ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. Παϖαϖετροϖούλου Μαρία Εϖιβλέϖουσα Καθηγήτρια Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρώ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ Πρόγραµµα Μεταϖτυχιακών Σϖουδών στις Κλινικές και Κλινικοεργαστηριακές Ειδικότητες Μαρία Παϖαϖετροϖούλου Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Μοριακή τυϖοϖοίηση Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ροτα ιών σε λύµατα Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΓΕΩΡΓΙΑ ΚΟΜΝΗΝΟΥ Βιολόγος ΠΑΤΡΑ 2006

2 ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. Παϖαϖετροϖούλου Μαρία Εϖιβλέϖουσα Καθηγήτρια Καθηγήτρια Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 2. Ηλιοϖούλου Ιωάννα (Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Εϖιτροϖής) Καθηγήτρια Ζωολογίας Τµήµατος Βιολογίας, Παν/µίου Πατρών 3. Βανταράκης Αϖόστολος (Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Εϖιτροϖής) Εϖίκ. Καθηγητής Υγιεινής Τµήµατος Ιατρικής, ηµοκριτείου Παν/µίου Θράκης 4.Μϖασιάρης Χαράλαµϖος (Μέλος Εϖταµελούς Εξεταστικής Εϖιτροϖής) Καθηγητής Παθολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 5.Αναστασίου Ευάγγελος (Μέλος Εϖταµελούς Εξεταστικής Εϖιτροϖής) Καθηγητής Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 6.Σϖηλιοϖούλου Ίριδα (Μέλος Εϖταµελούς Εξεταστικής Εϖιτροϖής) Αναϖλ. Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 7.Παληογιάννη Φωτεινή (Μέλος Εϖταµελούς Εξεταστικής Εϖιτροϖής) Αναϖλ. Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών 8.Γελαστοϖούλου Ελένη (Μέλος Εϖταµελούς Εξεταστικής Εϖιτροϖής) Εϖικ. Καθηγήτρια Υγιεινής Τµήµατος Ιατρικής, Παν/µίου Πατρών

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εργασία αυτή εκϖονήθηκε στο Εργαστήριο Υγιεινής του τµήµατος Ιατρικής Πανεϖιστηµίου Πατρών στο ϖλαίσιο του Ερευνητικού Προγράµµατος Ενίσχυσης Ερευνητικού υναµικού ΠΕΝΕ 2001 µε τίτλο: Ανάϖτυξη µοριακών µεθόδων α) για την ανίχνευση και τυϖοϖοίηση εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα-ιών β) για τη διάκριση ϖροέλευσης (ανθρώϖινης ή ζωικής) της Escherichia coli ϖου αϖοµονώνεται αϖό ακατέργαστα λύµατα. Η χρηµατοδότηση του ϖρογράµµατος ϖραγµατοϖοιήθηκε αϖό τη Γ.Γ.Ε.Τ. και την Ε.Υ.Α.Π.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. Γενικό Μέρος 1 Εισαγωγή 2 1. Ιοί εντερικής ϖροέλευσης στο υδάτινο ϖεριβάλλον 3 2. Ιοί εντερικής ϖροέλευσης στα λύµατα 6 3. Παράγοντες ϖου εϖηρεάζουν την εϖιβίωση των ιών στο ϖεριβάλλον Βιολογικός καθαρισµός αστικών αϖοβλήτων Εϖαναχρησιµοϖοίηση εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων Αϖοµόνωση ιών εντερικής ϖροέλευσης Μοριακή τυϖοϖοίηση εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών 33 8 Εντεροϊοί Εϖιδηµιολογικά στοιχεία 38 9 Αδενοϊοί Αδενοϊοί Υϖοοµάδας F : Τύϖοι 40 και Εϖιδηµιολογικά στοιχεία Ρότα ιοί Εϖιδηµιολογικά στοιχεία 47 Σκοϖός 50 Ειδικό Μέρος 52 Υλικά 53 Μεθοδολογία Σταθµοί δειγµατοληψίας ειγµατοληψία Συµϖύκνωση και αϖοµόνωση των ιών Αϖοµόνωση του γενετικού υλικού των ιών Ταυτοϖοίηση των ιών εντερικής ϖροέλευσης 66 5.Α Αντίδραση αντίστροφης µεταγραφής 66 5.Β Αλυσιδωτή αντίδραση ϖολυµεράσης 68 5.Γ Nested αλυσιδωτή αντίδραση ϖολυµεράσης Μοριακή τυϖοϖοίηση ιικών στελεχών 74 iv

5 6.Α Καθαρισµός του ϖροϊόντος της Nested PCR 74 6.Β Εφαρµογή Nucleotide Sequencing Analysis 75 6.Γ. Οµαδοϖοίηση των ιών ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό τα δείγµατα λυµάτων 75 Αϖοτελέσµατα ϖειραµάτων Ιοί εντερικής ϖροέλευσης στα λύµατα 78 1.Α. Εντεροϊοί 85 1.Β Αδενοϊοί 92 1.Γ Ρότα ιοί Σταθµοί δειγµατοληψίας Α ΚΕΡΕΦΥΤ Β ΡΙΟ Γ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Περιοχές δειφµατοληψίας Α Αττική Β Αχαΐα Συγκεντρωτικά αϖοτελέσµατα 130 Συζήτηση - Συµϖεράσµατα 132 Παράρτηµα 148 Περίληψη 161 Summary 165 Βιβλιογραφία 167 v

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Περίληψη Οι εντεροϊοί έχουν ιδιαίτερη σηµασία για τη δηµόσια υγεία, δεδοµένου ότι σχετίζονται µε εϖιδηµίες γαστρεντερίτιδας (µη βακτηριογενούς ϖροέλευσης) αϖό την κατανάλωση µολυσµένου νερού. Οι ιοί αυτοί µϖορούν να αϖοµονωθούν σε µεγάλες ϖοσόστητες αϖό κόϖρανα και ούρα ανθρώϖινης ϖροέλευσης, καθώς και αϖό λύµατα και µολυσµένα νερά. Εϖιϖλέον, οι Αδενοϊοί είναι ϖαθογόνοι για τον άνθρωϖο και η ϖαρουσία τους σε ϖεριβαλλοντικά δείγµατα δύναται να ϖροκαλέσει σηµαντικές µολύνσεις. Οι Αδενοϊοί είναι ιοί ανθρώϖινης εντερικής ϖροέλευσης ϖου ϖεριέχουν DNA και ορισµένοι ορότυϖοι τους είτε δεν καλλιεργούνται, είτε καλλιεργούνται δύσκολα στις συνήθεις κυτταρικές σειρές. Γι αυτόν το λόγο, η ανίχνευσή τους σε µολυσµένο νερό και ο ρόλος τους ως ϖαραγόντων ϖρόκλησης γαστρεντερίτιδας έχουν υϖοτιµηθεί. Οι Ρότα ιοί είναι υϖεύθυνοι για οξεία ϖεριστατικά γαστρεντερίτιδας στον άνθρωϖο και τα ζώα. Κατόϖιν του διϖλασιασµού του γενετικού τους υλικού στον γαστρεντερικό σωλήνα οι ιοί αυτοί εκκρίνονται και δύνανται να διασϖαρούν στο ϖεριβάλλον και το νερό. Γενικά, οι Ρότα ιοί έχουν εµϖλακεί σε ϖεριστατικά γαστρεντερίτιδας σε ϖολλές χώρες. Η σταθερότητα των ανθρωϖίνων Ρότα ιών στο νερό και η ανθεκτικότητά τους σε φυσικοχηµικές διαδικασίες εξυγίανσης κατά την εϖεξεργασία των λυµάτων συντείνουν στην εξάϖλωσή τους. Στην ϖαρούσα διατριβή ανιχνεύθηκαν και αϖοµονώθηκαν εντεροϊοί, αδενοϊοί και ρότα ιοί αϖό ακατέργαστα λύµατα, τα οϖοία ελήφθησαν αϖό την είσοδο τεσσάρων σταθµών βιολογικού καθαρισµού (δύο στην Αττική και δύο στην Αχαΐα). Συνολικά ελήφθησαν 118 δείγµατα ακατέργαστων λυµάτων κατά την ϖερίοδο Σεϖτέµβριο 2000 Σεϖτέµβριο Η µεθοδολογία αφορούσε στην συµϖύκνωση των ιών ακολουθούµενη αϖό RT-nested PCR, ϖροκειµένου να εϖιτευχθεί αύξηση της ευαισθησίας αϖοµόνωσης των ιών. Μετά την αϖοµόνωση 162

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ γενετικού υλικού των ιών ϖραγµατοϖοιήθηκε τυϖοϖοίησή τους εφαρµόζοντας nucleotide sequencing analysis. Οι Ρότα ιοί ανιχνεύθηκαν σε 17 δείγµατα (14.2%). Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησής τους ήταν rotavirus τύϖος G1 (88.2%) και τύϖος G2 (11.8%). Οι Αδενοϊοί βρέθηκαν σε 55 δείγµατα (45.8%). Η Sequencing ανάλυση είχε ως αϖοτέλεσµα την ϖαρουσία στα δείγµατα αδενοϊών της οµάδας F [τύϖοι 40 (34.6%) και 41 (63.6%)] και της οµάδας C [τύϖος 2 (1.8%)]. Οι Εντεροϊοί ανιχνεύθηκαν σε 30 δείγµατα (40%) και η sequencing ανάλυση είχε ως αϖοτέλεσµα την ϖαρουσία αρκετών τύϖων όϖως (α) coxsackievirus (τύϖοι A6-3.3%, A9-3.3%, A16-3.3%, B4-16.7%, B5-3.3%), (β) echovirus (τύϖοι 2-6.7%, %, 30-10%), (γ) εντεροϊοί τύϖοι %, % καθώς και porcine εντεροϊός (6.7%), poliovirus 1 (6.7%) και poliovirus 2 (10%). Η µικροβιολογική ϖοιότητα του νερού εϖοµένως και η ανθρώϖινη υγεία εϖηρεάζονται σηµαντικά αϖό την ϖαρουσία µικροοργανισµών εντερικής ϖροέλευσης, οι οϖοίοι ϖροέρχονται αϖό λύµατα ϖου καταλήγουν στο υδάτινο ϖεριβάλλον. Πολλές εϖιδηµίες αϖό ιούς εντερικής ϖροέλευσης έχουν κατά καιρούς συνδυαστεί µε το νερό. Οι υδατογενείς εϖιδηµίες γενικά εξαϖλώνονται στον ϖληθυσµό αϖό κατανάλωση µολυσµένου νερού, κολύµβηση σε ακατάλληλα νερά αναψυχής καθώς εϖίσης µεταδίδονται αϖο τη σωµατική εϖαφή και την εισϖνοή. Τα µη εϖεξεργασµένα λύµατα της µελέτης ϖεριέχουν ϖολλούς και διαφορετικούς τύϖους ιών εντερικής ϖροέλευσης οι οϖοίοι κατά κύριο λόγο ϖροκαλούν γαστρεντερίτιδα. Εϖοµένως καθίσταται αναγκαία η εϖξεργασία των λυµάτων στο µέγιστο δυνατό βαθµό στους σταθµούς βιολογικού καθαρισµού. Η Sequencing ανάλυση έδειξε την ϖαρουσία ανθρώϖινων Ρότα ιών A (τύϖοι G1 και G2), οι οϖοίοι ϖροκαλούν ϖαγκοσµίως διάρροια σε ϖαιδιά καθώς εϖίσης και την ϖαρουσία αδενοϊών τύϖου 40 και 41, οι οϖοίοι είναι σηµαντικοί αιτιολογικοί ϖαράγοντες γαστρεντερίτιδας, κυρίως σε θερµά κλίµατα. Αϖό την άλλη ϖλευρά η ϖοικιλία των εντεροϊών ϖου ανιχνεύθηκε στα ακατέργαστα λύµατα 163

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ήταν µεγαλύτερη συγκρινόµενη µε την αντίστοιχη των υϖολοίϖων ιών της µελέτης. Η ϖαρούσα διατριβή αναδεικνύει την αϖοτελεσµατικότητα της µεθόδου «nucleotide sequencing analysis», ως µέσου εϖιδηµιολογικής µελέτης και ανάλυσης της συσχέτισης ιών ϖου εµϖλέκονται σε ανθρώϖινες ασθένειες κι εκέινων ϖου ανιχνεύονται σε ακατέργαστα λύµατα. 164

10 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Summary Enteroviruses have been associated with outbreaks of waterborne nonbacterial gastroenteritis and are of important concern for public health. Significant numbers of viruses can be isolated from faeces and urine of humans as well as from sewage and polluted waters. Adenoviruses are also pathogenic to humans and their presence in environmental samples (polluted waters) may cause infections. Like rotaviruses, adenoviruses are causative agents of gastroenteritis, are the only human enteric viruses to contain DNA and many serotypes are difficult to culture in regular cell lines For this reason, and because adenoviruses are slow growing, their presence in polluted water and their role as originators of gastroenteritis have probably been underestimated. Rota viruses are responsible for severe gastroenteritis in humans and animals. After replicating in the gastrointestinal tract, these viruses are excreted and may be dispersed in environmental waters. Rota viruses have been implicated in waterborne gastroenteritis outbreaks in many countries. The stability of human rotaviruses in environmental water and their resistance to physicochemical treatment processes in sewage treatment plants may facilitate their transmission. In the present study, enteroviruses, adenoviruses and rota viruses were detected in raw sewage samples from inlets of four biological treatment plants in Greece (two in Athens, two in Patras}. Raw sewage samples (118) were analyzed for the presence of these viruses during the period September 2000 to September Our approach consisted of a simple concentration of viruses from raw sewage followed by RT-nested PCR in order to increase the sensitivity of virus detection. The viral sequences detected were then characterized by nucleotide sequencing analysis. 165

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Rota viruses were detected in 17 samples (14.2%). Sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of rotavirus type G1 (88.2%) and type G2 (11.8%). Adenoviruses were found in 55 samples (45.8%). Sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of adenovirus group F type 40 (34.6%), type 41 (63.6%) and group C type 2 (1.8%). Enteroviruses were detected in 30 samples (40%) and sequencing analysis of the positive sewage samples revealed the presence of several types such as (a) coxsackievirus types (A6-3.3%, A9-3.3%, A16-3.3%, B4-16.7%, B5-3.3%), (b) echovirus types (2-6.7%, %, 30-10%), (c) enterovirus types (68-3.3%, %) as well as porcine enterovirus (6.7%). poliovirus 1 (6.7%) and poliovirus 2 (10%). Water quality and, therefore human health, may be significantly affected by the presence of pathogenic enteric microorganisms derived from sewage discharged to the aquatic environment. Outbreaks of enteric virus disease have been linked to water at various times and to different causes. Waterborne disease may be transmitted by consumption of polluted drinking water, by immersion in recreational water or by contact with skin or inhalation. Raw sewage was found to be contaminated by different types of enteric viruses that mainly cause gastroenteritis; therefore, it is necessary to use the most efficient water treatment measures in sewage treatment plants. Sequencing analysis showed the presence of human rotavirus A type G1 and G2 which cause childhood diarrhea worldwide and enteric adenoviruses (types 40 and 41) which are important etiological agents of pediatric gastroenteritis, principally in temperate climates. On the other hand, the variety of enteroviruses identified in the raw sewage samples was more extensive compared to the other viruses of the study. The present study demonstrated the efficiency of the nucleotide sequencing analysis for studying epidemiological relationships between strains involved in human infections and those found in raw sewage. 166

12

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

14 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 1. Ιοί Εντερικής Προέλευσης Στο Υδάτινο Περιβάλλον Η υδατογενής µετάδοση των µικροβίων είναι ένας ϖολύ αϖοτελεσµατικός τρόϖος για την ευρεία και ταυτόχρονη εξάϖλωση ασθενειών σε ένα µεγάλο τµήµα ϖληθυσµού. Μεγάλος αριθµός εντερικών µικροοργανισµών µϖορούν να εισέλθουν στο υδάτινο ϖεριβάλλον µέσω των κοϖράνων µολυσµένων ατόµων (Haas et al. 1993). Οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης εισέρχονται στον οργανισµό µέσω της στοµατικής οδού, ϖολλαϖλασιάζονται και τελικά αϖοβάλλονται στα ούρα και τα κόϖρανα σε µεγάλες συγκεντρώσεις. Πολλοί αϖό τους ιούς µϖορούν να εϖιβιώσουν στο νερό ή τα λύµατα και µάλιστα, µετά την εϖεξεργασία των λυµάτων. Αϖό όλους τους ιούς ιδιαίτερη σηµασία για τη δηµόσια υγεία έχουν οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης. Η ϖιο µελετηµένη οµάδα ιών εντερικής ϖροέλευσης είναι οι Εντεροϊοί (ϖου ϖεριλαµβάνουν τους Polio-ιούς 1-2-3, τους Coxsackie-ιούς Α-Β, τους Echo-ιούς Α- Β και τους εντεροϊούς 68-71). Άλλοι ιοί εντερικής ϖροέλευσης είναι ο ιός της ηϖατίτιδας Α, οι Ρεο-ιοί, οι Αδενοϊοί, οι Ρότα-ιοί, οι Άστρο-ιοί και οι Nορο-ιοί οι οϖοίοι όϖως και οι εντεροϊοί υϖάρχουν στα κόϖρανα, έχουν ανιχνευθεί στα λύµατα και ευθύνονται για ϖληθώρα ασθενειών στον άνθρωϖο (Πίνακας 1). Κάθε χρόνο, 5-18 εκατοµµύρια άνθρωϖοι σε όλο τον κόσµο ϖεθαίνουν αϖό γαστρεντερίτιδα, ενώ εκτιµάται ϖώς 1 εκατοµµύριο ϖαιδιά ϖεθαίνουν αϖό διάρροια ϖου οφείλεται σε ρότα ιούς. Εϖιϖλέον, στη Μεσόγειο ενδηµεί ο ιός της ηϖατίδας Α και ο ιός ϖολιοµυελίτιδας δεν έχει ακόµα ϖλήρως εξαλειφθεί ιδιαίτερα στις νότιες και ανατολικές ϖεριοχές. Όσον αφορά στους αδενοϊούς, τους αστροϊούς, τους Norο, καθώς και τον ιό της ηϖατίτιδας Ε, φαίνεται ότι ϖροκαλούν γαστρεντερίτιδα µετά αϖό κατανάλωση µολυσµένου νερού ή τροφίµων (ιδιαίτερα οστρακοειδών). Στον ϖίνακα 2 αναφέρονται ενδεικτικά ϖοσοστά θνησιµότητας των ϖαραϖάνω ιών (Centers for Disease Control and Prevention, 1995). 3

15 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ΠΙΝΑΚΑΣ 1 : Ιοί Εντερικής Προέλευσης ϖου µεταδίδονται υδατογενώς (Bosch, 1998) Ιοί Εντερικής Προέλευσης Εντεροϊοί Polio-ιοί Echo-ιοί Coxsakie-ιοί Α, Β Reo-ιοί Adeno-ιοί Rota-ιοί Ιός ηϖατίτιδας Α Astro-ιοί Calici-ιοί Human calici-ιοί Norwalk SRSV Ιός ηϖατίτιδας Ε Corona-ιοί Parvo-ιοί Toro-ιοί Κλινικά Σύνδροµα Παράλυση, µηνιγγίτιδα, ϖυρετός Μηνιγγίτιδα, ϖαθήσεις του αναϖνευστικού συστήµατος, ερύθηµα, ϖυρετός, διάρροια Κυνάγχη, µηνιγγίτιδα, ϖαθήσεις του αναϖνευστικού συστήµατος, ϖερικαρδίτιδα, µυοκαρδίτιδα, ϖλευροδυνία Παθήσεις του αναϖνευστικού συστήµατος, γαστρεντερίτιδα ιάρροια-ϖαθήσεις του αναϖνευστικού συστήµατος, ϖαθήσεις οφθαλµών Γαστρεντερίτιδα (κυρίως στα βρέφη) Ηϖατίτιδα-ίκτερος Γαστρεντερίτιδα Γαστρεντερίτιδα Γαστρεντερίτιδα (ενηλίκων), ϖυρετός Γαστρεντερίτιδα Ηϖατίτιδα Γαστρεντερίτιδα, αναϖνευστικές ασθένειες Γαστρεντερίτιδα Γαστρεντερίτιδα ΠΙΝΑΚΑΣ 2 :Ποσοστό θνησιµότητας ατόµων ϖου έχουν ϖροσβληθεί αϖό ιούς εντερικής ϖροέλευσης στις αναϖτυγµένες χώρες (CDS, 1995) Ιοί Εντερικής Προέλευσης Θνησιµότητα % Polio-ιός Echo-ιοί Coxsakie-ιοί Α Coxsakie-ιοί B Adeno-ιοί 0.01 Rota-ιοί Ιός ηϖατίτιδας Α 0.60 Norwalk

16 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης ϖου ϖεριέχονται στις ανθρώϖινες εκκρίσεις ακολουθούν διάφορες ϖορείες στο ϖεριβάλλον (σχήµα 1). Όταν µεγάλη ϖοσότητα µολυσµένων λυµάτων µε εντερικούς µικροοργανισµούς αναµιγνύεται µε νερό ϖου στη συνέχεια, είτε χωρίς εϖεξεργασία καταλήγει στη θάλασσα, είτε είναι ανεϖαρκώς εϖεξεργασµένο και χρησιµοϖοιείται για άρδευση ή ϖόση, τότε είναι ϖολύ ϖιθανό να ϖροκληθεί υδατογενής εϖιδηµία (Bosch A., 1998). Ο άνθρωϖος είναι δυνατό να έρθει σε εϖαφή µε ιούς εντερικής ϖροέλευσης ως εξής: α)µε την κατανάλωση ϖόσιµου νερού ϖου ϖροέρχεται αϖό εϖιφανειακά και υϖόγεια ύδατα ϖου ϖεριέχουν κοϖρανώδεις ϖροσµίξεις ή ανεϖαρκώς εϖεξεργασµένα λύµατα. β)µε την κατανάλωση οστρακοειδών ϖου καλλιεργούνται σε µολυσµένα νερά. γ)µε την κατανάλωση δηµητριακών ϖου καλλιεργήθηκαν µε τη χρησιµοϖοίηση ακατάλληλου νερού άρδευσης. δ) µε την κολύµβηση σε ϖαραλίες όϖου διοχετεύονται µη εϖεξεργασµένα λύµατα στη θάλασσα. Ανθρώϖινες Εκκρίσεις Εϖίγεια ροή Λύµατα Στερεά αϖόβλητα Ωκεανοί και ϖαράκτιες Ποτάµια & Λίµνες Υϖόγεια νερά Άρδευση ϖεριοχές Οστρακοειδή Νερά αναψυχής Παροχή νερού ηµητριακά Υδατοσταγονίδια ΑΝΘΡΩΠΟΣ Σχήµα 1: Πορεία ιών εντερικής ϖροέλευσης στο υδάτινο ϖεριβάλλον µε τελικό αϖοδέκτη τον άνθρωϖο (Rao et al., 1986). 5

17 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 2. Ιοί Εντερικής Προέλευσης στα Λύµατα Πάνω αϖό 140 διαφορετικά είδη ιών εντερικής ϖροέλευσης είναι γνωστό ότι ϖεριέχονται στα κόϖρανα. Σε γενικές γραµµές σε ένα γραµµάριο κοϖράνων ασθενούς µϖορούν να ανιχνευθούν 10 6 ιικά σωµατίδια, ενώ και στα λύµατα έχουν µετρηθεί συγκεντρώσεις της τάξης των µολυσµατικών µονάδων/λίτρο (Parker et al. 2002). Πιο συγκεκριµένα, σε κόϖρανα ασθενών µϖορεί να ϖεριέχονται ϖάνω αϖό ιικά σωµατίδια ιού της ηϖατίτιδας Α, τα οϖοία αϖοβάλλονται αϖό τον οργανισµό του ασθενούς για διάστηµα 30 ηµερών έως και 3 µηνών αϖό την εµφάνιση της νόσου. Οι ρότα ιοί εκκρίνονται σε ακόµα µεγαλύτερες ϖοσότητες ( ιικά σωµατίδια /γραµµάριο κοϖράνων) για ένα ϖερίϖου µήνα αϖό την εµφάνιση της νόσου. Οι Noro ιοί αντίθετα ϖεριέχονται σε µικρότερες συγκεντρώσεις στα κόϖρανα των ασθενών ( ιικά σωµατίδια/ γραµµάριο κοϖράνων) και αϖοβάλλονται αϖό τον οργανισµό για διάστηµα ϖερίϖου 2 εβδοµάδων αϖό την εκδήλωση της νόσου. Τέλος, οι εντεροϊοί ϖεριέχονται στα κόϖρανα σε συγκέντρωση ιικών σωµατιδίων/ γραµµάριο κοϖράνων και αϖοβάλλονται αϖό τον ασθενή για 7 ϖερίϖου εβδοµάδες. Εϖιϖλέον, στα κόϖρανα φορέων αϖοβάλλονται ιοί ο αριθµός των οϖοίων στα µη εϖεξεργασµένα αστικά λύµατα κυµαίνεται αϖό µολυσµατικές µονάδες/λίτρο (Bitton 1980). Η συχνότητα και ο αριθµός των ιικών σωµατιδίων ϖου µϖορούν να ανιχνευθούν στα λύµατα, εξαρτάται αϖό τη συχνότητα των µολύνσεων, τον αριθµό των φορέων στην κοινότητα, τη συχνότητα χρησιµοϖοίησης του εµβολίου της ϖολυοµυελίτιδας καθώς εϖίσης και την ευαισθησία της µεθόδου αϖοµόνωσης και ανίχνευσής τους. Στις εύκρατες ϖεριοχές, συχνότερη αϖοµόνωση ιών εντερικής ϖροέλευσης αϖό τα λύµατα ϖαρατηρείται ϖρος το τέλος της άνοιξης και τις αρχές φθινοϖώρου. Η ϖαρουσία των ιών στα λύµατα µελετήθηκε αϖό τους Sattar και Westwood το 1977 στην Οττάβα του Καναδά ϖου βρήκαν ότι το 79% των δειγµάτων ϖου ανέλυσαν ϖεριείχε ϖαθογόνους για τον άνθρωϖο ιούς. Το 78% αϖό αυτούς ήταν 6

18 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Reo-ιοί, ενώ το υϖόλοιϖο 22% ήταν εντεροϊοί. Πιο ϖρόσφατες µελέτες δείχνουν ότι στα λύµατα είναι η συχνή η ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης κυρίως αδενοϊών, εντεροϊών, Norwalk-ιών, και του ιού της ηϖατίτιδας Α σε ϖοσοστό % του συνολικού αριθµού των δειγµάτων ϖου εξετάζονται (Griffin et al. 1999, Vantarakis et al. 1999). Η ϖαρουσία των ιών ϖοικίλλει ανάλογα µε την εϖοχή του έτους. Οι αδενοϊοί, οι άστρο-ιοί και οι ρότα ιοί αϖοµονώνονται συχνότερα στα κόϖρανα κατά τη διάρκεια του φθινοϖώρου, του χειµώνα και την αρχή της άνοιξης. Αντίθετα, οι εντεροϊοί αϖοµονώνονται συχνότερα το καλοκαίρι. Ενδιαφέρον ϖαρουσιάζουν στοιχεία αναφορικά µε τη γεωγραφική κατανοµή ϖου εµφανίζουν τα διάφορα είδη ιών εντερικής ϖροέλευσης. Συγκεκριµένα, ο ιός της ηϖατίτιδας E σϖανίως αϖοµονώνεται αϖό τα κόϖρανα ή τα λύµατα ϖεριοχών της Ευρώϖης. Πρόσφατες έρευνες αναφέρουν την αϖοµόνωσή του σε δείγµατα λυµάτων στην Βαρκελώνη της Ισϖανίας και στην Ουάσινγκτον των Ηνωµένων Πολιτειών Αµερικής, γεγονός ϖου αιφνιδίασε τους ερευνητές αφού ο ιός δεν ενδηµεί στις χώρες αυτές. Κατά συνέϖεια δεν υϖάρχει ϖεριορισµός ως ϖρος την ϖαρουσία των ιών εντερικής ϖροέλευσης ακόµα και στις ϖιο αναϖτυγµένες χώρες κυρίως λόγω της αυξηµένης µετακίνησης των ϖληθυσµών ϖου ϖαρατηρείται τα τελευταία χρόνια (αϖό τις υϖό ανάϖτυξη χώρες στις αναϖτυγµένες). Παρόλα αυτά η συχνότητα αϖοµόνωσης των ιών εντερικής ϖροέλευσης σε δείγµατα νερού αυξάνεται δραµατικά στις υϖό ανάϖτυξη χώρες εξαιτίας της ανεϖάρκειας των συστηµάτων ύδρευσης και αϖοχέτευσης, τις ακατάλληλες συνθήκες υγιεινής και τον υϖερϖληθυσµό. Η ϖαρουσία των ιών στα µη εϖεξεργασµένα λύµατα εϖιβάλλει την εφαρµογή κατάλληλης εϖεξεργασίας τους ϖροκειµένου να εξουδετερωθούν, ώστε να αϖοφευχθούν υδατογενείς εϖιδηµίες. Οι υδατογενείς λοιµώξεις ϖου ϖροκαλούνται λόγω ανεϖαρκούς εϖεξεργασίας και αϖοµόλυνσης των λυµάτων ταξινοµούνται στις ϖέντε ϖαρακάτω κατηγορίες: 7

19 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 2.1. Λοιµώξεις αϖό τη χρησιµοϖοίηση µολυσµένων µη εϖεξεργασµένων εϖιφανειακών υδάτων. Τα εϖιφανειακά νερά (ϖοτάµια, λίµνες) ϖου δέχονται εκροές λυµάτων ϖιθανόν να ϖεριέχουν ιούς εντερικής ϖροέλευσης οι οϖοίοι δεν είναι ϖάντα ανιχνεύσιµοι διότι είτε βρίσκονται σε ϖολύ µικρές συγκεντρώσεις είτε είναι αναµεµιγµένοι µε διαλυµένα συστατικά και εϖικάθονται στο ίζηµα (Hot et al. 2003). Ο αριθµός των ιών εντερικής ϖροέλευσης ϖου µϖορεί να αϖοµονωθεί αϖό τα εϖιφανειακά νερά, ϖοικίλλει εϖοχιακά, εξαρτάται αϖό των όγκο των διοχετευοµένων λυµάτων, και αϖό τις κλιµατολογικές συνθήκες. Η υγειονοµική σηµασία της ύϖαρξης των ιών εντερικής ϖροέλευσης στα εϖιφανειακά νερά, τεκµηριώθηκε αϖό τον Koopman (1982), ο οϖοίος µελέτησε µια εϖιδηµία γαστρεντερίτιδας ϖου οφειλόταν σε ιούς Noro λόγω της κολύµβησης σε νερά ϖου είχαν µολυνθεί µε λύµατα. Η ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης στα εϖιφανειακά νερά εϖιβεβαιώνεται και σε ϖρόσφατες µελέτες. Ο Pavlov και οι συνεργάτες του (2005) αϖοµόνωσαν polio-ιούς σε δείγµατα υδάτων ϖοταµού στη Νότια Αφρική τονίζοντας τον κίνδυνο ϖρόκλησης υδατογενούς εϖιδηµίας λόγω της κατανάλωσης του νερού αϖό µεγάλο αριθµό ατόµων Λοιµώξεις αϖ τη χρησιµοϖοίηση µολυσµένων, µη εϖεξεργασµένων υϖογείων υδάτων. Οι ιοί στα υϖόγεια νερά µϖορούν να ϖροέρχονται είτε αϖό την εϖίγεια διάθεση της λάσϖης των λυµάτων ή αϖό τη βαθιά εναϖοθήκευσή τους. Υϖό κατάλληλες συνθήκες έχει ϖαρατηρηθεί ότι οι ιοί ταξιδεύουν σε µεγάλη αϖόσταση (100m) στο χώµα και τα υϖόγεια νερά και µάλιστα λόγω του µικρού τους µεγέθους (23-38nm) µεταφέρονται ταχύτερα σε σχέση µε τα βακτήρια (0.5-3µm) και τα ϖρωτόζωα (4-15µm) (Abbaszadegan et al. 2003). Στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής κατά την ϖερίοδο έχουν αναφερθεί ϖεριστατικά υδατογενών λοιµώξεων τα οϖοία σε ϖοσοστό 58% σχετίζονταν µε τη µόλυνση των υϖογείων υδάτων αϖό ιούς εντερικής ϖροέλευσης (ιός ηϖατίτιδας Α, ρότα-ιοί και ιοί Norο) (Craun & Calderon, 1996). 8

20 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 2.3. Λοιµώξεις αϖό την κατανάλωση µολυσµένου ϖόσιµου νερού. Όταν εϖιφανειακά ή υϖόγεια νερά ϖου είναι µολυσµένα µε κοϖρανώδεις ϖροσµίξεις ϖρόκειται να χρησιµοϖοιηθούν για ϖόσιµο νερό, ϖρέϖει να υϖοστούν αϖοτελεσµατική εϖεξεργασία, ϖροκειµένου να αδρανοϖοιηθούν οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης και να αϖοφευχθεί η ϖρόκληση υδατογενών εϖιδηµιών. Η µολυσµατική δόση δεν είναι γνωστή για ϖολλούς ιούς εντερικής ϖροέλευσης, αλλά θεωρείται ότι είναι 1-10 µολυσµατικές µονάδες (PFU). Πολλές µελέτες αναφέρουν την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης (αδενοϊοί, άστροϊοί, ιός ηϖατίτιδας Α, ρότα ιοί και ιοί Noro) σε δείγµατα ϖόσιµου νερού και την ϖρόκληση υδατογενών εϖιδηµιών αϖό την κατανάλωσή του (Kukkula et al. 1997). Ενδεικτικά τον Αύγουστο του 1998 σε ϖεριοχή της Ελβετίας αναφέρθηκε εϖιδηµία γαστρεντερίτιδας οφειλόµενη στην κατανάλωση µολυσµένου ϖόσιµου νερού. Στα δείγµατα ϖου εξετάστηκαν αϖοµονώθηκαν ιοί Norο (Hafliger et al. 2000) Λοιµώξεις αϖό νερά αναψυχής. Πολλές ϖαραλιακές ϖόλεις αϖοβάλλουν καθηµερινά τα λύµατά τους στη θάλασσα χωρίς ϖροηγουµένως να έχει ϖροηγηθεί εϖεξεργασία τους. Τα ϖαράκτια νερά έχουν ενοχοϖοιηθεί για τη µετάδοση ασθενειών στους ανθρώϖους µέσω εϖαφής µε το θαλασσινό νερό ή την κατάϖοσή του (Wetz et al.2004). Ιοί εντερικής ϖροέλευσης αϖοµονώνονται συχνά αϖό το θαλασσινό νερό και τα ιζήµατα του ϖυθµένα ϖαράκτιων ϖεριοχών (Smith et al. 1978). Εϖιδηµιολογικές µελέτες έχουν δείξει ότι υϖάρχει µικρός αλλά υϖαρκτός κίνδυνος ϖρόκλησης γαστρεντερίτιδας (κυρίως σε ϖαιδιά 0-4 ετών), ϖου οφείλεται σε ιούς εντερικής ϖροέλευσης, αϖό την κολύµβηση σε ϖεριοχές ϖου έχουν µολυνθεί µε λύµατα (Shuval 1986, Cabelli 1989, Holmes 1989). 9

21 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 2.5. Λοιµώξεις αϖό την κατανάλωση µολυσµένων οστρακοειδών. Ένα µεγάλο ϖοσοστό ιών εντερικής ϖροέλευσης συγκεντρώνεται στους ιστούς διάφορων υδρόβιων οργανισµών (µύδια, στρείδια κ.α) ϖου τρέφονται διηθώντας µεγάλες ϖοσότητες θαλασσινού νερού. Αυτοί οι οργανισµοί καταναλώνονται ωµοί ή ελάχιστα µαγειρεµένοι µε αϖοτέλεσµα την ϖρόκληση λοιµώξεων στον άνθρωϖο (Sair A.I. et al. 2002). Οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης ϖου σχετίζονται µε την κατανάλωση οστρακοειδών και ενοχοϖοιούνται για την ϖρόκληση τροφιµογενών λοιµώξεων είναι ο ιός της ηϖατίτιδας Α και ο Norwalk-ιός (De Leon et Jaykus 1997, Lees 2000). Στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής η ϖρώτη εϖιδηµία ηϖατίτιδας Α αϖό την κατανάλωση οστρακοειδών ϖραγµατοϖοιήθηκε τις αρχές της δεκαετίας του 60. Το 1988 στη Κίνα σηµειώθηκε µεγάλη εϖιδηµία ηϖατίτιδας Α ( ϖεριστατικά) αϖό την κατανάλωση οστρακοειδών ϖου καλλιεργήθηκαν σε νερά µολυσµένα αϖό λύµατα. Στη Μεγάλη Βρετανία το 1976 και στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής το 1980 σηµειώθηκαν για ϖρώτη φορά εϖιδηµίες γαστρεντερίτιδας αϖό την κατανάλωση µυδιών οφειλόµενη στους ιούς Norwalk (Apleton and Pereira 1977,Gunn et al. 1982). Πρόσφατες µελέτες εϖισηµαίνουν τη σηµασία των εϖι-δηµιών αϖό την κατανάλωση µολυσµένων οστρακοειδών γιατί αφορούν µεγάλο αριθµό ατόµων και ϖολλές ϖεριοχές σε όλο τον κόσµο (Halliday et al. 1991, Sanchez et al. 2002). 10

22 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 3. Παράγοντες ϖου εϖηρεάζουν την εϖιβίωση των ιών στο ϖεριβάλλον Η µελέτη των συνθηκών εϖιβίωσης των ιών και γενικότερα όλων των ϖαθογόνων µικροοργανισµών ϖου ϖεριέχονται στα λύµατα είναι αϖαραίτητη για τη δηµιουργία κατάλληλων µονάδων εϖεξεργασίας (βιολογικός καθαρισµός) µε σκοϖό την ϖροάσϖιση της ηµόσιας Υγείας αλλά και την εϖαναχρησιµοϖοίηση των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων (νερού και λάσϖης). Η εϖιβίωση των ιών εντερικής ϖροέλευσης στο ϖεριβάλλον εϖηρεάζεται αϖό διάφορους φυσικούς, χηµικούς και βιολογικούς ϖαράγοντες ϖολλοί αϖό τους οϖοίους εξαρτώνται αϖό τον τύϖο τη δοµή και τη σύσταση του ιού. Σε γενικές γραµµές οι κύριοι ϖαράγοντες ϖου καθορίζουν την εϖιβίωση των ιών στο ϖεριβάλλον και ειδικότερα στο νερό και το έδαφος είναι η θερµοκρασία, το ph, το φως, η ϖροσρόφησή τους στο έδαφος και η ϖαρουσία άλλων µικροοργανισµών (Guardabassi et al. 2003). Οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης εκτός αϖό το γενετικό τους υλικό ϖου είναι RNA, µε εξαίρεση τους αδενοϊούς ϖου έχουν DNA, διαθέτουν και ένα ϖερίβληµα ϖρωτεϊνικής σύστασης ϖου λέγεται καψίδιο. Η εϖιβίωση τους στο ϖεριβάλλον εξαρτάται αϖό την εϖίδραση ϖου έχουν οι ϖαράγοντες ϖου ϖροαναφέρθηκαν στο γενετικό τους υλικό, αλλά και τις ϖρωτεΐνες του καψιδίου (Sobsey et al. 2003). ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑ Αϖοτελεί τον σηµαντικότερο ϖαράγοντα εϖιβίωσης των ιών στο νερό και το έδαφος. Οι µεταβολές τις θερµοκρασίας εϖηρεάζουν δυσµενώς τη διάρκεια ζωής των ιών. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι σε υψηλές θερµοκρασίες καταστρέφεται το καψίδιο των ιών λόγω µετουσίωσης των ϖρωτεϊνών ϖου το αϖοτελούν, ενώ σε ϖολύ χαµηλές θερµοκρασίες αδρανοϖοιείται το γενετικό υλικό των ιών. Σε γενικές γραµµές όσο η θερµοκρασία αυξάνεται τόσο µειώνεται ο χρόνος ζωής των ιών. ιάφορες εργαστηριακές µελέτες ϖου αφορούν στην εϖιβίωση των ιών αναφέρουν ϖως οι ιοί είναι ϖερισσότερο ανθεκτικοί στις χαµηλές θερµοκρασίες (-20 0 C 1 0 C) ϖαρά στις υψηλές (ϖάνω αϖό 22 0 C) (Hurst et al. 1988). 11

23 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Σύµφωνα µε τον Nasser και τους συνεργάτες του (1993) ο ιός της ηϖατίτιδας Α εµφανίζει τη µεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις υψηλές θερµοκρασίες. Εϖιϖρόσθετα, όταν ο polio-ιός 1 και ο ιός της ηϖατίτιδας Α, ϖου αϖοµονώθηκαν σε διάφορα δείγµατα νερού (υϖόγεια ύδατα, θαλασσινό νερό και λύµατα), εξετάστηκαν σε τρεις διαφορετικές θερµοκρασίες (10 0 C, 20 0 C και 30 0 C) διαϖιστώθηκε ταχύτατη αϖενεργοϖοίησή τους στους 30 0 C. Ο Chung και οι συνεργάτες του το 1993 µελέτησαν την εϖιβίωση του polio-ιού, του ιού της ηϖατίτιδας Α και του ρότα-ιού σε δείγµατα θαλασσινού νερού στους 25 0 C και τους 4 0 C και καταλήγοντας στα ίδια συµϖεράσµατα. Οι ρότα ιοί εµφανίζουν µεγαλύτερη σταθερότητα στους 4 0 C, µικρότερη στους 20 0 C και ελάχιστη στους 37 0 C (Moe et al. 1982). Σε θερµοκρασία ϖάνω αϖό 55 0 C οι polio-ιοί στα λύµατα αϖενεργοϖοιούνται σε λιγότερο αϖό 30 λεϖτά (Clarke et al. 1961), ενώ στην ενεργό ιλύ στους 4 0 C διάρκεια ζωής τους ξεϖερνά τις 66 ηµέρες (Wellings et al. 1976). Φως- Ακτινοβολία Το φως άµεσα ή έµµεσα εϖιδρά στην εϖιβίωση των ιών στο νερό. Η άµεση εϖίδραση του φωτός εξαρτάται αϖό το µήκος κύµατος της ακτινοβολίας. Είναι γνωστό ότι η υϖεριώδης ακτινοβολία µϖορεί να αϖενεργοϖοιήσει τους ιούς ως αϖοτέλεσµα του σχηµατισµού διµερών θυµίνης ή υγροϖοίησης ουρακιλών και της αϖοδιάταξης των ϖρωτεϊνών του καψιδίου. Γι αυτό το λόγο, ϖροτείνεται η χρήση της υϖεριώδους ακτινοβολίας για την αϖοµόλυνση των ιών στα λύµατα και το θαλασσινό νερό (Wilhelm et al. 2002). Η έµµεση εϖίδραση του φωτός αφορά στην ενεργοϖοίηση χηµικών ουσιών ϖου είναι τοξικές για τους ιούς καθώς και στην ϖιθανή αύξηση των µικροοργανισµών ϖου ανταγωνίζονται τους ιούς ως ϖρος την εϖιβίωσή τους (Fukada et al και Jocksch et al. 1996). Τέλος, σηµαντική ϖροστασία αϖό την εϖίδραση του φωτός ϖαρέχεται στους ιούς όταν είναι ϖροσροφηµένοι σε σωµατίδια αργίλου (ιλύς) (Bitton et al. 1979). 12

24 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ph Το ph του µέσου διάλυσης εϖηρεάζει την εϖιβίωση των ιών είτε άµεσα ϖροκαλώντας αϖοδιάταξη των ϖρωτεϊνών του καψιδίου είτε έµµεσα εµϖοδίζοντας την ϖροσρόφησή τους σε διάφορες εϖιφάνειες, ϖου ως γνωστόν ευνοεί την εϖιβίωση τους (Fujioka et al. 1975, Mandel et al και Bitton et al. 1980). Οι ϖερισσότεροι ιοί εµφανίζουν µεγάλη σταθερότητα σε τιµές ph αϖό 5 έως 9. Ο polio ιός για ϖαράδειγµα ϖαραµένει ενεργός για ϖολλές εβδοµάδες σε ph αϖό 3.8 έως 8.5 (Pollard et al. 1949). Μελέτες έδειξαν ότι η αϖενεργοϖοίηση των ρότα ιών σε δείγµατα νερού σχετίζεται µε την τιµή του ph (Pancorbo et al. 1987). Εϖιϖλέον, έχει µελετηθεί η εϖίδραση διαφόρων χηµικών ουσίων στην εϖιβίωση των ϖου εξαρτώνται αϖό το ph. Χαρακτηριστικό είναι το ϖαράδειγµα της αµµωνίας η οϖοία σε ph ϖροκαλεί αϖοδιάταξη των ϖρωτεϊνών του ϖεριβλήµατος των ιών σε αντίθεση µε το ιόν του αµµωνίου ϖου δεν εϖιδρά στην µολυσµατικότητα των εντεροϊών (Ward et al. 1977). Προσρόφηση ιών σε εϖιφάνειες Οι ιοί στα λύµατα βρίσκονται συνήθως συγκεντρωµένοι µε άλλους ιούς δηµιουργώντας συσσωµατώµατα ή ϖροσροφηµένοι σε στερεά αϖόβλητα. Έχει διαϖιστωθεί ότι η αϖορρόφηση των ιών αϖό το έδαφος και η ϖροσκόλλησή τους σε ιζήµατα ενισχύει την εϖιβίωσή τους δρώντας ϖροστατευτικά έναντι αντίξοων ϖεριβαλλοντικών συνθηκών, τοξικών ϖαραγόντων και ανταγωνιστικών µικροοργανισµών (Gerba et al. 1975, Liew et al. 1980, Hejkal et al.1981, Draft OSRAS Rev A 2001). Ο Nagajima και οι συνεργάτες του το 2003 µελετώντας λύµατα, εϖιβεβαίωσαν ότι η ϖροσρόφηση του polio-ιού σε σωµατίδια ενεργού λάσϖης (σε 1 γραµµάριο λάσϖης ϖροσρόφηση 10 8 σωµατιδίων polio-ιών) συνεϖάγεται ενίσχυση της ενεργότητάς του για διάστηµα µεγαλύτερο των 28 ηµερών ϖροστατεύοντας τον ϖαράλληλα αϖό τις µεταβολές τις θερµοκρασίας. Η ϖροσκόλληση του ϖαραϖάνω ιού και του echo-ιού σε ιζήµατα ϖαράκτιων ϖεριοχών αυξάνει το χρόνο εϖιβίωσής τους αϖό 1 ώρα σε 4 µέρες και αϖό 1µέρα σε 6 µέρες αντίστοιχα (LaBelle et al. 1980). 13

25 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Η ϖροσρόφηση των ιών στο έδαφος και κατά συνέϖεια η εϖιβίωση και η µετακίνησή τους εξαρτώνται αϖό ϖολλούς ϖαράγοντες όϖως είναι η υγρασία, το ϖοσό της οργανικής ύλης, η σύσταση του εδάφους, το ph και η ϖαρουσία κατιόντων (ϖίνακας 3). Οι ιοί εµφανίζουν σταθερότητα σε ουδέτερες τιµές ph ( ), ενώ η αϖορρόφησή τους ενισχύεται σε τιµές όξινου ph (Gerba et al και England et al. 1982). Εϖιϖρόσθετα, η ϖαρουσία κατιόντων και διαλυµένων αλάτων σε συνδυασµό µε το ph φαίνεται να ενισχύουν την αϖορρόφηση των ιών αϖό το έδαφος (Sobsey et al και Gerba et al. 1984). Πρωταρχικό ρόλο στην αϖενεργοϖοίηση των ιών στο έδαφος διαδραµατίζει η ικανότητα συγκράτησης νερού αϖό το έδαφος δηλαδή η υγρασία του. Έχει ϖαρατηρηθεί ότι σε συνθήκες υγρασίας κάτω αϖό 10% οδηγεί σε ραγδαία αδρανοϖοίηση των ιών και αναστολή της µετακίνησής τους στην εϖιφάνεια του εδάφους και την εισχώρησή τους στο υϖέδαφος. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην αϖοδιάταξη του ϖεριβλήµατος και του γενετικού υλικού των ιών. Κατά συνέϖεια είναι ϖροφανές ϖως η βροχόϖτωση σε συνδυασµό µε τη θερµοκρασία ευνοούν σηµαντικά την εϖιβίωση των ιών στο έδαφος λόγω αύξησης της υγρασίας (Beavers and Gardner 1993). Παρουσία άλλων µικροοργανισµών Η εϖίδραση ϖου έχει η ϖαρουσία άλλων µικροοργανισµών στην εϖιβίωση των ιών στα εϖιφανειακά νερά, τα λύµατα και το έδαφος έχει µελετηθεί διεξοδικά. Τα βακτήρια και οι άλλοι µικροοργανισµοί ϖαίζουν σηµαντικό ρόλο στην εξουδετέρωση των ιών ϖαράγοντας ϖρωτεολυτικά και άλλα ένζυµα ϖου τους καταστρέφουν (O Brien et al. 1977, Katayoshi et al και Girones et al. 1989). Ο Deng και οι συνεργάτες του το 1995 αϖέδειξαν ότι ο ιός της ηϖατίτιδας Α αϖενεργοϖοιείται ταχύτατα σε µη εϖεξεργασµένα λύµατα τα οϖοία ϖεριέχουν ϖληθώρα µικροβίων σε σχέση µε αϖοστειρωµένα δείγµατα αϖοβλήτων (Deng et al. 1995). Στο θαλασσινό νερό ϖολλές µελέτες αναφέρουν αδρανοϖοίηση των εντεροϊών ϖου σχετίζεται µε τον ανταγωνισµό ϖου αναϖτύσσεται µε τους υϖόλοιϖους µικροοργανισµούς. Ο Raphael και οι συνεργάτες του το 1985 διαϖίστωσαν τη δυσµενή εϖίδραση στην εϖιβίωση των ρότα ιών σε εϖιφανειακά 14

26 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ϖου είχε ο ανταγωνισµός µε άλλους µικροοργανισµούς (Raphael at al. 1985). Τέλος, η εϖιβίωση του polio-ιού στην άµµο αναστέλλεται αϖό την ϖαρουσία αερόβιων µικροοργανισµών του εδάφους (Hurst et al. 1988). Τα ϖαραϖάνω στοιχεία οδήγησαν στην ευρεία χρήση µικροοργανισµών στα διάφορα στάδια εϖεξεργασίας των λυµάτων ώστε να αϖενεργοϖοιηθούν οι ιοί. ΠΙΝΑΚΑΣ 3 : Παράγοντες ϖου εϖηρεάζουν την εϖιβίωση των ιών ϖου είναι ϖροσροφηµένοι στο έδαφος. Παράγοντας Θερµοκρασία Υγρασία ph Συγκέντρωση αλάτων και ϖαρουσία κατιόντων Ποσό οργανικής ύλης Χαρακτηριστικά του εδάφους Τύϖος του ιού Συσσωµάτωση των ιών Εϖίδραση στην Εϖιβίωση των ιών Οι ιοί εϖιβιώνουν ϖερισσότερο σε χαµηλές θερµοκρασίες Η αύξηση της υγρασίας ευνοεί την εϖιβίωση Οι ϖερισσότεροι ιοί εντερικής ϖροέλευσης είναι σταθεροί σε τιµές ph 3-9 Η ϖαρουσία ορισµένων κατιόντων ϖροστατεύει τους ιούς και εµϖοδίζει την αϖενεργοϖοίησή τους Η αύξηση του ϖοσού της οργανικής ύλης συνήθως ενισχύει την εϖιβίωση των ιών Η ικανότητα συγκράτησης του νερού αϖό το έδαφος καθορίζει την ϖροσρόφηση των ιών Ανάλογα µε τον τύϖο του ιού έχει ϖαρατηρηθεί διαφορετική εϖίδραση των διαφόρων ϖαραγόντων Ευνοεί την εϖιβίωσή τους (Yates and Yates 1988) 15

27 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 4. Βιολογικός Καθαρισµός Αστικών Αϖοβλήτων Ένας αϖό τους ϖιο αϖοτελεσµατικούς τρόϖους αντιµετώϖισης της ρύϖανσης των υδάτινων ϖόρων αϖό τα αϖόβλητα είναι οι Εγκαταστάσεις Εϖεξεργασίας Αστικών Αϖοβλήτων (Ε.Ε.Α.Α). Οι εγκαταστάσεις αυτές έχουν ως σκοϖό τον καθαρισµό των αστικών αϖοβλήτων αϖό τα βλαβερά συστατικά ϖου ϖεριέχουν, ώστε αυτά να διατεθούν ακίνδυνα στο ϖεριβάλλον (Ανδρεαδάκης Α., 1989). Ως βλαβερά συστατικά των αϖοβλήτων θεωρούνται τα ογκώδη αντικείµενα, όϖως η άµµος, τα µικρού µεγέθους στερεά ϖου αιωρούνται στη µάζα των αϖοβλήτων (αιωρούµενα στερεά), τα οργανικά-φυσικά συστατικά (ϖ.χ. υδατάνθρακες, ϖρωτεΐνες, λίϖη), οι ϖαθογόνοι µικροοργανισµοί (όϖως οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης) και τα θρεϖτικά στοιχεία (άζωτο και φώσφορος). Αν τα αϖόβλητα διοχετευτούν χωρίς εϖεξεργασία σε έναν υδάτινο αϖοδέκτη δηµιουργούν διάφορα ϖροβλήµατα. Τα ογκώδη στερεά όϖως η άµµος και τα αιωρούµενα στερεά ϖροκαλούν ϖερισσότερο αισθητική δυσαρέσκεια ϖαρά ουσιαστική ρύϖανση του υδάτινου φορέα. Οι ϖαθογόνοι µικροοργανισµοί και ιδιαίτερα οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης είναι υϖεύθυνοι για τη µετάδοση ασθενειών όϖως έχει ήδη αναφερθεί. Κάθε υδάτινος φορέας αλλά και τα ίδια τα αϖόβλητα, ϖεριέχουν µικροοργανισµούς ϖου καταναλώνουν τα οργανικά συστατικά των αϖοβλήτων, καθώς και το άζωτο και το φώσφορο, για να τραφούν και να ϖολλαϖλασιαστούν καταναλώνοντας ϖαράλληλα οξυγόνο, ϖου βρίσκεται διαλυµένο στο νερό µε αϖοτέλεσµα το λεγόµενο φαινόµενο του ευτροφισµού. Το Συµβούλιο Περιβάλλοντος της Ευρωϖαϊκής Ένωσης µε την οδηγία ϖου εξέδωσε (19/3/92), ϖροβλέϖει των εγκατάσταση Ε.Ε.Α.Α. σε όλες της ϖόλεις της κοινότητας. Συγκεκριµένα, ϖροτείνεται η ϖραγµατοϖοίηση βιολογικού καθαρισµού για όλες τις ϖόλεις µέχρι το Εϖιϖλέον, για τις ϖόλεις ϖου βρίσκονται σε ευαίσθητες ϖεριοχές ϖροβλέϖεται και τριτοβάθµιος καθαρισµός, ενώ για τις ϖόλεις µε λιγότερους αϖό κατοίκους, ο ϖρωτοβάθµιος καθαρισµός θεωρείται αρκετός. Όϖως αναφέρει η οδηγία της Ε.Ε, µια Εγκατάσταση Εϖεξεργασίας Αστικών Αϖοβλήτων (Ε.Ε.Α.Α) χαρακτηρίζεται αϖό το βαθµό καθαρισµού, ο οϖοίος 16

28 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η καθορίζεται αϖό τα ϖοια βλαβερά συστατικά ϖου αναφέρθηκαν ϖροηγουµένως αϖοµακρύνει. Τα ογκώδη στερεά, η άµµος και τα αιωρούµενα στερεά, αϖοµακρύνονται ϖάντα σε µια Ε.Ε.Α.Α, οϖότε ο καθαρισµός χαρακτηρίζεται ϖρωτοβάθµιος. Ο δευτεροβάθµιος ή συχνά αϖοκαλούµενος βιολογικός καθαρισµός αϖοσκοϖεί στην αϖοµάκρυνση των οργανικών συστατικών και την εξουδετέρωση των ϖαθογόνων µικροοργανισµών µε διάφορες µεθόδους αϖοµόλυνσης. Ο τριτοβάθµιος καθαρισµός αφορά στην αϖοµάκρυνση των θρεϖτικών στοιχείων φωσφόρου και αζώτου. 4.1 Πρωτοβάθµια Εϖεξεργασία Οι βασικές µονάδες σε µια εγκατάσταση µε ϖρωτοβάθµιο καθαρισµό είναι οι εσχάρες (µια σειρά αϖό µεταλλικές ράβδους στις οϖοίες συγκρατούνται τα ογκώδη στερεά), οι εξαµµωτές (ειδικά σχεδιασµένες δεξαµενές στις οϖοίες δηµιουργούνται κατάλληλες συνθήκες ροής ϖου ϖροκαλούν καθίζηση της άµµου) και οι δεξαµενές ϖρωτοβάθµιας καθίζησης (όϖου καθιζάνει και αϖοµακρύνεται το 70% των αιωρούµενων στερεών και το 30% των οργανικών συστατικών). Συχνά ένας εξαµµωτής ϖεριέχει και διάταξη για την αϖοµάκρυνση των ελαίων και λιϖών ϖου ϖεριέχονται στα αϖόβλητα. Τα αιωρούµενα συστατικά ϖου καθιζάνουν στον ϖυθµένα των δεξαµενών ϖρωτοβάθµιας καθίζησης αϖοτελούν την ϖρωτοβάθµια λάσϖη. Τα ογκώδη στερεά ϖου συγκρατούνται στις εσχάρες και η άµµος ϖου καθιζάνει στους εξαµµωτές, αφυδατώνονται και µεταφέρονται σε χωµατερές. 4.2 Βιολογική ή ευτεροβάθµια Εϖεξεργασία Μια εγκατάσταση µε βιολογικό ή δευτεροβάθµιο καθαρισµό εϖιτυγχάνει όχι µόνο ϖρωτοβάθµιο, αλλά και δευτεροβάθµιο καθαρισµό, δηλαδή σχεδόν ϖλήρη αϖοµάκρυνση (µεγαλύτερη αϖό 95%) των οργανικών συστατικών. Η ιδέα του βιολογικού καθαρισµού στηρίζεται στην ϖραγµατοϖοίηση των βιοχηµικών διεργασιών ϖου γίνονται ανεξέλεγκτα στη φύση (ϖ.χ. κατά τη διοχέτευση αϖοβλήτων σε έναν υδάτινο αϖοδέκτη), µε ελεγχόµενο τρόϖο σε ειδικές για το σκοϖό αυτό δεξαµενές. Στις δεξαµενές αυτές δίνονται οι ιδανικές συνθήκες στους 17

29 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η µικροοργανισµούς ϖου είναι η τροφή (οργανικά συστατικά αϖοβλήτων) και το οξυγόνο, για να αναϖτυχθούν και να ϖολλαϖλασιαστούν. Έτσι, τη θέση των βλαβερών οργανικών συστατικών ϖαίρνουν οι µικροοργανισµοί κυρίως τα βακτήρια, ϖου όχι µόνο δεν είναι βλαβεροί, όϖως οι ϖαθογόνοι, αλλά αϖοτελούν και το εργαλείο καθαρισµού σε µια Ε.Ε.Α.Α. Το οξυγόνο ϖαρέχεται στους µικροοργανισµούς τεχνητά µε διατάξεις αερισµού, ϖου καλούνται αεριστήρες, οϖότε και οι δεξαµενές ονοµάζονται δεξαµενές αερισµού. Το µίγµα των µικροοργανισµών και της τροφής αϖοτελούν την καλούµενη «ενεργό ιλύ», οϖότε και η µέθοδος αυτή του βιολογικού καθαρισµού καλείται µέθοδος Ενεργού Ιλύος (Στάµου Α.Ι. & Βογιατζής Ζ.Σ., 1994). Η ιλύς αυτή αϖοµακρύνεται αϖό τη µάζα των αϖοβλήτων, αφήνοντας τα αϖόβλητα να ϖεράσουν σε δεξαµενές δευτεροβάθµιας καθίζησης, όϖου η ιλύς καθιζάνει και συλλέγεται στον ϖυθµένα των δεξαµενών (δευτεροβάθµια λάσϖη), ενώ τα καθαρισµένα αϖόβλητα υϖερχειλίζουν αϖό την ϖεριφέρεια των δεξαµενών. Μετά τη δευτεροβάθµια εϖεξεργασία τα καθαρισµένα αϖόβλητα µϖορεί να διατεθούν ακίνδυνα στον υδάτινο αϖοδέκτη εφόσον κριθεί ότι δεν είναι ιδιαίτερα ευαίσθητος, ώστε να αϖαιτείται τριτοβάθµια εϖεξεργασία. Τα καθαρισµένα ϖλέον αϖόβλητα ϖροκειµένου να διοχετευτούν χωρίς φόβο στον αϖοδέκτη, υφίστανται µόνο τη διεργασία της αϖολύµανσης για την εξόντωση των ϖαθογόνων µικροοργανισµών σε εϖιµήκεις δεξαµενές. Αϖολύµανση Σκοϖός της αϖολύµανσης είναι η καταστροφή των ϖαθογόνων µικροοργανισµών, ώστε να αϖοφεύγεται η µετάδοση ασθενειών µε τα νερά του αϖοδέκτη στον οϖοίο διοχετεύονται τα αϖόβλητα. 4.3 Τριτοβάθµια Εϖεξεργασία Τριτοβάθµια εϖεξεργασία ϖραγµατοϖοιείται όταν τα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα διοχετεύονται σε αϖοδέκτη, όϖου είναι ϖιθανή η δηµιουργία συνθηκών ευτροφισµού ή όταν αναµένονται λειτουργικά ϖροβλήµατα στην λειτουργία της εγκατάστασης αϖό διόγκωση της λάσϖης. 18

30 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Η ϖρωτοβάθµια και δευτεροβάθµια λάσϖη αϖό τις δεξαµενές καθίζησης υφίσταται συµϖύκνωση (αύξηση του ϖοσοστού των στερεών ϖου ϖεριέχει), σταθεροϖοίηση (µείωση των ϖαθογόνων µικροοργανισµών, των οσµών και της δυνατότητας της λάσϖης να γίνει σηϖτική) και αφυδάτωση µε ξήρανση. Η σταθεροϖοίηση γίνεται αερόβια µε τον αερισµό της λάσϖης σε δεξαµενές όµοιες µε τις δεξαµενές αερισµού ή αναερόβια. Σε µια ϖαραλλαγή της µεθόδου ενεργού ιλύος ϖου καλείται ϖαρατεταµένος αερισµός και εφαρµόζεται ευρύτατα στην Ελλάδα, η αερόβια σταθεροϖοίηση της λάσϖης γίνεται στις δεξαµενές αερισµού (Stamou A.I. et al. 1993). Η αφυδάτωση της λάσϖης αϖοσκοϖεί στην αϖοµάκρυνση µεγάλου µέρους του νερού ϖου ϖεριέχει. Μετά την ξήρανσή της η λάσϖη διατίθεται σε χωµατερή ή για λίϖασµα. Στο ϖαρακάτω σχήµα (2) ϖαρουσιάζεται ένα υϖόδειγµα σχεδιασµού των Βασικών Μονάδων Εγκατάστασης Εϖεξεργασίας Αστικών Αϖοβλήτων. 19

31 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 1) Προκαταρκτική εϖεξεργασία 1.1 Φρεάτιο άφιξης - Εσχάρες. 1.2 Αεριζόµενοι εξαµµωτέςλιϖοσυλλέκτες. 1.3 ίαυλος µέτρησης ϖαροχής. 2) Βιολογική εϖεξεργασία. 2.1 εξαµενή εϖιλογής βακτηριδίων ( ΕΒ). 2.2 Φρεάτιο διανοµής Νοί (Φ 1). 2.3 Ανοξικές δεξαµενές (ΑΟ ) - δεξαµενές αερισµού ( Α). 2.4 Φρεάτιο διανοµής Νο2 (Φ 2). 2.5 εξαµενές καθίζησης ( Κ). 2.6 Αντλιοστάσιο λάσϖης (ΑΝΛ). 2.7 Αντλιοστάσιο ανάµικτου υγρού (ΑΝΑΥ). 3) Αϖολύµανση µε χλωρίωση ( ΧΛ). 4) Εϖεξεργασία λάσϖης. 4.1 Πάχυνση λάσϖης σε δεξαµενές ϖάχυνσης ( ΠΧ). 4.2 Αφυδάτωση λάσϖης µε ταινιοφιλτρόϖρεσσες (ΤΦ). 5) Αντλιοστάσιο στραγγιδίων. ΙΑΘΕΣΗ ΕΚΡΟΗΣ ΣΤΟΝ ΑΠΟ ΕΚΤΗ Σχήµα 2 : Υϖόδειγµα Σχεδιασµού Μονάδας Εϖεξεργασίας Αστικών Αϖοβλήτων (Στάµου, 1995). 20

32 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Εξουδετέρωση των Ιών Εντερικής Προέλευσης µε τη Μέθοδο Ενεργού Ιλύος Η µέθοδος της Ενεργού Ιλύος αϖοτελεί την ϖιο κατάλληλη βιολογική εϖεξεργασία των αϖοβλήτων για την αϖοµάκρυνση των ιών. Έχει διαϖιστωθεί ότι ϖάνω αϖό το 90% των ιικών σωµατιδίων ϖροσκολλώνται στα αιωρούµενα στερεά και µεταφέρονται στη λάσϖη κατά την ϖρωτοβάθµια και δευτεροβάθµιά καθίζηση (Bitton et al. 1980, Omura et al & Rao et al.1986). Οι Glass και O Brien (1980) αναφέρουν ότι µετά αϖό 10 ώρες αερισµό, το 25% των ιών αϖοµακρύνθηκε µεταφερόµενο στη λάσϖη και το 75% αϖενεργοϖοιήθηκε στο στάδιο βιολογικής εϖεξεργασίας των λυµάτων. Κατά συνέϖεια, η µέθοδος της ενεργού ιλύος δεν αρκεί για την ϖλήρη αϖοµάκρυνση των ιών ούτε για την αϖενεργοϖοίησή τους. Στην Ινδία όϖως αναφέρουν ο Rao και οι συνεργάτες του (1977) µε την εφαρµογή της ϖαραϖάνω µεθόδου αϖοµακρύνθηκε το 90%-99% των ιών εντερικής ϖροέλευσης. Εϖιϖλέον, ϖαρόµοια έρευνα στο Χιούστον των Ηνωµένων Πολιτειών Αµερικής έδειξε ότι αϖοµακρύνθηκε το 93%-99% των ρότα ιών στα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα (Rao et al. 1986). Σε κάϖοιες ϖεριϖτώσεις όµως όϖως για ϖαράδειγµα σε βιολογικό καθαρισµό στη Γαλλία εϖιτεύχθηκε αϖοµάκρυνση των εντεροϊών σε ϖοσοστά µόλις 48% και 69% (Schwartzbrod et al. 1985). Είναι γεγονός ότι έχουν αϖοµονωθεί ιοί εντερικής ϖροέλευσης (polio-ιοί, coxsackie-ιοί Α και Β, echo-ιοί, ρότα ιοί, reo-ιοί και αδενοϊοί) σε διάφορες ϖεριοχές σε µερικώς εϖεξεργασµένα αϖόβλητα. Εϖιϖλέον, έχουν αναφερθεί ϖεριϖτώσεις όϖου τα λύµατα δεν έχουν αϖολυµανθεί αϖό ιούς µετά τη δευτερογενή εϖεξεργασία τους (Koivunen et al & Rajala et al. 2003). Συνοϖτικά η αϖοµάκρυνση ή η αϖενεργοϖοίηση των ιών µε τη µέθοδο της ενεργού ιλύος ϖραγµατοϖοιείται ως εξής : Α) Με την ϖροσρόφηση των ιών στα αιωρούµενα στερεά οϖότε µεταφέρονται στη λάσϖη. Β) Αϖενεργοϖοίηση των ιών ως αϖοτέλεσµα της δράσης βακτηρίων. Γ) Κατανάλωση των ιών αϖό ϖρωτόζωα και µετάζωα. 21

33 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Μέθοδοι αϖολύµανσης Προκειµένου να εξαλειφθεί ο κίνδυνος αϖό την ϖαρουσία των ιών στα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα και να εϖαναχρησιµοϖοιηθούν είναι αϖαραίτητη η αϖολύµανσή τους. Η ϖιο ϖαραδοσιακή µέθοδος αϖολύµανσης είναι η χλωρίωση η οϖοία αν και είναι αϖοτελεσµατική για τα βακτήρια δεν συµβαίνει το ίδιο για όλους τους τύϖους των ιών εντερικής ϖροέλευσης (Tyrrell et al & Veschetti et al. 2003). Στην Αµερική εφαρµόζεται εδώ και ϖολλά χρόνια η χλωρίωση των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων ώστε να εϖαναχρησιµοϖοιηθούν για ϖόση, άρδευση ή να διοχετευθούν στη θάλασσα. Παρόλα αυτά, τα τελευταία χρόνια έχουν δηµιουργηθεί ερωτηµατικά εξαιτίας της δυσµενούς εϖίδρασης του χλωρίου στο υδάτινο ϖεριβάλλον ϖου διοχετεύονται τα χλωριωµένα αϖόβλητα. Αντίθετα στη Μ. Βρετανία, δεν εφαρµόζεται µια ορισµένη µέθοδος αϖολύµανσης σε όλες τις µονάδες εϖεξεργασίας αϖοβλήτων. Τα τελευταία χρόνια, φαίνεται να ενισχύεται η χρησιµοϖοίηση της υϖεριώδους ακτινοβολίας (UV) ως µεθόδου αϖολύµανσης. Η χρησιµοϖοίηση της υϖεριώδους ακτινοβολίας αν και έχει ϖολλά ϖλεονεκτήµατα έχει ένα βασικό µειονέκτηµα ϖου αφορά στη δυσκολία ϖροσδιορισµού της κατάλληλης δόσης ώστε να εξουδετερωθούν οι διάφοροι ϖαθογόνοι µικροοργανισµοί (Oppenheimer et al & Salgot et al. 2002). Η τρίτη µέθοδος αϖολύµανσης ϖου εφαρµόζεται αφορά στη χρησιµοϖοίηση του όζοντος το οϖοίο είναι εξαιρετικά αϖοτελεσµατικό στην αϖενεργοϖοίηση των ιών και δεν έχει δυσάρεστες εϖιϖτώσεις για το ϖεριβάλλον (White et al & Qualls et al. 1989). Παρόλα αυτά το υψηλό κόστος της µεθόδου αϖοτελεί ϖεριοριστικό ϖαράγοντα εφαρµογής της σε ευρεία κλίµακα σε σχέση µε τη χλωρίωση και την υϖεριώδη ακτινοβολία. Ανάλογα µε τον τύϖο του ιού και τη δοµή του συνιστάται εφαρµογή διαφορετικής µεθόδου αϖολύµανσης ή συνδυασµός τους. Αυτό είναι και το σηµαντικότερο εµϖόδιο ϖου ϖρέϖει να ξεϖεραστεί, ώστε να είναι δυνατή η εξουδετέρωση όλων των ιών εντερικής ϖροέλευσης στα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα. Ο ιός της ηϖατίτιδας Α εµφανίζεται ιδιαίτερα ανθεκτικός στην εϖίδραση του χλωρίου και της υϖεριώδους ακτινοβολίας, ενώ αϖενεργοϖοιείται αϖοτελεσµατικά µε τη χρήση όζοντος. Οι Αδενοϊοί εµφανίζουν µεγάλη αντοχή στην 22

34 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η εϖίδραση της υϖεριώδους ακτινοβολίας, αλλά είναι ευαίσθητοι στη χλωρίωση (Nwachcuku et al & Gerba et al. 2003). Οι ιοί Norwalk όϖως και ο ιός της ηϖατίτιδας Α είναι ανθεκτικοί στη χλωρίωση και στην υϖεριώδη ακτινοβολία. Οι ρότα ιοί και οι reo-ιοί εµφανίζουν ιδιαίτερη αντοχή στο όζον και την υϖεριώδη ακτινοβολία σε σχέση µε τους εντεροϊούς, αλλά είναι ϖιο ευαίσθητοι στη χλωρίωση (Wolfe et al & Clark et al. 1993). Πρόσφατες µελέτες υϖοστηρίζουν ότι ο ϖιο ενδεδειγµένος τρόϖος αϖολύµανσης των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων είναι ο συνδυασµός των ϖαραϖάνω µεθόδων (Koivumen et al. 2005). Έχει διαϖιστωθεί ότι η χρησιµοϖοίηση του όζοντος σε συνδυασµό µε τη χλωρίωση δίνει ϖολύ καλά αϖοτελέσµατα αναφορικά µε την εξουδετέρωση των ιών. Σε άλλες µελέτες αναφέρεται ότι ο συνδυασµός υϖεριώδους ακτινοβολίας και όζοντος οδηγεί σε ταχύτατη αϖενεργοϖοίηση των ιών (Tyrrell et al. 1995). Συµϖερασµατικά, οι υϖάρχουσες µέθοδοι αϖολύµανσης εµφανίζουν ϖλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα τα οϖοία ϖρέϖει να λαµβάνονται υϖ όψη κατά την εξουδετέρωση των ιών στα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα (Πίνακας 4). Τα τελευταία χρόνια εφαρµόζεται σε ϖαγκόσµια κλίµακα συνδυασµός των µεθόδων αϖολύµανσης, ώστε η διάθεση των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων να ϖραγµατοϖοιείται µε ασφαλή τρόϖο. 23

35 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ΠΙΝΑΚΑΣ 4 : Σύγκριση Μεθόδων Αϖολύµανσης. Χαρακτηριστικό Αϖοµάκρυνση κολοβακτηριδίων ΟΖΟΝΩΣΗ Μέθοδος Αϖολύµανσης ΥΠΕΡΙΩ ΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑ ΧΛΩΡΙΩΣΗ Πολύ καλή Πολύ καλή Πολύ καλή Αϖοµάκρυνση ιών Πολύ καλή Καλή Μέτρια Πιθανότητες εϖανανάϖτυξης µικροοργανισµών Καµία Σηµαντική Ελάχιστη Εϖίδραση στον υδάτινο αϖοδέκτη Καµία Καµία Αύξηση διαλυτών στερεών Παραϖροϊόντα αϖολύµανσης Κανένα Κανένα Αλογονοφόρµια Εϖικινδυνότητα ϖαραϖροϊόντων Εϖικινδυνότητα χρησιµοϖοιούµενων χηµικών Μηδενική Μηδενική Μεγάλη Καµία Καµία Μεγάλη Κόστος εγκατάστασης Σηµαντικό Σηµαντικό Μέσο (Jancanelo et al & Scoville et al. 1995) 24

36 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 5. Εϖαναχρησιµοϖοίηση Εϖεξεργασµένων Αϖοβλήτων Το νερό σήµερα είναι ένα αγαθό σε έλλειψη. Η ζήτηση νερού για διάφορες χρήσεις είναι σήµερα µεγαλύτερη αϖό τους διαθέσιµους υδάτινους ϖόρους κυρίως στις χώρες της Βόρειας Αφρικής και της Μέσης Ανατολής. Το ϖρόβληµα γίνεται ολοένα και ϖιο έντονο τις τελευταίες δεκαετίες λόγω των ϖαρατηρούµενων ϖαρατεταµένων ϖεριόδων ολιγοµβρίας, της συνεχούς αύξησης του ϖληθυσµού και εξαιτίας των αυξηµένων καταναλωτικών συνηθειών όσον αφορά στη χρήση του νερού στα αστικά κέντρα (Mc Kenzie, 2005). Ο συνολικός ϖληθυσµός των Μεσογειακών χωρών έφθασε το 2000, τα 427 εκατοµµύρια ϖαρουσιάζοντας αύξηση 50% αϖό το 1970 (ϖληθυσµός: 142 εκατοµµύρια). Σύµφωνα µε τις ϖιο ϖρόσφατες εκτιµήσεις δηµογραφικών στοιχείων όϖως αυτές ϖαρουσιάζονται αϖό το Περιφερειακό Ερευνητικό Κέντρο Blue Plan της UNEP ο ϖληθυσµός της Μεσογείου θα αγγίξει τα εκατοµµύρια µέχρι το 2025 (Attane et al. 2001). Σήµερα, ο ρυθµός αστικοϖοίησης κυµαίνεται στις χώρες αυτές γύρω στο 64.3% ενώ εκτιµάται ϖως θα αυξηθεί σε 72.4% µέχρι το Πιο συγκεκριµένα, εκτιµάται ότι ο αστικός ϖληθυσµός των µεσογειακών χωρών θα αυξηθεί αϖό εκατοµµύρια ϖου ήταν το 2000 σε 379 εκατοµµύρια µέχρι το Είναι σήµερα αϖοδεκτό ότι οι χώρες της Μεσογείου βρίσκονται σε µία δυναµική κατάσταση έντονων δηµογραφικών, κοινωνικών, ϖολιτιστικών, οικονοµικών και ϖεριβαλλοντικών αλλαγών µε συνέϖεια τη συνεχή αύξηση στη χρήση των φυσικών ϖόρων και αγαθών. Η υϖερκατανάλωση νερού κυρίως στις αστικές κοινωνίες αϖοτελεί ϖρόβληµα σε ολόκληρη την ϖεριοχή της Ευρώϖης και κυρίως στις χώρες της Μεσογείου, οι οϖοίες αντιµετωϖίζουν συνεχείς ϖεριόδους ξηρασίας. Τα κρίσιµα ϖροβλήµατα των υδάτινων ϖόρων, όϖως η υϖερβολική χρήση, η ρύϖανση και η µη ενσωµάτωση της διαχείρισης του νερού σε άλλους τοµείς της ϖολιτικής, δεν έχουν ακόµα αντιµετωϖιστεί. Το νερό δεν ϖρέϖει να συνεχίσει να αντιµετωϖίζεται ως ϖόρος ανεξάντλητος, και ϖάντα διαθέσιµος. Η εϖαναχρησιµοϖοίηση των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων είναι 25

37 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η διαδεδοµένη και εφαρµόζεται κυρίως για αρδευτικό σκοϖό στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής (Φλόριντα, Αριζόνα και Κολοράντο), στην Κεντρική και Νοτιοανατολική Αφρική όϖου εϖικρατούν συνθήκες έντονης ξηρασίας. Για ϖολλές χώρες ειδικά της Βόρειας Αφρικής και της Ανατολικής Μεσογείου, η εϖεξεργασία των αστικών λυµάτων καθώς και η εϖαναχρησιµοϖοίηση τους στη γεωργία για σκοϖούς άρδευσης αϖοτελεί σήµερα µία µεγάλη ευκαιρία και ταυτόχρονα ϖρόκληση έτσι ώστε να δοθούν λύσεις και στο θέµα της τελικής διάθεσης των λυµάτων αλλά και στο ϖρόβληµα της έλλειψης νερού. Σε ϖολλές ϖεριοχές, η ζήτηση νερού είναι µεγαλύτερη της διαθεσιµότητας, ακόµη και σε έτη κανονικών ατµοσφαιρικών κατακρηµνίσεων. Εϖίσης, υϖό τέτοιες συνθήκες, η ανάϖτυξη νέων ϖηγών νερού είναι χρονοβόρα, δαϖανηρή και ϖολλές φορές ϖεριβαλλοντικά αϖαγορευτική. Η ανάκτηση υγρών αϖοβλήτων αϖοτελεί ένα αξιόϖιστο υδατικό ϖόρο, ιδιαίτερα στο αστικό ϖεριβάλλον και κατά τα έτη ξηρασίας µϖορεί να αντικαταστήσει διαθέσιµους ϖόρους τόσο για ϖόσιµες όσο και για µη ϖόσιµες χρήσεις (Angelakis et al. 1999). Οι κύριοι τρόϖοι εϖαναχρησιµοϖοίησης των εϖεξεργασµένων λυµάτων είναι οι εξής : Γεωργική άρδευση Εµϖλουτισµός υϖόγειων υδροφορέων Βιοµηχανική ανακύκλωση Αϖοκατάσταση του φυσικού ϖεριβάλλοντος και δηµιουργία χώρων αναψυχής Αστική χρήση µη ϖόσιµου νερού (ϖυρόσβεση, τουαλέτες) Χρήση για ϖόσιµο νερό Ένας αϖό τους κυριότερους ϖεριοριστικούς ϖαράγοντες (ϖίνακας 5) στην εϖαναχρησιµοϖοίηση των εϖεξεργασµένων λυµάτων είναι η ϖαρουσία ϖαθογόνων ϖαραγόντων µεταξύ των οϖοίων είναι και οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης. Σηµαντικός κίνδυνος για τη ηµόσια Υγεία ϖροκύϖτει κατά τη διάρκεια της εϖεξεργασίας των λυµάτων ή της διάθεσης των εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων αϖό τη δηµιουργία υδατοσταγονιδίων τα οϖοία 26

38 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ενδέχεται να ϖεριέχουν ιούς εντερικής ϖροέλευσης. Ο κίνδυνος ϖρόσκλησης ασθενειών είναι ιδιαίτερα µεγάλος για τους εργαζόµενους στις µονάδες εϖεξεργασίας λυµάτων. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν κρούσµατα ηϖατίτιδας Α και C σε εργαζόµενους βιολογικών καθαρισµών (Khuder et al. 1998, Brautbar 1999, Thorn J. et al. 2001). Γι αυτό το λόγο η ϖροσϖάθεια ϖου γίνεται στην Ευρώϖη και τις Η.Π.Α για την χρησιµοϖοίηση των εϖεξεργασµένων εκροών των βιολογικών καθαρισµών (νερό και λάσϖη) εστιάζεται στην κατανόηση των ϖαραγόντων ϖου εϖηρεάζουν την εϖιβίωση των ιών στο υδάτινο ϖεριβάλλον για την εφαρµογή µηχανισµών εξουδετέρωσής τους και την αϖοφυγή εϖιδηµιών. ΠΙΝΑΚΑΣ 5 : Κατηγορίες Ανάκτησης και Εϖαναχρησιµοϖοίησης υγρών αϖοβλήτων και ϖιθανοί Περιορισµοί. Εϖαναχρησιµοϖοίηση Αϖοβλήτων 1.Άρδευση - φυτικές καλλιέργειες - εµϖορικά φυτώρια Περιορισµοί Ποιότητα νερού (κυρίως ως ϖρος την εϖίδραση αλάτων στο έδαφος και τα φυτά) 2.Άρδευση κοινόχρηστων χώρων αναψυχής - ϖάρκα - σχολεία - εθνικοί δρόµοι - ιϖϖοδρόµια - νεκροταφεία - ϖεριφερειακές ζώνες ϖρασίνου 3.Βιοµηχανική χρήση - ψύξη - µεταϖοίηση - βαριά βιοµηχανίες Προστασία ηµόσιας Υγείας (σε σχέση µε ϖαθογόνα, όϖως ϖαράσιτα, ιοί και βακτήρια) Μόλυνση εϖιφανειακών και υϖόγειων νερών όταν δεν υφίσταται κατάλληλο σύστηµα διαχείρισης Εµϖορικότητα και δηµόσια αϖοδοχή των ϖροϊόντων Συστατικά του νερού ϖου ανακτάται µϖορούν να ϖροξενήσουν διάβρωση, εναϖόθεση, βιολογική ανάϖτυξη ή γενικά ϖροβλήµατα ρύϖανσης ηµόσια υγεία (ιδιαίτερα σε σχέση µε µεταφερόµενα οργανικά ή ϖαθογόνα µε υδατοσταγονίδια) 27

39 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 4.Εµϖλουτισµός υϖόγειων υδροφορέων - αναϖλήρωση - ϖροστασία - ιζηµατολογικός έλεγχος 5.Αναψυχή και άλλες ϖεριβαλλοντικές χρήσεις - λίµνες και δεξαµενές - αϖοκατάσταση ελωδών χώρων - αύξηση ϖαροχής υδατορευµάτων - ανάϖτυξη αλιευτικών χώρων - δηµιουργία ϖάγου 6.Μη ϖόσιµες χρήσεις - ϖυροϖροστασία - κλιµατισµός - καθαρισµός τουαλετών Ιχνη οργανικών, άλλων χηµικών και ϖαθογόνων στο ανακτώµενο νερό µε υψηλό δυναµικό τοξικότητας Συνολικά διαλυµένα στερεά, µέταλλα και ϖαθογόνα στο ανακτώµενο νερό Προστασία της δηµόσιας υγεία αϖό βακτήρια και ιούς Ευτροφισµός οφειλόµενος στο άζωτο και το φώσφορο ϖου ϖεριέχονται στα εϖεξεργασµένα αϖόβλητα Αισθητικές ενοχλήσεις Προστασία δηµόσιας υγείας αϖό τη µεταφορά ϖαθογόνων αϖό τη δηµιουργία υδατοσταγονιδίων Ποιοτικές εϖιδράσεις σε ενα- ϖόθεση, διάβρωση, βιολογική ανάϖτυξη και γενικά ρύϖανση Προβλήµατα αϖό την ϖιθανή διασταύρωση του ανακτώµενου νερού µε το σύστηµα υδροδότησης 7.Πόσιµες χρήσεις - αϖευθείας χρήση εϖεξεργασµένων αϖοβλήτων - ϖροηγούµενη ανάµειξη µε το νερό υδροδότησης Ιχνη οργανικών, άλλων χηµικών και ϖαθογόνων στο ανακτώµενο νερό µε υψηλό δυναµικό τοξικότητας ηµόσια και αισθητική αϖοδοχή ϖροστασία δηµόσιας υ- γείας σε σχέση µε τη µεταφορά ϖαθογόνων και κυρίως ιών (Takashi et al. 2001, Aomar et al. 2002, Toze S. 2004) 28

40 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 6. Αϖοµόνωση Ιών Εντερικής Προέλευσης Οι µέθοδοι ϖου χρησιµοϖοιούνται για την αϖοµόνωση των ιών εντερικής ϖροέλευσης αϖό τα λύµατα κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες: α) στις καλλιεργητικές µε τη χρήση κυτταρικών σειρών ανάλογα µε το είδος του ιού και β) τις µοριακές όϖως είναι η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) ϖου αϖαιτεί την αϖοµόνωση του DNA ή του RNΑ ανάλογα µε το είδος του ιού ϖου εξετάζουµε. Οι µοριακές τεχνικές µε βάση έρευνες ϖου έχουν γίνει αναφορικά µε την ϖαρουσία ιών στα λύµατα αϖοδεικνύονται να είναι ταχύτερες, ϖιο ευαίσθητες και ϖιο ακριβείς συγκρινόµενες µε τις καλλιεργητικές. Εϖιϖλέον, µε τη χρήση µοριακών τεχνικών είναι δυνατόν να ανιχνευθούν ιοί, ϖου εξαιτίας της αργής τους ανάϖτυξης είναι δύσκολο και σε κάϖοιες ϖεριϖτώσεις αδύνατο να καλλιεργηθούν (ρότα ιοί, αδενοϊοί F τύϖου 40 και 41). (Arens Max, 1999). Ο Yu-Li Tsai και οι συνεργάτες του (1993) ανίχνευσε µε τη χρήση Ανάστροφης Μεταγραφής και PCR (RT-PCR) εντεροϊούς αϖό λύµατα ϖου συλλέχθηκαν αϖό µονάδα βιολογικού καθαρισµού στην Καλιφόρνια των H.Π.Α. Στην ϖαρούσα εργασία έγινε σύγκριση της µοριακής τεχνικής µε την καλλιεργητική και αϖοδείχτηκε ότι η RT-PCR εµφανίζει ϖολύ µεγάλη ευαισθησία και συνιστάται ανεϖιφύλαχτα για την αϖοµόνωση ιών αϖό ϖεριβαλλοντικά δείγµατα. Στην Ισϖανία ο Puig και οι συνεργάτες του το 1994 και η Pina και οι συνεργάτες του το 1998 εξέτασαν δείγµατα λυµάτων ϖου ϖροέρχονταν αϖό το αϖοχετευτικό δίκτυο της Βαρκελώνης µε σκοϖό την αϖοµόνωση αδενοϊών µε τη χρήση PCR. Τα αϖοτελέσµατα ήταν ιδιαίτερα ικανοϖοιητικά και η µέθοδος αϖοδείχθηκε ϖολύ ευαίσθητη και αξιόϖιστη. Ο Dubois και οι συνεργάτες του το 1994 και το 1997 αϖοµόνωσαν αϖό λύµατα ϖεριοχών της Γαλλίας ρότα ιούς και εντεροϊούς µε την εφαρµογή της RT-PCR. Η ϖαρουσία ρότα ιών σε λύµατα µελετήθηκε αϖό την ερευνητική οµάδα του Εργαστηρίου Ιολογίας του Πανεϖιστηµίου 29

41 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η της Γκρενόµϖλ στη Γαλλία (Gratacap-Cavallier B. et al. 2000) µε την εφαρµογή της RT-PCR. Η µέθοδος οδήγησε στην αϖοµόνωση ρότα ιών ανθρώϖινης και ζωϊκής ϖροέλευσης. Οι κυριότερες ϖαρατηρήσεις αϖό τις ϖαραϖάνω µελέτες είναι : α) µόνο µικρό ϖοσοστό των σωµατιδίων των ιών ϖου υϖάρχουν στα λύµατα µϖορούν να ανιχνευθούν µε καλλιεργητικές τεχνικές (ο συνηθισµένος τύϖος ιού ϖου καλλιεργείται είναι ο polio-ιός), β) οι µοριακές τεχνικές ϖαρά τα ϖλεονεκτήµατα ϖου εµφανίζουν έναντι των καλλιεργητικών τεχνικών συχνά είναι δύσκολο να εφαρµοστούν µε εϖιτυχία εξαιτίας ϖληθώρας αναστολέων ϖου υϖάρχουν στα λύµατα, και γ) µε την καθιέρωση των µοριακών µεθόδων για την αϖοµόνωση ιών αϖό τα λύµατα δίνεται η δυνατότητα στους ερευνητές να ϖροχωρήσουν στην µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών, ϖου είναι ο αϖώτερος σκοϖός των ερευνών, ϖου διεξάγονται σήµερα σε ϖαγκόσµια κλίµακα. Πολύ ϖριν την καθιέρωση των µοριακών τεχνικών, η τυϖοϖοίηση των ιών στηριζόταν στην χρήση αντισωµάτων µε τα οϖοία διακρίνονταν οι αντιγονικές διαφορές µεταξύ των διαφόρων τύϖων ιών. Το ϖρόβληµα για τους ερευνητές ήταν ότι κάϖοια είδη ιών δεν µϖορούν να τυϖοϖοιηθούν µε τη χρήση αντισωµάτων γιατί δεν εµφανίζουν αντιγονικές διαφορές. Παρόλα αυτά οι ανοσολογικές τεχνικές έδιναν ικανοϖοιητικά αϖοτελέσµατα για την ταξινόµηση των ιών σε µεγάλες οµάδες(τύϖους) ϖου διέφεραν σηµαντικά ως ϖρος τις αντιγονικές τους ιδιότητες. Η ανάγκη για τη διάκριση µεταξύ ιών ϖου εµφανίζουν κοινά αντιγονικά χαρακτηριστικά, οδήγησε στην ανάϖτυξη των µοριακών τεχνικών (Car et al. 2001). Το γονιδίωµα ενός ιού µϖορεί να εµφανίζει µεγάλες διαφορές σε εϖίϖεδο νουκλεοτιδίων (µεταλλάξεις), αλλά το γεγονός αυτό να µην εϖηρεάζει την έκφραση των ϖρωτεϊνών και τα µορφολογικά χαρακτηριστικά του ιού. Στις διαφοροϖοιήσεις του 30

42 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η γονιδιώµατος των ιών ϖου ϖροκύϖτουν λόγω µεταλλάξεων στηρίζονται οι µοριακές τεχνικές τυϖοϖοίησης, οι οϖοίες συγκρίνουν το γονιδίωµα διαφόρων στελεχών ιών ϖου αϖοµονώνονται αϖό κλινικά και ϖεριβαλλοντικά δείγµατα. Για ϖαράδειγµα, έστω ότι αϖό κάϖοιο ασθενή έχει αϖοµονωθεί ένα ιικό στέλεχος. Με την εφαρµογή των µοριακών τεχνικών διαϖιστώνονται οι αλλαγές στην νουκλεοτιδική του αλληλουχία, ϖου ϖιθανόν έχουν συµβεί και είτε ταξινοµείται µαζί µε άλλα ϖαρόµοια στελέχη του ίδιου είδους, είτε µϖορεί να αϖοτελέσει καινούριο τύϖο. Ιδιαίτερα οι RNA ιοί (ϖ.χ. εντεροϊοί και ρότα ιοί ), εµφανίζουν µεγάλο ϖοσοστό µεταλλάξεων σε σχέση µε τους DNA ιούς (αδενοϊοί), γιατί η RNA ϖολυµεράση δεν έχει την ικανότητα διόρθωσης λαθών κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του γονιδιώµατος. Η τυϖοϖοίηση των ιών έχει µεγάλη σηµασία κυρίως για εϖιδηµιολογικούς σκοϖούς. Οι µοριακές τεχνικές τυϖοϖοίησης µϖορούν να συµβάλλουν στην ταυτοϖοίηση των ϖαθογόνων µικροβίων (ιών, βακτηρίων) ϖου ϖροκαλούν τις διάφορες εϖιδηµίες καθώς και στην εξακρίβωση του τρόϖου µετάδοσής τους. Εϖιϖλέον, µε την τυϖοϖοίηση τα εϖιδηµιολογικά στοιχεία ϖου θα ϖροκύψουν και αφορούν στη γεωγραφική και εϖοχιακή κατανοµή των ϖαθογόνων, µϖορούν να οδηγήσουν στη λήψη µέτρων αντιµετώϖισης των εϖιδηµιών σε διάφορες ϖεριοχές (για ϖαράδειγµα η ταυτοϖοίηση ϖαθογόνων στελεχών ϖου ευθύνονται για µια εϖιδηµία σε ένα ϖληθυσµό µϖορεί να οδηγήσει τους ερευνητές στην ανακάλυψη εµβολίου)(muir P. et al. 1998). Η µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών ϖραγµατοϖοιείται όλο και ϖερισσότερο σε ϖαγκόσµια κλίµακα µε τη χρήση διαφόρων µοριακών τεχνικών όϖως είναι : α) Νucleotide Sequencing, β) Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis (RFLP), γ) Southern Blot Analysis, δ) Oligonoucleotide Fingerprint Analysis, ε) Reverse Hybridization, 31

43 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η στ) DNA Enzyme Immunoassay, ζ) RNase Protection Assay, η) Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis, θ) Heteroduplex Mobility Assay And Heteroduplex Tracking Assay ι) Genome Segment Length Polymorphism Analysis (Electropherotyping). Όλες οι ϖαραϖάνω τεχνικές έχουν αναϖτυχθεί τα τελευταία 20 χρόνια και έχουν αϖοδειχθεί εξαιρετικά χρήσιµες στην ϖροσϖάθεια των ερευνητών να τυϖοϖοιήσουν τους ιούς ϖου αϖοµονώνονται είτε µε καλλιεργητικές είτε µε µοριακές µεθόδους. Πολλές αϖό τις µεθόδους τυϖοϖοίησης ϖου αναφέρθηκαν µϖορούν να εφαρµοστούν µε τη χρησιµοϖοίηση αϖλών αντιδραστηρίων και οργάνων, χωρίς ιδιαίτερα υψηλό κόστος αϖό τα ϖερισσότερα εργαστήρια. Άλλες µέθοδοι και ιδιαίτερα η nucleotide sequencing analysis, βρίσκουν όλο και ϖερισσότερο ευρεία εφαρµογή σε ϖολλά ερευνητικά εργαστήρια, εξαιτίας της αϖοτελεσµατικότητάς τους στην τυϖοϖοίηση των ιών. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών βρίσκεται σε εξέλιξη και γίνεται ϖροσϖάθεια βελτίωσης των µεθόδων τυϖοϖοίησης, ώστε να είναι εύκολη η εφαρµογή τους στα ερευνητικά εργαστήρια. Eίναι ϖιθανό µια µέθοδος τυϖοϖοίησης να εµφανίζει υψηλή ικανότητα διάκρισης µεταξύ συγγενών ιικών στελεχών και µεγάλη εϖαναληψιµότητα αϖοτελεσµάτων, αλλά να είναι ϖολύϖλοκη και οικονοµικά ασύµφορη. Για το σκοϖό αυτό, ϖρέϖει στο µέλλον να δοθεί έµφαση αϖό τους ερευνητές στην αϖλοϖοίηση της µεθοδολογίας και τη µείωση του κόστους, ϖου αϖαιτούν οι διάφορες τεχνικές, ϖροκειµένου να γίνουν ϖιο ϖροσιτές. 32

44 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η 7. Μοριακή Τυϖοϖοίηση Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών Οι µοριακές τεχνικές ϖου έχουν χρησιµοϖοιηθεί αϖό τους ϖερισσότερους ερευνητές για την τυϖοϖοίηση των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών είναι : α) η Ανάλυση της Αλληλουχίας των Νουκλεοτιδίων(Nucleotide Sequencing Analysis) και β) η Ανάλυση των Νουκλεϊκών οξέων µετά αϖό εϖίδραση Ενζύµων Περιορισµού RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis). Οι ϖιο καλά µελετηµένοι ιοί είναι οι εντεροϊοί και ιδιαίτερα οι polioιοί οι οϖοίοι έχουν αϖοµονωθεί αϖό κλινικά κυρίως δείγµατα και λιγότερο αϖό ϖεριβαλλοντικά (λύµατα). Ο Divizia και οι συνεργάτες του (1999) αϖοµόνωσε polio-ιούς αϖό µη εϖεξεργασµένα λύµατα στα Τίρανα της Αλβανίας. Στη συνέχεια εφαρµόστηκε DNA sequencing. Τέλος, τα στοιχεία αϖό την ανάλυση sequencing εϖεξεργάστηκαν µε εξειδικευµένο ϖρόγραµµα σε ηλεκτρονικό υϖολογιστή και µε τη βοήθεια δενδρογράµµατος αϖεικονίστηκε η σχέση, ανάλογα µε την νουκλεοτιδική αλληλουχία, µεταξύ των στελεχών των polio-ιών ϖου αϖοµονώθηκαν. Ο Kumiko Matsuura και οι συνεργάτες του (2000) αϖοµόνωσαν αϖό λύµατα στην Ιαϖωνία στελέχη polio-ιών ϖροκειµένου να τα τυϖοϖοιήσουν. Για την τυϖοϖοίηση των στελεχών ϖου αϖοµονώθηκαν χρησιµοϖοιήθηκε η µέθοδος RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism analysis) ϖου βασίζεται στη χρήση κατάλληλων ενζύµων ϖεριορισµού τα οϖοία κόβουν το DNA σε ορισµένες θέσεις, οϖότε ϖροκύϖτουν κοµµάτια DNA τα οϖοία στη συνέχεια ηλεκτροφορούνται και ϖαρατηρούνται µε χρήση υϖεριώδους ακτινοβολίας. Ανάλογα µε τις διαφορές ϖου εµφανίζουν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των διαφόρων στελεχών, ϖροκύϖτουν διαφορετικά ϖρότυϖα ζωνών στα ηλεκτροφορήµατα βάσει των οϖοίων γίνεται η κατάταξη των 33

45 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ιικών στελεχών στον ίδιο ή σε διαφορετικό τύϖο. Στην ϖαρούσα εργασία εφαρµόστηκε εϖιϖλέον και Sequencing analysis. Τα αϖοτελέσµατα της sequencing analysis δεν ϖαρουσίασαν σηµαντικές διαφορές συγκρινόµενα µε αυτά της RFLP analysis. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των αδενοϊών αϖασχολεί όλο και ϖερισσότερο τους ερευνητές εξαιτίας της έντονης ϖαρουσίας τους σε κλινικά και ϖεριβαλλοντικά δείγµατα (λύµατα). Οι τεχνικές ϖου έχουν αναφερθεί για την τυϖοϖοίηση των αδενοϊών είναι, όϖως και στην ϖερίϖτωση των εντεροϊών, η nucleotide sequencing analysis και η RFLP analysis. H Pina και οι συνεργάτες της (1998) εξετάζοντας δείγµατα λυµάτων αϖό το αϖοχετευτικό δίκτυο της Βαρκελώνης στην Ισϖανία αϖοµόνωσαν στελέχη αδενοϊών µε σκοϖό την τυϖοϖοίησή τους. Η τυϖοϖοίηση των στελεχών ϖου αϖοµονώθηκαν ϖραγµατοϖοιήθηκε µε nucleotide sequencing analysis και τα στοιχεία εϖεξεργάστηκαν µε τη χρήση ηλεκτρονικού υϖολογιστή. Για την τυϖοϖοίηση των αδενοϊών σε κλινικά δείγµατα έχει εφαρµοστεί και η RFLP analysis δίνοντας ικανοϖοιητικά αϖοτελέσµατα (Quan-Gen Li et al. 1999). Η RFLP analysis µϖορεί να εφαρµοστεί και σε ϖεριβαλλοντικά δείγµατα για την τυϖοϖοίηση αδενοϊών. Οι ρότα ιοί είναι µια κατηγορία RNA ιών ϖου τα τελευταία χρόνια αϖασχολούν όλο και ϖερισσότερο τη ηµόσια Υγεία εξαιτίας της συνεχούς αύξησης των εϖιδηµιών οξείας γαστρεντερίτιδας ϖου ϖροκαλούν σε ϖαιδιά σε ϖαγκόσµια κλίµακα. Οι ερευνητές για το λόγο αυτό ασχολούνται όλο και ϖερισσότερο µε την τυϖοϖοίηση στελεχών των ρότα ιών ϖου αϖοµονώνονται αϖό κλινικά και ϖεριβαλλοντικά δείγµατα εφαρµόζοντας σύγχρονες µοριακές τεχνικές όϖως είναι η Nucleotide Sequencing analysis και η RFLP analysis. Οι δύο ϖαραϖάνω τεχνικές όϖως ϖροαναφέρθηκε έχουν δοκιµαστεί µε εϖιτυχία στην τυϖοϖοίηση των εντεροϊών και των αδενοϊών. Εκτός αϖό αυτές τις δύο τεχνικές, ιδιαίτερα για τους ρότα ιούς (ϖου το γονιδίωµα τους αϖοτελείται αϖό 11 τµήµατα RNA), έχει χρησιµοϖοιηθεί η µέθοδος Genome Segment Length Polymorphism Analysis (Electropherotyping). Αυτή η µέθοδος εφαρµόζεται αϖοκλειστικά 34

46 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η σε ιούς ϖου το γενετικό τους υλικό είναι κατατετµηµένο (ιός της γρίϖης και ρότα ιοί). Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στις διαφορές ϖου εµφανίζουν ως ϖρος το µέγεθος τα 11 τµήµατα RNA των διαφόρων στελεχών ρότα ιών ϖου αϖοµονώνονται. Αρχικά, το RNA των ιών αϖοµονώνεται, στη συνέχεια ηλεκτροφορείται σε gel ϖολυακρυλαµιδίου και τα ϖρότυϖα των ζωνών ϖου σχηµατίζονται συγκρίνονται. Αυτή η µέθοδος αναϖτύχθηκε αϖό τον Dolan και τους συνεργάτες του (1985) και εφαρµόστηκε για τη µοριακή τυϖοϖοίηση ρότα ιών στη Βόρεια Αφρική και τη Χιλή. Παρόλα αυτά, τα τελευταία χρόνια τείνει να εγκαταλειφθεί και έχει αντικατασταθεί αϖό τη Sequencing και RFLP analysis. Ο Dubois και οι συνεργάτες του (1997) αϖοµόνωσαν στελέχη ρότα ιών αϖό λύµατα σε ϖεριοχές της Γαλλίας.Η τυϖοϖοίηση των στελεχών ϖου αϖοµονώθηκαν έγινε µε την εφαρµογή RFLP analysis, αφού εϖιλέχθηκαν τα κατάλληλα ένζυµα ϖεριορισµού. Οι ερευνητές κατέληξαν στο συµϖέρασµα ότι η συνδυασµένη εφαρµογή RT-PCR και RFLP analysis, ϖαρέχει καινούρια στοιχεία, ϖου αφορούν στην ϖαρουσία και τυϖοϖοίηση των ρότα ιών ϖου αϖοµονώνονται αϖό ϖεριβαλλοντικά δείγµατα (λύµατα) συµβάλλοντας στη διεξαγωγή εϖιδηµι-ολογικών µελετών. Η Baggi και οι συνεργάτες της (2000) εξέτασαν δείγµατα λυµάτων αϖό βιολογικό καθαρισµό στο Λουγκάνο της Ελβετίας, για την ϖαρουσία ρότα ιών µε σκοϖό την τυϖοϖοίησή τους. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των αϖοµονωθέντων στελεχών ϖραγµατοϖοιήθηκε µε sequencing analysis. Τέλος, ο Castello και οι συνεργάτες του (2000) αϖό το Πανεϖιστήµιο Έρευνας και Τεχνολογίας στο Μϖουένος Άιρες της Αργεντινής, τυϖοϖοίησαν στελέχη ρότα ιών των οµάδων B και C ϖου αϖοµόνωσαν αϖό κόϖρανα ασθενών. Η µέθοδος ϖου χρησιµοϖοίησαν ήταν η Nucleotide Sequencing analysis. 35

47 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Εικόνα 1: Σωµατίδια Polio-ιού ( Οι εντεροϊοί ανήκουν στην οικογένεια Picornaviridae και ϖεριλαµβάνουν τους Polio-ιούς 1-2-3, τους Coxsackie-ιούς, τους Echo-ιούς A και B και τους Εντεροϊούς Έχουν µικρό µέγεθος(30nm) και αϖοτελούνται αϖό ένα καψίδιο µε εικοσάεδρο συµµετρία ϖου ϖεριέχει ένα µονόκλωνο, γραµµικό µόριο RNA µεγέθους kb. Οι εντεροϊοί µεταδίδονται ευρέως και αϖαντώνται σε ϖαγκόσµια κλίµακα. Οι άνθρωϖοι αϖοτελούν φυσικούς ξενιστές των εντεροϊών. Ο ιός µεταδίδεται µέσω της κοϖρανοστοµατικής και αναϖνευστικής οδού και ϖροκαλεί διάφορα νοσήµατα όϖως ϖαράλυση, µηνιγγίτιδα, αναϖνευστικές ϖαθήσεις και οξεία γαστρεντερίτιδα. Τα ϖαιδιά αϖοτελούν τους ϖρωταρχικούς στόχους για τους εντεροϊούς και λειτουργούν ως κύρια ϖηγή µόλυνσης. Εϖειδή ο ιός µεταδίδεται µέσω της κοϖρανοστοµατικής οδού, οι φτωχές συνθήκες υγιεινής και υϖερ- ϖληθυσµού βοηθούν στη µετάδοσή τους. Το γεγονός αυτό δικαιολογεί τον αυξηµένο αριθµό µολύνσεων σε ϖαιδιά κάτω των 15 ετών ϖου ζουν σε οικογένειες κάτω αϖό δυσµενείς κοινωνικο-οικονοµικές συνθήκες. Έχει ϖαρατηρηθεί ότι οι εντεροϊοί δείχνουν εϖοχιακή ϖροτίµηση. Οι εϖιδηµίες εµφανίζονται κυρίως τους καλοκαιρινούς και φθινοϖωρινούς µήνες ιδιαίτερα στις εύκρατες ϖεριοχές. Ορισµένοι τύϖοι εντεροϊών µϖορούν να είναι ενδηµικοί σε ένα ϖληθυσµό. Η ϖολιοµυελίτιδα εµφανίζει ϖαγκόσµια κατανοµή και οι Polio-ιοί εξαϖλώνονται ϖιο συχνά κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού και του φθινοϖώρου, ενώ οι ϖεριϖτώσεις µολύνσεων το χειµώνα είναι σϖάνιες. Οι 36

48 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ϖερισσότερες µολύνσεις µε Polio-ιούς είναι ασυµϖτωµατικές. Τρεις ανοσολογικοί τύϖοι Polio-ιών (ορότυϖοι) έχουν αναγνωριστεί (polio-ιός 1,2,3). Και οι τρεις τύϖοι εµφανίζουν ϖολλές κοινές βιολογικές και δοµικές ιδιότητες. Αϖό τους τρεις τύϖους Polio-ιών αυτός ϖου οδηγεί κυρίως στην ϖαράλυση είναι ο τύϖος 1. Η ασθένεια εµφανίζεται σε όλες τις ηλικίες, αλλά κυρίως τα ϖαιδιά είναι ϖιο ευϖαθή αϖό τους ενήλικες λόγω της εϖίκτητης ανοσίας ϖου εµφανίζει ο ενήλικος ϖληθυσµός. Σε αϖοµονωµένες ϖεριοχές, η ϖολιοµυελίτιδα ϖροσβάλλει όλες τις ηλικίες στο ίδιο ϖοσοστό. Σε µη αναϖτυγµένες χώρες, όϖου οι φτωχές συνθήκες υγιεινής ευνοούν την εξάϖλωση του ιού, η ϖολιοµυελίτιδα αϖοτελεί σοβαρή βρεφική ασθένεια και ϖαιδική λοίµωξη. Τέλος, στις αναϖτυγµένες χώρες, ϖριν τη χρήση του εµβολίου, ϖαιδιά ϖάνω αϖό την ηλικία των 5 ετών κυρίως ϖροσβάλλονταν, ενώ το 25% των µολύνσεων αφορούσε εφήβους ϖάνω αϖό 15 ετών. Η ανάγκη ευρέσεως εµβολίου είχε ως αϖοτέλεσµα οι Polio-ιοί να έχουν µελετηθεί ϖερισσότερο αϖό τους άλλους ιούς εντερικής ϖροελεύσεως (Πριν της χρήσης του εµβολίου, νέες ϖεριϖτώσεις ϖαραλυτικής ϖολιοµυελίτιδας εµφανίζονταν κάθε χρόνο). Οι ιοί Coxsackie, µια µεγάλη υϖοοµάδα των εντεροϊών, χωρίζονται σε δύο οµάδες, την Α και τη Β, ϖου εµφανίζουν διαφορετικές ϖαθογόνες ιδιότητες. Οι ιοί της οµάδας Β έχουν αναφερθεί σε όλο τον κόσµο. Η αϖοµόνωσή τους έχει γίνει κυρίως αϖό κόϖρανα ανθρώϖου, φαρυγγικά εϖιχρίσµατα, λύµατα, νερό ϖοταµών και θαλασσινό νερό. Οι Coxsackie-ιοί αϖοµονώνονται ϖιο συχνά το καλοκαίρι ή στις αρχές του φθινοϖώρου. Η µόλυνση µιας οικογένειας µε Coxsackie-ιούς έχει µεγάλη σηµασία. Αϖό τη στιγµή ϖου κάϖοιο µέλος της οικογένειας ϖροσβληθεί, συνήθως, όλα τα άτοµα θα µολυνθούν, έστω κι αν δεν εµφανίσουν όλα κλινικά συµϖτώµατα. Οι Coxsackie-ιοί µοιάζουν στις ιδιότητές τους µε τους Polio και τους Echo-ιούς. Λόγω των εϖιδηµιολογικών οµοιοτήτων τους όλοι οι εντεροϊοί εµφανίζονται µαζί στη φύση, ακόµα και στον ίδιο ξενιστή ή το ίδιο δείγµα 37

49 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η λύµατος. Οι Echo-ιοί κατατάσσονται µαζί µε τους υϖόλοιϖους εντεροϊούς γιατί ϖροσβάλλουν το γαστρεντερικό σωλήνα του ανθρώϖου. Πάνω αϖό 30 ορότυϖοι είναι γνωστοί, αλλά δεν είναι όλοι ϖαθογόνοι για τον άνθρωϖο. Οι Echo-ιοί εµφανίζουν ϖαγκόσµια κατανοµή και η εϖιδηµιολογία είναι ϖαρόµοια µε αυτή των άλλων εντεροϊών. Οι εντεροϊοί, αντίθετα µε τα εντεροβακτήρια, ϖου ανευρίσκονται συνέχεια στην ϖεϖτική οδό, δηµιουργούν µόνο ϖαροδικές µολύνσεις. Είναι ϖιθανότερο να ανιχνευθούν σε νεαρά άτοµα ϖαρά σε µεγαλύτερα. Στις εύκρατες ζώνες, οι µολύνσεις συµβαίνουν κυρίως το καλοκαίρι και το φθινόϖωρο και είναι 5 φορές ϖιο συχνές σε οικογένειες ϖου ζουν σε φτωχές συνοικίες ϖαρά σε άλλες ϖου ζουν σε ϖλούσιες, όϖου οι συνθήκες διαβίωσης είναι ϖολύ καλύτερες. Τέλος, στους εντεροϊούς κατατάσσονται και άλλοι τέσσερις τύϖοι ιών (τύϖοι 68,69,70 και 71) ϖου αναϖτύσσονται σε καλλιέργειες κυττάρων νεφρού ϖιθήκων, και 3 αϖό αυτούς (68,70 και 71) ϖροκαλούν ασθένειες στους ανθρώϖους. Ο εντεροϊός 68 αϖοµονώθηκε αϖό την αναϖνευστική οδό ϖαιδιών µε βρογχιολίτιδα ή ϖνευµονία. Ο εντεροϊός 70 είναι η κύρια αιτία της οξείας αιµορραγικής εϖιϖεφυκίτιδας και εξαϖλώνεται όϖως και οι άλλοι εντεροϊοί κάτω αϖό άσχηµες υγειονοµικές συνθήκες. Ο εντεροϊός 71 αϖοµονώθηκε αϖό ασθενείς µε µηνιγγίτιδα, εγκεφαλίτιδα και ϖαράλυση ϖου ϖροσοµοιάζει µε την ϖολιοµυελίτιδα. Είναι µια αϖό τις κύριες αιτίες των ασθενειών του Κεντρικού Νευρικού Συστήµατος, σε όλο τον κόσµο. 8.1 Εϖιδηµιολογικά στοιχεία Οι polio ιοί δε σχετίζονται µε υδατογενείς εϖιδηµίες όϖως άλλοι ιοί εντερικής ϖροέλευσης. Παρ όλα αυτά εϖειδή µεταδίδονται µέσω της κοϖρανοστοµατικής οδού, η ϖιθανότητα να ανιχνευθούν στα λύµατα ϖρέϖει να λαµβάνεται υϖόψη, ιδιαίτερα στις ϖεριοχές όϖου ανεϖαρκώς εϖεξεργασµένα λύµατα καταλήγουν σε υδάτινους αϖοδέκτες και χρησιµοϖοιούνται για οικιακούς σκοϖούς. Ο Pavlov και οι συνεργάτες του 38

50 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η το 2005 αϖοµόνωσαν κλινικά στελέχη polio ιών αϖό λύµατα και εϖιφανειακά νερά στη Νότια Αφρική. Το 2004 ο Blompvist και οι συνεργάτες του αϖοµόνωσαν κλινικά στελέχη polio ιών τύϖου 3 αϖό δείγµατα λυµάτων στην Εσθονία. Ο Yoshida και οι συνεργάτες του το 2002 αϖοµόνωσαν polio ιούς αϖό ϖεριβαλλοντικά δείγµατα και υϖοστηρίζουν ότι ο κίνδυνος έκθεσης σε αυτούς ϖου ϖεριέχονται στα λύµατα είναι υϖαρκτός όταν αυτά χρησιµοϖοιούνται για άρδευση. Οι polio ιοί ϖου ϖεριέχονται στις ανθρώϖινες εκκρίσεις αϖοτελούν κίνδυνο για τη δηµόσια υγεία όταν διοχετεύονται στο ϖεριβάλλον, καθώς είναι δυνατή η µετάδοσή τους σε ϖληθυσµούς οι οϖοίοι δεν εµβολιάζονται (Friedrich et al. 2000, Buttinelli et al. 2003). Στην Ιαϖωνία κατά την ϖερίοδο αϖοµονώθηκαν 78 στελέχη polio ιών αϖό δείγµατα λυµάτων της ϖεριοχής Τoyama. Η τυϖοϖοίηση των ιών µε τη µέθοδο RFLP ανέδειξε και τους τρεις τύϖους polio ιών (κλινικά στελέχη) (Matsuura et al. 2000). O ιός της ϖολιοµυελίτιδας ενδηµεί στην ϖεριοχή τους Ισραήλ και της Παλαιστίνης. Για τον σκοϖό αυτό εφαρµόζεται αϖό το 1988 εντατικό ϖρόγραµµα εµβολιασµού. Ο Schulman και οι συνεργάτες του το 2000 αϖοµόνωσαν polio ιό τύϖου 1 αϖό δείγµατα λυµάτων στο Ισραήλ. Ο Manor και οι συνεργάτες του εξετάζοντας δείγµατα λυµάτων στην ίδια ϖεριοχή αϖοµόνωσαν polio ιούς τύϖου 1 (άγρια και κλινικά στελέχη). Τέλος, το 1996 στην Αλβανία σηµειώθηκε σοβαρή εϖιδηµία ϖολιοµυελίτιδας κατά την οϖοία 140 άτοµα ασθένησαν και το 12% αϖεβίωσε. Κατά τη διάρκεια της εϖιδηµίας εξετάστηκαν δείγµατα νερού αϖό τον ϖοταµό Lana στα Τίρανα για την ϖαρουσία polio ιών. Με την εφαρµογή της RT-PCR και την τυϖοϖοίηση µε Sequencing ανάλυση ανιχνεύθηκε polio ιός τύϖου 1 (Divizia et al. 1999). Εκτός αϖό τους polio ιούς στα λύµατα έχουν ανιχνευθεί και άλλοι τύϖοι εντεροϊών. Ο Ehler και οι συνεργάτες του το 2005 αϖοµόνωσαν εντεροϊούς αϖό δείγµατα λυµάτων και ϖόσιµου νερού αϖό ϖεριοχές της Νοτίου Αφρικής κατά την ϖερίοδο Ιούλιος 2000 Ιούνιος Οι ιοί 39

51 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η τυϖοϖοιήθηκαν και ανιχνεύτηκαν coxsakie B, coxsakie A και echo ιοί. Σε µεγαλύτερο ϖοσοστό βρέθηκε ιός coxsakie Β5 (22,7%). Στην Ισϖανία κατά την ϖερίοδο Ιούνιος 2001-Αύγουστος 2003 εξετάστηκαν δείγµατα λυµάτων αϖό βιολογικούς καθαρισµούς της Βαρκελώνης. Με την εφαρµογή RT nested PCR αϖοµονώθηκαν εντεροϊοί, οι οϖοίοι στην συνέχεια τυϖοϖοιήθηκαν µε Sequencing ανάλυση και ταυτοϖοιήθηκε echo ιός 14. Ο Grabow και οι συνεργάτες του το 2004 εξέτασαν 172 δείγµατα ϖόσιµου νερού για την ανίχνευση και την ταυτοϖοίηση εντεροϊών. Η µελέτη ϖραγµατοϖοιήθηκε στη Νότια Αφρική και τα δείγµατα συλλέχθηκαν αϖό δύο σταθµούς εϖεξεργασίας νερού. Σύµφωνα µε τα αϖοτελέσµατα ανιχνεύθηκαν εντεροϊοί coxsakie Β σε ϖοσοστό 88% (τύϖοι Β3 και Β5) και polio ιοί σε ϖοσοσό 12% (τύϖου 1 κλινικό στέλεχος). Οι Coxsakie ιοί σύµφωνα µε ϖρογενέστερα στοιχεία αϖοτελούν σηµαντικό αιτιολογικό ϖαράγοντα για την ϖρόκληση υδατογενών εϖιδηµιών (Griffin et al. 2003). Ο Seung-Hoon Lee (2002) και οι συνεργάτες του εξετάζοντας δείγµατα ϖόσιµου νερού αϖό αστικές ϖεριοχές στην Κορέα αϖοµόνωσαν polio ιούς τύϖου 1, Coxsakie Β και echo 6. Ο Donalson και οι συνεργάτες του το 2001 εξετάζοντας εϖιφανειακά νερά στη Φλόριδα των Η.Π.Α. ανίχνευσαν διάφορους τύϖους εντεροϊών (coxsakie Α9, coxsakie Α16 και polio 1). Σε µια µελέτη ϖου έλαβε χώρα στο Πουέρτο Ρίκο εξετάστηκαν δέγµατα εϖεξεργασµένων και µη εϖεξεργασµένων λυµάτων, στα οϖοία ανιχνεύτηκαν coxsakie ιοί Β5 (Dahling et al. 1989). Στην Ελλάδα (Αθήνα) κατά την ϖερίοδο ϖραγµατοϖοιήθηκε µελέτη στην οϖοία ελέγχθησαν δείγµατα λυµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών µε τη χρησιµοϖοίηση καλλιεργητικών τεχνικών. Σύµφωνα µε τα αϖοτελέσµατα ανιχνεύτηκαν coxsakie ιοί τύϖου Β2, Β4 και Β5 (Krikelis et al. 1985, Krikelis et al. 1986). Τέλος, κατά το έτος 2001 στην Ελλάδα σηµειώθηκαν ϖεριστατικά µηνιγγίτιδας. Αναλύθηκαν κλινικά δείγµατα αϖό ασθενείς και ανιχνεύτηκαν ιοί echo 6, coxsakie Β, echo 13, polio 1 και echo 30 (Siafacas et al. 2004). 40

52 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Εικόνα 2 : Αδενοϊός Ανθρώϖινης Προέλευσης ( Εκτός αϖό τους εντεροϊούς, στα λύµατα τα τελευταία χρόνια έχουν αϖοµονωθεί και άλλοι ιοί εντερικής ϖροέλευσης όϖως για ϖαράδειγµα οι Αδενοϊοί. Οι αδενοϊοί είναι οι µόνοι ιοί εντερικής ϖροέλευσης ϖου ϖεριέχουν DNA και είναι εξαιρετικά ϖαθογόνοι για τον άνθρωϖο. Ο αριθµός των αδενοιών στα λύµατα φαίνεται µε βάση ϖρόσφατα στατιστικά στοιχεία ϖως είναι µεγαλύτερος σε σχέση µε αυτό των εντεροϊών, αν και ο ρόλος τους στην ϖρόκληση γαστρεντερίτιδας είχε υϖοτιµηθεί εξαιτίας της δύσκολης αϖοµόνωσής τους αϖό τα ϖεριβαλλοντικά δείγµατα. Πάντως, σήµερα οι Adeno-ιοί αϖοτελούν µετά τους Rota-ιούς την κυριότερη αιτία οξείας γαστρεντερίτιδας ϖου εµφανίζεται στα ϖαιδιά (Jiang, 2001). Οι αδενοϊοί αϖοµονώθηκαν για ϖρώτη φορά το 1953 και αϖό τότε έχουν αναγνωριστεί ϖερίϖου 100 ορότυϖοι, αϖό τους οϖοίους οι 49 µολύνουν τον άνθρωϖο. Οι 49 αυτοί ορότυϖοι ταξινοµούνται σε 6 υϖοοµάδες (A,B,C,D,E,F), ανάλογα µε την οµολογία ϖου εµφανίζει το DNA τους. Οι αδενοϊοί είναι ιοί µεσαίου µεγέθους και το καψίδιό τους έχει διάµετρο 60-90nm. Περιέχουν δίκλωνο, γραµµικό DNA (30-42kbp), ϖου κωδικοϖοιεί γονίδια και έχει µοριακό βάρος 20-25Χ10 6 daltons. Οι αδενοϊοί έχουν ταξινοµηθεί στην οικογένεια Adenoviridae ϖου ϖεριλαµβάνει δύο γένη, το Mastadenovirus (ϖροσβάλλουν τα θηλαστικά και τον άνθρωϖο) και το Aviadenovirus (Philipson, 1975 & Wong,2002). 41

53 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Οι αδενοϊοί είναι άφθονοι στη φύση, µολύνοντας ϖτηνά, ϖολλά θηλαστικά και τον άνθρωϖο σε ϖαγκόσµια κλίµακα, χωρίς να εµφανίζουν εϖοχιακή κατανοµή. Παρόλο ϖου τα εϖιδηµιολογικά τους χαρακτηριστικά ϖοικίλουν ανάλογα µε τον τύϖο του ιού, οι αδενοϊοί µεταδίδονται µέσω της κοϖρανοστοµατικής οδού, µέσω των χεριών, των ιατρικών εργαλείων και των ϖροσοψίων. Ορισµένοι τύϖοι αδενοϊών ϖροκαλούν χρόνιες, ασυµ- ϖτωµατικές ασθένειες του αναϖνευστικού και του γαστρεντερικού συστήµατος, ενώ άλλοι (τύϖοι 1,2,5 και 6) είναι ενδηµικοί σε διάφορες ϖεριοχές του κόσµου και ευθύνονται για το 5-10%των αναϖνευστικών ϖαιδιατρικών ϖαθήσεων. Εϖιϖλέον, µερικοί τύϖοι αδενοϊών (8,19 και 37) ϖροκαλούν σϖοραδικές εϖιδηµίες ϖου σχετίζονται µε τους οφθαλµούς. Οι αδενοϊοί 4 και 7 ϖροσβάλλουν κυρίως άτοµα σε µεγάλες στρατιωτικές µονάδες ή κατασκηνώσεις (για αυτούς τους δύο τύϖους είναι διαθέσιµο εµβόλιο για στρατιωτική χρήση). Ιδιαίτερα σηµαντικοί είναι οι αδενοϊοί της υϖοοµάδας F (τύϖοι 40 και 41) ϖου ενοχοϖοιούνται συχνά για την ϖρόκληση οξείας γαστρεντερίτιδας στα ϖαιδιά (Enriquez, 1995, Crabtree, 1997 & Harley,2001). 9.1 Αδενοϊοί Υϖοοµάδας F : Τύϖοι 40 και 41 Αϖοτελούν τη δεύτερη σηµαντικότερη αιτία ϖρόκλησης γαστρεντερίτιδας σε ϖαιδιά κάτω των 5 ετών µετά τους ρότα ιούς. Μεταδίδονται µέσω της κοϖρανοστοµατικής οδού, η ϖερίοδος εϖώασής τους κυµαίνεται αϖό 8-10 µέρες, και η διάρροια ϖου ϖροκαλούν διαρκεί αϖό 5 µέχρι και 12 µέρες, ϖερισσότερο αϖό οϖοιαδήϖοτε άλλη ϖερίϖτωση γαστρεντερίτιδας οφειλόµενης σε ιούς. Οι τύϖοι 40 και 41 δεν καλλιεργούνται όϖως άλλοι αδενοϊοί σε συνηθισµένες κυτταρικές σειρές, οϖότε καθίσταται αναγκαία η εφαρµογή µοριακών τεχνικών ϖροκειµένου να αϖοµονωθούν και να ταυτοϖοιηθούν τόσο στα κλινικά όσο και τα ϖεριβαλλοντικά δείγµατα. Τα τελευταία χρόνια έχουν ϖαρατηρηθεί αντιγονικές αλλαγές µεταξύ στελεχών των ϖαραϖάνω τύϖων γεγονός ϖου έχει οδηγήσει τους ερευνητές στη διεξαγωγή ϖληθώρας εϖιδηµιολογικών ερευνών µε σκοϖό τη µελέτη 42

54 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η των γενετικών µεταλλάξεων ϖου έχουν ϖροκύψει στα διάφορα στελέχη ϖου αϖοµονώνονται κυρίως αϖό κόϖρανα ασθενών (Zlateva K. T. et al., 2005). Σκοϖός των ϖαραϖάνω ερευνών είναι να τεθούν υϖό έλεγχο οι ϖεριϖτώσεις γαστρεντερίτιδας ϖου οφείλονται στους αδενοϊούς 40 και 41 και να ϖαρασκευαστεί εµβόλιο, ώστε να ϖρολαµβάνονται εϖιδηµίες ϖου σε ϖολλές ϖεριϖτώσεις είναι θανατηφόρες (Yolken et al. 1985). 9.2 Εϖιδηµιολογικά στοιχεία Οι αδενοϊοί έχουν ανιχνευθεί σε µη εϖεξεργασµένα κι εϖεξεργασµένα λύµατα, στα ϖόσιµα κι εϖιφανειακά ύδατα σε ϖολλές ϖεριοχές κι ευθύνονται για ϖολλές υδατογενείς εϖιδηµίες σε όλο τον κόσµο. Ιδιαίτερα οι αδενοϊοί F τύϖοι 40 και 41 αϖασχολούν όλο και ϖερισσότερο τη δηµόσια υγεία, καθώς αϖοτελούν σηµαντικό αιτιολογικό ϖαράγοντα ϖρόκλησης οξείας γαστρεντερίτιδας στα ϖαιδιά µετά τους Ρότα ιούς (Crabtree et al. 1997). Ο Heerden και οι συνεργάτες του (2005) εξέτασαν δείγµατα ϖόσιµου κι εϖιφανειακού νερού στη Νότια Αφρική κατά την ϖερίοδο αϖο τον Ιούνιο 2002 έως τον Ιούλιο Οι αδενοϊοί αϖοµονώθηκαν σε ϖοσοστό 5,32% όσον αφορά στο ϖόσιµο νερό και 22,22% στα εϖιφανειακά νερά. Ακολούθησε τυϖοϖοίηση των ιών και βρέθηκαν αδενοϊοί τύϖων 40 και 41 (εντερική ϖροέλευση) σε ϖοσοστό 70% και τύϖου 2. Στη Βαρκελώνη κατά την ϖερίοδο ελέγχθηκαν δείγµατα λυµάτων και αϖοµονώθηκαν αδενοϊοί εντερικής ϖροέλευσης τύϖων 40 και 41 (Formiga-Cruz et al. 2005). Εϖίσης, ο Karamoko και οι συνεργάτες του (2005) αϖοµόνωσαν αδενοϊούς εντερικής ϖροέλευσης σε δείγµατα ανεϖεξέργαστων λυµάτων και οστρακοειδών στο Μαρόκο µε την εφαρµογή µοριακών τεχνικών. Μια άλλη σηµαντική µελέτη όσον αφορά στην ταυτοϖοίηση αδενοϊών στα λύµατα αστικών ϖεριοχών ϖραγµατοϖοιήθηκε στο Σάο Πάολο στη Βραζιλία το Συνολικά αναλύθηκαν 95 δείγµατα λυµάτων, στα οϖοία αϖοµονώθηκαν αδενοϊοί σε ϖοσοστό 72,6%. Η τυϖοϖοίηση των αδενοϊών ϖραγµατοϖοιήθηκε µε 43

55 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η RFLP ανάλυση και είχε ως αϖοτέλεσµα την ανίχνευση αδενοϊών εντερικής ϖροέλευσης τύϖου 41 (62,9%) και τύϖου 40 (25,9%). Στην εν λόγω εργασία οι αδενοϊοί δεν εµφάνισαν εϖοχιακή κατανοµή (Santos et al. 2004). Ο Jiang και οι συνεργάτες του το 2004 στη Βόρεια Καλιφόρνια των Η.Π.Α. αϖοµόνωσαν αδενοϊούς στο 50% των δειγµάτων εϖιφανειακού νερού ϖου ελέγχθησαν. Στην ίδια µελέτη αϖοµονώθηκαν εντεροϊοί και ο ιός της Ηϖατίτιδας Α σε ϖοσοστά ϖολύ υψηλότερα αϖο αυτό των αδενοϊών, γεγονός ϖου ϖροκαλεί αίσθηση καθώς στις ϖερισσότερες Ευρωϖαϊκές χώρες οι αδενοϊοί αϖοµoνώνονται συχνότερα αϖό τις άλλες κατηγορίες ιών εντερικής ϖροέλευσης (Pina et al. 1998). Στη Νότια Αφρική οι αδενοϊοί αϖασχολούν τη ηµόσια Υγεία καθώς ενοχοϖοιούνται σε ϖολλές ϖεριϖτώσεις υδατογενών λοιµώξεων. Η Heerden και οι συνεργάτες της το 2003 εξέτασαν δείγµατα µη εϖεξεργασµένου κι εϖεξεργασµένου νερού και αϖοµόνωσαν αδενοϊούς σε ϖοσοστά 12,75% και 4,41% αντίστοιχα. Τα αϖοτελέσµατα αυτά συγκρινόµενα µε άλλες µελέτες αϖοδεικνύουν ϖως οι αδενοϊοί ανιχνεύονται σε µεγαλύτερο ϖοσοστό σε σύγκριση µε τους ενετεροϊούς σε δείγµατα ϖόσιµου νερού, λυµάτων, εϖιφανειακών και θαλασσίων υδάτων (Puig et al. 1994, Grabow et al. 2001). Όσον αφορά στην εϖοχιακή κατανοµή των αδενοϊών στην ϖαρούσα µελέτη δεν ϖαρατηρήθηκε σηµαντική διακύµανση στην αϖοµόνωσή τους. Στην Ελλάδα στην ϖεριοχή της Θεσσαλονίκης κατά την ϖερίοδο ϖραγµατοϖοιήθηκε εϖιδηµιολογική µελέτη σχετικά µε τους αδενοϊούς ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό κλινικά δείγµατα ασθενών. Οι ιοί τυϖοϖοιήθηκαν µε Sequencing ανάλυση και ανιχνεύθηκαν οι τύϖοι Ad 8, Ad 3, Ad 2 και Ad 4. Η ϖαραϖάνω µελέτη αν και δεν αφορά ϖεριβαλλοντικά δείγµατα είναι σηµαντική γιατί συµβάλλει στη συλλογή εϖιδηµιολογικών στοιχείων για τη χώρα µας (Frantzidou et al. 2005). 44

56 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η Εικόνα 3: Σωµατίδια Ρότα ιών (Dr Guatelli, 2005) Μια τρίτη οµάδα ιών εντερικής ϖροέλευσης ϖου αϖασχολεί όλο και ϖερισσότερο τη ηµόσια Υγεία είναι οι Rota-ιοί ϖου αϖοτελούν την κύρια αιτία οξείας γαστρεντερίτιδας ϖου εµφανίζεται κυρίως στα βρέφη και τα ϖαιδιά µικρής ηλικίας. Στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής κάθε χρόνο αναφέρονται κατά µέσο όρο 50 ϖεριϖτώσεις θανάτων ϖαιδιών αϖό γαστρεντερίτιδα οφειλόµενη στους ρότα ιούς, ενώ το κόστος νοσηλείας ασθενών ξεϖερνά τα 352 εκατοµµύρια δολάρια. Εϖιϖλέον, στις ανα- ϖτυσσόµενες χώρες οι ϖεριϖτώσεις οξείας γαστρεντερίτιδας ϖου οδηγούν στο θάνατο ξεϖερνούν το 1 εκατοµµύριο. Κάθε χρόνο αναφέρονται σε ϖαγκόσµια κλίµακα 140 εκατοµµύρια ϖεριϖτώσεις γαστρεντερίτιδας αϖό ρότα ιούς αϖό τις οϖοίες ϖερίϖου καταλήγουν στο θάνατο (Parashar et al. 2003). Οι Rota-ιοί αϖοµονώθηκαν για ϖρώτη φορά αϖό τα κόϖρανα ζώων το 1971 και το 1973 αϖό κόϖρανα ανθρώϖων (Parashar U.D. et al & Anderson et al. 2004). Ανήκουν στην οικογένεια Reoviridae. Το γονιδίωµά τους αϖοτελείται αϖό 11 δίκλωνα τµήµατα RNA και ϖεριβάλλεται αϖό ϖρωτεϊνικό καψίδιο διαµέτρου 70nm. To καψίδιο των ρότα ιών ϖεριλαµβάνει τρεις στιβάδες ϖρωτεϊνικής σύστασης: την εξωτερική (ϖρωτεΐνες VP4 και VP7), την εσωτερική (ϖρωτεΐνη VP6) και την ϖυρηνική (ϖρωτεΐνη VP2). Έχουν αναγνωριστεί 6 οµάδες ρότα ιών µε διαφορετικές αντιγονικές 45

57 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ιδιότητες αϖό τις οϖοίες οι τρεις (A, B και C) ϖροσβάλλουν τον άνθρωϖο (Gerba C.P et al. 1996). Οι ρότα ιοί ϖροκαλούν γαστρεντερίτιδα ήϖια και οξεία µε συµϖτώµατα όϖως εµετό, διάρροια και χαµηλό ϖυρετό. Στις ϖεριϖτώσεις οξείας γαστρεντερίτιδας, όταν δε χορηγηθούν υγρά και ηλεκτρολύτες, ο ασθενής οδηγείται στο θάνατο εξαιτίας της ακατάσχετης διάρροιας. Οι ρότα ιοί ϖροσβάλουν άτοµα κάθε ηλικίας, αλλά µεγαλύτερη ευαισθησία εµφανίζουν τα ϖαιδιά ηλικίας 6 µηνών έως και 2 ετών, τα ϖρόωρα βρέφη, οι ηλικιωµένοι και οι ανοσοκατασταλµένοι ασθενείς. Οι ρότα ιοί µεταδίδονται µέσω της κοϖρανοστοµατικής οδού και κατά τη διάρκεια της νόσου αϖοβάλλονται µεγάλες ϖοσότητες στα κόϖρανα των ασθενών ( ιικά σωµατίδια/ml κοϖράνων). Οι ρότα ιοί εξαϖλώνονται ευκολότερα σε ϖεριοχές µε µεγάλο ϖληθυσµό και φτωχές συνθήκες υγιεινής. Οι ρότα ιοί της οµάδας Α αϖοτελούν τη µεγαλύτερη και την ϖιο καλά µελετηµένη οµάδα των ρότα ιών. Οι Α ρότα ιοί κατατάσσονται σε 14 τύϖους, ϖου ονοµάζονται G ανάλογα µε τις µεταλλάξεις της ϖρωτεΐνης VP7 και σε 20 τύϖους, ϖου ονοµάζονται P εξαιτίας γενετικών αλλαγών της ϖρωτεΐνης VP4. Στον άνθρωϖο έχουν ανιχνευθεί 10 G και 9 P τύϖοι Α ρότα ιών ( Narayan 2004). Οι ρότα ιοί Α εµφανίζουν διασϖορά σε ϖαγκόσµια κλίµακα. Αϖοτελούν την κύρια αιτία οξείας γαστρεντερίτιδας βρεφών και ϖαιδιών. Κάθε χρόνο στις H.Π.Α αναφέρονται ϖάνω αϖό 3 εκατοµµύρια ϖερι- ϖτώσεις γαστρεντερίτιδας, σε ϖαιδιά, οφειλόµενης στους ρότα Α. Στις εύκρατες ϖεριοχές, οι ϖερισσότερες ϖεριϖτώσεις µόλυνσης αϖό ρότα ιούς Α ϖαρατηρούνται το χειµώνα, ενώ στις τροϖικές όλο το χρόνο. Οι ρότα ιοί της οµάδας Β αναγνωρίστηκαν για ϖρώτη φορά το Σε αντίθεση µε τους ρότα Α ιούς ευθύνονται για την οξεία γαστρεντερίτιδα ϖου εµφανίζεται στα ενήλικα άτοµα. Οι ρότα ιοί Β είναι ενδηµικοί στην Κίνα και την Ινδία (Tao et al. 1984). Τέλος, οι ρότα ιοί της οµάδας C αναγνωρίστηκαν τα τελευταία χρόνια 46

58 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η και ευθύνονται όϖως και οι Α ρότα ιοί για σϖοραδικές εϖιδηµίες οξείας γαστρεντερίτιδας σε ϖαιδιά διαφόρων ϖεριοχών. Τα ϖρώτα κρούσµατα γαστρεντερίτιδας αϖό C ρότα ιούς αναφέρθηκαν στην Ιαϖωνία (1989) και την Αγγλία (1990) (Jiang et al. 1995) Εϖιδηµιολογικά στοιχεία Κάθε χρόνο σε ϖαγκόσµια κλίµακα ϖαρατηρούνται ϖερισσότερα αϖό 130 εκατοµµύρια κρούσµατα οξείας γαστρεντερίτιδας σε ϖαιδιά κάτω των 5 ετών και θάνατοι ϖου οφείλονται στους ρότα ιούς. Η ϖλειοψηφία των εϖιδηµιών αφορά κυρίως τιυς αναϖτυσσόµενες χώρες στην Αφρική, την Ασία και τη Λατινική Αµερική (Unicomb et al. 1997, Culniffe et al. 1998, Carna et al. 1999, Zarnani et al. 2004). Οι ϖροσϖάθειες για την ϖαρασκευή εµβολίου έναντι των ρότα ιών της οµάδας Α, ϖου ϖροκαλούν γαστρεντερίτιδα στα βρέφη ξεκινούν το Μελέτες έδειξαν ότι ο εµβολιασµός των ϖαιδιών µείωσε τα ϖεριστατικά γαστρεντερίτιδας σε ϖοσοστό ϖου κυµαίνεται αϖό 69% έως 91%. Το εµβόλιο αυτό ϖαρείχε ϖροστασία για τους τύϖους G1, G2, G3 και G4 των ρότα ιών Α, έχει όµως αϖοσυρθεί γιατί υϖάρχει αυξηµένη ϖιθανότητα εϖανεµφάνισης της ασθένειας µετά τον εµβολιασµό (Wilhelmi et al. 2003). Προκειµένου να ϖαασκευαστούν νέα εµβόλια το ενδιαφέρον των ερευνών εστιάζεται στη µοριακή τυϖοϖοίηση των ρότα ιών ϖου αϖοµονώνονται αϖό ϖεριβαλλοντικά (λύµατα, ϖόσιµο νερό, εϖιφανειακά ύδατα) και κλινικά δείγµατα (κόϖρανα ασθενών). Εϖιδηµιολογικές µελέτες σχετικά µε τους ρότα ιούς σε χώρες της Ασίας (Μϖαγλαντές, Κίνα, Ισϖανία, Ινδία, Κορέα) αναφέρουν ότι ο ϖιο συχνά ευρισκόµενος ττύϖος ρότα ιών Α είναι ο G1 ακολουθούµενος αϖό τους G2 και G4. Αϖό το 1999 κι έϖειτα ϖαρατηρούνται αυξηµένες αϖοµονώσεις ρότα ιών Α τύϖου G9, ο οϖοίος αϖοµονώθηκε για ϖρώτη φορά στις Η.Π.Α. το 1983 (Negishi et al. 2004). Η Villena και οι συνεργάτες της το 2003 εξέτασαν δείγµατα 47

59 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η εϖεξεργασµένων λυµάτων στο Κάιρο (Αίγυϖτος) και τη Βαρκελώνη (Ισϖανία). Οι ιοί τυϖοϖοιήθηκαν και σε µεγάλα ϖοσοστά και στις δύο ϖεριοχές ανιχνεύθηκε ο τύϖος G1 ενώ σε µικρότερα ϖοσοστά βρέθηκαν οι τύϖοι G3, G9, G2, G4 και G5. Εϖίσης, στη Γερµανία µετά αϖό έλεγχο ανεϖεξέργαστων λυµάτων αϖοµονώθηκαν ρότα ιοί Α τύϖων G1, G2 και G9 (Puschi et al. 2005). Ρότα ιοί οµάδας Α αϖοµονώθηκαν και αϖό δείγµατα λυµάτων αϖό τους Baggi και Peluzzi (2000) στην Ελβετία. Οι αϖοµονωθέντες ιοί τυϖοϖοιήθηκαν µε Sequencing ανάλυση και βρέθηκε αϖοκλειστικά ο τύϖος G1. Στην εν λόγω µελέτη διαϖιστώθηκε ότι το µεγαλύτερο ϖοσοστό των θετικών δειγµάτων ϖαρατηρήθηκε κατά τους χειµερινούς µήνες του έτους. Ο Gratacap-Cavallier και οι συνεργάτες του το 2000 αϖοµόνωσαν ρότα ιούς αϖό δείγµατα ϖόσιµου νερού στη Γαλλία. Τα δείγµατα συλλέγχθηκαν αϖό τις κατοικίες ϖαιδιών ϖου εισήχθησαν στο νοσοκοµείο µε συµϖτώµατα οξείας γαστρεντερίτιδας. Εφαρµόζοντας Sequencing ανάλυση ανιχνεύθηκαν οι τύϖοι G1 και G4 ρότα ιών της οµάδας Α. Τέλος, ο Bosch και οι συνεργάτες του το 1995 τυϖοϖοίησαν ρότα ιούς σε δείγµατα λυµάτων της Βαρκελώνης, όϖου ανιχνεύτηκαν οι τύϖοι G1, G2 και G3 της οµάδας Α. Όϖως έχει ήδη αναφερθεί οι ρότα ιοί αϖοµονώνονται συχνά αϖό κόϖρανα ασθενών ϖου νοσηλεύονται µε οξεία γαστρεντερίτιδα σε ϖολλές χώρες ϖαγκοσµίως. Στον ϖαρακάτω ϖίνακα αναφέρονται συνοϖτικά εϖιδηµίες γαστρεντερίτιδας αϖό ρότα ιούς σε διάφορες χώρες καθώς και τύϖοι ϖου βρέθηκαν στα κόϖρανα των ασθενών ϖου εξετάστηκαν. 48

60 Ε Ι Σ Α Γ Ω Γ Η ΠΙΝΑΚΑΣ 6 : Συνοϖτική ϖαρουσίαση εϖιδηµιών γαστρεντερίτιδας αϖό ρότα ιούς (ταυτοϖοιηµένα στελέχη αϖό κλινικά δείγµατα). Χρονολογία Χώρα Τύϖος ρότα ιού Βιβλιογραφία 2005 Τουρκία Οµάδα Α: G1, G2, Cataloluk et al. G3, G4, G Νότια Αφρική Οµάδα Α: G1, G2 Page et al Ισϖανία Οµάδα Α: G1, G2, G3, G4, G9 Sanchez-Fauquier et al Ινδία Οµάδα Α: G3 Kelkar et al Ντιτρόιτ - ΗΠΑ Οµάδα Α: G1, G2, G4, G9 Abdel Haq et al Βραζιλία Οµάδα Α: G1, G2, Santos et al. G3, G4, G Αυστραλία Οµάδα Α: G1, G2, Kirkwood et al. G3, G4, G Τουρκία Οµάδα Α: G1, G2, Kurugol et al. G3, G Αφρική Οµάδα Α: G1, G3, Steele et al. G Αλβανία Οµάδα Α: G3, G9 Villena et al Παραγουάη Οµάδα Α: G1, G2, Coluchi et al. G4, G Ινδία Οµάδα Α: G1, G2, Das et al. G Γαλλία Οµάδα Α: G1, G2, Chikhi-Brachet al. G Αυστραλία Οµάδα Α: G6, G8 Cooney et al Μαλάουι Οµάδα Α: G1, G3, Cunliffe et al. G4, G8, G Μεγάλη Βρετανία Οµάδα Α: G1, G2, G3, G4 Iturriza- Gomara et al Αργεντινή Οµάδα Α: G1, G2, Arguelles et al. G3, G Ισϖανία Οµάδα Α: G1, G4 Gilla et al. 49

61 ΣΚΟΠΟΣ

62 ΣΚΟΠΟΣ Οι ιοί εντερικής ϖροέλευσης ϖου ϖεριέχονται στις ανθρώϖινες εκκρίσεις ακολουθούν διάφορες ϖορείες στο ϖεριβάλλον. Όταν µεγάλη ϖοσότητα µολυσµένων λυµάτων µε εντερικούς µικροοργανισµούς αναµιγνύεται µε νερό ϖου στη συνέχεια, είτε χωρίς εϖεξεργασία καταλήγει στη θάλασσα, είτε είναι ανεϖαρκώς εϖεξεργασµένο και χρησιµοϖοιείται για άρδευση ή ϖόση, τότε είναι ϖολύ ϖιθανό να ϖροκληθεί υδατογενής εϖιδηµία. Η ϖαρουσία των ιών στα µη εϖεξεργασµένα λύµατα εϖιβάλλει την εφαρµογή κατάλληλης εϖεξεργασίας τους η οϖοία ϖραγµατοϖοιείται σε µονάδες βιολογικού καθαρισµού, ώστε να είναι δυνατή η εϖαναχρησιµοϖοίησή τους χωρίς δυσάρεστες συνέϖειες για τη ηµόσια Υγεία. Η ανίχνευση των ιών αϖό τα δείγµατα λυµάτων ϖραγµατοϖοιείται µε την εφαρµογή µοριακών τεχνικών οι οϖοίες είναι ευαίσθητες, ακριβείς και δίνουν γρήγορα αϖοτελέσµατα γεγονός ϖολύ σηµαντικό θέλουµε να ανιχνεύσουµε τον αιτιολογικό ϖαράγοντα ϖρόκλησης µιας υδατογενούς εϖιδηµίας. Τα τελευταία χρόνια ϖροκείµενου να συλλέξουµε εϖιδηµιολογικά στοιχεία ϖου αφορούν στην ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης σε µια ϖεριοχή και να τα συσχετίσουµε µε ϖεριστατικά γαστρεντερίτιδας ϖου ϖαρατηρούνται µας ενδιαφέρει η τυϖοϖοίηση των ιών ϖου αϖοµονώνονται τόσο σε κλινικά όσο και σε ϖεριβαλλοντικά δείγµατα. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών εξασφαλίζει τη συλλογή σηµαντικών εϖιδηµιολογικών στοιχείων τα οϖοία µϖορούν να αξιοϖοιηθούν µε σκοϖό την ϖροαγωγή της ηµόσιας Υγείας. Σκοϖός της µελέτης 1. Η ανίχνευση των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών αϖό τα δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων ϖου συλλέξαµε αϖό µονάδες βιολογικού καθαρισµού των ϖεριοχών της Αττικής και της Αχαΐας. 2. Η ανάϖτυξη και η εφαρµογή µοριακής µεθόδου για την ανίχνευση των ρότα ιών αϖό τα δείγµατα των λυµάτων. 3. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών ϖου ανιχνεύθηκαν στα δείγµατα των λυµάτων. 4. Σύγκριση των αϖοτελεσµάτων ϖου ϖροέκυψαν µεταξύ των δύο ϖεριοχών δειγµατοληψίας (Αττική-Αχαΐα). 51

63

64 ΥΛΙΚΑ

65

66 ΥΛΙΚΑ ΧΗΜΙΚΑ Αγαρόζη Seakem GTG (FMC Lab) Αιθανόλη (Merck) Αιθυλενοδιαµινοτετροξικό οξύ συν.εdτα (Sigma) Ακετόνη (Merck) Βρωµιούχο αιθίδιο συν. EtBr (Sigma) Γλυκίνη (Sigma) ιαιθυλοϖυρανθρακικό Η 2Ο συν. DEPC- Η 2Ο (Sigma) ιθειοθρεϊτόλη συν. DTT (Sigma) ιµεθυλοσουλφοξείδιο συν.dmso (Sigma) ισκία αλατούχου ρυθµιστικού διαλ/τος φωσφορικών συν.ρβs (Gibco) Ισοθειοκυανική Γουανίνη συν.guscn (Sigma) Σωµατίδια Αργιλίου (Sigma) TritonΧ-100 (Merck) φχ 174 x ΗaeΙΙΙ µοριακός δείκτης DNA (Promega) Χλωριούχο Νάτριο (Merck) Χλωριούχο Κάλλιο (Merck) ΕΝΖΥΜΑ Taq Πολυµεράση Dynazyme (Finnzymes) Αναστολέας RNAάσης (Promega) Αντίστροφη µεταγραφάση ΑΜV (Promega) Εκκινητές (Minotech) Ρυθµιστικό διάλυµα Taq ϖολυµεράσης (Finnzymes) Ρυθµιστικό διάλυµα αντίστροφης µεταγραφάσης (Promega) 54

67 ΥΛΙΚΑ ΙΑΛΥΜΑΤΑ Ρυθµιστικό διάλυµα Γλυκίνης 0.25 Μ, ph 9,5 Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο για 15 λεϖτά στους 121 O C, 1 ατµόσφαιρα. ΡΒS ph ιάλυση µίας ταµϖλέτας ΡΒS σε 500 ml ddη 2Ο. Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο για 15 λεϖτά στους 121 O C, 1 ατµόσφαιρα. ιαλύµατα για τη ρύθµιση του ph HCl 5N, 1N NaOH 5N, 1N Ρυθµιστικό διάλυµα λύσης των ιών: ιάλυση 120g GUSCN σε 100ml αϖό 0.1 Μ Τris-ΗCl (ph 6.4). Προσθήκη 22 ml 0.2 Μ διαλύµατος ΕDΤΑ (pη 8.0) και τέλος ϖροσθήκη 2.6 g Τriton Χ-100. Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο για 15 λεϖτά στους 121 O C, 1 ατµόσφαιρα. Ρυθµιστικό διάλυµα έκλουσης ιών: ιάλυση 24 g GUSCN σε 20 ml 0.1 Μ Τris-ΗCl. Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο για 15 λεϖτά στους 121 O C, 1 ατµόσφαιρα. ιάλυµα σωµατιδίων αργιλίου: ιάλυση 60 g σωµατιδίων αργιλίου σε 500 ml αϖοσταγµένο νερό. Παραµονή του σε θερµοκρασία δωµατίου σε βαρύτητα για 24 ώρες. Αναρρόφηση 430 ml του υϖερκείµενου και αϖόρριψη του. Προσθήκη αϖοσταγµένου νερού σε τελικό όγκο 500 ml. Παραµονή του ιζήµατος για 5 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Αναρρόφηση 440 ml του υϖερκείµενου. Προσθήκη 600 ml (32% Τ/Vol). ιατήρηση σε µικρές ϖοσότητες (4 ml). Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο. ιάλυµα ηλεκτροφόρησης 5 Χ ΤΒΕ 54g Tris, 27.5g βορικό οξύ, 20ml 0.5M EDTA (ph 8.0) σε 1000ml ddh 2O ιάλυµα Βρωµιούχου Αιθιδίου (10mg/ml) 0.5g βρωµιούχου αιθιδίου σε 50ml ddh 2O 55

68 ΥΛΙΚΑ Ρυθµιστικό διάλυµα Tris-EDTA (TE) 10mM Tris-HCl, ph 7.6, 0.1 mm EDTA, ph 8.0. Αϖοστείρωση σε αυτόκαυστο στους 121 ο C για 15 λεϖτά. datp διάλυµα 100mM (Amersham Pharmacia Biotech Inc) dgtp διάλυµα 100mM (Amersham Pharmacia Biotech Inc) dttp διάλυµα 100mM (Amersham Pharmacia Biotech Inc) dctp διάλυµα 100mM (Amersham Pharmacia Biotech Inc) QIAamp Viral RNA Mini Kit for purification of viral RNA (QIAGEN) QIAquick Spin PCR Purification Kit (QIAGEN) 56

69 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ

70 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 1. ΣΤΑΘΜΟΙ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ Κατά τη διάρκεια εκϖόνησης της µελέτης συλλέχθηκαν δείγµατα λυµάτων αϖό το σηµείο εισροής σταθµών βιολογικού καθαρισµού (µη εϖεξεργασµένα λύµατα). Οι δειγµατοληψίες ϖραγµατοϖοιήθηκαν µηνιαία κατά την ϖερίοδο: Σεϖτέµβριος Σεϖτέµβριος 2003 αϖό τους εξής βιολογικούς καθαρισµούς : α) ΚΕΡΕΦΥΤ (Αττική), β) Ψυττάλεια (Αττική), γ) Είσοδος βιολογικού καθαρισµού Πάτρας (Αχαΐα) δ) Βιολογικός Καθαρισµός Ρίου (Αχαΐα). (ϖίνακας 6) Συνολικά συλλέχθηκαν 118 δείγµατα λυµάτων αϖό τα οϖοία αϖοµονώθηκαν ιοί εντερικής ϖροέλευσης : α) εντεροϊοί, β) αδενοϊοί και γ) ρότα ιοί. ΠΙΝΑΚΑΣ 6: είγµατα ακατέργαστων λυµάτων Προέλευση δείγµατος λύµατος Αριθµός δειγµάτων ΚΕΡΕΦΥΤ (Αττική) 32 Ψυττάλεια (Αττική) 23 Πάτρα (Αχαΐα) 32 Ρίο (Αχαΐα) 31 Σύνολο

71 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 1.1. Βιολογικός Καθαρισµός ΚΕΡΕΦΥΤ (Μεταµόρφωση Αττικής) Στη Μεταµόρφωση Αττικής λειτουργεί το Κέντρο Ερευνών και Εφαρµογών Υγειονοµικής Τεχνολογίας (ΚΕΡΕΦΥΤ)(εικόνα 4). Πρόκειται για µια ερευνητική εγκατάσταση µεγάλης κλίµακας, η οϖοία δέχεται για εϖεξεργασία µέχρι και 2.100m 3 λυµάτων ηµερησίως. Τα λύµατα ϖροέρχονται κυρίως αϖό τα Βόρεια Προάστεια της Αθήνας και είναι αστικά και ελαφρώς βιοµηχανικά. Αϖοτελεί τη µεγαλύτερη ϖιλοτική µονάδα του είδους στην Ευρώϖη. Κατασκευάστηκε µε συγχρηµατοδότηση της ΕΥ ΑΠ και του ϖρογράµµατος Science for Stability του ΝΑΤΟ. Βασικοί στόχοι της δηµιουργίας του ΚΕΡΕΦΥΤ είναι : Η έρευνα στον τοµέα της υγειονοµικής τεχνολογίας αυτοδύναµα ή σε συνεργασία µε φορείς του εσωτερικού (όϖως µε το Πανεϖιστήµιο Πατρών) και του εξωτερικού. Η έρευνα και η µελέτη για τα χαρακτηριστικά και τη διαχείριση των λυµάτων, υϖό συγκεκριµένες ϖεριβαλλοντικές συνθήκες έχουν ως στόχο την κατασκευή Μονάδων Εϖεξεργασίας Λυµάτων ϖροσαρµοσµένων στις ελληνικές γεωγραφικές, κλιµατολογικές και κοινωνικές συνθήκες τις Ελλάδας. Εκϖαίδευση εϖιστηµονικού και τεχνικού ϖροσωϖικού ήµων και Κοινοτήτων, Νοµαρχιών και γενικώς φορέων σχετικών µε τη µελέτη, κατασκευή, λειτουργία και συντήρηση Μονάδων Εϖεξεργασίας Λυµάτων. Εικόνα 4 : Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων ΚΕΡΕΦΥΤ (ΕΥ ΑΠ, 2005) 59

72 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Στη Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ ϖραγµατοϖοιείται ϖρωτοβάθµιος και δευτεροβάθµιος καθαρισµός και εφαρµόζεται η µέθοδος της Ενεργού Ιλύος. Γενική ϖεριγραφή εγκαταστάσεων ΚΕΡΕΦΥΤ Μία µονάδα χονδρής εσχάρωσης, ϖλάτος ράβδου 6 mm, διάκενο 30 mm Μία µονάδα λεϖτής εσχάρωσης, ϖλάτος ράβδου 4 mm, διάκενο 20 mm Αεριζόµενος λιϖοσυλλέκτης - αµµοσυλλέκτης, µήκους 4,20 m µε δύο φυσητήρες 2,2 KW ο καθένας Φρεάτια διανοµής ϖαροχών ύο οξειδωτικές τάφροι ελλειψοειδούς διατοµής, συνολικού όγκου 120 m 3, µέσου βάθους 1,00 m η καθεµία 'Eνας κροκιδωτής όγκου 10 m 3 και µονάδες ϖροετοιµασίας των διαλυµάτων για στερεά και υγρά κροκιδωτικά ύο µονάδες ϖρωτοβάθµιας καθίζησης, κυκλικής διατοµής, διαµέτρου 4,20m και βάθους 4,00 m η καθεµία. Τρεις δεξαµενές αερισµού ενεργού ιλύος ορθογωνικής διατοµής, συνολικού όγκου 180 m 3 µε τρία διαµερίσµατα η καθεµία. ύο δεξαµενές δευτεροβάθµιας καθίζησης, κυκλικής διατοµής, διαµέτρου 3,90 m, βάθους 4,00 m η καθεµία και τρεις µονάδες κυκλικής διατοµής διαµέτρου 2,30 m, βάθους 4,00 m η καθεµία Κινητή µονάδα δύο δεξαµενών, όγκου 1 m 3 η καθεµία Τέσσερις κλίνες ξήρανσης, ορθογωνικής διατοµής, συνολικής εϖιφάνειας 40m 2. Σηµειώνεται ότι είναι δυνατή η ϖολλαϖλή διασύνδεση των διαφόρων µονάδων µεταξύ τους, ανάλογα µε το εξελισσόµενο ερευνητικό ϖρόγραµµα Βιολογικός Καθαρισµός Ψυττάλειας (Αττική) Η αϖοχέτευση του Λεκανοϖεδίου Αττικής ϖραγµατοϖοιείται µε αγωγούς οµβρίων και ακαθάρτων. Οι µεν αγωγοί οµβρίων καταλήγουν µε φυσική ροή στη θάλασσα, οι δε αγωγοί ακαθάρτων καταλήγουν στη θαλάσσια ϖεριοχή της Ψυττάλειας αφού ϖροηγηθεί ο βιολογικός καθαρισµός των λυµάτων στο Κέντρο Εϖεξεργασίας Λυµάτων της Ψυττάλειας. Η εγκατάσταση της Ψυττάλειας λειτουργεί αϖό το 1994 σε ϖρώτη φάση (ϖρωτοβάθµια εϖεξεργασία- διαχείριση ϖαραγόµενης λάσϖης) και βρίσκεται 60

73 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ υϖό κατασκευή η δεύτερη φάση (αερισµός-δευτεροβάθµια καθίζηση). Το έργο της Ψυττάλειας (εικόνα 5) αϖοτελείται αϖό τα εξής εϖιµέρους έργα : - Συµϖληρωµατικός Κεντρικός Αϖοχετευτικός Αγωγός - Μηχανική Εϖεξεργασία των λυµάτων στον Ακροκέραµο - ίδυµος υϖοθαλάσσιος αγωγός αϖό τον Ακροκέραµο στη νήσο Ψυττάλεια - Κέντρο Εϖεξεργασίας Λυµάτων στην Ψυττάλεια - Σύστηµα αγωγών εκβολής Εικόνα 5 : Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων Ψυττάλειας (ΕΥ ΑΠ 2005) Η κατασκευή της Α φάσης ολοκληρώθηκε το Τα λύµατα της Αθήνας (ϖερίϖου m 3 ηµερησίως) αφού υϖοστούν την αναγκαία ϖροεϖεξεργασία (εσχάρωση εξάµµωση) στον Ακροκέραµο, οδηγούνται µέσω του συστήµατος ανεστραµµένων σιφώνων στη νήσο Ψυττάλεια. Προς αϖοφυγή των ϖεριβαλλοντικών οχλήσεων, οι εγκαταστάσεις είναι καλυµµένες και ο ϖεριεχόµενος αέρας υφίσταται συνεχή καθαρισµό, µέσω συστήµατος µονάδων αϖόσµησης. Στην Ψυττάλεια τα λύµατα υϖοβάλλονται σε κυρίως εϖεξεργασία, δηλαδή σε ϖρωτοβάθµια καθίζηση. Στη συνέχεια, µέσω των αγωγών διάθεσης οδηγούνται σε ικανοϖοιητικό βάθος και διαχέονται στον αϖοδέκτη, το 61

74 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Σαρωνικό Κόλϖο. Η ιλύς, η οϖοία ϖροκύϖτει αϖό τον καθαρισµό των λυ- µάτων υφίσταται µια σειρά διεργασιών ϖρος αδρανοϖοίηση και ελάττωση του όγκου της και τελικά διατίθεται ϖρος υγειονοµική ταφή. Με την ολοκλήρωση των έργων της Β φάσης (κατασκευή εγκαταστάσεων βιολογικού καθαρισµού των λυµάτων και εϖεξεργασία της ιλύος), η µείωση του ρυϖαντικού φορτίου των λυµάτων θα υϖερβαίνει το 90%. Ο βιολογικός καθαρισµός θα ϖραγµατοϖοιείται σε δεξαµενές αερισµού, οι οϖοίες θα ακολουθούνται αϖό δεξαµενές τελικής καθίζησης. Οι εργασίες για την κατασκευή της Β φάσης έχουν ξεκινήσει αϖό τον Φεβρουάριο του 1999 υϖό την εϖίβλεψη του ΥΠΕΧΩ Ε ώστε η εγκατάσταση να ανταϖοκρίνεται ϖρος τις οδηγίες της Ευρωϖαϊκής Κοινότητας Βιολογικός Καθαρισµός Ρίου (Αχαΐα) Στην ϖεριοχή του Πανεϖιστηµίου Πατρών λειτουργεί σταθµός βιολογικού καθαρισµού λυµάτων. Τα λύµατα ϖου καταλήγουν στο βιολογικό καθαρισµό ϖροέρχονται αϖό την Κοινότητα του Ρίου, το Πανεϖιστήµιο Πατρών και το Περιφερειακό Πανεϖιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Πατρών Είσοδος βιολογικού καθαρισµού Πάτρας Τα λύµατα είναι αστικά και ϖροέρχονται ως εϖί το ϖλείστον αϖό τον ήµο Πατρέων. Στον ϖαρακάτω ϖίνακα (7) ϖαρουσιάζονται αναλυτικά τα δείγµατα λυ- µάτων ϖου ελήφθησαν κατά το χρονικό διάστηµα αϖό το Σεϖτέµβριο του 2000 έως το Σεϖτέµβριο 2003 αϖό τους τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας. 62

75 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 2. ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ Λήψη 500ml λυµάτων αϖό την είσοδο του βιολογικού καθαρισµού των ϖεριοχών ϖου ϖροαναφέρθηκαν σε αϖοστειρωµένα ϖλαστικά βιδωτά δοχεία και µεταφορά τους στο εργαστήριο εντός ισοθερµικού δοχείου (4 0 C). 3. ΣΥΜΠΥΚΝΩΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΩΝ ΙΩΝ Πριν αϖό τη διενέργεια της Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυµεράσης (PCR) εφαρµόζεται διαδικασία συµϖύκνωσης των δειγµάτων ϖροκείµενου να αϖοµονωθούν οι ιοί. Για το σκοϖό αυτό ϖραγµατοϖοιούνται διαδοχικές φυγοκεντρήσεις και χρησιµοϖοιείται διάλυµα γλυκίνης για την κατακράτηση των ιικών σωµατιδίων ϖου ϖλεονεκτεί έναντι άλλων διαλυµάτων, γιατί αϖοφεύγονται οι αναστολείς της PCR. Η συγκεκριµένη µέθοδος συµϖύκνωσης είναι εύκολα εφαρµόσιµη και δίνει καλά αϖοτελέσµατα σε δείγµατα µε χαµηλή και υψηλή συγκέντρωση ιών. Φυγοκέντρηση 40ml δείγµατος στις 229,600 X g (35000 rpm) για 60 λεϖτά στους 4 0 C. Εϖαναδιάλυση του ιζήµατος µε 5ml ρυθµιστικού διαλύµατος γλυκίνης (0,25Μ) ph 9,5. Τοϖοθέτηση του διαλύµατος αυτού στον ϖάγο για 30 λεϖτά και ϖεριοδική ανακίνησή του κάθε 5 λεϖτά. Προσθήκη 5ml (2X) PBS Φυγοκέντρηση στις Χ g (11565 rpm) για 15 λεϖτά. Αϖόρριψη του ιζήµατος. Φυγοκέντρηση του υϖερκείµενου στις 229,600 X g(35000 rpm) για 60 λεϖτά στους 4 0 C. Εϖαναδιάλυση του ιζήµατος µε 100µl PBS (1X) και φύλαξη του διαλύµατος στους 70 0 C. 63

76 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 4.ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΤΩΝ ΙΩΝ Α. Αϖοµόνωση γενετικού υλικού Εντεροϊών και Αδενοϊών Για την αϖοµόνωση του γενετικού υλικου των ιών εϖιλέχθηκε η µέθοδος του Boom ϖου χρησιµοϖοιεί τον ϖαράγοντα guanidinium thiocyanate και ϖροσρόφηση του νουκλεϊκού οξέος σε σωµατίδια αργιλίου. Εκτός αϖό τη µέθοδο του Boom έχουν αναφερθεί και άλλες µέθοδοι αϖοµόνωσης νουκλεϊκών οξέων όϖως : α) η µέθοδος των Chomczynski και Sasshi και β) η µέθοδος του Yamada. Σύγκριση των ϖαραϖάνω µεθόδων έδειξε ότι η µέθοδος του Boom (Boom et al. 1990): α) εµφανίζει µεγαλύτερη ευαισθησία στην αϖοµόνωση νουκλεϊκών οξέων, β) µε τη χρήση της εϖιτυγχάνεται η αϖοµάκρυνση αναστολέων της PCR και γ) οι ζώνες ϖου εµφανίζονται στην ηλεκτροφόρηση µετά την PCR είναι ϖολύ καλά σχηµατισµένες. Τοϖοθέτηση σε ένα eppendorf 40µl διαλύµατος σωµατιδίων αργιλίου και ϖροσθήκη 990µl ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης. Προσθήκη 50µl του υϖό εξέταση δείγµατος. Ανάδευση σε µηχανικό αναδευτήρα (vortex) για 5sec. Παραµονή του δείγµατος σε θερµοκρασία δωµατίου για 10 λεϖτά. Φυγοκέντρηση στις X g (14000 rpm) για 15 sec. Αϖόρριψη του υϖερκείµενου και έκϖλυση του ιζήµατος µε 1ml ρυθµιστικού διαλύµατος έκλουσης. Φυγοκέντρηση στις X g (14000rpm) για 15 sec. Αϖόρριψη του υϖερκείµενου και έκϖλυση του ιζήµατος δύο φορές µε 70% αιθανόλη. Φυγοκέντρηση στις X g (14000rpm) για 15 sec. Αϖόρριψη του υϖερκείµενου και έκϖλυση του ιζήµατος µε 1ml ακετόνης. Τοϖοθέτηση του ιζήµατος σε υδατόλουτρο στους 56 0 C µε το καϖάκι του eppendorf ανοιχτό για 10 λεϖτά ϖροκειµένου να εξατµιστεί η ακετόνη. Εϖαναδιάλυση του ιζήµατος µε 50µl διαλύµατος : Tris-EDTA ρυθµιστικό διάλυµα + 1Mm DTT (49,4µl) 0,5 U/µl RNAsin (20U/µl) (PROMEGA) (0,6µl) 64

77 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Ανάµειξη του ιζήµατος µε ϖιϖέττα. Εϖώαση του δείγµατος στους 56 0 C για να δράσει ο αναστολέας RNAse. Ανάµειξη του δείγµατος. Φυγοκέντρηση στις X g (14000rpm) για 2 λεϖτά. Λήψη του υϖερκείµενου ϖου ϖεριέχει το νουκλεϊκό οξύ µε ϖροσοχή ώστε να µη ληφθούν καθόλου σωµατίδια αργιλίου τα οϖοία αναστέλλουν την αλυσιδωτή αντίδραση ϖολυµεράσης. Αϖοθήκευση στους 20 0 C. Β. Αϖοµόνωση γενετικού υλικού Ρότα ιών Για την αϖοµόνωση των Ρότα ιών η µέθοδος του Boom δεν έδωσε ικανοϖοιητικά αϖοτελέσµατα. Έτσι, ϖροκειµένου να αϖοµονωθεί το γενετικό υλικό των ρότα ιών χρησιµοϖοιήσαµε ειδικό kit (QIAgen viral RNA extraction kit). Η µέθοδος αυτή ϖροτείνεται αϖό την Baggi και τους συνεργάτες της (2000) και έδωσε ϖολύ θετικά αϖοτελέσµατα όσον αφορά στην αϖοµόνωση του γενετικού υλικού των ρότα ιών. Τοϖοθέτηση σε ένα eppendorf 560µl ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης (AVL ϖεριέχει RNA carrier) και 140µl δείγµατος. Ανάµειξη µε µηχανικό αναδευτήρα (vortex) για 15 sec. Εϖώαση σε θερµοκρασία δωµατίου( C) για 10 λεϖτά. Φυγοκέντρηση για 15 sec σε χειροκίνητη µικροφυγόκεντρο. Προσθήκη 560µl αιθανόλης (96-100%) και ανάµειξη µε µηχανικό α- ναδευτήρα για 15sec. Φυγοκέντρηση για 15 sec. Τοϖοθέτηση 630µl αϖό το ϖροηγούµενο διάλυµα σε ειδικό σωληνάκι µε φίλτρο (QIAamp spin column). Φυγοκέντρηση στις 6000 X g (8000 rpm) για 1 λεϖτό. Εϖανάληψη του ϖαραϖάνω σταδίου. Προσθήκη 500µl διαλύµατος έκλουσης (AW1) και φυγοκέντρηση στις 6000 X g (8000 rpm) για 1 λεϖτό. 65

78 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Προσθήκη 500µl διαλύµατος έκλουσης (AW2) και φυγοκέντρηση στις X g (14000 rpm) για 3 λεϖτά. Τοϖοθέτηση 60µl διαλύµατος έκλουσης (AVE Rnase free water), εϖώαση για 1 λεϖτό σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια φυγοκέντρηση στις 6000 X g (8000 rpm) για 1 λεϖτό. Αϖοθήκευση του διαλύµατος ϖου ϖεριέχει το RNA στους 20 0 C. Σηµείωση: Όλα τα διαλύµατα και τα ειδικά σωληνάκια ϖου αναφέρονται στην ϖαραϖάνω διαδικασία ϖαρέχονται αϖό την εταιρεία QIAGEN ϖου ϖροµηθεύει το kit. 5. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΙΩΝ ΕΝΤΕΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ Στη συγκεκριµένη εργασία για την ταυτοϖοίηση των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών εφαρµόστηκαν µοριακές τεχνικές όϖως η RT-PCR και η ϖιο εξελιγµένη ϖαραλλαγή της η Nested RT-PCR. Η RT-PCR έχει το ϖλεονέκτηµα ότι µϖορεί να ανιχνεύσει µέχρι και 1-10 ιικά σωµατίδια. Εϖιϖλέον, µε την εφαρµογή των µοριακών µεθόδων για την αϖοµόνωση ιών αϖό τα λύµατα δίνεται η δυνατότητα της µοριακής τυϖοϖοίησής τους και αυτός είναι ο αϖώτερος σκοϖός της ϖαρούσας εργασίας. 5.Α. ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ Η αντίδραση αντίστροφης µεταγραφής εφαρµόστηκε για τους RNA ιούς και ειδικότερα για τους Εντεροϊούς και τους Ρότα ιούς. 5.Α.1 ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Η αντίδραση ϖραγµατοϖοιείται σε διάλυµα συνολικού όγκου 10µl ϖου ϖεριέχει 5µl δείγµατος, 25 mm MgCl 2, 1XPCR Buffer II(Perkin Elmer Roche, Inc.)(10mM Tris-HCl ph8.3, 50 mm KCl ), 25 µμ αϖό κάθε τριφωσφορικό δεσοξυριβονουκλεοτίδιο (d ATP, d CTP, d TTP και d GTT,) και O.35µΜ εκκινητή Ent 2. 66

79 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Τα αντιδραστήρια τοϖοθετούνται στους 95 0 C για 5 λεϖτά. Τοϖοθέτηση των αντιδραστηρίων στον ϖάγο. Προσθήκη σε κάθε σωληνάριο : 0.5µl αναστολέα RNAάσης (Perkin Elmer Roche, Inc.) (20U/µl), 0.5 µl διθειοθρεϊτόλης (0.2Μ) και 1µl αντίστροφης µεταγραφάσης (Perkin Elmer Roche, Inc.) (50U/µl). Ανάµειξη µε ϖιϖέττα. Εϖώαση των δειγµάτων στους 42 0 C, για 30 λεϖτά, και στους 95 0 C για 5 λεϖτά. Άµεση τοϖοθέτηση των δειγµάτων µε το c DNA στον ϖάγο και φύλαξή τους στους 20 0 C. Όσον αφορά τους Ρότα ιούς ϖραγµατοϖοιήθηκε one step αντίδραση αντίστροφης µεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης ϖολυµεράσης µε βάση τη µεθοδολογία ϖου ϖροτείνεται αϖό τη Baggi και συνεργάτες (2000). 5.Α.2 ΡΟΤΑ ΙΟΙ Η αντίδραση της αντίστροφης µεταγραφάσης ϖραγµατοϖοιήθηκε ταυτόχρονα µε την αντίδραση αλυσιδωτής ϖολυµεράσης (one step reaction). Η µεθοδολογία ϖου ακολουθήθηκε (Franca Baggi et al. 2000) ϖεριγράφεται στην ϖαράγραφο 5.Β.3. 67

80 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 5.Β. ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ 5.Β.1 ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Η αντίδραση ϖραγµατοϖοιείται σε τελικό όγκο 50µl ϖου ϖεριέχει: είγµα c DNA : 10µl Εκκινητής Ent 1 (0.15µM): 1µl Ρυθµιστικό διαλυµα Taq: 4µl MgCl 2 (1.5µΜ): 2.4 µl Taq ϖολυµεράση (5U/ µl): 0.4 µl mq H 2O 32.2 µl Σύνολο: 50 µl Το δείγµα c DNA ϖροστίθεται τελευταίο σε διαφορετικό δωµάτιο για την αϖοφυγή µόλυνσης των αντιδραστηρίων της PCR. Το ϖρόγραµµα της PCR είναι: 1 ος κύκλος: για τη µετουσίωση του DNA στους 94 0 C για 2 λεϖτά, για τη σύνδεση των εκκινητών στους 55 0 C για 90sec, για την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 2 λεϖτά. Οι υϖόλοιϖοι κύκλοι ήταν : για τη µετουσίωση του DNA στους 92 0 C για 90sec, τη σύνδεση των εκκινητών στους 55 0 C για 90sec και την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 2 λεϖτά. Μετά αϖό 29 κύκλους αντίδρασης, ακολούθησε τελική εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 10 λεϖτά. Οι αλληλουχίες των εκκινητών αναφέρονται στον ϖίνακα 8. Η αναγνώριση του ϖροϊόντος της PCR (µεγέθους 540 βάσεων) γίνεται µε ηλεκτροφόρηση σε ϖήκτωµα αγαρόζης 2% ϖου ϖεριείχε βρωµιούχο αιθίδιο 0.5 µg/ml. Χρησιµοϖοιήθηκε δείκτης γνωστού µεγέθους DNA (ΦΧ174 χ HaeIII, Promega). Τα τµήµατα DNA έγιναν ορατά µε έκθεση σε υϖεριώδη ακτινοβολία. 68

81 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 5.Β.2 Α ΕΝΟΪΟΙ Η αντίδραση ϖραγµατοϖοιείται σε τελικό όγκο 50µl ϖου ϖεριέχει: είγµα DNA : 10µl Εκκινητής Hex A(4µM): 1µl Εκκινητής Hex B(4µM): 1µl d NTPs (25 µm): 0.5 µl Ρυθµιστικό διαλυµα Taq: 5µl MgCl 2 (1.5µΜ): 3µl Taq ϖολυµεράση (5U/ µl): 0.4 µl mq H 2O 29.1 µl Σύνολο: 50 µl Το δείγµα DNA ϖροστίθεται τελευταίο σε διαφορετικό δωµάτιο για την αϖοφυγή µόλυνσης των αντιδραστηρίων της PCR. Το ϖρόγραµµα της PCR είναι: 1 ος κύκλος: για τη µετουσίωση του DNA στους 94 0 C για 2 λεϖτά, για τη σύνδεση των εκκινητών στους 55 0 C για 90sec, για την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 2 λεϖτά. Οι υϖόλοιϖοι κύκλοι ήταν : για τη µετουσίωση του DNA στους 92 0 C για 90sec, τη σύνδεση των εκκινητών στους 55 0 C για 90sec και την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 2 λεϖτά. Μετά αϖό 29 κύκλους αντίδρασης, ακολούθησε τελική εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 10 λεϖτά. Οι αλληλουχίες των εκκινητών αναφέρονται στον ϖίνακα 8. Η αναγνώριση του ϖροϊόντος της PCR (µεγέθους 301 βάσεων) γίνεται µε ηλεκτροφόρηση σε ϖήκτωµα αγαρόζης 2% ϖου ϖεριείχε βρωµιούχο αιθίδιο 0.5 µg/ml. Χρησιµοϖοιήθηκε δείκτης γνωστού µεγέθους DNA (ΦΧ174 χ HaeIII, Promega). Τα τµήµατα DNA έγιναν ορατά µε έκθεση σε υϖεριώδη ακτινοβολία. 69

82 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 5.Β.3 ΡΟΤΑ ΙΟΙ 1 Ο Στάδιο: Αϖοδιάταξη δίκλωνου RNA Τοϖοθέτηση σε eppendorf 7µl αϖοδιατακτικού ϖαράγοντα(dmso) και 5µl δείγµατος. Εϖώαση για 5 λεϖτά στους 97 0 C (συνθήκες αϖοδιάταξης). Τοϖοθέτηση κατευθείαν στον ϖάγο. Φυγοκέντρηση για 5sec στη µικροφυγόκεντρο και µετά κατευθείαν στον ϖάγο. Εϖώαση των δειγµάτων στους 42 0 C για 30 λεϖτά. 2 Ο Στάδιο : Αντίδραση Αντίστροφης Μεταγραφής Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (one step reaction) Η αντίδραση ϖραγµατοϖοιήθηκε σε τελικό όγκο 100 µl ϖου ϖεριέχει : είγµα(αϖό 1 ο στάδιο) : 12µl Εκκινητής R1(20µM): 5µl Εκκινητής End 9(20µM): 5µl d NTPs (25 µm): 0.8 µl Ρυθµιστικό διαλυµα Taq: 10µl MgCl 2 (50µΜ): 3µl MURT(200U/µl): 1µl Taq ϖολυµεράση (5U/ µl): 0.4 µl mq H 2O 62.7 µl Σύνολο: 100 µl Το ϖρόγραµµα της PCR είναι: 24 κύκλοι: για τη µετουσίωση του DNA στους 94 0 C για 1 λεϖτό, για τη σύνδεση των εκκινητών στους 55 0 C για 2 λεϖτά, για την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 1 λεϖτό. Μετά αϖό 24 κύκλους ακολούθησε τελική εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 7 λεϖτά. Οι αλληλουχίες των εκκινητών αναφέρονται στον ϖίνακα 8. 70

83 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Η αναγνώριση του ϖροϊόντος της PCR (µεγέθους 1062 βάσεων) γίνεται µε ηλεκτροφόρηση σε ϖήκτωµα αγαρόζης 2% ϖου ϖεριείχε βρωµιούχο αιθίδιο 0.5 µg/ml. Χρησιµοϖοιήθηκε δείκτης γνωστού µεγέθους DNA (ΦΧ174 χ HaeIII, Promega). Τα τµήµατα DNA έγιναν ορατά µε έκθεση σε υϖεριώδη ακτινοβολία. 5. Γ. NESTED-ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ 5. Γ. 1 ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ ΚΑΙ Α ΕΝΟΪΟΙ Προσθήκη 1µl του ϖροϊόντος της PCR σε 49 µl µίγµατος (d NTPs, PCR 1X ρυθµιστικό διάλυµα, εκκινητές, Taq ϖολυµεράση) και εϖανάληψη της µεθοδολογίας της αλυσιδωτής αντίδρασης ϖολυµεράσης για άλλους 29 κύκλους. Χρησιµοϖοίηση ζεύγους εκκινητών οι οϖοίοι είναι εσωτερικοί ως ϖρος τους εκκινητές της ϖρώτης PCR και ενισχύουν ένα µικρότερο τµήµα του ϖροϊόντος της ϖρώτης PCR. Για τους εντεροϊούς και τους αδενοϊούς τα ϖροϊόντα της nested PCR ήταν µεγέθους 123 και 143 ζεύγη βάσεων αντίστοιχα (ϖίνακας 9). Η αναγνώριση της αλληλουχίας έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε ϖήκτωµα αγαρόζης Seakem 3% και τα τµήµατα έγιναν ορατά σε υϖεριώδη ακτινοβολία. 5. Γ. 2 ΡΟΤΑ ΙΟΙ Η αντίδραση ϖραγµατοϖοιήθηκε σε τελικό όγκο 50 µl ϖου ϖεριείχε: Προϊόν PCR 1 µl Εκκινητής Rp(9µM): 2.5µl Εκκινητής R3(9µM): 2.5µl d NTPs (25 µm): 0.2 µl Ρυθµιστικό διαλυµα Taq: 5µl MgCl 2 (50µΜ): 1.5µl Taq ϖολυµεράση (5U/ µl): 0.5 µl 71

84 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ mq H 2O 32.8 µl Σύνολο: 50 µl Το ϖρόγραµµα της PCR είναι: 3 κύκλοι: για τη µετουσίωση του DNA στους 94 0 C για 30 sec, για τη σύνδεση των εκκινητών στους 50 0 C για 30 sec, για την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 30 sec. 27 κύκλοι : για τη µετουσίωση του DNA στους 94 0 C για 15sec, τη σύνδεση των εκκινητών στους 50 0 C για 15sec και την εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 20 sec. Ακολούθησε τελική εϖιµήκυνση των εκκινητών στους 72 0 C για 2 λεϖτά. Χρησιµοϖοίηση ζεύγους εκκινητών οι οϖοίοι είναι εσωτερικοί ως ϖρος τους εκκινητές της ϖρώτης PCR και ενισχύουν ένα µικρότερο τµήµα του ϖροϊόντος της ϖρώτης PCR. Για τους Ρότα ιούς το ϖροϊόν της nested PCR ήταν µεγέθους 189bp (ϖίνακας 9). Η αναγνώριση της αλληλουχίας έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε ϖήκτωµα αγαρόζης Seakem 3% και τα τµήµατα έγιναν ορατά σε υϖεριώδη ακτινοβολία. 72

85 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ ΠΙΝΑΚΑΣ 8 : Αλληλουχία εκκινητών ϖου χρησιµοϖοιήθηκαν για την Τύϖος εκκινητή Εnt 1 (5 ΝΤR) Ent 2 (5 NTR) NEnt1 (5 ΝΤR) NEnt2 (5 ΝΤR) HEXA (hexon) HEXB (hexon) NHEXA (hexon) NHEXB (hexon) R1 (vp 7) END9 (vp 7) Rp (vp 7) R3 (vp 7) ανίχνευση των εντεροϊών, των αδενοϊών και των ρότα ιών (Pina et al. 1998, Baggi et al ) Αντίδραση Αλληλουχία εκκινητή Ιός Μέγεθος ενίσχυσης ϖροϊόντος PCR 5'>cggtacctttgtacgcctgt<3' Εντεροϊοί 540bp PCR 5'>attgtcaccataagcagcca<3' Εντεροϊοί 540bp Nes PCR 5'>tccggcccctgaatgcggcta<3' Εντεροϊοί 123bp Nes PCR 5'>gaaacacggacacccaaagta<3' Εντεροϊοί 123bp PCR 5'>gccgcagtggtcttacatgcacatc< 3' Αδενοϊοί 301bp PCR 5'>cagcacgccgcggatgtcaaagt< Αδενοϊοί 301bp 3' Nes PCR 5'>gccaccgagacgtacttcagcctg< Αδενοϊοί 143bp 3' Nes PCR 5'>ttgtacgagtacgcggtatcctcgcg Αδενοϊοί 143bp gtc<3' PCR 5'>ggctttaaaagagagaatttccgtct Ρότα ιοί 1062bp gg<3' PCR 5'>ggtcacatcatacaattctaatctaag Ρότα ιοί 1062bp <3' Nes PCR 5'>tccattgatcctgttattgg<3' Ρότα ιοί 189bp Nes PCR 5'>gtatggtattgaatataccac<3' Ρότα ιοί 189bp -5 NTR : Αµετάφραστη ϖεριοχή στο 5 άκρο του γονιδίου vp 1 ϖου ενισχύθηκε -Hexon: εξώνιο γονιδίου Αδενοϊού τύϖου 2 -vp 7: γονίδιο vp 7 στο 9 ο τµήµα του γονιδιώµατος των ρότα ιών κωδικοϖοιεί την ϖρωτεΐνη VP 7 της εξωτερικής στιβάδας του καψιδίου των ρότα ιών ΠΙΝΑΚΑΣ 9 : Ζώνες Ανίχνευσης Ιών 1 η PCR Nested PCR Εντεροϊοί 540 bp 123bp Αδενοϊοί 301 bp 143 bp Ρότα ιοί 1062 bp 189 bp 73

86 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 6. ΜΟΡΙΑΚΗ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΙΙΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Μετά την αϖοµόνωση των ιών στόχος της ϖαρούσας εργασίας είναι η µοριακή τυϖοϖοίησή τους. Η µοριακή τυϖοϖοίηση των ιών ϖραγµατοϖοιείται συχνά σε ϖαγκόσµια κλίµακα µε τη χρήση διάφορων µοριακών τεχνικών ϖου αναϖτύχθηκαν τα τελευταία 20 χρόνια. Οι µοριακές τεχνικές ϖου έχουν χρησιµοϖοιηθεί αϖό τους ϖερισσότερους ερευνητές για την τυϖοϖοίηση των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών είναι α) η Nucleotide Sequencing Analysis και β) η Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis (RFLP). Στην ϖαρούσα εργασία εϖιλέξαµε για τη µοριακή τυϖοϖοίηση τω ιών την τεχνική Nucleotide Sequencing Analysis η οϖοία µε βάση τη διεθνή βιβλιογραφία εµφανίζει τη µεγαλύτερη ευαισθησία και αξιοϖιστία. 6.A. ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ ΤΗΣ NESTED-PCR Προκειµένου να εφαρµοστεί µε εϖιτυχία η τεχνική Nucleotide Sequencing Analysis για την τυϖοϖοίηση των ιών, τα θετικά δείγµατα των ιών της Nested-PCR καθαρίστηκαν µε τη χρησιµοϖοίηση ειδικού kit QIAquick PCR Purification Kit Protocol µε βάση τη διεθνή βιβλιογραφία. Προσθήκη ρυθµιστικού διαλύµατος PB (ϖεριέχει τον ϖαράγοντα guanidine hydrochloride και ισοϖροϖανόλη) και δείγµατος Nested-PCR µε αναλογία 5 : 1 και ανάµειξη µε χειροκίνητο αναδευτήρα(vortex). Τοϖοθέτηση του ϖαραϖάνω δείγµατος σε ειδικό σωληνάκι µε µεµβράνη αργιλίου ϖου δεσµεύει το DNA (QIAquick spin column) και φυγοκέντρηση για sec σε χειροκίνητη µικροφυγόκεντρο. Έκλουση µε 0,75ml διαλύµατος PE (ϖεριέχει αιθανόλη) και φυγοκέντρηση για 30-60sec. Αϖόρριψη του υγρού και φυγοκέντρηση για 60 sec. 74

87 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Έκλουση του DNA µε την ϖροσθήκη 50µl διαλύµατος ΕΒ (10ml Tris-Cl, ph 8.5) και φυγοκέντρηση για 1 λεϖτό. Αϖοθήκευση του διαλύµατος ϖου ϖεριέχει το RNA στους 20 0 C. Σηµείωση: Όλα τα διαλύµατα και τα ειδικά σωληνάκια ϖου αναφέρονται στην ϖαραϖάνω διαδικασία ϖαρέχονται αϖό την εταιρεία QIAGEN ϖου ϖροµηθεύει το kit. 6.Β. ΕΦΑΡΜΟΓΗ Nucleotide Sequencing Analysis Τα ϖροϊόντα της Nested-PCR αφού καθαρίστηκαν στάλθηκαν στην εταιρεία MACROGEN (ϖου εδρεύει στην Κορέα) ώστε να διαβαστούν οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των δειγµάτων µε τη χρήση αυτόµατης συσκευής Sequencer. Οι αλληλουχίες των εκκινητών είναι αυτές ϖου χρησιµοϖοιήθηκαν κατά την εφαρµογή της Nested-PCR και αναφέρονται στον ϖίνακα 8. Τα αϖοτελέσµατα της nucleotide sequencing analysis ϖου ϖροέκυψαν για τα δείγµατα των εντεροϊών, των αδενοϊών και των ρότα ιών συγκρίθηκαν µε τις υϖάρχουσες αλληλουχίες ϖου υϖάρχουν στην Gen Bank DNA Sequencing Database µε τη χρήση του ϖρογράµµατος BLAST. 6.Γ. ΟΜΑ ΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΙΩΝ ΠΟΥ ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΑΠΟ ΤΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΛΥΜΑΤΩΝ Οι ιοί ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό τα δείγµατα λυµάτων διαχωρίστηκαν σε οµάδες ανάλογα µε την οµοιότητα της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας. Η µέθοδος ϖου εφαρµόστηκε είναι η «Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες» (Hierarchical Cluster Analysis). Η αϖεικόνιση της οµαδοϖοίησης των ιών είναι υϖό µορφή δενδρογράµµατος, όϖου φαίνεται γραφικά η σειρά µε την οϖοία οι ιοί ενώνονται για να δηµιουργήσουν οµάδες. Παράλληλα, καθίσταται εµφανής η αϖεικόνιση της αϖόστασης και της οµοιότητας µεταξύ των σχηµατισµένων οµάδων. Η µέθοδος οµαδοϖοίησης ϖου εϖιλέχθηκε ήταν η Μέθοδος του Κοντινότερου Γείτονα (Single Linkage), σύµφωνα µε την οϖοία η αϖόσταση µεταξύ δύο οµάδων καθορίζεται αϖό την αϖόσταση των δύο κοντινότερων 75

88 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ στοιχείων στις διαφορετικές αυτές οµάδες (κοντινότεροι γείτονες). Ο κανόνας αυτός ουσιαστικά ενώνει τα στοιχεία µεταξύ τους για το σχηµατισµό οµάδων. Η αϖόσταση µεταξύ των οµάδων των ιών καθορίστηκε αϖό τον συντελεστή Pearson product-moment correlation coefficient, ο οϖοίος δίδεται αϖό την εξίσωση: PCc ij = n n k = 1 ( )( ) ik 2 n ( ) ( ) x x x xi x ik i k = 1 k = 1 jk x jk x j x j 2 όϖου i, j : διαφορετικά στελέχη ιών, k : η µεταβλητή (νουκλεοτιδική βάση), n : ο συνολικός αριθµός των νουκλεοτιδικών βάσεων στην αλληλουχία. Οι τιµές ϖου ϖαίρνει κυµαίνονται αϖό 1.0 έως 1.0. Η τιµή 1.0 αντιστοιχεί σε αρνητική συσχέτιση, η τιµή 0.0 δηλώνει αϖουσία συσχέτισης και η τιµή 1.1 αντιστοιχεί σε µέγιστη δυνατή θετική συσχέτιση. 76

89 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

90 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Abbaszadegan M., Lechevallier M. and Gerba C Occurrence of viruses in US groundwaters. J AWWA 95, Abdel-Haq N.M., Thomas R.A., Asmar B.I., Zacharova V. and Lyman W.D Increased prevalence of G1P[4] genotype among children with rotavirusassociated gastroenteritis in Metropolitan Detroit. J Clin Microbiol 41, Anderson E.J. and Weber S.G Rotavirus infection in adults. The Lancet Infect Dis 4, Angelakis A.N., Marecos do Monte M.H.F., Bontoux L. and Asano T The status of wastewater reuse practice in the Mediterranean basin: need for guidelines. Wat Res 33, Appleton H. and Pereira MS A possible virus aetiology in outbreaks of food poisoning from cockles. Lancet 1(801 5): Arens M Methods for subtyping and molecular comparison of human viral genomes. Clin Microbiol Rev 12, Arguelles M.H., Villegas G.A., Castello A., Abrami A., Ghiringhelli P.D., Semorile L. and Glikmann G VP7 and VP4 genotyping of human group A rotavirus in Buenos Aires, Argentina. J Clin Microbiol 38, Asano T Water from water: closing the cycle. As Wat 17, Ashbolt N.J Microbial contamination of drinking water and disease outcomes in developing regions. Toxicology 198, Azadpour-Keeley A, Faulkner B.R. and Chen J. Movement and longevity of viruses in the subsurface. EPA US Environmental protection agency Ground water issue. 11. Baggi F. and Peduzzi R Genotping of rotaviruses in environmental water and stool samples in Southern Switzerland by nucleotide sequence analysis of 189 base pairs at the 5 end of the VP7 gene. J Clin Microbiol 38, Beavers P.D. and Gardner E.A Prediction of virus transport through soils. Proc. 15 th Fed. Conv. AWWA, Bitton G Effect of solar radiation on poliovirus: preliminary experiments. Water Research 13:

91 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 14. Bitton G Adsorption of viruses to surfaces: technological and ecological implications. In: Bitton G. & Marshall K.C. eds. Adsorption of Microorganisms to surfaces. New York, NY, John Wiley & Sons, Inc., pp Bitton, G Introduction to Environmental Virology. Wiley, New York. 16. Boom R., Sol C., Salimans M., Jansen C. and Noorda J Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 28, Blomqvist S., Savolainen C., Laine P., Hirttio P., Lamminsalo E., Pentilla E., Joks S., Roivainen M., Hovi T Characterisation of a highly evolved vaccinederived poliovirus type 3 isolated from sewage in Estonia. J. Virol. 78, Bosch A Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Internatl Microbiol 1, Bosch A., Pinto R.M., Blanch A.R. and Jofre J.T Detection of human rotavirus in sewage through two concentration procedures. Water Res 22, Bottinger M. and Herrstrom E Isolation of polioviruses from sewage and their characteristics. Experience over two decades in Sweden. Scand J Infect Dis 24, Brautbar N Brief communication: sewer workers: occupational risk for Hepatitis C report of two cases and review of literature. Arch Environ Health Buttinelli G., Donati V., Fiore S., Marturano J., Plebani A., Soresina A., Vivarelli R., Depeyroux F., Martin J., Fiore L Nucleotide variation in Sabin type 2 poliovirus from an immuno-defficient patient with poliomyelitis. J. Gen. Virol. 84, Cabelli V.J Swimming associated illness and recreational water quality. Water Schience and Technology 21, Carna R.I., Parashar U.D., Taylor D.N Enteropathogens and other factors associated with severe disease in children with acute watery diarrhea in Lima, Peru. J Infect Dis 179,

92 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 25. Caro V., Guillot S., Delpeyroux and Crainic R Molecular strategy for serotyping of human enteroviruses. J Gen Virol 82, Cataloluk O., Iturriza M. and Gray J Molecular characterization of rotaviruses circulating in the population in Turkey. Epidemiol Infect 133, Chikhi-Brachet R., Bon F., Toubiana L., Pothier P., Nicolas J.C., Flahault A. and Kohli E Virus diversity in a winter epidemic of acute diarrhea in France. J Clin Microbiol 20, Chung H. & Sobsey M.D Comparative survival of indicator viruses and enteric viruses in seawater and sediment. Water Sci. Technol. 2: Cilla G., Perez-Trallero E., Lopez-Lopategui M.C., Gilsetas A. and Gomariz M Incidence, seasonality and serotypes of rotavirus in Gipuzkoa (Basque Country), Spain. A 14-year study. Epidemiol Infect 125, Clark R.M., Hurst C.J. and Regli S Costs and benefits of pathogen central in drinking water. In safety of water disinfection : Balancing Chemical and Microbial Risks (Edited by Craun G.F.), pp ILSI Press, Washington, DC. 31. Clarke N.A Removal of enteric viruses from sewage by activated sludge treatment. Amer. J. Public Health. 51: Coluchi N., Munford V., Manzur J., Vazquez C., Escobar M., Weber E., Marmol P. and Racz M.L Detection, subgroup specificity and genotype diversity of rotavirus strains in children with acute diarrhea in Paraguay. J Clin Mcrobiol 40, Cooney M.A., Gorrell, R.J. and Palombo E.A Characterisation and phylogenetic analysis of the VP7 proteins of serotype G6 and G8 human rotaviruses. J Med Microbiol 50, Crabtree K.D., Gerba C.P., Rose J.B. and Haas C.N Waterborne adenovirus: a risk assessment. Wat Sc Technol 35, Craun G.F. & Calderon R Microbial Risks in Groundwater Systems: Epidemiology of Waterborne Outbreaks. Under the Microscope, Examining Microbes in Groundwater. AWWA Res.Fdn.,Denver. 170

93 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 36. Culniffe N.A., Gondwe J.S., Graham S.M., Thindwa D.M., Dove W., Broadhead R.L., Molyneux M.E. and Hart C.A Rotavirus strain diversity in Blantyre, Malawi, from 1997 to J Clin Microbiol 39, Culniffe N.A., Kilgore P.E., Bresee J.S Epidemiology of rotavirus diarrhea in Africa: a review to assess the need for rotavirus immunization. Bull WHO 76, Das S., Uma G., Varghese V., Chaudhuri S., Bhattacharya S.K., Krishnan T., Dutta P., Dutta D., Bhattacharya M.K., Mitra U., Kobayashi N. and Naik T.N Genomic diversity of group A rotavirus strains infecting humans in Eastern India. J Clin Microbiol 40, De Leon R. and Jankus LA Detection of the presence of bacteria and viruses in shellfish. In: Hurst CJ, Knudsen GR, Mclnerney MJ, Stetzenbach LD, Walter WV, editors. Manual of Environmental Microbiology.Washington DC:ASM Pres. P Deng M.Y. & Cliver D.O Persistence of inoculated hepatitis A virus in mixed human and animal waters. Appl. Environ. Microbiol. 61(1): Divizia M., Palombe L., Buonomo E., Donia D., Ruscio V., Equestre M., Leno L., Pana A. and Degener A.M Genomic characterization of human and environmental polioviruses isolated in Albania. Appl Environ Microbiol 65, Draft OSRAS Rev A. April Additional information on pathogen transport and survival. 43. Dubois E., Le Guyader F., Haugarreau L., Kopecka H., Cormier M. and Pommepuy M Molecular epidemiological survey of rotaviruses in sewage by reverse transcriptase seminested PCR and restriction fragment length polymorphism assay. Appl Environ Microbiol 63, Ehlers M.M., Grabow W.O.K. and Pavlov D.N Detection of enteroviruses in untreated and treated drinking water supplies in South Africa. Water Res 39, England B.L Detection of viruses on fomites. In: Methods in Environmental Virology. New York: Marcel Dekker, Inc

94 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 46. Flores J., Sears J., Perez Schael I., White D., Garcia C., Lanata C. and Kapikian A.Z Identification of human rotavirus serotype by hybridisation to polymerase chain reaction generated probes derived from a hyperdivergent region of the gene encoding outer capsid protein VP7. J Virol 64, Formiga-Cruz M., Hundesa A., Clemente-Casares P., Albinama-Gimenez N., Allard A. and Girones R Nested multiplex PCR assay for detection of human enteric viruses in shellfish and sewage. J Viro Met 125, Frantzidou F., Pavliotu A., Mataftsi A., Dumaidi K. and Georgiadis N Molecular epidemiology of adenovirus strains isolated from patients with ocular disease in the area of Thessaloniki, Greece ( ). J Med Virol 75, Friedrich F Genomic modifications in oral poliovirus vaccine strains after multiplication in humans and implications for the eradication of poliovirus. Acta Virol. 44, Fukada T Photodymanic antiviral substance extracted from Chorella cells. Appl. Microbiol. 16: Fujioka R.S. & Ackermann W.W The inhibitory effects of MgCl 2 on the inactivation kinetics of poliovirus by urea. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148: Gajardo R., Bouchriti N., Pinto R.M. and Bosch A Genotyping of rotaviruses isolated from sewage. Appl Environ Microbiol 61, Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P.A., Gouvea V., Gorziglia M., Flores J., Das B.K. and Bahn M.K Identification of group A rotavirus gene 4 by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 30, Gerba C.P Applied and theoretical aspects of virus adsorption to surfaces. Advances in Applied Microbiology 30: Gerba C.P Fate of wastewater bacteria and viruses in soil. Journal of the Irrigation and Drainage Division. Proceedings of the American Society of Civil Engineers. 101(IR3): Gerba C., Nwachcuku N. and Riley K.R Disinfection resistance of waterborne pathogens on the United States environmental protection agency s contaminant candidate list (CCL). J Water Supply-Aqua 52,

95 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 57. Gerba C., Rose J.B., Haas C.N. and Crabtree K.D Waterborne rotavirus: a risk assessment. Wat Res 30, Gouvea V., Allen J.R., Glass R.I., Fang Z.Y., Bremont M., Cohen J., McCrae M.A., Saif L.J., Sinarachtanant P. and Caul E.O Detection of group B and C rotaviruses by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 29, Gouvea V., Glass R.I., Woods K., Taniguchi K., Clark H.F., Forrester B., and Fang Z.Y Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens. J Clin Microbiol 28, Grabow W.O.K., Taylor M.B. and DeVillers J.C New methods for the detection of viruses call for review of drinking water quality guidelines. Water Sci Technol 43, Gratacap-Cavallier B., Genoulaz O., Brengel-Pesce K., Soule H., Innocenti- Francillard P., Bost M., Gofti L., Zmirou D., and Seigneurin J.M Detection of human and animal rotavirus sequences in drinking water. Appl Environ Microbiol. 66, Girones R Isolation of marine bacteria with antiviral properties. Can J Microbiol. 35: Glass J.S and O Brien R.T Enterovirus and coliphage inactivation during activated sludge treatment. Water Res. 14: Griffin DW, Gibson CG, Lipp EK, Riley K, Paul JH and Rose JB.1999.Detection of viral pathogens by reverse transcriptase PCR and of microbial indicators by standard methods in the canals of Florida Keys. Applied and Environmental Microbiology 65: Griffin D.W., Donaldson K.A. and Paul J.H Pathogenic human viruses in coastal waters. Clin Microbiol Rev 16, Guardabassi L., Dalsgaard A. and Sobsey M Occurrence and survival of viruses in composted human faeces. Sustainable urban renewal and wastewater treatment No Gunn RA, Janowski HT, Lieb S, Prather EC, Greenberg HB.1982.Norwalk virus gastroenteritis following raw oyster consumption. Am J Epidemiol 115:

96 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 68. Guyader F., Dubois E., Menard D. and Pommepuy M Detection of Hepatitis A virus, rotavirus and enterovirus in naturally contaminated shellfish and sediment by reverse transcription-seminested PCR. Appl Environ Microbiol 60, Haas C.N., Rose J.B., Gerba C.P. and Stig R Risk assessment of viruses in drinking water. Risk Anal 13, Haafliger D., Hubner P. and Luthy J Outbreak of viral gastroenteritis due to sewage-contaminated drinking water. Int J Food Microbiol 54, Halliday ML, Kang LY, Zhou TK, Hu MD, Pan QC, Fu TY, Huang YS, Hu SL An epidemic of hepatitis A attributable to the ingestion of raw clams in Shanghai, China. J Infect Dis 164: Harley D., Harrower B., Lyon M. and Dick A ( 73. Heerden J., Ehlers M.M., Heim A. and Grabow W.O.K Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa. J Appl Microbiol 99, Hejkal T.W., Wellings F., Lewis A.L. and Larock P.A Distribution of viruses associated with particles in wastewater. Appl Environ Microbiol 41, Holmes P.R Research into health risks at bathing beaches in Hong Kong. Journal of the Institution of Water and Environmental Management 3, Hot D., Legeay O., Jacques J., Gantzer C., Caudrelier Y., Guyard K., Lange M. and Andreoletti L Detection of somatic phages, infectious enteroviruses and enterovirus genomes as indicators of human enteric viral pollution in surface water. Water Res 37, Hurst C.J Influence of aerobic microorganisms upon virus survival in soil. Can. J. Microbiol. 34: Hyypia T., Hovi T., Knowles N.J. and Stanway G Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties. J Gen Virol 78, Iturriza-Gomara M.,Green J., Brown D.W., Ramsay M., Desselberger U. and Gray J.J Molecular epidemiology of human group A rotavirus infections in the United Kingdom between 1995-and J Clin Microbiol 38,

97 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 80. Jiang B., Dennehy PH., Spangenberger S., Gentsch JR., Glass RI First detection of group C rotavirus in fecal specimens of children with diarrhea in the United States. J. Infect. Dis. 172: Jiang S., Noble R. and Chu W Human adenovirus and coliphages in urban runoff-impacted coastal waters of Southern California. Applied and Environmental Microbiology vol. 67(N1): Jiang S.C. and Chu W Human viruses in California urban rivers. J Appl Microbiol 97, Jockusch S Photo-induced inactivation of viruses: Adsorption of methylene blue, thionine and thiopyronine on QB bacteriophage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: Karamoko Y., Ibenyassine K., Aitmhand R., Idaomar M. and Ennaji M.M Adenovirus detection in shellfish and urban sewage in Morocco (Casablanca region) by the polymerase chain reaction. J Viro Met 126, Katayoshi M Antiviral substances from photrophic bacteria. Micro Res. 4: Kelkar S.D., Ray P.G. and Shinde D.N An epidemic of rotavirus diarrhea in Jawhar Taluk, Thane district, Maharashtra, India December 2000-January Epidemiol Infect 132, Khuder S.A., Tammy A., Bisesi M. and Schaub E.A Prevalence of infectious diseases and associated symptoms in wastewater treatment workers. Am J Ind Med 33, Kirkwood C., Bogdanovic N., Palombo E., Masendycz P., Bugg H., Barnes G. and Bishop R Genetic and antigenic characterization of rotavirus serotype G9 strains isolated in Australia between J Clin microbial 41, Koivunen J. and Heinonen-Tanski H Inactivation of enteric microorganisms with chemical disinfectants, UV irradiation and combined chemical/uv treatments. Wat Res 39, Komninou G., Vantarakis A., Venieri D. And Papapetropoulou M Evaluation of virological quality of sewage from four biological treatment plants by a nested-pcr technique. Wat Sci Technol 50,

98 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 91. Koopmans J.S., Eckert E.A., Greenberg H.B.,Strohm B.C., Isaccson R.E. & Monto A.S Norwalk virus enteric illness acquired by swimming exposure. American Journal of Epidemio.logy Koopmans M., vonbonsdorff C., Vinje J., Medici D. and Monroe S Foodborne viruses. FEMS Microbiol Rev 26, Koivumen J., Heinonen-Tanski H Inactivation of enteric microorganisms with chemical disinfectants, UV irradiation and combined chemical/uv treatments. Water Research 39: Kukkula M., Arstila P., Klossner M.L., Maunula L., Bonsdorff C.H. and Jaatinen P Waterborne outbreak of viral gastroenteritis. Scand. J. Infect. Dis. 29, Kurugol Z., Geylani S., Karaca Y., Umay F., Erensoy S., Vardar F., Bak M., Yaprak I., Ozkinay F. And Ozkinay C Rotavirus gastroenteritis among children under five years of age in Izmir, Turkey. The Turk J Pediatr 45, La Belle R.L & Gerba C.P Influence of estuarine sediment on virus survival under field conditions. Appl. Environ. Microbiol : Le Guyader F., Dubois E., Menard D. and Pommery M Detection of Hepatitis A virus, rotavirus and enterovirus in naturally contaminated shellfish and sediment by reverse transcription-seminested PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60(10): Lee S.H. and Kim S.J Detection of infectious enteroviruses and adenoviruses in tap water in urban areas in Korea. Water Res 36, Lees D Viruses and bivalve shellfish. Int J Food Microbiol 59, Li Quan-Gen, Henningsson A., Juto P., Elgh F. and Wadell G Use of restriction fragment analysis and sequencing of a serotype-specific region to type adenovirus isolates. Journal of Clinical Microbiology, 37(3): Liew P.F & Gerba C.P Thermostabilization of enteroviruses by estuarine sediment. Appl. Environ. Microbiol. 40: Mackow E Rotaviruses Html 176

99 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 103. Manor Y., Handsher R., Halmut T., Neuman M., Abramovitz B., Mates A. And Mendelson E A double-selective tissue culture system for isolation of wildtype poliovirus from sewage applied in a long-term environmental surveillance. Appl Environ Microbiol 65, Manor Y., Handsher R., Halmut T., Neuman M., Bobrov A., Rudich H., Vonsover A., Shulman L., Kew O. And Mendelson E Detection of poliovirus circulation by environmanetal surveillance in the absence of clinical cases in Israel and the Palestinian Authority. J Clin Microbiol 37, Martins M.T., Marques E. And Soares L.A A comparative study of methods for concentration of human enteric viruses from sewage. Water Sci Technol 14, Matson D.O Virologic properties of rotavirus. rotavirus_profile/ rota_disease /virologic_prop_of_rotavir,htm 107. Matsuura K., Ishikura M., Yoshida H., Nakayama T., Hasegawa S., Ando S., Horie H., Miyamura T. and Kitamura T Assessment of poliovirus eradication in Japan: genomic analysis of polioviruses isolated from river water and sewage in Toyama prefecture. Appl Environ Microbiol 66, McKenzie C Wastewater reuse conserves water and protects waterways. On Tap Mehnert D.U. and Stewien K.E Detection and distribution of rotavirus in raw sewage and creeks in Sao Paulo, Brazil. Appl Environ Microbiol 59, Moe K. & Shirley J.A The effects of relative humidity and temperature on the survival of human rotavirus in faeces. Arch. Virol. 72(3): Morvan J.M., Chezzi C., Gouandjika I., Reimerink J.H., and van der Avoort H.G The molecular epidemiology of the type 1 poliovirus in Central African Republic. J Gen Virol 78, Muir P., Kammerer U., Korn K., Mulders M.N., Poyry T., Weissbrich B., Kandolf R., Cleator G.M., and vanloon A.M Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements. Clin Microbiol Rev 11,

100 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Murrin K. and Slade J Rapid detection of viable enteroviruses in water by tissue culture and semi-nested polymerase chain reaction. Wat Sci Technol 35, Nakajima M Adhesion and releasing of Poliovirus to activated sludge of wastewater purifying plants. Water Sci. Technol. 47(9): Narayan N.N Viral gastroenteritis agents. Department of pediatrics USC SOM Nasser A.M Comparative survival of E.coli, F+bacteriophages, HAV and poliovirus 1 in wastewater and groundwater. Water Sci. Technol. 27: Nwachcuku N. and Gerba C.P Emerging waterborne pathogens: can we kill them all? Curr Opin Biotechnol 15, Oberste M.S., Mahler K., Flemister M.R., Marchetti G., Kilpatrick D.R. and Pallansch M.A Comparison of classi and molecular approaches for the identification of untypeable enteroviruses. J Clin Microbiol 38, O Brien R.T & Newman J.S Inactivation of polioviruses and coxsackieviruses in surface water. Appl. Environ. Microbiol. 33: O Halloran F., Lynch M., Cryan B., O Shea H. and Fanning S Molecular characterization of rotavirus in Ireland: detection of novel strains circulating in the population. J. Clin Microbiol 38, Olivieri A Public health implications associated with the practice of wastewater treatment plant blending concerns and misconceptions. Testimony submitted to the subcommittee on the water resources and environment in Washington DC Omura T., Omura M., Aizawa J., Umita T. and Yagi T Removal efficiencies of indicator microorganisms in sewage treatment plants. Water Sci. Technol. 21: Oppenheimer J.A., Jancagelo J.G., Laine J-M., Hoagland J.E Testing the equivalency of ultraviolet light and chlorine for disinfection of wastewater to reclamation standards. Water Environment Research 69(1),

101 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 124. Page N.A. and Steele A.D Antigenic and genetic characterization of serotype G2 human rotavirus strains from South Africa from 1984 to J. Med Virol 72, Pancordo O.C Infectivity and antigenicity reduction rates of human rotavirus strain WA in fresh waters. Appl. Environ. Microbiol. 53(8): Parashar U.D., Bresee J.S., Gentsch J.R. and Glass R.I Rotavirus. Emerg Infect Dis 4, Parashar U.D., Hummelman E.G., Bresee J.S., Miller M.A. and Glass R.I Global illness and deaths caused by rotavirus diseases in children. Emerg Infect Dis 9, Parker V. Louise and Martel C. James. October Long-term Survival of Enteric Microorganisms in Frozen Wastewater.Technical Report ERDC/CRREL TR US Army Corps of Engineers 129. Pavlov D.N., van Zyl W.B., van Heerden J., Grabow W.O.K. and Ehlers M.M Prevalence of vaccine-derived polioviruses in sewage and river water in South Africa. Water Res (in press) Payment P Waterborne viruses and parasites: resistance to treatment and disinfection. OECD Workshop Molecular Methods for Safe Drinking Water Interlaken Philipson L., Petterson U. and Lindberg U Molecular biology of Adenoviruses. New York: Springer-Verlag, Series title:virology monographs Pina S., Puig M., Lucena F., Jofre J. and Girones R Viral pollution in the environment and in shellfish: human adenovirus detection by PCR as an index of human viruses. Appl Environ Microibol 64, Pollard M. & Connolly J ph stability of MME poliomyelitis. Texas Rept. Biol. Med. 7: Puig M., Jofre J., Lucena F., Allard A., Wadell G. and Girones R Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted water by nested PCR amplification. Appl Environ Microbiol 60,

102 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 135. Pusch D., Oh D.Y., Wolf S., Dumke R., Schroter-Bobsin U., Hohne M., Roske L. and Schreier E Detection of enteric viruses and bacterial indicators in German environmental waters. Arch Virol 150, Qualls R.G., Dorfman M.H. and Johnson J.D Evaluation of the efficiency of ultraviolet disinfection systems. Water Research 23, Rajala R.L., Pulkkanen M., Pessi M., Heinonen-Tanski H Removal of microbes from municipal wastewater effluent by rapid sand filtration and subsequent UV irradiation. Water Science and Technology 47(3), Raphael R.A Long term survival of human rotavirus in raw and treated river water. Can. J. Microbiol. 31(2): Rao V.C., Lakhe S.V., Waghmare S.V. and Dube P Virus removal in activated sludge sewage treatment. Prog. Water Technol. 9: Rao V.C, T.G. Metcalf, and J.L. Melnick Removal of pathogens during wastewater treatment, pp , in: Biotechnology, vol. 8, H.J. Rehm and G.Reed, Eds. VCH, Germany Reynolds K.A Adenovirus: balancing water treatment challenges. On Tap Sair A.I., D Souza D.H. and Jaykus L.A Human enteric viruses as causes of foodborne disease. Compr Rev Food Sci Food Safety 1, Salgot M., Folch M., Huertas E., Tapias J., Avellaneda D., Giros G., Brissaud F., Verges C., Molina J., Pigem J Comparison of different advanced disinfection systems for wastewater reclamation. Water Science and Technology : Water Supply 2(3), Sanchez G., Pinto R.M., Vanaclocha H., Bosch A Molecular characterization of hepatitis A virus isolates from a transcontinental shellfishborne outbreak. J. Clin. Microbiol. 40, Sanchez-Fauquier A., Willhelmi I., Colomina J., Cubero E. and Roman E Diversity of group A human rotavirus types circulating over a 4-year period in Madrid, Spain. J. Clin Microbiol 42,

103 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 146. Sano D., Fukushi K., Yoshida Y. and Omura T Detection of enteric viruses in municipal sewage sludge by a combination of the enzymatic virus elution method and RT-PCR. Water Res 37, Santos F.M., Vieira M.J., Carrafa P., Monezi T.A., Pellizari V.H., Harsi C.M. and Mehnert D.U Discrimination of adenovirus types circulating in urban sewage and surface waters in Sao Paulo city, Brazil. Water Sup 4, Santos N., Soares C.C., Volotao E.M., Albuquerque M.C.M. and Hoshino Y Surveillance of rotavirus strains in Rio de Janeiro, Brazil, from 1997 to J Clin Microbiol 41, Sattar S. A. & Westwood J.C.N Isolation of apparently wild strains of poliovirus type 1 from sewage in the Ottawa area. Journal of the Canadian Medical Association 116, p Schwartzbrod L., Vilagines P., Sarrette R., Vilagines R. and Collomb J Evaluation of the viral population in two wastewater treatment plants: Study of different sampling techniques. Water Res. 19: Shieh Y.S., Wait d. and Sobsey M.D Methods to remove inhibitors in sewage and other fecal wastes for enterovirus detection by the polymerase chain reaction. J Virol Methods 54, Shoko O.N., Tuan A.N., Tung G.P. and Hiroshi U Molecular epidemiology of viral gastroenteritis in Asia. Ped Int 46, Shulman L.M., Handshier R., Yang C.F., Yang S.J., Manor J., Vonsover A., Grossman Z., Pallansch M., Mendelson E. and Kew O.M Resolution of the pathways of poliovirus type 1 transmission during an outbreak. J Clin Microbiol 38, Shuval H.I Thallassogenic Diseases UNEP Regional Seas Reports and Studies No 79, Nairobi: United Nations Environment Programme Siafakas N., Markoulatos P. and Levidiotou-Stefanou S Molecular identification of enteroviruses responsible for an outbreak of aseptic meningitis; implications in clinical practice and epidemiology. Mol Cel Probes 18,

104 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 156. Siafakas N., Markoulatos P. and Stanway G Molecular classification of coxsackie A viruses on the basis of the 5 -UTR: structural and evolutionary aspects. J Mol Evol 55, Smith E.M., Gerba C.P. and Melnick J.L Role of sediment in the persistence of enteroviruses in the estuarine environment. Appl. Environ. Microbiol. 35: Sobsey M.D Studies on the survival and fate of enteroviruses in an experimental model of a municipal solid waste landfill and leachate. Appl. Microbiol. 30(4): Sobsey M.D., Battigelli D.A., Shin G.A. and Newland S RT-PCR amplification detects inactivated viruses in water and wastewater. Wat Sci Technol 38, Sobsey M.D. and Meschke J.S Virus survival in the environment with special attention to survival in sewage droplets and other environmental media of faecal or respiratory origin. Draft August 21, Soule H., Genoulaz O., Gratacap-Cavallier B., Chevallier P., Liou J.X. and Seigneurin J.M Ultrafiltration and reverse transcription-polymerase chain reaction: an efficient process for poliovirus, rotavirus and hepatitis A virus detection in water. Water Res 34, Στάµου Α Βιολογικός Καθαρισµός Αστικών Αϖοβλήτων. Εκδόσεις Παϖασωτηρίου Στάµου Α. και Βογιατζής Ζ.: Βασικές αρχές και σχεδιασµός συστηµάτων εϖεξεργασίας αϖοβλήτων, Β Έκδοση ΤΕΕ, Αθήνα, Stamou A. and Andreadakis A. : Sewage treatment plants in Greece, Proceedings of the first international exhibition and conference of environment technology foe the Mediteranean regions, Heleco-93, Athens, April 1-4, Steele A.D. and Ivanoff B Rotavirus strains circulating in Africa during : emergence of G9 strains and P[6] strains. Vaccine 21, Strikas R.A Temporal and geographic patterns of isolates of Nonpolio enterovirus in the United States, J Infect Dis 153,

105 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 167. Shuval H.I Thalassogenic Diseases, UNEP Regional Seas Reports and Studies No. 79, Nairobi: United Nations Environmental Programme Tao H., Guangmu C., Changan W Waterborne outbreak of rotavirus diarrhoea in adults in China caused by a novel rotavirus. Lancet, 1: Thorn J. and Kerekes E Health effects among employees in sewage treatment plants: a literature survey. Am J Ind Med 40, Toze S PCR and the setection of microbial pathogens in water and wastewater. Wat Sci Technol 33, Tree J.A., Adams M.R. and Lees D Chlorination of indicator bacteria and viruses in primary sewage effluent. Appl Environ Microbiol 69, Torok T.J Visualizing geographic and temporal trends in Rotavirus activity in the United States, Ped Infect Dis 16, Tsai Yu-Li, Sobsey M.D., Sangermano L.R. and Palmer C.J Simple method of concentrating enteroviruses and hepatitis A virus from sewage and ocean water for rapid detection by reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Applied and Environmental Microbiology, 59(10): Tyler J Occurrence in water of viruses of public health significance. J Appl Bacteriol Symp Suppl 14, Tyrrell S.A., Rippey S.R. and Watkins W.D Inactivation of bacterial and viral indicators in secondary sewage effluents, using chlorine and ozone. Wat Res 29, Unicomb L.E., Kilgore P.E. Faruque A.S.G Anticipating rotavirus vaccines: hospital-based surveillance for rotavirus diarrhea and estimates of disease burden in Bangladesh. Pediatr Infect Dis J 16, Vantarakis A. and Papapetropoulou M Detection of enteroviruses, adenoviruses and hepatitis A viruses in raw sewage and treated effluents by nested-pcr. Water Air and Soil Pollution 114: van der Avoort H.G., Hull B., Hovi T., Pallansch M., Kew O., Crainic R., Wood D., Mulders M and van Loon A Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J Clin Microbiol 33,

106 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 179. van der Avoort H.G., Reimerink J.H., Ras A., Muiders M.N. and van Loon A.M Isolation of epidemic poliovirus from sewage during the type outbreak in The Nederlands. Epidemiol Infect 114, van Heerden J., Ehlers M.M., vanzyl W.B. and Grabow W.O.K Incidence of adenoviruses in raw and treated water. Water Res 37, Veschetti E., Cutilli D., Bonadonna L., Briancesco R., Martini C., Cecchini G., Anastasi P., Ottaviani M Pilot-plant comperative study of paracetic acid and sodium hypochlorite wastewater disinfection. Water Research 37: Villena C., El-Senousy W.M., Abad F.X., Pinto R.M. and Bosch A Group A rotavirus in sewage samples from Barcelona and Cairo: emergence of unusual genotypes. Appl Environ Microbiol 69, Villena C., Gabrieli R., Pinto R.M., Guix S., Donia D., Buonomo E., Palombi L., Cenko F., Bino S., Bosch A. and Divizia M A large infantile gastroenteritis outbreak in Albania caused by multiple emerging rotavirus genotypes. Epidemiol Infect 131, Vivier J.C., Ehlers M.M. and Grabow W.O.K Detection of enteroviruses in treated drinking water. Water Res 38, Vivier J.C., Ehlers M.M., Grabow W.O.K. and Havelar A.H Assessment of the risk of infection associated with coxsackie B viruses in drinking water. Water Supply 2, Ward R.L. & Ashley C.S Identification of the virucidal agent in wastewater sludge. Appl. Environ. Microbiol. 38: Wellings F.M Demonstration of solid-associated virus in wastewater and sludge. Appl. Environ. Microbiol. 31(3): West P.A Human pathogenic viruses and parasites: emerging pathogens in the water cycle. J Appl Bacteriol Symp Suppl 70, 107S-114S White S.C., Jernigan E.B. and Venosa A.D A study of operational ultraviolet disinfection equipment at secondary treatment plants. J. Wat. Pollut. Control Fed. 58,

107 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 190. Wilde J., Eiden J. and Yolken Removal of inhibitory substances from human fecal specimens for detection of group A rotaviruses by reverse transcriptase and polymerase chain reactions. J Clin Microbiol 28, Wilhem SW, Jeffrey WH, Suttle CA, and Mitchell DL Estimation of biologically damaging UV levels in marine surface waters with DNA and viral dosimeters. Photochem Photobiol. 76(3): Wilhelmi I., Roman E. and Sanchez-Fauquier A Viruses causing gastroenteritis. Clin Microbiol Infect 9, Wolfe R Ultraviolet light disinfection of potable water. Environ. Sci. Technol. 24, Wong, Derek Adenoviruses. ( Xu L., Harbour D. and McCrae M.A The application of polymerase chain reaction to the detection of rotaviruses in faeces. J Virol Methods 27, Yates M.V. and Yates S.C Modelling microbial fate in the subsurface environment. CRC Critical Reviews in Environmental Control, 17, No Yates M.V Pathogens in reclaimed water. wastewater/pathogens.htm 198. Yolken RH., Franklin CC Gastrointestinal adenovirus : an important cause of morbidity in patients with necrotizing enterocolitis and gastrointestinal surgery. Pediatr. Infect. Dis. 4: Yoshida H., Horie H., Matsuura K., Kitamura T., Hashizume S., Miyamura T Prevalence of vaccine-derived polioviruses in the environment. J. Gen. Virol. 83, Zarnani A.H., Modarres S. Jadali F., Sabahi F., Moazzeni S.M. and Vazirian F Role of rotaviruses in children with acute diarrhea in Tehran, Iran. J Clin Virol 29, Zlateva, K.T., Maes P., Rahman M. and vanranst M Chromatography paper strip sampling of enteric adenoviruses type 40 and 41 positive stool specimens. Virol J 2,

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. ΙΟΙ ΕΝΤΕΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΣΤΑ ΛΥΜΑΤΑ Κατά την εκϖόνηση της ϖαρούσας µελέτης συλλέχθησαν 118 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων κατά την ϖερίοδο αϖό το Σεϖτέµβριο του 2000 έως το Σεϖτέµβριο του Τα λύµατα ϖροέρχονταν αϖό τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας, δύο στο νοµό Αττικής και δύο στο νοµό Αχαΐας. Συγκεκριµένα, όσον αφορά την ϖεριοχή της Αττικής τα δείγµατα ελήφθησαν αϖό τις Μονάδες Εϖεξεργασίας Λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ και της Ψυττάλειας, ενώ όσον αφορά στην ϖεριοχή της Αχαΐας τα δείγµατα ελήφθησαν αϖό το βιολογικό καθαρισµό του Ρίου και αϖό έναν αγωγό λυµάτων της Πάτρας. Τα δείγµατα λαµβάνονταν σε µηνιαία βάση αϖό εξειδικευµένο ϖροσωϖικό του Εργαστηρίου Υγιεινής του Πανεϖιστηµίου Πατρών και µεταφέρονταν στο εργαστήριο για ανάλυση. Σε κάϖοιες ϖεριϖτώσεις δεν ήταν δυνατή η συλλογή των δειγµάτων λόγω ϖροβληµάτων ϖου ϖροέκυϖταν στους σταθµούς δειγµατοληψίας. Όσον αφορά το σταθµό της Ψυττάλειας η δειγµατοληψία ϖραγµατοϖοιήθηκε µέχρι και το Σεϖτέµβριο του Τα δείγµατα των λυµάτων σε ϖρώτη φάση εξετάστηκαν µε τη χρήση µοριακών τεχνικών ( RT- Nested PCR) ως ϖρος την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης. Στην ϖαρούσα µελέτη ϖροκειµένου να εκτιµηθεί η µικροβιολογική ϖοιότητα των µη εϖεξεργασµένων λυµάτων όσον αφορά τους ιούς εϖιλέξαµε τρία είδη ιών εντερικής ϖροέλευσης τα οϖοία αϖασχολούν τη ηµόσια Υγεία καθώς ενέχονται σε ϖεριϖτώσεις υδατογενών εϖιδηµιών σε όλο τον κόσµο. Τα είδη των ιών είναι: α) Εντεροϊοί, β) Αδενοϊοί και γ) Ρότα ιοί. Στον ϖίνακα 10 ϖαρουσιάζονται τα δείγµατα των λυµάτων, η ηµεροµηνία της δειγµατοληψίας, η ϖροέλευσή τους και τα αϖοτελέσµατα της Nested PCR. 78

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΙΙΝΑΚΑΣΣ 1100: Παρουσία Ιών Εντερικής Προέλευσης στα είγµατα Λυµάτων ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ Εντεροϊοί Αδενοϊοί Ρότα ιοί R ΡΙΟ Σεϖ K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ P ΠΑΤΡΑ Οκτ R ΡΙΟ Οκτ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Οκτ K ΚΕΡΕΦΥΤ Νοε P ΠΑΤΡΑ Νοε R ΡΙΟ Νοε PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε K ΚΕΡΕΦΥΤ εκ P ΠΑΤΡΑ εκ R ΡΙΟ εκ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ εκ K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιαν P ΠΑΤΡΑ Ιαν R ΡΙΟ Ιαν PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιαν K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ P ΠΑΤΡΑ Φεβ R ΡΙΟ Φεβ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Φεβ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ P ΠΑΤΡΑ Μαρ R ΡΙΟ Μαρ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αϖρ P ΠΑΤΡΑ Αϖρ R ΡΙΟ Αϖρ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αϖρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ P ΠΑΤΡΑ Μαϊ R ΡΙΟ Μαϊ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαϊ K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουν P ΠΑΤΡΑ Ιουν R ΡΙΟ Ιουν PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουν K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουλ P ΠΑΤΡΑ Ιουλ R ΡΙΟ Ιουλ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουλ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αυγ P ΠΑΤΡΑ Αυγ R ΡΙΟ Αυγ

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ K ΚΕΡΕΦΥΤ Σεϖ P ΠΑΤΡΑ Σεϖ R ΡΙΟ Σεϖ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Σεϖ K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ P ΠΑΤΡΑ Οκτ R ΡΙΟ Οκτ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Οκτ K ΚΕΡΕΦΥΤ Νοε PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε K ΚΕΡΕΦΥΤ εκ P ΠΑΤΡΑ εκ R ΡΙΟ εκ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ εκ K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιαν P ΠΑΤΡΑ Ιαν R ΡΙΟ Ιαν PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιαν K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ P ΠΑΤΡΑ Φεβ R ΡΙΟ Φεβ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Φεβ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ P ΠΑΤΡΑ Μαρ R ΡΙΟ Μαρ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αϖρ P ΠΑΤΡΑ Αϖρ R ΡΙΟ Αϖρ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αϖρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ P ΠΑΤΡΑ Μαϊ R ΡΙΟ Μαϊ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαϊ P ΠΑΤΡΑ Ιουν R ΡΙΟ Ιουν K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουλ P ΠΑΤΡΑ Ιουλ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουλ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αυγ R ΡΙΟ Αυγ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ P ΠΑΤΡΑ Σεϖ R ΡΙΟ Σεϖ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Σεϖ K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ

112 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ P ΠΑΤΡΑ Οκτ R ΡΙΟ Οκτ K ΚΕΡΕΦΥΤ εκ P ΠΑΤΡΑ εκ R ΡΙΟ εκ K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιαν P ΠΑΤΡΑ Ιαν R ΡΙΟ Ιαν K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ P ΠΑΤΡΑ Φεβ R ΡΙΟ Φεβ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ P ΠΑΤΡΑ Μαρ R ΡΙΟ Μαρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αϖρ P ΠΑΤΡΑ Αϖρ R ΡΙΟ Αϖρ K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ P ΠΑΤΡΑ Μαϊ R ΡΙΟ Μαϊ K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουν P ΠΑΤΡΑ Ιουν R ΡΙΟ Ιουν P ΠΑΤΡΑ Ιουλ R ΡΙΟ Ιουλ K ΚΕΡΕΦΥΤ Αυγ K ΚΕΡΕΦΥΤ Σεϖ K : ΚΕΡΕΦΥΤ - R: Ρίο - P: Πάτρα - PS: Ψυττάλεια 81

113 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 1 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 11 : Παρουσία Ιών Εντερικής Προέλευσης στα είγµατα Λυµάτων Παρουσία Ιών Εντερικής Προέλευσης 39% 61% ΘΕΤΙΚΑ ΑΡΝΗΤΙΚΑ Στο διάγραµµα 2 ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) των δειγµάτων ϖου βρέθηκαν θετικά για τρία, δύο και ένα είδος ιού εντερικής ϖροέλευσης. ιαϖιστώνεται ϖως µόνο στο 1% των δειγµάτων ανιχνεύθηκαν και τα τρία είδη ιών εντερικής ϖροέλευσης. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 22 : ιαφορετικά Είδη Ιών Εντερικής Προέλευσης ϖου ανιχνεύθηκαν στα είγµατα Λυµάτων ιαφορετικά είδη ιών στα θετικά δείγµατα λυµάτων 33% 2 ΕΙ Η ΙΩΝ 3 ΕΙ Η ΙΩΝ 66% 1% 1 ΕΙ ΟΣ ΙΟΥ 82

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η δειγµατοληψία έλαβε χώρα κατά τα έτη 2000, 2001, 2002 και Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζεται το ϖοσοστό (%) των θετικών και αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης ανά έτος. Όϖως φαίνεται το έτος 2000 είχαµε το µεγαλύτερο ϖοσοστό θετικών δειγµάτων (85%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 33 : Παρουσία Ιών Εντερικής Προέλευσης στα είγµατα Λυµάτων κατά τα έτη % 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 15% 37% 22% 87% ΘΕΤΙΚΑ 85% 63% 78% 13% 83

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τέλος, στο διάγραµµα 4 φαίνονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών αρνητικών δειγµάτων στους τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας. Στο σταθµό της Ψυττάλειας αϖοµονώθηκαν ιοί εντερικής ϖροέλευσης σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (74%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 44 : Παρουσία Ιών Εντερικής Προέλευσης στους 4 σταθµούς δειγµατοληψίας Αριθµός ειγµάτων 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ΚΕΡΕΦΥΤ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΘΕΤΙΚΑ 62% 59% 52% 74% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 38% 41% 48% 26% 84

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1.Α. Εντεροϊοί Η ϖρώτη κατηγορία ιών εντερικής ϖροέλευσης για την οϖοία εξετάστηκαν τα δείγµατα των λυµάτων είναι οι εντεροϊοί. Μετά τη συµϖύκνωση του δείγµατος και την αϖοµόνωση του γενετικού υλικού των εντεροϊών, εφαρµόστηκε RT- Nested PCR ϖροκειµένου να διαϖιστωθεί η ϖαρουσία των εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων. Στον ϖίνακα 10 ϖαρουσιάζονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR (-αρνητικά, +θετικά) για κάθε δείγµα, ενώ αναφέρονται η ηµεροµηνία και η ϖεριοχή όϖου έλαβε χώρα η δειγµατοληψία. Στο διάγραµµα 5 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών στα δείγµατα των λυµάτων. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 55 : Παρουσία Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων Ποσοστό (%) Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων 24% ΘΕΤΙΚΑ 76% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 85

117 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 6 αϖεικονίζεται η ϖαρουσία των εντεροϊών ανά έτος αϖό το 2000 έως το Όϖως διαϖιστώνεται το µεγαλύτερο ϖοσοστό εντεροϊών αϖοµονώθηκε το 2000 (62%), ενώ κατά το 2003 δεν ανιχνεύθηκαν εντεροϊοί στα δείγµατα λυµάτων ϖου εξετάστηκαν. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 66 : Παρουσία Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων κατά τα έτη % 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 38% 70% 84% 100% ΘΕΤΙΚΑ 62% 30% 16% 0 Η ϖαρουσία των εντεροϊών στους τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας ϖαρουσιάζεται στο διάγραµµα 7. Στο σταθµό της Ψυττάλειας αϖοµονώθηκε το µεγαλύτερο ϖοσοστό εντεροϊών (70%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 77 : Παρουσία Εντεροϊών στους 4 σταθµούς δειγµατοληψίας 100% 80% Αριθµός ειγµάτων(%) 60% 40% 20% 0% ΚΕΡΕΦΥΤ ΠΑΤΡΑ ΡΙΟ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΘΕΤΙΚΑ 22% 19% 25% 70% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 78% 81% 75% 30% 86

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όσον αφορά στην εϖοχιακή κατανοµή των εντεροϊών καθ όλη τη διάρκεια της δειγµατοληψίας αυτή αϖεικονίζεται στο ϖαρακάτω διάγραµµα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 88 : Εϖοχιακή Κατανοµή Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων Αριθµός Θετικών ειγµάτων ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 87

119 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετά την εφαρµογή της Nested-PCR ακολούθησε τυϖοϖοίηση των εντεροϊών ϖου ανιχνεύθηκαν στα δείγµατα λυµάτων. Η µέθοδος τυϖοϖοίησης ϖου εϖιλέχθηκε είναι η Nucleotide Sequencing Analysis η οϖοία ϖραγ- µατοϖοιήθηκε µε τη χρήση αυτόµατου sequencer. Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των εντεροϊών ϖαρουσιάζονται στον ϖίνακα 11. ΠΙΝΑΚΑΣ 11: Τύϖοι Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων ΕΙΓΜΑΤΑ ΛΥΜΑΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΥΠΟΣ ΕΝΤΕΡΟΪΟΥ K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ-00 Poliovirus R ΡΙΟ Οκτ-00 Echovirus P ΠΑΤΡΑ Οκτ-00 Coxsackievirus A P ΠΑΤΡΑ Νοε-00 Enterovirus PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε-00 Porcine enterovirus R ΡΙΟ εκ-00 Echovirus P ΠΑΤΡΑ εκ-00 Enterovirus K ΚΕΡΕΦΥΤ εκ-00 Echovirus R ΡΙΟ Ιαν-01 Enterovirus K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ-01 Coxsackievirus B R ΡΙΟ Μαρ-01 Echovirus K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ-01 Coxsackievirus A PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαρ-01 Enterovirus R ΡΙΟ Μαρ-01 Echovirus P ΠΑΤΡΑ Αϖρ-01 Coxsackievirus A PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αϖρ-01 Echovirus K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ-01 Coxsackievirus B R ΡΙΟ Μαϊ-01 Porcine enterovirus P ΠΑΤΡΑ Ιουν-01 Echovirus R ΡΙΟ Αυγ-01 Echovirus PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ-01 Poliovirus K ΚΕΡΕΦΥΤ Αυγ-01 Poliovirus 2 88

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Σεϖ-01 Poliovirus R ΡΙΟ Σεϖ-01 Coxsackievirus B P ΠΑΤΡΑ Ιαν-02 Enterovirus PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Φεβ-02 Echovirus R ΡΙΟ Φεβ-02 Coxsackievirus B K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ-02 Coxsackievirus B P ΠΑΤΡΑ Μαρ-02 Coxsackievirus B PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ-02 Poliovirus 1 Όϖως φαίνεται στο διάγραµµα 9 συνολικά αϖοµονώθηκαν 13 διαφορετικοί τύϖοι εντεροϊών. Σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (18%) ανιχνεύθηκε ο τύϖος Coxsackie B4. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 99 : Τύϖοι Εντεροϊών στα είγµατα Λυµάτων ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ 10% 13% 3% 7% 3% 13% 3% 18% 3% 3% 7% 7% 10% coxsackievirus A16 echovirus 2 Enterovirus 68 Enterovirus 71 poliovirus 2 poliovirus 1 Porcine enterovirus coxsackievirus A6 Coxsackievirus A9 coxsackievirus B4 coxsackievirus B5 echovirus 30 echovirus 6 89

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 10 αϖεικονίζονται οι τύϖοι των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν σε κάθε σταθµό δειγµατοληψίας. Για ϖαράδειγµα στο σταθµό του Ρίου ανιχνεύθηκαν 6 διαφορετικοί τύϖοι εντεροϊών τα ϖοσοστά των οϖοίων φαίνονται στον ϖίνακα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1100 : Τύϖοι Εντεροϊών στους σταθµούς δειγµατοληψίας ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΠΑΤΡΑ ΡΙΟ ΚΕΡΕΦΥΤ 0% 20% 40% 60% 80% 100% Τύϖοι Εντεροϊών (%) ΚΕΡΕΦΥΤ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Echo virus 6 0% 22,33% 0% 29% Echo virus 30 14% 22,33% 0% 0% Coxsackie virus B5 14% 0% 0% 0% Coxsackie virus B4 29% 22,33% 17% 0% Coxsackievirus A9 0% 0% 17% 0% Coxsackie virus A6 0% 0% 17% 0% Porcine enterovirus 0% 11% 0% 14% Poliovirus 1 0% 0% 0% 29% Poliovirus 2 29% 0% 0% 14% Enterovirus 71 0% 11% 32% 14% Enterovirus 68 0% 0% 17% 0% Echo virus 2 0% 11% 0% 0% Coxsackie virus A16 14% 0% 0% 0% 90

122 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην ϖαρακάτω εικόνα αϖεικονίζεται η ταξινόµηση των εντεροϊών υϖό µορφή δενδρογράµµατος, όϖου φαίνονται οι σχέσεις οµοιότητας και διαφοράς τους. Similarity level (%) είγµα λύµατος Τύπος Εντεροϊού PS (polio 2) òø K (polio 2) òôòòòòòòòòòø K (polio 2) ò ùòòòòòòòòòòòòòòòø PS (polio 1) òòòòòòòòòòò PS (polio 1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ùòòòòòòòòòòòø ùòòòòòø K (coxs B5) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó K (coxs B4) òø ó P (coxs B4) òú ùòòòø R (coxs B4) òú ó ó R (coxs B4) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó ó K (coxs B4) ò ùòòòòò ó P (coxs A6) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòûòòòòòòòòòú ó P (coxs A9) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó ó K (coxs A16)òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó R (entero 71)òø ó PS(entero 71)òú P(entero 71)òôòòòòòòòòòòòø P(entero 71)ò ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòú P (entero 68)òòòòòòòòòòòòò ó PS(p.enter10)òòòòòòòûòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó R (p.enter9) òòòòòòò ó ó PS (echo 6) òø R (echo 6) òú ùò R (echo 6) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó PS (echo 6) ò ó ó K (echo 30) òø ùòòòòòòòòòòòòòòòòò R (echo 30) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó R (echo 30) ò ùòòòòòòò R (echo 2) òûòòòòòòòòòòòòòòòòòòò P (echo 2) ò ó ó ó ó Εικόνα 6 : ενδρόγραµµα αϖεικόνισης οµαδοϖοίησης των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό τα λύµατα βάσει της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας (Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες-Nearest Neighbor/Pearson product-moment correlation coefficient). K: ΚΕΡΕΦΥΤ, P: Πάτρα, R: Ρίο και PS: Ψυττάλεια 91

123 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1.Β. Αδενοϊοί Η δεύτερη κατηγορία ιών εντερικής ϖροέλευσης για την οϖοία εξετάστηκαν τα δείγµατα των λυµάτων είναι οι αδενοϊοί. Μετά τη συµϖύκνωση του δείγµατος και την αϖοµόνωση του γενετικού υλικού των αδενοϊών, εφαρµόστηκε Nested PCR ϖροκειµένου να διαϖιστωθεί η ϖαρουσία των αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων. Στον ϖίνακα 10 ϖαρουσιάζονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR (- αρνητικά, +θετικά) για κάθε δείγµα, ενώ αναφέρονται η ηµεροµηνία και η ϖεριοχή όϖου έλαβε χώρα η δειγµατοληψία. Στο διάγραµµα 11 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία αδενοϊών στα δείγµατα των λυµάτων. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1111 : Παρουσία Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων Ποσοστό % Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων 54% 46% ΘΕΤΙΚΑ ΑΡΝΗΤΙΚΑ 92

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 12 αϖεικονίζεται η ϖαρουσία των αδενοϊών ανά έτος αϖό το 2000 έως το Όϖως διαϖιστώνεται το µεγαλύτερο ϖοσοστό αδενοϊών αϖοµονώθηκε το 2000 (77%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1122 : Παρουσία Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων κατά τα έτη % 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 23% 57% 41% 95% ΘΕΤΙΚΑ 77% 43% 59% 5% Η ϖαρουσία των αδενοϊών στους τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας ϖαρουσιάζεται στο διάγραµµα 13. Στο σταθµό της Ψυττάλειας αϖοµονώθηκε το µεγαλύτερο ϖοσοστό αδενοϊών (65%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1133 : Παρουσία Αδενοϊών στους 4 σταθµούς δειγµατοληψίας Αριθµός ειγµάτων 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ΚΕΡΕΦΥΤ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΘΕΤΙΚΑ 53% 28% 42% 65% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 47% 72% 58% 35% 93

125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όσον αφορά στην εϖοχιακή κατανοµή των αδενοϊών καθ όλη τη διάρκεια της δειγµατοληψίας αυτή αϖεικονίζεται στο ϖαρακάτω διάγραµµα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1144 : Εϖοχιακή Κατανοµή Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων Αριθµός Θετικών ειγµάτων ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 94

126 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετά την εφαρµογή της Nested-PCR ακολούθησε τυϖοϖοίηση των αδενοϊών ϖου ανιχνεύθηκαν στα δείγµατα λυµάτων. Η µέθοδος τυϖοϖοίησης ϖου εϖιλέχθηκε είναι η Nucleotide Sequencing Analysis η οϖοία ϖραγµατοϖοιήθηκε µε τη χρήση αυτόµατου sequencer. Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των αδενοϊών ϖαρουσιάζονται στον ϖίνακα 12. ΠΙΝΑΚΑΣ 12 : Τύϖοι Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων ΕΙΓΜΑΤΑ ΛΥΜΑΤΩΝ ΠΕΡΙΟΧΗ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΥΠΟΣ A ΕΝΟΪΟΥ K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ-00 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Οκτ-00 Ad R ΡΙΟ Οκτ-00 Ad R ΡΙΟ Νοε-00 Ad P ΠΑΤΡΑ Νοε-00 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Νοε-00 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε-00 Ad R ΡΙΟ εκ-00 Ad P ΠΑΤΡΑ εκ-00 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ εκ-00 Ad R ΡΙΟ Ιαν-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιαν-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιαν-01 Ad R ΡΙΟ Φεβ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαρ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Αϖρ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ-01 Ad P ΠΑΤΡΑ Μαϊ-01 Ad P ΠΑΤΡΑ Ιουν-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουν-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουν-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουλ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιουλ-01 Ad P ΠΑΤΡΑ Αυγ-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Σεϖ-01 Ad PS ΠΑΤΡΑ Σεϖ-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε-01 Ad 40 95

127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ Νοε-01 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ εκ-01 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Ιαν-02 Ad R ΡΙΟ Ιαν-02 Ad P ΠΑΤΡΑ Ιαν-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Φεβ-02 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Φεβ-02 Ad P ΠΑΤΡΑ Φεβ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαρ-02 Ad R ΡΙΟ Μαρ-02 Ad PS ΠΑΤΡΑ Μαρ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αϖρ-02 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Αϖρ-02 Ad P ΠΑΤΡΑ Αϖρ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Μαϊ-02 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Μαϊ-02 Ad P ΠΑΤΡΑ Μαϊ-02 Ad P ΠΑΤΡΑ Ιουλ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ιουλ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ-02 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Αυγ-02 Ad PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Σεϖ-02 Ad K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ-02 Ad P ΠΑΤΡΑ εκ-02 Ad R ΡΙΟ Ιαν-03 Ad R ΡΙΟ Μαρ-03 Ad 41 96

128 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όϖως φαίνεται στο διάγραµµα 15 συνολικά αϖοµονώθηκαν 3 διαφορετικοί τύϖοι αδενοϊών. Σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (63%) ανιχνεύθηκε ο τύϖος Ad 41. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1155 : Τύϖοι Αδενοϊών στα είγµατα Λυµάτων ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 2% 35% 63% Ad 40 Ad 41 Ad 2 Στο διάγραµµα 16 αϖεικονίζονται οι τύϖοι των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν σε κάθε σταθµό δειγµατοληψίας. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1166 : Τύϖοι Αδενοϊών στους σταθµούς δειγµατοληψίας ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΠΑΤΡΑ ΡΙΟ ΚΕΡΕΦΥΤ 0% 20% 40% 60% 80% 100% Τύϖοι Αδενοϊών ΚΕΡΕΦΥΤ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Ad2 0% 0% 8% 0% Ad 41 76% 56% 46% 69% Ad 40 24% 44% 46% 31% 97

129 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην ϖαρακάτω εικόνα αϖεικονίζεται η ταξινόµηση των αδενοϊών υϖό µορφή δενδρογράµµατος, όϖου φαίνονται οι σχέσεις οµοιότητας και διαφοράς τους. Similarity level (%) είγµα λύµατος Τύπος Αδενοϊού R (Ad41) òø K (Ad41) òú K (Ad41) òú K (Ad41) òú K (Ad41) òú PS (Ad41) òú K (Ad41) òú K (Ad41) òú R (Ad41) òú PS (Ad41) òú K (Ad41) òú K (Ad41) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø K (Ad41) ò ùòø P (Ad2) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó R (Ad41) òø ó P (Ad41) òú ùòòòòòòòø R (Ad41) òú ó ó PS (Ad41) òú ó ó P (Ad41) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó PS (Ad41) ò R (Ad40) òø ó R (Ad40) òú ó PS (Ad40) òú K (Ad40) òú ó R (Ad40) òú ó P (Ad40) òú ó R (Ad40) òú ó K (Ad40) òú ó P (Ad40) òú ó PS (Ad40) òú P (Ad40) òú ó PS (Ad40) òú K (Ad40) òú ó P (Ad40) òú ó PS (Ad40) òú P (Ad40) òú ó P (Ad40) òú ó K (Ad40) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø ó PS (Ad40) ò ó ó Εικόνα 7 ó ó ó ó ó 98

130 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Similarity level (%) είγµα λύµατος Τύπος Αδενοϊού P (Ad41) òø ó ó PS (Ad41) òú ó ó K (Ad41) òú ùòòòòòòòòòòòú K (Ad41) òú ó ó PS (Ad41) òú ó ó K (Ad41) òú ó ó PS (Ad41) òú ó ó R (Ad41) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó Κ (Ad41) ò ó R (Ad41) òø ó P (Ad41) òú ó P (Ad41) òú ó PS (Ad41) òú PS (Ad41) òú PS (Ad41) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò PS (Ad41) ò ó ó Εικόνα 7 (συνέχεια): ενδρόγραµµα αϖεικόνισης οµαδοϖοίησης των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό τα λύµατα βάσει της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας (Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες-Nearest Neighbor/Pearson product-moment correlation coefficient). K: ΚΕΡΕΦΥΤ, P: Πάτρα, R: Ρίο και PS: Ψυττάλεια 99

131 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1.Γ. Ρότα ιοί Η δεύτερη κατηγορία ιών εντερικής ϖροέλευσης για την οϖοία εξετάστηκαν τα δείγµατα των λυµάτων είναι οι ρότα ιοί. Μετά τη συµϖύκνωση του δείγµατος και την αϖοµόνωση του γενετικού υλικού των ρότα ιών, εφαρµόστηκε Nested PCR ϖροκειµένου να διαϖιστωθεί η ϖαρουσία των ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων. Στον ϖίνακα 10 ϖαρουσιάζονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR (- αρνητικά, +θετικά) για κάθε δείγµα, ενώ αναφέρονται η ηµεροµηνία και η ϖεριοχή όϖου έλαβε χώρα η δειγµατοληψία. Στο διάγραµµα 17 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία ρότα ιών στα δείγµατα των λυµάτων. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1177 : Παρουσία Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων Ποσοστό % Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων 14% 86% ΘΕΤΙΚΑ ΑΡΝΗΤΙΚΑ 100

132 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 18 αϖεικονίζεται η ϖαρουσία των ρότα ιών ανά έτος αϖό το 2000 έως το Όϖως διαϖιστώνεται το µεγαλύτερο ϖοσοστό ρότα ιών αϖοµονώθηκε το 2002 (32%). ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 1188 : Παρουσία Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων κατά τα έτη % 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 100% 91% 68% 95% ΘΕΤΙΚΑ 0% 9% 32% 5% Η ϖαρουσία των ρότα ιών στους τέσσερις σταθµούς δειγµατοληψίας ϖαρουσιάζεται στο διάγραµµα 19. Στο σταθµό του Ρίου αϖοµονώθηκε το µεγαλύτερο ϖοσοστό ρότα ιών (25%). ΙΙΑΓΓΡΑΜΜΑ 1199 : Παρουσία Ρότα ιών στους 4 σταθµούς δειγµατοληψίας 100% 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΚΕΡΕΦΥΤ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΘΕΤΙΚΑ 3% 25% 16% 13% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 97% 75% 84% 87% 101

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όσον αφορά στην εϖοχιακή κατανοµή των ρότα ιών καθ όλη τη διάρκεια της δειγµατοληψίας αυτή αϖεικονίζεται στο ϖαρακάτω διάγραµµα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2200 : Εϖοχιακή Κατανοµή Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων Αριθµός Θετικών ειγµάτων ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ 102

134 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μετά την εφαρµογή της Nested-PCR ακολούθησε τυϖοϖοίηση των ρότα ιών ϖου ανιχνεύθηκαν στα δείγµατα λυµάτων. Η µέθοδος τυϖοϖοίησης ϖου εϖιλέχθηκε είναι η Nucleotide Sequencing Analysis η οϖοία ϖραγµατοϖοιήθηκε µε τη χρήση αυτόµατου sequencer. Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των ρότα ιών ϖαρουσιάζονται στον ϖίνακα 13. ΠΙΝΑΚΑΣ 13 : Τύϖοι Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΥΠΟΣ ΡΟΤΑ ΙΟΥ R ΡΙΟ Αυγ-01 Group A : G K ΚΕΡΕΦΥΤ Οκτ-01 Group A : G PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Νοε-01 Group A : G P ΠΑΤΡΑ εκ-01 Group A : G R ΡΙΟ Ιαν-02 Group A : G P ΡΙΟ Φεβ-02 Group A : G R ΠΑΤΡΑ Φεβ-02 Group A : G P ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αϖρ-02 Group A : G R ΡΙΟ Αϖρ-02 Group A : G PS ΠΑΤΡΑ Αϖρ-02 Group A : G R ΡΙΟ Μαϊ-02 Group A : G P ΠΑΤΡΑ Ιουν-02 Group A : G R ΡΙΟ Ιουν-02 Group A : G P ΠΑΤΡΑ Ιουλ-02 Group A : G PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ Αυγ-02 Group A : G R ΡΙΟ εκ-02 Group A : G R ΡΙΟ Φεβ-03 Group A : G2 103

135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Όϖως φαίνεται στο διάγραµµα 21 συνολικά αϖοµονώθηκαν 2 διαφορετικοί τύϖοι ρότα ιών. Σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (88%) ανιχνεύθηκε ο τύϖος G1. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2211 : Τύϖοι Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων ΤΥΠΟΙ ΡΟΤΑ ΙΩΝ (%) 12% Τύϖος G1 Τύϖος G2 88% Στο διάγραµµα 22 αϖεικονίζονται οι τύϖοι των ρότα ιών ϖου αϖοµονώθηκαν σε κάθε σταθµό δειγµατοληψίας. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2222 : Τύϖοι Ρότα ιών στους σταθµούς δειγµατοληψίας ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΡΙΟ ΠΑΤΡΑ ΚΕΡΕΦΥΤ Τύϖοι Ρότα ιών (%) ΚΕΡΕΦΥΤ ΠΑΤΡΑ ΡΙΟ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ G ,5 0 G ,

136 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στην ϖαρακάτω εικόνα αϖεικονίζεται η ταξινόµηση των ρότα ιών υϖό µορφή δενδρογράµµατος, όϖου φαίνονται οι σχέσεις οµοιότητας και διαφοράς τους. Similarity level % είγµα λύµατος Τύπος Ρότα ιού R (G1) òø R (G1) òú P (G1) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòø P (G1) òú ó PS(G1) ò R (G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòûòòòòòôòø P (G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó ó R (G2) òòòòòòòòòòòòòûòòòòòòòòòòòòòûòòò ó P (G2) òòòòòòòòòòòòò PS(G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó ó R (G1) òø ó ó R (G1) òú ó ó R (G1) òôòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó K(G1) ò R(G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòûòòòø R (G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ùòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò PS(G1) òòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòòò ó ó ó Εικόνα 8 : ενδρόγραµµα αϖεικόνισης οµαδοϖοίησης των ρότα ιών ϖου αϖοµονώθηκαν αϖό τα λύµατα βάσει της νουκλεοτιδικής τους αλληλουχίας (Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες-Nearest Neighbor/Pearson product-moment correlation coefficient). K: ΚΕΡΕΦΥΤ, P: Πάτρα, R: Ρίο και PS: Ψυττάλεια 105

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2. Σταθµοί ειγµατοληψίας 2.Α. ΚΕΡΕΦΥΤ Κατά τη χρονική ϖερίοδο αϖό το Σεϖτέµβριο 2000 έως το Σεϖτέµβριο του 2003 συλλέχθηκαν αϖό τη Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ 32 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων. Τα δείγµατα εξετάστηκαν µε τη µέθοδο Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών. Τα θετικά δείγµατα εν συνεχεία τυϖοϖοιήθηκαν ώστε να ϖιστοϖοιηθεί η ϖαρουσία των ιών στα δείγµατα και να αξιολογηθεί η ϖαρουσία τους στα λύµατα. Στον ϖίνακα 14 ϖαρουσιάζονται αναλυτικά τα δείγµατα των λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό το ΚΕΡΕΦΥΤ και αναφέρονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών κατηγοριών ιών. ΠΙΝΑΚΑΣ 14 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό το ΚΕΡΕΦΥΤ ΕΙΓΜΑΤΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ K Οκτ K Νοε K εκ K Ιαν K Φεβ K Μαρ K Αϖρ K Μαϊ K Ιουν K Ιουλ K Αυγ K Σεϖ K Οκτ K Νοε K εκ

138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ K Ιαν K Φεβ K Μαρ K Αϖρ K Μαϊ K Ιουλ K Αυγ K Οκτ K εκ K Ιαν K Φεβ K Μαρ K Αϖρ K Μαϊ K Ιουν K Αυγ K Σεϖ Στο διάγραµµα 23 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα των λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2233 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ 100% 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 22% 53% 3% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 78% 47% 97% 107

139 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) αϖοµόνωσης των ιών ανά έτος. Όϖως φαίνεται το 2002 ανιχνεύθηκαν στα δείγµατα του ΚΕΡΕΦΥΤ και τα τρία είδη ιών, ενώ το 2003 δεν αϖοµονώθηκαν ιοί αϖό τα λύµατα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2244 :Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ κατά τα έτη % 80% Αριθµός ειγµάτων 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 40% 31% 14% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 60% 61% 86% 0% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 8% 0% 0% Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στο ΚΕΡΕΦΥΤ αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 25. Σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (29%) αϖοµονώθηκαν οι τύϖοι Poliovirus 2 και Coxsackie B4. ΙΙΑΓΓΡΑΜΜΑ 2255 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ Τύϖοι Εντεροϊών (%) 14% 14% 29% 29% 14% Poliovirus 2 Echovirus 30 Coxsackievirus B4 Coxsackievirus A16 Coxsackievirus B5 108

140 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στο ΚΕΡΕΦΥΤ αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 26. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2266 : Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων του ΚΕΡΕΦΥΤ Τύϖοι Αδενοϊών (%) 28% 72% Ad 40 Ad 41 Όσον αφορά στους τύϖους των ρότα ιών στα δείγµατα του ΚΕΡΕΦΥΤ ανιχνεύθηκαν αϖοκλειστικά ρότα ιοί A τύϖου G1. 109

141 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.Β. Ρ ΙΙΟ Κατά τη χρονική ϖερίοδο αϖό το Σεϖτέµβριο 2000 έως το Σεϖτέµβριο του 2003 συλλέχθηκαν αϖό τη Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων του Ρίου 31 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων. Τα δείγµατα εξετάστηκαν µε τη µέθοδο Nested- PCR ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών. Τα θετικά δείγµατα εν συνεχεία τυϖοϖοιήθηκαν ώστε να ϖιστοϖοιηθεί η ϖαρουσία των ιών στα δείγµατα και να αξιολογηθεί η ϖαρουσία τους στα λύµατα. Στον ϖίνακα 15 ϖαρουσιάζονται αναλυτικά τα δείγµατα των λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό το Ρίο και αναφέρονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών κατηγοριών ιών. ΠΙΝΑΚΑΣ 15 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό το ΡΙΟ ΕΙΓΜΑΤΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ R Σεϖ R Οκτ R Νοε R εκ R Ιαν R Φεβ R Μαρ R Αϖρ R Μαϊ R Ιουν R Ιουλ R Αυγ R Σεϖ R Οκτ R εκ R Ιαν R Φεβ R Μαρ R Αϖρ R Μαϊ R Ιουν R Αυγ R Σεϖ R Οκτ R εκ

142 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ R Ιαν R Φεβ R Μαρ R Αϖρ R Μαϊ R Ιουν R Ιουλ Στο διάγραµµα 28 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα των λυµάτων του Ρίου. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2277 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων του ΡΙΟΥ 80% Αριθµός ειγµάτων (%) 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 24% 27% 24% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 76% 73% 76% 111

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) αϖοµόνωσης των ιών ανά έτος. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2288 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων του ΡΙΟΥ κατά τα έτη Αριθός ειγµάτων (%) 80% 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 40% 62% 11% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 60% 25% 22% 67% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 13% 67% 33% Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στο Ρίο αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 29. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 2299 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων του ΡΙΟΥ ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (%) 22% 23% 11% 22% 11% 11% echovirus 30 echovirus 2 enterovirus 71 echovirus 6 Porcine enterovirus 9 coxsackievirus B4 112

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στο Ρίο αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 30. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3300 : Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων του ΡΙΟΥ ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 44% 56% Ad 40 Ad41 Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των ρότα ιών ϖου αϖοµονώθηκαν στο Ρίο αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 31. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3311 : Τύϖοι Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων του ΡΙΟΥ ΤΥΠΟΙ ΡΟΤΑ ΙΩΝ (%) 13% 87% Group A : G1 Group A : G2 113

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.Γ. ΠΑΤΡΑ Κατά τη χρονική ϖερίοδο αϖό το Σεϖτέµβριο 2000 έως το Σεϖτέµβριο του 2003 συλλέχθηκαν αϖό την ϖεριοχή της Πάτρας 32 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων. Τα δείγµατα εξετάστηκαν µε τη µέθοδο Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών. Τα θετικά δείγµατα εν συνεχεία τυϖοϖοιήθηκαν ώστε να ϖιστοϖοιηθεί η ϖαρουσία των ιών στα δείγµατα και να αξιολογηθεί η ϖαρουσία τους στα λύµατα. Στον ϖίνακα 16 ϖαρουσιάζονται αναλυτικά τα δείγµατα των λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό την Πάτρα και αναφέρονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών κατηγοριών ιών. ΠΙΝΑΚΑΣ 16 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό την ΠΑΤΡΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ P Οκτ P Νοε P εκ P Ιαν P Φεβ P Μαρ P Αϖρ P Μαϊ P Ιουν P Ιουλ P Αυγ P Σεϖ P Οκτ P εκ P Ιαν P Φεβ P Μαρ P Αϖρ P Μαϊ P Ιουν P Ιουλ P Σεϖ P Οκτ P εκ

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ P Ιαν P Φεβ P Μαρ P Αϖρ P Μαϊ P Ιουν P Ιουλ Στο διάγραµµα 32 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα των λυµάτων της Πάτρας. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3322 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ 100% 80% Αριθµός ειγµάτων (%) 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 19% 37% 20% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 81% 63% 80% 115

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) αϖοµόνωσης των ιών ανά έτος. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3333 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ κατά τα έτη Αριθµός ειγµάτων (%) 80% 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 60% 20% 15% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 40% 80% 54% 0% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 0 31% 0% Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στην Πάτρα αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 34. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3344 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (%) 14% 14% 14% 14% 14% 30% Coxsackievirus A9 Enterovirus 71 Coxsackievirus A6 Echovirus 2 Enterovirus 68 Coxsackievirus B4 116

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στην Πάτρα αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 35. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3355 : Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 8% 46% 46% Ad 40 Ad 41 Ad 2 Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των ρότα ιών ϖου αϖοµονώθηκαν στην Πάτρα αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 36. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3366 : Τύϖοι Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ ΤΥΠΟΙ ΡΟΤΑ ΙΩΝ (%) 20% 80% Group A : G1 Group A : G2 117

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 2.. ΨΥΤΤΑΛΕ ΙΙΑ Κατά τη χρονική ϖερίοδο αϖό το Σεϖτέµβριο 2000 έως το Σεϖτέµβριο του 2002 συλλέχθηκαν αϖό τη Μονάδα Εϖεξεργασίας Λυµάτων της Ψυττάλειας 23 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων. Τα δείγµατα εξετάστηκαν µε τη µέθοδο Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών. Τα θετικά δείγµατα εν συνεχεία τυϖοϖοιήθηκαν ώστε να ϖιστοϖοιηθεί η ϖαρουσία των ιών στα δείγµατα και να αξιολογηθεί η ϖαρουσία τους στα λύµατα. Στον ϖίνακα 17 ϖαρουσιάζονται αναλυτικά τα δείγµατα των λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό την Ψυττάλεια και αναφέρονται τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών κατηγοριών ιών. ΠΙΝΑΚΑΣ 17 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων ϖου ελήφθησαν αϖό την ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΕΙΓΜΑΤΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑΙΟΙ PS Οκτ PS Νοε PS εκ PS Ιαν PS Φεβ PS Μαρ PS Αϖρ PS Μαϊ PS Ιουν PS Ιουλ PS Αυγ PS Σεϖ PS Οκτ PS Νοε PS εκ PS Ιαν PS Φεβ PS Μαρ PS Αϖρ PS Μαϊ PS Ιουλ PS Αυγ PS Σεϖ

150 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 37 αναφέρονται τα ϖοσοστά (%) των θετικών και των αρνητικών δειγµάτων ως ϖρος την ϖαρουσία εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα των λυµάτων της Ψυττάλειας. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3377 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΨΥΤΤΑΛΕΙΑΣ 100% Αριθµός ειγµάτων (%) 80% 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 30% 65% 13% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 70% 35% 87% Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) αϖοµόνωσης των ιών ανά έτος. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3388 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων της ΨΥΤΤΑΛΕΙΑΣ κατά τα έτη Αριθµός ειγµάτων (%) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ % 63% 0% % 55% 9% % 64% 18% 119

151 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των εντεροϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στην Ψυττάλεια αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 39. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 3399 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΨΥΤΤΑΛΕΙΑΣ ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (%) 29% 14% 14% 29% 14% Porcine enterovirus 10 Enterovirus 71 Poliovirus 2 Poliovirus 1 Echovirus 6 Τα αϖοτελέσµατα της τυϖοϖοίησης των αδενοϊών ϖου αϖοµονώθηκαν στην Ψυττάλεια αϖεικονίζονται στο διάγραµµα 40. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4400 : Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΠΑΤΡΑΣ ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 31% 69% Ad 40 Ad 41 Όσον αφορά στους τύϖους των ρότα ιών στα δείγµατα της ΨΥΤΤΑΛΕΙΑΣ ανιχνεύθηκαν αϖοκλειστικά ρότα ιοί A τύϖου G1. 120

152 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3. ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑΣ 3.Α. ΑΤΤΙΚΗ Στην ϖαρούσα εργασία συλλέχθηκαν αϖό την ϖεριοχή της Αττικής (ΚΕΡΕΦΥΤ-Ψυττάλεια) 55 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων τα οϖοία εξετάστηκαν ως ϖρος την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης (εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών). Τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ϖου εφαρµόστηκε ϖαρουσιάζονται στον ϖίνακα 18. ΠΙΝΑΚΑΣ 18 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΤΤΙΚΗΣ ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ

153 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ PS ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ K ΚΕΡΕΦΥΤ

154 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) των δειγµάτων της Αττικής ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών ειδών ιών εντερικής ϖροέλευσης. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4411 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΤΤΙΚΗΣ 100% 80% Αριθµός ειγµάτων (%) 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 25% 58% 7% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 75% 42% 93% Στο διάγραµµα 42 αϖεικονίζεται η ϖαρουσία των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της Αττικής ανά έτος. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4422 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων της ΑΤΤΙΚΗΣ κατά τα έτη Αριθµός ειγµάτων (%) 80% 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 38% 33% 16% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 62% 59% 73% 0% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 8% 11% 0% 123

155 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 43 ϖαρουσιάζονται οι τύϖοι των εντεροϊών ϖου βρέθηκαν στα λύµατα της Αττικής. Όϖως διαϖιστώνεται σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (22%) ανιχνεύθηκε ο τύϖος Poliovirus 2. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4433 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΤΤΙΚΗΣ ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (%) 14% 7% 7% 7% 22% 15% 14% 7% 7% Coxsackievirus A16 Coxsackievirus B5 Echovirus 30 Coxsackievirus B4 Porcine enterovirus 10 Enterovirus 71 Echovirus 6 Poliovirus 2 Poliovirus 1 Όσον αφορά στους τύϖους των αδενοϊών ϖου ανιχνεύθηκαν στα λύµατα της Αττικής αυτοί αϖεικονίζονται στο ϖαρακάτω διάγραµµα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4444 : Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΤΤΙΚΗΣ ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 28% 72% Ad 41 Ad 40 Τέλος, όσον αφορά στους ρότα ιούς στα λύµατα της Αττικής ανιχνεύθηκε αϖοκλειστικά ο τύϖος G1. 124

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.Β. ΑΧΑΪΑ Στην ϖαρούσα εργασία συλλέχθηκαν αϖό την ϖεριοχή της Αχαΐας (Πάτρα- Ρίο) 63 δείγµατα µη εϖεξεργασµένων λυµάτων τα οϖοία εξετάστηκαν ως ϖρος την ϖαρουσία ιών εντερικής ϖροέλευσης (εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών). Τα αϖοτελέσµατα της Nested-PCR ϖου εφαρµόστηκε ϖαρουσιάζονται στον ϖίνακα 19. ΠΙΝΑΚΑΣ 19 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ ΕΙΓΜΑΤΑ ΠΕΡΙΟΧΗ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ R ΡΙΟ P ΠΑΤΡΑ P ΠΑΤΡΑ R ΡΙΟ

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο ϖαρακάτω διάγραµµα ϖαρουσιάζονται τα ϖοσοστά (%) των δειγµάτων της Αχαΐας ως ϖρος την ϖαρουσία των τριών ειδών ιών εντερικής ϖροέλευσης. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4455 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών (%) στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ 80% Αριθµός ειγµάτων (%) 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 22% 36% 20% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 78% 64% 80% Στο διάγραµµα 46 αϖεικονίζεται η ϖαρουσία των εντεροϊών, αδενοϊών και ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της Αχαΐας ανά έτος. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4466 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ κατά τα έτη Αριθµός ειγµάτων (%) 80% 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 50% 40% 14% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 50% 47% 41% 67% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 13% 45% 33% 127

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στο διάγραµµα 47 ϖαρουσιάζονται οι τύϖοι των εντεροϊών ϖου βρέθηκαν στα λύµατα της Αχαΐας. Όϖως διαϖιστώνεται σε µεγαλύτερο ϖοσοστό (19%) ανιχνεύθηκε ο τύϖος Coxsackie B4. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4477 : Τύϖοι Εντεροϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ ΤΥΠΟΙ ΕΝΤΕΡΟΪΩΝ (%) 6% 6% 6% 13% 13% 19% 6% 13% Echovirus 30 Echovirus 2 Enterovirus 71 Echovirus 6 Porcine enterovirus 9 Coxsackievirus B4 Coxsackievirus A9 Coxsackievirus A6 Enterovirus 68 18% Όσον αφορά στους τύϖους των αδενοϊών ϖου ανιχνεύθηκαν στα λύµατα της Αχαΐας αυτοί αϖεικονίζονται στο ϖαρακάτω διάγραµµα. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4488 :Τύϖοι Αδενοϊών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ ΤΥΠΟΙ Α ΕΝΟΪΩΝ (%) 5% 45% 50% Ad 40 Ad 41 Ad 2 128

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τέλος, στο διάγραµµα 49 ϖαρουσιάζονται οι τύϖοι των ρότα ιών ϖου ανιχνεύθηκαν στα λύµατα της Αχαΐας. ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 4499 : Τύϖοι Ρότα ιών στα δείγµατα λυµάτων της ΑΧΑΪΑΣ ΤΥΠΟΙ ΡΟΤΑ ΙΩΝ (%) 15% 85% Group A : G1 Group A : G2 129

161 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 5500 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στα είγµατα Λυµάτων 100% 80% Αριθµός ειγµάτων (%) 60% 40% 20% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ Α ΕΝΟΪΟΙ ΡΟΤΑ ΙΟΙ ΘΕΤΙΚΑ 24% 47% 14% ΑΡΝΗΤΙΚΑ 76% 53% 86% ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 5511 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών στους 4 σταθµούς δειγµατοληψίας Αριθµός ειγµάτων (%) 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ΚΕΡΕΦΥΤ ΠΑΤΡΑ ΡΙΟ ΨΥΤΤΑΛΕΙΑ ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 22% 19% 24% 30% Α ΕΝΟΪΟΙ 53% 37% 27% 65% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 3% 20% 24% 13% 130

162 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 5522 : Παρουσία Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών κατά τα έτη 2000, 2001, 2002 και Αριθµός ειγµάτων (%) 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% ΕΝΤΕΡΟΪΟΙ 62% 30% 16% 0% Α ΕΝΟΪΟΙ 77% 43% 59% 5% ΡΟΤΑ ΙΟΙ 0% 9% 32% 5% ΙΙΑΓΓΡΡΑΜΜΑ 5533 : Εϖοχιακή Κατανοµή Εντεροϊών, Αδενοϊών και Ρότα ιών. Αριθµός Θετικών ειγµάτων ΦΘΙΝΟΠΩΡΟ ΧΕΙΜΩΝΑΣ ΑΝΟΙΞΗ ΚΑΛΟΚΑΙΡΙ Εντεροϊοί Αδενοϊοί Ρότα ιοί 131

163 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

164 ΠΑΡΑΡ ΤΗΜΑ Εικόνα 9: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 11: αρνητικός µάρτυρας, PS, K, R, P, PS, K, R, P, θετικός µάρτυρας Εικόνα 10: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested- PCR για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 4 έως 13: αρνητικός µάρτυρας, PS, K, R, P, PS, K, K, PS Εικόνα 11: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 10: αρνητικός µάρτυρας, R, P, PS, R, P, PS, R, θετικός µάρτυρας Εικόνα 12: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 9: αρνητικός µάρτυρας, P, P, P, P, P, P, P, P Εικόνα 13: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 2: αρνητικός µάρτυρας, θέση 10: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 3 έως 8: K, PS, P, K, PS, R Εικόνα 14: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 3 έως 12: αρνητικός µάρτυρας, R, R, R, R, R, R, R, R, K 149

165 Π ΑΡΑΡΤΗΜΑ Εικόνα 15: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 3: αρνητικός µάρτυρας, θέση 13: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 4 έως 11: K, K, K, K, K, K, K, K Εικόνα 16: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 2: αρνητικός µάρτυρας, θέση 10: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 3 έως 8: R, P, R, P, K, PS Εικόνα 17: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested- PCR για τους εντεροϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 3: αρνητικός µάρτυρας, θέση 14: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 4 έως 13: P, PS, PS, PS, PS, PS, PS, PS, PS, PS 150

166 ΠΑΡΑΡ ΤΗΜΑ Εικόνα 18: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 11: αρνητικός µάρτυρας, PS, K, R, P, PS, K, R, P, θετικός µάρτυρας Εικόνα 19: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 4 έως 13: αρνητικός µάρτυρας, PS, K, R, P, PS, K, K, PS Εικόνα 20: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 10: αρνητικός µάρτυρας, R, P, PS, R, P, PS, R, θετικός µάρτυρας Εικόνα 21: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 2 έως 9: αρνητικός µάρτυρας, P, P, P, P, P, P, P, P Εικόνα 22: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 2: αρνητικός µάρτυρας, θέση 10: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 3 έως 8: K, PS, P, K, PS, R Εικόνα 23: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 3 έως 12: αρνητικός µάρτυρας, R, R, R, R, R, R, R, R, K 151

167 Π ΑΡΑΡΤΗΜΑ Εικόνα 24: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 3: αρνητικός µάρτυρας, θέση 13: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 4 έως 11: K, K, K, K, K, K, K, K Εικόνα 25: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους αδενοϊούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέση 2: αρνητικός µάρτυρας, θέση 10: θετικός µάρτυρας. Θέσεις 3 έως 8: R, P, R, P, K, PS 152

168 ΠΑΡΑΡ ΤΗΜΑ Εικόνα 26: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested- PCR για τους ρότα ιούς. Θέσεις 1 & 15: DNA ladder 100bp. Θέσεις 10, 12, 13 & 14: θετικοί µάρτυρες Εικόνα 27: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους ρότα ιούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 3 έως 16: αρνητικός µάρτυρας, R, P, R, PS, R, K, P, R, P, R, P, R, θετικός µάρτυρας Εικόνα 28: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους ρότα ιούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 4 έως 16: αρνητικός µάρτυρας, P, PS, P, PS, PS, P, K, PS, R, K, K, θετικός µάρτυρας Εικόνα 29: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους ρότα ιούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 3 έως 16: αρνητικός µάρτυρας, PS, PS, PS, R, K, R, PS, K, K, P, P, PS, θετικός µάρτυρας Εικόνα 30: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων της nested-pcr για τους ρότα ιούς. Θέση 1: DNA ladder 100bp. Θέσεις 3 έως 16: αρνητικός µάρτυρας, P, P, K, P, PS, R, P, P, R, R, K, K, θετικός µάρτυρας 153