ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ»

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» Διευθύντρια: Καθηγήτρια Ισιδώρα Παπασιδέρη ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της επαγωγής της έκφρασης μεταλλοπρωτεϊνασών του ιστού κατά τη λοίμωξη από Ελικοβακτήριο του πυλωρού» Στρωμελυσίνη 1 και επαγωγή του φαινομένου Επιθηλιακής προς Μεσεγχυματική Μετατροπή (Epithelial to Mesenchymal Transition-EMT) ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Κόλλια Παναγούλα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Ανθρώπου, ΕΚΠΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ Σγούρας Διονύσιος, Κύριος Ερευνητής, Εργαστήριο Ιατρικής Μικροβιολογίας, ΕΙΠ ΑΘΗΝΑ 2017

2 ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΠΑΙΔΕΙΑΣ, EΡΕΥΝΑΣ ΚΑΙ ΘΡΗΣΚΕΥΜΑΤΩΝ ΓΕΝΙΚΗ ΓΡΑΜΜΑΤΕΙΑ ΕΡΕΥΝΑΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΠΟΣ ΔΙΕΞΑΓΩΓΗΣ ΤΗΣ ΕΡΕΥΝΑΣ Εργαστήριο Ιατρικής Μικροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟΥ Δρ Σγούρας Διονύσιος 2

3 3

4 ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» Διευθύντρια: Καθηγήτρια Ισιδώρα Παπασιδέρη ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Μελέτη της επαγωγής της έκφρασης μεταλλοπρωτεϊνασών του ιστού κατά τη λοίμωξη από Ελικοβακτήριο του πυλωρού» Στρωμελυσίνη 1 και επαγωγή του φαινομένου Επιθηλιακής προς Μεσεγχυματική Μετατροπή (Epithelial to Mesenchymal Transition-EMT) ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΑΜ: ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Κόλλια Παναγούλα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Ανθρώπου, ΕΚΠΑ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΟΣ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ Σγούρας Διονύσιος, Κύριος Ερευνητής, Εργαστήριο Ιατρική Μικροβιολογίας, ΕΙΠ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Κόλλια Παναγούλα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Ανθρώπου, ΕΚΠΑ Αλεπόρου Βασιλική, Καθηγήτρια Βιοχημικής και Μοριακής Γενετικής, ΕΚΠΑ Σγούρας Διονύσιος, Κύριος Ερευνητής, Εργαστήριο Ιατρική Μικροβιολογίας, ΕΙΠ 4

5 5

6 Ευχαριστίες Με την ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας σηματοδοτείται η περάτωση του μεταπτυχιακού κύκλου σπουδών μου στο πρόγραμμα ειδίκευσης με τίτλο «Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική», υπό τη διεύθυνση της Καθηγήτριας Ισιδώρας Παπασιδέρη. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες σε όσους συνέβαλαν, άμεσα ή έμμεσα, στην ολοκλήρωση αυτής της διπλωματικής εργασίας. Αρχικά, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στις Καθηγήτριες Ισιδώρα Παπασιδέρη και Βασιλική Αλεπόρου, καθώς και στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παναγούλα Κόλλια οι οποίες μου έδωσαν την ευκαιρία να παρακολουθήσω το παρόν μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών αλλά και για την προσπάθεια την οποία κατέβαλλαν για την οργάνωση και ομαλή διεξαγωγή του. Στην οργάνωση του προγράμματος συνέβαλλε σε μεγάλο βαθμό η Γραμματέας Δήμητρα Αναγνωστοπούλου, την οποία και ευχαριστώ θερμά. Ειδικότερα, σημειώνω τη θετική στάση και το προσωπικό ενδιαφέρον, τόσο των καθηγητών όσο και της γραμματείας, απέναντι σε όλους τους φοιτητές, αναφορικά με την πορεία των σπουδών μας και την επιλογή διπλωματικής εργασίας. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη Δ.Ε.Π., τα οποία, με την ενεργό συμμετοχή τους καθ όλη τη διάρκεια του μεταπτυχιακού μάς μετέφεραν τις πολύτιμες γνώσεις τους. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον επιβλέποντα της παρούσας εργασίας Κύριο Ερευνητή του Εργαστηρίου Ιατρικής Μικροβιολογίας Δρ Διονύσιο Σγούρα για τη συνεχή καθοδήγηση, εμπιστοσύνη και κατανόηση που επέδειξε απέναντί μου ως επιστήμονας και ως άνθρωπος. Σημαντική ήταν επίσης η συμβολή του Διευθυντή των Εργαστηρίων Δημόσιας Υγείας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ, Δρ Ανδρέα Μεντή, τον οποίο ευχαριστώ για τη φιλοξενία και τις πολύτιμες παρεμβάσεις του. Το προσωπικό του εργαστηρίου συνέβαλε σε συνολικό επίπεδο στη δημιουργία φιλικού κλίματος και συνεργασίας. Ειδικότερα, ευχαριστώ θερμά τη Δρ Beatriz Martinez-Gonzalez για την αμέριστη υποστήριξη και διαρκή πειραματική παρότρυνση, όπως επίσης τη Δρ Άντα Βούλγαρη-Κόκοτα για την πολύτιμη επιστημονική καθοδήγηση και υπομονή της. Επιπλέον, ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτορα Ιωάννα Σουγλέρη για τις παρεμβάσεις της και κυρίως για το ερευνητικό της έργο, το οποίο αποτελεί υπόβαθρο της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Στο σημείο αυτό θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την παθολογοανατόμο της κλινικής του νοσοκομείου «Metropolitan» κ. Καλλιόπη Πετράκη και τους συνεργάτες της, οι οποίοι πραγματοποίησαν την ιστοπαθολογική αξιολόγηση των γαστρικών ιστοτεμαχίων. 6

7 Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τον Αχιλλέα Ελευθεριάδη και το Λευτέρη Κοντιζά για την άριστη συνεργασία και ιδιαίτερα τη φιλία τους. Επιπλέον, ευχαριστώ τους Αντώνη Καλλιαρόπουλο, Δρ Θάνο Κοσσυβάκη, Δρ Ελίνα Χορευτή, Δρ Βάσω Πόγκα και Δρ Μαίρη Εμμανουήλ, για τις εύστοχες υποδείξεις και τη θετική τους στάση. Οφείλω επίσης ένα μεγάλο ευχαριστώ στους φίλους μου, οι οποίοι με στήριξαν ουσιαστικά, τόσο σε ευχάριστες όσο και σε δύσκολες στιγμές. Κλείνοντας, το μεγαλύτερο ευχαριστώ, το οποίο δεν εκφράζεται με λόγια, οφείλω στην οικογένειά μου και ειδικότερα στους γονείς και την αδερφή μου. 7

8 Περιεχόμενα Συντμήσεις Περίληψη Abstract Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά στοιχεία Γενικά στοιχεία για το Ελικοβακτήριο του πυλωρού (H. pylori) Ιστορική αναδρομή Ταξινόμηση Φυλογένεση Μορφολογία Απαιτήσεις ανάπτυξης Εξέλιξη και επιδημιολογία Επιπολασμός και γεωγραφική κατανομή Μετάδοση Βιολογία της μόλυνσης Εξουδετέρωση του ph Μετάβαση στο βλεννογόνο Εδραίωση του αποικισμού Στρατολόγηση του Ανοσοποιητικού Συστήματος Γενετική ποικιλομορφία και διαφοροποίηση του H. pylori Κλινική εικόνα Χρόνια γαστρίτιδα Ιστοπαθολογία Διάγνωση και θεραπεία Παράγοντες παθογένειας Παράγοντες παθογένειας του H. pylori Το νησίδιο cagpai και ο παράγοντας παθογένειας CagA Το νησίδιο παθογένειας cag και η μεταφορά της πεπτιδογλυκάνης Κυτταροτοξική πρωτεΐνη VacA Πρόσθετοι παράγοντες παθογένειας Παράγοντες του ξενιστή που καθορίζουν την λοίμωξη του H. pylori MMPs Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Χαρακτηριστικά των MMPs

9 Μεταλλοπρωτεϊνάσες εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs) Δομή των MMPs Κατηγοριοποίηση των MMPs Ρύθμιση της δραστηριότητας των MMPs MMPs και καρκίνος Eπιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (Epithelial to mesenchymal transition- EMT) Αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση MMP Λοίμωξη από H. pylori και MMPs Σκοπός της παρούσας εργασίας Β. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χειρισμός βακτηριακών στελεχών H. pylori Καλλιέργεια στελεχών H. pylori Ταυτοποίηση H. pylori με τη δοκιμασία της ουρεάσης Κρυο-συντήρηση στελεχών H. pylori Απομόνωση H. pylori από γαστρικό ιστό Απομόνωση γονιδιακού DNA H. pylori από στερεή καλλιέργεια Ανίχνευση κλωνικής σχέσης στελεχών με RAPD PCR Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης Χειρισμός ευκαρυωτικής κυτταρική σειράς AGS Καλλιέργειες κυττάρων Υπολογισμός αριθμού κυττάρων Ανίχνευση ενδεχόμενης μόλυνσης από Mycoplasma Κρυο-συντήρηση ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών Μόλυνση κυττάρων AGS με H. pylori Απομόνωση υπερκειμένου καλλιέργειας για τον προσδιορισμό IL Προσδιορισμός φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης In vivo πειράματα μόλυνσης Στελέχη H. pylori που χρησιμοποιήθηκαν Διαμόλυνση ποντικών Προσδιορισμός επιπέδων έκφρασης με χρήση ποσοτικής αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-qPCR) Απομόνωση ολικού mrna από γαστρικό ιστό ποντικών Σύνθεση cdna από RNA, μέσω αντίστροφης μεταγραφής

10 4.3. Ποσοτική αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qpcr) για τον προσδιορισμο της μεταγραφικής δραστηριότητας της MMP-3 στο γαστρικό ιστό Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός έναντι εκκρινόμενης IL Επιβεβαίωση H. pylori μόλυνσης με ανοσοενζυμικό προσδιορισμός IgG αντισωμάτων στον ορό Ιστολογική χρώση και ανοσοϊστoχημεία Ιστολογική χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης Ανοσοϊστοχημεία Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πειραματική λοίμωξη H. pylori σε ποντίκια Περιγραφή των ομάδων ζώων Επιβεβαίωση H. pylori-λοίμωξης στις ομάδες μελέτης ποντικών Επιβεβαίωση κλωνικής σχέσης H. pylori στελεχών προ και μετά την επιτυχή εγκαθίδρυση της μόλυνσης στα ποντίκια Μελέτη της ικανότητας in vitro επαγωγής φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης In vitro μελέτη επαγωγής IL Μεταγραφική έκφραση MMP3 γαστρικού ιστού μολυσμένων με H. pylori ποντικών Ιστολογική εξέταση γαστρικού ιστού μολυσμένων με H. pylori ποντικών Ιστοπαθολογία γαστρικού ιστού Έκφραση MMP-3 και MMP-9 στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με H. pylori Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

11 11

12 Συντμήσεις ABL Abelson tyrosine-protein kinase 1 AKT RAC-alpha serine/threonine-protein kinase AP-1 Early response transcription factor Activating Protein-1 BabA Blood group antigen-binding adhesin BHIB Brain Heart Infusion Broth CagA Cytotoxin-associated gene A cagpai cag Pathogenicity Island (Νησίδιο Παθογένειας) CM CagA multimerization motifs CSK C-terminal Src kinase c-src cytoplasmic proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src DMSO Dimethyl sulfoxide dupa duodenal ulcer promoting gene ECM Extracellular matrix EGFR Epidermal growth factor receptor EMT Epithelial to mesenchymal transition FAM 6-carboxyfluorescein-fluorophore FBS Fetal bovine serum FN Fibronectin (Φιμπρονεκτίνη) Fu Furin GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GSK3β Glycogen synthase kinase-3 beta Hop Helicobacter outer membrane porin family Hp1 Ομάδα ποντικών μολυσμένων με το H. pylori στέλεχος HPARE Hp2 Ομάδα ποντικών μολυσμένων με το H. pylori στέλεχος HPARE CagAknockout Hp3 Ομάδα ποντικών μολυσμένων με το H. pylori στέλεχος SS1 PgdA Peptidoglycan deacetylase icea1 induced by contact with epithelium IL-8 Interleukin 8 LAMP1 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 LPS Lipopolysaccharide (Λιποπολυσακχαρίτης) PAR1/MARK Partitioning defective gene 1/Microtubule affinity-regulating kinase MGB Minor groove binder-quencher MMP Matrix metalloproteinases MT-MMP Membrane-type Matrix metalloproteinases NFAT Nuclear factor of activated T-cells NF-κΒ Nuclear Factor κ Β NOD-1 Nucleotide binding oligomerization domain containing protein-1 OipA Outer inflammatory protein OMV Outer-membrane vesicles PaCS particle-rich cytoplasmic structures PBS Phosphate Buffer Saline PEA3 Polyomavirus enhancer activator 3 homolog 12

13 PG Proteoglycan PgdA Peptidoglycan-N-acetylglucosamine deacetylase A PPI Proton pump inhibitor Pre Αμινο-τελικό πεπτίδιο σηματοδότησης MMPs Pro Πρόδρομο πεπτίδιο MMPs Rab7 Ras-related protein Rab-7a RAPD PCR Random Amplification Polymorphic DNA PCR RGD Arginylglycylaspartic acid ROS Reactive oxygen species (Δραστικές ρίζες οξυγόνου) RPMI Roswell Park Memorial Institute SabA Sialic acid-binding adhesin SHP-2 SRC homology 2 (SH2)-domain-containing protein tyrosine phosphatase 2 SNAI1 Zinc finger protein SNAI1 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 T4SS Type 4 Secretion System (Σύστημα Μεταφοράς τύπου 4) Tissue inhibitors of metalloproteinases (Ιστικοί αναστολείς TIMP μεταλλοπρωτεϊνασών) TlpB Methyl-accepting chemotaxis protein TLR Toll-like receptor TTC Tetrazolium chloride Un Ομάδα αμόλυντων ποντικών UNG Uracil-N-glycosylase VacA Vacuolating cytotoxin A Wnt Wingless-related integration site 13

14 Περίληψη Το Helicobacter pylori αποτελεί την κύρια αιτία γαστρίτιδας και πεπτικού έλκους ενώ ο μείζων παράγοντας παθογένειας CagA αυξάνει τον κίνδυνο ανάπτυξης γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Η H. pylori μόλυνση έχει προταθεί ότι εμπλέκεται στην αυξο-ρύθμιση διαφόρων μεταλλοπρωτεϊνασών εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs), μια ομάδα πρωτεολυτικών ενζύμων ικανών για αποδόμηση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου, κατά τη διάρκεια χρόνιας γαστρικής φλεγμονής. Προηγούμενα δεδομένα του εργαστηρίου υποδεικνύουν πως η CagA ενδεχομένως εμπλέκεται στην επαγωγή Επιθηλιακής προς Μεσεγχυματική Μετατροπή (EMT) μέσω της αυξορύθμισης της MMP-3 έκφρασης σε γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα μολυσμένα με H. pylori. Με σκοπό την επέκταση αυτών των παρατηρήσεων σε ένα in vivo πρότυπο, έλαβε χώρα μόλυνση C57BL/6 ποντικών, διάρκειας 6 και 9 μηνών, με τη χρήση 3 διαφορετικών στελεχών H. pylori, συμπεριλαμβανομένης και μιας ομάδας ελέγχου. Οι ομάδες, ανάλογα με το H. pylori στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε, ήταν οι εξής: Hp1: HPARE (CagA-θετικό στέλεχος, n=20), Hp2: CagA-knockout HPARE μετάλλαγμα (n=20) Hp3: SS1 στέλεχος αναφοράς (CagA θετικό, cagpai-ανενεργό => ανενεργό σύστημα μεταφοράς τύπου IV: T4SS, n=20) καθώς και η ομάδα ελέγχου αμόλυντων ποντικών (n=18). Η H. pylori μόλυνση στους 6 και 9 μήνες επιβεβαιώθηκε και στις 3 ομάδες μελέτης μέσω ανίχνευσης IgG αντισωμάτων. Στους 6 μήνες η ομάδα Hp1 παρουσίασε την υψηλότερη επαγωγή IgG, υποδηλώνοντας μια ανοσιακή απόκριση εξαρτώμενη από την έκφραση και ενδοκυτταρική μεταφορά της CagA. Ακολούθως, στους 9 μήνες, τόσο η ομάδα Hp1 όσο και η Hp3 εμφάνισαν αντίστοιχα υψηλή επαγωγή αντισωμάτων IgG, γεγονός το οποίο προτείνει ότι η λειτουργία του TIVSS δεν αποτελεί προϋπόθεση για τη συμμετοχή της CagA στην ανοσιακή απόκριση. Επιπλέον, σύγκριση του αρχικού στελέχους HPARE, με αυτό που απομονώθηκε 9 μήνες πέραν της μόλυνσης δεν παρουσίασε αλλαγές στη λειτουργικότητα της CagA, αναφορικά με την ικανότητα της πρωτεΐνης για επαγωγή φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης. Με τη χρήση RT-qPCR έγινε προσδιορισμός των επιπέδων mrna της MMP-3 από γαστρικούς ιστούς, 6 και 9 μήνες μετά τη μόλυνση. Στους 6 μήνες εμφανίστηκε στατιστικά σημαντική αυξορύθμιση της MMP-3 σε όλες τις μολυσμένες ομάδες συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου ενώ στους 9 μήνες, οι Hp1 και Hp3 παρουσίασαν υψηλότερα επίπεδα έναντι της Hp2, υποδηλώνοντας μια CagA εξαρτώμενη απόκριση. Επιπροσθέτως, η H. pylori-επαγόμενη γαστρίτιδα επιβεβαιώθηκε με ιστολογική χρώση ηωσίνης-αιματοξυλίνης ενώ παράλληλα έλαβε χώρα δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας για τον προσδιορισμό της πρωτεϊνικής έκφρασης της MMP-3. Δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα 14

15 επίπεδα έκφρασης ανάμεσα στις ομάδες μελέτης ενώ στους 9 μήνες η MMP-3 εμφανίστηκαν ελαφρώς αυξημένα. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν μια συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της CagA-ενός παράγοντα παθογένειας του H. pylori και της επαγωγής MMP-3 από τα κύτταρα του ξενιστή. Δεδομένου ότι η MMP-3 συμμετέχει στη διαδικασία της EMT, η οποία λαμβάνει χώρα και υπό συνθήκες κακοήθειας, ενισχύεται η σύνδεση της CagA με την διαδικασία της κυτταρικής εξαλλαγής. ΘΕΜΑΤΙΚΟ ΠΕΔΙΟ: Βακτηριακή παθογένεια ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Helicobacter pylori, CagA, MMPs, MMP-3 15

16 Abstract Helicobacter pylori consists the main causative agent of gastritis and peptic ulceration while the major pathogenic determinant of CagA increases the risk of gastric adenocarcinoma development. H. pylori infection has been implicated in the upregulation of various matrix metalloproteinases (MMPs), a group of proteolytic enzymes capable of degrading components of the extracellular matrix, during chronic gastric inflammation. Previous data from our lab indicate that CagA may be implicated in the induction of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT) through upregulation of MMP-3 expression in gastric epithelial cells infected with H. pylori. In order to further evaluate these observations in an in vivo model of infection, C57BL/6 mice were infected for 6 and 9 months, utilizing 3 different strains of H. pylori, including a control group. Mice groups, depending on the H. pylori strain used, were designated as follows: Hp1: HPARE (CagA-positive strain, n=20), Hp2: CagA-knockout HPARE isogenic mutant (n=20), Hp3: SS1 reference strain (CagA positive, cagpai-defective => defective type 4 secretion system: T4SS, n=20) and also the control group of uninfected mice (n=18). H. pylori infection at 6 and 9 months was confirmed in all 3 study groups through the detection of IgG antibodies. At 6 months Hp1 group presented the highest IgG induction, suggesting a CagA expression and translocation-dependent immune response. Following 9 months post infection, both Hp1 and Hp3 groups induced comparable levels of IgG antibodies, suggesting that TIVSS functionality may not consist a preresquisite for CagA implication in immune response. Furthermore, comparison of the infecting HPARE strain with the corresponding isolate 9 months post infection revealed no changes in CagA functionality, regarding the protein s ability to induce an elongation and scattering phenotype. MMP-3 mrna levels were extracted from murine gastric tissues, 6 and 9 months post infection and quantified through RT-qPCR. At 6 months post infection MMP-3 was statistically upregulated in all study groups comparing to the control group while at 9 months post infection, both Hp1 and Hp3 showed elevated levels compared to Hp2, implicating a CagA-dependent response. Moreover, H. pylori-induced gastritis was confirmed in all study groups using histological hematoxylin and eosin staining while MMP-3 protein expression was evaluated by immunohistochemistry. No differences were observed in expression levels among the study groups while at 9 months MMP-3 staining levels appeared slightly elevated. 16

17 Afforementioned results suggest a correlation between CagA-expression that is a pathogenic determinant of H. pylori and the induction of MMP-3 by host s cells. Provided that MMP-3 is involved in EMT, which also occurs during carcinogenesis, the implication of CagA in cell transformation is further underlined. FIELD OF INTEREST: Bacterial pathogenicity KEYWORDS: Helicobacter pylori, CagA, MMPs, MMP-3 17

18 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Γενικά στοιχεία 1.1. Γενικά στοιχεία για το Ελικοβακτήριο του πυλωρού (H. pylori) Το H. pylori είναι ένα Gram-αρνητικό, σπειροειδούς σχήματος βακτήριο, το οποίο αποικίζει το βλεννογόνο του ανθρώπινου στομάχου (Warren 1983). Ο γαστρικός αυλός, εξ αιτίας του όξινου pη του, αποτελεί αφιλόξενο περιβάλλον για τα περισσότερα μικρόβια. Το H. pylori ωστόσο είναι τόσο καλά προσαρμοσμένο σε αυτό το περιβάλλον, ώστε κατόπιν της λοίμωξης, η οποία λαμβάνει χώρα κυρίως κατά την παιδική ηλικία, παραμένει εκεί εφ όρου ζωής, εάν δεν εκριζωθεί (Falush et al. 2001). Ο συνδυασμός της βιοθέσης (niche), απουσία μικροβιακού ανταγωνισμού, μαζί με την ικανότητα εγκατάστασης χρόνιας λοίμωξης, καθιστούν το Η. pylori ως το πιο επιτυχημένο βακτηριακό παθογόνο. Το ποσοστό της λοίμωξης από H. pylori ανέρχεται μεσοσταθμικά περίπου στο 50% του παγκόσμιου πληθυσμού (Parsonnet 1995). Τα μολυσμένα άτομα, σχεδόν στο σύνολό τους, εμφανίζουν χρόνια γαστρική φλεγμονή, συνήθως ασυμπτωματική. Η φλεγμονή αυτή μπορεί να ανιχνευτεί μέσω βιοψίας στομάχου και συνακόλουθη ιστολογική εξέταση. Η εμμένουσα λοίμωξη μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω παθογένεια, η οποία μπορεί να περιλαμβάνει ασθένειες όπως το πεπτικό έλκος, τα λεμφώματα Hodgkin s και MALT (μη Hodgkin s), καθώς και το αδενοκαρκίνωμα. Παρά την αιτιολογική σχέση του H. pylori με τις παραπάνω ασθένειες, η πλειοψηφία των ασθενών δεν εμφανίζει συμπτωματική νόσο. Αντίθετα, το 10-15% των μολυσμένων ατόμων εμφανίζει γαστρικό ή δωδεκαδακτυλικό έλκος, το 1% γαστρικό αδενοκαρκίνωμα και σπανιότερα MALT λέμφωμα (Atherton & Blaser 2009, Houghton 2012, Peek & Blaser 2002). Η κλινική εικόνα που παρουσιάζεται κατά περίπτωση εξαρτάται από μια σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων παθογένειας του βακτηριακού στελέχους, του γενετικού υποβάθρου του ξενιστή αλλά και περιβαλλοντικών παραμέτρων (Yamaoka 2010). Αναφορικά με το γονιδίωμα του ξενιστή, πολυμορφισμοί σε γονίδια που ελέγχουν τη φλεγμονώδη απόκριση είναι δυνατόν να επηρεάσουν την πορεία της μόλυνσης. Επιπλέον, λαμβάνεται υπ όψιν η ηλικία στην οποία εγκαθιδρύεται η μόλυνση και κατ επέκταση η διάρκειά της. Περιβαλλοντικοί παράμετροι, οι οποίοι είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στο γαστρικό καρκίνο αποτελούν το κάπνισμα και η υψηλή κατανάλωση άλατος. Σημαντικό ρόλο παίζουν ακόμη βακτηριακοί παράγοντες παθογένειας, όπως είναι η CagA, VacA και διάφορα μόρια προσκόλλησης. 18

19 Εικόνα Α-1: Φυσική πορεία εξέλιξης της λοίμωξης από H. pylori. Η έκβαση της λοίμωξης επηρεάζεται από βακτηριακούς παράγοντες, γενετικές παραμέτρους του ξενιστή αλλά και από περιβαλλοντικές συνθήκες. Ασθενείς με αυξημένη παραγωγή οξέος αναπτύσσουν συνήθως καθ υπεροχή γαστρίτιδα άντρου, η οποία προδιαθέτει για δωδεκαδακτυλικό έλκος. Αντίθετα, ασθενείς με χαμηλή παραγωγή οξέος αναπτύσσουν συνήθως γαστρίτιδα στο σώμα του στομάχου, η οποία, ακολουθώντας μια αλληλουχία μοριακών συμβάντων, σπανιότερα καταλήγει σε αδενοκαρκίνωμα. Προσαρμογή από (Conteduca et al. 2013) Ιστορική αναδρομή Από τα τέλη του 19 ου έως τις αρχές του 20 ου αιώνα, αρκετές φορές αναφέρθηκαν περιγραφές μικροοργανισμών σπειροειδούς σχήματος, προερχόμενοι από τον στόμαχο ζώων (Bizzozero 1893). Πολύ σύντομα, παρόμοια σπειροειδή βακτήρια παρατηρήθηκαν και σε ανθρώπους, κάποιοι από τους οποίους έπασχαν από πεπτικό έλκος ή γαστρικό καρκίνο (Kuck et al. 2001, Luger 1917, Pel 1899). 19

20 Αρχικά, προτάθηκε αιτιολογική συσχέτιση των βακτηρίων με την ανάπτυξη των παραπάνω ασθενειών, ενώ οι πάσχοντες υποβάλλονταν ενίοτε σε θεραπεία με υψηλές δόσεις βισμουθίου (Pel 1899). Στη συνέχεια όμως η αιτιολογική σχέση βακτηρίου-κλινικής έκφανσης παραμερίστηκε, λόγω της παρουσίας του μικροβίου και στον στόμαχο ατόμων, τα οποία δεν παρουσίαζαν κλινικά συμπτώματα. Έως τις αρχές της δεκαετίας του 80, τα βακτήρια που παρατηρούνταν στον ανθρώπινο στόμαχο θεωρούνταν αποτέλεσμα επιμολύνσεων της τροφής. Εκείνη την περίοδο, οι Warren και Marshall, μέσω της επιτυχούς καλλιέργειάς του H. pylori από μολυσμένους ασθενείς, οδηγήθηκαν στην οριστική ταυτοποίησή του (Marshall et al. 1987, Marshall et al. 1985, Marshall & Warren 1984). Ο οργανισμός που απομονώθηκε έλαβε αρχικά διάφορες ονομασίες, μεταξύ των οποίων και «Campylobacter pylori». Τελικά, μετονομάστηκε σε Helicobacter pylori, υποδηλώνοντας πως πρόκειται για ένα βακτήριο διακριτό από τα μέλη του γένους Campylobacter (Goodwin & Sly 1989). Πολύ σύντομα εδραιώθηκε η σχέση του βακτηρίου με τη χρόνια γαστρίτιδα, η οποία μπορεί να εξελιχθεί σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι το πεπτικό έλκος, το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα και λέμφωμα (Ernst & Gold 2000) Ταξινόμηση Φυλογένεση Επικράτεια: Βακτήρια Φύλο: Πρωτεοβακτήρια Υπόφυλο: δ/ε Υποκατηγορία Ομοταξία: ε-πρωτεοβακτήρια Τάξη: Campylobacterales Οικογένεια: Helicobacteraceae Γένος: Helicobacter Εικόνα Α-2: Συστηματική κατάταξη του H. pylori (Woese et al. 1990). Το γένος Helicobacter υπάγεται στην οικογένεια Helicobactereraceae, η οποία περιλαμβάνει επίσης τα γένη Wolinella, Flexispira, Sulfurimonas, Thiomicrospira και Thiovulum. Μέχρι σήμερα, το γένος Helicobacter περιλαμβάνει παραπάνω από 20 αναγνωρισμένα είδη, ενώ αναμένεται επίσημη αναγνώριση για ακόμη περισσότερα (Fox 2002). Τα μέλη του γένους Helicobacter είναι μικροαερόφιλοι οργανισμοί, θετικοί στην καταλάση, την οξειδάση και πολλοί από αυτούς στην ουρεάση. Υποδιαιρούνται περαιτέρω σε δύο κατηγορίες: στα γαστρικά είδη Helicobacter και στα εντεροηπατικά. Αμφότερες οι ομάδες χαρακτηρίζονται από υψηλή οργανική εξειδίκευση, τέτοια ώστε τα γαστρικά είδη αδυνατούν να αποικίσουν το έντερο ή το ήπαρ και αντίστροφα. 20

21 1.4. Μορφολογία Το H. pylori είναι ένα αρνητικό κατά gram βακτήριο, διαστάσεων 2-4μm σε μήκος και 0.5-1μm σε πλάτος. Αν και συνήθως διαθέτει σπειροειδές σχήμα, απαντάται και με ραβδοειδές ενώ εμφανίζει κοκκώδες σχήμα κατόπιν παρατεταμένης in vitro καλλιέργειας ή αντιβιοτικής θεραπείας (Kusters et al. 1997). Επιπλέον, φέρει 2-6 μαστίγια με κολεό, περίπου 3μm σε μήκος, τα οποία συχνά απολήγουν σε μια διακριτή διόγκωση. Τα μαστίγια προσφέρουν κινητικότητα, ενώ επιτρέπουν στο βακτήριο να κινείται ταχέως μέσα σε πηκτά διαλύματα, όπως είναι η στιβάδα βλέννας που καλύπτει το γαστρικό επιθήλιο (O'Toole et al. 2000). Εικόνα Α-3: Helicobacter pylori. (α) Ηλεκτρονική μικροσκοπία και (β) Σχηματική αναπαράσταση, στην οποία απεικονίζονται το σχήμα, τα μαστίγια, η ουρεάση και το κανάλι πρωτονίων της, καθώς και η παραγωγή αμμωνίας, η οποία εξουδετερώνει το εγγύς όξινο περιβάλλον (γαλάζιο χρώμα). Προσαρμογή από (Montecucco & Rappuoli 2001) 21

22 1.5. Απαιτήσεις ανάπτυξης Ένα βασικό χαρακτηριστικό του H. pylori είναι πως πρόκειται για μικροαερόφιλο βακτήριο, με βέλτιστες συνθήκες ανάπτυξης σε επίπεδα οξυγόνου 2-5%, διοξειδίου του άνθρακα 5-10% και υψηλή υγρασία. Το H. pylori δεν χρειάζεται υδρογόνο, εντούτοις το στοιχείο αυτό δεν αναστέλλει την ανάπτυξή του βακτηρίου. Για την καλλιέργεια του H. pylori συνήθως χρησιμοποιούνται μικροαερόφιλες συνθήκες με 85% άζωτο, 10% διοξείδιο του άνθρακα και 5% οξυγόνο. Παρά το γεγονός ότι το βακτήριο επιβιώνει κατόπιν βραχείας έκθεσης σε ph< 4, ωστόσο αναπτύσσεται σε ένα εύρος ph από 5.5 έως 8 ενώ η βέλτιστη ανάπτυξή του λαμβάνει χώρα σε ουδέτερο ph (Scott et al. 2002, Stingl et al. 2002). Το H. pylori απαιτεί ένα μέσο ανάπτυξης με συγκεκριμένη σύσταση, η οποία συχνά συμπεριλαμβάνει αίμα ή ορό, ως επιπρόσθετες πηγές θρεπτικών ουσιών, οι οποίες πιθανόν εξουδετερώνουν την τοξική δράση των λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας. Στην τελευταία λειτουργία συμβάλλει επίσης ο εμπλουτισμός του θρεπτικού με κυκλοδεξτρίνες ή IsoVitaleX (Taneera et al. 2002). Τα στερεά θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται για την απομόνωση και καλλιέργεια του H. pylori περιέχουν συνήθως Columbia άγαρ με αίμα αλόγου και βόειο εμβρυικό ορό. Επιπλέον, προστίθεται προαιρετικά ένα μίγμα αντιβιοτικών σε δύο εμπορικά διαθέσιμες παραλλαγές. Η πρώτη είναι ένα μίγμα τύπου Dent, αποτελούμενο από βανκομυκίνη, τριμεθοπρίμη, σεφσολουδίνη και αμφοτερισίνη Β (Dent & McNulty 1988). Η δεύτερη είναι ένα μίγμα τύπου Skirrow, το οποίο περιλαμβάνει βανκομυκίνη, τριμεθροπρίμη, πολυμιξίνη Β και αμφοτερισίνη Β (Skirrow 1977). Τα υγρά θρεπτικά μέσα αποτελούνται συνήθως από ζωμό Mueller-Hinton με 2-10% βόειο ορό ή 0.2-1% κυκλοδεξτρίνες, συνοδευόμενα από μίγμα αντιβιοτικών Dent ή Skirrow. Η απομόνωση του H. pylori από δείγματα γαστρικού βιοπτικού υλικού είναι δύσκολη και όχι πάντα επιτυχής ενώ η καλλιέργεια αναπτύσσεται συνήθως μέσα σε 3-14 ημέρες. Το βακτήριο σχηματίζει μικρές (1mm), διαφανείς, λείες αποικίες (Han et al. 1995). Στη συνέχεια, μετά από επιτυχή ανακαλλιέργεια, το H. pylori προσαρμόζεται στις εργαστηριακές συνθήκες ανάπτυξης. Ως εκ τούτου, μπορεί να επιτευχθεί ικανοποιητική ανάπτυξή του μέσα σε 1-3 ημέρες. Μάλιστα, παρατεταμένη διάρκεια καλλιέργειας οδηγεί στην μετάπτωση του βακτηρίου σε μη καλλιεργήσιμη πλέον κοκκώδη μορφή (Kusters et al. 1997). Για τη μακροσκοπική ανίχνευση του H. pylori, μπορεί να προστεθεί στο τρυβλίο TTC σε τελική συγκέντρωση 0,004% (Westblom et al. 1991). Παρουσία του TTC, οι αποικίες του H. pylori αποκτούν σκούρο κόκκινο χρώμα με μεταλλική χροιά, λόγω της αναγωγής της ουσίας. Το βακτήριο μπορεί να συντηρηθεί για μεγάλο χρονικό διάστημα στους -80 o C, μέσα σε BHIB ή ζωμό βρουκέλλας, με 15-20% γλυκερόλη ή 10% DMSO. 22

23 Για τη βέλτιστη βιωσιμότητα του βακτηρίου συστήνεται η 48ωρη καλλιέργειά του, όπου το 90% των βακτηρίων εμφανίζεται με σπειροειδή μορφή Εξέλιξη και επιδημιολογία Η σχέση μεταξύ H. pylori και ανθρώπου εκτιμάται ότι υφίσταται προ της εξόδου του ανθρώπινου είδους από την Αφρική, όπως δηλώνει η πλέον κοντινή συγγένεια με το γονιδίωμα του Helicobacter acinonychis, το οποίο απομονώθηκε από τα άγρια αιλουροειδή (Eppinger et al. 2006). Φυλογενετικές αναλύσεις εκτιμούν ότι το βακτήριο εξαπλώθηκε από την Ανατολική Ασία κατά την ίδια χρονική περίοδο με τους ανατομικά σύγχρονους ανθρώπους. Η στενή αυτή σύνδεση υπογραμμίζεται από παρατηρήσεις σε πρότυπα γενετικής ποικιλομορφίας του μικροβίου, τα οποία αντικατοπτρίζονται στις μετακινήσεις πληθυσμών, αλλά και στη φυλετική διαφοροποίηση του ανθρώπου-ξενιστή (Linz et al. 2007). Μάλιστα, μέσω της γονοτύπησης διαφορετικών στελεχών σε παγκόσμια κλίμακα, χαρτογραφήθηκε η ανθρώπινη μετανάστευση στη Βόρεια Αμερική και τα νησιά του Ειρηνικού Ωκεανού (Falush et al. 2003, Moodley et al. 2009). Γενικά, εκτιμάται ότι το βακτήριο συνδέεται εξελικτικά με τα θηλαστικά από πολύ νωρίς, καθώς πολλά γαστρικά είδη του Helicobacter εντοπίζονται και σε άλλους εκπροσώπους εκτός του ανθρώπου (Solnick & Schauer 2001). Ειδικότερα, κατά την εξελικτική πορεία προς τον ανατομικά σύγχρονο άνθρωπο, πιθανόν έλαβε χώρα μόλυνση από προγονικά στελέχη του βακτηρίου (Cover & Blaser 2009) Επιπολασμός και γεωγραφική κατανομή Εκτιμάται πως ο μισός παγκόσμιος πληθυσμός είναι μολυσμένος με H. pylori, ωστόσο ο επιπολασμός εμφανίζει μεγάλη γεωγραφική διακύμανση. Για παράδειγμα, σε αρκετές χώρες όπως η Ινδία, η Σαουδική Αραβία και το Βιετνάμ, το ποσοστό του μολυσμένου πληθυσμού είναι μεγαλύτερο από 80%. Σε αυτές τις περιοχές, οι μολύνσεις λαμβάνουν χώρα κυρίως κατά την παιδική ηλικία (al-moagel et al. 1990, Graham et al. 1992, Malaty 2007). Αντίθετα, ο επιπολασμός του H. pylori σε βιομηχανοποιημένες χώρες είναι συνήθως κάτω από 40% και σημαντικά χαμηλότερος στα παιδιά συγκριτικά με τους ενήλικες (Crew & Neugut 2006). Συμπερασματικά, ο επιπολασμός του H. pylori είναι αντιστρόφως ανάλογος με την κοινωνικό-οικονομική κατάσταση και πιο συγκεκριμένα, το οικογενειακό εισόδημα, την υγιεινή και τις συνθήκες διαβίωσης μιας περιοχής (Malaty et al. 1996). Μάλιστα, οι ρυθμοί μόλυνσης από H. pylori στον βιομηχανοποιημένο κόσμο τείνουν να μειώνονται, ενώ στις αναπτυσσόμενες χώρες παραμένουν σχετικά σταθεροί. Αναφορικά με τις τελευταίες, η ευρεία χρήση αντιβιοτικών πιθανόν συνέβαλλε στη μείωση των μολύνσεων 23

24 από H. pylori κατά την παιδική ηλικία. Η εκρίζωση του βακτηρίου από έναν πληθυσμό με τη βοήθεια αντιβιοτικών αλλά και η επιπλέον πρόληψη των μολύνσεων μέσω της βελτίωσης του βιοτικού επιπέδου ενδεχομένως να συνδέονται και με την ελάττωση των κρουσμάτων γαστρικού καρκίνου παγκοσμίως (Peek 2002) Μετάδοση Παρόλο που η σχέση του H. pylori με σοβαρές ασθένειες του ανθρώπου έχει εδραιωθεί, οι ακριβείς μηχανισμοί πρόσληψης του βακτηρίου παραμένουν άγνωστοι. Η γάστρο-στοματική (π.χ. έκθεση σε έμεσμα) και έντερο-στοματική οδός από άνθρωπο σε άνθρωπο θεωρούνται ως οι πιθανότεροι τρόποι μετάδοσης (Feldman et al. 1998). Πράγματι, στελέχη H. pylori τα οποία έχουν απομονωθεί από παιδιά και τις μητέρες τους συχνά είχαν τον ίδιο γονότυπο, υποστηρίζοντας την υπόθεση πως η μόλυνση από H. pylori συμβαίνει κυρίως κατά την παιδική ηλικία, μέσω της στενής επαφής με συγγενικά μέλη (π.χ. μέσω μάσησης της τροφής από τους γονείς) (Kurosawa et al. 2000, Yamaoka et al. 2000). Εναλλακτικοί οδοί μετάδοσης, συμπεριλαμβανομένων της έκθεσης σε μολυσμένη τροφή ή νερό ή της επαφής με οικόσιτα ζώα όπως γάτες και πρόβατα, θεωρείται πως παίζουν κάποιο ρόλο (Goodman et al. 1996). Μέχρι σήμερα ωστόσο, δεν υπάρχουν ενδείξεις σχετικά με το ποια είναι η κύρια οδός μετάδοσης του βακτηρίου Βιολογία της μόλυνσης Ο εποικισμός του ανθρώπινου στομάχου από το H. pylori επιτυγχάνεται μέσω ενός συνδυασμού στρατηγικών, οι οποίες σχετίζονται με τις εκάστοτε προκλήσεις που παρουσιάζει το αφιλόξενο περιβάλλον του στομάχου στο βακτήριο (Εικόνα A-3). Το H. pylori συνθέτει ουρεάση, εξουδετερώνοντας το όξινο ph του στομάχου στη γύρω περιοχή. Επιπλέον, το ελικοειδές σχήμα και η δράση των μαστιγίων που διαθέτει, του επιτρέπουν να διασχίζει το παχύ στρώμα βλέννας, το οποίο οριοθετεί το επιθήλιο του στομάχου. Στη συνέχεια, προσδένεται στα αντιγόνα Lewis πάνω στην επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων του ξενιστή. Εκεί, εκκρίνει παράγοντες με χημειοτακτική δράση, οι οποίοι ενεργοποιούν στοιχεία της κυτταρομεσολαβούμενης φλεγμονής. Αναφορικά με την έκκριση παραγόντων, η παρουσία του νησιδίου παθογένειας cag, ενός τμήματος DNA 40-kb που κωδικοποιεί ένα σύστημα μεταφοράς τύπου IV, φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ευρωστία του βακτηρίου και την εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων. 24

25 Εξουδετέρωση του ph Ο εποικισμός του γαστρεντερικού σωλήνα από ένα βακτήριο, απαιτεί την ικανότητα επιβίωσης στο όξινο ph του στομάχου (Parsonnet et al. 1994).Το H. pylori διαθέτει εφτά ομαδοποιημένα γονίδια για τη βιοσύνθεση της κυτοσολικής ουρεάσης, ενός ενζύμου που περιέχει στο ενεργό κέντρο, ιόντα νικελίου και υδρολύει την ουρία σε αμμωνία και διοξείδιο του άνθρακα ((NH 2 ) 2 CO + H2O CO 2 + 2NH 3 ) (Hansson et al. 1993, Hu et al. 1994). Τα γονίδια αυτά κωδικοποιούν τις υπομονάδες ουρεάσης UreA (26.5 kda) και UreaB (60.3 kda) καθώς και επικουρικές υπομονάδες, οι οποίες είναι υπεύθυνες για την πρόσληψη ιόντων νικελίου και την ενσωμάτωσή τους στο ενεργό κέντρο του από-ενζύμου (Hu et al. 1994, Warren 1983). Η ουρεάση είναι ένα δωδεκαμερές έξι υπομονάδων UreA και έξι UreB, οργανωμένων σε ένα διπλό δακτύλιο διαμέτρου 13nm (Uemura et al. 2001). Η ποσότητα της παραγόμενης ουρεάσης ποικίλλει ανάλογα με τις συνθήκες καλλιέργειας, ενώ μπορεί να φθάσει το 10% της συνολικής βακτηριακής πρωτεΐνης (Hu et al. 1994). Η πρόσληψη της ουρίας από το H. pylori γίνεται μέσω ενός καναλιού πρωτονίων και η υδρόλυσή της από την ουρεάση παράγει αμμωνία, η οποία δημιουργεί ένα στρώμα ουδέτερου ph γύρω από την επιφάνεια του βακτηρίου (Linz et al. 2007). Ο ρόλος της ουρεάσης ως παθογόνου παράγοντα φανερώνεται από το γεγονός ότι μεταλλάγματα H. pylori ανίκανα να παράγουν ουρεάση αδυνατούν να αποικίσουν το στομάχι (Solnick & Schauer 2001). Παρ όλα αυτά, σε ουδέτερο ph, η ουρία είναι τοξική για το βακτήριο, καθώς δημιουργεί ένα αντίξοο αλκαλικό περιβάλλον (Cover & Blaser 2009). Ως εκ τούτου, το κανάλι της ουρίας ρυθμίζεται θετικά μέσω πρωτονίων, μένοντας ανοιχτό σε όξινες τιμές του ph, ενώ κλείνει όταν το ph είναι ουδέτερο. Η ουρεάση του H. pylori μπορεί να προκαλέσει βλάβη στα κύτταρα του ξενιστή μέσω της παραγωγής αμμωνίας. Σε in vitro πειράματα έχει καταδειχθεί η τοξική της δράση τόσο μεμονωμένα, όσο και συνεργατικά με μεταβολίτες των ουδετερόφιλων (al-moagel et al. 1990, Graham et al. 1992, Malaty 2007). Η βλάβη στα κύτταρα του ξενιστή περιλαμβάνει την διόγκωση ενδοκυτταρικών διαμερισμάτων, αλλαγές στην μεταφορά των κυστιδίων, καταστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης και της παραγωγής ATP, καθώς και την αναστολή του κυτταρικού κύκλου. Η αμμωνία μπορεί επίσης να αλληλεπιδράσει με χημικούς μεσολαβητές των ουδετεροφίλων, όπως η μυελοϋπεροξειδάση και να σχηματίσει καρκινικούς παράγοντες, οι οποίοι ενδεχομένως εμπλέκονται στην ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου κατόπιν της μόλυνσης με H. pylori (Graham et al. 1992). Ο ρόλος της ουρεάσης δεν περιορίζεται στον αποικισμό του H. pylori.. Η παραγόμενη αμμωνία εισέρχεται στον μεταβολισμό αζώτου του βακτηρίου και τελικά ενσωματώνεται σε πρωτεΐνες (Crew & Neugut 2006). Επιπλέον, ενδεχομένως η ουρεάση να σχετίζεται με τη στρατολόγηση μονοκυττάρων και ουδετερόφιλων στο φλεγμένο βλεννογόνο και την επαγωγή της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτταροκινών (Feldman et al. 25

26 1998). Επιπλέον, η ουρεάση αποτελεί βασικό αντιγόνο αναγνώρισης κατά την ανοσολογική απόκριση στην λοίμωξη από H.pylori, χωρίς ωστόσο να είναι πλήρως κατανοητός ο μηχανισμός και η έκταση της απόκρισης (Malaty et al. 1996, Peek 2002) Μετάβαση στο βλεννογόνο Το H. pylori μεταβαίνει από το γαστρικό αυλό στο βλεννογόνο, λόγω του εξαιρετικά χαμηλού ph που επικρατεί στον πρώτο, αλλά και για να μην αποβληθεί από το πεπτικό σύστημα. Με τη βοήθεια των μαστιγίων του, φθάνει έως το παχύ στρώμα βλέννας, το οποίο καλύπτει και προστατεύει το επιθήλιο του γαστρικού βλεννογόνου. Εκεί, προωθούμενο από τα μαστίγιά του διασχίζει την πηκτή στιβάδα της βλέννας, προσομοιάζοντας τη σπειροειδή κίνηση ενός κοχλία. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι μη κινητικά μεταλλάγματα αδυνατούν να αποικίσουν το στομάχι (Kurosawa et al. 2000). Ο προσανατολισμός του H. pylori προς το γαστρικό βλεννογόνο γίνεται μέσω χημειοτακτικών παραγόντων, όπως η ουρία και τα διττανθρακικά ιόντα (Yamaoka et al. 2000). Το στρώμα βλέννας παράγεται από τα βλεννοπαραγωγά κύτταρα, τα οποία εκκρίνουν κοκκία με υψηλά γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες (Goodman et al. 1996). Οι εκκρινόμενες γλυκοπρωτεΐνες, σε συνδυασμό με ένα εξωτερικό στρώμα από επιφανειοδραστικά φωσφολιπίδια, συνθέτουν ένα συνεχές πήκτωμα (Hopkins et al. 1993). Το πήκτωμα αυτό λειτουργεί ως μια ημιπερατή μεμβράνη, η οποία επιτρέπει τη ροή πρωτονίων [H + ] από τα τοιχωματικά κύτταρα του βλεννογόνου προς τον αυλό, αλλά όχι αντίστροφα. Επιπλέον, δεν είναι διαπερατή στα διττανθρακικά ανιόντα HCO - 3, με αποτέλεσμα την έντονη διαβάθμιση του ph από τον αυλό (ισχυρά όξινο) προς την επιφάνεια του βλεννογόνου (ελαφρά όξινο). Σε βιοψίες μολυσμένων ασθενών το H. pylori εντοπίζεται στο στρώμα της βλέννας αλλά και στην κορυφαία μεμβράνη των επιθηλιακών κυττάρων, όπου προσδένεται ισχυρά. Η παροχή θρεπτικών συστατικών, απαραίτητων για την ανάπτυξη του βακτηρίου, όπως είναι τα ιόντα σιδήρου και νικελίου, είναι περιορισμένη λόγω της χαμηλής διαπερατότητας της βλέννας αλλά και της συνεχούς επιθηλιακής μονοστιβάδας. Ως απάντηση σε αυτή την πρόκληση, το H. pylori εκκρίνει πιθανώς υδρολυτικά ένζυμα, παρόμοια με άλλα γαστρεντερικά βακτήρια (Dore et al. 2001). 26

27 Εικόνα Α-4 Μοριακοί μηχανισμοί εδραίωσης του H. pylori αποικισμού στο γαστρικό περιβάλλον. Μέσω του ελικοειδούς σχήματος και της σπειροειδούς κίνησης, το βακτήριο διασχίζει το παχύ στρώμα βλέννας. Πολλαπλά μαστίγια επιτρέπουν γρήγορη κίνηση και προσανατολισμό προς το στρώμα των επιθηλιακών κύτταρων, με τη μεσολάβηση του υποδοχέα χημειοταξίας TlpB. Το ένζυμο της ουρεάσης ουδετεροποιεί το περιβάλλον, καταλύοντας την υδρόλυση της ουρίας, σχηματίζοντας αμμωνία και διοξείδιο του άνθρακα. Ειδικά μόρια προσκόλλησης επιτρέπουν την αγκυροβόληση του H. pylori στα επιθηλιακά κύτταρα. Παράγοντες παθογένειας όπως η προσκολλητίνη SabA και η CagA επιτρέπουν την απελευθέρωση θρεπτικών συστατικών από την κορυφαία πλευρά των επιθηλιακών κυττάρων, είτε μέσω επαγωγής της φλεγμονή είτε με κατάργηση της κυτταρικής πολικότητας. Η εδραίωση της φλεγμονής επιτυγχάνεται επίσης με τη στρατολόγηση του ανοσοποιητικού συστήματος (Προσαρμογή από (Bauer & Meyer 2011) Εδραίωση του αποικισμού Το H. pylori προσδένεται ισχυρά στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα, με τη βοήθεια πρωτεϊνών και γλυκολιπιδίων. Η BabA, μια πρωτεΐνη εξωτερικής μεμβράνης του H. pylori, προσδένεται στα αντιγόνα Lewis τύπου B (Fox 1995, Kwok et al. 2002). Επιπλέον, η HpA και άλλες λεκτίνες, συνδέονται με γλυκοζυλιωμένα μόρια, με τη μεσολάβηση σαλικυλικού οξέος (Algood & Cover 2006). Η κυτταρική πρόσδεση του H.pylori, αν και απαραίτητο βήμα για τον εποικισμό του βλεννογόνου, είναι ωστόσο δύσκολο να αποσαφηνιστεί σε μοριακό επίπεδο. 27

28 Η πρόσδεση του H. pylori στη μονοστιβάδα του επιθηλίου φέρει επιπτώσεις στα κύτταρα του ξενιστή. Πρόκειται για μία σχεδόν μη αναστρέψιμη σύνδεση, η οποία οδηγεί σε δραματική αναδιάταξη της πλασματικής μεμβράνης (Haas et al. 1993, Suerbaum 1995). Σημειωτέον ότι το H. pylori δεν εισέρχεται στο επιθηλιακό κύτταρο. Αντίθετα, η πλασματική μεμβράνη του κυττάρου αλλάζει σχήμα και εκτείνεται ώστε να καλύψει μεγάλο τμήμα της βακτηριακής επιφάνειας, κατόπιν αναδιοργάνωσης του υποκείμενου κυτταροσκελετού. Αυτές οι αλλαγές επάγονται από πρωτεΐνες, τις οποίες εισάγει το βακτήριο στο κύτταρο του ξενιστή Στρατολόγηση του Ανοσοποιητικού Συστήματος Το H. pylori είναι ικανό να παραμείνει για μεγάλες χρονικές περιόδους στον ξενιστή χωρίς να εξαλειφθεί από το ανοσοποιητικό σύστημα ή από τις συχνές αλλαγές στο γαστρικό περιβάλλον. Αλληλεπιδράσεις του H. pylori με το επιθήλιο του ξενιστή πιθανόν επάγουν μηχανισμούς διαφυγής, προκαλώντας συχνά κυτταρική βλάβη και φλεγμονή. Για παράδειγμα, η προσκόλληση του H. pylori μέσω της πρωτεΐνης SabA έχει δειχθεί πως προωθεί την ανοσιακή απόκριση, διευκολύνοντας πιθανόν την πρόσβασή του σε απαραίτητα θρεπτικά συστατικά, τα οποία απελευθερώνονται από τα κατεστραμμένα κύτταρα του ξενιστή (Petersson et al. 2006). Παρόλο που δεν υπάρχουν άμεσες ενδείξεις ότι η φλεγμονή είναι επωφελής για το βακτήριο, η υπόθεση παραμένει ενδιαφέρουσα, δεδομένου ότι η μόλυνση επάγει πάντοτε φλεγμονή, ανεξάρτητα από το αν υπάρχουν ή όχι συμπτώματα. Ακόμα, η πρωτεΐνη CagA, ένας βασικός λοιμοτοξικός παράγοντας μεταφέρεται εντός του κυττάρου του ξενιστή μέσω του T4SS και αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες του καθορίζουν την λειτουργία του κυτταροσκελετού. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα, το H. pylori να καταστρέφει την πολικότητα των επιθηλιακών κυττάρων, εκμεταλλευόμενο την κορυφαία επιφάνειά τους ως βιοθέση αναπαραγωγής αλλά και για την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών, τα οποία φυσιολογικά μεταφέρονται στη βασοπλευρική περιοχή (Tan et al. 2009). Σε γενικές γραμμές, η ανοσία δεν φαίνεται να επηρεάζει καθοριστικά την εγκατάσταση της λοίμωξης, καθώς ανοσοκατεσταλμένοι ασθενείς δεν επιδεικνύουν υψηλότερα ποσοστά αποικισμού (Battan et al. 1990). Επιπλέον, εκτός από την προσκόλληση και τη συνακόλουθη μεταφορά τοξινών, το H. pylori διαθέτει μια πλειάδα μηχανισμών, μέσω των οποίων στρατολογεί και μετριάζει τη δράση της ανοσιακής απόκρισης. Ακόμη, το H. pylori εκφράζει λιποπολυσακχαρίτες (LPS) με πολύ χαμηλή ενδοτοξική και ανοσοβιολογική δράση συγκριτικά με αυτούς άλλων αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (Muotiala et al. 1992). Οι 28

29 LPS του H. pylori δρουν ανταγωνιστικά στη σηματοδότηση από τον ενδογενή ανοσολογικό υποδοχέα Toll-Like Receptor 4 (TLR4) (Lepper et al. 2005). Αυτή η ανταγωνιστική ιδιότητα τους βασίζεται σε εξειδικευμένες τροποποιήσεις του λιπιδιακού συστατικού Α αλλά και στη στέλεχο-ειδική έκφραση LPS αντιγόνων-o, τα οποία προσομοιάζουν δομικά με τα αντιγόνα επιφανείας των ομάδων αίματος κατά Lewis (Appelmelk et al. 1996, Moran et al. 1997). Αυτός ο μοριακός μιμητισμός δεν συμμετέχει μόνο σε αυτοάνοσες αποκρίσεις, αλλά ενδεχομένως να επιτρέπει στους λιποπολυσακχαρίτες του H. pylori να διαφύγουν την αναγνώριση από το ενδογενές ανοσιακό σύστημα (Appelmelk et al. 1996). Εικόνα Α-5: Αποικισμός μέσω ανοσοποιητικού συστήματος. Μοριακός μιμητισμός επιτυγχάνεται με ειδικές τροποποιήσεις μορίων LPS και του λιπιδίου Α, οδηγώντας σε χαμηλή ενδοτοξική ενεργότητα. Επιπλέον, οι LPS του H. pylori μπορούν να ανταγωνιστούν τον υποδοχέα αναγνώρισης TLR4. To συστατικό FlaA των μαστιγίων επάγει χαμηλές TLR5-μεσολαβούμενες αποκρίσεις ενώ η πρωτεΐνη κυστιδοποίησης VacA μπορεί να αναστείλει είτε τον πολλαπλασιασμό T- και B- κυττάρων, είτε την ωρίμανση των μακροφάγων. Η VacA δύναται επίσης να επάγει απόπτωση των μακροφάγων. Μέσω κάλυψης της βακτηριακής μεμβράνης με μόρια του κυττάρου ξενιστή, όπως το πλασμινογόνο και η χοληστερόλη, το H. pylori διαφεύγει την ανοσιακή αναγνώριση. Παράλληλα, η υψηλή γενετική ποικιλότητα επιτρέπει ταχεία προσαρμογή σε περιβαλλοντικές αλλαγές. TLR, Toll-like receptor, LPS, lipopolysaccharide, inos, inducible nitric oxide synthase. Προσαρμογή από (Bauer & Meyer 2011) 29

30 Η ενσωμάτωση της χοληστερόλης στη μεμβράνη του H. pylori και η διαδοχική γλυκοζυλίωσή της αλλά και η κάλυψη του βακτηρίου με μόρια του ξενιστή, όπως το πλασμινογόνο, πιθανόν αποτελούν επιπρόσθετους μηχανισμούς αντιγονικής διαφυγής (Ringner et al. 1994, Wunder et al. 2006). Ακόμα, τα μαστίγια του H. pylori, αποτελούν δομές οι οποίες φυσιολογικά αναγνωρίζονται μέσω του ενδογενούς ανοσιακού υποδοχέα TLR5, ενώ επάγουν ασθενή ανοσιακή απόκριση, λόγω του τροποποιημένου αμινοτελικού τους άκρου (Andersen-Nissen et al. 2005, Gewirtz et al. 2004, Lee et al. 2003). Άλλοι μηχανισμοί μέσω των οποίων το H. pylori πυροδοτεί το ανοσιακό σύστημα του ξενιστή βασίζονται σε εκκρινόμενους βακτηριακούς παράγοντες, οι οποίοι στοχεύουν άμεσα τα κύτταρα του συστήματος αυτού. Για παράδειγμα, η VacA, η οποία κωδικοποιείται στο γονιδίωμα όλων των H. pylori στελεχών, αναστέλλει τη μετάθεση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT στον πυρήνα. Ως αποτέλεσμα, εμποδίζεται ο πολλαπλασιασμός των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων (Gebert et al. 2003).Η VacA εμποδίζει επίσης τον πολλαπλασιασμό CD8+ και B-λεμφοκυττάρων, ενώ είναι ικανή να διαταράξει τη φυσιολογική λειτουργία των μακροφάγων, είτε επάγοντας απόπτωση, είτε αναστέλλοντας την ωρίμανση των φαγοσωμάτων (Menaker et al. 2004, Torres et al. 2007, Zheng & Jones 2003) Γενετική ποικιλομορφία και διαφοροποίηση του H. pylori Το μέγεθος των γονιδιωμάτων δύο H. pylori στελεχών (26695 και J99) κατόπιν αλληλούχησης ανέρχεται περίπου σε 1.7 Mbps, με ποσοστό GC 35-40%. Το γονιδίωμα του στελέχους περιλαμβάνει 1587 γονίδια ενώ αυτό του J (Alm et al. 1999, Boneca et al. 2003, Tomb et al. 1997). Αμφότερα γονιδιώματα περιλαμβάνουν δύο αντίγραφα των γονιδίων 16S, 23S και 5SrRNA. Πολλά στελέχη διαθέτουν ένα ή περισσότερα πλασμίδια, τα οποία δεν φαίνεται να φέρουν γονίδια λοιμοτοξικών παραγόντων ή ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (Heuermann & Haas 1995). Επιπλέον, έχουν καταγραφεί βακτηριοφάγοι, οι οποίοι μολύνουν το H. pylori, χωρίς ωστόσο λεπτομερή χαρακτηρισμό (Schmid et al. 1990). Το H. pylori παρουσιάζει σημαντική ποικιλία αλληλομόρφων και γενετικής διαφοροποίησης, στις οποίες τυπικά μετέχουν ενδογενείς σημειακές μεταλλάξεις και γονιδιακοί ανασυνδυασμοί. Ως αποτέλεσμα, κάθε μολυσμένο με H. pylori άτομο φέρει ένα διακριτό στέλεχος ενώ οι διαφορές μεταξύ μολυσμένων συγγενών εμφανίζονται να είναι αμελητέες (Akopyanz et al. 1992, Kansau et al. 1996, Miehlke et al. 1999). Η ποικιλία αλληλομόρφων ενισχύεται από ένα σημαντικό ρυθμό μετάλλαξης, μεγαλύτερο από αυτόν που απαντάται στα περισσότερα βακτήρια (Bjorkholm et al. 2001). Αυτός ο ρυθμός πιθανόν εξηγεί την ταχεία ανάπτυξη αντοχής σε κοινώς χορηγούμενα αντιβιοτικά, όπως η κλαριθρομυκίνη. Επιπλέον, 30

31 για τους υψηλούς ρυθμούς μεταλλαξογένεσης πιθανόν ευθύνεται η απουσία ολοκληρωμένου συστήματος επιδιόρθωσης λανθασμένου ζευγαρώματος DNA αλλά και αρκετών ενζύμων που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση μέσω εκτομής βάσεων (Suerbaum & Josenhans 2007, Tomb et al. 1997). Ένας μεγάλος αριθμός υπερ-μεταβλητών γονιδίων συχνά υπόκειται σε αλλαγές μήκους, ως αποτέλεσμα μετάλλαξης. Συνεπώς, μέσα σε έναν ευρύτερο πληθυσμό δημιουργούνται πολυάριθμοι υποπληθυσμοί (Robertson & Meyer 1992). Καθένας από αυτούς τους υποπληθυσμούς φέρει έναν ειδικό συνδυασμό ενεργών και μη γονιδίων. Για παράδειγμα, τα γονίδια που συμμετέχουν στη σύσταση της εξωτερικής μεμβράνης και τη βιοσύνθεση των LPS, οι οποία επιτρέπουν στο H. pylori να προσαρμόζεται ταχέως στις περιβαλλοντικές αλλαγές (Salaun et al. 2004, Saunders et al. 1998). Η υψηλή ενδογενής ικανότητα για πρόσληψη DNA σε συνδυασμό με έναν από τους ταχύτερους ρυθμούς ενδογονιδιωματικού ανασυνδυασμού σε σχέση με άλλα παθογόνα βακτήρια συμβάλλουν επίσης στη μεγάλη γενετική ποικιλία ανάμεσα στα διάφορα H. pylori στελέχη (Perez-Losada et al. 2006). 2. Κλινική εικόνα Ο αποικισμός του H. pylori καθαυτός δεν αποτελεί ασθένεια παρά μια κατάσταση, η οποία επηρεάζει τον κίνδυνο εμφάνισης κλινικών διαταραχών της άνω γαστροοισοφαγικής οδού και πιθανόν και της ηπατοσπληνικής. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση της λοίμωξης από H. pylori συμβάλλει στον εντοπισμό της αιτιολογίας μιας σχετικής νόσου, όπως είναι το πεπτικό έλκος αλλά και στην πρόληψη ασθενειών, ειδικότερα σε άτομα με οικογενειακό ιστορικό. Παρόλο που ο αποικισμός του γαστρικού βλεννογόνου από το H. pylori επάγει ιστολογική γαστρίτιδα σε όλα τα μολυσμένα άτομα, μόνο ένα μικρό ποσοστό εμφανίζει κλινική εικόνα. Εκτιμάται πως οι θετικοί ασθενείς για H.pylori έχουν 10-20% πιθανότητα να εμφανίσουν έλκος και 1-2% να εμφανίσουν γαστρικό καρκίνο (Ernst & Gold 2000, Kuipers 1999, Kuipers et al. 1995a). Ο κίνδυνος ανάπτυξης αυτών των ασθενειών παρουσία λοίμωξης από H. pylori εξαρτάται από παράγοντες που αφορούν το βακτήριο, τον ξενιστή αλλά και το περιβάλλον, οι οποίοι συνδέονται με το πρότυπο και τη βαρύτητα της γαστρίτιδας. 2.1.Χρόνια γαστρίτιδα Η λοίμωξη από H. pylori οδηγεί σχεδόν πάντοτε στη διήθηση του γαστρικού βλεννογόνου του άντρου και του σώματος από ουδετερόφιλα και μονοπύρηνα κύτταρα. Η χρόνια γαστρίτιδα αποτελεί την κυριότερη κλινική εικόνα που συνοδεύει την H. pylori λοίμωξη. Αυτή η σύνδεση είναι αποτέλεσμα της αμφίδρομης ανταγωνιστικής δράσης του οξέος έναντι 31

32 της ανάπτυξης του βακτηρίου και της σχετικής φλεγμονής του βλεννογόνου. Επιπλέον, τα επίπεδα έκκρισης του οξέος είναι καθοριστικής σημασίας για την έκβαση της λοίμωξης. Σε ασθενείς με φυσιολογική έκκριση οξέος, το H. pylori αποικίζει το γαστρικό άντρο, όπου βρίσκεται μικρός αριθμός τοιχωματικών κυττάρων. Αυτό το πρότυπο αποικισμού συνδέεται αντίστοιχα με την ανάπτυξη γαστρίτιδας στο άντρο. Εν προκειμένω, εκτίμηση της ιστοπαθολογίας δειγμάτων από το γαστρικό σώμα εμφανίζει περιορισμένη φλεγμονή και μικρό αριθμό αποικούντων βακτηρίων. Από την άλλη, σε άτομα στα οποία η έκκριση οξέος είναι περιορισμένη, τα βακτήρια κατανέμονται στο άντρο και στο σώμα, όπου οδηγούν σε πανγαστρίτιδα. Η μείωση στην έκκριση οξέος μπορεί να οφείλεται είτε σε απώλεια τοιχωματικών κυττάρων, ως αποτέλεσμα ατροφικής γαστρίτιδας, είτε σε καταστολή της λειτουργίας τους λόγω κατασταλτικών φαρμάκων, όπως είναι οι αναστολείς αντλίας πρωτονίων (PPIs) (Kuipers et al. 1995a). Εικόνα Α-6: Χαρακτηριστικά της H. pylori-μεσολαβούμενης παθολογίας. (α) Ανατομική δομή του ανθρώπινου στομάχου. (β) Τοπολογία του πεπτικού έλκους (γαστρικού και δωδεκαδακτυλικού) και του μη καρδιακού γαστρικού αδενοκαρκινώματος στο ανθρώπινο στόμαχο. (γ) Διαφορές στην έκβαση, πολλαπλασιασμό, φλεγμονή, έκκριση οξέος και κίνδυνος ανάπτυξης γαστρικού αδενοκαρκινώματος. Προσαρμογή από (Bauer & Meyer 2011) 32

33 2.2. Ιστοπαθολογία Η μόλυνση από H.pylori έχει ως αποτέλεσμα μια τυπική διαδοχή συμβάντων, καταλήγοντας στην ανάπτυξη γαστρικών ασθενειών. Η αλληλουχία η οποία απεικονίζεται στην Εικόνα Α-7 προτάθηκε αρχικά από τους Correa et al. και έκτοτε υποστηρίζεται από πολλές άλλες μελέτες (Correa et al. 1975). Αρχικά, ο αποικισμός του γαστρικού βλεννογόνου από το H. pylori επάγει φλεγμονώδη απόκριση, κυρίως τύπου Th1. Η οξεία γαστρίτιδα ακολουθείται από ενεργό χρόνια γαστρίτιδα, η οποία διαρκεί εφόρου ζωής, εάν δεν θεραπευτεί (Kuipers et al. 1995b). Παρόλα αυτά, τα περισσότερα θετικά στο H. pylori άτομα δεν αντιλαμβάνονται τη φλεγμονή, καθώς δεν παρουσιάζουν κλινικά συμπτώματα. Αυτή η φλεγμονώδης απόκριση χαρακτηρίζεται από εισροή ουδετεροφίλων, μονοπύρηνων κυττάρων, καθώς και Τ- βοηθητικών (Th1), τα οποία τυπικά στοχεύουν στην εκκαθάριση ενδοκυτταρικών μολύνσεων. Παρόλα αυτά, το H. pylori δεν είναι ενδοκυτταρικό παθογόνο και ως εκ τούτου η Th1 απόκριση καταλήγει σε βλάβη των επιθηλιακών κυττάρων παρά σε απομάκρυνση του βακτηρίου. Συνεπώς, η εμμένουσα παρουσία του μικροβίου προκαλεί ισόβια φλεγμονώδη απόκριση, συνοδευόμενη από κυτταρική βλάβη, επάγοντας έναν καταρράκτη ιστολογικών αλλοιώσεων. Εικόνα Α-7: Πρότυπη αναπαράσταση του ρόλου του H. pylori και άλλων παραγόντων στη γαστρική καρκινογένεση, βάσει του καταρράκτη συμβάντων, τον οποίο πρότειναν οι Correa et al. Προσαρμογή από (Kusters et al. 2006) Επιπλέον, η συνεχής παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου λόγω της παρατεταμένης φλεγμονής, μπορεί να προκαλέσει βλάβη στο DNA, όπως πολλαπλές μεταλλαγές, οι οποίες εμπλέκονται σε διαδοχικά συμβάντα κυτταρικής εξαλλαγής. 33

34 2.3. Διάγνωση και θεραπεία Οι διαγνωστικές δοκιμασίες για το H. pylori χωρίζονται σε παρεμβατικές και μη παρεμβατικές. Οι παρεμβατικές δοκιμασίες περιλαμβάνουν την ιστολογική εξέταση γαστρικής βιοψίας. Οι μη παρεμβατικές δοκιμές βασίζονται στην εξέταση περιφερικών δειγμάτων, όπως είναι το αίμα, η αναπνοή, το σάλιο, τα ούρα και τα κόπρανα, με σκοπό την ανίχνευση αντισωμάτων, βακτηριακών αντιγόνων ή την δραστηριότητα της ουρεάσης. Η επιλογή της κατάλληλης δοκιμασίας εξαρτάται από την εμπειρία και τις διαθέσιμες κλινικές υποδομές, ενώ συνήθως προτείνεται ο συνδυασμός δύο μεθόδων, καθώς για παράδειγμα, η ανίχνευση ειδικών αντισωμάτων έναντι του H. pylori δεν αντικατοπτρίζει απαραίτητα τρέχουσα λοίμωξη. Παρόλο που το H. pylori έχει ευαισθησία σε ένα ευρύ φάσμα αντιβιοτικών in vitro, η δράση τους αποτυγχάνει in vivo εάν αυτά λαμβάνονται μεμονωμένα. Συνεπώς, χρησιμοποιείται συνδυαστική θεραπευτική προσέγγιση, η οποία περιλαμβάνει δύο αντιβιοτικά (κλαρυθρομικίνη, σε συνδυασμό με αμοξικιλλίνη ή μετρονιδαζόλη) και είτε μια ένωση βισμουθίου, είτε κάποιο PPI. Σπανιότερα γίνεται χρήση τετραπλών θεραπειών, όπου η ένωση βισμουθίου και ο PPI συνδυάζονται με δύο αντιβιοτικά. Η χρήση αυτών των φαρμάκων συντελεί στην αποτελεσματική θεραπεία, με ποσοστά εκρίζωσης πάνω από 80%. Παρόλα αυτά, τα τελευταία χρόνια, εντοπίζονται διαρκώς ανθεκτικά στελέχη, οδηγώντας στη διερεύνηση εναλλακτικών φαρμάκων και στρατηγικών θεραπείας (Gueneau & Loiseaux-De Goer 2002, Guiney et al. 2003). Μάλιστα, κατά την περασμένη δεκαετία έγινε μεγάλη προσπάθεια για την ανάπτυξη στρατηγικών εμβολιασμού. Με βάση την επιτυχή εκρίζωση του Helicobacter felis κατόπιν ανοσοποίησης ποντικών με ουρεάση, η επαγωγή της χυμικής ή Th2-μεσολαβούμενης απόκρισης είναι στο επίκεντρο εκτεταμένης έρευνας (Gunn et al. 1998). Ωστόσο, μέχρι σήμερα έχει παρατηρηθεί αποτελεσματικός εμβολιασμός μόνο σε ζωικά μοντέλα, ενώ καμία δοκιμή εμβολίου στον άνθρωπο δεν απέβη επιτυχής (Guo et al. 2004). Τα πιθανά αίτια εντοπίζονται στην H. pyloriειδική ανοσολογική απόκριση αλλά και σε ανατομικές διαφορές του στομάχου. Εκτός από τα εμβόλια και τα αντιβιοτικά, υπάρχουν και άλλοι τρόποι πρόληψης και θεραπείας της H. pylori λοίμωξης και των σχετιζόμενων ασθενειών. Άτομα τα οποία μολύνθηκαν παράλληλα από H. pylori και έλμινθες, εμφάνισαν τυπικά επίπεδα αποικισμού H. pylori και πρότυπο γαστρίτιδας αλλά ανέπτυξαν σημαντικά χαμηλότερη βαρύτητα συμπτωμάτων (Guruge et al. 1998, Gyulai et al. 2004). Αξιοποιώντας αυτή την παρατήρηση, θα ήταν δυνατό να χορηγηθεί χαμηλή δόση ανοσορρυθμιστικών παραγόντων σε ασθενείς θετικούς στο H. pylori, προκειμένου να προκληθεί παρόμοιο αποτελέσματα με αυτό των εντερικών ελμίνθων. Μια εναλλακτική προσέγγιση είναι η χορήγηση προβιοτικών. Συγκεκριμένα, υπάρχουν ενδείξεις ότι το H. 34

35 pylori εκτοπίζεται από τους γαλακτοβακίλλους τόσο in vitro, όσο και σε περιορισμένη έκθεση in vivo (Ha et al. 2001, Hafsi et al. 2004, Hamajima et al. 2003). Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν πως συμπληρώματα με γαλακτοβάκιλλους μπορούν να μειώσουν οριακά τα επίπεδα αποικισμού του H. pylori και της συνεπαγόμενης φλεγμονής (Sgouras et al. 2004, Sgouras et al. 2005) ενώ έχουν συνδεθεί και με αύξηση του ποσοστού εκρίζωσης του παθογόνου (Hamajima et al. 2001). 3. Παράγοντες παθογένειας 3.1. Παράγοντες παθογένειας του H. pylori Το γεγονός ότι ορισμένοι μόνο από τους μολυσμένους με H. pylori ασθενείς εμφανίζουν επιπλοκές πέραν της ενεργού χρόνιας γαστρίτιδας, οδήγησε στην υπόθεση πως κάποια βακτηριακά στελέχη είναι περισσότερο παθογόνα από άλλα. Συγκεκριμένα, παλιότερες έρευνες συσχέτισαν τη βαρύτητα της παθογένειας με την ικανότητα ενός στελέχους να επάγει έντονες μορφολογικές αλλαγές και εκτεταμένη βλάβη σε καλλιέργειες κυττάρων (Leunk et al. 1988). Στην κλινική έκφανση της λοίμωξης συμμετέχουν διάφοροι βακτηριακοί παράγοντες ενώ η ευρεία γενετική ποικιλομορφία του H. pylori δυσκολεύει στη διερεύνησή τους. Έχουν ωστόσο εντοπιστεί αρκετοί γονιδιακοί τόποι που κωδικοποιούν παράγοντες παθογένειας, όπως είναι το νησίδιο cag (cagpai), η τοξίνη VacA και η προσκολλητίνη Bab2, οι οποίοι συσχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης γαστρικού καρκίνου και πεπτικού έλκους (Gerhard et al. 1999, van Doorn et al. 1998). Συνακόλουθα με τον επιπολασμό της ασθένειας, η κατανομή αυτών των γονιδιακών τόπων ποικίλει γεωγραφικά. Ενώ το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη VacA απαντάται σε όλα τα στελέχη και μάλιστα σε αρκετούς συνδυασμούς αλληλομόρφων, εντούτοις μόνο το 60-70% των στελεχών H. pylori Δυτικού τύπου φέρουν το cagpai. Αντίθετα, το cagpai είναι παρόν στο % όλων των στελεχών Ασιατικού τύπου. Επιπλέον, το γονίδιο bab2 βρίσκεται περίπου στο 85% όλων των στελεχών Το νησίδιο cagpai και ο παράγοντας παθογένειας CagA. Το cagpai αποτελεί έναν από τους πιο σημαντικούς στελεχο-ειδικούς παράγοντες, οι οποίοι καθορίζουν την H. pylori παθογένεια. Αυτός ο γενετικός τόπος 40 kb, περιέχει 31 γονίδια που κωδικοποιούν το T4SS ενώ μπορεί να μεταβιβαστεί από το ένα βακτήριο στο άλλο με οριζόντια μεταφορά (Alm et al. 1999, Tomb et al. 1997). Ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά κατά τη διερεύνηση της τοπολογίας του γονιδίου που κωδικοποιεί την CagA, πρωτεΐνη η οποία αποτελεί δείκτη για την H. pylori παθογένεια (Atherton 1998). Το caga γονίδιο, εντοπίζεται 35

36 στο 3 άκρο της κωδικής αλυσίδας του cagpai, ενώ το προϊόν του χαρακτηρίζεται ως η μόνη γνωστή βακτηριακή πρωτεΐνη τελεστής, η οποία μεταφέρεται μέσω του T4SS στα κύτταρα του ξενιστή. Το T4SS σχηματίζει μια μεμβρανική προεκβολή, στην κορυφή της οποίας εντοπίζεται συχνά η CagA. Η πρωτεΐνη μεταφέρεται μέσα στα επιθηλιακά κύτταρα και σε μικρότερο βαθμό μέσα στα αιμοποιητικά (Bauer et al. 2005, Odenbreit et al. 2000). Η CagA έχει εντοπιστεί επίσης πάνω στην επιφάνεια κυστιδίων της εξωτερικής μεμβράνης (OMVs), τα οποία εκκρίνονται από το H. pylori (Olofsson et al. 2010). Επιπλέον, μόρια ιντεγκρίνης, στην επιφάνεια των κυττάρων του ξενιστή δρουν ως υποδοχείς, οι οποίοι επιτρέπουν την επιτυχή μεταφορά της CagA και κατά συνέπεια παίζουν σημαντικό ρόλο στη λειτουργικότητα του T4SS (Kwok et al. 2007). Ο ρόλος της CagA ως δείκτης παθογένειας προέκυψε από παρατηρήσεις σε ασθενείς με υψηλούς τίτλους αντισωμάτων έναντι της πρωτεΐνης, στους οποίους εμφανίζονταν συχνότερα κρούσματα πεπτικού έλκους και γαστρικού καρκίνου (Blaser et al. 1995, Nomura et al. 2002, Wu et al. 2003). Ο συσχετισμός της CagA με το γαστρικό καρκίνο εδραιώθηκε κατόπιν μελετών, οι οποίες κατέδειξαν ότι ιστο-ειδική έκφραση του caga σε διαγονιδιακά ποντίκια αυξάνει τους ρυθμούς πολλαπλασιασμού στο γαστρικό επιθήλιο συντελώντας έτσι στην ανάπτυξη γαστρικού αδενοκαρκινώματος και αιματολογικού τύπου καρκίνους (Ohnishi et al. 2008). Επιπλέον, η CagA μπορεί να προκαλέσει προφλεγμονώδεις αποκρίσεις και να ενεργοποιήσει το μονοπάτι του μεταγραφικού παράγοντα STAT3, ο οποίος θεωρείται ότι παίζει ρόλο στη γαστρική καρκινογένεση (Bronte-Tinkew et al. 2009). Παρόλα αυτά, στελέχη από τα οποία απουσιάζει το cagpai και ως εκ τούτου δεν εκφράζουν το caga, έχουν εντοπισθεί σε ασθενείς με πεπτικό έλκος ή γαστρικό καρκίνο, σε χαμηλότερες ωστόσο συχνότητες. Δεν έχουν ακόμη αποσαφηνιστεί οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η CagA συμμετέχει σε διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια αλλά και το αντίκτυπο στη γαστρική παθογένεια. Πρόσφατες έρευνες έδειξαν πως η CagA εκτιθέμενη στην επιφάνεια του T4SS, έχει την δυνατότητα αλληλεπίδρασης με μία εξωτερικευμένη φωσφατιδυλοσερίνη της κυτταρικής μεμβράνης, διευκολύνοντας την είσοδό της στα κύτταρα του ξενιστή (Murata- Kamiya et al. 2010). Συνακόλουθα της εισόδου της στα επιθηλιακά κύτταρα, η CagA υφίσταται διαδοχική φωσφορυλίωση σε αμινοξικά κατάλοιπα τυροσίνης από τις κινάσες τυροσίνης c-src και Abl, οι οποίες έχουν ταυτοποιηθεί και ως ογκοπρωτεΐνες (Asahi et al. 2000, Selbach et al. 2002, Stein et al. 2000). Μάλιστα, η φωσφορυλίωση ελέγχεται αυστηρά από το H. pylori με χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Mueller et al. 2012). Συγκεκριμένα, η c-src ενεργοποιείται μόνο κατά τα αρχικά στάδια της μόλυνσης (0.5-2 ώρες), ενώ η Abl ενεργοποιείται ισχυρά σε απώτερα χρονικά στάδια (2-8 ώρες) (Selbach et al. 2003, Tammer et al. 2007). 36

37 Η φωσφορυλίωση λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένη αλληλουχία-μοτίβο το καρβοξυτελικό άκρο της CagA, η οποία αποτελείται από αμινοξικά κατάλοιπα του τύπου Glu-Pro-Ile-Tyr- Ala. Η αλληλουχία αυτή ονομάζεται EPIYA, από τον κώδικα αμινοξικών καταλοίπων ενός γράμματος, ενώ ο αριθμός της μπορεί να ποικίλλει ανάλογα το στέλεχος (Hatakeyama 2008, Stein et al. 2002). Παράλληλα, έχουν ταυτοποιηθεί τέσσερα είδη μοτίβων EPIYA-τα A,B,C και η D. Εικόνα Α-8: Δομικοί πολυμορφισμοί στην CagA. Η CagA δυτικού τύπου περιέχει τα τμήματα EPIYA-A, EPIYA-B και EPIYA-C. Αντίθετα, η CagA ανατολικού τύπου περιλαμβάνει τα τμήματα EPIYA-A, EPIYA-B και EPIYA-D αλλά όχι το EPIYA-C. Το μοτίβο EPIYA (πράσινο χρώμα) σε κάθε τμήμα αντιπροσωπεύει τις θέσεις φωσφορυλίωσης της CagA. Προσαρμογή από (Yamaoka 2010). Τα μοτίβα EPIYA-A και EPIYA-B εμφανίζουν παγκόσμια κατανομή, ενώ το μοτίβο EPIYA- C παρουσιάζεται συχνότερα σε στελέχη από Δυτικές χώρες (π.χ. Ευρώπη, Αυστραλία, Βόρεια Αμερική) και μερικές Ασιατικές (Μαλαισία και Ινδία). Αντίθετα, το μοτίβο EPIYA-D εντοπίζεται κυρίως σε πρωτεΐνες CagA από χώρες της Ανατολικής Ασίας (Ιαπωνία, Κίνα και Κορέα) και συνδέεται με την ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου (Jones et al. 2009). Το δυναμικό παθογένειας της CagA καθορίζεται περαιτέρω από τον αριθμό των μοτίβων αλλά και την ποικιλία των θέσεων φωσφορυλίωσης. Υψηλή φωσφορυλίωση, προκαλούμενη από αύξηση στον αριθμό των μοτίβων EPIYA, οδηγεί στην βέλτιστη πρόσδεση μιας άλλης ογκοπρωτεΐνης, της SHP-2. Κατόπιν της πρόσδεσής της στην CagA, η SHP-2 απορρυθμίζεται λειτουργικά (Higashi et al. 2002). Η CagA στρατολογεί και ενεργοποιεί την SHP-2 με φωσφο-εξαρτώμενο τρόπο, η οποία οδηγεί σε δραματικές μορφολογικές αλλαγές στο κύτταρο του ξενιστή. Αυτές αντικατοπτρίζονται στον ισχυρό πολυμερισμό της ακτίνης και στην περαιτέρω κυτταρική επιμήκυνση (φαινότυπος «hummingbird»)(segal et al. 1999). 37

38 Από την άλλη, η έκφραση των θέσεων EPIYA-A και EPIYA-B συνδέεται με την ικανότητα της CagA να προσδένεται στην κινάση τυροσίνης Csk, η οποία με τη σειρά της αναστέλλει την c-src-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της CagA. Ως αποτέλεσμα, ελαττώνεται η επαγωγή της κυτταρικής επιμήκυνσης από το σύμπλεγμα CagA-SHP-2 (Naito et al. 2006). Αυτές οι αντικρουόμενες λειτουργίες διαφορετικών θέσεων EPIYA υπογραμμίζουν τον περίπλοκο και πολύπλευρο ρόλο της CagA κατά την H. pylori-παθογένεια. Η CagA αλληλεπιδρά με έναν μεγάλο αριθμό παραγόντων του κυττάρου ξενιστή, οι οποίοι εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος, γεγονός που δυσχεραίνει την αποσαφήνιση της λειτουργίας της. Αναφορικά με τις αλληλεπιδράσεις αυτές, ενδέχεται να είναι εξαρτώμενες ή μη από τη φωσφορυλίωση, ενώ τα εμπλεκόμενα μόρια ποικίλουν από κινάσες, έως μόρια προσαρμογής (Backert et al. 2010). Η πρόσδεση της CagA στο σύμπλοκο κινασών PAR1/MARK, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πολικότητας των επιθηλιακών κυττάρων, έχει δειχθεί πως είναι μη φωσφο-εξαρτώμενη (Saadat et al. 2007). Η αλληλεπίδραση της κινάσης PAR1 με την CagA αναστέλλει τη δραστηριότητά της, οδηγώντας στην αποδέσμευση της δεύτερης από τη μεμβράνη, επάγοντας αλλοιώσεις στην πολικότητα του κυττάρου και τις διακυτταρικές συνδέσεις. Τα αποτελέσματα αυτά εξαρτώνται από τα συντηρημένα αμινοξικά μοτίβα στο C-τελικό άκρο της CagA, το οποίο ορίζεται ως δομική αυτοτελής περιοχή πολυμερισμού της CagA (CM) (Ren et al. 2006). Η πρόσδεση της PAR1 στην CM συμμετέχει στο διμερισμό της CagA, και ως εκ τούτου ισχυροποιεί το δεσμό μεταξύ CagA και SHP-2. Η λειτουργική συσχέτιση αυτής της αλληλεπίδρασης έχει αποσαφηνιστεί περαιτέρω μέσω κρυσταλλογραφικής ανάλυσης της CagA, δείχνοντας πως η CM εμποδίζει τη λειτουργία της PAR1, καταλαμβάνοντας την περιοχή πρόσδεσης υποστρώματος της PAR1 (Nesic et al. 2010). Ως εκ τούτου, η αλληλεπίδραση μεταξύ CagA-PAR1 δεν προκαλεί μονάχα αλλοιώσεις στην πολικότητα αλλά προωθεί και μορφογενετική απόκριση, επαγόμενη από την αλληλεπίδραση της CagA και της SHP-2. Ένας ακόμη κυτταρικός παράγοντας, ο οποίος πιθανόν ενέχεται σε καρκινογενείς αποκρίσεις, συνδεόμενος με την δράση της CagA, είναι η καθολικά εκφραζόμενη πρωτεΐνη β-κατενίνη. Ενώ η β-κατενίνη, προσδεμένη στη μεμβράνη είναι σημαντικό συστατικό των χασμοσυνδέσμων, η κυτταροπλασματική β-κατενίνη συμμετέχει στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος Wnt. Κατά την αποσύνδεση του μορίου αναστολλέα GSK3β από τη β-κατενίνη, αυτή μετατίθεται στον πυρήνα, όπου επάγει τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων της, τα οποία εμπλέκονται στην καρκινογένεση (Wu & Pan 2010). Κατόπιν της μετάθεσής της στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή, η CagA επάγει τη συσσώρευση της β-κατενίνης στον πυρήνα, καθώς και τη λειτουργική της ενεργοποίηση, μέσω της κατάλυσης του μεμβρανικού 38

39 συμπλέγματος E-καδερίνη/β-κατενίνη (Franco et al. 2005, Murata-Kamiya et al. 2007, Suzuki et al. 2005). Επίσης έχει δειχθεί πως η μόλυνση του H. pylori οδηγεί σε AKTεξαρτώμενη και παράλληλα ανεξάρτητη της CagA ενεργοποίηση της β-κατενίνης, μέσω φωσφορυλίωσης και κατόπιν σε απενεργοποίηση του αναστολέα της β-κατενίνης GSK3β (Sokolova et al. 2008). Εικόνα Α-9: Μοριακή παθολογία της CagA. Η CagA μετατίθεται μέσω δομικών αυτοτελών περιοχών φωσφατιδυλοσερίνης εντός του κυττάρου ξενιστή, όπου φωσφορυλιώνεται μέσω των κινασών Src και Abl. Η φωσφορυλίωση οδηγεί σε αλληλεπίδραση με τη φωσφατάση τυροσίνης SHP-2, η οποία επάγει ενεργοποίηση της ERK1/2. Τα μοριακά αυτά συμβάντα προκαλούν κυτταρική επιμήκυνση. Επιπλέον, η CagA μπορεί να αναστείλει την ενδοκυττάρωση του EGFR, εμποδίζοντας την αποικοδόμηση των υποδοχέων. Η CagA ενεργοποιεί επίσης τη β-κατενίνη και το STAT3, τα οποία οδηγούν σε μεταγραφή ογκογονιδίων. Η αλληλεπίδραση μεταξύ CagA και συμπλέγματος PAR1/MAPK μπορεί επίσης να οδηγήσει στην κατάργηση της κυτταρικής πολικότητας. Προσαρμογή από (Bauer & Meyer 2011) Μελέτες αλληλεπιδράσεων μεταξύ CagA-ξενιστή αποκαλύπτουν πολύτιμες πληροφορίες όσον αφορά στους μοριακούς μηχανισμούς, μέσω των οποίων το H. pylori επάγει εν δυνάμει καρκινογενείς αποκρίσεις. Παρόλα αυτά, οι υποκείμενοι μηχανισμοί σχετικά με την σχέση της CagA με το έλκος παραμένουν άγνωστοι. 39

40 3.1.2.Το νησίδιο παθογένειας cag και η μεταφορά της πεπτιδογλυκάνης. Εκτός από την μετάθεση της CagA, το T4SS φαίνεται ότι εμπλέκεται επίσης στην ενεργοποίηση και την έκφραση χημειοκινών, όπως η ιντερλευκίνη-8 (IL-8), που καθοδηγούν την ουδετεροφιλική διήθηση στο γαστρικό χόριο. Σε αυτή τη διαδικασία εμπλέκεται η συνδυαστική ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ και AP-1 του ξενιστή. Ο AP-1 ενεργοποιείται μέσω του μονοπατιού των MAPK (Bhattacharyya et al. 2002, Naumann et al. 1999, Sharma et al. 1998). Η φωσφορυλίωση της MAPK και η περαιτέρω ενεργοποίηση του AP-1 εξαρτώνται από τον παράγοντα αναγνώρισης ενδοκυτταρικών μοτίβων (NOD-1) (Allison et al. 2009). Ο NOD-1 αναγνωρίζει διάφορα βακτηριακά συστατικά, μεταξύ των οποίων και η πεπτιδογλυκάνη. Ειδικότερα, έχει προταθεί πως η πεπτιδογλυκάνη μεταφέρεται μέσα στο κύτταρο του ξενιστή μέσω του T4SS επάγοντας έτσι την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ μέσω του NOD-1 (Viala et al. 2004). Στη μεταφορά αυτή μεσολαβούν οι λιπιδιακές σχεδίες της πλασματικής μεμβράνης του κυττάρου-ξενιστή (Hutton et al. 2010). Απουσία του T4SS, η μεταφορά της πεπτιδογλυκάνης μπορεί να λάβει χώρα, με τη βοήθεια βακτηριακών OMVs κυστιδίων, τα οποία εισέρχονται στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα μέσω των λιπιδιακών σχεδίων (Hutton et al. 2010). Αυτός ο μηχανισμός επεξηγεί την διαφορά στην έκκριση IL-8 από διαφορετικές επιθηλιακές κυτταρικές σειρές και την εξάρτηση της έκκρισης αυτής από το T4SS (Bauer et al. 2005). Ειδικότερα, λαμβάνονται υπ όψιν οι διαφορές στη σύσταση των υποδοχέων που συνδέονται με τις λιπιδιακές σχεδίες, καθορίζοντας το βαθμό εξάρτησης της μεταφοράς της πεπτιδογλυκάνης από το T4SS ή/και τα OMV. Αμφότερες οι CagA και η πεπτιδογλυκάνη φαίνεται πως είναι υπεύθυνες για την επαγωγή μιας T4SS-εξαρτώμενης φλεγμονώδους απόκρισης. Παρ όλα αυτά, η ικανότητα της CagA να ενέχεται στην έκφραση της IL-8 δεν είναι ίδια για όλα τα CagA-θετικά στελέχη (Brandt et al. 2005, Kim et al. 2006). Παρατηρήσεις σε PaCS (particle-rich cytoplasmic structures) έδειξαν συσσώρευση των CagA και NOD-1, ενισχύοντας την παραδοχή ότι η CagA και η πεπτιδογλυκάνη είναι δυνατόν να επάγουν αποκρίσεις φλεγμονής και πολλαπλασιασμού στο γαστρικό επιθήλιο, με πιθανή παθολογική συσχέτιση (Necchi et al. 2010). Αντίθετα, πρόσφατες μελέτες φανερώνουν πως η έλλειψη της βακτηριακής αποακετυλάσης PgdA, η οποία είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική σύνθεση της πεπτιδογλυκάνης, έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη μεταφορά της CagA μέσα στα κύτταρα του ξενιστή (Franco et al. 2009). Το στοιχείο αυτό υποδηλώνει ότι ακόμα και απουσία πεπτιδογλυκάνης από το H. pylori διατηρεί την ικανότητά του να επάγει φλεγμονώδη απόκριση. 40

41 Κυτταροτοξική πρωτεΐνη VacA. H πρωτεΐνη VacA του H. pylori είναι μια εκκρινόμενη βακτηριακή τοξίνη, η οποία συμβάλλει στην εγκατάσταση της λοίμωξης αλλά και της παθογένειας με πολλαπλούς τρόπους. Όπως και η CagA, η έκφραση της συνδέεται με τη δημιουργία επιθηλιακού έλκους (Wada et al. 2004). Η VacA ταυτοποιήθηκε αρχικά μέσω της ικανότητάς της να προκαλεί κυστιδιοποίηση σε καλλιέργειες επιθηλιακών κυττάρων (Leunk et al. 1988). Τα κενοτόπια που επάγονται από την VacA είναι θετικά σε πρωτεΐνες-δείκτες του ώριμων ενδοκυτταρικών κυστιδίων, συμπεριλαμβανομένων των Rab7και LAMP1 (Li et al. 2004, Molinari et al. 1997, Papini et al. 1994). Εικάζεται ότι η VacA επάγει τη δημιουργία μεγάλων κενοτοπίων κατόπιν ενσωμάτωσής της σε ενδοσωμικές δομές, όπου ανιόντο-ειδικά κανάλια, οδηγούν στη διόγκωση των δομών αυτών (Cover & Blanke 2005). Παρόλο που η κυστιδιοποίηση παρατηρείται in vitro, δεν ισχύει το ίδιο και in vivo (Friedl & Wolf 2008). Η αμινοξική αλληλουχία της VacA δεν μοιάζει με αυτές άλλων προκαρυωτικών ή ευκαρυωτικών πρωτεϊνών. Παράλληλα, ενώ όλα τα στελέχη περιέχουν το γονίδιο vaca, η αλληλουχίες τους διαφέρουν σημαντικά. Τα vaca αλληλόμορφα διακρίνονται από διαφορές στην 5 περιοχή (περιοχή s) αλλά και τη μεσαία (περιοχή m). Τα στελέχη, τα οποία διαθέτουν γονότυπο s1m1 συνδέονται με αυξημένο κίνδυνο πεπτικού έλκους και γαστρικού αδενοκαρκινώματος συγκριτικά με στελέχη, τα οποία διαθέτουν άλλες μορφές αλληλομόρφων, όπως για παράδειγμα τα s2m2 (Atherton et al. 1995, Figueiredo et al. 2002). Σε χώρες με υψηλά ποσοστά αδενοκαρκινώματος όπως είναι η Κολομβία και η Ιαπωνία, τα περισσότερα στελέχη H. pylori περιλαμβάνουν τύπους vaca αλληλομόρφων με υψηλότερη παθογένεια (Van Doorn et al. 1999a). In vivo πειραματικές μελέτες επιβεβαιώνουν την συσχέτιση των vaca αλληλομόρφων και της γαστρικής παθογένειας. Συγκεκριμένα, αναφέρουν αλλοιώσεις του βλεννογόνου και γαστρική φλεγμονή κατόπιν χορήγησης μεγάλων ποσοτήτων VacA στον γαστρικό ιστό ποντικών (Telford et al. 1994). Επιπλέον, σχετικά πειράματα σε γερβίλους, οι οποίοι μολύνθηκαν με ισογενή αγρίου-τύπου αλλά και vaca knockout μεταλλαγμένα στελέχη έδειξαν ότι η VacA συμβάλλει στην ανάπτυξη γαστρίτιδας (Ogura et al. 2000). Εκτός από την ικανότητά της VacA να επάγει τον σχηματισμό κυστιδίων σε επιθηλιακά κύτταρα in vitro, μπορεί επίσης να προκαλέσει απόπτωση, μια διαδικασία η οποία περιορίζεται στον περισσότερο παθογενή συνδυασμό αλληλομόρφων s1m1 (Cover et al. 2003). Η υπομονάδα p34 της VacA ρυθμίζει τη διαπερατότητα της μιτοχονδριακής μεμβράνης μέσω ενός μηχανισμού εξαρτώμενου από τη δραστηριότητα καναλιών τοξινών, οδηγώντας τελικά στην απελευθέρωση του κυτοχρώματος c και την ενεργοποίηση της κασπάσης 3 (Galmiche et al. 2000, Willhite & Blanke 2004). 41

42 Καθώς τα VacA μεταλλάγματα, που δεν έχουν τη δυνατότητα να σχηματίζουν μεμβρανικά κανάλια αδυνατούν να επάγουν απελευθέρωση του κυτοχρώματος C, φαίνεται πιθανό πως οι VacA-μεσολαβούμενες αλλαγές στα μιτοχόνδρια βασίζονται στο σχηματισμό καναλιώνvaca στη μιτοχονδριακή μεμβράνη (Willhite et al. 2003). Σε αντίθεση με την VacA, η CagA επιδεικνύει αντιαποπτωτικό χαρακτήρα, οδηγώντας στην υπόθεση πως αυτοί οι δύο κομβικοί παράγοντες παθογένειας ίσως έχουν ανταγωνιστικές δράσεις. Πράγματι, η CagA έχει δειχθεί ότι αναστέλλει την απόπτωση που επάγεται από την VacA και παράλληλα μειώνει τον σχηματισμό κυστιδίων στα επιθηλιακά κύτταρα, ενώ η VacA μπορεί να εμποδίσει την κυτταρική επιμήκυνση που επάγει η CagA (Argent et al. 2008, Oldani et al. 2009). Αναφορικά με τον τελευταίο ρόλο της VacA, η πρωτεΐνη ασκεί τον ανασταλτικό της ρόλο εμπλεκόμενη σε μονοπάτια σηματοδότησης σχετικά με την κυτταρική επιμήκυνση, όπως για παράδειγμα το μονοπάτι EGFR (Tegtmeyer et al. 2009). Σημειωτέον ότι σε cagpai-θετικά στελέχη εντοπίζονται με μεγαλύτερη συχνότητα περισσότερο τοξικές s1 μορφές της VacA, ενώ τα cagpai-αρνητικά στελέχη διαθέτουν γενικά μη τοξικές s2 μορφές. Εικόνα Α-10: Δομή του γονιδίου vaca. Περιλαμβάνει πολυμορφικές περιοχές, οι οποίες οργανώνονται σε περιοχή σηματοδότησης (s), ενδιάμεση περιοχή (i) και μεσαία περιοχή (m). Προσαρμογή από (Polk & Peek 2010) 42

43 Πρόσθετοι παράγοντες παθογένειας. Εκτός από το νησίδιο cagpai και τις πρωτεΐνες CagA και VacA, επιπλέον παράγοντες παθογένειας εμπλέκονται στην κλινική εικόνα της H. pylori-μόλυνσης. Το γονίδιο dupa (duodenal ulcer-promoting gene A), το οποίο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη ομόλογη της VirB4 ATPάσης, σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης δωδεκαδακτυλικού έλκους αλλά και με ελαττωμένη πιθανότητα γαστρικής ατροφίας και γαστρικού καρκίνου (Lu et al. 2005). Πρόσφατες έρευνες δείχνουν πως το γεγονός αυτό οφείλεται ενδεχομένως στην έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών που επάγει το dupa από τα μονοπύρηνα κύτταρα (Hussein et al. 2010). Ένα ακόμη γονίδιο που εμπλέκεται στο πεπτικό έλκος είναι το icea1, το οποίο παρουσιάζει σημαντικές γεωγραφικές διαφορές στην έκφρασή του (Yamaoka et al. 1999). Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί μια περιοριστική ενδονουκλεάση με αλληλουχία αναγνώρισης την CATG, ενώ επάγεται από την προσκόλληση του βακτηρίου στο γαστρικό επιθήλιο (Peek et al. 1998). Η OipA (HopH) της εξωτερικής μεμβράνης του βακτηρίου, ανήκει στην οικογένεια πρωτεϊνών Hop και έχει ταυτοποιηθεί ως ένας εν δυνάμει παράγοντας παθογένειας. Παρόμοια με το γονίδιο vaca, το oipa εντοπίζεται σε όλα τα στελέχη του H. pylori αλλά η έκφρασή του τροποποιείται από μεταβλητούς αριθμούς επαναλήψεων CT δινουκλεοτιδίων στην 5 περιοχή. Η OipA ταυτοποιήθηκε αρχικά ως πρωτεΐνη επαγωγής φλεγμονώδους απόκρισης, ενώ ενδεχομένως να λειτουργεί και ως προσκολλητίνη (Yamaoka et al. 2000). Η έκφρασή της συνδέεται με αυξημένη in vitro και in vivo παραγωγή της IL-8 και πρόσφατα η OipA έχει δειχθεί ότι εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, καταλήγοντας σε αλλοίωση του φαινοτύπου του κυττάρου-ξενιστή (Tabassam et al. 2008). Άλλες προσκολλητίνες της πρωτεϊνικής οικογένειας Hop, όπως η SabA (HopP) και η BabA (HopS) χαρακτηρίζονται επίσης ως βακτηριακοί παθογόνοι παράγοντες, καθώς μεσολαβούν στην προσκόλληση του βακτηρίου στον ξενιστή Παράγοντες του ξενιστή που καθορίζουν την λοίμωξη του H. pylori. Έχει διαπιστωθεί πως εκτός από το βακτήριο, τα γονιδίωμα του ξενιστή διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην κλινική έκφανση των λοιμώξεων από H. pylori. Πράγματι, γενετικοί πολυμορφισμοί του ξενιστή, οι οποίοι επιδρούν στα επίπεδα έκφρασης σημαντικών γονιδίων που εμπλέκονται στην παθογένεια, επηρεάζουν την ευαισθησία στην λοίμωξη από H. pylori και κατ επέκταση τη βαρύτητα των κλινικών συμπτωμάτων. Γενικότερα, γενετικοί πολυμορφισμοί σε φλεγμονώδη γονίδια τείνουν να αυξάνουν τον κίνδυνο γαστρικού καρκίνου, όπως έχει δειχθεί για την IL-1, μια ισχυρή κυτοκίνη, αλλά και το σημαντικότερο αναστολέα έκκρισης γαστρικού οξέος (Calam 1999). Η IL-1 κωδικοποιείται από ένα 43

44 γονιδιακό σύμπλεγμα, το οποίο περιλαμβάνει τα γονίδια των IL-1B (γονίδιο που κωδικοποιεί την IL-1) και IL-RN (γονίδιο που κωδικοποιεί τον ανταγωνιστή του υποδοχέα της IL-1). Αρκετοί πολυμορφισμοί, όπως ο IL-1B*-31C, οδηγούν στην έκφραση μεγάλων ποσοτήτων IL-1β και συνακόλουθη μείωση της έκκρισης οξέος (El-Omar et al. 2001). Η μειωμένη έκκριση γαστρικού οξέος συνδέεται με τον αποικισμό του σώματος από το H. pylori, ο οποίος οδηγεί σε εμφάνιση ατροφικής πανγαστρίτιδας και ως εκ τούτου σε σημαντικό κίνδυνο γαστρικού καρκίνου και πεπτικού έλκους (El-Omar et al. 2003, Furuta et al. 2004, Hwang et al. 2003, Machado et al. 2003, Rad et al. 2003, Zambon et al. 2002). Παρόμοια αποτελέσματα έχουν περιγραφεί για πολυμορφισμούς σε άλλα γονίδια σχετικά με τη φλεγμονή, όπως για παράδειγμα τα γονίδια που κωδικοποιούν τον Παράγοντα Νέκρωσης Όγκων-α (TNF-α) και την IL-10. Διακριτοί πολυμορφισμοί στο TNF-α οδηγούν σε αυξημένη έκφραση TNF-α, η οποία επηρεάζει, σε συνδυασμό με την IL-1, την παραγωγή γαστρίνης και τελικά την παραγωγή οξέος από τα τοιχωματικά κύτταρα (Suzuki et al. 2001). Επιπλέον, εκτός από αλλαγές στην παραγωγή οξέος, οι ασθενείς με καρκίνο, οι οποίοι φέρουν τον γονότυπο IL1B-511T/T παρουσιάζουν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης συγκεκριμένων γονιδίων συγκριτικά με ασθενείς με διαφορετικούς γονότυπους. Η παρατήρηση αυτή οδηγεί στην υπόθεση ότι το αλληλόμορφο L1B-511T/T σχετίζεται με υπερμεθυλίωση πολλαπλών νησίδων CpG, η οποία πιθανόν συμβάλλει στον υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης γαστρικού καρκίνου σε άτομα μολυσμένα με H. pylori (Yoo et al. 2010). Παρόμοια με συγκεκριμένους γονότυπους IL-1, οι TNF-α πολυμορφισμοί συνδέονται στενά με την H. pylori-λοίμωξη και τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης γαστρικού καρκίνου (El- Omar et al. 2003, Ohyama et al. 2004, Yea et al. 2001). Επιπροσθέτως, ειδικοί απλότυποι IL-10 οδηγούν σε υψηλότερη έκφραση επιπέδων κυτοκινών, με συνέπεια την προώθηση αντι-φλεγμονώδους απόκρισης από το κύτταρο του ξενιστή (El-Omar et al. 2001, Hamajima et al. 2003, Hellmig et al. 2005, Zambon et al. 2005). Το γεγονός αυτό συνδέεται με αποικισμό περισσότερο παθογόνων H. pylori στελεχών (Rad et al. 2004). Αντίθετα, ειδικοί απλότυποι IL-10 επάγουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης της IL-10, ευνοώντας τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις και αυξάνοντας τον κίνδυνο γαστρικού καρκίνου. Πολυμορφισμοί σε άλλα γονίδια επηρεάζουν ενδεχομένως την παθογένεια που επάγει το H. pylori. Για παράδειγμα, μια συγκεκριμένη παραλλαγή της αλληλουχίας του υποκινητή του TLR-9 δημιουργεί μια περιοχή πρόσδεσης του NF-κB, η οποία αυξάνει τη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου (Ng et al. 2010). Καθώς η ενεργοποίηση του NFκB σχετίζεται με προκαρκινικές γαστρικές αλλοιώσεις, αυτός ο γονότυπος μπορεί να εμπλέκεται ενδεχομένως στον καρκίνο του στομάχου που επάγει το H. pylori. Επιπλέον, τα γονίδια που κωδικοποιούν την IL-8 και την NOD1 έχει δειχθεί ότι συνδέονται με το H. pylori επαγόμενο δωδεκαδακτυλικό έλκος αλλά και τη γαστρίτιδα (Hofner et al. 2007). 44

45 Ο αριθμός των πολυμορφισμών σε αυτά τα γονίδια επίσης φαίνεται ότι επηρεάζει δραματικά την κλινική έκβαση. Συμπερασματικά, ενώ οι πολυμορφισμοί ενός αλληλομόρφου γονιδίου που εμπλέκεται σε φλεγμονώδεις αποκρίσεις ενδεχομένως αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου από δύο έως τρεις φορές, η παρουσία ωστόσο πολλαπλών γονοτύπων εντείνει περαιτέρω τον κίνδυνο αυτό (Macarthur et al. 2004, Machado et al. 2003). 4. MMPs 4.1. Εξωκυττάρια θεμέλια ουσία Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (extracellular matrix-ecm) αποτελεί μια μη-κυτταρική δομή, παρούσα σε όλους τους ιστούς και ως εκ τούτου απαραίτητη για τη ζωή. Η ECM δημιουργείται κατά την πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη ενώ σε κάθε όργανο διαθέτει μοναδική σύσταση. Παρέχει συνοχή και ελαστικότητα στους ιστούς ενώ αναδιοργανώνεται διαρκώς, ελέγχοντας την ομοιοστασία στον ιστό (Hynes 2009). Η λειτουργική σημασία της ECM φανερώνεται σε περιπτώσεις μεταλλαγών γονιδίων, τα οποία κωδικοποιούν συστατικά της, με αποτέλεσμα ένα μεγάλο εύρος διαταραχών του ιστού (Bateman et al. 2009, Jarvelainen et al. 2009). Στα θηλαστικά, η ECM συντελείται από περίπου 300 πρωτεΐνες, οι οποίες περιλαμβάνουν το κολλαγόνο, πρωτεογλυκάνες (PGs) και γλυκοπρωτεΐνες (Hynes & Naba 2012). Υπάρχουν δύο κύρια είδη ECM, τα οποία διαφέρουν αναφορικά με την τοπολογία και τη σύστασή τους: η θεμέλια ουσία ενδιάμεσου συνδετικού ιστού, η οποία περιβάλλει τα κύτταρα και παρέχει υποστηρικτικό υπόστρωμα στους ιστούς και η βασική μεμβράνη, η οποία αποτελεί εξειδικευμένη μορφή της ECM και διαχωρίζει το επιθήλιο από το περιβάλλον στρώμα. Συστατικά της ECM, όπως είναι οι ιντεγκρίνες, λειτουργούν ως συνδέτες για διάφορους υποδοχείς επιθηλιακών κυττάρων, επάγοντας έτσι τη μεταγωγή σημάτων για διαδικασίες που ελέγχουν την προσκόλληση, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την επιβίωση ή τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Η ECM είναι επίσης ικανή για απομάκρυνση και τοπική απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων, όπως ο EGF (epidermal growth factor), ο FGF (fibroblast growth factor) καθώς και άλλων σηματοδοτικών μορίων. Τα συστατικά της ECM απομακρύνονται μέσω εκτομής από διαφορετικές οικογένειες πρωτεασών, μεταξύ των οποίων είναι και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs). Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η αναδιοργάνωση της ECM ενώ η απορρύθμισή της συνδέεται με διαφορετικές παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι η ίνωση, η οστεοαρθρίτιδα και ο καρκίνος (Frantz et al. 2010, Zhen & Cao 2014). 45

46 4.2. Χαρακτηριστικά των MMPs Μεταλλοπρωτεϊνάσες εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας (MMPs) Οι MMPs συγκροτούν μια μεγάλη οικογένεια ενδοπεπτιδασών, η δράση των οποίων εξαρτάται από ιόντα ψευδαργύρου. Συμμετέχουν στην αναδιαμόρφωση του ιστού και στην αποδόμηση συστατικών της ECM, όπως οι κολλαγενάσες, οι ελαστίνες, η ζελατίνη, οι γλυκοπρωτεΐνες της θεμέλιας ουσίας αλλά και οι πρωτεογλυκάνες. Οι MMPs εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα υπό φυσιολογικές συνθήκες, διατηρώντας την ομοιόσταση του οργανισμού. Η έκφρασή τους ρυθμίζεται από ορμόνες, αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες καθώς και από τους ενδογενείς αναστολείς των MMPs. Οι ιστικοί αναστολείς των MMPs (TIMPs) ασκούν επιπλέον εξειδικευμένο ενζυμικό έλεγχο. Η υπερέκφραση των MMPs έχει ως αποτέλεσμα την ανισορροπία μεταξύ της δραστηριότητας αυτών και των TIMPs, η οποία μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές παθολογικές καταστάσεις. Οι πρώτες περιγραφές των MMPs έγιναν το 1949, όταν αναφέρθηκαν ως ένζυμα αποπολυμερισμού, για τα οποία προτάθηκε ότι εμπλέκονται στην ογκογένεση. Η πρώτη MMP σπονδυλωτού, η κολλαγενάση, απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε 13 χρόνια αργότερα, ως το υπεύθυνο ένζυμο για την απορρόφηση της ουράς του γυρίνου κατά τη μεταμόρφωσή του σε ενήλικο άτομο. Στη συνέχεια, απομονώθηκαν αρκετά ένζυμα θηλαστικών, ενώ από το 1985 και ύστερα κατέστη δυνατή η αποτελεσματική ταυτοποίηση τους, μέσω των τεχνικών της μοριακής βιολογίας (Alexander et al. 1996, Baker et al. 2002, Rydlova et al. 2008, Woessner & Nagase 2000) Δομή των MMPs Ι. Τα περισσότερα μέλη της οικογένειας των MMPs οργανώνονται σε 3 διακριτές και συντηρημένες δομικά αυτοτελείς περιοχές βάσει των χαρακτηριστικών δομής τους. Αμινο-τελικό πεπτίδιο σηματοδότησης (Pre- /signal peptide): περιοχή του αμινοτελικού άκρου, η οποία εκτέμνεται από πεπτιδάσες σηματοδότησης κατά την είσοδο της MMP στο ενδοπλασματικό δίκτυο. 46

47 Αμινο-τελικό πρόδρομο πεπτίδιο/προπεπτίδιο (Propeptide): Αποτελείται από περίπου αμινοξικά κατάλοιπα, στα οποία συμπεριλαμβάνεται μια ισχυρά συντηρημένη αλληλουχία (PRCGXPD). Αφαίρεση του προπεπτιδίου μέσω πρωτεόλυσης οδηγεί στην ενεργοποίηση του ζυμογόνου, καθώς όλα τα μέλη της οικογένειας των MMPs παράγονται σε ανενεργή μορφή. Σε αρκετές περιπτώσεις η πρωτεόλυση λαμβάνει χώρα σε ειδική περιοχή αναγνώρισης από φουρίνη. Καταλυτική περιοχή (Catalytic domain): περιλαμβάνει 2 ιόντα ψευδαργύρου και τουλάχιστον ένα ιόν ασβεστίου σε διάφορα κατάλοιπα. Ένα από τα δύο ιόντα ψευδαργύρου εντοπίζεται στο ενεργό κέντρο και αλληλεπιδρά με τη σουλφυδρυλική ομάδα του καταλοίπου κυστεΐνης του προπεπτιδίου, συντηρώντας την πρωτεΐνη σε ανενεργό μορφή. Σημειωτέον ότι ορισμένες MMPs προσδένονται στο υπόστρωμα τους μέσω ειδικών επαναλήψεων αμινοξικών καταλοίπων, οι οποίες προσομοιάζουν το μοτίβο πρόσδεσης (RGD) κολλαγόνου της φιμπρονεκτίνης (FN). II. Ανάμεσα στα διάφορα μέλη των MMPs, στο καρβοξυ-τελικό άκρο, εμφανίζονται επιπλέον δομικές αυτοτελείς περιοχές. Περιοχή ομοιάζουσα με αιμοπηξίνη (Hemopexin-like domain): είναι ισχυρά συντηρημένη περιοχή η οποία εμφανίζει ομοιότητα στην αλληλουχία με την πρωτεΐνη του πλάσματος αιμοπηξίνη. Συνδέεται με την καταλυτική περιοχή μέσω μιας εύκαμπτης αρθρωτής υποπεριοχής (hinge subdomain) ενώ περιλαμβάνει 4 επαναλήψεις αιμοπηξίνης με έναν δισουλφιδικό δεσμό ανάμεσα στην πρώτη και την τέταρτη. Έχει δειχθεί ότι διαδραματίζει λειτουργικό ρόλο στην πρόσδεση υποστρώματος ή/και στις αλληλεπιδράσεις με τα TIMPs, μια οικογένεια συγκεκριμένων αναστολέων MMPs (Chambers & Matrisian 1997, Lockhart et al. 2003). Διαμεμβρανική περιοχή (Transmembrane domain): αφορά σε μεμβρανικού τύπου MMPs (MT-MMPs), μέσω της οποίας συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη. Αποτελείται από μια αλληλουχία υδρόφοβων αμινοξέων ενώ συνδέεται επιπλέον με μια κυτταροπλασματική περιοχή, η οποία συμμετέχει σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος. 47

48 Εικόνα Α-11: Σχηματική απεικόνιση της δομής των MMPs. Όλα τα μόρια MMPs διαθέτουν μια συντηρημένη περιοχή αποτελούμενη διαδοχικά από το αμινο-τελικό πεπτίδιο σηματοδότησης (Pre), το πρόδρομο πεπτίδιο (Pro) και την καταλυτική περιοχή. Η αλληλεπίδραση μεταξύ της σουλφυδρυλικής ομάδας του προδρόμου πεπτιδίου και του Zn 2+ της καταλυτικής περιοχής διατηρούν το μόριο σε ανενεργή μορφή. Η ενεργοποίηση του ενζύμου συνήθως απαιτεί πρωτεολυτική εκτομή του προδρόμου πεπτιδίου, η οποία συχνά λαμβάνει χώρα σε περιοχή αναγνώρισης από πρωτεάσες ομοιάζουσες με φουρίνη (Fu), μεταξύ του προδρόμου πεπτιδίου και της καταλυτικής περιοχής. Οι περισσότερες MMPs περιλαμβάνουν επιπλέον μια περιοχή ομοιάζουσα με αιμοπηξίνη. Επιπροσθέτως, οι MMPs που αγκυροβολούν στη μεμβράνη χρησιμοποιούν είτε μια καρβοξυ-τελική διαμεμβρανική περιοχή (TM) συνδεδεμένη με μια κυτταροπλασματική (Cy), είτε μέσω άγκυρας γλυκοσυλ-φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης (GPI). Εξαίρεση αποτελεί η MMP-23, η οποία αγκυροβολεί στη μεμβράνη μέσω μιας αμινοτελικής αλληλουχίας (SA). Η MMP-23 περιλαμβάνει επίσης μια αλληλουχία διάταξη κυστεΐνης (CA) και μια περιοχή ομοιάζουσα με ανοσοσφαιρίνη (Ig). Σημειωτέον ότι οι MMP-2 και -9 προσδένονται στο υπόστρωμα ζελατίνης μέσω ειδικών επαναλήψεων αμινοξικών καταλοίπων, οι οποίες προσομοιάζουν το μοτίβο πρόσδεσης κολλαγόνου της φιμπρονεκτίνης (FN). Προσαρμογή από (Kessenbrock et al.) 48

49 Κατηγοριοποίηση των MMPs Η οικογένεια των MMPs στον άνθρωπο περιλαμβάνει τουλάχιστον 26 ένζυμα, ενώ συνεχώς προστίθενται νέα μέλη (Egeblad & Werb 2002, Mannello 2006, Massi et al. 2003, Nabeshima et al. 2002). Υπάρχουν διάφορα συστήματα κατηγοριοποίησης των MMPs: I. Με βάση το υπόστρωμα, στο οποίο εξειδικεύονται (Πίνακας 1) (Korem et al. 2002, Massi et al. 2003, Nelson et al. 2000, Stetler-Stevenson 1999). Πίνακας A-1 Ομάδα Μέλη Υπόστρωμα Κολλαγενάσες MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18 Κολλαγόνο (I-V, VII-X και XIV), ζελατίνη, L-σελεκτίνη, πρωτεογλυκάνες, MMP-2 και MMP-9. Ζελατινάσες MMP-2, MMP-9 Ζελατίνη, κολλαγόνο (IV-VII, X και XIV), ελαστίνη, φιμπρονεκτίνη. Στρωμελυσίνες MMP-3 Κολλαγόνο (III-V και IX), ζελατίνη, αγκρεκάνη, λαμινίνη, ελαστίνη, πλασμινογόνο, MMP- 2/TIMP-2, MMP-7, MMP-8, MMP-9 και MMP-13. MMP-10, MMP-11, MMP-17 Κολλαγόνο (III-V), ζελατίνη, ελαστίνη, MMP-1 και MMP-8. Ματριλυσίνες MMP-7, MMP-26 Μεγάλο εύρος συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Μεμβρανικού τύπου (MT) MMP-14 έως MMP-17, MMP- 24, MMP-25 Κολλαγόνο (I-III), λοιπά συστατικά, MMP-2 και MMP-13. Λοιπές MMPs MMP-12, MMP-19 έως MMP- 23, MMP-28, MMP-29 Μεγάλη ετερογένεια υποστρωμάτων 49

50 II. Αποκλειστικά βάσει τοπολογίας, οι MMPs χωρίζονται σε εκκρινόμενες (MMP-1, -2, -3, - 7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -19, -20, -21, -27, -28) και μεμβρανικού τύπου (MT) (MMP-14, - 15, -16, -17, -23, -24, -25). Οι τελευταίες αποτελούν μη διαλυτά μόρια, με κοινό χαρακτηριστικό τη σύνδεση στην κυτταρική μεμβράνη. III. Με βάση τη στερεοδιάταξη της πρωτεΐνης. Α. Τυπικής δομής MMPs: συγκροτούνται από τις 3 ανθρώπινες κολλαγενάσες (MMP-1,-8 και -13), 2 στρωμελυσίνες (MMP-3 και -10) και τέσσερις επιπρόσθετες MMPs με μοναδικά χαρακτηριστικά (MMP-12, -19, -20 και -27). Β. Ματριλυσίνες (MMP-7 και -26): δεν διαθέτουν την περιοχή αιμοπηξίνης. Γ. Ζελατινάσες (MMP-2 και -9): περιλαμβάνουν 3 δομές φιμπρονεκτίνης τύπου 2, οι οποίες παρέχουν μια συμπαγή περιοχή πρόσδεσης κολλαγόνου. Δ. MMPs ενεργοποιούμενες από φουρίνη i) Mεμβρανικού τύπου-mmps: εντοπίζονται στην κυτταρική επιφάνεια μέσω της καρβοξυτελικής διαμεμβρανικής περιοχής (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP και MT5-MMP) ή μέσω άγκυρας γλυκοφωσφατιδυλινοσιτόλης (MT4-MMP και MT6-MMP). Οι MT-MMPs διαθέτουν στο εσωτερικό τους επιπρόσθετα κατάλοιπα μεταξύ του πρόδρομου πεπτιδίου και της καταλυτικής περιοχής, τα οποία εκτέμνονται από πρωτεάσες σερίνης ομοιάζουσες με φουρίνη, οδηγώντας στην ενδοκυτταρική ενεργοποίηση των προενζύμων. ii) Η προαναφερθείσα περιοχή εκτομής είναι επίσης παρούσα σε 3 εκκρινόμενες MMPs (MMP-11, -21 και -28), οι οποίες δεν ανήκουν σε καμία από τις παραπάνω κατηγορίες αλλά αποτελούν 2 ασυνήθιστες διαμεμβρανικές MMPs, (MMP-23A και -23B), οι οποίες αγκυροβολούν μέσω ενός αμινο-τελικού τμήματος στην κυτταρική μεμβράνη. Επιδεικνύουν ταυτόσημη αμινοξική αλληλουχία, παρά το γεγονός ότι κωδικοποιούνται από 2 διακριτά γονίδια. 50

51 Εικόνα Α-12: Ταξινόμηση των MMPs με βάση τη στερεοδιάταξη της πρωτεΐνης Προσαρμογή από (Fanjul-Fernández et al. 2010) Ρύθμιση της δραστηριότητας των MMPs Η πρωτεολυτική ενεργότητα των MMPs ρυθμίζεται σε 4 επίπεδα: την γονιδιακή έκφραση, τη μετατροπή από το ζυμογόνο (ανενεργό ένζυμο) σε ενεργό ένζυμο, τη διαμερισματοποίηση (περικυτταρική συσσώρευση ενζύμων) καθώς και από την παρουσία ειδικών αναστολέων. Περαιτέρω έλεγχος ασκείται από τη διαθεσιμότητα του υποστρώματος αλλά και τη συγγένεια του ενζύμου προς αυτό (Sternlicht & Werb 2001). Η έκφραση των MMP γονιδίων ρυθμίζεται κυρίως κατά τη μεταγραφή, όπου φυσιολογικά διατηρείται σε χαμηλά επίπεδα. Τα περισσότερα μέλη της οικογένειας των MMP γονιδίων μοιράζονται κοινά cis-ρυθμιστικά στοιχεία στις αλληλουχίες του υποκινητή τους, τα οποία επιτρέπουν στενό έλεγχο της κυτταρο-ειδικής τους έκφρασης. Συνεπώς, τα γονίδια των MMPs συχνά συν-εκφράζονται ή συν-καταστέλλονται, ως απόκριση σε πολλαπλά ερεθίσματα, συμπεριλαμβανομένων φλεγμονωδών κυτταροκινών, αυξητικών παραγόντων, 51

52 γλυκοκορτικοειδών ή ρετινοειδών (IL-1β, TNF-α και ογκοστατίνη M) (Vincenti & Brinckerhoff 2007, Yan & Boyd 2007). Συνήθως, η μεταγραφή λαμβάνει χώρα αρκετές ώρες μετά την έκθεση στο ερέθισμα, υποδηλώνοντας ότι οι MMP υποκινητές είναι καταρροϊκοί στόχοι σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος γονιδίων πρώιμης απόκρισης. Τα τελευταία κωδικοποιούν σηματοδοτικές πρωτεΐνες (NF-κB, MAPK, STAT και την οικογένεια Smad) που φωσφορυλιώνουν διαφορετικούς μεταγραφικούς παράγοντες (AP-1, PEA3, NF-κB και STAT) οι οποίοι τελικά προσδένονται σε cis-ρυθμιστικά στοιχεία υποκινητών MMP γονιδίων (Overall & Lopez-Otin 2002). Σημειωτέον ότι συνεκφραζόμενα γονίδια των MMPs, μοιράζονται αρκετές περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων του υποκινητή τους. Οι πρόδρομες μορφές των MMPs παραμένουν ανενεργές λόγω της αλληλεπίδρασης της σουλφυδρυλικής ομάδας του αμινοξικού καταλοίπου κυστεΐνη στην αλληλουχία PRCGXPD της πρόδρομης περιοχής και του ιόντος ψευδαργύρου του καταλυτικού κέντρου. Μεταπίπτουν σε ενεργές πρωτεϊνάσες με κατάλυση αυτής της αλληλεπίδρασης, η οποία ονομάζεται «διακόπτης κυστεΐνης». Η κατάλυση αυτή γίνεται είτε μέσω πρωτεόλυσης της πρόδρομης περιοχής, είτε μέσω χημικής τροποποίησης της πλευρικής ομάδας της κυστεΐνης. Υπάρχουν αρκετές πρωτεϊνάσες οι οποίες μεσολαβούν στην MMP ενεργοποίηση, όπως η φουρίνη, η πλασμίνη, αλλά και άλλες ενεργές MMPs (Sternlicht & Werb 2001). Κατόπιν ενεργοποίησης, οι MMP-2, -3, -7, -9 και -12 μπορούν να ασκήσουν αρνητική ανατροφοδότηση, αποδομώντας για παράδειγμα το πλασμινογόνο και ως εκ τούτου να παρεμποδίσουν τη μετατροπή του σε ενεργή πλασμίνη, η οποία επάγει τη δράση των MMPs. Αυτή η σύνθετη ρύθμιση είναι απαραίτητη, δεδομένου ότι ανεξέλεγκτη δραστηριότητα πρωτεϊνάσης, απελευθερούμενης από φλεγμονώδη κύτταρα είναι δυνατόν να οδηγήσει σε ιστική βλάβη αλλά και στη μετάπτωση της φλεγμονώδους απόκρισης σε χρόνια φλεγμονή και τελικά σε εξαλλαγή (Parks et al. 2004). Για παράδειγμα, η MMP-3 αποτελεί καταστολέα της σερπίνης α2-antiplasmin, που είναι ο κύριος αναστολέας της πλασμίνης, ενώ αρκετές άλλες MMPs φαίνεται να απενεργοποιούν λοιπές σερπίνες, όπως είναι η σερπίνη α1-protease inhibitor και α1-chymotrypsin inhibitor, επιμηκύνοντας την καταλυτική δραστηριότητα εξωκυτταρικών πρωτεϊνασών, οι οποίες αναστέλλονται φυσιολογικά από αυτά τα μόρια (Lijnen et al. 2001). Στη λειτουργία των MMPs εμπλέκονται επίσης δραστικές ρίζες οξυγόνου (ROS). Κατά τη φλεγμονώδη απόκριση δημιουργούνται μεγάλες ποσότητες ROS, παραγόμενες από ενεργοποιημένα ουδετερόφιλα και μακροφάγα. Αυτοί οι οξειδωτικοί παράγοντες ενεργοποιούν αρχικά τα MMPs μέσω οξείδωσης της κυστεΐνης του πρόδρομου πεπτιδίου και τελικά, σε συνδυασμό με το ένζυμο μυελοπεροξειδάση, απενεργοποιούν τα MMPs, 52

53 τροποποιώντας τα αμινοξικά κατάλοιπα της καταλυτικής περιοχής (Fu et al. 2003, Weiss et al. 1985). Η κυτταρική τοπολογία ή διαμερισματοποίηση των MMPs υπό φυσιολογικές συνθήκες υπαγορεύει συχνά τη βιολογική τους λειτουργία. Αρκετές MMPs αλληλεπιδρούν με υποδοχείς επιφανείας, όπως είναι οι ιντεγκρίνες ή εντοπίζονται σε συγκεκριμένες περιοχές της ECM, προκαλώντας συνακόλουθα τοπική αύξηση της συγκέντρωσής τους ενώ παράλληλα εμποδίζουν την πρόσβαση ενδογενών αναστολέων (Nagase et al. 2006). Τέλος, οι ιστικοί αναστολλείς μεταλλοπρωτεϊνασών (Tissue inhibitors of metalloproteinases - TIMPs) αποτελούν εξειδικευμένα μόρια, τα οποία προσδένονται στο καταλυτικό κέντρο των MMPs με στοιχειομετρία 1:1. Στα σπονδυλωτά έχουν ταυτοποιηθεί τεσσάρων ειδών MMPs (TIMP-1, TIMP-2,TIMP-3 και TIMP-4) ενώ η έκφρασή τους ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη και την αναδιαμόρφωση του ιστού (Brew et al. 2000). Αυτές οι ενδογενείς, εκκρινόμενες πρωτεΐνες αναστέλλουν το σύνολο των μορίων MMPs. Δεδομένου ότι κάθε MMP διαθέτει μεγάλο εύρος υποστρωμάτων, εμπλεκόμενα σε θεμελιώδεις κυτταρικές αποκρίσεις, η TIMPμεσολαβούμενη αναστολή ελέγχει ιεραρχικά καταρροϊκές οδούς της ομοιόστασης. Αρχικά, TIMPs ανθρώπου και ποντικού απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν το 1985 ως αναστολλείς της δραστηριότητας κολλαγενάσης. (Docherty et al. 1985) Κατόπιν RNAμεσολαβούμενης TIMP1 μειορύθμισης σε φυσιολογική σειρά ινοβλαστών ποντικού, τα κύτταρα απέκτησαν εξαλλαγμένο φαινότυπο. Έκτοτε, εντοπίζεται απορρύθμιση των TIMPs, η οποία συνοδεύει αποκλίνουσα έκφραση μεταλλοπρωτεΐνασών σε όλους τους ανθρώπινους καρκίνους. (Kosaka et al.) 53

54 Εικόνα Α-14: Πρότυπο έκφρασης MMPs και TIMPs σε φυσιολογικά κύτταρα του στρώματος. Προσαρμογή από (Fanjul-Fernández et al. 2010) MMPs και καρκίνος Οι MMPs παράγονται από μια ποικιλία κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων επιθηλιακών κυττάρων, ινοβλαστών και φλεγμονωδών κυττάρων. Στο σύνολό τους διασπούν δομικά συστατικά της ECM και ως εκ τούτου επηρεάζουν αρκετές φυσιολογικές διαδικασίες, όπως η αναπαραγωγή, η εμβρυογένεση, η αναδιαμόρφωση του ιστού αλλά και η αγγειογένεση. Ακόμη, παίζουν σημαντικό ρόλο σε μονοπάτια ανοσιακής απόκρισης, όπως η ενεργοποίηση της μεταγωγής σήματος της MAPK αλλά και του NFκB. Επιπλέον, εμπλέκονται σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η αρθρίτιδα, οι καρδιαγγειακές παθήσεις και οι νεοπλασίες. Ειδικότερα για τον καρκίνο, υπάρχουν ενδείξεις ότι οι MMPs παίζουν ρόλο στη δημιουργία και διατήρηση ενός μικροπεριβάλλοντος, το οποίο διευκολύνει την ανάπτυξη και μετάσταση νεοπλασιών (Baker et al. 2002, Chambers & Matrisian 1997, Coussens et al. 2002, Korem et al. 2002, McCawley & Matrisian 2001, Stetler-Stevenson 1999). 54

55 Η έκφραση και η δραστηριότητα των MMPs αυξάνονται σχεδόν σε κάθε τύπο καρκίνου ενώ συνδέονται με προχωρημένο στάδιο εξέλιξης του όγκου, αύξηση της εισβολής σε παρακείμενους ιστούς, μετάσταση αλλά και μειωμένη βιωσιμότητα. Έκφραση των MMPs, είτε από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα είτε από τα παρακείμενα κύτταρα του στρώματος, συμβάλλουν στην αναδιαμόρφωση της ECM και την απελευθέρωση παραγόντων ανάπτυξης, παρέχοντας ένα ευνοϊκό μικροπεριβάλλον για την εγκαθίδρυση του πρωτογενούς όγκου. Επιπλέον, υπάρχουν επιπλέον αποδείξεις πως οι MMPs ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου επάγοντας την απελευθέρωση παραγόντων κυτταρικής ανάπτυξης, όπως ο IGF (Kapoor et al. 2016). Οι δράσεις των MMPs έχουν παραδοσιακά συνδεθεί με μια ποικιλία μηχανισμών διαφυγής, τους οποίος αναπτύσσει ο καρκίνος απέναντι στο ανοσοποιητικό σύστημα. Αποδομώντας συστατικά της ECM, οι MMPs διευκολύνουν την αγγειογένεση, την εισβολή σε παρακείμενους ιστούς και τη μετάσταση (Kapoor et al. 2016). Οι MMPs ρυθμίζουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των εξαλλαγμένων κυττάρων, αποκόπτοντας την E-καδερίνη αλλά και μεταξύ εξαλλαγμένων κυττάρων και ECM, αποκόπτοντας ιντεγκρίνες, γεγονός το οποίο εντείνει επιπλέον την εισβλητική ικανότητα των κυττάρων του όγκου. Οι MMPs τροποποιούν και ενεργοποιούν σηματοδοτικά μόρια, συμπεριλαμβανομένων αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών, καθιστώντας αυτούς τους παράγοντες διαθέσιμους σε κύτταρα στόχους, είτε μέσω απελευθέρωσης τους από την ECM (π.χ. VEGF και bfgf) και συμπλέγματα αναστολής (π.χ. TGF). (Kapoor et al. 2016). Αναφορικά με τα αδενοκαρκινώματα, έχει παρατηρηθεί πως η εξαλλαγή επιθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει την απορρύθμιση της έκφρασης κυτταροειδικών γονιδίων, παρόμοια με την αναπτυξιακή διαδικασία της μετάπτωσης κυττάρων από επιθηλιακού σε μεσεγχυματικού τύπου (EMT) (Ginnebaugh et al. 2014, Pang et al. 2016, Puisieux et al. 2014, Steinestel et al. 2014). Σε διάφορα στάδια ΕΜΤ έχει καταγραφεί αυξορύθμιση τόσο της μεταγραφής όσο και της δράσης των MMPs, μεταξύ άλλων μορίων (Du et al. 2012, Giannandrea & Parks 2014, Nistico et al. 2012) Eπιθηλιακή προς μεσεγχυματική μετατροπή (Epithelial to mesenchymal transition- EMT) Η διαδικασία της EMT προσδίδει κινητικότητα σε επιθηλιακά κύτταρα, ενώ επιτρέπει τη μετάπτωση του φαινοτύπου τους σε μεσεγχυματικού τύπου. Διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στην ιστική μορφογένεση, ενώ μονοπάτια σχετικά με την EMT έχουν περιγραφεί κατά τη μετάσταση καρκινικών κυττάρων, αλλά και την ίνωση. Οι επιθηλιακές δομές ορίζονται από ένα στρώμα εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, τη βασική μεμβράνη, η οποία αποτελείται από λαμινίνη και κολλαγόνο τύπου IV (Horejs 2016). Ο αφορισμός αυτός συμβάλλει στη 55

56 λειτουργία και την ακεραιότητα του ιστού, αποτελώντας παράλληλα φραγμό για την εν δυνάμει παθογενή μετανάστευση κυττάρων. Η αλλαγή στον κυτταρικό φαινότυπο περιλαμβάνει την επαγωγή ασυνέχειας στη βασική μεμβράνη. Έχει αναφερθεί πως οι MMPs παίζουν σημαντικό ρόλο στην EMT ενώ απελευθερώνουν μια ποικιλία τμημάτων βασικής μεμβράνης, τα οποία διαδραματίζουν διακριτές βιολογικές δραστηριότητες (Horejs 2016). Τα πρώτα βήματα στην EMT είναι η αποδιάταξη των συνδέσμων μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων, δηλαδή των στενοσυνδέσμων, των συνδέσμων προσκόλλησης, των δεσμοσωμάτων και των χασμοσυνδέσμων, ενώ παράλληλα χάνεται η κυτταρική πολικότητα. Η έκφραση των επιθηλιακών γονιδίων καταστέλλεται, ταυτόχρονα με την ενεργοποίηση των μεσεγχυματκών γονιδίων. Στη συνέχεια, αναδιοργανώνεται η αρχιτεκτονική της ακτίνης, η οποία προσδίδει στα κύτταρα κινητικότητα και δυνατότητα εισβολής σε παρακείμενο ιστό, μέσω του σχηματισμού διαφόρων τύπων δομών, παρόμοιων με ψευδοπόδια αλλά και μέσω της έκφρασης MMPs, ικανών για αποδόμηση της ECM. Σημειωτέων ότι κατά την πρόοδο της EMT, εντοπίζονται κύτταρα μεσεγχυματικού φαινοτύπου, τα οποία έχουν απωλέσει την έκφραση της επιθηλιακής E-καδερίνης ενώ διαθέτουν βιμεντίνη και N-καδερίνη (Eastham et al. 2007, Ullmann et al. 2007). Παράλληλα, τα κύτταρα αυτά εμφανίζουν πρωτεΐνες επιφανείας με υψηλή αναλογία CD44/CD28, η οποία ωστόσο παρατηρείται και σε επιθηλιακά βλαστικά κύτταρα (Mani et al. 2008) Αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση Η έναρξη και η εξέλιξη της EMT περιλαμβάνει διακριτά σηματοδοτικά μονοπάτια, τα οποία επικοινωνούν μεταξύ τους. Ο TGFβ αποτελεί ισχυρό επαγωγέα της EMT, μεσολαβώντας στην ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων της EMT. Συγκεκριμένα, εμπλέκονται 3 κύριοι μεταγραφικοί παράγοντες, οι SNAI1, TWIST και ZEB. Κατά τη διάρκεια της EMT, μειορυθμίζεται η έκφραση επιθηλιακών πρωτεϊνών, κάποιες από τις οποίες είναι μέρος των συμπλεγμάτων κυτταρικών συνδέσεων (Huang et al. 2012, Peinado et al. 2007). Επιπλέον, η γονιδιακή έκφραση ανακατευθύνεται προς αλλαγές στην αρχιτεκτονική του κυτταροσκελετού, προωθώντας την προσκόλληση σε μεσεγχυματικά κύτταρα και σε διαφορετική αλληλεπίδραση με την ECM (De Craene & Berx 2013, Yilmaz & Christofori 2009, Yilmaz & Christofori 2010). Σημειωτέον ότι υπάρχουν παραλλαγές στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο και το βαθμό της μεσεγχυματικής διαφοροποίησης. Βασικό στοιχείο της EMT είναι η μειορύθμιση της E-καδερίνης, η οποία επάγει την αποσταθεροποίηση των συνδέσεων προσκόλλησης, διακόπτοντας τη συνέχεια του επιθηλίου (Peinado et al. 2007). Η καταστολή γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες συνδέσμων 56

57 επιθηλιακών κυττάρων συνοδεύεται από ενεργοποίηση γονιδίων, τα προϊόντα των οποίων προάγουν τη μεσεγχυματική προσκόλληση. Ειδικότερα, η μειορύθμιση της E-καδερίνης εξισορροπείται από την αυξημένη έκφραση της μεσεγχυματικής N-καδερίνης και της NCAM, οι οποίες αλληλεπιδρούν μεταξύ τους (Cavallaro & Christofori 2004, Yilmaz & Christofori 2009). Ακόμα, στην EMT συμβάλλουν αλλαγές στα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού. Συγκεκριμένα, αλλάζει η σύσταση των ενδιάμεσων ινιδίων μέσω της καταστολής της κυτταροκερατίνης και την ενεργοποίηση της έκφρασης βιμεντίνης (Huang et al. 2012). Επιπλέον, λαμβάνει χώρα αναδιαμόρφωση της ECM καθώς και αλλαγές στις αλληλεπιδράσεις κυττάρων με αυτή, οι οποίες είναι σημαντικές στην έναρξη και την πρόοδο της EMT. Συμπλέγματα ιντεγκρινών επιτρέπουν στα κύτταρα να λαμβάνουν σήματα από πρωτεΐνες της ECM μέσω αλληλεπιδράσεων με σηματοδοτικούς μεσολαβητές, όπως η ILK, η LIMS1 και η παρβίνη (Hansen et al. 2008, Yilmaz & Christofori 2009). Καθώς τα επιθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται σε μεσεγχυματικού τύπου, δεν αλληλεπιδρούν με τη βασική μεμβράνη ενώ επικοινωνούν με διαφορετική ECM. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα μειορυθμίζουν κάποιες επιθηλιακές ιντεγκρίνες αλλά ενεργοποιούν την έκφραση άλλων, κάποιες απ τις οποίες παίζουν ρόλο στην πρόοδο της EMT, όπως η α 3 β 1 και η α 5 β 1 (Yilmaz & Christofori 2009). Αλλαγές στη σύνθεση ιντεγκρινών κατά την EMT συνδέονται με αυξημένη έκφραση πρωτεασών, όπως οι MMP2 και MMP9, προωθώντας την αποδόμηση ECM πρωτεϊνών και επιτρέποντας την εισβολή σε παρακείμενο ιστό (Nistico et al. 2012). Επιπροσθέτως, οι MMPs στοχεύουν κάποιες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, απελευθερώνοντας για παράδειγμα το εξωκυτταρικό τμήμα της E-καδερίνης, συμβάλλοντας έτσι στην απώλεια συνδέσμων προσκόλλησης (Nistico et al. 2012). Στη ρύθμιση της EMT, συμμετέχουν, εκτός από τους μεταγραφικούς παράγοντες και το διαφορικό μάτισμα ανώριμων mrnas σε ώριμα, τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες με δομικές και λειτουργικές διαφορές. Τέτοιες διαφορές αντικατοπτρίζονται σε ισομορφές πρωτεϊνών όπως η κατενίνη p120, το σύμπλοκο CD44 καθώς και η RTKFGFR (Brown et al. 2011, Shirakihara et al. 2011, Warzecha et al. 2009, Yanagisawa et al. 2008). Επιπλέον, ρυθμιστική δράση ασκούν τα μη κωδικοποιητικά mirnas, τα οποία δεσμεύονται εκλεκτικά σε mrnas, εμποδίζοντας τη μετάφρασή τους ή προωθώντας την αποικοδόμησή τους (Lamouille et al. 2013). Για παράδειγμα, έχει δειχθεί πως σε εξαλλαγμένα κύτταρα το mir-9 μπορεί να καταστείλει την έκφραση του γονιδίου της E-καδερίνης, προωθώντας ένα μεσεγχυματικό φαινότυπο (Ma et al. 2010). Μάλιστα, κάποια από αυτά ρυθμίζουν την έκφραση των κύριων μεταγραφικών παραγόντων της EMT. Για παράδειγμα, τα mir-29b και mir-30a καταστέλλουν την έκφραση του SNAI1 και ως εκ τούτου, η αυξημένη έκφραση mir-29b μπορεί να αναστρέψει την EMT (Ru et al. 2012, Zhang et al. 2012). 57

58 4.4. MMP-3 Η μεταλλοπρωτεϊνάση 3 (MMP-3) (στρωμελυσίνη-1-sl-1), ανήκει στην οικογένεια των μεταλλοπρωτεϊνασών. Ανάμεσα στις πρώτες αναφορές, το 1974, περιγράφηκε ως μια ουδέτερη πρωτεϊνάση, εκκρινόμενη από ινοβλάστες αρθρικού υγρού κουνελιού, η οποία διασπά πρωτεογλυκάνες του χόνδρου (Werb & Reynolds 1974). Αφού απομονώθηκε και καθαρίστηκε, ονομάστηκε αρχικά πρωτεογλυκανάση, αργότερα στρωμελυσίνη και τελικά μεταλλοπρωτεϊνάση θεμέλιας ουσίας (MMP3) (Chin et al. 1985, Galloway et al. 1983, Okada et al. 1986). Η MMP-3 μοιράζεται δομική ομολογία με άλλες MMPs. Συγκεκριμένα, η ανθρώπινη MMP3 αποτελείται από ένα πεπτίδιο σηματοδότησης (17 αμινοξέα), ένα προπεπτίδιο (82 αμινοξέα), μια καταλυτική περιοχή (165 αμινοξέα), μια ενδιάμεση περιοχή πλούσια σε προλίνη (25 αμινοξέα) και μια καρβοξυτελική περιοχή (188 αμινοξέα), της οποίας η αμινοξική αλληλουχία εμφανίζει ομοιότητα προς την αιμοπηξίνη και τη βιτρονεκτίνη. Γι αυτό το λόγο, η καρβοξυτελική περιοχή καλείται και περιοχή αιμοπηξίνης. Το ένζυμο συντίθεται και εκκρίνεται από τα κύτταρα ως προένζυμο 57 kda. Παράλληλα υπάρχουν δύο πιθανά αμινοτελικά σημεία γλυκοζυλίωσης, ενώ το 20% περίπου των προενζύμων MMP3 γλυκοζυλιώνονται και εντοπίζονται ως προϊόν με μοριακό βάρος 59kDa. Η καταλυτική περιοχή του ενζύμου περιλαμβάνει δύο ιόντα ψευδαργύρου: ένα στο ενεργό κέντρο, όπου προσδένεται στις πλευρικές αλυσίδες τριών αμινοξικών καταλοίπων His (αριθμούμενα σύμφωνα με την προενζυμική μορφή της ανθρώπινης MMP3 ως His201, His205 και His211) και ένα δομικό ιόν Zn 2+, το οποίο αλληλεπιδρά με τις πλευρικές αλυσίδες των καταλοίπων Asp153, His151, His166 και His179. Επιπροσθέτως, τρία ιόντα Ca 2+ είναι ενωμένα στην καταλυτική περιοχή, η οποία σταθεροποιεί τη δομή. Το γονίδιο της ανθρώπινης MMP-3 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 11, q22-q23, όπου εδράζονται και αυτά άλλων MMPs (MMP-1,-7,-8,-12,-13,-20,-26). Σημειωτέον ότι έχουν απομονωθεί τα γονίδια του ανθρώπου (Sirum & Brinckerhoff 1989), του αρουραίου (Breathnach et al. 1987) και του ποντικού (Mudgett et al. 1998). Η περιοχή του υποκινητή περιέχει τις αλληλουχίες αναγνώρισης μεταγραφικών παραγόντων όπως TATA, AP1 και δύο παλίνδρομα ρυθμιστικά στοιχεία PEA3. Η MMP-3 αποκόπτει διάφορες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας και κυτταρικής επιφανείας. Στις πρωτεΐνες-στόχους συμπεριλαμβάνονται το κολλαγόνο τύπου Ι, ΙΙ, ΙΙΙ & Χ, η λαμινίνη και η Ε-καδερίνη. Το ένζυμο ενεργοποιεί επίσης προκολλαγενάσες: MMP-1,-813 και την προζελατινάση MMP9. Θεωρείται πως η MMP-3, εκτός της από φυσιολογική αποδόμηση της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας συμμετέχει άμεσα και στην παθολογική καταστροφή ιστών, συμπεριλαμβανομένων των γαστρικών έλκων αλλά και μερικών όγκων. Η αύξηση της έκφρασης της MMP-3 επάγει 58

59 νεοπλασματική ανάπτυξη σε επιθηλιακά κύτταρα ποντικού. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της μετάπτωσης επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικού τύπου, αποδομώντας την Ε-καδερίνη και προκαλώντας απώλεια των διακυτταρικών συνδέσεων (Lochter et al. 1997). Δεδομένα από πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι η MMP-3 επάγει την έκφραση διαφορετικού προϊόντος εναλλακτικής συρραφής της Rac1, η οποία με τη σειρά της προκαλεί ενδοκυτταρική αύξηση ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS). Ως αποτέλεσμα, ενεργοποιείται ένας από τους κύριους μεταγραφικούς παράγοντες της EMT, ο SNAI1 (Radisky et al. 2005) Λοίμωξη από H. pylori και MMPs Η λοίμωξη του στομάχου από H. pylori αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα χρόνιας γαστρίτιδας. Η γαστρίτιδα ενδέχεται να εξελιχθεί σε χρόνια ατροφική γαστρίτιδα, μια παθολογική κατάσταση, η οποία συνδέεται με την ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου. Αρκετές MMPs αλλά και αναστολείς αυτών εμπλέκονται στη γαστρίτιδα και το γαστρικό καρκίνο, χρησιμοποιούμενοι και ως μοριακοί δείκτες. Σημειώνεται η ικανότητα του H. pylori να επάγει κυταροκίνες (IL-1β, IL-6 και IL-8) και προφλεγμωνώδεις χημειοκίνες (TNFα), μέσω των παραγόντων παθογένειας και ειδικότερα της CagA και VacA. Τα σηματοδοτικά αυτά μόρια του ξενιστή αποτελούν φυσικούς ρυθμιστές των MMPs, δεδομένο το οποίο συνδέει αιτιολογικά το H. pylori και τις MMPs (Egeblad & Werb 2002, Krueger et al. 2006, Kundu et al. 2006). Ενώ είναι γνωστή η συμβολή της MMP3 στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις- υπάρχουν λίγες αναφορές σχετικά με το ρόλο της στη γαστρίτιδα. Στο επίπεδο του γαστρικού ιστού έχει αναφερθεί μεγαλύτερη συγκέντρωση MMP-3 σε ασθενείς με ενδιάμεση γαστρίτιδα συγκριτικά με αυτούς που εμφάνιζαν ελαφρύτερης μορφής (Yeh et al. 2010). Στα AGS κύτταρα, το H. pylori επάγει την έκκριση της MMP-3, ενώ παράλληλα στα C57BL/6 ποντίκια, η μόλυνση με cagpai θετικά ή αρνητικά στελέχη H. pylori έχει ως αποτέλεσμα γαστρική φλεγμονή και την επαγωγή και έκκριση της MMP-3 (Gooz et al. 2001, Gooz et al. 2003, Kundu et al. 2006). Επιπλέον, η MMP-3 ενεργοποιεί τις προενζυμικές μορφές αρκετών μεταλλοπρωτεϊνασών (Nagase 2012) όπως της MMP-9 (Nam et al. 2011), της MMP-7 (Chung et al. 2010), της MMP-1 (Pillinger et al. 2007), της MMP-13 (Pillinger et al. 2005) και της MMP-2 (Kundu et al. 2006). Όλες οι παραπάνω MMP, που έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί η MMP-3, έχουν φανεί να σχετίζονται με τη H. pylori λοίμωξη και μάλιστα η δράση κάποιων από αυτές φαίνεται να εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης CagA (Nam et al. 2011). Επιπλέον, η στρωμελυσίνη-2 (MMP-10), η οποία εμφανίζει εξαιρετική ομολογία (82%) με τη στρωμελυσίνη-1 και έχει χαρακτηριστεί ως ισοένζυμό της (106), χρησιμοποιείται ως 59

60 προγνωστικός καρκινικός δείκτης για γαστρικό καρκίνο (Aung et al. 2006), ενώ έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται στην λοίμωξη με H. pylori στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα μέσω των EGFR και ERK σηματοδοτικών οδών (Costa 2016). 5. Σκοπός της παρούσας εργασίας Τα τελευταία πειραματικά δεδομένα του εργαστηρίου υποδηλώνουν πως κατά την in vitro μόλυνση ανθρώπινων επιθηλιακών κυτταρικών σειρών AGS με H. pylori, ο παράγοντας παθογένειας του βακτηρίου CagA ενδεχομένως εμπλέκεται στην επαγωγή Επιθηλιακής προς Μεσεγχυματική Μετατροπή (EMT), μέσω αυξορύθμισης της MMP-3 έκφρασης (Sougleri et al. 2016). Η παρούσα εργασία στοχεύει στην επέκταση των παρατηρήσεων αυτών σε ένα in vivo πειραματικό πρότυπο της λοίμωξης από H. pylori. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν C57BL/6 ποντίκια, τα οποίοι μολύνθηκαν με πρότυπα στελέχη H. pylori, για διάστημα 6 και 9 μηνών αντίστοιχα. Τα βακτηριακά στελέχη διέφεραν ως προς την ικανότητα έκφρασης της πρωτεΐνης CagA αλλά και στην ικανότητα ενδοκυττάριας μετάθεσης της, μέσω του λειτουργικού συστήματος μεταφοράς τύπου-4 (T4SS). Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα στελέχη HPARE, ένα CagA-θετικό και λειτουργικό στέλεχος, το αντίστοιχο HPARE- CagAKO, CagA-knockout στέλεχος, καθώς και το στέλεχος Sydney Strain-1 (SS1) το οποίο αν και αποτελεί caga-θετικό στέλεχος, εν τούτοις δεν έχει ικανότητα διακυτταρικής μετάθεσης της CagA πρωτεΐνης. Στις κατάλληλες χρονικές περιόδους, κατόπιν συλλογής του γαστρικού ιστού, έγινε εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης της MMP-3, τόσο σε μεταγραφικό επίπεδο μέσω ποσοτικής RT-PCR, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης, ανοσοιστοχημικά. Η H. pylori μόλυνση επιβεβαιώθηκε μέσω ανίχνευσης IgG αντισωμάτων στον ορρό. Έγινε γενετική και φαινοτυπική σύγκριση μεταξύ του στελέχους αρχικής μόλυνσης και του απομονωθέντος 9 μήνες από την μόλυνση. Επιπλέον έγινε εκτίμηση της βαρύτητας και δραστηριότητας της συνοδού γαστρίτιδας μέσω χρώσης με αιματοξυλίνη-ηωσίνη. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν αυξημένα επίπεδα μεταγραφικής ενεργοποίησης της ΜΜP-3 με CagA-εξαρτώμενο τρόπο και αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης σε όλες τις ομάδες μελέτης της λοίμωξης με H. pylori, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αμόλυντων πειραματοζώων. 60

61 61

62 Β. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1. Χειρισμός βακτηριακών στελεχών H. pylori 1.1. Καλλιέργεια στελεχών H. pylori Η καλλιέργεια των στελεχών H. pylori, πραγματοποιήθηκε σε τρυβλία με στερεό θρεπτικό υλικό Columbia Blood Agar Base (Oxoid) εμπλουτισμένο με 7% αίμα αλόγου και 1% Vitox (Oxoid), παρουσία αντιβιοτικών: 10μg/ml βανκομυκίνη, 10μg/ml τριμεθοπρίμη, 104 IU/liter πολυμυξίνη Β, 2μg/ml αμφοτερικίνη Β, 10μg/ml ναλιδιξικό οξύ, 30μg/ml βακιτρακίνη, 5μg/ml φλουοροκυτοσίνη (Sigma). Μετά την παρασκευή του θρεπτικού υλικού, τα τρυβλία αποθηκεύονταν στους 4 C. Πριν την καλλιέργεια του H. pylori, τα τρυβλία τοποθετούνταν ανάποδα μέσα σε κλίβανο θερμοκρασίας 65 C για 20min με ελαφρά ανασηκωμένα τα καπάκια, έτσι ώστε να εξατμιστεί η τυχόν υγρασία που περιείχαν. Κατόπιν γινόταν ενοφθαλμισμός 150μl διαλύματος βακτηρίου, το οποίο είχε ήδη αποψυχτεί από τους -80 C. Οι βακτηριακές καλλιέργειες στην συνέχεια τοποθετούνταν μέσα σε ειδικά αεροστεγή επωαστικά δοχεία, παρουσία καταλύτη ανάπτυξης μικροαερόφιλων συνθηκών (90% N2, 5% CO2, 5% O2) (Campygen, Oxoid) και επωάζονταν σε κλίβανο σταθερής θερμοκρασίας στους 37 C για 24 ή 48 ώρες Ταυτοποίηση H. pylori με τη δοκιμασία της ουρεάσης Με τη συγκεκριμένη δοκιμασία είναι δυνατή η ανίχνευση της παρουσίας H. pylori σε μία καλλιέργεια, λόγω της δραστηριότητας του ενζύμου ουρεάση, το οποίο συνθέτει το βακτήριο. Η αρχή της δοκιμασίας βασίζεται στην υδρόλυση της ουρίας του γαστρικού περιεχομένου παρουσία ουρεάσης προς αμμωνία και διοξείδιο του άνθρακα (NH 3 και CO 2 ), αντίδραση μέσω της οποίας το βακτήριο ουδετεροποιεί το όξινο περιβάλλον του στομάχου. Ο προσδιορισμός πραγματοποιήθηκε με κατεργασία μικρής ποσότητας βιομάζας καλλιέργειας με υδατικό διάλυμα ουρίας 10% v/v, ph 6.8, παρουσία 1% v/v. ερυθρού της φαινόλης ως δείκτη αλλαγής του ph. Η παρουσία H. pylori στα δείγματα πιστοποιήθηκε με την ταχεία αλλαγή χρώματος του αντιδραστηρίου από κίτρινο-πορτοκαλί σε κόκκινο, λόγω αύξησης του ph του διαλύματος άνω του 8.4, από την παραγωγή NH Κρυο-συντήρηση στελεχών H. pylori 62

63 Η φύλαξη των στελεχών H. pylori λάμβανε χώρα σε αμπούλες κρυο-συντήρησης (cryovials) με κατάψυξη στους -80 o C, σε θρεπτικό υλικό Brain Heart Infusion Broth (BHIB), παρουσία 20% γλυκερόλης. Αναλυτικά, το σύνολο της βιομάζας ενός τρυβλίου ανεπτυγμένης και μακροσκοπικά διακριτής καλλιέργειας H. pylori επαναιωρείτο μέσα σε 1,8ml BHIB με 20% γλυκερόλη σε αμπούλες κρυο-συντήρησης. Η αποθήκευση γινόταν στους -80 o C Απομόνωση H. pylori από γαστρικό ιστό Από τμήμα γαστρικού ιστού ποντικού, πριν τη μονιμοποίησή του σε υγρό άζωτο, έγινε λήψη ιστοτεμαχίου και μεταφορά του σε 1ml θειογλυκολικού οξέος. Μετά την προσθήκη υάλινων σφαιριδίων, έγινε ανάδευση για 1min, με σκοπό την απελευθέρωση του H. pylori από το βλεννογόνο. Το βακτηριακό διάλυμα ήταν πλέον έτοιμο προς καλλιέργεια σε στερεό θρεπτικό υλικό Απομόνωση γονιδιακού DNA H. pylori από στερεή καλλιέργεια Για την απομόνωση του γονιδιακού DNA στελεχών H. pylori χρησιμοποιήθηκε εμπορικό kit (Macherey-Nagel) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αρχικά, γινόταν συλλογή μικρής ποσότητας βακτηριακής βιομάζας από το τρυβλίο καλλιέργειας και επαναιώρησή της σε 0.5ml dh 2 O. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση των βακτηρίων σε 8000x g, για 5min. Κατόπιν αφαίρεσης του υπερκειμένου, γινόταν επαναιώρηση του βακτηριακού ιζήματος σε 180μl διαλύματος T1 (διάλυμα περιέχον τον ανιονικό αποδιατακτικό παράγοντα δωδεκανικό θειικό νάτριο-sds), με διαδοχική προσθήκη 25μl πρωτεϊνάσης K και ολονύχτια επώαση στους 56 ο C. Την επόμενη ημέρα γινόταν προσθήκη 200μl διαλύματος χαοτροπικού άλατος B3 (υδροχλωρική γουανιδίνη) και επώαση στους 75 o C, για 10min. Στη συνέχεια, μετά την προσθήκη 210μl % αιθανόλης, ο συνολικός όγκος του δείγματος μεταφερόταν σε μια στήλη πυριτίου, όπου γινόταν φυγοκέντρηση στα 11000x g για 1 λεπτό, ούτως ώστε το DNA να προσκολληθεί στη στήλη. Ακολουθούσαν διαδοχικές πλύσεις του DNA με 500μl διαλύματος BW και 600μl διαλύματος B5. Τελικά, γινόταν έκλουση του γονιδιακού DNA με τη χρήση 100μl διαλύματος BE (5mM Tris/HCl, ph 8.5). 63

64 1.6. Ανίχνευση κλωνικής σχέσης στελεχών με RAPD PCR Η Random Amplification Polymorphic DNA PCR (RAPD PCR) αποτελεί μια παραλλαγή της end point PCR, κατά την οποία ένας εκκινητής μη συμπληρωματικός για κάποια συγκεκριμένη αλληλουχία-στόχο, αλλά με υψηλό ποσοστό βάσεων γουανίνης-κυτοσίνης (GC-content), ενισχύει τυχαία τμήματα DNA (Akopyanz et al. 1992). Κατόπιν ηλεκτροφόρησης των προϊόντων της αντίδρασης, δημιουργούνται προφίλ ζώνωσης ειδικά για κάθε στέλεχος, που επιτρέπουν τη ταυτοποίηση γενετικής συγγένειας. Σημειωτέον ότι τα συγκεκριμένα προφίλ που παράγονται μπορεί να διαφοροποιούνται μεταξύ των αντιδράσεων, οπότε τα προς εξέταση στελέχη πρέπει να περιλαμβάνονται στην ίδια αντίδραση. Για τον χαρακτηρισμό των στελεχών H. pylori χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ανεξάρτητοι εκκινητές: 1254, 1281, D11344 και D14307 (Akopyantz 1992). Πίνακας Β-1: Αλληλουχίες εκκινητών για την RAPD PCR Εκκινητής Μήκος (bp) Αλληλουχία (5-3 ) Ποσοστό %G+C CCGCAGCCAA AACGCGCAAC 60 D AGTGAATTCGCGGTGAGATGCCA 52 D GGTTGGGTGAGAATTGCACG 55 Οι αντιδράσεις τελικού όγκου 25μl, περιείχαν 20ng DNA, 1U Taq polymerase, 1.6μΜ τελική συγκέντρωση του κάθε εκκινητή (1254, 1281, D11344 και D14307), ρυθμιστικό διάλυμα 10mM Tris-HCl, 50μM KCl, 3mM MgCl 2, 250μM dntps. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες για τους εκκινητές 1254 και 1281: 4 κύκλοι πολλαπλασιασμού χαμηλής ευαισθησίας με θέρμανση στους (α) 94 ο C για 5min, (β) 36 ο C για 5min, (γ) 72 ο C για 5min, ακολουθούμενοι από 30 κύκλους πολλαπλασιασμού υψηλής ευαισθησίας με θέρμανση στους (α) 94 ο C για 60sec, (β) 36 ο C για 60sec και (γ) 72 ο C για 120sec και τελική επιμήκυνση με θέρμανση στους 72 ο C για 10min. Για τους εκκινητές D11344 και D14307 οι συνθήκες αντίδρασης ήταν: 4 κύκλοι πολλαπλασιασμού με θέρμανση στους (α) 94 ο C για 5min, (β) 40 ο C για 5min, (γ) 72 ο C για 5min, ακολουθούμενοι από 30 κύκλους πολλαπλασιασμού με 64

65 θέρμανση στους (α) 94 ο C για 60sec, (β) 55 ο C για 60sec, (γ) 72 ο C για 120 sec και τελική επιμήκυνση με θέρμανση στους 72 ο C για 10 min Ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης Τα προϊόντα της RAPD PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε γέλη 2% αγαρόζης και ρυθμιστικού διαλύματος TBE ph 8.3 (44.5mM Tris, 44.5mM βορικό οξύ, 1mM EDTA ph 8.0), παρουσία 0.5μg/ml βρωμιούχου αιθιδίου. Τα προϊόντα της ηλεκτροφόρησης ανιχνεύθηκαν και φωτογραφήθηκαν υπό ακτινοβολία υπεριώδους με το σύστημα Gel Doc (Biorad, Hercules, CA, USA). 2. Χειρισμός ευκαρυωτικής κυτταρική σειράς AGS 2.1. Καλλιέργειες κυττάρων Για τα πειράματα in vitro μόλυνσης χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος στομάχου AGS, με χρόνο διπλασιασμού περίπου 20 ώρες. Η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε φιάλες καλλιεργειών των 75cm 2, με θρεπτικό υλικό RPMI 1640 Glutamax I (Gibco), εμπλουτισμένο με 10% βόειο ορό (Gibco), παρουσία αντιβιοτικών (πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης 1% της Gibco) στους 37 C, σε ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% CO 2. Για την ανακαλλιέργεια τα κύτταρα αρχικά εκπλένονταν με 10ml στείρου φωσφορικού ισότονου ρυθμιστικού διαλύματος PBS (Gibco) και ακολουθούσε αποκόλληση με ολιγόλεπτη χρήση διαλύματος θρυψίνης περιεκτικότητας 0.05% (Gibco). Η αποκόλληση των κυττάρων επιβεβαιωνόταν μετά από παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο και γινόταν αναστολή της ενζυμικής δραστηριότητας με προσθήκη πλήρους θρεπτικού υλικού. Ακολουθούσε επαναιώρηση σε πλήρες θρεπτικό υλικό (RPMI, 10% FBS και 1% αντιβιοτικά) σε αναλογία 1:4 της αρχικής καλλιέργειας Υπολογισμός αριθμού κυττάρων Ο αριθμός των κυττάρων στο τελικό κυτταρικό εναιώρημα για τις ανάγκες των in vitro πειραμάτων επιμόλυνσης κυττάρων με κλινικά στελέχη H. pylori γινόταν με χρήση της πλάκας Neubauer σε 2 ανεξάρτητα πεδία. Πιο συγκεκριμένα γινόταν ανάμιξη κυτταρικού εναιωρήματος με διάλυμα 0,4% Trypan blue σε αναλογία 1:1, και τοποθέτηση στη πλάκα. Η καταμέτρηση για την εκτίμηση του ποσοστού των νεκρών (μπλε) και των ζωντανών 65

66 κυττάρων (άχρωμα) γινόταν με παρατήρηση της πλάκας Neubauer σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Ανίχνευση ενδεχόμενης μόλυνσης από Mycoplasma Η δοκιμασία για την παρουσία μυκοπλάσματος στα κύτταρα γινόταν σε εναιώρημα κυττάρων στο στάδιο της θρυψινοποίησης με PCR προσδιορισμό και χρήση μίγματος εκκινητών Myco5 και Myco3 που αναγνωρίζουν συντηρημένη περιοχή του 16 rdna του συνόλου των ειδών Mycoplasma spp. και Acholeplasma spp (Uphoff & Drexler 2014). Πίνακας Β-2: Αλληλουχίες εκκινητών για Mycoplasma PCR Γονίδιο Εκκινητής Αλληλουχία (5-3 ) 16s rdna Mycoplasma spp. Acholeplasma spp. Myco-5 Myco-3 CGCCTGAGTAGTACGTWCGC TGCCTGRGTAGTACATTCGC CGCCTGAGTAGTATGCTCGC CGCCTGGGTAGTACATTCGC GCGGTGTGTACAARACCCGA GCGGTGTGTACAAACCCCGA Οι συγκεκριμένοι εκκινητές οδηγούσαν στη δημιουργία προϊόντος μεγέθους bp, ανάλογα με το στέλεχος (Drexler & Uphoff 2002). Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιείτο δείγμα με προσθήκη dh 2 O ενώ ως θετικός μάρτυρας δείγμα DNA από συλλογή κολπικού υγρού, μολυσμένα με Mycoplasma sp., αραίωσης 1:10. Αρχικά, γινόταν συλλογή 1ml εναιωρήματος θρυψινοποιημένων AGS κυττάρων, και ακολουθούσε φυγοκέντρηση στα 13000x g, για 5min. Ακολούθως, γινόταν διαδοχικά εις διπλούν αναδιάλυση του ιζήματος με 1ml PBS και φυγοκέντρηση του εναιωρήματος στα 13000x g, για 5min. Τελικά, το ίζημα επαναιωρείτο σε 100μl PBS και επωαζόταν στους 95 o C για 15min για την αποτελεσματική λύση των κυττάρων. Στη συνέχεια, γινόταν απομόνωση γενωμικού DNA σύμφωνα με το εμπορικό πρωτόκολλο των Macherey-Nagel, ξεκινώντας από το στάδιο της λύσης με διάλυμα υδροχλωρικής γουανιδίνης B3 και επώαση στους 70 C, για 10min. 66

67 2.5. Κρυο-συντήρηση ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών Η συντήρηση των ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών πραγματοποιείτο στους -80 C σε βαθιά κατάψυξη. Πιο συγκεκριμένα, μια φιάλη καλλιέργειας κυττάρων επιφάνειας 75cm 2, με ποσοστό επικάλυψης άνω του 90%, ξεπλένονταν με 10ml PBS και ακολουθούσε θρυψινοποίηση. Μετά την αποκόλληση, τα κύτταρα επαναιωρούντο σε 3ml θρεπτικού υλικού RPMI περιεκτικότητας 20% σε βόειο ορό και 5% σε DMSO. Το κυτταρικό εναιώρημα φυλασσόταν σε αμπούλες κρυο-συντήρησης (cryovials) της εταιρίας NUNC σε συνολικό όγκο 1ml. Η ψύξη των αμπουλών ήταν αργή και σταδιακή με χρήση ειδικού δοχείου με ισοπροπανόλη, το οποίο διατηρούταν στους -80 o C. Κατόπιν παρέλευσης 24h, οι αμπούλες αποθηκεύονταν σε βαθιά κατάψυξη, σε δοχεία υγρού αζώτου, στους -190 o C Μόλυνση κυττάρων AGS με H. pylori Η μόλυνση γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων AGS με βακτήρια H. pylori γινόταν εκτός συγκεκριμένων περιπτώσεων σε αναλογία βακτηρίων ανά κύτταρο: 100 (Multiplicity of infection, MOI). Κύτταρα (2x10 5 ), επιστρώνονταν σε καλλιεργητικές πλάκες 6-κυψελίδων διαμέτρου 34.8mm και συνολικής επιφάνειας ανάπτυξης 9.5cm 2 (Corning, Life Sciences), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αφήνονταν να προσκολληθούν και να πολλαπλασιαστούν. Στις 48 ώρες, γινόταν ανανέωση θρεπτικού υλικού, απουσία αντιβιοτικών και τα κύτταρα αφήνονταν προς επώαση για 2h στον επωαστικό κλίβανο (37 C, CO 2 5%), προ της προσθήκης βακτηρίων. Οι καλλιέργειες βακτηρίων που θα χρησιμοποιούντο στη διαμόλυνση αποψύχονταν και τοποθετούντο σε κατάλληλο υλικό καλλιέργειας για 24 ώρες, προ της κυτταρικής διαμόλυνσης. Την ημέρα της διαμόλυνσης γινόταν συλλογή της βιομάζας από τις στερεές βακτηριακές καλλιέργειες και επαναιώρηση τους σε θρεπτικό υλικό (RPMI, 10% FBS) απουσία αντιβιοτικών. Ακολούθως γινόταν μέτρηση θολερότητας σε μήκος κύματος 600nm και η τελική τιμή του διαλύματος ρυθμιζόταν στα 0.79 η οποία αντιστοιχούσε επί τη βάσει προηγούμενων μετρήσεων του εργαστηρίου σε 10 9 βακτήρια/ml. Κατόπιν της τελικής ρύθμισης της συγκέντρωσης των βακτηρίων το βακτηριακό εναιώρημα διατηρούνταν για 1h υπό ανάδευση στους 37 C, στο πλήρες θρεπτικό υλικό με σκοπό την προσαρμογή τους. Κατά τη διαμόλυνση των κυττάρων, μεταφέρονταν 100μl βακτηριακού εναιωρήματος σε κάθε κυψελίδα ώστε να ικανοποιείται η προαναφερθείσα αναλογία 100 βακτηρίων ανά κύτταρο. 67

68 2.7. Απομόνωση υπερκειμένου καλλιέργειας για τον προσδιορισμό IL-8 Τη συγκεκριμένη πειραματική διάταξη με το πέρας 24 ωρών έγινε συλλογή του υπερκειμένου θρεπτικού υλικού της καλλιέργειας. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της IL-8, τα συλλεχθέντα υπερκείμενα φυγοκεντρήθηκαν στις 20000x g για 20min στους 4 C προς απομάκρυνση κυτταρικών και βακτηριακών θραυσμάτων Προσδιορισμός φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης Η παρατήρηση των επιμολυσμένων με H. pylori κυττάρων AGS έγινε σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο (Axiovert 40 C, Zeiss). Παράλληλα, έγινε λήψη φωτογραφιών (Power Shot A620 Canon Digital Camera ) από τουλάχιστον δέκα διαφορετικά οπτικά πεδία ανά κυψελίδα με φακό μεγέθυνσης 20Χ και 40Χ αντίστοιχα. Η σήμανση των κυττάρων με φαινότυπο διασποράς και επιμήκυνσης ανά οπτικό πεδίο έγινε με τη βοήθεια του προγράμματος ImageJ. 3. In vivo πειράματα μόλυνσης 3.1. Στελέχη H. pylori που χρησιμοποιήθηκαν Στα πειράματα in vivo μόλυνσης έγινε χρήση τριών διαφορετικών στελεχών H. pylori, των HPARE, HPARE CagA KO και. SS1. Συγκεκριμένα, το SS1 (Sydney Strain 1) προέρχεται από CagA- και VacA-θετικό ανθρώπινο κλινικό στέλεχος (γονότυπος s2i2m2), το οποίο προσαρμόστηκε εργαστηριακά για εγκαθίδρυση χρόνιας γαστρίτιδας σε στομάχι ποντικών (Lee et al. 1997). Σημειωτέον ότι το SS1 έχει απενεργοποιημένο vaca, ενώ αν και διαθέτει λειτουργικό cagpai, φέρει μη λειτουργικό γονίδιο cagy, γεγονός το οποίο έχει σαν αποτέλεσμα την αδυναμία για μετάθεση CagA πρωτεΐνης ενδοκυττάρια και αδυναμία επαγωγής έκκρισης IL-8 μετά από in vitro μόλυνση AGS κυττάρων (Crabtree et al. 2002, Philpott et al. 2002, van Doorn et al. 1999b). Αντίστοιχα, το HPARE προέρχεται από πειραματική προσαρμογή του ανθρώπινου κλινικού στελέχους HPAG1 και διαθέτει λειτουργικό cagpai και εκφράζει πρωτεΐνη VacA (γονότυπος s1m1) με ιδιαίτερα αυξημένη ικανότητα δημιουργίας κενοτοπίων. Μόλυνση με το εν λόγω στέλεχος επάγει έντονο φαινότυπο διασποράς και επιμήκυνσης λόγω μετάθεσης και επιτυχημένης ενδοκυττάριας φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης CagA αλλά και επαγωγή έκκρισης IL-8, ενός cagpai-εξαρτώμενου φαινομένου. Το στέλεχος HPARE παραχωρήθηκε ευγενώς από την Christine Varon. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκε ισογενές στέλεχος HPARE, το οποίο δεν εξέφραζε την πρωτεΐνη CagA (knock-out, CagAKO), μετά από απενεργοποίηση του γονιδίου cagα του βακτηρίου. Η 68

69 παρασκευή του CagAKO παρασκευάστηκε με την μέθοδο της παρεμβολής του γονιδίου της χλωραμφαινικόλης (van Vliet et al. 1998) στο στέλεχος HPARE Διαμόλυνση ποντικών Τα πειράματα in vivo μόλυνσης έλαβαν χώρα 2 φορές, με τη μεσολάβηση 2 μηνών. Έγινε χρήση αρσενικών C57BL/6 ποντικών, ηλικίας 6-8 εβδομάδων. Οι ποντικοί προέρχονταν από το Τμήμα Ζωικών Προτύπων Βιοϊατρικής Έρευνας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ. Οι συνθήκες στέγασης των ζώων ήταν σύμφωνες με το σχετικό ελληνικό νομοθετικό πλαίσιο. Σε κάθε πείραμα, ομάδες ελέγχου 10 ποντικών εμβολιάσθηκαν δια της στοματικής οδού με 100μl (1x10 8 βακτήρια) εναιωρήματος των H. pylori στελεχών HPARE, HPARE CagAKO και SS1. Το βακτηριακό εναιώρημα παρασκευάστηκε εντός 24 ωρών μετά από απόψυξη του αντίστοιχου στελέχους. Οι εμβολιασμοί έλαβαν χώρα εντός μίας εβδομάδας, σε 3 δόσεις ανά δεύτερη ημέρα. Οι ομάδες μελέτης των μολυσμένων ποντικών, ανάλογα με το H. pylori στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε, ορίστηκαν ως εξής: Hp1: HPARE (n=20), Hp2: HPARE-CagAKO (n=20) και Hp3: SS1 (n=20) Συμπεριλήφθηκε επίσης και μια ομάδα ελέγχου με αμόλυντους ποντικούς (n=18). Μετά το πέρας 6 και 9 μηνών αντίστοιχα έγινε αιμοληψία και τα ζώα θανατώθηκαν με αυχενική παρεκτόπιση. Από κάθε ποντικό αφαιρέθηκε ο στόμαχος, οποίος χωρίστηκε στη μέση με τομή κατά μήκος του ελάσσονος και του μείζονος τόξου από τον δωδεκαδάκτυλο προς τον θόλο. Το ένα κομμάτι του ιστού καταψύχθηκε άμεσα σε υγρό άζωτο για την απομόνωση RNA του ιστού ενώ το δεύτερο κομμάτι μονιμοποιήθηκε σε 10% φορμόλη. 4. Προσδιορισμός επιπέδων έκφρασης με χρήση ποσοτικής αντίδρασης ανάστροφης μεταγραφάσης (RT-qPCR) 4.1. Απομόνωση ολικού mrna από γαστρικό ιστό ποντικών Τα γαστρικά ιστοτεμάχια των ποντικών, μεταφέρθηκαν σε προζυγισμένα σωληνάρια 1.5ml Eppendorf, ζυγίστηκαν και κατόπιν προστέθηκε 1ml διαλύματος TRIzol (εταιρείας Ambion), το οποίο περιέχει χαοτροπικό παράγοντα (υδροχλωρική γουανιδίνη), Ακολούθως οι ιστοί ομογενοποιήθηκαν με τη βοήθεια μηχανικού μικρο-εμβόλου μίας χρήσεως στους 4 C. Ο ομογενοποιημένος πλέον ιστός επωάστηκε για 5min σε θερμοκρασία δωματίου. Αμέσως μετά έγινε προσθήκη 200μl χλωροφορμίου, με σκοπό το διαχωρισμό φάσεων, σε κάθε μία από τις οποίες εντοπίζονται διαφορετικά συστατικά. Ακολούθησε ήπια ανακίνηση για 15sec, επώαση για 2-3min σε θερμοκρασία δωματίου και διαχωρισμός των φάσεων με φυγοκέντρηση σε 69

70 12000x g, για 5min, στους 4 C. Απομονώθηκε προσεκτικά η υδατική φάση, όπου εντοπίζεται το RNA, και μεταφέρθηκε σε καινούργιο 1.5ml Eppendorf σωληνάριο. Έγινε κατακρήμνιση του RNA με προσθήκη 0.5ml ισοπροπανόλης. Κατόπιν φυγοκέντρησης στα 12000x g, για 15min, στους 4 C, αφαιρέθηκε το υπερκείμενο διάλυμα και το ίζημα του RNA επαναδιαλύθηκε σε 1ml 75% αιθανόλης αραιωμένης με αποστειρωμένο νερό απουσία RNασών. Περαιτέρω καθαρισμός του RNA επιτεύχθηκε με χρήση του εμπορικού RNeasy Mini kit της Invitrogen. Συγκεκριμένα, 700μl RNA μεταφέρθηκαν σε στήλη πυριτίου και ακολούθησε φυγοκέντρηση σε 8000x g, για 15sec, στους 4 C, προκειμένου το RNA να προσκολληθεί στη στήλη. Ακολούθησαν διαδοχικές πλύσεις με 700μl ρυθμιστικού διαλύματος RW1 (περιέχει άλατα γουανιδίνης) και δύο φορές με 500μl ρυθμιστικού διαλύματος RPE (προκειμένου να απομακρυνθούν τα άλατα του RW1). Έγινε μεταφορά της στήλης σε καινούργιο σωληνάριο συλλογής, ενώ για την τελική έκλουση του RNA χρησιμοποιήθηκαν 50μl στείρου ύδατος, απαλλαγμένου από RNασες Σύνθεση cdna από RNA, μέσω αντίστροφης μεταγραφής Για την αντίστροφη μεταγραφή του RNA σε cdna λήφθηκε υπ όψιν το πρωτόκολλο της εταιρείας New England Biolabs. Όλα τα συστατικά χρησιμοποιήθηκαν στις μισές ποσότητες από αυτές του πρωτοκόλλου, με αποτέλεσμα το διάλυμα να έχει τελικό όγκο 10μl. Συγκεκριμένα, το διάλυμα της αντίδρασης περιείχε 1Χ ρυθμιστικού διαλύματος ProtoScript II Reaction buffer, (τελικής σύστασης 50mM Tris-HCl, 75mM KCl, 3mM MgCl 2, ph 8.3), 10mM αναγωγικού παράγοντα DTT (Dithiothreitol), 1U αναστολέα RNασης, 6μM μείγματος εξαμερών εκκινητών τυχαίου υβριδισμού, 500μM μίγματος τυχαίων τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dntps), 5U αντίστροφης μεταγραφάσης και 4μg RNA αναδιαλυμένο σε H 2 O, απαλλαγμένο από νουκλεάσες. Οι κύκλοι της αντίστροφης μεταγραφής συμπεριέλαβαν μια επώαση στους 25 C για 10min, ακολουθούμενη από μία ακόμα στους 37 C για 60sec και μια τελική επώαση στους 95 C για 5min Ποσοτική αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qpcr) για τον προσδιορισμο της μεταγραφικής δραστηριότητας της MMP-3 στο γαστρικό ιστό Η αντίδραση αυτή πραγματοποιήθηκε στη συσκευή Agilent Mx3005P QPCR System (Agilent Technologies), με τη χρήση του εμπορικού kit TaqMan Gene Expression Master Mix Protocol (Applied Biosystems). Για κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 20μl, το οποίο περιείχε 0.2μg cdna, 1Χ Taqman Universal Master Mix II (AmpliTaq Gold DNA Polymerase: dntps (with dutp), ROX Passive Reference, Uracil-N glycosylase (UNG), ρυθμιστικό διάλυμα), 1Χ TaqMan Gene Expression Assay: ζεύγος 70

71 εκκινητών MMP-3 (mm _m1), GAPDH ( mm _g1) και αντίστοιχους MGB-ανιχνευτές, σημασμένους με χρωστική FAM. Οι κύκλοι της αντίδρασης αποτελούνταν από ένα αρχικό βήμα επώασης της UNG στους 50 C για 2min, ακολουθούμενος από έναν κύκλο ενεργοποίησης της πολυμεράσης στους 95 C για 10min και κατόπιν 40 διαδοχικούς κύκλους αποδιάταξης στους 95 C για 15sec και ειδικού υβριδισμού και επιμύκηνσης στους 60 C για 60sec και επιμήκυνσης στους 72 C για 30sec. Για τον υπολογισμό της μεταγραφικής έκφρασης της MMP-3 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος του 2 -ΔΔC T (Schmittgen & Livak 2008). Σύμφωνα με αυτή, οι τιμές C T για τα επίπεδα έκφρασης των MMP-3 mrnas σε κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκαν με αυτές των mrnas του διαχειριστικού γονιδίου GAPDH, μέσα στο ίδιο δείγμα. 5. Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός 5.1. Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός έναντι εκκρινόμενης IL-8 Για τον ανοσοενζυμικό προσδιορισμό των επιπέδων IL-8 στο υπερκείμενο διάλυμα AGS κυττάρων μολυσμένων με H. pylori για 24 ώρες έγινε δοκιμασία ELISA με τη χρήση εμπορικού kit (IL8/NAP-1 Module Set, Bender MedSystems) σε πλάκα 96 κυψελίδων. Γενικά, μέσω της ELISA γίνεται ποσοτικός προσδιορισμός μια πρωτεΐνης σε ένα διάλυμα, με βάση την εξειδικευμένη πρόσδεση αντισωμάτων και τη μέτρηση του τελικού σήματος ως οπτική απορρόφηση από το φθορισμό χρωμοφόρων ουσιών. Σημειωτέων ότι οι όγκοι των διαλυμάτων που αναφέρονται παρακάτω αφορούν σε κάθε κυψελίδα ξεχωριστά. Αρχικά, γίνεται επίστρωση με 100μl διαλύματος μονοκλωνικού αντισώματος έναντι ανθρώπινης IL-8 (5μg αντισώματος/ml διαλύματος PBS: 8g/ml NaCl, 0.2g/ml KCl, 2.85g/ml Na 2 HPO 4 x12h 2 O, 0.2g/ml KH 2 PO 4 ) και ολονύκτια επώαση στους 4 C. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το διάλυμα επίστρωσης και ακολουθεί πλύση με προσθήκη 300μl διαλύματος πλύσης (PBS % Tween 20) για 30sec, με σκοπό την απομάκρυνση αντισωμάτων τα οποία δεν προσδέθηκαν ισχυρά στο υπόστρωμα. Ακολουθεί μπλοκάρισμα των μη-ειδικών περιοχών του υποστρώματος με προσθήκη 250μl διαλύματος βόειας αλβουμίνης του ορού (5g Bovine Serum Albumin/ml PBS % Tween 20) και επώαση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν αφαιρείται το διάλυμα και επαναλαμβάνονται 2 διαδοχικές κατεργασίες πλύσης, σύμφωνα με το προηγούμενο βήμα. Στη συνέχεια προστίθενται 100μl αραιωμένου δείγματος υπερκειμένου (αραίωση 1:2 σε διάλυμα: PBS % Tween 20). Παράλληλα, γίνεται προσθήκη 100μl πρωτεΐνης γνωστής συγκέντρωσης (2000pg/ml διαλύματος: PBS +0.05% Tween 20) και διαδοχικές αραιώσεις, με σκοπό την 71

72 κατασκευή πρότυπης καμπύλης συγκέντρωσης πρωτεΐνης και την περαιτέρω τιτλοδότηση των δειγμάτων. Τα δείγματα επωάζονται ολονύκτια στους 4 C. Την επόμενη μέρα γίνονται 3 διαδοχικές πλύσεις και κατόπιν προστίθενται 50μl πολυκλωνικού αντισώματος έναντι IL-8, συζευγμένου με βιοτίνη (αραιωμένο 1:1000 σε διάλυμα: PBS % Tween 20) και επώαση για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν 3 διαδοχικών πλύσεων, γίνεται προσθήκη 100μl στρεπταβιδίνης συζευγμένης με HRP (horseradish peroxidase) και επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού μεσολαβήσουν 3 διαδοχικές πλύσεις, προστίθενται 100μl εμπορικού διαλύματος χρωμογόνου TMB σε 1:1 αναλογία με υπεροξείδιο του υδρογόνου ως δέκτη πρωτονίων, Pierce, USA) και η αντίδραση εξελίσσεται με τη σταδιακή εμφάνιση κυανού χρώματος για 15min, στο σκοτάδι. Η αντίδραση αναστέλλεται με τη προσθήκη 100μl διαλύματος H 3 PO 4 (1M) και αλλαγή του χρώματος από κυανό σε κίτρινο χρώμα. Ακολουθεί φωτομέτρηση του προϊόντος στα 450nm (συσκευή φωτομέτρησης Beckman Coulter DTX800 Multimode Detector). Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν στατιστικά με δοκιμασία Student s t Επιβεβαίωση H. pylori μόλυνσης με ανοσοενζυμικό προσδιορισμός IgG αντισωμάτων στον ορό. Η επιβεβαίωση εγκαθίδρυσης H. pylori μόλυνσης σε ποντικούς όλων των ομάδων μελέτης, έγινε με τη χρήση in house ELISA, για την ημιποσοτική εκτίμηση επιπέδων αντισωμάτων IgG έναντι του βακτηρίου στον ορό ποντικών. Για την επικάλυψη του υποστρώματος των κυψελίδων χρησιμοποιήθηκε αντιγόνο που παράχθηκε από βακτηριακές καλλιέργειες στελεχών SS1 και HPARE. Πιο συγκεκριμένα, ισόποσο εναιώρημα καλλιεργειών βακτηρίων H. pylori στελεχών SS1 και HPARE υποβλήθηκαν σε κατεργασία διάσπασης με χρήση υπερήχων σε στρώμα πάγου και ακολούθησε μικρο-διάλυση για τον καθαρισμό με χρήση μεμβράνης (SpectraPor; κατώτατο όριο πόρου 8kDa). Το τελικό διάλυμα αντιγόνου μετά από προσδιορισμό της συγκέντρωσης συνολικής πρωτεΐνης φυλάχθηκε στους -80 C σε τελική συγκέντρωση 1.5μg/ml. Για την επικάλυψη των κυψελίδων χρησιμοποιήθηκαν 100μl αντιγόνου H. pylori σε διάλυμα διττανθρακικών (0.159g/ml Na 2 CO 3, 0.293g/ml NaHCO 3 ) και ολονύκτια επώαση στους 4 ο C. Τα διαλύματα πλύσης, επικάλυψης και αραίωσης των ορών είχαν την ίδια σύσταση με αυτά που προαναφέρονται στην ELISA έναντι της ανθρώπινης IL- 8. Οι οροί των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:400 σε διάλυμα PBS με προσθήκη αλβουμίνης βόειου ορού (5g/ml) και Tween 20 (0.05%). Για τον προσδιορισμό των IgG αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε δευτεροταγές αντίσωμα IgG ανοσοσφαιρινών ποντικού συζευγμένο με HRP (1:10000). Η σταδιακή εμφάνιση κυανού χρώματος έγινε με προσθήκη 100μl εμπορικού διαλύματος χρωμογόνου TMB σε 1:1 αναλογία με υπεροξείδιο του υδρογόνου για 15min, στο σκοτάδι. Τέλος έγινε προσθήκη 100μl διαλύματος H 3 PO 4 72

73 (1M) για τον τερματισμό της αντίδρασης και φωτομέτρηση του κίτρινου προϊόντος στα 450nm. Το κατώτερο όριο θετικής αντίδρασης συνεκτιμήθηκε από το εύρος των αποτελεσμάτων των ομάδων μελέτης (μολυσμένων) και ελέγχου (αμόλυντων) πειραματοζώων. 6. Ιστολογική χρώση και ανοσοϊστoχημεία Αρχικά, κάθε μονιμοποιημένο κομμάτι γαστρικού ιστού υποβλήθηκε σε αφυδάτωση, με εμβάπτιση σε διαδοχικά αυξανόμενες συγκεντρώσεις αλκοόλης:70%, 80%, 96% και 100% κ.ο. Κατόπιν αυτού, ο ιστός εμβαπτίστηκε σε ξυλόλη (διαδικασία διαύγασης) και τελικά εγκλείσθηκε σε παραφίνη. Οι διαδικασίες της αφυδάτωσης, διαύγασης και έγκλεισης πραγματοποιήθηκαν σε ιστοκινέτα. Ο εγκλεισμένος πλέον ιστός τοποθετήθηκε σε μικροτόμο, όπου κόπηκε σε λεπτές τομές, πάχους 3μm. Οι τομές παραφίνης εκπτύχθηκαν σε υδατόλουτρο και στη συνέχεια έγινε επικόλλησή τους σε αντικειμενοφόρο πλάκα με σκοπό τη χρώση αιματοξυλίνηςηωσίνης Ιστολογική χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης Αναφορικά με τη χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης, η πλάκα με το ιστοτεμάχιο τοποθετήθηκε σε κλίβανο, στους 60 C, για 1 ώρα, με σκοπό την αποπαραφίνωση. Στη συνέχεια, το δείγμα μεταφέρθηκε σε αυτόματη συσκευή (Tissue stainer, εταιρείας Medite, Γερμανία), όπου έλαβε χώρα το σύνολο των βημάτων της χρώσης. Συγκεκριμένα, έγινε διαδοχική εμβάπτιση των τομών σε ξυλόλες και κατόπιν διαδοχική ενυδάτωση σε αλκοόλες κατιούσας συγκέντρωσης. Μετά το ξέπλυμα των τομών με νερό, έλαβε χώρα η χρώση αιματοξυλίνης. Η ουσία αυτή, λόγω του θετικού της φορτίου, προσδένεται στις φωσφορικές ομάδες στο DNA του πυρήνα, όπου προσδίδει κυανό χρώμα. Αφού απομακρύνθηκε η περίσσεια της χρωστικής με νερό, έγινε προσθήκη της ηωσίνης. Αντίστοιχα, η αρνητικά φορτισμένη αυτή χρωστική προσδένεται στο θετικό φορτίο των πρωτεϊνών του κυτταροπλάσματος, το οποίο αποκτά ανοιχτό ερυθρό χρώμα. Ακολούθησε αφυδάτωση των τομών με διαδοχική εμβάπτιση σε αλκοόλες αύξουσας συγκέντρωσης. Μετά την τοποθέτηση της καλυπτρίδας, οι τομές παρατηρήθηκαν σε οπτικό μικροσκόπιο. Έγινε προσδιορισμός των επιπέδων βαρύτητας της λεμφοκυτταρικής διήθησης καθώς και της ουδετεροφιλικής δραστηριότητας ενώ η στατιστική σημαντικότητα ανάμεσα στις ομάδες μελέτης εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία Wilcoxon rank-sum. 73

74 6.2. Ανοσοϊστοχημεία Για την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των πρωτεΐνών MMP-3 και MMP-9, οι τομές από κάθε δείγμα τοποθετήθηκαν σε θετικά φορτισμένη αντικειμενοφόρο πλάκα. Το θετικό φορτίο συμβάλλει στην προσκόλληση του δείγματος πάνω στην πλάκα, με σκοπό την αποφυγή απώλειας πρωτεΐνης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας. Ακολούθησε αποπαραφίνωση σε κλίβανο, στους 60 C, για 1 ώρα. Ακολούθως, οι τομές μεταφέρθηκαν στη συσκευή BenchMark Ultra (Ventana Medical Systems, Ross), όπου η διαδικασία της ανοσοϊστοχημείας έλαβε χώρα με αυτοματοποιημένο τρόπο. Πιο συγκεκριμένα, στο στάδιο της τιτλοδότησης (titration) έγινε προσθήκη πρωτογενούς IgG αντισώματος έναντι MMP-3 (mouse monoclonal, sc , Santa Cruz) ή MMP-9 ποντικού (mouse monoclonal, sc , Santa Cruz), αραίωσης 1:100. Για την ανίχνευση του σήματος χρησιμοποιήθηκε εμπορικό kit Ultraview DAB IHC detection, στο οποίο συμπεριλαμβάνεται το δευτερογενές αντίσωμα. 74

75 75

76 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Πειραματική λοίμωξη H. pylori σε ποντίκια 1.1. Περιγραφή των ομάδων ζώων Με βάση τον προγραμματισμό της λοίμωξης, τα ζώα χωρίστηκαν σε 4 ομάδες ως εξής: Hp1: αριθμός ζώων n=20, τα οποία μολύνθηκαν με το στέλεχος HPARE. Το συγκεκριμένο στέλεχος ήταν CagA-θετικό όσον αφορά την έκφραση και δυνατότητα ενδοκυττάριας μεταφοράς της πρωτεΐνης στα επιθηλιακά κύτταρα. Hp2: αριθμός ζώων n=20, τα οποία μολύνθηκαν με το ισογενές μετάλλαγμα HPARE CagA-knockout, στο οποίο έγινε καταστολή έκφρασης της πρωτεΐνης CagA με την παρεμβολή εντός πλαισίου ανάγνωσης στο γονίδιο caga της κασέτας αντοχής χλωραμφαινικόλης. Hp3: αριθμός ζώων n=20, τα οποία μολύνθηκαν με το στέλεχος αναφοράς SS1. Το στέλεχος αυτό ήταν CagA-θετικό και εξέφραζε την πρωτεΐνη. Παρόλα αυτά, δεν ήταν ικανό για τη μεταφορά της εντός του κυτταροπλάσματος των κυττάρων ξενιστή, λόγω απενεργοποιημένου T4SS καθώς και η Un: αριθμός ζώων n=18, ομάδα ελέγχου αμόλυντων ποντικών. Η κατάσταση της υγείας των ζώων παρακολουθείτο καθημερινά. Στους 6 και 9 μήνες θυσιάστηκαν 10 ζώα από κάθε ομάδα μελέτης και 9 από την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα, αφού προηγουμένως τα ζώα είχαν ζυγιστεί. Στον Πίνακα Γ-1 συνοψίζονται τα βάρη των ζώων στο χρονικό στάδιο της μόλυνσης, καθώς και στους 6 και 9 μήνες αργότερα ενώ στην Εικόνα Γ-1 παρουσιάζονται τα δεδομένα σε μορφή box plot. Σημειώνεται ότι στο boxplot απεικονίζονται από κάτω προς τα πάνω το 25 ο εκατοστημόριο (άκρη πράσινου τμήματος), η διάμεση τιμή (όριο μεταξύ πράσινου-μωβ τμήματος) και το 75 ο εκατοστημόριο (άκρη μωβ τμήματος) ενώ οι γραμμές σφάλματος ορίζουν το κατώτατο και ανώτερο όριο τιμών αντίστοιχα. 76

77 Πίνακας Γ-1: Βάρος ποντικών (g) στο χρονικό στάδιο της μόλυνσης καθώς και στους 6 και 9 μήνες αργότερα Διάρκεια Μόλυνσης Ομάδα N Average SE N Average SE N Average SE Hp Hp Hp Un Εικόνα Γ-1: Βάρος ποντικών κατά τις χρονικές στιγμές της μόλυνσης καθώς και 6 και 9 μήνες αργότερα. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση βάρους κατά τους 6 και 9 μήνες συγκριτικά με την t=0 (Student s t-test, p<0,001). Παρατηρήθηκε ότι το βάρος των ποντικών αυξήθηκε με στατιστικά σημαντικό τρόπο κατά τους 6 και 9 μήνες συγκριτικά με τη χρονική στιγμή της μόλυνσης t=0 (Student s t-test, p<0,001). Ανάμεσα στους 6 και 9 μήνες δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, όπως επίσης και μεταξύ των επιμέρους ομάδων μελέτης κάθε χρονικής στιγμής. 77

78 1.2. Επιβεβαίωση H. pylori-λοίμωξης στις ομάδες μελέτης ποντικών Η επιβεβαίωση της επιτυχούς εγκαθίδρυσής της H pylori-λοίμωξης στο γαστρικό ιστό των ποντικών έγινε με τη μέθοδο του προσδιορισμού αντισωμάτων IgG έναντι του βακτηρίου στο αίμα των ζώων. Για το σκοπό αυτό, συλλέχθηκαν δείγματα αίματος 2, 6 καθώς και 9 μήνες μετά τη μόλυνση. Σε κάθε περίπτωση, η αιμοληψία έγινε από τη βάση της ουράς του ποντικού και ο τίτλος IgG αντισωμάτων προσδιορίστηκε με τη χρήση μεθόδου ELISA. Στην Εικόνα Γ-2 απεικονίζονται οι μέσες τιμές της οπτικής απορρόφησης στα 450nm των ορών των πειραματοζώων, στους 2, 6 και 9 μήνες. Η κόκκινη γραμμή αποτελεί το κατώφλι της οπτικής απορρόφησης, πέραν του οποίου τα δείγματα χαρακτηρίζονταν ως θετικά. Εικόνα Γ-2: Box plot οπτικής απορρόφησης στα 450nm για την εκτίμηση του τίτλου IgG στους ορούς των ομάδων μελέτης, στους 2, 6 και 9 μήνες μετά τη μόλυνση. Στους 2 μήνες παρατηρήθηκε ότι μόνο τα ζώα της ομάδας Hp1 εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα anti-h. pylori IgG αντισωμάτων σε αντίθεση με τις ομάδες Hp2 και Hp3, όπου τα επίπεδα παρέμειναν χαμηλά, συγκρίσιμα με αυτά της ομάδας ελέγχου Un. Στη συνέχεια, στους 6 μήνες παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των μέσων επιπέδων στις ομάδες Hp1 και Hp3, σε αντίθεση με την Hp2, όπου παρέμειναν σε χαμηλά επίπεδα. Τέλος, στους 9 μήνες τα επίπεδα IgG αντισωμάτων εμφανίστηκαν ιδιαίτερα υψηλά σε όλες τις ομάδες μελέτης, σε αντίθεση με την ομάδα ελέγχου των αμόλυντων ποντικών. Από αυτά τα αποτελέσματα συνάγεται ότι εγκαθιδρύθηκε επιτυχώς η H. pylori-μόλυνση σε όλα τα ζώα. Η καθυστέρηση, η οποία παρατηρήθηκε στην αυξορύθμιση των επιπέδων IgG anti-h. pylori αντισωμάτων στην ομάδα Hp2 ενδεχομένως να οφείλεται στην αδυναμία έκφρασης της πρωτεΐνης CagA, ενός βακτηριακού παράγοντα, ο οποίος έχει δειχθεί να είναι εξαιρετικά ανοσογόνος. 78

79 1.3. Επιβεβαίωση κλωνικής σχέσης H. pylori στελεχών προ και μετά την επιτυχή εγκαθίδρυση της μόλυνσης στα ποντίκια Βιβλιογραφικά έχει αναφερθεί πως για την εγκαθίδρυση της μόλυνσης, συχνά υφίσταται τροποποίηση των γονιδίων του H. pylori, τα οποία κωδικοποιούν παθογόνους παράγοντες, με σκοπό την ανοσοδιαφυγή (Kraft et al. 2006). Συνεπώς, ήταν αναγκαία η επιβεβαίωση πως το HPARE στέλεχος, με το οποίο μολύνθηκαν οι ομάδες μελέτης, δεν είχε απολέσει τη λειτουργικότητα του T4SS και επομένως της ικανότητας μεταφοράς της πρωτεΐνης CagA ενδοκυττάρια. Για το λόγο αυτό έπρεπε να επιβεβαιωθεί ότι τα στελέχη που απομονώθηκαν στους 6 και 9 μήνες ήταν γενετικά ταυτόσημα με το αρχικό στέλεχος της μόλυνσης. Ο έλεγχος έγινε με τη χρήση της τεχνικής RAPD PCR. Η αντίδραση έλαβε χώρα με 4 διαφορετικούς εκκινητές (1254, 1281, D11344 και D14307), οι οποίοι λόγω του διαφορετικού ποσοστού G-C παρήγαγαν διαφορετικά προφίλ ζώνωσης. Στην Εικόνα Γ-3 παρουσιάζονται τα πρότυπα ηλεκτροφόρησης προϊόντων RAPD PCR των στελεχών HPARE και HPARE 9 μήνες μετά τη μόλυνση. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα ζώνωσης αυτά των πρότυπων εργαστηριακών H. pylori στελεχών και J99. Εικόνα Γ-3: Πρότυπα ηλεκτροφόρησης προϊόντος RPAD PCR των στελεχών HPARE και HPARE 9 μήνες μετά τη μόλυνση, καθώς και των στελεχών ελέγχου και J99. Η αντίδραση έλαβε χώρα με 4 διαφορετικούς εκκινητές. 79

80 Από τα αποτελέσματα συνάγεται ότι το αρχικό HPARE στέλεχος καθώς και το αντίστοιχο στέλεχος που απομονώθηκε 9 μήνες μετά τη μόλυνση παρήγαγαν ταυτόσημο πρότυπο ζώνωσης στην περίπτωση κάθε εκκινητή. Ως εκ τούτου, δεν φαίνεται ότι έχει λάβει χώρα κάποια σημαντική, ανιχνεύσιμη από τη μέθοδο γενετική αλλαγή (έλλειψη, προσθήκη ή αντικατάσταση βάσεων) στο επιμολύνον στέλεχος στο διάστημα των 9 μηνών παρουσίας του στο γαστρικό επιθήλιο των ποντικών. Άρα αναμένεται να έχει τις ίδιες ιδιότητες, όσον αφορά την λοιμοτοξικότητα των παραγόντων παθογένειας Μελέτη της ικανότητας in vitro επαγωγής φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης. Έχει τεκμηριωθεί πλέον ότι η μεταφορά και ενδοκυττάρια φωσφορυλίωση της βακτηριακής πρωτεΐνης CagA σε συστήματα in vitro λοίμωξης γαστρικών επιθηλιακών κυτταρικών σειρών AGS έχει σαν αποτέλεσμα, την επαγωγή κυτταρικού φαινοτύπου διασποράς και επιμήκυνσης με χαρακτηριστική δημιουργία φιλοποδίων και λαμελιποδίων. Για να ελεγχθεί περαιτέρω η λειτουργικότητα του HPARE στελέχους, μετά από 9 μήνες παραμονής του στο γαστρικό επιθήλιο ελέγχθηκε η ικανότητά του για επαγωγή του συγκεκριμένου φαινοτύπου. Για το σκοπό αυτό, κυτταρική σειρά γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων AGS μολύνθηκε αφ ενός με το αρχικό στέλεχος HPARE και το HPARE-9 μηνών. Με το πέρας 24 ωρών έγινε παρατήρηση του κυτταρικού φαινοτύπου σε ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο. Στην Εικόνα Γ-4 παρουσιάζονται ενδεικτικές φωτογραφίες, όπου φαίνεται ότι το φαινόμενο της κυτταρικής διασποράς και επιμήκυνσης που επάγεται από τα 2 βακτηριακά στελέχη είναι συγκρίσιμο. Επομένως, αμφότερα στελέχη ήταν ικανά να επάγουν το φαινότυπο επιμήκυνσης και διασποράς. 80

81 Εικόνα Γ-4: Καλλιέργειες AGS κυττάρων, 24 ωρών, μολυσμένες με HPARE, HPARE 9 μήνες μετά τη μόλυνση και μη μολυσμένα κύτταρα. Διακρίνεται ο φαινότυπος επιμήκυνσης και διασποράς (hummingbird). Παρατήρηση σε οπτικό μικροσκόπιο In vitro μελέτη επαγωγής IL-8 Η επαφή του H. pylori με τα επιθηλιακά κύτταρα επάγει σηματοδοτικούς μηχανισμούς, οι οποίοι οδηγούν στην απελευθέρωση χημειοκινών του ξενιστή, συμπεριλαμβανομένης της IL- 8. Αναφορικά με την CagA, πειραματικά δεδομένα καταλήγουν ότι CagA-θετικά στελέχη είναι ικανά για επαγωγή υψηλότερων επιπέδων IL-8 συγκριτικά με τα CagA αρνητικά. Για την αξιολόγηση της λειτουργικότητας του cagpai του στελέχους HPARE, έγινε σύγκριση της επαγωγής επιπέδων IL-8 μεταξύ των στελεχών HPARE και HPARE 9 μηνών. Τα επίπεδα της χημειοκίνης αξιολογήθηκαν με εμπορικό kit ELISA σε υπερκείμενα κυτταροκαλλιεργειών AGS, τα οποία είχαν μολυνθεί για 24 ώρες με τα αντίστοιχα H. pylori στελέχη. 81

82 Εικόνα Γ-5: Box plot τιτλοδότησης ανθρώπινης IL-8. Προσδιορίστηκαν οι τίτλοι της χημειοκίνης σε υπερκείμενα AGS κυττάρων, μολυσμένων με HPARE και HPARE 9M για 24 ώρες, με τη χρήση εμπορικού ELISA kit. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το Student s t-test και τα επίπεδα σημαντικότητας συμβολίζονται ως εξής: ****P<0,0001. Σύμφωνα με το παραπάνω διάγραμμα, το στέλεχος HPARE, με το οποίο μολύνθηκαν οι ποντικοί, επήγαγε συγκέντρωση IL8, με μέσο όρο περίπου 80 pg/ml. Από την άλλη, στο αντίστοιχο στέλεχος, το οποίο απομονώθηκε 9 μήνες αργότερα, η συγκέντρωση της χημειοκίνης κυμάνθηκε γύρω στα 40pg/ml, δηλαδή περίπου στο μισό του HPARE. Παρόλα αυτά, σε αμφότερα στελέχη τα επίπεδα της επαγόμενης IL-8 αυξήθηκαν με στατιστικά σημαντικό τρόπο, συγκριτικά με τα αμόλυντα κύτταρα. 2. Μεταγραφική έκφραση MMP3 γαστρικού ιστού μολυσμένων με H. pylori ποντικών Στη συνέχεια, έγινε χρήση της RT-qPCR τεχνικής για τη μελέτη των επιπέδων μεταγραφικής έκφρασης του γονιδίου της MMP3 στο γαστρικό ιστό ομάδων μελέτης μολυσμένων με H. pylori ποντικών. Αρχικά, συλλέχθηκαν οι γαστρικοί ιστοί των ποντικών στους 6 και 9 μήνες μετά τη μόλυνση και διατηρήθηκαν σε υγρό άζωτο. Μετά την ομογενοποίηση του ιστού, απομονώθηκε το ολικό mrna με χρήση TRIzol. Ακολούθησε αντίστροφη μεταγραφή και σύνθεση cdna το οποίο και αναλύθηκε με real time PCR. 82

83 Εικόνα Γ-6: In vivo μεταγραφική ενεργοποίηση της MMP3. Στατιστικά σημαντική μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου Mmp3 προσδιορίστηκε με qrt-pcr, στο γαστρικό ιστό C57BL/6 ποντικών, στους 6 και 9 μήνες κατόπιν μόλυνσης με τα στελέχη SS1 (Hp3), HPARE (Hp1) και HPARE-CagA KO (Hp2). Η στατιστική ανάλυση έγινε με το Student t-test και τα επίπεδα σημαντικότητας συμβολίζονται ως εξής *P<0.05, **P<0.01. Παρατηρήθηκε ότι στους 6 μήνες, το σύνολο των ομάδων μελέτης παρουσίασαν αυξορύθμιση των επιπέδων MMP3, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου αμόλυντων ποντικών. Στους 9 μήνες, τα ποντίκια, τα οποία μολύνθηκαν με HPARE παρουσίασαν στατιστικά σημαντική αυξορύθμιση της MMP3 συγκριτικά με την ομάδα, η οποία μολύνθηκε με CagA- KO. Από την άλλη, οι ομάδες μελέτης των HPARE και SS1 κατέδειξαν στατιστικά σημαντική υπερέκφραση της MMP3, σε σύγκριση με την αμόλυντη ομάδα. 3. Ιστολογική εξέταση γαστρικού ιστού μολυσμένων με H. pylori ποντικών 3.1. Ιστοπαθολογία γαστρικού ιστού Τα ευρήματα της ιστοπαθολογικής μελέτης ερμηνεύθηκαν σύμφωνα με το τροποποιημένο σύστημα ταξινόμησης κατά Sydney. Με βάση το σύστημα συτό αξιολογούνται: ο βαθμός της λεμφοκυτταρικής διήθησης στο χόριο (βαρύτητα της γαστρίτιδας) καθώς και η δραστηριότητα της χρόνιας φλεγμονής (διήθηση ουδετεροφίλων στο χόριο), όπως συνοψίζονται στην Εικόνα Γ-7. Σημειώνεται πως στο βλεννογόνο του στομάχου εντοπίζονται 83

84 σποραδικά λεμφοκύτταρα υπό φυσιολογικές συνθήκες απουσία μόλυνσης ενώ η παρουσία ουδετεροφίλων, έστω και σποραδικών αποτελεί δείκτη παρουσίας H. pylori-λοίμωξης. Εικόνα Γ-7: Σχηματική απεικόνιση της δραστηριότητας των πολυμορφοπύρηνων ουδετεροφίλων καθώς και της βαρύτητας της λεμφοκυτταρικής διήθησης στο μολυσμένο από H. pylori βλεννογόνο του στομάχου (Dixon et al. 1996) Παρατηρήθηκε ότι το σύνολο των ποντικών ανέπτυξε χρόνια ενεργό γαστρίτιδα με βαρύτητα της λεμφοκυτταρικής διήθησης, που κυμάνθηκε από ήπια έως έντονη βαθμίδα στους 6 και 9 μήνες. Πιο συγκεκριμένα, στους 6 μήνες η πλειονότητα των ζώων ανέπτυξαν μέτρια (n=30) και έντονη (n=27) γαστρίτιδα ενώ μόνο σε 3 παρατηρήθηκε ήπια γαστρική φλεγμονή (Πίνακας Γ-2). Πίνακας Γ-2: Βαρύτητα a (χρόνια φλεγμονώδης διήθηση) σε μολυσμένους με H. pylori ποντικούς Μήνες Ομάδα μελέτης Αριθμός ζώων ανά βαθμίδα b Hp Hp Hp Hp Hp Hp a Λεμφοκυτταρική διήθηση στο χόριο b Ιστοπαθολογική βαθμίδα σύμφωνα με το τροποποιημένο σύστημα αξιολόγησης της γαστρικής φλεγμονής κατά Sydney ως εξής: 0= Απουσία, 1= Ήπια, 2= Μέτρια, 3= Έντονη. 84

85 Παρόμοια, στους 9 μήνες, η κατανομή των ζώων ανά βαθμίδα βαρύτητας της γαστρικής φλεγμονής ήταν ήπια (n=3), μέτρια (n=31) και έντονη (n=26). Κανένα από τα αμόλυντα ζώα της ομάδας ελέγχου (n=18) δεν ανέπτυξε αξιόλογη γαστρική φλεγμονή, αν και σε κάποια ζώα καταγράφηκε σποραδική παρουσία λεμφοκυττάρων στο χόριο. Αναφορικά με την αξιολόγηση της δραστηριότητας της χρόνιας φλεγμονής, παρατηρήθηκε στη συντριπτική πλειοψηφία των ζώων ήπια έως μέτρια ουδετεροφιλική διήθηση. Αναλυτικότερα, στους 6 μήνες, στα περισσότερα ζώα παρατηρήθηκε ήπια (n=35) και μέτρια (n=24) ουδετεροφιλική διήθηση, πλην ενός ζώου, το οποίο ανέπτυξε έντονη φλεγμονή (Πίνακας Γ-3). Παρόμοια, στους 9 μήνες, κατανομή των ζώων ανά βαθμίδα δραστηριότητας της γαστρικής φλεγμονής ήταν ήπια (n=35), μέτρια (n=24) και έντονη (n=1). Πίνακας Γ-3: Δραστηριότητα a της χρόνιας γαστρίτιδας σε μολυσμένους με H. pylori ποντικούς Αριθμός ζώων ανά βαθμίδα b Μήνες Ομάδα μελέτης Hp Hp Hp Hp Hp Hp a Ουδετεροφιλική διήθηση στο χόριο b Ιστοπαθολογική βαθμίδα σύμφωνα με το τροποποιημένο σύστημα αξιολόγησης της γαστρικής φλεγμονής κατά Sydney ως εξής: 0= Απουσία, 1= Ήπια, 2= Μέτρια, 3= Έντονη Έκφραση MMP-3 και MMP-9 στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με H. pylori Τα επίπεδα έκφρασης της MMP-3 προσδιορίστηκαν στο γαστρικό ιστό ποντικών κατόπιν H. pylori λοίμωξης ανοσοϊστοχημικά. Στην Εικόνα Γ-8 παρουσιάζεται ο ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης MMP3, στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με διαφορετικά στελέχη H. pylori. Με καφέ χρώμα απεικονίζεται η παρουσία της MMP-3, ενώ με υποκύανο χρώμα τα φλεγμονώδη λεμφοκύτταρα. Παρατηρήθηκε ότι σε όλες τις ομάδες μελέτης τα επίπεδα της MMP-3 ήταν αυξημένα, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου αμόλυντων ποντικών, τόσο στους 6 όσο και στους 9 μήνες μετά τη μόλυνση. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των διαφορετικών ομάδων μελέτης, όπως HPARE, HPARE- 85

86 CagA-KO και SS1, ούτε στους 6, ούτε και στους 9 μήνες. Δεδομένου ότι η MMP-3 παράγεται από διαφορετικούς τύπους κυττάρων, όπως επιθηλιακά κύτταρα, κύτταρα του στρώματος (ινοβλάστες) και κύτταρα του ανοσοποιητικού, η χρώση εμφανίζεται διάχυτη και δεν είναι εύκολα διακριτή η ακριβής κυτταρική προέλευση. Τέλος, παρατηρήθηκε οριακά αυξημένη έκφραση της MMP-3 στους 9 μήνες σε σύγκριση με τα αντίστοιχα δείγματα των 6 μηνών αλλά αυτή δεν κρίθηκε ως στατιστικά σημαντική. Εικόνα Γ-8: Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός επιπέδων πρωτεΐνης MMP3 στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με διαφορετικά στελέχη H. pylori. Με καφέ χρώμα απεικονίζεται η παρουσία της MMP-3 ενώ με υποκύανο χρώμα τα φλεγμονώδη λεμφοκύτταρα. Εκτός της MMP-3, μελετήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης και της MMP-9, καθώς βιβλιογραφικά αναφέρεται ότι η MMP-3 αποτελεί ενεργοποιητή της δράσης της MMP-9 (Flores-Pliego et al. 2015). Στην Εικόνα Γ-9, παρουσιάζονται ενδεικτικά αποτελέσματα από τον ανοσοϊστοχημικό προσδιορισμό επιπέδων πρωτεΐνης MMP9, στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με διαφορετικά στελέχη H. pylori. Με καφέ χρώμα απεικονίζεται η παρουσία της MMP-9 αντίστοιχα, ενώ με υποκύανο χρώμα τα φλεγμονώδη λεμφοκύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ότι σε όλες τις ομάδες μελέτης τα επίπεδα της MMP-9 εμφανίστηκαν αυξημένα, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου αμόλυντων ποντικών, τόσο στους 6 όσο και στους 9 μήνες κατόπιν της μόλυνσης. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική 86

87 διαφορά μεταξύ των διαφορετικών ομάδων μελέτης, όπως HPARE, HPARE-CagA-KO και SS1, ούτε στους 6, ούτε και στους 9 μήνες. Παρόμοια με την περίπτωση της MMP-3, η MMP-9 αποτελεί πρωτεΐνη η οποία εκκρινεται στον εξωκυττάριο χώρο, παραγόμενη από επιθηλιακά, ανοσοποιητικά και κύτταρα του στρώματος, γεγονός που εξηγεί τη διάχυτη εμφάνιση της χεώσης στα αποτελέσματά μας. Αντίστοιχα με την MMP-3, παρατηρήθηκε οριακά αυξημένη έκφραση της MMP-9 στους 9 μήνες σε σύγκριση με τα αποτελέσματα των 6 μηνών εντούτοις αυτή δεν χαρακτηρίστηκε ως στατιστικά σημαντική. Εικόνα Γ-9: Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός επιπέδων πρωτεΐνης MMP9, στο γαστρικό επιθήλιο ποντικών μολυσμένων με διαφορετικά στελέχη H. pylori. Με καφέ χρώμα απεικονίζεται η παρουσία των MMP-3 και MMP-9 αντίστοιχα, ενώ με υποκύανο χρώμα τα φλεγμονώδη λεμφοκύτταρα. 87