ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΨΕΥΔΑΡΓΥΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΝΙΚΕΛΙΟΥ ΜΕ ΜΗ-ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ ΤΟΤΤΑ ΞΑΝΘΙΠΗ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ: ΕΠΙΚ. ΚΑΘ. Γ. ΨΩΜΑΣ OH O CH 3 HOOC NH Cl NH CH 3 CH 3 CH 3 CH COOH H 3 C O ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2014

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΑΝΟΡΓΑΝΗ ΧΗΜΕΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΤΤΑ ΞΑΝΘΙΠΗ, ΧΗΜΙΚΟΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΨΕΥΔΑΡΓΥΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΝΙΚΕΛΙΟΥ ΜΕ ΜΗ-ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ανόργανης Χημείας του Τομέα Γενικής και Ανόργανης Χημείας του Τμήματος Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επίκ. Καθηγητής Γεώργιος Ψωμάς- Επιβλέπων Καθηγητής Καθηγητής Δημήτριος Κεσίσογλου-Μέλος εξεταστικής επιτροπής Αναπλ. Καθηγητής Αθανάσιος Παπαδόπουλος- Μέλος εξεταστικής επιτροπής Η τριμελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε σύμφωνα με τη Γ.Σ.Ε.Σ. 259/ , για τη κρίση της Διπλωματικής Εργασίας της Τόττα Ξανθίπης, Χημικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την , όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της εργασίας με τίτλο ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΨΕΥΔΑΡΓΥΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΝΙΚΕΛΙΟΥ ΜΕ ΜΗ-ΣΤΕΡΟΕΙΔΗ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΦΑΡΜΑΚΑ και την ενέκρινε με βαθμό 10.

3 Πρόλογος Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η σύνθεση και η μελέτη της δομής ουδέτερων μονοπυρηνικών και πολυπυρηνικών συμπλόκων του νικελίου και του ψευδαργύρου με τα μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα, tolfenamic acid, mefenamic acid και naproxen παρουσία ή απουσία των ετεροκυκλικών ενώσεων πυριδίνη, 1,10-φαινανθρολίνη, 2,2 -διπυριδυλαμίνη, 2,2 -διπυριδίνη και 2,2 -διπυριδυλο κετονοξίμη με απώτερο στόχο τη μελέτη της βιολογικής τους δράσης. Ο χαρακτηρισμός των συμπλόκων ενώσεων έγινε με στοιχειακή ανάλυση, μετρήσεις μοριακής αγωγιμότητας, φασματοσκοπία υπερύθρου, φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού και μετρήσεις μαγνητικής επιδεκτικότητας σε θερμοκρασία δωματίου. Επιπρόσθετα, επιλύθηκαν οι κρυσταλλικές δομές επτά συμπλόκων με κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ. Μελετήθηκε ο τρόπος και η ισχύς σύνδεσης των συμπλόκων ενώσεων με το DNA με φασματοσκοπία υπεριώδους, κυκλική βολταμμετρία και ιξωδομετρία. Εξετάστηκε η ικανότητα των συμπλόκων να αντικαθιστούν το αιθίδιο βρωμίδιο από το σύμπλοκό του με το DNA. Ακόμη, διερευνήθηκε και η ικανότητα των υποκαταστατών και των συμπλόκων ενώσεων να συνδέονται με αλβουμίνη. Τέλος, τα σύμπλοκα μελετήθηκαν και ως προς την ικανότητά τους να δεσμεύουν in vitro ελεύθερες ρίζες. Κλείνοντας τον πρόλογο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επίκουρο καθηγητή Γ. Ψωμά για την καθοδήγησή του σε όλη τη διάρκεια της πειραματικής εργασίας, καθώς και τη συμβολή του στην ερμηνεία των πειραματικών αποτελεσμάτων και στη διόρθωση της εργασίας αυτής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον καθηγητή Δ. Φ. Κεσίσογλου, του οποίου η προσφορά και βοήθεια καθ όλη τη διάρκεια της μεταπτυχιακής εργασίας ήταν πολύτιμη και ουσιαστική. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον αναπλ. καθηγητή Α. Παπαδόπουλο για τη συνεργασία, για τις εύστοχες παρατηρήσεις του και για την πραγματοποίηση των πειραμάτων αντιοξειδωτικής μελέτης στο εργαστήριό του. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω τη Δρ. Α. Ραπτοπούλου και το Δρ. Β. Ψυχάρη του Ινστιτούτου Επιστήμης Υλικών στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», τον καθηγητή I. Turel και τον Δρ. F. Perdih του Εργαστηρίου Χημείας και Χημικής Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου της Λιουμπλιάνα στη Σλοβενία και τον επίκουρο καθηγητή Α.

4 Χατζηδημητρίου του εργαστηρίου Ανόργανης Χημείας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για την επίλυση της μοριακής δομής των συμπλόκων ενώσεων. Επίσης, όλα τα μέλη ΔΕΠ του Εργαστηρίου Ανόργανης Χημείας του Τμήματος Χημείας για τη διάθεση συνεργασίας σε όλη τη διάρκεια της εργασίας μου. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους προπτυχιακούς, μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου για το ευχάριστο περιβάλλον εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ πολύ την οικογένεια μου για την ηθική και υλική υποστήριξη που μου προσέφερε. Τόττα Ξανθίππη Ιανουαρίος 2014

5 Περιεχόμενα Θεωρητικό Μέρος 1.Το νικέλιο Εισαγωγή Το νικέλιο in vivo Γλυοξυλάση Ι Acireductone Dioxygenase Σουπεροξειδική Δισμουτάση Ni (Nickel Superoxide Dismutase) Ουρεάση (Urease) Υδρογενάση NiFe (NiFe Hydrogenase) Αφυδρογονάση CO (CO Dehydrogenase) Συνθετάση του ακέτυλο συνενζύμου Α (Acetyl-CoA Synthase) Αναγωγάση του μέθυλο συνενζύμου Μ(Methyl CoM Reductase) Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με βιολογική δράση Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με φάρμακα Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με ενδεχόμενη αντικαρκινική δράση Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με ενδεχόμενη αντιβακτηριακήαντιμυκητιακή δράση Ο ψευδάργυρος Εισαγωγή Ο ψευδάργυρος in vivo Καρβονική ανυδράση Καρβοξυπεπτιδάση Θερμολυσίνη Αλκοολική αφυδρογονάση α-αμυλάση Σουπεροξειδική δισμουτάση Cu-Zn DNA και RNA- πολυμεράση Σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου με βιολογική δράση Σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου με φάρμακα Σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου με πιθανή αντικαρκινική

6 δράση Σύμπλοκα του ψευδαργύρου με ενδεχόμενη αντιβακτηριδιακή δράση Σύμπλοκα του ψευδαργύρου με ενδεχόμενη αντιμικροβιακή δράση (αντιβακτηριακή και αντιμυκητιακή) Εισαγωγή στη φθορισμομετρία Φαινόμενα Φθορισμού Απόσβεση Φθορισμού Βιοχημικά Φθοροφόρα Οι φθορίζοντες δείκτες Φάσματα εκπομπής και μετατοπίσεις Stokes Απόσβεση φθορισμού Τα φθοροφόρα Τα εγγενή ή φυσικά φθοροφόρα Φθορισμός συνενζύμων Τα εξωγενή φθοροφόρα Αντιδραστήρια ιχνηθέτησης πρωτεϊνών Ανιχνευτές με μεγάλο χρόνο ζωής Λανθανίδες Σύμπλοκα μεταβατικών μετάλλων Υποκαταστάτες της διπλωματικής εργασίας Tolfenamic acid Σύμπλοκες ενώσεις με το tolfenamic acid Mefenamic acid Σύμπλοκες ενώσεις του mefenamic acid Naproxen Σύμπλοκες ενώσεις του naproxen Πειραματικό μέρος 1.Εισαγωγή Περιγραφή υποκαταστατών Αντιδραστήρια - Διαλύτες Όργανα Αντιδραστήρια Διαλύτες... 69

7 3.2 Όργανα μέτρησης Μελέτη της αλληλεπίδρασης των συμπλόκων με το DNA Μελέτη με υπεριώδη φασματοσκοπία (UV) Ιξωδομετρία Κυκλική βολταμμετρία Ανταγωνιστική δράση με ΕΒ Μελέτη της αλληλεπίδρασης των συμπλόκων ενώσεων με αλβουμίνες ορού αίματος Μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης Προσδιορισμός της μείωσης της δράσης της σταθερής ρίζας 1,1-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) Ανάλυση της καθαριστικής δράσης (scavenging activity) της κατιονικής ρίζας Ανταγωνισμός των μελετώμενων ενώσεων σε DMSO για ρίζες υδροξυλίου Σύνθεση των συμπλόκων Παρασκευή συμπλόκων του Zn Παρασκευή συμπλόκων του Ni Φασματοσκοπική μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με τη φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR) Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με τη φασματοσκοπία Υπεριώδους-Ορατού (Uv-vis) Μαγνητικές μετρήσεις των συμπλόκων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με κυκλική βολταμμετρία Χαρακτηρισμός της δομής των συμπλόκων ενώσεων Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Ζn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 - (nap) 2 ] Et 2 O Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(nap) 2 (bipy)(η 2 Ο)] Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(nap) 2 (phen)(ch 3 OH)]

8 9.6 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου του [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] Αλληλεπίδραση των συμπλόκων με το DNA Εισαγωγή Μελέτη της αλληλεπίδρασης των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων με φασματοσκοπία UV-vis Μελέτη της αλληλεπίδρασης των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων με DNA με κυκλική βολταμμετρία Ιξωδομετρία Μελέτη της ανταγωνιστικής δράσης των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων με το ΕΒ με φασματοσκοπία φθορισμού Συμπεράσματα αλληλεπίδρασης με το DNA Αλληλεπίδραση των ΜΣΑΦ και των σύμπλοκων ενώσεων με αλβουμίνες ορού αίματος Αλληλεπίδραση με την BSA Αλληλεπίδραση των συμπλόκων με ΗSA Συμπεράσματα της αλληλεπίδρασης με τις αλβουμίνες ορού αίματος Μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης των συμπλόκων Συμπεράσματα Βιβλιογραφία Περίληψη

9 Θεωρητικό Μέρος

10 1. To Nικέλιο 1.1 Εισαγωγή Το νικέλιο είναι μέταλλο, με ατομικό αριθμό 28, ανήκει στα μεταβατικά στοιχεία κι έχει ευρεία χρήση στη χημεία ενώσεων συναρμογής. Χρησιμοποιείται με τη μορφή κράματος καθώς επίσης και ως πρώτη ύλη άλλα και ως καταλύτης στη βιομηχανία [1,2]. Ακόμα, έχει αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητο στα πτηνά και στα ζώα, ο ρόλος του όμως στον ανθρώπινο οργανισμό δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, όμως πιθανόν σχετίζεται με την απορρόφηση του σιδήρου [3]. Όπως όλα τα μέταλλα έτσι και το νικέλιο σε μεγάλες ποσότητες είναι τοξικό για τον ανθρώπινο οργανισμό. Το ιόν του Ni 2+ περιέχεται σε ένζυμα, είτε σταθεροποιώντας την τριτοταγή δομή τους είτε ευρισκόμενο στο ενεργό τους κέντρο. Ένα απ τα πιο γνωστά ένζυμα που περιέχουν νικέλιο είναι η ουρεάση. Έχει διαπιστωθεί ότι το πρωτεολυτικό ένζυμο καρβοξυπεπτιδάση που περιέχει Zn(II) στο ενεργό του κέντρο, με την απομάκρυνση του ψευδαργύρου καθίσταται ανενεργό και με την προσθήκη Ni(II) επαναδραστηριοποιείται [4]. Τέλος, πολλά σύμπλοκα του νικελίου βρίσκουν εφαρμογή ενάντια σε λευχαιμικά κύτταρα. 1.2 Το Νικέλιο in vivo Το νικέλιο είναι ζωτικής σημασίας συμπαράγοντας κατάλυσης ενζύμων που έχουν βρεθεί σε ευβακτήρια, αρχαιοβακτήρια, μύκητες και φυτά [5-10]. Αυτά τα ένζυμα καταλύουν μια πληθώρα αντιδράσεων όπως π.χ. οξειδωαναγωγικές αντιδράσεις [11]. Σε ορισμένα ευκαρυωτικά συστήματα, η παρουσία του νικελίου απαιτείται για τη δραστικότητα του ενζύμου ουρεάση. Ωστόσο, όπως και με όλα τα υπόλοιπα μεταβατικά μέταλλα [12,13] η χρήση του νικελίου είναι γενικώς πολύπλοκη, διότι τα μέταλλα αυτά είναι εν δυνάμει τοξικά και μπορούν να προκαλέσουν πληθώρα κυτταρικών βλαβών [14,15,16], οπότε η διανομή και η συσσώρευσή του πρέπει να είναι στενά ελεγχόμενη. Έτσι, οι οργανισμοί με διατροφική απαίτηση την παρουσία νικελίου διαθέτουν μια μεγάλη ποικιλία από πρωτεΐνες που συμβάλουν στην ομοιόσταση του νικελίου από το κύτταρο. Το ιχνοστοιχείο αυτό υπάρχει παντού στη φύση, τα επίπεδά του όμως μέσα στο κύτταρο είναι συνήθως χαμηλά [7,17,18]. Υπάρχουν πρωτεΐνες-αντλίες οι οποίες εισάγουν το νικέλιο μέσα στο κύτταρο διαμέσου της κυτοπλασματικής μεμβράνης, όντως η NikABCD και η NiCoT (αντλία νικελίου/κοβαλτίου) [19,20]. Παράλληλα το κύτταρο 2

11 αποβάλλει από το κυτταρόπλασμα το νικέλιο, ωστόσο λίγα παραδείγματα με ειδική αποστολή την εξαγωγή του νικελίου έχουν αναφερθεί [ 21]. Η ομοιόσταση του νικελίου στους προκαρυωτικούς οργανισμούς διατηρείται αυστηρά από τους παράγοντες μεταγραφής γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την εισαγωγή, εξαγωγή και αποτοξίνωση του νικελίου από το κύτταρο. Η σημαντικότερη όμως παρουσία του νικελίου σε ζωντανούς οργανισμούς είναι το γεγονός ότι βρίσκεται στο ενεργό κέντρο ενζύμων, τα οποία συμμετέχουν σε σημαντικές καταλυτικές διαδικασίες. Έως τώρα έχουν αναφερθεί οχτώ συνολικά ένζυμα με νικέλιο στο ενεργό τους κέντρο. Αυτά είναι τα εξής : Γλυοξυλάση Ι (Glyoxylase I) Acireductone Dioxygenase Σουπεροξειδική Δισμουτάση Ni (Nickel Superoxide Dismutase) Ουρεάση (Urease) Υδρογενάση NiFe (NiFe Hydrogenase) Αφυδρογονάση CO (CO Dehydrogenase) Συνθετάση του ακέτυλο συνενζύμου Α (Acetyl-CoA Synthase) Αναγωγάση του μέθυλο συνενζύμου Μ(Methyl CoM Reductase) Η αντίδραση, η οποία καταλύεται από κάθε ένα από αυτά τα μεταλλοένζυμα, θα αναπτυχθεί αναλυτικά παρακάτω. Ωστόσο, ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον στοιχείο για τις αντιδράσεις αυτές είναι το γεγονός ότι για τα επτά από τα οχτώ, είτε το αντιδρών είτε το προϊόν είναι το αέριο (μονοξείδιο και διοξείδιο του άνθρακα, μεθάνιο, υδρογόνο, αμμωνία και οξυγόνο). Τα αέρια αυτά διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στο παγκόσμιο βιολογικό κύκλο του άνθρακα, του αζώτου και του οξυγόνου [22]. Η περιοχή του ενζύμου που περιέχει νικέλιο εμφανίζει εξαιρετική πλαστικότητα τόσο στη χημεία συναρμογής όσο και στην ηλεκτροχημεία του. Το μεταλλικό κέντρο στην σουπεροξειδική δισμουτάση (SOD) πρέπει να είναι ικανό να συμμετέχει σε οξειδοαναγωγικές διαδικασίες με ηλεκτροχημικά δυναμικά τα οποία κυμαίνονται από έως -160 mv [23], στην MCR (multi- component reaction) και στην CODH (carbon monoxide dehydrogenase) πρέπει να είναι ικανό να προσεγγίζει δυναμικά χαμηλά έως και -600 mv [24]. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι τα κέντρα του νικελίου στα ένζυμα αυτά εμφανίζουν μεγάλο ηλεκτροχημικό εύρος, της τάξης ~ 1.5 V. 3

12 Στη συνέχεια παρουσιάζονται αναλυτικά η καταλυτική δράση των ενζύμων που περιέχουν νικέλιο Γλυοξυλάση Ι (Glxl) Οι γλυοξυλάσες Ι και ΙΙ ( Glxl I και II) καταλύουν τη μετατροπή της μεθυλογλυοξάλης σε γαλακτικό ανιόν. Η μεθυλογλυοξάλη είναι μια τοξική ένωση για το DNA των κυττάρων, με το οποίο σχηματίζει προϊόντα προσθήκης [25]. Glx I O - + H 2 O O O HO O Το ενεργό κέντρο του ενζύμου περιέχει ένα ιόν νικελίου, το οποίο βρίσκεται σε οκταεδρικό περιβάλλον, δρά σαν οξύ κατά Lewis και καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης βρίσκεται στην ίδια οξειδωτική βαθμίδα +2 [26] Acireductone Dioxygenase (ARD) Το ένζυμο αυτό πραγματοποιεί τον προτελευταίο στάδιο στο μονοπάτι της μεθειονίνης [27,28]. Το νικέλιο βρίσκεται σε οκταεδρικό περιβάλλον, είναι υψηλού σπιν και η σφαίρα συναρμογής αποτελείται από δύο συναρμοσμένα μόρια νερού, τρία μόρια ιστιδίνης (υπόλοιπα) και ένα μόριο ασπαραγινικού οξέος. Το νικέλιο δε συμμετέχει σε οξειδοαναγωγικές διαδικασίες αλλά ούτε και συναρμόζει μόρια οξυγόνου. Αντ αυτού, το υπόστρωμα (1,2-διυδροξυ-3-όξο-5-(μεθυλοθειο)πεντ-1-ένιο) αντιδρά απευθείας με το οξυγόνο και σχηματίζει υπεροξικά παράγωγα και το νικέλιο παραμένει στη βαθμίδα οξείδωσης +2. Σχήμα 1. Η δομή του κέντρου του Ni στο ένζυμο ARD. 4

13 1.2.3 Σουπεροξειδική Δισμουτάση Νi (NiSOD) Η σουπεροξειδική δισμουτάση (NiSOD = superocide dismutase) προέκυψε από την αύξηση του επιπέδου του οξυγόνου πριν από δύο εκατομμύρια χρόνια [29] σαν ένα μέρος ενός μηχανισμού άμυνας του κυττάρου ενάντια σε δραστικά είδη οξυγόνου, που σχετίζονται με το μεταβολισμό του οξυγόνου (συμπεριλαμβανομένου την αναπνοή και το οξειδωτικό stress) [30]. Η SOD στοχεύει τα υπεροξείδια, τα οποία καταστρέφουν άμεσα τα clusters FeS των οξειδοαναγωγικών ενζύμων και αντιδρά με το μονοξείδιο του αζώτου για την παραγωγή του ανιόντος ΟΝΟΟ - το οποίο είναι ένα πανίσχυρο οξειδωτικό μέσο [31]. Υπάρχουν πολλά είδη SOD. Οι Cu/Zn SODs, οι Fe-SODs, οι Mn-SODs και οι Ni- SODs. Όλες καταλύουν την ίδια αντίδραση που είναι η μετατροπή των σουπεροξειδίων σε οξυγόνο και υπεροξείδιο του υδρογόνου [32]. Σχήμα 2. Το ενεργό κέντρο της SOD όπου φαίνεται η σφαίρα συναρμογής του Ni. Οι SODs που περιέχουν νικέλιο στο ενεργό τους κέντρο εμφανίζουν διττή δομή, δηλαδή η δομή του ενεργού τους κέντρου, όπου και περιέχεται το νικέλιο, αλλάζει δομή από επίπεδη τετραγωνική σε τετραγωνική πυραμιδική. Στην πρώτη περίπτωση η σφαίρα συναρμογής του νικελίου αποτελείται από δύο άτομα S, από δύο κυστεΐνες και δύο άτομα αζώτου Ουρεάση Η ουρεάση είναι ένα ένζυμο του βακτηριδίου Η.Pylori, που σχετίζεται με πολλές χρόνιες παθήσεις του ανθρώπινου πεπτικού συστήματος. Το ένζυμο αυτό παίζει σημαντικό ρόλο στη βιωσιμότητα του βακτηριδίου στο όξινο περιβάλλον του στομάχου. Για την αντιμετώπιση του βακτηριδίου, το νικέλιο μπορεί να αντικαθίσταται από ιόντα, όπως το βισμούθιο, που χορηγούνται στον άνθρωπο με μορφή συμπλόκων του βισμουθίου, κι έτσι να αναστέλλεται η δράση του ενζύμου [4]. 5

14 Η ουρεάση είναι το κλειδί για τον παγκόσμιο κύκλο αζώτου διότι καταλύει την υδρόλυση της ουρίας, που αποβάλλεται από τα σπονδυλωτά, σε αμμωνία και ανθρακικά ιόντα (Σχήμα 3) [33, 34]. Έτσι, το ένζυμο ουρεάση (που δεν υπάρχει στα σπονδυλωτά) διευκολύνει την αφομοίωση του αζώτου από τα φυτά, τα άλγη και τα βακτήρια. Αυτός ο ρόλος είναι εξαιρετικά σημαντικός αφότου σε παγκόσμιο επίπεδο το χρησιμοποιούμενο λίπασμα είναι η ουρία (Η 2 Ν-CO-NH 2 ). Σχήμα 3. Κατάλυση από την ουρεάση της υδρόλυσης της ουρίας σε αμμωνία και ανθρακικά ιόντα. Η ουρεάση περιέχει ένα διπυρηνικό κέντρο αποτελούμενο από δύο άτομα νικελίου τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με μια γέφυρα είτε νερού είτε υδροξυλίου. Το πρώτο νικέλιο έχει τετραγωνική πυραμιδική δομή και η χρωμοφόρα ομάδα του είναι NiN 2 O 3, ενώ το δεύτερο νικέλιο έχει ψευδοοκτεδρική δομή και η χρωμοφόρα του ομάδα είναι NiN 2 O Υδρογoνάση NiFe Η υδρογoνάση NiFe καταλύει αντιστρεπτά την αναγωγή δύο πρωτονίων σε Η 2 από δύο ηλεκτρόνια [35,36]. Αναερόβια μικρόβια απομακρύνουν το υδρογόνο από το περιβάλλον και συνδυάζουν την οξείδωσή του με την αναγωγή διαφόρων αποδεκτών ηλεκτρονίων (όπως οξυγόνο, νιτρικά ανιόντα, ανθρακικά κ.α.). Σχήμα 4. Η δομή του ενεργού κέντρου μιας NiFe-ιδρογονάσης. 6

15 Υπάρχουν τέσσερα είδη υδρογονασών NiFe. Όλες οι υδρογονάσες NiFe αποτελούνται από δύο υπομονάδες, μία μεγάλη και μία μικρή. Η μεγάλη περιέχει το διπυρηνικό σύμπλοκο NiFe, το οποίο είναι και το ενεργό του μορίου, και το οποίο συνδέεται με τη μικρή υπομονάδα, η οποία περιέχει ένα έως και τρία clusters FeS. Ο σίδηρος του συστήματος NiFe έχει ως ligands δύο μόρια CO και ένα ανιόν CN, τα οποία πιστεύεται ότι διατηρούν το άτομο του σιδήρου σε κατάσταση χαμηλού σπιν Αφυδρογονάση του μονοξειδίου του άνθρακα (CODH) H αφυδρογονάση του μονοξειδίου του άνθρακα καταλύει την αντιστρεπτή οξείδωση του CO σε CO 2, επιτρέποντας κατά αυτό τον τρόπο τα αναερόβια μικρόβια να αναπτύσσονται με CO ή CO 2 ως μοναδική πηγή άνθρακα και με CO ως μοναδική πηγή ενέργειας [37,38]. Υπάρχει μια μονοδραστική Ni CODH, που περιέχει δέκα άτομα Fe και ένα άτομο Ni ανά μονάδα και μια διδραστική Ni CODH, που περιέχει δεκατέσσερα άτομα Fe και τρία άτομα Ni ανά μονάδα. Σχήμα 5. Δομή του C-Cluster Συνθετάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α Η συνθετάση του ακέτυλο-συνενζύμου Α αλληλεπιδρά στενά με την CODH και σχηματίζει ένα ετεροτετραμερές το οποίο προκαλεί σύζευξη των αντιδράσεων που καταλύει, ώστε στη συνέχεια να καταλύσει τη σύνθεση του ακέτυλο συνενζύμου Α από CO 2. Κατά την αντίδραση αυτή σχηματίζεται μονοξείδιο του άνθρακα ως ενδιάμεσο το οποίο κινείται διαμέσου ενός τούνελ 70Å μεταξύ των ενεργών κέντρων CODH και της ACS [39]. Το ενεργό κέντρο στο ένζυμο αυτό είναι ένα cluster A [4Fe-4S], το οποίο συνδέεται με μια θειολική γέφυρα (μιας κυστεΐνης) με το πλησιέστερο άτομο Ni p (Σχήμα 6). Η σφαίρα συναρμογής του νικελίου δημιουργεί το ενεργό κέντρο της Ni-SOD, ενώ η συνολική διαμόρφωση είναι παρόμοια με αυτή των Fe-SOD (περιέχουν μόνο Fe) και στις οποίες το σύστημα [4Fe-4S] συνδέεται με το διπυρηνικό σύμπλοκο του Fe [40]. 7

16 Σχήμα 6. Δομή του ενεργού κέντρου του cluster A της ACS Αναγωγάση του μέθυλο συνενζύμου Μ Όλο το μεθάνιο που παράγεται με βιολογικό τρόπο στη γη προκύπτει από την καταλυτική δράση της MCR σε μικρόβια που παράγουν μεθάνιο. Η MCR καταλύει τη μετατροπή του μέθυλο-συνενζύμου Μ και της φωσφορικής Ν 7 -μερκαπτοεπτανοϋλορεονίνης σε μεθάνιο και σε δισουλφίδιο CoB-SS-CoM. Με βάση κρυσταλλογραφικά δεδομένα ανενεργών ενζύμων του Ni(II), η MCR αποτελείται από μια μονάδα (αβγ) 2, στην οποία το καταλυτικό της κέντρο είναι ένα σύμπλοκο Ni- υδροκορφίνης που ονομάζεται συνένζυμο F 430, στην υπομονάδα α (Σχήμα 7). Σχήμα 7. Η δομή του F 430 στο ενεργό κέντρο του MCR. Η δομή αυτή περιέχει μόνο πέντε διπλούς δεσμούς και το συνένζυμο αποτελεί το περισσότερο ανηγμένο πυρρόλιο στη φύση. Το σημαντικότερο είναι ότι μόνο όταν το Ni βρίσκεται στη βαθμίδα οξείδωσης +1, το ένζυμο μπορεί να ξεκινήσει την κατάλυση. 1.3 Σύμπλοκες ενώσεις του Ni με βιολογική δράση Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με φάρμακα Η βιταμίνη Β13 (Οροτικό οξυ, H 3 Or) και τα παράγωγά της έχουν πολύ μεγάλη σημασία για τα βιολογικά συστήματα, εξαιτίας της συμμετοχής τους στη βιοσύνθεση των πυριμιδινικών νουκλεοτιδίων του DNA. Γι αυτό το λόγο έχουν παρασκευαστεί και 8

17 μελετηθεί σύμπλοκα του οροτικού οξέος με διάφορα μέταλλα, τα οποία εμφανίζουν αντικαρκινική δράση. Ένα από αυτά είναι το [Ni(HOr)(H 2 O)(4-Meim) 3 ] 2 5H 2 O, όπου 4- Meim είναι το 4-μεθυλοϊμιδαζόλιο. Πρόκειται για ένα διπυρηνικό σύμπλοκο, στο οποίο το κάθε ιόν νικελίου βρίσκεται στο κέντρο παραμορφωμένου οκταέδρου [41]. Σχήμα 8. Κρυσταλλική δομή του [Ni(HOr)(H 2 O)(4-Meim) 3 ]2 5H 2 O. Η νιτραζεπάμη, μία 1,4-βενζοδιαζεπίνη, είναι ένα μυοχαλαρωτικό και αγχολυτικό φάρμακο, εμφανίζει αντισπασμωδική δράση και χρησιμοποιείται κυρίως σε παιδιά, τα οποία πάσχουν από οξεία επιληψία. Μία από τις ενώσεις συναρμογής, που έχουν αναφερθεί, είναι και το Ni(NCS) 2 (C 2 H 5 OH) 2 (H 2 O) 2 2C 15 H 11 N 3 O 3. Πρόκειται για ένα σύμπλοκο, στο οποίο το Ni 2+ έχει οκταεδρική διαμόρφωση, ενώ τα δύο μόρια της νιτραζεπάμης δεν είναι συναρμοσμένα με το κεντρικό κατιόν, αλλά συνδέονται με το σύμπλοκο μέσω δευτερευουσών host-guest αλληλεπιδράσεων. Η κρυσταλλική δομή (Σχήμα 9) αφορά την αντίστοιχη σύμπλοκη ένωση με Co, η οποία είναι ισοδομική με το σύμπλοκο του Ni 2+ [42]. Σχήμα 9. Κρυσταλλική δομή του Co(NCS) 2 (C 2 H 5 OH) 2 (H 2 O) 2 2C 15 H 11 N 3 O 3. 9

18 Το ακετυλοσαλικυλικό οξύ και τα παράγωγά του, γνωστά για τις αντισπασμωδικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές τους, έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή συμπλόκων, τα οποία εμφανίζουν και αντιεπιληπτική δράση. Το [Ni(H 2 O) 5 (5-nsa)] + (5-nsa) - H 2 O, όπου H(5-nsa) είναι το 5-νιτροσαλικυλικό οξύ είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με ελαφρά παραμορφωμένη οκταεδρική διαμόρφωση [43]. Σχήμα 10. Η κρυσταλλική δομή του [Ni(H 2 O) 5 (5-nsa)] + (5-nsa) - H 2 O Το σπαρφλοξασίν (sparfloxacin = Ηsf) είναι μια τρίτης γενιάς κινολόνη με αντιμικροβιακή δράση που χρησιμοποιείται κυρίως για τη θεραπεία της χρόνιας βρογχίτιδας και της πνευμονίας. Το [Ni(sf) 2 (H 2 O) 2 ] (Σχήμα 11) είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με οκταεδρική γεωμετρία, όπου το νικέλιο είναι συναρμοσμένο με δύο αποπρωτονιωμένα ligands sf -1 [44]. Σχήμα 11. Προτεινόμενη δομή του συμπλόκου [Ni(sf) 2 (H 2 O) 2 ] Τέλος, το Nadicl είναι ένα ισχυρό μη-στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο της ομάδας των φαινυλαλκανοϊκών οξέων που παρουσιάζει σημαντική αντιφλεγμονώδη, 10

19 αναλγητική και αντιπυρετική δράση. Χρησιμοποιείται κυρίως σε επώδυνες και φλεγμονώδει καταστάσεις όπως η ρευματοϊδής αρθρίτιδα, η σπονδυλίτιδα και η οστεοαρθρίτιδα. Το [Ni(dicl)(Hdicl)(Hpko) 2 ] + (Σχήμα 12) είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με οκταεδρική γεωμετρία όπου μόνο το ένα από τα δύο ligands είναι αποπρωτονιωμένο [45]. Σχήμα 12. Η κρυσταλλική δομή του [Ni(dicl)(Hdicl)(Hpko) 2 ] Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με ενδεχόμενη αντικαρκινική δράση Το [Ni(tcitr) 2 ], όπου Htcitr είναι το 2-(3,7-διμεθυλοκτ-6-υλιδενο)υδραζινοκαρβοθειαμίδιο, είναι ένα μονοπυρηνικό επίπεδο τετραγωνικό σύμπλοκο. Κατά τη μελέτη της αντικαρκινικής του δράσης στα ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα U937 βρέθηκε ότι προκαλεί 50% παρεμπόδιση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ότι είναι περισσότερο αποτελεσματικό από ό,τι το ελεύθερο ligand. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι εμφανίζει καλή αποπτωτική δράση. Πρέπει βέβαια να σημειωθεί ότι δεν έχει γίνει ανάλυση της δομής του με περίθλαση ακτίνων-χ [46] Τo Ni(C 15 H 11 N 4 O 2 ) 2 2H 2 Ο, όπου C 15 H 11 N 4 O 2 είναι η αποπρωτονιωμένη 3- πικολινοϋλοϋδραζόνη της Ν-μεθυλοϊσατίνης, είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του Ni 2+ με οκταεδρική διαμόρφωση. Εξετάστηκε η αντικαρκινική του δράση στα ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα ΤΟΜ-1 και ΝΒ4 και διαπιστώθηκε ότι μπορεί να παρεμποδίσει τον πολλαπλασιασμό και των δύο κυτταρικών σειρών (IC 50 =3.1 μμ και 4.6 μμ, αντίστοιχα). Τέλος, αξίζει να αναφερθεί ότι το συγκεκριμένο σύμπλοκο δεν επηρεάζει τη σύνθεση του DNA των κυττάρων ΤΟΜ-1 [47]. 11

20 Σχήμα 13. Κρυσταλλική δομή του Ni(C 15 H 11 N 4 O 2 )2 2H 2 Ο. Το Ni(C 6 H 6 N 3 S 2 ) 2, όπου C 6 H 6 N 3 S 2 είναι η αποπρωτονιωμένη θειοσεμικαρβαζόνη της θειοφαινο-2-καρβαλδεΰδης, είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με επίπεδη τετραγωνική διαμόρφωση. Το σύμπλοκο εξετάστηκε ως προς την ικανότητά του να παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των λευχαιμικών κυττάρων FLC και των μελανωμικών κυττάρων Β16. Βρέθηκε, ότι το σύμπλοκο εμφανίζει παρόμοια ή ακόμα και μικρότερη δράση από το ελεύθερο ligand [48]. Σχήμα 14. Κρυσταλλική δομή του Ni(C 6 H 6 N 3 S 2 ) 2. Τα Ni(NQTS) 2 2DMSO και Ni(NQSC) 2 2DMSO H 2 O, όπου οι υποκαταστάτες είναι η αποπρωτονιωμένη σεμικαρβαζόνη (NQSC) και τη θειοσεμικαρβαζόνη της ναφθοκινόνης (NQTS), αντίστοιχα, είναι μονοπυρηνικά σύμπλοκα με παραμορφωμένη οκταεδρική διαμόρφωση. Τα σύμπλοκα αυτά εμφανίζουν αυξημένη παρεμποδιστική δράση στον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του μαστού MCF- 7 σε σχέση με τα ελεύθερα ligands. Επίσης, το Ni(NQSC) 2 βρέθηκε ότι εμφανίζει μεγαλύτερη παρεμποδιστική δράση στην ανάπτυξη των κυττάρων σε σχέση με το Ni(NQTS) 2 [49]. 12

21 (Α) (Β) Σχήμα 15. Κρυσταλλική δομή των (Α) Ni(NQTS) 2 2DMSO και (Α) Ni(NQSC) 2 2DMSO H 2 O. Το Ni(fbt) 2, όπου ο Hfbt είναι η θειοσεμικαρβαζόνη της p-φθορο-βενζαλδεΰδης, είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με επίπεδη τετραγωνική διαμόρφωση. Το σύμπλοκο αυτό εξετάστηκε in vitro ως προς την ικανότητά του να παρεμποδίζει την εξάπλωση των ανθρώπινων λευχαιμικών κυττάρων U937 και την επαγωγή της απόπτωσής τους. Βρέθηκε ότι προκαλεί παρεμπόδιση στην ανάπτυξη των κυττάρων αυτών σε ποσοστό 75% σε συγκέντρωση 30 μg/ml. Επίσης, το σύμπλοκο αυτό δεν προκαλεί την τυπική θραυσματοποίηση του DNA μετά από 18 h. Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όχι όμως μέσω του μηχανισμού της απόπτωσης. Πιθανόν να δρα με διαφορετικό τρόπο, όπως παρεμποδίζοντας τη δράση της τελομεράσης ή κάποιων κινασών [50]. Σχήμα 16. Κρυσταλλική δομή του [Ni(fbt) 2 ]. Η δι(θειοϋδραζιδο)αμίδιο ελεσκλομόλη (bis(thiohydrazide) amide elesclomol) έχει ισχυρή αντιπολλαπλασιαστική δράση και πρόσφατα άρχισε να χρησιμοποιείται σε 13

22 κλινικές μελέτες ως αντικαρκινικός παράγοντας. Το σύμπλοκο του νικελίου με την ελεσκλομόλη (C 19 H 18 N 4 NaNiO 2 S 2 ) παρασκευάστηκε και μελετήθηκε ως προς την ικανότητά του να αναστέλλει την αύξηση του μεγέθους των κυττάρων Κ562, η οποία βρέθηκε ότι είναι ικανοποιητική [51]. Ένα ακόμα σύμπλοκο που μελετήθηκε ως προς την αντικαρκινική του δράση είναι το Ni(a) 2 όπου a =4 -methoxy-5,7-dihydroxy-isoflavone. Οι ισοφλαβόνες αποτελούν μια υποκατηγορία των φλαβονών και έχουν πολύ καλές βιολογικές ιδιότητες με μικρή τοξικότητα, όπως αντιοξειδωτική, αντιφλεγμονώδη δράση, δράση κατά των ιών και των όγκων. Το σύμπλοκο αυτό έχει δείξει καλύτερη δράση από το ligand όπως επίσης και μικρότερο δείκτη IC 50 σε ορισμένες κυτταρικές σειρές [52] Σύμπλοκες ενώσεις του νικελίου με ενδεχόμενη αντιβακτηριακή- αντιμυκητιακή δράση Το Ni(M5HFTSC) 2 Cl 2, στο οποίο ο υποκαταστάτης είναι η θειοσεμικαρβαζόνη της 5-μεθυλο-2-φουρφουράλης (M5HFTSC), είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο με επίπεδη τετραγωνική διαμόρφωση. Μελετήθηκε ως προς τη δράση του εναντίον δύο παθογόνων μυκήτων, τον νηματοειδή A. fumigatus και τον ζυμομύκητα C. Albicans, σε σχέση με το ελεύθερο ligand. Βρέθηκε ότι τόσο το ligand όσο και το αντίστοιχο σύμπλοκο δεν εμφανίζουν διαφορετική αντιμυκητιακή δράση [53]. Σχήμα 17. Κρυσταλλική δομή του Ni(M5HFTSC) 2 Cl 2. Ως προς τη δράση τους ενάντια σε φυτοπαθογόνους μύκητες έχουν μελετηθεί τα Ni(C 12 H 15 N 2 OS) 2 και Ni(C 12 H 13 N 2 O 2 S) 2 CH 2 Cl 2, των οποίων οι υποκαταστάτες είναι η Ν-βενζοϋλο-Ν,Ν -διαιθυλοθειουρία και το Ν-(μορφολινοθειοκαρβονυλο) βενζαμίδιο, 14

23 αντίστοιχα. Βρέθηκε ότι η παρεμπο-διστική δράση των ελεύθερων ligands είναι υψηλότερη από αυτή των αντίστοιχων συμπλόκων. Όσον αφορά τη δομή τους και τα δύο εμφανίζουν επίπεδη τετραγωνική διαμόρφωση [54]. (Α) Β Σχήμα 18. Κρυσταλλική δομή των (Α) Ni(C 12 H 15 N 2 OS) 2 και (Β) Ni(C 12 H 13 N 2 O 2 S) 2 CH 2 Cl 2. Μία άλλη περίπτωση αποτελεί το σύμπλοκο [Ni(SNNS)] 2 2H 2 O, όπου ο υποκαταστάτης (SNNS) είναι το αποπρωτονιωμένο 2,2 -dibenzyl-2,2 -(1,1 -(pyridine- 2,6-diyl)bis(ethan-1-yl-1-ylidene))bis(hydrazinecarbodithioate). Πρόκειται για ένα διπυρηνικό σύμπλοκο, στο οποίο κάθε ιόν νικελίου εμφανίζει οκταεδρική διαμόρφωση. Τα δύο ιόντα νικελίου γεφυρώνονται μέσω των αζώτων των πυριδινικών δακτυλίων. Έχει μελετηθεί η δράση του εναντίον τεσσάρων παθογόνων βακτηρίων και τεσσάρων μυκήτων. Βρέθηκε ότι τόσο το σύμπλοκο όσο και το ελεύθερο ligand δεν είναι πολύ δραστικά ενάντια σε αυτούς τους μικροοργανισμούς, γι αυτό και θεωρούνται ήπια αντιβιοτικά [55]. Σχήμα 19. Κρυσταλλική δομή του [Ni(SNNS)] 2 2H 2 O. 15

24 Το Ni 3 (H 2 O) 2 (DMA) 2 (acbshz) 2 2DMF, όπου DMA=διμεθυλαμίνη και acbshz το αποπρωτονιωμένο Ν -ακρυλοϋλο-5-βρωμοσαλικυλυδραζίδιο είναι ένα γραμμικό τριπυρηνικό σύμπλοκο, στο οποίο το κεντρικό ιόν του Ni 2+ εμφανίζει οκταεδρική διαμόρφωση, ενώ τα ακραία ιόντα νικελίου έχουν επίπεδη τετραγωνική διαμόρφωση. Tο σύμπλοκο βρέθηκε ότι λειτουργεί ανταγωνιστικά ως προς το ligand, με αποτέλεσμα τον περιορισμό της αντιμικροβιακής δράσης του ligand [56]. Σχήμα 20. Κρυσταλλική δομή του Ni 3 (H 2 O) 2 (DMA) 2 (acbshz) 2 2DMF. Το [NiPbL(SCN) 2 (DMF)(H 2 O)] 2, όπου L είναι η αποπρωτονιωμένη Ν,Ν δισ(σαλικιλυδενο)-1,3-προπανοδιαμίνη, είναι ένα ετεροτετραπυρηνικό σύμπλοκο, στο οποίο η διαμόρφωση γύρω από κάθε Ni 2+ είναι παραμορφω-μένη οκταεδρική. Η αντιβακτηριδιακή δράση του συμπλόκου μελετήθηκε εναντίον διαφόρων παθογόνων βακτηρίων σε σχέση με το ελεύθερο ligand και βρέθηκε ότι είναι περισσότερο δραστικό. Επίσης, βρέθηκε ότι το σύμπλοκο καθώς και το ligand έχουν πολύ καλή δραστικότητα εναντίον του νηματοειδούς μύκητα A.niger [57]. Σχήμα 21. Κρυσταλλική δομή του [NiLPb(SCN) 2 (DMF)(H 2 O)] 2 Το Ni(Pz 4 DM) 2, όπου ο υποκαταστάτης Pz 4 DM είναι η αποπρωτονιωμένη 4Νδιμεθυλοθειοσεμικαρβαζόνη της ακετυλοπυραζίνης, είναι ένα μονοπυρηνικό οκταεδρικό 16

25 σύμπλοκο, στο οποίο τα δύο ligands βρίσκονται σε mer-διαμόρφωση. Το ελεύθερο ligand βρέθηκε ότι παρεμποδίζει ισχυρά την ανάπτυξη των μυκήτων P. variotti και A. niger, ενώ το σύμπλοκο δεν παρουσιάζει καμία αντιμυκητιακή δράση [58]. Σχήμα 22. Κρυσταλλική δομή του [Ni(Pz 4 DM) 2 ]. Ένα ακόμα σύμπλοκο που μελετήθηκε ως προς την αντιμυκητιακή του δράση είναι το Ni(LH) 2, όπου LH = 1-(2-[(5-methylfuran-2yl)methylene)] hydrazono) phthalazine. Πρόκειται για ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του νικελίου με επίπεδη τετραγωνική γεωμετρία. Το ligand ανήκει στα υδραζίδια, τα οποία χρησιμοποιούνται στην ιατρική με πιο χαρακτηριστικά το ισονιαζίδιο (isoniazid) που χρησιμοποιείται κατά της φυματίωσης και το 1-υδραζινοφθαλαζίνιο (υδραλαζίνιο) (= 1-hydrazinophthalazine (hydralazine) ),που δρα κατά της υπέρτασης και ως περιφερειακό αγγειοδιασταλτικό φάρμακο. Το υδροχλωρίδιό του είναι ένα φάρμακο για την άμεση μείωση της πίεσης του αίματος σε μια κρίση υπέρτασης. Τα υδραζαλαζινικά παράγωγα (hydralazine derivatives) έχουν ευρεία χρήση για τη θεραπεία ασθενειών, όπως φυματίωση και πνευματικές διαταραχές. Επίσης, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιμικροβιακά και κατά της ελονοσίας και των όγκων [59]. Σχήμα 23. Κρυσταλλική δομή του [Νi(HL) 2 ]. 17

26 To σύμπλοκο [Ni(dtc) 2 ] [dtc = diethyldithiocarbamate] συντέθηκε και μελετήθηκε ως προς την αντιβακτηριδιακή και αντιμυκητιακή του δράση που οφείλεται στην ύπαρξη του διθειοκαρβαμιδικού παραγώγου. Πρόκειται για ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του νικελίου με επίπεδη τετραγωνική γεωμετρία (Σχήμα 24). Η αντιμυκητιακή και αντιβακτηριδιακή του δράση μελετήθηκε έναντι τριών βακτηριακών ειδών (Escherichia coli, Bacillus thuringiensiso και Pseudomonas aerunginosa) και τριών μυκητιακών ειδών (Aspergillus nigrus, Fusarium oxysporum και Penicillium chrysogenum). Το σύμπλοκο έχει δείξει πολύ καλύτερες δράσεις από τα συνηθισμένα αντιβιοτικά. Το [Ni(dtc) 2 ] έδειξε μεγαλύτερη δράση για τα B. thuringiensis και F. Oxysporum [60]. Σχήμα 24. Κρυσταλλική δομή [Ni(dtc) 2 ]. Οι θειοσεμικαρβαζόνες, οι σεμικαρβαζόνες και τα σύμπλοκα τους έχουν μελετηθεί ευρέως λόγω των βιολογικών και αντιμυκητιακών τους ιδιοτήτων. Μερικά σύμπλοκα που παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν ως προς αυτή τη δράση τους είναι τα [NiCl 2 (3STCH) 2 ], [NiBr 2 (3STCH) 2 ], [NiCl-(2,3BSTCH 2 )(H 2 O)]Cl και [NiBr(2,3BST- CH 2 )(H 2 O)]Br, όπου 3-thiophene aldehyde semicarbazone (3STCH) και 2,3-thiophene dicarboxaldehyde bis(se-micarbazone) (2,3BSTCH 2 ). Όλα τα σύμπλοκα είναι μονοπυρηνικά και έχουν οκταεδρική γεωμετρία. Από τα πειράματα για τον προσδιορισμό της αντιμυκητιακής δράσης προέκυψε ότι και τα δυο ligands είναι ανενεργά έναντι των μυκήτων Candida albicans, Candida glabrata και Aspergillus furnigatus. Από τον προσδιορισμό των δεικτών MIC 80, προέκυψε ότι τα σύμπλοκα που φέρουν ως ligand το 2,3BSTCH 2 είναι πιο δραστικά έναντι της C. glabrata από αυτά που φέρουν το 3STCH [61]. Μια επιπλέον κατηγορία ενώσεων που έχει παρασκευαστεί και μελετηθεί η αντιβακτηριδιακή τους δράση είναι τα methanesulfonicacid hydrazide (asulfonamide compound, msh: CH 3 SO 2 NHNH 2 ), τα παράγωγα salicylalde hydemethanesulfonylhydra- 18

27 zone (salmsh), 2-hydroxyacetophenone-methanesulfonyl hydrazone (afmsh), 2-hydroxy- 3-metoxybenzaldehyde-methanesulfonylhydrazone (o-vanmsh) και το σύμπλοκο τους με το Ni(II). Τα ligands και τα σύμπλοκα που παρασκευάστηκαν κυρίως σύμπλοκα του Pt- έχουν πολλές εφαρμογές στην ιατρική. Το σύμπλοκο του νικελίου που παρασκευάστηκε αποδείχτηκε ότι έχει καλύτερη δράση συγκριτικά με τα ligands στα Gram-θετικά βακτήρια B. cereus and S. aureus και σε δύο Gram-αρνητικά βακτήρια (E. coli και P. aeruginosa) [62]. Τέλος, τα πολυαιθερικά ιονοφόρα αντιβιοτικά (Polyether ionophorous antibiotics) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στην κτηνιατρική επειδή είναι πολύ αποτελεσματικά παρασιτοκτόνα και δρουν ως αντιβακτηριδιακά, μυκη-τοκτόνα κ.ά. Στην κατηγορία αυτή ανήκει και το mon (monensic acid). Το σύμπλοκο [Ni(Mon) 2 (H 2 O) 2 ] H 2 O 5MeCN είναι μονοπυρηνικό και έχει οκ-ταεδρική γεωμετρία (Σχήμα 25). Τα πειράματα βακτηριοκτόνου δράσης πραγματοποιήθηκαν έναντι των κυτταρικών σειρών B. subtillis (ATCC 6633), B. mycoides spp. και S. lutea FDA γένος PCI 1000 (ATCC 10054) και έδειξαν ότι η συναρμογή του μεταλλικού ιόντος επηρεάζει τη δράση του ligand και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη [63]. Σχήμα 25. Κρυσταλλική δομή του [Ni(Mon) 2 (H 2 O) 2 ] H 2 O 5MeCN. 19

28 2. Ο ψευδάργυρος 2.1 Εισαγωγή Το χημικό στοιχείο ψευδάργυρος είναι ένα γαλαζωπό-άσπρο, λαμπερό, διαμαγνητικό μέταλλο με ατομικό αριθμό 30, αν και οι περισσότεροι κοινοί εμπορικοί βαθμοί του μετάλλου έχουν ένα θαμπό αποτέλεσμα. Ο μεταλλικός ψευδάργυρος είναι σκληρός και εύθραυστος στις περισσότερες θερμοκρασίες αλλά γίνεται ελατός μεταξύ 100 και 150 C. Πάνω από τους 210 C, το μέταλλο γίνεται εύθραυστο πάλι και μπορεί να καταστραφεί με ένα χτύπημα. Ο ψευδάργυρος είναι καλός αγωγός του ηλεκτρισμού. Πολλά κράματα περιέχουν ψευδάργυρο, συμπεριλαμβανομένου και του ορείχαλκου, ένα κράμα ψευδάργυρου και χαλκού. Ο ψευδάργυρος αποτελεί περίπου το 75 ppm της επιφάνειας της γης, καθιστώντας τον το 24 ο σε αφθονία στοιχείο σε αυτή. Το χώμα περιέχει ppm ψευδάργυρου με μέσο όρο 64 ppm. Το νερό της θάλασσας έχει 30 ppb ψευδαργύρου και η ατμόσφαιρα περιέχει µg/m 3. Στα μεταλλεύματα, το στοιχείο βρίσκεται σε συνδυασμό με άλλα μέταλλα, όπως ο χαλκός και ο μόλυβδος. Ο ψευδάργυρος έχει χαμηλή έλξη με το οξυγόνο, ενώ αντιδρά με το θείο σχηματίζοντας εξαιρετικά αδιάλυτα σουλφίδια. Ο σφαλερίτης, που είναι μια μορφή σουλφιδίων του ψευδάργυρου, είναι το ορυκτό του μετάλλου αυτού στο οποίο υπάρχει ο ψευδάργυρος σε μεγαλύτερη συγκέντρωση, καθώς περιέχει ψευδάργυρο σε ποσοστό 60-62%. Άλλα μεταλλεύματα, από τα οποία εξάγεται ο ψευδάργυρος περιλαμβάνουν το σμιθσονίτη (ανθρακικός ψευδάργυρος, ZnCO 3 ) και τον ημιμορφίτη (πυριτικό άλας ψευδάργυρου). Αυτά τα δύο μεταλλεύματα διαμορφώθηκαν ως αποτέλεσμα διαδικασιών διάβρωσης σε σουλφίδια ψευδάργυρου στα αρχέγονα χρόνια. 2.2 Ο ψευδάργυρος in vivo Ο ψευδάργυρος είναι απαραίτητο στοιχείο για τη διατήρηση κάθε μορφής ζωής. Έχει εκτιμηθεί ότι από τις εκατοντάδες χιλιάδες πρωτεΐνες του ανθρώπινου σώματος, περιέχουν ψευδάργυρο. Επιπρόσθετα, υπάρχουν πάνω από 12 τύποι κυττάρων στο ανθρώπινο σώμα που περιέχουν ιόντα ψευδαργύρου, ο ρόλος των οποίων στη φαρμακευτική και την υγεία μελετάται συστηματικά τα τελευταία χρόνια. Τα εγκεφαλικά κύτταρα των θηλαστικών περιέχουν ψευδάργυρο, καθώς επίσης και οι σιελογόνοι αδένες, ο προστάτης, το ανοσοποιητικό σύστημα και το έντερο [64]. 20

29 Επίσης, ο Zn είναι το δεύτερο σε αφθονία ιχνοστοιχείο μετά το σίδηρο στον ανθρώπινο οργανισμό με περιεκτικότητα 2g ανά 70kg. Η απαιτούμενη ημερήσια ποσότητα είναι 15mg για ενηλίκους, 1-3 mg για παιδιά και 0,5-1,0 mg για νήπια. Οι κυριότερες πηγές Zn στη διατροφή του ανθρώπου είναι το κρέας, η μαγιά μπύρας, τα οστρακοειδή, το συκώτι, το γάλα, τα ψάρια και τα αυγά. Η δράση των περισσότερων μεταλλοενζύμων εξαρτάται από την παρουσία του ψευδαργύρου. Ο ρόλος του στα μεταλλοένζυμα μπορεί να είναι δομικός, όταν απαιτείται για τη δομική σταθερότητα της πρωτεΐνης, καταλυτικός όταν σχετίζεται άμεσα με την καταλυτική ικανότητα του ενζύμου, ρυθμιστικός, όταν ρυθμίζει μόνο, χωρίς να είναι απαραίτητος για την ενζυμική δραστικότητα ή τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και μη-καταλυτικός, όταν είναι άγνωστη η δράση του. Επιπλέον, ο ψευδάργυρος είναι απαραίτητος για τη σωστή λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος, ενώ συμμετέχει και στη σύνθεση των νουκλεϊκών οξέων [65]. Η ανεπάρκεια ψευδαργύρου προκύπτει από την ανεπαρκή πρόσληψη ψευδαργύρου ή την ανεπαρκή απορρόφηση από το σώμα. Συμπτώματα ανεπάρκειας ψευδαργύρου περιλαμβάνουν απώλεια μαλλιών, δερματικές κακώσεις, διάρροια, αδυνάτισμα των ιστών του σώματος, και, τελικά, θάνατο. Η όραση, η γεύση, η όσφρηση και η μνήμη συνδέονται επίσης με τον ψευδάργυρο και μια ανεπάρκεια σε ψευδάργυρο μπορεί να προκαλέσει δυσλειτουργίες σε αυτές τις αισθήσεις και στα σχετικά όργανα. Συγγενείς ανωμαλίες οι οποίες προκαλούν ανεπάρκεια ψευδαργύρου μπορούν να οδηγήσουν σε μια αρρώστια η οποία καλείται Acrodermatitis enteropathica [64]. Η λήψη επαρκούς ποσότητας ψευδαργύρου κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης και σε μικρά παιδιά αποτελεί πραγματικό πρόβλημα, ειδικά μεταξύ αυτών που δεν έχουν τη δυνατότητα για μια σωστή διατροφή. Η εγκεφαλική ανάπτυξη εμποδίζεται από ανεπάρκεια ψευδαργύρου μέσα στην μήτρα και κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης [64]. Ο ψευδάργυρος βρίσκεται σε όλα τα όργανα, τους ιστούς και τα υγρά του ανθρώπινου σώματος. Το μεγαλύτερο ποσοστό του ψευδαργύρου του σώματος βρίσκεται κυρίως στους σκελετικούς μύες εξαιτίας του υπερβολικά μεγάλου όγκου τους, αφού η πραγματική του συγκέντρωση δεν είναι υπερβολικά μεγάλη. Οι σκελετικοί μύες και τα οστά περιέχουν περισσότερο από 85% του ολικού Zn του σώματος. Ο Zn είναι ένα πρωταρχικά ενδοκυτταρικό ιόν, αφού ο ενδοκυτταρικός Zn συνεισφέρει περισσότερο 21

30 από 95% του συνολικού Zn του σώματος, οπότε μπορούμε να καταλήξουμε στο συμπέρασμα ότι οι κυριότεροι «χώροι λειτουργίας» του Zn βρίσκονται μέσα στο κύτταρο. Η συγκέντρωση του ψευδαργύρου σε εξωκυτταρικά υγρά είναι σχετικά χαμηλή συγκρινόμενη με τα ενδοκυτταρικά αποθέματα. Εάν το συνολικό ποσό του πλάσματος του αίματος θεωρηθεί ότι είναι 45mL/kg βάρους σώματος, τότε ένας άνθρωπος 70kg θα έχει περίπου 3L πλάσματος, το οποίο περιέχει μόνο 3 mg Zn. Το πλάσμα είναι το κυριότερο μέσο της μεταφοράς του ψευδαργύρου μέσα στο ανθρώπινο σώμα μέσω του οποίου μεταφέρεται στο ήπαρ, στο πάγκρεας, στα έντερα, στους μύες, στα λευκά αιμοσφαίρια, στα οστά και στους νεφρούς. Μέσα στο πλάσμα ο ψευδάργυρος φαίνεται ότι συνδέεται κυρίως με μία αλβουμίνη, ένα μικρό ποσοστό συνδέεται με ένα κλάσμα γλοβουλίνης, πιθανόν μία α 2 - μακρογλοβουλίνη και, τέλος, ένα πολύ μικρό ποσοστό συνδέεται με αμινοξέα. Ορισμένα ένζυμα που περιέχουν ψευδάργυρο είναι αυτά που περιγράφονται στη συνέχεια Καρβονική ανυδράση Οι καρβονικές ανυδράσες αποτελούν μία κατηγορία ενζύμων που καταλύουν την ισορροπία υδρόλυσης του CO 2. H αντίδραση αυτή χωρίς την παρουσία ενζύμου προχωρά αργά, ενώ η παρουσία του την επιταχύνει κατά 10 7 φορές. Οι καρβονικές ανυδράσες είναι σημαντικά βιολογικά ένζυμα που έχουν ουσιαστικό ρόλο σε διάφορες διαδικασίες, όπως η φωτοσύνθεση (για την αποτελεσματική απορρόφηση CO 2 ), αναπνοή (για την ταχύτατη απόθεση CO 2 ) και ο έλεγχος του ph Καρβοξυπεπτιδάση Οι καρβοξυπεπτιδάσες απελευθερώνονται από ανενεργές πρόδρομες ενώσεις που βρίσκονται στο πάγκρεας. Η πιο μελετημένη καρβοξυπεπτιδάση είναι η καρβοξυπεπτιδάση Α. Ο βιολογικός ρόλος της καρβοξυπεπτιδάσης είναι η λύση του C- τελικού πεπτιδικού δεσμού πρωτεϊνών, πολυπεπτιδίων και Ν-ακυλο-αμινοξέων, όταν η παράπλευρη αλυσίδα του C- άκρου είναι αρωματική ή διακλαδισμένη αλειφατική με L- διαμόρφωση. Το ένζυμο εμφανίζει και δράση εστεράσης. 22

31 2.2.3 Θερμολυσίνη Η θερμολυσίνη καταλύει την υδρόλυση πεπτιδικών δεσμών που περιέχουν υδρόφοβα αμινοξέα, όπως Leu, Ile, Val και Phe. Η θερμολυσίνη είναι μια ενδοπεπτιδάση του ψευδαργύρου με ΜΒ και περιέχει 1 ιόν Zn 2+ και 4 ιόντα Ca 2+, τα οποία προσφέρουν στο ένζυμο θερμική σταθερότητα. Το περιβάλλον γύρω από τον ψευδάργυρο είναι παρόμοιο με αυτό της καρβοξυπεπτιδάσης Αλκοολική αφυδρογονάση Οι αλκοολικές αφυδρογονάσες είναι ένζυμα, των οποίων η δράση εξαρτάται από την ύπαρξη του νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδίου NAD(H) και καταλύουν την αντιστρεπτή οξείδωση των πρωτοταγών αλκοολών προς αλδεΰδες ή κετόνες, αντίστοιχα, παράλληλα με την αναγωγή του ΝAD + προς NADH. Οι αλκοολικές αφυδρογονάσες είναι διμερή με ΜΒ και αποτελούνται από δύο όμοιες υπομονάδες που καθεμιά περιέχει από δύο άτομα Zn και ένα μόριο NAD(H). Υπάρχουν δύο διαφορετικά άτομα Zn, από τα οποία το ένα είναι απαραίτητο για την κατάλυση, ενώ η δράση του άλλου είναι κυρίως δομική α-αμυλάση Η α-αμυλάση είναι ένζυμο που καταλύει την υδρόλυση των πολυσακχαριτών, όπως το άμυλο και το γλυκογόνο, προς γλυκόζη και μαλτόζη. Είναι ένα ένζυμο όπου το ιόν ψευδαργύρου έχει μόνο δομικό ρόλο. Το ένζυμο περιέχει επίσης Ca 2+ που είναι απαραίτητο για την καταλυτική δράση. Η α-αμυλάση που απομονώθηκε από το μικροοργανισμό Bacillus subtilis περιέχει ψευδάργυρο, ο οποίος πιστεύεται ότι ενώνει δυο μονοπυρηνικά σύμπλοκα Σουπεροξειδική δισμουτάση Cu-Zn Η σουπεροξειδική δισμουτάση είναι ένα αρκετά διαδεδομένο ένζυμο στη φύση, που καταλύει τη διάσπαση του σουπεροξειδικού ιόντος. Οι αερόβιοι οργανισμοί περιέχουν μεγάλες ποσότητες σουπεροξειδικής δισμουτάσης. Η προστασία των κυττάρων από τα τοξικά παραπροϊόντα του Ο 2 της αναπνοής ολοκληρώνεται από το ένζυμο καταλάση, η οποία καταλύει τη διάσπαση του 23

32 Η 2 Ο 2. Το υπεροξείδιο διασπάται ακαριαία, αλλά η καταλυτική δράση της σουπεροξειδικής δισμουτάσης είναι σημαντική επιταχύνοντας τη διάσπαση κατά δέκα φορές. Η σουπεροξειδική δισμουτάση που απομονώθηκε από ευκαρυωτικούς οργανισμούς περιέχει χαλκό και ψευδάργυρο, ενώ αυτή που προέρχεται από άλλες πηγές περιέχει σίδηρο ή μαγγάνιο. Τα δύο είδη έχουν στενή σχέση όπως προκύπτει και από την ομοιότητα των αλληλουχιών των αμινοξέων Η DNA- και RNA- πολυμεράση Η DNA- και RNA- πολυμεράση είναι από τα πιο αντιπροσωπευτικά ένζυμα που περιέχουν Zn. Όπως όλες οι πολυμεράσες νουκλεϊκών οξέων, καταλύουν την αντίδραση της αύξησης της αλυσίδας του DNA και του RNA, αντίστοιχα. Ο ρόλος του ψευδαργύρου στις πολυμεράσες είναι κυρίως καταλυτικός και είναι ανάλογος με αυτόν που έχει προταθεί για την καρβονική ανυδράση. Ο ψευδάργυρος συναρμόζεται στο τελικό 3 -ΟΗ διευκολύνοντας την αποπρωτονίωσή του και προετοιμάζει το έδαφος για την πυρηνόφιλη προσβολή από την α-φωσφορική ομάδα του εισερχόμενου νουκλεοτιδίου. 2.3 Σύμπλοκες ενώσεις του Ζn με βιολογική δράση Ενώσεις του ψευδαργύρου (όπως το ZnO) έχουν βρει εφαρμογή ως αντιμυκητιακά μέσα και περιέχονται στη δερματική αλοιφή με την εμπορική ονομασία Calamine. Ψευδάργυρος με τη μορφή του σκευάσματος Baby Zinc χορηγείται σε παιδιά που υποφέρουν από θανατηφόρα διάρροια σε χώρες της Ασίας και της Αφρικής με αποτέλεσμα να παρατηρηθεί ελάττωση της παιδικής θνησιμότητας [65]. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί αρκετές σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου που παρουσιάζουν βιολογική δράση. Συγκεκριμένα, έχουν χαρακτηρισθεί σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου με φάρμακα με πιθανή δράση κατά της υπερουραιμίας, για την επούλωση τοπικών εγκαυμάτων, για την καταπολέμηση της νόσου Alzheimer καθώς και άλλες που παρουσιάζουν αντιβακτηριδιακή, αντιδιαβητική, αντικαρκινική, αντιμικροβιακή, αντιπολλαπλασιαστική, αντισπασμωδική και αντιφλεγμονώδη δράση [66,67]. 24

33 2.3.1 Σύμπλοκες ενώσεις του Ζn με φάρμακα Οι κινολόνες (quinolonecarboxylic acids ή 4-quinolones), μια ομάδα συνθετικών αντιβακτηριδιακών παραγόντων που περιέχουν ένα σκελετό από 4-oxo-1,4- dihydroquinoline, χρησιμοποιούνται ευρέως στη θεραπεία πολλών μολύνσεων. Ο κύριος στόχος είναι οι γυράσες (τοποϊσομεράσες ΙΙ) και η τοποϊσομεράση IV, ένζυμα που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA. Μερικές από τις βιολογικές ιδιότητες που μελετώνται είναι η αντίδραση των κινολονών με το DNA, η αντιβακτηριδιακή δράση σε διάφορους μικροοργανισμούς, η κυτταροτοξικότητα και η ενδεχόμενη αντικαρκινική δράση. Σε πολλές περιπτώσεις τα σύμπλοκα των μετάλλων με τα φάρμακα είναι πιο δραστικά από το ελεύθερο φάρμακο. Μερικά σύμπλοκα που συντέθηκαν με σκοπό να μελετηθεί η βιολογική τους δράση είναι τα Zn(oxo)(phen)Cl] MeOH, [Zn(flmq)(phen)Cl] 0.5MeOH, [Zn(erx)- (phen)cl], [Zn(erx)(bipy)Cl], [Zn(flmq) 2 (phen)] 2MeOH [Zn(oxo) 2 (bipy)], [Zn(oxo) 2 - (H 2 O) 2 ], [Zn(oxo)(bipy)Cl] MeOH και [Zn(oxo) 2 (phen)] 2MeOH. Το οxolinic acid (Hoxo) και το flumequine, (Hflmq), είναι πρώτης γενιάς κινολόνες και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος και στη φαρμακευτική κτηνιατρική για τη θεραπεία ασθενειών των ζώων που προκαλούνται από μεγάλη ποικιλία Gram-αρνητικών βακτηρίων. Το enrofloxacin (Herx) ανήκει στις κινολόνες δεύτερης γενιάς και έχει ένα ευρύ φάσμα δράσεων έναντι πολλών Gram- αρνητικών και Gram-θετικών βακτηρίων. Το enrofloxacin είναι η πρώτη φθοροκινολίνη που χρησιμοποιήθηκε σε εφαρμογές της κτηνιατρικής και κυρίως για τη θεραπεία λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος, του αναπνευστικού συστήματος και δερματικές μολύνσεις στα κατοικίδια αλλά και στα ζώα φάρμας [68]. (Α) (Β) Σχήμα 26. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(oxo)(bipy)Cl] MeOH και (Β) [Zn(oxo) 2 (phen) ] 2MeOH 25

34 Ακόμα, έχουν συντεθεί ενώσεις του ψευδαργύρου με το μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες φάρμακο mefenamic acid παρουσία ή απουσία ορισμένων άζωτοδοτών (2,2 -bipyridine(=bipy), 2,2 -bipyridylamine (=bipyam), 1,10-phenanthroline (=phen), η 2,2 -dipyridylketone oxime (=Hpko)) [Zn(mef-O) 2 (H 2 O) 4 ] (1), [Zn(mef- O,O ) 2 (bipy)] (2), [Zn(mef-O, O ) 2 (bipyam)] (3), [Zn(mef-O) 2 (Hpko-N,N ) 2 ] EtOH (4) και [Zn(mef-O)(mef-O,O )(phen)(h 2 O)] (5). Πρόκειται για μονοπυρηνικά σύμπλοκα του ψευδαργύρου και η δομή έχει χαρακτηριστεί στα σύμπλοκα 2,4 και 5 όπου το σύμπλοκο 2 έχει μια παραμορφωμένη τριγωνική πρισματική γεωμετρία ενώ τα 4 και 5 παραμορφωμένη οκταεδρική. To mefenamic acid ανήκει στα μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ΜΣΑΦ), τα οποία παρουσιάζουν αναλγητικά, αντιφλεγμονώδη και αντιπυρετικά φάρμακα με γνωστές (κυρίως γαστρεντερικές (π.χ. γαστρικό έλκος, ναυτία, διάρροια, δυσπεψία) και νεφρικές (π.χ. υπέρταση και σε σπάνιες περιπτώσεις διάμεση νεφρίτιδα, οξεία νεφρική ανεπάρκεια)) παρενέργειες. Tο mefenamic acid (=Hmef) ανήκει στα ΜΣΑΦ στην κατηγορία των φαινυλανθρανιλικών οξέων, έχει αναλγητικές ιδιότητες και μοιάζει χημικά με τα tolfenamic και flufenamic acids. Οι παρενέργειες του είναι πονοκέφαλος, εμετοί και νευρικότητα. Το mefenamic acid κυκλοφορεί με την εμπορική ονομασία Ponstan [69]. (Α) (Β) (Γ) Σχήμα 27. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(mef-O,O ) 2 (bipy)], (Β) [Zn(mef-O) 2 (Hpko-N,N ) 2 ] EtOH και (Γ) [Zn(mef-O)(mef-O,O )(phen)(h 2 O)] Σύμπλοκες ενώσεις του ψευδαργύρου με πιθανή αντικαρκινική δράση Τα σύμπλοκα [Zn(AcPipPheF) 2 ] και [Zn(OAc)(AcPipPheF)] 2 έχουν μελετηθεί ως προς την αντιπολλαπλασιαστική τους δράση έναντι των καρκινικών σειρών Hela, των 26

35 κυττάρων χρόνιας μυελογενούς λευκαιμίας στον άνθρωπο K562 και των καρκινικών κυττάρων του μαστού στον άνθρωπο MDA-MB-361 και MDA-MB-453. Το πρώτο σύμπλοκο του ψευδαργύρου είναι μονοπυρηνικό και έχει παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία (Σχήμα 28). Το δεύτερο είναι διπυρηνικό όπου ο Zn(1) έχει παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία ενώ η γεωμετρία του Zn(2) μπορεί να περιγραφεί ως παραμορφωμένη τετράγωνη πυραμιδική (Σχήμα 28). Οι βιολογικές μελέτες έδειξαν ότι οι ενώσεις εμφανίζουν ενδεχόμενη αντικαρκινική δράση. Η αντιπολλαπλασιαστική δράση των συμπλόκων αυτών βρέθηκε ό,τι είναι μεγαλύτερη από ότι του cis-platin. Η τιμή IC 50 ποικίλει από 26 ως 90 nm, έναντι όλων των μελετημένων κυτταρικών σειρών, ενώ για τη cis-platin η τιμή IC 50 κυμαίνεται από 2 ως 17 nm και για τα άλατα ψευδαργύρου, ZnCl 2, η IC 50 είναι από 81 ως 93 nm. Το δεύτερο σύμπλοκο παρουσιάζει μεγαλύτερη δράση έναντι όλων των καρκινικών κυτταρικών σειρών και τη μεγαλύτερη επιλεκτικότητα έναντι K562 και MDA-MB-453 καρκινικών σειρών [70]. (Α) (Β) Σχήμα 28. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(AcPipPheF) 2 ] και [Zn(OAc)(AcPipPheF)] 2. (Β) Το μονοπυρηνικό σύμπλοκο [Ζn(atdz)(DCA)(H 2 O) 2 ] 2H 2 O, (atdz = 2-amino- 1,3,4-thiadiazole, C 2 H 3 N 3 S; DCA = demethylcantharate, 7-oxabicyclo[2,2,1]heptane-2,3- dicarboxylate, C 8 H 8 O 5 ) έχει οκταεδρική γεωμετρία (Σχήμα 29). Από μελέτες βρέθηκε ότι εμφανίζει μέτρια αντιπολλαπλασιαστική ικανότητα έναντι των καρκινικών κυτταρικών του ηπατώματος (SMMC7721) και των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του στήθους (MCF-7) [71]. 27

36 Σχήμα 29. Κρυσταλλική δομή του [Ζn(atdz)(DCA)(H 2 O) 2 ] 2H 2 O Στα σύμπλοκα του ψευδαργύρου [Zn(L 3 ) 2 DMF] και [Zn(L 5 ) 2 DMF] όπου HL 3 = 2- benzoylpyridine thiosemicarbazone και HL 5 = 2-benzoy-lpyridine N(4)-phenylthiosemicarbazone έχει επίσης μελετηθεί η αντικαρκινική δράση τους. Οι ετεροκυκλικές θειοσεμικαρβαζόνες και τα σύμπλοκα τους με μεταβατικά μέταλλα έχουν μελετηθεί εκτενώς λόγω της χημείας συναρμογής τους και των πολλών φαρμακευτικών τους ιδιοτήτων, όπως η αντιπαρασιτική, η αντιβακτηριδιακή και αντικαρκινική τους δράση. Οι in vitro έρευνες έδειξαν ότι και τα δυο σύμπλοκα παρουσιάζουν σημαντική αντικαρκινική δράση έναντι των καρκινικών κυτταρικών σειρών K562 [72]. Το [Zn(meclo) 2 (H 2 O) 2 ] είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του ψευδαργύρου που φέρει ως ligand το meclofenamic acid (N-(2,6-dichloro-m-tolyl)anthranilic acid), Hmeclo. Το meclofenamic acid είναι ένα ΜΣΑΦ, ανήκει στα φεναμικά παράγωγα με αξιοσημείωτες αναλγητικές ιδιότητες και χρησιμοποιείται στη θεραπεία της οστεοαρθρίτιδας, της ρευματοειδούς αρθρί-τιδας και άλλων επώδυνων μυοσκελετικών ασθενειών. Το meclofenamic acid και το σύμπλοκο του ψευδαργύρου έχουν μελετηθεί ως προς την αντιπολ-λαπλασιαστική τους δραστηριότητα in vitro έναντι των κυττάρων τριών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών, του MCF-7 (καρκινική σειρά κυττάρων του στήθους), T24 (καρκινικών κυττάρων της ουροδόχου κύστης), και A-549 (κυττάρων του πνευμονικού καρκινώματος) καθώς και της κυτταρικής σειράς του ποντικιού L-929. Το σύμπλοκο αυτό παρουσιάζει μεγάλη εκλεκτικότητα έναντι της σειράς T-24 [73]. Παρασκευάστηκαν τα σύμπλοκα [Zn(DMDT) 2 ], [Zn(PyDT) 2 ], [Zn(RSDT) 2 ], [Zn(MSDT) 2 ] 2 (Σχήμα 30), [Zn(ESDT) 2 ] και [Zn(TSDT) 2 ] ( dimethyl-(dmdt), pyrrolidine- (PyDT), methyl- (MSDT), ethyl- (ESDT) και tert-butyl- (TSDT) 28

37 sarcosinedithiocarbamate) και προσδιορίστηκε in vitro η κυτταροτοξικότητά τους και η καρκινική τους δράση έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Τα σύμπλοκα επιδρούν στον προγραμματισμό του κυτταρικού κύκλου διαφορετικά συγκριτικά με την cisplatin, υποδεικνύοντας ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης. Τόσο η cisplatin όσο και το [Zn(DMDT) 2 ] είναι πιο δραστικά στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών απ ό,τι στα καρκινικά κύτταρα του αυχένα. Ωστόσο, τα σύμπλοκα παρουσιάζουν ίδια δράση έναντι των καρκινικών σειρών που δεν καταπολεμούνται από τη cisplatin [74]. Σχήμα 30. Κρυσταλλική δομή του [Zn(MSDT) 2 ] 2. Το σύμπλοκο [Zn 2 (L 1 ) 2 (ClO 4 ) 2 ] είναι διπυρηνικό και έχει πενταγωνική διπυραμιδική γεωμετρία ενώ το [Zn(L 2 ) 2 ] είναι μονοπυρηνικό και έχει οκταεδρική γεωμετρία (2-benzoylpyridine S-methyldithiocarbazate = HL 1 και 2-benzoylpyridine S- phenyldithiocarbazate = HL 2 ). Τα δύο αυτά σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς τη δράση του έναντι βακτηρίων, μυκητών και κυτταρικών σειρών in vitro Κ562. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι διαφορετικά υποκαταστημένες ομάδες προσδένονται στα dithiocarbazate και στα μέταλλα και έδειξαν διακριτές διαφορές στη βιολογική δράση. Τα σύμπλοκα αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να γίνει διάκριση των καρκινικών κυττάρων της λευχαιμίας K562 από τη φυσιολογική ηπατική κυτταρική σειρά QSG7701 [75]. Ένα ακόμα σύμπλοκο που έχει μελετηθεί ως προς την αντικαρκινική του δράση είναι το [Zn(L) 2 ] 2 H 2 O όπου HL = 2-acetylpyrazine N(4)-phenylthiosemicarbazone (Σχήμα 31). Είναι ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του ψευδαργύρου με οκταεδρική γεωμετρία. Τόσο το ligand όσο και το σύμπλοκο παρουσιάζουν βιολογική δράση και συγκεκριμένα το HL με δείκτη MIC = 3.90 μg/ml έναντι του Pseudomonas aeruginosa, και το σύμπλοκο με IC 50 = 1.0 μm κατά των λευχαιμικών σειρών K562 [76]. 29

38 Σχήμα 31. Κρυσταλλική δομή του [Zn(L) 2 ] 2 H 2 O Επίσης, τα σύμπλοκα [Zn 2 (ClQ) 4 (CH 3 OH) 2 ] (1), [Zn(BrQ) 2 (H 2 O) 2 ] (2) και [Zn 2 (ClIQ) 4 ] (3) (H-ClQ = 5,7-dichloro-8-hydroxylquinoline, H-BrQ = 5,7-dibromo-8- hydroxylquinoline και H-ClIQ = 5-chloro-7-iodo-8- hydroxylquinoline) παρασκευάστηκαν και μελετήθηκε η βιολογική τους δράση. Τα σύμπλοκα παρουσίασαν σημαντική κυτταροτοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων BEL-7404, SK-OV-3, NCI-H460, και των φυσιολογικών κυττάρων HL-7702 in vitro, με τιμές IC 50 να κυμαίνονται από 1.4 nm μέχρι mm. Όλα τα σύμπλοκα σημαντικά αυξημένη κυτταροτοξικότητα έναντι της κυτταρικής σειράς BEL-7404 συγκριτικά με το ελεύθερο ligand 5,7-dihalo-8- quinolinol [77]. (Α) (Β) (Γ) Σχήμα 32. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn 2 (ClQ) 4 (CH 3 OH) 2 ], (Β) [Zn(BrQ) 2 (H 2 O) 2 ] και (Γ) [Zn 2 (ClIQ) 4 ] 30

39 2.3.3 Σύμπλοκα του ψευδαργύρου με ενδεχόμενη αντιβακτηριδιακή δράση To σύμπλοκο [Zn(MOX)(HIm)Cl 2H 2 O] (όπου MOX = moxifloxacin, μια κινολόνη τέταρτης γενιάς, HIm = imidazole) παρασκευάστηκε και μελετήθηκε η αντιβακτηριδιακή του δράση έναντι δυο βακτηριδιακών σειρών που ονομάζονται Staphylococcus aureus (S. aureus) και Escherichia coli (E. coli) και βρέθηκε ότι έχει ικανοποιητική δράση [78]. Ένα ακόμα σύμπλοκο που παρασκευάστηκε με αυτό το σκοπό είναι το μονοπυρηνικό σύμπλοκο [Zn(Mon) 2 (H 2 O) 2 ] H 2 O 4.5MeCN με οκταεδρική γεωμετρία, όπου mon είναι το πολυαιθερικό ιονοφόρο αντιβιοτικό monensin (monensic acid, MonH). Η αντιβακτηριδιακή δράση του ligand και του συμπλόκου μελετήθηκαν έναντι των μικροοργανισμών Bacillus subtillis (ATCC 6633), Bacillus mycoides spp. και Sarcina lutea FDA σειρά PCI 1000 (ATCC 10054) και αποδείχθηκε ότι η δράση του ligand επηρεάζεται από την παρουσία του μετάλλου και πρέπει να λαμβάνεται υπόψη στις βιολογικές μελέτες [79]. Σχήμα 33. Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Zn(Mon) 2 (H 2 O) 2 ] H 2 O 4.5MeCN. Οι φθοροκινολόνες αποτελούν μια σημαντική ομάδα των χημειοθε-ραπευτικών ενώσεων, που παρουσιάζουν ισχυρή αντιβακτηριδιακή δράση. Μια αντιπροσωπευτική ένωση της ομάδας αυτής είναι το ciprofloxacin (Cip), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στις κλινικές μελέτες ως αντιμικροβιακός παράγοντας. Έξι διπυρηνικά σύμπλοκα του Zn(II) με το ciprofloxacin και ουδέτερα διδραστικά ligands, όπως το [Zn 2 (Cip) 2 (mtma) 2 (pip)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O (Σχήμα 34), παρασκευάστηκαν, μελετήθηκε η βακτηριοστατική τους δράση και προέκυψε ότι όλα τα σύμπλοκα ήταν πιο δραστικά από 31

40 τα άλατα των μετάλλων και τις βάσεις του Schiff. Επίσης, βρέθηκε ότι όλα τα σύμπλοκα είναι πιο δραστικά από τα γνωστά φάρμακα έναντι των μικροοργανισμών S. aureus και B. subtilis. Για τους μικροοργανισμούς S.marcescens, το σύμπλοκο [Zn 2 (Cip) 2 (apq) 2- (pip)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O και για το P. aeruginosa, το σύμπλοκο [Zn 2 (Cip) 2 (dcnd) 2- (pip)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O είναι πιο δραστικά απ τα γνωστά φάρμακα. Ακόμα, όλα τα σύμπλοκα είναι πιο δραστικά έναντι του Staphylococcus aureus MTCC 1430 και Bacillus subtilis MTCC 121 συγκριτικά με τα ήδη φάρμακα. Στην περίπτωση του Serratia marcescens MTCC 86 το σύμπλοκο III είναι δραστικότερο έναντι όλων των φαρμάκων, ενώ για το Pseudomonas aeruginosa MTCC 1688 το σύμπλοκο VI σε σχέση με τα γνωστά φάρμακα με εξαίρεση το gatifloxacin. Τέλος, όσον αφορά την Escherichia coli MTCC 443 τα σύμπλοκα [Zn 2 (Cip) 2 (mtma) 2 (dpeda)-(h 2 O) 2 ] 3H 2 O, [Zn 2 (Cip) 2 (apq) 2- (dpeda)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O,[Zn 2 (Cip) 2 (dcnd) 2 (dpeda)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O και [Zn 2 (Cip) 2 (apq) 2- (dpeda)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O παρουσίασαν καλύτερη δράση συγκριτικά με τα gatifloxacin, norfloxacin και pefloxacin [80]. Σχήμα 34. Κρυσταλλική δομή του [Zn 2 (Cip) 2 (mtma) 2 (pip)(h 2 O) 2 ] 3H 2 O Μερικά ακόμα σύμπλοκα στα οποία εξετάσθηκε η αντιβακτηριδιακή τους δράση είναι τα [Zn(O 2 CMe) 2 (ampaoh) 2 ] (1), [Zn(O 2 CPh) 2 (ampaoh) 2 ] (2), [Zn(dapdoH 2 ) 2 ] (NO 3 ) 2 (3) και [Zn(dampdoH 2 ) 2 ] (NO 3 ) 2 (4) όπου pyridine-2-amidoxime (ampaoh), 2,6- diacetylpyridine dioxime (dapdoh 2 ) και pyridine-2,6-diamidoxime (dampdoh 2 ) (Σχήμα 35). Πρόκειται για μονοπυρηνικά σύμπλοκα του ψευδαργύρου, στα οποία τα ligands ανήκουν στην κατηγορία των πυριδυλοξιμών που είναι ενώσεις με μεγάλη βιολογική σημασία, όπως δραστηριότητα στα καρδιοαγγειακά συστήματα, ως ηρεμιστικά, αγχολυτικά και αντισπασμωδικά, αναλγητική και αντιφλεγμονώδη δράση. 32

41 Η αντιβακτηριδιακή δράση των ligands και των συμπλόκων εξετάστηκε έναντι των E. coli, Z. mobilis και C. glutamicum. Σύμφωνα με τις τιμές MIC, τα ελεύθερα ligands ampaoh 2 και dampdoh 2 και τα αντίστοιχα σύμπλοκά τους 1, 2 και 4 δεν παρεμποδίζουν την ανάπτυξη των εξεταζόμενων βακτηρίων. Το βακτήριο C. glutamicum έδειξε μια μικρή μείωση του μεγέθους του παρουσία των ενώσεων 1 και 2 σε συγκέντρωση 200μΜ. Τέλος, τα σύμπλοκα 3 παρεμποδίζει την ανάπτυξη του Ζ. mobilis και ελαφρώς των E. Coli και του C. glutamicum, αλλά αυτή η παρεμπόδιση πλησιάζει την αντίστοιχη που προκαλείται από τα ελεύθερα ligands [81]. (A) (B) Σχήμα 35. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(dapdoH 2 ) 2 ] (NO 3 ) 2 και (Β) [Zn(dampdoH 2 ) 2 ] (NO 3 ) 2. Τέλος, μια ακόμα ένωση που συντέθηκε με σκοπό να διερευνηθεί η αντιβακτηριδιακή της δράση είναι το σύμπλοκο [ZnCl 2 (HATtsc)] CH 3 CN. Πρόκειται για ένα μονοπυρηνικό σύμπλοκο του ψευδαργύρου με τη γεωμετρία συναρμογής γύρω από το μέταλλο να περιγράφεται ως ενδιάμεση μεταξύ τετραγωνική πυραμιδική και τριγωνική διπυραμιδική. Το ligand 2-acetyl-2-thiazoline thiosemicarbazone (HATtsc) ανήκει στις θειαζολίνες/θειοσεμικαρβαζόνες που είναι παρούσες σε μεγάλο αριθμό φυσικών και συνθετικών προϊόντων, πολλά από τα οποία έχουν αντιβιοτική δράση, όπως τα micacocidin και το bacitracin A. Η αντιβακτηριδιακή δράση του συμπλόκου αυτού μελετήθηκε έναντι των μικροοργανισμών Staphylococcus pidermidis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis, Escherichia coli και Pseudomonas aeruginosa και βρέθηκε ότι είναι αρκετά δραστικό [82]. 33

42 Σχήμα 36. Κρυσταλλική δομή του [ZnCl 2 (HATtsc)] CH 3 CN Σύμπλοκα του ψευδαργύρου με ενδεχόμενη αντιμικροβιακή δράση (αντιβακτηριακή και αντιμυκητιακή) Έχουν παρασκευαστεί και μελετηθεί αρκετά σύμπλοκα του ψευδαργύρου όπως τα Zn(fpedtc) 2 ] (1), [Zn(fpedtc) 2 (py)] (2), [Zn(fpedtc) 2 (1,10-phen)] (3) και [Zn(fpedtc) 2 (2,2 -bipy)] (4) (όπου fpedtc = N-furfuryl-N-(2-phenylethyl)dithiocarbamate, py = pyridine, 1,10-phen = 1,10-phenanthroline και 2,2 -bipy =2,2 -bipyridine) (Σχήμα 36). Το ligand που χρησιμοποιήθηκε ανήκει στα διθειοκαρβαμιδικά και τόσο αυτό όσο και τα σύμπλοκά του έχουν χρησιμοποιηθεί ως αγροχημικά, κυρίως λόγω της μεγάλης τους ικανότητας να ελέγχουν τις μυκητιάσεις στα φυτά και την σχετικά μικρή τους τοξικότητα. Το αυχενικό καρκίνωμα είναι ασθένεια που κυρίως εκδηλώνεται σε γυναίκες σε όλο τον κόσμο με μεγάλα ποσοστό θνησιμότητας. Η ασθένεια αυτή αντιμετωπίζεται με τη cisplatin, η οποία όμως παρουσιάζει μεγάλη νεφροτοξικότητα. Τα διθειοκαρβαμιδικά χρησιμοποιού-νται λόγω της ικανότητας τους να δρουν ως παρεμποδιστές της προκαλούμενης από τη cisplatin νεφροτοξικότητας. Όλα τα σύμπλοκα που παρασκευάστηκαν είναι μονοπυρηνικά και μελετήθηκε η αντιβακτηριδιακή τους δράση τόσο σε Gram-αρνητικούς όσο και σε Gram-θετικούς μικροοργανισμούς και η αντιμυκητιακή δράση των συμπλόκων εξετάσθηκε έναντι των μυκητών M. gypseum, T. rubrum, E. floccosum και T. mentagrophyte και βρέθηκε ότι είναι ικανοποιητική. Επίσης, προσδιορίστηκε και η κυτταροτοξικότητά τους στις κυτταρικές σειρές HeLa. To σύμπλοκο 1 παρουσιάζει τη μέγιστη παρεμποδιστική δράση με συγκέντρωση 40 mg ml -1 στην κυτταρική σειρά HeLa [83]. 34

43 (Α) (Β) Σχήμα 37. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(fpedtc) 2 (py)] και (Β) [Zn(fpedtc) 2 (1,10-phen)] Επιπλέον, το [Zn(L-Tyr) 2 (bpy)] 2 3H 2 O CH 3 OH (1), όπου L-Tyr και bpy είναι η L- tyrosine και η 2,2 -διπυριδίνη (2,2 -bpy) αντίστοιχα, έχει εξετασθεί ως προς την αντιβακτηριδιακή του δράση (Σχήμα 38) όπως επίσης και οι ενώσεις [Zn(Im)(L- Tyr) 2 ] 2 5H 2 O (2) και {[Zn(L-Tyr) 2 (H 2 O)] H 2 O} n.η αντιβακτηριδιακή τους δράση μελετήθηκε έναντι ορισμένων βακτηριδιακών σειρών, όπως τα Gram-αρνητικά E.coli, P.fluorescens, S. marcescens και το Gram-θετικό βακτήριο Bac. subtilis ενώ η αντιμυκητιακή τους δράση έναντι των μυκήτων των φυτών F. solani και P. verrucosum και του μύκητα των ζώων A. flavus. Απ όλες τις ενώσεις που μελετήθηκαν βρέθηκε ότι μόνο το άλας του Zn(II) παρεμποδίζει την ανάπτυξη των μυκήτων. Οι βιολογικές μελέτες των τριών zinc(ii) συμπλόκων έδωσαν πολύ καλά αποτελέσματα στην περίπτωση του συμπλόκου (2), το οποίο παρεμποδίζει ισχυρά την αύξηση του βακτηρίου B. subtilis. Η αύξηση της βιολογικής δράσης των συμπλόκων 1 3 βρέθηκε ότι εξαρτάται από την ύπαρξη του δευτεροταγούς ligand με αυτή τη σειρά των δευτεροταγούς ligands : imidazole>h 2 O>2,2 -bpy [84]. Σχήμα 38. Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Zn(L-Tyr) 2 (bpy)] 2 3H 2 O CH 3 OH (1). 35

44 Επιπλέον, τα σύμπλοκα [Zn(L 1 )OAc], [Zn(L 1 ) 2 2H 2 O], [Zn(L 2 )OAc], [Zn(L 2 ) 2 2H 2 O] καθώς και τα ligands HL 1 = 4-[(1,3-Diphenyl-1H-pyrazol-4- ylmethylene)-amino]-5-mercapto-1,2,4-triazole], και HL 2 = 4-[(1,3-Diphenyl-1Hpyrazol-4-ylmethylene)-amino]-5-mercapto-3-methyl-4H-1,2,4-triazole έχουν διερευνηθεί ως προς την αντιβακτηριδιακή τους δράση έναντι Gram-θετικών (S. aureus, B. subtilis) και Gram-αρνητικών (E. coli, P. aeruginosa) βακτηρίων καθώς και την αντιμυκητιακή έναντι Asp.niger και Asp.flavus. Οι μελέτες αντιμικροβιακής δράσης υποδεικνύουν ότι οι βάσεις Schiff είναι βιολογικά ενεργές ενώσεις και τα σύμπλοκά τους έχουν καλύτερη δράση έναντι των βακτηρίων και μυκήτων που μελετήθηκαν σε σχέση με τα ελεύθερα ligands [85]. To σύμπλοκο [Zn(phen)(Tz)Cl 2 H 2 O], όπου phen = 1,10-phenan-throline και Tz = 1,2,4-triazole μελετήθηκε για την αντιβακτηριδιακή του δράση in vitro κατά των Gram-θετικών Bac.subtilis [MTCC 121], Stap.aureus [NRRLB 767] και Gramαρνητικών E.coli [K 12], Ps.aeruginosa, Pantoea dispersa και για την in vitro αντιμυκητιακή του δράση έναντι των Asp.niger, Rhizopus sp., Fusarium oxysporum, Penicillium notatum και βρέθηκε ότι παρουσιάζει διάφορους βαθμούς παρεμπόδισης της ανάπτυξης των βακτηρίων και των μυκήτων [86]. Τέλος, τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα του ψευδαργύρου [Zn(Metu) 2 Cl 2 ], Zn(Tmtu) 2 Cl 2 ], [Zn(Diaz) 2 Cl 2 ], [Zn(Dmtu) 2 Cl 2 ] και [Ζn(Detu) 2 Cl 2 ] αποτέλεσαν αντικείμενο μελέτης ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση. Τα ligands που χρησιμοποιήθηκαν ανήκουν στις θειόνες και είναι τα N-methylthiourea (Metu), N,N dimethylthiourea (Dmtu), tetramethylthiourea (Tmtu), N,N -diethylthiourea (Detu) και diazinane-2-thione (Diaz). Οι θειόνες έχουν θέσεις σύνδεσης που μοιάζουν με αυτές που απαντώνται στα βιολογικά συστήματα και γι αυτό αποτελούν αντικείμενο μελέτης τόσο αυτές όσο και οι σύμπλοκες ενώσεις τους. Οι αντιμικροβιακές μελέτες έγιναν με τον προσδιορισμό της ελάχιστης συγκέντρωσης παρεμπόδισης και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα σύμπλοκα παρουσιάζουν σημαντική δράση κατά των gram-αρνητικών βακτηρίων (E.coli, Ps.aeruginosa) και των ζυμών (Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae). Ωστόσο, μέτρια δράση παρατηρήθηκε έναντι των ειδών μούχλας Asp.niger και Penicillium citrinum. Τα σύμπλοκα μελετήθηκαν και για τη δυνατότητα παρεμπόδιση της δράσης του ενζύμου Alkaline Phosphatase EC και βρέθηκε ότι είναι ενεργό [87]. 36

45 (A) (B) Σχήμα 39. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Zn(Tmtu) 2 Cl 2 ] και (Β) [Zn(Diaz) 2 Cl 2 ]. 37

46 3. Φθορισμομετρία και εφαρμογές Τα τελευταία 20 χρόνια έχει παρατηρηθεί αύξηση της χρήσης της φασματοσκοπίας φθορισμού στις βιολογικές επιστήμες. Η φασματοσκοπία φθορισμού και ο φθορισμός συναρτήσει του χρόνου (time resolved), θεωρούνται πρώτιστα ερευνητικά εργαλεία στη βιοχημεία και τη βιοφυσική και η χρήση τους έχει επεκταθεί. Στις μέρες μας, ο φθορισμός είναι μια φασματοσκοπία που χρησιμοποιείται εκτενώς στη βιοτεχνολογία, στη διαγνωστική ιατρική, την κυτταρομετρία ροής, την ιατροδικαστική και τη γενετική ανάλυση. Η φθορισμομετρία είναι ευαίσθητη τεχνική, και δεν είναι αναγκαία στις βιοχημικές μετρήσεις η χρήση ακριβών και δύσκολων τεχνικών που περιλαμβάνουν ραδιενεργούς ανιχνευτές. Έχει παρατηρηθεί σημαντική αύξηση στη χρήση του φθορισμού για την απεικόνιση των κυττάρων και των μορίων. Η τεχνολογία της φθορισμομετρίας χρησιμοποιείται με πολλούς τρόπους από τους επιστήμονες. 3.1 Φαινόμενα φθορισμού Η φασματοφωτομετρία είναι η εκπομπή φωτός (luminescence) από οποιοδήποτε υπόστρωμα και λαμβάνει χώρα από ηλεκτρονικά διεγερμένες καταστάσεις. Η φασματοφωμετρία αυτή χωρίζεται σε δύο κατηγορίες, την φθορισμομετρία και τη φωσφορομετρία, ανάλογα με τη φύση της διεγερμένης κατάστασης. Στις διεγερμένες μονές καταστάσεις, το ηλεκτρόνιο στο διεγερμένο τροχιακό είναι συζευγμένο με ένα δεύτερο ηλεκτρόνιο (αντίθετου σπιν) στο βασικό τροχιακό. Συνεπώς, η επιστροφή στη θεμελιώδη κατάσταση είναι επιτρεπτή λόγω σπιν και συμβαίνει γρήγορα με εκπομπή ενός φωτονίου. O ρυθμός εκπομπής του φθορισμού είναι συνήθως 10 8 s -1, κι επομένως ο τυπικός μέσος όρος ζωής είναι περίπου 10ns (10x 10-9 s). O χρόνος ζωής φθορισμού (τ) μιας φθορίζουσας ουσίας είναι ο μέσος χρόνος μεταξύ της διέγερσης και της επιστροφής στη θεμελιώδη κατάσταση. Είναι χρήσιμο να εξεταστεί το 1 ns συγκριτικά με την ταχύτητα του φωτός. Το φως ταξιδεύει 30 cm σε 1 νανοδευτερόλεπτο. Πολλές φθορίζουσες ουσίες έχουν μικρότερο χρόνο ζωής από ένα νανοδευτερόλεπτο. Εξαιτίας του μικρού χρόνου ζωής του φθορισμού, μετρήσεις της εκπομπής συναρτήσει του χρόνου απαιτούν περίπλοκες τεχνικές οπτικής και ηλεκτρονικής. Παρά την προστιθέμενη πολυπλοκότητα, η φθορισμομετρία συναρτήσει του χρόνου χρησιμοποιείται ευρέως εξαιτίας των αυξανόμενων διαθέσιμων πληροφοριών από τα δεδομένα, συγκρινόμενη με 38

47 τις στατικές μετρήσεις. Επίσης, η πρόοδος στην τεχνολογία έχει κάνει τις μετρήσεις συναρτήσει του χρόνου ευκολότερες, ακόμα και όταν χρησιμοποιούνται μικροσκόπια. Η φωσφορομετρία είναι η εκπομπή φωτός από τριπλά διεγερμένες καταστάσεις, στις οποίες το ηλεκτρόνιο στο διεγερμένο τροχιακό έχει τον ίδιο προσανατολισμό με το ηλεκτρόνιο της βασικής κατάστασης. Οι μεταπτώσεις στη βασική κατάσταση είναι απαγορευμένες και ο ρυθμός εκπομπής είναι μικρός ( s -1 ), έτσι ο μέσος όρος ζωής του φωσφορισμού κυμαίνεται από μιλιδευτερόλεπτα (ms) ως δευτερόλεπτα. Είναι δυνατοί ακόμα μεγαλύτεροι χρόνοι ζωής, όπως φαίνεται από τα παιχνίδια που φωσφορίζουν. Μετά από έκθεση στο φως, οι ουσίες φωσφορίζουν για αρκετά λεπτά ενώ τα διεγερμένα ηλεκτρόνια επιστρέφουν στην βασική τους κατάσταση. Η φωσφορομετρία δεν είναι συνήθως ορατή σε ρευστά διαλύματα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό παρατηρείται επειδή υπάρχουν πολλές διαδικασίες απενεργοποίησης που ανταγωνίζονται την εκπομπή, όπως διαδικασίες απόσβεσης. Είναι αναγκαίο να αναφερθεί ότι οι διαφορές μεταξύ της φωσφορομετρίας και της φθορισμομετρίας δεν είναι πάντα ξεκάθαρες. Τα σύμπλοκα που περιέχουν μεταβατικά μέταλλα με έναν ή και περισσότερους οργανικούς υποκαταστάτες (transition metal-ligand complexes = MLCs) παρουσιάζουν μικτές μονέςτριπλές καταστάσεις. Τα MLCs παρουσιάζουν χρόνους ζωής μεταξύ εκατοντάδων νανοδευτερολέπτων και αρκετών μικροδευτερολέπτων. Οι αρωματικές ουσίες είναι αυτές που κυρίως εμφανίζουν το φαινόμενο του φθορισμού. Στο Σχήμα 40 παρουσιάζονται κάποιες τυπικές φθορίζουσες ουσίες (φθοροφόρα). Μια ουσία που μπορεί να χαρακτηριστεί ως φθοροφόρα είναι η κινίνη (quinine), που βρίσκεται σε τονωτικά νερά. Εάν παρατηρηθεί ένα μπουκάλι τονωτικό νερό που έχει εκτεθεί στο φως του ήλιου, μια ανοιχτή μπλε λάμψη θα παρατηρηθεί σταδιακά στην επιφάνεια. Αυτή η λάμψη είναι περισσότερο προφανής όταν το γυαλί παρατηρείται υπό την κατάλληλη γωνία ως προς τη διεύθυνση του φωτός και όταν η διηλεκτρική σταθερά ελαττώνεται προσθέτοντας λιγότερο πολικούς διαλύτες, όπως αλκοόλες. Η κινίνη στα τονωτικά νερά διεγείρεται από την υπεριώδη ακτινοβολία του φωτός και ως εκ τούτου επιστρέφοντας στη θεμελιώδη κατάσταση εκπέμπει μπλε φως στα 450nm. 39

48 Σχήμα 40. Οι δομές κάποιων τυπικών φθοριζουσών ουσιών. Στην καθημερινή ζωή, εκτός από την κινίνη, έχουν καταγραφεί πολλά φθοροφόρα. Η πράσινη ή πορτοκαλοκόκκινη λάμψη μερικές φορές είναι ορατή στα ψυκτικά λόγω της ύπαρξης ιχνών της φλουορεσκεΐνης (fluorescein) ή ροδαμίνης (rhodamine) (Σχήμα 40). Οι πολυπυρηνικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες, όπως τα ανθρακένια (anthracene) και τα περυλένια (perylene), μπορούν να καταταγούν στις φθορίζουσες ουσίες και η εκπομπή από αυτά τα είδη χρησιμοποιείται για τον περιβαλλοντικό έλεγχο της μόλυνσης του πετρελαίου. Επίσης, κάποιες υποκατεστημένες οργανικές ενώσεις είναι φθορίζουσες, όπως για παράδειγμα η 1,4-bis(5phenyloxazol-2- yl)benzene (POPOP) η οποία χρησιμοποιείται στα σπινθηρίσματα και το πορτοκαλί ακριδίνης (acridine orange) που χρησιμοποιείται για την επισήμανση του DNA. Η πυριδίνη 1 και η ροδαμίνη συχνά χρησιμοποιούνται στα laser βαφής (dye lasers). Σε αντίθεση με τα αρωματικά οργανικά μόρια, τα άτομα είναι γενικά μη φθορίζουσες ουσίες σε συμπυκνωμένες φάσεις. Μια αξιοσημείωτη εξαίρεση αποτελούν οι λανθανίδες. Ο φθορισμός των ιόντων Eu και Tb είναι αποτέλεσμα της μετάπτωσης ηλεκτρονίων μεταξύ των f τροχιακών. Αυτά τα τροχιακά είναι προστατευμένα από το διαλύτη από υψηλότερα συμπληρωμένα τροχιακά. Οι λανθανίδες εμφανίζουν μεγάλους 40

49 χρόνους απόσβεσης λόγω αυτής της μικρής προστασίας και τα μικρά ποσοστά εκπομπής λόγω του μικρού συντελεστή απόσβεσης. Τα φάσματα φθορισμού γενικά παρουσιάζονται ως φάσματα εκπομπής. Ένα φάσμα εκπομπής φθορισμού είναι ένα διάγραμμα της έντασης του φθορισμού προς το μήκος κύματος (νανόμετρα, nm) ή αριθμός κύματος (wavenumber, cm -1 ). Στο Σχήμα 41 παρουσιάζονται δυο τυπικά φάσματα εκπομπής φθορισμού. Τα φάσματα εκπομπής διαφέρουν αρκετά και εξαρτώνται από τη χημική δομή του φθοροφόρου και το διαλύτη στον οποίο είναι διαλυμένη η ουσία. Τα φάσματα μερικών ενώσεων, όπως του περυλενίου, εμφανίζουν σταθερή δομή λόγω των επιμέρους δονήσεων των ενεργειακών επιπέδων της βασικής και διεγερμένης κατάστασης. Άλλες ουσίες, όπως η κινίνη, έχουν φάσματα απαλλαγμένα από παλμική δομή. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της φθορισμομετρίας είναι η υψηλή ευαισθησία ανίχνευσης. Η ευαισθησία του φθορισμού χρησιμοποιήθηκε το 1877 για να αποδειχθεί ότι οι ποταμοί Δούναβης και Ρήνος επικοινωνούν μέσω υπόγειων ρευμάτων. Για να αποδειχθεί αυτή η σύνδεση προστέθηκε ορισμένη ποσότητα φλουορεσκεΐνης (Σχήμα 40) στα νερά του Δούναβη. Μετά από 60 ώρες ο χαρακτηριστικός πράσινος φθορισμός του φθοροφόρου εμφανίστηκε σε ένα μικρό ποτάμι που οδηγούσε στο Ρήνο. Στις μέρες μας, η φλουορεσκεΐνη εξακολουθεί να χρησιμοποιείται ως δείκτης κινδύνου για τον εντοπισμό αντικειμένων στην θάλασσα, όπως οι διαστημικές κάψουλες που προσγειώνονται στον Ατλαντικό Ωκεανό. Σχήμα 41. Φάσματα εκπομπής και απορρόφησης φθορισμού του περυλενίου και της θειϊκής κινίνης. 41

50 3.2 Απόσβεση του φθορισμού Η ένταση του φθορισμού μπορεί να ελαττωθεί από πολλές διαδικασίες. Αυτή η μείωση της έντασης ονομάζεται απόσβεση. Η απόσβεση μπορεί να συμβεί μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Η απόσβεση σύγκρουσης (collisional quenching) λαμβάνει χώρα όταν το διεγερμένο φθοροφόρο απενεργοποιείται όταν έρχεται σε επαφή με ένα άλλο μόριο σε διάλυμα το οποίο ονομάζεται αποσβέστης. Η μείωση της έντασης στην απόσβεση σύγκρουσης μπορεί να περιγραφεί από την εξίσωση Stern-Volmer : F 0 = 1+ K [ Q] 1 k 0[ Q SV = + qτ ] F όπου Κ SV είναι η σταθερά απόσβεσης Stern-Volmer, k q η διμοριακή σταθερά απόσβεσης, τ 0 ο μη αποσβεσμένος (unquenching) μέσος όρος ζωής και [Q] η συγκέντρωση του αποσβέστη. Η σταθερά απόσβεσης Stern-Volmer, Κ SV, υποδεικνύει πόσο ευαίσθητο είναι ένα φθοροφόρο σε έναν αποσβέστη. Ένα φθοροφόρο που βρίσκεται «θαμμένο» σε ένα μακρομόριο είναι συνήθως απρόσιτο από υδατοδιαλυτούς αποσβέστες κι έτσι η τιμή Κ είναι χαμηλή. Αντίθετα, αν το φθοροφόρο βρίσκεται ελεύθερο σε ένα διάλυμα ή σε μία επιφάνεια μιας διμοριακής ουσίας παρατηρούνται μεγαλύτερες τιμές Κ. Μια μεγάλη κατηγορία μορίων μπορεί να δράσει ως αποσβέστης σύγκρουσης (collisional quencher), όπως το οξυγόνο, τα αλογόνα, οι αμίνες και μόρια που έχουν έλλειψη ηλεκτρονίων όπως τα ακρυλαμίδια. Ο μηχανισμός της απόσβεσης διαφέρει ανάλογα με το ζευγάρι φθοροφόρο-αποσβέστης. Για παράδειγμα, η απόσβεση της ινδόλης από το ακρυλαμίδιο γίνεται μέσω μεταφοράς ενός ηλεκτρονίου από την ινδόλη στο ακρυλαμίδιο, που δε συμβαίνει στην βασική κατάσταση. Η απόσβεση από αλογόνα και βαριά άτομα λαμβάνει χώρα μέσω σύζευξης σπιν-τροχιάς (spin-orbit coupling) και διασυστημική σύζευξη στην τριπλή κατάσταση (intersystem crossing to the triplet state). Εκτός από την απόσβεση σύγκρουσης (collisional quenching), η απόσβεση φθορισμού μπορεί να συμβεί μέσω πολλών διαφορετικών διαδικασιών. Τα φθοροφόρα μπορούν να σχηματίσουν με αποσβέστες μη φθορίζοντα σύμπλοκα. Αυτή η διαδικασία αναφέρεται ως στατική απόσβεση δεδομένου ότι λαμβάνει χώρα στη βασική κατάσταση και δεν σχετίζεται με διάχυση ή μοριακή σύγκρουση (molecular collisions). 42

51 3.3 Βιοχημικά φθοροφόρα Τα φθοροφόρα χωρίζονται σε δυο γενικές τάξεις: στα εγγενή και στα εξωγενή. Τα εγγενή φθοροφόρα είναι οι ουσίες που υπάρχουν στη φύση, ενώ τα εξωγενή είναι αυτά που προστίθενται σε ένα δείγμα, το οποίο δεν έχει τις επιθυμητές φθορίζουσες ιδιότητες. Σε μια πρωτεΐνη, το κυρίαρχο φθοροφόρο είναι η ινδόλη της τρυποτοφάνης (Σχήμα 42). Η ινδόλη απορροφά περίπου στα 280nm και εκπέμπει στα 340nm. Το φάσμα εκπομπής της ινδόλης είναι πολύ ευαίσθητο στην πολικότητα του διαλύτη. Η εκπομπή της ινδόλης μπορεί να εμφανίζει μετατόπιση σε μικρότερα μήκη κύματος (blue shift) στην περίπτωση που η ομάδα είναι καλυμμένη από τη φυσική πρωτεΐνη (native protein, Ν) και η εκπομπή της μπορεί να μετατοπιστεί σε μεγαλύτερα μήκη κύματος (red shift) όταν η πρωτεΐνη είναι ξεδιπλωμένη (unfolded, U). Συνήθως οι μεμβράνες δεν εμφανίζουν εγγενή φθορισμό. Για το λόγο αυτό γίνεται επισήμανση των μεμβρανών με ανιχνευτές, οι οποίοι αυθόρμητα χωρίζουν την πλευρά της μη πολικής πλευρικής αλυσίδας της μεμβράνης. Ένας από τους πιο γνωστούς ανιχνευτές μεμβράνης είναι το διφαινυλοεξατριένιο (DPH). Εξαιτίας της χαμηλής του διαλυτότητας και της χαμηλής εκπομπής στο νερό, η εκπομπή του DPH είναι ορατή μόνο από το δεσμό μεμβράνη- DPH (Σχήμα 42). Άλλοι λιπιδικοί ανιχνευτές συμπεριλαμβάνουν φθοροφόρα που συνδέονται στη λιπιδική αλυσίδα ή στην αλυσίδα λιπαρού οξέος. Σχήμα 42. Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης βιομορίων. Στην κορυφή το φάσμα εκπομπής της τρυπτοφάνης των πρωτεϊνών, στο κέντρο το φάσμα του εξωγενή 43

52 μεμβρανικού ανιχνευτή DPH. Κάτω, το φάσμα του DAPI που συνδέεται με το DNA. Το DNA από μόνο του εμφανίζει πολύ μικρή εκπομπή. Παρ όλο που το DNA περιέχει αζωτούχες βάσεις που μοιάζουν με φθοροφόρα, εντούτοις φθορίζει ελάχιστα ή/και καθόλου. Ωστόσο, μεγάλη ποικιλία από χρωστικές ενώνονται αυθόρμητα με το DNA, όπως η ακριδίνη, το αιθίδιο βρωμίδιο και άλλα κατιονικά επίπεδα είδη. Για το λόγο αυτό η επισήμανση των κυττάρων με βαφές που συνδέονται με το DNA εφαρμόζεται πολύ για την οπτικοποίηση και ταυτοποίηση των χρωμοσωμάτων. Υπάρχει μεγάλη κατηγορία φθοροφόρων που συνδέονται αυθόρμητα με το DNA. Ένα παράδειγμα ενός ευρέως χρησιμοποιούμενου ανιχνευτή DNA είναι η 4, 6-διαμιδινο-2-φαινυλοϊνδόλη (DAPI). Μια μεγάλη κατηγορία πολλών άλλων υποστρωμάτων εμφανίζουν σημαντικό φθορισμό. Ανάμεσα στα βιοχημικά μόρια που εμφανίζουν φθορισμό συγκαταλέγονται το ανηγμένο αδενίνο νικοτιναμίδιο-δινουκλεο-τίδιο (ΝΑDH), οι οξειδωμένες φλαβίνες (FAD, το αδενίνο-δινουκλεοτίδιο και FMN, το μονονουκλεοτίδιο) και πυριδοξύλοφωσφορικά άλατα όπως επίσης και η χλωροφύλλη. Μερικές φορές ένα είδος δε φθορίζει ή δεν εμφανίζει φθορισμό στην επιθυμητή περιοχή UV του φάσματος. Σ αυτές τις περιπτώσεις μια μεγάλη κατηγορία από εξωγενείς ανιχνευτές έχουν χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση των μακρομορίων. Δυο από τους ευρέως χρησιμοποιούμενους ανιχνευτές, το dansyl chloride DNS-Cl, και το φθορίζον ισοθειακυανικό (FITC) απεικονίζονται στο Σχήμα 43. Αυτοί οι ανιχνευτές αντιδρούν με τα ελεύθερα άζωτα των πρωτεϊνών, οδηγώντας σε πρωτεΐνες που φθορίζουν στα μπλε (DNS) ή πράσινα (FITC) μήκη κύματος. Επίσης, οι πρωτεΐνες μπορούν να επισημανθούν και στις ελεύθερες σουλφυδυλομάδες χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια μαλεϊμιδίου, όπως το μαλεϊμίδιο Bodipi 499/508. Είναι συχνά χρήσιμο να χρησιμοποιούνται μεγαλύτερου μήκους κύματος ανιχνευτές όπως η χρωστική ροδαμίνη Texas Red (rhodamine dye Texas Red). Οι χρωστικές κυανίνης συχνά εφαρμόζονται για την επισήμανση των νουκλεϊκών οξέων. Ένας χρήσιμος φθορίζων ανιχνευτής είναι αυτός που επιδεικνύει υψηλή ένταση, είναι σταθερός κατά τη διάρκεια της φωτοβολίας και δε διαταράσσει σημαντικά το βιομόριο ή τη διαδικασία που ακολουθείται. 44

53 Σχήμα 43. Φθοροφόρα που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό βιομορίων 3.4 Οι φθορίζοντες δείκτες Μια άλλη ομάδα φθοροφόρων περιλαμβάνει τους φθορίζοντες δείκτες. Αυτοί είναι φθοροφόρα των οποίων οι φασματικές ιδιότητες είναι ευαίσθητες στο υπόστρωμα που εξετάζεται. Ένα παράδειγμα αποτελεί το Sodium Green, το οποίο απεικονίζεται στο Σχήμα 44. Αυτό το φθοροφόρο περιέχει έναν αζακορονοειδή αιθέρα, ο οποίος έχει εγκλωβίσει ιόντα Na +. Καθώς συνδέεται με το νάτριο η ένταση της εκπομπής του Sodium Green αυξάνεται, κι έτσι η ποσότητα του Νa + μπορεί να ανιχνευθεί. Οι φθορίζοντες δείκτες είναι διαθέσιμοι για μια μεγάλη ποικιλία υποστρωμάτων συμπεριλαμβανομένων των Ca 2+, Mg 2+, Na +, Cl - και O 2. 45

54 Σχήμα 44. Επιδράσεις του νατρίου στην εκπομπή του Sodium Green. 3.5 Τα φάσματα εκπομπής και οι μετατοπίσεις Stokes (Stokes Shift) Μια πολύ σημαντική πλευρά του φθορισμού είναι η ύπαρξή της σε μήκη κύματος μεγαλύτερα απ αυτά που συμβαίνει η απορρόφηση. Αυτές οι μετατοπίσεις Stokes, που είναι πιο σημαντικές για πολικά φθοροφόρα σε πολικούς διαλύτες, συμβαίνουν εξαιτίας των αλληλεπιδράσεων μεταξύ του φθοροφόρου και του άμεσου περιβάλλοντός του. Τα υπολείμματα της ινδολικής ομάδας της τρυπτοφάνης στην πρωτεΐνη είναι ένα τέτοιο παράδειγμα φθοροφόρου ευαίσθητου στο διαλύτη. Η εκπομπή από την εκτεθειμένη επιφάνεια του θραύσματος θα λάβει χώρα σε μεγαλύτερα μήκη κύματος από την αντίστοιχη τρυπτοφάνη στο εσωτερικό μιας πρωτεΐνης. Το φαινόμενο αυτό απεικονίζεται στο Σχήμα 45, όπου φαίνεται η μετατόπιση στο φάσμα μιας τρυπτοφάνης σε μια ξεδιπλωμένη πρωτεΐνη και η διαδοχική έκθεσή της σε μια υδατική φάση. Πριν το ξεδίπλωμα η τρυπτοφάνη είναι προστατευμένη από το διαλύτη από την αναδιπλωμένη πρωτεΐνη. 46

55 Σχήμα 45. Το φάσμα εκπομπής του TNS σε νερό, μετά από σύνδεση με την απομυογλοβίνη και λιπιδικά κυψελίδια. Μια σημαντική ιδιότητα αρκετών φθοροφόρων είναι η ευαισθησία στο περιβάλλον τους. Τα φάσματα εκπομπής και οι εντάσεις των εξωγενών ανιχνευτών συχνά χρησιμοποιούνται για να προσδιορισθεί η ακριβής θέση των ανιχνευτών στο μακρομόριο. Για παράδειγμα, ένας από τους πιο χρησιμοποιημένους ανιχνευτές είναι το ΤNS (= 6-(p-toluidinily)naphthalene-2-sulfonate ) που εμφανίζει την επιθυμητή ιδιότητα να φθορίζει ασθενώς στο νερό (Σχήμα 45). Η πράσινη εκπομπή του TNS απουσία πρωτεϊνών είναι δύσκολα ορατή στις φωτογραφίες. Ο ασθενής φθορισμός στο νερό και ο ισχυρός φθορισμός όταν συνδέεται με βιομόρια είναι μια επιθυμητή ιδιότητα, την οποία εμφανίζουν και άλλοι ανιχνευτές, συμπεριλαμβανομένων πολλών χρωστικών του DNA. Η πρωτεΐνη απομυογλοβίνη περιέχει μια υδροφοβική κοιλότητα που δεσμεύει την αίμη. Ακόμα, σε αυτήν την κοιλότητα μπορούν να συνδεθούν και άλλα μη πολικά μόρια. Μετά την προσθήκη της απομυογλοβίνης σε ένα διάλυμα ΤNS, υπάρχει μεγάλη αύξηση της έντασης του φθορισμού, καθώς επίσης και μετατόπιση στο φάσμα εκπομπής σε μικρότερα μήκη κύματος. Αυτή η αύξηση του φθορισμού του TNS αντικατοπτρίζει το μη πολικό χαρακτήρα της πλευράς της απομυογλοβίνης που είναι συνδεδεμένη η αίμη. Επίσης, το ΤNS συνδέεται και με μεμβράνες (Σχήμα 45). Το φάσμα εκπομπής του όταν 47

56 δεσμεύεται στις μεμβράνες του DMPC (= dimyristoyl-l-α-phosphatidylcholine) είναι ελαφρώς πιο ασθενές και σε μεγαλύτερα μήκη κύματος συγκριτικά με αυτό της απομυογλοβίνης. Αυτό υποδεικνύει ότι οι θέσεις σύνδεσης του TNS στην επιφάνεια των μεμβρανών είναι περισσότερο πολικές. Από το φάσμα εκπομπής γίνεται αντιληπτό ότι το TNS δεσμεύεται στην πολική περιοχή των μεμβρανών, παρά στη μη πολική πλευρά της αλυσίδας. Για το λόγο αυτό, τα φάσματα εκπομπής των ευαίσθητων σε διαλύτες φθοροφόρων παρέχουν πληροφορίες για την περιοχή των θέσεων σύνδεσης των μακρομορίων. 3.6 Απόσβεση του φθορισμού Όπως έχει ήδη αναφερθεί, μια μεγάλη ποικιλία μικρών μορίων ή ιόντων μπορούν να δράσουν ως αποσβέστες φθορισμού, δηλαδή ως ουσίες που ελαττώνουν την ένταση της εκπομπής. Αυτά τα υποστρώματα περιλαμβάνουν το ιωδίδιο (Ι - ), το οξυγόνο και τα ακρυλαμίδια. Η ευκολία προσέγγισης των φθοροφόρων σε τέτοιου είδους αποσβέστες μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της θέσης των ανιχνευτών στα μακρομόρια ή του πορώδους των πρωτεϊνών και των μεμβρανών των αποσβεστών. Αυτή η διαδικασία απεικονίζεται στο Σχήμα 46, το οποίο δείχνει την ένταση εκπομπής της πρωτεΐνης ή του φθοροφόρου που είναι συνδεδεμένο στην επιφάνεια παρουσία του υδατοδιαλυτού αποσβέστη ιωδίδιο, Ι -. Όπως φαίνεται στη δεξιά πλευρά του σχήματος, η ένταση της εκπομπής της τρυπτοφάνης στην επιφάνεια της πρωτεΐνης (W 2 ), ή στην επιφάνεια της κυτταρικής μεμβράνης (P 2, δεξιά) μειώνεται παρουσία του αποσβέστη. Η ένταση της προστατευμένης τρυπτοφάνης (W 1 ) ή ενός ανιχνευτή στο εσωτερικό της μεμβράνης (P 1 ) επηρεάζεται λιγότερο από το δυσδιάλυτο ιωδίδιο (αριστερά). Η σταθερά απόσβεσης Stern-Volmer Κ SV του ιωδίδιου θα είναι μεγαλύτερη για το εκτεθειμένο φθοροφόρο από το προστατευμένο. Εναλλακτικά, μπορεί να προστεθεί ένας λιποδιαλυτός αποσβέστης, όπως τα βρωμιούχα λιπαρά οξέα, για να μελετηθεί η περιοχή στο εσωτερικό των άκυλο-πλευρικών αλυσίδων των μεμβρανών. 48

57 Σχήμα 46. Η ευκολία προσέγγισης των φθοροφόρων στον αποσβέστη (Q). 3.7 Τα φθοροφόρα Οι φθορίζοντες ανιχνευτές αποτελούν έναν πολύ σημαντικό τομέα της φθορισμομετρίας. Το μήκος κύματος και ο χρόνος ανάλυσης που απαιτούν τα όργανα είναι μεγάλης σημασίας για τις φασματικές ιδιότητες των φθοροφόρων. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα φθοροφόρα διακρίνονται σε εγγενή ή φυσικά και στα εξωγενή ανάλογα με το αν φθορίζουν φυσικά (εγγενή) ή αν φθορίζουν με τη βοήθεια άλλων μορίων (εξωγενή) Τα εγγενή ή φυσικά φθοροφόρα Ο φθορισμός των φυσικών πρωτεϊνών οφείλεται στις αρωματικές αζωτούχες βάσεις της τρυπτοφάνης (trp), της τυροσίνης (tyr) και της φαινυλαλανίνης (phe) (Σχήμα 47). Η ινδόλη της τρυπτοφάνης αποτελεί την κύρια ομάδα που απορροφά και εκπέμπει στο UV στις πρωτεΐνες. Η τυροσίνη έχει κβαντική απόδοση παρόμοια με την τρυπτοφάνη (Πίνακας 1), αλλά η κορυφή στο φάσμα εκπομπής της είναι πιο στενή 49

58 (Σχήμα 48) δημιουργώντας έτσι την εντύπωση της μεγαλύτερης κβαντικής απόδοσης της τυροσίνης. Σχήμα 47. Φυσικά βιοχημικά φθοροφόρα. Πίνακας 1. Οι φθορισμομετρικές παράμετροι των αρωματικών αζωτούχων βάσεων σε νερό και ουδέτερο ph. Είδη λ ex (nm) λ ex (nm) Πλάτος Κβαντική Χρόνος ταινίας (nm) απόδοση ζωής (ns) Φαινυλαλανίνη Τυροσίνη Τρυπτοφάνη Σχήμα 48. Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης των αμινοξέων που φθορίζουν σε νερό και ph

59 Φθορισμός συνενζύμων Τα συνένζυμα συχνά φθορίζουν (Σχήμα 47). Το NADH φθορίζει σε μεγάλο βαθμό, με τα μέγιστα εκπομπής και απορρόφησης να είναι στα 340 nm και 460 nm, αντίστοιχα (Σχήμα 49), ενώ στην οξειδωμένη του μορφή, NAD +, δε φθορίζει. Η ομάδα που φθορίζει είναι ο νικοτιναμιδικός δακτύλιος. Ο μέσος όρος ζωής του σε υδατικό ρυθμιστικό διάλυμα είναι περίπου 0.4 ns. Παρ όλα αυτά, ανάλογα με την πρωτεΐνη που συνδέεται το συνένζυμο, ο φθορισμός του ΝΑDH μπορεί να αυξηθεί ή να ελαττωθεί. Σχήμα 49. Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης των συνενζύμων NADH και FAD. Ένα ακόμα συνένζυμο που φθορίζει είναι το πυριδοξυλ-φωσφορικό (pyridoxyl phosphate). Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησής του εξαρτώνται από τη χημική δομή στην πρωτεΐνη, όπου οι πυριδοξυλ-ομάδες συχνά συνδέονται με λυσίνη μέσω αλδεϋδικών ομάδων. Η ταινία εκπομπής της πυριδοξαμίνης (pyridoxamine) βρίσκεται σε μικρότερα μήκη κύματος από το πυριδοξυλ-φωσφορικό και εξαρτάται από το ph, ενώ το φάσμα εκπομπής της πυριδοξυλομάδας εξαρτάται από την αντίδρασή της με τις πρωτεΐνες. Η φασματοσκοπία της πυριδοξυλ-ομάδας είναι περίπλοκη και φαίνεται ότι αυτό το συνένζυμο υπάρχει σε διάφορες μορφές. Η ριβοφλαβίνη, FMN (Flavin mononucleotide) και το FAD (Flavin adenine dinucleotide) απορροφούν στην περιοχή του ορατού (~ 450nm) και εκπέμπουν στα 525 nm (Σχήμα 49). Σε αντίθεση με το NADH, οι οξειδωμένες μορφές είναι αυτές που φθορίζουν και όχι οι ανηγμένες. Ο τυπικός μέσος όρος ζωής της FMN και του FAD είναι 4.7 ns και 2.3 ns, αντίστοιχα. Οι φλαβοπρωτεΐνες φθορίζουν ελάχιστα ή και καθόλου όταν συνδέονται με πρωτεΐνες εκτός από μερικές εξαιρέσεις. 51

60 Τα νουκλεοτίδια και τα νουκλεϊκά οξέα κατατάσσονται γενικά στα μη φθορίζοντα μόρια. Παρ όλα αυτά υπάρχουν κάποιες εξαιρέσεις. Η ζύμη trna PHE περιέχει μια πολύ φθορίζουσα βάση, γνωστή ως βάση-υ (Y-base), η οποία εμφανίζει μέγιστο εκπομπής στα 470 nm και μέσο όρο ζωής τα 6 ns. Τα μόρια αυτά αποτελούν τα κυρίαρχα φθοροφόρα στους ιστούς των ζώων. Πρόσφατα, άρχισε να αναπτύσσεται ενδιαφέρον για εκπομπή φωτός από φυσικά φθοροφόρα που βρίσκονται στους ιστούς και τα οποία δεν είναι συνένζυμα. Το μεγαλύτερο μέρος του φθορισμού των κυττάρων οφείλεται στο ΝADH και στις φλαβίνες. Άλλα φθοροφόρα έχουν βρεθεί σε άθικτους ιστούς όπως το κολλαγόνο και οι πορφυρίνες (Σχήμα 50). Σ αυτές τις περιπτώσεις, η εκπομπή δεν οφείλεται σ ένα μοναδικό είδος αλλά σε όλες τις δομές που εκπέμπουν και είναι παρούσες στο συγκεκριμένο ιστό. Σχήμα 50. Τα φάσματα εκπομπής των φυσικών φθοροφόρων από ιστούς Τα εξωγενή φθοροφόρα Συχνά τα μόρια που ενδιαφέρουν για μελέτη δεν φθορίζουν ή ο φυσικός φθορισμός τους είναι αμελητέος για τα επιθυμητά πειράματα, όπως για παράδειγμα το DNA και τα λιπίδια. Σ αυτές τις περιπτώσεις γίνεται ιχνηθέτηση των μορίων με εξωγενείς ανιχνευτές. Οι πρωτεΐνες συνήθως επισημαίνονται με χρωμοφόρα με μεγαλύτερα μήκη κύματος εκπομπής και απορρόφησης από τις αρωματικές αζωτούχες βάσεις. 52

61 Αντιδραστήρια ιχνηθέτησης πρωτεϊνών Μεγάλος αριθμός φθοροφόρων είναι διαθέσιμος για την ομοιοπολική και μηομοιοπολική ιχνηθέτηση των πρωτεϊνών. Οι ομοιοπολικοί ανιχνευτές μπορούν να έχουν μεγάλη ποικιλία δραστικών ομάδων για σύζευξη με αμίνες και σουλφυδρυλομάδες ή ιστιδίνες στις πρωτεΐνες. Μερικά απ αυτά τα ευρέως χρησιμοποιούμενα μόρια παρουσιάζονται στο Σχήμα 51. Σχήμα 51. Οι ανιχνευτές που αντιδρούν με σύζευξη με μακρομόρια. Το Dansyl χλωρίδιο χρησιμοποιείται κυρίως για την επισήμανση πρωτεϊνών, κυρίως όταν είναι επιθυμητές μετρήσεις πόλωσης. Η ευρεία χρήση του οφείλεται στο γεγονός ότι ανακαλύφθηκε πολύ νωρίς και επίσης έχει επιθυμητό χρόνο ζωής (~ 10 ns). Το μόριο αυτό διεγείρεται στα 350 nm, όπου οι πρωτεΐνες δεν απορροφούν. Δεδομένου ότι οι Dansyl- ομάδες απορροφούν κοντά στα 350 nm μπορούν να χρησιμεύσουν ως αποδέκτες στο φθορισμό πρωτεϊνών. Τα φάσματα εκπομπής αυτών των ανιχνευτών είναι πολύ ευαίσθητα στην πολικότητα του διαλύτη, και τα μέγιστα εκπομπής είναι κοντά στα 520 nm (Σχήμα 52). 53

62 Σχήμα 52. Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης των FITC (κορυφή) και DNS-Cl (κέντρο). Επίσης, δίνουν και τα φάσματα διέγερσης και εκπομπής του Cascade Yellow σε μεθανόλη (κάτω). Άλλα φθοροφόρα που χρησιμοποιούνται ως εγγενείς ιχνηθέτες είναι οι φλουοροσκεΐνες και οι ροδαμίνες (Σχήμα 53). Αυτές οι χρωστικές έχουν ευνοϊκά μεγάλα μέγιστα απορρόφησης στην περιοχή nm και μήκη κύματος εκπομπής από 510 nm ως 615 nm, αντίστοιχα. Σε αντίθεση με το Dansyl-Cl, τα φθοροφόρα αυτά δεν επηρεάζονται από την πολικότητα του διαλύτη. Άλλα μόρια που χρησιμοποιούνται ως φθοροφόρα είναι τα ιωδοακεταμίδια, τα ισοθειοκυανικά παράγωγα και τα μαλεϊμίδια. Τα ιωδοακεταμίδια και τα μαλεϊμίδια χρησιμοποιούνται κυρίως για την επισήμανση σουλφυδρυλικών ομάδων, ενώ τα ισοθειοκυανικά παράγωγα, το Ν-υδροξυσουκινιμίδιο και τα σουλφονυλοχλωρίδια για την ιχνηθέτηση αμινών. Σ όλα τα παραπάνω φθοροφόρα η σύζευξη με τις πρωτεΐνες γίνεται με ομοιοπολικούς δεσμούς. Στη συνέχεια, αναφέρονται ορισμένα παραδείγματα όπου η φθορίζουσα ουσία συναρμόζεται με την πρωτεΐνη μη ομοιοπολικά. Αυτά είναι κυρίως ναφθυλαμινο σουλφονικά οξέα (naphthylamine sulfonic acids), απ τα οποία τα 1- anilinonaphthalene-6-sulfonic acid (ANS) και 2-(p-toluidinyl)naphthalele-6-sulfonic acid (TNS) χρησιμοποιούνται περισσότερο. Οι ανιχνευτές αυτοί δε φθορίζουν καθόλου ή ελάχιστα σε νερό, αλλά φθορίζουν έντονα όταν συνδέονται με πρωτεΐνες ή μεμβράνες. Στο Σχήμα 54 παρουσιάζεται το φάσμα εκπομπής της BSA (bovine serum albumin) που διεγέρθηκε στα 280nm καθώς το δείγμα τιτλοδοτείται με ANS. Απουσία της βοοειδούς 54

63 αλβουμίνης η εκπομπή του ΑΝS το οποίο είναι διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα είναι ασήμαντη. Σχήμα 53. Οι δομές και τα κανονικοποιημένα φάσματα εκπομπής του αντισώματος antimouse IgG σε σύζευξη με (1) φλουοροσκεΐνη, (2) ροδαμίνη 6G, (3) τετραμεθυλοροδαμίνη, (4) Lissamine rhodamine B και (5) χρωστικήtexas Red. Σχήμα 54. Το φάσμα εκπομπής της BSA κατά την προσθήκη αυξανόμενης συγκέντρωσης ANS. Οι αριθμοί υποδεικνύουν το μέσο όρο των μορίων ANS που συνδέονται με κάθε μόριο αλβουμίνης. Η διέγερση γίνεται στα 280nm. Η δομή δείχνει την κρυσταλλική δομή της HSA. 55

64 Ανιχνευτές με μεγάλο χρόνο ζωής Οι ανιχνευτές που παρουσιάστηκαν είναι οργανικά μόρια με ποικίλες φασματικές ιδιότητες και ευαισθησία στις περιβαλλοντικές συνθήκες. Παρ όλο που υπάρχουν πολλά οργανικά φθοροφόρα, σχεδόν όλα παρουσιάζουν χρόνους ζωής από 1 ως 10 ns, γεγονός που περιορίζει τις πληροφορίες που μπορούν να ληφθούν από τη φθορισμομετρία. Όμως, υπάρχουν και εξαιρέσεις στο μικρό χρόνο ζωής των οργανικών φθοροφόρων. Το πυρένιο (pyrene) παρουσιάζει χρόνο ζωής κοντά στα 400 ns σε απαερωμένους οργανικούς διαλύτες. Ένα άλλο οργανικό φθοροφόρο που έχει μεγάλο χρόνο ζωής, κοντά στα 200 ns, είναι το κορονένιο (coronene). Τόσο το πυρένιο όσο και το κορονένιο εμφανίζουν χαμηλές αρχικές ανισοτροπίες και δεν είναι πολύ χρήσιμα για πειράματα ανισοτροπίας. Όμως, υπάρχουν δυο είδη οργανομεταλλικών φθοροφόρων τα οποία εμφανίζουν μεγάλους χρόνους ζωής και άλλα μοναδικά χαρακτηριστικά που επιτρέπουν νέα είδη πειραμάτων Λανθανίδες Οι λανθανίδες είναι μοναδικά μέταλλα που φθορίζουν και έχουν εκπομπή σε υδατικά διαλύματα και χρόνο αποσύνθεσης (decay times) από 0.5 ως 3 ms. Η εκπομπή είναι αποτέλεσμα μεταπτώσεων στα 4f τροχιακά, που είναι απαγορευμένες μεταπτώσεις. Έτσι οι συντελεστές απορρόφησης είναι μικροί, μικρότεροι από 10 Μ -1 cm -1, και οι ρυθμοί εκπομπής είναι χαμηλοί οδηγώντας σε μεγάλους χρόνους ζωής. Οι λανθανίδες συμπεριφέρονται ως άτομα και εμφανίζουν γραμμικά φάσματα (Σχήμα 55). Εξαιτίας της ασθενούς απορρόφησης, οι λανθανίδες συνήθως δε διεγείρονται απευθείας, αλλά μέσω χηλικών οργανικών υποκαταστατών. Έτσι, το φάσμα διέγερσης του συμπλόκου στο Σχήμα 55 απεικονίζει το φάσμα απορρόφησης του υποκατα-στάτη και όχι της λανθανίδας. 56

65 Σχήμα 55. Τα φάσματα εκπομπής και η ένταση ελάττωσης του τέρβιου. Οι λανθανίδες έχουν ευρεία χρήση σε ευαίσθητες ανιχνεύσεις και κυρίως στην ανοσοανάλυση (immunoassay). Η βασική ιδέα φανερώνεται στο Σχήμα 56. Όλα τα βιολογικά δείγματα παρουσιάζουν αυτοφθορισμό, που είναι συνήθως ο περιοριστικός παράγοντας στην υψηλής ευαισθησίας ανίχνευση. Ο αυτοφθορισμός συχνά εξασθενεί στην κλίμακα των ns, όπως και τα περισσότερα φθοροφόρα. Εξαιτίας του μεγάλου χρόνου αποσύνθεσής τους, οι λανθανίδες συνεχίζουν να εκπέμπουν μετά την εξαφάνιση του αυτοφθορισμού. Ο ανιχνευτής ενεργοποιείται μετά το φλας διέγερσης για να ενοποιηθεί η ένταση από την λανθανίδα. Ο όρος «time-resolved» είναι σε μεγάλο βαθμό λανθασμένος και δεν αποδίδεται στις μετρήσεις του χρόνου αποσύνθεσης. Αυτή η χρονικά περιορισμένη ανοσοανάλυση είναι ουσιαστικά μέτρηση όπου η ένταση είναι σταθερής κατάστασης και μετράται μετά από μια χρονική περίοδο μετά τον παλμό διέγερσης. Σχήμα 56. Οι αρχές που διέπουν την time-resolved ανίχνευση στην ανοσοανάλυση λανθανίδων. 57

66 Ωστόσο η χρήση λανθανίδων έχει πολλούς περιορισμούς. Ένας απ αυτούς είναι ότι πρέπει να είναι σε χηλικές ενώσεις με σκοπό να ληφθεί σημαντική διέγερση. Το γεγονός αυτό οδηγεί συχνά σε αποτιμήσεις με πολλά στάδια και το τελευταίο στάδιο προστίθεται στο χηλικό μόριο. Μια άλλη δυσκολία είναι η απουσία πολικής εκπομπής, κι έτσι οι λανθανίδες δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για μετρήσεις ανισοτροπίας Σύμπλοκα μεταβατικών μετάλλων Μια άλλη ομάδα ανιχνευτών με μεγάλους χρόνους ζωής είναι τα σύμπλοκα μεταβατικών μετάλλων. Αυτά συνήθως είναι σύμπλοκα του ρουθηνίου (Ru II), του ρήνιου (Re I) και του οσμίου (Os II) με μία ή περισσότερες διιμίνες ως υποκαταστάτες (Σχήμα 57). Σε αντίθεση με τις λανθανίδες, αυτές οι ενώσεις εμφανίζουν μοριακό φθορισμό που οφείλεται στη μεταφορά φορτίου μεταξύ του μετάλλου και του υποκαταστάτη (metal-to-ligand charge-transfer state). Η μετάπτωση είναι απαγορευμένη κι έτσι οι χρόνοι αποσύνθεσης είναι μεγάλοι. Αυτά τα σύμπλοκα είναι πολύ σταθερά, όπως ο ομοιοπολικός δεσμός, με αποτέλεσμα να μην υπάρχει σημαντικός διαχωρισμός του μετάλλου με τον υποκαταστάτη. Οι χρόνοι ζωής των συμπλόκων αυτών κυμαίνονται από 10 ns ως 10 μs. Για παράδειγμα, το σύμπλοκο [Ru(bpy) 2 (mcbpy)-pe] (Σχήμα 57) έχει χρόνο αποσύνθεσης κοντά στα 400 ns κατά τη σύζευξή του με πρωτεΐνες και λιπίδια. Τα σύμπλοκα μεταβατικών μετάλλων είναι φωτοσταθερά και παρουσιάζουν μεγάλες μεταθέσεις Stokes, έτσι ώστε να μην παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ανιχνευτών [88]. Σχήμα 57. Ελάττωση της έντασης του [Ru(bpy) 2 (mcbpy)-pe] σε κυψελίδα DPPG. 58

67 4. Υποκαταστάτες της διπλωματικής εργασίας Τα ligands που χρησιμοποιήθηκαν είναι το tolfenamic acid (Ν-(3-chloro-2- methylphenyl)anthranilic acid), το mefenamic acid (2-[(2,3-dimethylphenyl)amino] benzoic acid) και το naproxen ((±) 6-methoxy-2-methyl-2-naphthaleneacetic acid). Οι ενώσεις αυτές ανήκουν στα μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Τα ΜΣΑΦ αποτελούν μια κατηγορία φαρμάκων με αναλγητική, αντιφλεγμονώδη και αντιπυρετική δράση, τα οποία χρησιμοποιούνται για τη συμπτωματική αντιμετώπιση του πόνου και των άλλων συμπτωμάτων της φλεγμονής. Ο μηχανισμός δράσης τους σχετίζεται με την αναστολή παραγωγής προσταγλανδινών (PGs). Με βάση τη χημική τους δομή, τα ΜΣΑΦ κατατάσσονται σε: 1. παράγωγα του σαλικυλικού οξέος Στην κατηγορία αυτή ανήκουν μεταξύ άλλων, και οι ενώσεις (Α) aspirin και (Β) diflunisal (Hdifl) με δομές: O C OH F OH O C CH 3 O F COOH Α Β 2. φαινυλαλκανοϊκά οξέα Παραδείγματα ενώσεων που ανήκουν στην κατηγορία αυτή είναι οι (Α) Fenorpofen, και (Β) naproxen (Hnap) που έχουν τις ακόλουθες δομές: CH 3 CH 3 CH COOH O C H COOH H 3 C O Α Β 3. ανθρανιλικά οξέα Κυριότερες ενώσεις της κατηγορίας αυτής είναι τα (Α) mefenamic acid (Hmef) (Β) flufenamic acid (Hfluf) 59

68 HOOC NH CF 3 HOOC H N CH 3 CH 3 4. οξικάμες Α Κυριότερα μέλη των οξικαμών είναι το (Α) tenoxicam (HTenx) και το (Β) piroxicam (HPir) S O S OH O N Α O N H 5. κοξίμπες που περιλαμβάνουν σουλφοναμίδια N Χαρακτηριστικές ενώσεις που ανήκουν στις κοξίμπες είναι οι (Α) Celecoxib, και (Β) Rofecoxib με δομές : O OH S N O Β O Β N H N O O F 3 C N N O S NH O O S CH 3 Α CH 3 Β O 4.1 Tolfenamic acid Το tolfenamic acid (Ηtolf) ανήκει στα ΜΣΑΦ και κατατάσσεται στα ανθρανιλικά παράγωγα. Παρόμοια χημική δράση παρουσιάζουν τα mefenamic acid, meclofenamate, niflumic acid και flulenamic acid (Σχήμα 58). Το tolfenamic acid αναστέλλει τη βιοσύνθεση των προσταγλανδινών και παρουσιάζει ανασταλτική δράση στη βιοσύνθεση 60

69 των λευκοτριενίων (leukotrienes) [89]. Η μικρή διαλυτότητα του tolfenamic acid στο νερό αποτελεί το κυριότερο πρόβλημα στη φαρμακευτική του χρήση και για την αντιμετώπισή του έγιναν προσπάθειες για συμπλοκοποίησή του με διάφορες κυκλοδεξτρίνες [90]. Το tolfenamic acid αποτελεί τη δραστική ουσία φαρμάκων με τις εμπορικές ονομασίες Clotam, Clotam Rapid, Gantil, Migea, τα οποία έχουν αντιπυρετική, αναλγητική και αντιφλεγμονώδη δράση. Το Gantil παρέχεται για τη θεραπεία των ρευματοειδών ασθενειών. Επιπλέον, έχει χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή του φάρμακου Tolfedine, που χρησιμοποιείται σε σκύλους και γάτες. (Α) Σχήμα 58. Τα ανθρανιλικά οξέα tolfenamic acid (Α) και mefenamic acid (Β), αντίστοιχα. (Β) Σύμπλοκες ενώσεις με το tolfenamic acid Στη βιβλιογραφία αναφέρονται αρκετά σύμπλοκα με ligand το tolfenamic acid. Το [Cu(tolf) 2 (H 2 O)] 2 είναι διπυρηνικό σύμπλοκο όπου κάθε άτομο Cu έχει παραμορφωμένη τετραγωνική γεωμετρία. Άλλα σύμπλοκα που φέρουν Htolf είναι τα [Mn(tolf) 2 (H 2 O) 2 ], [Co(tolf) 2 (H 2 O) 2 ], [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 2 ] και [Zn(tolf) 2 (H 2 O)] για τα οποία βρέθηκε ότι η αντιοξειδωτική τους δράση είναι ικανοποιητική [91]. Έχουν παρασκευαστεί αρκετά σύμπλοκα του τολφεναμικού οξέος με τον Zn. Το τριπυρηνικό σύμπλοκο [Zn 3 (tolf) 6 (CH 3 OH) 2 ] και τα μονοπυρηνικά [Zn(tolf)(phen)Cl], [Zn(tolf)(bipy)Cl], [Zn(tolf) 2 (phen)] και [Zn(tolf) 2 (bipy)] χαρακτηρίστηκαν δομικά και μελετήθηκε η βιολογική τους δράση (Σχήμα 59) [92]. (Α) (Β) 61

70 (Γ) (Δ) Σχήμα 59. Κρυσταλλικές δομές των (Α) [Zn 3 (tolf) 6 (CH 3 OH) 2 ], (Β) [Zn(tolf)-(phen)Cl], (Γ) [Zn(tolf ) 2 (phen)] Et 2 O και (Δ) [Zn(tolf ) 2 (bipy)]. Τέλος, παρασκευάστηκαν και μελετήθηκαν τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα του Co με τολφεναμικό ligand [Co(tolf) 2 (MeOH) 4 ], [Co(tolf) 2 (bipy)(meoh) 2 ], [Co(tolf) 2 - (phen)(meoh) 2 ], [Co(tolf) 2 (bipyam)] και [Co(tolf) 2 (py) 2 (MeOH) 2 ] (Σχήμα 60) [93]. (Α) (Β) Σχήμα 60. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Co(tolf) 2 (bipy)(meoh) 2 ] και (Β) [Co(tolf) 2 (bipyam)]. 4.2 Mefenamic acid Το mefenamic acid (Ηmef) είναι μια δραστική αναλγητική και αντιπυρετική ένωση με ελαφρώς ήπιες παρενέργειες όπως πονοκέφαλος, διάρροια, εμετός και νευρικότητα (Σχήμα 58). Στο εμπόριο κυκλοφορεί με την ονομασία Ponstan στην Ευρώπη και ως Ponstel στην Αμερική. Επίσης, καταπολεμεί τον εμμηνορροϊκό πόνο. Το μεφεναμικό οξύ μειώνει τις φλεγμονές (πρήξιμο) και τις συστολές της μήτρας μέσω ενός άγνωστου μηχανισμού. Όμως, θεωρείται ότι σχετίζεται με την αναστολή της δράσης των προσταγλανδινών [69]. 62

71 4.2.1 Σύμπλοκες ενώσεις του mefenamic acid Έχουν παρασκευαστεί και μελετηθεί η βιολογική δράση των σύμπλοκων ενώσεων του κοβαλτίου με το mefenamic acid [Co(mef) 2 (MeOH) 4 ], [Co(mef) 2 (bipy)(meoh) 2 ], [Co(mef) 2 (phen)(meoh) 2 ] και [Co(mef) 2 (py) 2 (MeOH) 2 ] (Σχήμα 61) [94]. (Α) (Β) Σχήμα 61. Κρυσταλλικές δομές των συμπλόκων (Α) [Co(mef) 2 (MeOH) 4 ] και [Co(mef) 2 (bipy)(meoh) 2 ]. (Β) Επίσης, τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα του χαλκού [Cu 2 (mef) 4 (H 2 O) 2 ], [Cu(mef) 2 (bipy)], [Cu(mef) 2 (phen)], [Cu(mef) 2 (bipyam)] και [Cu(mef) 2 (py) 2 (MeOH) 2 ] φέρουν ως μεφεναμικά ligands και παρασκευάστηκαν με σκοπό να εκτιμηθεί η βιολογική τους δράση (Σχήμα 62) [95]. (Α) Σχήμα 62. Κρυσταλλικές δομές (Α) Cu(mef) 2 (bipy)] και (Β) [Cu(mef) 2 (bipyam)] (Β) Άλλα σύμπλοκα που φέρουν mefenemato ligand και έχει προσδιοριστεί η βιολογική τους δράση είναι τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα του ψευδαργύρου [Zn(mef) 2 (H 2 O) 4 ], [Zn(mef) 2 (bipy)], [Zn(mef) 2 (bipyam)], [Zn(mef) 2 (Hpko) 2 ] και [Zn(mef) 2 (phen)(h 2 O)] (Σχήμα 63) [69]. 63

72 (Α) (Β) (Γ) Σχήμα 63. Κρυσταλλικές δομές (Α) [Zn(mef) 2 (bipy)], (Β) [Zn(mef) 2 (Hpko) 2 ] και (Γ) [Zn(mef) 2 (phen)(h 2 O)]. 4.3 Naproxen Το Naproxen (Hnap) (Σχήμα 64) ανήκει στην κατηγορία των φαινυλαλκανοϊκών οξέων, και εμφανίζει αντιφλεγμονώδη, αναλγητική και αντιπυρετική δράση. Χρησιμοποιείται ευρέως σε επώδυνες καταστάσεις όπου σχηματίζονται φλεγμονές όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η σπονδυλίτιδα και η οστεοαρθρίτιδα [96]. Στο εμπόριο κυκλοφορεί με τις ονομασίες Aleve, Anaprox, Antalgin, Apranax, Feminax Ultra, Flanax, Inza, Midol Extended Relief, Nalgesin, Naposin, Naprelan, Naprogesic, Naprosyn, Narocin, Proxen, Soproxen, Synflex και Xenobid. Σχήμα 64. Το naproxen (Hnap). 64

73 4.3.1 Σύμπλοκες ενώσεις του naproxen Το naproxen έχει αποτελέσει το επίκεντρο αρκετών ερευνητικών μελετών. Ένα σύμπλοκο του που παρασκευάστηκε και εξετάσθηκε η αντικαρκινική του δράση είναι το διπυρηνικό σύμπλοκο [Ru 2 (nap) 4 (H 2 O) 2 ] (PF 6 ) [97]. Ένα ακόμα σύμπλοκο που φέρει naproxen είναι αυτό του βισμουθίου [Bi(nap) 3 ] το οποίο παρασκευάστηκε με σκοπό να εξετασθεί η δράση του έναντι ορισμένων βακτηριδιακών σειρών [98]. Επίσης, στην κατηγορία αυτή ανήκουν και αρκετά σύμπλοκα του χαλκού όπως τα [Cu 2 (nap) 4 ] n και [Cu(nap) 2 (3-pym) 2 ] n [99] (Σχήμα 65) και τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα [Cu(nap) 2 (bipy)] H 2 O και [Cu(nap) 2 (phen)] H 2 O (Σχήμα 66) τα οποία παρασκευάστηκαν και προσδιορίστηκε η βιολογική τους δράση [96]. Σχήμα 65. Κρυσταλλική δομή του [Cu(nap) 2 (3-pym) 2 ] n. (Α) (Β) Σχήμα 66. Κρυσταλλικές δομές των (Α) [Cu(nap) 2 (bipy)] H 2 O και (Β) [Cu(nap) 2 (phen)] H 2 O. Τέλος, έχουν παρασκευαστεί και τα σύμπλοκα του κοβαλτίου με ligand το naproxen [Co(nap) 2 (MeOH) 4 ], [Co(nap) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ], [Co(nap) 2 (phen)(h 2 O) 2 ] και [Co(nap) 2 (bipy)(h 2 O) 2 ] (Σχήμα 67) [100]. Σχήμα 67. Κρυσταλλική δομή του [Co(nap) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] 65

74 Πειραματικό Μέρος 66

75 1. Εισαγωγή Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η σύνθεση μονοπυρηνικών και πολυπυρηνικών συμπλόκων του νικελίου και του ψευδαργύρου με τα μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα tolfenamic acid, mefenamic acid και naproxen παρουσία ή απουσία ετεροκυκλικών ενώσεων καθώς και η μελέτη της δομής και της βιολογικής τους δράσης. 2.Περιγραφή υποκαταστατών Οι υποκαταστάτες που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διπλωματική εργασία ήταν το tolfenamic acid, το mefenamic acid και το naproxen. Πρόκειται για φάρμακα που ανήκουν στην κατηγορία των μη-στεροειδών αντιφλεγμονώδη φαρμάκων (ΜΣΑΦ). Τα ΜΣΑΦ είναι μια κατηγορία φαρμάκων με αντιφλεγμονώδη, αναλγητική και αντιπυρετική δράση και χρησιμοποιούνται για την αντιμετώπιση του πόνου και των διαφόρων συμπτωμάτων της φλεγμονής. Σκοπός τους είναι η απαλοιφή του πόνου αναστέλλοντας τη δράση ενζύμων, όπως η κυκλοξυγενάση (COX). Τα ένζυμα αυτά καταλύουν το σχηματισμό προσταγλανδινών (PGs), που αποτελούν ενδιάμεσο στάδιο για τη διαδικασία της φλεγμονής. Με βάση τη χημική τους δομή διαχωρίζονται στις κατηγορίες: παράγωγα του σαλικυλικού οξέος, φαινυλαλκανοϊκά οξέα, ανθρανιλικά οξέα, οξικάμες, και κοξίμπες. Τα tolfenamic acid και mefenamic acid ανήκουν στα ανθρανιλικά οξέα ενώ το naproxen στα φαινυλαλκανοϊκά οξέα [101]. Ακόμη, ως υποκαταστάτες χρησιμοποιήθηκαν οι δότες ατόμων Ν 2,2 -διπυριδίνη (2,2 -bipyridine=bipy), 1,10-φαινανθρολίνη (1,10 -phenanthroline=phen), 2,2 διπυριδυλαμίνη (2,2 -dipyridylamine = bipyam) και πυριδίνη (pyridine= py) καθώς και η 2,2 -διπυριδυλο κετονοξίμη ( di-2-pyridyl ketone oxime = Hpko) (Σχήμα 68). Α. bipy Β. phen 67

76 Γ. bipyam Δ. py Ε. Hpko Σχήμα 68. Οι άζωτο δότες (Α-Δ) και η οξίμη (Ε). 68

77 3.Αντιδραστήρια-Διαλύτες- Όργανα 3.1 Αντιδραστήρια-Διαλύτες Από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν τα tolfenamic acid, mefenamic acid, ZnCl 2, Zn(NO 3 ) 2 6H 2 O, NiCl 2 6H 2 O, CT DNA, BSA, HSΑ, ΕΒ, trisodium citrate, 2,2 -bipyridine, 2,2 -dipyridylamine, 1,10-phenanthroline και ΚΟΗ αγοράστηκαν από τη Sigma- Aldrich, ενώ το naproxen, το ΝaCl και όλοι οι διαλύτες αγοράστηκαν από την Merck. Το διάλυμα του CT DNA παρασκευάστηκε ύστερα από διάλυση του CT DNA σε διάλυμα buffer (το οποίο περιέχει 150 mm NaCl και 15 mm trisodium citrate σε ph 7.0) υπό συνεχή ανάδευση και στη συνέχεια διατηρήθηκε στους 4 ο C. O λόγος της απορρόφησης στα 260 nm προς την αντίστοιχη στα 280nm (Α 260 /Α 280 ) του διαλύματος DNA κυμαίνεται μεταξύ και θεωρείται επαρκώς καθαρό από πρωτεϊνικά μόρια. Η συγκέντρωση του διαλύματος προσδιορίστηκε από την απορρόφηση στα 260nm ύστερα από αραίωση 1:20. Γνωρίζοντας ότι ο συντελεστής μοριακής απορρόφησης (ε) είναι 6600 Μ -1 cm -1 και με βάση τον τύπο Beer-Lambert Α= ε c d, υπολογίστηκε η συγκέντρωση του διαλύματος. 3.2 Όργανα μέτρησης Οι στοιχειακές αναλύσεις άνθρακα, υδρογόνου και αζώτου εκτελέσθηκαν σε στοιχειακό αναλυτή της Perkin-Elmer. Οι μετρήσεις μοριακής αγωγιμότητας εκτελέσθηκαν με συσκευή αγωγιμότητας Crison Basic 30. Τα φάσματα IR ( cm -1 ) των ενώσεων λήφθηκαν σε φασματόμετρο Nicolet FT-IR 6700 με μορφή δισκίων KBr. Τα φάσματα UV-vis των ενώσεων λήφθηκαν σε διαλύματα dmso, των οποίων οι συγκεντρώσεις κυμαίνονταν από 10-5 ως 5x10-3 και σε στερεή κατάσταση σε αιώρημα nujol (nujol mulls) και καταγράφηκαν με φασματοφωτόμετρο διπλής δέσμης φωτός Hitachi U Tα φάσματα φθορισμού καταγράφηκαν με τη μορφή διαλυμάτων στο φθορισμόμετρο Hitachi F Οι μαγνητικές μετρήσεις σε θερμοκρασία περιβάλλοντος έγιναν με τη μέθοδο Faraday σε μαγνητοζυγό Johnson Matletley Chemicals Limited Magnetic Susceptibility Balance. Η μελέτη της κυκλικής βολταμμετρίας έγινε σε συσκευή Autolab Electrochemical analyzer του οίκου Eco Chemie. Τα πειράματα της κυκλικής βολταμμετρίας 69

78 εκτελέσθηκαν σε κυψελίδα τριών ηλεκτροδίων χωρητικότητας 30 ml. Το ηλεκτρόδιο εργασίας ήταν λευκόχρυσος ενώ σύρμα Pt χρησιμοποιήθηκε ως αντισταθμιστικό ηλεκτρόδιο. Ως ηλεκτρόδιο αναφοράς χρησιμοποιήθηκε ένα ηλεκτρόδιο Ag/AgCl κορεσμένο με KCl. Τα κυκλικά βολταμμογραφήματα λήφθηκαν σε 0.33 mm διαλύματα dmso και σε 0.33 mm διαλύματα dmso/buffer (1:2) με ταχύτητα σάρωσης ν=100 mv s -1, όπου το TEAP και το διάλυμα buffer ήταν οι φέροντες ηλεκτρολύτες, αντίστοιχα. Ο φέροντας ηλεκτρολύτης TEAP (=tetraethylammonium perchlorate, υπερχλωρικό τετρααιθυλαμμώνιο) είχε αρχικά ανακρυσταλλωθεί από αιθανόλη. Η επιλογή του dmso ως διαλύτη έγινε γιατί όλα τα σύμπλοκα έχουν πολύ καλή διαλυτότητα σε αυτό. Η καθαρότητά του ελέχθηκε με τη λήψη του κυκλικού βολταμογραφήματος ενός διαλύματος που περιέχει μόνο το φέροντα ηλεκτρολύτη σε συγκέντρωση 0.1 Μ. Το οξυγόνο απομακρύνθηκε από τα διαλύματα με διοχέτευση καθαρού αζώτου. Η αποξυγόνωση των διαλυμάτων ήταν απαραίτητη επειδή το οξυγόνο μπορεί να δώσει ηλεκτροδιακές δράσεις που συνεπάγονται την αλλοίωση των μορφών των καμπυλών έντασης-τάσης. Όλες οι ηλεκτροχημικές μετρήσεις έγιναν σε θερμοκρασία 25.0±0.2 0 C. H μελέτη της ιξωδομετρίας έγινε σε ένα περιστροφικό ιξωδόμετρο ALPHA L της Fungilab εξοπλισμένο με 18 ml LCP spindle και οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στα 100 rpm [102]. Η επίλυση ορισμένων κρυσταλλικών δομών πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Επιστήμης Υλικών, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος, Αγία Παρασκευή Αττικής. Το περιθλασίμετρο που χρησιμοποιήθηκε για την επίλυση της κρυσταλλικής δομής των συμπλόκων ήταν Rigaku R-AXIS SPIDER Image Plate εφοδιασμένο με γραφίτη μονοχρωματικής ακτινοβολίας Cu Ka. Η συλλογή δεδομένων (ω-σαρώσεις) και οι διάφορες διορθώσεις (εύρεση κυψελίδας, διορθώσεις πολωσιμότητας και απορρόφησης) εφαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SHELXS-97 και καθορίστηκαν με τεχνικές πλήρους-μήτρας ελαχίστων τετραγώνων στο F με το πρόγραμμα SHELXS-97 χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο αριθμό ανακλάσεων και προσδιορίζοντας τον απαραίτητο αριθμό παραμέτρων για κάθε σύμπλοκο. Τα άτομα του υδρογόνου αναφέρονται ως ισοτροπικά, εκτός αυτών των μεθυλικών ομάδων τα οποία υπολογίστηκαν ως μέρη δακτυλίου τον συνδεδεμένων ατόμων. Όλα τα υπόλοιπα άτομα είναι ανισοτροπικά. 70

79 Η επίλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου του ψευδαργύρου με τον υποκαταστάτη tolfenamic acid και Hpko πραγματοποιήθηκε στο τμήμα Χημείας και Χημικής Τεχνολογίας στο Πανεπιστήμιο της Λουμπλιάνας στη Σλοβενία. Χρησιμοποιήθηκε περιθλασίμετρο μονοκρυστάλλων ακτίνας Χ Nonius Kappa CCD εφοδιασμένο με γραφίτη μονοχρωματικής ακτινοβολίας Mo Ka. Η επεξεργασία των δεδομένων έγινε με το πρόγραμμα DENZO. Η δομή επιλύθηκε με άμεσες μεθόδους χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα SIR-97 και καθορίσθηκε με τεχνικές πλήρους-μήτρας ελαχίστων τετραγώνων στο F με το πρόγραμμα SHELXS-97 χρησιμοποιώντας τον αντίστοιχο αριθμό ανακλάσεων και προσδιορίζοντας τον απαραίτητο αριθμό παραμέτρων για το σύμπλοκο. Η επίλυση των κρυσταλλικών δομών του νικελίου με κρυσταλλογραφία ακτίνων-x πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Χημείας του ΑΠΘ σε περιθλασίμετρο Bruker Kappa APEX II. Για την επεξεργασία των ανακλάσεων που οδήγησε στην επίλυση των δομών χρησιμοποιήθηκαν το λογισμικό Bruker SAINT, το πρόγραμμα SUPERFLIP και το CRYSTALS version 14.40b. Όλα τα άτομα (εκτός των Η) προσδιορίσθηκαν ανισότροπα. Τα άτομα Η βρέθηκαν στις αναμενόμενες θέσεις. Τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα των συμπλόκων δίνονται στους Πίνακες 2, 3 και 4. Πίνακας 2. Κρυσταλλογραφικά δεδομένα των συμπλόκων [Ζn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] και [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ]. Σύμπλοκο [Ζn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] Μοριακός τύπος C 51 H 44 Cl 2 N 8 O 7 Zn C 76 H 70 N 12 O 13 Zn 4 Μοριακό βάρος Θερμοκρασία (Κ) 150(2) 293(2) Ακτινοβολία (Å) MoK\a Cu Ka Σύστημα Μονοκλινές Μονοκλινές Ομάδα συμμετρίας σημείου P 2 1 /c P 2 1 /n a (Å) (2) (2) b (Å) (3) (4) c (Å) (4) (4) α ( ο ) β ( ο ) (2) (10) γ ( ο ) Όγκος (Å 3 ) (14) (2) 71

80 Μόρια ανά κυψελίδα, Ζ 4 4 Πυκνότητα (calc) (Μg/m 3 ) Συντελεστής απορρόφησης μ (mm -1 ) Ανακλάσεις συνολικές Ανακλάσεις [I >2σ (Ι)] Παράμετροι Goodness-of-fit on F Final R [I >2σ (Ι)] R1= , wr2= R1=0.1208, wr2= Πίνακας 3. Κρυσταλλογραφικά δεδομένα των συμπλόκων [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ], [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] και [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ]. Σύμπλοκο [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ] Μοριακός τύπος C 20 H 19 Cl 1 N 2 Ni 0.50 O 3 C 50 H 40 C l2 N 8 Ni 1 O 6 C 53 H 50 N 8 Ni 1 O 7 Μοριακό βάρος Θερμοκρασία (Κ) Ακτινοβολία (Å) Mo K\a Mo K\a Mo K\a Σύστημα Ορθορομβικό τρικλινές μονοκλινές Ομάδα συμμετρίας σημείου I b a 2 P -1 P 1 21/c 1 a (Å) (15) (4) (9) b (Å) 7.234(5) (6) (2) c (Å) (12) (6) (2) α ( ο ) (2) 90 β ( ο ) (2) (7) γ ( ο ) (2) 90 Όγκος (Å 3 ) 3736(4) (16) (8) Μόρια ανά κυψελίδα, Ζ Πυκνότητα (calc) (Μg/m 3 ) Συντελεστής απορρόφησης μ (mm -1 ) Ανακλάσεις συνολικές Ανακλάσεις [I >2σ (Ι)] Παράμετροι Goodness-of-fit on F Final R [I >2σ (Ι)] R1= , wr2= R1= , wr2= R1= , wr2=

81 Πίνακας 4. Κρυσταλλογραφικά δεδομένα των συμπλόκων [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] και [Ni(nap) 2 (phen)(η 2 Ο)]. Σύμπλοκο [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)] Μοριακός τύπος C 13 H N 0.67 Ni 0.33 O 2.33 C 40 H 36 Ni 1 N 2 O 7 Μοριακό βάρος Θερμοκρασία (Κ) Ακτινοβολία (Å) Mo K\a Mo K\a Σύστημα Μονοκλινές Μονοκλινές Ομάδα συμμετρίας σημείου P 2 1 P 2 1 a (Å) (7) (3) b (Å) (5) (2) c (Å) (3) (9) α ( ο ) β ( ο ) (5) (2) γ ( ο ) Όγκος (Å 3 ) (3) (9) Μόρια ανά κυψελίδα, Ζ 6 4 Πυκνότητα (calc) (Μg/m 3 ) Συντελεστής απορρόφησης μ (mm -1 ) Ανακλάσεις συνολικές Ανακλάσεις [I >2σ (Ι)] Παράμετροι Goodness-of-fit on F Final R [I >2σ (Ι)] R1= , wr2= R1= , wr2=

82 4. Μελέτη της αλληλεπίδρασης των συμπλόκων με το DNA 4.1 Μελέτη με υπεριώδη φασματοσκοπία (UV) Η αλληλεπίδραση των υποκαταστατών και των συμπλόκων με το DNA μελετήθηκε με τη φασματοσκοπία υπεριώδους με σκοπό να προσδιορισθεί ο τρόπος αυτής της αλληλεπίδρασης και να υπολογιστεί η σταθερά σύνδεσης, Κ b. Στα πειράματα αυτά, τα φάσματα του DNA παρουσία καθενός από τα σύμπλοκα έχουν καταγραφεί για σταθερή συγκέντρωση DNA σε διάφορους λόγους r= [compound]/[dna]. H σταθερά σύνδεσης των συμπλόκων με το DNA, Κ b, προσδιορίστηκε από τα φάσματα UV των συμπλόκων, που έχουν καταγραφεί για μια σταθερή συγκέντρωση απουσία ή παρουσία του DNA, σε διάφορες τιμές r. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν με διαλύτη DMSO και δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στα φάσματα του DNA. H σταθερά Κ b αποτελεί ένα χρήσιμο εργαλείο για των έλεγχο της ισχύος σύνδεσης ενώσεων με το DNA. Αντιπροσωπεύει τη σταθερά σύνδεσης ανά ζεύγη βάσεων του DNA, μπορεί να ληφθεί μελετώντας τις αλλαγές που παρατηρούνται κατά τη σταδιακή προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων του DNA στην απορρόφηση που αντιστοιχούν στο λ max και δίνεται από το λόγο της τεταγμένης επί την αρχή προς την κλίση της ευθείας ελαχίστων τετραγώνων στο διάγραμμα του λόγου [ DNA] προς ( ε ε ) a f [DNA] σύμφωνα με την εξίσωση που ακολουθεί: [ DNA] ( ε ε ) A f = [ DNA] + ( ε ε ) b f K b 1 ( ε ε ) b f 4.2 Ιξωδομετρία Το ιξώδες του διαλύματος DNA μετρήθηκε παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων των υποκαταστατών και των συμπλόκων. Η σχέση μεταξύ του σχετικού ιξώδους του διαλύματος (η/η 0 ) και του μήκους του DNA (L/L 0 ) υπολογίζεται από τη σχέση: L/L 0 = (η/η 0 ) 1/3, όπου L 0 είναι το φαινομενικό μοριακό μήκος απουσία του συμπλόκου. Τα δεδομένα που λαμβάνονται παρουσιάζονται ως διαγράμματα (η/η 0 ) 1/3 προς r, όπου η είναι το ιξώδες του DNA παρουσία των συμπλόκων και η 0 είναι το ιξώδες μόνο του DNA σε διάλυμα buffer. 74

83 4.3 Κυκλική βολταμμετρία Η αλληλεπίδραση των συμπλόκων με το DNA μελετήθηκε παρακολουθώντας τις αλλαγές που παρατηρήθηκαν στο κυκλικό βολταμμογράφημα ενός διαλύματος του συμπλόκου σε 1:2 buffer:dna συγκέντρωσης 0.40mM ύστερα από προσθήκη DNA σε διάφορες τιμές r. Επίσης, το buffer χρησιμοποιήθηκε ως φέρον ηλεκτρολύτης και τα κυκλικά βολταμμογραφήματα καταγράφηκαν για ν= 100 mvs Ανταγωνιστική δράση με ΕΒ Οι μελέτες ανταγωνιστικής δράσης των συμπλόκων με το ΕΒ πραγματοποιήθηκε με φασματοσκοπία φθορισμού με σκοπό να εξεταστεί αν μια ένωση μπορεί να αντικαταστήσει το ΕΒ από το σύμπλοκο DNA-EB. Το σύμπλοκο DNA-EB παρασκευάστηκε προσθέτοντας 20μΜ ΕΒ και 26μΜ DNΑ σε ρυθμιστικό διάλυμα. Η ικανότητα των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων που παρασκευάστηκαν να αντικαθιστούν το ΕΒ στην ένωση DNA-EB μελετήθηκε από την ελάττωση φθορισμού που παρατηρείται προσθέτοντας σταδιακά συγκεκριμένη ποσότητα διαλύματος της υπό μελέτη ένωσης μέσα σε διάλυμα που περιέχει το EB-DNA. 75

84 5. Μελέτη της αλληλεπίδρασης των συμπλόκων ενώσεων με αλβουμίνες ορού αίματος Η μελέτη ικανότητας σύνδεσης των συμπλόκων στις πρωτεΐνες πραγμα-τοποιήθηκε με πειράματα φθορισμού, χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα βοοειδού (BSA, 3μΜ) ή ανθρώπινης αλβουμίνης ορού αίματος (ΗSA, 3μΜ). Η μεταβολή του φθορισμού της τρυπτοφάνης της BSA στα 343nm ή της HSA στα 351nm καταγράφηκε με την προσθήκη διαλυμάτων των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων τους σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Τα φάσματα φθορισμού για τους υποκαταστάτες και τα σύμπλοκα καταγράφηκαν και κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες. Τα διαγράμματα Stern-Volmer και Scatchard χρησιμοποιούνται με σκοπό να μελετηθεί η αλληλεπίδραση των ενώσεων με τις πρωτεΐνες. Η εξίσωση Stern-Volmer είναι : I I 0 = 1+ k [ q τ 0 Q] = 1+ K όπου, Ι 0 ο αρχικός φθορισμός της αλβουμίνης, Ι= ο φθορισμός της αλβουμίνης μετά την προσθήκη της ένωσης, k q =η σταθερά απόσβεσης των αλβουμίνων, Κ sv = η δυναμική σταθερά απόσβεσης (σταθερά Stern-Volmer), τ 0 = ο μέσος χρόνος ζωής φθορισμού των αλβουμίνων, [Q]= η συγκέντρωση της ένωσης, K SV = k q τ 0. Λαμβάνοντας τ 0 =10-8 s και αφού υπολογιστεί η δυναμική σταθερά απόσβεσης από την κλίση του διαγράμματος I 0 προς [Q], μπορεί να υπολογιστεί η κατά προσέγγιση σταθερά απόσβεσης (k q, Μ -1 s -1 ). I Η εξίσωση Scatchard είναι: I I 0 I = nk K [ Q] I όπου, Κ είναι η σταθερά σύνδεσης της αλβουμίνης με την ένωση η οποία μπορεί να 0 SV [ Q] Ι Ι 0 υπολογιστεί από την κλίση της ευθείας στο διάγραμμα προς [ Q] Ι και n ο αριθμός των Ι 0 θέσεων σύνδεσης ανά αλβουμίνη που υπολογίζεται από την τεταγμένη επί την αρχή προς την κλίση στο ίδιο διάγραμμα. 76

85 6. Μελέτη της αντιοξειδωτικής δράσης Στις in vitro αναλύσεις κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε τουλάχιστον τρεις φορές και η απόκλιση της απορρόφησης ήταν μικρότερη από 10% του μέσου. 6.1 Προσδιορισμός της μείωσης της δράσης της σταθερής ρίζας 1,1-diphenyl-picrylhydrazyl (DPPH) Σε διάλυμα 0.1mM της DPPH σε καθαρή αιθανόλη προστίθεται ίση ποσότητα διαλυμάτων των ουσιών σε αιθανόλη. Χρησιμοποιήθηκε αιθανόλη ως διάλυμα ελέγχου. Τα διαλύματα των συμπλόκων έχουν συγκέντρωση 0.1mM. Μετά από 60 min σε θερμοκρασία δωματίου καταγράφηκε η απορρόφηση στα 517nm. Η ένωση NDGA χρησιμοποιήθηκε ως ουσία αναφοράς. 6.2 Ανάλυση της καθαριστικής δράσης (scavenging activity) της κατιονικής ρίζας To ABTS συγκέντρωσης 2mM διαλύθηκε αρχικά στο νερό. Τα διαλύματα αυτά στη συνέχεια αντέδρασαν με 0.17mM potassium persulfate και έδωσαν κατιονικές ρίζες ABTS (ABTS + ) μετά από παραμονή σε σκοτεινό μέρος σε θερμοκρασία δωματίου για ώρες. Η διαδικασία αυτή οδήγησε σε μια μερική οξείδωση του ABTS, επειδή το ABTS και το potassium persulfate αντιδρούν στοιχειομετρικά με αναλογία 1:0.5. Η οξείδωση του ABTS άρχισε αμέσως, όμως, η απορρόφηση δεν ήταν η μέγιστη και σταθερή μέχρι και μετά την παρέλευση 6 ωρών. Η ρίζα ήταν σταθερή σε αυτή την μορφή για περισσότερες από δύο μέρες, όταν αποθηκεύτηκε στο σκοτεινό δωμάτιο σε θερμοκρασία δωματίου. Τα διαλύματα ABTS + διαλύθηκαν σε αιθανόλη και έδωσαν απορρόφηση 0.70 στα 734nm. Μετά από προσθήκη 10μL των διαλυμένων ενώσεων ή των ενώσεων αναφοράς (0.1mM) σε DMSO, η καταγραφείσα απορρόφηση λήφθηκε μετά από 1 λεπτό απ την αρχική ανάμειξη. 77

86 6.3 Ανταγωνισμός των μελετώμενων ενώσεων σε DMSO για ρίζες υδροξυλίου Οι ρίζες υδροξυλίου (. ΟΗ) δημιουργήθηκαν από το σύστημα Fe 3+ / ασκορβικό οξύ από τον προσδιορισμό της φορμαλδεΰδης που παρήχθηκε από την οξείδωση του DMSO. Το μίγμα της αντίδρασης περιείχε EDTA (0.1 mm), Fe 3+ (167μΜ), DMSO (33mM) σε φωσφορικό buffer (50 mm, ph 7.4), τις εξεταζόμενες ουσίες (συγκέντρωση 0.1 mm) και το ασκορβικό οξύ (10mM). Μετά από επώαση 30 λεπτών (37 ο C), η αντίδραση διακόπηκε με CCl 3 COOH (17% w/v) και μετρήθηκε η απορρόφηση στα 412 nm. Η ουσία αναφοράς που χρησιμοποιήθηκε ήταν το Trolox [69]. 78

87 7. Σύνθεση των συμπλόκων 7.1 Παρασκευή συμπλόκων του Zn Τα σύμπλοκα του ψευδαργύρου που παρασκευάστηκαν διακρίνονται σε δύο κατηγορίες : Στα μονοπυρηνικά σύμπλοκα Στις μεταλλοκορωνοειδείς ενώσεις του ψευδαργύρου. Τα μονοπυρηνικά σύμπλοκα του ψευδαργύρου με τον τύπο [Zn(L) 2 (Hpko) 2 ] παρασκευάστηκαν σύμφωνα με την αντίδραση : ZnCl 2 + 2HL + 2KOH + 2Hpko [Zn(L) 2 (Hpko) 2 ] Παρασκευή του συμπλόκου [Ζn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] (1) Το σύμπλοκο (1) παρασκευάστηκε με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος (20mL) tolfenamic acid (0.2mmol, 0.052g) και ΚΟΗ (0.2mmol, 0.011g ) σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) ZnCl 2 (0.1mmol, 0.014g) ταυτόχρονα με μεθανο-λικό διάλυμα (5 ml) Hpko (0.2mmol, 0.040g).To διάλυμα που προκύπτει αναδεύεται για 5 λεπτά, θολώνει και διηθείτε. Μετά από μερικές μέρες παραλήφθηκαν άχρωμοι κρύσταλλοι [Ζn(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] κατάλληλοι για επίλυση της κρυσταλλικής δομής με περίθλαση ακτίνων Χ. Απόδοση 55% mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ζn(nap) 2 (Hpko) 2 ] (2) Με παρόμοιο τρόπο παρασκευάστηκε και το σύμπλοκο (2) με τη χρήση όμως naproxen (0.2mmol, 0.046g). To υποκίτρινο μικροκρυσταλλικό προϊόν παραλήφθηκε αμέσως μετά την ανάδευση του τελικού διαλύματος. Απόδοση 65%, 58.5 mg. Οι μεταλλοκορoνοειδεί ενώσεις [Zn 4 (L) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] που συντέθηκαν είχαν για υποκαταστάτες το tolfenamic acid και το naproxen. Παρασκευή του συμπλόκου [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (3) Σε αιθανολικό διάλυμα (60mL) του συμπλόκου [Zn(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (0.2mmol, 0.112g) προστέθηκε ορισμένη ποσότητα DMF (4mL) και στη συνέχεια αποπρωτονιωμένο με μεθανολικό διάλυμα (2mL) ΚΟΗ (0.2mmol, 0.011g) αιθανολικό διάλυμα (5mL) Hpko (0.2mmol, 0.040g). Το τελικό διάλυμα αφού θόλωσε ελαφρά διηθήθηκε. Μετά την πάροδο δέκα ημερών λήφθηκαν υποκίτρινοι κρύσταλλοι 79

88 [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] κατάλληλοι για επίλυση της δομής με περίθλαση ακτίνων- Χ. Απόδοση 40%, 10mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Zn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (4) Το σύμπλοκο [Zn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] παρασκευάστηκε ακολουθώντας διαφορετική συνθετική πορεία. Αποπρωτονιωμένο με μεθανολικό διάλυμα (1mL) ΚΟΗ (0.1mmol, g), αιθανολικό διάλυμα (5mL) tolfenamic acid (0.1mmol, 0.026g) και αποπρωτονιωμένο με μεθανολικό διάλυμα (0.3mL) ΚΟΗ (0.3mmol, g) αιθανολικό διάλυμα Ηpko (0.3mmol, 0.06g) προστέθηκαν στάγδην και ταυτόχρονα σε αιθανολικό διάλυμα (30mL) ZnCl 2 (0.1mmol, 0.014g), στο οποίο είχε πρώτα προστεθεί ορισμένη ποσότητα DMF (4mL). Μετά από μερικές μέρες παραλήφθηκε το μικροκρυσταλλικό σύμπλοκο [Zn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ]. Απόδοση 45%, mg. 7.2 Παρασκευή συμπλόκων του Ni Τα σύμπλοκα του νικελίου κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες : Σύμπλοκα με δότη ατόμων Ο, δηλαδή [Ni(L) 2 (H 2 O) 2 ] Σύμπλοκα με δότη ετεροκυκλικά άτομα Ν, όπως bipy, phen, bipyam και py Σύμπλοκα με την οξίμη Hpko Τα σύμπλοκα του νικελίου με δότη ατόμων Ο είναι το [Νi(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] και [Νi(nap) 2 H 2 O) 2 ]. Παρασκευή του συμπλόκου [Νi(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) Με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος (20 ml) αποπρωτονιομένου με μεθανολικό διάλυμα ΚΟΗ (0.4mmol, 0.022g ) tolfenamic acid (0.4mmol, 0.105g) σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g) παρασκευάστηκε το μικροκρυσταλλικό προϊόν [Νi(tolf) 2 (H 2 O) 4 ]. Απόδοση 65%,, 84.5 mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (6) Σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g) προστίθεται μεθανολικό διάλυμα (10mL) naproxen (0.4mmol, 0.092g) το οποίο έχει αποπρωτονιωθεί με μεθανολικό διάλυμα ΚΟΗ (0.4mmol, 0.022g ). Μετά από μερικές μέρες το διάλυμα 80

89 διηθείται και παραλαμβάνεται το ανοιχτό πράσινο μικροκρυσταλλικό σύμπλοκο [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ]. Απόδοση 45%, 247mg. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα σύμπλοκα που περιέχουν ως ligand και δότη ετεροκυκλικών ατόμων Ν και είναι τα [Νi(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ], [Νi(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ], [Νi(tolf) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ], [Ni(tolf) 2 (bipyam)], [Ni(nap) 2 (bipy)- (CH 3 OH)], [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)], [Ni(nap) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] και [Ni(nap) 2 (bipyam)]. Παρασκευή του συμπλόκου [Νi(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) Το σύμπλοκο [Νi(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] παρασκευάστηκε με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος (20mL) tolfenamic acid (0.4mmol, 0.105g) και KOH (0.4mmol, 0.022g) σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g). Μετά από ολιγόλεπτη ανάδευση, το διάλυμα διηθήθηκε και παραλήφθηκαν οι λαχανί κρύσταλλοι κατάλληλοι για επίλυση με περίθλαση ακτίνων-χ. Απόδοση 62%, 198.4mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Νi(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] (8) Με παρόμοιο τρόπο με το προηγούμενο σύμπλοκο παρασκευάστηκε το Νi(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ]. Όμως, χρησιμοποιήθηκε μεθανολικό διάλυμα (5mL) bipy (0.4mmol, 0.062g) αντί για phen. Απόδοση 56%, 91.3 mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Νi(tolf) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ] (9) Μεθανολικό διάλυμα (20mL) tolfenamic acid (0.4mmol, 0.105g) KOH (0.4mmol, 0.022g) προστίθεται στάγδην και υπό ανάδευση σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g). Στη συνέχεια, προστίθεται πυριδίνη (2mL). Μετά από μερικές μέρες το διάλυμα διηθείται και παραλαμβάνεται το μικροκρυσταλλικό προϊόν που αντιστοιχεί στο σύμπλοκο [Νi(tolf) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ]. Απόδοση 45%, 68.5mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (bipyam)] (10) Μεθανολικό διάλυμα (20mL) tolfenamic acid (0.4mmol, 0.105g) αποπρωτονιώθηκε με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος ΚΟΗ (0.4mmol, 0.022g) και ανάδευση 1 ώρας. Έπειτα, προστέθηκε σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g) ταυτόχρονα με μεθανολικό διάλυμα (5mL) bipyam (0.2mmol, 81

90 0.034g). Μετά από μερικές μέρες παραλήφθηκε με διήθηση το πράσινο μικροκρυσταλλικό σύμπλοκο [Ni(tolf) 2 (bipyam)]. Απόδοση 55%, 206.8mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (11) Μεθανολικό διάλυμα (15mL) naproxen (0.8mmol, 0.18g) και KOH (0.8mmol, 0.045g) προστίθενται ταυτόχρονα με μεθανολικό διάλυμα (10mL) bipy (0.4 mmol, 0.062g) σε μεθανολικό διάλυμα (10mL) NiCl 2 6H 2 O (0.4mmol, 0.095g). Στη συνέχεια, το διάλυμα αναδεύεται για μισή ώρα και προστίθενται 5mL διαιθυλαιθέρα έτσι ώστε να σχηματιστεί μια στιβάδα πάνω από το τελικό διάλυμα. Μετά από μερικές μέρες παραλαμβάνονται γαλάζιοι κρύσταλλοι [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] κατάλληλοι για επίλυση με περίθλαση ακτίνων Χ. Απόδοση 52%, 49mg,. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)] (12) Με τρόπο παρόμοιο με το παραπάνω σύμπλοκο παρασκευάστηκε και το σύμπλοκο[ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)]. Οι μόνες διαφορές είναι ότι χρησιμοποιήθηκε η μισή ποσότητα αντιδραστηρίων και phen (0.2mmol, 0.036g) στη θέση της bipy. Το γαλάζιο μικροκρυσταλλικό προϊόν που παραλήφθηκε με διήθηση έχει απόδοση 60%, 84mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] (13) Μεθανολικό διάλυμα (15mL) naproxen (1mmol, 0.230g) και KOH (1mmol, 0.056g) προστίθεται στάγδην και υπό ανάδευση σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.5mmol, 0.119g). Έπειτα, προστίθεται πυριδίνη (2mL) και μετά από μερικές μέρες το διάλυμα διηθείται και παραλαμβάνεται το μικροκρυσταλλικό προϊόν [Ni(nap) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ]. Απόδοση 66%, 237.6mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (bipyam)] (14) Το σύμπλοκο [Ni(nap) 2 (bipyam)] παραλήφθηκε με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος (15mL) naproxen (0.8 mmol, 0.180g) που έχει αποπρωτονιωθεί με μεθανολικό διάλυμα KOH (0.8mmol, 0.045g) σε μεθανολικό διάλυμα (10mL) NiCl 2 6H 2 O (0.4mmol, 0.095g) ταυτόχρονα με μεθανολικό διάλυμα (10mL) bipyam (0.4mmol, 0.068g). Ακολούθησε ανάδευση μισή ώρα και προσθήκη μια στιβάδας 82

91 διαιθυλαιθέρα (5mL). Μετά από χρονικό διάστημα δέκα ημερών παραλήφθηκε μπλε μικροκρυσταλλικό προϊόν. Απόδοση 53%, 145.7mg. Στην τρίτη κατηγορία των συμπλόκων του νικελίου ανήκουν αυτά που έχουν συναρμοσμένη η οξίμη Hpko και είναι [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ], [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] και [Ni(nap) 2 (Hpko) 2 ]. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] (15) Το σύμπλοκο παρασκευάστηκε με προσθήκη μεθανολικού διαλύματος (20mL) tolfenamic acid (0.4mmol, 0.105g) και KOH (0.4mmol, 0.022g) σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g) ταυτόχρονα με μεθανολικό διάλυμα (5mL) Ηpko (0.2mmol, 0.040g). Πορτοκαλοκαφέ κρύ-σταλλοι του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ], κατάλληλοι για επίλυση με περίθλαση ακτίνων -Χ, παραλήφθηκαν μετά από μερικές μέρες και αφού το διάλυμα ήταν σε ατμόσφαιρα διαιθυλαιθέρα. Απόδοση 37%, 71.4mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] (16) Με παρόμοιο τρόπο με το σύμπλοκο [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ], παραλήφθηκε και το σύμπλοκο αυτό όμως χρησιμοποιήθηκε μεθανολικό διάλυμα (20mL) mefenamic acid (0.4mmol, 0.096g) στη θέση του tolfenamic acid. Οι πορτοκαλοκαφέ κρύσταλλοι που παραλήφθηκαν μετά από διάστημα δύο εβδομάδων ήταν κατάλληλοι για επίλυση της δομής τους με περίθλαση ακτίνων -Χ. Απόδοση 42%, 80.6mg. Παρασκευή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (17) Το σύμπλοκο παρασκευάστηκε με προσθήκη σε μεθανολικό διάλυμα (5mL) NiCl 2 6H 2 O (0.2mmol, 0.047g) μεθανολικού διαλύματος (10mL) naproxen (0.4mmol, 0.092g) και KOH (0.4mmol, g ) ταυτόχρονα με μεθανολικό διάλυμα (5mL) Ηpko (0.4mmol, 0.080g). To καφέ μικροκρυσταλλικό σύμπλοκο [Ni(nap) 2 (Hpko) 2 ] παραλήφθηκε μετά από μερικές μέρες και αφού το διάλυμα ήταν σε ατμόσφαιρα διαιθυλαιθέρα. Απόδοση 45%, 81mg. Οι διαλυτότητες όλων των συμπλόκων δίνονται στον Πίνακα 4. Όλα τα σύμπλοκα είναι διαλυτά σε DMSO και σε DMF. Τα περισσότερα σύμπλοκα είναι μερικώς διαλυτά 83

92 σε μεθανόλη (MeOΗ), ακετονιτρίλιο (CH 3 CN), χλωροφόρμιο (CHCl 3 ), διχλωρομεθάνιο (CH 2 Cl 2 ) και ακετόνη και αδιάλυτα στο νερό. Πίνακας 5. Διαλυτότητες των συμπλόκων (1)-(17). Σύμπλοκα MeOH CH 3 CN DMSO DMF H 2 O CHCl 3 CH 2 Cl 2 Ακετόνη (1) ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΥ Α ΔΥ ΔΠ ΔΥ (2) ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΠ Α ΔΥ ΔΥ Α (3) ΔΥ ΔΥ Δ Δ Α ΔΥ ΔΥ ΔΥ (4) ΔΥ ΔΥ Δ Δ Α ΔΥ ΔΥ ΔΥ (5) ΔΥ ΔΥ Δ Δ ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΥ (6) ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΥ Α ΔΘ ΔΘ Α (7) ΔΠ ΔΠ Δ Δ Α Δ ΔΥ Δ (8) ΔΥ ΔΘ ΔΠ ΔΠ Α ΔΠ ΔΠ ΔΘ (9) ΔΠ ΔΠ Δ Δ Α Δ Δ Δ (10) ΔΥ ΔΥ ΔΠ ΔΠ Α Α ΔΘ Α (11) ΔΠ ΔΥ ΔΠ ΔΠ ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΥ (12) ΔΥ ΔΥ ΔΥ ΔΥ Α ΔΥ Δ ΔΥ (13) Δ Δ Δ Δ ΔΘ Δ Δ Δ (14) ΔΠ ΔΠ Δ Δ Α ΔΥ ΔΥ ΔΥ (15) ΔΥ ΔΘ ΔΥ ΔΠ Α ΔΠ ΔΥ ΔΥ (16) ΔΥ ΔΥ ΔΠ ΔΠ ΔΘ Α Α Α (17) Δ Δ Δ Δ ΔΘ Δ Δ Δ Δ: διαλυτή, Α: αδιάλυτη, ΔY: διαλυτή σε υπέρηχους, ΔΠ :διαλυτή με παραμονή, ΔΘ: διαλυτή εν θερμώ 84

93 Πίνακας 6. Μοριακό βάρος, αποτελέσματα στοιχειακών αναλύσεων και τιμές μοριακής αγωγιμότητας (σε μs/cm) των συμπλόκων σε διάλυμα DMSO 10-3 M. Οι τιμές στις παρενθέσεις αντιστοιχούν στις θεωρητικές τιμές της στοιχειακής ανάλυσης. Σύμπλοκα ΜΒ %C %H %N (1) (60.20) (4.36) (2) (65.10) (4.80) (3) (73.11) (4.09) (4) (53.72) (3.51) (5) (55.9) (4.69) (6) (60.79) (5.47) (7) (60.03) (4.79) (8) (61.19) (4.65) (9) (61.8) (4.82) (10) (60.75) (4.16) (11) (66.46) (5.44) (12) (67.15) (5.07) (13) (64.15) (5.67) (14) (66.30) (5.12) (11) 8.65 (9.10) 5.03 (5.68) 4.10 (4.4) 3.88 (4.35) Λ μ (μs/cm) (7.00) (6.80) (7.59) (9.32) (3.99) (3.92) (3.94) (6.10) 14 85

94 Συνέχεια (15) (61.37) 4.25 (4.12) (11.45) 8 (16) (65.64) 4.20 (5.19) (11.55) 13 (17) (65.60) 4.46 (4.84) 8.97 (9.18) 6 Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία όταν η μοριακή του αγωγιμότητα είναι μs/cm μία ουσία είναι 1:1 ηλεκτρολύτης. Παρατηρούμε λοιπόν ότι οι τιμές αυτές για τα μελετώμενα σύμπλοκα είναι αρκετά μικρότερες από 22.5 μs/cm (Πίνακας 5), άρα δεν είναι ηλεκτρολύτες, δεν διίστανται στο διάλυμα DMSO και παραμένουν σταθερά. Από τις στοιχειακές αναλύσεις διαπιστώνουμε ότι οι πειραματικές τιμές συμπίπτουν με τις θεωρητικές τιμές. 86

95 8.Φασματοσκοπική μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων Οι φασματοσκοπικές μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων που παρασκευάστηκαν ήταν: Φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR), Φασματοσκοπία Υπεριώδους- Ορατού (Uv-vis) Μαγνητικές μετρήσεις σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, και Μελέτη με κυκλική βολταμμετρία 8.1 Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με τη φασματοσκοπία Υπερύθρου (IR) Στα φάσματα υπερύθρου ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι κορυφές που αποδίδονται σε δονήσεις τάσεως της καρβοξυλικής ομάδας των ΜΣΑΦ που είναι ενδεικτικές του τρόπου συναρμογής της. Οι δονήσεις τάσης ν(ο-η), ν(c=o) carboxylic και ν(c-ο) carboxylic της καρβοξυλικής ομάδας των τριών ΜΣΑΦ που μελετούνται βρίσκονται στα 3355 cm -1, 1661 cm -1 και 1265 cm -1 αντίστοιχα για το tolfenamic acid, 3370 cm -1, 1649 cm -1 και 1257 cm -1 αντίστοιχα για το mefenamic acid και 3385 cm -1, 1728 cm -1 και 1265cm -1 αντίστοιχα για το naproxen (Σχήμα 69) % T Wav enumbers (cm-1) (Α) 87

96 70 65 %T Wavenumbers (cm-1) (Β) %T Wavenumbers (cm-1) (Γ) Σχήμα 69. Τα φάσματα υπερύθρου των Ηtolf (A), Hmef (B) και Hnap (Γ). Στα σύμπλοκα (1), (5),(7)-(10) και (15) που παρασκευάστηκαν, οι δονήσεις τάσης της καρβοξυλικής ομάδας του υποκαταστάτη tolfenamic acid έχουν αντικατασταθεί από δύο χαρακτηριστικές ταινίες. Η μία βρίσκεται στην περιοχή cm -1 που 88

97 αντιστοιχεί στην αντισυμμετρική δόνηση τάσης v asym (C=O), και η άλλη στην περιοχή cm -1 και αποδίδεται στη συμμετρική δόνηση τάσης v sym (C=O) της καρβοξυλικής ομάδας. Στο σύμπλοκο [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] (16), η αντισυμμετρική δόνηση τάσης της καρβοξυλικής ομάδας του mefenemato ligand βρίσκεται στα 1608cm -1 και η συμμετρική δόνηση τάσης στα 1387cm -1. Στα φάσματα IR των συμπλόκων που φέρουν ως υποκαταστάτη το naproxen (2), (6), (11)-(14) και (17) η v asym (C=O) εντοπίζεται στην περιοχή cm -1 και η v sym (C=O) στην περιοχή cm -1 (Πίνακας 7). Πίνακας 7. Χαρακτηριστικές δονήσεις τάσης των σύμπλοκων ενώσεων (1)-(17) παρασκευάστηκαν. Η παράμετρος Δ ορίζεται ως η διαφορά της v sym (CO 2 ) από την v asym (CO 2 ). Σύμπλοκα v asym(co 2 ) (cm -1 ) v sym (CO 2 ) (cm -1 ) Δ (cm -1 ) [Ζn(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (1) [Ζn(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (2) [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (6) [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) [Ni(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] (8) [Ni(tolf) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] (9) [Ni(tolf) 2 (bipyam)] (10) [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (11) [Ni(nap) 2 (phen)(η 2 Ο)] (12) [Ni(nap) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ] (13) [Ni(nap) 2 (bipyam)] (14)

98 [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (15) [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ] (16) [Ni(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (17) Η διαφορά μεταξύ της αντισυμμετρικής και της συμμετρικής δόνησης τάσης της καρβοξυλικής ομάδας είναι Δ=[ν asym (CO 2 ) - ν sym (CO 2 )] και η τιμής της είναι χαρακτηριστική του τρόπου συναρμογής της καρβοξυλικής ομάδας. Στα σύμπλοκα η διαφορά κυμαίνεται μεταξύ 192 cm -1 και 221 cm -1 που δηλώνει ασύμμετρο τρόπο συναρμογής της καρβοξυλικής ομάδας (Σχήματα 70-74). Επιπλέον, στην περιοχή cm -1 εμφανίζονται μέτριας εντάσεως κορυφές που μπορούν να αποδοθούν στις δονήσεις εκτός επιπέδου (p r ) των αρωματικών υδρογόνων των πυριδινικών δακτυλίων με χαρακτηριστική τιμή για κάθε υποκαταστάτη Ν-Ν. Πιο συγκεκριμένα, η αντίστοιχη τιμή για σύμπλοκα με bipy εντοπίζεται στην περιοχή cm -1 και για αυτά με phen στα cm -1, το bipyam στα cm -1 και για αυτά με py στα 692 cm -1. Η οξίμη Hpko δίνει μια κορυφή στα 744 cm -1 και μετά τη συναρμογή της με το μέταλλο εμφανίζει μια χαρακτηριστική ευρεία κορυφή ενδιάμεσης έντασης στα cm %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 70. Το φάσμα ΙR του [Zn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] 90

99 %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 71. Το φάσμα ΙR του [Νi(tolf) 2 (Η 2 Ο) 4 ] %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 72. Το φάσμα ΙR του [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] 91

100 65 %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 73. Το φάσμα ΙR του [Ni(nap) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 74. Το φάσμα ΙR του [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Οι μεταλλοκορoνοειδείς ενώσεις [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (3) και [Zn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (4) εμφανίζουν πιο περίπλοκα φάσματα. Οι χαρακτηριστικές κορυφές του συμπλόκου [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (3) αφορούν τις δονήσεις τάσεις v(n- O ox ) pko στα 1265 cm -1, v(c=o ox ) pko στα 1461cm -1, v asym (CO 2 ) στα 1596 cm -1 και v sym (CO 2 ) στα 1437 cm -1 (Σχήμα 75). Επίσης, οι κορυφές που αντιστοιχούν στην ένωση 92

101 [Zn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (4) εντοπίζονται στα 1265 cm -1 για τη v(n-o ox ) pko, για τη v(c=o ox ) pko στα 1467cm -1,ενώ οι δονήσεις τάσης v asym (CO 2 ) και v sym (CO 2 ) στα 1595 cm -1 στα 1442 cm -1, αντίστοιχα %T Wav enumbers (cm-1) Σχήμα 75. Το φάσμα IR του [Zn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (3) 8.2 Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με τη φασματοσκοπία Υπεριώδους-Ορατού (Uv-vis) Τα φάσματα υπεριώδους-ορατού των συμπλόκων ενώσεων λήφθηκαν σε διάλυμα DMSO και σε αιώρημα nujol με σκοπό τη διερεύνηση της δομής σε διάλυμα και σε στερεή κατάσταση (Σχήματα 76 και 77). Διαπιστώθηκε μετά από σύγκριση μεταξύ των αντίστοιχων φασμάτων, ότι τα σύμπλοκα διατηρούν τη δομή τους σε διάλυμα (Πίνακας 8). 93

102 A 0.2 A λ(nm) λ(nm) (Α) (Β) Σχήμα 76. Φάσμα του συμπλόκου (Α) [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) σε DMSO συγκέντρωσης 10-5 Μ και (B) [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)] (12) σε DMSO συγκέντρωσης Μ A 0.8 A λ(nm) λ(nm) (A) (B) Σχήμα 77. Φάσμα του συμπλόκου (A) [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (8) και (Β) [Νi(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (12) σε αιώρημα nujol. Για τα σύμπλοκα του νικελίου εμφανίζονται τρεις ταινίες που μπορούν να αποδοθούν σε d-d μεταπτώσεις, όπως αναμένεται για οκταεδρικά σύμπλοκα του Ni (II). Πιο συγκεκριμένα μια ταινία (ταινία Ι) εμφανίζεται στην περιοχή nm και μπορεί να αποδοθεί σε μετάπτωση 3 A 2g 3 T 2g. Η ταινία ΙΙ στην περιοχή nm αποδίδεται σε μετάπτωση 3 A 2g 3 T 1g και η ταινία ΙΙΙ στην περιοχή nm αποδίδεται σε μετάπτωση 3 A 2g 3 T 1g (P). Στην υπεριώδη περιοχή εμφανίζονται χαρακτηριστικές ταινίες για όλα τα σύμπλοκα (Zn(II) Ni(II)) (1) (17) που μπορούν να αποδοθούν σε intra ligand μεταπτώσεις (Πίνακας 8). 94

103 Πίνακας 8. Μήκος κύματος των μέγιστων των ταινιών των ηλεκτρονικών φασμάτων σε διάλυμα DMSO και ως αιώρημα nujol των συμπλόκων. Σε παρενθέσεις δίνονται οι τιμές του συντελεστή μοριακής απόσβεσης ε για τις αντίστοιχες ταινίες. Σύμπλοκα [Ζn(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (1) [Ζn(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (2) [Ζn 4 (nap) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (3) [Ζn 4 (tolf) 2 (pko) 4 (OH) 2 ] (4) Ταινία Ι Ταινία ΙΙ DMSO nujol DMSO nujol 303 (33500) 314 (13200) 298 (27820) 300 (4004) (13900) 331 (10580) 333 (23860) 336 (3116)

104 Σύμπλοκα [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (6) [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) [Ni(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] (8) [Ni(tolf) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] (9) [Ni(tolf) 2 (bipyam)] (10) [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (11) [Ni(nap) 2 (phen)(η 2 Ο)] (12) [Ni(nap) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ] (13) [Ni(nap) 2 (bipyam)] (14) [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (15) [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ] (16) [Ni(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (17) Ταινία Ι Ταινία ΙI Ταινία ΙII Ταινία ΙV Ταινία V DMSO nujol DMSO nujol DMSO nujol DMSO nujol DMSO nujol 1013 (6) 995 (30) 1022 (6) 1017 (6) 1055 (5) 970 (5) 1000 (8) 998 (8) 995 (6) 1014 (10) 931 (17) 950 (14) 929 (16.80) (10) 731 (35) 642 (12) 644 (10) 719 (12) 641 (14) 634 (6) 638 (8) 694 (5) 645 (12) 520 (135) 535(sh) (110) 518(sh) (150) (35) 395 (420) 419 (40) 404(sh) (60) 416 (40) 409(sh) (24) 401(sh) (26) 390(sh) (60) 403 (12) 399(sh) (30) 385 (150) 350 (160) 392(sh) (160) (3967) 332 (5.225) 332 (4.133) 332 (3.900) 319 (17.500) 351 (17.767) 349 (15.360) 324 (12.700) (27.600) 318 (3500) 296 (84.400) 293 (66.400) 304 (32.250) 308 (36.333) 318 (5.140) 319 (3.293) 304 (13.567) 288 (36.133) 284 (32.400)

105 8.3 Μαγνητικές μετρήσεις των συμπλόκων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος Οι μαγνητικές μετρήσεις σε θερμοκρασία περιβάλλοντος έγιναν σύμφωνα με τη μέθοδο Faraday. Τα αποτελέσματα της δρώσας μαγνητικής ροπής, μ eff, όπως υπολογίστηκε για τα σύμπλοκα δίνονται στον Πίνακα 9. Πίνακας 9. Διαμαγνητικές διορθώσεις χ Δ και τιμές δρώσας μαγνητικής ροπής μ eff (BΜ= μαγνητόνες Bohr ) των συμπλόκων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Σύμπλοκα Mr χ Δ (x 10-6 ) μ eff (ΒΜ) [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (6) [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) [Ni(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] (8) [Ni(tolf) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] (9) [Ni(tolf) 2 (bipyam)] (10) [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (11) [Ni(nap) 2 (phen)(η 2 Ο)] (12) [Ni(nap) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ] (13) [Ni(nap) 2 (bipyam)] (14) [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (15) [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ] (16) [Ni(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (17)

106 Οι σύμπλοκες ενώσεις (5)-(17) είναι παραμαγνητικές και οι τιμές της δρώσας μαγνητικής ροπής,μ eff, είναι στην περιοχή BM που είναι τιμή μεγαλύτερη από την θεωρητικά αναμενόμενη (2.83 ΒΜ) και είναι χαρακτηριστική για μονοπυρηνικά οκταεδρικά σύμπλοκα του Νi +2 με απομονωμένα ιόντα. 8.4 Μελέτη των σύμπλοκων ενώσεων με κυκλική βολταμμετρία Η μελέτη των συμπλόκων με την κυκλική βολταμμετρία έγινε σε διάλυμα DMSO διότι όλα τα σύμπλοκα διαλύονται σε μεγάλο βαθμό σε αυτό. Τα κυκλικά βολταμμογραφήματα λήφθηκαν με ταχύτητα σάρωσης 100 mv/s στην περιοχή δυναμικού +1.5V έως -1.5V αλλά και σε επιμέρους περιοχές με σκοπό την εύρεση, την απόδοση και την εξάρτηση των κυμάτων που παρουσιάζονται. Η σάρωση ξεκινάει από τιμή δυναμικού 0 V, προχωρά προς αρνητικές τιμές έως την τιμή -1.5 V συνεχίζει προς τις θετικές τιμές δυναμικού έως την τιμή +1.5 V, επιστρέφει στο αρχικό δυναμικό 0 V ολοκληρώνοντας έναν κύκλο (κυκλικό βολταμμογράφημα) και επαναλαμβάνεται για δύο ή τρεις κύκλους ακόμα scan 1 scan I(µA) scan 1 scan 2 I(µA) E(V) E(V) (Α) (B) Σχήμα 78. Κυκλικά βολταμμογραφήματα στην περιοχή +1.5 V έως -1.5 V των συμπλόκων (Α) [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] και (B) [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)]. Για το σύμπλοκο [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) (Σχήμα 78) εμφανίζονται δυο καθοδικά κύματα (Ep c1 ) στα -495 mv και (Ep c2 ) mv, που υποδηλώνουν ότι η αναγωγή του Ni(II) γίνεται σε δύο στάδια και δύο ανοδικά κύματα που αποδίδονται στη οξείδωση του Ni (0) προς Ni(I) και Ni(II) στα -335 mv (Ep a1 ) και -231 mv (Ep a2 ), αντίστοιχα. Όλα τα 98

107 υπόλοιπα σύμπλοκα παρουσιάζουν παρόμοια κυκλικά βολταμμογραφήματα σε διάλυμα DMSO και τα αντίστοιχα δυναμικά δίνονται στον Πίνακα 10. Πίνακας 10. Καθοδικά και ανοδικά δυναμικά (mv) των οξειδοαναγωγικών δράσεων που λαμβάνουν χώρα σε διάλυμα dmso των συμπλόκων ενώσεων του νικελίου. Σύμπλοκα Ε pc1 Ε pc2 Ε pa1 Ε pa2 [Ni(tolf) 2 (H 2 O) 4 ] (5) [Ni(nap) 2 (H 2 O) 2 ] (6) [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] (7) [Ni(tolf) 2 (phen)(ch 3 OH) 2 ] (8) [Ni(tolf) 2 (py) 2 (H 2 O) 2 ] (9) [Ni(tolf) 2 (bipyam)] (10) [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] (11) [Ni(nap) 2 (phen)(η 2 Ο)] (12) [Ni(nap) 2 (py) 2 (Η 2 Ο) 2 ] (13) [Ni(nap) 2 (bipyam)] (14) [Ni(tolf) 2 (Ηpko) 2 ] (15) [Ni(mef) 2 (Ηpko) 2 ] (16) [Ni(nap) 2 (Ηpko) 2 ] (17)

108 9. Χαρακτηρισμός της δομής των συμπλόκων ενώσεων 9.1 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Ζn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Το σύμπλοκο [Zn(tolf) 2 (Hpko) 2 ] είναι μονοπυρηνικό και τα δυο τολφεναμικά ligands είναι αποπρωτονιωμένα και συναρμόζονται με το άτομο του ψευδαργύρου μέσω ενός οξυγόνου ο καθένας. Στους Πίνακες 11 και 12 δίνονται οι επιλεγμένες αποστάσεις και γωνίες δεσμών, αντίστοιχα. Στο Σχήμα 79 δίνεται η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου. Πίνακας 11. Επιλεγμένες αποστάσεις των δεσμών στο σύμπλοκο [Zn(tolf) 2 (Hpko) 2 ]. Δεσμός Å Δεσμός Å Zn(1)- O(8) (14) Ζn(1)-N(14) (16) Zn(1)-O(9) (13) Zn(1)-N(10) (17) Zn(1)- Ν(17) (17) Ζn(1)-N(15) (16) O(9)- C(56) 1.273(2) O(6)- C(56) 1.265(2) O(4)- N(14) 1.367(2) O(5)- N(15) 1.370(2) Πίνακας 12. Επιλεγμένες γωνίες δεσμών του συμπλόκου [Zn(tolf) 2 (Hpko) 2 ]. Γωνίες ( ) Γωνίες ( ) O(8)- Zn(1)- O(9) 85.57(6) O(8)- Zn(1)- N(17) (6) O(8)- Zn(1)- N(14) 97.38(6) O(9)- Zn(1)- N(17) 89.17(6) O(9)- Zn(1)- N(14) 94.04(6) N(17)- Zn(1)- N(14) 75.75(6) O(9)- Zn(1)- N(10) (6) O(8)- Zn(1)- N(10) 89.84(6) N(17)- Zn(1)- N(10) 96.47(6) N(14)- Zn(1)- N(10) 95.62(6) O(8)- Zn(1)- N(15) 95.23(6) O(9)- Zn(1)- N(15) 96.41(6) N(17)- Zn(1)- N(15) 92.54(6) N(14)- Zn(1)- N(15) (6) N(10)- Zn(1)- N(15) 74.88(6) 100

109 Σχήμα 79. Η κρυσταλλική δομή του [Zn(tolf) 2 (Hpko) 2 ]. Τα δυο tolfenamato ligands συναρμόζονται στον ψευδάργυρο μονοδραστικά μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου και τα δύο Hpko ligands είναι διδραστικά συναρμοσμένα στον Zn μέσω του οξιμικού αζώτου και ενός πυριδινικού αζώτου σχηματίζοντας μ αυτόν τον τρόπο έναν πενταμελή χηλικό δακτύλιο. Ο ψευδάργυρος εμφανίζει αριθμό συναρμογής έξι και είναι περιτριγυρισμένος από δύο τολφεναμικά ligands και δύο Hpko εμφανίζοντας μια παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία με τις κορυφές του οκταέδρου να είναι κατειλημμένες από τέσσερα άτομα αζώτου της Hpko και δύο άτομα οξυγόνου του tolf -1. Οι αποστάσεις των ατόμων των οξυγόνων γύρω από το άτομο του Zn είναι περίπου ίσες (Zn(1)- O(8) = (14) Å και Zn(1)-O(9) = (13) Å). Το ίδιο ισχύει και για τις αποστάσεις του με τα άζωτα, με τα μήκη δεσμών Zn(1)-N(10), Ζn(1)-N(15), Ζn(1)- N(14) και Zn(1)- Ν(17) να είναι (17) Å, (16) Å, (16) Å και (17) Å, αντίστοιχα. Το άζωτο Ν(17) της 2,2 -διπυριδυλκετονοξίμη και το οξυγόνο Ο(8) του τολφεναμικού ligand βρίσκονται στις κορυφές του οκταέδρου, ενώ τα άζωτα Ν(10), Ν(15) και Ν(14) και το οξυγόνο Ο(9) καταλαμβάνουν τις κορυφές της βάσης του οκταέδρου. 101

110 9.2 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 (nap) 2 ] Et 2 O Η κρυσταλλική του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 (nap) 2 ] Et 2 O φαίνεται στο Σχήμα 80 και οι σημαντικότερες αποστάσεις και γωνιών δεσμών δίνονται στους Πίνακες 13 και 14, αντίστοιχα. Σχήμα 80. Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 (nap) 2 ] Et 2 O Πίνακας 13. Επιλεγμένες αποστάσεις δεσμών του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 (nap) 2 ] Et 2 O.Δεσμός (Å) Δεσμός (Å) Δεσμός (Å) Zn(1) O(1) 1.978(6) Zn(2) N(2) 2.134(6) Zn(3) N(23) 2.193(7) Zn(1) O(21) 1.970(6) Zn(2) N(61) 2.135(7) Zn(3) N(43) 2.185(8) Zn(1) O(2X) 1.992(5) Zn(2) N(62) 2.202(7) Zn(3) N(42) 2.188(6) Zn(1) O(111) 1.982(9) Zn(2) N(3) 2.209(7) Zn(4) O(1X) 1.975(5) Zn(1) O(112) 2.444(14) Zn(3) O(1X) 2.072(6) Zn(4) O(61) 1.966(6) Zn(2) O(1X) 2.109(5) Zn(3) O(2X) 2.140(5) Zn(4) O(41) 1.947(6) Zn(2) O(2X) 2.104(6) Zn(3) N(22) 2.128(7) Zn(4) O(91) 1.976(10) 102

111 Πίνακας 14. Επιλεγμένες γωνίες δεσμών του συμπλόκου [Zn 4 (OH) 2 (pko) 4 (nap) 2 ] Et 2 O. Γωνία ( ο ) Γωνία ( ο ) Γωνία ( ο ) O(1) Zn(1) O(21) 107.7(3) O(1X) Zn(2) O(2X) 79.9(2) O(1X) Zn(3) N(43) 159.5(2) O(1) Zn(1) O(2X) 102.1(2) O(1X) Zn(2) N(2) 105.8(2) O(2X) Zn(3) N(43) 94.8(2) O(21) Zn(1) O(2X) 101.8(2) O(2X) Zn(2) N(2) 91.0(2) N(22) Zn(3) N(43) 89.9(3) O(1) Zn(1) O(111) 94.9(3) O(1X) Zn(2) N(61) 91.2(2) O(1X) Zn(3) N(42) 88.5(2) O(21) Zn(1) O(111) 105.1(3) N(2) Zn(2) N(61) 156.1(2) O(2X) Zn(3) N(42) 111.4(2) O(2X) Zn(1) O(111) 141.9(3) O(1X) Zn(2) N(62) 164.0(2) N(22) Zn(3) N(42) 154.6(2) O(1) Zn(1) O(112) 140.8(4) O(2X) Zn(2)- N(62) 97.5(2) N(43) Zn(3) N(42) 75.0(3) O(21) Zn(1 )- O(112) 106.4(4) N(2) Zn(2) N(62) 90.0(2) O(1X) Zn(3) N(23) 94.0(2) O(2X) Zn(1) O(112) 89.1(4) N(61) Zn(2 )- N(62) 74.6(3) O(2X) Zn(3) N(23) 160.5(2) O(111) Zn(1) O(112) 57.7(4) O(1X) Zn(2) N(3) 88.0(2) N(22) Zn(3) N(23) 74.8(3) O(61) Zn(4) O(41) 110.2(3) O(2X) Zn(2) N(3) 158.1(2) N(43) Zn(3) N(23) 97.0(3) O(61) Zn(4) O(91) 111.2(3) N(2) Zn(2) N(3) 74.7(3) N(42) Zn(3) N(23) 86.8(2) O(91) Zn(4) O(1X) 115.1(3) N(61) Zn(2) N(3) 89.6(3) O(1X) Zn(3) O(2X) 79.9(2) O(41) Zn(4) O(91) 111.8(3) N(62) Zn(2) N(3) 99.0(2) O(1X) Zn(3 ) N(22) 109.7(3) O(61) Zn(4) O(1X) 103.9(2) O(2X) Zn(2) N(61) 108.7(3) O(2X) Zn(3) N(22) 89.8(2) O(41) Zn(4)- O(1X) 104.1(2) Zn(4) O(1X) Zn(3) 109.7(3) Zn(3) O(1X) Zn(2) 101.1(2) Zn(1) O(2X) Zn(3) 108.9(2) Zn(4) O(1X)- Zn(2) 107.9(2) Zn(1) O(2X) Zn(2) 108.0(2) Zn(2) O(2X) Zn(3) 99.1(2) Πρόκειται για μία μεταλλοκορονοειδή ένωση με τύπο (ΟΗ) 2 [inv12-mc Zn(II)N(pko) - 4](nap) 2 Et 2 O. Η παραπάνω μεταλλοκορονοειδής ένωση χαρακτηρίζεται ως ανεστραμμένη (inverse) επειδή τα άτομα του ψευδαργύρου προσανατολίζονται προς το εσωτερικό της κοιλότητας (cavity) αντί για τα άτομα οξυγόνου. Οι μεταλλοκορονοειδείς ενώσεις είναι αντίστοιχες των κορονοειδών αιθέρων και προέκυψαν από την αντικατάσταση των ατόμων άνθρακα στους κορονοειδείς αιθέρες από ένα άτομο μετάλλου και ένα άλλο ετεροάτομο, συνήθως πρόκειται για Ν ή S. Η ονοματολογία των μεταλλοκορονοειδών ενώσεων σχετίζεται με την αντίστοιχη των κορονοειδών αιθέρων, με τη διαφορά ότι είναι πιο πολύπλοκη. Γενικά ο τύπος της μεταλλοκορονοειδούς ένωσης είναι M m X x [A-MC M(ox)H(Z) -B] όπου τα Α και B δείχνουν το μέγεθος του δακτυλίου και τον αριθμό των ατόμων οξυγόνου που δρουν ως δότες, ενώ τα γράμματα MC ορίζουν τη μεταλλοκορονοειδή ένωση (MetallaCrown). Στον τύπο που δόθηκε, M και (ox) είναι αντίστοιχα το μέταλλο του δακτυλίου και η οξειδωτική του 103

112 κατάσταση, H είναι το είδος του ετεροατόμου του δακτυλίου (για παράδειγμα άζωτο) και Z είναι η συντομογραφία του οργανικού ligand που παρέχει ως δότες τα άτομα οξυγόνου. Επίσης υπάρχουν m δεσμευμένα μέταλλα M και x ανιόντα X που σχηματίζουν γέφυρα μεταξύ των δεσμευμένων μεταλλικών ιόντων Μ' και τα οξυγόνα ή τα μεταλλικά ιόντα του δακτυλίου. Έτσι, ο τύπος (ΟΗ) 2 [inv12-mc Zn(II)N(pko) -4](nap) 2 Et 2 O χαρακτη-ρίζει ένα δωδεκαμελή μεταλλοκορονοειδή δακτύλιο με τέσσερα συμμετρικώς τοποθετημένα άτομα οξυγόνου, το Zn ΙΙ είναι το μέταλλο, Ν είναι το ετεροάτομο του δακτυλίου και pko - 1 είναι οι δότες των ατόμων οξυγόνου. Υπάρχουν δύο δεσμευμένα ιόντα ΟΗ -, δύο συναρμοσμένα ligands nap -1 και ένα μόριο Et 2 O ως διαλύτης κρυσταλλικού πλέγματος. Στο σύμπλοκο [Zn 4 (OH) 2 (pkο) 4 (nap) 2 ] Et 2 O το αποπρωτονιωμένο κετονοξιμικό ligand pko - δρα ως χηλικό τριδραστικό ligand και συναρμόζεται με το ένα άτομο ψευδαργύρου με το κετονοξιμικό άτομο αζώτου (Ν Κ ) και ένα άζωτο του πυριδινικού δακτυλίου (Ν) ενώ μέσω κετονοξιμικού οξυγόνου (Ο Κ ) ενώνεται με ένα γειτονικό ιόν Zn II (Σχήμα 81). Το άλλο άζωτο του πυριδινικού δακτυλίου (Ν) παραμένει μη συναρμοσμένο. Ο τρόπος συναρμογής των ligands pkο -1 χαρακτηρίζεται ως η 1 : η 1 : η 1 :μ 2 (ή ) σύμφωνα με το συμβολισμό Harris. O M M N N C N Σχήμα 81. Συναρμογή του ligand pko - στο σύμπλοκο (ΟΗ) 2 [inv12-mc Zn(II)N(pko) - 4](nap) 2 Et 2 O. Δύο από τα τέσσερα άτομα Zn, τα Zn(1) και Zn(4), ενώνονται με τα άτομα οξυγόνου του μεταλλοκορονοειδούς δκατυλίου και τα άλλα δύο άτομα Zn, οι Zn(2) και Zn(3), ενώνονται με τα άτομα αζώτου του μεταλλοκορονοειδούς δακτυλίου. Η αλληλουχία των ατόμων στο δακτύλιο είναι Zn(1)-O(1)-N(2)-Zn(2)- N(61)-O(61)-Zn(4)-O(41)-N(42)- Zn(3)-N(22)-O(21) (Σχήμα 82 (Α)). 104

113 (Α) (Β) Σχήμα 82. (A) Ο μεταλλοκορονοειδής δακτύλιος (ΟΗ) 2 [inv12-mc Zn(II)N(pko) -4]. (Β) Ο μεταλλοκορονοειδής δακτύλιος (ΟΗ) 2 [inv12-mc Zn(II)N(pko) -4] και οι δεσμοί των τεσσάρων ατόμων Zn. Τα μεταλλικά ιόντα εμφανίζουν διαφορετικούς αριθμούς συναρμογής και διαφορετικές γεωμετρίες (Σχήμα 82(Β)). Τα άτομα Ζn(2) και Zn(3) έχουν αριθμό συναρμογής έξι και βρίσκονται σε παραμορφωμένο Ν 4 Ο 2 οκταεδρικό περιβάλλον καθώς συναρμόζονται με τέσσερα άτομα αζώτου των pko - και δύο άτομα οξυγόνου, Ο(2Χ) και Ο(1Χ), προερχόμενα από τις δύο υδροξυ-γέφυρες. Οι αποστάσεις των δεσμών Zn- O (υδροξυ) [Zn(2)-O(1X)= 2.109(5) Å, Zn(2)-O(2X)= 2.104(6) Å, Zn(3)-O(1X)= 2.072(6) Å και Zn(3)-O(2X)= 2.140(5) Å] είναι μικρότερες από τις αποστάσεις Ζn-N (οξιμικό) [Zn(2)- N(2)= 2.134(6) Å, Zn(2)-N(61)= 2.135(7) Å, Zn(3)-N(22)= 2.128(7) Å και Zn(3)-N(42)= 2.188(6) Å] και Zn-N (πυριδινικό) [Zn(2)-N(3)= 2.209(7) Å, Zn(2)-N(62) = 2.202(7) Å, Zn(3)-N(23)= 2.193(7) Å και Zn(3)-N(43) =2.185(8) Å]. Το άτομο Zn(4) έχει αριθμό συναρμογής τέσσερα και συναρμόζεται με δύο οξιμικά οξυγόνα, Ο(1) [Ζn(4)-Ο(41)= 1.947(6) Å] και Ο(61) [Ζn(4)-Ο(61)= 1.966(6) Å], ένα μ- υδροξυ-οξυγόνο, Ο(1Χ) [Ζn(4)-Ο(1Χ)= 1.975(5) Å] και ένα καρβοξυλικό οξυγόνο του μονοδραστικά συναρμοσμένου nap -, Ο(91) [Ζn(4)-Ο(91)= 1.976(10) Å]. Με βάση την τιμή της τετραεδρικότητας (Η τετραεδρικότητα ενός συμπλόκου μπορεί να καθοριστεί από τη γωνία μεταξύ δύο επιπέδων, που το καθένα περιέχει το μέταλλο και 2 παρακείμενα άτομα. Για αυστηρώς επίπεδα τετραγωνικά σύμπλοκα η τετραεδρικότητα είναι 0 o και για τετραεδρικά σύμπλοκα η τετραεδρικότητα είναι 90 ο ) (=86.35 ) που υπολογίστηκε γύρω από το άτομο Zn(4), η γεωμετρία του μπορεί να θεωρηθεί ως παραμορφωμένη τετραεδρική. 105

114 Το άτομο Zn(1) έχει αριθμό συναρμογής πέντε και συναρμόζεται με δύο οξιμικά οξυγόνα, Ο(1) [Ζn(1)-Ο(1)= 1.978(6) Å] και Ο(21) [Ζn(1)-Ο(21)= 1.970(6) Å], ένα μ- υδροξυ-οξυγόνο, Ο(2Χ) [Ζn(1)-Ο(2Χ)= 1.992(5) Å] και τα δύο καρβοξυλικά οξυγόνα του δεύτερου nap -1, Ο(111) [Ζn(1)-Ο(111)= 1.982(9) Å] και Ο(112) [Ζn(1)-Ο(112)= 2.444(14) Å]. Με χρήση των μεγαλύτερων γωνιών γύρω από το άτομο Zn(1) [O(2X)- Zn(1)-O(111)= 141.9(3) και O(1)-Zn(1)-O(112) = 140.8(4) ], ο δείκτης τριγωνικότητας τ είναι ίσος με και υποδεικνύει τετραγωνική πυραμιδική διευθέτηση των ατόμων οξυγόνου γύρω από το Zn(1) με τα άτομα Ο(1), Ο(2Χ), Ο(111) και Ο(112) να καταλαμβάνουν τη βάση της πυραμίδας και το Ο(21) να βρίσκεται στην κορυφή της. Από την άλλη, εφόσον η απόσταση Ζn(1)-Ο(112)= 2.444(14) Å θεωρηθεί ότι βρίσκεται στο όριο της δεσμικής απόστασης, τότε ο Zn(1) έχει αριθμό συναρμογής τέσσερα και παραμορφωμένη τετραεδρική γεωμετρία (η τετραεδρικότητα είναι ίση με ). Σχήμα 83. Η σφαίρα συναρμογής των τεσσάρων ατόμων ψευδαργύρου. Η διευθέτηση των τεσσάρων μεταλλικών ιόντων είναι σχεδόν ρομβική (Σχήμα 84). Οι δυο διαγώνιοι του ρόμβου ταυτίζονται με τις ενδομοριακές αποστάσεις Zn(1) Zn(4) (=5.808 Å) και Zn(2) Zn(3) (=3.230 Å). Η μικρότερη διαγώνιος έχει μήκος σχεδόν ίσο με τις πλευρές του ρόμβου [Zn(1) Zn(2) = Å, Zn(2) Zn(4) = Å, Zn(4) Zn(3) = Å και Zn(3) Zn(1) = Å]. Τα διαγώνια άτομα του ψευδαργύρου συνδέονται μεταξύ τους με δύο μ 3 -υδροξυ-γέφυρες [Ο(2Χ),Ο(1Χ)]. Τα άτομα του οξυγόνου Ο(1Χ) και Ο(2Χ) εμφανίζουν τετραγωνική πυραμιδική γεωμετρία συναρμογής [Zn(3)-O(1X)-Zn(2)=101.1(2) ο και Zn(3)-O(2X)-Zn(2)= 99.1(2) ο ]. Κάθε 106

115 άτομο οξυγόνου της γέφυρας ενώνει τα δυο οκταεδρικά άτομα ψευδαργύρου Zn(2) και Zn(3) με ένα άτομο ψευδαργύρου Zn(1) και Zn(4). Οι δεσμοί Ζn(2)-O (υδροξυ) και Zn(3)- O (υδροξυ) [Zn(2)-O(1X)= 2.109(5) Å, Zn(2)-O(2X)= 2.104(6) Å, Zn(3)-O(1X)= 2.072(6) Å και Zn(3)-O(2X)= 2.140(5) Å] είναι μεγαλύτεροι από τους δεσμούς Ζn(1)-O (υδροξυ) και Ζn(4)-O (υδροξυ) [Zn(1)-O(2X)=1.992(5) Å και Zn(4)-O(1X)=1.975(5) Å] και έχει ως συνέπεια το μεγαλύτερο αριθμό συναρμογής των Ζn(2) και Ζn(3). Σχήμα 84. Η ρομβική διευθέτηση των τεσσάρων μεταλλικών ιόντων. Τα δύο ligands naproxen συναρμόζονται με διαφορετικό τρόπο στα δύο άτομα ψευδαργύρου Zn(1) και Zn(4). Το ένα naproxen συναρμόζεται μονοδραστικά μέσω του ενός καρβοξυλικού οξυγόνου Ο(91) στο Zn(4), ενώ το δεύτερο naproxen είναι διδραστικό και είναι ασύμμετρα χηλικά συναρμοσμένο στο Zn(1) μέσω των δύο καρβοξυλικών οξυγόνων Ο(111) και Ο(112). 9.3 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ] Το σύμπλοκο αυτό είναι μονοπυρηνικό κεντροσυμμετρικό, τα τολφεναμικά ligands είναι αποπρωτονιωμένα και συναρμόζονται μέσω των καρβοξυλικών οξυγόνων τους με το άτομο του νικελίου. Στον Πίνακα 15 δίνονται επιλεγμένες αποστάσεις και γωνίες δεσμών και στο Σχήμα 85 η κρυσταλλική δομή του [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ]. 107

116 Πίνακας 15. Eπιλεγμένες αποστάσεις και γωνίες δεσμών του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ]. Δεσμός Å Δεσμός Å Ni(1) - N(21) 2.081(6) Ni(1) - O(2) 2.034(4) Ni(1) - O(27) 2.049(6) Ni(1) - N(21) 2.081(6) O(2) - C(3) 1.240(7) Ni(1) O(27) 2.049(6) C(3) - O(4) 1.238(8) Γωνίες ( ) Γωνίες ( ) N(21) - Ni(1) O(27) 95.6(2) O(2) - Ni(1) O(2) 179.5(3) N(21) - Ni(1) O(2) 87.3(2) N(21) - Ni(1) - N(21) 78.8(4) O(27) - Ni(1) O(2) 92.0(2) O(27) - Ni(1) N(21) 172.7(3) N(21) - Ni(1) O(2) 92.3(2) O(2) - Ni(1) - N(21) 92.3(2) O(27) - Ni(1) O(2) 88.4(2) O(2) Ni(1) N(21) 87.3(2) Σχήμα 85. Κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (bipy)(ch 3 OH) 2 ]. Το νικέλιο έχει αριθμό συναρμογής έξι και συναρμόζεται με δυο τολφεναμικά ligands, μια bipy και δύο μεθανόλες. Εμφανίζει παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία 108

117 με τις έξι κορυφές να καταλαμβάνονται από τα τέσσερα άτομα οξυγόνου δυο προερχόμενα από τα tolf και δύο από τις CH 3 OH και τα δύο άτομα αζώτου της bipy. Τις δυο κορυφές του οκταέδρου καταλαμβάνουν τα δύο οξυγόνα Ο(2) και Ο(2) των δυο τολφεναμικών ligands [O(2) - Ni(1) O(2) = 179.5(3) ο ], ενώ στο επίπεδο του οκταέδρου τα δύο άτομα αζώτου Ν(21) και Ν(21) του bipy και τα δύο άτομα οξυγόνου Ο(27) και Ο(27) από δύο μόρια μεθανόλης. Οι αποστάσεις γύρω από το άτομο του νικελίου δεν είναι ίσες. Η απόσταση του Νi με το Ν(bipy) [Ni(1) - N(21) = 2.081(6) Å ] είναι μεγαλύτερη από την αντίστοιχη του Νi με το Ο(methanol) [Ni(1) - O(27) = 2.049(6) Å] που με τη σειρά του είναι μεγαλύτερη από την απόσταση του Ni με το καρβοξυλικό οξυγόνο O(tolf) [Ni(1) - O(2) = 2.034(4) Å]. 9.4 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(nap) 2 (bipy)(ch 3 OH)] Το σύμπλοκο [Ni(nap) 2 (bipy)(cη 3 ΟH)] είναι μονοπυρηνικό και τα δυο αποπρωτονιωμένα ligands naproxen συναρμόζονται μέσω των καρβοξυλικών οξυγόνων με το άτομο του νικελίου, στο οποίο συνδέεται και ένα bipy και ένα ligand μεθανόλη. Στον Πίνακα 16 δίνονται τα χαρακτηριστικά μήκη και γωνίες δεσμών και στο Σχήμα 86 η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου. Πίνακας 16. Τα χαρακτηριστικά μήκη και γωνίες δεσμών του [Ni(nap) 2 (bipy)(cη 3 ΟH)] Δεσμός Å Δεσμός Å Ni(1) O(2) 2.073(3) C(23) O(22) 1.262(5) Ni(1) O(5) 2.187(3) C(23) O(24) 1.238(6) Ni(1) O(7) 2.073(3) C(6) O(5) 1.257(5) Ni(1) O(22) 2.017(3) C(6) O(7) 1.266(5) Ni(1) N(39) 2.067(3) Ni(1) N(52) 2.052(4) Γωνίες ( ) Γωνίες ( ) O(2) - Ni(1) - O(5) 90.03(12) O(2) Ni(1) O(22) 90.90(12) 109

118 O(2) - Ni(1) O(7) 92.35(11) O(5) Ni(1) O(22) (11) O(5) - Ni(1) - O(7) 61.64(11) O(7) - Ni(1) - O(22) 96.84(12) O(2) Ni(1) - N(39) 91.89(14) O(5) Ni(1) N(39) (12) O(7) - Ni(1) - N(39) (13) O(22) Ni(1) N(39) 92.62(13) O(2) Ni(1) - N(52) (14) O(5) Ni(1) N(52) 91.94(13) O(7) - Ni(1) - N(52) 96.18(13) O(22) - Ni(1) - N(52) 90.42(13) N(39) Ni(1) N(52) 79.30(15) Ni(1) O(2) C(4) 128.4(3) Ni(1) - O(2) - H(56) 91.4 Σχήμα 86. Κρυσταλλική δομή του [Ni(nap) 2 (bipy)(cη 3 ΟH)] Το νικέλιο έχει αριθμό συναρμογής έξι και παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία όπου και οι έξι κορυφές του οκταέδρου καταλαμβάνονται από τέσσερα άτομα οξυγόνου τρία προερχόμενα από τα δύο naproxen και το τέταρτο από τη μεθανόλη και δύο άτομα αζώτου προερχόμενα από τη bipy. Τα δυο ligands naproxen είναι συναρμοσμένα στο Ni με διαφορετικό τρόπο, το ένα συναρμόζεται μονοδραστικά μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου Ο(22) και το δεύτερο διδραστικά χηλικά μέσω των δύο καρβοξυλικών οξυγόνων Ο(5) και Ο(7). Στις αξονικές θέσεις του οκταέδρου βρίσκεται το Ν(52) του άζωτο δότη και το Ο(2) της μεθανόλης [O(2) Ni(1) - N(52) = (14) ο ] και τα άτομα Ο(5), Ο(7), Ο(22) και Ν(39) να βρίσκονται στο ισημερινό επίπεδο. 110

119 9.5 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)] Το σύμπλοκο αυτό είναι μονοπυρηνικό και τα δύο ligands naproxen είναι αποπρωτονιωμένα και συναρμόζονται το ένα μονοδραστικά και το δεύτερο διδραστικά μέσω γέφυρας. Στον Πίνακα 17 δίνονται οι χαρακτηριστικές αποστάσεις δεσμών και γωνίες, ενώ στο Σχήμα 87 η κρυσταλλική δομή του [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)]. Πίνακας 17. Τα χαρακτηριστικά μήκη και γωνίες δεσμών του [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)] Δεσμός Å Δεσμός Å Ni(1) O(2) 2.059(2) C(3)-O(2) 1.263(5) Ni(1) O(4) 2.199(3) C(3)-O(4) 1.245(4) Ni(1) O(19) 2.044(3) C(20)-O(19) 1.262(4) Ni(1) - O(36) 2.099(3) C(20)-O(21) 1.231(5) Ni(1) N(37) 2.062(3) Ni(1) N(40) 2.092(3) Γωνίες ( ο ) Γωνίες ( ο ) O(2) - Ni(1) O(4) 61.27(10) O(19) Ni(1) O(36) 93.72(11) O(2) Ni(1) O(19) 93.21(11) O(2) Ni(1) N(37) 95.26(11) O(4) Ni(1) O(19) (10) O(4) Ni(1) N(37) 90.54(11) O(2) Ni(1) O(36) 91.29(11) O(19) Ni(1) N(37) 92.65(11) O(4) Ni(1) O(36) 86.69(11) O(36) Ni(1) N(37) (12) O(2) Ni(1) N(40) (12) O(4) Ni(1) N(40) (10) O(19) Ni(1) N(40) 93.19(11) O(36) Ni(1) N(40) 92.72(13) N(37) Ni(1) N(40) 80.01(13) 111

120 Σχήμα 87. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Ni(nap) 2 (phen)(h 2 O)]. Το άτομο του Νi έχει αριθμό συναρμογής έξι παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία όπου οι έξι κορυφές του οκταέδρου καταλαμβάνονται από τέσσερα άτομα οξυγόνου τρία προερχόμενα από τα δυο naproxen και το τέταρτο από τo νερό και δυο άτομα αζώτου προερχόμενα από τη phen. Τα δύο ligands naproxen έχουν διαφορετικό τρόπο συναρμογής με το νικέλιο, το ένα συναρμόζεται μονοδραστικά μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου Ο(19) και το δεύτερο ligand διδραστικά χηλικά μέσω των δύο καρβοξυλικών οξυγόνων Ο(2) και Ο(4). Οι αποστάσεις γύρω από το άτομο του νικελίου δεν είναι ίσες. Η μικρότερη απόσταση είναι αυτή μεταξύ του ατόμου Ni και του οξυγόνου του μονοδραστικά συναρμοσμένου naproxen [Ni(1) O(19) = 2.044(3) Å]. Οι αποστάσεις μεταξύ του ατόμου του νικελίου και των καρβοξυλικών οξυγόνων του διδραστικά συναρμοσμένου naproxen είναι Ni(1) O(2) = 2.059(2) Å και Ni(1) O(4) = 2.199(3) Å. Οι αποστάσεις του νικελίου με τα Ν(phen) είναι Ni(1) N(37) = 2.062(3) Å και Ni(1) N(40) = 2.092(3) Å, ενώ η απόσταση το με Ο(36) του νερού είναι 2.099(3) Å. Στις αξονικές θέσεις του οκταέδρου βρίσκονται το Ν(40) της φαινανθρολίνης και το Ο(2) απ το ένα ligand και τα άτομα Ο(19), Ο(36), Ο(4) και Ν(37) στον ισημερινό επίπεδο του. 9.6 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Το σύμπλοκο [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] είναι μονοπυρηνικό και περιτριγυρίζεται από δύο αποπρωτονιωμένα τολφεναμικά ligands και δύο Hpko. Στο Σχήμα 88 δίνεται η 112

121 κρυσταλλική δομή του συμπλόκου και στους Πίνακες 18 και 19 επιλεγμένες αποστάσεις και γωνίες δεσμών. Σχήμα 88. Η περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Πίνακας 18. Οι επιλεγμένες αποστάσεις δεσμών του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Δεσμός (Å) Δεσμός (Å) Ni(1) O(2) 2.052(2) C(3)-O(2) 1.250(4) Ni(1) O(24) 2.036(3) C(3)-O(4) 1.242(4) Ni(1) N(42) 2.086(3) C(25)-O(24) 1.248(4) Ni(1) N(45) 2.065(3) C(25)-O(26) 1.256(4) Ni(1) N(57) 2.085(3) Ni(1) N(64) 2.056(3) Τα δυο tolfenamato ligands συναρμόζονται στο νικέλιο μονοδραστικά μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου και τα δύο Hpko ligands είναι διδραστικά συναρμοσμένα στο Ni μέσω του οξιμικού αζώτου και ενός πυριδινικού αζώτου σχηματίζοντας μ αυτόν τον τρόπο έναν πενταμελή χηλικό. 113

122 Πίνακας 19. Η γωνίες δεσμών του συμπλόκου [Ni(tolf) 2 (Hpko) 2 ] Γωνία ( ο ) Γωνία ( ο ) O(2) Ni(1) O(24) 87.00(12) O(2) Ni(1) N(42) (12) O(24) Ni(1) N(42) 85.23(12) O(2) - Ni(1) - N(45) (10) O(24) Ni(1) N(45) 89.21(11) N(42) - Ni(1) - N(45) 77.07(11) O(2) Ni(1) N(57) 88.96(12) O(24) Ni(1) N(57) (12) N(42) Ni(1) N(57) 98.86(11) N(45) - Ni(1) - N(57) 93.95(12) O(2) Ni(1) N(64) 86.55(10) O(24) Ni(1) N(64) 99.85(11) N(42) Ni(1) - N(64) 96.11(11) N(45) - Ni(1) - N(64) (11) N(57) Ni(1) - N(64) 77.50(12) Το νικέλιο έχει αριθμό συναρμογής έξι και είναι περιτριγυρισμένος από δύο tolfenamato ligands και δύο Hpko εμφανίζοντας μια παραμορφωμένη οκταεδρική γεωμετρία με τις κορυφές του οκταέδρου να είναι κατειλημμένες από τέσσερα άτομα αζώτου του Hpko και δύο άτομα οξυγόνου του tolf -1. Το Ν(57) της 2,2 -διπυριδυλκετονοξίμης και το Ο(24) του τολφεναμικού ligand βρίσκονται στις κορυφές του οκταέδρου [O(24) Ni(1) N(57) = (12) ο ], ενώ τα άτομα Ν(45), Ν(42), Ν(64) και Ο(2) καταλαμβάνουν τις κορυφές της βάσης του οκταέδρου. 9.7 Περιγραφή της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου του [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] δίνεται στο Σχήμα 89 και επιλεγμένες αποστάσεις και γωνίες δεσμών δίνονται στους Πίνακες 20 και 21, αντίστοιχα. Το σύμπλοκο είναι μονοπυρηνικό και τα μεφεναμικά ligands είναι αποπρωτονιωμένα και συναρμόζονται μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου με το άτομο του νικελίου. 114

123 Σχήμα 89. Η κρυσταλλική δομή του συμπλόκου [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] Πίνακας 20. Οι επιλεγμένες αποστάσεις δεσμών του συμπλόκου [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] Δεσμός Å Δεσμός Å Ni(1) O(2) 2.069(3) C(3)-O(2) 1.266(4) Ni(1) O(20) 2.027(2) C(3)-O(4) 1.267(4) Ni(1) N(38) 2.069(3) C(21)-C(20) 1.280(4) Ni(1) N(42) 2.075(3) C(21)-C(22) 1.263(4) Ni(1) N(53) 2.074(3) Ni(1) N(60) 2.085(3) Πίνακας 21. Οι επιλεγμένες γωνίες δεσμών του συμπλόκου [Ni(mef) 2 (Hpko) 2 ] Γωνίες ( ο ) Γωνίες ( ο ) O(2) Ni(1) O(20) 84.62(10) O(2) Ni(1) N(53) (10) O(2) Ni(1) N(38) 88.50(11) O(20) - Ni(1) - N(53) 88.01(11) O(20) Ni(1) N(38) 99.54(10) N(38) Ni(1) N(53) 96.69(11) O(2) Ni(1) N(42) 91.85(11) N(42) Ni(1) N(53) 95.66(11) O(20) - Ni(1) - N(42) (11) O(2) Ni(1) N(60) 98.28(11) N(38) Ni(1) - N(42) 78.13(11) O(20) Ni(1) N(60) 90.90(11) 115

124 N(38) - Ni(1) - N(60) (12) N(42) Ni(1) N(60) 91.79(11) N(53) Ni(1) - N(60) 77.80(11) Tα δύο mefenamato ligands συναρμόζονται στο νικέλιο μονοδραστικά μέσω ενός καρβοξυλικού οξυγόνου και τα δύο Hpko ligands είναι διδραστικά συναρμοσμένα στο Ni μέσω του οξιμικού αζώτου και ενός πυριδινικού αζώτου σχηματίζοντας με τον τρόπο αυτό έναν πενταμελή χηλικό. Το άτομο του νικελίου έχει αριθμό συναρμογής έξι και περιβάλλεται από δύο mefenamato ligands και δυο Hpko. Η γεωμετρία γύρω από το Ni είναι παραμορφωμένη οκταεδρική με τα άτομα O(20) και N(42) να καταλαμβάνουν τις αξονικές θέσεις του οκταέδρου [O(20) - Ni(1) - N(42) = (11) ο ] και τα άτομα Ν(38), Ν(53), Ν(60) και Ο(2) τις κορυφές της βάσης του. 116

125 10. Αλληλεπίδραση των συμπλόκων με το DNA 10.1 Εισαγωγή To DNA αλληλεπιδρά με τα μεταλλικά ιόντα και τα σύμπλοκά τους με δύο τρόπους: Ομοιοπολικά, όπου κάποιο ή κάποια απ τα ευκίνητα ligands των συμπλόκων αντικαθίστανται από μία βάση αζώτου του DNA, όπως αυτή του αζώτου 7 της γουανίνης και, Μη-ομοιοπολικά, όπου παρατηρούνται τρεις διαφορετικοί τρόποι αλληλεπίδρασης: η παρεμβολή, η συναρμογή στην αύλακα και η εξωτερική συναρμογή. (Α) (Β) Σχήμα 90. (Α) Ομοιοπολική αλληλεπίδραση του DNA με το σύμπλοκο [(ΝΗ 3 ) 2 Pt ΙΙ ] 2+, (B) Μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση συμπλόκων και ιόντων με το DNA. Με πράσινο χρώμα απεικονίζεται η εξωτερική συναρμογή, με κόκκινο η συναρμογή στην αύλακα και με κίτρινο η παρεμβολή Μελέτη της αλληλεπίδρασης των ΜΣΑΦ και των συμπλόκων με φασματοσκοπία UV-vis Η μελέτη με της αλληλεπίδρασης με τη φασματοσκοπία UV-vis πραγματοποιείται σε δύο στάδια. Με την προσθήκη συμπλόκου σε διάλυμα DNA μπορεί να εξεταστεί ο τρόπος σύνδεσης του DNA με σύμπλοκα μετάλλων. Ένας απ αυτούς είναι με παρεμβολή, όπου 117