ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΟΛΥΤΕΧΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ, ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΧΗΜΙΚΩΝ ΔΙΕΡΓΑΣΙΩΝ ΚΑΙ ΕΓΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Β ΧΗΜΙΚΗΣ ΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΤΟΥ ΠΡΟΦΙΛ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΔΙΕΡΓΑΣΙΑΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ ΒΙΟΑΠΟΙΚΟΔΟΜΗΣΙΜΟΥ ΠΟΛΥ(3-ΥΔΡΟΞΥ ΒΟΥΤΥΡΙΚΟΥ) ΕΣΤΕΡΑ (PHB) ΜΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΣΧΕΔΙΑΣΜΟ ΓΙΑ ΤΗ ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΣΤΕΦΑΝΙΑΣ-ΧΡΙΣΤΙΝΑΣ ΓΕΛΑΔΑΡΗ Επιβλέπων: Λέκτορας Χρήστος Χατζηδούκας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2016

2 Περίληψη Στην παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιείται καλλιέργεια του βακτηριακού στελέχους Azohydromonas lata σε επίπεδο κωνικών φιαλών και βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας. Η μελέτη επικεντρώνεται κυρίως στη (i) χαρτογράφηση των περιοχών λειτουργίας και απόκριση του μικροβιακού συστήματος στην επιβολή διαφόρων μεταβολών των συνθηκών λειτουργίας μέσω της μελέτης των κυριότερων λειτουργικών παραμέτρων του (ii) μελέτη της επιρροής της προϊστορίας ανάπτυξης του μικροοργανισμού και πιο συγκεκριμένα της ανομοιογένειας και ανομοιομορφίας του κυτταρικού πληθυσμού στα επόμενα στάδια της κυτταρικής ζύμωσης και προόδου της κύριας βακτηριακής καλλιέργειας. Απώτερος στόχος είναι η ανάπτυξη, με συστηματικό τρόπο, βέλτιστων πολιτικών τροφοδοσίας για τη μεγιστοποίηση του ρυθμού παραγωγής PHB και του ποσοστιαίου συσσωρευμένου PHB ανά g ξηρής βιομάζας (DCW). Οι κύριες λειτουργικές παράμετροι της διεργασίας είναι η πολιτική τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών και πηγής αζώτου, ο περιορισμός πηγής αζώτου, ο ρυθμός αερισμού της καλλιέργειας, το προφίλ συγκέντρωσης του διαλυμένου οξυγόνου, η σύσταση των εξερχόμενων αερίων ρευμάτων O2 και CO2, η θερμοκρασία και το ph. Από το σύνολο των πειραμάτων προκύπτει ότι η συγκέντρωση της συνολικής ξηρής βιομάζας (DCW), του πολυμερούς PHB και της υπολειπόμενης βιομάζας σημειώνει αυξητική πορεία. Πραγματοποιούνται πειράματα πολιτικών ημισυνεχούς τροφοδοσίας με προσθήκη επιπλέον πηγής αζώτου ((ΝΗ4)2SO4) στα οποία ο ρυθμός παραγωγής βιομάζας είναι μεγαλύτερος συγκριτικά με το ρυθμό παραγωγής PHB, λόγω συνθηκών περίσσειας πηγής αζώτου. Αντίστροφα, σε πειράματα χωρίς επιπλέον προσθήκη (ΝΗ4)2SO4 ο ρυθμός παραγωγής του PHB είναι μεγαλύτερος. Όσον αφορά το ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB ανά g DCW, παρουσιάζει μια σταθερή, ελαφρώς ανοδική πορεία που διακυμαίνεται γύρω από μία σταθερή τιμή. Στην πλειονότητα των πειραμάτων η μέγιστη τιμή σημειώνεται στις πρώτες ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Οι μεγαλύτερες τιμές κ.β σύστασης και συγκέντρωσης PHB ανέρχονται στο % g PHB ανά g DCW και 13.2 g/l, αντίστοιχα. Συμπερασματικά, η πολυπαραμετρικότητα και η ευαισθησία του βιολογικού συστήματος δυσχεραίνουν τη συστηματοποίηση μιας βελτιστοποιημένης παραγωγικής διαδικασίας, την ανάπτυξης μιας ευέλικτης πολιτικής τροφοδοσίας και την επαρκή κλιμάκωσης της διεργασίας σε εμπορικό επίπεδο. I

3 Abstract In the present diploma thesis cultivations of the bacterial strain of Azohydromonas lata is performed in flasks and a lab-scale bioreactor for the fermentative production of poly-(3- hydroxy butyrate) (PHB). The study is mainly focused on: (i) the mapping of regions of operation and the response of the present microbial system to the imposition of various changes of conditions of operation via the study of its main functional parameters and (ii) the study of the culture prehistory influence on the bacterial growth and more concretely, the inhomogeneousness and unevenness of cellular population in the next stages of bacterial fermentation and progress of the main culture. The ultimate objective that is pursued through this study is to develop, in a systematic way, the optimal operating policies of the studied fermentation process for the maximization of the PHB production rate and the percentage accumulated PHB per g of dry cell mass (DCW). The principal process operating variables that are studied are the provisioning policy of nutritious components and nitrogen source ((NH4)2SO4), the restriction of nitrogen source, the culture aeration rate, the dissolved oxygen concentration profile, the composition of the exhaust gas stream in Ο2 and CO2, the temperature and ph. From the total set of experiments it results that the concentration profile of DCW, PHB and residual biomass is augmentative. Experiments of fed-batch operating policies with addition of nitrogen source are conducted resulting in a larger production rate of residual biomass compared to the production rate of PHB, because of excess of nitrogen source. On the other hand, in similar experiments where only the nutritious components are replenished without any addition of (NH4)2SO4, the reverse phenomenon is observed and the production rate of PHB is larger. As it concerns the PHB content, it presents an impercipient ascending course that ranges around a constant value. In the majority of experiments the biggest PHB content is marked in the first hours of culture growth. The maximum PHB content and PHB concentration that is recorded is 72.21% g PHB per g DCW, and 13.2 g/l respectively. In conclusion, the fact that this microbial system is sensitive and multi-parametric emerges and this is the reason that impedes the systematic optimization of the productive process, the development of a flexible cultivation policy and the efficient process scale-up at a commercial scale. II

4 Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή μου κύριο Χρήστο Χατζηδούκα για τη συνεχή βοήθεια και υποστήριξη, την πολύτιμη καθοδήγηση, καθώς και τις χρήσιμες συμβουλές και υποδείξεις του καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας. Ακόμη, ευχαριστώ θερμά το μεταδιδακτορικό ερευνητή Γιάννη Πένλογλου, του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης για τη σημαντική βοήθειά του κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την οικογένειά μου για την αμέριστη υποστήριξη, την υπομονή και την ειλικρινή εμπιστοσύνη τους κατά τη διάρκεια των μέχρι τώρα σπουδών μου και όλους τους φίλους μου που στάθηκαν δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια. III

5 Μαθησιακά αποτελέσματα Στα πλαίσια της εκπόνησης της παρούσας διπλωματικής εργασίας προκύπτουν μαθησιακά αποτελέσματα που συνοψίζονται ακολούθως και σχετίζονται με την ικανότητα: κατανόησης της δυσκολίας αντιμετώπισης των προβλημάτων που ανακύπτουν σε ερευνητικά θέματα κι επομένως την ανάπτυξη ικανότητας αντιμετώπισης του προβλήματος λαμβάνοντας υπόψη συνδυαστικά τους πιθανούς παράγοντες σφάλματος και όχι μεμονωμένα κατανόησης της δυσκολίας λήψης επιθυμητών κι αναμενόμενων πειραματικών αποτελεσμάτων που προκύπτει λόγω της τριβής με ερευνητικό θέμα συνεχούς εγρήγορσης και άμεσης ανταπόκρισης για την επίλυση προβλημάτων που προκύπτουν κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας με σκοπό την αποφυγή αποτυχίας ή διακοπής του πειράματος συνδυαστικής αξιοποίησης των γνώσεων που έχουν ληφθεί καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών και εφαρμογής του θεωρητικού γνωστικού υπόβαθρου σε πρακτικό επίπεδο σχεδιασμού και διεξαγωγής πειραμάτων αξιολόγησης και ερμηνείας των πειραματικών αποτελεσμάτων με βάση το θεωρητικό υπόβαθρο, κατανόησης των φαινομένων που λαμβάνουν χώρα, ανασκόπησης πιθανών προβλημάτων και επανασχεδιασμού των πειραμάτων όταν αυτό είναι απαραίτητο οργάνωσης και ταξινόμησης των συμπερασμάτων, ιδεών και γνώσεων με σκοπό την αποτύπωση και παρουσίασή τους κατά τη συγγραφή της διπλωματικής εργασίας λήψης περαιτέρω γνώσεων και εξάσκησης με το πρόγραμμα Microsoft Office και κυρίως με τα Word, Excel και Powerpoint εξοικείωσης με το εργαστήριο που περιλαμβάνει τον πειραματικό εξοπλισμό, καθώς και τις πειραματικές τεχνικές και μεθόδους Πιο συγκεκριμένα το παραπάνω αφορά την ανάπτυξη ικανότητας: i) παρασκευής θρεπτικών μέσων ανάπτυξης κατάλληλων για τη βακτηριακή καλλιέργεια του Azohydromonas lata, καθώς κι άλλων πρότυπων διαλυμάτων και αντιδραστηρίων IV

6 ii) προετοιμασίας προκαλλιέργειας και ανάπτυξης στερεών καλλιεργειών σε τριβλίο Petri για τη δημιουργία βακτηριακών αποικιών iii) χρήσης του κινούμενου επωαστήρα (shaking incubator)για την επώαση και ανάπτυξη των στερεών και υγρών καλλιεργειών του A.lata iv) πλήρωσης και λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα και όλων των ρυθμιστικών οργάνων που αποτελούν τη διάταξή του v) αποστείρωσης των απαραίτητων πειραματικών σκευών και των διαλυμάτων των θρεπτικών μέσων ανάπτυξης με τη χρήση κλίβανου αποστείρωσης με ατμό, καθώς και αποστείρωσης θρεπτικού μέσου με διήθηση υπό κενό με τη χρήση φίλτρων vi) χρήσης του θαλάμου νηματικής ροής (laminar flow) για την τήρηση ασηπτικών συνθηκών περιβάλλοντος, καθώς επίσης και χρήσης γαντιών και αιθανόλης vii) δειγματοληψίας από κωνικές φιάλες και βιοαντιδραστήρα υπό ασηπτικές συνθήκες viii) χρήσης φασματοφωτόμετρου Υπεριώδους-Ορατού για τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας μετά από κατάλληλες αραιώσεις του δείγματος ix) χρησιμοποίησης του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου και λήψης φωτογραφιών της καλλιέργειας x) ερμηνείας του κύκλου ζωής και της φυσιολογίας των βακτηριακών κυττάρων μέσω της παρακολούθησης του κυτταρικού πληθυσμού με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο xi) χρήσης της φυγοκέντρου για το διαχωρισμό της βιομάζας από το υπερκείμενο υγρό των λαμβανόμενων δειγμάτων xii) χρήσης του φασματοφωτόμετρου αέριας χρωματογραφίας FTIR, της συσκευής υπερήχων για τη διάρρηξη των βακτηριακών κυττάρων και του περιστροφικού εξατμιστήρα για την ανάκτηση πολυμερούς xiii) εξοικείωσης με τις απαραίτητες αναλυτικές μεθόδους: μέθοδος φασματοσκοπίας Υπερύθρου (FTIR), ανάκτηση και καθαρισμός PHB από επιλεγμένα δείγματα με τη μέθοδο μηχανικής διάρρηξης κυτταρικών μεμβρανών με υπερήχους και εκχύλιση του PHB με χλωροφόρμιο, μέθοδοι μέτρησης των αμμωνιακών αλάτων και της σακχαρόζης σε υπερκείμενα υγρά επιλεγμένων δειγμάτων V

7 Πίνακας Περιεχομένων Κεφάλαιο 1 ο : Εισαγωγή Κίνητρο Ερευνητικού Θέματος Σκοπός της Διπλωματικής Εργασίας... 2 Κεφάλαιο 2 ο : Οι πολύ (ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους Συνθετικά πολυμερή-πλαστικά Βιοδιασπώμενα-βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή Σημαντικότητα και χρήσεις των πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκών) εστέρων PHAs Εφαρμογές των PHAs Βιοαποικοδόμηση των PHAs Πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικός) εστέρας (PHB) Κεφάλαιο 3 ο : Υλικά και μέθοδοι Βακτηριακό στέλεχος Αποθήκευση βακτηριακού στελέχους Υλικά Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Αποστείρωση των μέσων ανάπτυξης και των σκευών του εργαστηρίου Προετοιμασία προκαλλιέργειας Ανάπτυξη καλλιέργειας σε κωνικές φιάλες Ανάπτυξη καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα Παρακολούθηση ανάπτυξης και δειγματοληψία Αναλυτικές μέθοδοι Μέτρηση ξηρής βιομάζας Ταυτοποίηση και υπολογισμός % κ.β. PHB σε δείγματα ξηρής βιομάζας Μέτρηση συγκέντρωσης αμμωνιακών αλάτων Μέτρηση συγκέντρωσης σακχάρων Ανάκτηση και καθαρισμός PHB από επιλεγμένα δείγματα Κεφάλαιο 4 o : Πειραματικός σχεδιασμός Ανάπτυξη καλλιέργειας σε κωνικές φιάλες VI

8 4.2 Ανάπτυξη καλλιέργειας και παραγωγή PHB στο Βιοαντιδραστήρα Κεφάλαιο 5 ο : Παράθεση και σχολιασμός αποτελεσμάτων των πειραματικών μετρήσεων Αποτελέσματα πειραμάτων στην κλίμακα των κωνικών φιαλών Πείραμα Πείραμα Πείραμα Πείραμα Αποτελέσματα πειραμάτων στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα Πείραμα 1 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πείραμα 2 - τροφοδοσία AL2 και μηδενικής πηγής αζώτου Πείραμα 3 - τροφοδοσία AL2 και μηδενικής πηγής αζώτου Πείραμα 4 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πείραμα 5 και Πείραμα 6 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πείραμα 7 και Πείραμα 8 - τροφοδοσία AL Αποτελέσματα πειράματος για τη μελέτη της επίδρασης της ανομοιογένειας του κυτταρικού πληθυσμού του σταδίου προκαλλιέργειας στην περαιτέρω ανάπτυξη του A.lata Κεφάλαιο 6 ο : Συμπεράσματα και προτάσεις Συμπεράσματα Προτάσεις Κεφάλαιο 7 ο : Βιβλιογραφία VII

9 Κατάλογος Σχημάτων Σχήμα 2.1. Σύσταση του PHB Σχήμα 3.1. Κωνικές φιάλες μέσα στον κινούμενο επωαστήρα Σχήμα 3.2. Διάταξη του βιοαντιδραστήρα και μονάδας παρακολούθησης-ρύθμισης (αριστερά).... Error! Bookmark not defined. Σχήμα 3.3. Ποιοτική αναπαράσταση της μεθόδου προσδιορισμού του % περιεχόμενου PHB με τη μέθοδο FTIR. Τα δύο φάσματα είναι από διαφορετικά στάδια της καλλιέργειας με διαφορετικά ποσοστά συσσώρευσης. Οι απορροφήσεις οφείλονται στον εστερικό δεσμό (C=O) και στην αμιδό-ομάδα (N-H2) Σχήμα 3.4. Καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου προσδιορισμού του ενδοκυττάριου ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB σε δείγματα ξηρής βιομάζας καλλιεργειών του Azohydromonas lata. Η καμπύλη προέκυψε από τη συσχέτιση των επεξεργασμένων FTIR φασμάτων με το πραγματικό % περιεχόμενο PHB μετρημένο με GC Σχήμα 4.1. Διαγραμματική απεικόνιση σχεδιασμού πειράματος για τη μελέτη της επίδρασης της πηγής αζώτου (θειικού αμμωνίου) στην ανάπτυξη της κύριας καλλιέργειας Σχήμα 4.2. Σχεδιασμός πειράματος έναρξης καλλιέργειας από διαφορετικές συγκεντρώσεις πηγής αζώτου Σχήμα 5.1. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 4, 7, 8 -Πείραμα 1 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.2. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 5, 6, 9 -Πείραμα 1 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.3. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 4, 5, 8, 9, 10-Πείραμα 2 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.4. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 5, 9, 10-Πείραμα 2 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.5 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας στις κωνικές φιάλες (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 1 g/l)- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες VIII

10 Σχήμα 5.6 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας στις κωνικές φιάλες (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 4 g/l)- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.7. Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης των καλλιεργειών ως προς την οπτική πυκνότητα- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες Σχήμα 5.8.Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 1, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες Σχήμα 5.9. Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 2, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες Σχήμα Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 3, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες Σχήμα Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 4, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες Σχήμα 5.12 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και (NH4)2SO4)-Πείραμα Σχήμα 5.13 Το δυναμικό προφίλ του ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας και η καταναλισκόμενη συγκέντρωση πηγής αζώτου (g/l)-πείραμα Σχήμα 5.14 Το δυναμικό προφίλ του διαλυμένου οξυγόνου και των % Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)-Πείραμα Σχήμα 5.15 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα Σχήμα 5.16 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της IX

11 καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα Σχήμα 5.17 Το δυναμικό προφίλ των % απαερίων Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα Σχήμα 5.18 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου του κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα Σχήμα 5.19 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα Σχήμα 5.20 Το δυναμικό προφίλ των λειτουργικών παραμέτρων του συστήματος που μελετώνται κατά την πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα Σχήμα 5.21 Το δυναμικό προφίλ τροφοδοσίας σακχαρόζης και θειικού αμμωνίου της βακτηριακής καλλιέργειας του υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα Σχήμα 5.22 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2) - Πείραμα Σχήμα 5.23 Το δυναμικό προφίλ του διαλυμένου οξυγόνου και των % Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα Σχήμα 5.24 Η δυναμική μεταβολή των λειτουργικών παραμέτρων και της τροφοδοσίας της πηγής σακχαρόζης κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα X

12 Σχήμα 5.25 Το δυναμικό προφίλ της οπτικής πυκνότητας και της συγκέντρωσης σακχαρόζης (g/l), κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα Σχήμα 5.26 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα Σχήμα 5.27 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα Σχήμα 5.28 Σύγκριση καλλιεργειών που ξεκίνησαν από διαφορετικές αποικίες του ίδιου τριβλίου-πείραμα 5 στις κωνικές φιάλες XI

13 Κατάλογος Πινάκων Πίνακας 3.1. Σύσταση θρεπτικών μέσων ανάπτυξης AL, ανάλογα με την κλίμακα της καλλιέργειας (τροποποιημένοι από τη δουλειά των Wang and Lee, 1997) Πίνακας 3.2. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων (Trace Element Solution) (Wang and Lee, 1997) Πίνακας 4.1. Όγκοι υγρής καλλιέργειας των κωνικών φιαλών Πίνακας 4.2. Διαλύματα κωνικών φιαλών Πίνακας 4.3. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 1 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας 4.4. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 2 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Πίνακας 4.5. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 3 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία και μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Πίνακας 4.6. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 4 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας 4.7. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 5 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας 4.8. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 6 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας 4.9. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 7 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 8 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Πίνακας Οπτική πυκνότητα των καλλιεργειών της πρώτης ομάδας από κωνικές φιάλες. 57 Πίνακας Οπτική πυκνότητα των καλλιεργειών της δεύτερης ομάδας από κωνικές φιάλες Πίνακας Οπτική πυκνότητα καλλιεργειών της τρίτης ομάδας από κωνικές φιάλες XII

14 Πίνακας 5.1. Συγκέντρωση της πηγής αζώτου στις καλλιέργειες 1, 2, 3, 4 (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.2. Χρονική εξέλιξη της καλλιέργειας 2Α (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.3. Χρονική εξέλιξη της καλλιέργειας 2Β (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.4. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 2 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από αποικία σε τριβλίο Petri (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.5. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 2 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από freeze dried stock (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.6. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 3 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από αποικία σε τριβλίο Petri (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.7. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 3 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από freeze dried stock (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες) Πίνακας 5.8. Κατανάλωση πηγής αζώτου και δυναμικό προφίλ % περιεχόμενου PHB ανά g DCW κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα με ημισυνεχείς συνθήκες (συνεχής τροφοδοσία AL2) (Πείραμα 3) Πίνακας 5.9. Το ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB ανά g DCW κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα με ημισυνεχείς συνθήκες (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4) (Πείραμα 4) Πίνακας 6.1. Συγκεντρωτικός πίνακας λειτουργικών παραμέτρων που μελετώνται για τη χαρτογράφηση των περιοχών λειτουργίας της βακτηριακής καλλιέργειας του A.lata XIII

15 Κατάλογος Συμβόλων [(NH4)2SO4]: συγκέντρωση του θειικού αμμωνίου σε g/l DF (Dilution Factor): παράγοντας αραίωσης [Α]690nm: απορρόφηση του χρωματισμένου διαλύματος στα 690 nm [C]: συγκέντρωση της σακχαρόζης σε g/l [Α]540nm: απορρόφηση του χρωματισμένου διαλύματος στα 540nm XIV

16 Κεφάλαιο 1 ο : Εισαγωγή 1.1. Κίνητρο Ερευνητικού Θέματος Είναι γεγονός ότι τα τελευταία χρόνια, τόσο σε παγκόσμια αλλά ιδιαίτερα σε Ευρωπαϊκή κλίμακα, επηρεάζοντας έτσι και τα Ελληνικά δεδομένα, ο τομέας της βιομηχανίας εξειδικευμένων υλικών (specialties) διανύει μια μεταβατική περίοδο. Πρόκειται για ένα στάδιο αναζήτησης νέων προϊόντων σημαντικά υψηλής προστιθέμενης αξίας και ιδιαίτερης χρηστικότητας βασισμένα σε αειφόρες παραγωγικές διεργασίες, όπως προστάζει το φαινόμενο της παγκοσμιοποίησης και οι εξελισσόμενες καταναλωτικές απαιτήσεις. Οι τάσεις αυτές έχουν πλέον εξαπλωθεί και αποτελούν ένα ισχυρό κίνητρο για την ανάπτυξη καινοτόμων προϊόντων, αγορών αλλά και τεχνολογιών. Στο πλαίσιο της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας οι τάσεις αυτές αποτέλεσαν γνώμονα και κινούσα δύναμη και τέθηκε ως στόχος να αναπτυχθούν ή να εξελιχθούν τεχνολογίες νέες ή υπάρχουσες που θα οδηγήσουν με τρόπο οικονομικά βιώσιμο και αειφόρο είτε σε καινοτόμα προϊόντα είτε σε προϊόντα που η διεθνής αγορά, μέσα από τις διάφορες καταναλωτικές της εκφάνσεις και ανάγκες, τα έχει ήδη απαιτήσει και προδιαγράψει και είναι έτοιμη να τα δεχτεί. Πιο συγκεκριμένα, οι περιβαλλοντικές επιπτώσεις των συμβατικών υλικών σε συνδυασμό με τις σημαντικές εφαρμογές των βιοϋλικών στον τομέα της βιοϊατρικής, αλλά και τις πολυάριθμες καθημερινές εφαρμογές τους, έστρεψε το ερευνητικό ενδιαφέρον, εδώ και δύο δεκαετίες, στην παραγωγή υψηλής προστιθέμενης αξίας βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών από μικροβιακές καλλιέργειες (βιοπολυμερών). Μάλιστα, τα τελευταία χρόνια γίνεται προσπάθεια μαζικής παραγωγής και εμπορευματοποίησής τους. Οι πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (polyhydroxyalkanoates, PHAs) αποτελούν μια οικογένεια πλήρως βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών, οι οποίοι σχηματίζονται στο κυτταρόπλασμα μικροοργανισμών ως αποθήκες άνθρακα και ενέργειας. Παρουσιάζουν εξαιρετική 1

17 Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγή βιοσυμβατότητα και καθόλου τοξικότητα, ενώ παράγονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες (όπως σάκχαρα, άμυλο, τυρόγαλα, κ.λ.π). Το μεγαλύτερο εμπόδιο στη βιομηχανική παραγωγή και πλήρη εμπορευματοποίησή τους είναι το υψηλό κόστος παραγωγής τους, καθώς και η ελλιπής γνώση στον έλεγχο, την κλιμάκωση και τη βελτιστοποίηση της παραγωγικής διεργασίας, με αποτέλεσμα να βρίσκουν σήμερα περιορισμένες συμβατικές εφαρμογές όπως είναι τα υλικά συσκευασίας, καθώς και τα βιοϊατρικά και φαρμακευτικά προϊόντα. 1.2 Σκοπός της Διπλωματικής Δ Εργασίας Η παρούσα μελέτη πραγματεύεται τη μικροβιακή παραγωγή του πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικού εστέρα) poly(3-hydroxybutyrate), PHB) μέσω της καλλιέργειας του βακτηριακού στελέχους Azohydromonas lata, με βασικό σκοπό τη μείωση του συνολικού κόστους παραγωγής. Ο σκοπός αυτός προσεγγίζεται μέσα από τρεις βασικούς ερευνητικούς στόχους: τη χαρτογράφηση του προφίλ λειτουργίας της βακτηριακής καλλιέργειας αρχικά στο επίπεδο των κωνικών φιαλών και στη συνέχεια στο επίπεδο του βιοαντιδραστήρα εργαστηριακής κλίμακας, τη βελτιστοποίηση της παραγωγικής διαδικασίας με αναζήτηση της βέλτιστης πολιτικής λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα για την αποτελεσματικότερη παραγωγή του PHB σε υψηλή συγκέντρωση και ωριαία παραγωγή κατά τρόπο συνεπή, ελεγχόμενο, συστηματικό και επαναλαμβανόμενο, και τον προσδιορισμό και τη μελέτη της επίδρασης των κύριων λειτουργικών παραμέτρων που υπεισέρχονται στην προσπάθεια για βελτιστοποίηση και πιθανή κλιμάκωση της διεργασίας της μικροβιακής καλλιέργειας από το εργαστηριακό επίπεδο σε πιλοτικό ή ακόμη και βιομηχανικό. Η εντατικοποίηση της παραγωγής θεωρείται σήμερα κλειδί για την διασφάλιση της ανταγωνιστικότητας και επιδιώκεται με την ανάπτυξη τεχνολογιών που εξασφαλίζουν αειφορία στην παραγωγή του συγκεκριμένου προϊόντος. Η τελευταία στηρίζεται στο σχεδιασμό, την κατασκευή και τη λειτουργία νέων παραγωγικών διαδικασιών που εξασφαλίζουν ενεργειακά, οικονομικά και περιβαλλοντικά οφέλη προϋποθέτοντας τη βελτιστοποίηση της παραγωγικής διαδικασίας. Από την άλλη, η προκαταρκτική μελέτη των 2

18 Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγή συνθηκών κλιμάκωσης ενός πρωτοκόλλου λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα θα αποτελέσει σημαντικό υπόβαθρο για μια επιτυχημένη, υπό κλίμακα, μεταφορά της παραγωγικής διεργασίας και σε μεγαλύτερου μεγέθους βιοαντιδραστήρες, ακόμη και σε βιομηχανική κλίμακα. Στο πλαίσιο της μελέτης αυτής διεξήχθησαν πειράματα και στα δύο επίπεδα καλλιέργειας: κωνικές φιάλες και βιοαντιδραστήρας, που περιλάμβαναν προσεκτική παρακολούθηση της χρονικής εξέλιξης βακτηριακών καλλιεργειών του στελέχους Azohydromonas lata, καθώς και της εξέλιξης της μορφολογίας των κυττάρων και των λειτουργικών παραμέτρων του βιοαντιδραστήρα. Οι τελευταίες αποτελούν καίριες παραμέτρους, μεμονωμένα ή συνδυαστικά και πρέπει να τροποποιηθούν αναλογικά με το βαθμό κλιμάκωσης της διεργασίας. Η μελέτη του συστήματος πραγματοποιήθηκε με βάση τις σημαντικότερες διατροφικές και λειτουργικές παραμέτρους κάτω από ασυνεχείς και ημισυνεχείς συνθήκες καλλιέργειας. Μελετήθηκε συστηματικά η επίδραση των σημαντικότερων παραμέτρων (π.χ., αρχική σύσταση του μέσου όσο αφορά το λόγο άνθρακας/άζωτο (g/g), οι συνθήκες μεταφοράς οξυγόνου, ο χρόνος παραμονής στη στατική φάση, η συχνότητα ανάδευσης, το διαλυμένο οξυγόνο, το ph της καλλιέργειας, ο όγκος εμβολιασμού, οι πολιτικές τροφοδοσίας) κυρίως στα ποσοτικά χαρακτηριστικά του συστήματος και έγινε μια προσπάθεια για τον εντοπισμό μιας μεθοδολογίας χειρισμού του ρυθμού ανάπτυξης και απόδοσης της καλλιέργειας, της παραγωγικότητας και της αποτελεσματικότητας συσσώρευσης του βιοπολυμερούς PHB στο κυτταρόπλασμα των μικροβιακών κυττάρων. Ανάμεσα στους στόχους της μελέτης αυτής που εστιάζουν στη μικροβιακή παραγωγή του PHB με υψηλή απόδοση και υψηλή παραγωγικότητα, όπως ήδη αναφέρθηκε, περιλαμβάνεται και η προσπάθεια εύρεσης μια στρατηγικής βελτιστοποίησης της παραγωγής του βιοπολυμερούς υπό ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας. Με βάση την παραγόμενη πληροφορία για τη βέλτιστη καλλιέργεια σε βιοαντιδραστήρα υπό ασυνεχείς συνθήκες (Penloglou, 2010), μελετήθηκε η δυνατότητα ενίσχυσης του ρυθμού ανάπτυξης του κυτταρικού πληθυσμού και της συσσώρευσης του προϊόντος μέσα από ένα προφίλ ημισυνεχούς λειτουργίας. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε πειραματικός προσδιορισμός και προσπάθεια εύρεσης και εφαρμογής κατάλληλων πολιτικών τροφοδοσίας, με στόχο την επίτευξη καθοδηγούμενου μεταβολισμού 3

19 Κεφάλαιο 1 ο Εισαγωγή των κυττάρων προς επιθυμητά μεταβολικά μονοπάτια, εφαρμόζοντας συνθήκες περιορισμού διατροφικών συστατικών (κυρίως αζώτου). Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη θίγεται ιδιαίτερα η σημασία της προϊστορίας ανάπτυξης των κυττάρων του μικροοργανισμού στην επίδραση που έχουν στην περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας. Η δυναμική παρακολούθηση των καλλιεργειών πραγματοποιήθηκε με μια σειρά on-line και off-line αναλυτικών τεχνικών που περιλαμβάνει μετρήσεις: για το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων, την ξηρή μάζα κυττάρων, την κατανάλωση των υποστρωμάτων/πηγών-άνθρακα, την κατανάλωση άλλων διατροφικών συστατικών (πηγές αζώτου), τη μέτρηση κατανάλωσης ή παραγωγής Ο2 και CO2 και τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του PHB, μέσω κατάλληλων αναλυτικών μεθόδων. 4

20 Κεφάλαιο 2 ο : Οι πολ ολύ (ύδρο ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs PHAs) και η σημασία τους Συνθετικά πολυμερή-πλαστικά πλαστικά Από τη στιγμή της ανακάλυψής τους τα συνθετικά πολυμερή-πλαστικά αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της καθημερινότητας του ανθρώπου. Οι εξαιρετικές μηχανικές τους ιδιότητες και το τεράστιο εύρος εφαρμογών έχουν οδηγήσει στην κατάκτηση μεγάλου μέρους της αγοράς υλικών και στη συνεχή αύξηση του ρυθμού κατανάλωσης ( Loo and Sudesh, 2007). Γενικά, τα συμβατικά πολυμερή και συγκεκριμένα τα συνθετικά πλαστικά (παράγωγα της βιομηχανίας πετρελαίου), όπως είναι το τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο (PET), το πολυαιθυλένιο (PE), το πολυβινυλοχλωρίδιο (PVC), το πολυπροπυλένιο (PP), το πολυστυρένιο (PS), το πολυαμίδιο (PA), κ.α., θεωρούνται ιδανικά υλικά για επεξεργασία και χρήση. Μπορεί να είναι ανθεκτικά στη δράση πολλών χημικών, να παρέχουν ηλεκτρική και θερμική μόνωση, να έχουν σημαντική αντοχή στη θραύση, υψηλή σκληρότητα, κατάλληλη ελαστικότητα για πολλές εφαρμογές και ταυτόχρονα να είναι πολύ ελαφριά (Rincones et al., 2009, Siracusa et al., 2008). Το μεγάλο πρόβλημα όμως που προκύπτει από την υπέρμετρη παραγωγή και χρήση των συμβατικών πλαστικών είναι η μεγάλη δυσκολία στη διάθεση των απορριμμάτων τους (Sudesh and Iwata, 2008). Έχουν ισχυρή αντίδραση στη βιοαποικοδόμηση από τους μικροοργανισμούς του περιβάλλοντος και συσσωρεύονται στο έδαφος ή στη θάλασσα για εκατονταετίες (Ojumu et al., 2004). Ενδεικτικά, το 2003 ο ρυθμός ετήσιας παραγωγής πλαστικών ήταν περίπου 130,000,000 tn/yr, με ρυθμό αύξησης περίπου 4-5% κάθε χρόνο, ενώ η ετήσια κατανάλωση πλαστικών υλικών κατά άνθρωπο στην Ευρώπη και στις Η.Π.Α. ήταν 60 και 80 kg, αντίστοιχα (Shen et al., 2009). Περίπου το 40% των χρησιμοποιούμενων πλαστικών δεν ανακυκλώνεται και εκατομμύρια τόνοι απορρίπτονται στο χερσαίο ή υδάτινο περιβάλλον. Συγκεκριμένα, για το 2008 ο ρυθμός συσσώρευσης πλαστικών απορριμμάτων έχει υπολογιστεί περίπου σε 5

21 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. 25,000,000 tn/yr, μόνο για την ευρωπαϊκή ζώνη (Jacquel et al., 2008). Τις τελευταίες δεκαετίες τα βιοαποικοδομήσιμα ή βιοδιασπώμενα πλαστικά αποτελούν σημαντικό αντικείμενο έρευνας. Από τις ιδιότητες αυτών των υλικών ίσως η πιο ελκυστική είναι η φυσική διάσπασή τους στο περιβάλλον σε σύντομο χρονικό διάστημα (Sudesh and Iwata, 2008). Προέρχονται συνήθως από ανανεώσιμες πρώτες ύλες και διασπώνται από διάφορα είδη μικροοργανισμών που αναπτύσσονται στο περιβάλλον. Κατέχουν παρόμοιες φυσικές και μηχανικές ιδιότητες με τα συνθετικά πλαστικά και για το λόγο αυτό αποτελούν μια εναλλακτική πρόταση στη χρήση των κοινών πλαστικών, ενώ παράλληλα δίνουν λύση στο πρόβλημα της μόλυνσης του περιβάλλοντος, της εξοικονόμησης χώρου απόθεσης απορριμμάτων και της μελλοντικής απεξάρτησης από ορυκτές πρώτες ύλες (Queiroz and Collares Queiroz, 2009; Rincones et al., 2009) Βιοδιασπώμενα-βιοαποικοδομήσιμα πολυμερή Γενικά, τα βιοδιασπώμενα πολυμερή διακριτοποιούνται στις δύο ακόλουθες μεγάλες κατηγορίες (Jering and Günther, 2010; Shen et al., 2009): (i) Φυσικά βιοδιασπώμενα πολυμερή. (ii) Συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή. Τα βιοδιασπώμενα πολυμερή που παράγονται με φυσικές διαδικασίες ονομάζονται φυσικά πολυμερή. Σε αυτά ανήκουν τα πολυμερή από πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες, όπως αυτά με βάση το άμυλο, το κολλαγόνο και τη χιτίνη, καθώς και τα πολυμερή που παράγονται από μικροοργανισμούς μέσω ζυμώσεων: Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (Polyhydroxyalkanoates, PHAs). Τα συνθετικά βιοδιασπώμενα πολυμερή χωρίζονται στα πολυμερή που προέρχονται από ανανεώσιμες πρώτες ύλες και σε αυτά που προέρχονται από πετροχημικές πρώτες ύλες (μη-ανανεώσιμες). Στην πρώτη υποκατηγορία συνθετικών βιοδιασπώμενων πολυμερών ανήκουν πολυμερή (π.χ., το Πολυγαλακτικό οξύ (PLA)) των οποίων οι πρώτες ύλες μπορούν να παραχθούν μέσω μικροβιακής δράσης. Στη δεύτερη υποκατηγορία ανήκουν πολυμερή που παράγονται από ανεξάντλητες πρώτες ύλες, αλλά μέσω χημικών-βιοχημικών διεργασιών (π.χ., Πολυκαπρολακτόνη (PCL)) (Sudesh and Iwata, 2008). 6

22 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. Είναι γεγονός ότι τα βιοδιασπώμενα πολυμερή μπορούν να συμβάλουν σημαντικά στη διατήρηση των παγκόσμιων φυσικών πηγών ορυκτού πλούτου και στην προστασία του περιβάλλοντος (Bastioli, 2005). Ωστόσο, η διείσδυση και η δυναμική τους στη διεθνή αγορά αναμένεται να έχει ανοδική πορεία, εφόσον πραγματοποιηθούν οι αναγκαίες ερευνητικές και οικονομικές επενδύσεις για την ανάπτυξη και βελτίωση της τεχνολογίας παραγωγής τους και κατά επέκταση καθιερωθούν τα βιομηχανικά πρότυπα και οι πιστοποιήσεις που θα ενθαρρύνουν την αγορά αυτών των υλικών (Platt, 2006). Η παρούσα μελέτη αφορά την παραγωγή ενός βιοαποικοδομήσιμου πολυμερούς, Πολύ(3- ύδροξυ βουτυρικός) Εστέρας (PHB) της οικογένειας των Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκών) Εστέρων (PHAs) Σημαντικότητα και χρήσεις των πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκών) εστέρων PHAs Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (ή τα Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκά) οξέα) (PHAs) είναι γραμμικοί πολυεστέρες των ύδροξυ αλκανοϊκών οξέων, οι οποίοι σχηματίζονται στο κυτταρόπλασμα βακτηρίων και άλλων μικροοργανισμών ως αποθήκη άνθρακα και ενέργειας, με τη μορφή διακριτών κόκκων, κάτω από συνθήκες μη ισορροπημένης ανάπτυξης (Chen, 2010; Lu et al., 2009). Μπορεί να περιλαμβάνουν αλειφατικά ή αρωματικά μονομερή ύδροξυ οξέων (Παπανεοφύτου, 2008). Πρόκειται για πλήρως βιοαποικοδομήσιμα και βιοσυμβατά πολυμερή, τα οποία παράγονται από φυσικές και ανανεώσιμες πρώτες ύλες και κατέχουν παρόμοιες ιδιότητες με τα συνθετικά πολυμερή. Στο έδαφος και το νερό διασπώνται από βακτήρια και μύκητες με τον ίδιο τρόπο που αποικοδομούνται τα φυτικά και ζωικά απόβλητα στο περιβάλλον. Η ιδιότητά τους αυτή να βιοδιασπώνται και το γεγονός ότι μπορούν να παραχθούν από ανανεώσιμες πρώτες ύλες τους προσδίδει σημαντική εμπορική αξία. Τα συμβατικά πλαστικά παράγονται από πεπερασμένα αποθέματα άνθρακα και πετρελαίου και επιπλέον, δεν είναι βιοδιασπώμενα. Άλλες μέθοδοι παρασκευής βιοαποικοδομήσιμων πολυεστέρων περιλαμβάνουν τη χημική σύνθεσή τους (Ratledge and Kristiansen, 2001). Σήμερα έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 150 διαφορετικά είδη PHAs (ομοπολυμερή και συμπολυμερή), ενώ ο αριθμός αυτός συνεχώς αυξάνει (Loo and Sudesh, 2007; Lu et al., 2009). Γενικά τα PHAs χωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες, ανάλογα με το μέγεθος της αλυσίδας 7

23 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. της επαναλαμβανόμενης μονάδας (Akaraonye et al., 2010): (1) Σε PHAs μικρού μήκους αλυσίδας (short-chain-length PHAs, scl-phas), όπου το επαναλαμβανόμενο μονομερές αποτελείται από 3-5 άτομα άνθρακα. (2) Σε PHAs μεσαίου μήκους αλυσίδας (medium-chain-length PHAs, mcl-phas), όπου το επαναλαμβανόμενο μονομερές αποτελείται από 6-14 άτομα άνθρακα. Τα τελευταία χρόνια στις παραπάνω κατηγορίες έχει προστεθεί και αυτή των PHAs μεγάλου μήκους αλυσίδας >C14 (long chain length, lcl-phas), για τα οποία ακόμη η γνώση και το ενδιαφέρον είναι μάλλον περιορισμένα (Wu et al., 2009) Εφαρμογές των PHAs Ένα από τα σημαντικότερα πεδία εφαρμογών των βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών είναι ο βιοϊατρικός τομέας (Chen, 2009; Hazer and Steinbuchel, 2007; Novikova et al., 2008, Xiong et al., 2010). Στο πεδίο αυτό τα βιοδιασπάσιμα πολυμερή παρουσιάζουν σημαντικό πλεονέκτημα συγκριτικά με τα χημικά παραγόμενα πολυμερή, καθώς κατά την παραγωγή τους απουσιάζουν τα μεταλλικά στοιχεία που χρησιμοποιούνται ως καταλύτες στη χημική σύνθεση (Kim and Lenz, 2001). Πολλά από τα PHAs έχουν δοκιμαστεί με επιτυχία ως προς τη βιοσυμβατότητά τους σε ζωικούς, αλλά και ανθρώπινους οργανισμούς (Vallapil et al., 2006). Επιπλέον, έχουν εφαρμοστεί στη μηχανική ιστών, ως ελάσματα οστών, οστεοσυνθετικά υλικά και χειρουργικά ράμματα (Misra et al., 2006; Philip et al., 2007). Επιπροσθέτως, τα πολυμερή αυτά έχουν αξιοποιηθεί επιτυχημένα ως μεταφορείς φαρμάκων και ορμονών με στοχευμένη απελευθέρωση στον ανθρώπινο οργανισμό (Steinbuchel and Fuchtenbucch, 1998). Γενικά, ένα πολυμερές της οικογένειας των PHAs με μοριακό βάρος της τάξεως των 20,000,000 g/mol θεωρείται κατάλληλο για την παραγωγή σκληρών ινών και μεταφορών φαρμάκων. Παρά το γεγονός ότι στη βιβλιογραφία εμφανίζονται μέθοδοι παραγωγής με μοριακό βάρος που ικανοποιεί τις προδιαγραφές αυτές, κυρίως μέσω γενετικά τροποποιημένων μικροοργανισμών, η μαζική παραγωγή τους απουσιάζει κυρίως λόγω της έλλειψης συγκεκριμένης, οικονομικά βιώσιμης στρατηγικής (Choi and Lee, 2004). Σήμερα, ίσως η μεγαλύτερη συνεισφορά των PHAs στον τομέα της βιοϊατρικής είναι στην καρδιαγγειακή ιατρική (παραγωγή εμπορικών υποκατάστατων αρτηριών, αγγειακά 8

24 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. μοσχεύματα, καρδιακές βαλβίδες, χειρουργικά νήματα, επιδέσμους (Williams and Martin, 2002)). Ακόμη, συνεισφέρουν στην αναγέννηση-ανάπλαση ιστών και νεύρων (Gao et al., 2006). Οι πρώτες βιομηχανικές εφαρμογές των PHAs ήταν απλές συσκευασίες καθημερινής χρήσης, όπως μπουκάλια για σαμπουάν κατασκευασμένα από βιοπολυμερές Biopol της βρετανικής εταιρείας I.C.I. Co. (Απρίλιος του 1990, Wella A.G.) (Philip et al., 2007). Πλέον, η αξιοποίηση των PHAs σε μεγάλο εύρος βιομηχανικών εφαρμογών είναι σημαντική. Σκληρά και λεπτά φύλλα των PHAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως προστατευτικό αδιάβροχο περιτύλιγμα, σε αντικατάσταση του συνδυασμού χαρτονιού-αλουμινίου που εφαρμόζεται σήμερα (Lauzier et al., 1993; Mauclaire et al., 2010). Γενικά, μετά από την κατάλληλη επεξεργασία των PHAs μπορούν να προκύψουν ελάσματα, φιλμ και διαφράγματα (Chen, 2005). Στη διεθνή αγορά υπάρχουν σήμερα αρκετές εταιρίες οι οποίες διαθέτουν εμπορικά ομο- ή συμ- πολυμερή των PHAs (Chen, 2009; Philip et al., 2007). Συνολικά 16 εταιρίες παράγουν PHAs σε πιλοτικό ή βιομηχανικό επίπεδο. Συνοπτικά, κάποια από τα διαθέσιμα προϊόντα είναι: το Mirel (πρώην Biopol ) (συμπολυμερές του 3-ύδροξυ βουτυρικού και του 3ύδροξυ βαλερικού οξέος, P(3HB-3HV)), το Biomer (ομοπολυμερές του 3-ύδροξυ βουτυρικού οξέος, P(3HB)), το Kaneka (πρώην Nodax ) (συμπολυμερές του 3-ύδροξυ βουτυρικού και του 3 ύδροξυ εξανοϊκού οξέος, P(3HB-3HHx)) και το Biocycle (ομοπολυμερές του 3-HB, P(3HB) και συμπολυμερές των 3-HB και 3-HV, P(3HB-3HV)). Το PHB με την εμπορική σημασία Biomer αξιοποιείται προς την παραγωγή χτενών, στυλό και άλλων σκληρών πλαστικών. Το Mirel έχει εγκριθεί από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (Food and Drug Administration, FDA) των Η.Π.Α. για εφαρμογές σε συσκευασίες τροφίμων. Από το προϊόν Kaneka παρασκευάζονται συνθετικά χαρτιά, ελαστικά φιλμ περιτυλίγματος και γενικότερα θερμοπλαστικά προϊόντα (Philip et al., 2007). Πέρα από τις βιοϊατρικές και συμβατικές καθημερινές εφαρμογές, υπάρχει ένα άλλο πλήθος εφαρμογών των βιοαποικοδομήσιμων πολυμερών. Λόγω του πιεζοηλεκτρικού χαρακτήρα τους, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αισθητήρες πίεσης όπως για παράδειγμα σε πληκτρολόγια ηλεκτρονικού υπολογιστή, σε μετρητικά πίεσης και ελαστικότητας, σε ηχεία και άλλα (Philip et al., 2007). Τα μονομερή των PHAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δομικά συστατικά για την παραγωγή χημικών υψηλής προστιθέμενης αξίας, όπως αντιβιοτικά, 9

25 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. βιταμίνες, αρωματικά (Ren et al., 2005). Επιπροσθέτως, η παρασκευή σύνθετων υλικών με βάση τα PHAs, όπως για παράδειγμα τα νανοσύνθετα υλικά και μίγματα με άλλα υλικά και πολυμερή έχει οδηγήσει σε προϊόντα με εξαιρετικές τελικές ιδιότητες, όπως υψηλή μηχανική αντοχή και σταθερότητα στη θέρμανση. Μονομερή των PHAs έχουν χρησιμοποιηθεί και στην παρασκευή νέων βιοκαυσίμων (Zhang et al., 2009). Τα PHAs βρίσκουν εφαρμογή και στον αγροτικό τομέα, καθώς έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εγκλεισμό και τη στοχευμένη αποδέσμευση σπόρων, την ελεγχόμενη αποδέσμευση λιπασμάτων και εντομοκτόνων (Verlinden et al., 2007). Σύμφωνα με τις προβλέψεις της γερμανικής εταιρίας Biomer Biotechnology Co., που παράγει εμπορικά το Biomer (P(3HB)), μέχρι το 2030 το 60-65% των διαθέσιμων PHAs θα διατίθεται για εφαρμογές συσκευασιών (Shen et al., 2009) Βιοαποικοδόμηση των PHAs Ίσως η σημαντικότερη ιδιότητα της οικογένειας των PHAs είναι η πλήρης βιοαποικοδομησιμότητά τους στο περιβάλλον (Qu et al., 2006; Redy et al., 2003). Τα PHAs μπορούν να αποικοδομηθούν στο χώμα, σε θαλάσσιο περιβάλλον, σε λιπάσματα και σε αστικά λύματα. Οι σημαντικότερες παράμετροι που επηρεάζουν τη βιοαποικοδομησιμότητα τους διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: Σε παραμέτρους που εξαρτώνται από τα χαρακτηριστικά του περιβάλλοντος, όπως η πυκνότητα του μικροβιακού πληθυσμού στο συγκεκριμένο περιβάλλον, το επίπεδο της υγρασίας, η θερμοκρασία, το ph και η διαθεσιμότητα θρεπτικών συστατικών. Σε παραμέτρους που αντιστοιχούν σε ιδιότητες του προς αποικοδόμηση βιοπολυμερούς, όπως η κατανομή σύστασης συμπολυμερούς, η κατανομή μοριακού βάρους, το ποσοστό κρυσταλλικότητας, το σημείο τήξεως, η διαθέσιμη επιφάνειά του και τυχόν πρόσθετα συστατικά. Επίσης, το είδος των μονομερών που περιέχει ένα ομο- ή συμ- πολυμερές των PHAs επηρεάζει κατά πολύ το ρυθμό αποικοδόμησης. Έχει βρεθεί πως το PHB παρουσιάζει ισχυρότερη αντίσταση στη δράση των μικροοργανισμών του περιβάλλοντος, συγκριτικά με συμπολυμερή, όπως είναι τα P(3HB-3HV) και P(3HB-3HΗx) (Reddy et al., 2003). 10

26 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. Ο μηχανισμός της αποικοδόμησης προϋποθέτει την ανάπτυξη αποικιών μικροοργανισμών στην επιφάνεια του πολυμερούς και την εξωκυττάρια έκκριση αποπολυμεράσης από αυτούς. Κατά την αποικοδόμησή τους τα PHAs διασπώνται στα επαναλαμβανόμενα μονομερή τους, τα οποία, όπως ήδη αναφέρθηκε, διακρίνονται σε μονομερή που αποτελούνται από 3-5 άτομα C και σε αυτά που αποτελούνται από 6-14 άτομα C για scl-phas και mcl-phas αντίστοιχα. Τα τελικά προϊόντα της αερόβιας βιοαποικοδόμησης των PHAs είναι κυρίως CO2 και Η2Ο ενώ τα αντίστοιχα της αναερόβιας είναι CO2 και CH4 (Reddy et al., 2003) Πολύ(3-ύδροξυ ύδροξυ βουτυρικός) εστέρας (PHB) O Πολύ(3-ύδροξυ βουτυρικός) εστέρας (PHB) αποτελεί το πιο απλό και σημαντικό μέλος της οικογένειας των PHAs (Xu et al., 2010). Ήταν το πρώτο που ανακαλύφθηκε και από τότε αποτελεί το πιο πολυμελετημένο και χαρακτηρισμένο από τα PHAs. Μπορεί να συσσωρευτεί στο κυτταρόπλασμα βακτηρίων όπως ο Α. eutrophus και ο A. latus, σε ποσοστό που ξεπερνά το 90% της ξηρής μάζας κυττάρων (Anderson and Dawes, 1990). Στο εσωτερικό των κόκκων πολυμερούς το PHB παραμένει σε άμορφη κατάσταση, ενώ κρυσταλλώνεται ραγδαία μετά την εκχύλιση και καταβύθιση του (Madison and Huisman, 1999). Έχει μηχανικές ιδιότητες παρόμοιες με κάποια από τα συνθετικά πλαστικά, όπως είναι το πολυπροπυλένιο ή το πολυαιθυλένιο και μπορεί να υποστεί διέλαση, να μορφοποιηθεί σε καλούπια, να περιστραφεί σε ίνες, να πάρει μορφή ταινίας, καθώς κι άλλες μηχανικές επεξεργασίες, ανάλογα με την επιθυμητή εφαρμογή (Philip et al., 2007). Το μοριακό βάρος του PHB εκτείνεται σε τυπικές τιμές μεταξύ 10,000 και 3,000,000 g/mol, με δείκτη πολυδιασποράς περίπου ίσο με 2. Οι πυκνότητες του κρυσταλλικού και άμορφου PHB είναι 1.26 και 1.18 g/cm 3, αντίστοιχα (Khanna and Srivastava, 2005). Τέλος, είναι αδιάλυτο στο νερό και σε αντίθεση με το πολυπροπυλένιο βυθίζεται σε αυτό, καθώς έχει σημαντικά μεγαλύτερη πυκνότητα, διευκολύνοντας την αναερόβια βιοαποικοδόμησή του (Jendrossek, 2001). Στο Σχήμα 2.1 είναι ορατά τα μονομερή (3ΗΒ) που αποτελούν τον PHB. Λόγω του υψηλού μοριακού του βάρους, ακόμη και μεγάλες ποσότητες PHB έχουν μικρή επίδραση στην ωσμωτική πίεση εντός του κυττάρου, η οποία ρυθμίζει την εισροή νερού μέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Επίσης, η οξείδωση του PHB σε διοξείδιο του άνθρακα και νερό αποδίδει μεγάλες ποσότητες ενέργειας. Αυτές οι ιδιότητες τον καθιστούν ιδανικό απόθεμα άνθρακα και 11

27 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. ενέργειας για βακτήρια (Ratledge and Kristiansen, 2001). Σχήμα 2.1. Σύσταση του PHB. Γενικά, στις πολύ διαδεδομένες εφαρμογές του PHB συμπεριλαμβάνονται τα πλαστικά συσκευασιών, όπως μπουκάλια και δοχεία, τα υλικά προστασίας τροφίμων από υγρασία και οξυγόνο, όπως επικαλυπτικά και μεμβράνες περιτυλίγματος, ίνες, και άλλα (Hazel and Steinbuchel, 2007; Siracusa et al., 2008). Τα συμπολυμερή του PHB (κυρίως με PHV) εμφανίζουν πολύ μικρότερη διαπερατότητα σε οξυγόνο από το πολυαιθυλένιο και το πολυπροπυλένιο, χαρακτηριστικό που τα καθιστά καταλληλότερα για συσκευασίες τροφίμων (Salehizadeh and van Loosdrecht, 2004). Επιπλέον, ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του PHB είναι ότι είναι βιοσυμβατό και μπορεί να εμφυτευθεί στο σώμα χωρίς να προκαλέσει ανοσοκαταστολή, που είναι και η αιτία της απόρριψης των περισσότερων ξένων υλικών από το σώμα. Αποικοδομείται βραδέως σε 3- ύδροξυ-βουτυρικό οξύ, που αποτελεί συστατικό του αίματος. Η βραδύτητα της αποικοδόμησης το καθιστά ακατάλληλο για αποικοδομήσιμα ράμματα και άλλα εμφυτεύματα των οποίων οι ρυθμοί αποικοδόμησης πρέπει να είναι υψηλοί ενώ κρίνεται κατάλληλο για πιο ανθεκτικά εμφυτεύματα, όπως πλάκες οστών και επίδεσμοι τραυμάτων (Ratledge and Kristiansen, 2001). 2.7 Φάσεις ανάπτυξης ενός βακτηριακού μικροοργανισμού Σε ασυνεχείς καλλιέργειες (batch cultivations), ο κύκλος ανάπτυξης αποτελείται από τις ακόλουθες φάσεις (Dutta, 2008): 12

28 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. 1. Φάση καθυστέρησης: μια χρονική περίοδος κατά την οποία η αύξηση του αριθμού των κυττάρων είναι μηδενική. Στη φάση αυτή δεν παρατηρείται πολλαπλασιασμός των βακτηρίων, αλλά τα κύτταρα των βακτηρίων συνθέτουν τα απαραίτητα ένζυμα, και τις πρωτεϊνες για την επόμενη φάση. Πρόκειται για φάση προσαρμογής του βακτηρίου στις συνθήκες που βρέθηκε, και η διάρκεια αυτής της φάσης εξαρτάται από τον αρχικό αριθμό των βακτηρίων, από την ηλικία της καλλιέργειας και από τη σύσταση του θρεπτικού υλικού. 2. Επιταχυνόμενη φάση ανάπτυξης: ο αριθμός των κυττάρων αρχίζει να αυξάνεται και ο ρυθμός διαίρεσης αυξάνεται μέχρι να φθάσει το ανώτατο όριο. 3. Εκθετική φάση ανάπτυξης: ο αριθμός των κυττάρων αυξάνει εκθετικά καθώς τα κύτταρα διαιρούνται (ο ρυθμός ανάπτυξης αυξάνεται κατά αυτή τη φάση, αλλά ο ρυθμός διαίρεσης είναι σταθερός στη μέγιστη τιμή του). Η φάση αυτή χαρακτηρίζεται από έντονο πολλαπλασιασμό των μικροβίων, καθόσον μετά από κάθε διαίρεση των μικροβιακών κυττάρων (χρόνος γενεάς) ο αριθμός των μικροβίων διπλασιάζεται. Ο χρόνος γενεάς για τα περισσότερα βακτήρια είναι Κατά τη διάρκεια της φάσης αυτής τα κύτταρα μπορούν να υποστούν αλλαγές στο μέγεθος, επίσης στο τέλος της φάσης παρατηρείται αναστολή της ανάπτυξης καθόσον τα αρχικά θρεπτικά υλικά εξαντλούνται, και λόγω συγκέντρωσης στο υλικό προϊόντων ανταλλαγής της ύλης βλαπτικών για τον περαιτέρω πολλαπλασιασμό των μικροβίων. Για τους αερόβιους μικροοργανισμούς η έλλειψη οξυγόνου αποτελεί κύριο αίτιο αναστολής της ανάπτυξης. 4. Επιβραδυνόμενη φάση ανάπτυξης: αφού ο ρυθμός ανάπτυξης φθάνει ένα μέγιστο, ακολουθείται από την επιβράδυνση τόσο του ρυθμού ανάπτυξης όσο και του ρυθμού διαίρεσης. 5. Στατική φάση: ο κυτταρικός πληθυσμός φθάνει ένα ανώτατο όριο και δεν αυξάνεται περαιτέρω. Κατά τη φάση αυτή αναστέλλεται ο πολλαπλασιασμός των μικροβίων λόγω έλλειψης θρεπτικών υλικών, ελάττωσης σε οξυγόνο, και συσσώρευσης τοξικών προϊόντων από το μεταβολισμό των κυττάρων. Παρατηρείται όμως ελάχιστος πολλαπλασιασμός, ικανός να αντικαθιστά τον αριθμό των νεκρών κυττάρων. 13

29 Κεφάλαιο 2 ο Οι Πολύ(ύδροξυ αλκανοϊκοί) εστέρες (PHAs) και η σημασία τους. 6. Φάση θανάτωσης: αφού έχουν εξαντληθεί τα διαθέσιμα θρεπτικά συστατικά, ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων μειώνεται. Κατά τη φάση αυτή ο αριθμός των νεκρών κυττάρων υπερβαίνει κατά πολύ τον αριθμό των παραγομένων. Παρατηρείται σε ορισμένες περιπτώσεις συσσώρευση οξέων (Escherichia coli, Γαλακτοβάκιλλοι). Παρατηρούνται επίσης ανώμαλες μορφές των μικροβίων και αλλαγές των χρωστικών ιδιοτήτων και τα Gram-θετικά βακτήρια είναι δυνατόν να ερμηνευτούν μετά από χρώση ως Gram-αρνητικά. Η διάρκεια της φάσης θανάτου εξαρτάται από το βακτήριο. 14

30 Κεφάλαιο 3 ο : Υλικά και μέθοδοι 3.1. Βακτηριακό στέλεχος Για τις ανάγκες του συγκεκριμένου έργου και την παραγωγή του PHB θα χρησιμοποιηθεί ως παραγωγικό σύστημα το βακτήριο άγριου-τύπου Azohydromonas lata (DSM1123). Από το 2005 το στέλεχος αυτό έχει μετονομαστεί από την προηγούμενη ονομασία του Alcaligenes latus (Xie and Yokota, 2005). Πρόκειται για ένα μεσόφιλο αερόβιο βακτήριο, αρνητικό σε χρώση κατά Gram (Gram-negative), που απομονώνεται από το χώμα σε περιοχές όπως η Καλιφόρνια των Η.Π.Α. και η Αυστραλία. Τα κύτταρά του είναι σφαιρικά και ρομβοειδή με διαστάσεις συνήθως μm, ενώ οι αποικίες τους είναι κατά κανόνα σφαιρικές και υποκίτρινες. Η βέλτιστη περιοχή θερμοκρασιών για την ανάπτυξη του είναι ο C και η βέλτιστη περιοχή ph (Grothe et al., 1999, Yamane et al., 1996). 3.2 Αποθήκευση βακτηριακού στελέχους Η αποθήκευση και συντήρηση του βακτηριακού στελέχους πραγματοποιείται με τρεις διαφορετικούς τρόπους: (α) με αποθήκευση λυοφιλοποιημένης καλλιέργειας στους -30 ο C για 3-4 χρόνια, (β) με αποθήκευση δειγμάτων όγκου 1 ml από αναπτυσσόμενη καλλιέργεια σε πλούσιο μέσο ανάπτυξης (ΝΒ, Παράγραφος 2.4) σε ίση ποσότητα 40% (v/v) γλυκερίνης, στους 30 ο C για 4 μήνες, και (γ) με δημιουργία μεμονωμένων αποικιών (single colonies) σε τριβλία (Petri-dishes), τα οποία περιέχουν ισόποσα διαλύματα μέσου ΝΒ (8 g/l) και αγαρόζης (15 g/l) και συντήρηση στους 0 o C, για 4 εβδομάδες. Για τη δημιουργία των μεμονωμένων αποικιών της τρίτης μεθόδου χρησιμοποιείται η τεχνική της διασποράς των κυττάρων στην επιφάνεια του στερεού θρεπτικού υποστρώματος (Madigan et al., 2005). Όλες οι καλλιέργειες ενοφθαλμίζονται από προκαλλιέργεια που έχει αναπτυχθεί από μεμονωμένη αποικία σε Petri-dish αγαρόζης/nb, για την εξασφάλιση της ομοιομορφίας και του συγχρονισμού των κυττάρων. Για την ασφαλή αποθήκευση του βακτηρίου και τη 15

31 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι διασφάλιση της βιωσιμότητας των κυττάρων, φρέσκα Petri-dishes προετοιμάζονται κάθε 4 εβδομάδες από stock γλυκερίνης. Τα Petri-dishes επωάζονται στους 30 ο C για 24 h χωρίς ανάδευση. Τα stock της γλυκερίνης ανανεώνονται κάθε 4 μήνες από καλλιέργεια σε μέσο ανάπτυξης NB που ενοφθαλμίζεται με 2-3 mg από το λυοφιλοποιημένο stock της προμηθεύτριας εταιρίας Υλικά Όλα τα θρεπτικά συστατικά και τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν είναι της ισπανικής εταιρείας Panreac Quimica S.A., σε καθαρότητα κλίμακας Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC). Για τον περιορισμό του αφρίσματος του βιοαντιδραστήρα, κυρίως σε συνθήκες γρήγορης ανάπτυξης και συσσώρευσης πολυμερούς, χρησιμοποιήθηκε το σιλικονούχο αντιαφριστικό (antifoam) SE-15 της γερμανικής εταιρείας Sigma-Aldrich Chemie GmbH. Τα κατάλληλα αντιδραστήρια για τη μέτρηση της συγκέντρωσης των αμμωνιακών ήταν της γερμανικής εταιρείας Merck Chemicals KGaA. Τα πρότυπα ρυθμιστικά διαλύματα για τη βαθμονόμηση του πεχαμέτρου του βιοαντιδραστήρα είναι της ίδιας εταιρίας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τα βακτήρια του A.lata αναπτύσσονται σε δύο διαφορετικά μέσα: (i) σε ένα πλούσιο σε διατροφικά στοιχεία, Nutrient Broth (NB), και (ii) σε ένα φτωχότερο σε διατροφικά συστατικά, το AL medium. Το μέσο NB τροφοδοτείται στο μικροοργανισμό πάντα σε συγκέντρωση 8 g/l (5 g/l πεπτόνες και 3 g/l εκχύλισμα κρέατος) και είναι κατάλληλο για γρήγορο διπλασιασμό των κυττάρων, χωρίς σημαντική συσσώρευση πολυμερούς, οπότε χρησιμοποιείται για την προετοιμασία της προκαλλιέργειας. Στο μέσο NB δεν πραγματοποιείται ρύθμιση του ph πριν ή κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας. Το AL είναι χημικά καθορισμένο με τέτοιο τρόπο ώστε να επάγει τη συσσώρευση του ενδοκυττάριου PHB από τα κύτταρα, ως αποτέλεσμα περιορισμού κάποιου από τα σημαντικότερα θρεπτικά συστατικά και κυρίως του αζώτου. Ταυτόχρονα περιορίζει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων (Wang and Lee, 1997). Η σύσταση του AL δεν είναι πάντα σταθερή αλλά μπορεί να μεταβάλλεται ανάλογα με την κλίμακα της καλλιέργειας (κωνικές φιάλες και βιοαντιδραστήρας) και τις επιθυμητές συνθήκες κάθε πειράματος, όπως 16

32 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι παρουσιάζεται στον Πίνακα 3.1. Επιπλέον, το διάλυμα ιχνοστοιχείων (Trace Element Solution, TES) που εμπεριέχεται στο μέσο AL παρασκευάζεται σε υδατικό διάλυμα (HCl) 1Ν και η σύστασή του είναι αυτή του Πίνακα 3.2. Για την προετοιμασία όλων των μέσων ανάπτυξης και του διαλύματος ιχνοστοιχείων χρησιμοποιείται νερό το οποίο είναι αρχικά απιονισμένο από ένα σύστημα μεμβρανών και στη συνέχεια απεσταγμένο σε σύστημα απόσταξης της γερμανικής εταιρείας GLF mbh (μοντέλο 2002). Στα μέσα ανάπτυξης AL1 και AL2 (Πίνακας 3.1) οι συγκεντρώσεις της πηγής αζώτου ((ΝΗ4)2SO4) μεταβάλλονται ώστε να διερευνηθεί η επίδραση του λόγου C/N στην ανάπτυξη της καλλιέργειας. Το ph του μέσου ρυθμίζεται αρχικά στην τιμή 7.00±0.05 με ρυθμιστικά διαλύματα NaOH, 2M και HCl, 1Μ και στη συνέχεια μεταβάλλεται με την ανάπτυξη της καλλιέργειας χωρίς να υφίσταται κάποια ρύθμιση. Στο μέσο ανάπτυξης AL2 το ph ρυθμίζεται αυτόματα στο βιοαντιδραστήρα στην τιμή 7.00±0.05, λίγο πριν τον εμβολιασμό της προκαλλιέργειας, και διατηρείται στην τιμή αυτή καθ όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας με αυτόματο έλεγχο και τροφοδοσία των ρυθμιστικών διαλυμάτων NaOH 3M και HCl 3% v/v. Πίνακας 3.1. Σύσταση θρεπτικών μέσων ανάπτυξης AL, ανάλογα με την κλίμακα της καλλιέργειας (τροποποιημένοι από τη δουλειά των Wang and Lee, 1997). Μέσο Ανάπτυξης/Κλίμακα AL1/Κωνικές φιάλες AL2/Βιοαντιδραστήρας Σακχαρόζη (g/l) (ΝΗ 4) 2SO 4 (g/l) 2 - KH 2PO 4 (g/l) Na 2HPO 4 12H 2O (g/l) 9 9 MgSO 4 7H 2O (g/l) CaCl 2 2H 2O (g/l) Κιτρικό οξύ (g/l) TES (ml/l) 1 3 Στην περίπτωση συνθηκών ημισυνεχούς λειτουργίας (τροφοδοσία φρέσκου μέσου ανάπτυξης) στις κωνικές φιάλες και στο βιοαντιδραστήρα, το μέσο ανάπτυξης που τροφοδοτείται έχει τροποποιημένη σύσταση. Οι κωνικές φιάλες πληρώνονται με μέσο ανάπτυξης AL1 με σύσταση 17

33 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι που φαίνεται στον Πίνακα 3.1 παραπάνω. Στις κωνικές φιάλες πραγματοποιείται, κατά περιπτώσεις, αραίωση της καλλιέργειας με διπλασιασμό του όγκου τους, με σκοπό την εφαρμογή συνθηκών περιορισμού πηγής αζώτου, κάτω από επαρκή ποσότητα (περίσσεια) της πηγής άνθρακα. Επομένως, στην περίπτωση αυτή το AL1 έχει μηδενική συγκέντρωση πηγής αζώτου. Στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα η τροφοδοσία πραγματοποιείται με συμπυκνωμένο μέσο ανάπτυξης (μέσο AL2), καθώς στόχος είναι η αποφυγή της μεγάλης αραίωσης της καλλιέργειας και η ανάπτυξή της με υψηλή πυκνότητα κυττάρων. Πριν από την έναρξη λειτουργίας του ο αντιδραστήρας πληρώνεται με 1.3 l θρεπτικoύ μέσου ανάπτυξης AL2 (1.3 φορές συμπυκνωμένο) το οποίο περιέχει (NH4)2SO4 σε συγκέντρωση ίση με 2 g/l και κατά τη διάρκεια της λειτουργίας του τροφοδοτείται ημισυνεχώς με συμπυκνωμένο μέσο AL2 (10 φορές συμπυκνωμένο) (Πίνακας 3.1) και επιλεκτικά και με πηγή αζώτου (ΝΗ4)2SO4, ανάλογα με την πολιτική τροφοδοσίας που ακολουθείται. Πίνακας 3.2. Σύσταση διαλύματος ιχνοστοιχείων (Trace Element Solution) (Wang and Lee, 1997). Συστατικό Συγκέντρωση σε Υδατικό Διάλυμα HCl, 1N FeSO 4 7H 2O (g/l) 20 H 3BO 4 (g/l) 0.3 CoCl 2 6H 2O (g/l) 0.2 ZnSO 4 7H 2O (g/l) 0.03 MnCl 2 4H 2O (g/l) 0.03 (NH 4) 6Mo 7O 24 4H 2O (g/l) 0.03 NiSO 4 7H 2O (g/l) 0.03 CuSO 4 5H 2O (g/l) Αποστείρωση των μέσων ανάπτυξης και των σκευών του εργαστηρίου Η αποστείρωση των θρεπτικών μέσων ανάπτυξης και των σκευών του εργαστηρίου πραγματοποιείται σε κλίβανο αποστείρωσης με ατμό (Steam Sterilizer Raypa AES-75 της ισπανικής εταιρείας R. Espinal S.L.) υπό συνθήκες 121 ο C και χρόνο παραμονής 20 min. Το 18

34 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι θρεπτικό μέσο AL, σε αντιδιαστολή με το ΝΒ, δεν αποστειρώνεται ως ενιαίο διάλυμα όλων των συστατικών του, αλλά εφαρμόζεται ξεχωριστή αποστείρωση επιμέρους συστατικών και στη συνέχεια γίνεται ανάμιξη των επιμέρους διαλυμάτων. Δηλαδή τα ακόλουθα συστατικά αποστειρώνονται ξεχωριστά ως εξής: η σακχαρόζη αποστειρώνεται στους 121 ο C και 20 min σε συγκέντρωση μέχρι 80 g/l, για αποφυγή της καραμέλωσής της. Τα δύο φωσφορικά άλατα (KH2PO4 και Na2HPO4 12H2O) αποστειρώνονται ξεχωριστά στους 121 ο C και 20 min σε συγκέντρωση μέχρι 42 g/l, για αποφυγή της καταβύθισής τους. Τα άλατα MgSO4 7H2O (g/l) και CaCl2 2H2O (g/l) αποστειρώνονται με βιολογικά φίλτρα αποστείρωσης Whatman Inc. (U.S.A) PTFE Filters 0.2 μm σε συγκεντρώσεις μέχρι 10 g/l και 1 g/l αντίστοιχα. Το διάλυμα ιχνοστοιχείων προετοιμάζεται σε υδατικό διάλυμα HCl 1N και αποστειρώνεται επίσης με βιολογικά φίλτρα. Όλα τα υπόλοιπα συστατικά αποστειρώνονται στον κλίβανο σε συνθήκες 121 ο C για 20 min. Το μέσο ετοιμάζεται στο θάλαμο νηματικής ροής (Herasafe KS-12 της αμερικανικής εταιρείας Thermo Electron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc.), έπειτα της αποστείρωσης όλων των συστατικών και αφού όλα έχουν επανέλθει στη θερμοκρασία περιβάλλοντος. Ο θάλαμος προ-αποστειρώνεται με δράση υπεριώδους ακτινοβολίας για 30 min. Όταν είναι απαραίτητο να προετοιμαστούν διαλύματα με συγκέντρωση σακχαρόζης άνω των 80 g/l και θειικού μαγνησίου άνω των 10 g/l, κατά την προετοιμασία διαλυμάτων τροφοδοσίας με υψηλή συγκέντρωση, αποστειρώνονται με συσκευές αποστείρωσης βιολογικών διαλυμάτων με φιλτράρισμα υπό κενό (Disposable Filter Unit 0.45μm, της αμερικανικής εταιρείας Nalgene Nucn International Corp.) Προετοιμασία προκαλλιέργειας Για τον εμβολιασμό οποιασδήποτε καλλιέργειας και στις δύο κλίμακες του πειράματος (κωνικές φιάλες και βιοαντιδραστήρας) προετοιμάζεται προκαλλιέργεια σε δύο στάδια. Αρχικά, παρασκευάζονται και αποστειρώνονται στον κλίβανο ατμού στους 121 ο C για 20 min τα θρεπτικά μέσα Nutrient Broth που χρειάζονται στα δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο θρεπτικό μέσο 20 ml ΝΒ ενοφθαλμίζεται σε μια κωνική φιάλη τύπου Erlenmeyer των 100 ml, εμβολιάζεται με μία μεμονωμένη αποικία κυττάρων, που έχει αναπτυχθεί σε ειδικά αποστειρωμένα τριβλία Petri-dish. Μετά από ανάπτυξη περίπου 12 h και όταν η καλλιέργεια 19

35 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι είναι οπτικά θολή, με οπτική πυκνότητα περίπου ίση με τη μονάδα, ml του πρώτου σταδίου προκαλλιέργειας χρησιμοποιείται για τον εμβολιασμό ml αποστειρωμένου μέσου NB σε κωνική φιάλη του 1 l. Η ανάπτυξη και των δύο σταδίων προκαλλιέργειας πραγματοποιείται μέσα σε θερμοστατούμενο κινούμενο επωαστήρα (της γερμανικής εταιρείας GFL mbh, μοντέλο GFL3033) σε συνθήκες 30 0 C και 250 rpm. Η μικροβιακή ανάπτυξη στο δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας πραγματοποιείται απουσία της φάσης υστέρησης (lag phase). Τη στιγμή που η οπτική πυκνότητα στο δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας είναι ίση με 1.5±0.1 (στο μέσο της δηλαδή της εκθετικής φάσης, 4-6 h ανάπτυξης), η καλλιέργεια διακόπτεται και η απαραίτητη ποσότητα φυγοκεντρείται στα 4000xg για 5 min, πλένεται με μέσο AL και μετά από επαναιώρηση τροφοδοτείται στην κυρίως καλλιέργεια. Ως κατάλληλος όγκος εμβολιασμού από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας ορίζεται το 1/5 του τελικού όγκου της κύριας καλλιέργειας. Η αρχική οπτική πυκνότητα κάθε καλλιέργειας εκτείνεται γενικά στο εύρος τιμών Ανάπτυξη καλλιέργειας σε κωνικές φιάλες Ασυνεχείς (batch) και ημισυνεχείς (fed-batch) καλλιέργειες του στελέχους A.lata αναπτύσσονται σε κωνικές φιάλες τύπου Erlenmyer του 1 l ή των 2 l με διαφορετικούς λειτουργικούς όγκους του μέσου ανάπτυξης AL1. Ο λόγος του όγκου της κωνικής φιάλης προς το λειτουργικό όγκο της καλλιέργειας δεν είναι πάντοτε σταθερός, αλλά μπορεί να μεταβάλλεται με τις επιθυμητές συνθήκες αερισμού της καλλιέργειας. Οι καλλιέργειες αναπτύσσονται στον κινούμενο επωαστήρα σε συνθήκες 30 ο C και με τροχιακή (orbital) συχνότητα ανάδευσης rpm που μεταβάλλεται χειροκίνητα ανάλογα με τις ανάγκες κάθε καλλιέργειας σε αερισμό. Όλες οι κωνικές φιάλες και τα υπόλοιπα γυάλινα ή πλαστικά σκεύη, καθώς και ο βιοαντιδραστήρας, που χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, αποστειρώνονται στον κλίβανο ατμού σε συνθήκες 121 ο C και 1 atm για 20 min. 20

36 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Σχήμα 3.1. Κωνικές φιάλες μέσα στον κινούμενο επωαστήρα Ανάπτυξη καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα Στα πειράματα στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα οι συνθήκες της καλλιέργειας είναι πιο ελεγχόμενες και υπάρχουν περισσότερες διαθέσιμες on-line μετρήσεις που επιτρέπουν την άμεση ρύθμιση των διαφόρων λειτουργικών παραμέτρων στις επιθυμητές τιμές τους, όταν παρουσιάζουν απόκλιση από αυτές. Ο βιοαντιδραστήρας είναι γυάλινος, συνολικού όγκου 3 l (BioFlo 110 Bioreactor/Fermentor της αμερικανικής εταιρείας New Brunswick Scientific Co. Inc.). Ο ωφέλιμος όγκος του συγκεκριμένου αντιδραστήρα είναι 2 l ενώ οι καλλιέργειες πραγματοποιούνται σε όγκο 1.3 l. Είναι εξοπλισμένος με μετρητικά που παρουσιάζουν online ενδείξεις της θερμοκρασίας, του ph, του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης, της συχνότητας περιστροφής του αναδευτήρα, της παροχής αέρα/οξυγόνου στην είσοδο, της σύστασης του αέριου ρεύματος σε O2 και CO2 στην έξοδο του βιοαντιδραστήρα. Γύρω από τον αντιδραστήρα τοποθετείται θερμαντικός μανδύας με ηλεκτρική αντίσταση για τη διατήρηση της θερμοκρασίας του στους 30 ο C, όπου και ρυθμίζεται αυτόματα. Όταν η θερμοκρασία της καλλιέργειας αποκλίνει από την επιθυμητή τιμή στέλνεται σήμα στο ρυθμιστή και μέσω της ψυκτικής σπείρας, που υπάρχει μέσα στο βιοαντιδραστήρα, ρέει νερό ψύξης που επαναφέρει τη θερμοκρασία στα κανονικά επίπεδα. 21

37 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Το ph μετρείται (με ηλεκτρόδιο 225 mm της ισπανικής εταιρείας Mettler Toledo Inc. βυθισμένο στην καλλιέργεια) και ρυθμίζεται αυτόματα στην επιθυμητή τιμή (συνήθως 7.00±0.05), με την παροχή δύο ρυθμιστικών διαλυμάτων: υδροχλωρικού οξέος, HCl συγκέντρωσης 1M και καυστικού νατρίου, NaOH συγκέντρωσης 2Μ. Όταν η τιμή του ph τείνει να πέσει κάτω ή να ανέβει πάνω από την επιτρεπόμενη απόκλιση τότε γίνεται προσθήκη βάσης ή οξέος αντίστοιχα στην καλλιέργεια ώστε να την επαναφέρει από τις όξινες ή βασικές συνθήκες στις ουδέτερες. Το διαλυμένο οξυγόνο στην καλλιέργεια (Dissolved Oxygen, D.O.) μετρείται με ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο (InPro 6800 Ο2 Sensor 12/15 mm της ισπανικής εταιρείας Mettler Toledo Inc.) και ρυθμίζεται με βάση τη συχνότητα περιστροφής του αναδευτήρα και την παροχή αέρα/οξυγόνου στην είσοδο του αντιδραστήρα. Δηλαδή όταν το διαλυμένο οξυγόνο της καλλιέργειας ελαττώνεται, αυξάνεται η συχνότητα περιστροφής του αναδευτήρα ώστε να το επαναφέρει στην επιθυμητή τιμή του. Η περιοχή λειτουργίας της συχνότητας περιστροφής του αναδευτήρα εκτείνεται στο εύρος τιμών 100 με 1000 rpm. Η παροχή αέρα/οξυγόνου μετρείται με τη βοήθεια ενός ροομέτρου (Ki 0-5 l/min της αμερικανικής εταιρείας Key Instruments Inc.), που είναι προσαρμοσμένο μετά από το συμπιεστή αερίων (M37 της αμερικανικής εταιρείας KnF Laboport Inc.) και πριν από την είσοδο του βιοαντιδραστήρα. Η παροχή αέρα/οξυγόνου επιλέγεται σε εύρος τιμών l/min. Στην περίπτωση που η παροχή του ατμοσφαιρικού αέρα είναι ανεπαρκής για τις απαιτήσεις του συστήματος, στην καλλιέργεια τροφοδοτείται καθαρό οξυγόνο. Ο αερισμός της καλλιέργειας πραγματοποιείται μέσω ενός κατανεμητή (sparger) που βρίσκεται στον κύριο όγκο της καλλιέργειας, ακριβώς κάτω από τον αναδευτήρα. Ο τροφοδοτούμενος αέρας/οξυγόνο αποστειρώνεται σε φίλτρα Whatman Inc. (U.S.A.) PTFE Filters 0.2 μm. Οι ενδείξεις του οργάνου μέτρησης του D.O. εκφράζονται ως ποσοστό % της συγκέντρωσης κορεσμού του διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο ανάπτυξης πριν τον εμβολιασμό της καλλιέργειας κι αφού είχε προηγηθεί επαρκής αερισμός αυτής. Ακόμη, ο βιοαντιδραστήρας περιέχει ένα μετρητικό στάθμης (level controller ) το οποίο μετρά τη στάθμη της καλλιέργειας και όταν αυτή ξεπεράσει, λόγω αφρισμού της καλλιέργειας, το σήμα αναφοράς (set point) που έχει οριστεί στο ρυθμιστή, παρέχεται αντιαφριστικό (Sigma Antifoam SE-15, συγκέντρωσης υδατικού διαλύματος 1% v/v). 22

38 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Σχήμα 3.2. Διάταξη του βιοαντιδραστήρα και μονάδας παρακολούθησης-ρύθμισης (αριστερά). Τέλος, ελέγχεται η ορθή λειτουργία των τεσσάρων περισταλτικών αντλιών (με παροχή λειτουργίας μεταξύ ml/h). Δύο από αυτές τροφοδοτούν τον βιοαντιδραστήρα με HCl και NaOH, όταν αυτό είναι απαραίτητο για τη ρύθμιση του ph, η τρίτη αντλία ενεργοποιείται αυτόματα σε απόκριση του αισθητήρα αφρισμού τροφοδοτώντας με αντιαφριστικό (antifoam) για την παρεμπόδιση δημιουργίας αφρού στην καλλιέργεια. Η τέταρτη αντλία χρησιμοποιείται για την τροφοδοσία με μέσο ανάπτυξης AL2, μετά από εξωτερική ρύθμιση του χρήστη. Στην περίπτωση που η πολιτική τροφοδοσίας απαιτεί την προσθήκη επιπλέον πηγής αζώτου, η τροφοδοσίας του υδατικού διαλύματος (ΝΗ4)2SO4 πραγματοποιείται με τη βοήθεια μιας πέμπτης αντλίας. Στο Σχήμα 3.2 γίνεται απεικόνιση του βιοαντιδραστήρα και της μονάδας ελέγχου και παρακολούθησης, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης της καλλιέργειας του στελέχους A.lata Παρακολούθηση ανάπτυξης και δειγματοληψία Η δυναμική παρακολούθηση ανάπτυξης της καλλιέργειας (κατά τη διάρκεια των πειραμάτων) πραγματοποιείται με μέτρηση της οπτικής πυκνότητας (Optical Density, O.D.) ή θολερότητας 23

39 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι δειγμάτων όγκου 2-3 ml. Η μέτρηση πραγματοποιείται στα 600 nm του ορατού φωτός σε Φασματοφωτόμετρο Υπεριώδους/ορατού (U-1800 UV/VIS Spectrophotometer της εταιρείας Hitachi High-Technologies Inc.) μέσα σε κυψελίδα χαλαζία. Πριν από κάθε μέτρηση γίνεται η διόρθωση γραμμής βάσης (baseline correction) σε ένα εύρος τιμών μήκους κύματος που περιέχει το επιθυμητό. Στην προκειμένη περίπτωση στα nm. Με τον τρόπο αυτό αφαιρείται ο θόρυβος από το περιβάλλον που προκαλείται από το διοξείδιο του άνθρακα, το οξυγόνο ή άλλες προσμίξεις στον αέρα και προσθέτει μη επιθυμητές κορυφές στο λαμβανόμενο φάσμα. Ως τυφλό δείγμα χρησιμοποιείται το απεσταγμένο νερό. Τρέχοντας το τυφλό δείγμα αφαιρείται η απορρόφηση αυτού από τα πραγματικά δεδομένα των προς μέτρηση δειγμάτων και επιτυγχάνεται όσο το δυνατόν μεγαλύτερη ακρίβεια στις μετρήσεις. Τα δείγματα της καλλιέργειας συλλέγονται περιοδικά ανά τακτά χρονικά διαστήματα (συνήθως ανά 1 h). Αν η οπτική πυκνότητα του δείγματος ξεπερνά τη διακριτική ικανότητα του οργάνου ( ) στο δείγμα πραγματοποιείται η κατάλληλη αραίωση με απεσταγμένο νερό. Η τελική τιμή της O.D. προκύπτει ως γινόμενο της ένδειξης του φασματοφωτόμετρου, μετά από την κατάλληλη αραίωση, και του συντελεστή αραίωσης. Η μέτρηση της O.D. αποτελεί μια off-line μέτρηση της ανάπτυξης της καλλιέργειας. Σε κωνική φιάλη η δειγματοληψία πραγματοποιείται, μετά την απομάκρυνση της από τον κινούμενο επωαστήρα, μέσα στο θάλαμο νηματικής ροής (laminar flow) και με τη χρήση φλόγας από λύχνο Buchner για την τήρηση ασηπτικών συνθηκών. Στο βιοαντιδραστήρα η δειγματοληψία πραγματοποιείται επίσης ασηπτικά με χειροκίνητη αναρρόφηση ποσότητας δείγματος. Από το δείγμα που λαμβάνεται κάθε φορά ένα μέρος χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της O.D., ένα μέρος για την οπτική παρατήρηση των κυττάρων σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Leica DM4000B της γερμανικής εταιρείας Microsystems Wetzlar GmbH). Με τη χρήση κατάλληλου λογισμικού είναι δυνατή και η λήψη φωτογραφιών της καλλιέργειας για την παρακολούθηση της ανάπτυξής της, καθώς και της μορφολογίας των κυττάρων. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της ξηρής βιομάζας απαιτεί ένα ξεχωριστό δείγμα ποσότητας 10 ml. Το δείγμα αυτό συλλέγεται σε σωλήνες, falcon tube, των 15 ml, φυγοκεντρείται στα 10000xg για 10 min και τελικά γίνεται διαχωρισμός των κυττάρων, που 24

40 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι έχουν κατακρημνιστεί στον πυθμένα από το υπερκείμενο υγρό. Το τελευταίο μεταγγίζεται σε διαφορετικό falcon tube και φυλάσσεται στο ψυγείο (σε θερμοκρασία 4 ο C) για συντήρηση ενώ τα κύτταρα καταψύχονται σε θερμοκρασία (-30 ο C). Ο λόγος για τον οποίο τα κύτταρα τοποθετούνται στην κατάψυξη είναι ώστε να σταματήσει οποιαδήποτε πιθανή μεταβολική διεργασία. Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της ξηρής βιομάζας το δείγμα με τα κύτταρα που είχε καταψυχθεί λυοφιλοποιείται (freeze drying) και ζυγίζεται. Η ποσότητα της ολικής ξηρής βιομάζας αντιστοιχεί στα 10 ml του δείγματος οπότε η τιμή αυτή ανάγεται στο 1 l για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ξηρής βιομάζας σε (g/l). Μετά τον προσδιορισμό της ξηρής μάζας κυττάρων το δείγμα χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του ποσοστιαίου περιεχόμενου πολυμερούς PHB στα ξηρά κύτταρα, με τη μέθοδο FTIR που περιγράφεται στην Παράγραφο Το υπερκείμενο υγρό του ίδιου δείγματος χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της συγκέντρωσης των διατροφικών συστατικών (κυρίως του θειικού αμμωνίου και της συγκέντρωσης σακχαρόζης), μετά την απαραίτητη αραίωση που απαιτεί η κάθε μέθοδος. Για την απομόνωση του ενδοκυττάριου πολυμερούς και το χαρακτηρισμό του από την καλλιέργεια απομακρύνεται ένα τρίτο δείγμα. Όταν η καλλιέργεια βρίσκεται σε πρόωρο στάδιο ανάπτυξης (O.D.< 20) ο απαραίτητος όγκος για την απομόνωση, καταβύθιση και καθαρισμό της μάζας του PHB είναι 50 ml. Για το ενδιάμεσο στάδιο καλλιέργειας (20 < O.D.< 100) η ποσότητα που απαιτείται είναι 35 ml και για το τελικό στάδιο υπό υψηλές συγκεντρώσεις (O.D.> 100), απαιτείται όγκος 20 ml Αναλυτικές μέθοδοι Για τον πλήρη έλεγχο και την καλύτερη ρύθμιση της μικροβιακής παραγωγής PHB είναι απαραίτητο η καλλιέργεια να παρακολουθείται διεξοδικά, χρησιμοποιώντας on-line και offline τεχνικές για την άμεση μέτρηση και προσδιορισμό των σημαντικότερων παραμέτρων του συστήματος. Επιπλέον, μετά από τη συλλογή δειγμάτων αυτά αναλύονται ώστε να υπολογισθούν τα μεγέθη ως προς τα οποία μελετάται η παραγωγή PHB και η συμπεριφορά του μικροοργανισμού. 25

41 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Μέτρηση ξηρής βιομάζας Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της βιομάζας μετρείται η ξηρή μάζα κυττάρων (Dry Cell Weight, DCW) δειγμάτων 10 ml της καλλιέργειας. Αρχικά, τα δείγματα φυγοκεντρούνται στα 10,000 g (φυγόκεντρος Heraus Biofuge primor της αμερικάνικης εταιρίας Thermo Electron Corp., Thermo Fisher Scientific Inc.) για min, ώστε να γίνει ο διαχωρισμός του υπερκείμενου υγρού από τα κύτταρα, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, και τα κύτταρα καταψύχονται. Το δείγμα με τα κύτταρα που είχε καταψυχθεί λυοφιλοποιείται (freeze drying) και ζυγίζεται. Η ποσότητα της ολικής ξηρής βιομάζας αντιστοιχεί στα 10 ml του δείγματος οπότε η τιμή αυτή ανάγεται στο 1 l για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ξηρής βιομάζας σε (g/l). Η λυοφιλοποίηση πραγματοποιείται σε ένα λυοφιλοποιητή (Freeze Dryer) Thermo MicroModulyo-230, ο οποίος είναι εξοπλισμένος με την αντλία κενού Thermo Savant VLP120 ValuPump της ίδιας εταιρίας και διαρκεί 15 h. Η απόδοση της ξηρής βιομάζας ως προς τη μάζα της καταναλισκόμενης σακχαρόζης υπολογίζεται από το λόγο της συγκέντρωσης της βιομάζας (DCW) προς την ποσότητα της σακχαρόζης που έχει αξιοποιηθεί από το μικροοργανισμό μέχρι εκείνη τη χρονική στιγμή Ταυτοποίηση και υπολογισμός % κ.β. PHB σε δείγματα ξηρής βιομάζας Η δυνατότητα ενδοκυττάριας συσσώρευσης PHB των βακτηρίων A.lata με μεγάλη απόδοση είναι γνωστή εδώ και αρκετά χρόνια (Wang and Lee, 1997; Yezza et al., 2007). Για να επιβεβαιωθεί το γεγονός αυτό από τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της Φασματοσκοπίας Υπερύθρου (FTIR). Η ταυτοποίηση πραγματοποιείται σε δείγματα ξηρής βιομάζας που περιέχουν το ενδοκυττάριο πολυμερές. Πρόκειται για μια μέθοδο με σημαντικά πλεονεκτήματα: μικρή απαιτητή ποσότητα δείγματος, μικρός χρόνος προετοιμασίας, ταχύτητα ανάλυσης και απουσία χρήσης οποιουδήποτε διαλύτη (Helm and Naumann, 1995; Kansiz et al., 2000). Η μέθοδος FTIR, όταν εφαρμόζεται για την ανάλυση βακτηριακών δειγμάτων, προσφέρει μία πλήρη χημική και βιοχημική σύσταση των κυττάρων (Nauman et al., 1991). Οι κύριες κορυφές στα φάσματα βακτηρίων, τα οποία χρησιμοποιούνται για τη μικροβιακή παραγωγή PHB, οφείλονται κυρίως στην παρουσία 26

42 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι πρωτεϊνών, λιπιδίων, πολυσακχαριτών, νουκλεϊκών οξέων και κόκκων βιοπολυμερούς (Kansiz et al., 2000). Τα φάσματα συλλέχθηκαν από ένα φασματοφωτόμετρο FTIR 2000 Spectrophotometer της αμερικάνικης εταιρίας Perkin Elmer Inc., εφοδιασμένο με ανιχνευτή ημιαγωγών τελλουριούχου-καδμίου-υδραργύρου (MCT detector), ο οποίος διατηρείται σε περιβάλλον υγρού αζώτου. Ξηρά δείγματα κυττάρων, τα οποία περιλαμβάνουν το πολυμερές και την υπολειπόμενη βιομάζα (συνολική βιομάζα χωρίς το PHB) προετοιμάζονται για ανάλυση. Τα φάσματα λαμβάνονται από πελέτες βρωμιούχου καλίου, KBr, στις οποίες περιλαμβάνονται τα δείγματα. Η ανάλυση πραγματοποιείται στο εύρος κυματάριθμων (Wavenumber Range) cm -1, με ανάλυση 4 cm -1. Από το φάσμα αφαιρείται το φάσμα του περιβάλλοντος που λαμβάνεται με 14 επαναλήψεις ( cm -1, με ανάλυση 4 cm -1 ), λίγο πριν την εισαγωγή της πελέτας στο όργανο. Το λογισμικό Spectrum v.301 της ίδιας εταιρίας χρησιμοποιείται για τη διόρθωση γραμμής βάσεως (baseline correction) και την εξομάλυνση των φασμάτων. Επίσης, με τη βοήθεια του ίδιου προγράμματος εντοπίζονται οι εντάσεις των σημαντικότερων κορυφών των φασμάτων. Οι δύο κορυφές που ενδιαφέρουν περισσότερο είναι: (i) η απορρόφηση στα 1726 cm -1, η οποία οφείλεται στην παρουσία του εστερικού δεσμού του πολυμερούς (C=O), και (ii) η απορρόφηση στα 1655 cm -1, η οποία οφείλεται στην παρουσία της άμιδο-ομάδας (N-H2) και αντιστοιχείται στην υπολειπόμενη βιομάζα. Όσο ο χρόνος καλλιέργειας προχωρά και ταυτόχρονα η συσσώρευση PHB από το βακτήριο είναι μεγαλύτερη, τόσο η ένταση της κορυφής του εστερικού δεσμού (C=O) ισχυροποιείται. Επίσης, αξίζει να σημειωθεί πως ανάμεσα στα δείγματα που παράχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, η ακριβής θέση της κορυφής του δεσμού (C=O) μεταβάλλεται μεταξύ cm -1, γεγονός που οφείλεται στα διαφορετικά χαρακτηριστικά των κόκκων πολυμερούς στα κύτταρα, όπως για παράδειγμα στο βαθμό κρυστάλλωσης των αλυσίδων του πολυμερούς (Randriamahefa et al., 2003). Αντίστοιχα και η ακριβής θέση της κορυφής της άμιδο-ομάδας (N-H2) μεταβάλλεται μεταξύ cm -1. Στο Σχήμα 3.3 που ακολουθεί τα FTIR φάσματα δύο επιλεγμένων δειγμάτων παρουσιάζονται συγκριτικά. 27

43 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι A cm-1 Name BioR_14-01_08.30_1_1 Description Sample 056 By user_2 Date Monday, January cm-1, 1.95A cm -1, 1.34A cm-1, 1.38A cm-1, 1.38A A cm-1 Name BioR_ _1_1_1_1 Description Sample 063 By user_2 Date Monday, January Σχήμα 3.3. Ποιοτική αναπαράσταση της μεθόδου προσδιορισμού του % περιεχόμενου PHB με τη μέθοδο FTIR. Τα δύο φάσματα είναι από διαφορετικά στάδια της καλλιέργειας με διαφορετικά ποσοστά συσσώρευσης. Οι απορροφήσεις οφείλονται στον εστερικό δεσμό (C=O) και στην αμιδό-ομάδα (N-H2). Μετά την ποιοτική ταυτοποίηση της ύπαρξης του ενδοκυττάριου πολυμερούς σε δείγματα ξηρής μάζας του A.lata, απαιτείται και η ποσοτικοποίηση της μεθόδου. Για το σκοπό αυτό υπολογίζεται η τιμή του λόγου των εντάσεων των δύο σημαντικότερων κορυφών των φασμάτων: η απορρόφηση του δεσμού (C=O) προς την απορρόφηση της ομάδας (N-H2). Στη συνέχεια κατασκευάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης μεταξύ του λόγου των δύο κορυφών και του πραγματικού % περιεχόμενου PHB που προσδιορίζεται με Αέρια Χρωματογραφία (GC). Στο 28

44 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Σχήμα 3.4 παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου. Παρατηρείται μία γραμμική συσχέτιση μεταξύ του νεπέριου λογάριθμου του λόγου των δύο εντάσεων, υπολογισμένου από την ανάλυση των FTIR φασμάτων, με το πραγματικό ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB, μετρημένο με GC (Εξίσωση 1). Ο συντελεστής παλινδρόμησης (R-square) της εξίσωσης βαθμονόμησης βρέθηκε ίσος με R 2 =0.9384, τιμή αρκετά ικανοποιητική. Αξίζει να σημειωθεί πως η μεθοδολογία που περιγράφεται εδώ χρησιμοποιείται μόνο όταν η κορυφή της απορρόφησης του πολυμερούς είναι ξεκάθαρα ορατή στα φάσματα, για λόγο εντάσεων μεγαλύτερο του 0.5 (περίπου 23% περιεχόμενο PHB ανά g DCW). Ο υπολογισμός του % περιεχόμενου πολυμερούς γίνεται με βάση την εξίσωση: % PHB = ln(ftirλόγος ) [ 1 ] Σχήμα 3.4. Καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου προσδιορισμού του ενδοκυττάριου ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB σε δείγματα ξηρής βιομάζας καλλιεργειών του Azohydromonas lata. Η καμπύλη προέκυψε από τη συσχέτιση των επεξεργασμένων FTIR φασμάτων με το πραγματικό % περιεχόμενο PHB μετρημένο με GC. 29

45 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Η συγκέντρωση του παραγόμενου PHB (g/l) υπολογίζεται από το γινόμενο του % περιεχόμενου στην καλλιέργεια PHB με τη συγκέντρωση της ξηρής βιομάζας DCW (g/l). H συγκέντρωση της υπολειπόμενης βιομάζας προκύπτει ως η διαφορά της συγκέντρωσης του PHB (g/l) από τη συγκέντρωση της συνολικής ξηρής βιομάζας, DCW (g/l) Μέτρηση συγκέντρωσης αμμωνιακών αλάτων Η συγκέντρωση του (NH4)2SO4 κατά τη διάρκεια μιας καλλιέργειας μετρείται off-line με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Χρησιμοποιείται το Spectroquant Ammonium Test της γερμανικής εταιρίας Merck KGaA. Σε τέτοια συστήματα μικροβιακών καλλιεργειών το αμμωνιακό άζωτο υπάρχει, τόσο με τη μορφή αμμωνιακών ιόντων, όσο και ως αμμωνία. Η ισορροπία μεταξύ των δύο αυτών μορφών εξαρτάται ισχυρά από το ph του διαλύματος. Σε αλκαλικό περιβάλλον η ισορροπία μετακινείται προς την πλευρά της αμμωνίας και σχεδόν ολόκληρο το αμμωνιακό άζωτο λαμβάνει αυτή τη μορφή. Η αμμωνία αντιδρά με υποχλωριώδη ιόντα προς το σχηματισμό μονοχλωραμίνης. Η τελευταία αντιδρά με ποσότητα υποκατεστημένων φαινολών σχηματίζοντας ένα έγχρωμο (μπλε-πράσινο) παράγωγο της ινδοφαινόλης. Η ένταση της απορρόφησης του χρωματισμένου διαλύματος είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του παραγώγου της ινδοφαινόλης και κατ επέκταση της συγκέντρωσης του (NH4)2SO4 στο μέσο ανάπτυξης της καλλιέργειας. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των αμμωνιακών αλάτων χρησιμοποιούνται τα δείγματα των υπερκείμενων υγρών που συλλέχθηκαν και ακολουθείται το παρακάτω πρωτόκολλο. (i) Το δείγμα συλλέγεται και αραιώνεται με απεσταγμένο νερό, ανάλογα με την περιοχή λειτουργίας της μέτρησης, mg/l. (ii) Σε γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα τοποθετούνται 5 ml από το αντιδραστήριο Reagent NH4-1 (υγρό διάλυμα υποχλωριωδών ιόντων). (iii) Προστίθενται 0.10 ml από το αραιωμένο δείγμα και ακολουθεί ανάδευση. (iv) Προστίθεται μία δόση του αντιδραστηρίου Reagent NH4-2 (στερεά υποκατεστημένη φαινόλη) και αναδεύεται μέχρι πλήρους διάλυσης. 30

46 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι (v) Μετά από 15 min το χρωματισμένο διάλυμα τοποθετείται σε κυψελίδα 10 mm και μετρείται η απορρόφηση στα 690nm, στο φασματοφωτόμετρο UV/VIS. Πριν τη μέτρηση των δειγμάτων έχει ακολουθηθεί η ίδια διαδικασία με διάλυμα που έχει μηδενική συγκέντρωση αμμωνιακών αλάτων (τυφλό), ώστε αυτή η ένδειξη να αποτελέσει τη βάση υπολογισμού. Στο Σχήμα 3.5 παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου, η οποία κατασκευάστηκε από τις απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων θειικού αμμωνίου γνωστής συγκέντρωσης. Η γραμμική συσχέτιση που προέκυψε έχει συντελεστή κοντά στη μονάδα (R 2 = ). Η τελική τιμή της συγκέντρωσης προκύπτει από την Εξίσωση 2: [(NH4)2SO4] = [A]690nm DF Για DF = 5 η εξίσωση γίνεται: [(NH4)2SO4] = [A]690nm [2] όπου, [(NH4)2SO4] είναι η συγκέντρωση του θειικού αμμωνίου σε g/l, DF (Dilution Factor) o παράγοντας αραίωσης, και [Α]690nm η απορρόφηση του χρωματισμένου διαλύματος στα 690 nm. Συγκέντρωση Θειικού Αμμωνίου (g/l) Θειικό Αμμώνιο Γραμμική Συσχέτιση [(ΝΗ4) 2 SO4] = [A] R² = ΑπορρόφησηOD 690nm Σχήμα 3.5. Καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου μέτρησης της συγκέντρωσης θειικού αμμωνίου. 31

47 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι Μέτρηση συγκέντρωσης σακχάρων Ίσως η σημαντικότερη παράμετρος τέτοιων συστημάτων παραγωγής PHB είναι ο μεταβολισμός της πηγής άνθρακα και ο ρυθμός κατανάλωσης της από τα βακτήρια. Συνεπώς, κατά τη διάρκεια των καλλιεργειών του A.latus είναι πολύ σημαντικό να παρακολουθεί δυναμικά αυτός ο ρυθμός. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία είναι αυτή της μεθόδου DNS (Miller, 1959). Η μέθοδος βασίζεται αρχικά στη διάσπαση του μη-αναγωγικού δισακχαρίτη (σακχαρόζη) σε αναγωγικούς μονοσακχαρίτες (γλυκόζη και φρουκτόζη) σε όξινο περιβάλλον. Οι τελευταίοι αντιδρούν με το δι-νίτρο-σαλικυλικό οξύ (DNS) προς το σχηματισμό του έγχρωμου (πορτοκαλί) παραγώγου άμινο-νίτρο-σαλικυλικού οξέος. Το χρωματισμένο διάλυμα απορροφά στο ορατό, με την ένταση να εξαρτάται από τη συγκέντρωση του άμινονίτρο-σαλικυλικού οξέος και αναλογικά από τη συγκέντρωση της σακχαρόζης. Για την παρασκευή 100 ml αντιδραστηρίου DNS διαλύεται αργά με ανάδευση 1 g 2-ύδροξυ-3,5- δινιτροβενζοϊκό οξύ (ή 3,5 δινιτροσαλικυλικό οξύ) σε 20 ml υδατικού διαλύματος NaOH 2N. Στη συνέχεια, αναμιγνύονται με 30 g τρυγικού καλιονατρίου (NaKC4O6 4H2O) και 50 ml απεσταγμένο νερό. Το μίγμα ογκομετρείται μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Μετά την ανάμιξη καλύπτεται με αλουμινόχαρτο ώστε να μην είναι εκτεθειμένο σε φως. Το αντιδραστήριο αφήνεται σε ήπια ανάδευση, χωρίς θέρμανση, έχει χρώμα σκούρο πορτοκαλί και είναι σταθερό για αρκετές μέρες σε θερμοκρασία δωματίου. Για τη μέτρηση της συγκέντρωσης της σακχαρόζης σε δείγματα της καλλιέργειας πραγματοποιηθήκαν τα εξής στάδια: (i) Το δείγμα συλλέγεται και αραιώνεται με απεσταγμένο νερό, ανάλογα με την περιοχή λειτουργίας της μέτρησης, 0-2 g/l. (ii) Σε γυάλινο δοκιμαστικό σωλήνα τοποθετούνται 0.4 ml δείγματος και 0.05 ml διαλύματος HCl 10N. (iii) Ο δοκιμαστικός σωλήνας τοποθετείται για 15 min σε υδατόλουτρο στους 80 o C. (iv) Προστίθενται 0.05 διαλύματος NaOH 10N για την εξουδετέρωση του διαλύματος. (v) Προστίθενται 0.5 ml διαλύματος DNS. 32

48 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι (vi) Ακολουθεί βρασμός για 5 min, προσθήκη 4 ml απεσταγμένου νερού και μέτρηση της απορρόφησης στο φασματοφωτόμετρο UV/VIS στα 540 nm. Ως βάση για τη μέτρηση χρησιμοποιείται η απορρόφηση ενός δείγματος που δεν περιέχει σακχαρόζη και έχει υποστεί την παραπάνω διαδικασία. Στο Σχήμα 3.6 παρουσιάζεται η καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου, η οποία κατασκευάστηκε από τις απορροφήσεις πρότυπων διαλυμάτων σακχαρόζης γνωστής συγκέντρωσης. Η γραμμική συσχέτιση που προέκυψε έχει συντελεστή κοντά στη μονάδα (R 2 = ). Η τελική τιμή της συγκέντρωσης της σακχαρόζης προκύπτει από την Εξίσωση 3. [C] = DF [A]540nm [3] όπου, [C] είναι η συγκέντρωση της σακχαρόζης σε g/l, DF (Dilution Factor) o παράγοντας αραίωσης, και [Α]540nm η απορρόφηση του χρωματισμένου διαλύματος στα 540nm. Συγκέντρωση σακχαρόζης (g/l) Σακχαρόζη Γραμμική Συσχέτιση [C] = [A] R² = ΑπορρόφησηOD 540 nm Σχήμα 3.6. Καμπύλη βαθμονόμησης της μεθόδου μέτρησης της συγκέντρωσης σακχαρόζης Ανάκτηση και καθαρισμός PHB από επιλεγμένα δείγματα Ένα από τα σημαντικότερα στάδια της διεργασίας μικροβιακής παραγωγής PHB είναι η ανάκτηση και ο καθαρισμός του ενδοκυττάριου προϊόντος, καθώς η διαδικασία αυτή συμβάλλει κατά πολύ στο συνολικό κόστος παραγωγής (Jacquel et al., 2008). Οι πέντε 33

49 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι διαφορετικές μέθοδοι ανάκτησης με βάση χημικές, μηχανικές και ενζυμικές μεθόδους (ή/και συνδυασμοί τους) είναι: (i) Η εκχύλιση του προϊόντος με θερμό χλωροφόρμιο κοντά στο σημείο ζέσεως του διαλύτη (60 ο C), σε συσκευή με επαναρροή. (ii) H εκχύλιση του ενδοκυττάριου PHB με θερμή ακετόνη κοντά στο σημείο ζέσεως της (58 ο C), σε συσκευή απόσταξης Soxhlet. (iii) H μηχανική διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών με υπέρηχους και η εκχύλιση του PHB με χλωροφόρμιο. (iv) Η διάρρηξη των κυτταρικών μεμβρανών με δράση υποχλωριώδους νατρίου και η ταυτόχρονη εκχύλιση του PHB με χλωροφόρμιο. (v) Η ενζυμική λύση των κυττάρων με δράση λυσοζύμης και απορρυπαντικών και η εκχύλιση του PHB με χλωροφόρμιο. Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας, από τις μεθόδους αυτές επιλέχθηκε να χρησιμοποιείται η μέθοδος (iii) (συνδυασμός υπέρηχων-χλωροφορμίου) με βάση τρία κριτήρια: (α) την ελαχιστοποίηση του συνολικού χρόνου επεξεργασίας, (β) τη μεγιστοποίηση του ποσοστού ανάκτησης του PHB και (γ) την ελάχιστη δυνατή μείωση των μοριακών βαρών του τελικού πολυμερούς (Penloglou, 2010). Ως αποτελεσματικότητα ανάκτησης (Recovery Efficiency, RE) του PHB ορίζεται ο λόγος της μάζας του καθαρού πολυμερούς, το οποίο ανακτάται στο τέλος κάθε μεθόδου, προς τη συνολική μάζα του ενδοκυττάριου υπάρχοντος PHB, υπολογισμένου με τη συνδυαστική μέθοδο FTIR-GC. ( ) ( ) / µ άζα g ανακτηµ ένου PHB µετρηµ ένη βαρυµετρικά Re = [4] συνολικ ή µ άζα g συσσωρευµ ένου PHB µετρηµ ένη µε τη µ έθοδο FTIR GC Πρόκειται για την άμεση ένδειξη της ικανότητας της μεθόδου να διαρρηγνύει τις κυτταρικές μεμβράνες και να εκχυλίζει το πολυμερές. Η μέθοδος ανάκτησης του ενδοκυττάριου πολυμερούς που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη είναι ο συνδυασμός μηχανικής διάρρηξης των κυτταρικών μεμβρανών με υπέρηχους και εκλεκτικής εκχύλισης του PHB από τη βιομάζα με χλωροφόρμιο (CHCl3). Στο τέλος της καλλιέργειας, 300 ml από το συνολικό όγκο της τοποθετούνται σε λουτρό πάγου (0 o C) για επεξεργασία με υπέρηχους. Χρησιμοποιείται η συσκευή υπερήχων Vibra Cell VC-505 της 34

50 Κεφάλαιο 3 ο Υλικά και μέθοδοι αμερικάνικης εταιρίας Sonics & Materials Inc., εφοδιασμένη με ένα μεταλλικό probe από κράμα τιτανίου (TI-6AL-4V). Η μηχανική επεξεργασία και διάρρηξη των κυττάρων πραγματοποιείται σε κύκλους των 30 sec (συνολικός καθαρός χρόνος 5-60 min), με μια παύση 5 sec να ακολουθεί κάθε κύκλο για την απαραίτητη ψύξη του δείγματος. Το χρονικό διάστημα που βρέθηκε να είναι το βέλτιστο για την παραμονή της καλλιέργειας στη μηχανική επεξεργασία είναι 30 min. Έπειτα της επεξεργασίας με υπερήχους το αιώρημα συγκεντρώνεται και φυγοκεντρείται στα 10,000 g για 15 min στους 0 o C. Το υπερκείμενο της φυγοκέντρισης απομακρύνεται, ενώ στο ίζημα που περιέχει τα διαρρηγμένα κύτταρα και το πολυμερές προστίθεται συγκεκριμένη ποσότητα χλωροφορμίου (20 ml CHCl3 ανά 1 g βιομάζας). Το νέο αιώρημα, αναδεύεται στα 250 rpm και 30 ο C για ένα συγκεκριμένο χρονικό διάστημα ( h), με σκοπό την επαρκή εκχύλιση του PHB από το διαλύτη. Η τιμή 1.5 h είναι η βέλτιστη για τη διάρκεια της εκχύλισης. Μετά το τέλος της εκχύλισης στο αιώρημα προστίθεται απεσταγμένο νερό (5 ml H2O για κάθε 20 ml CHCl3). Το μίγμα φυγοκεντρείται στα 10,000 g για 15 min στους 0 ο C, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός διφασικού συστήματος: μία οργανική φάση πλούσια σε χλωροφόρμιο (η οποία περιέχει το διαλυτό PHB) και μία υδατική φάση επάνω από την οργανική. Η διαρρηγμένη υπολειπόμενη βιομάζα σχηματίζει μια τρίτη στερεή φάση στη διεπιφάνεια χλωροφορμίου-νερού. Η οργανική φάση απομονώνεται από τις άλλες δύο με τη βοήθεια φιαλών διαχωρισμού φάσεων (χωνί διαχωρισμού φάσεων) και συμπυκνώνεται μέχρι περίπου τα 5 ml στον περιστροφικό εξατμιστήρα στους 35 o C. Το διαλυμένο PHB καταβυθίζεται με την προσθήκη κρύας μεθανόλης στο διάλυμα του χλωροφορμίου (10 ml CH3OH για κάθε 1 ml CHCl3) σε λουτρό πάγου. Το αιώρημα αφήνεται για 15 h στους -25 o C πριν φυγοκεντρηθεί στα 10,000 g για 15 min στους 0 o C. Το καταβυθισμένο πολυμερές επαναδιαλύεται σε χλωροφόρμιο και αφήνεται σε γυάλινο τριβλίο μέχρι ξήρανσης. Την επόμενη μέρα ακολουθεί το στάδιο καθαρισμού, ενώ η ανακτημένη ποσότητα ζυγίζεται και συγκρίνεται με την ολική ποσότητα του ενδοκυττάριου PHB που μετρήθηκε με τη μέθοδο FTIR/GC. 35

51 Κεφάλαιο 4 o : Πειραματικός σχεδιασμός 4.1. Ανάπτυξη καλλιέργειας σε κωνικές φιάλες Η θρέψη και ανάπτυξη των βακτηρίων απαιτεί την πρόσβαση τους σε πηγές ενέργειας και σε ενώσεις απαραίτητες για τη σύνθεση των κυτταρικών τους δομών. Η παρουσία συστατικών όπως το άζωτο, ο φώσφορος, το οξυγόνο, το μαγνήσιο, το θείο, τα μεταλλικά στοιχεία κλπ. είναι πολύ σημαντική για την ανάπτυξη και το διπλασιασμό των κυττάρων σε τέτοιου είδους καλλιέργειες (Babel et al., 2001; Madigan et al., 2005). Από την άλλη πλευρά, για να ενισχυθεί η ενδοκυττάρια συσσώρευση PHB στα βακτηριακά κύτταρα, αυτά θα πρέπει να βρεθούν σε ένα διατροφικό περιβάλλον με περιορισμό σε συγκεκριμένα συστατικά, π.χ., συνθήκες πλήρους απουσίας πηγής αζώτου ή φωσφόρου (Sudesh et al., 2000). Συνεπώς, το μέσο ανάπτυξης θα πρέπει να είναι χημικώς καθορισμένο με τέτοιο τρόπο ώστε να επιτρέπει την επαρκή ανάπτυξη της υπολειπόμενης βιομάζας, αλλά ταυτόχρονα και την επαγωγή της συσσώρευσης του πολυμερούς (Philip et al., 2009). Σε μικροβιακά συστήματα παραγωγής PHB η ανάπτυξη της κυτταρικής μάζας και η ενδοκυττάρια σύνθεση πολυμερούς είναι λειτουργίες ισχυρά συνδεδεμένες με το μεταβολισμό της πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) και την παρουσία ή μη συγκεκριμένης πηγής αζώτου (θειικό αμμώνιο) στο μέσο ανάπτυξης (Johnson et al., 2010a; Madison and Huisman, 1999). Η ρύθμιση του μεταβολισμού της πηγής άνθρακα, είτε προς την παραγωγή πολυμερούς με υψηλό ρυθμό, είτε προς τον κυτταρικό διπλασιασμό και την ανάπτυξη της υπολειπόμενης βιομάζας, σχετίζεται άμεσα με τη συγκέντρωση της πηγής αζώτου (Grothe et al., 1999). Υπάρχουν μελέτες σε διαφορετικά βακτήρια, οι οποίες έχουν αποδείξει τη σημαντική επίδραση του λόγου μάζας (C/N), τόσο στο ρυθμό παραγωγής του PHB, όσο και στις μοριακές ιδιότητες του (Grothe et al., 1999; Johnson et al., 2010b; Quagliano and Miyazaki, 1997). 37

52 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας πραγματοποιήθηκε μια σειρά πειραμάτων σε κωνικές φιάλες, όπου οι κυριότερες προς εξέταση παράμετροι ήταν ο λόγος άνθρακας/αζώτου (C/N) (g/g) και η αρχική συγκέντρωση (ΝΗ4)2SO4, με στόχο τη δημιουργία κατάλληλων περιοριστικών συνθηκών πηγής αζώτου που επάγουν τη συσσώρευση πολυμερούς. Για τη μεγιστοποίηση της παραγωγής του ενδοκυττάριου πολυμερούς σε ασυνεχείς συνθήκες αναζητείται μια βέλτιστη τιμή ή περιοχή τιμών της αρχικής συγκέντρωσης του θειικού αμμωνίου καθώς και της αναλογίας συγκέντρωσης της πηγής άνθρακα προς άζωτο (C/N). Ο περιορισμός της πηγής του αζώτου ενισχύει κατά πολύ την παραγωγή PHB, καθώς επάγει την παραγωγή συνθάσης (ένζυμο D-πολυμεράση) το οποίο ευνοεί τη συσσώρευση PHB (Merrick and Doudoroff, 1961). Ταυτόχρονα, είναι απαραίτητο να υπάρχει περίσσεια της πηγής άνθρακα, κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες αερισμού. Οι υπόλοιπες πειραματικές συνθήκες καθορίστηκαν από πειράματα που είχαν διεξαχθεί στο παρελθόν και οδήγησαν σε βέλτιστες τιμές απόδοσης και συσσώρευσης ενδοκυττάριου πολυμερούς (Penloglou, 2010) και παρέμειναν ταυτόσημες μεταξύ των πειραμάτων. Σε αυτό το πλαίσιο συνθηκών, πραγματοποιείται μια προσπάθεια εφαρμογής πολιτικής περιορισμού αζώτου κατά την αραίωση της καλλιέργειας, με σκοπό την επαγωγή της ενδοκυττάριας συσσώρευσης PHB (Khanna and Srivastava, 2005; Patwardhan and Srivastava, 2008). Έτσι σχεδιάζεται μια σειρά πειραμάτων κατά τα οποία γίνεται μια προσπάθεια χαρτογράφησης των διαφόρων περιοχών λειτουργίας, καθώς και του τρόπου που ανταποκρίνεται ο μικροοργανισμός κατά τη μετάβασή του σε περιβάλλον με διαφορετικές συνθήκες. ΠΕΙΡΑΜΑ 1 Στόχο του πρώτου πειράματος αποτελεί η μελέτη της συμπεριφοράς του μικροοργανισμού κατά τη μετάβασή του σε διαφορετικό περιβάλλον (μεταβατική συμπεριφορά) και η περαιτέρω προσαρμογή και ανάπτυξή του σε αυτό. Πιο συγκεκριμένα μέσα από το πείραμα αυτό επιδιώκεται: Η παρακολούθηση της αποικοδόμησης του συσσωρευμένου πολυμερούς PHB. Η παρακολούθηση της συμπεριφοράς της καλλιέργειας κατά την παραμονή της, μετά τη 37

53 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός συσσώρευση πολυμερούς, σε συνθήκες μηδενικής σακχαρόζης (χωρίς πηγή C) αλλά επάρκειας αζώτου. Παρακολούθηση της δυνατότητας αναγέννησης της καλλιέργειας από τη φάση κατανάλωσης του πολυμερούς PHB στη φάση αύξησης της καλλιέργειας ή στη φάση επανασυσσώρευσης του PHB. Μέτρηση των χρόνων μετάβασης από τη μία φάση (κατάσταση) στην άλλη. Μελέτη της επίδρασης της φάσης ανάπτυξης της προκαλλιέργειας στη χρονική διάρκεια της φάσης καθυστέρησης (lag-phase duration) της κύριας καλλιέργειας. Ουσιαστικά μελετάται η επίδραση της πηγής αζώτου (με επάρκεια σακχαρόζης, απουσία σακχαρόζης, με χαμηλό ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB, με υψηλό ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB εφαρμόζοντας τις ακόλουθες πολιτικές: Από Νutrient Broth AL1 (χωρίς (ΝH4)2SO4) Από Νutrient Broth AL1 (2 g/l (ΝH4)2SO4) Από Νutrient Broth AL1 (4 g/l (ΝH4)2SO4) AL1 (0 g/l (ΝH4)2SO4) AL1 (4 g/l (ΝH4)2SO4) Από Νutrient Broth AL1 (χωρίς σακχαρόζη + 2 g/l (ΝH4)2SO4) Ακολουθεί ο σχεδιασμός του πρώτου πειράματος με τη μορφή διαγράμματος στο Σχήμα 4.1. Όπως αναφέρθηκε και στην Παράγραφο 3.6, η επαρκής ποσότητα μικροοργανισμού για τον εμβολιασμό των κωνικών φιαλών, καθώς και του βιοαντιδραστήρα για την ανάπτυξη της καλλιέργειας του στελέχους Azohydromonas lata παράγεται με τη σταδιακή κλιμάκωση μικρότερων ποσοτήτων βακτηριακής καλλιέργειας, που ονομάζονται προκαλλιέργειες (precultures). Στα δύο αυτά στάδια προετοιμασίας της προκαλλιέργειας είναι επιθυμητές οι συνθήκες εκείνες που ευνοούν τη γρήγορη ανάπτυξη της βιομάζας και τη μικρή συσσώρευση πολυμερούς. Από τη στιγμή που θα επιτευχθεί μια ικανοποιητική συγκέντρωση βιομάζας είναι απαραίτητο να υπάρχει μια μετάβαση του μεταβολισμού των βακτηρίων σε διαδικασία σύνθεσης βιοπολυμερούς, χωρίς την περαιτέρω ανάπτυξη της υπολειπόμενης βιομάζας (ορίζεται ως στάδιο της κύριας καλλιέργειας). Η μετάβαση πραγματοποιείται με μια απλή πολιτική τροφοδοσίας φυγοκεντρημένης κυτταρικής βιομάζας από το 2 ο στάδιο της προκαλλιέργειας στις επιμέρους κύριες καλλιέργειες, όπως ακριβώς περιγράφεται παρακάτω. Κατά το πρώτο στάδιο προκαλλιέργειας 20 ml NB σε κωνική φιάλη Erlenmyer των 100 ml, 38

54 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός εμβολιάζονται με μεμονωμένη αποικία που έχει αναπτυχθεί σε Petri-dish και τοποθετούνται στον κινούμενο επωαστήρα στους 30 ο C με συχνότητα ανάδευσης 210 rpm. Μετά από περίπου 16 h, όπου η οπτική πυκνότητα του πρώτου σταδίου προκαλλιέργειας βρίσκεται σε μια περιοχή τιμών , ξεκινά το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας με εμβολιασμό 2 ml από το πρώτο στάδιο προκαλλιέργειας σε 300 ml NB σε κωνική φιάλη Erlenmyer των 1000 ml και επωάζεται στις ίδιες συνθήκες για περίπου 7-8 h. Η πρώτη φάση προκαλλιέργειας παρουσιάζει φάση καθυστέρησης (lag-phase). Αυτό οφείλεται στο γεγονός πως τα κύτταρα του μικροοργανισμού χρειάζονται κάποιο χρόνο ώστε να προσαρμοστούν στο περιβάλλον που τοποθετούνται, να αρχίσουν να παράγουν τα κατάλληλα ένζυμα που θα προωθήσουν τις αντιδράσεις στα διάφορα μεταβολικά μονοπάτια για την παραγωγή των δομών και την ανάπτυξη του μικρο- 39

55 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Σχήμα 4.1. Διαγραμματική απεικόνιση σχεδιασμού πειράματος για τη μελέτη της επίδρασης της πηγής αζώτου (θειικού αμμωνίου) στην ανάπτυξη της κύριας καλλιέργειας. 40

56 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός οργανισμού. Η δεύτερη φάση προκαλλιέργειας δεν εμφανίζει φάση καθυστέρησης (no lagphase).στον Πίνακα 4.1 που ακολουθεί δίνεται αναλυτικά το περιεχόμενο κάθε κωνικής φιάλης πριν από την έναρξη της κύριας καλλιέργειας. Πίνακας 4.1. Όγκοι υγρής καλλιέργειας των κωνικών φιαλών. Κωνική φιάλη Όγκος κωνικής Όγκος μέσου Όγκος ενοφθα AL1 (5 φορές Μέσο χωρίς σακχαρόζη (ΝΗ 4) 2SO 4 (16 g/l) H 2O (ml) φιάλης (l) (ml) λμίσματος (ml) συμπυκνωμένο) (ml) (ml) l 1l συνέχιση l 1l συνέχιση Η πειραματική διαδικασία για την έναρξη επιμέρους κύριων καλλιεργειών στις κωνικές φιάλες είναι η ακόλουθη: Υπό ασηπτικές συνθήκες, σε αποστειρωμένα falcon tubes συλλέγεται η αντίστοιχη ποσότητα 25 ή 50 ml για κάθε κωνική φιάλη. Στη συνέχεια, φυγοκεντρούνται στα 3600xg για 10 min. Κάτω από ασηπτικές συνθήκες, γίνεται απόχυση του υπερκείμενου υγρού και συλλέγονται τα κύτταρα με επαναιώρηση με λίγη από την ποσότητα του μέσου κάθε κωνικής φιάλης και τοποθετούνται μέσα στην τελευταία. Οι ποσότητες που λαμβάνονται από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας μπορεί να μην είναι ακριβώς 50 και 25 ml, αλλά εξαρτάται από την οπτική πυκνότητα στην οποία διακόπτεται η προκαλλιέργεια και υπολογίζεται αναλόγως ώστε η κυρίως καλλιέργεια να ξεκινήσει με οπτική πυκνότητα OD

57 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Αρχικά ξεκινούν οι κωνικές φιάλες 3, 4, 5 και 6. Κωνική φιάλη 3 (AL-χωρίς πηγή Ν): Σε κωνική φιάλη 1 l που περιέχει 250 ml μέσο εμβολιάζεται με κύτταρα από 25 ml από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας. Κωνική φιάλη 4 (AL-2 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από 50 ml δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας Κωνική φιάλη 5 (AL-4 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από 50 ml δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας Κωνική φιάλη 6 (AL-2 g/l πηγή Ν- χωρίς σακχαρόζη): κωνική φιάλη του 1 l, 250 ml καλλιέργειας, εμβολιάζεται με κύτταρα από 25 ml από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας. Η δεύτερη φάση προκαλλιέργειας αφήνεται να αναπτυχθεί περαιτέρω. Μετά από 5 και 10 ώρες παραμονής στη στατική φάση ξεκινούν αντίστοιχα οι καλλιέργειες 7 και 8 Κωνική φιάλη 7 (AL-2 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από 50 ml δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας. Κωνική φιάλη 8 (AL-2 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από 50 ml δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας. Η μοναδική διαφορά μεταξύ των κωνικών φιαλών 7 και 8 έγκειται στον χρόνο έναρξής τους. Η κάθε κωνική φιάλη ξεκινά από διαφορετική φάση ανάπτυξης του δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας με σκοπό να μελετηθεί η συμπεριφορά του μικροοργανισμού που έχει παραμείνει για διαφορετική χρονική διάρκεια στη στατική φάση. Όταν η κωνική φιάλη 5 φτάσει σε τέτοια φάση ανάπτυξης κατά την οποία εκτιμάται ότι έχει καταναλωθεί η μισή ποσότητα αζώτου οπότε περιέχονται 2 g/l πηγής Ν, πραγματοποιείται η ταυτόχρονη έναρξη της φιαλών 9 και 10. Κωνική φιάλη 9 (Fresh AL- 0 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από ml της καλλιέργειας 5 έπειτα από φυγοκέντριση (ο μισός από τον όγκο της καλλιέργειας της Flask 5). Κωνική φιάλη 10 (συνέχιση της ίδιας καλλιέργειας από την κωνική φιάλη 5 έπειτα από μετάγγιση σε φιάλη μικρότερη όγκου): κωνική φιάλη του 1 l, ml καλλιέργειας 42

58 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Εφόσον, η καλλιέργεια μέσα στην κωνική φιάλη 9 παρουσιάσει την επιθυμητή ανάπτυξη προτείνεται, με βάση το σχεδιασμό του πειράματος, η μελέτη της συμπεριφοράς του μικροοργανισμού κατά τη μετάβασή του από την κωνική φιάλη 9 που έχει φτάσει σε τέτοια φάση ανάπτυξης ώστε το ποσοστό πολυμερούς να είναι περίπου 60% (at medium PHB content ~ 60%) στις ακόλουθες περιπτώσεις: Κωνική φιάλη 11 (Φρέσκο μέσο AL-4 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, εμβολιάζεται με κύτταρα από ml της καλλιέργειας 9 έπειτα από φυγοκέντριση (ο μισός από τον όγκο της καλλιέργειας της κωνικής φιάλης 9). Κωνική φιάλη 12 (συνέχιση της ίδιας καλλιέργειας της κωνικής φιάλης 9 έπειτα από μετάγγιση σε φιάλη μικρότερη όγκου): κωνική φιάλη του 1 l, ml καλλιέργειας Εφόσον η κωνική φιάλη 12 δώσει υψηλό ποσοστό πολυμερούς > 85%, έπειτα από φυγοκέντριση γίνεται μεταφορά σε νέα κωνική φιάλη και ξεκινάει η καλλιέργεια 13: Κωνική φιάλη 13: (Φρέσκο μέσο AL 4 g/l πηγή Ν): κωνική φιάλη των 2 l, 500 ml μέσο, ενοφθάλμισμα από ml δεύτερου σταδίου προκαλλιέργειας. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι ο λόγος για τον οποίο γίνεται η μετάγγιση της καλλιέργειας από κωνική φιάλη χωρητικότητας 2 l σε κωνική φιάλη 1 l έχει να κάνει με το λειτουργικό όγκο της καλλιέργειας σε σχέση με το συνολικό όγκο κάθε κωνικής φιάλης κι επομένως με τις συνθήκες αερισμού της καλλιέργειας. Η διάμετρος της κωνικής φιάλης μεταβάλλεται ανάλογα με το ύψος της καλλιέργειας που περιέχεται σε αυτή. Αν ο μισός όγκος της καλλιέργειας παρέμενε μέσα στη φιάλη 2 l, η διεπιφάνεια μεταξύ υγρού-αερίου (υγρή καλλιέργεια-αέρας που καταλαμβάνει τον υπολειπόμενο χώρο μέσα στην κωνική φιάλη) θα ήταν μεγαλύτερη (σε χαμηλότερο ύψος φτάνει η καλλιέργεια άρα μεγαλύτερη η διάμετρος της φιάλης και μεγαλύτερο headspace). Επομένως, με βάση τα φαινόμενα μεταφοράς η μεταφορά του οξυγόνου από τον αέρα στην υγρή καλλιέργεια θα ήταν αποτελεσματικότερη και θα είχαμε υψηλότερους ρυθμούς μεταφοράς οξυγόνου προς την καλλιέργεια σε σχέση με τις προηγούμενες διατάξεις, άρα ανομοιομορφία συνθηκών. Επιπλέον, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να αναφερθεί ότι η κωνική φιάλη 9 ξεκινά μετά από φυγοκέντριση. Κατά τη διαδικασία της φυγοκέντρισης γίνεται ο διαχωρισμός των στερεών κυττάρων από όλα τα υπόλοιπα συστατικά που είναι διαλυμένα μέσα στην υγρή φάση. 43

59 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Επομένως, στην κωνική φιάλη 9 μεταφέρονται μόνο τα κύτταρα που περιέχουν το συσσωρευμένο πολυμερές και την υπολειπόμενη βιομάζα. Όλοι οι ανασταλτικοί παράγοντες ή ανεπιθύμητα παραπροϊόντα αντιδράσεων που πιθανόν έχουν παραχθεί κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας μέσα στην κωνική φιάλη 5 έχουν απομακρυνθεί κατά την απόχυση. Επομένως, η παρουσία κυττάρων, που έχουν συσσωρεύσει κάποια ποσότητα πολυμερούς, μέσα σε φρέσκο θρεπτικό μέσο (ανανέωση σακχαρόζης) με μηδενική πηγή αζώτου και μάλιστα ελλείψει πιθανών ανασταλτικών παραγόντων θα έπρεπε θεωρητικά να προωθήσει τη συσσώρευση πολυμερούς στα κύτταρα που έχει ήδη φτιάξει. Από την άλλη πλευρά, η κωνική φιάλη 10 αποτελεί συνέχιση της κωνικής φιάλη 5 περιέχοντας όλους του πιθανούς ανασταλτικούς παράγοντες καθώς κι ότι έχει απομείνει από την αρχική ποσότητα της πηγής αζώτου. Ακόμη, η κωνική φιάλη 9 περιέχει την ίδια πηγή άνθρακα με την κωνική φιάλη 5 από την οποία ξεκίνησε οπότε θεωρητικά δεν θα υπάρχει φάση καθυστέρησης. Για τους λόγους που αναφέρονται παραπάνω είναι επιθυμητή η σύγκριση της συμπεριφοράς του μικροοργανισμού στις δύο περιπτώσεις των κωνικών φιαλών 9 και 10. ΠΕΙΡΑΜΑ 2 Ο δεύτερος κύκλος πειραμάτων σε κωνικές φιάλες είναι μια επανάληψη του Πειράματος 1 με κάποιες διακριτές διαφοροποιήσεις οι οποίες προέκυψαν μετά την ολοκλήρωση του Πειράματος 1 και αποσκοπούν στην αποτελεσματικότερη εκτέλεση των πειραμάτων και διεξαγωγή συμπερασμάτων. Συγκεκριμένα, το δεύτερο πείραμα στις κωνικές φιάλες διαφοροποιείται από το πρώτο ως προς την αρχική συγκέντρωση της πηγής αζώτου στην καλλιέργεια 9 (κωνική φιάλη 9) που δεν ξεκινάει με 0 g/l (NH4)2SO4, αλλά με 0.8 g/l, ώστε να είναι ομαλότερη η μετάβαση σε συνθήκες περιορισμού πηγής αζώτου. Μια ακόμη διαφορά μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου κύκλου πειραμάτων είναι η ακόλουθη. Η έναρξη της καλλιέργειας 8 (κωνική φιάλη 8) πραγματοποιείται στο πρώτο πείραμα μετά από παραμονή της δεύτερης φάσης της προκαλλιέργειας (ΝΒ-2) για 10 ώρες σε στατική φάση. Στο δεύτερο κύκλο πειραμάτων το δεύτερο στάδιο της προκαλλιέργειας αφήνεται περισσότερες ώρες σε στατική φάση προκειμένου να είναι εμφανής η επίδρασή της στην ανάπτυξη της καλλιέργειας 8. 44

60 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός ΠΕΙΡΑΜΑ 3 Δεδομένης της σημαντικότητας της πηγής αζώτου στην ανάπτυξη της καλλιέργειας αλλά και στην κατεύθυνση της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων, σχεδιάζεται ένας νέος κύκλος πειραμάτων που αποσκοπεί στη μελέτη της πορείας ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων όταν η καλλιέργεια ξεκινά από διαφορετικές συγκεντρώσεις πηγής αζώτου. Επιπλέον, προκειμένου να αξιολογηθεί η δυνατότητα του επιλεγμένου βακτηριακού στελέχους να καλλιεργείται σε συστήματα βιοαντιδραστήρων συνεχούς λειτουργίας κι όχι ασυνεχούς ή ημισυνεχούς λειτουργίας, που αποτελεί σημαντική παράμετρο οικονομικής βιωσιμότητας και κερδοφορίας μιας εγκατάστασης βιομηχανικής κλίμακας κρίνεται σημαντικό να μελετηθεί η συμπεριφορά του μικροοργανισμού σε μεταβατικές καταστάσεις που είναι σύνηθες σε διατάξεις συνεχούς λειτουργίας. Έτσι παράλληλος στόχος του συγκεκριμένου κύκλου πειραμάτων είναι η μελέτη της συμπεριφοράς των βακτηριακών κυττάρων κατά τη μετάβασή τους σε διαφορετικό περιβάλλον, καθώς και η αποτίμηση της δυνατότητας του μικροοργανισμού να προσαρμοστεί και να συνεχίσει να αναπτύσσεται ή να επανέλθει στην προηγούμενη κατάστασή του όταν μεταβαίνει σε περιβάλλον με διαφορετικές συνθήκες, μετά από την ανάπτυξή του ως ένα στάδιο. Έτσι οι διακριτοί στόχοι του πειράματος αυτού είναι: Η εύρεση της βέλτιστης τιμής της αρχικής συγκέντρωσης του (NH4)2SO4. Η εύρεση του χρονικού σημείου εκείνου στο οποίο η ανάπτυξη της καλλιέργειας έχει φτάσει σε τέτοιο στάδιο ώστε η καλλιέργεια να τροφοδοτηθεί με φρέσκο μέσο ανάπτυξης AL1 για τη βελτιστοποίηση της παραγωγής πολυμερούς. Μελέτη της συμπεριφοράς των βακτηριακών κυττάρων κατά τη μετάβασή τους σε περιβάλλον με νέο μέσο ανάπτυξης που περιέχει νέα πηγή άνθρακα και αζώτου, όταν το περιεχόμενο πολυμερές έχει ανέλθει στο 60% και μετά από απομάκρυνση πιθανών τοξικών παραγόντων (καλλιέργεια 2Α). Μελέτη της συμπεριφοράς των βακτηριακών κυττάρων κατά τη μετάβασή τους σε περιβάλλον με νέο μέσο ανάπτυξης που περιέχει νέα πηγή άνθρακα, χωρίς πηγή αζώτου, όταν το περιεχόμενο πολυμερές έχει ανέλθει στο %. (καλλιέργεια 2Β). Για το λόγο αυτό έγινε ο σχεδιασμός των ακόλουθων πειραμάτων. Τέσσερις κωνικές φιάλες ξεκίνησαν με αρχικές συγκεντρώσεις 1, 2, 3, 4 g/l (NH4)2SO4 για να μελετηθεί η συμπεριφορά 45

61 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός του βακτηριακών κυττάρων σε συνθήκες διαφορετικής αρχικής συγκέντρωση πηγής N2. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών γίνεται σε κωνικές φιάλες των 2 l για καλύτερο αερισμό της κάθε καλλιέργειας, αλλά και για να υπάρχει η δυνατότητα τροφοδοσίας νέου μέσου ανάπτυξης στην καλλιέργεια χωρίς να απαιτείται φυγοκέντριση, διαχωρισμός των κυττάρων και επαναιώρησή τους σε νέο μέσο. Συγκεκριμένα, αφού οι καλλιέργειες καταναλώσουν κάποια ποσότητα της πηγής αζώτου γίνεται προσθήκη 50 ml AL(0 g/l NH4) και 200 ml νερού. Με την αραίωση της κάθε καλλιέργειας ως προς την πηγή αζώτου πραγματοποιείται ταυτόχρονη αύξηση των στροφών, δηλαδή αυξάνεται η ταχύτητα ανάδευσης ώστε να καλύπτονται αποτελεσματικότερα οι ανάγκες της καλλιέργειας σε οξυγόνο. Ακολουθεί ο σχεδιασμός του τρίτου κύκλου πειραμάτων με τη μορφή διαγράμματος στο Σχήμα 4.2. Σε τέσσερις κωνικές φιάλες των 2 l προστίθενται οι απαραίτητες ποσότητες μέσου ανάπτυξης AL1 και πηγής αζώτου, (NH4)2SO4 ώστε σε κάθε κωνική φιάλη να περιέχεται μέσο με αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 1, 2, 3, 4 g/l αντίστοιχα. Η συνολική ποσότητα του μέσου ανάπτυξης στις κύριες καλλιέργειες είναι ίση με 300 ml. Οι ποσότητες AL1, (NH4)2SO4 και νερού που προστίθενται σε κάθε κωνική φιάλη φαίνονται στον Πίνακα 4.2 που ακολουθεί. Πίνακας 4.2. Διαλύματα κωνικών φιαλών. Κωνική φιάλη Συγκέντρωση (ΝΗ 4) 2SO 4 (g/l) Συνολικός όγκος καλλιέργειας (ml) Όγκος AL1 (ml) Όγκος (NH 4) 2SO 4 (ml) Όγκος H 2O (ml) A Β Όλες οι κύριες καλλιέργειες εμβολιάζονται με κατάλληλη ποσότητα από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας όπως περιγράφηκε στο Πείραμα 1. Μετά από ικανοποιητική ανάπτυξη καθεμιάς από τις κύριες καλλιέργειες (οπτική πυκνότητα OD>6-8) γίνεται αραίωση της 46

62 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός καλλιέργειας με προσθήκη 50 ml μέσου AL1 (χωρίς πηγή αζώτου) και 200 ml αποστειρωμένου νερού. Η καλλιέργεια 2 στην κωνική φιάλη που ξεκινά με 2 g/l (NH4)2SO4, μετά από την απαιτούμενη ανάπτυξη, χρησιμοποιείται για να ξεκινήσουν οι καλλιέργειες στις κωνικές φιάλες 2Α και 2Β. Η καλλιέργεια 2Α ξεκινά με κύτταρα από 200 ml (κατόπιν φυγοκέντρισης) από την καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 2 όταν φτάσει σε τέτοιο στάδιο ώστε με βάση τη μετρούμενη οπτική πυκνότητα να εκτιμάται ότι το % περιεχόμενο PHB είναι περίπου 60% κ.β. Το υπόλοιπο της καλλιέργειας 2 μεταγγίζεται σε κωνική φιάλη όγκου 1 l και συνεχίζεται η επώασή του. Με βάση το σχεδιασμό του πειράματος, η καλλιέργεια 2Β ξεκινά με κύτταρα από 200 ml (κατόπιν φυγοκέντρισης) από την παραπάνω καλλιέργεια όταν αυτή φτάσει σε τέτοιο στάδιο ώστε με βάση τη μετρούμενη οπτική πυκνότητα να εκτιμάται ότι το % περιεχόμενο PHB είναι μεγαλύτερο από 80% κ.β. 47

63 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Σχήμα 4.2. Σχεδιασμός πειράματος έναρξης καλλιέργειας από διαφορετικές συγκεντρώσεις πηγής αζώτου 48

64 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός ΠΕΙΡΑΜΑ 4 O σχεδιασμός του Πειράματος 4 είναι όμοιος με αυτό του προηγούμενου με τη διαφορά ότι το πείραμα επαναλαμβάνεται μόνο για τις κωνικές φιάλες με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 2 και 3 g/l. Στο εν λόγω πείραμα μελετάται ξανά η συμπεριφορά των καλλιεργειών που έχουν αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 2 και 3 g/l. Το πείραμα αυτό επαναλαμβάνεται δύο φορές. Στην πρώτη περίπτωση η προκαλλιέργεια ξεκινά από αποικία σε τριβλία Petri που είχαν προετοιμαστεί περίπου 3 εβδομάδες πριν και συντηρούνταν στο ψυγείο, ενώ στη δεύτερη περίπτωση η προκαλλιέργεια ξεκινά από ξηραμένα κύτταρα συντηρούμενα σε συνθήκες κατάψυξης, -30 ο C (freeze dried stock), για περισσότερα από ένα χρόνο. Ο σκοπός του πειράματος αυτού είναι ο ίδιος με το προηγούμενο ενώ επιπρόσθετα διερευνάται και η ιστορία των κυττάρων. Είναι πολύ σημαντικό να αναφερθεί ότι η ιστορία και ο τρόπος συντήρησης των βακτηριακών κυττάρων αναμένεται να επηρεάζει την περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας σε πολύ μεγάλο βαθμό. 4.2 Ανάπτυξη καλλιέργειας και παραγωγή PHB στο Βιοαντιδραστήρα Μεταξύ των διαφορετικών στρατηγικών ελάττωσης του κόστους παραγωγής του PHB, η βελτιστοποίηση των λειτουργικών συνθηκών για την επίτευξη υψηλής συσσώρευσης βιοπολυμερούς σε καλλιέργειες με μεγάλη πυκνότητα βιομάζας, είναι πρωταρχική επιδίωξη (Johnson et al., 2010a; Sudesh et al., 2000). Ανάμεσα στους τρόπους βελτίωσης του ρυθμού παραγωγής, οι ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας σε βιοαντιδραστήρα έχουν δείξει ότι αποτελούν την πιο επιτυχημένη πρακτική για υψηλή συγκέντρωση και απόδοση συσσωρευμένης μάζας πολυμερούς προς την καταναλισκόμενη πηγή άνθρακα (Khanna and Srivastava, 2005; Patwardhan and Srivastava, 2008). Το επίπεδο της μελέτης μεταφέρεται από τις κωνικές φιάλες στο βιοαντιδραστήρα. Επίσης, πραγματοποιείται προσπάθεια scale-up της βέλτιστης καλλιέργειας από το επίπεδο των κωνικών φιαλών στο επίπεδο του βιοαντιδραστήρα, κάτω από ημισυνεχείς συνθήκες λειτουργίας, ενώ ταυτόχρονα εξετάζονται διαφορετικές πολιτικές τροφοδοσίας. Με βάση τον σχεδιασμό των πειραμάτων στο βιοαντιδραστήρα οι παρακάτω τρεις πολιτικές τροφοδοσίας εφαρμόζονται συνδυαστικά με άλλες λειτουργικές συνθήκες (βλέπε Σχήμα 9). 49

65 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Τροφοδοσία μέσου AL2 και (ΝΗ4)2SO4 Τροφοδοσία μέσου AL2 χωρίς πηγή αζώτου Τροφοδοσία μέσου AL2 και τροφοδοσία (ΝΗ4)2SO4 μικρότερης συγκέντρωσης συγκριτικά με την πρώτη πολιτική Το πρώτο και το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας παρασκευάζονται όπως περιγράφηκε παραπάνω στα πειράματα στις κωνικές φιάλες. Για την έναρξη της καλλιέργειας στο βιοαντιδραστήρα γίνεται εμβολιασμός με κύτταρα από 200 ml από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας (κατόπιν φυγοκέντρισης). Για την πολιτική τροφοδοσίας των βιοαντιδραστήρων χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο ανάπτυξης AL2 (με ή χωρίς πηγή αζώτου) 10 φορές συμπυκνωμένο. Στο πλαίσιο των παραπάνω στρατηγικών ημισυνεχούς λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα διαμορφώθηκαν τα ακόλουθα οκτώ πειράματα τα οποία αξιολογούνται ως προς τη δυνατότητα βελτιστοποίησης της παραγωγής και συσσώρευσης PHB της καλλιέργειας αλλά και την προοπτική κλιμάκωσης της συγκεκριμένης στρατηγικής. Αναλυτικά οι συνθήκες που εφαρμόζονται στα πειράματα αυτά διατυπώνονται κατά περίπτωση στους Πίνακες ΠΕΙΡΑΜΑ 1 Πίνακας 4.3. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 1 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα 1 Αρχικός όγκος καλλιέργειας 1.3 l σε βιοαντιδραστήρα 2 l Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης AL2 Τρόπος λειτουργίας βιοαντιδραστήρα Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 20 % Ρυθμός αερισμού καλλιέργειας 0.2 (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) 2 g/l Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας ~15 h από την έναρξη της καλλιέργειας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) 4 g/h (για 10 ώρες) 0 g/h 50

66 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας 0.4 g/h(για 10 ώρες) 0 g/h Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.=0.136 ΠΕΙΡΑΜΑ 2 Πίνακας 4.4. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 2 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου. Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα 2 Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιοαντιδραστήρα 1.3 l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 20 % Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας 0.2 (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) 2 g/l Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας ~24 h από την έναρξη της καλλιέργειας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα σακχαρόζης Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας 4 g/h(για 12.5 ώρες) 0 g/h μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.=0.204 ΠΕΙΡΑΜΑ 3 Πίνακας 4.5. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 3 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία και μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου. Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα 3 Αρχικός όγκος καλλιέργειας 1.3 l σε βιοαντιδραστήρα 2 l Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης AL2 Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C 51

67 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. set point) Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) 1 Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) 1 Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας 50 %(για 14 ώρες) 20 % 0.3 (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα 2 g/l 15.5 h από την έναρξη της καλλιέργειας 3 g/h(για 5 ώρες) 5 g/h(για 2 ώρες) 7g/h(για 3 ώρες) 0 g/h μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.=0.204 ΠΕΙΡΑΜΑ 4 Πίνακας 4.6. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 4 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 50 %(για ώρες) 20 % Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου (NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας 0.3 (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα 2 g/l h από την έναρξη της καλλιέργειας 3 g/h(για 8 ώρες) 4 g/h(για 4 ώρες) 0 g/h 0.3 g/h(για 8 ώρες) 0.4 g/h(για 4 ώρες) 0 g/h Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.=

68 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός ΠΕΙΡΑΜΑ 5 Πίνακας 4.7. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 5 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 50 %(για 12 ώρες) 20 % Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας ΠΕΙΡΑΜΑ (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα 2 g/l 12 h από την έναρξη της καλλιέργειας 3 g/h(για 5 ώρες) 5 g/h(για 4 ώρες) 10 g/h(για 2 ώρες) 0 g/h 0.1 g/h(για 5 ώρες) 0.17 (για 4 ώρες) 0.33(για 1 ώρα) (για 4 ώρες) 0.17(για 1 ώρα) 0 g/h Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.= Πίνακας 4.8. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 6 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 50 %(για 11 ώρες) 20 % Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας 0.1 (l/min) (για 12 ώρες) 0.15(για 1 ώρα) 0.25(για 1 ώρα) 0.35 (για 2 ώρες) 0.2(για 2 ώρες) ατμοσφαιρικού αέρα 53

69 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας 2 g/l 12 h από την έναρξη της καλλιέργειας 2 g/h(για 3 ώρες) 3(για 2 ώρες) 5(για 1 ώρα) 6(για 5 ώρες) 0(για 5 ώρες) 7 (για 8 ώρες) 0 g/h 0.1 g/h(για 9 ώρες) 0 g/h Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.= ΠΕΙΡΑΜΑ 7 Πίνακας 4.9. Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 7 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 25 % (για 26 ώρες) 15 % (για 9.5 ώρες) 25 % (25 ώρες) Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας 0.1 (l/min) ατμοσφαιρικού αέρα Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) 2 g/l 26 h από την έναρξη της καλλιέργειας 3 g/h(για 8 ώρες) 0(για 1 ώρα) 4(για 1 ώρα) 0(για 5 ώρες) 5(για 10 ώρες) 0 g/h μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.=

70 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός ΠΕΙΡΑΜΑ 8 Πίνακας Λειτουργικές συνθήκες πειράματος 8 σε βιοαντιδραστήρα με τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου. Αρχικός όγκος καλλιέργειας Θρεπτικό μέσο ανάπτυξης Τρόπος λειτουργίας βιονατιδραστήρα Λειτουργικές Συνθήκες-Πείραμα l σε βιοαντιδραστήρα 2 l AL2 Ημισυνεχής Έλεγχος ph Ρυθμιστικά διαλύματα NaOH 2M και HCl 1M - Αρχική τιμή 7.00±0.05 Έλεγχος θερμοκρασίας 30 ο C Σήμα αναφοράς Διαλυμένου οξυγόνου (D.O. sp) 25 % (για 23 ώρες) 15 % (για 10 ώρες) 25 % Ρυθμος αερισμού καλλιέργειας Αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ((NH 4) 2 SO 4) Χρόνος έναρξης τροφοδοσίας Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) Ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου ((NH 4) 2SO 4) 0.1 (l/min) (για 16 ώρες) 0.18 (για 1 ώρα) 0.2 (για 1 ώρα) 0.15 (για 17 ώρες) ατμοσφαιρικού αέρα 2 g/l 13 h από την έναρξη της καλλιέργειας 2 g/h(για 1 ώρα) 3(για 6 ώρες) 5(για 1 ώρα) 2(για 11 ώρες) 4(για 2 ώρες) 0 g/h μηδενική τροφοδοσία πηγής αζώτου Ρυθμός ανάδευσης Μέγεθος εμβολιασμού κύριας καλλιέργειας Χρονικά μεταβαλλόμενο προφίλ Αρχική τιμή οπτικής πυκνότητας, O.D.= Επίδραση της ανομοιογένειας του κυτταρικού πληθυσμού της προκαλλιέργειας στην περαιτέρω ανάπτυξη και παραγωγικότητα του A.lata Παράλληλα με τα πειράματα στο βιοαντιδραστήρα και με αφορμή τη συμπεριφορά της καλλιέργειας κατά το Πείραμα 2 σε βιοαντιδραστήρα, σχεδιάζεται ένας ακόμη κύκλος πειραμάτων σε κωνικές φιάλες προκειμένου να διευκρινιστεί το ενδεχόμενο της ανομοιομορφίας/ανομοιογένειας του κυτταρικού πληθυσμού από το στάδιο της προκαλλιέργειας ακόμη και η επίδραση αυτής της πιθανής ανομοιογένειας στην ανάπτυξη και την παραγωγικότητα της κύριας καλλιέργειας. Στο πλαίσιο αυτού του σκοπού σχεδιάστηκε και υλοποιήθηκε το ακόλουθο πείραμα που γραφικά απεικονίζεται στο Σχήμα 4.4. Το επιλεγμένο βακτηριακό στέλεχος Azohydromonas lata αναγεννάται από freeze dried stock σε 20 ml θρεπτικού μέσου ΝΒ σε κωνική φιάλη των 100 ml και επωάζεται στους 30 ο C στις 210 στροφές/λεπτό. Το πρώτο στάδιο προκαλλιέργειας είχε διάρκεια 13.5 h. Κατά το δεύτερο 55

71 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός στάδιο προκαλλιέργειας 100 ml ΝΒ σε κωνική φιάλη των 500 ml εμβολιάστηκαν με 20 ml από το πρώτο στάδιο προκαλλιέργειας και τοποθετήθηκαν στον επωαστήρα σε συνθήκες 30 ο C και 210 στροφές/λεπτό για 4 h. Δύο Petri-dishes στρώθηκαν με περίπου 40 ml θρεπτικό υλικό (NB και Agar) το καθένα και εμβολιάστηκαν με τη βοήθεια βρόγχου εμβολιασμού με προκαλλιέργεια του δευτέρου σταδίου. Έπειτα, τοποθετήθηκαν στον επωαστήρα στους 30 ο C για 34.5 h. Η ανάπτυξη των αποικιών στα Petri-dishes διήρκησε περίπου 2 μέρες. Σχήμα 4.3. Διαγραμματική απεικόνιση των σταδίων της πειραματικής διαδικασίας Στη συνέχεια, έξι κωνικές φιάλες των 1000 ml που περιείχαν 100 ml ΝΒ εμβολιάστηκαν η καθεμία με μία ξεχωριστή αποικία από αυτές που αναπτυχθήκαν στα Petri-dishes που παρασκευάστηκαν. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν για περίπου 11 h. Οι μετρήσεις οπτικής πυκνότητας που ελήφθησαν δίνονται στον Πίνακα 4.11 ακολούθως. 56

72 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Πίνακας Οπτική πυκνότητα των καλλιεργειών της πρώτης ομάδας από κωνικές φιάλες. Time (h) O.D (Flask) O.D.(1) O.D.(2) O.D.(3) O.D.(4) O.D.(5) O.D.(6) 0 START START START START START START Η κωνική φιάλη 6 η οποία επέδειξε την ταχύτερη ανάπτυξη επιλέχθηκε ως η βέλτιστη, καθώς είχε και τη μεγαλύτερη οπτική πυκνότητα σε σχέση με τις υπόλοιπες, και χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία νέων αποικιών σε τριβλία Petri με βάση τη διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω. Η επώασή τους στους 30 ο C είχε διάρκεια περίπου 42 h και στη συνέχεια συντηρήθηκαν σε ψυγείο. Τέσσερις κωνικές φιάλες των 500 ml που περιείχαν 100 ml θρεπτικού μέσου ΝΒ, εμβολιάστηκαν με μία ξεχωριστή αποικία, που αναπτύχθηκε σε ένα από τριβλία Petri που παρασκευάστηκαν, κι επωάστηκαν στους 30 ο C και στις 210 στροφές/λεπτό. Η πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών αυτών αποδίδεται με τη χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητάς τους όπως περιγράφεται στον Πίνακα 4.12 που ακολουθεί. Πίνακας Οπτική πυκνότητα των καλλιεργειών της δεύτερης ομάδας από κωνικές φιάλες. Time (h) O.D (Flask) O.D.(1) O.D.(2) O.D.(3) O.D.(4) 0 START START START START Στη συνέχεια, ετοιμάστηκαν τέσσερις κωνικές φιάλες των 1000 ml με 300 ml μέσου AL1 και πηγή αζώτου (NH4)2SO4 συγκέντρωσης 2 g/l. Καθεμία εμβολιάστηκε με 50 ml καλλιέργειας των τεσσάρων διαφορετικών κωνικών φιαλών αντίστοιχα. Οι συνθήκες επώασης ήταν 30 ο C και 240 στροφές/λεπτό. Η πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών αυτών αποδίδεται με τη χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητάς τους όπως περιγράφεται στον Πίνακα 4.13 που ακολουθεί. 57

73 Κεφάλαιο 4 ο Πειραματικός σχεδιασμός Πίνακας Οπτική πυκνότητα καλλιεργειών τη τρίτης ομάδας από κωνικές φιάλες. Time (h) O.D (Flask) O.D.(1) O.D.(2) O.D.(3) O.D.(4) Τα αποτελέσματα των μετρήσεων και τα συμπεράσματα που προέκυψαν από αυτόν τον κύκλο πειραμάτων αναπτύσσονται στο επόμενο κεφάλαιο. 58

74 Κεφάλαιο 5 ο : Παράθεση και σχολιασμός αποτελεσμάτων των πειραματικών μετρήσεων 5.1 Αποτελέσματα πειραμάτων στην κλίμακα των κωνικών φιαλών Πείραμα 1 Στα Σχήματα 5.1 και 5.2 παρακάτω φαίνεται η πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών ως προς την οπτική πυκνότητά τους. Οπτική πυκνότητα κωνική φιάλη 3 κωνική φιάλη 4 κωνική φιάλη 7 κωνική φιάλη Χρόνος καλλιέργειας(ώρες) Σχήμα 5.1. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 4, 7, 8 -Πείραμα 1 σε κωνικές φιάλες. 59

75 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων 8 7 Οπτική πυκνότητα Χρόνος καλλιέργειας(ώρες) κωνική φιάλη 3 κωνική φιάλη 5 κωνική φιάλη 6 κωνική φιάλη 9 Σχήμα 5.2. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 5, 6, 9 -Πείραμα 1 σε κωνικές φιάλες. Κατά τη μετάβαση από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας στις κύριες καλλιέργειες πραγματοποιείται αλλαγή της πηγής άνθρακα (C), ταυτόχρονα με την αλλαγή του θρεπτικού μέσου από NB σε AL1 όπου χρησιμοποιείται η σακχαρόζη ως πηγή άνθρακα. Κατά τη μετάβαση αυτή ο μικροοργανισμός, αφού ανιχνεύσει το νέο περιβάλλον ανάπτυξης του, συνθέτει νέα ένζυμα προκειμένου να μεταβολίσει τη νέα πηγή άνθρακα. Η διαδικασία αυτή γίνεται αντιληπτή στην πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας ως φάση καθυστέρησης η οποία περιλαμβάνει την προσαρμογή του μικροοργανισμού στο νέο περιβάλλον και την παραγωγή των κατάλληλων ενζύμων. Το φαινόμενο αυτό γίνεται έντονα αντιληπτό στην καλλιέργεια 3 (κωνική φιάλη 3) που διεξάγεται με πλήρη απουσία της πηγής αζώτου. Η καλλιέργεια αυτή εκδηλώνει πολύ μεγάλη φάση καθυστέρησης και πρακτικά δεν εισέρχεται ποτέ σε φάση εκθετικής ανάπτυξης. Τα κύτταρα στην καλλιέργεια αυτή δεν μπορούν να εκκινήσουν τη διαδικασία παραγωγής των 60

76 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων απαραίτητων ενζύμων για το μεταβολισμό της σακχαρόζης (ως νέας πηγής άνθρακα), αφού το άζωτο που λείπει από την καλλιέργεια αποτελεί βασικό συστατικό για τη σύνθεση ενζύμων. Η καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 4 παρουσιάζει μεγαλύτερη ανάπτυξη συγκριτικά με την καλλιέργεια 3, καθώς ξεκινά με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 2 g/l και όχι μηδενική. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει πως μια τέτοια αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου είναι επαρκής για την παραγωγή των απαραίτητων ενζύμων στην καλλιέργεια και κατ επέκταση την περαιτέρω ανάπτυξή της. Μάλιστα παρατηρείται (Σχήμα 5.1) πως η συγκεκριμένη καλλιέργεια διέρχεται από όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, καταλήγοντας στη φάση θανάτωσης. Με βάση τον πειραματικό σχεδιασμό, στην κωνική φιάλη 6 λείπει ο άνθρακας, καθώς δεν περιέχει σακχαρόζη και έχει προηγηθεί και έκπλυση των κυττάρων οπότε δεν υπάρχει και άνθρακας από το ΝΒ, όπου βρισκόταν προηγουμένως. Το γεγονός αυτό δικαιολογεί τις πολύ χαμηλές τιμές οπτικής πυκνότητας που παρουσιάζει η καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 6, όπως φαίνεται από το Σχήμα 5.2 παραπάνω, καθώς η πηγή C σε μια καλλιέργεια αποτελεί το σημαντικότερο συστατικό για τη δομική ανάπτυξη και την αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού της. Οι κωνικές φιάλες 7 και 8 παρουσιάζουν παρόμοια πορεία ανάπτυξης της οπτικής πυκνότητας με την κωνική φιάλη 4. Και οι τρεις καλλιέργειες ξεκίνησαν με ίδια αρχική συγκέντρωση σε πηγή αζώτου ίση με 2 g/l, βάση πειραματικού σχεδιασμού. Η μοναδική διαφορά των καλλιεργειών 7 και 8 σε σχέση με την καλλιέργεια 4 έγκειται στο ότι ξεκίνησαν σε διαφορετική χρονική στιγμή από το δεύτερο στάδιο προκαλλιέργειας (είχε περάσει στη στατική φάση του κυτταρικού κύκλου), οπότε είναι αναμενόμενο να παρουσιάσουν μεγαλύτερη χρονική καθυστέρηση, συγκριτικά με την καλλιέργεια 4. Ακόμη, αναμένεται να παρουσιάσουν και διαφορετική πορεία ανάπτυξης από την καλλιέργεια 4, καθώς η παραμονή στη στατική φάση θεωρητικά δυσχεραίνει κατά πολύ τη μετάβαση του κυτταρικού πληθυσμού και κατ επέκταση την προσαρμογή και περαιτέρω ανάπτυξή του σε ένα νέο περιβάλλον (Φρέσκο μέσο AL1 με συγκέντρωση (ΝΗ4)2SO4 ίση με 2 g/l). Η αναμενόμενη συμπεριφορά παρατηρείται εν μέρει (Σχήμα 5.1). Η ανάπτυξη της καλλιέργειας 7, που ξεκίνησε μετά από 5 περίπου h παραμονής στη στατική φάση της προκαλλιέργειας του δευτέρου σταδίου (ΝΒ-2), καθυστερεί χρονικά 61

77 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων συγκριτικά με την 4. Επιπλέον, και η καλλιέργεια 8 παρουσιάζει μεγαλύτερη χρονική καθυστέρηση σε σχέση με την καλλιέργεια 4, αλλά και με την 7 αφού ξεκίνησε αργότερα και από τη δεύτερη, μετά από παραμονή περίπου 10 h της προκαλλιέργειας 2 ου σταδίου στη στατική φάση. Το γεγονός όμως πως παρά τη διαφορετική αυτή χρονική καθυστέρηση, η πορεία ανάπτυξης της οπτικής πυκνότητας και των τριών καλλιεργειών είναι παρόμοια, παρουσιάζοντας μια αύξηση στην αρχή, φτάνοντας στην υψηλότερη τιμή και ακολουθώντας μια πτωτική πορεία στη συνέχεια, όπως υποδηλώνουν και οι διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου, αποτελεί ένδειξη πως πιθανόν το δεύτερο στάδιο καλλιέργειας να μην έμεινε επαρκώς στη στατική φάση. Επομένως, η ανάγκη για μεγαλύτερη παραμονή της 2 ης φάσης προκαλλιέργειας στη στατική φάση, πριν την έναρξη των καλλιεργειών 7 και 8, οδήγησε στο σχεδιασμό του Πειράματος 2 στις κωνικές φιάλες, όπως περιγράφεται αναλυτικά παραπάνω. Από το Σχήμα 5.2 παρατηρείται η πολύ μικρή ανάπτυξη ως προς την οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας 5, όπως ήταν αναμενόμενο. Η αρχική συγκέντρωση του (ΝΗ4)2SO4 που είναι ίση με 4 g/l είναι και η αιτία της παρατηρούμενης συμπεριφοράς. Μια τόσο μεγάλη αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου είναι ασύμφορη και γενικά δυσχεραίνει πολύ την περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας. Μη επιθυμητή ανάπτυξη παρατηρείται και στην καλλιέργεια της κωνικής φιάλη 9 με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 0 g/l, που ξεκίνησε από την καλλιέργεια της κωνικής φιάλης 5 με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 4 g/l. Η συμπεριφορά αυτή δικαιολογείται, καθώς η καλλιέργεια 5 από την οποία ξεκίνησε δεν αναπτύχθηκε επαρκώς, αφού η αρχική συγκέντρωση (ΝΗ4)2SO4 ίση με 4 g/l λειτουργεί ως ανασταλτικός παράγοντας ανάπτυξης μιας καλλιέργειας, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω. Πιθανότατα η αναστολή ανάπτυξης που προκαλεί η αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου των 4 g/l να απαιτεί να δοθεί περισσότερος χρόνος στην καλλιέργεια ώστε να παρατηρηθεί μια υποτυπώδης ανάπτυξη. Γίνεται προσπάθεια επαναπροσέγγισης αυτής της συμπεριφοράς μέσα από το δεύτερο κύκλο πειραμάτων (Πείραμα 2 στις κωνικές φιάλες). 62

78 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Τέλος, η καλλιέργεια της κωνικής φιάλης 10 προφανώς και δεν παρουσίασε την επιθυμητή συμπεριφορά, καθώς βάση πειραματικού σχεδιασμού αποτέλεσε συνέχεια της προβληματικής καλλιέργειας 5. Λόγω της προβληματικής συμπεριφοράς που παρουσίασε η καλλιέργεια της κωνικής φιάλης 5 και κατ επέκταση και η καλλιέργεια 9 που ξεκίνησε από αυτή, δεν ήταν δυνατή η έναρξη των καλλιεργειών 11, 12 και 13 για τη συνέχιση του πειράματος βάση του αρχικού σχεδιασμού. Ένα σημαντικό συμπέρασμα που προκύπτει από τις παραπάνω παρατηρούμενες συμπεριφορές είναι το γεγονός πως οποιουδήποτε είδους μεταβάσεις μιας καλλιέργειας έχουν παρεμποδιστική δράση στην περαιτέρω ανάπτυξή τους. Η συμπεριφορά των καλλιεργειών μετά από τη μετάβασή τους σε νέο περιβάλλον υποδηλώνει τη δυσκολία προσαρμογής του κυτταρικού πληθυσμού στις νέες συνθήκες και δυσχεραίνει την επαναφορά τους σε προηγούμενο στάδιο ανάπτυξης και καθοδήγησή τους προς συγκεκριμένα μεταβολικά μονοπάτια, ιδιαίτερα όταν σημειώνεται αρκετά μεγάλος χρόνος παραμονής σε μια επόμενη φάση ανάπτυξης. Η παρεμποδιστική αυτή δράση των μεταβάσεων επηρεάζει αρνητικά κατ επέκταση και την προσπάθεια βελτιστοποίησης και περαιτέρω κλιμάκωσης της ανάπτυξης καλλιεργειών σε βιοαντιδραστήρες, ιδιαίτερα στην περίπτωση της συνεχούς λειτουργίας ενός βιοαντιδραστήρα που απαιτεί συνεχείς εναλλαγές των συνθηκών ανάπτυξης της καλλιέργειας Πείραμα 2 Στα Σχήματα 5.3 και 5.4 που ακολουθούν φαίνεται η πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών ως προς την οπτική τους πυκνότητα. 63

79 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Οπτική πυκνότητα στις καλλιέργειες 4 και Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) κωνική φιάλη 4 κωνική φιάλη 8 κωνική φιάλη Οπτική πυκνότητα στην καλλιέργεια 3 Σχήμα 5.3. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 3, 4, 5, 8, 9, 10-Πείραμα 2 σε κωνικές φιάλες. 45 Οπτική πυκνότητα στις καλλιέργειες 4 και κωνική φιάλη 5 κωνική φιάλη 9 κωνική φιάλη Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.4. Χρονική εξέλιξη της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών 5, 9, 10-Πείραμα 2 σε κωνικές φιάλες. 64

80 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Κατά την επανάληψη του προηγούμενου πειράματος (Πείραμα 2 στις κωνικές φιάλες) παρατηρείται ότι η πορεία ανάπτυξης ως προς την καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 3 είναι παρόμοια με τη διαφορά ότι στο Πείραμα 2 εμφανίζει μικρότερες τιμές η οπτική πυκνότητα. Η καλλιέργεια της κωνικής φιάλης 4 παρουσιάζει ταχύτερη πορεία ανάπτυξης στο Πείραμα 2 δίνοντας πολύ μεγαλύτερες τιμές οπτικής πυκνότητας. Επιπλέον, συγκριτικά με την ανάπτυξη της καλλιέργειας 4 στο Πείραμα 1, στο εν λόγω πείραμα αφού φτάσει στη μέγιστη τιμή η οπτική πυκνότητα (51.6) στη συνέχεια δεν παρουσιάζει σημαντική πτωτική πορεία, αλλά μειώνεται ελάχιστα και διακυμαίνεται γύρω από μία σταθερή τιμή. Η συμπεριφορά της καλλιέργειας 4, όπως εμφανίζεται στο Πείραμα 2, πιθανότατα να είναι και ορθότερη-πιο κοντά στην αναμενόμενη, καθώς αποτελεί ένδειξη ότι ο κυτταρικός πληθυσμός συνεχίζει να διαιρείται και να πολλαπλασιάζεται, παρουσιάζοντας μια αρκετά έντονη αυξητική πορεία ανάπτυξης, μέχρι το σημείο εκείνο όπου εμφανίζει και τη μέγιστη O.D. και στη συνέχεια αφού έχει καταναλωθεί μεγάλο μέρος της πηγής αζώτου και βρίσκεται υπό συνθήκες περιορισμού του αζώτου ευνοείται κυρίως η συσσώρευση του βιοπολυμερούς, PHB, που έχει παραχθεί. Η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας 5 είναι παρόμοια στα δύο πειράματα, με τη διαφορά ότι στο Πείραμα 1 σημειώνονται ελαφρώς μεγαλύτερες τιμές οπτικής πυκνότητας. Μάλιστα και στις δύο περιπτώσεις η μέγιστη πυκνότητα της σημειώνεται στον ίδιο χρόνο, στις 20 ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η καλλιέργεια 8 επίσης σημειώνει παρόμοια πορεία ανάπτυξης της οπτικής πυκνότητας στα δύο πειράματα, με τη διαφορά ότι στο Πείραμα 1 έχει ελαφρώς χαμηλότερες τιμές οπτικής πυκνότητας συγκριτικά με το Πείραμα 2. Επιπλέον, είναι αναμενόμενο στο Πείραμα 2 να καθυστερήσει να εμφανίσει τη μέγιστη τιμή της οπτικής πυκνότητας και γενικότερα να καθυστερήσει χρονικά η ανάπτυξη της δεδομένου ότι προκαλλιέργεια του 2ου σταδίου έμεινε για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα στη στατική φάση. Η διαφορά της συμπεριφοράς των κυττάρων που έχουν παραμείνει για κάποιο χρονικό διάστημα στη στατική φάση και στη συνέχεια μεταβαίνουν σε ένα νέο περιβάλλον με φρέσκο μέσο ανάπτυξης και αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 2 g/l συγκριτικά με την περίπτωση όπου δεν έχουν μεταβεί στη στατική φάση (καλλιέργεια 4) παρατηρείται πιο ξεκάθαρα στο Πείραμα 2. Πιο 65

81 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων συγκεκριμένα στην καλλιέργεια 8 παρατηρείται αύξηση της οπτικής πυκνότητας ως τη μέγιστη τιμή και έπειτα ακολουθεί μια πτωτική πορεία ενώ στην καλλιέργεια 4, όπου ο κυτταρικός πληθυσμός της 2 ης φάσης προκαλλιέργειας δεν έχει περάσει σε στατική φάση και μεταβαίνουν σε όμοιο περιβάλλον ανάπτυξης, παρατηρείται αύξηση της O.D. ως τη μέγιστη τιμή της η οποία στη συνέχεια παραμένει σχεδόν σταθερή. Όσο αφορά την καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 9, λαμβάνοντας υπόψη τη διαφοροποίηση κατά την οποία δεν ξεκίνησε με συγκέντρωση 0 g/l (NH4)2SO4, αλλά με 0.8 g/l, υπήρξε περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας, και πάλι όχι όμως στο βαθμό που ήταν επιθυμητό. Μάλιστα, αυτή η αύξηση της οπτικής πυκνότητας, που υποδηλώνει την ανάπτυξη της καλλιέργειας 9, παρατηρείται εφόσον η καλλιέργεια παρέμεινε για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα μέσα στον επωαστήρα. Δηλαδή, η χρονική ανταπόκριση της καλλιέργειας είναι πιο αργή. Οπότε απαιτείται περισσότερος χρόνος ώστε να παρατηρηθεί κάποια ανάπτυξη στην καλλιέργεια 9. Εφόσον η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας 5 από την οποία ξεκίνησε η καλλιέργεια 9 εμφανίζεται παρόμοια και στα δύο πειράματα, είναι αναμενόμενο και το ίδιο να συμβαίνει και για την καλλιέργεια 9. Στο Πείραμα 1 που παρατηρήθηκε στασιμότητα στην καλλιέργεια 9 έγινε η υπόθεση ότι πιθανόν τα κύτταρα αντιμετώπισαν δυσκολία στο να ανταποκριθούν και να προσαρμοστούν στο νέο περιβάλλον στέρησης πηγής αζώτου (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 0 g/l). Οπότε, δεν παρουσίασαν ούτε μεγάλη αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού, όπως ήταν αναμενόμενο λόγω ανανέωσης της πηγής άνθρακα, αλλά ούτε και συσσώρευση PHB λόγω της στέρησης πηγής αζώτου. Η ίδια συμπεριφορά όμως επαναλαμβάνεται και στο Πείραμα 2 (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 0.8 g/l). Επομένως, προκύπτει το συμπέρασμα πως η παραπάνω συμπεριφορά πιθανότατα να οφείλεται σε διάφορους ανασταλτικούς παράγοντες, όπως ουσίες που έχουν παραχθεί από το μεταβολισμό των κυττάρων, στη φυσιολογία των κυττάρων, στη φυγοκέντριση ή στη μεταφορά τους. Το συμπέρασμα επομένως που προκύπτει από τα Πειράματα 1 και 2 είναι η παρεμποδιστική δράση που ασκούν οι μεταβάσεις μιας καλλιέργειας σε νέο περιβάλλον στην περαιτέρω ανάπτυξή της. Η προσαρμογή των βακτηριακών κυττάρων σε νέες συνθήκες είναι προβληματική και δύσκολη μετά τη μετάβασή τους σε περιβάλλον διαφορετικό από αυτό που 66

82 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων είχαν συνηθίσει να μεγαλώνουν (π.χ. μεταβολή συγκέντρωσης πηγής αζώτου). Όπως αναφέρθηκε και στα αποτελέσματα του Πειράματος 1, η συμπεριφορά των καλλιεργειών μετά από τη μετάβασή τους σε νέο περιβάλλον υποδηλώνει τη δυσκολία προσαρμογής του κυτταρικού πληθυσμού στις νέες συνθήκες ανάπτυξης και δυσχεραίνει την επαναφορά τους σε προηγούμενο στάδιο ανάπτυξης ιδιαίτερα μετά από αρκετά μεγάλο χρόνο παραμονής σε μια επόμενη φάση ανάπτυξης Πείραμα 3 Στo Σχήμα 5.5 που ακολουθεί φαίνεται η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου 1 g/l ΣυγκέντρωσηDCW, PHBκαι Υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) DCW (g/l) PHB (g/l) Residual Biomass (g/l) % PHB content % περιεχόμενο PHB Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) 0 Σχήμα 5.5 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας στις κωνικές φιάλες (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 1 g/l)- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες. Παρόμοια πορεία ανάπτυξης εμφανίζει και η καλλιέργεια με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 2 g/l. Όσον αφορά την πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών με αρχική συγκέντρωση (ΝΗ4)2SO4 ίση με 3 και 4 g/l, η συσσώρευση του πολυμερούς παρουσιάζει μια 67

83 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων πτωτική πορεία ενώ η συγκέντρωση DCW, PHB και της υπολειπόμενης βιομάζας αυξάνονται. Ενδεικτικά δίνεται το ακόλουθο διάγραμμα. Συγκέντρωση DCW, PHB και υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) DCW (g/l) PHB (g/l) Residual Biomass (g/l) %PHB content % περιεχόμενο PHB Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.6 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας στις κωνικές φιάλες (αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 4 g/l)- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες. 68

84 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Οπτική πυκνότητα Καλλιέργεια 1 Καλλιέργεια 2 Καλλιέργεια 3 Καλλιέργεια Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.7. Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης των καλλιεργειών ως προς την οπτική πυκνότητα- Πείραμα 3 σε κωνικές φιάλες. Από το Σχήμα 5.7 για τις καλλιέργειες με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου 1 και 2 g/l αντίστοιχα, παρατηρείται μια παρόμοια αυξητική πορεία της οπτικής πυκνότητας με την καλλιέργεια 1 να σημειώνει ελαφρώς μεγαλύτερες τιμές της O.D. για τις ίδιες χρονικές στιγμές. Μετά την αραίωση και την προσθήκη του φρέσκου μέσου ανάπτυξης AL1 (στις 15 ώρες από την έναρξη των καλλιεργειών), σημειώνεται μια αναμενόμενη σημαντική ελάττωση της οπτικής πυκνότητας, η οποία στη συνέχεια παρουσιάζει ξανά αυξητική πορεία. Η απότομη αυτή μείωση της O.D. οφείλεται στο γεγονός ότι μετά την αραίωση ο ίδιος αριθμός κυττάρων βρίσκεται σε μεγαλύτερο όγκο μέσου ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η συγκέντρωση (g/l) του πολυμερούς και της υπολειπόμενης βιομάζας σημειώνει αύξηση και στις δύο καλλιέργειες. Η καλλιέργεια με αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου ίση με 3 g/l (Σχήμα 5.7) ακολουθεί την ίδια πορεία αύξησης της O.D. με τις καλλιέργειες 1 και 2, παρουσιάζοντας όμως μια χρονική καθυστέρηση. Αξιοσημείωτο είναι ότι τη χρονική στιγμή πριν την αραίωση της καλλιέργειας η % κ.β. σύσταση του PHB ήταν μεγαλύτερη συγκριτικά με την αντίστοιχη στις καλλιέργειες 1 και 2, αν και η αρχική συγκέντρωση του (NH4)2SO4 στην καλλιέργεια 3 είναι μεγαλύτερη από τις 1 69

85 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων και 2. Ακόμη, οι τιμές που σημειώνουν οι συγκεντρώσεις (g/l) πολυμερούς και υπολειπόμενης βιομάζας είναι μικρότερες. Η καλλιέργεια που ξεκινά με συγκέντρωση (NH4)2SO4 4 g/l παρουσιάζει πολύ αργή πορεία ανάπτυξης (Σχήμα 5.7) συγκριτικά με τις υπόλοιπες καλλιέργειες. Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η συγκέντρωση πηγής αζώτου στην καλλιέργεια πάνω από 3 g/l έχει έντονα παρεμποδιστική και ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη της καλλιέργειας κι επομένως δεν ενδείκνυται η πολιτική αυτή για αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου. Το συμπέρασμα αυτό έχει επιβεβαιωθεί και στα Πειράματα 1 & 2. Η αύξηση της οπτικής πυκνότητας των καλλιεργειών οφείλεται σε δύο παράγοντες: στην κυτταρική αύξηση και στη συσσώρευση πολυμερούς. Η παρουσία αζώτου είναι εκείνη που επάγει την ανάπτυξη των κυτταρικών δομών και κατ επέκταση την κυτταρική διαίρεση. Από την άλλη πλευρά, όσο μικρότερη είναι η αρχική συγκέντρωση του (NH4)2SO4, τόσο περισσότερο επάγεται η παραγωγή πολυμερούς και η συσσώρευσή του στο κυτταρόπλασμα των βακτηριακών κυττάρων. Επομένως, στις κωνικές φιάλες 1 και 2 όπου η αρχική συγκέντρωση της πηγής αζώτου είναι 1 και 2 g/l αντίστοιχα, δικαιολογούνται οι υψηλότερες τιμές οπτικής πυκνότητας που παρατηρούνται συγκριτικά με αυτές των κωνικών φιαλών 3 και 4 όπου η αρχική συγκέντρωση της πηγής αζώτου είναι μεγαλύτερη, 3 και 4 g/l αντίστοιχα, καθώς μετά από τον περιορισμό της πηγής αζώτου συσσωρεύεται μεγαλύτερο ποσοστό πολυμερούς. Ακόμη, η γρηγορότερη αύξηση της οπτικής πυκνότητας που παρουσιάζει η καλλιέργεια 2 σε σχέση με την 1 είναι αναμενόμενη εφόσον η 2 ξεκινά με αρχική συγκέντρωση αζώτου ίση με 2 g/l, που είναι αρκετή για να επάγει την κυτταρική αύξηση, αλλά και ταυτόχρονα περιορισμένη ώστε να ευνοείται η συσσώρευση του πολυμερούς PHB. Η αραίωση των καλλιεργειών, στο κατάλληλο στάδιο ανάπτυξης, με την προσθήκη 50 ml μέσου ανάπτυξης AL1 και 200 ml αποστειρωμένου νερού γίνεται ώστε να μελετηθεί ο τρόπος που ανταποκρίνεται η καλλιέργεια, η αντίδραση της κατά τη μετάβασή της σε μια κατάσταση όπου έχει προστεθεί νέο φρέσκο μέσο ανάπτυξης AL1, όπου ο ίδιος κυτταρικός πληθυσμός βρίσκεται σε περιβάλλον περιορισμού της πηγής αζώτου, σε συνθήκες όμως περίσσειας πηγής άνθρακα. 70

86 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Επιπροσθέτως, για τις καλλιέργειες με αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 1 και 2 g/l ο ρυθμός κατανάλωσης πηγής αζώτου είναι ο ίδιος, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.1 που ακολουθεί. Ενώ για συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από 2 g/l (3 και 4 g/l), η κατανάλωση του (NH4)2SO4 ξεκινά πιο αργά χρονικά. Και πιο συγκεκριμένα για την καλλιέργεια 3 η συγκέντρωση της πηγής αζώτου παρουσιάζει σημαντική πτώση στις 20.5 ώρες μετά την έναρξη της καλλιέργειας ενώ στο αντίστοιχο χρονικό διάστημα για τις καλλιέργειες 1 και 2 έχει καταναλωθεί σχεδόν όλη η ποσότητα του (NH4)2SO4. Επομένως, η υψηλή αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου έχει παρεμποδιστική δράση στην ανάπτυξη της καλλιέργειας, που προφανώς οφείλεται στην αλλαγή του ρυθμού κατανάλωσης του (NH4)2SO4. Πίνακας 5.1. Συγκέντρωση της πηγής αζώτου στις καλλιέργειες 1, 2, 3, 4 (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4 (g/l)- Καλλιέργεια 1 Συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4 (g/l)- Καλλιέργεια 2 Συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4 (g/l)- Καλλιέργεια 3 Συγκέντρωση (NH 4) 2SO 4 (g/l)- Καλλιέργεια Στoυς Πίνακες 5.2 και 5.3 που ακολουθούν δίνονται τα αποτελέσματα από την πορεία ανάπτυξης των καλλιεργειών στις κωνικές φιάλες 2Α και 2Β. 71

87 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Πίνακας 5.2. Χρονική εξέλιξη της καλλιέργειας 2Α (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Οπτική πυκνότητα DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) % περιεχόμενο PHB Πίνακας 5.3. Χρονική εξέλιξη της καλλιέργειας 2Β (Πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος Οπτική DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη % καλλιέργειας (h) πυκνότητα βιομάζα (g/l) περιεχόμενο PHB Στον Πίνακα 5.2 φαίνεται η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας 2 μετά την έναρξη της κωνικής φιάλης 2Α, δηλαδή μετά την προσθήκη νέας πηγής άνθρακα και νέας πηγής αζώτου. Σημειώνονται, αύξηση της οπτικής πυκνότητας, αύξηση της συγκέντρωσης του πολυμερούς και της υπολειπόμενης βιομάζας. Η ανοδική πορεία της υπολειπόμενης βιομάζας οφείλεται στην προσθήκη της πηγής αζώτου και κατ επέκταση στη δημιουργία κυτταρικών δομών και στην κυτταρική αύξηση. Επιπλέον, αξίζει να σημειωθεί ότι ενώ η συγκέντρωση του PHB παρουσιάζει 72

88 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων αύξηση, το ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές ελαττώνεται. Αυτό συμβαίνει διότι ο αριθμός των κυττάρων αυξάνεται, αλλά δεν έχουν όλα τα κύτταρα συσσωρευμένο πολυμερές. Κάποια από αυτά είναι γεμάτα και κάποια άδεια. Οι καλλιέργειες 2A και 2Β προέρχονται από την ίδια κύρια καλλιέργεια που ξεκίνησε με αρχική συγκέντρωση (NH4)2SO4 ίση με 2 g/l. Κατά την έναρξη της καλλιέργειας 2A, τα κύτταρα που βρίσκονται σε στάδιο ανάπτυξης κατά το οποίο περιέχουν περίπου 60 % κ.β. σύσταση PHB τοποθετούνται σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει νέα πηγή άνθρακα και νέα πηγή αζώτου. Επιπλέον, είναι απαλλαγμένα από τοξικούς παράγοντες που πιθανόν να δρούσαν ανασταλτικά στην ανάπτυξή τους, εφόσον έχουν υποστεί φυγοκέντριση. Για την έναρξη της κωνικής φιάλης 2Β έγινε προσθήκη νέου μέσου ανάπτυξης το οποίο επίσης περιείχε πηγές άνθρακα και αζώτου. Η διαφορά τους έγκειται στο γεγονός ότι η καλλιέργεια 2Β ξεκίνησε με μεγαλύτερη χρονική καθυστέρηση συγκριτικά με τη καλλιέργεια 2A. Έτσι ο κυτταρικός πληθυσμός που χρησιμοποιήθηκε για τον εμβολιασμό της (από την καλλιέργεια 2) αναμένονταν ότι θα είχε μεγαλύτερη συσσώρευση πολυμερούς. Είναι σημαντικό να αναφερθεί όμως ότι το χρονικό εκείνο σημείο όπου η καλλιέργεια στην κωνική φιάλη 2 είχε φτάσει σε ανάπτυξη με % κ.β. σύσταση PHB, όπου έπρεπε να γίνει και η έναρξη της καλλιέργειας 2Β βάσει πειραματικού σχεδιασμού, ήταν κατά τη διάρκεια της νύχτας, όταν δεν πραγματοποιούνταν μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας. Οπότε η έναρξη της κωνικής φιάλης 2Β δεν έγινε την κατάλληλη χρονική στιγμή. Κατά τη διάρκεια της νύχτας η συσσώρευση πολυμερούς αυξήθηκε. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αφού κατανάλωσαν την πηγή αζώτου σε μεγάλο ποσοστό, άρχισαν να καταναλώνουν το συσσωρευμένο πολυμερές ώστε να αναπτύσσουν κυτταρικές δομές. Το παραπάνω φαινόμενο θα επαληθευόταν από την αύξηση της υπολειπόμενης βιομάζας. Όμως μετά από 12 ώρες που μεσολάβησαν παρατηρείται μικρή ελάττωση της υπολειπόμενης βιομάζας (από g/l σε g/l), οπότε η υπόθεση της κατανάλωσης πολυμερούς για την κυτταρική ανάπτυξη δεν είναι εμφανής σε υπολειπόμενη βιομάζα. Επιπλέον, από κάποια δείγματα ελήφθησαν φωτογραφίες με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για την παρατήρηση των βακτηριακών κυττάρων. Η λήψη των φωτογραφιών έγινε για δείγματα 73

89 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων που ελήφθησαν από τις κωνικές φιάλες την ίδια χρονική στιγμή, ώστε να είναι όσο το δυνατόν περισσότερο ακριβής η σύγκριση της φυσιολογίας των κυττάρων μεταξύ των δειγμάτων. Στη συνέχεια, σχολιάζονται οι φωτογραφίες που ελήφθησαν από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης της καλλιέργειας. Σχήμα 5.8.Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 1, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες. Παρατηρείται αυξημένο μέγεθος των βακτηριακών κυττάρων που μοιάζουν να έχουν διογκωθεί λόγω του συσσωρευμένου PHB. Το βακτηριακό κύτταρο που επισημαίνεται με βελάκι στο Σχήμα 5.8 παρουσιάζει την επιθυμητή μορφολογία για ένα κύτταρο αφού προηγηθεί το στάδιο ανάπτυξης κατά το οποίο ευνοείται η συσσώρευση πολυμερούς. Οι μαύρες κηλίδες που είναι διακριτές μέσα στα βακτηριακά κύτταρα αποτελούν τους κόκκους του συσσωρευμένου πολυμερούς. 74

90 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Σχήμα 5.9. Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 2, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες. Στο Σχήμα 5.9 παρατηρείται ότι εκτός από τη συσσώρευση πολυμερούς ευνοείται και η κυτταρική αύξηση. Τα βακτηριακά κύτταρα είναι περισσότερα σε αριθμό και μοιάζουν να είναι επίσης διογκωμένα λόγω του συσσωρευμένου πολυμερούς. 75

91 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Σχήμα Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 3, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες. Στο Σχήμα 5.10 υπάρχουν πολλά μικρά σε μέγεθος βακτηριακά κύτταρα τα οποία όμως δεν περιέχουν PHB. Ενώ λοιπόν έχει ευνοηθεί η κυτταρική αύξηση στη συγκεκριμένη καλλιέργεια λόγω της μεγάλης αρχικής συγκέντρωσης πηγής αζώτου, 3 g/l, δεν συνέβη το ίδιο και με τη συσσώρευση του πολυμερούς. 76

92 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Σχήμα Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου των κυττάρων της καλλιέργειας 4, 18.5 ώρες από την έναρξή της-πείραμα 3 στις κωνικές φιάλες. Τα βακτηριακά κύτταρα που απεικονίζονται στο Σχήμα 5.11 είναι μικρά σε μέγεθος και άδεια από πολυμερές. Επιπλέον, δεν παρατηρείται σημαντική αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού. Οι παρατηρήσεις αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα πως η αρχική συγκέντρωση των 4 g/l (NH4)2SO4, δεν είναι επαρκής ούτε για να προάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, αλλά προφανώς ούτε και τη συσσώρευση αζώτου, όπως αναλύθηκε και παραπάνω βάσει πειραματικών αποτελεσμάτων. Το συμπέρασμα που προκύπτει από την παραπάνω ανάλυση είναι ότι η έναρξη μιας καλλιέργειας με υψηλή αρχική συγκέντρωση πηγής αζώτου δεν είναι αποτελεσματική λόγω της παρεμποδιστικής δράσης που ασκεί η παρουσία (NH4)2SO4 σε υψηλές συγκεντρώσεις στην κυτταρική ανάπτυξη. Οι συγκεντρώσεις 1 και 2 g/l της πηγής αζώτου είναι οι πλέον αποδοτικές με τη συγκέντρωση των 2 g/l να επιλέγεται ως η πιο βέλτιστη. 77

93 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Πείραμα 4 Μετά την ανάλυση των δειγμάτων, προέκυψαν τα αποτελέσματα των μετρήσεων που φαίνονται στους πίνακες που ακολουθούν. Πίνακας 5.4. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 2 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από αποικία σε τριβλίο Petri (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Οπτική πυκνότητα DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) % περιεχόμενο PHB Αραίωση Αλλαγή φιάλης 2l->1l

94 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Πίνακας 5.5. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 2 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από freeze dried stock (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Οπτική πυκνότητα DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) % περιεχόμενο PHB Αραίωση Αλλαγή φιάλης 2l->1l Πίνακας 5.6. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 3 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από αποικία σε τριβλίο Petri (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Οπτική πυκνότητα DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) % περιεχόμενο PHB Αραίωση

95 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Πίνακας 5.7. Χρονική εξέλιξη καλλιέργειας με αρχική συγκέντρωση 3 g/l πηγής αζώτου που ξεκίνησε από freeze dried stock (Πείραμα 4 στις κωνικές φιάλες). Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Οπτική πυκνότητα DCW (g/l) PHB (g/l) Υπολειπόμενη βιομάζα (g/l) % περιεχόμενο PHB Αραίωση

96 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Από τους Πίνακες φαίνεται ότι η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας είναι όμοια είτε ξεκινήσει από αποικία σε τριβλίο Petri είτε από freeze dried stock με αρχική συγκέντρωση 2 και 3 g/l αντίστοιχα. Οι τιμές όλων των μεγεθών είναι ελαφρώς αυξημένες στην περίπτωση που η καλλιέργεια ξεκινάει από freeze dried stock στην περίπτωση της καλλιέργειας 2. Οι μικρές αυτές διαφοροποιήσεις μπορούν να θεωρηθούν αμελητέες και να μην ληφθούν υπόψη ώστε να καθορίσουν αν η καλλιέργεια θα ξεκινήσει από μεμονωμένη αποικία ενός plate ή από freeze dried stock υπό την προϋπόθεση όμως ότι και το freeze dried stock, αλλά και το plate είναι υγιή και ενεργά. Για τη συμπεριφορά των καλλιεργειών μετά από τη μετάβασή τους στις κωνικές φιάλες 2Α και 2Β δεν διεξάγεται κάποιο συγκεκριμένο συμπέρασμα, η πορεία ανάπτυξης φαίνεται επίσης να είναι παρόμοια, τα μεγέθη σημειώνουν την ίδια τάξη μεγέθους με πολύ μικρές διαφορές στις τιμές τους. Επιπλέον, χρήζει ιδιαίτερης σημασίας να αναφερθεί ότι με βάση αποτελέσματα πειραμάτων που δεν παρατίθενται εδώ, η διάρκεια ζωής μιας καλλιέργειας μέσα σε ένα τριβλίο Petri είναι ίση με 40 ημέρες περίπου σε συνθήκες συντήρησης ψυγείου. Μετά από το πέρας αυτού του χρονικού διαστήματος οι αποικίες των βακτηριακών κυττάρων είναι ανενεργές, κάποιες έχουν περάσει και στη φάση θανάτωσης με αποτέλεσμα αν ξεκινήσουν από αυτές κύριες καλλιέργειες είναι πιθανό όχι μόνο να σημειώσουν μεγάλη χρονική καθυστέρηση στην ανάπτυξη τους, αλλά και να μην παρουσιάσουν την επιθυμητή ανάπτυξη. 5.2 Αποτελέσματα πειραμάτων στην κλίμακα του βιοαντιδραστήρα Πείραμα 1 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Στο Σχήμα 5.12 που ακολουθεί φαίνεται η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας. Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, το διαλυμένο οξυγόνο ρυθμίζεται στο 20 % από την έναρξη λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα και η τροφοδοσία ατμοσφαιρικού αέρα στα 0.2 l/min. Η τροφοδοσία της καλλιέργειας με πηγή άνθρακα και αζώτου (μέσο AL2 και (ΝΗ4)2SO4) ξεκινά στις 15 h ανάπτυξης της καλλιέργειας και είναι αντίστοιχα 4 και 0.4 g/h. 81

97 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Το δυναμικό προφίλ των συγκεντρώσεων PHB, υπολειπόμενης βιομάζας και DCW (συνολική βιομάζα) (g/l) παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.12 ακολούθως. Η ανάπτυξη της DCW, της υπολειπόμενης βιομάζας και του PHB παρουσιάζει μια συνεχή ανοδική πορεία. Η συμπεριφορά όμως της υπολειπόμενης βιομάζας έρχεται σε αντιπαράθεση με την αναμενόμενη κατά την οποία η ανάπτυξη της θα έπρεπε να πραγματοποιείται με χαμηλό ρυθμό μόνο κατά τις πρώτες ώρες της καλλιέργειας, όταν και η τιμή της συγκέντρωσης της πηγής αζώτου είναι επαρκής. Από τη στιγμή που η τελευταία εξαντλείται, η υπολειπόμενη βιομάζα θα έπρεπε να παραμένει σταθερή και τα κύτταρα να ρυθμίζουν το μεταβολισμό τους αποκλειστικά προς τη συνεχή σύνθεση βιοπολυμερούς. Η δυναμική απόκριση της συσσώρευσης του πολυμερούς σε όρους ποσοστιαίου περιεχομένου παρουσιάζεται στο Σχήμα Το μέγιστο ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB σημειώνεται στις 8.75 h ανάπτυξης και ανέρχεται στο 51.5 % g PHB ανά g DCW. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα 26 οι τιμές της ποσοστιαίας κ.β. σύστασης πολυμερούς παρουσιάζουν μία διακύμανση γύρω από μία μέση τιμή γύρω στο 50 % και δεν αποκλίνουν πολύ μεταξύ τους. Η πορεία αυτή δεν δικαιολογείται, καθώς και η μέγιστη συσσώρευση PHB είναι μικρή συγκριτικά με αυτή που έχει παρατηρηθεί σε αντίστοιχα πειράματα στο παρελθόν, αλλά και με τον περιορισμό της πηγής αζώτου, το οποίο όπως φαίνεται από το Σχήμα 5.13 καταναλώνεται από τον κυτταρικό πληθυσμό, είναι αναμενόμενη μια αυξημένη συσσώρευση πολυμερούς. 82

98 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Οπτική πυκνότητα,συγκέντρωσηdcw, PHB και Υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) O.D. DCW (g/l) PHB (g/l) Res.biomass (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.12 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και (NH4)2SO4)-Πείραμα 1. % περιεχόμενο PHB ανά g DCW % PHB 0.05 Συγκέντρωση θειικού αμμωνίου (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Συγκέντρωση πηγής αζώτου (g/l) Σχήμα 5.13 Το δυναμικό προφίλ του ποσοστιαίου περιεχόμενου PHB κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας και η καταναλισκόμενη συγκέντρωση πηγής αζώτου (g/l)-πείραμα 1. 83

99 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Η παραπάνω μη δικαιολογημένη συμπεριφορά δείχνει πως πιθανόν να μην έχουν επιτευχθεί οι κατάλληλες συνθήκες που αυξάνουν το ρυθμό συσσώρευσης πολυμερούς και ελαττώνουν το ρυθμό αύξησης του κυτταρικού πληθυσμού και τη σύνθεση της υπολειπόμενης βιομάζας που ουσιαστικά περιλαμβάνει τις υπόλοιπες δομικές μονάδες των κυττάρων. Επομένως, στην πορεία θα γίνει μια προσπάθεια δημιουργίας των περιοριστικών συνθηκών σε συνδυασμό με την τροποποίηση κι άλλων λειτουργικών παραμέτρων του συστήματος ώστε να καθοδηγηθεί ο κυτταρικός πληθυσμός προς τη συσσώρευση PHB Πείραμα 2 - τροφοδοσία AL2 και μηδενικής πηγής αζώτου Οι πειραματικές συνθήκες του πειράματος αυτού ήταν όμοιες με του προηγούμενου με τη διαφορά ότι δεν υπήρξε τροφοδοσία επιπλέον πηγής αζώτου, ώστε να ενισχυθεί ο περιορισμός της πηγής αζώτου και η τροφοδοσία του μέσου AL2 ξεκίνησε αργότερα. Παρόλα αυτά το εν λόγω πείραμα δεν οδήγησε σε επιθυμητά αποτελέσματα. Είναι σημαντικό στο σημείο αυτό να θιγεί το ζήτημα της επίδρασης που έχει η προϊστορία ανάπτυξης του μικροοργανισμού στο στάδιο της προκαλλιέργειας αλλά ακόμη και προγενέστερα κατά την ανάπτυξη των βακτηριακών αποικιών στο Petri-dish, στην περαιτέρω ανάπτυξη της καλλιέργειας σε εργαστηριακό αλλά και κατ επέκταση σε βιομηχανικό επίπεδο. Στο συγκεκριμένο πείραμα παρατηρήθηκε μεγάλη φάση καθυστέρησης στο πρώτο στάδιο προκαλλιέργειας οπότε ακόμη και μετά το πέρας τον 16 h παρατηρήθηκαν ίνες μέσα στην προκαλλιέργεια που αποδεικνύει την μη επαρκή ανάπτυξή της για την έναρξη του δευτέρου σταδίου. Αυτό που συνέβη ήταν ότι ο μικροοργανισμός δεν είχε «ωριμάσει», δεν είχε αναπτύξει επαρκώς το γονιδίωμά του και κατ επέκταση ούτε και τα απαραίτητα ένζυμα με αποτέλεσμα όταν έγινε η μετάβαση από το «πλούσιο» μέσο NB στο «φτωχότερο» μέσο AL2 να παρατηρηθεί πολύ μεγάλη καθυστέρηση και τελικά δεν κατάφερε να αναπτυχθεί η κύρια καλλιέργεια μέσα στο βιοαντιδραστήρα. Το γεγονός ότι ένας κυτταρικός πληθυσμός που δεν έχει αναπτυχθεί επαρκώς μεταβαίνει σε ένα άλλο μέσο ανάπτυξης φτωχότερο σημαίνει ότι όχι μόνο θα καθυστερήσει η ανάπτυξή του, καθώς ούτως ή άλλως απαιτείται ένα χρονικό διάστημα προσαρμογής στο νέο περιβάλλον, αλλά είναι πιθανόν ο μικροοργανισμός να αρχίζει να καταναλώνει περισσότερα συστατικά από το σύνηθες για να καλύψει το κενό της ανεπαρκούς δομικής ανάπτυξής του. 84

100 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Η συμπεριφορά αυτή μπορεί να οφείλεται σε δύο λόγους: είτε η ποσότητα των κυττάρων που ελήφθησε από μεμονωμένη αποικία του Petri-dish ήταν ανεπαρκής ή ανενεργή είτε το freeze dried stock από το οποίο παρασκευάστηκε το τριβλίο ήταν ανενεργό. Η συμπεριφορά αυτή του μικροοργανισμού οδήγησε, όπως ήδη αναφέρθηκε, στο σχεδιασμό ενός επιπλέον διερευνητικού πειράματος στις κωνικές φιάλες όπου γίνεται μια προσπάθεια κατανόησης της επίδρασης της προϊστορίας ανάπτυξης του μικροοργανισμού στην περαιτέρω ανάπτυξη της κύριας καλλιέργειας, το οποίο περιγράφεται αναλυτικά στην Παράγραφο Πείραμα 3 - τροφοδοσία AL2 και μηδενικής πηγής αζώτου Όπως έχει ήδη αναφερθεί, κατά την περίοδο ανάπτυξης της καλλιέργειας η τελευταία διέρχεται από κάποια στάδια κατά τα οποία συμβαίνουν παράλληλα η αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού, η συσσώρευση του βιοπολυμερούς PHB, καθώς και η παραγωγή υπολειπόμενης βιομάζας. Ανάλογα όμως με τις συνθήκες και την πολιτική τροφοδοσίας, που εφαρμόζονται κάθε φορά στην καλλιέργεια, ενώ οι παραπάνω διαδικασίες συνεχίζουν να πραγματοποιούνται παράλληλα, υπερτερεί κάποια από αυτές. Το διαλυμένο οξυγόνο (Dissolved Oxygen - D.O.) αποτελεί έναν από τους παράγοντες που επηρεάζει την ανάπτυξη της καλλιέργειας και η προσπάθεια μελέτης της επίδρασής του είναι συστηματικότερη στα πειράματα που ακολουθούν. Όπως προκύπτει από μαθηματικά υπολογιστικά μοντέλα, όταν το D.O. είναι κάτω από 20 % ευνοείται κυρίως η συσσώρευση πολυμερούς. Για D.O. από 50 % και πάνω ευνοείται η κυτταρική αύξηση. Για την περιοχή τιμών 25-45% σε D.O. ευνοείται η αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού με μικρότερο ρυθμό διπλασιασμού ενώ παράλληλα τα κύτταρα συσσωρεύουν PHB. Η διαφορά με τα προηγούμενα πειράματα βιοαντιδραστήρων είναι ότι το αρχικό σήμα αναφοράς στο ρυθμιστή (PI) για το διαλυμένο οξυγόνο είναι ίσο με 50 % ενώ στα προηγούμενα ρυθμιζόταν εξ αρχής στο 20 %. Η αλλαγή του σήματος αναφοράς του διαλυμένου οξυγόνου στην καλλιέργεια από το 50 % στο 20 % πραγματοποιείται στις 14 ώρες και η έναρξη της τροφοδοσίας με AL2 στις 15.5 ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η πολιτική αυτή ρύθμισης του διαλυμένου οξυγόνου στην καλλιέργεια αποσκοπεί στη δημιουργία αρχικά ενός επαρκούς κυτταρικού πληθυσμού και στη μετέπειτα αύξηση του ρυθμού συσσώρευσης 85

101 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων PHB. Μια επιπλέον διαφορά εκτός από το σήμα αναφοράς του D.O. συγκριτικά με το προηγούμενο πείραμα είναι η εφαρμοζόμενη πολιτική τροφοδοσίας του AL2 και η μικρή αύξηση του αερισμού της καλλιέργειας (0.2 -> 0.3 l/min). Ο βιοαντιδραστήρας τροφοδοτείται με 3 g/h πηγής άνθρακα (σακχαρόζη) μέχρι και τις 19.5 ώρες. Στη συνέχεια, στις 20.5 ώρες η τροφοδοσία της πηγής άνθρακα αυξάνεται από τα 3 στα 5 g/h και στις 22.5 ώρες σημειώνεται ξανά αύξηση από τα 5 στα 7 g/h. Η τροφοδοσία διακόπτεται στις 26 ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η ελάχιστα διαφοροποιημένη αυτή πολιτική τροφοδοσίας, κατά την οποία πραγματοποιείται σταδιακή αύξηση του μέσου AL2, έχει σκοπό να εξαλείψει την πιθανότητα κατανάλωσης και μη επάρκειας της πηγής άνθρακα στην καλλιέργεια, παράγοντας στον οποίο θα μπορούσε να οφείλεται η παρατηρούμενη συμπεριφορά ελαττωμένης συσσώρευσης PHB των προηγούμενων πειραμάτων. Ακόμη, η καλλιέργεια στερείται επιπλέον τροφοδοσίας πηγής αζώτου, ώστε να ενισχυθούν οι συνθήκες περιορισμού του αζώτου που επάγουν τη συσσώρευση βιοπολυμερούς. Στο εν λόγω πείραμα αυτό που επιτυγχάνεται με τη ρύθμιση του διαλυμένου οξυγόνου στο 50 % είναι να υφίσταται η καλλιέργεια εξ αρχής σε μία κατάσταση, όπου ευνοείται η αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού της. Δημιουργούνται δηλαδή κύτταρα τα οποία στη συνέχεια είναι ικανά να συσσωρεύσουν πολυμερές. Τέσσερις με έξι ώρες αφού βγει η καλλιέργεια από τη φάση καθυστέρησης είναι επιθυμητή η αλλαγή του σήματος αναφοράς του ρυθμιστή στο 20 %. Στο σημείο αυτό σταματά να ευνοείται η αύξηση του πληθυσμού των βακτηριακών κυττάρων και υπερτερεί η συσσώρευση του PHB. Βέβαια, αυτό δεν συμβαίνει άμεσα, αλλά όπως και σε όλες τις μεταβολές υπάρχει μια μεταβατική περίοδος, που διαφέρει ανάλογα με το είδος της μεταβολής που επιβάλλεται στην καλλιέργεια, κατά την οποία τα κύτταρα προσαρμόζουν τις λειτουργίες τους με βάση τις νέες συνθήκες και το νέο περιβάλλον στο οποίο εκτίθενται. Οι τιμές των μεταβολών, καθώς και τα χρονικά σημεία στα οποία αυτές επιβάλλονται προβλέπονται με βάση μαθηματικά μοντέλα. Το υπολογιστικό μοντέλο, που χρησιμοποιείται εδώ, δεν δίνει ακριβή πληροφορία για τη φάση καθυστέρησης της καλλιέργειας οπότε δεν μπορεί να καθοριστεί επακριβώς το χρονικό σημείο στο οποίο αναμένεται να λήξει η φάση καθυστέρησης ώστε 4-6 ώρες αφού αρχίσει η κυτταρική αύξηση να γίνει η μεταβολή του 86

102 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων σήματος αναφοράς. Στην περίπτωση που η αλλαγή του σήματος αναφοράς γινόταν σε αργότερη χρονική στιγμή, ως αποτέλεσμα θα ήταν η παραγωγή περισσότερης βιομάζας. Το χρονικό σημείο στο οποίο ξεκινά η τροφοδοσία με το μέσο AL2 δηλαδή το σημείο που προσθέτουμε επιπλέον πηγή άνθρακα προκύπτει επίσης από το ίδιο υπολογιστικό μοντέλο. Μία επίσης ιδιαίτερα σημαντική παράμετρος που μελετάται κατά τη διάρκεια των πειραμάτων είναι το ποσοστό των απαερίων (οξυγόνου και διοξειδίου του άνθρακα) που εξέρχονται από τον αντιδραστήρα. Η παρατήρηση των τιμών των συγκεκριμένων αερίων αποτελεί ένα δείκτη φυσιολογικής ή μη εξέλιξης της καλλιέργειας, καθώς και των φαινομένων που λαμβάνουν χώρα σε αυτή. Παρακάτω δίνεται το διάγραμμα του ποσοστού απαερίων O2 και CO2 που εξέρχονται από το βιοαντιδραστήρα συναρτήσει του χρόνου ανάπτυξης της καλλιέργειας για το συγκεκριμένο πείραμα (Σχήμα 5.14). Όσο διαρκεί η φάση καθυστέρησης της καλλιέργειας (lag phase) κατά την οποία δεν υπάρχει κυτταρική αύξηση κι επομένως δεν καταναλώνεται οξυγόνο τα επίπεδα του O2 παραμένουν σταθερά (μέχρι τις 14.5 ώρες από την έναρξη της καλλιέργειας). Όταν τελειώσει η φάση καθυστέρησης και αρχίσει η αύξηση του κυτταρικού πληθυσμού κι επομένως και η κατανάλωση οξυγόνου η περιεκτικότητα σε O2 του αερίου ρεύματος που εξέρχεται από τον αντιδραστήρα ελαττώνεται και στο διάγραμμα παρατηρείται φθίνουσα πορεία (από τις 15.5 μέχρι και τις 23.5 ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας). Επίσης, στη φάση αυτή σημειώνεται ταυτόχρονη αύξηση της αντίστοιχης περιεκτικότητας σε CO2 λόγω της κυτταρικής αναπνοής του αυξανόμενου βακτηριακού πληθυσμού. Η ελάττωση του O2 και η αύξηση του CO2 στην έξοδο του αντιδραστήρα μέχρι και τις 23.5 ώρες επιβεβαιώνει την αύξηση κυτταρικού πληθυσμού, καθώς τα κύτταρα καταναλώνουν O2 και παράγουν CO2 κατά την κυτταρική αναπνοή σε όλη τη διάρκεια κυτταρικής ανάπτυξης και αύξησης. Το τέλος της φάσης καθυστέρησης κι επομένως το σημείο στο οποίο γίνεται η αλλαγή του σήματος αναφοράς του D.O. στο ρυθμιστή PI από 50 % σε 20 %, φαίνεται στο Σχήμα Η αλλαγή αυτή διακρίνεται με την μετάπτωση που παρατηρείται κατά την αλλαγή του σήματος αναφοράς του ρυθμιστή για το διαλυμένο οξυγόνο από το 50 % στο 20 %. 87

103 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων % απαέρια Ο 2 και CO O2 CO2 do % Διαλυμένο οξυγόνο Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.14 Το δυναμικό προφίλ του διαλυμένου οξυγόνου και των % Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)-Πείραμα 3. Ακόμη, είναι ιδιαίτερα σημαντικό να αναφερθεί ότι η ρύθμιση του διαλυμένου οξυγόνου επιτυγχάνεται με την αύξηση ή τη μείωση των στροφών κατά την ανάδευση της καλλιέργειας. Ουσιαστικά η ανάδευση αποτελεί τη ρυθμίζουσα μεταβλητή και το διαλυμένο οξυγόνο τη ρυθμιζόμενη. Παρατηρώντας κανείς τη συμπεριφορά μιας βέλτιστης καλλιέργειας, μπορεί να διακρίνει δύο διαφορετικές περιοχές λειτουργίας, όσον αφορά τη συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου. Στην πρώτη περιοχή, η οποία αντιστοιχεί στο πρώτο στάδιο της καλλιέργειας μέχρι τη στιγμή της τροφοδοσίας, επικρατούν συνθήκες ταχείας κατανάλωσης του οξυγόνου και συνεπώς γρήγορης ελάττωσης του από το μέσο ανάπτυξης. Στην δεύτερη περιοχή, κατά το δεύτερο στάδιο τροφοδοσίας (αποτελεί συνέχεια του προηγούμενου με διαφορετικό D.O.), οι ρυθμοί μεταφοράς και κατανάλωσης οξυγόνου είναι ίσοι και η καλλιέργεια προχωρά με σταθερή τιμή του D.O. (ίση με τη βέλτιστη τιμή, 20 % στην προκειμένη περίπτωση). Το σημείο που διαχωρίζει τα δύο Στάδια της καλλιέργειας είναι εκείνο κατά το οποίο γίνεται η αλλαγή του σήματος αναφοράς. Η απλή στρατηγική τροφοδοσίας/αραίωσης ενός σταδίου εξασφαλίζει την 88

104 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων απαραίτητη περίσσεια συγκέντρωσης σακχαρόζης στο μέσο ανάπτυξης και ταυτόχρονα την εφαρμογή συνθηκών περιορισμού του αζώτου, οι οποίες θεωρητικά επάγουν την ενδοκυττάρια συσσώρευση PHB. Η αναμενόμενη θεωρητικά συμπεριφορά της καλλιέργειας είναι η ακόλουθη. Πριν τη στιγμή της τροφοδοσίας του φρέσκου μέσου ανάπτυξης τα κύτταρα συσσωρεύουν PHB ταυτόχρονα με την ανάπτυξη της υπολειπόμενης βιομάζας, λόγω της επάρκειας του θειικού αμμωνίου. Από τη στιγμή που εξαντλείται η συγκέντρωση της πηγής αζώτου, παύει η σύνθεση νέας υπολειπόμενης βιομάζας και τα κύτταρα αξιοποιούν τη σακχαρόζη κυρίως για τη συσσώρευση νέου βιοπολυμερούς. Παρακάτω στο Σχήμα 5.14 δίνεται το δυναμικό προφίλ της βακτηριακής καλλιέργειας. Οπτική πυκνότητα O.D. DCW (g/l) PHB (g/l) Residual Biomass (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Συγκέντρωση DCW, PHB και Υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) Σχήμα 5.15 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα 3. 89

105 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας αυξάνεται συνεχώς για 22.5 ώρες από την έναρξή της. Από το σημείο εκείνο κι έπειτα παρουσιάζει μια πτωτική πορεία που δικαιολογείται καθώς τα κύτταρα περνούν στη φάση επιβράδυνσης και τελικά στη φάση θανάτωσης. Από το Σχήμα 5.14 είναι φανερή και η φάση καθυστέρησης που πραγματοποιείται στο χρονικό διάστημα ώρες ανάπτυξης όπου ξεκινά και η εκθετική αύξηση των κυττάρων. Η συγκέντρωση πολυμερούς και της υπολειπόμενης βιομάζας παρουσιάζουν μια αυξητική πορεία σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Η ποσότητα του (NH4)2SO4 με το οποίο είχε τροφοδοτηθεί αρχικά ο αντιδραστήρας καταναλώνεται κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας γεγονός που επιβεβαιώνεται και από την μέτρηση του (NH4)2SO4 στα λαμβανόμενα δείγματα, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.8. Δεδομένης και της έλλειψης τροφοδοσίας επιπλέον πηγής αζώτου δεν δικαιολογείται η συνεχής αύξηση της υπολειπόμενης βιομάζας. Παρ όλα αυτά, από το Σχήμα 5.15 είναι φανερό ότι ενώ αρχικά ο ρυθμός παραγωγής PHB και υπολειπόμενης βιομάζας ήταν σχεδόν ίσοι, στις 20.5 ώρες της καλλιέργειας και έπειτα παρατηρείται αύξηση του ρυθμού παραγωγής του πολυμερούς, γεγονός που επίσης καταδεικνύει και την κατανάλωση του θειικού αμμωνίου στην καλλιέργεια, η οποία όπως αναφέρθηκε ευνοεί τη συσσώρευση πολυμερούς και ελαττώνει την παραγωγή υπολειπόμενης βιομάζας. Παρά το γεγονός ότι η τιμή του D.O. είναι στο 20 % και δεδομένης της έλλειψης τροφοδοσίας πηγής αζώτου, παράμετροι που θεωρητικά δημιουργούν στην καλλιέργεια συνθήκες ευνοϊκές για τη συσσώρευση πολυμερούς, δεν παρατηρείται συνεχής αυξητική πορεία στο ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές ανά g DCW. Μεταξύ των 14.5 και 18.5 ωρών παρατηρείται μείωση του ποσοστιαίου πολυμερούς. Από τις 18.5 μέχρι και τις 20.5 ώρες καλλιέργειας σημειώνεται αύξηση του ποσοστιαίου περιεχόμενου πολυμερούς, ενώ στη συνέχεια συνεχίζει να μειώνεται μέχρι τις 23.5 ώρες, όπου εμφανίζει και τη μέγιστη τιμή του 67.7 % g PHB ανά g DCW και στη συνέχεια ελαττώνεται και πάλι. Επιπλέον, με βάση το Σχήμα 5.14 η ανάπτυξη του κυτταρικού πληθυσμού φαίνεται φυσιολογική με βάση τα ποσοστά O2 και CO2 που εξέρχονται ως απαέρια από τον αντιδραστήρα, οπότε ούτε ο αερισμός της καλλιέργειας αποτελεί στην περίπτωση αυτή παράγοντα που θα μπορούσε να δικαιολογήσει αυτή τη συμπεριφορά ανάπτυξης της καλλιέργειας. 90

106 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Πίνακας 5.8. Κατανάλωση πηγής αζώτου και δυναμικό προφίλ % περιεχόμενου PHB ανά g DCW κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα με ημισυνεχείς συνθήκες (συνεχής τροφοδοσία AL2) (Πείραμα 3). Χρόνος καλλιέργειας (hours) Συγκέντρωση πηγής (ΝΗ 4) 2SO 4 (g/l) % περιεχόμενο PHB ανά g DCW Στον εν λόγω πείραμα παρατηρήθηκαν υψηλότερες τιμές συγκέντρωσης PHB και ποσοστού συσσωρευμένου PHB συγκριτικά με το Πείραμα 1, γεγονός που δικαιολογείται λόγω της έλλειψης προσθήκης επιπλέον πηγής αζώτου. Ακόμη, η μη επαναληψιμότητα στις μετρούμενες τιμές μεταξύ των Πειραμάτων και 1 και 3 δικαιολογείται και από το γεγονός πως ενώ η κύρια καλλιέργεια στο βιοαντιδραστήρα ξεκίνησε στο Πείραμα 3 από O.D. περίπου ίσο με 0.2 ενώ στο Πείραμα 1 ίση με Δηλαδή, το σημείο της εκθετικής φάσης ανάπτυξης στο στάδιο του 2 ου σταδίου προκαλλιέργειας είναι διαφορετικό. Πιο συγκεκριμένα στο εν λόγω 91

107 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων πείραμα ο κυτταρικός πληθυσμός είναι μεγαλύτερος. Επομένως, εκτός από τα φαινόμενα μεταφοράς οξυγόνου, η ανάπτυξης της προκαλλιέργειας υπεισέρχεται ως παράγοντας μελέτης που επιδρά στην παρατηρούμενη συμπεριφορά του A.lata. Το γεγονός πως υπεισέρχονται πολλές παράμετροι που επηρεάζουν τη συμπεριφορά του συστήματος, με κύρια τα φαινόμενα μεταφοράς οξυγόνου, καθώς επίσης και την ανάπτυξη του μικροοργανισμού στο στάδιο της προκαλλιέργειας δικαιολογούν τις διαφορετικές συμπεριφορές που εμφανίζει η καλλιέργεια μεταξύ των πειραμάτων Πείραμα 4 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Στο πείραμα αυτό η πολιτική τροφοδοσίας περιλαμβάνει εκτός από το μέσο AL2 και πηγή αζώτου. Η πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας φαίνεται στο Σχήμα Οπτική πυκνότητα O.D. DCW (g/l) PHB (g/l) Residual Biomass (g/l) Συγκέντρωση PHB, DCW και Υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.16 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα 4. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι κατά τη διάρκεια της νύχτας η ρύθμιση του διαλυμένου οξυγόνου είχε απενεργοποιηθεί και η ανάδευση παρέμεινε στις 100 στροφές/λεπτό. Η 92

108 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων ενεργοποίηση έγινε ξανά στις ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η οπτική πυκνότητα της καλλιέργειας αυξάνεται από την έναρξη μέχρι και τις ώρες. Στην επόμενη μέτρηση που έγινε 11 ώρες αργότερα φαίνεται ελάττωση της οπτικής πυκνότητας. Προφανώς στο μεσοδιάστημα η ανάπτυξη της καλλιέργειας άρχισε να φθίνει. Η ξηρή βιομάζα αυξάνεται σε όλη τη διάρκεια του πειράματος. Η έναρξη της τροφοδοσίας πραγματοποιείται στις ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας. Τότε γίνεται και η αλλαγή του σήματος αναφοράς του διαλυμένου οξυγόνου στην καλλιέργεια από το 50 % στο 20 %. Ο βιοαντιδραστήρας τροφοδοτείται με 3 g/h πηγή άνθρακα (σακχαρόζη) και 0.3 g/h πηγή αζώτου, (NH4)2SO4. Πίνακας 5.9. Το ποσοστιαίο περιεχόμενο PHB ανά g DCW κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα με ημισυνεχείς συνθήκες (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4) (Πείραμα 4). Χρόνος καλλιέργειας (hours) % περιεχόμενο PHB ανά g DCW

109 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Όπως φαίνεται και από τον Πίνακα 5.9, το ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές ανά g ξηρής βιομάζας ακολουθεί την παρακάτω πορεία. Μεταξύ των και ωρών παρατηρείται αύξηση του ποσοστιαίου πολυμερούς. Από τις μέχρι και τις ώρες καλλιέργειας παρατηρείται αύξηση του ποσοστιαίου περιεχόμενου πολυμερούς, καθώς η καλλιέργεια καταναλώνει το άζωτο κι επομένως ο περιορισμός πηγής αζώτου ευνοεί τη συσσώρευση πολυμερούς. Από τις ώρες όπου ξεκινά η τροφοδοσία με (NH4)2SO4 το ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές ελαττώνεται μέχρι και τις ώρες. Στο χρονικό διάστημα με ώρες παρουσιάζει αύξηση και στη συνέχεια ελαττώνεται και πάλι. Στις ώρες σημειώνεται αύξηση της τροφοδοσίας σε πηγή άνθρακα και αζώτου στα 4 g/h και 0.4 g/h αντίστοιχα. Κατά τη μετάβαση αυτή το ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές παρουσιάζει μια μικρή αύξηση, στη συνέχεια ελαττώνεται και μετά από 11 ώρες αφού προφανώς έχει καταναλωθεί όλη η πηγή αζώτου, παρουσιάζει μικρή αύξηση. Η μέγιστη τιμή ποσοστιαίου περιεχόμενου πολυμερούς PHB παρατηρείται στις ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας και ανέρχεται στο 68.8 % g PHB ανά g DCW. Η διακύμανση αυτή των τιμών της ποσοστιαίας συσσώρευσης PHB στα βακτηριακά κύτταρα οφείλεται στην πολιτική τροφοδοσίας της πηγής (ΝΗ4)2SO4 κατά την οποία σημειώνονται αυξομειώσεις στο ρυθμό τροφοδοσίας όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.9. Η συγκέντρωση πολυμερούς και της υπολειπόμενης βιομάζας παρουσιάζουν μια αυξητική πορεία σε όλη τη διάρκεια του πειράματος, σύμφωνα με το Σχήμα Η συνεχής αυτή αυξητική πορεία της υπολειπόμενης βιομάζας και το γεγονός πως κάποιες τιμές της συγκέντρωσής της είναι ελαφρώς μεγαλύτερες συγκριτικά με αντίστοιχες της συγκέντρωσης του PHB (g/l) εκδηλώνεται προφανώς διότι ο ρυθμός κατανάλωσης πηγής αζώτου ήταν μεγαλύτερος σε σχέση με το ρυθμό τροφοδοσίας και η καλλιέργεια ήταν επαρκής σε πηγή αζώτου. Επομένως, δεν δημιουργούνται κατάλληλες περιοριστικές συνθήκες μέσα στην καλλιέργεια που ευνοούν τη συσσώρευση πολυμερούς. Η συμπεριφορά αυτή κατά την οποία ο ρυθμός παραγωγής υπολειπόμενης βιομάζας είναι μεγαλύτερο από το ρυθμό συσσώρευσης PHB επαναλαμβάνεται όπως και στο Πείραμα 1, όπου κι εκεί υπήρχε επιπλέον τροφοδοσία της πηγής αζώτου στην καλλιέργεια. 94

110 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων 25 % απαέρια O 2 και CO O2 CO Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.17 Το δυναμικό προφίλ των % απαερίων Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα 4. Όπως φαίνεται από το Σχήμα 5.17, η ελάττωση του ποσοστού O2 και η αύξηση του ποσοστού CO2 στην έξοδο του αντιδραστήρα μέχρι και τις ώρες επιβεβαιώνει την αύξηση κυτταρικού πληθυσμού, καθώς τα κύτταρα καταναλώνουν O2 και παράγουν CO2 κατά την κυτταρική αναπνοή σε όλη τη διάρκεια κυτταρικής ανάπτυξης. Από τις ώρες ανάπτυξης όπου πραγματοποιείται αύξηση της τροφοδοσίας μέχρι και τις ώρες σημειώνεται και αύξηση του ποσοστού O2 και η μείωση του ποσοστού CO2 στην έξοδο του αντιδραστήρα. Φαίνεται δηλαδή ότι η πορεία των αεριών είναι φυσιολογική με βάση την ανάπτυξη της καλλιέργειας οπότε η πρόσβαση του κυτταρικού πληθυσμού στο οξυγόνο που διατίθεται δεν φαίνεται να αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα της συσσώρευσης πολυμερούς. Η συμπεριφορά αυτή του μικροοργανισμού, κατά την οποία δεν φτάνει σε υψηλό ποσοστό συσσώρευσης πολυμερούς κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας, δικαιολογείται καθώς ο ρυθμός τροφοδοσίας πηγής αζώτου στα κύτταρα του A.lata δεν επιτρέπει την κατανάλωσή του κι επομένως τη δημιουργία κατάλληλων συνθηκών περιορισμού του που θα ευνοούσαν τη συσσώρευση βιοπολυμερούς. Η μέγιστη ποσοστιαία συσσώρευση του PHB ανέρχεται στο 95

111 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων % και σημειώνεται στις ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας (Πίνακας 5.9), πριν την έναρξη τροφοδοσίας της πηγής αζώτου. Παρακάτω στα Σχήματα 5.18 και 5.19 δίνονται ενδεικτικά κάποιες φωτογραφίες της καλλιέργειας σε διαφορετικές χρονικές στιγμές ανάπτυξής της που ελήφθησαν με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Σχήμα 5.18 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου του κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα 4. 96

112 Κεφάλαιο 5ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Σχήμα 5.19 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)- Πείραμα 4. Από τις παραπάνω φωτογραφίες γίνεται αντιληπτό ότι ενώ ο κυτταρικός πληθυσμός αυξάνεται τα κύτταρα δε συσσωρεύουν πολυμερές. Το κύτταρο που έχει επισημανθεί με βελάκι αντιπροσωπεύει την επιθυμητή μορφή κυττάρου σε μέγεθος και σε συσσώρευση PHB Πείραμα Πείραμα 5 και Πείραμα 6 - τροφοδοσία AL2 και πηγής αζώτου Ομοίως με το προηγούμενο πείραμα, διεξάγεται μια προσπάθεια μελέτης της συμπεριφοράς ανάπτυξης της καλλιέργειας του A.lata σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας με την εφαρμογή παρόμοιων συνθηκών και με διαφοροποιημένο το προφίλ τροφοδοσίας της πηγής άνθρακα και αζώτου (μέσο AL2 και (NH4)2SO4. Για το Πείραμα 5, η έναρξη της τροφοδοσίας γίνεται στις 12 h ανάπτυξης της καλλιέργειας. Επίσης, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι στις 21 ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας έγινε προσθήκη 150 ml μέσου AL2 που δεν περιείχε πηγή 97

113 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων αζώτου. Παρακάτω δίνονται ενδεικτικά τα διαγράμματα του Πειράματος 5 στα οποία απεικονίζεται το δυναμικό προφίλ των λειτουργικών παραμέτρων που μελετώνται κατά την πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας, καθώς επίσης και το δυναμικό προφίλ τροφοδοσίας πηγής σακχαρόζης (μέσο AL2) και πηγής αζώτου (διάλυμα (ΝΗ4)2SO4) αντίστοιχα. Ανάδευση rpm Ανάδευση D.O. Θερμοκρασία ph Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) % Διαλυμένο οξυγόνο, ΘερμοκρασΊα (οc), ph Σχήμα 5.20 Το δυναμικό προφίλ των λειτουργικών παραμέτρων του συστήματος που μελετώνται κατά την πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα 5. Σύμφωνα με το Σχήμα 5.20 το ph και η θερμοκρασία της καλλιέργειας διατηρούνται σταθερά ενώ η τιμή του διαλυμένου οξυγόνου ρυθμίζεται με τη βοήθεια της ανάδευσης. Είναι φανερό ότι αρχικά ο υπάρχει αύξηση του αριθμού των στροφών του αναδευτήρα ώστε το διαλυμένο οξυγόνο να φτάσει από το 0 στο 50 %. Στη συνέχεια, κατά την αλλαγή του σήματος αναφοράς του D.O. από το 50 στο 20 % στις 11 περίπου ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας, ο αριθμός των στροφών ελαττώνεται. 98

114 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων % Σακχαρόζη και Θειικό αμμώνιο Θειικό αμμώνιο Σακχαρόζη Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.21 Το δυναμικό προφίλ τροφοδοσίας σακχαρόζης και θειικού αμμωνίου της βακτηριακής καλλιέργειας του υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2 και πηγής (ΝΗ4)2SO4)-Πείραμα 5. Όσον αφορά την πορεία η ανάπτυξης της καλλιέργειας, είναι παρόμοια με αυτή των προηγούμενων πειραμάτων στα οποία εφαρμόστηκε πολιτική τροφοδοσίας επιπλέον πηγής αζώτου. Πιο συγκεκριμένα, για το Πείραμα 5 το μεγαλύτερο ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές είναι 65.2 % g PHB ανά g DCW κι επιτεύχθηκε στις 19 h ανάπτυξης. Για το Πείραμα 6 το μεγαλύτερο ποσοστιαίο περιεχόμενο πολυμερές είναι 59.6 % g PHB ανά g DCW κι επιτεύχθηκε στις 17 h ανάπτυξης. Στο σημείο αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό να αναφερθεί ότι καταστρώθηκαν ισοζύγια μάζας για τον άνθρακα ώστε να βρεθεί η ποσότητα της σακχαρόζης και του θειικού αμμωνίου που συσσωρεύεται στον όγκο της βακτηριακής καλλιέργειας. Για την κατάστρωση των ισοζυγίων λήφθηκε υπόψη ότι άνθρακας περιέχεται στο συσσωρευμένο PHB, στην υπολειπόμενη βιομάζα και στο CO2 που παράγεται λόγω της κυτταρικής αναπνοής. Το φαινόμενο κατά το οποίο ενώ η πηγή αζώτου καταναλώνεται η υπολειπόμενη βιομάζα συνεχίζει να αυξάνεται και τα κύτταρα δεν χρησιμοποιούν την παρεχόμενη πηγή άνθρακα για 99

115 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων να συσσωρεύσουν πολυμερές εξακολουθεί να παρατηρείται. Βέβαια ο ρυθμός κατανάλωσης της πηγής αζώτου ή ο ρυθμός κατανάλωσης της πηγής άνθρακα είναι σημεία στα οποία πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή ώστε να βρεθεί ο λόγος αυτής της συμπεριφοράς Πείραμα 7 και Πείραμα 8 - τροφοδοσία AL2 Το πειράματα που ακολουθούν αποτελούν τα δύο τελευταία που πραγματοποιήθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. Όπως και στα προηγούμενα πειράματα, τα βακτήρια αρχικά καλλιεργούνται υπό batch συνθήκες με τις βέλτιστες αρχικές συνθήκες ανάπτυξης: συγκέντρωση σακχαρόζης 20 g/l, (C/N)=10 g/g, (C/P)=1.9 g/g και D.O. που μεταβάλλεται κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας. Ο αρχικός όγκος της καλλιέργειας είναι 1.3 l του μέσου ανάπτυξης AL2. Η παροχή του αέρα μεταβάλλεται από το χρήστη, ανάλογα με τις ανάγκες της καλλιέργειας. Η τροφοδοσία του μέσου ανάπτυξης AL2 ξεκινά την 13 η ώρα της καλλιέργειας. Τα σημαντικότερα μεγέθη του συστήματος παρακολουθούνται δυναμικά και στα Σχήματα που ακολουθούν φαίνεται το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας. Οπτική πυκνότητα, Συγκέντρωση DCW, PHB και Υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) DCW (g/l) O.D. PHB (g/l) Residual Biomass (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.22 Το δυναμικό προφίλ ανάπτυξης της καλλιέργειας σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας (g/l) κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2) - Πείραμα

116 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Η πορεία ανάπτυξης σε όρους οπτικής πυκνότητας και συγκεντρώσεων DCW, PHB και υπολειπόμενης βιομάζας προσομοιάζει αυτές των προηγούμενων πειραμάτων. Το μέγιστο ποσοστό περιεχόμενου πολυμερούς είναι % και σημειώνεται στις ώρες ανάπτυξης της καλλιέργειας δηλαδή σχετικά στην αρχή. Η πορεία που ακολουθεί είναι συνεχείς αυξομειώσεις και μια διακύμανση γύρω από μία σταθερή τιμή όπως επίσης παρατηρήθηκε στα προηγούμενα πειράματα. % απαέρια Ο 2 και CO Ο2 CO2 D.O Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) % Διαλυμένο οξυγόνο Σχήμα 5.23 Το δυναμικό προφίλ του διαλυμένου οξυγόνου και των % Ο2 και CO2, κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα 8. Από το Σχήμα 5.23 φαίνεται ότι το δυναμικό προφίλ της καλλιέργειας όσον αφορά τον αερισμό της είναι φυσιολογικό. Δηλαδή, καθώς η καλλιέργεια αναπτύσσεται το ποσοστό του οξυγόνου που εξέρχεται από τον αντιδραστήρα ελαττώνεται ενώ αυτό του διοξειδίου του άνθρακα αυξάνεται που οφείλεται στην κυτταρική αναπνοή ενός συνεχώς αυξανόμενου κυτταρικού πληθυσμού. Το διαλυμένο οξυγόνο στην καλλιέργεια, αρχικά ρυθμίζεται σε πολύ υψηλότερη τιμή από την επιθυμητή ώστε να αυξηθούν οι στροφές του αναδευτήρα και να διαλύσει μέχρι 101

117 Κεφάλαιο 5 ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων να φτάσει στο 50 % και στη συνέχεια γίνεται η αλλαγή του σήματος αναφοράς στο 20 % όπου και παραμένει σχεδόν σταθερό. Παρατηρούνται κάποιες διακυμάνσεις οι οποίες πιθανόν να οφείλονται στο θόρυβο των οργάνων, αλλά και στο χρονικό διάστημα που απαιτεί ο ρυθμιστής ώστε να ανταποκριθεί στην κάθε μεταβολή. Ακόμη, είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι η αύξηση του αερισμού της καλλιέργειας οδηγεί και σε αύξηση του διοξειδίου του άνθρακα που συσσωρεύεται πάνω από την υγρή καλλιέργεια, καθώς επίσης και σε αύξηση της διαλυτότητα του μέσα στην υγρή καλλιέργεια λόγω της κυτταρικής αναπνοής. Η αυξημένη ποσότητα CO2 μπορεί να αποτελέσει παράγοντα τοξικότητας για τα βακτηριακά κύτταρα. Επομένως, απαιτείται η συνεχής παρακολούθηση του αερισμού που αποτελεί μία από τις κυριότερες παραμέτρους που μελετώνται για τη χαρτογράφηση του προφίλ λειτουργίας του A.lata, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Στο Σχήμα 5.24 που ακολουθεί διακρίνεται η δυναμική μεταβολή των κυριότερων λειτουργικών παραμέτρων, του διαλυμένου οξυγόνου (do2), της θερμοκρασίας, του ph, καθώς και της τροφοδοσίας της πηγής σακχαρόζης (μέσο AL2), όπως παρακολουθείται καθ όλη την πορεία ανάπτυξης της καλλιέργειας. Η θερμοκρασία και το ph διατηρούνται σταθερά στις επιθυμητές τιμές που αποτελούν και τις βέλτιστες για την ανάπτυξης των καλλιεργειών του A.lata. 102

118 Κεφάλαιο 5ο do Θερμοκρασία 140 ph Τροφοδοσία AL % τροφοδοσία AL2 % Διαλυμένο οξυγόνο, θερμοκρασία (OC), ph Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.24 Η δυναμική μεταβολή των λειτουργικών παραμέτρων και της τροφοδοσίας της πηγής σακχαρόζης κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στο βιοαντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα Συγκέντρωση σακχαρόζης (g/l) θεωρητική Συγκέντρωση σακχαρόζης (g/l) πειραματική 35 O.D Οπτική πυκνότητα Συγκέντρωση σακχαρόζης (g/l) Χρόνος καλλιέργειας (ώρες) Σχήμα 5.25 Το δυναμικό προφίλ της οπτικής πυκνότητας και της συγκέντρωσης σακχαρόζης (g/l), κατά την ανάπτυξη της καλλιέργειας υπό ημισυνεχείς συνθήκες στον αντιδραστήρα (συνεχής τροφοδοσία AL2)- Πείραμα

119 Κεφάλαιο 5ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Όπως προκύπτει από το Σχήμα 5.25, οι πειραματικές μετρήσεις της συγκέντρωσης σακχαρόζης που έγιναν στα λαμβανόμενα δείγματα όπως υποδεικνύει το πρωτόκολλο δεν αποκλίνουν πολύ από τις θεωρητικά υπολογιζόμενες τιμές με βάση τα ισοζύγια μάζας. Επιπλέον, δεν παρατηρείται έλλειψη της πηγής άνθρακα κατά τη διάρκεια ανάπτυξης της καλλιέργειας το οποίο θα αποτελούσε παράγοντα αναχαίτησης της φυσιολογικής ανάπτυξης των βακτηριακών κυττάρων και θα αποτελούσε εμπόδιο των μεταβολικών τους διεργασιών και συνεπώς και της συσσώρευσης πολυμερούς. Στην περίπτωση αυτή, αν η καλλιέργεια στερούταν θρεπτικών συστατικών τα κύτταρα θα οδηγούνταν στην κατανάλωση του ήδη συσσωρευμένου πολυμερούς για τη συντήρησή τους. Η ύπαρξη όμως επαρκούς σακχαρόζης στην καλλιέργεια του A.lata αποκλείει την περίπτωση ελλιπούς τροφοδοσίας θρεπτικών συστατικών ως ανασταλτικό παράγοντα ανάπτυξης στην προκειμένη περίπτωση. Σχήμα 5.26 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα

120 Κεφάλαιο 5ο Παράθεση και σχολιασμός των πειραματικών αποτελεσμάτων Σχήμα 5.27 Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου κυτταρικού πληθυσμού στις ώρες ανάπτυξής του από την έναρξη της καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα ημισυνεχούς λειτουργίας (συνεχής τροφοδοσία AL2) Πείραμα 8. Από τα Σχήματα 5.26 και 5.27 είναι διακριτό ότι τα βακτηριακά κύτταρα έχουν συσσωρεύσει PHB. Το σχήμα των κυττάρων όμως είναι σφαιρικό και όχι πιο μακρόστενο, όπως επισημαίνεται στο Σχήμα 5.8 που προσεγγίζει την επιθυμητή φυσιολογία των κυττάρων του A.lata, όπως έχει παρατηρηθεί στο παρελθόν. Τα θέματα στερεοχημείας που υπεισέρχονται με βάση την παραπάνω παρατήρηση αποτελούν έναν πιθανό παράγοντα που επηρεάζει τη συμπεριφορά και το προφίλ λειτουργίας του πολυπαραμετρικού αυτού συστήματος. 5.3 Αποτελέσματα πειράματος για τη μελέτη της επίδρασης της ανομοιογένειας του κυτταρικού πληθυσμού του σταδίου προκαλλιέργειας στην περαιτέρω ανάπτυξη του A.lata Στο Σχήμα 5.28 που ακολουθεί δίνονται τα αποτελέσματα των μετρήσεων του πειράματος που αφορούσε τη μελέτη της επίδρασης της προϊστορίας ανάπτυξης του μικροοργανισμού A.lata από το στάδιο της προκαλλιέργειας στην περαιτέρω ανάπτυξή του στην κύρια καλλιέργεια και στην παραγωγή PHB. 105