ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΔΟΜΗΣ ΚΑΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΤΩΝ ΖΩΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΓΓΕΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΟΥ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ιωάννης Κ. Γρίβας Κτηνίατρος Θεσσαλονίκη

2 2

3 ΙΩΑΝΝΗ Κ. ΓΡΙΒΑ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΓΓΕΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΟΥ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στην Κτηνιατρική Σχολή Τομέας Δομής και Λειτουργίας των Ζωικών Οργανισμών Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής Γ.Χ. Παπαδόπουλος, Επιβλέπων Καθηγητής Γ. Κωστόπουλος, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθηγήτρια Ε. Μιχαλούδη-Παύλου, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής I. Μάγρας Εξεταστής Καθηγητής Χ.Μπάτζιος Εξεταστής Καθηγητής Α. Μάνθος Εξεταστής Καθηγήτρια Λ. Ανδριοπούλου- Οικονόμου Εξεταστής 3

4 4

5 Ιωάννης Κ. Γρίβας Α.Π.Θ. ΑΝΑΤΟΜΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΑΓΓΕΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΔΙΑΦΟΡΩΝ ΜΕΤΑΞΥ ΤΟΥ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ ΤΟΥ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΤΟΥ ΕΠΙΜΥΟΣ ISBN «Η έγκριση της παρούσας διδακτορικής διατριβής από την Κτηνιατρική σχολή του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως». (νόμος 5343/1932, άρθρο 202 παρ.2) 5

6 6

7 Για την εκπόνηση της παρούσας διδακτορικής διατριβής χορηγήθηκε στον κ. Γρίβα υποτροφία εσωτερικού από το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών 7

8 8

9 Πίνακας περιεχομένων ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Μορφολογία του ιπποκάμπειου σχηματισμού Κυτταροαρχιτεκτονική του ιπποκάμπειου σχηματισμού Συνδέσεις του ιπποκάμπειου σχηματισμού Αγγείωση του ιπποκάμπειου σχηματισμού Διαφοροποίηση του ιπποκάμπειου σχηματισμού κατά μήκος του διαφραγματο κροταφικού άξονά του Αστροκύτταρα nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Προέλευση του πειραματικού υλικού Μονιμοποίηση του πειραματικού υλικού Χειρισμός των ιστοτεμαχίων Ποσοτική ανάλυση Αιμοφόρα αγγεία σημασμένα με σινική μελάνη GFAP-ανοσοδραστικά κύτταρα nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων του πεδίου CA Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA Ασύμμετρες συνάψεις στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας Μεθοδολογικές παρατηρήσεις Στατιστική ανάλυση...57 Συντομογραφίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται στις εικόνες και στα σχήματα: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αιμοφόρα αγγεία σημασμένα με σινική μελάνη

10 3.1.1 Πυκνότητα των αγγείων Διάμετρος των αγγείων Πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων Διάμετρος των τριχοειδών αγγείων Πυκνότητα των μεσαίου μεγέθους αγγείων Διάμετρος των μεσαίου μεγέθους αγγείων Πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων Διάμετρος των μεγάλου μεγέθους αγγείων GFAP-ανοσοδραστικά κύτταρα nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων του πεδίου CA Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA Ασύμμετρες συνάψεις στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας του πεδίου CA ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αγγείωση Αστροκύτταρα nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων και ασύμμετρες συνάψεις στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας του πεδίου CA ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Α. ΕΛΛΗΝΟΓΛΩΣΣΗ Β. ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΗ

11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός του εγκεφάλου των σπονδυλωτών έχει μελετηθεί εκτενώς από ανατόμους, νευροχημικούς, φυσιολόγους, μοριακούς βιολόγους και ψυχολόγους, λόγω της ιδιαίτερης οργάνωσης των νευρωνικών κυκλωμάτων του και του ρόλου του στη φυσιολογία και στην παθολογία του εγκεφάλου. Ιδιαίτερο επιστημονικό ενδιαφέρον προκαλεί η εμπλοκή του ιπποκάμπειου σχηματισμού στο μηχανισμό της μνήμης και της μάθησης και στη ρύθμιση της συμπεριφοράς βάσει πληροφοριών που προέρχονται από το εξωτερικό περιβάλλον. Εξίσου ενδιαφέρουσα καθιστά τη μελέτη του ιπποκάμπειου σχηματισμού η μεγάλη τάση που παρουσιάζει για επιληψία και η ευαισθησία του στην ισχαιμία/υποξία του εγκεφάλου. Ένα χαρακτηριστικό του ιπποκάμπειου σχηματισμού που δημιουργεί ελπίδες για την αποσαφήνιση του μηχανισμού των φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών που αναφέρθηκαν είναι οι διαφορές που παρατηρούνται μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος του. Εάν οι λειτουργικές διαφορές μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος συσχετιστούν με ανατομικές/ιστολογικές διαφορές, πιθανώς να αποκτήσουμε μία καλύτερη γνώση για τον μηχανισμό των φυσιολογικών και παθολογικών αυτών διεργασιών. Στα πλαίσια αυτής της λογικής, στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκαν ποσοτικές διαφορές της αγγείωσης, των αστροκυττάρων, των νευρώνων που εκφράζουν την νευρική ισομορφή της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (neuronal nitric oxide synthase, nnos) και της εννεύρωσης των νευρώνων αυτών και των πυραμιδοειδών κυττάρων, καθώς υπάρχουν στοιχεία που συνδέουν τις ανατομικές αυτές παραμέτρους με τη μνήμη, τη μάθηση, την επιληψία και την ισχαιμία. Για τη μελέτη της πυκνότητας και της διαμέτρου των αγγείων στο οπτικό μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκαν ιστολογικές τομές χρωματισμένες μετά από ενδοαγγειακή έγχυση σινικής 11

12 μελάνης και με τη μέθοδο Nissl. Η μέτρηση της πυκνότητας των αστροκυττάρων και των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων στο οπτικό μικροσκόπιο και των συνάψεων που δέχεται το κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο πραγματοποιήθηκε σε ιστολογικές τομές ανοσοκυτταροχημικά σημασμένες για την όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας (glial fibrillary acidic protein, GFAP) και nnos αντίστοιχα. Τέλος, οι συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων και στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας του πεδίου CA1 του κυρίως ιππόκαμπου μετρήθηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε ιστολογικές τομές χωρίς σήμανση. Η εργασία αυτή διαιρείται σε τέσσερις ενότητες, Εισαγωγή, Υλικά και Μέθοδοι, Αποτελέσματα και Συζήτηση. Στην ενότητα «Εισαγωγή» γίνεται μία γενική αναφορά στη μορφολογία, στην κυτταροαρχιτεκτονική, στις συνδέσεις και στην αγγείωση του ιπποκάμπειου σχηματισμού, στις διαφορές που παρατηρούνται ανάμεσα στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα του, στα αστροκύτταρα και στους nnos-ανοσοδραστικούς νευρώνες. Στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι» περιγράφεται το πειραματικό υλικό και οι τρόποι χειρισμού του, καθώς και οι μέθοδοι που εφαρμόσθηκαν για την απόκτηση των αποτελεσμάτων. Στην ενότητα «Αποτελέσματα» παρουσιάζονται τα αποτελέσματα των μετρήσεων που πραγματοποιήθηκαν και γίνεται σύγκρισή τους μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Στην ενότητα «Συζήτηση» γίνεται μία προσπάθεια αξιολόγησης των αποτελεσμάτων, σε συνδιασμό με στοιχεία της διεθνούς βιβλιογραφίας και συσχετισμού των ανατομικών/ιστολογικών διαφορών που διαπιστώνονται με αντίστοιχες διαφορές στην φυσιολογία και την παθολογία του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Για την πραγματοποίηση της παρούσας έρευνας οφείλω να ευχαριστήσω τα μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Γ. Χ. Παπαδόπουλο, τον καθηγητή κ. Γ. Κωστόπουλο και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Ε. Μιχαλούδη-Παύλου, 12

13 για την εμπιστοσύνη που έδειξαν στο πρόσωπό μου, αναθέτοντάς μου το συγκεκριμένο θέμα. Ιδιαιτέρως ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Γ. Χ. Παπαδόπουλο χωρίς την πνευματική καθοδήγηση του οποίου ακόμα θα περιπλανιώμουν στο αχανές πεδίο των νευροεπιστημών και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κα. Ε. Μιχαλούδη-Παύλου που με βοήθησε να μετουσιώσω την θεωρία σε πράξη. Και οι δύο είναι για μένα πολύτιμοι δάσκαλοι. Ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Χ. Μπάτζιο που μεταμόρφωσε τους αριθμούς που κατέγραψα σε λόγο. Ευχαριστώ τον καθηγητή κ. Ι. Μάγρα, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Ι. Αντωνόπουλο, τον επίκουρο καθηγητή κ. Γ. Μπατζία, την λέκτορα κα. Α. Τσιγκοτζίδου, τους συναδέλφους κ. Γ. Δελή, κ. Ι. Λιαγκούρα, κα. Μ. Λάτσαρη, τον κ. Χ. Δρόσο και την κα. Α. Τσιπινιά, που με βοήθησαν σε πολλά πρακτικά, καθημερινά θέματα και κυρίως γιατί δεν βαρέθηκαν να με ακούνε. Ευχαριστώ την κα. Μ. Χιωτέλλη για την τεχνική και ψυχολογική στήριξη που απλόχερα μου παρείχε. Ευχαριστώ το Ιδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.) για την πολύτιμη υλική στήριξη της παρούσας έρευνας. Τέλος, ευχαριστώ τη σύζυγο μου κα. Αναστασία Καρακίτσου για την υπομονή και την αγάπη της και την οικογένειά μας για την πολύπλευρη αρωγή της. 13

14 14

15 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η μελέτη της δομής του ιπποκάμπειου σχηματισμού απασχόλησε τους νευροανατόμους πολύ νωρίς. Εφαρμόζοντας κάθε νέα τεχνική χρώσης και αποτύπωσης των νευρωνικών πληθυσμών και κυκλωμάτων, πολλοί ασχολήθηκαν με την δομή του και τις συνδέσεις που σχηματίζουν οι νευρώνες του μεταξύ τους και με νευρώνες άλλων περιοχών του εγκεφάλου (Golgi 1886 Ramón y Cajal 1911 de Nó 1922, 1933, 1934 Blackstad , 1970 Storm-Mathisen και Blackstad 1964 Zimmer 1971 Hjorth-Simonsen και Jeune 1972 Hjorth-Simonsen 1972, 1973 Zimmer και Hjorth-Simonsen 1975 Zimmer και Haug 1978 Freund και Buzsaki 1996 Parra και συν Burwell 2000 Pitkänen και συν Scharfman και συν Witter και συν. 2000α, 2000β O Mara και συν Alonso 2002 Witter και Wouterlood 2002 Scremin 2004). Χρησιμοποιώντας στοιχεία από τις παραπάνω μελέτες, καθώς και από τις ακόλουθες βιβλιογραφικές ανασκοπήσεις και βιβλία (Seifert 1983 Swanson και συν Amaral και Witter 1989, 1995 Chan-Palay και Köhler 1989 Witter και συν da Silva και συν Storm-Mathisen και συν Amaral 1991 Ribak και συν Paxinos και Watson 1998 Cooper και Lowenstein 2002 Witter και Amaral 2004) θα γίνει μία προσπάθεια να περιγραφεί περιληπτικά η θέση του ιπποκάμπειου σχηματισμού στον εγκέφαλο του επίμυος, η μορφολογία του, μακροσκοπική και μικροσκοπική, οι συνδέσεις και η αγγείωσή του. Επίσης, θα γίνει αναφορά στα βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν τη διαφοροποίηση του ιπποκάμπειου σχηματισμού κατά μήκος του διαφραγματο κροταφικού άξονά του. Tέλος, θα αναφερθούν κάποια στοιχεία για τα αστροκύτταρα και τους nnos-ανοσοδραστικούς νευρώνες των εγκεφαλικών ημισφαιρίων γενικά και του ιπποκάμπειου σχηματισμού ειδικότερα. 15

16 1.1 Μορφολογία του ιπποκάμπειου σχηματισμού O ιπποκάμπειος σχηματισμός έχει δύο σκέλη, αριστερό και δεξί, το καθένα από τα οποία έχει καμπύλο, ημισεληνοειδές σχήμα, και ωοειδή διατομή (Amaral και Witter 1995) (εικ. 1.1). Στον επίμυ, το κοίλο χείλος του κάθε σκέλους φέρεται προς τα εμπρός και διαφραγματικά και προέκτασή του αποτελεί η παρυφή, ενώ το κυρτό προς τα πίσω και κροταφικά (Cooper και Lowenstein 2002). Όταν αφαιρεθεί από τον υπόλοιπο εγκέφαλο, έχει τη μορφή θαλάσσιου ιππόκαμπου, απ όπου και η ονομασία του. Δεν είναι ορατός από την επιφάνεια του εγκεφάλου. Για να αποκαλυφθεί πρέπει να αφαιρεθεί ο υπερκείμενος κροταφικός λοβός των εγκεφαλικών ημισφαιρίων. Εικόνα 1.1. Σχεδιάγραμμα του εγκεφάλου του επίμυος, στο οποίο διακρίνεται η θέση και ο προσανατολισμός του ιπποκάμπειου σχηματισμού, καθώς και των πεδίων του σε σχέση με τα εγκεφαλικά ημισφαίρια. 16

17 Εικόνα 1.2. Σχεδιάγραμμα εγκάρσιας τομής του ιπποκάμπειου σχηματισμού, στο οποίο διακρίνονται τα πεδία του και οι στιβάδες τους, καθώς και το «τρισυναπτικό κύκλωμα» των νευρώνων του. Το πρόσθιο άκρο του συνορεύει με το διάφραγμα και καλείται διαφραγματικός, πρόσθιος ή ραχιαίος πόλος και το οπίσθιο άκρο του με τον κροταφικό λοβό και καλείται κροταφικός, οπίσθιος ή κοιλιακός πόλος. Βρίσκεται εξωτερικά του θαλάμου και εσωτερικά του κροταφικού κέρατος της πλάγιας κοιλίας. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός αποτελείται από τον κυρίως ιππόκαμπο και τις γειτονικές σε αυτόν περιοχές του φλοιού, δηλαδή, την οδοντωτή έλικα και το υπόθεμα. Αντικείμενο της παρούσας έρευνας είναι ο κυρίως ιππόκαμπος και η οδοντωτή έλικα. Όπως φαίνεται στην εικόνα 1.2, η οδοντωτή έλικα, σε εγκάρσια ιστολογική τομή, έχει σχήμα V κατά μήκος των διαφραγματικών δύο τρίτων του ιπποκάμπειου σχηματισμού ή U κατά μήκος του κροταφικού τρίτου, ενώ ο κυρίως ιππόκαμπος έχει σχήμα C ή κέρατος προβάτου, από όπου προκύπτει και η χαρακτηριστική ονομασία του «Αμμώνειο Κέρας» (Cornu Ammonis, CA) (Cooper και Lowenstein 2002). Οι δύο καμπύλοι σχηματισμοί διαπλέκονται μεταξύ τους, έτσι ώστε το ένα σκέλος του καθενός εισέρχεται μερικώς μεταξύ των δύο σκελών του άλλου (εικ. 1.3). Ο κυρίως ιππόκαμπος χωρίζεται σε τρία πεδία, CA1, 17

18 CA2 και CA3 (de Nó 1934) (εικ. 1.3). Χωροταξικά το πεδίο CA3 βρίσκεται στο πρόσθιο χείλος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, το πεδίο CA1 στην εξωτερική επιφάνεια, η οδοντωτή έλικα στην εσωτερική επιφάνεια, το υπόθεμα στο οπίσθιο χείλος, ενώ το πεδίο CA2 καλύπτει μία στενή περιοχή μεταξύ των πεδίων CA1 και CA3 (εικ. 1.1, 1.2 και 1.3). 1.2 Κυτταροαρχιτεκτονική του ιπποκάμπειου σχηματισμού Παρατήρηση ιστολογικών τομών, εγκάρσιων στον διαμήκη άξονα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, αποκαλύπτει ότι τα κυτταρικά σώματα και οι αποφυάδες των νευρώνων καθώς και τα δεμάτια ινών, είναι οργανωμένα σε διακριτές μεταξύ τους στιβάδες. Οι κύριοι νευρώνες της οδοντωτής έλικας ονομάζονται κοκκοειδή κύτταρα, ενώ του κυρίως ιππόκαμπου, πυραμιδοειδή κύτταρα (Amaral και Witter 1995 Cooper και Lowenstein 2002 Witter και Amaral 2004). Όπως αναφέρθηκε, σε εγκάρσιες ιστολογικές τομές η οδοντωτή έλικα έχει σχήμα V ή U. Το ένα σκέλος του V ή U, το οποίο βρίσκεται σε γειτονία με το πεδίο CA1, ονομάζεται υπερπυραμιδικό ή εγκλεισμένο ή μεσαίο, και το άλλο υποπυραμιδικό ή ελεύθερο ή εξωτερικό (Witter και Amaral 2004). Μεταξύ του εγκλεισμένου σκέλους της οδοντωτής έλικας και του πεδίου CA1 βρίσκεται η ιπποκάμπεια σχισμή. Τόσο στην οδοντωτή έλικα, όσο και στον κυρίως ιππόκαμπο, στιβάδες με σχετικά λιγοστά, αραιά κατανεμημένα κύτταρα βρίσκονται πάνω και κάτω από τη στιβάδα, στην οποία είναι συγκεντρωμένοι οι κύριοι νευρώνες. Εξαιτίας αυτής της διάταξης, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός αναφέρεται ως τρίστιβος φλοιός ή αρχιχιτώνιο, σε αντίθεση με το εξάστιβο νεοχιτώνιο και το πεντάστιβο παλαιοχιτώνιο. Οι στιβάδες της οδοντωτής έλικας είναι η μοριώδης στιβάδα (molecular layer, ML) επιφανειακά, η στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων (granular cell layer, GL) στο μέσο και η πολύμορφη στιβάδα ή πύλη (polymorphic layer, PoL ή Hilus) εν τω βάθει. Αντίστοιχα, στον κυρίως ιππόκαμπο, επιφανειακά απαντάται η σκάφη και προχωρώντας βαθύτερα η στιβάδα των 18

19 πολύμορφων κυττάρων (stratum οriens, sor), η στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων (stratum pyramidale, spy), η ακτινωτή στιβάδα (stratum radiatum, sr) και η βοθριώδηςμοριώδης στιβάδα (stratum lacunosum-moleculare, sl-m) (εικ. 1.3). Στο πεδίο CA3, τμήμα της ακτινωτής στιβάδας που συνορεύει με τη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων είναι η διαυγής στιβάδα (stratum lucidum, sl). Για να ενταχθεί ο κυρίως ιππόκαμπος στο τρίστιβο πρότυπο του αρχιχιτωνίου συνηθίζεται να θεωρούνται οι δύο πρώτες στιβάδες, όπως και οι δύο τελευταίες, ως μία στιβάδα (Cooper και Lowenstein 2002). Εικόνα 1.3. Σχεδιάγραμμα τμήματος εγκάρσιας τομής του ιπποκάμπειου σχηματισμού, στο οποίο διακρίνονται λεπτομερώς τα πεδία του κυρίως ιππόκαμπου και οι στιβάδες αυτού και της οδοντωτής έλικας. 19

20 Οι κύριοι νευρώνες της οδοντωτής έλικας, τα κοκκοειδή κύτταρα, αντιπροσωπεύουν την πλειοψηφία των κυττάρων της και τα σχετικά μικρά σε μέγεθος (διάμετρος 8-12 μm) κυτταρικά σώματά τους είναι πυκνά στοιβαγμένα (4-8 κατά πλάτος) στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων. Οι δενδρίτες αυτών των κυττάρων, οι οποίοι αναδύονται από το κορυφαίο τμήμα των κυτταρικών σωμάτων, φέρουν μεγάλο αριθμό ακανθοειδών προεξοχών, διακλαδίζονται σε μικρή απόσταση από την έκφυσή τους και διασχίζουν στη συνέχεια τη μοριώδη στιβάδα, μέσα στα όρια της οποίας παραμένουν, δεχόμενοι συνδεσμικές και συνδετικές προσαγωγούς ίνες στην αρχή της πορείας τους, καθώς και ίνες από την διατιτραίνουσα οδό σε πιο απομακρυσμένα σημεία τους. Οι νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων αναδύονται από το βασικό τμήμα των κυτταρικών σωμάτων. Κάθε κοκκοειδής νευρώνας έχει έναν κύριο νευραξονικό κλάδο και αρκετούς παράπλευρους κλάδους που απολήγουν στους νευρώνες της πύλης. Ο κύριος νευραξονικός κλάδος εξερχόμενος της οδοντωτής έλικας διατρέχει όλο το πλάτος του πεδίου CA3 εντός της διαυγούς στιβάδας. Οι νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων είναι λεπτοί και αμύελοι. Τους έχει δοθεί η ονομασία βρυώδεις ίνες, διότι φέρουν μεγάλες ακανόνιστες προεκβολές, οι οποίες τους προσδίδουν μία αδρή εμφάνιση σε ιστολογικές τομές χρωματισμένες με τη μέθοδο Golgi ή με ενδοκυτταρική έγχυση. Οι προεκβολές των βρυωδών ινών σχηματίζουν εντός των ορίων της διαυγούς ζώνης περίπλοκες συνάψεις με μεγάλες, πολλαπλώς διακλαδισμένες άκανθες, τις ακανθοειδείς προεξοχές των δενδριτών των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3. Στο έσω όριο της στιβάδας των κοκκοειδών κυττάρων, εντοπίζονται τα καλαθοειδή κύτταρα, μία ομάδα ανασταλτικών νευρώνων με εκτεταμένες νευραξονικές διακλαδώσεις (το δίκτυο που σχηματίζουν μοιάζει με καλάθι, απ όπου και το όνομά τους), οι οποίες περιορίζονται στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων. Πέραν των καλαθοειδών κυττάρων, αρκετοί, διαφορετικοί μορφολογικά, υποτύποι GABAεργικών διάμεσων νευρώνων, εντοπίζονται στην μοριώδη στιβάδα και την πύλη. Τα κύτταρα αυτά επίσης εμφανίζουν συχνά εκτεταμένες νευραξονικές διακλαδώσεις και σχηματίζουν 20

21 νευραξονοσωματικές και νευραξονοδενδριτικές συνάψεις με κοκκοειδή και άλλα κύτταρα (Cooper και Lowenstein 2002). Μεταξύ των νευρώνων της πύλης περιλαμβάνονται και τα βρυώδη κύτταρα, τα οποία ονομάζονται έτσι, διότι οι εγγύς δενδρίτες τους καλύπτονται σε μεγάλο βαθμό από μεγάλες, ακανόνιστου σχήματος άκανθες. Το αν τα βρυώδη κύτταρα πρέπει να θεωρούνται ως τροποποιημένα έκτοπα πυραμιδοειδή κύτταρα του ιπποκάμπειου σχηματισμού ή αν αποτελούν έναν ειδικό τύπο κυττάρων της οδοντωτής έλικας δεν έχει διευκρινιστεί προς το παρόν (Frotscher και συν Freund και Buzsaki 1996). Γενικά, τα βρυώδη κύτταρα θεωρούνται ως διεγερτικοί κύριοι νευρώνες, οι οποίοι σχηματίζουν συνάψεις με άλλους νευρώνες της πύλης και έχουν μακρείς νευραξονικούς κλάδους που συμβάλλουν στις ομοπλάγιες (συνδετικές) και τις ετεροπλάγιες (συνδεσμικές) ίνες που προβάλλουν στα κοκκοειδή κύτταρα (Amaral 1978). Οι κύριοι νευρώνες του αμμώνειου κέρατος, τα πυραμιδοειδή κύτταρα, ονομάζονται έτσι εξαιτίας του σχήματος του σώματός τους που είναι κωνικό ή πυραμιδοειδές. Φέρουν μεγάλους, κορυφαίους και βασικούς δενδρίτες. Τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3 έχουν χαρακτηριστικά μεγάλα κυτταρικά σώματα, πυκνά διαταγμένα σε μία στιβάδα πάχους μm. Ένας ή δύο κορυφαίοι δενδρίτες αναδύονται από το κυτταρικό σώμα και δίνουν κλάδους που κατευθύνονται ακτινωτά προς την ακτινωτή και την βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Οι βασικοί δενδρίτες είναι περισσότεροι και δίνουν κλάδους που πορεύονται λοξά εντός της στιβάδας των πολύμορφων κυττάρων προς τη σκάφη. Οι νευράξονες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3 αναδύονται από τη βάση του κυτταρικού σώματος ή από το αρχικό τμήμα ενός βασικού δενδρίτη, διακλαδίζονται ευρέως και προβάλουν εντός του ιπποκάμπειου σχηματισμού, τόσο προς τα πεδία CA3 και CA2 και την πύλη της οδοντωτής έλικας, σχηματίζοντας την συνδετική οδό, όσο και προς το πεδίο CA1, σχηματίζοντας την οδό των παράπλευρων κλάδων του Schäffer. Τα σώματα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1, συγκρινόμενα με αυτά των αντίστοιχων 21

22 νευρώνων των πεδίων CA3 και CA2, είναι λίγο μικρότερα και πιο πυκνά διατεταγμένα εντός των ορίων της, πάχους μm, στιβάδας των πυραμιδοειδών κυττάρων. Συνήθως έχουν έναν μόνο κορυφαίο δενδρίτη, που αναλύεται σε αρκετούς κλάδους εντός της ακτινωτής στιβάδας, οι οποίοι αναλύονται περαιτέρω και απολήγουν σε θυσσάνους λεπτών κλάδων εντός της βοθριώδους-μοριώδους στιβάδας. Οι βασικοί δενδρίτες είναι πολυάριθμοι και διακλαδίζονται εντός της στιβάδας των πολύμορφων νευρώνων. Οι δενδρίτες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 καλύπτονται από πολυάριθμες άκανθες. Οι νευράξονες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 αναδύονται από σημείο του κυτταρικού σώματος κοντά στην έκφυση του κορυφαίου δενδρίτη, ή σπανιότερα από το αρχικό τμήμα ενός βασικού δενδρίτη, δίνουν ορισμένους παράπλευρους κλάδους που παραμένουν εντός των ορίων της στιβάδας των πολύμορφων κυττάρων και σχηματίζουν συνάψεις με άλλους νευρώνες του πεδίου CA1, ενώ οι κύριοι κλάδοι εισέρχονται στη σκάφη και σχηματίζουν την απαγωγό οδό που οδεύει προς το υπόθεμα και τον ενδορρινικό φλοιό, καθώς και σε πιο απομακρυσμένες περιοχές, δηλαδή στον περιρρινικό φλοιό, στον μετωπιαίο λοβό και στο διάφραγμα (Cooper και Lowenstein 2002). Οι στιβάδες των μη πυραμιδοειδών κυττάρων του ιπποκάμπειου σχηματισμού, περιλαμβάνουν τα κυτταρικά σώματα ενός μικρότερου αριθμού νευρώνων, των διάμεσων νευρώνων. Οι διάμεσοι νευρώνες εντοπίζονται σε όλες τις περιοχές και τα πεδία του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Freund και Buzsaki 1996), διαφέρουν όμως μορφολογικά. Ένα κοινό γνώρισμα των περισσοτέρων, είναι ότι εμφανίζουν ευρύτατα διακλαδισμένους νευράξονες. Παρότι το μεγαλύτερο ποσοστό αυτών των κυττάρων είναι ανοσοδραστικά έναντι αντισωμάτων για το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA), παρουσιάζουν μεταξύ τους σημαντικές διαφορές, τόσο στην μορφολογία των κυτταρικών σωμάτων τους, όσο και στον τρόπο που διακλαδίζονται οι δενδρίτες και οι νευράξονές τους. Οι διάφορες υποομάδες των GABAεργικών νευρώνων του ιπποκάμπειου σχηματισμού μπορούν ασφαλέστερα να διακριθούν μεταξύ τους με βάση την ανοσοδραστικότητά τους για νευροδραστικές ουσίες, 22

23 για νευροπεπτίδια, για πρωτεΐνες δέσμευσης του ασβεστίου και για πρωτεΐνες της επιφάνειας του κυττάρου. Οι διάμεσοι νευρώνες στον ιπποκάμπειο σχηματισμό είναι σημαντικοί ρυθμιστές της ηλεκτρικής δραστηριότητας (Freund και Buzsaki 1996). Ελέγχοντας τα προσερχόμενα και τα εξερχόμενα σήματα, καθώς και τη διεγερσιμότητα των κύριων νευρώνων (Miles και συν. 1996) παίζουν σημαντικό ρόλο στον συγχρονισμό μεγάλων πληθυσμών κυττάρων και στη δημιουργία ρυθμικών εξερχόμενων ώσεων (Buzsaki και Chrobak 1995 Cobb και συν Gulyàs και συν. 1999). 1.3 Συνδέσεις του ιπποκάμπειου σχηματισμού Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός δέχεται προσαγωγούς ίνες από τον ενδορρινικό φλοιό, το διάφραγμα, την αμυγδαλή, τον θάλαμο, τον υποθάλαμο και τους μονοαμινεργικούς πυρήνες του στελέχους του εγκεφάλου. Σε ορισμένα είδη, το κάθε σκέλος του ιπποκάμπειου σχηματισμού δέχεται πλήθος συνδεσμικών προσαγωγών ινών από το ετεροπλάγιο σκέλος (Ramón y Cajal 1911 de Nó 1922, 1933, 1934 Blackstad , 1970 Raisman και συν Amaral και Witter 1989). Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός, δέχεται επίσης, πληροφορίες από τον αισθητικό φλοιό, έμμεσα όμως μέσω του συνειρμικού φλοιού, καθώς και από περιοχές που σχετίζονται με την εγρήγορση, την προσοχή, τα συναισθήματα και τη μνήμη (Cooper και Lowenstein 2002). Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός πιστεύεται ότι ενοποιεί αυτές τις διαφορετικές πληροφορίες και γι αυτό το λόγο θεωρείται ως μία περιοχή του μη ειδικού συνειρμικού φλοιού. Οι προερχόμενες από τον ενδορρινικό φλοιό προσαγωγοί ίνες, εισέρχονται στον ιπποκάμπειο σχηματισμό μέσω ινών της διατιτραίνουσας οδού (perforant path). Η διατιτραίνουσα οδός χωρίζεται σε δύο μοίρες, την εξωτερική και τη μέση. Στα τρωκτικά, η εξωτερική μεταφέρει οσφρητικές προσαγωγούς ίνες και η μέση μη οσφρητικές. Αυτές οι 23

24 προσαγωγοί ίνες είναι διεγερτικές και χρησιμοποιούν το γλουταμινικό οξύ ως νευροδιαβιβαστή. Προσαγωγοί ίνες προερχόμενες από το διάφραγμα εισέρχονται μέσω της παρυφής του ιπποκάμπειου σχηματισμού και της ψαλίδας και χρησιμοποιούν ακετυλοχολίνη και γ-αμινοβουτυρικό οξύ ως νευροδιαβιβαστή, ενώ ίνες προερχόμενες από τον υπομέλανα τόπο, τους πυρήνες της ραφής και το κοιλιακό καλυπτρικό πεδίο προβάλλουν στον ιπποκάμπειο σχηματισμό και χρησιμοποιούν ως νευροδιαβιβαστή νοραδρεναλίνη, σεροτονίνη και δοπαμίνη αντίστοιχα (Cooper και Lowenstein 2002). Απαγωγοί ίνες από τον ιπποκάμπειο σχηματισμό και κυρίως από το πεδίο CA1, εκτός από το υπόθεμα απολήγουν στην πλάγια διαφραγματική περιοχή, στον πυρήνα της διαγώνιας ταινίας (του Broca), στον επικλινή πυρήνα, στην κοιλιακή ταινία του τετράδυμου πετάλου (ventral taenia tecta), στον πρόσθιο οσφρητικό πυρήνα, στον υποθαλάμο, στο αμυγδαλοειδές σώμα, στον οσφρητικό βολβό, στον οπισθοσπλήνιο, στο στεφανιαίο, και στον προμετωπιαίο φλοιό (Van Groen και Wyss 1990 Jay και Witter 1991 Naber και Witter 1998). Σύμφωνα με την κλασσική περιγραφή (Ramón y Cajal 1893 Lorente de Nó 1933, 1934, Blackstad 1956, 1958 Raisman και συν Blackstad και συν Andersen και συν. 1971), το βασικό κύκλωμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού οργανώνεται εγκάρσια προς τον διαμήκη άξονα αυτού και αποτελείται από μία αλυσίδα τριών κύριων διεγερτικών οδών. Το πρώτο τμήμα του κυκλώματος σχηματίζεται από νευρικές ίνες (διατιτραίνουσα οδός), οι οποίες προέρχονται από τον ενδορρινικό φλοιό και απολήγουν συναπτόμενες με τα κοκκοειδή κύτταρα της οδοντωτής έλικας. Το δεύτερο τμήμα αποτελείται από τους νευράξονες των κοκκοειδών κυττάρων (τις βρυώδεις ίνες - οδός των βρυωδών ινών), οι οποίες σχηματίζουν συνάψεις με τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA3. Το τρίτο και τελευταίο τμήμα του κυκλώματος σχηματίζεται από τους νευράξονες των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA3 (οδός των παράπλευρων κλάδων του Schäffer), οι οποίοι καταλήγουν συναπτόμενοι με τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA1. Δεδομένου ότι 24

25 νευρικές ίνες από το πεδίο CA1 καταλήγουν στον ενδορρινικό φλοιό τόσο άμεσα, όσο και έμμεσα, μέσω του υποθέματος, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός είναι οργανωμένος σαν ένα κλειστό κύκλωμα διεγερτικών συνάψεων. Μία πιο ολοκληρωμένη θεώρηση του κυκλώματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, λαμβάνει υπόψη αρκετούς επιπλέον τύπους συνάψεων. Αυτοί, περιλαμβάνουν συνάψεις μεταξύ κύριων και διάμεσων νευρώνων, συνάψεις κύριων νευρώνων με συνδετικές νευρικές ίνες προερχόμενες από άλλους ομοπλάγιους κύριους νευρώνες του ιπποκάμπειου σχηματισμού και ρυθμιστικές προσαγωγούς ίνες προερχόμενες από περιοχές εκτός του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Cooper και Lowenstein 2002). Μία σημαντική ιδιότητα των συνάψεων του νευρωνικού κυκλώματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι η δυνατότητα για μακρόχρονη ενδυνάμωση (long term potentiation, LTP) (Bliss και Lomo 1973 Swanson και συν. 1982). Έχει παρατηρηθεί, ότι μια σύντομη, υψηλής συχνότητας, αλληλουχία ερεθισμάτων σε οποιαδήποτε από τις οδούς του βασικού κυκλώματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού αυξάνει τα μετασυναπτικά διεγερτικά δυναμικά. Η αύξηση αυτή μπορεί να διαρκέσει επί ώρες, ή, στο άθικτο ζώο, επί ημέρες ή ακόμη και εβδομάδες. Με τη μακρόχρονη ενδυνάμωση στον ιπποκάμπειο σχηματισμό συνδέεται η αποθήκευση της δηλωτικής μνήμης (συνειδητά ανακαλούμενες πληροφορίες, που αφορούν άτομα, τόπους και πράγματα) στα θηλαστικά. 1.4 Αγγείωση του ιπποκάμπειου σχηματισμού Όπως είναι γνωστό, στον επίμυ το αρτηριακό αίμα προσάγεται στην περιοχή της κεφαλής με την αριστερή και τη δεξιά κοινή καρωτίδα. Η κοινή καρωτίδα αναλύεται στην έσω και έξω καρωτίδα και την ινιακή αρτηρία. Η έσω καρωτίδα αναλύεται στην πρόσθια και στη μέση εγκεφαλική αρτηρία και στην οπίσθια αναστομωτική αρτηρία, από την οποία εκφύονται η οπίσθια εγκεφαλική και η πρόσθια χοριοειδής αρτηρία. Η ινιακή αρτηρία αναλύεται στην κονδυλική και στην οπίσθια μηνιγγική αρτηρία και στον παλίνδρομο και στον ινιακό κλάδο. Ο 25

26 ινιακός κλάδος της ινιακής αρτηρίας αναλύεται στον νωτιαίο και στον εγκεφαλικό κλάδο. Τα εγκεφαλικά ημισφαίρια αιματώνονται από τον αρτηριακό κύκλο, ο οποίος σχηματίζεται από την αναστόμωση της αριστερής και της δεξιάς πρόσθιας εγκεφαλικής αρτηρίας (πρόσθια αναστομωτική αρτηρία) και την αναστόμωση της αριστερής και της δεξιάς οπίσθιας αναστομωτικής αρτηρίας στο μέσο της οποίας εκβάλλει η βασική αρτηρία, η οποία σχηματίζεται από τον αριστερό και τον δεξιό εγκεφαλικό κλάδο. Αξίζει να αναφερθεί ότι στους επίμεις παρατηρούνται πολυάριθμες αρτηριακές και φλεβικές αναστομώσεις, οι οποίες αφορούν σε όλα τα μεγέθη αγγείων από τον ίδιο τον αρτηριακό κύκλο, μέχρι τα μικρότερα τριχοειδή, τα οποία σχηματίζουν εκτεταμένα συνεχή πλέγματα (Coyle 1976, 1978 Scremin 2004). Λίγο πριν ή μετά το σημείο έκφυσης της οπίσθιας εγκεφαλικής από την οπίσθια αναστομωτική αρτηρία, αναδύεται από την οπίσθια αναστομωτική ή την οπίσθια εγκεφαλική αντίστοιχα η διαμήκης αρτηρία του ιπποκάμπειου σχηματισμού (διάμετρος 0,25 mm), η οποία μετά από σύντομη πορεία προς τα εμπρός ακολουθεί τον διαμήκη άξονα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Η διαμήκης αρτηρία του ιπποκάμπειου σχηματισμού δίνει σε σχεδόν τακτά διαστήματα κατά μήκος του, βραχείς κάθετους κλάδους, τις εγκάρσιες αρτηρίες του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Οι εγκάρσιες αρτηρίες του ιπποκάμπειου σχηματισμού διακρίνονται στις έσω και στις έξω. Οι έσω εγκάρσιες αρτηρίες του ιπποκάμπειου σχηματισμού διασχίζουν την ιπποκάμπεια σχισμή, διακλαδίζονται ευρέως και αιματώνουν όλες τις στιβάδες του κυρίως ιππόκαμπου, την μοριώδη στιβάδα και την στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων του εγκλεισμένου σκέλους της οδοντωτής έλικας. Οι έξω εγκάρσιες αρτηρίες του ιπποκάμπειου σχηματισμού αναδύονται είτε από την διαμήκη. είτε από τις εγκάρσιες αρτηρίες, είναι βραχύτερες και μικρότερης διαμέτρου από τις έσω εγκάρσιες αρτηρίες, πορεύονται παράλληλα με την εξωτερική επιφάνεια του ελεύθερου σκέλους της οδοντωτής έλικας και αιματώνουν τη μοριώδη στιβάδα και τη στιβάδα των 26

27 κοκκοειδών κυττάρων του σκέλους αυτού και την πύλη, απαντώνται δε κυρίως στο μέσο και στο κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Coyle 1976, 1978 Scremin 2004). Οι φλεβικοί κλάδοι του ιπποκάμπειου σχηματισμού διακρίνονται στις έσω, στις έξω και στις εν τω βάθει εγκάρσιες φλέβες. Οι έσω και οι έξω εγκάρσιες φλέβες παροχετεύουν το αίμα από τις περιοχές που αιματώνουν οι έσω και οι έξω εγκάρσιες αρτηρίες αντίστοιχα και πορεύονται παράλληλα με αυτές. Οι εν τω βάθει εγκάρσιες φλέβες παροχετεύουν το αίμα από το τμήμα της σκάφης που προβάλει μέσα στην πλάγια κοιλία και το υποκείμενο τμήμα της στιβάδας των πολύμορφων νευρώνων του πεδίου CA3 του κυρίως ιππόκαμπου, πορεύονται εντός της παρυφής, απαντώνται δε κυρίως στο μέσο και στο διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Από τις έσω, έξω και εν τω βάθει εγκάρσιες φλέβες του ιπποκάμπειου σχηματισμού σχηματίζονται η έσω, η έξω και η εν τω βάθει διαμήκης φλέβα του ιπποκάμπειου σχηματισμού αντίστοιχα, οι οποίες, όπως και η διαμήκης αρτηρία, ακολουθούν τον διαμήκη άξονα του ιπποκάμπειου σχηματισμού και αφού πορευθούν, για μικρό διάστημα, παράλληλα προς την άζυγη έσω εγκεφαλική φλέβα εκβάλλουν μαζί με τις ετεροπλάγιές τους σε αυτήν, σχηματίζοντας τη μεγάλη εγκεφαλική φλέβα του Galen. Η φλέβα του Galen ενώνεται με τον κοιλιακό οβελιαίο κόλπο και σχηματίζουν τον ευθύ κόλπο, ο οποίος ενώνεται με τον ραχιαίο οβελιαίο και τον εγκάρσιο κόλπο στην ουραία σύγκλιση των φλεβικών κόλπων. Από εκεί το αίμα αποχετεύεται κυρίως στη γναθιαία φλέβα, η οποία είναι κλάδος της έξω σφαγίτιδας (Coyle 1976, 1978 Scremin 2004). 1.5 Διαφοροποίηση του ιπποκάμπειου σχηματισμού κατά μήκος του διαφραγματο κροταφικού άξονά του Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός εμφανίζει ανατομική και λειτουργική διαφοροποίηση κατά τον διαμήκη διαφραγματοκροταφικό άξονά του (Nadel 1968 Stevens και Cowey 1973 Isaacson 1974 Moser και Moser 1998α Witter και συν. 2000β Small 2002 Bannerman και συν. 2004). 27

28 Στον επίμυ το σχήμα της εγκάρσιας διατομής του ιπποκάμπειου σχηματισμού εμφανίζεται αποπλατυσμένο στο διαφραγματικό τμήμα και περισσότερο ωοειδές, σχεδόν κυκλικό, στο κροταφικό τμήμα. Διαφορές παρατηρούνται και στο σχήμα και το πάχος των διάφορων περιοχών, πεδίων και στιβάδων κατά τον διαμήκη άξονα (Gaarskjaer 1978). Πέρα από αυτές τις μακροσκοπικές διαφορές, υπάρχουν και άλλες που αφορούν την πυκνότητα των διαφόρων ομάδων νευρωνικών πληθυσμών. Η πυκνότητα του πληθυσμού των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 εμφανίζει μεγαλύτερες τιμές στο διαφραγματικό τμήμα συγκριτικά με το κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Λιαγκούρας, 2006). Διαφορές παρατηρούνται και στην πυκνότητα πληθυσμών διάμεσων και κύριων νευρώνων ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για νευροδιαβιβαστές, για υποδοχείς νευροδιαβιβαστών, για τα υπεύθυνα για τη σύνθεση των νευροδιαβιβαστών ένζυμα, για νευροπεπτίδια και για πρωτεΐνες δέσμευσης του ασβεστίου. Το διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού εμφανίζει, σε σύγκριση με το κροταφικό, μεγαλύτερη πυκνότητα Α1 υποδοχέων αδενοσίνης (Lee και συν. 1983), μεγαλύτερη πυκνότητα υποδοχέων NMDA στο πεδίο CA1 και μικρότερη στην πύλη της οδοντωτής έλικας, μικρότερη πυκνότητα υποδοχέων AMPA στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων και στη διαυγή στιβάδα του πεδίου CΑ3 και στην πύλη της οδοντωτής έλικας (Martens και συν. 1998), μικρότερη πυκνότητα μονοαμινεργικών, χολινεργικών, GABAεργικών και γλουταμινεργικών απολήξεων (Gage και Thompson 1980 Verney και συν Hörtnagl και συν. 1991), μικρότερη πυκνότητα διάμεσων νευρώνων ανοσοδραστικών για καλρετινίνη, για σωματοστατίνη στο πεδίο CA1 του κυρίως ιππόκαμπου και στην οδοντωτή έλικα και για συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου στο πεδίο CA3 και την οδοντωτή έλικα (Nomura και συν. 1997α). Τέλος, οι Ashton και συν. (1989) αναφέρουν ότι η αναλογία νευρογλοία/νευρώνες αυξάνει από τον διαφραγματικό προς τον κροταφικό ιπποκάμπειο σχηματισμό. Επίσης, το σχέδιο της προσαγωγού και απαγωγού συνδεσμολογίας αλλάζει μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος (Andersen και συν Siegel και Tassoni 28

29 1971 Swanson και Cowan 1977 Witter 1986). Οι Petrovich και συν. (2001) διαίρεσαν τον ιπποκάμπειο σχηματισμό με βάση την προσαγωγό συνδεσμολογία σε 5 παράλληλες ζώνες. Η ζώνη 1 περιλαμβάνει το διαφραγματικό μισό του CA1 και οι ζώνες 2-5 το κροταφικό CA1/υπόθεμα. Ο κροταφικός ιπποκάμπειος σχηματισμός προβάλλει στον προμετωπιαίο φλοιό ενώ ο διαφραγματικός δεν προβάλλει (Goldman-Rakic και συν Jay και Witter 1991 Barbas και Blatt 1995 Verwer και συν. 1997). Οι προσαγωγοί συνδέσεις του ιπποκάμπειου σχηματισμού με υποφλοιικούς σχηματισμούς, όπως η αμυγδαλή, ο υποθάλαμος, ο επικλινής πυρήνας περιορίζονται στο κροταφικο τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού (Ottersen 1982 Amaral και Witter 1989 Canteras και Swanson 1992 Pitkänen και συν Petrovich και συν. 2001), ενώ προσαγόμενα αισθητικά ερεθίσματα (κυρίως οπτικο-χωρικά) από τον συνειρμικό, τον ενδορρινικό και τον περιρρινικό φλοιό καταλήγουν κυρίως στο διαφραγματικό τμήμα (Ruth και συν Witter και Groenewegen 1984 Amaral και Witter 1989). Αντιθέτως, άλλοι τύποι προσαγόμενων πληροφοριών, όπως για παράδειγμα οσφρητικών, φαίνεται πως κατανέμονται περισσότερο ομοιόμορφα κατά τον διαμήκη άξονα (Moser και Moser 1998α) και γι αυτό το λόγο η μνήμη που σχετίζεται με αυτές τις πληροφορίες εξαρτάται λιγότερο από τον διαφραγματικό ιπποκάμπειο σχηματισμό (Bunsey και Eichenbaum 1995, 1996). Ο διαφραγματικός και ο κροταφικός ιπποκάμπειος σχηματισμός διαφέρουν και ως προς τη φυσιολογία τους (Jung και συν Maruki και συν Papatheodoropoulos και Kostopoulos 2000α). Μελέτες δείχνουν πως το διαφραγματικό κυρίως τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού παίζει τον κύριο ρόλο στην χωροταξική αντίληψη, μάθηση και μνήμη (Morris και συν Bannerman και συν. 1999, 2004). Οι Moser και συν. (1993) διαπίστωσαν ότι εκτομή του διαφραγματικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, η οποία αφαιρεί 20 με 37% του συνολικού όγκου του, είχε ως αποτέλεσμα σημαντικότατη μείωση της ικανότητας εντόπισης από τον επίμυ της βυθισμένης εξέδρας στον υδάτινο λαβύρινθο του Morris. Αντιθέτως, εκτομή παρόμοιου όγκου ιστού, περιορισμένη στον 29

30 κροταφικό ιππόκαμπο, δεν προκαλούσε μείωση στην ικανότητα μάθησης, σε σχέση με τα ζώα μάρτυρες. Αρκετές μελέτες που ακολούθησαν επιβεβαίωσαν αυτή τη διαφοροποίηση μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού ιπποκάμπειου σχηματισμού (Jarrard 1989 Moser και συν Stubley-Weatherly και συν Moser και Moser 1998β Bannerman και συν Richmond και συν. 1999) και επέκτειναν τη διαφοροποίηση αυτή και στον λαβύρινθο Τ και σε άλλες δοκιμασίες μάθησης (Hock και Bunsey 1998 Bannerman και συν. 2002α, 2002β Kjelstrup 2002 McHugh 2004). Πρόσφατες μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν παραδείγματα εξαρτημένου φόβου, αποδίδουν συγκριτικά μεγαλύτερο ρόλο στο κροταφικό τμήμα στην εξαρτημένη εμβροντησία και στη συμπεριφορά που σχετίζεται με το άγχος (Phillips και LeDoux 1992, 1994 Kim και συν Maren και Fanselow 1997 Maren και συν Richmond και συν Bannerman και συν. 2004). Σύμφωνα με πρόσφατες απόψεις, ο κροταφικός ιπποκάμπειος σχηματισμός έλεγχει την εξαρτημένη εμβροντησία τροποποιώντας την δοπαμινεργική διαβίβαση στον προμετωπιαίο φλοιό, προς τον οποίο προβάλλει (Peleg και συν Pezze και συν. 2003). Φαίνεται ότι ο κροταφικός ιπποκάμπειος σχηματισμός χρησιμεύει ως ένα νευρωνικό κέντρο αναμετάδοσης, το οποίο λαμβάνει αισθητικές πληροφορίες, οι οποίες προερχόμενες από φλοιικούς σχηματισμούς, υφίστανται επεξεργασία στον διαφραγματικό ιππόκαμπο, προτού αποσταλούν σε βαθύτερους υποφλοιικούς σχηματισμούς (π.χ. αμυγδαλή, υποθάλαμος) που εμπλέκονται σε καταστάσεις φόβου και άγχους (Trivedi και Coover 2004). Είναι γνωστό ότι ο εγκέφαλος είναι πολύ ευαίσθητος στην υποξία και την ισχαιμία, καθώς έχει πολύ υψηλές μεταβολικές ανάγκες και πολύ μικρά αποθέματα οξυγόνου και γλυκόζης (Siesjö 1978). Σε ανθρώπους και ζώα, το πεδίο CA1 του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι μία από τις πλέον ευαίσθητες περιοχές του εγκεφάλου στην ισχαιμία (Spielmeyer 1925 Ιto και συν Pulsinelli και συν Smith και συν. 1984β Pulsinelli 1985), ενώ οι παρακείμενες περιοχές CA3 και οδοντωτή έλικα είναι σχετικά ανθεκτικές. Ευαίσθητα είναι κυρίως τα πυραμιδοειδή κύτταρα. Οι περισσότεροι διάμεσοι 30

31 νευρώνες επιβιώνουν, ακόμα και για μήνες, μετά το ισχαιμικό επεισόδιο (Schmidt-Kastner και Freund 1991). Ωστόσο, παρατηρείται σημαντική διαφοροποίηση της ευαισθησίας του ιπποκάμπειου σχηματισμού στην ισχαιμία και κατά τον διαμήκη άξονά του. Το διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι περισσότερο ευαίσθητο από το κροταφικό (Smith και συν. 1984α Akai και Yanagihara 1993). Οι Ashton και συν. (1989) αναφέρουν ότι μετά από θρομβωτική ισχαιμία παρατήρησαν βλάβη μόνο σε πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA1 και ενώ στο διαφραγματικό τμήμα αφορούσε στο 90% των νευρώνων, στο κροταφικό το ποσοστό ήταν μόνο 10%. Παρόμοια αλλαγή παρατήρησαν και στη συναπτική διαβίβαση μετά το ισχαιμικό επεισόδιο, η οποία μειώθηκε 70% στο διαφραγματικό τμήμα και μόνο 10% στο κροταφικό. Τα αίτια αυτής της διαφοροποίησης δεν είναι σαφώς διευκρινισμένα. Επίσης, οι Smith και συν. (1984α) ανέφεραν ότι, κατά την επαναιμάτωση μετά την ισχαιμία, η ροή του αίματος είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού από ό,τι στο διαφραγματικό. Η σταθερότητα της λειτουργίας του κυκλώματος των νευρώνων εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ διέγερσης και αναστολής. Η συνεχής και εκτεταμένη εκπόλωση των νευρωνικών κυκλωμάτων έχει ως αποτέλεσμα την επιληπτική κρίση (Mangan και Bertram 1997 Chen και συν. 1999). Η επιληψία είναι αποτέλεσμα μακράς διαρκείας πλαστικών αλλαγών στον εγκέφαλο, οι οποίες επηρεάζουν την έκφραση υποδοχέων και διαύλων ιόντων και συνεπάγονται ανάπτυξη και επαναδιάταξη συνάψεων, καθώς και ενεργό αστρογλοίωση (Heinemann και συν Rogawski και Loscher 2004). Στους περισσότερους ασθενείς με επιληψία, στις επιληπτικές κρίσεις συμμετέχει και ο ιπποκάμπειος σχηματισμός. Οι περιπτώσεις αυτές εμφανίζουν τη μεγαλύτερη δυσκολία στην ιατρική τους αντιμετώπιση. Έχει ακόμη διαπιστωθεί ότι ο ιπποκάμπειος σχηματισμός ενέχεται στην επιληψία του κροταφικού λοβού (Braak και Braak 1993 Avoli και συν Price και συν. 2005) και ότι οι επιληπτικές κρίσεις που προκαλούνται στο ένα σκέλος του ιπποκάμπειου σχηματισμού διαδίδονται και στο ετεροπλάγιο σκέλος και κατόπιν και σε 31

32 άλλες περιοχές του εγκεφάλου, όπως η αμυγδαλή (Goto και συν Feng και Durand 2005). Η μεγάλη τάση του ιπποκάμπειου σχηματισμού για επιληψία (Green 1964 Dichter και Spencer 1969 Engel 2001) και ειδικότερα του πεδίου CA3 (Hablitz και Johnston 1981) είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό, σε σύγκριση με το διαφραγματικό τμήμα στον άνθρωπο (Falconer 1974 Babb και συν Quigg και συν. 1997) και στα πειραματόζωα (Racine και συν Lothman και Collins 1981 Gilbert και συν Bragdon και συν Lee και συν Becker και συν Borck και Jefferys 1999 Derchansky και συν. 2004). Η μεγαλύτερη τάση του κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού για επιληψία ίσως να σχετίζεται με την ασθενέστερη συναπτική αναστολή στο κροταφικό τμήμα του πεδίου CA1, σε σύγκριση με το διαφραγματικό (Papatheodoropoulos και συν. 2002). Επίσης, έχει διαπιστωθεί ότι οι επιληπτικές εκφορτίσεις στον κροταφικό ιπποκάμπειο σχηματισμό εμφανίζουν μεγαλύτερη πιθανότητα εκδήλωσης, μεγαλύτερη ισχύ και μεγαλύτερη εμπλοκή των υποδοχέων NMDA (Papatheodoropoulos και συν., 2005). Αξίζει τέλος να αναφερθεί ότι, το διαφραγματικό τμήμα του πεδίου CA1 του ιπποκάμπειου σχηματισμού έχει μεγαλύτερη ικανότητα για επαγωγή μακρόχρονης ενδυνάμωσης (LTP) στις διεγερτικές συνάψεις υπό φυσιολογικές συνθήκες (Papatheodoropoulos και Kostopoulos 2000α Maruki και συν Colgin και συν. 2004), μικρότερη πιθανότητα απελευθέρωσης διαβιβαστή στις συνάψεις των παράπλευρων κλωνίων Schäffer με τα πυραμιδοειδή κύτταρα του πεδίου CA1 και μεγαλύτερη ικανότητα για βραχύχρονη συναπτική πλαστικότητα (Papatheodoropoulos και Kostopoulos 2000β). 1.6 Αστροκύτταρα Τα αστροκύτταρα είναι κύτταρα της νευρογλοίας. Χαρακτηρίζονται από το αστεροειδούς σχήματος κυτταρικό σώμα, τις ακτινωτά διατεταγμένες αποφυάδες τους, οι οποίες συνδέονται μέσω χασματοσυνδέσεων με άλλες αστροκυτταρικές αποφυάδες, 32

33 περιβάλλουν τις συνάψεις και τους κόμβους του Ranvier και καταλήγουν με αποπλατυσμένα άκρα, τους μυζητικούς ποδίσκους, γύρω από τα τριχοειδή αγγεία. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, οι προεκβολές των γειτονικών αστροκυττάρων αλληλοκαλύπτονται σε μικρό μόνο βαθμό, ενώ οι σχετικά ανεξάρτητες περιοχές στις οποίες κατανέμονται οι αποφυάδες κάθε αστροκυττάρου μπορεί να περικλείουν παραπάνω από ( ) συνάψεις (Bushong και συν Ogata και Kosaka 2002). Τα αστροκύτταρα διακρίνονται σε πλασμώδη και ινώδη. Τα πλασμώδη αστροκύτταρα, τα οποία εντοπίζονται σχεδόν αποκλειστικά στη φαιή ουσία, έχουν σχετικά μεγάλα κυτταρικά σώματα, μεγάλο αριθμό ευρέως διακλαδισμένων αποφυάδων και περιέχουν λιγότερα κυτταροπλασματικά ινίδια από τα ινώδη. Τα ινώδη αστροκύτταρα εντοπίζονται στη λευκή ουσία, έχουν μικρότερο κυτταρικό σώμα, αλλά μακρύτερες, παχύτερες και πιο αναπτυγμένες αποφυάδες, οι οποίες περιέχουν άφθονα κυτταροπλασματικά ινίδια (Duffy 1983 Shehab και συν Montgomery 1994). Ωστόσο, σε κάποιες περιοχές του ιπποκάμπειου σχηματισμού και του νωτιαίου μυελού, πολλά αστροκύτταρα της φαιής ουσίας είναι ινώδη (Taft και συν. 2005). Τα αστροκύτταρα παίζουν σημαντικό λειτουργικό ρόλο στο κεντρικό νευρικό σύστημα. Παρέχουν θρεπτικά συστατικά (Trendelenburg και Dirnagl 2005) και αυξητικούς παράγοντες στους νευρώνες, όπως ο αναστολέας της απόπτωσης των νευρώνων και η ερυθροποιητίνη (Ruscher και συν. 2002), είναι υπεύθυνα για την ομοιοστασία του νερού και των ιόντων Κ + και Η + (Leis και συν Dienel και Hertz 2005 Kimelberg 2005), απομακρύνουν το πλεονάζον εξωκυτταρικό γλουταμινικό οξύ (Anderson και Swanson 2000) και τοξίνες (Duffy 1983 Bignami και Dahl 1994 Eng και συν Barres 2003), δεσμεύουν και εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου, μέσω της γλουταθειόνης ή των μεταλλοθειονών (Dringen 2000 Dringen και συν Trendelenburg και συν. 2002), ενώ υπάρχουν ενδείξεις ότι ενέχονται και στους μηχανισμούς από τους οποίους εξαρτάται η συναπτική πλαστικότητα (Eng και συν. 2000). Επίσης, τα αστροκύτταρα είναι πιθανό να 33

34 παίζουν σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση των νευρικών πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων (stem cells). Τέλος, προάγουν την ανάπτυξη νέων αγγείων και παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της νευρογένεσης (Lim και Alvarez-Buylla 1999) και συναπτογένεσης (Verderio και συν. 1999) σε ασθενή ή τραυματισμένο ιστό του εγκεφάλου ή του νωτιαίου μυελού (Barres 2003 Song και συν. 2002). Ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση των αστροκυττάρων είναι θεμελιώδη σημεία στην φυσιολογική ανάπτυξη και λειτουργία του ΚΝΣ, αλλά μπορεί και να συμβάλλουν στην παθογένεση ποικίλων νευρολογικών παθήσεων (Bignami και συν Eng 1985 Eng και συν. 1992, 2000 Tower 1992 da Cunha και συν Eddleston και Mucke 1993 Montgomery 1994 Rutka και συν. 1997). Αντιδρώντας σε βλάβες, όπως τραυματισμούς, ισχαιμικές καταστάσεις, επιληψία, νευροεκφυλιστικές ασθένειες, ανάπτυξη όγκων, γενετικές ανωμαλίες ή χημικές επιδράσεις, τα πλασμώδη αστροκύτταρα πολλαπλασιάζονται σε μικρό βαθμό (υπερπλασία), αυξάνονται σε μέγεθος (υπερτροφία) και αναπτύσσουν πολλές αποφυάδες, μεγάλου πάχους και μήκους, ανοσοδραστικών στην όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας (glial fibrillary acidic protein, GFAP) (Latov και συν Duffy 1983 Eng και συν Bignami και Dahl 1994 Hill και συν. 1996). Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται αστροκυττάρωση ή «αστρογλοίωση» (astrogliosis) ή «ενεργός αστρογλοίωση» (reactive gliosis) (Norenberg 2005). Ένα χαρακτηριστικό αποτέλεσμα της αστρογλοίωσης είναι η αυξημένη έκφραση της GFAP. Η GFAP είναι το κύριο συστατικό των ενδιάμεσων ινιδίων του κυτταρικού σκελετού των ώριμων αστροκυττάρων του ΚΝΣ (Eng 1985 Brenner 1994 Eng και Ghirnikar 1994 Inagaki και συν Laping και συν McLendon και Bigner 1994 Eng και Lee 1995 Brenner και Messing 1996 Eng και συν. 2000). Ως μέλος της οικογένειας των κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, η GFAP θεωρείται σημαντική για την τροποποίηση της κινητικότητας και του σχήματος των αστροκυττάρων και τη σταθερότητα των αποφυάδων τους. Πρόσφατες μελέτες σε μεταλλαγμένα ζώα που τους είχε αφαιρεθεί το γονίδιο για την 34

35 σύνθεση της GFAP, έδειξαν ότι τα ζώα αυτά παρότι είναι φυσιολογικά ως προς την ανάπτυξη, την αναπαραγωγή και το μέσο όρο ζωής (Pekny και συν Gomi και συν. 1995), παρουσιάζουν αλλαγές στον όγκο των αστροκυττάρων (Ding και συν. 1998), στην μακρόχρονη ενδυνάμωση LTP (αύξηση) (McCall και συν. 1996) και στην μακρόχρονη καταστολή LTD (long term depression) (μείωση) (Shibuki και συν. 1996), επηρεάζονται σοβαρότερα από την αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (Liedtke και συν. 1998), και παρουσιάζουν μειωμένη μυελίνωση σε προχωρημένες ηλικίες (Liedtke και συν. 1996), μειωμένη ευαισθησία σε τραυματισμούς του νωτιαίου μυελού (Nawashiro και συν Wang και συν. 1997) και στην ισχαιμία (Tanaka και συν. 2002). Ανοσοδραστικότητα στην GFAP εμφανίζουν τα πλασμώδη και τα ινώδη αστροκύτταρα, η «ακτινωτή νευρογλοία» της παρεγκεφαλίδας (νευρογλοία Bergmann) και τα αστροκύτταρα που βρίσκονται κάτω από το επένδυμα των κοιλιών του εγκεφάλου. Τα GFAP-ανοσοδραστικά αστροκύτταρα κατανέμονται ανομοιόμορφα στο ΚΝΣ (Tugo και συν Kamo και συν Kálmán και Hajós 1989 Bignami και Dahl 1994 Martin και O Callaghan 1995). Το σχέδιο κατανομής των GFAP-ανοσοδραστικών αστροκυττάρων δεν εξελίσσεται μεταγεννητικά, αλλά είναι ήδη ολοκληρωμένο κατά την γέννηση και φαίνεται πως καθορίζεται κατά την διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης (Taft και συν. 2005). Στον ιπποκάμπειο σχηματισμό παρατηρείται έντονη ανοσοδραστικότητα για την GFAP. Τα GFAP-ανοσοδραστικά αστροκύτταρα διαφέρουν τόσο πολύ σε σχήμα και πυκνότητα πληθυσμού μεταξύ των διαφόρων στιβάδων των πεδίων του κυρίως ιππόκαμπου, ώστε είναι εύκολη η διάκριση των ορίων των στιβάδων σε ιστολογικές τομές. Σύμφωνα με τους Kálmán και Hajós (1989), στη σκάφη εντοπίζονται ογκώδη αστεροειδή κύτταρα πλησίον της επιφάνειας, ενώ τα αστροκύτταρα στην στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων έχουν σχήμα κηροπήγιου με μικρού μήκους προεκβολές, οι οποίες κατευθύνονται προς την επιφάνεια, χωρίς ωστόσο να φτάνουν ως εκεί. Η στιβάδα των πυραμιδοειδών 35

36 κυττάρων φαίνεται κενή αστροκυττάρων. Στην ακτινωτή και στην βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα παρατηρούνται αστροκύτταρα με λεπτές αποφυάδες, λίγο μεγαλύτερου μήκους από ό,τι στις υπόλοιπες στιβάδες του κυρίως ιππόκαμπου. Στην επιφάνεια του αμμώνειου κέρατος που συνορεύει με την οδοντωτή έλικα παρατηρούνται ογκώδη αστροκύτταρα με μικρού μήκους αποφυάδες, πολλές από τις οποίες πορεύονται παράλληλα με την επιφάνεια. Στην οδοντωτή έλικα, η μορφολογία των αστροκυττάρων των τριών στιβάδων διαφέρει τόσο πολύ, ώστε είναι ακόμη πιο σαφή τα μεταξύ τους όρια. Η μοριώδης στιβάδα τόσο του εγκλεισμένου, όσο και του ελεύθερου σκέλους αποτελείται από τρεις GFAP-ανοσοδραστικές ζώνες. Μία εξωτερική ζώνη, με αστροκύτταρα που έχουν το τυπικό σχήμα κηροπηγίου και κυτταρικά σώματα ακανόνιστα διατεταγμένα σε όλη την έκτασή της, μία μεσαία ζώνη με ένα στοίχο αραιά διατεταγμένων αστεροειδών αστροκυττάρων, και μία εσωτερική ζώνη με ένα στοίχο αστροκυττάρων σχήματος κηροπηγίου με κυτταρικά σώματα κανονικά διατεταγμένα στο όριο μεταξύ μοριώδους στιβάδας και στιβάδας των κοκκοειδών κυττάρων. Η στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων έχει ομοιόμορφα διατεταγμένα αστεροειδή αστροκύτταρα με μικρού μήκους αποφυάδες, η πυκνότητα των οποίων ελαττώνεται στην πύλη, όχι όμως σε τέτοιο βαθμό ώστε να μπορούμε να διακρίνουμε δύο ζώνες. Η πύλη έχει πολύ πυκνά διατεταγμένα αστεροειδή αστροκύτταρα. 1.7 nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Το μονοξείδιο του αζώτου (nitric oxide, NO) είναι μία ελεύθερη αέρια ρίζα. Καθώς είναι και υδατο- και λιπο-διαλυτό, διαχέεται ελεύθερα στους ιστούς. Για το λόγο αυτό δεν αποθηκεύεται, όπως οι παραδοσιακοί νευροδιαβιβαστές, αλλά απελευθερώνεται αμέσως μετά τη σύνθεσή του και διαχέεται στον εξωκυττάριο χώρο. Συντίθεται από το αμινοξύ L- αργινίνη, με μια οξειδωτική αντίδραση, η οποία καταλύεται από το ένζυμο συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (nitric oxide synthase, NOS), με τελικά προϊόντα κιτρουλίνη και 36

37 μονοξείδιο του αζώτου (Ignarro και συν Palmer και συν. 1987, 1988 Moncada και συν. 1989, 1991 Alderton και συν. 2001). Η συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου συναντάται σε 3 ισομορφές, τη νευρική (neuronal, nnos, Τύπου Ι), τη μορφή των μακροφάγων, ή επαγόμενη, ή ανοσολογική (inducible, inos, Τύπου ΙΙ) και την ενδοθηλιακή (endothelial, enos, Τύπου ΙΙΙ) (Förstermann και συν Wolf 1997). Τόσο η enos, όσο και nnos, είναι δομικά ένζυμα εξαρτώμενα από το σύμπλοκο Ca 2+ -καλμοδουλίνης, τα οποία παράγουν μικρές ποσότητες μονοξείδιου του αζώτου μετά από παροδικές αυξήσεις της συγκέντρωσης των ενδοκυτταρικών ιόντων ασβεστίου (Iadecola 1997 Gibson και συν. 2005). Το γεγονός αυτό καθιστά τις δύο αυτές ισομορφές υπεύθυνες για την παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου υπό φυσιολογικές συνθήκες και για τη δράση του ως μόριο-αγγελιοφόρος. Αντίθετα, η inos επάγεται μεταγραφικά σε διάφορους τύπους κυττάρων από ορισμένα ανοσολογικά ερεθίσματα (Nathan και Xie 1994) και λειτουργεί ανεξάρτητα από τις αυξήσεις του ενδοκυτταρικού ασβεστίου. Σε αντίθεση με τις άλλες δύο ισομορφές, η inos έχει διαρκώς προσκολλημένη καλμοδουλίνη, η οποία κρατά το ένζυμο σε μία τονικά ενεργή κατάσταση, προκαλώντας συνεχή παραγωγή μονοξείδιου του αζώτου σε μεγάλες ποσότητες. Το μονοξείδιο του αζώτου φαίνεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε αρκετές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες (Moncada και συν Lowenstein και συν. 1994). Δρα ως ένας ενδογενής ενεργοποιητής του ενζύμου γουανυλοκυκλάση (guanylate cyclase) και κατ αυτόν τον τρόπο, αυξάνει την κυκλική μονοφωσφορική γουανοσίνη (cyclic guanocine monoposphate, cgmp) (Moncada και συν. 1991). Η καταλυτική δραστηριότητα της nnos στα νευρικά κύτταρα διεγείρεται από την αύξηση του ενδοκυτταρικού ασβεστίου ως αποτέλεσμα δυναμικού ενέργειας. Η ένωση του ασβεστίου με την καλμοδουλίνη επιτρέπει στο σύμπλοκο ασβεστίου καλμοδουλίνης να ενωθεί στην nnos και να την ενεργοποιήσει. Στον εγκέφαλο, αυξημένη δραστηριότητα στις διεγερτικές οδούς είναι γνωστό 37

38 ότι προκαλεί αύξηση των επιπέδων της cgmp. Αυτό φαίνεται πως επιτυγχάνεται διότι ένας υποτύπος υποδοχέα του γλουταμινικού οξέος, του κύριου διεγερτικού νευροδιαβιβαστή, ο υποδοχέας NMDA (N-methyl-D-aspartate), ενεργοποιώντας την NOS με την οποία συνδέεται αυξάνει τη σύνθεση μονοξείδιου του αζώτου, με αποτέλεσμα αύξηση της cgmp (Garthwaite 1991 Vincent και Hope 1992). H nnos είναι συνδεδεμένη στους υποδοχείς NMDA, μέσω της πρωτείνης PSD 95 της μετασυναπτικής πύκνωσης. Κατ αυτόν τον τρόπο, το ένζυμο εκτίθεται άμεσα στα ιόντα ασβεστίου που εισέρχονται στο κύτταρο μέσω του «ανοιχτού» διαύλου των ενεργοποιημένων NMDA υποδοχέων. Ιόντα ασβεστίου που εισέρχονται στο κύτταρο μέσω άλλων οδών είναι μάλλον σε μεγάλη αραίωση όταν πλέον φτάσουν κοντά στην nnos και δεν μπορούν να την ενεργοποιήσουν. Επομένως, η nnos υπό φυσιολογικές συνθήκες ενεργοποιείται μόνο από τους NMDA υποδοχείς και η παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου αντικατοπτρίζει την νευροδιαβιβαστική δραστηριότητα του γλουταμινικού οξέος (Kiss και Vizi 2001). Υπερβολική διέγερση των υποδοχέων ΝMDA συμβάλει σε αρκετές νευροεκφυλιστικές καταστάσεις, συμπεριλαμβανομένων αυτών που προκαλούν η εγκεφαλική ισχαιμία, τραυματισμοί και η χρόνια επιληψία και υπάρχουν ενδείξεις ότι το μονοξείδιο του αζώτου εμπλέκεται σε αυτές τις καταστάσεις (Garthwaite 1991 Vincent και Hope 1992). Το μονοξείδιο του αζώτου φαίνεται ωστόσο ότι έχει και μία αντίθετη δράση, αναστέλλοντας τους υποδοχείς NMDA, συνδεόμενο σε μία θέση οξειδοαναγωγικής ρύθμισης των τελευταίων. Αυτός πιθανώς είναι ένας από τους λόγους που εξηγούν την αντιφατικότητα των αποτελεσμάτων από τη χορήγηση αναστολέων της NOS στην ισχαιμία και στις επιληπτικές κρίσεις, αφού αυτά εξαρτώνται από τη δόση, τον χρόνο χορήγησης και την κατάσταση των υποδοχέων NMDA (Rundfeldt και συν. 1995). Το μονοξείδιο του αζώτου φαίνεται ότι λειτουργεί ως ένας διακυτταρικός αγγελιοφόρος, ο οποίος επιτρέπει την επικοινωνία μεταξύ νευρώνων, νευρογλοίας και αγγειακού συστήματος (Garthwaite 1991 Vincent 1993). 38

39 To μονοξείδιο του αζώτου που παράγεται από την nnos, είναι πιθανό να εμπλέκεται και σε μία μη συναπτική διαβίβαση μεταξύ νευρικών κυττάρων, η οποία μάλιστα δεν απαιτεί την παρουσία ειδικών υποδοχέων. Το μονοξείδιο του αζώτου διαχέεται γύρω από τις συνάψεις αναστέλλοντας την δράση των μεταφορέων μονοαμινών, γεγονός που συνεπάγεται την αύξηση τοπικά της εξωκυτταρικής συγκέντρωσης των μονοαμινών και καθώς οι μονοαμίνες, δρώντας προσυναπτικά, αναστέλλουν την απελευθέρωση γλουταμινικού, το μονοξείδιο του αζώτου δρα τελικά ως ανάδρομος αναστολέας της απελευθέρωσης γλουταμινικού (Kiss και Vizi 2001). Επίσης, το μονοξείδιο του αζώτου σχετίζεται με τις διαδικασίες μάθησης και μνήμης (Schumann και Madison 1991 Zou και συν Pitsikas και συν. 2002). Αναστολή της παραγωγής μονοξείδιου του αζώτου από τον ειδικό αναστολέα της nnos, 7-nitroindazole, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητας για μάθηση (Meyer 1998) και του σχηματισμού μνήμης στους επίμυες (Borowicz και συν Vanaja και Ekambaram 2004). Το μονοξείδιο του αζώτου συμμετέχει σε αρκετούς τύπους συναπτικής πλαστικότητας, μεταξύ των οποίων στη μακρόχρονη καταστολή (LTD) στην παρεγκεφαλίδα και το νεοραβδωτό σώμα και στη μακρόχρονη ενδυνάμωση (LTP) στον ιπποκάμπειο σχηματισμό και τον φλοιό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων (Garthwaite και Boulton 1995 Arancio και συν Daniel και συν Hawkins και συν Centonze και συν Kiss και Vizi 2001). Στην περίπτωση της μακρόχρονης καταστολής στις διεγερτικές συνάψεις, το μονοξείδιο του αζώτου φαίνεται πως συντίθεται προσυναπτικά ή από διάμεσους νευρώνες, ενώ στην μακρόχρονη ενδυνάμωση θεωρείται ότι λειτουργεί ως ανάδρομος αγγελιοφόρος, ο οποίος συντίθεται μετασυναπτικά και δρα προσυναπτικά (Bon και Garthwaite 2003). Ωστόσο, έχουν αναφερθεί και μετασυναπτικές δράσεις του μονοξείδιου του αζώτου στον ιππόκαμπο, οι οποίες σχετίζονται με την επαγωγή μακρόχρονης ενδυνάμωσης στον μετασυναπτικό νευρώνα (Ko και Kelly 1999 Lu και συν Bon και Garthwaite 2003). 39

40 To μονοξείδιο του αζώτου το οποίο παράγεται από το ενδοθήλιο των αγγείων του εγκεφάλου, τις περιαγγειακές νευρικές ίνες και τον περιβάλλοντα νευρικό ιστό, είναι ζωτικής σημασίας για τη ρύθμιση της ροής του αίματος στον εγκέφαλο. Το μονοξείδιο του αζώτου δρα μέσω της ενεργοποίησης της γουανυλοκυκλάσης στα λεία μυϊκά κύτταρα, ως παράγοντας χαλάρωσης (Toda και συν. 1993), και, αλλάζοντας το φορτίο της επιφάνειας του ενδοθηλίου, επηρεάζει την ροή και τη συγκόλληση των κυκλοφορούντων λευκοκυττάρων (Kubes και συν. 1994). Η δράση του μονοξείδιου του αζώτου στη ρύθμιση της εγκεφαλικής κυκλοφορίας είναι σημαντική, τόσο κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, όσο και κατά την υπερκαπνία και την εστιακή διέγερση των νευρώνων (Iadecola 1992 Northington και συν Akgoren και συν Gotoh και συν. 2001). Ο ρόλος του μονοξειδίου του αζώτου στους μηχανισμούς της ισχαιμικής βλάβης του εγκεφάλου αποτελεί αντικείμενο συζήτησης. Το πρόβλημα αυτό οφείλεται στα πολύπλοκα βιολογικά χαρακτηριστικά του μονοξειδίου του αζώτου, τα οποία συνηγορούν τόσο υπέρ της ευεργετικής, όσο και της επιζήμιας δράσης του στον προσβεβλημένο εγκέφαλο (Beckman και συν Manzoni και συν Lipton και συν Iadecola 1993 Wink και συν. 1993, 1997 Choi 1994 Zhang και Iadecola 1994 Fagni και συν Kubes 1995 Gibson και συν Willmot και συν. 2005). Το μονοξείδιο του αζώτου φαίνεται ότι συμμετέχει και στη γένεση των επιληπτικών κρίσεων. Από ορισμένες μελέτες αποκαλύφθηκε ότι υπάρχει στενή σχέση μεταξύ του μονοξείδιου του αζώτου και των προκαλούμενων από τη χορήγηση καϊνικού οξέος επιληπτικών κρίσεων στα τρωκτικά (Garthwaite και συν de Sarro και συν de Sarro και συν Kato και συν. 2005). Έχει διαπιστωθεί ότι και οι τρεις ισομορφές συνθετάσης μονοξειδίου του αζώτου εντοπίζονται στον εγκέφαλο (Paakkari και Lindsberg 1995). Στον ιπποκάμπειο σχηματισμό, η enos εντοπίζεται, εκτός από το ενδοθήλιο των αγγείων, σε πυραμιδοειδή κύτταρα (Dinerman και συν. 1994), ενώ η nnos σύμφωνα με κάποιους ερευνητές εντοπίζεται 40

41 αποκλειστικά σε διάμεσους νευρώνες (Hope και συν Vincent και Kimura 1992 Valtshanoff και συν , Dun και συν Jinno και συν. 1999) ή κατά άλλους σε διάμεσους και κύριους νευρώνες (Chiang και συν Wendland και συν Vaid και συν Iwase και συν. 1998). Aρκετές εργασίες ασχολήθηκαν με τον εντοπισμό της NOS γενικότερα ή της nnos ειδικότερα σε νευρώνες που εκφράζουν κάποιον άλλο γνωστό νευροδιαβιβασή ή νεροτροποποιητή, όπως GABA και σωματοστατίνη, ή κάποια πρωτεΐνη σύνδεσης ασβεστίου, όπως καλρετινίνη, παρβαλβουμίνη και καλβιδίνη (Valtshanoff και συν Megías και συν Nomura και συν. 1997α, 1997β Jinno και Kosaka 2002, 2004). Αξίζει να αναφερθεί ότι υπάρχουν ενδείξεις, από in vivo και in vitro μελέτες, ότι και οι 3 ισομορφές NOS μπορούν να εκφραστούν στα αστροκύτταρα (Murphy και Pearce 2004). Στον επίμυ, στην οδοντωτή έλικα η μεγαλύτερη πυκνότητα nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων παρατηρείται στην πύλη, ενώ σημαντικός αριθμός παρατηρείται και στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων (Valtschanoff και συν Freund και Buzsáki 1996). Οι nnosανοσοδραστικοί νευρώνες της πύλης έχουν κατά κανόνα μεγάλα κυτταρικά σώματα και οι δενδριτικοί τους θύσανοι εκφύονται είτε από τους δύο πόλους (δίπολα κύτταρα), είτε από περισσότερα σημεία (πολύπολα κύτταρα). Οι δενδριτικοί τους κλάδοι φέρουν μέτριο αριθμό ακάνθων και σπανίως εισέρχονται στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων. Μεγάλοι νευρώνες της πύλης, που εντοπίζονται κοντά στο όριο της με τη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων, έχουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των καλαθοειδών κυττάρων. Οι κορυφαίοι δενδρίτες τους διασχίζουν τη μοριώδη στιβάδα, ενώ οι βασικοί δενδρίτες τους παραμένουν εντός της πύλης. Οι nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες της στιβάδας των κοκκοειδών κυττάρων έχουν μικρότερα κυτταρικά σώματα ατρακτοειδούς ή πυραμιδοειδούς σχήματος, τα οποία είναι συγκεντρωμένα πλησίον του ορίου της με την πύλη. Οι κορυφαίοι δενδρίτες τους διακλαδίζονται ακτινοειδώς σχηματίζοντας ένα θύσανο και φτάνουν ως τα εξωτερικά όρια της μοριώδους στιβάδας. Οι βασικοί δενδρίτες επίσης αναδύονται από το κυτταρικό σώμα και πορεύονται εντός της πύλης πλησίον της στιβάδας των κοκκοειδών κυττάρων, 41

42 δίνοντας μικρό αριθμό κλάδων. Πολύπολα ή ακτινωτά προσανατολισμένα δίπολα κύτταρα παρατηρούνται και στη μοριώδη στιβάδα. Οι δενδρίτες των πολύπολων και των δίπολων κυττάρων στερούνται ακάνθων. Αξιοσημείωτο είναι ότι παχείς νευράξονες προερχόμενοι από nnos-ανοσοδραστικούς νευρώνες του πεδίου CA1 συχνά διασχίζουν την ιπποκάμπεια σχισμή και καταλήγουν στην πύλη της οδοντωτής έλικας (Sik και συν. 1994). Μεγάλος αριθμός ανοσοδραστικών για την nnos διάμεσων νευρώνων εντοπίζονται και στα πεδία CA1 και CA3 του κυρίως ιππόκαμπου, εμφανίζουν όμως ανομοιομορφία στην κατανομή, στα δενδριτικά πλέγματα και στην ένταση σήμανσής τους (Freund και Buzsáki 1996). Βρίσκονται σε μεγαλύτερη πυκνότητα στην ακτινωτή στιβάδα και στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων. Μέτριοι αριθμοί κυτταρικών σωμάτων παρατηρούνται στη στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων και λίγα μόνο κύτταρα στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Τα δενδριτικά πλέγματα των ασθενώς σημασμένων νευρώνων προσανατολίζονται προς την περιφέρεια και εκφύονται από τους δύο πόλους σχετικά μικρών (διάμετρος pm) ατρακτοειδών ή σφαιρικών κυτταρικών σωμάτων. Παρατηρείται μία συγκέντρωση κυττάρων τέτοιου τύπου στην ακτινωτή στιβάδα του πεδίου CA3, στη στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων στο όριο των πεδίων CA3 και CA2 και στην ακτινωτή στιβάδα του πεδίου CA1 κοντά στο όριό του με το υπόθεμα. NOS-ανοσοδραστικοί νευρώνες με μεγάλα κυτταρικά σώματα (διάμετρος pm) και έντονη σήμανση ολόκληρου του δενδριτικού πλέγματος εντοπίζονται κυρίως στην ακτινωτή στιβάδα κοντά στο όριό της με τη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Οι νευρώνες αυτοί συνήθως βρίσκονται πλησίον του υποθέματος. Μία ακόμη συνήθης θέση εντόπισής τους είναι η στιβάδα των πολύμορφων νευρώνων, όπου εμφανίζουν δενδρίτες που κατευθύνονται οριζόντια. Ορισμένοι κλάδοι τους συχνά διασχίζουν τη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων και εισέρχονται στην ακτινωτή στιβάδα. Από τους νευρώνες της ακτινωτής στιβάδας αναδύεται ένας κορυφαίος δενδριτικός θύσανος με μακρείς οριζόντιους κλάδους, οι οποίοι εισέρχονται στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Μόνο ένας ή δύο δενδρίτες πρώτης τάξης κατευθύνονται προς τη σκάφη. Έντονα 42

43 σημασμένοι μεγάλοι νευρώνες παρατηρούνται και στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων, με ένα δενδριτικό θύσανο σε κάθε πόλο, χαρακτηριστικό των διάμεσων νευρώνων. Πυκνά πλέγματα νευραξονικών κλάδων παρατηρούνται στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα και σε μικρότερο βαθμό στην ακτινωτή στιβάδα. Εκτός από το αρχικό τμήμα των νευραξόνων που συνήθως κατευθύνεται ακτινωτά, όλοι οι κλάδοι τους κατευθύνονται κατά κύριο λόγο οριζόντια, είναι δε έντονα κιρσοειδείς. Κιρσοειδείς ίνες παρατηρούνται και στις άλλες στιβάδες, με μικρή συχνότητα όμως. Η πορεία των νευραξόνων μπορεί να παρατηρηθεί, μόνο αν αυτοί προέρχονται από τους έντονα σημασμένους μεγάλους νευρώνες. Οι νευράξονες των νευρώνων της στιβάδας των πολύμορφων κυττάρων έχουν κλάδους που κατευθύνονται προς τη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Το αρχικό τμήμα των νευράξονων ορισμένων από τους νευρώνες αυτούς έχει αρχικά κατεύθυνση προς τη σκάφη, αλλά μετά από σύντομη πορεία στρέφεται και αναλύεται σε παράλληλους μεταξύ τους κλάδους που απολήγουν στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα. Όπως αναφέρθηκε, μικρός αριθμός των κλάδων αυτών διασχίζει την ιπποκάμπεια σχισμή και απολήγει στην πύλη της οδοντωτής έλικας. 43

44 44

45 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Προέλευση του πειραματικού υλικού Για τις ανάγκες της έρευνας θυσιάστηκαν δέκα εννέα νεαροί ενήλικοι (ηλικίας ημερών) αρσενικοί αλφικοί επίμυες της φυλής Wistar. Τα πειραματόζωα προήλθαν από την εκτροφή του Εργαστηρίου Ανατομικής, Ιστολογίας και Εμβρυολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ.. Σε όλους τους χειρισμούς πάρθηκε κάθε αναγκαίο μέτρο για την καλή μεταχείριση των πειραματοζώων και για την ελαχιστοποίηση του πόνου, σύμφωνα με την οδηγία του Συμβουλίου Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων της 24ης Νοεμβρίου 1986, 86/609/EEC, για την προστασία και τη χρήση πειραματοζώων. 2.2 Μονιμοποίηση του πειραματικού υλικού Για τη χρώση των αγγείων του ιπποκάμπειου σχηματισμού εφαρμόσθηκε, με κάποιες τροποποιήσεις, το πρωτόκολλο των Yu και συν. (1994). Χρησιμοποιήθηκαν εννέα πειραματόζωα. Κάτω από γενική αναισθησία με αιθέρα, τα ζώα τοποθετήθηκαν ύπτια στο χειρουργικό τραπέζι και διανοίχθηκε η θωρακική τους κοιλότητα. Διαμέσου της αριστερής κοιλίας της καρδιάς τοποθετήθηκε καθετήρας (Νο 19) στην πρόσθια αορτή και με τη βοήθεια καταθλιπτικής αντλίας εγχύσεων, χορηγήθηκαν στα ζώα διαδοχικά: α. 10 ml διαλύματος 0,4% νιτρώδους νατρίου σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,1Μ φωσφορικού νατρίου με 0,9% χλωριούχο νάτριο και ph 7,4 (saline phosphate buffer, PBS), για την έκπλυση των αγγείων από το αίμα. β. 75 ml διαλύματος σινικής μελάνης, μαύρου χρώματος, 67% σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,1Μ φωσφορικού νατρίου και ph 7,4 (phosphate buffer, PB), για τη χρώση των αγγείων και γ. 300 ml διαλύματος 10% φορμαλδεΰδης σε 0,1Μ PB και ph 7,4, για τη 45

46 μονιμοποίηση των ιστών. Καθ όλη τη διάρκεια της χορήγησης των διαλυμάτων, η οπίσθια αορτή του πειραματοζώου διατηρήθηκε κλειστή με τη χρήση αιμοστατικής λαβίδας. Αμέσως μετά την μονιμοποίηση in situ, οι εγκέφαλοι αφαιρέθηκαν και παρέμειναν στο ίδιο μονιμοποιητικό για 24 ώρες στους 4 ο C. Για τη λήψη ιστολογικών τομών για την ανοσοκυτταροχημική σήμανση των αστροκυττάρων και των nnos-νευρώνων και τη μελέτη των νευρικών συνάψεων χρησιμοποιήθηκαν δέκα πειραματόζωα. Ακολουθώντας την προαναφερθείσα προετοιμασία, χορηγήθηκαν στα ζώα διαμέσου της πρόσθιας αορτής α. φυσιολογικός ορός 0,9 % NaCl, 10-20ml για 30 δευτερόλεπτα, για την έκπλυση των αγγείων από το αίμα και β. 300 ml διαλύματος 4% παραφορμαλδεΰδης και 0,2% γλουταραλδεΰδης σε 0,1 Μ ΡΒ και ph 7,4, για τη μονιμοποίηση των ιστών. Οι εγκέφαλοι μετά την αφαίρεσή τους παρέμειναν σε διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης σε 0,1 Μ ΡΒ, ph 7,4, για 1 ώρα στους 4 ο C. 2.3 Χειρισμός των ιστοτεμαχίων Μετά την μονιμοποίηση, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός αφαιρέθηκε από τον υπόλοιπο εγκέφαλο και πλύθηκε 2-3 φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα 0,05Μ TRIS με 0,9% χλωριούχο νάτριο και ph 7,4 (saline TRIS buffer, ΤBS). Στη συνέχεια, διαχωρίσθηκε το κροταφικό από το διαφραγματικό τμήμα του, όπως προτείνουν οι Nomura και συν. (1997α) (εικ. 2.1). 46

47 Εικόνα 2.1. Σχεδιάγραμμα πλάγιας όψης του ιπποκάμπειου σχηματισμού, στο οποίο διακρίνονται το σημείο διαχωρισμού του διαφραγματικού από το κροταφικό τμήμα και η νοητή καμπύλη που ακολουθεί τον διαμήκη άξονά του, από την κορυφή του διαφραγματικού άκρου στην κορυφή του κροταφικού άκρου. Τα δύο τμήματα του ιπποκάμπειου σχηματισμού κόπηκαν στη συνέχεια με τη βοήθεια μικροτόμου δόνησης (Campden Instruments) σε τομές εγκάρσιες στον διαμήκη άξονά του (εικ. 2.1). Αυτό έγινε για να υπάρχει σε κάθε τομή η χαρακτηριστική διάταξη των πεδίων του κυρίως ιππόκαμπου, της οδοντωτής έλικας και των στιβάδων τους (εικ. 1.3) και να διευκολύνεται η σαφής διάκριση μεταξύ τους (Gaarskjaer 1978 Amaral και Witter 1989). Από τα χρωσμένα με σινική μελάνη ιστοτεμάχια συλλέχθηκαν τομές πάχους 100 μm, που τοποθετήθηκαν εναλλάξ σε δύο σειρές αντικειμενοφόρων πλακών. Η πρώτη σειρά χωρίς άλλη επεξεργασία και η δεύτερη σειρά, αφού υπέστη χρώση με τη μέθοδο Nissl, αφυδατώθηκαν εγκλείστηκαν σε Entelan και καλύφθηκαν. Η χρώση Nissl εφαρμόσθηκε για να είναι ευδιάκριτα τα όρια των περιοχών του ιπποκάμπειου σχηματισμού, και των επιμέρους στιβάδων τους. 47

48 Για την ανοσοκυτταροχημική σήμανση των αστροκυττάρων και των nnos-νευρώνων εφαρμόσθηκε η μέθοδος του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης (μέθοδος ABC, Hsu και συν. 1981). Ακολουθώντας τη διαδικασία που προαναφέρθηκε, τα ιστοτεμάχια που προορίζονταν για ανοσοκυτταροχημική σήμανση και παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο κόπηκαν σε τομές πάχους 50 μm. Οι τομές συλλέχθηκαν διαδοχικά σε τρεις ομάδες Α, Β, Γ, χωριστά οι προερχόμενες από το κροταφικό και οι προερχόμενες από το διαφραγματικό τμήμα. Ακολούθως, οι τομές πλύθηκαν 4 φορές για 10 λεπτά σε 0,05 Μ TBS και για αυτές των ομάδων Β και Γ ακολουθούσε ανοσοκυτταροχημική αντίδραση. Οι τομές μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια Eppendorf χωρητικότητας 1,5 ml, τα οποία περιείχαν 4% φυσιολογικό ορό αίγας σε TBS. Τα φιαλίδια παρέμειναν υπό συνεχή ανάδευση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια οι τομές μεταφέρθηκαν σε νέα φιαλίδια, τα οποία περιείχαν το πρώτο αντίσωμα (πιν. 2.1), και 0,2% Triton X-100 (ΤΧ) σε TBS. Τα αντισώματα ήταν της εταιρείας SIGMA. Πίνακας 2.1 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΡΑΙΩΣΕΙΣ ΑΥΤΩΝ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΟΣΟΚΥΤΤΑΡΟΧΗΜΙΚΗ ΣΗΜΑΝΣΗ ΤΩΝ ΤΟΜΩΝ ΤΩΝ ΟΜΑΔΩΝ Β ΚΑΙ Γ. Ομάδα Αντίσωμα Αραίωση Β nnos 1: : 3000 Γ GFAP 1:200 1: 400 Οι τομές παρέμειναν υπό συνεχή ανάδευση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Κατόπιν, τοποθετήθηκαν για 48 ώρες στους 4 ο C. Στη συνέχεια, παρέμειναν υπό συνεχή ανάδευση για άλλα 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθησαν 4 δεκάλεπτες εκπλύσεις σε TBS, τοποθέτηση των τομών σε νέα φιαλίδια, τα οποία περιείχαν δεύτερο αντίσωμα κατά του πρώτου αντισώματος (αντί-αντίσωμα), σε αραίωση 1:200 σε TBS και συνεχής ανάδευση για 2 ώρες. Μετά από 4 δεκάλεπτες εκπλύσεις των τομών σε TBS, τοποθετήθηκαν σε νέα φιαλίδια με 1% συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης 48

49 (Vectastain ΑΒC kit, Vector Laboratories) σε TBS, όπου παρέμειναν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Για την ανίχνευση της δεσμευμένης βιοτίνης, οι τομές μετά από 4 δεκάλεπτες εκπλύσεις σε TBS, τοποθετήθηκαν, προστατευμένες από το φως, σε διάλυμα 0,05% 3,3 -διαμινοβενζιδίνης (DAB, Sigma Deishagen, Germany) σε 0,1Μ ΤΒ για 5 λεπτά. Ακολούθως, προστέθηκε στο διάλυμα 0,01% υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). Μετά από παραμονή 5-10 λεπτών των τομών στο διάλυμα και 2 δεκάλεπτες εκπλύσεις τους σε TBS, οι μισές από αυτές τοποθετήθηκαν σε αντικειμενοφόρες πλάκες, εγκλείσθηκαν σε DPX (BDH) και καλύφθηκαν με καλυπτρίδες. Οι υπόλοιπες τομές καθώς και οι τομές της ομάδας Α που προορίζονταν για παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, μεταφέρθηκαν σε γυάλινα φιαλίδια, πλύθηκαν σε διάλυμα 0,1Μ ΡΒ και ph=7,4 και εμβαπτίσθηκαν για 30 λεπτά σε διάλυμα 1% τετροξειδίου του οσμίου σε 0,1Μ ΡΒ, στους 4 ο C. Ακολούθως, οι τομές πλύθηκαν 2 φορές για 5 λεπτά σε διάλυμα 0,1Μ οξικού νατρίου και μεταφέρθηκαν, για ενίσχυση της οπτικής αντίθεσης (contrast), σε υδατικό διάλυμα 1% οξικού ουρανυλίου για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προστατευμένες από το φως. Μετά από 2 πεντάλεπτες εκπλύσεις σε διάλυμα οξικού νατρίου, οι τομές αφυδατώθηκαν σταδιακά σε σειρά διαλυμάτων αιθυλικής αλκοόλης, μεταφέρθηκαν σε οξείδιο του προπυλενίου για 5 λεπτά και τέλος εμποτίστηκαν για 24 ώρες με διάλυμα μίγματος εποξειδικής ρητίνης Araldite (CY 212, AGAR) 1:1 με οξείδιο του προπυλενίου (Glauert και συν. 1956, 1991 Luft 1961 ). Την επομένη, οι τομές μεταφέρθηκαν σε πρόσφατα παρασκευασμένο μίγμα εποξειδικής ρητίνης Araldite, όπου παρέμειναν για 3 ώρες. Το στάδιο αυτό επαναλήφθηκε μία ακόμα φορά και τελικά οι τομές εγκλείσθηκαν σε Araldite μεταξύ δύο λεπτών φύλλων πλαστικού, κατάλληλα τοποθετημένων πάνω σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες (Holländer 1970). Η ρητίνη πολυμερίστηκε για 48 ώρες στους 60 ο C. Μετά τον πολυμερισμό, οι τομές εξετάσθηκαν και φωτογραφήθηκαν στο οπτικό μικροσκόπιο και επιλεγμένες περιοχές κόπηκαν και επικολλήθηκαν στην κορυφή κυλίνδρων πολυμερισμένης ρητίνης. Από τα επιλεγμένα αυτά 49

50 τεμαχίδια ιστού λήφθηκαν με υπερμικροτόμο (Reichert OM2) ημίλεπτες τομές πάχους 1 μm και λεπτές τομές πάχους nm, οι οποίες τοποθετήθηκαν σε χάλκινα πλέγματα (AGAR Scientific, Copper G203, old 300), καλλυμένα με Formvar. Οι ημίλεπτες τομές χρησιμοποιήθηκαν, στην περίπτωση των ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για nnos τομών, ως «οδηγοί» για τις λεπτές τομές και στην περίπτωση των σημασμένων με GFAP τομών, για τη μέτρηση της πυκνότητας των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων στην επιφάνεια του επιλεγμένου πεδίου. Οι λεπτές τομές, μετά από χρώση τους με οξικό ουρανύλιο 3% σε απεσταγμένο νερό και κιτρικό μόλυβδο (Reynolds 1963 Westrum 1965), εξετάσθηκαν και φωτογραφήθηκαν στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (Zeiss EM 9S). Ως μάρτυρες, τόσο για το επίπεδο του οπτικού, όσο και του ηλεκτρονικού μικροσκοποίου, χρησιμοποιήθηκαν τομές στις οποίες παραλήφθηκε το στάδιο της προσθήκης αντισώματος. Σε καμία περίπτωση δεν παρατηρήθηκε ανοσοσήμανση στις τομές μάρτυρες. 2.4 Ποσοτική ανάλυση Αιμοφόρα αγγεία σημασμένα με σινική μελάνη Η καταμέτρηση της επιφάνειας που κάλυπταν τα χρωματισμένα με σινική μελάνη αγγεία έγινε με τη βοήθεια συστήματος ανάλυσης εικόνας (Image pro Plus, Media Cybernetics) σε ηλεκτρονικό υπολογιστή. Πιο συγκεκριμένα, η εικόνα από ένα οπτικό μικροσκόπιο Zeiss Axioplan μεταφερόταν, με τη βοήθεια ψηφιακού εικονοσκοπίου (digital camera), στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Το λογισμικό ανάλυσης εικόνας στη συνέχεια επεσήμανε τα χρωματισμένα αγγεία στο πεδίο, τα όρια του οποίου όριζε ο παρατηρητής, και καταμετρούσε: α. Τη διάμετρο των τμημάτων των αγγείων σε μm, β. Την επιφάνεια που κατελάμβαναν σε μm 2 και γ. Το κλάσμα της επιφάνειας αυτής προς τη συνολική επιφάνεια του επιλεγμένου πεδίου (πυκνότητα). 50

51 Με βάση τη διάμετρό τους και ακολουθώντας τις αρχές κατηγοριοποίησης που έχουν προταθεί στο παρελθόν (Bär και Wolff 1972 Hunziker και συν Mato και Ookawara 1979 Conradi και συν. 1980), ως τριχοειδή χαρακτηρίστηκαν τα αγγεία των οποίων η διάμετρος ήταν μικρότερη από 8 μm. Τα αγγεία των οποίων η διάμετρος ήταν ίση με ή μεγαλύτερη από 8 μm και μικρότερη από 20 μm χαρακτηρίστηκαν ως μεσαίου μεγέθους αγγεία, ενώ τα αγγεία, των οποίων η διάμετρος ήταν ίση με ή μεγαλύτερη από 20 μm χαρακτηρίστηκαν ως μεγάλου μεγέθους αγγεία. Τα στοιχεία συλλέχθηκαν σε πίνακες του προγράμματος Excell (Microsoft Office 2000). Από κάθε ζώο μετρήθηκαν 40 τομές, 10 από τον αριστερό κροταφικό τμήμα, 10 από τον αριστερό διαφραγματικό τμήμα, 10 από τον δεξιό κροταφικό τμήμα και 10 από τον δεξιό διαφραγματικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Μετρήθηκαν μόνο τομές άρτιες και ομοιόμορφα χρωματισμένες. Για τις μετρήσεις χρησιμοποιήθηκε στο οπτικό μικροσκόπιο ο αντικειμενικός φακός 10x GFAP-ανοσοδραστικά κύτταρα Για την ποσοτική εκτίμηση της πυκνότητας των αστροκυττάρων καταμετρούνταν η επιφάνεια που καταλάμβαναν τα κυτταρικά στοιχεία των GFAP-ανοσοδραστικών κυττάρων (κυτταρικά σώματα και αποφυάδες των αστροκυττάρων), σε ολόκληρη την έκταση της εγκάρσιας τομής του ιπποκάμπειου σχηματισμού και το αποτέλεσμα εκφράζονταν ως κλάσμα της συνολικής επιφάνειας του ιστού. Οι μετρήσεις γίνονταν με τον ίδιο ακριβώς τρόπο που μετρήθηκε η επιφάνεια των σημασμένων με σινική μελάνη αγγείων, με τη βοήθεια του συστήματος ανάλυσης εικόνας. Στην περίπτωση αυτή, ωστόσο, χρησιμοποιήθηκαν ημίλεπτες τομές της ομάδας Γ, πάχους 1 μm, και αντικειμενικός φακός 20x. Η επιλογή αυτή έγινε διότι το πάχος των αρχικών τομών (50 μm) δεν επέτρεπε τη φωτογράφιση όλων των χρωσμένων κυτταρικών στοιχείων σε ένα επίπεδο εστίασης. Αυτό διακρίνεται στις εικόνες α και β, οι οποίες απεικονίζουν δύο μικροφωτογραφίες 51

52 του ίδιου οπτικού πεδίου σε διαφορετικό επίπεδο εστίασης. Κατά τη λήψη των ημίλεπτων τομών διαπιστώθηκε ότι το αντίσωμα κατά της GFAP δεν είχε διεισδύσει σε όλο το πάχος της τομής. Έτσι, οι ημίλεπτες τομές που χρησιμοποιήθηκαν πρόερχονταν από τα πρώτα 5 μm της άνω και της κάτω επιφάνειας των αρχικών τομών. Σε αυτό το βάθος παρατηρούνταν ικανοποιητική διείσδυση του αντισώματος που είχε ως αποτέλεσμα σαφή σήμανση των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων. Λόγω του γεγονότος ότι η διάκριση των ορίων μεταξύ ακτινωτής και βοθριώδους μοριώδους στιβάδας δεν μπορούσε να γίνει με ακρίβεια σε αυτή την ομάδα τομών, παραλήφθηκε η καταμέτρηση των GFAPανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων στη βοθριώδη μοριώδη στιβάδα. 52

53 Εικόνα α και β. Μικροφωτογραφίες του ίδιου οπτικού πεδίου ιστολογικής τομής ανοσοκυτταροχημικά σημασμένης για GFAP σε δύο διαφορετικά επίπεδα εστίασης. 53

54 2.4.3 nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Μετρήθηκαν nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες σε ολόκληρη την έκταση του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Οι μετρήσεις έγιναν σε τομές της ομάδας Β, πάχους 50 μm, με την χρήση του οπτικού μικροσκοπίου και με αντικειμενικό φακό 10x. Η επιφάνεια του ιστού που μας ενδιέφερε καταμετρήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος ανάλυσης εικόνας. Τα κυτταρικά σώματα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων, στην συγκεκριμένη κάθε φορά επιφάνεια, καταμετρήθηκαν από τον παρατηρητή Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων του πεδίου CA1 Οι μετρήσεις έγιναν σε λεπτές τομές της ομάδας Β στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Οι nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες αναγνωρίσθηκαν σε ημίλεπτες τομές και χαρτογραφήθηκαν με τη βοήθεια συσκευής σχεδίασης (camera lucida). Στη συνέχεια έγινε στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ταυτοποίηση με τους νευρώνες στις λεπτές τομές και καταμετρήθηκαν οι συνάψεις που παρατηρούνταν στην κυτταρική μεμβράνη του σώματός τους. Η μέθοδος αυτή δεν επιτρέπει την καταμέτρηση του συνολικού αριθμού των συνάψεων που σχηματίζονται στην επιφάνεια ενός κυτταρικού σώματος, αλλά μόνο τον αριθμό των συνάψεων που παρατηρούνται σε μία τομή του κυτταρικού σώματος. Αυτό που ενδιαφέρει όμως στα πλαίσια της παρούσας έρευνας είναι η σύγκριση των σχετικών πληθυσμών μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού ιπποκάμπειου σχηματισμού. Και σε αυτή την περίπτωση ίσχυσε ο περιορισμός στη διάκριση μεταξύ ακτινωτής και βοθριώδους-μοριώδους στιβάδας, που περιγράφηκε στην παράγραφο

55 2.4.5 Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 Οι μετρήσεις έγιναν σε λεπτές τομές της ομάδας Α, στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα πυραμιδοειδή κύτταρα αναγνωρίσθηκαν με βάση τα μικροσκοπικά τους χαρακτηριστικά στο οπτικό μικροσκόπιο, στις τομές πάχους 50 μm και τις ημίλεπτες τομές πάχους 1 μm, και χαρτογραφήθηκαν. Αφού αναγνωριζόταν η ταυτότητα ενός πυραμιδοειδούς νευρώνα στη λεπτή τομή, καταμετρούνταν οι συνάψεις που παρατηρούνταν στην κυτταρική μεμβράνη του σώματός του. Με τον τρόπο που μετρήθηκαν οι συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnosανοσοδραστικών νευρώνων (παρ ), μετρήθηκαν και οι συνάψεις στο κυτταρικό σώμα πυραμιδοειδών κυττάρων σε ολόκληρη την έκταση της στιβάδας των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 του ιπποκάμπειου σχηματισμού Ασύμμετρες συνάψεις στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας Οι μετρήσεις έγιναν σε λεπτές τομές της ομάδας Α, στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Μετρήθηκαν οι ασύμμετρες (τύπου I) συνάψεις, οι οποίες παρατηρούνταν στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας. Για μεγαλύτερη ακρίβεια εφαρμόσθηκε μία δειγματοληπτική μέθοδος, η οποία στηρίζεται στη μέθοδο optical fractionator (οπτικός διαχωριστής) (Keuker και συν. 2001). Πιο συγκεκριμένα, ως πεδίο μέτρησης χρησιμοποιήθηκε το φωτογραφικό πεδίο του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Σε ένα τετράγωνο διάκενο του μεταλλικού πλέγματος, πάνω στο οποίο βρισκόταν η λεπτή τομή, σαρώνονταν ολόκληρη η ορατή περιοχή βουστροφηδόν, ξεκινώντας από την πάνω αριστερή γωνία, με βήμα ένα οπτικό πεδίο και καταμετρούνταν οι συνάψεις που παρατηρούνταν σε κάθε τέταρτο πεδίο οριζόντια (δηλαδή 1 ο,4 ο,7 ο κ.ο.κ.) και κάθε τρίτο κατακόρυφα (δηλαδή 1 ο,3 ο,5 ο κ.ο.κ.), (εικ ). 55

56 Εικόνα Σχεδιάγραμμα στο οποίο φαίνεται η δειγματοληπτική μέθοδος που εφαρμόσθηκε για την καταμέτρηση των ασύμετρων συνάψεων στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας. Είναι σκιασμένα τα οπτικά πεδία, στα Εικόνα Σχεδιάγραμμα στο οποίο φαίνεται ποιοι νευρώνες καταμετρούνταν, από αυτούς που διακρίνονταν στο οπτικό πεδίο. Οι κίτρινοι σχηματισμοί καταμετρούνταν, ενώ οι κυανοί όχι. οποία γινόταν καταμέτρηση. Συνολικά μετρήθηκαν 200 οπτικά πεδία από το διαφραγματικό και το κροταφικό τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού αντίστοιχα. Καταμετρήθηκαν μόνο οι συνάψεις που η συναπτική τους σχισμή εντασσόταν πλήρως στο παρατηρούμενο οπτικό πεδίο ή τεμνόταν από την αριστερή ή την κάτω πλευρά του. Συνάψεις, των οποίων η συναπτική σχισμή τεμνόταν από την δεξιά ή την πάνω πλευρά του οπτικού πεδίου, δεν καταμετρήθηκαν για να αποφευχθεί η διπλή καταμέτρηση (εικ ). Από την καταμέτρηση παραλείφθηκαν τα οπτικά πεδία τα οποία καταλαμβάνονταν από μεγάλο τμήμα κυτταρικού σώματος, δενδρίτη, 56

57 νευράξονα ή αγγείου. Μετρήσεις έγιναν σε οπτικά πεδία που προέρχονταν από όλη την έκταση της ακτινωτής στιβάδας του πεδίου CA Μεθοδολογικές παρατηρήσεις α) Το νιτρώδες νάτριο είναι αγγειοδιασταλτικό και χορηγήθηκε πριν από την έγχυση του διαλύματος παραφορμαλδεΰδης για να αντισταθμιστεί η παρατηρούμενη αγγειοσύσπαση από την επίδραση της παραφορμαλδεΰδης και η επακόλουθη μείωση του ρυθμού διάχυσης των χορηγούμενων υγρών στον εγκεφαλικό ιστό. β) Μέριμνα για τον υπολογισμό του βαθμού συρρίκνωσης του ιστού δεν λήφθηκε, καθώς οι μετρήσεις αφορούσαν μόνο την ποσοτική σύγκριση πληθυσμών, μεταξύ ανάλογων στην επιφάνεια και επομένως και τον όγκο περιοχών του διαφραγματικού και του κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού και όχι τον υπολογισμό αντικειμενικών ποσοτήτων σε συγκεκριμένο όγκο ζώντος ιστού. Θεωρήθηκε λοιπόν ότι ο βαθμός συρρίκνωσης ήταν ο ίδιος και για τα δύο τμήματα, αφού υπέστησαν κοινή κατεργασία. γ) Κατά την καταμέτρηση συνάψεων καταμετρούνταν μόνο συνάψεις, των οποίων όλα τα στοιχεία, δηλαδή προσυναπτική και μετασυναπτική μεμβράνη, συναπτική σχισμή και συναπτικά κυστίδια, μπορούσαν να διακριθούν χωρίς αμφιβολία Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι τόσο της περιγραφικής όσο και της συμπερασματικής στατιστικής. Η κανονικότητα των πειραματικών δεδομένων ελέγχθηκε με τους ελέγχους των Shapiro-Wilk και του Lilliefors, ενώ η ομοιογένεια των διακυμάνσεων ελέγχθηκε με τον 57

58 έλεγχο του Levene.Στις περιπτώσεις που κρίθηκε αναγκαίο, έγινε ο κατάλληλος μετασχηματισμός των πρωτογενών δεδομένων (π.χ. σε νεπέριους λογαρίθμους, σε τετραγωνική ρίζα, κ.λπ.), με στόχο την κανονικοποίησή τους (Ζolman 1993). Ειδικότερα, αναφορικά με την πυκνότητα και τη διάμετρο των αγγείων (σύνολο αγγείων, τριχοειδή, μεσαίου και μεγάλου μεγέθους αγγεία), ως προς το τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, για δοσμένο πεδίο (CA1, CA3 και DG) και στιβάδα (sor, spy, sr και sl-m για τα πεδία CA1 και CA3 και ML, GL και Hilus για το πεδίο DG), χρησιμοποιήθηκε ο έλεγχος της t-κατανομής (t-test). Σε περιπτώσεις μη κανονικότητας των δεδομένων, χρησιμοποιήθηκε ο μη παραμετρικός έλεγχος των Mann-Whitney. Η ίδια διαδικασία ανάλυσης χρησιμοποιήθηκε και για την πυκνότητα των αστροκυτταρικών (GFAPανοσοδραστικών) στοιχείων και των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων, ως προς το τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, για δοσμένο πεδίο και στιβάδα, καθώς και για την ανάλυση του αριθμού των συνάψεων στο κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων του πεδίου CA1, ως προς το τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, για δοσμένη στιβάδα και τέλος του αριθμού των συνάψεων στο κυτταρικό σώμα των πυραμιδοειδών κυττάρων και των συνάψεων στο νευροπίλημα της ακτινωτής στιβάδας, του πεδίου CA1, ως προς το τμήμα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Όλοι οι έλεγχοι έγιναν σε επίπεδο σημαντικότητας 5% (Ρ 0,05), εκτός αν δηλώνεται διαφορετικά. Για όλες τις αναλύσεις χρησιμοποιήθηκε το στατιστικό πακέτο SPSS

59 Συντομογραφίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται στις εικόνες και στα σχήματα: DG : Οδοντωτή έλικα. CA1 : Πεδίο 1 αμμώνειου κέρατος (Cornu Ammonis 1). CA2 : Πεδίο 2 αμμώνειου κέρατος (Cornu Ammonis 2). CA3 : Πεδίο 3 αμμώνειου κέρατος (Cornu Ammonis 3). Hilus : Πολύμορφη στιβάδα ή πύλη. ML : Mοριώδης στιβάδα. GL : Στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων. SL-M : Βοθριώδης-μοριώδης στιβάδα. sr : Ακτινωτή στιβάδα. spy : Στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων. sor : Στιβάδα των πολύμορφων νευρώνων. sl : Διαυγής στιβάδα. GABA : γ-αμινοβουτυρικό οξύ. GFAP : όξινη πρωτεΐνη των ινιδίων της αστρογλοίας. LTP : Μακρόχρονη ενδυνάμωση (long term potentiation). LTD : Μακρόχρονη καταστολή (long term depression). NOS : Συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (nitric oxide synthase). nnos : Νευρική ισομορφή της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (neuronal-nos). inos : Επαγόμενη ισομορφή της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (inducible- NOS). enos : Ενδοθηλιακή ισομορφή της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου (endothelial- NOS). SEM : Τυπικό σφάλμα μέσου (Standard error of the mean). 59

60 60

61 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Αιμοφόρα αγγεία σημασμένα με σινική μελάνη Η τεχνική της έγχυσης σινικής μελάνης αποκαλύπτει πλήρως το δίκτυο των αιμοφόρων αγγείων του νευρικού ιστού και γι αυτό το λόγο είναι πολύ διαδεδομένη (Coyle 1976, 1978 Duvernoy και συν Lawrence και συν Eriksdotter-Nilsson και συν Dusart και συν Sirevaag και συν Finger και Dunnett 1989 Yu και συν Miyoshi και συν Prieto και συν. 2005). Πιο συγκεκριμένα, χρωματίζει τις αρτηρίες, τις φλέβες, ακόμα και τα μικρότερα τριχοειδή αγγεία (Duvernoy και συν Sirevaag και συν Tata και Anderson 2002 Prieto και συν. 2005). Επιπλέον, χρωματίζει μόνο τον αυλό των αγγείων και δεν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων, επιτρέποντας αξιόπιστη εκτίμηση της διαμέτρου των αγγείων (Duvernoy και συν Tata και Anderson 2002). Τα αγγεία βάφτηκαν μελανά, ενώ ο υπόλοιπος ιστός παρέμεινε λευκός. Αυτή η ιδιότητα της τεχνικής, την κατέστησε ιδιαίτερα χρήσιμη για την καταμέτρηση της διαμέτρου και της επιφάνειας που καλύπτουν τα αγγεία, δεδομένου ότι αυτά έγιναν ευδιάκριτα από το σύστημα ανάλυσης εικόνας που χρησιμοποιήθηκε. Ακόμα και στις τομές στις οποίες εφαρμόσθηκε διπλή χρώση, με τον συνδυασμό και της τεχνικής Nissl, διαπιστώθηκε ότι το συγκεκριμένο σύστημα είχε τη δυνατότητα να διακρίνει, χωρίς λάθη, τα χρωσμένα αγγεία από τον υπόλοιπο ιστό (εικ. 3.1.α έως 3.1.θ). Από τις μικροφωτογραφίες (βλ. εικ. 3.1.β) είναι εμφανές, όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή (παρ ), ότι τα εγκάρσια αγγεία του ιπποκάμπειου σχηματισμού, που αναδύονται από τη διαμήκη αρτηρία και τη διαμήκη φλέβα του ιπποκάμπειου σχηματισμού, αναλύονται σε πολυάριθμους κλάδους, που αιματώνουν ολόκληρο τον ιπποκάμπειο σχηματισμό. 61

62 Εικόνα 3.1.α. και 3.1.β. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τομών του διαφραγματικού (α) και του κροταφικού (β) τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού χρωσμένων με σινική μελάνη και μέθοδο Nissl. 62

63 Εικόνα 3.1.γ. και 3.1.δ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τόμων του διαφραγματικού (γ) και του κροταφικού (δ) τμήματος του πεδίου CA1 του ιπποκάμπειου σχηματισμού χρωσμένων με σινική μελάνη και μέθοδο Nissl. 63

64 Εικόνα 3.1.ε. και 3.1.ζ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τόμων του διαφραγματικού (ε) και του κροταφικού (ζ) τμήματος του πεδίου CA3 του ιπποκάμπειου σχηματισμού χρωσμένων με σινική μελάνη και μέθοδο Nissl. 64

65 Εικόνα 3.1.η. και 3.1.θ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τόμων του διαφραγματικού (η) και του κροταφικού (θ) τμήματος της οδοντωτής έλικας του ιπποκάμπειου σχηματισμού χρωσμένων με σινική μελάνη και μέθοδο Nissl. 65

66 Η διάμετρος των αγγείων εκφράζεται σε μικρόμετρα (μm) ± SEM (τυπικό σφάλμα μέσου), ενώ η πυκνότητά τους ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αγγεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM Πυκνότητα των αγγείων Από τη στατιστική ανάλυση και αξιολόγηση των πειραματικών δεδομένων (πιν ) διαπιστώνεται ότι, η πυκνότητα των αγγείων του ιπποκάμπειου σχηματισμού, είναι συνολικά μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,117±0,002, βλ. και εικ. 3.1.β), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,112±0,001, βλ. και εικ. 3.1.α). Παρόμοια, στο πεδίο CA1 του κυρίως ιππόκαμπου και στην οδοντωτή έλικα, μεγαλύτερη πυκνότητα αγγείων παρατηρείται στο κροταφικό τμήμα (0,127±0,003 και 0,116±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.1.δ και 3.1.η αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,119±0,002 και 0,101±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.1.γ και 3.1.ζ αντίστοιχα βλ. και εικ α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων η πυκνότητα των αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,121±0,004), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,096±0,003, βλ. και εικ β). Στο πεδίο CA3, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων η πυκνότητα των αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,113±0,003, βλ. και εικ 3.1.στ), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,096±0,003, βλ. και εικ. 3.1.ε), ενώ αντίθετα στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,150±0,005), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,126±0,006, βλ. και εικ γ). Αν η σύγκριση της πυκνότητας γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και η πυκνότητα των αγγείων της ακτινωτής στιβάδας των πεδίων CA1 και CA3 αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,083±0,003 και 0,084±0,002 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,077±0,002 και 0,077±0,003 αντίστοιχα). Στην οδοντωτή έλικα, στη μοριώδη στιβάδα και στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων η πυκνότητα των αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα 66

67 (0,134±0,004 και 0,107±0,003 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,113±0,004 και 0,090±0,003 αντίστοιχα, βλ. και εικ δ). Πίνακας ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 0,143±0,003 Α 0,156±0,007 Α 0,147±0,003 CA1 spy 0,096±0,003 Α 0,121±0,004 Β 0,105±0,002 sr 0,077±0,002 Α 0,083±0,003 Β* 0,079±0,002 sl-m 0,152±0,006 Α 0,145±0,005 Α 0,149±0,004 Σύνολο 0,119±0,002 Α 0,127±0,003 Β 0,122±0,002 sor 0,110±0,003 Α 0,109±0,003 Α 0,110±0,002 CA3 spy 0,096±0,003 Α 0,113±0,003 Β 0,105±0,002 sr 0,077±0,003 Α 0,084±0,002 Β* 0,081±0,002 sl-m 0,150±0,005 Α 0,126±0,006 Β 0,141±0,004 Σύνολο 0,108±0,002 Α 0,107±0,002 Α 0,107±0,002 ML 0,113±0,004 Α 0,134±0,004 Β 0,123±0,003 DG GL 0,090±0,003 Α 0,107±0,003 Β 0,098±0,002 Hilus 0,100±0,002 Α 0,105±0,003 Α 0,103±0,002 Σύνολο 0,101±0,002 Α 0,116±0,002 Β 0,108±0,002 ΣΥΝΟΛΟ 0,112±0,001 Α 0,117±0,002 Β 0,114±0,001 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η πυκνότητά των αγγείων εκφράζεται ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αγγεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM. 67

68 3.1.2 Διάμετρος των αγγείων Η διάμετρος των αγγείων του ιπποκάμπειου σχηματισμού (πιν ), είναι συνολικά μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (7,461±0,063 μm, βλ. και εικ. 3.1.β), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (6,855±0,048 μm, βλ. και εικ. 3.1.α). Μεγαλύτερης διαμέτρου αγγεία παρατηρήθηκαν και στα πεδία CA1 και CA3 και στην οδοντωτή έλικα στο κροταφικό τμήμα (7,124±0,091, μm 7,748±0,114 μm και 7,618±0,121 μm αντίστοιχα) σε σύγκριση με το διαφραγματικό (6,768±0,067 μm, 6,969±0,083 μm και 6,892±0,113 μm αντίστοιχα, βλ. και εικ α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων και στην ακτινωτή στιβάδα, η διάμετρος των αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (6,410±0,123 μm και 8,146±0,219 μm αντίστοιχα, βλ. και εικ 3.1.δ), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (5,897±0,108 μm και 7,109±0,132 μm αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.1.γ και εικ β). Αν η σύγκριση των διαμέτρων γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και η διαμετρος των αγγείων της στιβάδας των πολύμορφων κυττάρων του πεδίου CA1 αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (7,209±0,113 μm), σε σύγκριση με το κροταφικό (6,937±0,178 μm). Στο πεδίο CA3, η διάμετρος των αγγείων στη στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων και στην ακτινωτή στιβάδα είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (7,545±0,180 μm 9,097±0,234 μm, αντίστοιχα, βλ. και εικ 3.1.στ), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (6,550±0,128 μm και 7,968±0,227 μm, αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.1.ε και εικ γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη μοριώδη στιβάδα και στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων, η διάμετρος των αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (7,597±0,175 μm και 6,805±0,146 μm, αντίστοιχα, βλ. και εικ 3.1.η), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (6,566±0,119 μm και 6,165±0,167 μm, αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.1.ζ και εικ δ). 68

69 Πίνακας ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 7,209±0,113 Α 6,937±0,178 Β* 7,126±0,096 CA1 spy 5,897±0,108 Α 6,410±0,123 Β 6,092±0,083 sr 7,109±0,132 Α 8,146±0,219 Β 7,560±0,128 sl-m 6,971±0,137 Α 7,229±0,133 Α 7,083±0,097 Σύνολο 6,768±0,067 Α 7,124±0,091 Β 6,903±0,054 sor 6,550±0,128 Α 7,545±0,180 Β 6,948±0,112 CA3 spy 6,594±0,131 Α 6,965±0,170 Α 6,779±0,108 sr 7,968±0,227 Α 9,097±0,234 Β 8,537±0,171 sl-m 7,031±0,114 Α 7,217±0,187 Α 7,104±0,101 Σύνολο 6,969±0,083 Α 7,748±0,114 Β 7,319±0,071 ML 6,566±0,119 Α 7,597±0,175 Β 7,046±0,112 DG GL 6,165±0,167 Α 6,805±0,146 Β 6,465±0,115 Hilus 8,155±0,218 Α 8,564±0,244 Α 8,352±0,164 Σύνολο 6,892±0,113 Α 7,618±0,121 Β 7,235±0,085 ΣΥΝΟΛΟ 6,855±0,048 Α 7,461±0,063 Β 7,111±0,039 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η διάμετρος των αγγείων εκφράζεται σε μικρόμετρα (μm) ± SEM. Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.1.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.1.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της διαμέτρου των αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.2.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.2.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της διαμέτρου των αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). 69

70 Εικόνα α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ Εικόνα α ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ μm 0, ,15 9 0,13 0,11 0,09 Β Β 8 7 Β Β Β 0,07 6 0,05 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ 5 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΑΓΓΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 Εικόνα β ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 μm 0, ,15 9 0,13 0,11 Β 8 Β 0,09 7 Β* 0,07 Β* 6 Β 0,05 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 5 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΑΓΓΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA3 Εικόνα γ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA3 μm 0, ,15 9 Β 0,13 0,11 0,09 Β Β 8 7 Β 0,07 Β* 6 0,05 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 5 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα δ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΑΓΓΕΙΩΝ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ Εικόνα δ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ μm 0, ,15 9 0,13 0,11 Β 8 0,09 Β 7 Β 0,07 6 Β 0,05 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ 5 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 70

71 3.1.3 Πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων Η πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων του ιπποκάμπειου σχηματισμού (πιν ), είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,040±0,001), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,038±0,001). Επίσης, στο πεδίο CA3 και στην οδοντωτή έλικα, παρατηρείται μεγαλύτερη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων στο διαφραγματικό τμήμα (0,037±0,001 και 0,040±0,001 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,033±0,001 και 0,035±0,001 αντίστοιχα, βλ. και εικ α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων μεγαλύτερη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων εμφανίζει το κροταφικό τμήμα (0,054±0,004), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,044±0,002), ενώ αντίθετα στην ακτινωτή στιβάδα μεγαλύτερη πυκνότητα τριχοειδών αγγείων εμφανίζει το διαφραγματικό τμήμα (0,028±0,001), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,023±0,001, βλ. και εικ β). Αν η σύγκριση της πυκνότητας γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και η πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων της στιβάδας των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,054±0,002), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,049±0,002). Στο πεδίο CA3, στη στιβάδα των πολύμορφων νευρώνων η πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,043±0,002), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,035±0,002, βλ. και εικ γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη μοριώδη στιβάδα και στην πύλη η πυκνότητα των τριχοειδών αγγείων είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,042±0,002 και 0,032±0,002 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,034±0,002 και 0,026±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ δ). 71

72 Πίνακας ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 0,044±0,002 Α 0,054±0,004 Β 0,047±0,002 CA1 spy 0,049±0,002 Α 0,054±0,002 Β* 0,051±0,001 sr 0,028±0,001 Α 0,023±0,001 Β 0,026±0,001 sl-m 0,038±0,002 Α 0,039±0,002 Α 0,038±0,001 Σύνολο 0,041±0,001 Α 0,043±0,002 Α 0,042±0,001 sor 0,043±0,002 Α 0,035±0,002 Β 0,040±0,001 CA3 spy 0,044±0,002 Α 0,041±0,002 Α 0,042±0,001 sr 0,025±0,001 Α 0,023±0,001 Α 0,024±0,001 sl-m 0,032±0,002 Α 0,034±0,004 Α 0,033±0,002 Σύνολο 0,037±0,001 Α 0,033±0,001 Β 0,035±0,001 ML 0,042±0,002 Α 0,034±0,002 Β 0,038±0,001 DG GL 0,045±0,002 Α 0,044±0,002 Α 0,045±0,001 Hilus 0,032±0,002 Α 0,026±0,002 Β 0,029±0,001 Σύνολο 0,040±0,001 Α 0,035±0,001 Β 0,038±0,001 ΣΥΝΟΛΟ 0,040±0,001 Α 0,038±0,001 Β 0,039±0,000 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η πυκνότητά των αγγείων εκφράζεται ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αγγεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM. 72

73 3.1.4 Διάμετρος των τριχοειδών αγγείων Η μέση τιμή της διαμέτρου των τριχοειδών αγγείων του ιπποκάμπειου σχηματισμού είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (4,227±0,010 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (4,193±0,009 μm, βλ. και πιν ). Στο πεδίο CA1 του κυρίως ιππόκαμπου, η διάμετρος των τριχοειδών αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (4,268±0,016 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (4,220±0,014 μm, βλ. και εικ α). Επίσης στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων μεγαλύτερη διάμετρος τριχοειδών αγγείων παρατηρείται στο κροταφικό τμήμα (4,337±0,035 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (4,212±0,032 μm, βλ. και εικ β). Στο πεδίο CA3, στην ακτινωτή στιβάδα η διάμετρος των τριχοειδών αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (4,246±0,032 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (4,156±0,030 μm, βλ. και εικ γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων η διάμετρος των τριχοειδών αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (4,241±0,036 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (4,137±0,031 μm, βλ. και εικ δ). Αν η σύγκριση της διαμέτρου γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και η διάμετρος των τριχοειδών αγγείων στην πύλη της οδοντωτής έλικας αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (4,278±0,034 μm), σε σύγκριση με το κροταφικό (4,171±0,033 μm). 73

74 Πίνακας ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 4,244±0,025 Α 4,301±0,036 Α 4,261±0,020 CA1 spy 4,212±0,032 Α 4,337±0,035 Β 4,268±0,023 sr 4,153±0,024 Α 4,193±0,028 Α 4,170±0,018 sl-m 4,310±0,032 Α 4,291±0,034 Α 4,301±0,023 Σύνολο 4,220±0,014 Α 4,268±0,016 Β 4,240±0,010 sor 4,179±0,034 Α 4,185±0,037 Α 4,182±0,025 CA3 spy 4,245±0,036 Α 4,217±0,035 Α 4,230±0,025 sr 4,156±0,030 Α 4,246±0,032 Β 4,199±0,022 sl-m 4,176±0,033 Α 4,183±0,036 Α 4,179±0,024 Σύνολο 4,185±0,017 Α 4,211±0,018 Α 4,197±0,012 ML 4,117±0,024 Α 4,177±0,028 Α 4,143±0,018 DG GL 4,137±0,031 Α 4,241±0,036 Β 4,183±0,023 Hilus 4,278±0,034 Α 4,171±0,033 Β* 4,225±0,024 Σύνολο 4,161±0,017 Α 4,192±0,018 Α 4,175±0,012 ΣΥΝΟΛΟ 4,193±0,009 Α 4,227±0,010 Β 4,208±0,007 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η διάμετρος των αγγείων εκφράζεται σε μικρόμετρα (μm) ± SEM. Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των τριχοειδών αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.3.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.3.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των τριχοειδών αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05). Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της διαμέτρου των τριχοειδών αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.4.α) και των στιβάδων αυτών ( , γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της διαμέτρου των τριχοειδών αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). 74

75 Εικόνα α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ Εικόνα α ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ μm 0,06 4,4 0,05 4,3 0,04 4,2 B 0,03 Β Β 0,02 4,1 0,01 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ 4,0 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 Εικόνα β ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 μm 0,06 4,4 0,05 Β Β* 4,3 B 0,04 4,2 0,03 0,02 Β 4,1 0,01 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 4,0 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 Εικόνα γ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 μm 0,06 4,4 0,05 4,3 0,04 0,03 Β 4,2 B 0,02 4,1 0,01 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 4,0 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα δ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ Εικόνα δ μm ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΤΡΙΧΟΕΙΔΩΝ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 0,06 4,4 0,05 4,3 0,04 4,2 B 0,03 0,02 Β Β 4,1 B* 0,01 ML GL Hilus 4,0 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 75

76 3.1.5 Πυκνότητα των μεσαίου μεγέθους αγγείων Η πυκνότητα των μεσαίου μεγέθους αγγείων στο σύνολο του ιπποκάμπειου σχηματισμού, στα πεδία του κυρίως ιππόκαμπου και στην οδοντωτή έλικα δεν εμφανίζει στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος (πιν , εικ α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων μεγαλύτερη πυκνότητα μεσαίου μεγέθους αγγείων παρατηρείται στο κροταφικό τμήμα (0,049±0,003), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,039±0,003, βλ. και εικ β). Στο πεδίο CA3, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων η πυκνότητα των μεσαίου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,044±0,003), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,035±0,002), ενώ αντίθετα στην ακτινωτή στιβάδα η πυκνότητα των αγγείων μεσαίου μεγέθους είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,027±0,002), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,021±0,002, βλ. και εικ γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων παρατηρείται μεγαλύτερη πυκνότητα αγγείων μεσαίου μεγέθους στο κροταφικό τμήμα (0,042±0,003), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,034±0,002, βλ. και εικ δ). 76

77 Πίνακας ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 0,063±0,003 Α 0,055±0,005 Α 0,060±0,003 CA1 spy 0,039±0,003 Α 0,049±0,003 Β 0,043±0,002 sr 0,023±0,001 Α 0,025±0,002 Α 0,024±0,001 sl-m 0,067±0,005 Α 0,058±0,004 Α 0,063±0,004 Σύνολο 0,050±0,002 Α 0,047±0,002 Α 0,049±0,001 sor 0,041±0,002 Α 0,040±0,003 Α 0,041±0,002 CA3 spy 0,035±0,002 Α 0,044±0,003 Β 0,039±0,002 sr 0,027±0,002 Α 0,021±0,002 Β 0,024±0,001 sl-m 0,060±0,005 Α 0,047±0,005 Α 0,055±0,004 Σύνολο 0,041±0,002 Α 0,037±0,002 Α 0,039±0,001 ML 0,040±0,002 Α 0,045±0,004 Α 0,043±0,002 DG GL 0,034±0,002 Α 0,042±0,003 Β 0,038±0,002 Hilus 0,032±0,002 Α 0,029±0,002 Α 0,030±0,001 Σύνολο 0,035±0,001 Α 0,039±0,002 Α 0,037±0,001 ΣΥΝΟΛΟ 0,035±0,001 Α 0,044±0,001 Α 0,042±0,001 Α A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05). Η πυκνότητά των αγγείων εκφράζεται ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αγγεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM Διάμετρος των μεσαίου μεγέθους αγγείων Η διάμετρος των μεσαίου μεγέθους αγγείων (πιν , εικ α, β, γ και δ) δεν εμφανίζει στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Διαφορές δεν παρατηρούνται και μεταξύ των δύο τμημάτων των πεδίων του κυρίως ιππόκαμπου και της οδοντωτής έλικας, αλλά και των επιμέρους στιβάδων τους. Αν όμως η σύγκριση της διαμέτρου γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα του πεδίου CA3, η διάμετρος των μεσαίου μεγέθους αγγείων αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (12,27±0,13 μm), σε σύγκριση με το κροταφικό (11,93±0,15 μm). 77

78 Πίνακας ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 11,94±0,10 Α 11,76±0,17 Α 11,89±0,09 CA1 spy 11,49±0,15 Α 11,57±0,15 Α 11,53±0,10 sr 12,06±0,11 Α 12,12±0,12 Α 12,09±0,08 sl-m 11,99±0,13 Α 12,06±0,14 Α 12,02±0,10 Σύνολο 11,92±0,06 Α 11,93±0,07 Α 11,92±0,05 sor 11,80±0,15 Α 11,81±0,16 Α 11,80±0,11 CA3 spy 11,81±0,16 Α 11,82±0,15 Α 11,82±0,11 sr 12,11±0,13 Α 11,94±0,13 Α 12,03±0,09 sl-m 12,27±0,13 Α 11,93±0,15 Β* 12,13±0,10 Σύνολο 12,03±0,07 Α 11,88±0,07 Α 11,96±0,05 ML 12,04±0,12 Α 11,89±0,13 Α 11,98±0,09 DG GL 11,58±0,15 Α 11,93±0,16 Α 11,75±0,11 Hilus 12,15±0,15 Α 12,21±0,16 Α 12,18±0,11 Σύνολο 11,96±0,08 Α 12,00±0,08 Α 11,98±0,06 ΣΥΝΟΛΟ 11,92±0,05 Α 11,96±0,05 Α 11,95±0,03 A, B*: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (Ρ 0,1). Η διάμετρος των αγγείων εκφράζεται σε μικρόμετρα (μm) ± SEM. Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των μεσαίου μεγέθους αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.5.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.5.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των μεσαίου μεγέθους αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05). Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της διαμέτρου των μεσαίου μεγέθους αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.6.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.6.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β*: Η διαφορά της μέσης τιμής της διαμέτρου των μεσαίου μεγέθους αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (Ρ 0,1). 78

79 Εικόνα α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ Εικόνα α ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ μm 0,07 12,3 0,06 12,1 0,05 11,9 0,04 11,7 0,03 0,02 11,5 0,01 11,3 0,00 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ 11,1 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 Εικόνα β ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 μm 0,07 12,3 0,06 12,1 0,05 11,9 0,04 B 11,7 0,03 0,02 11,5 0,01 11,3 0,00 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 11,1 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 Εικόνα γ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 μm 0,07 12,3 0,06 12,1 0,05 0,04 B 11,9 11,7 B* 0,03 0,02 0,01 B 11,5 11,3 0,00 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 11,1 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ Εικόνα δ μm ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΣΑΙΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 12,3 0,07 0,06 12,1 0,05 11,9 0,04 0,03 B 11,7 11,5 0,02 0,01 11,3 0,00 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ 11,1 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 79

80 3.1.7 Πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων Στο σύνολο του ιπποκάμπειου σχηματισμού, η πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,041±0,001), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,035±0,001, βλ. και πιν ). Επίσης, και στα δύο πεδία του κυρίως ιππόκαμπου και στην οδοντωτή έλικα, η πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,043±0,003, 0,038±0,002 και 0,044±0,003 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,038±0,002, 0,035±0,002 και 0,029±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων και στην ακτινωτή στιβάδα, η πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,028±0,003 και 0,035±0,003 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,023±0,002 και 0,025±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ β). Στο πεδίο CA3, στις στιβάδες των πολύμορφων νευρώνων και των πυραμιδοειδών κυττάρων, όπως και στην ακτινωτή στιβάδα, η πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,035±0,003, 0,032±0,003 και 0,040±0,003 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,031±0,003, 0,022±0,003 και 0,026±0,002 αντίστοιχα, βλ. και εικ γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη μοριώδη στιβάδα και στην πύλη η πυκνότητα των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,056±0,005 και 0,051±0,004 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,032±0,003 και 0,037±0,003 αντίστοιχα, βλ. και εικ δ). 80

81 Πίνακας ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 0,044±0,004 Α 0,056±0,007 Α 0,048±0,003 CA1 spy 0,023±0,002 Α 0,028±0,003 Β 0,026±0,002 sr 0,025±0,002 Α 0,035±0,003 Β 0,030±0,002 sl-m 0,053±0,006 Α 0,051±0,007 Α 0,052±0,005 Σύνολο 0,038±0,002 Α 0,043±0,003 Β 0,040±0,002 sor 0,031±0,003 Α 0,035±0,003 Β 0,033±0,002 CA3 spy 0,022±0,003 Α 0,032±0,003 Β 0,027±0,002 sr 0,026±0,002 Α 0,040±0,003 Β 0,033±0,002 sl-m 0,062±0,006 Α 0,046±0,007 Α 0,055±0,005 Σύνολο 0,035±0,002 Α 0,038±0,002 Β 0,036±0,001 ML 0,032±0,003 Α 0,056±0,005 Β 0,043±0,003 DG GL 0,017±0,002 Α 0,024±0,003 Α 0,020±0,002 Hilus 0,037±0,003 Α 0,051±0,004 Β 0,044±0,002 Σύνολο 0,029±0,002 Α 0,044±0,003 Β 0,037±0,002 ΣΥΝΟΛΟ 0,035±0,001 Α 0,041±0,001 Β 0,038±0,001 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05). Η πυκνότητά των αγγείων εκφράζεται ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αγγεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM Διάμετρος των μεγάλου μεγέθους αγγείων Από τη σύγκριση των μέσων τιμών της διαμέτρου των μεγάλου μεγέθους αγγείων (πιν ) μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού ιπποκάμπειου σχηματισμού διαπιστώνεται ότι η μόνη διαφορά παρατηρείται στην οδοντωτή έλικα, όπου η διάμετρος των μεγάλου μεγέθους αγγείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (34,62±0,68 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (32,30±0,52 μm, βλ. και εικ α). Αν η σύγκριση της διαμέτρου γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και η διάμετρος των μεγάλου μεγέθους αγγείων στο πεδίο CA3 αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (33,74±0,55 μm), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (32,64±0,62 μm). 81

82 Πίνακας ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 32,70±0,90 Α 30,75±1,02 Α 32,09±0,70 CA1 spy 28,46±0,99 Α 30,19±1,50 Α 29,39±0,93 sr 36,89±1,22 Α 35,40±1,09 Α 36,06±0,81 sl-m 31,79±1,15 Α 31,41±1,00 Α 31,58±0,75 Σύνολο 33,73±0,61 Α 33,15±0,64 Α 33,45±0,44 sor 31,68±1,17 Α 33,38±1,15 Α 32,67±0,83 CA3 spy 29,57±1,09 Α 29,09±0,73 Α 29,30±0,62 sr 36,16±1,22 Α 35,96±0,92 Α 36,04±0,74 sl-m 29,24±0,78 Α 32,57±1,18 Α 30,84±0,70 Σύνολο 32,64±0,62 Α 33,74±0,55 Β* 33,26±0,41 ML 31,82±0,83 Α 34,41±1,09 Α 33,19±0,70 DG GL 29,13±0,87 Α 30,63±0,96 Α 29,89±0,65 Hilus 34,24±0,87 Α 36,69±1,15 Α 35,48±0,72 Σύνολο 32,30±0,52 Α 34,62±0,68 Β 33,50±0,43 ΣΥΝΟΛΟ 32,95±0,34 Α 33,80±0,35 Α 33,40±0,25 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η διάμετρος των αγγείων εκφράζεται σε μικρόμετρα (μm) ± SEM. Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των μεγάλου μεγέθους αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.7.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.7.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των μεγάλου μεγέθους αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05). Εικόνα Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της διαμέτρου των μεγάλου μεγέθους αγγείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.8.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.8.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της διαμέτρου των μεγάλου μεγέθους αγγείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). 82

83 Εικόνα α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ Εικόνα α ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ μm 0, , Β* Β 0,035 Β Β Β 28 0, ,005 CA1 CA3 DG 18 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 Εικόνα β ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA1 μm 38 0, , ,035 Β 26 0,020 Β 22 0,005 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 18 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 Εικόνα γ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΟΥ ΠΕΔΙΟΥ CA3 μm 0, , ,035 Β Β Β 26 0, ,005 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ 18 sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα δ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ Εικόνα δ ΔΙΑΜΕΤΡΟΣ ΤΩΝ ΜΕΓΑΛΟΥ ΜΕΓΕΘΟΥΣ ΑΓΓΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ μm 0, ,050 Β Β , , ,005 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ 18 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα Διαφραγματικό ΤμήμαΚροταφικό Τμήμα 83

84 3.2 GFAP-ανοσοδραστικά κύτταρα Με την ανοσοκυτταροχημική τεχνική που εφαρμόσθηκε για την αναγνώριση της GFAP, σημάνθηκαν τα κυτταρικά σώματα και οι αποφυάδες των αστροκυττάρων (εικ α). Στην περιφέρεια των αιμοφόρων αγγείων παρατηρούνται σε ιστολογικές τομές σημασμένοι οι μυζητικοί ποδίσκοι των αστροκυττάρων (εικ. 3.2.ε και εικ. 3.2.ζ). Με περισσότερη λεπτομέρεια διακρίνονται στις ημίλεπτες τομές (εικ 3.2.η και εικ. 3.2.θ). Στις ημίλεπτες τομές, όπως είναι εμφανές και από τις μικροφωτογραφίες, είναι εύκολη η διάκριση μεταξύ σημασμένων κυτταρικών στοιχείων και μη σημασμένου ιστού, γεγονός που επέτρεψε την καταμέτρηση με το σύστημα ανάλυσης εικόνας. Η πυκνότητα των GFAP-ανοσοδραστικών στοιχείων (εκφρασμένη ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από GFAP-ανοσοδραστικά στοιχεία προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM) στο πεδίο CA3 του κυρίως ιππόκαμπου είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,0152±0,0010), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,0091±0,0006, βλ. και πιν. 3.2, εικ. 3.2.α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων η πυκνότητα των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,0114±0,0008), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,0098±0,0010), ενώ αντίθετα στην ακτινωτή στιβάδα είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,0138±0,0011), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,0096±0,0009, βλ. και εικ. 3.2.β). Στο πεδίο CA3, στις στιβάδες των πολύμορφων νευρώνων και των πυραμιδοειδών κυττάρων και στην ακτινωτή στιβάδα η πυκνότητα των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,0214±0,0024, 0,0128±0,0011 και 0,0121±0,0011 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,0108±0,0012, 0,0071±0,0007 και 0,0071±0,0007 αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.2.γ). Στην οδοντωτή έλικα, στη μοριώδη στιβάδα η πυκνότητα των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων είναι μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (0,0160±0,0018), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (0,0108±0,0012), ενώ αντίθετα στη 84

85 στιβάδα των κοκκοειδών κυττάρων και στην πύλη είναι μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (0,0132±0,0011 και 0,0149±0,0017 αντίστοιχα), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,0106±0,0013 και 0,0103±0,0009 αντίστοιχα, βλ. και εικ. 3.2.δ). Πίνακας 3.2 ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ GFAP-ΑΝΟΣΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 0,0137±0,0009 A 0,0128±0,0011 A 0,0133±0,0007 CA1 spy 0,0114±0,0008 A 0,0098±0,0010 B 0,0106±0,0007 sr 0,0096±0,0009 A 0,0138±0,0011 B 0,0117±0,0007 Σύνολο 0,0116±0,0005 A 0,0121±0,0006 A 0,0118±0,0004 sor 0,0214±0,0024 A 0,0108±0,0012 B 0,0160±0,0014 CA3 spy 0,0128±0,0011 A 0,0071±0,0007 B 0,0101±0,0007 sr 0,0121±0,0011 A 0,0071±0,0007 B 0,0108±0,0008 Σύνολο 0,0152±0,0010 A 0,0091±0,0006 B 0,0122±0,0006 ML 0,0108±0,0012 A 0,0160±0,0018 B 0,0130±0,0010 DG GL 0,0132±0,0011 A 0,0106±0,0013 B 0,0119±0,0008 Hilus 0,0149±0,0017 A 0,0103±0,0009 B 0,0126±0,0010 Σύνολο 0,0128±0,0008 A 0,0123±0,0008 A 0,0125±0,0006 ΣΥΝΟΛΟ 0,0132±0,0005 A 0,0112±0,0004 A 0,0122±0,0003 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05). Η πυκνότητά των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων εκφράζεται ως κλάσμα της επιφάνειας που καλύπτεται από αυτά προς την συνολική επιφάνεια που μετρήθηκε ± SEM. Εικόνα 3.2. Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των GFAPανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.1.7.α) και των στιβάδων αυτών (3.1.7.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των GFAP-ανοσοδραστικών κυτταρικών στοιχείων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05). 85

86 Εικόνα 3.2.α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ GFAP-ΑΝΟΣΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 Β 0,000 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα 3.2.β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ GFAP-ΑΝΟΣΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 B B 0,000 sor spy sr ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα 3.2.γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ GFAP-ΑΝΟΣΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA3 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 B B B 0,000 sor spy sr ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα 3.2.δ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ GFAP-ΑΝΟΣΟΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 0,025 0,020 0,015 B 0,010 0,005 B B 0,000 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 86

87 Εικόνα 3.2.ε και ζ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικής τομής ανοσοκυτταροχημικά σημασμένης για GFAP, στις οποίες διακρίνονται σημασμένα κυτταρικά στοιχεία στην περιφέρεια αιμοφόρων αγγείων, σε μικρότερη (ε) και μεγαλύτερη μεγέθυνση (ζ). 87

88 Εικόνα 3.2.η και θ. Μικροφωτογραφίες ημίλεπτων ιστολογικών τομών ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για GFAP, στις οποίες διακρίνονται σημασμένα κυτταρικά στοιχεία στην περιφέρεια αιμοφόρων αγγείων. 88

89 3.3 nnos-ανοσοδραστικοί νευρώνες Στον ιπποκάμπειο σχηματισμό, νευρώνες που εμφανίζουν ανοσοδραστικότητα για την πρωτεΐνη nnos, εντοπίστηκαν σε όλες τις περιοχές και στιβάδες, με διαφορετική ωστόσο πυκνότητα (εικ. 3.3.ε). Η μορφολογία των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων ήταν ποικίλη. Παρατηρήθηκαν χαρακτηριστικοί διάμεσοι νευρώνες, όπως ατρακτοειδή, δίπολα (εικ. 3.3.ζ) και πολύπολα κύτταρα (εικ.3.3.η), αλλά και νευρώνες που έμοιαζαν με πυραμιδοειδή κύτταρα (εικ. 3.3.θ). Η πυκνότητα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων (αριθμός των nnosανοσοδραστικών κυτταρικών σωμάτων ανά μm 2 ) στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πολύμορφων νευρώνων ήταν μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (2,6±0,3), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (1,4±0,2), ενώ αντίθετα στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων ήταν μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (12,8±0,9), σε σύγκριση με το κροταφικό (8,2±1,6, βλ. και πιν. 3.3, εικ. 3.3.β, 3.3.ι και 3.3.κ αντίστοιχα). Στο πεδίο CA3, στη στιβάδα των πολύμορφων κυττάρων μεγαλύτερη πυκνότητα nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων παρατηρήθηκε στο κροταφικό τμήμα (3,6±0,3), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (1,4±0,2, βλ. και εικ. 3.3.γ, 3.3.λ και 3.3.μ αντίστοιχα). Αν η σύγκριση της πυκνότητας των nnosανοσοδραστικών νευρώνων γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και στο πεδίο CA1, στη βοθριώδη-μοριώδη στιβάδα αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο διαφραγματικό τμήμα (6,7±0,7), σε σύγκριση με το κροταφικό (5,4±1,0) και στο πεδίο CA3, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων αποδεικνύεται μεγαλύτερη στο κροταφικό τμήμα (7,6±0,9), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (5,2±0,5). 89

90 Πίνακας 3.3 ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΣ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ Πεδίο Στιβάδα sor 1,4±0,2 A 2,6±0,3 B 1,9±0,2 CA1 spy 12,8±0,9 A 8,2±1,6 B 10,7±0,9 sr 3,4±0,3 A 4,7±0,7 A 4,0±0,4 sl-m 6,7±0,7 A 5,4±1,0 B * 6,1±0,6 Σύνολο 6,1±0,6 A 5,2±0,5 A 5,7±0,4 sor 1,4±0,2 A 3,6±0,3 B 2,6±0,2 CA3 spy 5,2±0,5 A 7,6±0,9 B * 6,5±0,6 sr 6,3±0,6 A 6,5±0,5 A 6,4±0,4 sl-m 11,6±1,3 A 9,6±1,5 A 10,6±1,0 Σύνολο 5,9±0,5 A 6,5±0,4 A 6,2±0,3 ML 2,4±0,3 A 3,5±0,6 A 3,0±0,3 DG GL 9,9±1,0 A 13,7±1,8 A 11,6±1,0 Hilus 8,8±0,6 A 12,1±1,6 A 10,4±0,9 Σύνολο 6,6±0,6 A 8,5±0,9 A 7,5±0,5 ΣΥΝΟΛΟ 6,1±0,3 A 6,6±0,4 A 6,4±0,2 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Η πυκνότητα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων αναφέρεται στον αριθμό των nnos-ανοσοδραστικών κυτταρικών σωμάτων ανά μm 2. Εικόνα 3.3. Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών της πυκνότητας των nnosανοσοδραστικών νευρώνων των πεδίων του κυρίως ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας (3.3.α) και των στιβάδων αυτών (3.3.β, γ και δ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής της πυκνότητας των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). 90

91 Εικόνα 3.3.α ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΙΠΠΟΚΑΜΠΕΙΟΥ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΥ 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 CA1 CA3 DG ΠΕΡΙΟΧΗ Εικόνα 3.3.β ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 B 0,4 B* 0,2 0,0 B sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα 3.3.γ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA3 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 B* 0,4 0,2 0,0 B sor spy sr slm ΣΤΙΒΑΔΑ Εικόνα 3.3.δ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΟΔΟΝΤΩΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 ML GL Hilus ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 91

92 Εικόνα 3.3.ε και ζ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τομών του ιπποκάμπειου σχηματισμού ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για nnos. Διακρίνεται η κατανομή των nnos κυττάρων (ε), και σε μεγαλύτερη μεγέθυνση διακρίνεται ένα σημασμένο κύτταρο το οποίο μοιάζει με πυραμιδοειδές κύτταρο και εντοπίζεται στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων του πεδίου CA1 (ζ). 92

93 Εικόνα 3.3.η και θ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τομών ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για nnos. Διακρίνεται ένα πολύπολο σημασμένο κύτταρο (η), καθώς και ένα δίπολο σημασμένο κύτταρο σε στενή γειτονία με επίσης σημασμένο κύτταρο (θ). 93

94 Εικόνα 3.3.ι και κ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τομών του διαφραγματικού (ι) και του κροταφικού (κ) τμήματος του πεδίου CA1 του ιπποκάμπειου σχηματισμού ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για nnos. 94

95 . Εικόνα 3.3.λ και μ. Μικροφωτογραφίες ιστολογικών τομών του διαφραγματικού (λ) και του κροταφικού (μ) τμήματος του πεδίου CA3 του ιπποκάμπειου σχηματισμού ανοσοκυτταροχημικά σημασμένων για nnos. 95

96 3.4 Συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnosανοσοδραστικών νευρώνων του πεδίου CA1 Μετρήθηκαν οι ασύμμετρες (τύπου I) (εικ. 3.4.δ, 3.4.ε) και οι συμμετρικές (τύπου II) (εικ. 3.4.ζ, 3.4.η) συνάψεις στο κυτταρικό σώμα των nnos-ανοσοδραστικών νευρώνων, όλων των στιβάδων του πεδίου CA1. Παρατηρήθηκαν από 0 έως 5 ασύμμετρες και από 0 έως 6 συμμετρικές συνάψεις σε κάθε κυτταρικό σώμα που εξετάστηκε. Συχνότερα παρατηρούνταν 0 (60%), 1 (26%) ή 2 (9%) ασύμμετρες και 2 (32%), 1 (26%) ή 0 (21%) συμμετρικές συνάψεις. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων φαίνονται στον πίνακα 3.4. Στην επιφάνεια των 99 από τις 246 συνολικά τομές κυτταρικών σωμάτων των nnosανοσοδραστικών νευρώνων που εξετάστηκαν παρατηρούνται τόσο συμμετρικές (τύπου II), όσο και ασύμμετρες (τύπου I) συνάψεις, γεγονός που συνηγορεί στην άποψη ότι πρόκειται για διάμεσους νευρώνες. Σε 147 από τις 246 τομές όμως, 85 από τις οποίες εντοπίζονταν στην στιβάδα spy, δεν εντοπίστηκαν ασύμμετρες συνάψεις. Άρα δεν μπορεί να αποκλειστεί το ενδεχόμενο, κάποιοι από τους nnos-ανοσοδραστικούς νευρώνες να είναι κύριοι νευρώνες, όπως προτείνουν κάποιοι ερευνητές (Chiang και συν. 1994, Wendland και συν. 1994, Vaid και συν. 1996, Iwase και συν. 1998). Από τη σύγκριση μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος του ιπποκάμπειου σχηματισμού, προκύπτει ότι το πεδίο CA1 έχει μεγαλύτερο αριθμό συμμετρικών συνάψεων ανά τομή nnos-ανοσοδραστικού κυτταρικού σώματος στο κροταφικό τμήμα (1,99±0,130), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (1,39±0,101, βλ. και εικ. 3.4.α). Στο πεδίο CA1, στη στιβάδα των πυραμιδοειδών κυττάρων μεγαλύτερος αριθμός συμμετρικών συνάψεων ανά τομή nnos-ανοσοδραστικού κυτταρικού σώματος παρατηρείται στο κροταφικό τμήμα (1,76±0,204), σε σύγκριση με το διαφραγματικό (1,22±0,112, βλ. και εικ. 3.4.β). Αν η σύγκριση του αριθμού των συνάψεων ανά τομή nnosανοσοδραστικού κυτταρικού σώματος γίνει σε επίπεδο σημαντικότητας α=10% (Ρ 0,1), τότε και στην ακτινωτή στιβάδα ο αριθμός των ασύμμετρων συνάψεων αποδεικνύεται 96

97 μεγαλύτερος στο διαφραγματικό τμήμα (0,97±0,187), σε σύγκριση με το κροταφικό (0,54±0,092, βλ. και εικ. 3.4.γ). Πίνακας 3.4 ΣΥΝΑΨΕΙΣ ΑΝΑ ΤΟΜΗ nnos-ανοσοδραστικου ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΟΣ ΠΕΔΙΟ CA1 ΤΜΗΜΑ ΔΙΑΦΡΑΓΜΑΤΙΚΟ ΚΡΟΤΑΦΙΚΟ ΣΥΝΟΛΟ ΑΣΥΜΜΕΤΡΕΣ ΣΥΝΑΨΕΙΣ sor 0,50±0,224 Α 0,31±0,175 Α 0,37±0,137 spy 0,63±0,103 Α 0,60±0,174 Α 0,62±0,089 sr 0,97±0,187 Α 0,54±0,092 Β* 0,71±0,095 ΣΥΝΟΛΟ 0,72±0,088 Α 0,53±0,083 Α 0,63±0,061 ΣΥΜΜΕΤΡΙΚΕΣ ΣΥΝΑΨΕΙΣ sor 3,00±0,447 Α 3,15±0,436 Α 3,11±0,323 spy 1,22±0,112 Α 1,76±0,204 Β 1,39±0,102 sr 1,55±0,198 Α 1,89±0,166 Α 1,76±0,128 ΣΥΝΟΛΟ 1,39±0,101 Α 1,99±0,130 Β 1,66±0,083 A, B: Μέσες τιμές στην ίδια σειρά με διαφορετικό εκθέτη διαφέρουν σημαντικά (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). Εικόνα 3.4. Γραφικές παραστάσεις των μέσων τιμών του αριθμού των ασύμμετρων και των συμμετρικών συνάψεων ανά τομή nnos-ανοσοδραστικού κυτταρικού σώματος στο πεδίο CA1 του κυρίως ιπποκάμπου (3.4.α) και των στιβάδων αυτού (3.4.β και γ) στο διαφραγματικό και στο κροταφικό τμήμα. Β: Η διαφορά της μέσης τιμής του αριθμού των συνάψεων ανά τομή nnosανοσοδραστικού κυτταρικού σώματος μεταξύ διαφραγματικού και κροταφικού τμήματος είναι στατιστικά σημαντική (P 0,05, όπου υπάρχει αστερίσκος Ρ 0,1). 97

98 Εικόνα 3.4.α ΣΥΝΑΨΕΙΣ ΑΝΑ ΤΟΜΗ KYTTΑΡΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΟΣ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 Β 1,0 0,5 0,0 Ασύμμετρες Συμμετρικές Εικόνα 3.4.β ΑΣΥΜΜΕΤΡΕΣ ΣΥΝΑΨΕΙΣ ΑΝΑ ΤΟΜΗ KYTTΑΡΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΟΣ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 sor spy sr ΣΤΙΒΑΔΑ Β* Εικόνα 3.4.γ ΣΥΜΜΕΤΡΙΚΕΣ ΣΥΝΑΨΕΙΣ ΑΝΑ ΤΟΜΗ KYTTΑΡΙΚΟΥ ΣΩΜΑΤΟΣ nnos-ανοσοδραστικων ΝΕΥΡΩΝΩΝ ΠΕΔΙΟΥ CA1 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 Β 0,5 0,0 sor spy sr ΣΤΙΒΑΔΑ Διαφραγματικό Τμήμα Κροταφικό Τμήμα 98

99 Εικόνα 3.4.δ και ε. Μικροφωτογραφίες από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο υπέρλεπτης ιστολογικής τομής ανοσοκυτταροχημικά σημασμένης για nnos στις οποίες διακρίνεται μία ασύμμετρη (τύπου I) σύναψη στο κυτταρικό σώμα σημασμένου κυττάρου, σε μικρότερη (δ) και μεγαλύτερη μεγέθυνση (ε). 99

100 Εικόνα 3.4.ζ και η. Μικροφωτογραφίες από το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο υπέρλεπτης ιστολογικής τομής ανοσοκυτταροχημικά σημασμένης για nnos στις οποίες διακρίνεται μία συμμετρική (τύπου ΙI) σύναψη στο κυτταρικό σώμα σημασμένου κυττάρου σε μικρότερη (ζ) και μεγαλύτερη μεγέθυνση (η). 100