Ο ΡΟΛΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΙΣ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗΣ

Transcript

1 1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗΣ A ΜΑΙΕΥΤΙΚΗ-ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Β. ΤΑΡΛΑΤΖΗΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ ΑΡΙΘΜ Ο ΡΟΛΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΙΣ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ ΤΗΣ ΜΕΣΟΚΥΤΤΑΡΙΑΣ ΟΥΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ Π. ΚΟΛΙΟΥΛΗΣ ΜΑΙΕΥΤΗΡΑΣ ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2017

2 2

3 3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΓΡΗΓΟΡΙΟΣ ΓΚΡΙΜΠΙΖΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΕΝΕΛΑΟΣ ΖΑΦΡΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ, ΟΜΟΤΙΜΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ (ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ) ΓΡΗΓΟΡΙΟΣ ΓΚΡΙΜΠΙΖΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΕΝΕΛΑΟΣ ΖΑΦΡΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ ΜΗΛΙΑΡΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΘΕΟΔΩΡΙΔΗΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΑΠΑΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΕΛΕΝΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από την Ιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα». (Νόμος 5343/32, αριθ. 202/2 και ν. 1268/82, αριθ.50/8).

4 4

5 5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΟΣΜΗΤΟΡΑΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΑΚΙΟΥΛΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ Ο ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΤΟΥ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΟΥ ΤΟΜΕΑ O ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΥΡΚΟΣ

6 6

7 7 Στους γονείς μου Περικλή, Αικατερίνη Στη σύζυγό μου Δανάη Στους δασκάλους μου Ι. Μπόντη Β. Ταρλατζή Γ. Γκριμπίζη

8 8

9 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ...σελ. 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...σελ. 15 Κεφάλαιο 1: ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗ...σελ Ιστορική αναδρομή...σελ Επιδημιολογία...σελ Κλινική εικόνα...σελ Αιτιοπαθογένεια...σελ Μελέτες σχετικά με το ρόλο του συστήματος των μεταλλοπρωτεασών στην αιτιοπαθογένεια της αδενομύωσης...σελ Κλινική και ιστολογική ταξινόμηση...σελ Θεραπευτική αντιμετώπιση...σελ. 30 Κεφάλαιο 2: ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ GPCR, KISS-ΠΕΠΤΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΛΛΟ- ΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ...σελ Υποδοχείς συνδεόμενοι με πρωτεϊνη G (GPCR)...σελ KISS-πεπτίνες και υποδοχείς GPCR...σελ KISS-πεπτίνες και μετάσταση κακοήθων νεοπλασιών...σελ KISS-πεπτίνες και πλακουντοποίηση...σελ KISS-πεπτίνες και έκκριση GnRH έναρξη ήβης σελ KISS-πεπτίνες και καταμήνιος κύκλος...σελ KISS-πεπτίνες και μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡ)...σελ. 44 Κεφάλαιο 3: ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ σελ Παθολογική Ανατομική...σελ Ανοσοϊστοχημεία.....σελ. 48 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ...σελ Σκοπός...σελ Υλικό και Μέθοδοι...σελ Ασθενείς που μελετήθηκαν...σελ Μέθοδοι...σελ Ανοσοϊστοχημική μέθοδος...σελ. 53

10 Βαθμολόγηση των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων...σελ Στατιστική Ανάλυση...σελ Αποτελέσματα...σελ Αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής εξέτασης για το KISS-1...σελ Αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής εξέτασης για το TIMP3...σελ Συζήτηση...σελ Περίληψη...σελ Abstract...σελ Βιβλιογραφία...σελ Συντομεύσεις...σελ. 86

11 11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι παθογενετικοί μηχανισμοί της αδενομύωσης παραμένουν σήμερα σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστοι. Στοιχεία από μελέτες υποδεικνύουν ότι αλλαγές στην αγγειογένεση και στην έκφραση ενζύμων που διασπούν την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία, ίσως αποτελούν το υπόβαθρο για την παθογένεια, εξέλιξη και βαρύτητα της αδενομύωσης. Περιορισμένος αριθμός μελετών εστιάζει στην ολοένα και περισσότερο αναδεικνυόμενη συμμετοχή των συστημάτων της αγγειογένεσης, ινωδόλυσης και των μεταλλοπρωτεασών στη νόσο αυτή. Η αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας που προκαλούν τα συστήματα αυτά, αποτελεί προϋπόθεση για την εμφύτευση του αδενομυωσικού ιστού στο μυομήτριο. Η τροποποίηση αυτών των συστημάτων μπορεί να θεωρηθεί ως σημαντική μελλοντική θεραπευτική στρατηγική για την αντιμετώπιση της αδενομύωσης. Ως αδενομύωση ορίζεται η έκτοπη παρουσία ενδομητρίου ανάμεσα στις ίνες του μυομητρίου. Η αδενομύωση έχει ως επακόλουθο τη διάχυτη αύξηση του μεγέθους της μήτρας, που μπορεί να φτάσει να αντιστοιχεί στο μέγεθος εγκύμονος μήτρας έως 12 εβδομάδων κύησης. Μικροσκοπικά, οι εστίες αδενομύωσης εμφανίζονται ως έκτοποι μη-νεοπλασματικοί αδένες μαζί με κύτταρα του στρώματος του ενδομητρίου, που περιβάλλονται από υπερτροφικό και υπερπλαστικό μυομήτριο. Υπολογίζεται, ότι το 80% των ασθενών με αδενομύωση είναι γυναίκες ηλικίας ετών και ότι το 90% είναι πολυτόκες. Περίπου το ένα τρίτο των γυναικών με αδενομύωση παρουσιάζουν συμπτώματα, των οποίων η βαρύτητα σχετίζεται με τον αριθμό των παθολογικών εστιών και την έκταση της διείσδυσης του ενδομητρίου στο μυομήτριο. Από τα συμπτώματα αυτά τα πιο συχνά είναι η μηνορραγία και η δυσμηνόρροια. Περίπου 10% των γυναικών αιτιώνται δυσπαρεύνια. Η υπογονιμότητα φαίνεται ότι αποτελεί λιγότερα συχνό πρόβλημα, λόγω της συχνότερης εμφάνισης της νόσου σε μεγαλύτερες ηλικίες. Δεν είναι ωστόσο ακόμη ξεκάθαρο αν η αδενομύωση είναι σχετικά συχνή και σε μικρότερες ηλικίες, αφού έως πρόσφατα η διάγνωσή της στηριζόταν κυρίως σε ιστολογικά παρασκευάσματα

12 12 υστερεκτομής, ενώ σήμερα στη διαγνωστική προστέθηκαν σύγχρονες απεικονιστικές μέθοδοι και η υστεροσκόπηση. Αξίζει επίσης να σημειωθεί, ότι δεν έχουν ακόμη καθιερωθεί γενικώς αποδεκτά κριτήρια, σε ό,τι αφορά στο ελάχιστο βάθος διείσδυσης του ενδομήτριου στο μυομήτριο, ώστε να τεθεί ιστολογικά η διάγνωση της αδενομύωσης. Η αιτιοπαθογένεια της αδενομύωσης παραμένει ακόμη ασαφής. Πρόσφατες μελέτες καταλήγουν στην υπόθεση ότι προκαλείται από διαταραχή της συνέχειας μεταξύ βασικής στιβάδας του ενδομήτριου και του υποκείμενου μυομητρίου. Η κοινή επιφάνεια ενδομητρίου-μυομητρίου (endometrialmyometrial interface - EMI) έχει μια μοναδική αρχιτεκτονική και λειτουργία: δεν υπάρχει υποβλεννογόνιος χιτώνας και έτσι το μυομήτριο καθίσταται ευάλωτο στη διείσδυση ενδομήτριων αδένων και κυττάρων του στρώματος. Στο μηχανισμό αυτής της διαταραχής της συνέχειας μπορεί να ενέχονται η προηγηθείσα κύηση, ο μηχανικός χειρουργικός τραυματισμός, η γενετική προδιάθεση, η διαταραγμένη τοπική ανοσολογική απάντηση με την εμφάνιση χρόνιας φλεγμονώδους διεργασίας και τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη, δεδομένου ότι η νόσος εμφανίζεται σε αναπαραγωγική ηλικία και υποστρέφεται στην εμμηνόπαυση. Μια άλλη θεωρία υποστηρίζει ότι η αδενομύωση μπορεί να αναπτυχθεί από τη διαφοροποίηση αρχέγονου πολυδύναμου μυλλεριανού ιστού προς λάθος κατεύθυνση. Τα κύτταρα της αδενομύωσης χαρακτηρίζονται από αυξημένη έκφραση επιφανειακών αντιγόνων, μορίων προσκόλλησης, αυξητικών παραγόντων και αυξημένα επίπεδα κυκλοοξυγενάσης/ υπεροξειδικής δισμουτάσης/ ξανθινοξειδάσης. Έχει επίσης βρεθεί, όπως θα αναλυθεί και παρακάτω, ότι από κύτταρα του στρώματος, καθώς και από λευκοκύτταρα, παράγονται μεταλλοπρωτεϊνάσες της θεμέλιας εξωκυττάριας ουσίας (matrix metalloproteinases MMPs), οι οποίες φαίνεται ότι προκαλούν αποσταθεροποίηση των κυτταρικών δομών και των αιμοφόρων αγγείων του ενδομητρίου, με συνέπεια τη δυσλειτουργική αιμορραγία της μήτρας σε περίπτωση υποκείμενης αδενομύωσης. Έτσι, η αδενομύωση αποτελεί μοναδικό παράδειγμα καλοήθους τοπικής διήθησης και κατά συνέπεια θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο για τη μελέτη των μοριακών και γενετικών προϋποθέσεων που

13 13 ενέχονται στην τοπική κυτταρική διείσδυση, που κατεξοχήν λαμβάνει χώρα στον καρκίνο. Τα τελευταία χρόνια, στο πλαίσιο της ακριβέστερης εκτίμησης του βιογενετικού προφίλ της αδενομύωσης, έχει αναπτυχθεί ένα εκτεταμένο πεδίο μελέτης σε γονιδιακό και μοριακό επίπεδο. Οι εξελίξεις στη μοριακή γενετική και η ανάπτυξη τεχνικών τόσο σε επίπεδο γονιδίων, όσο και σε επίπεδο ανίχνευσης μοριακών δεικτών βοήθησαν σημαντικά στην παραπάνω κατεύθυνση. Στο πλαίσιο αυτής της διερεύνησης, πλήθος παραγόντων μελετήθηκαν με ανοσοϊστοχημικές τεχνικές. Σε ό,τι αφορά στη σχέση των μελετούμενων στην παρούσα διατριβή προϊόντων πρωτεϊνικής έκφρασης συγκεκριμένων γονιδίων με την αδενομύωση, λίγα πράγματα είναι γνωστά μέχρι σήμερα. Επιπλέον, μελέτες που να συνδυάζουν το συσχετισμό των παραπάνω γονιδίων με την εμφάνιση της νόσου, καθώς και τον έλεγχο της προγνωστικής τους αξίας δεν απαντώνται στην τρέχουσα βιβλιογραφία. Οι παραπάνω λόγοι και η προτροπή του Καθηγητή κ. Ι. Μπόντη και του Καθηγητή κ. Γ. Γκριμπίζη με ώθησαν στην πραγματοποίηση αυτής της μελέτης με σκοπό την εκτίμηση, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας, της έκφρασης σε πρωτεϊνικό επίπεδο των γονιδίων KISS-1, TGLN και TIMP-3, σε εστίες αδενομύωσης σε σύγκριση με το αντίστοιχο ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο, καθώς και με ενδομήτριο από ασθενείς χωρίς αδενομύωση. Για τεχνικούς λόγους και παρά τις επανειλημμένες προσπάθειες με διαφορετικά αντισώματα κατέστη τελικά δυνατή μόνο η μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης του γονιδίου KISS-1. Η παρούσα μελέτη αποτελείται από το Γενικό και το Ειδικό μέρος. Το πρώτο μέρος έχει χωριστεί σε τρία κεφάλαια ως εξής: Κεφάλαιο 1: ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗ Κεφάλαιο 2: ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ GPCR, KISS-ΠΕΠΤΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΛΛΟ- ΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ Κεφάλαιο 3: ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ

14 14 Στο Ειδικό μέρος αναπτύσσεται η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε, τα αποτελέσματα, η συζήτηση με τα συμπεράσματα, περίληψη της μελέτης και τέλος η βιβλιογραφία. Τη διατριβή αυτή μου ανέθεσαν ο Καθηγητής Μαιευτικής και Γυναικολογίας κ. Ι. Μπόντης, ο Καθηγητής της Μαιευτικής και Γυναικολογίας κ. Γ. Γκριμπίζης και ο Καθηγητής Μαιευτικής και Γυναικολογίας κ. Β. Ταρλατζής, επιστήμονες με παγκόσμια πλέον αναγνώριση. Τους εκφράζω τη βαθιά μου ευγνωμοσύνη, θεωρώ δε μεγάλη τιμή την ευκαιρία που μου έδωσαν να ασχοληθώ με αυτό το ανεξιχνίαστο ακόμη κομμάτι της Γυναικολογίας, το οποίο σήμερα αποτελεί μεγάλο πεδίο έρευνας, και τους ευχαριστώ για την εμπιστοσύνη που μου έδειξαν, αλλά και τη συνεχή συμπαράστασή τους κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της μελέτης. Αισθάνομαι επίσης, την ανάγκη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Καθηγητή του Α.Τ.Ε.Ι.Θ. κ. Μ. Ζαφράκα για την ουσιαστική υποστήριξή του σε ό,τι αφορά στο εργαστηριακό μέρος της μελέτης, την καθοδήγησή του στη συγγραφή και ανακοίνωση τόσο της μελέτης όσο και επιστημονικών ανακοινώσεων. Θα ήταν παράλειψη να μην ευχαριστήσω τον Καθηγητή Ιστολογίας/ Εμβρυολογίας κ. Δ. Μηλιαρά για την βοήθειά του στην υλοποίηση του εργαστηριακού μέρους της μελέτης και τη συνεχή υποστήριξή του.

15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15

16 16

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗ 17

18 18

19 Ιστορική αναδρομή Ορισμένοι συγγραφείς πιθανολογούν ότι υπάρχουν πρώιμες αναφορές ήδη από τα τέλη του 17 ου αιώνα και τις αρχές του 18 ου αιώνα στον ευρωπαϊκό χώρο, για τις νόσους που σήμερα ονομάζονται ενδομητρίωση και αδενομύωση. Ωστόσο, η πρώτη περιγραφή της αδενομύωσης προέρχεται από τον Γερμανό Παθολογοανατόμο Carl von Rokitansky, το έτος 1860, ο οποίος χρησιμοποίησε τον όρο «αδενομύωμα». Ο Rokitansky διαπίστωσε την ύπαρξη αδένων ενδομητρίου στο μυομήτριο και ονόμασε το εύρημα αυτό «αδενοειδές κυστεοσάρκωμα της μήτρας» ( cystosarcoma adenoids uterinum ). Κατά τα επόμενα 50 χρόνια, το «αδενομύωμα» (όπως και η ενδομητρίωση) θεωρείτο ως μία παθολογική κατάσταση σχετιζόμενη με τις «αιμορραγικές ωοθηκικές κύστεις», έως ότου το 1921 αναγνωρίστηκε η ενδομητρική προέλευση της νόσου [1]. Η πρώτη συστηματική περιγραφή της νόσου που ονομάζουμε σήμερα αδενομύωση έγινε από τον Thomas Stephen Cullen, ο οποίος στα τέλη του 19 ου αιώνα διερεύνησε πλήρως την «διείσδυση του βλεννογόνου» σε διάφορα σημεία της κατώτερης περιτοναϊκής κοιλότητας, κάτι που είχε παρατηρηθεί και από άλλους ερευνητές. Ο Cullen αναγνώρισε τη διείσδυση «βλεννογόνου του ενδομητρίου» στο επιθήλιο των ιστών και διατύπωσε την πρώτη υπόθεση για τον μηχανισμό μέσω του οποίου ο βλεννογόνος διηθεί τους υποκείμενους ιστούς [1]. Το 1925, δύο έτη πριν την καθιέρωση του όρου «ενδομητρίωση» από τον Sampson, ο Frankl ονόμασε τη διείσδυση του ενδομητρίου στο μυομήτριο adenomyosis uteri και περιέγραψε επακριβώς την ανατομική εικόνα. Ο ίδιος αναφέρει: «επέλεξα την ονομασία αδενομύωση, η οποία δεν υποδηλώνει κάποια φλεγμονώδη διεργασία, όπως οι όροι αδενομητρίτις, αδενομυοσίτις, αδενομυομητρίτις...» [1]. Ο σύγχρονος ορισμός της αδενομύωσης καθιερώθηκε τελικά το 1972 από τον Bird: «Ως αδενομύωση ορίζεται η καλοήθης διείσδυση ενδομητρίου στο μυομήτριο, με αποτέλεσμα τη διάχυτη αύξηση του μεγέθους της μήτρας, στην οποία μικροσκοπικά οι εστίες αδενομύωσης εμφανίζονται ως έκτοποι μηνεοπλασματικοί αδένες ενδομητρίου και στρώματος που περιβάλλονται από υπερτροφικό και υπερπλαστικό μυομήτριο» [1].

20 Επιδημιολογία Μέχρι πρόσφατα, η διάγνωση της αδενομύωσης βασιζόταν αποκλειστικά στην ιστολογική εξέταση παρασκευασμάτων υστερεκτομής. Αυτό είχε και έχει ως συνέπεια τη δυσχερή εκτίμηση του επιπολασμού της νόσου στο γενικό πληθυσμό και της κλινικής της σημασίας. Η δυσκολία αυτή έγκειται στο γεγονός ότι η ιστολογική τεκμηρίωση της διάγνωσης της νόσου είναι δυνατή μόνο σε ασθενείς που έχουν κάποια ένδειξη για υστερεκτομή [2]. Μάλιστα, η μείωση του αριθμού των υστερεκτομών για καλοήθη νόσο, που παρατηρείται τα τελευταία χρόνια, επέτεινε το φαινόμενο αυτό [3]. Επιπρόσθετα, η έλλειψη ομοιογένειας και ακρίβειας σε ό,τι αφορά τα ιστολογικά κριτήρια για τη διάγνωση της αδενομύωσης, δημιουργεί αμφιβολία σχετικά με την επαναληψιμότητα της ιστολογικής διάγνωσης της νόσου. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει και τις διαφορές του επιπολασμού τις νόσου ανάμεσα σε διάφορες μελέτες [4]. Το αποτέλεσμα είναι ότι δεν υπάρχουν ακόμη ξεκάθαρα δεδομένα σχετικά με τον επιπολασμό της αδενομύωσης, τόσο στο γενικό πληθυσμό όσο και στο επίπεδο μεμονωμένων γυναικολογικών κλινικών, καθώς οι περισσότερες μελέτες αφορούν ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή [5]. Η συνεχής βελτίωση των απεικονιστικών μεθόδων, ιδιαίτερα της υπερηχογραφίας με την εισαγωγή του διακολπικού υπερηχογραφήματος και της μαγνητικής τομογραφίας της πυέλου, καθώς και η καθιέρωση γενικώς αποδεκτών κριτηρίων διάγνωσης, αναμένεται να βελτιώσουν τη διαγνωστική ακρίβεια στο εγγύς μέλλον.

21 Κλινική εικόνα Περίπου τα δύο τρίτα των γυναικών με αδενομύωση παρουσιάζουν συμπτώματα, η βαρύτητα των οποίων σχετίζεται με τον αριθμό των παθολογικών εστιών και την έκταση της διείσδυσης του ενδομητρίου στο μυομήτριο. Από τα συμπτώματα αυτά τα πιο συχνά είναι η μηνομητρορραγία, η δυσμηνόρροια και το χρόνιο πυελικό άλγος. Περίπου 10% των γυναικών αιτιώνται άλγος κατά τη σεξουαλική επαφή (δυσπαρεύνια). Η επιφανειακή αδενομύωση πιστεύεται πως εκφράζεται συνηθέστερα με ανώμαλη αιμορραγία από τη μήτρα, ενώ η εν τω βάθει με πυελικό άλγος, βαρύτερες μηνομητρορραγίες ή και δυσπαρεύνια [6, 7]. Η υπογονιμότητα φαινόταν έως πρόσφατα να αποτελεί λιγότερα συχνό πρόβλημα, λόγω της συχνότερης εμφάνισης της αδενομύωσης σε μεγαλύτερες ηλικίες. Ωστόσο δεν είναι ακόμη ξεκάθαρο εάν η αδενομύωση είναι σχετικά συχνή και σε μικρότερες ηλικίες, καθώς η διάγνωση στηριζόταν, όπως προαναφέρθηκε, σε ιστολογικά παρασκευάσματα υστερεκτομής [6]. Μελέτες σε ασθενείς με αδενομύωση, τόσο στο ενδομήτριο εντός της ενδομήτριας κοιλότητας (που αναφέρεται συχνά ως ορθότοπο ή εύτοπο ενδομήτριο) όσο και στο έκτοπο ενδομήτριο στις εστίες αδενομύωσης έδειξαν στοιχεία που συνηγορούν για επηρεασμένη λειτουργικότητα και υποδεκτικότητα του ενδομητρίου στις ασθενείς αυτές. Τα ευρήματα αυτά είναι μια έμμεση ένδειξη του συσχετισμού της αδενομύωσης με την υπογονιμότητα. Αυτό όμως θα πρέπει ακόμη να αποδειχθεί μέσα από συστηματοποιημένη κλινική έρευνα [8]. Κατά την κλινική εξέταση, η μήτρα μπορεί να βρεθεί ομότιμα και σφαιρικώς διογκωμένη, ενώ η μετακίνησή της μπορεί να είναι επώδυνη. Την κλινική υποψία θα έρθει να συμπληρώσει και να επιβεβαιώσει αρχικά ο απεικονιστικός έλεγχος με το διακολπικό υπερηχογράφημα της πυέλου. Σε περίπτωση αμφιβολίας, κυρίως όταν υπάρχει διαφοροδιαγνωστικός προβληματισμός για την ύπαρξη λειομυώματων ή υπερτροφίας του ενδομητρίου, η περαιτέρω διάγνωση συμπληρώνεται με την μαγνητική τομογραφία της πυέλου και την υδροϋπερηχογραφία. Η υστερο-σαλπιγγογραφία δεν ενδείκνυται πλέον σε αυτές τις περιπτώσεις [7].

22 Αιτιοπαθογένεια Η αιτιοπαθογένεια της αδενομύωσης παραμένει ακόμη ασαφής. Υπολογίζεται, ότι το 80% των ασθενών με αδενομύωση είναι γυναίκες ηλικίας 40 έως 50 ετών και ότι το 90% είναι πολυτόκες. Πρόσφατες μελέτες καταλήγουν στην υπόθεση ότι προκαλείται από διαταραχή της συνέχειας μεταξύ της βασικής μεμβράνης του ενδομητρίου και του υποκείμενου μυομητρίου. Η κοινή επιφάνεια ενδομητρίου-μυομητρίου, που διεθνώς αναφέρεται ως ΕΜΙ (endometrial-myometrial interface) έχει μια μοναδική αρχιτεκτονική και λειτουργία: Δεν υπάρχει υποβλεννογόνιος χιτώνας και έτσι το μυομήτριο καθίσταται ευάλωτο στη διείσδυση ενδομήτριων αδένων και κυττάρων του στρώματος [9, 10]. Στο μηχανισμό αυτής της διαταραχής της συνέχειας μπορεί να ενέχονται η προηγηθείσα κύηση, ο μηχανικός χειρουργικός τραυματισμός, η γενετική προδιάθεση, η διαταραγμένη τοπική ανοσολογική απάντηση με την εμφάνιση χρόνιας φλεγμονώδους διεργασίας και τα οιστρογόνα και η προγεστερόνη, δεδομένου ότι η νόσος εμφανίζεται σε αναπαραγωγική ηλικία και υποστρέφεται στην εμμηνόπαυση [11-14]. Μια άλλη θεωρία υποστηρίζει ότι η αδενομύωση μπορεί να αναπτυχθεί από τη διαφοροποίηση αρχέγονου πολυδύναμου μυλλεριανού ιστού προς λάθος κατεύθυνση [15]. Από την άλλη πλευρά, υπάρχουν πειραματικές μελέτες σε πειραματόζωα, στις οποίες η τεχνητή διαταραχή της έσω στιβάδας του μυομητρϊου (λέπτυνση, διακοπή συνέχειας, αποδιοργάνωση δομών) δεν προκάλεσε την εμφάνιση αδενομύωσης [16]. Επιπλέον, σε πρόσφατες μελέτες δεν βρέθηκε καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ αδενομύωσης και προηγηθείσας καισαρικής τομής, απόξεσης ενδομητρίου ή αναρροφητικής κένωσης της μήτρας η μόνη στατιστικά συσχετιζόμενη μεταβλητή ήταν η παρουσία υπερπλασίας του ενδομητρίου κατά την υστερεκτομή [17, 18]. Η υπερηχογραφία με μαγνητοσκόπηση (videosonography) [18, 19] και διάφορα πειραματικά δεδομένα δείχνουν να υπάρχει μία τροποποιημένη συσταλτικότητα του μυομητρίου στην ενδομητρίωση συγκεκριμένα, υπέρμετρη, έκτοπης προελεύσεως, ανώμαλη ή ατελής διάδοση του κύματος [20]. Για την αδενομύωση δεν υπάρχουν ακόμη παρόμοιες έρευνες επάνω στη συσταλτικότητα του μυομητρίου. Έχουν όμως προταθεί παρακρινικοί

23 23 μηχανισμοί, σύμφωνα με τους οποίους η τοπική παραγωγή οιστρογόνων επιφέρει παθολογική συσταλτικότητα, με επακόλουθο αυτοτραυματισμό των ιστών της μήτρας, που έχουν ως συνέπεια την αποκόλληση τμημάτων της βασικής μεμβράνης του ενδομητρίου και τη διείσδυσή του ενδομητρίου στο υποκείμενο μυομήτριο [21]. Η αδενομύωση φαίνεται να επηρεάζεται από τα επίπεδα των στεροειδών ορμονών. Σε μελέτες παρατήρησης της περισταλτικότητας του μυομητρίου με μαγνητοσκόπηση λήψεων με μαγνητική τομογραφία και υπερηχογραφία παρατηρήθηκαν κυκλικές αλλαγές της ζώνης σύναψης (junctional zone) μεταξύ ενδομητρίου και μυομητρίου. Στην αιτιοπαθογένεια της αδενομύωσης ενοχοποιούνται τα αυξημένα επίπεδα οιστρογόνων και μάλιστα περισσότερο σε τοπικό παρά σε συστηματικό επίπεδο δράσεως. Για παράδειγμα έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα οιστραδιόλης στο αίμα της εμμήνου ρύσεως γυναικών με αδενομύωση, όχι όμως και στο περιφερικό τους αίμα. Η αυξημένη έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων τύπου βήτα και η έλλειψη έκφρασης των προγεστερονικών υποδοχέων ίσως να σχετίζονται με την ανάπτυξη ή και την πρόοδο της νόσου και μπορεί έτσι να εξηγείται η πτωχή ανταπόκριση της αδενομύωσης σε προγεσταγόνα [18]. Τα κύτταρα της αδενομύωσης χαρακτηρίζονται από αυξημένη έκφραση επιφανειακών αντιγόνων, μορίων προσκόλλησης, αυξητικών παραγόντων και αυξημένα επίπεδα κυκλοοξυγενάσης/ υπεροξειδικής δισμουτάσης/ ξανθινοξειδάσης [22-25]. Έχει επίσης βρεθεί ότι κύτταρα του στρώματος, καθώς και λευκοκύτταρα, παράγουν μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας διάμεσης ουσίας (matrix metalloproteinases MMPs), οι οποίες φαίνεται ότι προκαλούν αποσταθεροποίηση των κυτταρικών δομών και των αιμοφόρων αγγείων του ενδομητρίου, με συνέπεια τη δυσλειτουργική αιμορραγία της μήτρας σε περίπτωση υποκείμενης αδενομύωσης. Μελέτες έχουν δείξει ότι η αυξημένη διεισδυτικότητα των κυττάρων του στρώματος στην εξωκυττάρια διάμεση ουσία σχετίζεται με την ανάπτυξη της αδενομύωσης [26]. Σπουδαίο ρόλο φαίνεται να παίζουν οι μεταλλοπρωτεάσες ή μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs matrix metalloproteases or metalloproteinases), πέρα από τη διείσδυση του ενδομήτριου ιστού στο υποκείμενο μυομήτριο και στη νεοαγγειογένεση στις αδενομυωσικές εστίες 27.

24 24 Επίσης, κάποιο ρόλο ενδεχομένως να παίζει και το σύστημα του πλασμινογόνου [27]. Το σύστημα των MMPs αποτελείται από ένα ενζυμικό στοιχείο, τις MMPs, καθώς και από ένα ανασταλτικό στοιχείο των ενζύμων, τους ιστικούς αναστολείς των μεταλλοπρωτεασών, τους TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteases) [28]. Πρόκειται για μια ομάδα πρωτεολυτικών ενζύμων που μπορούν να διασπάσουν τα συστατικά στοιχεία της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού, που λαμβάνει χώρα κατά τη διείσδυση και μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [29]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το σύστημα των MMPs παίζει καθοριστικό ρόλο στη φυσιολογική εξέλιξη και ανάπτυξη του ενδομητρίου μέσω μιας κυκλικής έκφρασης [30], η οποία κορυφώνεται με την εμμηνορρυσία [31], κατά την οποία το ενδομήτριο αποπίπτει [32]. Εξαιτίας της αναγκαιότητας για ισορροπία ανάμεσα στις MMPs και στους TIMPs, δεν είναι παράξενο που μια διαταραγμένη έκφραση των MMPs και των TIMPs σχετίζεται με την παθοφυσιολογία πολλών νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένης ενδεχομένως και της αδενομύωσης. Έτσι έχει προταθεί πως μία παρέμβαση στο σύστημα των MMPs ικανή να περιορίσει ή να προλάβει τις διαδικασίες διείσδυσης που απαιτούνται για την ανάπτυξη ή και την εξέλιξη τέτοιων νοσημάτων, ίσως να άνοιγε νέους δρόμους στη φαρμακευτική αντιμετώπισή τους [28]. Επίσης, περιγράφεται ότι το σύστημα του πλασμινογόνου διασπά με πρωτεολυτική δράση την εξωκυττάρια θεμέλια ουσία και ρυθμίζει την ενεργοποίηση των MMPs και αυξητικών παραγόντων, συμμετέχοντας έτσι τόσο σε φυσιολογικές διαδικασίες όσο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η θρόμβωση, η αρτηριοσκλήρωση, η ενδομητρίωση, ο καρκίνος και ίσως και η αδενομύωση [33].

25 Μελέτες σχετικά με το ρόλο του συστήματος των μεταλλοπρωτεασών στην αιτιοπαθογένεια της αδενομύωσης Οι Matsuda και συνεργάτες [26] μελέτησαν τη διεισδυτικότητα των κυττάρων του στρώματος στα διάφορα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, εξετάζοντας διαφορές στην έκφραση των MMPs σε επίπεδο mrna μεταξύ αδενομυωσικού και φυσιολογικού μυομητρικού ιστού επίμυων in vitro, καθώς και την επίδραση ενός αναστολέα των MMPs στη διεισδυτικότητα αυτή. Η αδενομύωση προκλήθηκε πειραματικώς με αυτόλογη μεταμόσχευση και η έκφραση των ΜΜΡs μετρήθηκε με τη βοήθεια αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (polymerase chain reaction - PCR), dot blot υβριδισμού και ζυμογραφίας. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα του στρώματος σε αδενομυωσικό ιστό είχαν σαφώς μεγαλύτερη διεισδυτικότητα στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία από αυτά του φυσιολογικού μυομητρίου, ενώ ο αναστολέας των MMPs εμπόδιζε το φαινόμενο αυτό. Η έκφραση της MMP-14 σε επίπεδο mrna βρέθηκε αυξημένη στους αδενομυωσικούς ιστούς [26]. Σε παρόμοια μελέτη οι Mori και συνεργάτες [34], διαπίστωσαν καταστολή της περαιτέρω διείσδυσης-επέκτασης του αδενομυωσικού ιστού σε επίμυες με αδενομύωση που σιτίζονταν με τροφή που περιείχε ΟΝΟ-4817, έναν αναστολέα των MMPs. Επίσης, παρατηρήθηκαν μικρότερα ποσοστά εμφάνισης αδενομύωσης στην ομάδα που είχε υποστεί αυτόλογη μεταμόσχευση και τρέφονταν με τροφή περιεκτικότητας από 0,1 έως 1,0% σε ΟΝΟ-4817, συγκριτικά με την ομάδα που μετά τη μεταμόσχευση σιτιζόταν με κανονική τροφή. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν ένδειξη ότι ο αναστολέας ΟΝΟ-4817, ίσως αναστέλλει και την ανάπτυξη της αδενομύωσης [34]. Οι Li και συνεργάτες [27] μελέτησαν τη σχέση της έκφρασης των MMP- 2 και MMP-9 με την αγγειογένεση που παρατηρείται στην αδενομύωση. Η μελέτη έγινε σε ιστολογικά παρασκευάσματα υστερεκτομών από γυναίκες με και χωρίς αδενομύωση. Με ανοσοϊστοχημική ανάλυση αξιολογήθηκαν η έκφραση των MMP-2 και MMP-9, ο αυξητικός παράγων του αγγειακού ενδοθηλίου (VEGF vascular endothelial growth factor) και η μικροαγγειακή πυκνότητα (MVD microvessel density). Η έκφραση των MMP-2, MMP-9 και VEGF βρέθηκε αυξημένη σε ασθενείς με αδενομύωση, τόσο στο φυσιολογικό ενδομήτριο όσο και στις αδενομυωσικές εστίες, σε σύγκριση με το ενδομήτριο

26 26 φυσιολογικών γυναικών. Η μικροαγγειακή πυκνότητα ήταν αυξημένη στο έκτοπο ενδομήτριο συγκριτικά με το «εύτοπο» αδενομυωσικό ή μη. Ακόμη, στην αδενομύωση διαπιστώθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ VEGF και MMP-2, VEGF και MMP-9, καθώς και μεταξύ μικροαγγειακής πυκνότητας και MMP-2 και μικροαγγειακής πυκνότητας και MMP-9. Συμπερασματικά φαίνεται ότι η αυξημένη έκφραση των MMP-2 και MMP-9 συσχετίζεται πιθανόν με την ανάπτυξη αδενομύωσης, επάγοντας τη διείσδυση του ενδομητρίου στο μυομήτριο και την αγγειογένεση στις αδενομυωσικές εστίες [27]. Οι Inagaki και συνεργάτες [35] διαπίστωσαν αυξημένα επίπεδα MMPs και κυτοκινών (ιντερλευκίνης-1β, TNF-α, γ-ιντερφερόνης και TGF-β1) στην ενδομήτρια κοιλότητα ασθενών με αδενομύωση, ινομυώματα ή ενδομήτριο πολύποδα. Τα δείγματα ελήφθησαν με έκπλυση της ενδομήτριας κοιλότητας γυναικών με μία από τις ανωτέρω παθολογικές οντότητες και έγινε σύγκριση με δείγματα από υγιείς γυναίκες. Τα επίπεδα των MMPs ανιχνεύθηκαν με ζυμογραφία, και για τις κυτοκίνες χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ELISA. Διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων των MMP-2 και -9 σε γυναίκες με αδενομύωση, ινομυώματα και ενδομήτριο πολύποδα συγκριτικά με τις γυναίκες-μάρτυρες, ενώ τα επίπεδα των κυτοκινών βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα μόνο στις γυναίκες που έπασχαν από αδενομύωση [35]. Σε μία άλλη μελέτη, ο Kobayashi [36] μελέτησε την έκφραση του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase-type plasminogen activator - upa) και του υποδοχέα αυτού (upa receptor upar) σε κύτταρα του στρώματος και του επιθηλίου, από εύτοπο και έκτοπο ενδομήτριο γυναικών με αδενομύωση. Με χρήση Western blot και ζυμογραφίας διαπιστώθηκε ότι τα έκτοπα κύτταρα εμφάνιζαν 12-πλάσια έκκριση upa-αντιγόνου και τετραπλάσια έκφραση upar-υποδοχέων, σε σύγκριση με τα κύτταρα που διατηρούσαν τη θέση τους στο ενδομήτριο. Τα ευρήματα αυτά καταδεικνύουν μια πιθανή συσχέτιση της υπερέκφρασης των upar-υποδοχέων από τα επιθηλιακά κύτταρα και της υπερέκκρισης του upaαντιγόνου από τα κύτταρα του στρώματος με τη διεισδυτική τάση που έχει το έκτοπο ενδομήτριο στην αδενομύωση [36]. Οι Kang και συνεργάτες [37] διερεύνησαν τη σχέση ανάπτυξης της αδενομύωσης με τον πολυμορφισμό της περιοχής του προαγωγέα γονιδίων

27 27 των MMP-2 και TIMP-2 με τη βοήθεια PCR-RFLP (polymerase chain reaction-- restriction fragment length polymorphism αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πολυμορφισμοί μεγέθους περιοριστικών τεμαχίων DNA). Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από γυναίκες με αδενομύωση και χωρίς αδενομύωση. Κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι ο πολυμορφισμός MMP C/T σχετίζεται με την ανάπτυξη αδενομύωσης [37]. Στην ίδια διαπίστωση κατέληξαν οι Shan και συνεργάτες [38] μελετώντας αυτή τη φορά τον πολυμορφισμό MMP-7-181A/G. Έτσι, η αδενομύωση αποτελεί μοναδικό παράδειγμα καλοήθους τοπικής διήθησης και κατά συνέπεια θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μοντέλο για την μελέτη των μοριακών και γενετικών προϋποθέσεων που ενέχονται στην τοπική κυτταρική διείσδυση, που κατεξοχήν λαμβάνει χώρα στον καρκίνο.

28 Κλινική και ιστολογική ταξινόμηση Λαμβάνοντας υπόψη τα ιστολογικά χαρακτηριστικά και την έκταση της διείσδυσης στο μυομήτριο, η αδενομύωση δύναται να κατηγοριοποιηθεί ως εξής [39]: 1) Διάχυτη αδενομύωση. Χαρακτηρίζεται από εστίες ενδομητρίου (αδένες και στρώμα) διάσπαρτες σε όλο το μυομήτριο. 2) Εστιακή αδενομύωση. Μια εντοπισμένη περιοχή υπερτροφικού και μορφολογικά διαταραγμένου ενδομητρίου και μυομητρίου, ενσωματωμένη συνήθως στο μυομήτριο. Η ιστολογική εικόνα διαφέρει από ασθενή σε ασθενή, από σχεδόν συμπαγή έως και κυστική. Έτσι η εστιακή αδενομύωση θα μπορούσε να διαχωριστεί σε: α) Αδενομύωμα: Διήθηση περιορισμένης περιοχής μυομητρίου με σαφή όρια και συμπαγή κυρίως χαρακτηριστικά. β) Κυστική αδενομύωση: Ακραία μορφή που χαρακτηρίζεται από την παρουσία μονήρους αδενομυωσικής κύστεως στο μυομήτριο. Σε γυναίκες ηλικίας κάτω των 30 ετών, η μορφή αυτή ονομάζεται νεανική κυστική αδενομύωση και έχει πέραν της ηλικίας ως απαιτούμενα κριτήρια διάγνωσης τη βαριά δυσμηνόρροια και μέγεθος της σαφώς αφοριζόμενης κύστεως >1cm. 3) Πολυποειδή αδενομυώματα: Περιγεγραμμένες ενδομήτριες μάζες, αποτελούμενες κυρίως από αδένες ενδομητρίου και στρώμα με κύριο συστατικό του τις λείες μυϊκές ίνες. α) Τυπικά πολυποειδή αδενομυώματα: Χωρίς δομικές ή κυτταρικές ατυπίες. β) Άτυπα πολυποειδή αδενομυώματα: Ύπαρξη άτυπων ενδομήτριων αδένων, συνήθως πλακώδης μεταπλασία και στρώμα αποτελούμενο από λείες μυϊκές ίνες.

29 29 4) Άλλες μορφές α) Αδενομύωμα ενδοτραχήλου: Σπάνιες μορφές αδενομυωματωδών πολύποδων στον τράχηλο της μήτρας, που περιέχουν ως επιθηλιακό συστατικό τους ενδοτραχηλικό ιστό. β) Οπισθοπεριτοναϊκά αδενομυώματα: Προέρχονται πιθανόν από μεταπλασία υπολειμμάτων των μυλλεριανών πόρων οπισθοπεριτοναϊκά και στην περιοχή του ανώτερου ορθοκολπικού διαφράγματος.

30 Θεραπευτική αντιμετώπιση Η ολική υστερεκτομή αποτελεί μέχρι σήμερα τη μόνη οριστική και πλήρη λύση στην αντιμετώπιση της αδενομύωσης. Αμέσως επόμενες επιλογές είναι η συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση με διατήρηση της μήτρας (conservative uterine-sparing surgery), η φαρμακευτική αντιμετώπιση ή ο συνδυασμός τους. Υπάρχουν ερευνητικά δεδομένα που δείχνουν ότι η συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση με διατήρηση της μήτρας έχει περισσότερα πλεονεκτήματα και είναι περισσότερο αποτελεσματική ως προς την ανακούφιση των συμπτωμάτων και ως προς τον μακροπρόθεσμο έλεγχο των συμπτωμάτων σε ασθενείς με αδενομύωση ή και αδενομύωμα, σε σύγκριση με τη φαρμακευτική αντιμετώπιση ως μονοθεραπεία. Επιπλέον, η συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση είναι πολλά υποσχόμενη μέθοδος, καθώς το κύριο σύμπτωμα, η δυσμηνόρροια, δύναται να βελτιωθεί σημαντικά, έως και κατά 80%. Η μηνορραγία βελτιώθηκε σε περισσότερο από τα δύο τρίτα των ασθενών μετά από μία τύπου Ι συντηρητική χειρουργική επέμβαση (πλήρης εκτομή της αδενομύωσης, ονομάζεται επίσης αδενομυωματεκτομή), οι δε μισές από τις ασθενείς παρατήρησαν βελτίωση των συμπτωμάτων μετά από μία τύπου ΙΙ συντηρητική χειρουργική επέμβαση (συντηρητική κυτταρομειωτική επέμβαση) [40]. Επιπρόσθετα, με τη συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση, με διατήρηση της μήτρας, δεν παρατηρήθηκε καμία αρνητική επίδραση σε ό,τι αφορά την αναπαραγωγική ικανότητα. Μάλιστα, η αναπαραγωγική ικανότητα φαίνεται να βελτιώνεται με τη συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση σε σύγκριση με τη φαρμακευτική αντιμετώπιση ως μονοθεραπεία πέρα από την αύξηση του δείκτη γεννητικότητας, αυξήθηκε και το ποσοστό των επιτυχών τελειόμηνων κυήσεων και τοκετών. Έτσι πιστεύεται, πως η εκρίζωση της βλάβης είναι διαδικασία που βελτιώνει την γονιμότητα. Τα ανωτέρω στοιχεία βασίζονται σε περιορισμένο αριθμό μελετών. Στην πράξη, ένδειξη για συντηρητική χειρουργική αντιμετώπιση έχουν ασθενείς που χρήζουν παροδικής ανακούφισης των συμπτωμάτων με ταυτόχρονη διατήρηση της γονιμότητας [40]. Οι φαρμακευτικές θεραπευτικές επιλογές στην αδενομύωση ακολουθούν τις βασικές αρχές αντιμετώπισης της ενδομητρίωσης, οι οποίες

31 31 στοχεύουν στην μείωση της παραγωγής των ενδογενών οιστρογόνων ή στην επαγωγή της διαφοροποίησης του ενδομητρίου με προγεσταγόνα. Κλινικά έχει αποδειχθεί η δυσμενής επίδραση αδιάλειπτων ωοθυλακιορρηκτικών κύκλων στην ανάπτυξη και διατήρηση της αδενομύωσης: Τα συμπτώματα της νόσου συνήθως εμφανίζονται μετά την εμμηναρχή και παύουν μετά την εμμηνόπαυση. Αντικείμενο λοιπόν της φαρμακευτικής αντιμετώπισης είναι η αναστολή της ωοθυλακιορρηξίας, η αναστολή της εμμήνου ρύσεως και η επίτευξη μιας σταθερής στάθμης στεροειδών ορμονών, με βάση την υπόθεση ότι τόσο το έκτοπο όσο και το ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο ανταποκρίνονται με παρόμοιο τρόπο [41]. Οι φαρμακευτικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται συνήθως στην αδενομύωση βασίζονται κυρίως στον κεντρικό ρόλο που διαδραματίζει ο άξονας υποθάλαμος-υπόφυση-ωοθήκες σε κάθε φάση του αναπαραγωγικού κύκλου των θηλαστικών. Αυτές συμπεριλαμβάνουν τους αγωνιστές της GnRH, τα από του στόματος αντισυλληπτικά δισκία, τα προγεσταγόνα, τη δαναζόλη και πρόσφατα τους εκλεκτικούς τροποποιητές των υποδοχέων των οιστρογόνων (selective estrogen receptor modulators - SERMs), τους εκλεκτικούς τροποποιητές των υποδοχέων της προγεστερόνης (selective progesterone receptor modulator - SPRMs) και τους αναστολείς της αρωματάσης (aromatase inhibitors - ΑΙs). Οι παράγοντες αυτοί δημιουργούν ένα περιβάλλον υπο-οιστρογονικό (αγωνιστές της GnRH, αναστολείς της αρωματάσης), υπερανδρογονικό (δαναζόλη, γεστρινόνη) ή υπερπρογεστερονικό (αντισυλληπτικά, προγεσταγόνα), με συνέπεια την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του ενδομητρίου. Εάν επιτευχθεί αμηνόρροια, οι διάφορες φαρμακευτικές επιλογές δεν φαίνεται να παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε ό,τι αφορά στην ανακούφιση από το άλγος ωστόσο, από εκεί και πέρα ποικίλλουν οι ανεπιθύμητες ενέργειες, το κόστος και η ανοχή των σκευασμάτων. Βέβαια, η φαρμακευτική θεραπεία στοχεύει στα συμπτώματα της νόσου και δεν δρα κυτταρομειωτικά, με αποτέλεσμα οι εστίες της αδενομύωσης να είναι ανθεκτικές και να επιβιώνουν μετά από οποιαδήποτε φαρμακευτική αγωγή, οποιασδήποτε δοσολογίας και ανεξάρτητα από τη διάρκεια χορήγησής τους.

32 32 Έτσι, οι εστίες αδενομύωσης αναλαμβάνουν σύντομα ξανά τη μεταβολική τους δραστηριότητα μετά τη διακοπή της φαρμακευτικής αγωγής [41]. Χρειάζεται μια ευρύτερη και βαθύτερη κατανόηση της παθοφυσιολογίας της νόσου, προκειμένου στο μέλλον να μπορούν να αντιμετωπισθούν αποτελεσματικότερα αυτές οι ομάδες ασθενών. Η σημερινή πρόκληση είναι η προσαρμογή της θεραπείας στις ανάγκες της ασθενούς, ανάλογα με τον τύπο και την έκταση της νόσου [40].

33 33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ GPCR, KISS-ΠΕΠΤΙΝΕΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ

34 34

35 Υποδοχείς συνδεόμενοι με την πρωτεΐνη G (GPCR - G-proteincoupled receptors) Τα περισσότερα κύτταρα του ανθρώπου περιβάλλονται από μια μεμβράνη αποτελούμενη από δύο στοιβάδες φωσφολιπιδίων. Η μεμβράνη αυτή επιτρέπει στο κύτταρο να διατηρεί μια ομάδα βιοχημικά ενεργών δομών στο εσωτερικό του, αποτρέποντας ταυτόχρονα την ανεπιθύμητη είσοδο άλλων ουσιών από το εξωτερικό περιβάλλον. Για την ορθή τους λειτουργία, οι δομές αυτές πρέπει να μπορούν να δέχονται εντολές από το εξωτερικό περιβάλλον. Τα κύτταρα βρίσκονται σε διαρκή επικοινωνία μεταξύ τους και με το περιβάλλον, γεγονός που προϋποθέτει την ύπαρξη ενός μοριακού σκελετού, που αποτελεί τον μηχανισμό μετάδοσης των πληροφοριών μέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Ο μοριακός αυτός σκελετός αποτελείται από τους υποδοχείς GPCR, οι οποίοι είναι πρωτεϊνικής φύσεως και εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Η μετάδοση του σήματος πραγματοποιείται με τη σύζευξη G-πρωτεϊνών στο εσωτερικό του κυττάρου. Η πολυπεπτιδική τους αλυσίδα διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη επτά φορές (βλέπε εικόνα 3). Οι GPCR διαμεσολαβούν στη μετάδοση μιας ευρείας ποικιλίας εξωκυττάριων σημάτων στον ενδοκυττάριο χώρο, όπως η αλλαγή της συγκέντρωσης πεπτιδίων, ορμονών, λιπιδίων και ιόντων, αλλά και πιο εξειδικευμένα νευροδιαβιβαστών, οσφρητικών και γευστικών ερεθισμάτων και φωτονίων στον οφθαλμό [42]. Μια τυπική ενεργοποιημένη μονάδα μετάδοσης του σήματος (ενεργό τριμερές σύμπλοκο active ternary complex) αποτελείται από το εξωκυττάριο συζευγμένο μόριο (αγωνιστής), τον διαμεμβρανικό υποδοχέα GPCR και την ενδοκυττάρια G-πρωτεϊνη [43] (βλ. εικόνες 4 και 5). Η ενεργοποίηση βασίζεται σε έναν αλλοστερικό μηχανισμό. Η αλλοστερική σύζευξη είναι αμοιβαία, σύμφωνα με το νόμο της θερμοδυναμικής. Η σύζευξη του αγωνιστή αυξάνει τη συγγένεια προς τη G-πρωτεΐνη στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ η σύζευξη της G-πρωτεΐνης αυξάνει με τη σειρά της τη συγγένεια του υποδοχέα προς τον αγωνιστή σε όμοιο βαθμό. Ένας μεγάλος αριθμός μορίων μικρού μοριακού βάρους λειτουργούν ως αγωνιστές, συναγωνιστές ή ανταγωνιστές συνδεόμενοι με τους υποδοχείς GPCR, τροποποιώντας έτσι την κυτταρική δραστηριότητα ποικιλοτρόπως. Αυτό αποτελεί τη βάση στην εξέλιξη πολλών

36 36 φαρμάκων και έτσι οι υποδοχείς αυτοί αποτελούν πολύ σημαντικούς στόχους στη φαρμακευτική θεραπεία [43] Εικόνα 1. Ο υποδοχέας GPCR σε μορφή α-έλικας διαπερνά επτά φορές την κυτταρική μεμβράνη. Εικόνα 2. Αριστερά: Ένας θερμοδυναμικός κύκλος περιγράφει το σχηματισμό συμπλέγματος μεταξύ ενός αγωνιστή (κίτρινο), του υποδοχέα (μπλε) και μιας G-πρωτεΐνης (κόκκινο). Δεξιά: Η κρυσταλλική δομή μιας ενεργοποιημένης μονάδας μετάδοσης σήματος [44].

37 37 Εικόνα 3. Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού ενεργοποίησης του υποδοχέα GPCR.

38 KISS-πεπτίνες και υποδοχείς GPCR Το 2001 αναγνωρίσθηκε η συζευξιμότητα ενός από τους υποδοχείς GPCR, του KISS1 (προηγούμενες ονομασίες GPR54, AXOR12, hot7t175) με τα τρία βιολογικώς ενεργά πεπτίδια που κωδικοποιεί το γονίδιο KISS-1, που ονομάζονται KISS-πεπτίνες - (ΚΡ)-54, ΚΡ-13 και ΚΡ-10 - και που απομονώθηκαν από ανθρώπινο πλακούντα [44-46]. Ύστερα από την περιγραφή του ρόλου τους στη μετάσταση του καρκίνου και στην πλακουντοποίηση, το σύστημα των υποδοχέων KISS1 (GPR54) έτυχε αυξημένης προσοχής με την ανακάλυψη του ρόλου του ως ενός μοριακού σήματος έναρξης της ήβης [47]. Οι KISS-πεπτίνες (ΚΡ) ταυτοποιήθηκαν αρχικά το 1996 σε κακοήθη μελανώματα, μέσω ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου, του KISS-1 [48]. Αρχικά, για το μεγαλύτερο παράγωγο διάσπασής τους, την ΚΡ-54, αναγνωρίστηκε η ικανότητά του να καταστέλλει το μεταστατικό δυναμικό κυττάρων κακοήθους μελανώματος του ανθρώπου. Η έκφραση της ΚΡ-54 είχε ως αποτέλεσμα την καταστολή της μετάστασης του μελανώματος σε αθυμικούς επίμυες (αρουραίους), για αυτό το λόγο ονομάστηκε μεταστίνη. Η πλήρης πρωτεϊνική αλυσίδα των KISS-πεπτινών (ΚΡ-145) περιέχει μια αλληλουχία PEST, πλούσια σε προλίνη, γλουταμικό οξύ, σερίνη, θρεονίνη και ασπαρτικό οξύ. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα KISS1 (GPR54) από τις KISS-πεπτίνες προκαλεί την κινητοποίηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου, χωρίς να επιφέρει αλλαγές στη συσσώρευση του κυκλικού ΑΜΡ και χωρίς να επηρεάζεται από την τοξίνη του κοκκύτη, γεγονός που καταδεικνύει ότι είναι ένας υποδοχέας που συνδέεται με πρωτεΐνη G (G-protein-coupled receptor, GCPR) [44, 45]. Σε ένα μεγάλο αριθμό μελετών γίνεται προσπάθεια προσέγγισης του μηχανισμού ενεργοποίησης-μετάδοσης σήματος που προκαλεί η σύζευξη των KISSπεπτινών (ΚΡ) με τους υποδοχείς KISS1 (GPR54). Στην κορυφή της αλυσιδωτής αντίδρασης, η ενεργοποίηση των KISS1 (GPR54) από τις KISSπεπτίνες (ΚΡ) έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος [44] και την διέγερση διαφόρων κινασών όπως η MAPK (mitogen-activated protein kinase πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη από μιτογόνα), οι ERK1 και ERK2 (extracellular signal-regulated kinase κινάση ρυθμιζόμενη από εξωκυττάρια σήματα), η p42/44, η PKC, η PLC, η κινάση μυελοειδούς

39 39 λευχαιμίας 1 και οι εξαρτώμενες από καλμοδουλίνη/ασβέστιο, τυροσινικές κινάσες [44, 49-53]. Ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός παραμένει ανεξιχνίαστος.

40 KISS-πεπτίνες και μετάσταση κακοήθων νεοπλασιών Μια στρατηγική αναγνώρισης γονιδίων που εμπλέκονται στη μετάσταση του καρκίνου είναι η έγχυση των προς μελέτη γονιδίων σε κυτταρικές σειρές ισχυρά μεταστατικών κυττάρων και στη συνέχεια η παρατήρηση της ικανότητάς τους να μεθίστανται μετά από έγχυσή τους σε αθυμικούς άτριχους επίμυες (αρουραίους). Η μεταφορά του φυσιολογικού χρωμοσώματος 6 στις κυτταρικές σειρές κακοήθων μελανωμάτων C8161 και MelJuSo, κατέστειλε τη μετάσταση κατά 95%, δίχως να επηρεάσει την τοπική διείσδυση ή την ογκογονικότητα [54, 55]. Χρησιμοποιώντας μια τροποποιημένη αφαιρετική μέθοδο υβριδισμού, αναγνωρίσθηκε μια σειρά υποψήφιων γονιδίων. Όμως μόνο ένα γονίδιο, το KISS-1, εκφραζόταν στα μη-μεταστατικά κύτταρα, ενώ απουσίαζε από τα μεταστατικά. Η έγχυση της C8161 σε αθυμικούς επίμυες, μετά από επιμόλυνσή της με ένα φορέα του KISS-1, επιβεβαίωσε το παραπάνω εύρημα. Η μεταστατική ικανότητα, συγκριτικά με την έγχυση μόνο C8161, μειώθηκε από τις 50 κατά μέσο όρο μεταστάσεις σε μόλις μόνο μία [54]. Έχει επίσης παρατηρηθεί και άμεση αλληλεπίδραση του KISS-1 με δύο μεταγραφικούς παράγοντες (transcription factors), του ενεργοποιητή της πρωτεΐνης-2a και του sp-1, για τους οποίους έχει φανεί ότι αμφότεροι είναι σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, στην ανάπτυξη των όγκων και στη μετάσταση [56]. Σε μία άλλη δοκιμασία κυτταρικής κινητικότητας, η ΚΡ-54 ανέστειλε την χημειοταξία, ενώ στη δοκιμασία κυτταρικής μετανάστευσης διαμέσου ενός φίλτρου καλυμμένου με Matrigel, η ΚΡ-54 ανέστειλε την κυτταρική διείσδυση, πιθανόν μέσω της προς τα κάτω ρύθμισης των μεταλλοπρωτεασών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (ΜΜΡ) από τις KISS-πεπτίνες [46, 51, 57]. Μελετώντας την αναδιοργάνωση της ακτίνης, βρέθηκε ότι η ΚΡ-10 διέγειρε την παραγωγή ινών στρες [44]. Η τοπική παραγωγή συμφύσεων επαγόταν επίσης από την ΚΡ-54, μέσω αυξημένης φωσφορυλίωσης της κινάσης και παξιλλίνης, που είναι ουσιαστικές στο σχηματισμό συμφύσεων. Υπάρχουν όμως δεδομένα από μελέτες στις οποίες η ΚΡ-54 δεν προκάλεσε τον σχηματισμό συμφύσεων [58]. Έτσι παραμένει αδιευκρίνιστο το εάν η ΚΡ- 54 αναστέλλει την κυτταρική διείσδυση μέσω τροποποιημένης κυτταρικής κινητικότητας, προσκολλητικότητας ή μέσω συνδυασμού αυτών. Η επαγωγή

41 41 της απόπτωσης φαίνεται ότι είναι ένας ακόμη μηχανισμός αναστολής της μετάστασης από τις KISS-πεπτίνες [53]. Προκειμένου να αποδειχθεί η σημασία των KISS-πεπτινών όχι μόνο ως αναστολέων της μετάστασης στο κακόηθες μελάνωμα, αλλά και ως ρυθμιστών του μεταστατικού δυναμικού μιας ποικιλίας καρκίνων, αναζητήθηκαν και ανιχνεύθηκαν αλλαγές των ΚΡ και KISS1 (GPR54) σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα μεταστατικών και μη όγκων. Στην πλειονότητα των μελετών βρέθηκε μειωμένη έκφραση των ΚΡ στους πρωτογενείς και τους μεταστατικούς όγκους, με περιπτώσεις ακόμη και πλήρους απουσίας των ΚΡ σε μεταστάσεις [46, 48, 51, 55-57, 59-64]. Ο συσχετισμός του σταδίου του καρκίνου με την έκφραση των ΚΡ έδειξε ότι τα επίπεδα των πεπτιδίων μειώνονται με την πρόοδο της νόσου. Υψηλή έκφραση ανιχνεύθηκε σε καλοήθεις όγκους, ενώ χαμηλή ήταν η έκφραση σε προχωρημένα κλινικά στάδια [60, 62, 63].

42 KISS-πεπτίνες και πλακουντοποίηση Με τη βοήθεια ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (quantitative polymerase chain reaction qpcr) και ανάλυσης μικροσυστοιχιών cdna (cdna microarrays) μελετήθηκε ανθρώπινος τροφοβλαστικός ιστός, στον οποίο βρέθηκε μειωμένη έκφραση των KP και KISS1 (GPR54) [61, 65]. Συγκεκριμένα, η μεταγραφική έκφραση των ΚΡ δεν είχε διαφορά μεταξύ πρώιμων και όψιμων πλακουντιακών ιστών, η έκφραση όμως του KISS1 (GPR54) ήταν υψηλότερη στους πρώιμους πλακούντες, γεγονός που συμπίπτει με τη μετάβαση από περισσότερο διεισδυτικά κύτταρα στην αρχόμενη σε λιγότερο διεισδυτικά στην προχωρημένη κύηση [61]. Σε αντιστοιχία με καρκινικούς φαινοτύπους, η διείσδυση των τροφοβλαστών αναστέλλεται από τις ΚΡ και σχετίζεται επίσης με την καταστολή της δραστηριότητας των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 [65, 66]. Μετρήσεις της ΚΡ-54 κατά τη διάρκεια της κύησης ανέδειξαν μια αύξηση της τάξης του 10 3 της ΚΡ-54 στο πρώτο τρίμηνο, ενώ στο τρίτο τρίμηνο η αύξηση ήταν της τάξης του Τα επίπεδα έπεφταν σε σχεδόν φυσιολογική στάθμη την 5 η ημέρα της λοχείας, γεγονός που υποδεικνύει ως πηγή των ΚΡ τον πλακούντα [67]. Ο ρόλος των ΚΡ στην πλακουντοποίηση και της σχετικής ρύθμισης των ΜΜΡ, οδήγησε στην υπόθεση πως οι ΚΡ ίσως να έχουν ένα πρόσθετο ρόλο στην παθογένεια της προεκλαμψίας. Η ταυτόχρονη ανάλυση της έκφρασης του mrna των ΚΡ και ΜΜΡ-9 σε τροφοβλάστες γυναικών με προεκλαμψία, έδειξε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ΚΡ με αντίστοιχα σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα ΜΜΡ-9, συγκρινόμενα με τα επίπεδα εγκύων χωρίς προεκλαμψία [66]. Ωστόσο σε μια άλλη μελέτη, τα προαναφερθέντα επίπεδα ΚΡ βρέθηκαν μειωμένα στην προεκλαμψία [67]. Η περαιτέρω μελέτη της σχέσης KP/KISS1 (GPR54) και προεκλαμψίας είναι αναγκαία, δεδομένου ότι τα παραπάνω στοιχεία καταδεικνύουν την πιθανή συμμετοχή τους στην παθογένεια της προεκλαμψίας.

43 KISS-πεπτίνες και έκκριση GnRH έναρξη ήβης Το 2003, τρεις ανεξάρτητες ερευνητικές ομάδες αναγνώρισαν τον υποδοχέα KISS1 (GPR54) ως ένα μόριο διακόπτη για την έναρξη της ήβης [68-70]. Από μελέτες επάνω σε μέλη μιας οικογένειας με ιδιοπαθή υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό, βρέθηκαν μεταλλάξεις του γονιδίου-υποδοχέα (ομόζυγη μετάλλαξη λευκίνης148 σε σερίνη148) [70] και ετερόζυγες μεταλλάξεις R331X (X: απροσδιόριστο αμινοξύ) και X399R. Τα άτομα με τις μεταλλάξεις αυτές είχαν χαμηλά επίπεδα γοναδοτροπινών και μια πλήρη ή μερική έλλειψη ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) και δεν προχωρούν στην ήβη, ενώ ανταποκρίνονται σε θεραπεία υποκατάστασης με GnRH [70, 71]. Στη συνέχεια ακολούθησε η ανακάλυψη μιας σειράς μεταλλάξεων του υποδοχέα KISS1 (GPR54) που οδηγούν σε ιδιοπαθή υπογοναδοτροπικό υπογοναδισμό, συμπεριλαμβανομένων των C223R και R297L [68, 72]. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων από τις έρευνες σε επίμυες και ανθρώπους καταλήγει στην υπόθεση πως οι KISS-πεπτίνες σχετίζονται με την έκκριση της GnRH. Η ενεργοποίηση της αλυσιδωτής αντίδρασης της GnRH από τις ΚΡ και η ανάδρομη (feedback) ρύθμιση της έκφρασης των ΚΡ από τα στεροειδή του φύλου στον προσεγκέφαλο, έχει τεκμηριωθεί μέσα από πολυάριθμες έρευνες [73-78]. Αυτή είναι μια ισχυρή ένδειξη της συμμετοχής τους στην έναρξη της ήβης. Παρόλο που η οδός των ΚΡ αποτελεί προϋπόθεση για την έναρξη της ήβης, το πιθανότερο είναι πως συμμετέχουν πολυάριθμοι ακόμη παράγοντες στην φυσική αυτή διαδικασία [73].

44 KISS-πεπτίνες και καταμήνιος κύκλος Η διέγερση του άξονα των γοναδοτροπινών από τις ΚΡ υποδεικνύει την πιθανή συμμετοχή τους στη θετική ανάδραση μεταξύ οιστρογόνων, GnRH και LH και τη ρύθμιση του καταμήνιου κύκλου. Η αυξημένη έκκριση KP/KISS1 (GPR54) αποτελεί απαραίτητο στοιχείο στη θετική ανάδραση επί της αλυσιδωτής αντίδρασης της GnRH και στην ωοθυλακιορρηξία [47] KISS-πεπτίνες και μεταλλοπρωτεϊνάσες της εξωκυττάριας ουσίας (Matrix metaloproteinases - ΜΜΡ) Έχει αποδειχθεί η προς τα κάτω ρύθμιση των μεταλλοπρωτεϊνασών της εξωκυττάριας ουσίας ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 από τις ΚΡ [49, 57, 65, 66]. Οι ΚΡ περιγράφονται ως ρυθμιστές των ΜΜΡ τόσο στο μεταγραφικό όσο και στο επίπεδο πρωτεΐνης. Οι αλλαγές σε επίπεδο μεταγραφής γίνονται μέσω μείωσης του πυρηνικού παράγοντα nuclear factor-kb, που συνδέεται με την περιοχή του προαγωγέα της ΜΜΡ-9, που είναι απαραίτητη για την έκφραση της ΜΜΡ-9. Σε επίπεδο πρωτεΐνης, η αλληλεπίδραση μεταξύ τελικών αμινοξέων της ΚΡ-145 και προ-μμρ-2 ή προ-μμρ-9, οδηγεί στο σχηματισμό συμπλεγμάτων των οποίων η σημασία δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί. Ενεργές ΜΜΡ μπορεί αντιθέτως να διασπάσουν το δεσμό γλυκίνη118-λευκίνη119 των ΚΡ, με αποτέλεσμα την απενεργοποίηση των ΚΡ και αυτή ίσως είναι μια μορφή αρνητικής ανάδρασης μεταξύ ΚΡ και ΜΜΡ [79].

45 45 Κεφάλαιο 3: Παθολογική Ανατομική και Ανοσοϊστοχημεία

46 46

47 Παθολογική Ανατομική Η ειδικότητα της Παθολογικής Ανατομικής έχει τις ρίζες της στο 1838, όταν ο Johannes Miller εκδίδει το βιβλίο του On the Nature and Structure Characteristics of Cancer, το πρώτο βιβλίο Ιστοπαθολογίας. Το πρώτο σύνθετο μικροσκόπιο είχε κατασκευασθεί νωρίτερα το 1591, αλλά παρουσίαζε μεγάλα προβλήματα οπτικής. Το 1673 ο Anton van Leeuwenhoek κατασκεύασε απλά μικροσκόπια με μονήρεις φακούς, στα oποία η μεγέθυνση και η ανάλυση βελτιωνόταν. Ο πρώτος κατάλληλος μικροτόμος για ζωϊκούς ιστούς κατασκευάσθηκε το Μεγάλη υπήρξε η συνεισφορά του Rudolf Carl Virchow, γνωστού Γερμανού Παθολογοανατόμου στα μέσα του 19ου αιώνα, μεταξύ άλλων με την επινόηση της κυτταρικής θεωρίας, την αποσαφήνιση του μηχανισμού της θρόμβωσης και της πνευμονικής εμβολής και γενικότερα με την καθιέρωση της Παθολογικής Ανατομικής σε μικροσκοπικό κυρίως επίπεδο ως βασική αρχή έρευνας στις Ιατρικές επιστήμες. Ακολούθησαν αργότερα οι μικροτόμοι Cambridge Rocker (1885), Minot (1886) και οι ολισθαίνοντες μικροτόμοι (1910). Η χρήση παραφίνης για τη διήθηση των ιστών και την υποβοήθηση έτσι της διαδικασίας της μικροτομής, εισήχθη στα μέσα του 19ου αιώνα. Διάφορες χημικές ουσίες δοκιμάστηκαν ως στερεωτικά.. Η ευρέως διαδεδομένη σήμερα φορμαλίνη, χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το Αυτόματοι επεξεργαστές ιστών αντικατέστησαν την χειροκίνητη επεξεργασία, αρχίζοντας από το 1945, ενώ οι πρώτοι κρυοστάτες κατασκευάστηκαν το Η ενζυμική ιστοχημεία, η ηλεκτρονική και πολωτική μικροσκόπηση αποτελούν σημαντικά διαγνωστικά εργαλεία τα τελευταία 50 χρόνια. Τέλος, η εξάπλωση της Ανοσοϊστοχημείας ξεκίνησε τη δεκαετία του 1980, έφερε μια επανάσταση στην διαγνωστική του καρκίνου και μέχρι σήμερα ακόμη εξελίσσεται [80]. Σήμερα βρισκόμαστε πλέον στην εποχή της Μοριακής Παθολογικής Ανατομικής (Molecular Pathology).

48 Ανοσοϊστοχημεία Ο όρος Ανοσοϊστοχημεία αναφέρεται στη διαδικασία ανίχνευσης αντιγόνων (π.χ. πρωτεΐνης) στα κύτταρα μιας ιστικής διατομής, αξιοποιώντας την αρχή της σύνδεσης αντισωμάτων σε συγκεκριμένα αντιγόνα στους βιολογικούς ιστούς. Η Ανοσοϊστοχημεία για πρώτη φορά ανακαλύφθηκε και εφαρμόσθηκε από τον Albert Coons το 1941 [81]. Μαζί με τον César Milstein και Niels K. Jerne, o Georges J. F. Köhler κέρδισε το Βραβείο Νόμπελ Φυσιολογίας και Ιατρικής το 1984, με τις "θεωρίες σχετικά με την ειδικότητα στην ανάπτυξη και τον έλεγχο του ανοσοποιητικού συστήματος και την ανακάλυψη της αρχής για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων». Η τεχνική των Milstein και Köhler για την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων έθεσε τα θεμέλια στη χρήση των αντισωμάτων για διαγνωστικούς ή θεραπευτικούς σκοπούς και σε πολλές άλλες επιστημονικές εφαρμογές. Η ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιείται ευρέως στην διάγνωση παθολογικών κυττάρων, π.χ. καρκινικά κύτταρα. Ειδικοί μοριακοί δείκτες εντοπίζονται σε συγκεκριμένες κυτταρικές διαδικασίες όπως ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος (απόπτωση). Η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιείται επίσης στη διερεύνηση της κατανομής και εντόπισης βιολογικών δεικτών και της διαφορετικής έκφρασης πρωτεϊνών στα διάφορα τμήματα ενός ιστού. Η ανίχνευση της αντίδρασης αντισώματος-αντιγόνου γίνεται με διάφορους τρόπους. Συνήθως, το αντίσωμα είναι συζευγμένο με ένα ένζυμο, όπως η υπεροξειδάση που καταλύει μια χημική αντίδραση, από την οποία προκύπτει συγκεκριμένο χρώμα.

49 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 49

50 50

51 51 4. Σκοπός Η αδενομύωση αποτελεί ένα σχετικά συχνό καλόηθες νόσημα του γυναικείου γεννητικού συστήματος, του οποίου ο ακριβής επιπολασμός δεν έχει ακόμη εξακριβωθεί. Νεότερες διαγνωστικές μέθοδοι αναμένεται να αποσαφηνίσουν την πραγματική συχνότητα της νόσου και την ηλικιακή της κατανομή. Ασάφεια επικρατεί επίσης σε ό,τι αφορά την κλινική ταξινόμηση της αδενομύωσης. Αιτιολογική θεραπεία της νόσου δεν υπάρχει, ενώ οι θεραπευτικές επιλογές περιορίζονται προς το παρόν στην συμπτωματική αντιμετώπιση είτε φαρμακευτικά είτε χειρουργικά, αφού η αιτιοπαθογένειά της παραμένει ασαφής. Τα τελευταία χρόνια στην προσπάθεια ακριβέστερης διάγνωσης και ορθότερου σχεδιασμού αντιμετώπισης και κατανόησης των μηχανισμών γένεσης της αδενομύωσης, πολλοί ερευνητές έχουν επικεντρώσει το ενδιαφέρον τους στην ανίχνευση μοριακών δεικτών σε αυτό το καλόηθες νόσημα της μήτρας. Ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον έχει η κυτταρική έκφραση αυτών των μοριακών δεικτών και η σημασία τους στην πρόγνωση των ασθενών σε συνδυασμό με τους παραδοσιακούς κλινικοπαθολογοανατομικούς παράγοντες της νόσου, καθώς και η σχέση τους σε ό,τι αφορά την αποτελεσματική θεραπεία. Τα στοιχεία που προκύπτουν από την τρέχουσα βιβλιογραφία σχετικά με τα παραπάνω είναι ασαφή, ενώ δεν υπάρχει ομοφωνία μεταξύ των συγγραφέων σχετικά με τα αποτελέσματα των μελετών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η εκτίμηση, με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας, της έκφρασης σε πρωτεϊνικό επίπεδο των γονιδίων KISS-1, TGLN και TIMP-3, σε εστίες αδενομύωσης σε σύγκριση με το αντίστοιχο ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο, καθώς και με ενδομήτριο από ασθενείς χωρίς αδενομύωση.

52 52 5. Υλικό και Μέθοδοι 5.1. Ασθενείς που μελετήθηκαν Στην παρούσα μελέτη συμπεριλήφθηκαν 29 ασθενείς πάσχουσες από αδενομύωση ηλικίας ετών, καθώς και 29 ασθενείς ηλικίας ετών που δεν έπασχαν από αδενομύωση, αλλά από άλλο καλόηθες νόσημα (8 ασθενείς με ώριμο κυστικό τεράτωμα, 9 με λειομυώματα μήτρας, 2 με κύστη ωχρού σωματίου, 3 με ορώδες κυσταδένωμα, 4 με βλεννώδες κυσταδένωμα, 1 με υπογονιμότητα σαλπιγγικού παράγοντα, 1 με κύστη ωοθυλακίου, 1 με ορώδη κύστη ωοθήκης). Στην πρώτη ομάδα, η διάγνωση τέθηκε μετά από υστερεκτομή. Η δεύτερη ομάδα επιλέχθηκε αναδρομικά ως ομάδα ελέγχου, στην οποία μελετήθηκε φυσιολογικό ενδομήτριο που ανακτήθηκε με διαγνωστική απόξεση ή pipelle στο πλαίσιο λαπαροσκόπησης προς αποκλεισμό ενδομητρίωσης. Προεγχειρητικά είχε αποκλεισθεί η ύπαρξη αδενομύωσης με τη χρήση διακολπικού υπερηχογραφήματος και γενικώς αποδεκτών μορφολογικών κριτηρίων [2]. Μετά τη χρώση με αιματοξυλίνη και ηωσίνη, μελετήθηκαν οι διάφορες τομές προκειμένου να επιβεβαιωθεί η διάγνωση. Η μελέτη διήρκεσε από το Σεπτέμβριο του 2008 έως τον Ιούνιο του 2014 και έλαβε χώρα στην Α Μαιευτική-Γυναικολογική Κλινική του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.) και στο Εργαστήριο Ιστολογίας- Εμβρυολογίας του Α.Π.Θ.

53 Μέθοδοι Ανοσοϊστοχημική μέθοδος Όλα τα ιστολογικά παρασκευάσματα τοποθετήθηκαν σε παραφίνη μετά από μονιμοποίηση σε φορμόλη. Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση έγινε σε ιστικές τομές, πάχους 5 μm, μονιμοποιημένες σε 10% ουδέτερη φορμόλη και σκηνωμένες σε παραφίνη. Αντιπροσωπευτικοί κύβοι από κάθε περίπτωση επιλέχθηκαν προς ανοσοϊστοχημική χρώση. Η χρώση με ανοσοϋπεροξειδάση για το KISS-1 εφαρμόσθηκε σε τομές πάχους 5.0 μm για όλους τους ιστούς. Συγκεκριμένα, για το KiSS-1 εφαρμόστηκε το μονοκλωνικό αντίσωμα IgG2a (κλώνος 24-Q, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, Texas, Η.Π.Α) με αραίωση 1:50. Ακολούθησε ανίχνευση με ένα τυποποιημένο αυτόματο σύστημα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης (i-view Paraffin DAB; Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, Η.Π.Α.). Της όλης διαδικασίας είχε προηγηθεί μια προεπεξεργασία με ρυθμιστικό διάλυμα EZPrep (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, Arizona, Η.Π.Α.). Ακολούθησε μια επίχρωση με αιματοξυλίνη. Ως θετικός μάρτυρας για το KISS-1 χρησιμοποιήθηκε ανθρώπινος πλακούντας. Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε μη άνοσος ορός από κονίκλους (κουνέλια), ο οποίος αντικατέστησε το πρωτογενές αντίσωμα. Σε ό,τι αφορά στο ΤΙΜΡ3, εφαρμόσθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού ΤΙΜΡ-3, σε αραίωση 1:100 (κλώνος Ζ188, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA), ακολουθώντας ένα αυτοματοποιημένο σύστημα ανοσοϊστοχημικής ανίχνευσης (Nexes, Ventana, Tucson, Arizona, USA), με μέθοδο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης και χρωμογόνο διαμινοβενζιδίνη (I- VIEW Paraffin DAB, Ventana). Της κύριας μεθόδου προηγήθηκε προεπεξεργασία των τομών σε διάλυμα buffer EZ Prep. Ως αντίχρωση χρησιμοποιήθηκε χρώση αιματοξυλίνης. Ως θετικός μάρτυρας για το ΤΙΜΡ-3 χρησιμοποιήθηκε ανθρώπινος πλακούντας. Ως αρνητικός μάρτυρας για την ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε μη-άνοσος ορός κονίκλου, που αντικατέστησε στη μέθοδο το πρωτογενές αντίσωμα.

54 Βαθμολόγηση των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων: Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής αντίδρασης έγινε με τη βοήθεια ημιποσοτικής μεθόδου, σύμφωνα με συγκεκριμένη μεθοδολογία [82, 83]. Αναλυτικότερα, η ένταση της χρώσης (και κατά αναλογία η βαθμολόγηση της πρωτεϊνικής έκφρασης) έγινε ως εξής (διαγράμματα 1, 2, 3): 0 = αρνητική 1+ = χαμηλή 2+ = μέτρια 3+ = ισχυρή Επιπρόσθετα, σε κάθε παρασκεύασμα, αξιολογήθηκε το επί τοις εκατό ποσοστό των κεχρωσμένων κυττάρων και στη συνέχεια επιλέχθηκαν 5 ομάδες ως εξής: 0 = αρνητικό 1 = <10% 2 = 10-50% 3 = 51-80% 4 = >80% Σύμφωνα λοιπόν με τη συνολική βαθμολογία (ένταση και έκταση χρώσης) τα ιστολογικά παρασκευάσματα κατατάχθηκαν σε ομάδες χαμηλής (0-2 βαθμοί), μέτριας (3-6 βαθμοί) ή ισχυρής (8-12 βαθμοί) πρωτεϊνικής έκφρασης Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση της μελέτης χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα IBM SPSS (Statistical Package for Social Science, version 20, SPSS Inc., Chicago, IL, Η.Π.Α.). Δεδομένης της μη κανονικής κατανομής των τιμών, η ανάλυση έγινε με τη βοήθεια του Mann-Whitney U test. Στατιστικά σημαντικές θεωρήθηκαν τιμές p < 0.05, ενώ τιμές p = 0.05 θεωρήθηκαν οριακής στατιστικής σημασίας (borderline significance).

55 55 6. Αποτελέσματα 6.1. Αποτελέσματα ανοσοϊστοχημικής εξέτασης για το KISS-1 Τα αποτελέσματα της ημιποσοτικής ανάλυσης του ανοσοϊστοχημικού σκορ για το KISS-1 παρουσιάζονται αναλυτικά για μία προς μία ασθενή στους Πίνακες 1, 2 και 3. Στις αδενομυωσικές εστίες (Πίνακας 1), η πρωτεϊνική έκφραση του KISS-1 στους έκτοπους αδένες ήταν υψηλή στις 20 από τις 29 ασθενείς, μέτρια σε οκτώ και χαμηλή σε μία ασθενή. Στο έκτοπο στρώμα υψηλή ήταν η πρωτεϊνική έκφραση σε δύο, μέτρια σε μία και χαμηλή σε 26 ασθενείς. Στις ίδιες ασθενείς, που είχαν αδενομύωση (Πίνακας 2), σε 12 περιπτώσεις οι ορθότοποι αδένες έδειξαν υψηλή πρωτεϊνική έκφραση, σε 15 μέτρια πρωτεϊνική έκφραση και χαμηλή σε δύο ασθενείς, ενώ στο ορθότοπο στρώμα η πρωτεϊνική έκφραση ήταν υψηλή σε 10, μέτρια σε 11 και χαμηλή σε οκτώ ασθενείς. Σε ό,τι αφορά το φυσιολογικό ενδομήτριο, ασθενών που δεν έπασχαν από αδενομύωση (Πίνακας 3), τόσο στους αδένες όσο και στο στρώμα, η πρωτεϊνική έκφραση διατηρήθηκε σε μέτρια επίπεδα στην πλειονότητα των ασθενών. Σε μία ασθενή η πρωτεϊνική έκφραση στους αδένες ήταν υψηλή, σε 23 ήταν μέτρια και σε πέντε χαμηλή, ενώ στο φυσιολογικό στρώμα η πρωτεϊνική έκφραση κυμάνθηκε σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε όλα τα δείγματα. Στον Πίνακα 4 και στην εικόνα 6 παρουσιάζονται τα σκορ Η (H-scores) για τους αδένες και το στρώμα από εστίες αδενομύωσης, ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο ασθενών με αδενομύωση και φυσιολογικό ενδομήτριο ασθενών χωρίς αδενομύωση. Τα παραπάνω στοιχεία αναλύθηκαν στατιστικά με τη χρήση του Mann-Whitney U test. Στην ανάλυση σε ασθενείς με αδενομύωση, η πρωτεϊνική έκφραση των έκτοπων αδένων ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των ορθότοπων αδένων (p<0,05), ενώ το έκτοπο στρώμα είχε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη πρωτεϊνική έκφραση συγκριτικά με το ορθότοπο στρώμα (p < 0,01). Η σύγκριση ασθενών με αδενομύωση με ασθενείς χωρίς αδενομύωση έδειξε στατιστικά σημαντικά υψηλότερη πρωτεϊνική έκφραση στους έκτοπους αδένες σε σύγκριση με τους αντίστοιχους ορθότοπου ενδομητρίου ασθενών

56 56 χωρίς αδενομύωση (p<0,001), ενώ στο στρώμα δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά (p>0,178). Τέλος, οι ορθότοποι αδένες και το ορθότοπο στρώμα ασθενών με αδενομύωση είχαν σημαντικά υψηλότερη πρωτεϊνική έκφραση συγκρινόμενα αντίστοιχα με τους φυσιολογικούς αδένες και το στρώμα ασθενών χωρίς αδενομύωση (p < για αμφότερες τις συγκρίσεις). Πίνακας 1: Βαθμολόγηση ανοσοϊστοχημικών χρώσεων σε εστίες αδενομύωσης (έκτοπο ενδομήτριο) ΑΔΕΝΟΜΥΩΣΗ ΑΔΕΝΕΣ ΣΤΡΩΜΑ ΕΝΤΑΣΗ ΕΝΤΑΣΗ ΗΛΙΚΙΑ ΚΩΔΙΚΟΣ SCORE SCORE / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / , , ,10345 (36-67)

57 57 Πίνακας 2: Βαθμολόγηση ανοσοϊστοχημικών χρώσεων σε ορθότοπο ενδομήτριο ασθενών με αδενομύωση. ΟΡΘΟΤΟΠΙΚΟ ΕΝΔΟΜΗΤΡΙΟ ΑΔΕΝΕΣ ΕΝΤΑΣΗ ΣΤΡΩΜΑ ΕΝΤΑΣΗ SCORE SCORE , ,4828

58 58 Πίνακας 3: Βαθμολόγηση ανοσοϊστοχημικών χρώσεων σε φυσιολογικό ενδομήτριο, ασθενών χωρίς αδενομύωση. ΕΝΤΑΣΗ ΑΔΕΝΕΣ ΕΝΤΑΣΗ ΣΤΡΩΜΑ ΗΛΙΚΙΑ ΚΩΔΙΚΟΣ SCORE SCORE / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / ,5517 1,

59 59 Πίνακας 4. Ανοσοϊστοχημικά σκορ της πρωτεϊνικής έκφρασης του KISS-1 στους αδένες και στο στρώμα από εστίες αδενομύωσης, ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο ασθενών με αδενομύωση και φυσιολογικό ενδομήτριο ασθενών χωρίς αδενομύωση αδένες σκορ IHC τμήμα ιστού n χαμηλό (0-2 βαθμοί) μέτρια (3-6 βαθμοί) υψηλή (8-12 βαθμοί) Έκτοποι Ορθότοποι Φυσιολογικοί* στρώμα Έκτοπο Ορθότοπο Φυσιολογικό* IHC score : immunohistochemical score * Από ασθενείς χωρίς αδενομύωση

60 60 H-scores έκτοπο ορθότοπο φυσιολογικό αδένες στρώμα Εικόνα 6. Μέσες τιμές των H-scores πρωτεϊνικής έκφρασης του KISS-1 στους αδένες και στο στρώμα από εστίες αδενομύωσης, ορθότοπο (ή εύτοπο) ενδομήτριο ασθενών με αδενομύωση και φυσιολογικό ενδομήτριο ασθενών χωρίς αδενομύωση

61 61 Εικόνα 7. Σχετικά χαμηλότερη πρωτεϊνική έκφραση του KISS-1 σε μεγαλύτερους έκτοπους αδένες, συγκριτικά με το περιβάλλον στρώμα σε αδενομύωση (x 100). Λευκό βέλος = αδένας, μαύρο βέλος = στρώμα.

62 62 Εικόνα 8. Σχετικά χαμηλότερη πρωτεϊνική έκφραση του KISS-1 σε ένα μεγαλύτερο έκτοπο αδένα, συγκριτικά με ένα μικρότερο αδένα όπου παρατηρείται υψηλή πρωτεϊνική έκφραση στην αδενομύωση (x 100). Λευκό βέλος = μικρότερος αδένας, μαύρο βέλος = μεγαλύτερος αδένας.