κλπ. 4.SortMeRNA( Χρησιµοποιείται για την αποµάκρυνση του rrna το οποίο συνήθως δεν είναι απαραίτητο σε µελέτες τρανσκριπτοµικής. 5.Trinity( Χρησιµοποιείται για τη συναρµολόγηση των µεταγράφων από αλληλουχίες RNA sequencing. Χρησιµοποιεί σταθερό kmer (25) σε σχέση µε τα υπόλοιπα προγράµµατα. 6.SoapdenovoTrans ( 7.Oases ( το οποίο χρησιµοποιεί το genome assembler Velvet ( 8.Transabyss ( που χρησιµοποιεί το genome assembler Abyss ( /software/abyss). 9.IGV ( Είναι πρόγραµµα παρουσίασης δεδοµένων NGS. 10.BLAST (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/latest/). 11.Bowtie2 ( 12.R programming language ( 56

57 13.DESeq2( ) Είναι πρόγραµµα µελέτης της γονιδιακής έκφρασης το οποίο στηρίζεται στη γλώσσα προγραµµατισµού R ( 14.SAMTools ( 15.Picard Tools ( 16.Trinotate ( 17.signalP v4 ( 18.tmhmm v2 ( 19.RNAMMER ( 20.Cytoscape ( 21.BiNGO ( Έλεγχος ποιότητας και φιλτράρισµα αλληλουχιών. Ένα από τα προγράµµατα που χρησιµοποιείται ευρέως για τον έλεγχο της ποιότητας αλληλούχησης είναι το FastQC ( projects/fastqc/). Το λογισµικό αυτό χρησιµοποιείται εκτενώς για Το φιλτράρισµα των αλληλουχιών έγινε µε το λογισµικό PRINSEQ το οποίο επιτρέπει τη χρήση ζευγών αλληλουχιών (paired-end). Αυτό πραγµατοποιήθηκε σε τρεις γύρους: 1ος γύρος: Αφαίρεση αλληλουχιών µε βάσεις ποιότητας < 20, περικοπή ως 5 Ν στα 5 και 3 άκρα. 2ος γύρος: Ελάχιστο µήκος αλληλουχίας 100bp, κατώφλι εντροπίας 50, περικοπή ουράς αδενίνης πάνω από 5 bp στα άκρα 5 και 3. 3ος γύρος: Αφαίρεση ακριβών επαναληπτικών αλληλουχιών. Η αφαίρεση αλληλουχιών που προέρχονταν από εκκινητές (primers) ή δείκτες (indexes) πραγµατοποιήθηκε µε το λογισµικό Cutadapt. Ο καθαρισµός των δεδοµένων από τέτοιου είδους αλληλουχίες είναι απαραίτητες διότι δηµιουργούν προβλήµατα ειδικά κατά την εκ νέου δηµιουργία των µεταγράφων (de novo transcriptome assembly). To πρόγραµµα πραγµατοποιεί περικοπεί περιοχών που περιέχουν τέτοιου είδους αλληλουχίες µε ανοχή σφαλµάτων. Πέρα από τα δεδοµένα που αφορούν στο συγκεκριµένο πείραµα το λογισµικό χρειάζεται και ένα αρχείο 57

58 που θα περιέχει τις συγκεκριµένες αλληλουχίες των εκκινητών. Οι αλληλουχίες παρέχονται από την Illumina για αυτόν τον σκοπό. Για την αποµάκρυνση αλληλουχιών που προέρχονται από ριβοσωµικό RNA (rrna) χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό sortmerna Συναρµογή µεταγραφώµατος και µελέτη γονιδιακής έκφρασης. Για την κατασκευή του συναρµολογήµατος των µεταγράφων (transcriptome assembly) χρησιµοποιήθηκαν τέσσερις από τους ευρέως χρησιµοποιούµενους assemblers (Trinity, Oases, SOAPdenovoTrans, TransABYSS). Μετά από σύγκριση µεταξύ των τεσσάρων για το συγκεκριµένο dataset του C. nodosa το καλύτερο αποτέλεσµα έδωσε το πρόγραµµα Trinity v2.0.6 (Haas et al., 2013). Το συναρµολόγηµα στη συνέχεια πέρασε από ένα ακόµα σταδιοιο φιλτραρίσµατος και τα µετάγραφα που δεν υποστηρίζονταν ικανοποιητικά (FPKM and IsoPct<1) από αλληλουχίες απορρίφθηκαν. Αυτό επετεύχθη µε το perl script align_and_estimate_abundance.pl (πακέτο Trinity) το οποίο βασίστηκε στα προγράµµατα RSEM και Bowtie2. Το ποσοστό ολοκλήρωσης και η αρτιότητα το συναρµολογήµατος αξιολογήθηκαν µε το λογισµικό CEGMA v.2.5 (Parra et al., 2007). Η ταυτοποίηση των ORFs (Open Reading Frames) πραγµατοποιήθηκε µε το πρόγραµµα TransDecoder (Haas et al., 2013) και η σουίτα Trinotate χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση και την επισηµείωση των µεταγράφων. Τόσο οι αλληλουχίες RNA όσο και οι πρωτεϊνικές αλληλουχίες υποβλήθηκαν σε οµοπαράθεση µε τις βάσεις δεδοµένων Swiss-Prot και TrEMBL µε επίπεδο e-value 10e-4. Για να εντοπιστούν µεταγραφικοί παράγοντες (transcription factors) πραγµατοποιήθηκε σύγκριση µε τη βάση δεδοµένων Plant Transcription Factor Database ( (Perez-Rodriguez et al., 2010) µε επίπεδο e-value 10e-5. Για τη µελέτη της γονιδιακής έκφρασης, οι αλληλουχίες που προήλθαν από το RNAseq οµοπαρατέθηκαν στα µετάγραφα (transcripts) ανά µεταχείριση µε το λογισµικό Bowtie2, καταµετρήθηκαν και η µεταβολή της γονιδιακής έκφρασης εκτιµήθηκε µε το πρόγραµµα DESeq2 (Love et al., 2014). Τα γονίδια θεωρήθηκαν ότι παρουσιάζουν µεταβολή στη γονιδιακή έκφραση όταν η απόλυτη του λογαρίθµου µε βάση 2 της µεταβολής υπερέβαινε τη µονάδα log2fc>1 η 58

59 σηµαντικότητα FDR<0,05. Με σκοπό την ταξινόµηση των µεταγράφων στο σύστηµα Gene Ontology πραγµατοποιήθηκε οµοπαράθεση (blastn; cut-off e-value 10e-04) µε το γονιδίωµα του Arabidopsis thaliana (TAIR10 genome release) και η αντιστοίχηση µε όρους GO και GO enrichment analysis µε το πακέτο Cytoscape v και το πρόγραµµα BiNGO v µε τη χρήση υπεργεωµετρικού τεστ (hypergeometric test), ενώ η σηµαντικότητα ορίστηκε ως FDR<0, Αποτελέσµατα Συναρµογή µεταγραφώµατος και επισηµείωση του Τα µετάγραφα της τσιπούρας (Sparus aurata) αλληλουχήθηκαν µε RNAseq. Για να αποφευχθούν σφάλµατα σχετικά µε την αλληλούχηση, οι αλληλουχίες που σχετίζονταν µε εκκινητές, δείκτες, rrna καθώς και οι αλληλουχίες χαµηλής ποιότητας αποµακρύνθηκαν. Αυτό είχε ως αποτέλεσµα να παραµείνουν στο δείγµα ζεύγη αλληλουχιών υψηλής ποιότητας bp οι οποίες χρησιµοποιήθηκαν για τη συναρµογή του µεταγραφώµατος. Αυτή η επεξεργασία αφενός µείωσε τον αριθµό των αλληλουχιών αλλά αύξησε σηµαντικά την ποιότητα των αλληλουχιών Γονιδιακή έκφραση Οι µεταβολές της γονιδιακής έκφρασης στα ψάρια παρουσιάζονται στο Διάγραµµα 11. Τα γονίδια gr, gpx και nr3c1 φάνηκε να επηρεάζονται κατά την περίοδο ασιτίας. Αντίθετα, τα γονίδια gk και gpx4 φάνηκε να µην µεταβάλλονται σχεδόν καθ όλη τη διάρκεια των µεταχειρίσεων της ασιτίας. 59

60 Διάγραµµα 11 Μεταβολές της γονιδιακής έκφρασης γονιδίων στόχων σε ήπαρ ατόµων τσιπούρας κατά τη διάρκεια της ασιτίας (***P<0,001, **P<0,01, *P<0,05). Η οριζόντια γραµµή αντιπροσωπεύει τη διάµεσο. Κάθε πλαίσιο-κουτί περιλαµβάνει το 50% των παρατηρήσεων. Οι ανώτερες και κατώτερες απολήξεις υποδεικνύουν το 75% και το 25% των παρατηρήσεων, αντίστοιχα. (C: σίτιση σύµφωνα µε τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή, P75: Aσιτία 75%: Παρεχόταν το 75% της τροφής, P50: Aσιτία 50%: Παρεχόταν το 50% της τροφής, P25: Aσιτία 25%: Παρεχόταν το 25% της τροφής, P0: Πλήρης Aσιτία) 60

61 Διάγραµµα 12 Διάγραµµα ροής για την επεξεργασία δεδοµένων της αλληλούχησης νέας γενιάς Illumina RNAseq Μέτρηση Κορτιζόλης Η τεχνική ELISA, αποτελεί µια από τις κυριότερες διαγνωστικές µεθόδους µε δυνατότητα ανάγνωσης αντιδραστηρίων φθορισµού (fluorescence), χηµειοφωταύγειας (luminescence), απορρόφησης (absorbance) απορρόφησης UV, TRF και είναι µια ταχεία ενζυµική ανοσοχηµική µέθοδος για τον καθορισµό της παρουσίας ενός αντιγόνου, το οποίο δεσµεύεται σε ένα ένζυµο. Το µόριο που προκύπτει µπορεί να συνδεθεί µε ειδικούς ανοσολογικούς στόχους σε δείγµατα σωµατικών υγρών και να υποδείξει την παρουσία τους ενζυµικά. Η τεχνική της ELISA, µπορεί να χρησιµοποιηθεί τόσο για ποιοτική όσο και για ποσοτική ανάλυση. Η ποιοτική ανάλυση παρέχει απλά ενδείξεις για την ύπαρξη 61

62 θετικού ή αρνητικού αποτελέσµατος σε ένα δείγµα. Η ποσοτική ανάλυση στηρίζεται στη µέτρηση της απορρόφησης ή οπτικής πυκνότητας (ΟD) του δείγµατος και στη σύγκριση αυτής µε µια πρότυπη καµπύλη, προκειµένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του αντιγόνου ή του αντισώµατος στο δείγµα. Για την ποσοτική µέτρηση της αλληλεπίδρασης αντιγόνου αντισώµατος, υπάρχουν διάφοροι τρόποι επισήµανσης που επιτρέπουν την ανίχνευση του µορίου που µας ενδιαφέρει, οι οποίοι είναι οι ακόλουθοι: Eπισήµανση µε ραδιενέργεια (ραδιοανοσολογικός προσδιορισµός-ria) Eπισήµανση µε ένζυµα (ανοσοενζυµικός προσδιορισµός-εia) Χρήση φθοριζόντων συστατικών, ως ιχνηθετών, µαζί µε υποστρώµατα που προκαλούν φθορισµό (φθορισµοµετρικός προσδιορισµός-fia). Στην παρούσα φάση του έργου, υπολογίστηκαν οι συγκεντρώσεις της κορτιζόλης σε ορό αίµατος µε τη χρήση της ELISA. Σε κάθε δειγµατοληψία, η λήψη του αίµατος γινόταν µε τη χρήση σύριγγας 5mL από την ραχιαία φλέβα. Τα δείγµατα αίµατος που ελήφθησαν από τα ψάρια φυγοκεντρήθηκαν στις 3000rpm για 30min, για το διαχωρισµό του πλάσµατος και τέλος καταψύχθηκαν στους -80οC. Τα επίπεδα της κορτιζόλης στο αίµα ποσοτικοποιήθηκαν κατά την περίοδο ασιτίας και τα αποτελέσµατα φαίνονται στο διάγραµµα 13. Σηµαντική διαφορά παρατηρήθηκε στην ηµέρα 7 σε σχέση µε το µάρτυρα, µε τα επίπεδα της κορτιζόλης να ανέρχονται σε 7,1±2,3 µg/dl (P<0,05). Την ηµέρα 14, τα επίπεδα της κορτιζόλης παρουσίασαν αύξηση φτάνοντας σε 7,6±4,8 µg/dl, όµως δε διέφεραν σηµαντικά σε σχέση µε το µάρτυρα (P>0,05). Κατά τις επόµενες µέρες του πειραµατισµού (FS21 και FS42), τα επίπεδα της κορτιζόλης του αίµατος µειώθηκαν σε επίπεδα που δε διέφεραν στατιστικά µε το µάρτυρα. 62

63 Διάγραµµα 13 Οι µεταβολές τις κορτιζόλης κατά τη διάρκεια της ασιτίας στην τσιπούρα. Οι µέσοι όροι των µετρήσεων παριστούνται µε µπάρες και οι κάθετες γραµµές συµβολίζουν το τυπικό σφάλµα. Μέσοι όροι µε διαφορετικούς δείκτες διαφέρουν σηµαντικά. Η κατασκευή cdna βιβλιοθήκης έχει ολοκληρωθεί και διατηρείται στις εγκαταστάσεις του τµήµατος Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος. Με τον τρόπο αυτό µπορούµε να ανατρέξουµε στο µέλλον στην εξεύρεση γονιδίων από συγκρκριµένους ιστούς και συγκεκριµένες πειραµατικές εφαρµογές. Αυτό είναι ιδιαίτερα θετικό για οργανισµούς µη-µοντέλα (non-modelorganisms), διότι δεν υπάρχει η πληροφορία του γονιδιώµατος, σε αντίθεση µε οργανισµούς µοντέλα (modelorganisms) όπως το ζεβρόψαρο (Danio rerio) το takifugu (Takikifugu rubripes). Πέρα από αυτά, έχει αρχίσει και η αλληλούχηση του γονιδιώµατος εµπορικών ψαριών όπως η τιλάπια (Oreochromis niloticus), η πέστροφα (Oncorhynchus mykiss) και ο γάδος (Gadus morhua). 63

64 3.4 Συζήτηση Η γονιδιακή έκφραση συγκεκριµένων γονιδίων-στόχων µελετήθηκε υπό συνθήκες stress µε την τεχνική RT-qPCR. Με τον τρόπο αυτό φάνηκε η διαφορική γονιδιακή έκφραση υπό συνθήκες stress τόσο βραχυπρόθεσµα, όσο και µακροπρόθεσµα. Aπό τα παραπάνω αποτελέσµατα, είναι φανερό ότι η ρύθµιση της γονιδιακής έκφρασης, είναι άµεση συνάρτηση της ενεργειακής απαίτησης του οργανισµού. Είναι γνωστό ότι το stress επηρεάζει την αύξηση των οργανισµών. Οι Pickering et al (1991) έδειξαν ότι άτοµα πέστροφας υπό συνθήκες stress παρουσίασαν µειωµένα επίπεδα αυξητικής ορµόνης (GH) στην αιµατική κυκλοφορία. H µελέτη της γονιδιακής σε επίπεδο όλου του γονιδιώµατος της τσιπόυρας, είναι δύσκολη. Η τεχνολογία του RNAseq µπορεί να υποστηρίξει αυτές τις µελέτες σε ένα σχετικά χαµηλό κόστος ανά νουκλεοτίδιο. Για την παρούσα µελέτη, ανακατασκευάστηκαν τα µετάγραφα του αγγελιοφόρου RNA (mrna). Πρέπει όµως να ληφθεί υπόψη το γεγονός ότι ο αριθµός των µεταγράφων µπορεί να επηρεαστεί σηµαντικά από πολυµορφικούς τόπους. Από την άλλη, η οµαδοποίηση µεταγράφων για µείωση του όγκου της πληροφορίας µπορεί να εισάγει σφάλµατα. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης κατέδειξε την επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται µε του όρους Gene Ontology response to stimulus και response to stress. το σύνολο των γονιδίων που επάγονται υπό συνθήκες stress ανήκουν σε ρυθµιστικά στοιχεία του γονιδιώµατος. Το γεγονός αυτό ενισχύει την υπόθεση ότι ρυθµιστικά δίκτυα της µεταγραφής, της αίσθησης και της µεταγωγής του σήµατος αντιδρούν στο σύνολο του γονιδιώµατος κατά την έκθεση σε αβιοτικό stress. Για την αντιµετώπιση των διαταραχών που υφίστανται οι υδρόβιοι οργανισµοί από στρεσσογόνους παράγοντες, διαθέτουν µηχανισµούς αποµάκρυνσής τους και αναπτύσσουν µηχανισµούς προσαρµογής και ανθεκτικότητας, στους οποίους συµµετέχουν αρκετά µεταβολικά συστήµατα. Οι µηχανισµοί αυτοί περιλαµβάνουν αντιδράσεις οξειδοαναγωγής ή υδρόλυσης, ενσωµάτωση των µεταλλικών ιόντων σε µη τοξικές ενώσεις, αποµόνωσή τους σε υποκυτταρικές δοµές (λυσοσώµατα ή εξειδικευµένα σωµάτια) και η σύνδεσή τους µε χηλικούς παράγοντες που ευνοούν την απέκκριση. 64

65 Οι αναλύσεις σε επίπεδο γονιδιώµατος, όπως το RNAseq παράγουν τεράστιες ποσότητες δεδοµένων και ένα µέρος των δεδοµένων πρέπει να υποστηριχθεί από επιπλέον αναλύσεις. Οι αντιδράσεις στο stress είναι ανάλογη του είδους, της ηλικίας, του ιστού και της δεινότητας της καταπόνησης. H µελέτη της λειτουργίας των γονιδίων, παράλληλα µε τη µελέτη της φυσιολογίας και της συµπεριφοράς, θα εµπλουτίσουν τη γνώση σχετικά µε την ευζωία των ψαριών. Με αυτόν τον τρόπο, ο τοµέας των υδατοκαλλιεργειών θα γίνει στο µέλλον πιο ανταγωνιστικός και θα παράγει προϊόντα που θα καλύπτουν τις καταναλωτικές ανάγκες. 65

66 4 Βλάβες DNA στο ήπαρ κατά την εφαρµογή πρωτοκόλλων αύξησης-αντιστάθµισης 4.1 Εισαγωγή Το στρες είναι µια κατάσταση κατά την οποία οργανισµός δεν µπορεί να διατηρήσει κανονική φυσιολογική κατάσταση, διότι κάποιοι παράγοντες δρουν δυσµενώς στην ευζωία του. Η καταπόνηση αυτή επηρεάζει αρνητικά τις φυσικές άµυνες του οργανισµού, µε αποτέλεσµα να µένει απροστάτευτος από την εισβολή παθογόνων και την πρόκληση νοσηρών καταστάσεων. Τα διαφορετικά είδη ιχθύων εµφανίζουν διαφορετική ανθεκτικότητα απέναντι στους στρεσσογόνους παράγοντες. Οι ιχθύες εκτίθενται σε τέτοιου είδους παράγοντες, τόσο στη φύση όσο και σε ελεγχόµενες συνθήκες, όπως η ιχθυοκαλλιέργεια ή το εργαστήριο. Κατά συνέπεια, η καταπόνηση που υφίστανται τα ψάρια σε συνθήκες εκτροφής είναι σηµαντικός παράγοντας υποβάθµισης της ευζωίας των, συνεπάγεται την ταυτόχρονη µείωση των ζωοτεχνικών δεικτών και έχει σηµαντικές επιπτώσεις στην παραγωγή. Η υποβάθµιση της παραγωγής συνδέεται τόσο µε την µείωση της ποσότητας, όσο και της ποιότητας του τελικού προϊόντος. Για το σκοπό αυτό αναπτύσσονται ολοένα και περισσότερες τεχνικές για την κατανόηση και την ορθή εκτίµηση των συνιστωσών της ευζωίας των ψαριών σε συνθήκες εντατικής εκτροφής. Η ανάπτυξη των υδατοκαλλιεργειών σε παγκόσµιο επίπεδο, έχει δώσει κίνητρα στην προσπάθεια για την κατανόηση των µηχανισµών του stress, το οποίο υφίστανται οι υδρόβιοι οργανισµοί σε συνθήκες εκτροφής. Κάθε στιγµή, το DNA, που είναι το γενετικό υλικό των κυττάρων, καταστρέφεται από εσωτερικές και εξωτερικές τοξίνες. To DNA µπορεί να καταστραφεί µε πολλούς τρόπους. Για παράδειγµα, παραγωγή ενέργειας στα κύτταρα µπορεί να παράγει τοξικά µόρια, αποκαλούµενα αντενεργά είδη οξυγόνου, τα οποία αποτελούν µια κατηγορία ελεύθερων ριζών (free radicals). Αυτές οι ουσίες µπορούν να αντιδράσουν και να τροποποιήσουν τις βάσεις του DNA καθώς και να αποτρέψουν τον κώδικα από το να χρησιµοποιηθεί κατάλληλα. Εάν το DNA είναι σαν ένα φερµουάρ («zipper»), οι ελεύθερες ρίζες παράγουν σκόρπια νηµάτια ή διαστρεβλωµένα δόντια που µπορούν να φράξουν και να σπάσουν αυτή τη δοµή. έκθεση σε τοξίνες, όπως είναι υπεριώδης ακτινοβολία ή καπνός των τσιγάρων, µπορεί επίσης να καταστρέψει το DNA. Επίσης, τα ένζυµα που φτιάχνουν νέο DNA 66

67 (που συµβαίνει αµέσως πριν διαιρεθεί ένα κύτταρο) µπορεί να κάνουν λάθη προκαλώντας ανάρµοστα (αταίριαστα) ζεύγη βάσεων. Βλάβες στο DNA ή λάθη σε πρόσφατα ξαναδιπλωµένο DNA, είναι αρκετά συχνά. Η ακεραιότητα λοιπόν του γενετικού υλικού, είναι θεµελιώδης αρχή για τις βασικές λειτουργίες ενός οργανισµού, όπως η ανάπτυξη και η αύξηση και για το λόγο αυτό, στις πειραµατικές µεταχειρίσεις υπολογίστηκε το ποσοστό βλάβης του DNA µε τη µέθοδο SCGE. Η Comet assay έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως ένα απλό, ευαίσθητο και γρήγορο εργαλείο για την εκτίµηση της ζηµιάς (καταστροφής) του DNA καθώς και της επισκευής σε µεµονωµένα ευκαρυωτικά καθώς επίσης και σε µερικά προκαρυωτικά κύτταρα. Οι Ostling και Johanson (1984) ήταν οι πρώτοι οι οποίοι ποσοτικοποίησαν τη ζηµία στο DNA των κυττάρων χρησιµοποιώντας µια τεχνική ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα αγαρόζης γνωστή ως µονοκύτταρη ηλεκτροφόρηση πηκτωµάτων ή Comet assay. Εντούτοις, οι ουδέτερες συνθήκες που χρησιµοποίησαν, επέτρεψαν την ανίχνευση µόνο των σπασιµάτων διπλού κλώνου DNA. Αργότερα, δοκιµή προσαρµόστηκε σε αλκαλικές συνθήκες από τους Singh et al. (1988), οι οποίοι οδήγησαν σε µια ευαίσθητη έκδοση της τεχνικής που θα µπορούσε να αξιολογήσει και τα δίκλωνα και τα µονόκλωνα σπασίµατα του DNA. Από την έναρξή χρήσης της, δοκιµή έχει τροποποιηθεί στα διάφορα βήµατα (λύση, ηλεκτροφόρηση) για να καταστεί κατάλληλη για τα διάφορα είδη ζηµιάς σε διαφορετικά κύτταρα (Collins, 2004; Speit and Hartmann, 2005). Η comet assay έχει αρκετά πλεονεκτήµατα έναντι µερικών άλλων δοκιµών γενοτοξικότητας δεδοµένου ότι είναι ευρέως εφαρµόσιµη. Πιο συγκεκριµένα, µπορεί να χρησιµοποιηθεί στη γενετική τοξικολογία για τη διαλογή και τη ρυθµιστική δοκιµή των βιοµηχανικών χηµικών ουσιών, φαρµακευτικών ειδών, βιοκτόνων και καλλυντικών. Επιπρόσθετα, συµβάλλει στον ελέγχο της µόλυνσης του περιβάλλοντος από τους γενοτοξικούς παράγοντες. Έχει εφαρµοστεί στη Μοριακή Επιδηµιολογία καθώς και στην κλινική διάγνωση αποτελεσµάτων των ασθενειών και ελέγχου της θεραπείας. Όσον αφορά στον τοµέα της διατροφής, είναι δυνατόν να εντοπίσει τα επιβλαβή και ευεργετικά αποτελέσµατα της διατροφής και των διαιτητικών συστατικών. Επιπλέον, η comet assay, είναι µια τεχνική σχετικά ευαίσθητη, η διαδικασία είναι αρκετά γρήγορη και απλή και παρόλο που απαιτείται µικρός σχετικά αριθµός κυττάρων (περίπου 100), θεωρείται πολύ αξιόπιστη. Ανιχνεύει όχι µόνο τη ζηµιά του DNA αλλά µπορεί να χρησιµοποιηθεί και για την ανίχνευση της 67

68 επισκευής του DNA. Τέλος, εκτέλεσή της είναι σχετικά χαµηλού κόστους (Dhawan et al., 2008). Η ποσοτικοποίηση της βλάβης του DNA, µε τη χρήση της comet assay, µπορεί να προσφέρει µια εκτίµηση της φυσιολογικής κατάστασης ενός οργανισµού ή ενός κυττάρου. Τα διάφορα είδη ψαριών (εσωτερικών υδάτων και θαλάσσια) έχουν χρησιµοποιηθεί για περιβαλλοντική επισκόπηση. Η comet assay, έχει βρει ευρεία εφαρµογή ως απλή και ευαίσθητη µέθοδος, για την in vivo και την in vitro ζηµία του DNA σε διαφορετικούς ιστούς (βράγχια, συκώτι, αίµα) των ψαριών που εκτίθενται στο διάφορες ουσίες στο υδρόβιο περιβάλλον. Το βασικό επίπεδο της ζηµίας του DNA στα ψάρια, έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες, όπως είναι για παράδειγµα θερµοκρασία του νερού στα ερυθροκύτταρα του κέφαλου (Mugil cephalus) (de Andrade et al., 2004a) και ηλικία και το φύλο στο είδος Limanda limanda (Akcha et al., 2003). Εποµένως, αυτοί οι παράγοντες πρέπει να υπολογισθούν κατά τη διάρκεια των µελετών περιβαλλοντικής εποπτείας για τη γενοτοξικότητα. ευαισθησία της τεχνικής µπορεί να επηρεαστεί από την υψηλή µεταβλητότητα µεταξύ των ατόµων (Akcha et al., 2003). χρήση των χηµικών και µηχανικών διαδικασιών για την απόκτηση των κυττάρων, µπορεί επίσης να οδηγήσει στη ζηµία του DNA (Kosmehl et al., 2006). 4.2 Μεθοδολογία Η ηλεκτροφόρηση µεµονωµένων κυττάρων (Single Cell Gel Electrophoresis SCGE), γνωστή και ως comet assay, πραγµατοποιήθηκε όπως περιγράφεται από τους Singh et al. (1988) για την εκτίµηση του stress λόγω ολικής/µερικής ασιτίας επαναδιατροφής, σε εντατικά εκτρεφόµενες τσιπούρες. Τα ψάρια θανατώθηκαν ακαριαία και τα δείγµατα που ελήφθησαν από το ήπαρ, αρχικά εκπλύθηκαν µε ρυθµιστικό διάλυµα HBSS. Ακολούθησε πέψη του κολλαγόνου και µηχανικός τεµαχισµός του ιστού. Τα κύτταρα διηθήθηκαν µε αποστειρωµένη γάζα (~150µm) και ακολούθησαν δύο διαδοχικές πλύσεις µε ρυθµιστικό διάλυµα HBSS και φυγοκέντρηση 2.000rpm για 5min. Η πελέτα των κυττάρων αραιώθηκε σε ρυθµιστικό διάλυµα PBS, το κυτταρικό εναιώρηµα οµογενοποιήθηκε µε αγαρόζη χαµηλού σηµείου τήξης 1% και τοποθετήθηκε σε αντικειµενοφόρους πλάκες. Στη συνέχεια οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε διάλυµα λύσης στους 4 C για 1h, ο τόσο για την αποµάκρυνση των κυτταρικών πρωτεϊνών, όσο και για την αποδιάταξη της κυτταρικής και πυρηνικής µεµβράνης. Τα δείγµατα εκπλύθηκαν µε 68

69 απεσταγµένο νερό και τοποθετήθηκαν σε σκοτεινή συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης, σε αλκαλικό ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης (ph>12) για 15min. Μετά την ηλεκτροφόρηση, τα δείγµατα εκπλύθηκαν σε διάλυµα εξουδετέρωσης. Το στάδιο αυτό είναι απαραίτητο για να πραγµατοποιηθεί η χρώση του DNA. Ακολούθησε η µικροσκοπική παρατήρηση των κυτταρικών πυρήνων ύστερα από χρώση του DNA µε 100X SYBR Green I. Το µικροσκόπιο φθορισµού που χρησιµοποιήθηκε (Zeiss Axiostar plus), ήταν εφοδιασµένο µε φίλτρο διέγερσης και αποκοπής στα 497 και 520nm, αντίστοιχα. Από κάθε άτοµο/δείγµα χρησιµοποιήθηκαν δύο (2) αντικειµενοφόρες πλάκες και καταγράφηκαν 50 πυρήνες κυττάρων από κάθε πλάκα. Στο Διάγραµµα 15 απεικονίζεται η διαφορά κοµητών από (Α) κύτταρο που δεν έχει υποστεί βλάβη και (Β) κύτταρο που έχει υποστεί βλάβη. Διάγραµµα 14 Κύτταρο µε ακέραιο πυρηνικό DNA (A) και κατακερµατισµένη χρωµατίνη (Β). 4.3 Αποτελέσµατα Συµπεράσµατα Στις πειραµατικές µεταχειρίσεις, υπολογίστηκε το ποσοστό βλάβης του DNA µε τη µέθοδο SCGE. Τα αποτελέσµατα των µέσων όρων του TM και ΟΤΜ παρουσιάζονται στα διαγράµµατα 16 και 17. Ειδικότερα, πρέπει να αναφερθεί ότι οι µεταχειρίσεις CS διέφεραν στο σύνολό τους σηµαντικά σε σχέση µε το µάρτυρα. Όσον αφορά στις µεταχειρίσεις FS, το µοτίβο κερµατισµού του DNA δεν εµφανίστηκε σύνθετο. Οι µεταχειρίσεις FS7, FS14 και FS21 παρουσίασαν σηµαντική διαφορά σε σχέση µε το µάρτυρα (P<0,05) µε τιµές 1,62±0,27, 1,72±0,36 και 69

70 1,93±0,15, αντίστοιχα. Τέλος, η µεταχείριση FS42 εµφάνισε µέσο όρο 0,63±0,06 και δε διέφερε σηµαντικά από το µέσο όρο του µάρτυρα. Διάγραµµα 15 Κερµατισµός του DNA κατά τη διάρκεια της ασιτίας. Οι µπάρες αποτελούν τους µέσους όρους των µετρήσεων και οι γραµµές τα τυπικά σφάλµατα. Οι µέσοι όροι που φέρουν διαφορετικούς εκθέτες διαφέρουν σηµαντικά. Διάγραµµα 16 Οι µεταβολές τις κορτιζόλης κατά τη διάρκεια της ασιτίας στην τσιπούρα. Οι µέσοι όροι των µετρήσεων παριστούνται µε µπάρες και οι κάθετες γραµµές συµβολίζουν το τυπικό σφάλµα. Μέσοι όροι µε διαφορετικούς δείκτες διαφέρουν σηµαντικά. (C: σίτιση σύµφωνα µε τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή, P75: Aσιτία 75%: Παρεχόταν το 75% της τροφής, P50: Aσιτία 50%: Παρεχόταν το 50% της τροφής, P25: Aσιτία 25%: Παρεχόταν το 25% της τροφής, P0: Πλήρης Aσιτία) 70

71 Διάγραµµα 18 Συσχέτιση γονιδιακής έκφρασης υποδοχέα γλυκοκορτικοειδών και κορτιζόλης πλάσµατος Η βλάβη του γενετικού υλικού σε συνθήκες φυσικού stress (ασιτία, παγίδευση, ιχθυοπυκνότητα κ.α.) δεν έχει µελετηθεί επαρκώς στη διεθνή Διάγραµµα 17 Κερµατισµός του DNA κατά τη διάρκεια της ασιτίας. Οι µπάρες αποτελούν τους µέσους όρους των µετρήσεων και οι γραµµές τα τυπικά σφάλµατα. Οι µέσοι όροι που φέρουν διαφορετικούς εκθέτες διαφέρουν σηµαντικά. βιβλιογραφία. Αντιθέτως, υπάρχουν πολλές αναφορές που αφορούν στην άµεση ή 71

72 έµµεση θραύση του DNA λόγω χηµικού stress (βαρέα µέταλλα, χηµικοί ρυπαντές). H SCGE είναι µια ευρέως χρησιµοποιούµενη και κοινώς αποδεκτή µέθοδος, καθώς χρησιµοποιείται στο πλείστο των ερευνών που αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία, όταν η µηδενική υπόθεση περιλαµβάνει τον όρο γενοτοξικότητα. Παρόλα αυτά, τίθεται ζήτηµα επαναληψιµότητας (Hartmann et al., 2003) ενώ η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων είναι αµφιλεγόµενη. Στην παρούσα µελέτη, η τεχνική SCGE χρησιµοποιήθηκε για να αποτυπώσει την επίδραση του φυσικού stress στο γονιδίωµα ατόµων τσιπούρας. Η ιχθυοπυκνότητα, η διατροφή, ο τρόπος ταΐσµατος και οι διάφορες διαχειριστικές πρακτικές αλληλοεπιδρούν για να καθορίσουν τα επίπεδα της ευζωίας ενός οργανισµού. Τα παραπάνω έχουν αθροιστικό αποτέλεσµα στα επίπεδα του stress, στην ανοχή απέναντι στο stress, στη φυσική κατάσταση και στη συµπεριφορά ενός οργανισµού. Ίσως ο πιο σηµαντικός βιοχηµικός δείκτης στρες είναι η κορτιζόλη και ο οποίος χρησιµοποιείται ευρέως από τους ερευνητές (Barton and Iwama, 1991: Barton, 2002). Για το στρες όµως που προέρχεται από την ασιτία η κορτιζόλη ίσως να µην είναι και ορθότερος δείκτης, διότι ανάλογα µε τη διάρκειά του µπορεί να γίνει και χρόνιο. Γενικά, τα επίπεδα της κορτιζόλης µεταξύ των ψαριών που ταΐζονται κανονικά και εκείνων που βρίσκονται σε ασιτία, ποικίλλουν ευρέως ανάλογα µε το είδος των ψαριών. Πιο συγκεκριµένα, ασιτία δεν επηρέασε στατιστικά σηµαντικά τα επίπεδα κορτιζόλης του πλάσµατος στην πέστροφα Oncorhynchus mykiss (Bastrop et al., 1992) και σε ενήλικους ιχθύες του είδους Stizostedion vitreum (Czesny et al., 2003). Ωστόσο, σε ενήλικα άτοµα σολοµού που βρίσκονταν υπό κανονικές συνθήκες διατροφής, µετρήθηκαν πολύ χαµηλότερα επίπεδα κορτιζόλης συγκριτικά µε τα άτοµα που βρίσκονταν υπό συνθήκες ασιτίας (Barton, 2002). Αντιθέτως, ασιτία στο γατόψαρο, Ictalurus punctatus, οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων της κορτιζόλης του πλάσµατος (Peterson and Small, 2004). Τα αποτελέσµατα φανέρωσαν ότι η περίοδος ασιτίας σχετίζεται µε τη βλάβη που υφίσταται το πυρηνικό DNA. Η αντιγραφή και η µεταγραφή του γονιδιώµατος είναι διαδικασίες οι οποίες επηρεάζονται άµεσα από πιθανές βλάβες του DNA. Επίσης, οι βλάβες αυτές ευθύνονται για τη γήρανση, τον κυτταρικό θάνατο και την καρκινογένεση. Για τα θηλαστικά, είναι γνωστό ότι ακόµα και υπό φυσιολογικές συνθήκες προκαλούνται µεταλλάξεις στο γένωµα της τάξεως 1/ ζεύγη βάσεων, οι οποίες σχετίζονται µε το οξειδωτικό stress (Ames, 1989). Η 72

73 ποσοτικοποίηση της βλάβης του DNA µπορεί να προσφέρει µια εκτίµηση της φυσιολογικής κατάστασης ενός οργανισµού ή ενός κυττάρου (Chen et al., 2007). Στα ψάρια φαίνεται ότι οι ενεργές µορφές οξυγόνου (ROS), που προκύπτουν κατά την ασιτία, βιοσυσσωρεύονται στο ήπαρ (Pascual et al., 2003). Οι ROS ως αποτέλεσµα του αυξηµένου οξειδωτικού stress που παράγονται, υποβαθµίζουν το DNA και τις πρωτεΐνες και προκαλούν κυτταρικές βλάβες (Rios et al., 2007). Η πιθανή παραγωγή ελευθέρων ριζών κατά τις πρώτες εβδοµάδες ασιτίας ίσως ευθύνεται για τη βλάβη στο γενετικό υλικό, ενώ κατά το επόµενο διάστηµα φαίνεται να δρουν µηχανισµοί που την επιδιορθώνουν (Robinson et al., 1997). Έχει αποδειχθεί ότι η παρατεταµένη ασιτία θέτει τον οργανισµό σε φάση προσαρµογής, µε σταθεροποίηση του µεταβολισµού σε χαµηλά επίπεδα (O Connor et al., 2000). Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της ασιτίας υπάρχει η περίπτωση της µεταβολής της κοινωνικής ιεραρχίας εντός των πληθυσµών (EFSA, 2008). Σε επίµυες, παρουσιάστηκε βλάβη του DNA σε µονοκύτταρα του αίµατος, ανάλογη των ηµερών µερικής ασιτίας, η οποία αποκαταστάθηκε κατά την επανασίτιση (Rocha et al., 2008). Επίσης, στη βιβλιογραφία έχει αναφερθεί ότι συνθήκες οξέος stress ευθύνονται για βλάβες στο DNA των οργανισµών. Οι Aniagu et al. (2006) διαπίστωσαν ότι η εντονότερη δραστηριότητα σε κέφαλο (Leuciscus cephalus) ευθύνεται για την πρόκληση οξειδωτικού stress και τον αυξηµένο κερµατισµό του DNA. Πρόσφατα αναφέρθηκε συγκεκριµένος µηχανισµός στα θηλαστικά, ο οποίος φαίνεται να συσχετίζει το χρόνιο stress µε την καταστροφή του γενετικού υλικού (Hara et al., 2011). Τα µειωµένα επίπεδα της φωσφοπρωτεΐνης p53, συνδέονται µε την αύξηση συγκέντρωσης της αδρεναλίνης και πιθανώς ευθύνονται για την καταστροφή του γενετικού υλικού. Εκτός από την εµπλοκή του β-αδρενεργικού υποδοχέα, στο βιοχηµικό αυτό µηχανισµό φαίνεται να συµµετέχει και η πρωτεΐνη β-αρρεστίνη 1, η οποία ρυθµίζει τη δράση των GPCR υποδοχέων (G proteincoupled receptors). Αν και τα ψάρια χρησιµοποιούνται ολοένα και περισσότερο στη βασική βιολογική έρευνα σε σχέση µε τα θηλαστικά, λόγω των πλεονεκτηµάτων που διαθέτουν, φαίνεται ότι υπάρχουν σηµαντικές διαφορές, σε σχέση µε to stress, µεταξύ των ειδών. Στο σηµείο αυτό πρέπει να αναφερθούν οι προσπάθειες προς την κατεύθυνση της ανάπτυξης δεικτών stress, που δεν απαιτούν θυσία ζώντος πειραµατικού υλικού, αλλά παρακολουθούν τις µεταβολές της χηµικής σύστασης του νερού. Πιο 73

74 συγκεκριµένα, πρόκειται συνήθως για τις µεταβολές στεροειδών ορµονών, που εκκρίνονται στο νερό της δεξαµενής από τα ψάρια, όπως είναι για παράδειγµα η κορτιζόλη (Ellis et al., 2004, Fanouraki et al., 2008). 74

75 5 Εκτίµηση Οικονοµικών δεικτών βάσει των αποτελεσµάτων 5.1 Εισαγωγή Στη διεθνή έχουν χρησιµοποιηθεί διάφορα οικονοµικά µοντέλα, για πολλά καλλιεργούµενα είδη ψαριών, που επιτρέπουν την ανάλυση των σχέσεων που υφίστανται µεταξύ των βιολογικών και οικονοµικών παραγόντων, βοηθώντας στην λήψη των κατάλληλων µεταχειριστικών αποφάσεων (Bjorndal, το 1988; Sperber et al, το 1977; Rizzo and Spagnolo 1996). Οι Mark Keenum και John Waldrop το 1988 προέβησαν σε οικονοµική ανάλυση του γατόψαρου στον Μισσισιπή εξετάζοντας τρία διαφορετικά µεγέθη φάρµας µε σκοπό να εκτιµήσουν το κόστος παραγωγής του γατόψαρου. Υπολόγισαν ότι το ετήσιο µεταβλητό κόστος αντιπροσωπεύει από 82,57% έως 84,57% του συνολικού κόστους. Οι J. Garcia και B. Garcia τo 2006 προχώρησαν σε οικονοµετρική ανάλυση βιωσιµότητας της γλώσσας σε χερσαίες δεξαµενές. Σκοπός τους ήταν να προσδιορίσουν τις σηµαντικότερες µεταβλητές που συνθέτουν το κόστος παραγωγής και να προχωρήσουν σε ανάλυση ευαισθησίας για την NPV και το IRR, για καθεµία από τις θεωρητικές εγκαταστάσεις που είχαν σχεδιάσει. Οι C. Adams και A. Lazur το 2000 προχώρησαν σε ανάλυση κόστους και οφέλους για την τιλάπια σε µια υποθετική λίµνη στην Καλιφόρνια. Λαµβάνοντας υπόψη τις υποθέσεις που έγιναν σχετικά µε την παραγωγή, το µέγεθος εξαλίευσης, την τιµή πώλησης, και τις µοναδιαίες δαπάνες παραγωγής, η υποθετική καλλιέργεια tilapia εµφάνισε θετικές ταµειακές ροές από το πέµπτο έτος λειτουργίας της. Οι καθαρές επιστροφές είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στις αλλαγές στην τιµή αγοράς του γόνου, τις δαπάνες των τροφών, και τα ποσοστά επιβίωσης όπως προέκυψε από την γενόµενη ανάλυση ευαισθησίας. Οι Ozden Kocak και Fusun Tathdil το 2004 κάνοντας δοµική και οικονοµική ανάλυση σε 24 µονάδες τσιπούρας και λαβρακίου στην περιοχή Milas υπολόγισαν το κόστος παραγωγής ανά Kgr της τσιπούρας και του λαβρακίου. Τα στοιχεία που προέκυψαν µέσω των συνεντεύξεων και των ερωτηµατολογίων χρησιµοποιήθηκαν για τους υπολογισµούς που έγιναν µε την µέθοδο της άµεσης κοστολόγησης. Οι δαπάνες συνολικής παραγωγής αποτελούνται από τις µεταβλητές δαπάνες 95% και 5% σταθερές δαπάνες. Στο σύνολο, των Kgr της τσιπούρας και των

76 Kgr λαβρακίου που παράγονται κατά µέσον όρο ετησίως στην περιοχή, το κόστος της τσιπούρας υπολογίζεται σε 2,48 $ / kg, για δε το λαβράκι σε 2,34 $ / kg. Ο Καραγιάννης και οι συνεργάτες του το 2002 χρησιµοποιώντας το στοχαστικό µοντέλο Cobb-Douglas µέτρησαν την τεχνική αποτελεσµατικότητα, τον επιµερισµό του κόστους και την αποτελεσµατικότητα των καλλιεργειών τσιπούρας και λαβρακίου. Έδειξαν ότι οι µεγάλες σε µέγεθος µονάδες έχουν καλύτερα κατανεµηµένη τεχνική αποτελεσµατικότητα. Η εξειδίκευση της καλλιέργειας είτε σε τσιπούρα είτε σε λαβράκι επιδρά θετικά στο κόστος αλλά όχι στην αποτελεσµατικότητα του επιµερισµού του. Η χρήση προσωπικού µε τεχνικές επιδεξιότητες επιδρά θετικά µόνο όσον αφορά την τεχνική αποτελεσµατικότητα. Τα εµπειρικά αποτελέσµατα που προέκυψαν, δείχνουν τεχνική αναποτελεσµατικότητα που υπολογίζεται σε 83.7% που σηµαίνει ότι µε την βελτίωση της µπορεί να προκύψει σηµαντική εξοικονόµηση πόρων. Τέτοιες βελτιώσεις θα µπορούσαν να ενισχύσουν σηµαντικά την ανταγωνιστικότητα του κλάδου µε συνέπεια χαµηλότερες τιµές διάθεσης στην κατανάλωση και πιθανώς περαιτέρω να επέκταση στις εξαγωγές. Ο Θεοδώρου το 2002 παρατηρεί ότι τα περιθώρια κέρδους έχουν συµπιεστεί έντονα, και οι ex-farm τιµές στην Ελλάδα έχουν µειωθεί, από 14 / kg το 1989 σε 4.56 / kg το Οι στρατηγικές διαχείρισης πρέπει να κατατείνουν, στις οικονοµίες κλίµακας, στην διαφοροποίηση των καλλιεργούµενων ειδών, και στην βελτίωση της ποιότητας των εκτρεφόµενων ειδών. Τα επίπεδα παραγωγής µπορούν να αυξηθούν µέχρι 20% στην επόµενη δεκαετία, ενώ το κόστος παραγωγής πρέπει να µειωθεί περισσότερο από 5% το χρόνο. Αυτό θα γίνει µε την καλύτερη διαχείριση του ζωικού κεφαλαίου και του περιβάλλοντος διαβίωσης και την συνεχή βελτίωση της τεχνολογίας των τροφών. Οι υψηλές δαπάνες παραγωγής και η αδυναµία εξεύρεσης κατάλληλων και διαθέσιµων θαλάσσιων χώρων δηµιουργούν ένα ιδιαίτερα ανταγωνιστικό περιβάλλον για τον κλάδο της ιχθυοκαλλιέργειας. Εποµένως, για την επιτυχή ενασχόληση στον κλάδο απαιτείται η ύπαρξη καλά σχεδιασµένου επιχειρηµατικού σχεδίου και η εκπόνηση των αναγκαίων οικονοµοτεχνικών µελετών ή µελετών σκοπιµότητας. Για τους επαγγελµατίες της υδατοκαλλιέργειας, δε αποτελεί ικανή και αναγκαία συνθήκη δεδοµένης της επίδρασης εξωγενών παραγόντων που αυξάνουν τον κίνδυνο της παραγωγικής διαδικασίας. 76

77 5.2 Μεθοδολογία - Αποτελέσµατα Οι τροφές αποτελούν το σηµαντικότερο ποσοστό κόστους στην παραγωγή. Δύο είναι οι σηµαντικοί παράγοντες εδώ: το κόστος αγοράς της τροφής και ο συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής που θα επιτευχθεί στο τέλος της εκτροφής. για το σκοπό αυτό στο πλαίσιο της παρούσας έρευνας έγινε προσπάθεια να διερευνηθεί η επίδραση της µερικής ασιτίας (75%) στην αύξηση της τσιπούρας καθώς και η αποτίµηση του οικονοµικού οφέλους που προκύπτει από τη µειωµένη χορήγηση τροφής. Για το σκοπό αυτό και παράλληλα µε το πείραµα διατροφής συγκεντρώνονταν οικονοµικά δεδοµένα για την εξαγωγή συµπερασµάτων σχετικά µε την οικονοµικότητα των δύο χειρισµών. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της µεταχείρισης επετεύχθη µια σηµαντική µείωση της τροφής που καταναλώθηκε, της τάξης του 33,7%. Η µείωση αυτή συνεπάγεται τη σηµαντική συµπίεση του κόστους εκτροφής και κατ επέκταση µια αξιοσηµείωτη αύξηση του καθαρού κέρδους. Στο παραπάνω συµπέρασµα οδηγούµαστε αν αναλογιστούµε ότι η αύξηση αντιστάθµισης έχει ως αποτέλεσµα παρόµοια τελική βιοµάζα και σχετικά µικρή διαφορά στον δείκτη FCR και για τα δύο πειράµατα (Πίν. 11). Το ποσό αυτό θεωρείται ιδιαίτερα σηµαντικό λαµβάνοντας υπόψη ότι οι τροφές αποτελούν το 50-60% των εξόδων σε µία εταιρεία παραγωγής ψαριών. Πίνακας 11 Συντελεστής µετατρεψιµότητας της τροφής (F.C.R) και ο ειδικός ρυθµός αύξησης (S.G.R) Μάρτυρας Μεταχείριση Αρχικό Βάρος (gr) 5,80 5,78 Τελικό Βάρος (gr) 30,21 28,83 Αύξηση 24,41 23,03 Κατανάλωση τροφής 45,16 29,93 FCR 1,85 1,3 Ειδικότερα, το κόστος εκτροφής των δύο µεταχειρίσεων δίνεται στον Πίνακα 12, από τον οποίο είναι µειωµένο, στη µεταχείριση, κατά ποσοστό 31,8519%. Πίνακας 12 Εκτίµηση κόστους εκτροφής 77

78 Μάρτυρας Μεταχείριση Αρχικό Βάρος (gr) 5,8 5,8 Τελικό Βάρος (gr) 30,21 28,83 Αύξηση 24,41 23,03 Κατανάλωση τροφής 45, ,939 FCR 1,85 1,3 Κόστος εκτροφής 0,054 0,0368 Μεταβολή κόστους εκτροφής (%) 0-31,8519 Το µεικτό κέρδος εκτροφής του χειρισµού υπολογίστηκε στα 0,079 (Πιν. 13) και το καθαρό κέρδος, στη µεταχείριση αυξήθηκε κατά 16,745. Για τον υπολογισµό του καθαρού κέρδους έγινε η παραδοχή ότι το κόστος τροφής ανέρχεται στα 1,2 ανά κιλό τροφής και ότι η τιµή πώλησης της του προϊόντος θα ήταν 5,5 ανά κιλό. Πίνακας 13 Εκτίµηση κέρδους εκτροφής Μάρτυρας Μεταχείριση Αρχικό Βάρος (gr) 5,8 5,8 Τελικό Βάρος (gr) 30,21 28,83 Αύξηση 24,41 23,03 Κατανάλωση τροφής 45, ,939 FCR 1,85 1,3 Κόστος εκτροφής 0,054 0,036 Έσοδα 0,122 0,115 Καθαρό κέρδος 0,068 0,079 Μεταβολή κέρδους 0 16,745 Στη συνέχεια και για την όσο το δυνατόν πιο ολοκληρωµένη συγκριτική αξιολόγηση των χειρισµών, υπολογίστηκαν ο δείκτης αποδοτικότητας, ο οικονοµικός δείκτης µετατρεψιµότητας και ο οικονοµικός δείκτης κέρδους. 78

79 Ο δείκτης αποδοτικότητας (Δ.Α.) υπολογίστηκε σύµφωνα µε τον τύπο (1) και αποτελεί τον λόγο των µεικτών κερδών προς το κόστος εκτροφής. ο δείκτης αποδοτικότητας είναι σηµαντικά µεγαλύτερος στη διαχείριση, επιβεβαιώνοντας για µια ακόµα φορά τη επίτευξη µεγαλύτερου κέρδους µε την εφαρµογή µερικής αντιστάθµισης (Πιν. 14). Δ.Α. = µεικτά κέρδη (1) Κόστος εκτροφής Πίνακας 14 Δείκτης αποδοτικότητας Μάρτυρας Μεταχείριση Αρχικό Βάρος (gr) 5,8 5,8 Τελικό Βάρος (gr) 30,21 28,83 Αύξηση 24,41 23,03 Κατανάλωση τροφής 45, ,939 FCR 1,85 1,3 Κόστος εκτροφής 0,054 0,036 Έσοδα 0,122 0,115 Καθαρό κέρδος 0,068 0,079 Δείκτης αποδοτικότητας 2,252 3,205 Ο οικονοµικός δείκτης µετατρεψιµότητας δίνεται από τον τύπο (2) και αποτελεί την οικονοµική έκφραση του δείκτης µετατρεψιµότητας τροφής. ECR = FCR x C ( /Kg ψαριού) (2) Όπου: FCR = δείκτης µετατρεψιµότητας C = κόστος δίαιτας ( /Kg ψαριού) 79

80 Από τον υπολογισµό του EPI (Διάγραµµα 19) φαίνεται ότι ο µάρτυρας έχει καλύτερα αποτελέσµατα γιατί, όπως ειπώθηκε, ο EPI αποτελεί µια οικονοµική έκφραση του FCR και συνεπώς ο µειωµένος δείκτης µετατρεψιµότητας στη µεταχείριση οδηγεί σε έναν µικρότερο EPI. Από την άλλη πλευρά, ο οικονοµικός δείκτης κέρδους - Economic Profit Index EPI ( /kg ψαριού) υπολογίστηκε από τον τύπο 1 αποτελεί ένα ακόµα δείκτη καθαρού κέρδους. EPI = (W * P) ECR * WI (3) Όπου: W = Τελικό Βάρος P = Τιµή ECR = οικονοµικός δείκτης µετατρεψιµότητας WI = αύξηση βάρους Ο οικονοµικός δείκτης κέρδους είναι υψηλότερος στη µεταχείριση (Διάγραµµα 20) σε σχέση µε τον µάρτυρα γιατί συνδυάζει τόσο την καταναλωθείσα τροφή όσο και το κέρδος από την εκτροφή αλλά και την αύξηση βάρους που επιτυγχάνεται µε τον εκάστοτε χειρισµό. 80

81 Η αύξηση αντιστάθµισης συµβάλει αποφασιστικά στη µείωση µίας σηµαντικής και µέχρι σήµερα ανελαστικής δαπάνης του κλάδου των υδατοκαλλιεργειών, όπως είναι το κόστος της τροφής. 0,124 0,122 0,120 0,118 0,116 0,114 0,112 0,110 0,108 0,106 0,112 Μάρτυρας 0,123 Διαχείριση Διάγραµµα 20 Οικονοµικός δείκτης κέρδους 81