ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΖΑΧΑΡΕΝΙΑΣ ΛΟΥΚΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΖΑΧΑΡΕΝΙΑΣ ΛΟΥΚΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΩΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΑΛΚΟΟΛΟΥΧΑ ΠΟΤΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2003

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΖΑΧΑΡΕΝΙΑΣ ΛΟΥΚΟΥ ΧΗΜΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟ ΩΝ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΟΥ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΑΛΚΟΟΛΟΥΧΑ ΠΟΤΑ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, του Τοµέα Φυσικής Αναλυτικής και Περιβαλλοντικής Χηµείας, του Τµήµατος Χηµείας, του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επίκουρη Καθηγήτρια Α. ΖΩΤΟΥ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Καθηγητής Ι. ΣΤΡΑΤΗΣ (Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Αναπληρωτής Καθηγητής Ε. ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ (Μέλος συµβουλευτικής επιτροπής) Καθηγητής. Μπόσκου Καθηγητής Ι. Παπαδογιάννης Επίκουρος Καθηγητής Γ. Ζαχαριάδης Επίκουρη Καθηγήτρια Β. Σαµανίδου

3 Η επταµελής εξεταστική επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της ιδακτορικής ιατριβής της Ζαχαρένιας Λούκου, Χηµικού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης την 29 η Οκτωβρίου 2003, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της διατριβής µε τίτλο: «Ανάπτυξη Μεθόδων Ταυτόχρονου Προσδιορισµού Βιογενών Αµινών µε Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης και Εφαρµογή σε Αλκοολούχα Ποτά». Η επιτροπή έκρινε οµόφωνα ότι η διατριβή είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συµβολή στην πρόοδο της Επιστήµης. ΤΑ ΜΕΛΗ ΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Καθηγητής. ΜΠΟΣΚΟΥ Καθηγητής Ι. ΠΑΠΑ ΟΓΙΑΝΝΗΣ Καθηγητής Ι. ΣΤΡΑΤΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Ε. ΣΟΥΦΛΕΡΟΣ Επίκουρος Καθηγητής Γ. ΖΑΧΑΡΙΑ ΗΣ Επίκουρη Καθηγήτρια Α. ΖΩΤΟΥ Επίκουρη Καθηγήτρια Β. ΣΑΜΑΝΙ ΟΥ

4 «Η έγκριση της ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέα» (Νόµος 5343 / 1932, αρθρ. 202 παρ. 2)

5 Στην οικογένειά µου

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 1 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ Γενικά περί βιογενών αµινών Οι βιογενείς αµίνες στα τρόφιµα Τρόφιµα που δεν έχουν υποστεί ζύµωση Τρόφιµα που έχουν υποστεί ζύµωση Μικροοργανισµοί υπεύθυνοι για τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών Παράγοντες που επηρεάζουν τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών Ρόλος και σπουδαιότητα των βιογενών αµινών Τοξικότητα Μέθοδοι προσδιορισµού των βιογενών αµινών Βιβλιογραφική επισκόπηση Αντικείµενο της διατριβής Σκοπός της διατριβής Πλεονεκτήµατα ΙΙ. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2. ΘΕΩΡΙΑ ΤΗΣ ΥΓΡΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ ΕΙ Η ΤΗΣ HPLC ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΣΥΓΚΡΑΤΗΣΗΣ Χρωµατογραφία Προσρόφησης (Adsorption Chromatography ) Χρωµατογραφία Αντίστροφης Φάσης (RPC) Χρωµατογραφία Κανονικής Φάσης (NPC) Χρωµατογραφία Ιοντοανταλλαγής (Ion- Exchange Chromatography).. 37

7 3.3. Χρωµατογραφία Αποκλεισµού Μεγέθους (Size Exclusion 37 Chromatography) Χρωµατογραφία Κατανοµής (Partition Chromatography) Χρωµατογραφία Συγγένειας (Affinity Chromatography) Χρωµατογραφία Σχηµατισµού Ζεύγους Ιόντων (Ion-Pair Chromatography) ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ HPLC οχεία διαλυτών Απαέρωση διαλυτών Είδη έκλουσης Ισοκρατική έκλουση Βαθµωτή έκλουση Αντλίες HPLC Αντλίες σταθερής πίεσης Αντλίες πεπιεσµένου αέρα Αντλίες ενίσχυσης της πίεσης Αντλίες σταθερής ροής Αντλίες παλινδρόµησης Αντλίες τύπου σύριγγας Αντλίες ισοκρατικής και βαθµωτής έκλουσης Συστήµατα εισαγωγής δείγµατος Αναλυτικές στήλες Υλικά πλήρωσης HPLC Χηµικώς τροποποιηµένα υλικά πλήρωσης Ανιχνευτές Γενικά χαρακτηριστικά ανιχνευτών HPLC Είδη ανιχνευτών Ανιχνευτές Υπεριώδους Ορατού (UV-Vis) Ανιχνευτές Παράταξης Φωτοδιόδων Φθορισµοµετρικοί Ανιχνευτές.. 63

8 Φασµατογράφος Μαζών Συστήµατα καταγραφής αποτελεσµάτων ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Παραγωγοποίηση (Derivatization) Βελτίωση των ιδιοτήτων ανίχνευσης (Detectability) Παραγωγοποίηση για ανίχνευση Υπεριώδους Ορατού Παραγωγοποίηση για Φθορισµοµετρική ανίχνευση Παραγωγοποίηση πρίν από και µετά τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό (Pre- and Post- Colum Derivatization) Παραγωγοποίηση πριν από τον χρωµατογραφικό 73 διαχωρισµό Παραγωγοποίηση µετά τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό Εκχύλιση Στερεάς Φάσης - Υγρού (Solid Phase Extraction) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Επικύρωση της µεθόδου Εκτιµητική στατιστική οκιµασία t (t-τest) οκιµασία t του µέσου δύο δειγµάτων συσχετισµένων ζευγών (Paired t - test). 86 III. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7. ΟΡΓΑΝΑ ΣΥΣΚΕΥΕΣ Όργανα Συσκευές ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ ΥΛΙΚΑ Αντιδραστήρια Υλικά. 93

9 9. ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΑΝΑΛΥΤΙΚΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ Εύρεση κατάλληλου εκλουστικού συστήµατος Εύρεση βέλτιστων συνθηκών παραγωγοποίησης Επίδραση της συγκέντρωσης του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης Επίδραση της τιµής ph Επίδραση της θερµοκρασίας Επίδραση του χρόνου Εύρεση κατάλληλων συνθηκών Εκχύλισης Στερεάς Φάσης - Υγρού Εύρεση βέλτιστων συνθηκών προκατεργασίας δειγµάτων οίνου και ζύθου Στάδια βέλτιστης διαδικασίας προσδιορισµού των βιογενών αµινών ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΊΧΝΕΥΣΗ Βελτιστοποίηση συνθηκών ανίχνευσης Χάραξη καµπυλών αναφοράς πρότυπων διαλυµάτων Ακρίβεια και επαναληπτικότητα της µεθόδου κατά τη διάρκεια της ίδιας ηµέρας και κατά τη διάρκεια διαδοχικών ηµερών Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού της µεθόδου Εφαρµογή της µεθόδου σε δείγµατα οίνου και ζύθου Μελέτη της ανάκτησης της µεθόδου ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ Βελτιστοποίηση συνθηκών ανίχνευσης Χάραξη καµπυλών αναφοράς πρότυπων διαλυµάτων 137

10 11.3. Ακρίβεια και επαναληπτικότητα της µεθόδου κατά τη διάρκεια της ίδιας ηµέρας και κατά τη διάρκεια διαδοχικών ηµερών Όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισµού της µεθόδου Εφαρµογή της µεθόδου σε δείγµατα οίνου και ζύθου Μελέτη της ανάκτησης της µεθόδου ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΗΣ ΚΑΘΑΡΟΤΗΤΑΣ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΚΟΡΥΦΩΝ ΤΩΝ ΝΤΑΝΣΥΛΑΜΙ ΙΩΝ ΜΕ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ (LC-MS) ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΒΙΟΓΕΝΩΝ ΑΜΙΝΩΝ ΜΕ ΤΑΥΤΟΧΡΟΝΗ ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΚΑΙ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΊΧΝΕΥΣΗ Χάραξη καµπυλών αναφοράς πρότυπων διαλυµάτων Ακρίβεια και επαναληπτικότητα της µεθόδου ταυτόχρονης ανίχνευσης κατά τη διάρκεια της ίδιας ηµέρας και κατά τη διάρκεια διαδοχικών ηµερών Εφαρµογή της µεθόδου ταυτόχρονης ανίχνευσης σε δείγµατα 168 οίνου και ζύθου Μελέτη της ανάκτησης της µεθόδου ταυτόχρονης ανίχνευσης ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΕΣ ΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΗΤΑΣ 183 IV. ΑΝΑΚΕΦΑΛΑΙΩΣΗ 189 V. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 199 VI. EXTENDED SUMMARY 201

11 VII. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 205 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι 213 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙI 237 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙII 241

12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η διατριβή αυτή εντάσσεται στα πλαίσια της ερευνητικής δραστηριότητας του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χηµείας του Τµήµατος Χηµείας του Α.Π.Θ., µε στόχο την ανάπτυξη νέων µεθόδων ανάλυσης. Ειδικότερα δε, αποτελεί συνέχεια της προσπάθειας ανάπτυξης νέων χρωµατογραφικών µεθόδων, χρησιµοποιώντας την τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης, για τον ταυτόχρονο προσδιορισµό οργανικών κυρίως ενώσεων, σε ποικίλα δείγµατα. Αντικείµενο της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη χρωµατογραφικών µεθόδων ανάλυσης βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά. Οι βιογενείς αµίνες, σε χαµηλές συγκεντρώσεις, είναι απαραίτητες για πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του ανθρώπινου οργανισµού, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις µπορεί να έχουν τοξική επίδραση, ιδιαίτερα παρουσία αιθανόλης, εξαιτίας της συνεργιστικής της δράσης µε τις βιογενείς αµίνες. Για τον λόγο αυτό, είναι απαραίτητη η ανάπτυξη ευαίσθητων, εκλεκτικών και αξιόπιστων µεθόδων ελέγχου των επιπέδων των βιογενών αµινών, σε αλκοολούχα ποτά ευρείας κατανάλωσης, όπως είναι οι οίνοι και οι ζύθοι. Στην παρούσα διατριβή αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν µέθοδοι ταυτόχρονου προσδιορισµού έντεκα βιογενών αµινών, µε την τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης-αντίστροφης φάσης, µετά από παραγωγοποίηση των αµινών µε ντανσυλοχλωρίδιο και στη συνέχεια καθαρισµό των παραγώγων από τα παραπροϊόντα της αντίδρασης, χρησιµοποιώντας Εκχύλιση Στερεάς Φάσης-Υγρού. Η ανίχνευση πραγµατοποιήθηκε µε χρήση φασµατοφωτοµετρικού και φθορισµοµετρικού ανιχνευτή (ανεξάρτητα και ταυτόχρονα). Οι µέθοδοι αυτές εφαρµόστηκαν µε πολύ ικανοποιητικά αποτελέσµατα, στην ανάλυση δειγµάτων Ελληνικών οίνων και ζύθων. Η αξιοπιστία των µεθόδων που αναπτύχθηκαν, επιβεβαιώθηκε επίσης και µε τον έλεγχο της καθαρότητας και την ταυτοποίηση των κορυφών, µε χρήση Υγρής Χρωµατογραφίας και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων σε σειρά µε Φασµατοµετρία Μαζών (LC-MS). Τέλος, πραγµατοποιήθηκε σύγκριση των συστηµάτων ανίχνευσης και επεξεργασία των αποτελεσµάτων, µε εφαρµογή 1

13 στατιστικών δοκιµασιών σηµαντικότητας διαφορών (δοκιµασίες t). Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται για πρώτη φορά, απ ότι γνωρίζουµε, φθορισµοµετρική ανίχνευση ντανσυλοπαραγώγων των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά, ταυτοποίηση των παραγώγων µε LC-MS, καθώς και εφαρµογή ταυτόχρονης φασµατοφωτοµετρικής και φθορισµοµετρικής ανίχνευσης µε παράλληλη στατιστική σύγκριση των αποτελεσµάτων. Το σύνολο σχεδόν του πειραµατικού µέρους της διατριβής αυτής πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, στο χρονικό διάστηµα Το µέρος των αναλύσεων που αφορούσε στην ταυτοποίηση των ενώσεων µε Υγρή Χρωµατογραφία Φασµατοφωτοµετρία Μαζών, πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του Τεχνικού Πανεπιστηµίου της Βιέννης, κατά τη διάρκεια της παραµονής µου εκεί στα πλαίσια του προγράµµατος Erasmus-Socrates. Στο σηµείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Αναστασία Ζώτου, για την υπόδειξη του θέµατος της διατριβής, τη συνεχή επιστηµονική καθοδήγηση, το αµείωτο ενδιαφέρον και την υποµονή της κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής. Θεωρώ υποχρέωσή µου να ευχαριστήσω θερµά τον Καθηγητή κ. Ι. Στράτη, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, για την παρακολούθηση της πορείας της διατριβής, τις εύστοχες υποδείξεις και συµβουλές του και την ηθική συµπαράσταση του σ όλη τη διάρκεια της διατριβής. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Ε. Σουφλερό, µέλος της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής, εκφράζω τις θερµές ευχαριστίες µου για την παρακολούθηση της πορείας της διατριβής, τις εύστοχες υποδείξεις του και την ένταξη µέρους της διατριβής αυτής σε ερευνητικό πρόγραµµα ΠΕΝΕ µε τίτλο: «Βιογενείς Αµίνες στους Ελληνικούς Οίνους» (Αρ. Έργου Ε.Ε. 1957), του οποίου ήταν ο επιστηµονικώς υπεύθυνος. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου προς τη ΓΓΕΤ, για την οικονοµική ενίσχυση του µέρους της διατριβής που εντάσσονταν στο πρόγραµµα ΠΕΝΕ. 2

14 Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή κ. Ι. Παπαδογιάννη, τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Γ. Ζαχαριάδη, την Επικίκουρη Καθηγήτρια κ. Β. Σαµανίδου και τον Λέκτορα κ. Γ. Θεοδωρίδη, για τις χρήσιµες συζητήσεις σε θέµατα της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερµά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. E. Rosenberg, του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χηµείας, του Τεχνικού Πανεπιστηµίου της Βιέννης, για την πολύτιµη βοήθειά του σε τεχνικά θέµατα, κατά τη διάρκεια της παραµονής µου στο εργαστήριο. Ακόµη ευχαριστώ θερµά όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Αναλυτικής Χηµείας, για τη φιλική ατµόσφαιρα συνεργασίας που µου πρόσφεραν. Τέλος, ευχαριστώ την οικογένειά µου που µε στήριξε ηθικά στην προσπάθειά µου αυτή. Θεσσαλονίκη, 2003 Ζαχαρένια Λούκου 3

15 4

16 Ι. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα τελευταία χρόνια, στα πλαίσια του ποιοτικού ελέγχου, η έρευνα στην αναλυτική χηµεία έχει στραφεί στην ανάλυση τροφίµων και ποτών για τον προσδιορισµό ενώσεων, οι οποίες ενώ περιέχονται σε µικρές συγκεντρώσεις, µπορεί να έχουν σηµαντικές επιπτώσεις στην ανθρώπινη υγεία. Οι βιογενείς αµίνες, οι οποίες από αναλυτική σκοπιά αποτελούν το αντικείµενο έρευνας της παρούσας διδακτορικής διατριβής, ανήκουν σ αυτή την κατηγορία ενώσεων. Ειδικότερα, στην παρούσα εργασία αναπτύσσονται αναλυτικές µέθοδοι προσδιορισµού τους, οι οποίες εφαρµόζονται στην ανάλυση αλκοολούχων ποτών και συγκεκριµένα σε δείγµατα ελληνικού οίνου (λευκού, ερυθρού και ρητινίτη), και ζύθου. Παρ ότι οι συγκεντρώσεις των βιογενών αµινών στα αλκοολούχα ποτά είναι σχετικά χαµηλές, µπορεί να επηρεάσουν τη φυσιολογική λειτουργία του ανθρώπινου οργανισµού (αλλεργικές αντιδράσεις, τοξική επίδραση κ.ά.). Το γεγονός αυτό, σε συνδυασµό µε την πιθανή υψηλή κατανάλωση αλκοολούχων ποτών και την επιβλαβή συνεργιστική δράση της αιθανόλης, καθιστά απόλυτα δικαιολογηµένη τη συνεχή προσπάθεια για ανάπτυξη περισσότερο ευαίσθητων και αξιόπιστων µεθόδων προσδιορισµού των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά. 1. ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ 1.1. Γενικά περί βιογενών αµινών Οι βιογενείς αµίνες είναι βασικές αζωτο-ενώσεις οι οποίες σχηµατίζονται κυρίως κατά την αποκαρβοξυλίωση των αντίστοιχων αµινοξέων. Είναι οργανικές ενώσεις µε σαφή βασικότητα, χαµηλής σχετικής µοριακής µάζας, οι οποίες συντίθενται κατά τη διάρκεια του µεταβολισµού σε φυτά, ζώα και ανθρώπους. Σύµφωνα µε το κριτήριο κατά Smith [1, 2], από τις ενώσεις που ορίζονται ως «βιογενείς αµίνες» εξαιρούνται εκείνες που έχουν καρβοξυλική οµάδα στο µόριό τους, ακόµη κι αν πρόκειται για βασικές αζωτο-ενώσεις. Οι βιογενείς αµίνες στα τρόφιµα και τα ποτά σχηµατίζονται κατά τη δράση των ενζύµων που υπάρχουν 5

17 στις πρώτες ύλες ή κατά τη µικροβιακή αποκαρβοξυλίωση των ελεύθερων αµινοξέων [3]. Ορισµένα αµινοξέα αποκαρβοξυλιώνονται προς CO 2 και βιογενείς αµίνες (πρωτοταγείς αµίνες). Η γενική αντίδραση έχει ως εξής: R-CH(NH 2 )-COOH R-CH 2 NH 2 + CO 2 (1.1) Τα ένζυµα που καταλύουν την αντίδραση αποκαρβοξυλίωσης (αποκαρβοξυλάσες) έχουν φωσφορική πυριδοξάλη ως συνένζυµο, που δρα µε τη δηµιουργία βάσης Schiff. Με τον µηχανισµό αυτό δηµιουργούνται βιολογικά σηµαντικές αµίνες από τα αντίστοιχα αµινοξέα, όπως η ισταµίνη από την ιστιδίνη, η τρυπταµίνη από την τρυπτοφάνη, η τυραµίνη από την τυροσίνη, η 2- φαινυλαιθυλαµίνη από τη φαινυλαλανίνη, η καδαβερίνη από τη λυσίνη κ.ο.κ. Μια σηµαντική κατηγορία ενώσεων είναι οι πολυαµίνες, οι οποίες προέρχονται από την πουτρεσκίνη, που είναι η βιογενής αµίνη της ορνιθίνης στα θηλαστικά. Η πουτρεσκίνη προέρχεται από την αργινίνη µε ενδιάµεσο σχηµατισµό της ορνιθίνης. Από την πουτρεσκίνη και µε συµµετοχή της S-αδενοσυλ-µεθειονίνης δηµιουργούνται οι πολυαµίνες σπερµίνη και σπερµιδίνη, που παίζουν σηµαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση της δοµής των ριβοσωµατίων και νουκλεοπρωτεϊνών γενικά, συµπεριλαµβανοµένων ορισµένων ιών και του DNA πολλών οργανισµών [4, 5]. Λαµβάνοντας υπόψη τη δοµή τους καθώς και τις διάφορες επιπτώσεις που µπορεί να έχουν στον ανθρώπινο οργανισµό, οι βιογενείς αµίνες, που εξετάζονται στην παρούσα εργασία, µπορούν να ταξινοµηθούν σε τρεις κατηγορίες: Τις αρωµατικές και ετεροκυκλικές αµίνες ισταµίνη, τυραµίνη, 2- φαινυλαιθυλαµίνη και τρυπταµίνη στις οποίες αποδίδεται κάποια τοξικότητα και ευθύνονται για συµπτώµατα όπως ναυτία, πονοκέφαλοι κ.ά. Τις αλειφατικές δι-, τρι-, και πολυαµίνες πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, σπερµίνη και σπερµιδίνη οι οποίες ανήκουν στον ίδιο µεταβολικό κύκλο και ενισχύουν την τοξικότητα των αρωµατικών και ετεροκυκλικών αµινών. 6

18 Τις αλειφατικές πτητικές αµίνες µεθυλαµίνη, αιθυλαµίνη και ισοαµυλαµίνη για τις οποίες δεν έχουν αναφερθεί τοξικές ή άλλες επιπτώσεις, ο προσδιορισµός των οποίων όµως είναι απαραίτητος, γιατί µπορούν να αλλοιώσουν τις οργανοληπτικές ιδιότητες ορισµένων τροφίµων [6]. Οι συντακτικοί τύποι των αµινών αυτών δίνονται παρακάτω: Μεθυλαµίνη CH 3 NH 2 Αιθυλαµίνη CH 3 CH 2 NH 2 Ισοαµυλαµίνη (CH 3 ) 2 CHCH 2 CH 2 NH 2 Πουτρεσκίνη H 2 N(CH 2 ) 4 NH 2 Καδαβερίνη H 2 N(CH 2 ) 5 NH 2 Σπερµιδίνη H 2 N(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NH 2 Σπερµίνη H 2 N(CH 2 ) 3 NH(CH 2 ) 4 NH(CH 2 ) 3 NH 2 Τρυπταµίνη 2-Φαινυλαιθυλαµίνη Ισταµίνη Τυραµίνη Προϋποθέσεις για τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών διαµέσου της αποκαρβοξυλίωσης των αµινοξέων από τους µικροοργανισµούς, αποτελούν: Η διαθεσιµότητα ελεύθερων αµινοξέων, η οποία όµως δεν οδηγεί πάντα στο σχηµατισµό βιογενών αµινών [7]. Η παρουσία θετικών µικροοργανισµών ως προς την αποκαρβοξυλίωση (decarboxylase positive microorganisms) Συνθήκες που ευνοούν την ανάπτυξη βακτηριδίων, τη σύνθεση της αποκαρβοξυλάσης και τη δράση της [8]. 7

19 1.2. Οι βιογενείς αµίνες στα τρόφιµα Οι βιογενείς αµίνες βρίσκονται φυσιολογικά σε όλα τα τρόφιµα, που περιέχουν πρωτεΐνες ή ελεύθερα αµινοξέα και συντρέχουν εκείνες οι συνθήκες, οι οποίες επιτρέπουν τη µικροβιακή ή βιοχηµική δραστηριότητα. Η συνολική ποσότητα των διάφορων βιογενών αµινών που σχηµατίζονται εξαρτάται σηµαντικά από τη φύση των τροφίµων και τους µικροοργανισµούς που υπάρχουν σ αυτά. Βιογενείς αµίνες, σε σηµαντικές ποσότητες, βρίσκονται σ ένα ευρύ φάσµα τροφίµων, συµπεριλαµβανοµένων των ψαριών, του κρέατος και των υποπροϊόντων τους, των γαλακτοκοµικών προϊόντων και ιδιαίτερα των τυριών, των αλκοολούχων ποτών, όπως οι οίνοι και οι ζύθοι, των διάφορων φρούτων και λαχανικών, των ξηρών καρπών και της σοκολάτας [8]. Όλες οι παραπάνω οµάδες τροφίµων µπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: Στα τρόφιµα τα οποία υπόκεινται σε ζυµώσεις και σ αυτά που δεν υπόκεινται. Ως ζύµωση ορίζεται κάθε επιθυµητή βιοχηµική µεταβολή ενός πρωτογενούς τροφίµου, η οποία προκαλείται από τη δράση µικροοργανισµών και ενζύµων. Η ζύµωση πραγµατοποιείται, µε σκοπό να ενισχύσει τη γεύση, το άρωµα, την υφή, τη διατροφική αξία, τη διάρκεια ζωής και άλλες επιθυµητές ιδιότητες των τροφίµων [9] Τρόφιµα που δεν έχουν υποστεί ζύµωση Στα τρόφιµα τα οποία δεν έχουν υποστεί ζύµωση, η παρουσία ορισµένων βιογενών αµινών, πάνω από ένα ορισµένο επίπεδο, θεωρείται ένδειξη µη επιθυµητής µικροβιακής δράσης. Έτσι, τα επίπεδα των βιογενών αµινών µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες µικροβιακής αλλοίωσης. Παρ όλα αυτά, η ύπαρξη βιογενών αµινών στα τρόφιµα δε συνδέεται απαραίτητα µε την ανάπτυξη µικροοργανισµών αλλοίωσης, µιας και δεν είναι όλοι θετικοί ως προς την αποκαρβοξυλίωση (decarboxylase positive) [10]. Τα επίπεδα της ισταµίνης, της πουτρεσκίνης και της καδαβερίνης, συνήθως αυξάνονται κατά την αλλοίωση των ψαριών και των κρεάτων, ενώ τα επίπεδα της σπερµίνης και της σπερµιδίνης ελαττώνονται [8]. Ψάρια: Το σκουµπρί είναι το ψάρι που έχει συνδεθεί µε περιστατικά δηλητηρίασης από ισταµίνη. Ο σχηµατισµός της ισταµίνης στο σκουµπρί και σε 8

20 άλλα ψάρια, πλούσια σε ιστιδίνη, αποδίδεται περισσότερο σε µικροβιακή δράση, παρά σε ενδογενή δράση της αποκαρβοξυλάσης της ιστιδίνης [11]. ιάφορες αµίνες όπως η ισταµίνη, η πουτρεσκίνη, η καδαβερίνη, η τυραµίνη, η σπερµίνη και η σπερµιδίνη, έχουν ανιχνευτεί σε ψάρια όπως ο κολιός, η ρέγκα, ο τόνος και οι σαρδέλες [3]. Άλλες αµίνες όπως η τριµεθυλαµίνη και η διµεθυλαµίνη υπάρχουν στα ψάρια και σε προϊόντα τους, σε επίπεδα που εξαρτώνται από τη νωπότητά τους [12]. Φρούτα, χυµοί και λαχανικά: Αρκετοί χυµοί που παρασκευάζονται από πορτοκάλια, µούρα, λεµόνια, µανταρίνια, φράουλες και σταφύλια περιέχουν διάφορες βιογενείς αµίνες, σε ποικίλα επίπεδα συγκεντρώσεων, µε την πουτρεσκίνη να είναι η πιο σηµαντική. Υψηλά επίπεδα αµινών έχουν επίσης αναφερθεί στις ντοµάτες, στις µπανάνες, στα δαµάσκηνα και στο σπανάκι. Η φαινυλαιθυλαµίνη αποτελεί φυσικό συστατικό των κόκκων του κακάο, οπότε συναντάται και στη σοκολάτα και τα υποπροϊόντα της. Τέλος, µερικές ποικιλίες µανιταριών περιέχουν υψηλά επίπεδα φαινυλαιθυλαµίνης [3]. Κρέας: Το φρέσκο και το επεξεργασµένο χοιρινό κρέας περιέχουν υψηλά επίπεδα αδρεναλίνης, σπερµιδίνης και σπερµίνης, αλλά χαµηλά επίπεδα νοραδρεναλίνης, πουτρεσκίνης, ισταµίνης, καδαβερίνης και τυραµίνης. Επίσης, σε διάφορους άλλους τύπους κρέατος έχουν ανιχνευτεί διάφορες βιογενείς αµίνες [3]. Γάλα: Στο ανθρώπινο γάλα έχουν ανιχνευτεί σπερµίνη, σπερµιδίνη και πουτρεσκίνη µε µεγάλες διαφοροποιήσεις από άτοµο σε άτοµο [3]. Στο πλήρες και ηµιαποβουτυρωµένο αγελαδινό γάλα, αυτές οι πολυαµίνες έχουν προσδιοριστεί σε χαµηλά επίπεδα [13] Τρόφιµα που έχουν υποστεί ζύµωση Κατά τη διαδικασία ζύµωσης στα τρόφιµα, υπάρχουν διάφοροι µικροοργανισµοί µερικοί από τους οποίους είναι ικανοί να παράγουν συνθετικά βιογενείς αµίνες από τα αντίστοιχα αµινοξέα. Στα περισσότερα προϊόντα ζύµωσης, στα οποία αναπτύσσονται βακτήρια του γαλακτικού οξέος, περιέχονται σηµαντικές ποσότητες πουτρεσκίνης, καδαβερίνης, ισταµίνης και τυραµίνης [8]. 9

21 Τυριά και γαλακτοκοµικά προϊόντα: Μετά τα ψάρια, τα τυριά είναι το τρόφιµο, το οποίο συνδέεται συχνότερα µε περιστατικά δηλητηρίασης από ισταµίνη. Έχουν πραγµατοποιηθεί πολλές µελέτες για τον προσδιορισµό του περιεχοµένου των αµινών στα τυριά. ιάφορες αµίνες όπως η ισταµίνη, η τυραµίνη, η καδαβερίνη, η πουτρεσκίνη, η τρυπταµίνη και η φαινυλαιθυλαµίνη έχουν προσδιοριστεί σε πολλούς τύπους τυριών. Η περιεκτικότητά τους ποικίλλει τόσο από είδος σε είδος, όσο και στο ίδιο είδος τυριού, ανάλογα µε την παρτίδα παραγωγής [14]. Προϊόντα κρέατος: Τα διάφορα προϊόντα κρέατος, όπως τα αλλαντικά, δεν έχουν µελετηθεί εκτενώς, όµως σύµφωνα µε τις µελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί, οι συνθήκες και ο χρόνος αποθήκευσης καθώς και η διαδικασία παρασκευής παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των µικροοργανισµών που ευθύνονται για την παραγωγή των αµινών [10, 15]. Προϊόντα ψαριών: Παρ ότι δεν έχουν γίνει αρκετές µελέτες για τον προσδιορισµό των βιογενών αµινών σε προϊόντα ψαριών, όπως οι διάφορες πάστες και τα αλίπαστα, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα επίπεδα των βιογενών αµινών παρουσιάζουν σηµαντικές διακυµάνσεις. Κατά τις αναλύσεις παστών σαρδελών, έχουν παρατηρηθεί υψηλά επίπεδα βιογενών αµινών, που αποδίδονται στις συνθήκες παρασκευής, οι οποίες ευνοούν τη δράση των µικροοργανισµών [16]. Ποτά προϊόντα ζύµωσης: Ποτά, τα οποία έχουν υποστεί ζυµώσεις, όπως οι οίνοι και οι ζύθοι, περιέχουν βιογενείς αµίνες, µερικές φορές σε υψηλές συγκεντρώσεις. Παρ ότι οι βιογενείς αµίνες στα ποτά αυτά κυµαίνονται συνήθως σε χαµηλότερα επίπεδα απ ότι σε άλλα τρόφιµα, όπως τα τυριά και τα ψάρια, η κατανάλωση ποτών σε µεγάλες ποσότητες, σε συνδυασµό µε τη συνεργιστική δράση της αιθανόλης, καθιστούν απαραίτητη τη µελέτη προσδιορισµού των επιπέδων των βιογενών αµινών. Οι βιογενείς αµίνες στους οίνους προκύπτουν κυρίως από την αποκαρβοξυλίωση των αµινοξέων, τα οποία υπάρχουν σε υψηλά ποσοστά στα σταφύλια και κατ επέκταση στο γλεύκος. Η συγκέντρωση των αµινοξέων στους οίνους εξαρτάται από τις κλιµατολογικές συνθήκες και τις συνθήκες λίπανσης κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των σταφυλιών καθώς και από τις βιοχηµικές αντιδράσεις, που λαµβάνουν χώρα τόσο κατά τη διάρκεια όσο και µετά τις 10

22 ζυµώσεις του γλεύκους. Τα αµινοξέα αποτελούν το % του συνολικού αζώτου στους οίνους. Η προέλευση των βιογενών αµινών στους οίνους αποτελεί ακόµη και σήµερα θέµα αντιπαράθεσης [17]. Ορισµένες αµίνες, όπως η αιθανολαµίνη, η τυραµίνη και η ισταµίνη, υπάρχουν ήδη σε χαµηλές συγκεντρώσεις στο γλεύκος ( 3,5 mg.l -1 ). Έχει αναφερθεί ότι υψηλές συγκεντρώσεις βιογενών αµινών ( 30 mg.l -1 ) προκύπτουν από τη δράση των ζυµών κατά την αλκοολική ζύµωση. Αρκετοί ερευνητές αποδίδουν τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών στους οίνους στη δράση γαλακτικών βακτηρίων κατά τη µηλογαλακτική ζύµωση, ενώ άλλοι τον αποδίδουν κυρίως στη δράση των ζυµών [18-21]. Τέλος, ορισµένοι ερευνητές [18] έδειξαν ότι υπάρχει η δυνατότητα οι βιογενείς αµίνες να δηµιουργούνται ως αποτέλεσµα της δράσης µικροοργανισµών που επιµολύνουν τους οίνους, ενώ άλλοι [22, 23] θεωρούν την παρουσία της ισταµίνης µόνο ή και των άλλων βιογενών αµίνών ως ένδειξη ανθυγιεινών συνθηκών, που επικρατούν κατά την παραγωγή των οίνων. Περισσότερες από 20 βιογενείς αµίνες έχουν ταυτοποιηθεί στους οίνους και έχουν αναφερθεί συγκεντρώσεις γι αυτές, που κυµαίνονται από λίγα mg.l -1 έως περίπου 50 mg.l -1, ανάλογα µε την ποιότητα και τον τύπο του οίνου [24]. Το είδος και τα επίπεδα των βιογενών αµινών στους ζύθους επηρεάζεται κυρίως από τις πρώτες ύλες, την τεχνική ζυθοποίησης και τις συνθήκες υγιεινής, που τηρούνται κατά την παραγωγή τους. Υψηλά επίπεδα πουτρεσκίνης, αγµατίνης, σπερµιδίνης και σπερµίνης καθώς και η ισταµίνη, 2- φαινυλαιθυλαµίνη, τρυπταµίνη και καδαβερίνη σε χαµηλές συγκεντρώσεις υπάρχουν συνήθως στη βύνη. Κατά την παραγωγή των ζύθων και την αποθήκευσή τους, σχηµατίζονται και συσσωρεύονται διάφορες αµίνες. Όπως και στους οίνους, έτσι και στους ζύθους ο σχηµατισµός των βιογενών αµινών αποδίδεται σε διάφορους παράγοντες. Εξαιτίας της υψηλής κατανάλωσης ζύθου ο προσδιορισµός των επιπέδων των βιογενών αµινών είναι απαραίτητος. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί τα επίπεδα των βιογενών αµινών σε Αµερικανικούς, Ευρωπαϊκούς και Βραζιλιάνικους ζύθους [25-27], δεν υπάρχουν όµως στοιχεία για τα επίπεδα των βιογενών αµινών τόσο σε Ελληνικούς οίνους όσο και σε Ελληνικούς ζύθους. 11

23 1.3. Μικροοργανισµοί υπεύθυνοι για τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι βιογενείς αµίνες δηµιουργούνται από τα αντίστοιχα αµινοξέα κατά την παρουσία ειδικών (για κάθε αµινοξύ) µικροβιακών ενζύµων, που είναι γνωστά ως αποκαρβοξυλάσες. Ορισµένα είδη βακτηρίων που ανήκουν σε διαφορετικά γένη, όπως Baccilus, Citrobacter, Clostridium, Klebsiella, Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Photobacterium, καθώς και τα γαλακτικά βακτήρια Lactobacillus, Pediococcus και Streptococcus, έχουν την απαραίτητη αποκαρβοξυλάση και είναι ικανά να αποκαρβοξυλιώσουν ένα ή περισσότερα αµινοξέα [8, 28]. Γαλακτικά βακτήρια, ικανά να παράγουν βιογενείς αµίνες, όπως τα Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchnerri, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus divergens και Lactobacillus hilgatdii έχουν αποµονωθεί στο κρέας και σε προϊόντα του [29]. Τα βακτήρια Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus mitis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bunchnerii, Streptococcus lactis καθώς και άλλα είδη των Streptococcus και Lactobacillus, έχουν αποµονωθεί από διάφορους τύπους τυριών και θεωρούνται υπεύθυνα για τον σχηµατισµό αµινών, όπως η ισταµίνη, η πουτρεσκίνη και η καδαβερίνη [14]. Ο ρόλος των βακτηρίων του γαλακτικού οξέος µελετήθηκε εκτενώς, αφού η µηλογαλακτική ζύµωση θεωρείται υπεύθυνη για τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών στους οίνους, µε τη δράση των βακτηρίων Lactobacillus και Pediococcus [14, 30]. Στην περίπτωση των τροφίµων και ποτών που υφίστανται ζυµώσεις, η χρήση καλλιεργειών που προκαλούν την έναρξη της ζύµωσης µπορεί να επηρεάσει τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών, άµεσα ή έµµεσα, διαµέσου των αλληλεπιδράσεων µεταξύ των διαφόρων µικροβιακών πληθυσµών [26]. Έτσι, στα κριτήρια για την επιλογή των βακτηρίων που θα χρησιµοποιηθούν ως καλλιέργεια πρέπει να συµπεριλαµβάνεται και ο έλεγχος σχηµατισµού βιογενών αµινών. 12

24 1.4. Παράγοντες που επηρεάζουν τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών Εφόσον οι βιογενείς αµίνες σχηµατίζονται στα τρόφιµα ως αποτέλεσµα της δράσης ζυµοµυκήτων ή της δράσης βακτηρίων, που περιέχουν τα ειδικά ένζυµα αποκαρβοξυλίωσης, η αναστολή της συγκεκριµένης δράσης και η παρεµπόδιση της ανάπτυξης των βακτηρίων είναι πολύ σηµαντικές για τον έλεγχο του σχηµατισµού των βιογενών αµινών. Εκτός από τη διαθεσιµότητα των ελεύθερων αµινοξέων, οι συνθήκες παραγωγής των τροφίµων επηρεάζουν σηµαντικά τον σχηµατισµό των αµινών. Έτσι, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα της τυραµίνης, της πουτρεσκίνης και της καδαβερίνης στα τρόφιµα ποικίλουν ανάλογα µε την εφαρµοζόµενη τεχνική παραγωγής και τον τύπο των µικροοργανισµών ζύµωσης, ενώ στα µαγειρεµένα τρόφιµα ποικίλουν ανάλογα µε τις συνθήκες µαγειρέµατος, όπως το βράσιµο, το ψήσιµο ή το τηγάνισµα σε λάδι και τη θερµοκρασία συντήρησής τους [31]. Ο σχηµατισµός της ισταµίνης στα τυριά έχει συνδεθεί µε διάφορους παράγοντες όπως η διαθεσιµότητα των αµινοξέων, το ph, η περιεκτικότητα σε ηλεκτρολύτες π.χ. NaCl, οι συνθήκες υγιεινής και η θερµοκρασία παραγωγής και συντήρησης. Η θερµοκρασία συντήρησης παίζει τον πιο σηµαντικό ρόλο[14]. Στους οίνους η τιµή του pη είναι ένας σηµαντικός παράγοντας που επηρεάζει την αποκαρβοξυλίωση των αµινοξέων, εφόσον ο σχηµατισµός των αµινών θεωρείται µηχανισµός άµυνας των µικροοργανισµών ενάντια στο όξινο περιβάλλον [32]. Η παρουσία σακχάρων όπως η γλυκόζη, εντείνει τόσο την ανάπτυξη όσο και τη δράση των βακτηρίων αποκαρβοξυλίωσης. Συγκεντρώσεις γλυκόζης µεταξύ 0,5 2,0 % (w/v) θεωρούνται οι βέλτιστες για τον σχηµατισµό των αµινών, ενώ συγκεντρώσεις µεγαλύτερες του 3 % (w/v) παρεµποδίζουν την ενζυµική δράση [11]. Σε ότι αφορά την επίδραση της θερµοκρασίας συντήρησης των τροφίµων, οι απόψεις διίστανται. Σε µελέτη που έγινε σε αντσούγιες, δεν παρατηρήθηκε σηµαντική επίδραση της θερµοκρασίας στη συγκέντρωση της τυραµίνης, παρ ότι η ψύξη καθυστερούσε τον σχηµατισµό της [32]. Έχει παρατηρηθεί, όµως ότι 13

25 η συγκέντρωση της ισταµίνης και της τυραµίνης, στα τυριά αυξάνεται µε τον χρόνο και τη θερµοκρασία συντήρησης / αποθήκευσης [33]. Για τον έλεγχο των βιογενών αµινών στα τρόφιµα, είναι απαραίτητη η καλύτερη κατανόηση του µηχανισµού σχηµατισµού τους. Γενικά, οι βιογενείς αµίνες στα τρόφιµα µπορούν να ελεγχθούν µε την αυστηρή εφαρµογή συνθηκών υγιεινής, τόσο στα πρωτογενή υλικά, όσο και κατά τη διάρκεια παραγωγής / κατεργασίας και συντήρησης των τροφίµων. Η τήρηση των παραπάνω συνθηκών οδηγεί στην παρεµπόδιση της ανάπτυξης των µικροοργανισµών που είναι υπεύθυνοι για τον σχηµατισµό των βιογενών αµινών. Επιπλέον, για τα τρόφιµα που υπόκεινται σε ζύµωση, η χρήση σύντοµων ζυµώσεων, µε την προσεκτική επιλογή των κατάλληλων καλλιεργειών, οδηγεί στην παρεµπόδιση του σχηµατισµού βιογενών αµινών Ρόλος και σπουδαιότητα των βιογενών αµινών Οι βιογενείς αµίνες διαδραµατίζουν σηµαντικό βιολογικό ρόλο ως πηγές αζώτου και αποτελούν πρόδροµες ενώσεις στη σύνθεση ορµονών, αλκαλοειδών, νουκλεϊνικών οξέων και πρωτεϊνών. Εξάλλου, σηµαντική είναι η συνεισφορά τους στο άρωµα των τροφίµων, ενώ θεωρούνται πιθανές πρόδροµες ενώσεις στο σχηµατισµό καρκινογενών Ν-νιτροζοενώσεων [12, 34]. Οι πολυαµίνες (πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, σπερµίνη και σπερµιδίνη) είναι αναντικατάστατα συστατικά όλων των ζώντων κυττάρων. Παρ ότι είναι γνωστό ότι είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη, ο ακριβής βιολογικός τους ρόλος κατά τον µεταβολισµό των κυττάρων δεν είναι απόλυτα σαφής. Εξαιτίας της ποικιλοµορφίας του ρόλου τους, κατά τον µεταβολισµό και την ανάπτυξη των κυττάρων, οι βιογενείς πολυαµίνες είναι απαραίτητες σε µεγάλες ποσότητες στους ιστούς που αναπτύσσονται γρήγορα. Όλα τα κύτταρα έχουν την ικανότητα να συνθέτουν πολυαµίνες, η παρουσία τους όµως στους οργανισµούς µπορεί να οφείλεται και στην πρόσληψή τους από εξωτερικές πηγές από τις οποίες η διατροφή είναι η πιο πιθανή. Οι πολυαµίνες είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της υψηλής µεταβολικής δραστηριότητας, της φυσιολογικής 14

26 λειτουργίας του οργανισµού, καθώς και για τη διατήρηση του ανοσοποιητικού συστήµατος της κοιλιακής χώρας [13, 35]. Το µεγαλύτερο ποσοστό πολυαµινών δεν παραµένει στους ιστούς της κοιλιακής χώρας, αλλά διανέµεται στα διάφορα όργανα του σώµατος. Είναι πιθανή η ύπαρξη µιας «δεξαµενής» πολυαµινών στον ανθρώπινο οργανισµό, από την οποία ελευθερώνονται ελεγχόµενα οι πολυαµίνες, όταν και όπου είναι απαραίτητο [13]. Ορισµένες κατηγορίες αµινών, όπως οι κατεχολαµίνες και η ισταµίνη, πραγµατοποιούν σηµαντικές µεταβολικές λειτουργίες στον ανθρώπινο οργανισµό και έχουν ιδιαίτερη επίδραση στο νευρικό σύστηµα και στον έλεγχο της πίεσης [11]. Η 2-φαινυλαιθυλαµίνη και η τυραµίνη προκαλούν υπέρταση σε αντίθεση µε την ισταµίνη που προκαλεί υπόταση. Η ισταµίνη έχει τον ιδιαίτερο βιολογικό ρόλο να ευθύνεται για τα άµεσα συµπτώµατα που παρατηρούνται κατά τις αλλεργικές αντιδράσεις [14]. Η πουτρεσκίνη, η καδαβερίνη και η αγµατίνη έχουν αναγνωριστεί ως ενώσεις που ενισχύουν την τοξικότητα της ισταµίνης στον άνθρωπο, παρεµποδίζοντας τη δράση των µεταβολιτών της [14, 36]. Επιπλέον, ο έλεγχος της ισταµίνης, της τυραµίνης, της πουτρεσκίνης, της καδαβερίνης, της σπερµίνης και της σπερµιδίνης είναι σηµαντικός, όχι µόνο εξαιτίας της πιθανής τοξικότητάς τους, αλλά και επειδή µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες του βαθµού νωπότητας ή αλλοίωσης ενός τροφίµου. ευτερογενείς αµίνες όπως η σπερµίνη και η σπερµιδίνη µπορούν να υποστούν νίτρωση, δίνοντας νιτροενώσεις, οι οποίες, αντιδρώντας µε νιτρώδη άλατα, σχηµατίζουν καρκινογενείς ενώσεις [11] Τοξικότητα Οι βιογενείς αµίνες, σε χαµηλές συγκεντρώσεις, είναι απαραίτητες για πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του ανθρώπινου οργανισµού, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις µπορεί να προκαλέσουν ανεπιθύµητες ενέργειες, ιδιαίτερα παρουσία αιθανόλης [37, 38]. Ο µεταβολισµός των βιογενών αµινών, όταν προσλαµβάνονται σε µέτριες δόσεις, βασίζεται στη δράση της µονοαµινο- 15

27 (ΜΑΟ) και διαµινοξειδάσης (DAO)[8]. Η αλληλεπίδραση µεταξύ αιθανόλης, η οποία παρεµποδίζει τη δράση της µονοαµινοξειδάσης, και των βιογενών αµινών φαίνεται ότι είναι συνεργιστική [39]. Στον πίνακα 1.1 δίνονται οι βιογενείς αµίνες, που προκαλούν συχνότερα παρενέργειες, καθώς και οι επιπτώσεις που έχουν στον ανθρώπινο οργανισµό [36]. Οι πιο συχνές και γνωστές δηλητηριάσεις, που προκαλούνται από την κατανάλωση τροφίµων και οφείλονται στις βιογενείς αµίνες, σχετίζονται µε την ισταµίνη. Έχουν αναφερθεί πολλά περιστατικά δηλητηριάσεων από ισταµίνη, µετά από κατανάλωση τυριών ή ψαριών. Η ισταµίνη προκαλεί πονοκεφάλους, υπόταση, ταχυπαλµία, οίδηµα, εµετούς, διάρροιες κ.ά. Η πρόσληψή της βέβαια διαµέσου της διατροφής απαιτεί εφάπαξ ποσότητες της τάξης των 600 έως 1000 mg, ώστε να παρατηρηθούν ορισµένα συµπτώµατα δηλητηρίασης στον άνθρωπο [17, 20]. Η ισταµίνη ασκεί την τοξικότητά της, αλληλεπιδρώντας µε δύο τύπους αποδεκτών, Η 1 και Η 2, της κυτταρικής µεµβράνης σε ανθρώπους και ζώα. Επιφέρει διαστολή στα περιφερειακά αγγεία, τα τριχοειδή αγγεία και τις αρτηρίες, προκαλώντας έτσι υπόταση, εξάψεις και πονοκεφάλους [14]. Οι συσπάσεις που προκαλούνται από την ισταµίνη στους εντερικούς λείους µύες, στις οποίες µεσολαβούν οι Η 1 αποδέκτες, µπορεί να είναι υπεύθυνες για τις κράµπες στην κοιλιακή χώρα, τη διάρροια και τους εµετούς [40]. Η ισταµίνη είναι η πιο τοξική αµίνη που έχει ανιχνευτεί στα τρόφιµα π.χ. ψάρια, τυρί, προϊόντα κρέατος και οίνους [8, 28]. Η τοξικότητά της εξαρτάται από τη συγκέντρωσή της στο τρόφιµο που καταναλώνεται, την ύπαρξη και τα επίπεδα άλλων αµινών, όπως της πουτρεσκίνης και καδαβερίνης, τη δράση των αµινοξειδασών π.χ. ΜΑΟ και DAO, τη δράση και διαθεσιµότητα της Ν- µεθυλοτρανσφεράσης (ΗΜΤ), η οποία µεθυλιώνει την ισταµίνη, µετατρέποντάς την σε Ν-µεθυλοϊσταµίνη και η οποία µε τη σειρά της οξειδώνεται από τη ΜΑΟ, τη λήψη ορισµένων φαρµάκων, όπως αντιϊσταµινικά και φάρµακα κατά της ελονοσίας, τα οποία παρεµποδίζουν τη δράση των ενζύµων µεταβολισµού της ισταµίνης, την ύπαρξη αµινών οι οποίες δρουν ως υποκινητές / ενισχυτές της τοξικότητας της ισταµίνης, όπως η τυραµίνη (η οποία παρεµποδίζει τη ΜΑΟ), 16

28 Πίνακας 1.1. Βιογενείς αµίνες και οι επιπτώσεις τους στον ανθρώπινο οργανισµό Αµίνη Ισταµίνη Τυραµίνη Πουτρεσκίνη και Καδαβερίνη 2-Φαινυλαιθυλαµίνη Τρυπταµίνη Επιπτώσεις Συµπτώµατα ιέγερση ροής γαστρικών εκκρίσεων Απελευθέρωση αδρεναλίνης και νοραδρεναλίνης ιέγερση των αισθητήριων και των κινητήριων νεύρων ιέγερση των λείων µυών της µήτρας, του εντερικού και αναπνευστικού συστήµατος Υπόταση Περιφερειακή αγγειοσυστολή Αύξηση της καρδιακής λειτουργίας (Cardiac output) ακρύρροια Αύξηση του ρυθµού της αναπνοής Αύξηση των επιπέδων σακχάρου του αίµατος Απελευθέρωση νοραδρεναλίνης από το συµπαθητικό νευρικό σύστηµα Ηµικρανίες Υπέρταση Υπόταση Βραδυκαρδία Τέτανος Μερική παράλυση των άκρων Ενίσχυση / πρόκληση της τοξικότητας άλλων αµινών Απελευθέρωση νοραδρεναλίνης από το συµπαθητικό νευρικό σύστηµα Υπέρταση Ηµικρανίες Υπέρταση η τρυπταµίνη (η οποία παρεµποδίζει τη DAO) και η 2-φαινυλαιθυλαµίνη (η οποία παρεµποδίζει τις ΗΜΤ και DAO) και τέλος από τη φυσική κατάσταση του κάθε ατόµου [8, 14]. Οι αρωµατικές αµίνες 2-φαινυλαιθυλαµίνη και τυραµίνη, σε δόσεις των 3 mg.kg -1 και mg.kg -1 αντίστοιχα, προκαλούν ηµικρανίες και υπέρταση [37]. 17

29 Υψηλές συγκεντρώσεις (>50 mg.kg -1 ) 2-φαινυλαιθυλαµίνης σε ορισµένα τρόφιµα (όπως π.χ. η σοκολάτα) µπορεί επίσης να προκαλέσουν ανωµαλίες στη φυσιολογική λειτουργία του οργανισµού. Οι πτητικές αλειφατικές µονοαµίνες, µεθυλαµίνη και αιθυλαµίνη, προκαλούν διάφορους ερεθισµούς. Η ισοαµυλαµίνη και οι αλειφατικές πολυαµίνες, πουτρεσκίνη και καδαβερίνη, δρουν συνήθως συζευγµένα µε τις υπόλοιπες βιογενείς αµίνες. Επίσης, η πουτρεσκίνη και η καδαβερίνη µπορούν να αντιδράσουν µε νιτρώδη άλατα και να σχηµατίσουν ετεροκυκλικές καρκινογενείς νιτροζαµίνες, νιτροζοπυριδίνη και νιτροζοπιπεριδίνη [28]. Ένα αρκετά αποτελεσµατικό σύστηµα αποτοξίνωσης που υπάρχει στο εντερικό σύστηµα των θηλαστικών είναι ικανό να µεταβολίζει τις φυσιολογικές ποσότητες βιογενών αµινών, που λαµβάνονται διαµέσου της διατροφής [28]. Κάτω από κανονικές συνθήκες, στους ανθρώπους οι εξωγενείς αµίνες που απορροφούνται από τα τρόφιµα, µεταβολίζονται γρήγορα, εξαιτίας της δράσης της αµινοξειδάσης. Στα αλλεργικά άτοµα ή όταν προσλαµβάνονται διαµέσου φαρµάκων παρεµποδιστές των ΜΑΟ και DAO ή τέλος στην περίπτωση που οι λαµβανόµενες συγκεντρώσεις αµινών είναι ιδιαίτερα υψηλές, η φυσική διαδικασία αποτοξίνωσης παρεµποδίζεται και οι αµίνες συσσωρεύονται από τον οργανισµό. Η παρουσία αµινών, οι οποίες είτε παρεµποδίζουν το σύστηµα αποτοξίνωσης του οργανισµού είτε ενισχύουν την τοξικότητα της ισταµίνης, µπορεί να εξηγήσει γιατί αλλοιωµένα τρόφιµα, όπως τα ψάρια ή παλαιωµένα τρόφιµα όπως τα τυριά και οι οίνοι, είναι πιο τοξικά από ένα υδατικό διάλυµα ισταµίνης της ίδιας συγκέντρωσης. Τα επίπεδα τοξικότητας των αµινών είναι πολύ δύσκολο να καθοριστούν, γιατί εξαρτώνται από το κάθε άτοµο καθώς και από την ύπαρξη και τα επίπεδα άλλων αµινών. Ανώτατο όριο 100 mg.kg -1 τροφίµου και 2 mg.l -1 αλκοολούχου ποτού έχει προταθεί για την ισταµίνη. Ποσότητες από mg.kg -1 για την τυραµίνη και 30 mg.kg -1 για τη 2-φαινυλαιθυλαµίνη έχουν αναφερθεί ως τοξικές δόσεις σε τρόφιµα [8, 11]. 18

30 1.7. Μέθοδοι προσδιορισµού των βιογενών αµινών Βιβλιογραφική επισκόπηση Οι µελέτες για την ανίχνευση των βιογενών αµινών και για τον έλεγχο των επιπέδων τους στα τρόφιµα δε θα ήταν δυνατόν να πραγµατοποιηθούν χωρίς υποστήριξη από τις κατάλληλες αναλυτικές µεθόδους, οι οποίες θα πρέπει να είναι ακριβείς, επαναλήψιµες, ταχείες, να χαρακτηρίζονται από υψηλή ευαισθησία, να µην απαιτούν ακριβό και εξειδικευµένο εξοπλισµό και να είναι δυνατή η τυποποίησή τους. Έχουν δηµοσιευτεί διάφορες µέθοδοι για την αποµόνωση και τον προσδιορισµό των αµινών, δεν υπάρχει όµως µια ποσοτική αναλυτική µέθοδος, η οποία να µπορεί να εφαρµοστεί για τον προσδιορισµό των αµινών σε όλα τα είδη τροφίµων. Η πολυπλοκότητα του υποστρώµατος των δειγµάτων των τροφίµων, η ύπαρξη παρεµποδίσεων, καθώς και ο σχετικά µεγάλος αριθµός αµινών, που υπάρχουν στα δείγµατα τροφίµων, είναι τυπικά προβλήµατα τα οποία καλείται να αντιµετωπίσει ένας αναλυτικός χηµικός. Αντιδραστήρια όπως το υπερχλωρικό οξύ, το τριχλωροξικό οξύ, το υδροχλωρικό οξύ καθώς και οργανικοί διαλύτες χρησιµοποιούνται συνήθως για την εκχύλιση των βιογενών αµινών από δείγµατα τροφίµων. ιάφορες αναλυτικές µέθοδοι έχουν αναπτυχθεί για τον διαχωρισµό και τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισµό των βιογενών αµινών στα τρόφιµα. Εκτός από τις ραδιοανοσολογικές [41] ή τις ενζυµικές [14] µεθόδους, µέθοδοι που χρησιµοποιούν χρωµατογραφικές τεχνικές, όπως η χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας [42-44], η αέρια χρωµατογραφία [45-47] και η χρωµατογραφία ιοντοανταλλαγής, µε αµπεροµετρική ανίχνευση [48], έχουν χρησιµοποιηθεί για τον προσδιορισµό των βιογενών αµινών. Από όλες τις χρωµατογραφικές τεχνικές, αυτή που προτιµάται από τους περισσότερους ερευνητές για τον ποσοτικό προσδιορισµό των βιογενών αµινών είναι η Υγρή Χρωµατογραφία Υψηλής Πίεσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) [18, 22, 24-27, 49-68], επειδή προσφέρει υψηλή εκλεκτικότητα και ευαισθησία. Οι περισσότερες βιογενείς αµίνες που υπάρχουν στα τρόφιµα δεν απορροφούν ικανοποιητικά στην υπεριώδη (UV) ή ορατή (Vis) περιοχή του 19

31 φάσµατος και ούτε φθορίζουν, επειδή δεν έχουν µια εύκολα ανιχνεύσιµη χρωµοφόρα οµάδα στο µόριό τους. Γι αυτό τον λόγο, είναι απαραίτητη η παραγωγοποίησή τους, προκειµένου ν αυξηθεί η ευαισθησία της µεθόδου. Αν δεν παραγωγοποιηθούν οι βιογενείς αµίνες, τότε κατά τον χρωµατογραφικό προσδιορισµό τους, οι λαµβανόµενες κορυφές είναι πολύ ευρείες και µπορούν ν ανιχνευτούν µόνο φθορισµοµετρικά, ενώ η φασµατοφωτοµετρική ανίχνευση είναι δυνατή µόνο για τις ετεροκυκλικές και αρωµατικές αµίνες. Έτσι, η παραγωγοποίηση είναι απαραίτητη, προκειµένου να µπορέσουν ν ανιχνευτούν φασµατοφωτοµετρικά και οι αλειφατικές αµίνες, αλλά και για ν αυξηθεί η ευαισθησία προσδιορισµού όλων των αµινών γενικά [69]. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί µέθοδοι παραγωγοποίησης των αµινών που εφαρµόζονται είτε κατά τη διάρκεια του χρωµατογραφικού διαχωρισµού τους (on-line derivatization) [50, 70] ή µετά την έξοδο τους από τη στήλη (post-column derivatization) [27, 71, 72]. H πιο συνηθισµένη µέθοδος παραγωγοποίησης είναι αυτή που εφαρµόζεται πριν από τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό (pre-column derivatization), επειδή είναι απλή, δεν απαιτεί επιπρόσθετο εργαστηριακό εξοπλισµό και δίνει τη δυνατότητα τα παράγωγα που προκύπτουν να καθαρίζονται από την περίσσεια των αντιδραστηρίων και τα πιθανά παραπροϊόντα της αντίδρασης, πριν εισέλθουν στη στήλη. Για τη φασµατοφωτοµετρική ανίχνευση των βιογενών αµινών, κατάλληλα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης πριν από τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό είναι το ντανσυλοχλωρίδιο (Dns-Cl) [24, 26, 49, 51, 52, 68] και το νταµπσυλοχλωρίδιο (Dbs-Cl) [60, 64]. Για τη φθορισµοµετρική ανίχνευση ως αντιδραστήρια παραγωγοποίησης πριν από τον χρωµατογραφικό διαχωρισµό έχουν χρησιµοποιηθεί η ο-φθαλαλδεΰδη (ΟΡΑ), παρουσία µιας θειόλης όπως το 3-µερκαπτοπροπιονικό οξύ (3-ΜΡΑ) [73] ή η 2-µερκαπτοαιθανόλη [74] ή το 2- ναφθοξυκαρβονυλοχλωρίδιο (NOC-Cl)[75]. Ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης για φθορισµοµετρική ανίχνευση, έχει επίσης χρησιµοποιηθεί το Dns-Cl [65, 76, 77]. Ο προσδιορισµός των βιογενών αµινών στους οίνους και τους ζύθους έχει πραγµατοποιηθεί κυρίως µε RP-HPLC και φθορισµοµετρική ανίχνευση, εφαρµόζοντας παραγωγοποίηση µε OPA [17, 27, 50, 55, 56, 62, 63, 78], ενώ 20

32 περιορισµένος αριθµός εργασιών αναφέρει φασµατοφωτοµετρική ανίχνευση και παραγωγοποίηση µε Dns-Cl [24, 26, 68] ή Dbs-Cl [60]. Αντίθετα, δεν έχει δηµοσιευθεί ακόµη καµία εργασία, που να αναφέρεται στη φθορισµοµετρική ανίχνευση βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά, εφαρµόζοντας παραγωγοποίηση µε Dns-Cl. Η χρήση της ΟΡΑ για την παραγωγοποίηση των βιογενών αµινών έχει το µειονέκτηµα ότι η ΟΡΑ αντιδρά κυρίως µε πρωτοταγείς αµίνες και τα παράγωγα που προκύπτουν δεν είναι σταθερά, σε αντίθεση µε το Dns-Cl και Dbs-Cl, που αντιδρούν τόσο µε πρωτοταγείς όσο και µε δευτεροταγείς αµίνες, δίνοντας ιδιαίτερα σταθερά παράγωγα. Τα προϊόντα της παραγωγοποίησης µε το Dbs-Cl είναι έγχρωµα και απορροφούν στην περιοχή του ορατού, ενώ τα ντανσυλοπαράγωγα έχουν την ιδιότητα να απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή και παράλληλα να φθορίζουν έντονα. Η χαρακτηριστική αυτή ιδιότητα των ντανσυλοπαραγώγων των βιογενών αµινών µπορεί εποµένως να χρησιµοποιηθεί και στην ταυτόχρονη φασµατοφωτοµετρική και φθορισµοµετρική ανίχνευσή τους. Παρ όλα αυτά, στη βιβλιογραφία δεν έχει αναφερθεί ακόµη παρόµοια µελέτη. Μέχρι πρόσφατα τα προβλήµατα µε την ανίχνευση, τον διαχωρισµό και τον ποσοτικό προσδιορισµό των βιογενών αµινών στα αλκοολούχα ποτά οφείλονταν στο γεγονός ότι οι βιογενείς αµίνες βρίσκονται σε σχετικά χαµηλά επίπεδα στα ποτά, της τάξης των µερικών mg.l -1, ενώ παράλληλα υπάρχουν σε υψηλότερες συγκεντρώσεις ενώσεις όπως τα ελευθέρα αµινοξέα και οι πολυφαινόλες, οι οποίες παρεµποδίζουν. Έτσι, ασχέτως µε το αντιδραστήριο που θα επιλεγεί για την παραγωγοποίηση και τον προσδιορισµό των βιογενών αµινών στα αλκοολούχα ποτά πρέπει να προηγηθούν διαδικασίες καθαρισµού / αποµόνωσης και προσυγκέντρωσης των βιογενών αµινών στο δείγµα. Στη βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί διάφορες µέθοδοι για την αποµόνωση των αµινών από τα αλκοολούχα ποτά, όπως η εκχύλιση υγρού υγρού (LLE) πριν [49, 61], ή µετά [38] από την αντίδραση παραγωγοποίησης καθώς και η εκχύλιση στερεάς φάσης - υγρού (SPE). Τα τελευταία χρόνια η SPE προτιµάται έναντι της LLE επειδή δεν απαιτεί µεγάλη κατανάλωση διαλυτών, δεν είναι χρονοβόρα διαδικασία και παρέχει τη δυνατότητα ταυτόχρονης διαχείρισης πολλών δειγµάτων. Έτσι, έχουν 21

33 πραγµατοποιηθεί αρκετές µελέτες, στις οποίες χρησιµοποιείται η SPE είτε πριν από την παραγωγοποίηση µε τη χρήση κατιοντοανταλλακτικών µικροστηλών [62, 63] είτε µετά την παραγωγοποίηση, χρησιµοποιώντας µικροστήλες C 18 [24] ή ισχυρά ανιοντοανταλλακτικές µικροστήλες SAX [63], επιτυγχάνοντας ταυτόχρονα και προσυγκέντρωση των δειγµάτων. Επίσης, για την αποµάκρυνση των φαινολικών ενώσεων, που περιέχονται στα αλκοολούχα ποτά και κυρίως στους ερυθρούς οίνους, εκτός από την SPE χρησιµοποιούνται και στερεά αντιδραστήρια στο στάδιο προκατεργασίας των δειγµάτων, όπως η πολυβινυλοπυρρολιδόνη (PVP), η οποία τις προσροφά. Αν δεν αποµακρυνθούν οι φαινολικές ενώσεις, τότε προσροφούνται στο υλικό πλήρωσης των µικροστηλών SPE ή τις αναλυτικής στήλης µε αποτέλεσµα την ελάττωση της διαχωριστικής τους ικανότητας και τη σταδιακή καταστροφή τους. Στο σηµείο αυτό πρέπει να αναφερθεί ότι για λόγους διασφάλισης ποιότητας και ποιοτικού ελέγχου, η ταυτοποίηση και ο έλεγχος καθαρότητας των κορυφών είναι πρωταρχικής σηµασίας σε δείγµατα µε πολύπλοκο υπόστρωµα, όπως αυτό των οίνων και των ζύθων. Για τον σκοπό αυτό χρησιµοποιούνται ανιχνευτές παράταξης φωτοδιόδων για τον έλεγχο καθαρότητας των κορυφών και η φασµατοµετρία µαζών για την ταυτοποίησή τους. Έχουν πραγµατοποιηθεί ελάχιστες µελέτες ταυτοποίησης των παραγώγων των αµινών ύστερα από παραγωγοποίηση µε Dns-Cl [79-81], αλλά καµία απ αυτές δεν έχει εφαρµοστεί σε δείγµατα τροφίµων Αντικείµενο της διατριβής Η µελέτη που παρουσιάζεται στην παρούσα διατριβή περιλαµβάνει τις εξής επιµέρους ενότητες: 1. Ανάπτυξη µεθόδου ταυτόχρονου ποσοτικού προδιορισµού έντεκα βιογενών αµινών (µεθυλαµίνη, αιθυλαµίνη, τρυπταµίνη, 2- φαινυλαιθυλαµίνη, ισοαµυλαµίνη, πουτρεσκίνη, καδαβερίνη, ισταµίνη, τυραµίνη, σπερµιδίνη και σπερµίνη) µε την τεχνική της Υγρής Χρωµατογραφίας Υψηλής Πίεσης αντίστροφης φάσης και χρήση 22

34 φασµατοφωτοµετρικού ανιχνευτή. Η µέθοδος περιλαµβάνει παραγωγοποίησή των αµινών µε ντανσυλοχλωρίδιο πριν από την εισαγωγή τους στη στήλη και καθαρισµό των παραγώγων από τα παραπροϊόντα της αντίδρασης µε εκχύλιση στερεάς φάσης-υγρού, βελτιστοποίηση των συνθηκών παραγωγοποίησης και των συνθηκών εκχύλισης στερεάς φάσης και εφαρµογή της στην ανάλυση δειγµάτων οίνων και ζύθων. 2. Ποσοτικός προσδιορισµός των αµινών µε χρήση φθορισµοµετρικού ανιχνευτή µε τις ίδιες συνθήκες παραγωγοποίησης, εκχύλισης στερεάς φάσης και χρωµατογραφικού διαχωρισµού, όπως αυτές διαµορφώθηκαν κατά τον φασµατοφωτοµετρικό προσδιορισµό τους. Εφαρµογή της µεθόδου στην ανάλυση δειγµάτων οίνων και ζύθων. 3. Ταυτοποίηση των παραγώγων των αµινών τόσο σε πρότυπο διάλυµα όσο και σε αντιπροσωπευτικό δείγµα οίνου (µίγµα πέντε λευκών και πέντε ερυθρών οίνων) και έλεγχος της καθαρότητας των λαµβανόµενων χρωµατογραφικών κορυφών, µε χρήση διάταξης Υγρού Χρωµατογράφου Υψηλής Πίεσης µε ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων, σε συνδυασµό µε Φασµατογράφο Μαζών. Οι χρωµατογραφικές συνθήκες ήταν οι ίδιες µ αυτές που χρησιµοποιήθηκαν τόσο κατά τον φασµατοφωτοµετρικό όσο και κατά τον φθορισµοµετρικό προσδιορισµό τους. 4. Ταυτόχρονη φασµατοφωτοµετρική και φθορισµοµετρική ανίχνευση των αµινών, µε τους ανιχνευτές συνδεδεµένους σε σειρά, χρησιµοποιώντας τις ίδιες χρωµατογραφικές συνθήκες, όπως προηγουµένως. Εφαρµογή στην ανάλυση δειγµάτων οίνων και ζύθων. 5. Σύγκριση των συστηµάτων ανίχνευσης και επεξεργασία των αποτελεσµάτων µε εφαρµογή στατιστικών δοκιµασιών σηµαντικότητας διαφορών (δοκιµασίες t). 23

35 1.9. Σκοπός της διατριβής - Πλεονεκτήµατα Η εκπόνηση της παρούσας διατριβής εντάσσεται στα πλαίσια της προσπάθειας για την ανάπτυξη περισσότερο ευαίσθητων, εκλεκτικών και αξιόπιστων µεθόδων για τον προσδιορισµό των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, οι βιογενείς αµίνες, σε χαµηλές συγκεντρώσεις, είναι απαραίτητες για πολλές φυσιολογικές λειτουργίες του ανθρώπινου οργανισµού, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις µπορεί να έχουν τοξικές επιδράσεις, ιδιαίτερα παρουσία αιθανόλης, εξαιτίας της συνεργιστικής της δράσης µε τις βιογενείς αµίνες. Έτσι, γίνεται κατανοητό γιατί είναι απαραίτητη η ανάπτυξη ευαίσθητων και αξιόπιστων µεθόδων ελέγχου των επιπέδων των βιογενών αµινών, σε αλκοολούχα ποτά ευρείας κατανάλωσης, όπως είναι οι οίνοι και οι ζύθοι. Επίσης, σε χρωµατογραφικές αναλύσεις δειγµάτων µε πολύπλοκο υπόστρωµα, όπως αυτό των οίνων και των ζύθων, είναι απαραίτητος ο έλεγχος της καθαρότητας και της ταυτότητας των χρωµατογραφικών κορυφών για λόγους ποιοτικού ελέγχου και διασφάλισης της αξιοπιστίας της ανάλυσης. Ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης των αµινών επιλέχθηκε το ντανσυλοχλωρίδιο για δύο λόγους: Αφενός τα ντανσυλοπαράγωγα που προκύπτουν είναι ιδιαίτερα σταθερά και αφετέρου έχουν την ιδιότητα να απορροφούν ισχυρά στο υπεριώδες και παράλληλα να φθορίζουν έντονα. Η ιδιότητά τους αυτή αξιοποιήθηκε, προκειµένου να αναπτυχθεί φθορισµοµετρική µέθοδος χρωµατογραφικού προσδιορισµού καθώς και µέθοδος ταυτόχρονης ανίχνευσής τους σε αλκοολούχα ποτά. Η φθορισµοµετρική ανίχνευση, όπως είναι γνωστό, προσφέρει βελτιωµένη ευαισθησία και εκλεκτικότητα έναντι της φασµατοφωτοµετρικής ανίχνευσης. Εξάλλου, µε την ταυτόχρονη φασµατοφωτοµετρική και φθορισµοµετρική ανίχνευση, που πραγµατοποιήθηκε, συνδέοντας τους δύο ανιχνευτές σε σειρά, δίνεται η δυνατότητα, όσες ενώσεις δε µπορούν να ανιχνευτούν µε το ένα σύστηµα ανίχνευσης να ανιχνεύονται µε το άλλο. Αυτό οφείλεται στη διαφορετική εκλεκτικότητα των µεθόδων ανίχνευσης ως προς το υπόστρωµα. Με τη χρήση της ταυτόχρονης ανίχνευσης, αυξάνεται εποµένως η αξιοπιστία της ανάλυσης και παράλληλα αξιοποιείται και η 24

36 δυνατότητα µιας αµεσότερης σύγκρισης των αναλυτικών παραµέτρων κάθε µεθόδου. Στην παρούσα διατριβή η σύγκριση αυτή πραγµατοποιήθηκε µε τη χρήση στατιστικών δοκιµασιών σηµαντικότητας (t-tests) και εφαρµόστηκε στον προσδιορισµό των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά. Η αξιοπιστία των µεθόδων που αναπτύχθηκαν επιβεβαιώθηκε επίσης και µε τον έλεγχο της καθαρότητας των κορυφών και την ταυτοποίησή τους, µε χρήση υγρής χρωµατογραφίας και ανιχνευτή παράταξης φωτοδιόδων σε συνδυασµό µε φασµατοφωτοµετρία µαζών. Η ευαισθησία και η εκλεκτικότητα των προτεινόµενων µεθόδων φασµατοφωτοµετρικής και φθορισµοµετρικής ανίχνευσης βελτιώθηκε µε τη βελτιστοποίηση των συνθηκών παραγωγοποίησης, µε τη βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης στερεάς φάσης (µετά την παραγωγοποίηση) καθώς και µε την προκατεργασία των δειγµάτων µε πολυβινυλοπυρρολιδόνη. Η ευαισθησία των µεθόδων που αναπτύχθηκαν στην παρούσα διατριβή είναι κατά µια τάξη µεγέθους υψηλότερη απ αυτή των ήδη υπαρχουσών µεθόδων. Τα στοιχεία πρωτοτυπίας και η συνεισφορά στη διεθνή βιβλιογραφία της παρούσας διατριβής είναι: 1. Η χρήση φθορισµοµετρικής και ταυτόχρονης φασµατοφωτοµετρικής και φθορισµοµετρικής ανίχνευσης για τον προσδιορισµό των ντανσυλοπαραγώγων των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά. 2. Η σύγκριση των αποτελεσµάτων της ταυτόχρονης ανίχνευσης µε χρήση στατιστικών δοκιµασιών σηµαντικότητας (t- tests). 3. Ο έλεγχος της καθαρότητας των χρωµατογραφικών κορυφών των ντανσυλοπαραγώγων των βιογενών αµινών σε αλκοολούχα ποτά καθώς και η ταυτοποίησή τους. 4. Η βελτιστοποίηση των συνθηκών εκχύλισης στερεάς φάσης που εφαρµόζεται για τον καθαρισµό των ντάνσυλοπαραγώγων των βιογενών αµινών. 5. Η αυξηµένη ευαισθησία κατά µία τάξη µεγέθους των προτεινόµενων µεθόδων έναντι των ήδη υπαρχουσών µεθόδων. 6. Ο δειγµατολειπτικός έλεγχος των επιπέδων των βιογενών αµινών σε δείγµατα οίνων και ζύθων Ελληνικής παραγωγής. 25