ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΕΙΑΣ» ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ «Βιομηχανική Χημεία - Οίνος και Αλκοολούχα Ποτά» ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Φασματοσκοπική και Χημειομετρική μελέτη του παραδοσιακού ούζου ΞΑΝΘΗ ΘΕΟΔΟΣΙΟΥ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ ΙΟΥΝΙΟΣ 2017

2

3 ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Φασματοσκοπική και Χημειομετρική Μελέτη του παραδοσιακού ούζου ΞΑΝΘΗ ΘΕΟΔΟΣΙΟΥ Α.Μ.: ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΛΙΟΥΝΗ ΜΑΡΙΑ, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ε.Κ.Π.Α. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Λιούνη Μαρία, Αναπληρώτρια Καθηγητρία Ε.Κ.Π.Α.- Επιβλέπουσα Μαυρομούστακος Θωμάς, Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α. Μεθενίτης Κωνσταντίνος, Αναπληρωτής Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α. ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 27/06/2017

4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής μελέτης αποτέλεσε η διάκριση του ούζου με βάση το χημικό προφίλ. Τόσο από άλλα αποστάγματα που είναι αρωματισμένα με γλυκάνισο όσο και από άλλα αλκοολούχα ποτά ανά τον κόσμο, με τη χρήση των φασματοσκοπικών μεθόδων FT-IR, SNIF-NMR και IR-MS και την επεξεργασία των αναλυτικών δεδομένων μέσω διαφόρων μεθόδων Χημειομετρίας. Κατά τη διάρκεια της λήψης φασμάτων με τη μέθοδο του FT-IR το ενδιαφέρον επικεντρώθηκε και στους διαφορετικούς τρόπους προκατεργασίας των δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα, λήφθηκαν φάσματα από συμπυκνωμένα δείγματα που είχαν έγχυθει σε δισκίο KBr, από υπολείμματα επαναπόσταξης των δειγμάτων αλλά και χωρίς να υποστούν επεξεργασία. Μέσω της στατιστικής επεξεργασίας των δεδομένων επιτεύχθηκε διαφοροποίηση τόσο βάσει της γεωγραφικής προέλευσης, του τύπου ανισούχου του ποτού αλλά και του τρόπου παραγωγής. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Βιομηχανική Χημεία Αλκοολούχων Ποτών ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙ ΙΑ: αυθεντικότητα, ούζο, αποστάγματα, σταθερά ισότοπα, Χημειομετρία, FT-IR, SNIF-NMR, IR-MS

5 ABSTRACT This thesis is about the discrimination ouzo based on the chemical profil from other aniseed flavored spirits and other alcoholic beverages around the world by using FT-IR, SNIF-NMR and IR-MS techniques and Chemometrics analysis. During the spectroscopic measurements with the FT-IR method, our interest was also focused on the different ways of pre-processing of the samples. In particular, spectra have been obtained from concentrated samples injected into a KBr pill, from the residue of the samples distillation but also from samples without pre-processing. Through examining the former results with statistical methods we achieved geographical differentiation and also discrimination based on the type of anised drink and the way of production. SUBJECT AREA: Industrial Chemistry of Alcocholics Beverages KEYWORDS: authenticity, ouzo, distillates, stable isotopes, Chemometrics, FT-IR, SNIF-NMR, IR-MS

6 Στον παππού μου τον Γιώργο

7 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στο Γενικό Χημείο του Κράτους (ΓΧΚ) της Κύπρου στο εργαστήριο Αυθεντικότητας Τροφίμων μέσω του προγράμματος Erasmus+. Υπεύθυνη για την ανάθεση του θέματος ήταν η Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Κα Μαρία Λιούνη μαζί με τον Καθηγητή Κο Θωμά Μαυρομούστακο και την υπεύθυνη του εργαστηρίου στο ΓΧΚ Κα Ρεβέκκα Κοκκινόφτα. Τους ευχαριστώ θερμά για την πολύπλευρη στήριξή τους από την ανάθεση του θέματος μέχρι την ολοκλήρωση της μελέτης μου. Ευχαριστώ τη Δρ. Πόπη Κανάρη, Διευθύντρια του ΓΧΚ της Κύπρου για τη δυνατότητα που μου παρείχε να εργαστώ σε ένα άρτια εξοπλισμένο εργαστήριο με τις καλύτερες δυνατές συνθήκες. Επίσης, ευχαριστώ από καρδιάς την υπεύθυνη του εργαστηρίου Δρ. Ρεβέκκα Κοκκινόφτα πρώτα απ όλα για τη στήριξή της, τις συμβουλές της και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, χωρίς τη συμβολή της οποίας το ερευνητικό αυτό δεν θα ήταν εφικτό. Επιπλέον, την ευχαριστώ που μου διέθεσε τον εργαστηριακό εξοπλισμό να πραγματοποιήσω τις διάφορες αναλύσεις μου αλλά και για το χρόνο που διέθεσε για να μου διδάξει τις βασικές αρχές της Χημειομετρίας και πως να χρησιμοποιώ τα προγράμματα για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων μου. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον υπεύθυνο του τομέα Τροφίμων Δρ. Στέλιο Γιαννόπουλο και όλους τους συναδέλφους στο εργαστήριο Νάσω Οικονομίδου, Ελένη Τζιόνη, Χαρά Σαββίδου και Χαράλαμπο Λουκά, για τη συνεχή γνώση που μου προσέφεραν και για τη βοήθειά τους σε οποιαδήποτε απορία μου αλλά και τους συναδέλφους στα υπόλοιπα εργαστήρια του ΓΧΚ για τη στήριξή τους. Θα ήθελα ακόμη, να ευχαριστήσω τον Κο Αγάπιο Αγαπίου, Λέκτορα στο Πανεπιστήμιο της Κύπρου στο Τμήμα Χημείας, για τη μεγάλη και σημαντική βοήθεια που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της βιβλιογραφικής μου μελέτης, για τη σωστή συγγραφή και τον τρόπο παρουσίασης της έρευνάς μου. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τον Κο Θωμά Μαυρομούστακο που μου έδωσε την ιδέα και το κίνητρο να εκπονήσω το ερευνητικό μου έργο στην Κύπρο.

8 Αλλά και την οικογένεια μου για την αμέριστη και έμπρακτη συμπαράσταση και την ενθάρρυνσή τους σε κάθε μου νέο στόχο. Για τη διεκπεραίωση της παρούσας ερευνητικής εργασίας, θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια για τη συνεργασία και την πολύτιμη συμβολή της στην ολοκλήρωση της.

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ... vi ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ιστορική αναδρομή Νομοθετικό Πλαίσιο Παρασκευή ούζου Πρώτες ύλες παραγωγής αλκοολούχων ποτών με άνισο Παραγωγική διαδικασία ούζου Σύσταση ούζου Το άρωμα στα ανισούχα αποστάγματα Αρωματισμός Αποσταγμάτων Αρωματικά συστατικά Μέθοδοι ανάλυσεις του αρώματος ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η αυθεντικότητα στα αλκοολούχα ποτά Σήματα ποιότητας Μεθοδολογία για τον καθορισμό της αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών ΚΕΦΑΛΑΙΟ Χημειομετρία Επεξεργασία δεδομένων Δημιουργία περιγραφικών μεταβλητών Προ-επεξεργασία των περιγραφικών μεταβλητών για ανάλυση Έννοια των πολυμεταβλητών τεχνικών Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) Διακριτική Ανάλυση (DA)... 49

10 3.3.3 Ιεραρχική Ανάλυση συστάδων (HCA) Δένδρα Ταξινόμησης και Παλινδρόμησης (CARΤ) Ταξιδόμηση k μέσων SIMCA Μερικά Ελάχιστα Τετράγωνα (Partial Least Square, PLS) ΚΕΦΑΛΑΙΟ Υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμών Fourier (FT-IR) Αναλύσεις λόγου σταθερών ισοτόπων (SIRA) Φασματομετρία Μάζας Λόγου Ισοτόπων (IR-MS) SNIF-NMR Τεχνικές προκατεργασίας δειγμάτων Περιστροφικός συμπυκνωτής (rotary evaporator) Τεχνική Διασποράς σε παστίλιες KBr ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δειγματοληψία Συμπύκνωση δειγμάτων σε περιστροφικό συμπυκνωτή Παρασκευή δισκίων KBr Λήψη φασμάτων με χρήση Φασματοσκοπίας Υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier, FTIR Μελέτη φασμάτων FTIR ΚΕΦΑΛΑΙΟ Χημειομετρική Ανάλυση Φασμασματοσκοπικών Δεδομένων FTIR απευθείας σε ATR Χημειομετρική Ανάλυση Φασμασματοσκοπικών Δεδομένων FTIR από δισκία KBr CART στα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-NIR από δισκία KBr CART στα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-IR από δισκία KBr... 82

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δειγματοληψία Προετοιμασία δειγμάτων για την τεχνική του SNIF-NMR Προετοιμασία δειγμάτων για την τεχνική του IR-MS ΚΕΦΑΛΑΙΟ Σύγκριση ούζων μεταξύ τους Σύγκριση αποσταγμάτων μελασσικής και οινικής προέλευσης ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΕΙΚΟΝΕΣ ΣΧΗΜΑΤΑ ΠΙΝΑΚΕΣ

12 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ Εικόνα Πίνακας ο οποίος απεικονίζει την παραγωγική διαδικασία της απόσταξης Εικόνα : Αποστακτική συσκευή Εικόνα 2.2.1:Σύμβολα για σήματα ποιότητας προϊόντων στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα Εικόνα 5.2.1: Κρύσταλλος ZnSe για λήψη φάσματος με ATR Εικόνα 5.4.1: Υδραυλική πρέσσα Εικόνα 5.6.1: Φασματοφωτόμετρο υπερύθρου Εικόνα 7.2.1: Πορεία προσδιορισμού λόγων δευτερίου Εικόνα 7.3.1: Πορεία προσδιορισμού ισοτόπων C 13 /C 12 και O 18 /O i

13 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα : Σκελετικές δομές των ενώσεων: (α) Κινναμωμική αλδεΰδη (β)trans-ανηθόλη (γ) ευγενόλη (δ) εστραγόλη Σχήμα : Διάγραμμα ροής παραγωγής ούζου Σχήμα 1.4.1:Μεταβολισμός μεθανόλης Σχήμα 1.4.2: Μηχανισμός αφυδάτωση ξυλόζης μέσω ενολοποίησης προς παραγωγή φουρφουράλης Σχήμα 1.4.3: Συνοπτικό διάγραμμα του μεταβολισμού (καταβολισμού) της αιθανόλης στον οργανισμό του ανθρώπου Σχήμα 1.4.4: Σχηµατισµός 1,1-διαιθόξυ-αιθανίου (ακετάλης) µέσω αντίδρασης της ακεταλδεΰδης και της αιθυλικής αλκοόλης Σχήμα 2.1.1: Κριτήρια αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών Σχήμα 2.3.1: Τεχνικές που μπορούν να εφαρμοστούν στον καθορισμό της αυθεντικότητας των τροφίμων και ποτών Σχήμα 3.1.1: Χημειομετρικές Μέθοδοι Σχήμα : Πίνακας Χ, αρχικών δεδομένων: Μ γραμμές (παρατηρήσεις), Ν στήλες (μεταβλητές) Σχήμα : α) Το άνυσμα του μέσου όρου παρίσταται με ένα σημείο (μαυρισμένο) στο μέσο του πλήθους των δεδομένων β) Νέο σύστημα συντεταγμένων, με κέντρο το σημείο των μέσων όρων Σχήμα : Πίνακες που προκύπτου από την PCA Σχήμα : Εφαρμογή HCA Σχήμα :Παραγοντοποίηση πίνακα με PLS Σχήμα 4.1.1:Διαχωρισμός του IR φάσματος σε επιμέρους περιοχές, όπου εμφανίζονται οιχαρακτηριστικές ομάδες των οργανικών ενώσεων Σχήμα 4.1.2: Σχηματική αναπαράσταση φασματοφωτομέτρου FT-IR με συμβολόμετρο Σχήμα 4.2.1:Διάγραμμα ροής ανάλυσης δείγματος με μεθόδους SIRA ii

14 Σχήμα :Οργανολογία IR-MS Σχήμα : Μεταβολικοί κύκλοι Σχήμα : Φάσμα 2 Η-NMR της αιθανόλης Σχήμα 5.7.1: Σύγκριση φάσματος FTIR ούζου 100%, χωρίς προκατεργασία σε ATR, σε δισκίο έπειτα από συμπύκνωση και υπόλειμμα απόσταξης σε ATR Σχήμα 5.7.2: Σύγκριση φάσματος FTIR ούζου 100%, τσίπουρου χωρίς γλυκάνισο και τσίπουρο με γλυκάνισο σε δισκίο έπειτα από συμπύκνωση (πάνω) αλλά και απευθείας σε ATR (κάτω) Σχήμα 6.1.1: Διάκριση δειγμάτων ούζου με PCA στα φασματικά δεδομένα FTIR απευθείας σε ATR Σχήμα Διάκριση ελλαδικών δειγμάτων με PCA στα φασματικά δεδομένα FTIR απευθείας σε ATR Σχήμα : Επιτυχία ταξινόμησης σε συστάδες 24 δειγμάτων ούζων και άλλων ανισούχων ποτών Σχήμα : Δένδρο ταξινόμησης των 24 δειγμάτων σε 3 τάξεις Σχήμα : Σχηματική συμπεριφορά των 24 δειγμάτων με CARΤ Σχήμα : Επιτυχία ταξινόμησης σε συστάδες 43 δειγμάτων με ή χωρίς γλυκάνισο αποσταγμάτων Σχήμα : Σχηματική συμπεριφορά των 43 δειγμάτων με CARΤ Σχήμα 8.1.1: Διάγραμμα διασποράς φορτίων R1 vs. R2 για το μοντέλο PLS- DA (X: group, R, 13 C, 18 O, (D/H)I, (D/H)II, αλκοολικός βαθμός, Υ: ομάδα 1 και ομάδα 2) Σχήμα 8.1.2: Διάγραμμα σημαντικότητας μεταβλητών (VIP) για το μοντέλο PLS-DA Σχήμα 8.1.3: Διάγραμμα διασποράς για το μοντέλο PLS-DA (Χ:Ούζα 100% και Υ:Ούζα) Σχήμα 8.2.1: Διάγραμμα διασποράς φορτίων R1 vs. R2 για το μοντέλο PCA-X (X: group, R, 13 C, 18 O, (D/H)I, (D/H)II, αλκοολικός βαθμός) iii

15 Σχήμα 8.2.2: Διάγραμμα σκέδασης του μοντέλου PCA για τη διάκριση ούζων, τσίπουρων και τσικουδιάς Σχήμα 8.2.3: Διάγραμμα διασποράς του μοντέλου PLS-DA για τη διάκριση ούζων, τσίπουρων, τσικουδιάς Σχήμα 8.2.4: Διάγραμμα προβέψεων vs. παρατηρήσεων του μοντέλου PLS- DA για τη διάκριση ούζων, τσικουδιάς, τσίπουρων iv

16 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.4.1: Περιεκτικότητα σε ανώτερες αλκοόλες (g/hl ΑΑ) σε δείγματα ούζου Πίνακας : Το χαρακτηριστικό άρωμα διαφόρων ενώσεων Πίνακας : Έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί για την ταυτοποίηση του αρώματος του ούζου Πίνακας 2.2.1: Σύμφωνα με τον ΕΚ 110/2008, στην κατηγορία «Αποσταγμένο anis», υπάρχουν έξι γεωγραφικές ενδείξεις ούζου με καταγωγή από την Ελλάδα Πίνακας 2.2.2: Σύμφωνα με τον ΕΚ 110/2008, στην κατηγορία «Απόσταγμα στεμφύλων σταφύλης», υπάρχουν πέντε γεωγραφικές ενδείξεις τσίπουρου και μια τσικουδιάς με καταγωγή από την Ελλάδα Πίνακας 2.2.3: Γεωγραφικές ενδείξεις αλκοολούχων ποτών αναγνωρισμένες σε εθνικό επίπεδο Πίνακας 4.1.1: Εφαρμογές της φασματοσκοπίας FT-IR- ATR στην αυθεντικότητα ποτών Πίνακας 4.2.1: Τα στοιχεία, τα σταθερά ισότοπά τους και οι πληροφορίες που δίνουν κατά τον έλεγχο της αυθεντικότητας Πίνακας : Εφαρμογές ισοτοπικών αναλύσεων στην αυθεντικότητα ποτών Πίνακας 5.1.1: Δείγματα ούζου που μελετήθηκαν Πίνακας Ταξινόμηση σε τρεις ομάδες με CART Πίνακας : Στοιχεία δόμησης του μοντέλου με CARΤ Πίνακας Ταξινόμηση σε δυο ομάδες με CART Πίνακας 8.1.: Τιμές των σταθερών ισοτοπικών λόγων των δειγμάτων της μελέτης Πίνακας 8.2.1:Επισκόπηση των τιμών των παραμέτρων v

17 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Τα τελευταία χρόνια έχει αυξηθεί το ερευνητικό ενδιαφέρον για την πιστοποίηση της αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών. Σε ελληνικό επίπεδο, όσο αφορά τα αλκοολούχα ποτά, έχει ερευνηθεί η αυθεντικότητα κρασιών, τσίπουρου & τσικουδιάς. Στόχος της συγκεκριμένης έρευνας είναι η πιστοποίηση της αυθεντικότητας ενός αρκετά διαδεδομένου αλκοολούχου ποτού, του ούζου, που αποτελεί τόσο ελληνικό όσο και κυπριακό προϊόν, με προστατευόμενη ονομασία προέλευσης. Η διαδικασία παραγωγής του ούζου, όσο και οι πρώτες ύλες που μπορούν να χρησιμοποιηθούν, εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία. Πρωταρχικός στόχος της έρευνας ήταν η διάκριση του ούζου που προέρχεται από 100% απόσταξη, από το ούζο που προέρχεται από ανάμιξη αποστάγματος με αιθέραια έλαια. Επιπλέον, θα γίνει προσπάθεια για διάκριση του ούζου και από άλλα αποστάγματα, όπως το τσίπουρο, τη ζιβανία καθώς και από άλλα ανισούχα αποστάγματα ανά τον κόσμο. Μετά από τη μελέτη για τις διάφορες μεθόδους που έχουν εφαρμοστεί για την αυθεντικότητα των αλκοολούχων ποτών, καταλήξαμε πως οι πιο κατάλληλες μέθοδοι είναι η ανάλυση των δειγμάτων με φασματοσκοπία FT-IR, SNIF- NMR, IR-MS και η επεξεργασία των αποτελεσμάτων με χρήση διαφόρων τεχνικών της Χημειομετρίας. vi

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ, ΝΟΜΟΘΕΤΙΚΟ ΠΛΑΙΣΙΟ, ΠΑΡΑΓΩΓΗ & ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΟΥΖΟΥ 1.1 Ιστορική αναδρομή Η ιστορία των αποσταγμάτων εκτείνεται πολύ πίσω στα βάθη της ιστορίας. Mία από πρώτες γνωστές βιοτεχνολογικές εφαρμογές ήταν το κρασί και, χάρη στην ύπαρξη πρωτόγονων τεχνικών απόσταξης, τα αποστάγματά του. Η απόσταξη μελετήθηκε από Αλεξανδρινούς σοφούς και αργότερα από Άραβες αλχημιστές και αποτέλεσε σημαντικό κεφάλαιο στην επιστήμη της Χημείας (Εικόνα 1.1.1). Αυτό που δεν ξέρουμε ακριβώς είναι πότε άρχισε η απόσταξη με χρήση χάλκινου άμβυκα. Το όνομα υποδηλώνει ότι ήταν πιθανότατα ένας Έλληνας και όχι ένας Άραβας αυτός που έκανε την εφεύρεση. Ο άμβυξ, απ όπου προέρχεται η λέξη alembic, ήταν ένα δοχείο με μια ευρεία βάση και λεπτό λαιμό, πολύ παρόμοιο με το βραστήρα του αποστακτήρα. Η ελληνική λέξη φαίνεται να πέρασε στα αραβικά (al-ambiq), και μέσα από τα αραβικά και σε άλλες ευρωπαϊκές γλώσσες [1]. Τα αποστάγματα είχαν τόσο υψηλό αλκοολικό βαθμό, σε σχέση με τα ποτά που παράγονταν μέχρι τότε από ζύμωση, που ακόμα και οι πιο ανθεκτικοί μύκητες δεν μπορούσαν να επιβιώσουν σε περιβάλλον μεγαλύτερο των 15 αλκοολικών βαθμών, γεγονός το οποίο έθετε ένα φυσικό όριο στα αλκοολούχα ποτά που παρασκευάζονταν με ζύμωση. Η απόσταξη επέτρεψε στους αλχημιστές να ξεπεράσουν αυτό το όριο [2]. Η ιστορία, η διαμόρφωση και εξέλιξη των ποτών με γλυκάνισο είναι στενά συνδεδεμένη με τις δεξιότητες των χαλκουργών, δεδομένου ότι χωρίς χαλκό εξακολουθεί να είναι απλά αδύνατη η παραγωγή τέτοιων αποσταγμάτων και, ως εκ τούτου, όπως ήταν η πρόοδος στην επεξεργασία του χαλκού, έτσι και η παραγωγή αλκοολούχων ποτών με γλυκάνισο εξελίχθηκε πάρα πολύ. Αργότερα βελτιώσεις στον εξοπλισμό απόσταξης συνέβαλαν στη μεγάλης κλίμακας απόσταξη στεμφύλων (ένα υποπροϊόν της οινοποίησης) στη Μικρά Ασία και στις περιοχές παραγωγής σταφυλιών στην Ελλάδα. Μέχρι τα μέσα 1

19 του 15 ου αιώνα, η Αλεξάνδρεια, η Κωνσταντινούπολη και η Σμύρνη ήταν τα πιο σημαντικά κέντρα γνώσης των δεξιοτήτων της απόσταξης. Δεν είναι γνωστό πότε ακριβώς άρχισε η παραγωγή του ούζου, ούτε πότε άρχισε να χρησιμοποιείται αυτό το όνομα, αλλά ξέρουμε σίγουρα ότι έγινε σε ελληνικό έδαφος και αναπτύχθηκε από την παραγωγή του τσίπουρου. Αυτός είναι ο λόγος για την αρχική ονομασία του, μεταβρασμένο (αποσταγμένο και πάλι) τσίπουρο. Η λέξη ούζο δεν σημαίνει τίποτα στα ελληνικά και δεν φαίνεται να είχε χρησιμοποιηθεί ευρέως μέχρι το δεύτερο μισό του 19 ο αιώνα. Εικόνα Πίνακας ο οποίος απεικονίζει την παραγωγική διαδικασία της απόσταξης. Προς το τέλος της δεκαετίας του 1920, ο Paul Ricard στη Γαλλία εμπορευματοποιήσε ένα ποτό με γλυκάνισο με το όνομά του. Το 1932, έλαβε το «νομικό» δικαίωμα να παράγει και να πουλάει το ποτό. Η συνταγή του κατοχυρώθηκε από το κράτος και το «pastis» γεννήθηκε επίσημα. Το όνομά του προέρχεται από το προβηγκικό «pastisson» και το ιταλικό «pasticcio», ένα συνώνυμο για το μείγμα ή την ανάμιξη [1]. Στο πλαίσιο των ανισούχων ποτών στη Γαλλία παράγονται δύο κατηγορίες αλκοολούχων ποτών: αφενός εκείνη των ανισούχων αποσταγμάτων με την ονομασία ανίς και αφετέρου των ανιζέτ (anisette), που αποτελούν μια κατηγορία λικέρ. Τα ανίς αντικατέστησαν το λικέρ αψέντι, που αρωματιζόταν με τα φύλλα του φυτού Αρτεμισία η άψινθος (κοινώς αψινθία) και πινόταν πολύ το 18 ο αιώνα. Το φυτό αυτό έχει άρωμα συγγενές με εκείνο της ανηθόλης αλλά περιέχει στο 2

20 αιθέραιο έλαιο του και το γλυκοζίτη αψιθίνη, ουσία τοξική για το νευρικό σύστημα. Η ουσία αυτή προκάλεσε κρίσεις επιληψίας και θανάτους στους καταναλωτές του ποτού αψέντι, αιτία η οποία οδήγησε στην αντικατάσταση του από τα ανίς. Στις χώρες της Ιβηρικής Χερσονήσου παράγονται επίσης ανισούχα αλκοολούχα ποτά, τα οποία στη μεν Πορτογαλία λέγονται anisado στη δε Ισπανία anis, ενώ τα λικέρ με αρωματισμό ανηθόλης λέγονται ανεζόν (anesone). Στην Ιταλία παράγεται ένα λίκερ με βάση την ανηθόλη, η sambuca. Στην Τουρκία παράγεται το raki από αλκοόλη που προέρχεται από σταφίδα και η οποία εναποστάζεται με άνισο. Διατίθεται με τις ονομασίες yeniraki, klubrakisi, altinbasrakisi και tekel rakisi. Στο Λίβανο και στη Συρία παράγεται το arrak. Στα νότια παράλια της Μεσογείου, στην Αίγυπτο, παράγεται το zebib από αλκοόλη αρωματισμένη με άνισο. Η αλκοόλη δεν είναι απαραίτητα αμπελοοινικής προέλευσης, αλλά μπορεί να προέρχεται και από άλλες ζυμούμενες ζαχαρούχες πρώτες ύλες, όπως χουρμάδες, σύκα κ.ά. Στην πρώην Γιουγκοσλαβία παράγεται ως λικέρ το anisette, ενώ κυκλοφορούν επίσης, διάφορα είδη ανίς. Στην Ελλάδα τέλος παράγεται το ούζο, το οποίο θεωρείται ο εξελιγμένος απόγονος των αρωματισμένων με γλυκάνισο αποσταγμάτων στέμφυλων αλλά και το τσίπουρο αρωματισμένο με γλυκάνισο [3,4,5]. Η νεότερη ιστορία του ούζου άρχισε στο νησί της Λέσβου, στο Πλωμάρι, από την οικογένεια Βαρβαγιάννη. Τα τοπικά και χρονικά πλεονεκτήματα ήταν ότι: Η Λέσβος είχε ενδημικό γλυκάνισο (στο χωριό Λισβόρι, όπου ακόμη και σήμερα ο πράσινος γλυκάνισος (Pimpinella anisum) φύεται μόνο μερικά χιλιόμετρα βορειοδυτικά του Πλωμαρίου), Το νερό του νησιού είχε ανώτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, Ο ιδρυτής Ευστάθιος Βαρβαγιάννης ήταν γνώστης της τέχνης της απόσταξης. Με ένα συνδυασμό αυτών των τριών παραγόντων, δεν προκαλεί καμία έκπληξη ότι η Λέσβος έγινε η γενέτειρα του ούζου. Ξεκινώντας από το νησί 3

21 της Λέσβου, η φήμη του ούζου σύντομα άρχισε να αναγνωρίζεται σε όλο τον κόσμο [1]. Το ούζο αποτελεί ένα ποτό κατεξοχήν ελληνικό. Η προέλευση της ονομασίας του ούζου δεν είναι γνωστή με απόλυτη σιγουριά. Εικάζεται ότι η ονομασία προέρχεται από παράφραση του "uso Massalia" δηλαδή "προς χρήση στη Μασσαλία", που αναγραφόταν στα κιβώτια των εξαγώγιμων παρτίδων στον Τύρναβο. Μια δεύτερη εκδοχή είναι ότι το ούζο είναι απόγονος ενός ποτού από την Ισπανία, το οποίο ήρθε στην Ελλάδα από εμπόρους και η ονομασία του προέρχεται πάλι από παράφραση της λέξης uso. Η τρίτη εκδοχή αναφέρει, ότι η λέξη ούζο προέρχεται από μια πρόποση που έκαναν κατά τα βυζαντινά χρόνια. Σύμφωνα με μία άλλη άποψη, η λέξη ούζο προέρχεται από το τούρκικο üzüm, το οποίο σημαίνει "τσαμπί σταφύλι" και "αφέψημα από σταφίδες". Από την άλλη, ο Έλληνας πεζογράφος Νίκος Γαβριήλ Πεντζίκης ( ), ισχυριζόταν ότι η λέξη ούζο, ετυμολογικά προέρχεται από τη φράση "ου ζω", δίνοντας στο ποτό μια υπερβατική διάσταση και ορίζοντάς το σαν μια έκφραση της κατάστασης του πνεύματος που οδηγεί πέραν της ζωής και του θανάτου. Τέλος, σύμφωνα με κάποιους φιλολόγους ίσως προέρχεται από το αρχαίο ελληνικό ρήμα «όζω» που σημαίνει μυρίζω [6-12]. Η ιστορία του τσίπουρου προηγείται αυτής του ούζου και έχει πολλά κοινά με όσα αναφέρθηκαν προηγουμένως γι αυτό και δεν θα γίνει κάποια επιπλέον αναφορά. Η ιστορία του τσίπουρου είναι στενά συνδεδεμένη όχι μόνο με τις τεχνικές της απόσταξης, αλλά και την εμπειρία της οινοποίησης. Δεδομένου ότι μια από τις πρώτες ύλες για το τσίπουρο είναι τα υπολείμματα της διαδικασίας οινοποίησης (δηλ. τα στέμφυλα), είναι απαραίτητο να υπάρχει πρόσβαση σε σταφύλια προκειμένου να παραχθεί τσίπουρο [1]. 4

22 1.2 Νομοθετικό Πλαίσιο Ι. Νομοθεσία Αλκοολούχων Ποτών Σύμφωνα με τον ισχύοντα κανονισμό 110/2008 του Συμβουλίου των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων ως «αλκοολούχο ποτό» νοείται το αλκοολικό ποτό που: α) προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση β) έχει ιδιαίτερα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά γ) έχει ελάχιστο αλκοολικό τίτλο 15% vol. δ) παράγεται: i) είτε απευθείας: με απόσταξη φυσικά ζυμωθέντων προϊόντων, με ή χωρίς προσθήκη αρτυμάτων ή/και με διαβροχή, ή με παρόμοια επεξεργασία, φυτικών υλών σε αιθυλική αλκοόλη γεωργικής προέλευσης ή/και σε προϊόντα απόσταξης γεωργικής προέλευσης ή/και αλκοολούχα ποτά κατά την έννοια του παρόντος κανονισμού ή/και με προσθήκη αρτυμάτων, σακχάρων και άλλων γλυκαντικών προϊόντων ή/και άλλων γεωργικών προϊόντων ή/και τροφίμων σε αιθυλική αλκοόλη γεωργικής προέλευσης ή/και σε προϊόντα απόσταξης γεωργικής προέλευσης ή/και σε αλκοολούχα ποτά υπό κατά την έννοια του παρόντος κανονισμού, ii) είτε με ανάμιξη αλκοολούχου ποτού με ένα ή περισσότερα: άλλα αλκοολούχα ποτά ή/και αιθυλική αλκοόλη γεωργικής προέλευσης ή προϊόντα απόσταξης γεωργικής προέλευσης ή/και άλλα αλκοολικά ποτά ή/και ποτά [3]. 5

23 ΙΙ. Νομοθεσία Αλκοολούχων Ποτών με άνισο Σύμφωνα με Ευρωπαϊκό Κανονισμό 110/2008 ισχύει ο παρακάτω διαχωρισμός των αλκοολούχων ποτών με άνισο [3]: i. Αλκοολούχο ποτό με άνισο Αλκοολούχο ποτό με άνισο είναι το αλκοολούχο ποτό που παράγεται με αρωμάτιση αιθυλικής αλκοόλης γεωργικής προέλευσης με φυσικά εκχυλίσματα αστεροειδούς ανίσου (Ιllicium verum Hook f.), ανίσου (κοινώς γλυκάνισου) (Pimpinella anissum L.), μάραθου (Foeniculum vulgare Mill.) ή οποιουδήποτε άλλου φυτού περιέχει το ίδιο βασικό αρωματικό συστατικό, με την εφαρμογή μιας από τις ακόλουθες μεθόδους ή συνδυασμού τους: i) διαβροχή ή/και απόσταξη, ii) επαναπόσταξη της αλκοόλης παρουσία των σπόρων ή άλλων μερών των φυτών που αναφέρονται ανωτέρω, iii) προσθήκη φυσικών, αποσταγμένων εκχυλισμάτων φυτών που έχουν άρωμα ανίσου. Ο ελάχιστος κατ όγκο αλκοολικός τίτλος του αλκοολούχου ποτού με άνισο είναι 15%. Για την παρασκευή των αλκοολούχων ποτών με άνισο επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται μόνο φυσικές αρτυματικές ουσίες και αρτυματικά. Είναι δυνατόν συμπληρωματικά να χρησιμοποιούνται και άλλα φυσικά εκχυλίσματα φυτών ή αρωματικοί σπόροι αλλά πρέπει να υπερισχύει η γεύση του άνισου. ii. Pastis Pastis είναι το αλκοολούχο ποτό με άνισο που περιέχει επίσης φυσικά εκχυλίσματα γλυκόριζας (Glycyrrhiza spp.), με αποτέλεσμα την παρουσία χρωστικών που ονομάζονται «χαλκόνες», καθώς και γλυκυρριζικού οξέος σε ελάχιστη και μέγιστη αναλογία 0,05 και 0,5 γραμμαρίων ανά λίτρο, αντίστοιχα. Ο ελάχιστος κατ όγκο αλκοολικός τίτλος του pastis είναι 40%. Για την παρασκευή του pastis επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται μόνο φυσικές αρτυματικές ουσίες και αρτυματικά. Το pastis έχει περιεκτικότητα σε σάκχαρα, εξεφρασμένη ως ιμβερτοσάκχαρο, μικρότερη από 100 γραμμάρια ανά λίτρο και ελάχιστη 6

24 και μέγιστη περιεκτικότητα σε ανηθόλη 1,5 και 2 γραμμάρια ανά λίτρο, αντίστοιχα. iii. Anis Anis είναι το αλκοολούχο ποτό με άνισο, το χαρακτηριστικό άρωμα του οποίου προέρχεται αποκλειστικά από άνισο (κοινώς γλυκάνισου) (Pimpinella anisum L.) ή/και αστεροειδή άνισο (Illicium verum Hook f.) ή/και μάραθο (Foeniculum vulgare Mill.) Ο ελάχιστος κατ όγκο αλκοολικός τίτλος του anis είναι 35%. Για την παρασκευή του anis επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται μόνο φυσικές αρτυματικές ουσίες και αρτυματικά. iv. Αποσταγμένο anis Αποσταγμένο anis είναι το anis το οποίο περιέχει αλκοόλη που αποστάχθηκε παρουσία των σπόρων αποκλειστικά από άνισο (κοινώς γλυκάνισο) (Pimpinella anisum L.) ή/και αστεροειδή άνισο (Illicium verum Hook f.) ή/και μάραθο (Foeniculum vulgare Mill.) και, στην περίπτωση γεωγραφικών ενδείξεων, μαστίχας και άλλων αρωματικών σπόρων, φυτών ή φρούτων, υπό την προϋπόθεση ότι η εν λόγω αλκοόλη αποτελεί τουλάχιστον το 20% του αλκοολικού τίτλου του αποσταγμένου anis. Ο ελάχιστος κατ όγκο αλκοολικός τίτλος του αποσταγμένου anis είναι 35%. Για την παρασκευή του αποσταγμένου anis επιτρέπεται να χρησιμοποιούνται μόνο φυσικές αρτυματικές ουσίες και αρτυματικά. ΙΙΙ. Νομοθεσία Ελληνικών Αποσταγμάτων με γλυκάνισο i. Ούζο Το ούζο αποτελεί έναν εξελιγμένο απόγονο των αποσταγμάτων στεμφύλων και άλλων ζυμωμένων σακχαρούχων πρώτων υλών, αρωματισμένων με σπόρους από γλυκάνισο, μάραθο και μαστίχα. Κατατάσσεται στη γενική κατηγορία των αποσταγμένων anis, των αλκοολούχων ποτών με άρωμα ανίσου, δηλαδή ανηθόλης. Για τον αρωματισμό χρησιμοποιούνται και άλλα 7

25 αρωματικά τμήματα φυτών, σπόροι, ρίζες, όπως αστεροειδής άνισος, κάρδαμο (κακουλές), ζιγγιβέρι (πιπερόριζα), άνθη κανέλλας, μοσχοκάρυδο, ρίζα στρονθίου (τσουένι) και κορίανδρος. Η βασική διαφορά του ούζου από τα άλλα αλκοολούχα ποτά με άρωμα ανίσου έγκειται στον τρόπο αρωματισμού του. Στα περισσότερα anis τα αρωματικά συστατικά των σπόρων παραλαμβάνονται με εκχύλιση τους σε υδραλκοολικό διάλυμα ή προστίθενται σε αυτό έτοιμα. Προηγείται δηλαδή συνήθως η παραλαβή των αιθέριων ελαίων των σπόρων με νερό και κατόπιν αυτά τα έλαια προστίθενται στο υδραλκοολικό διάλυμα. Στο ούζο παραδοσιακά η παραλαβή των αρωματικών ουσιών γίνεται με απόσταξη των αιθέριων ελαίων των σπόρων σε υδραλκοολικό διάλυμα [4]. Η επισήμανση μπορεί να φέρει τη λέξη «απεριτίφ», αλλά όχι τη διατύπωση «από απόσταξη», «διπλά αποσταγμένο» ή «εκ νέου απόσταξη». Μόνο εάν η περιεκτικότητα σε οινόπνευμα του ούζου είναι αποκλειστικά προϊόν απόσταξης επιτρέπεται να δηλώνεται ως «100% αποσταγμένο». Σήμερα, τα περισσότερα ποιοτικά ούζα είναι 100% αποσταγμένα [1]. Ειδικότερα για να μπορεί το αλκοολούχο ποτό με άνισο να ονομάζεται ούζο θα πρέπει: να παρασκευάζεται αποκλειστικά στην Ελλάδα και στην Κύπρο να λαμβάνεται με σύμμιξη αλκοολών που έχουν αρωματισθεί με απόσταξη ή διαβροχή με σπόρους ανίσου και ενδεχομένως μάραθου, μαστίχας από το ιθαγενές μαστιχόδεντρο της Χίου (pistacia lentiscus Chia ή Latifolia) και άλλους αρωματικούς σπόρους, φυτά και καρπούς. Η αλκοόλη που έχει αρωματιστεί με απόσταξη πρέπει να αντιπροσωπεύει το 20% τουλάχιστον του αλκοολικού τίτλου του ούζου. Το εν λόγω προϊόν της απόσταξης πρέπει: να λαμβάνεται με απόσταξη μέσα σε χάλκινους παραδοσιακούς άμβυκες, ασυνεχούς λειτουργίας, χωρητικότητας μέχρι 1000 L. να έχει αλκοολικό τίτλο από 55% μέχρι και 80% vol. Το ούζο πρέπει να είναι άχρωμο και η περιεκτικότητα του σε ζάχαρη να είναι τέτοια ώστε το διατιθέμενο στην κατανάλωση ούζο να μην έχει στερεό υπόλειμμα μεγαλύτερο από 50 g/l. Επίσης, πρέπει να τονισθεί ότι στο μίγμα 8

26 των εκχυλισμάτων του ούζου επιτρέπεται η προσθήκη νερού μέχρι διαμόρφωσης του αλκοολικού τίτλου κατανάλωσης, ο οποίος δεν επιτρέπεται να είναι κατώτερος από 37,5% vol. [3]. ii. Tσίπουρο Τσίπουρο είναι το ποτό που παρασκευάζεται από απόσταξη στεμφύλων (τσίπουρα) με ή χωρίς υγιή οινολάσπη ή γλευκολάσπη σταφυλιών. Σύμφωνα με τον ΕΚ 110/2008, ένα ποτό με την παραπάνω προέλευση μπορεί να φέρει την ονομασία τσίπουρο ή τσικουδιά. Πιο συγκεκριμένα πάντως, τσικουδιά θεωρείται το αλκοολούχο απόσταγμα που λαμβάνεται από την πρώτη απόσταξη των στεμφύλων και περιέχει τα προϊόντα της ζύμωσης των στεμφύλων, χωρίς άλλη προσθήκη ή επεξεργασία. Το απόσταγμα αυτό παρασκευάζεται κυρίως στην Κρήτη και περιλαμβάνει μόνο τα αρωματικά συστατικά του σταφυλιού σε αντίθεση με το τσίπουρο που μπορεί να περιέχει και άλλα αρωματικά συστατικά [13,14]. Ο ίδιος ΕΚ καθορίζει και τις προδιαγραφές που πρέπει να έχουν τα ποτά με την επωνυμία τσίπουρο ή τσικουδιά, οι οποίες είναι οι ακόλουθες: Ο αλκοολικός βαθμός τους πρέπει να είναι τουλάχιστον 35% vol. στους 20 C. Το ανώτατο όριο απόσταξης να είναι το 86% vol. Το ανώτατο όριο μεθανόλης τα 800 g/hl απόλυτης αλκοόλης [3]. Στην περίπτωση του τσίπουρου ο αρωματισμός γίνεται με αρωματικά συστατικά που προέρχονται συνήθως από γλυκάνισο, μάραθο και συγγενή προς αυτά άλλα υλικά. Ο αρωματισμός συνηθίζεται από τους περισσότερους παραδοσιακούς παραγωγούς τσίπουρου στη Μακεδονία, Θεσσαλία, Ήπειρο και αλλού. Θα πρέπει να τονιστεί πως το τσίπουρο δεν αποτελεί απόσταγμα anis ακόμα και αν έχει αρωματιστεί με γλυκάνισο, καθώς ανήκει στην κατηγορία αποστάγματα στεμφύλων σταφυλιών [5]. 9

27 1.3 Παρασκευή ούζου Πρώτες ύλες παραγωγής αλκοολούχων ποτών με άνισο Για την παραγωγή των ποτών αυτής της κατηγορίας χρειάζονται αρωματικοί σπόροι κατάλληλοι να προσφέρουν τις απαραίτητες αρωματικές ουσίες, αιθανόλη γεωργικής προέλευσης και πολλές βοηθητικές ύλες, όπως νερό, φυσικά αιθέρια έλαια και γλυκαντικές ουσίες. i. Αιθανόλη γεωργικής προέλευσης Η αιθυλική αλκοόλη ποτοποιίας είναι η παραγόμενη αλκοόλη από την απόσταξη προϊόντων αλκοολικής ζύμωσης σακχαρούχων υλών προέλευσης αμπέλου ή άλλων σακχαρούχων και αμυλούχων πρώτων υλών γεωργικής προέλευσης, όπως η μελάσσα, τα χαρούπια, τα σύκα, τα φρούτα και τα δημητριακά. Για την παραγωγική διαδικασία του ούζου ειδικότερα, η επιλογή της προέλευσης της αιθανόλης είναι ένας πολύ σημαντικός παράγοντας. Η αιθανόλη πρέπει να είναι εξαιρετικά καθαρή, δηλαδή απαλλαγμένη από πτητικές ενώσεις, ώστε να μην εμποδίζεται ή να αλλοιώνεται η εμφάνιση του αρώματος των σπόρων. Η επίδραση των πτητικών ενώσεων είναι πολύ μεγάλη, γιατί προκαλούν το φαινόμενο της συνέργειας, δηλαδή της αρωματικής ενίσχυσης ή μείωσης ενός συστατικού από την παρουσία άλλων συστατικών. Πιο συγκεκριμένα, στις ελληνικές ποτοποιίες οινοπνευματωδών ποτών χρησιμοποιούνται δύο είδη αιθανόλης γεωργικής προέλευσης, η οινική και η μελασσική. Η μελασσική που παράγεται από τεύτλα, χρησιμοποιείται κυρίως για την παραγωγή ούζου και είναι υψηλής καθαρότητας σε σχέση με την οινική (που χρησιμοποιείται συνήθως για την παραγωγή μπράντυ και λικέρ) και παρουσιάζει σε πολύ μικρά ποσοστά προσμίξεις μεθανόλης και ισοβουτυλικής αλκοόλης [3,7]. ii. Αρωματικά φυτά Αρωματικές ύλες είναι τα φυσικά αιθέρια έλαια, τα φυσικά αρώματα και τα εκχυλίσματα. Τα φυσικά αιθέρια έλαια είναι μίγματα πτητικών οργανικών ουσιών με έντονη οσμή και δριμεία γεύση και λαμβάνονται από αρωματικά φυτά ή μέρη αυτών με τεχνικές έκθλιψης ή απόσταξης, κατά περίπτωση. Με την απευθείας εκχύλιση αρωματικών φυτών ή τμημάτων τους προκύπτουν τα 10

28 πραγματικά εκχυλίσματα, τα οποία, εκτός από αιθέρια έλαια, περιέχουν και άλλες μη πτητικές ουσίες που εκχυλίζονται. Αντίστοιχα, με τη διάλυση των φυσικών αιθέριων ελαίων δημιουργούνται τα φυσικά αρώματα (essence). Σκόπιμο κρίνεται, να αναφερθούν τα φυτά, μέρη των οποίων (σπέρματα, καρποί, φλοιοί, άνθη, ρίζες) χρησιμοποιούνται για τον αρωματισμό του ούζου και ορισμένων από τα ποτά τύπου ανίς. Γλυκάνισος ή κοινό άνισο (Pimpinella anisuml.) Όλο το φυτό περιέχει αρωματικά μέρη. Στους σπόρους του γλυκάνισου υπάρχει 2-6% άχρωμο αιθέριο έλαιο, το οποίο περιέχει μέχρι 90% ανηθόλη και εστραγόλη (μεθυλοχαβικόλη). Οι σπόροι περιέχουν 30% περίπου λιπαρά έλαια και χολίνη. Στην ελληνική χλωρίδα απαντώνται έξι είδη ανίσου, ενώ υπάρχουν αναφορές για την καλλιέργειά του από την αρχαιότητα. Μάραθος ή φοινίκουλο το κοινό (Foeniculum vulgare) Το φυτό και ιδιαίτερα οι σπόροι του περιέχουν αιθέριο έλαιο (~5%) που αποτελείται 50-60% από ανηθόλη και 20% περίπου φενχόνη, η οποία έχει πικρή και δριμεία γεύση, καθώς και δέκα ακόμη περίπου ενώσεις σε αξιόλογες ποσότητες. Σημαντικό πλεονέκτημα του μάραθου, έναντι του γλυκάνισου, είναι η φτηνότερη τιμή του, εξαιτίας της χαμηλότερης περιεκτικότητας ανηθόλης στο αιθέριο έλαιο που αποστάζει. Αστεροειδές άνισο ή θέλκτρον (Illicum verum) Ο αρωματικός καρπός του χρησιμοποιείται για την παραγωγή αιθέριου ελαίου με απόσταξη, παρεμφερούς του ανισέλαιου, που περιέχει 90-95% ανηθόλη. Περιέχει επίσης α-πινένιο, β-φελλανδρένιο, μεθυλοχαβικόλη, μεθυλαιθέρα της υδροκινόνης και πιθανόν σαφρόλη και ανισαλδεΰδη. Το αιθέριο έλαιο του αστεροειδούς είναι ένα υγρό το οποίο εξαιτίας της μεγάλης περιεκτικότητας του σε ανηθόλη πήζει σε σχετικά υψηλή θερμοκρασία. Είναι άχρωμο ή λίγο κίτρινο. Έχει τη χαρακτηριστική οσμή της ανηθόλης και η γεύση του είναι γλυκιά. Η καθαρότητα του ελέγχεται με τη βοήθεια του ειδικού βάρους, της στροφικής ικανότητας, του σημείου τήξης και με την βοήθεια αέριας χρωματογραφίας. 11

29 Κορίανδρος ο εδώδιμος ή κόλιαντρο (CoriandrumsativumL) Το αιθέριο έλαιο του κορίανδρου περιέχει ως και 70% d-λιναλοόλη, καθώς και γερανιόλη, βορνεόλη και τερπένια. Μαστίχα (Pistacialentiscus Chia) Η ενδημική ποικιλία της Χίου παρέχει μαστίχα εξαιρετικής ποιότητας, η οποία και καλλιεργείται συστηματικά. Η ρητίνη περιέχεται στο φλοιό και όχι στο ξύλο, έτσι η συλλογή της γίνεται χαράσσοντας πολλές κατακόρυφες τομές στο βλαστό και στα μεγαλύτερα κλαδιά. Κάρδαμο ή κακουλές (Elettaria cardamomum) Το αιθέριο έλαιο του φυτού περιέχει μεταξύ άλλων ένα γλυκοζίδιο (γλυκοτροπαιολίνη) το οποίο μετά από υδρόλυση σχηματίζει ισοθειοκυανικό βενζύλιο, το οποίο έχει αντιβιοτική δράση. Μοσχοκάρυδο (Myristikafragrane) Ο σπόρος περιέχει 40% λιπίδια (βούτυρο μοσχοκάρυδου) και 10% περίπου αιθέριο έλαιο, το οποίο περιέχει τις αλκοόλες ευγενόλη, σαφρόλη και ένα τοξικό βενζολικό παράγωγο, τη μυριστικίνη. Η σάρκα του καρπού είναι πλουσιότερη σε αιθέριο έλαιο, αλλά φτωχή σε βούτυρο. Κιννάμωμον ή κανέλα (Cinnamomum) Το αιθέριο έλαιο το οποίο περιέχει η κανέλλα είναι έντονα αρωματικό, πλούσιο σε κινναμωμική αλδεΰδη. Δεν περιέχεται μόνο μέσα στο φλοιό, αλλά και στα φύλλα, που έχουν έντονη οσμή ευγενόλης. Οι πολύ καλής ποιότητας φλοιοί αναδύουν την οσμή της 2-επτανόνης, η οποία προσδίδει την αίσθηση της νωπότητας [15-17]. 12

30 Σχήμα : Σκελετικές δομές των ενώσεων: (α) Κινναμωμική αλδεΰδη (β)trans-ανηθόλη (γ) ευγενόλη (δ) εστραγόλη Παραγωγική διαδικασία ούζου Η παρασκευή του ούζου πριν την ίδρυση οργανωμένων οινοπνευματοποιείων για την παραγωγή καθαρού οινοπνεύματος γεωργικής προέλευσης γινόταν από ζυμωθέντα στέμφυλα σε μικρούς άμβυκες με δύο, συνήθως, αποστάξεις. Με την πρώτη απόσταξη παραγόταν ένα φλέγμα (ή σούμα ή χάμικο ή γράπα) 20-30% vol., αρωματισμένο ή μη, και με τη δεύτερη γινόταν το τελικό ποτό, ο ανακαθαρισμός και ο αρωματισμός του με απομάκρυνση των ανεπιθύμητων κλασμάτων και επαναπόσταξή τους, συνήθως με την πρώτη ύλη ή και με το φλέγμα, ορισμένες φορές. Δεδομένου του χαμηλού αλκοολικού βαθμού της πρώτη ύλης, που αποτελούν τα ζυμωθέντα στέμφυλα και λόγω της μεγάλης επιβάρυνσης με μεθανόλη και ανώτερες αλκοόλες που αυτά συνήθως περιέχουν, η διπλή απόσταξη για την επίτευξη του τελικού αλκοολικού βαθμού και του ανακαθαρισμού είναι τεχνικά απαραίτητη [9,15]. 13

31 Αρχικά, το ούζο δεν ήταν τίποτε άλλο από ένα «μεταβρασμένο» ή «διπλοβρασμένο» τσίπουρο. Ο αρωματισμός του αποστάγματος στεμφύλων, όπως εικάζεται, αρχικά εφαρμόστηκε για να καλύπτει τις ελλείψεις στο αρωματικό δυναμικό της προς απόσταξη πρώτης ύλης. Η εξαιρετική ποιότητά του όμως αύξησε τη ζήτηση του έτσι ώστε τη δεκαετία του 1920, όταν μειώθηκε σημαντικά η παραγωγή σταφυλιών λόγω φυλλοξήρας, που πρόσβαλε τον ελληνικό αμπελώνα, αλλά και εξαιτίας των πολεμικών γεγονότων της περιόδου εκείνης οι ποτοποιοί άρχισαν να καταφεύγουν σε άλλες πρακτικές χρησιμοποιώντας για την απόσταξη καθαρή αλκοόλη. Με τον καιρό, όμως, αντικαταστάθηκε και η προσθήκη των ανισούχων φυτών ή σπόρων με εκχυλίσματα αιθερίων ελαίων (essens). Αφορμή και πάλι για τις νέες αυτές αλλαγές στην παραγωγή του ούζου αποτέλεσαν η αδυναμία ικανοποίησης των αυξημένων αναγκών σε ανισούχους σπόρους και, ενδεχομένως, η επιζητούμενη συμπίεση του κόστους παραγωγής του. Μάλιστα, ο αρωματισμός στις περιπτώσεις αυτές γινόταν χωρίς τη διαδικασία της απόσταξης αλλά απλά με ανάμιξη αλκοόλης και αιθέριων ελαίων (εν ψυχρώ μέθοδος) [5]. Στάδιο 1 ο : Η επιλογή των πρώτων υλών Σε αυτές ανήκουν τόσο η αλκοόλη γεωργικής προέλευσης που πρέπει να πληρεί τους κανονισμούς όσο και τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται για τον αρωματισμό του ούζου, είτε αυτό είναι άνισος (κοινώς γλυκάνισο) (Pimpinella anisum L.) ή αστεροειδής άνισος (Illicium verum Hook f.) ή μάραθος (Foeniculum vulgare Mill.), μαστίχα και άλλοι αρωματικοί σπόροι, φυτών ή φρούτων. Επίσης, στις πρώτες ύλες ανήκει και η ζάχαρη αλλά και πιθανά αιθέραια έλαια που μπορεί να χρησιμοποιηθούν. Καθοριστικό ρόλο στη δημιουργία του ούζου παίζει ο γλυκάνισος. Όταν το φυτό φτάσει στην τέλεια ωρίμανσή του, μαζεύεται, δένεται σε μικρά δεμάτια και ξηραίνεται στη σκιά προσεκτικά, ώστε να διατηρήσει το πράσινο χρώμα του. Ακολουθεί το δρυμώνισμα, μια χειρονακτική διαδικασία κατά την οποία με προσοχή γίνεται ο διαχωρισμός του καρπού από τα κοτσάνια, πάνω σε μια επικλινή μαρμάρινη πλάκα. Για την αποθήκευση του γλυκάνισου, η οποία γίνεται εξίσου προσεκτικά, χρησιμοποιούνται σακιά από φυτικές ίνες και λαμβάνονται όλα τα απαραίτητα μέτρα κατά της υγρασίας [15]. 14

32 Τέλος, αξίζει να αναφερθεί η πρακτική της δημοφιλούς μάρκας της Λέσβου (Πιτσιλαδής) όπου χρησιμοποιούν μια μοναδική και ασυνήθιστη τεχνική για να μεγιστοποιηθεί η εκχύλιση του αρώματος από τον άνισο: οι σπόροι γλυκάνισου αφήνονται να μουλιάσουν στη θάλασσα για 24 ώρες πριν από την απόσταξη! Σύμφωνα με τον διευθυντή ποιότητας αυτού του αποστακτηρίου, ο ρόλος του θαλασσινού νερού είναι διττός: πρώτον, οι σπόροι μουσκεύονται και η απόδοση της εκχύλισης του αρώματος κατά την επακόλουθη απόσταξη μεγιστοποιείται. Δεύτερον, οι σπόροι απορροφούν το θαλασσινό αλάτι και αυτό βελτιώνει την συνολική γεύση του αποστάγματος [1]. Στάδιο 2 ο : Διαδοχικές αποστάξεις Αρχικά, τοποθετείται στον άμβυκα καθαρή αιθανόλη και μετά νερό. Ακολούθως, προστίθενται σπόροι και άλλες αρωματικές πρώτες ύλες. Αν προστεθεί μαστίχα, αυτή καθώς θερμαίνεται γίνεται ημίρρευστη και ρέει προς τον πυθμένα και για αυτό το λόγο πρέπει να διαλύεται σε μικρή ποσότητα αλκοόλης. Πριν την απόσταξη μπορεί να γίνει εκχύλιση των σπόρων για μερικές ώρες σε αλκοόλη. Κατόπιν οι άμβυκες σφραγίζονται, και ξεκινά η απόσταξη με ατμό που παράγεται από ατμολέβητα. Η θέρμανση αρχικά είναι έντονη, ενώ στη συνέχεια μειώνεται η παροχή ατμού, όταν η θερμοκρασία του υγρού φτάσει στους 60 C. Η απόσταξη αρχίζει στους 80 C. Το "μυστικό" της αποστακτικής διαδικασίας είναι τα σημεία που πρέπει να γίνει ο διαχωρισμός του αποστάγματος σε τρία κλάσματα (κοψίματα). Το πρώτο κλάσμα που λαμβάνεται λέγεται κεφαλή, το δεύτερο καρδιά και το τρίτο ουρά. Στο πρώτο περιέχονται ουσίες που θεωρούνται ανεπιθύμητες στο απόσταγμα και είναι είτε τα πολύ πτητικά συστατικά, τα οποία διαφεύγουν πρώτα, καθώς το προς απόσταξη υγρό μεταφέρεται στον άμβυκα, είτε τα λιγότερο πτητικά συστατικά που απομένουν από προηγούμενες αποστάξεις. Τα κοψίματα γίνονται κανονικά με βάση τον αλκοολικό τίτλο (δηλαδή το πρώτο περίπου στους 80% vol., το δεύτερο στους 30% vol. και το τρίτο στους 6-4% vol.), αν και η εμπειρία έχει δείξει ότι μπορεί να γίνονται είτε βάσει της χρονικής διάρκειας της απόσταξης, είτε βάσει της ποσότητας του αποστάγματος. 15

33 Οι πρώτες ποσότητες αποστάγματος συλλέγονται χωριστά και αποτελούν, όπως ήδη αναφέρθηκε τις κεφάλες. Στη συνέχεια παραλαμβάνεται η καρδιά του αποστάγματος, που αποτελεί και το κομμάτι που θα δώσει τελικά το ούζο, και η απόσταξη συνεχίζεται με σκοπό να παραληφθεί όλη η αλκοόλη που βρίσκεται ακόμα στον άμβυκα. Από κάποιο σημείο της αποστακτικής διαδικασίας και μετά (κάτω από 40% vol.), το εξερχόμενο απόσταγμα αποκτά μια γαλακτώδη χροιά, λόγω μη διαλυτοποίησης της ανηθόλης, καθώς μειώνεται σταδιακά ο αλκοολικός βαθμός. Παραλαμβάνεται έτσι το τρίτο κλάσμα του αποστάγματος, η ουρά. Όταν ο αλκοολικός βαθμός είναι μικρότερος από 5% vol. η συνέχιση της απόσταξης, πέρα από το σημείο αυτό, καθίσταται αντιοικονομική. Η απόσταξη διαρκεί συνολικά 10 περίπου ώρες. Διαδοχικά ακολουθούν τρεις αποστάξεις αλλά αυτό εξαρτάται από τον κάθε αποσταγματοποιό, αν και η συνέχιση της απόσταξης είναι αντιοικονομική. Περαιτέρω ο άμβυκας αδειάζεται και πλένεται σχολαστικά, ώστε να δεχτεί το επόμενο προς απόσταξη υγρό. Ο άμβυκας συνήθως διαθέτει πλέγμα που εμποδίζει τους σπόρους να έρθουν σε επαφή με τη σερπαντίνα θέρμανσης ή τον πυθμένα, αν η θέρμανση γίνεται με γυμνή φλόγα. Όταν δεν υπάρχει πλέγμα, τα αρωματικά σπόρια τοποθετούνται σε σάκους. Ο άμβυκας πρέπει να διατηρείται σε απόλυτα καθαρή κατάσταση. Η σταδιακή εναπόθεση υπολειμμάτων σπόρων και η υπερθέρμανση αυτών δημιουργεί ενώσεις, οι οποίες αν μεταφερθούν στο απόσταγμα προσδίδουν δυσάρεστη οσμή [5,9,10,15]. Τέλος, ο άμβυκας συνήθως θερμαίνεται έμμεσα με ατμό που κυκλοφορεί μέσα σε ένα χάλκινο θερμαντικό σπείρωμα (σερπαντίνα) που βρίσκεται λίγα εκατοστά πάνω από τον πυθμένα. Τα συμπυκνώματα του ατμού επαναρρέουν προς το δοχείο από το οποίο τροφοδοτείται με αποσκληρυμένο νερό, ο ατμολέβητας. Επίσης είναι δυνατόν να θερμαίνεται απ ευθείας με γυμνή φλόγα που προέρχεται από την καύση υγραερίου [18]. Οι κεφάλες και ιδιαίτερα οι ουρές, οι οποίες έχουν τα πιο βαριά αρωματικά συστατικά και οσμές καμένου, συνήθως αναμιγνύονται και επαναποστάζονται. Η απόσταξη αυτή, στην οποία φυσικά δεν προστίθενται αρωματικοί σπόροι, μπορεί να γίνει με την ίδια τεχνική. Με τον τρόπο αυτό προκύπτει ένα 16

34 απόσταγμα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στην παραγωγή ενός ούζου κατώτερης ποιότητας. Οι κεφαλές και οι ουρές που προκύπτουν από μια τέτοια απόσταξη δε χρησιμοποιούνται για νέα απόσταξη. Το διάλυμα νερού-αιθανόλης (υδραλκοολικό) που χρησιμοποιείται για την απόσταξη είναι 40-60% vol., ώστε να έχει τη μεγαλύτερη ικανότητα εκχύλισης. Η χρησιμοποίηση μόνο νερού στον άμβυκα θα οδηγούσε σε παραλαβή υδατικού συμπυκνώματος, στο οποίο λόγω διαχωρισμού στοιβάδων αιθέριων ελαίων-νερού θα ήταν δύσκολη η ομογενοποίηση και η τμηματική του χρησιμοποίηση. Η χρήση καθαρής αιθανόλης 96% vol. θα είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική απώλεια μέρους αυτής που θα έμενε ως υπόλειμμα στον άμβυκα. Στην περίπτωση χρησιμοποίησης μικρότερων ποσοτήτων αρωματικών σπόρων ή σπόρων με μικρότερη περιεκτικότητα σε ανηθόλη, πρέπει να προστεθεί κατά τη διάρκεια της τελικής ανάμιξης για την παρασκευή ούζου συμπληρωματική ποσότητα φυσικού απεσταγμένου εκχυλίσματος ανηθόλης. Ακόμη και για τον ίδιο παραγωγό μπορεί να επέλθει διαφοροποίηση της ποιότητας, εξαιτίας της διαφοράς που εμφανίζουν οι αρωματικοί σπόροι. Ως αγροτικά προϊόντα παρουσιάζουν διαφορές τόσο ποιοτικές ανά ποικιλία και έτος αλλά και στην απόδοση παραγωγής. Μια αρκετά ικανοποιητική μέθοδος για την ποτοποιία που αφορά την παραλαβή αιθέριων ελαίων για τον αρωματισμό πέραν του 20% του αποστάγματος, το οποίο δεν έχει αρωματισθεί με απόσταξη, ή για βελτίωση του προϊόντος αναφέρεται ως Ταχεία Υδρο-Απόσταξη (T.Υ.Α.). Η μέθοδος βασίζεται στην παραλαβή των αρωματικών ουσιών με ατμό και παρουσιάζει μεγάλη οικονομία καυσίμων και χρόνου. Χρησιμοποιείται πολύ για παρεμφερή ποτά εκτός Ελλάδος. Η απόσταξη διακόπτεται με βάση τον παραλαμβανόμενο όγκο ή με βάση την ένδειξη του αλκοολόμετρου [5,9,10,15]. Στάδιο 3 ο : Ο ποιοτικός έλεγχος Καθ όλη τη διάρκεια της παραγωγικής διαδικασίας, λαμβάνονται δείγματα του προϊόντος και ελέγχονται στο εργαστήριο ποιοτικού ελέγχου. Το εργαστήριο πρέπει να διαθέτει σύστημα αέριας χρωματογραφίας, έτσι ώστε ανά πάσα στιγμή να παρακολουθούνται οι αναλογίες των πρώτων υλών του προϊόντος. Με το σύστημα αυτό ελέγχεται η ποιότητα του αποστάγματος και των πρώτων υλών που το απαρτίζουν. Ακόμη γίνονται έλεγχοι μέτρησης σκληρότητας 17

35 νερού, αλκοολικού βαθμού, έλεγχος κατά την εισαγωγή των πρώτων υλών, όπως ποιότητα οινοπνεύματος, απόδοση γλυκάνισου, ποιότητα ζάχαρης και ελαίων, όπως το μαστιχέλαιο κ.λπ.[18]. Στάδιο 4 ο : Συλλογή καρδιάς & καταλάγιασμα απoστάγματος Το αδόλωτο, όπως ονομάζεται το κεντρικό κλάσμα, που αποτελεί το τέλειο απόσταγμα της τελευταίας φάσης της διαδικασίας, αποθηκεύεται σε μεγάλες ανοξείδωτες δεξαμενές για να καταλαγιάσει, να ζευγαρώσουν τα υλικά της συνταγής και να γίνουν ένα ομοιογενές μίγμα. Το απόσταγμα (79-80% abv) αφήνεται να «ηρεμήσει» για ημέρες [1,19]. Στάδιο 5 ο : Ο τελικός ποιοτικός έλεγχος του ούζου Στις δεξαμενές αυτές μετριέται ο όγκος του, η θερμοκρασία και ο αλκοολικός του βαθμός, προϋποθέσεις απαραίτητες για την μετέπειτα αραίωσή του [18]. Στάδιο 6 ο : Αραίωση& Ανάμιξη Προστίθεται νερό για να μειωθεί η περιεκτικότητα σε αλκοόλ στους 37,5-45% abv. Η ρύθμιση ή αραίωση γίνεται με προσθήκη αποσκληρυμένου ή απιονισμένου νερού προκειμένου να περιορισθεί ο σχηματισμός θολωμάτων ή ιζημάτων. Το νερό παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στον τελικό χαρακτήρα του προϊόντος καθώς επηρεάζει τη γεύση και το άρωμα του ούζου. Η σειρά προσθήκης των διαφόρων συστατικών κατά την τελική ανάμιξη είναι καθορισμένη και έχει άμεση σχέση με τη σχετική πολικότητα των ενώσεων που πρόκειται να αναμιχθούν. Οι μη πολικές ενώσεις διαλύονται σε μη πολικούς διαλύτες και έτσι η ανηθόλη, ως μη πολική ένωση, διαλύεται σε αιθανόλη. Η ανηθόλη λοιπόν που περιέχει το ούζο, ως αδιάλυτη στο νερό, προκαλεί το γνωστό γαλάκτωμα με την προσθήκη νερού στο ούζο. Στην περίπτωση που δεν χρησιμοποιείται αποκλειστικά απόσταγμα, η τελική ανάμιξη για την παρασκευή του ούζου αρχίζει με την προσθήκη προϋπολογισμένων ποσοτήτων ανηθόλης (φυσικού απεσταγμένου εκχυλίσματος) σε αιθυλική αλκοόλη ποτοποιίας και έπειτα ανάμιξη με το απόσταγμα. 18

36 Σχήμα : Διάγραμμα ροής παραγωγής ούζου. Παράλληλα γίνεται διάλυση της επιθυμητής ποσότητας ζάχαρης σε νερό, ώστε να επιτευχθεί ο ακριβής, επιθυμητός, τελικός αλκοολικός τίτλος. Ο υψηλός αλκοολικός τίτλος είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ενσωμάτωση του πλούσιου αρώματος του ούζου. Η πιο συνηθισμένη περιεκτικότητα σε ζάχαρη είναι τα 20 g/l, ενώ ορισμένα ούζα δεν έχουν καθόλου ζάχαρη. Το σύνολο αναμιγνύεται καλά με τη βοήθεια αναμικτήρα ή αντλίας. Από την τελική ανάμιξη μέχρι την εμφιάλωση μπορεί να μεσολαβήσει μικρό χρονικό διάστημα, έως και ένας μήνας. Έχει σκοπό την ωρίμανση και τη σταθεροποίηση του ούζου, δηλαδή την οριστική διαμόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του προϊόντος πριν αυτό δοθεί στην κατανάλωση. Πρέπει να σημειωθεί ότι το ούζο είναι ένα αλκοολούχο ποτό που δεν μπορεί να υποστεί παλαίωση εξαιτίας της οξείδωσης που υφίσταται η ανηθόλη με την πάροδο του χρόνου. Η έκθεση επίσης στο φως έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση δυσάρεστου αρώματος [1,4,5]. Στάδιο 7 ο : Η εμφιάλωση και η συσκευασία Στην διαδικασία της εμφιάλωσης, το τελικό πια προϊόν φιλτράρεται από ανοξείδωτο φίλτρο και διοχετεύεται στο σύστημα εμφιάλωσης, σφράγισης και επισήμανση των φιαλών [20]. 19

37 Εικόνα : Αποστακτική συσκευή. 1.4 Σύσταση ούζου Τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των αποσταγμάτων οφείλονται σε συστατικά όπως τα λιπαρά οξέα, οι εστέρες των λιπαρών οξέων, οι καρβονυλικές ενώσεις, οι αζωτούχες ενώσεις, οι λακτόνες. Η διαφορετική περιεκτικότητα των ενώσεων σε κάθε ανισούχο ποτό χαρίζει τον ιδιαίτερο χαρακτήρα σε καθένα από αυτά. i. Το νερό Το νερό είναι το συστατικό που περιέχεται συνήθως σε μεγαλύτερη ποσότητα στα οινοπνευματώδη ποτά, κάτι που συμβαίνει και στο ούζο. Προστίθεται στον άμβυκα πριν την απόσταξη αλλά και μετά από αυτή κατά την αραίωση του αποστάγματος στον επιθυμητό αλκοολικό βαθμό [5]. ii. Η αιθυλική αλκοόλη ή αιθανόλη ή οινόπνευμα Είναι το κύριο προϊόν της ζύμωσης των σακχάρων από τους ζυμομύκητες κατά τη διεργασία της αλκοολικής ζύμωσης. Η αιθυλική αλκοόλη είναι το συστατικό, που μετά το νερό, περιέχεται σε μεγαλύτερη αναλογία στα αποστάγματα. Η περιεκτικότητά της, % κατ όγκον στους 20 C, αποτελεί τον αλκοολικό τίτλο. Στην καθαρή της μορφή η αιθυλική αλκοόλη είναι υγρό διαυγές, άχρωμο, εύφλεκτο, υδατοδιαλυτό και διαλύει οργανικά οξέα, αιθέρια έλαια και εστέρες [5]. 20

38 iii. Η μεθυλική αλκοόλη ή μεθανόλη Η μεθανόλη βρίσκεται συνήθως στα αποστάγματα σε υψηλότερο ποσοστό σε σχέση με τον οίνο και αποτελεί μία ουσία με ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι είναι εξαιρετικά τοξική. Είναι ένα άχρωμο υγρό σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με ήπια ή ουδέτερη οσμή. Η μεθανόλη διαλύεται στο νερό, στους αιθέρες αλλά και στις αλκοόλες. Οξειδώνεται πολύ πιο αργά στο σώμα απ ότι η αιθανόλη, ακόμα και μετά από δυο μέρες, το ένα τρίτο της ποσότητας που είχε καταναλωθεί παραμένει στο σώμα. Συγκεντρώνεται στους ιστούς με τη μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε νερό, καταστρέφει το οπτικό νεύρο του οφθαλμού προκαλώντας τύφλωση και σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις προκαλεί θάνατο. Λόγω της τοξικότητάς της έχει καθορισθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση ανώτατο όριο μεθανόλης στην αλκοόλη γεωργικής προέλευσης, που είναι τα 30 g/hl άνυδρης αλκοόλης (ΑΑ) (Ε.Κ. 110/2008) [5,21,22]. Η παράνομη παραγωγή αλκοόλης παραμένει βασικό πρόβλημα παγκοσμίως. Η δηλητηρίαση από μεθανόλη κυρίως προκαλείται λόγω του ότι η μεθανόλη χρησιμοποιείται στην παραγωγή αλκοόλης μαϊμου αντί αιθυλικής αλκοόλης ή από κατανάλωση ποτών με μεθανόλη. Σύμφωνα με μια μελέτη του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (2009), τα παράνομα ποτά καταλαμβάνουν περίπου το 30% της παγκόσμιας κατανάλωσης αλκοόλ [21-26]. Η μεθανόλη σχηματίζεται κατά την ενζυματική υδρόλυση των πηκτινών που υπάρχουν σε όλους τους φυτικούς ιστούς και ιδιαίτερα στα ώριμα φρούτα (γι αυτό το λόγο για την παραγωγή του ούζου προτιμάται αλκοόλη από μελάσσα και όχι από σταφύλι). Για τη λήψη αποσταγμάτων με μειωμένα ποσοστά μεθανόλης, θα πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στην όσο το δυνατό μεγαλύτερη παρεμπόδιση της μόλυνσης των ζυμώμενων στεμφύλων από μύκητες ή βακτήρια, τα οποία μπορούν να μεταφέρουν πηκτινεστεράση στα στέμφυλα, το ένζυμο δηλαδή που μετατρέπει την πηκτίνη σε μεθανόλη. Η τοξικότητά της προκαλείται από τους μεταβολίτες της παρά από την ίδια τη μεθανόλη. Πρώτα μετατρέπεται σε φορμαλδεΰδη. Έπειτα η φορμαλδεΰδη, ταχύτατα μετατρέπεται σε φορμικό οξύ, το οποίο είναι το κυρίως υπεύθυνο για την τοξικότητα [5,21,23]. Τέλος, η μεθανόλη είναι πολύ υδατοδιαλυτή με αποτέλεσμα να αφομοιώνεται σχεδόν πλήρως στο νερό και να αποστάζεται μαζί με αυτό, μετά την αιθυλική αλκοόλη. Η ιδιότητά της να αποστάζει σε 21

39 μεγαλύτερη αναλογία με τους τελευταίους αλκοολικούς βαθμούς την κάνει να θεωρείται προϊόν «ουράς» [5,21]. Σχήμα 1.4.1:Μεταβολισμός μεθανόλης. iv. Τα οξέα Το ούζο περιέχει μεγάλο αριθμό οξέων, τα οποία συμμετέχουν σημαντικά στο αρωματικό δυναμικό του. Τα οξέα των αποσταγμάτων, τα οποία στην πλειονότητά τους είναι πτητικά, σχηματίζονται ως δευτερογενή προϊόντα κατά την αλκοολική και μηλογαλακτική ζύμωση. Με τον όρο πτητικά οξέα αναφέρονται γενικά τα οξέα που μπορούν να συναποσταχθούν με την αλκοόλη και το νερό και να συλλεχθούν στα αποστάγματα. Το οξικό οξύ (CH3COOH) περιέχεται στη μεγαλύτερη αναλογία, ενώ τα λιπαρά οξέα βραχείας αλυσίδας, όπως: προπιονικό, βουτυρικό, ισοβουτυρικό, ισοβαλεριανικό, βρίσκονται σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις. Τα λιπαρά οξέα μακράς αλυσίδας με 6 έως 18 άτομα άνθρακα, έχουν υψηλότερες συγκεντρώσεις στο τσίπουρο, αλλά έχουν λιγότερο δυνατό άρωμα και απλώς αυξάνουν την οξύτητα του αποστάγματος. Η συγκέντρωση των πτητικών οξέων που περιέχονται στο ούζο εξαρτάται από το είδος της αλκοόλης γεωργικής προέλευσης, την υγιεινή κατάσταση των πρώτων υλών από τις οποίες παράχθηκε η αλκοόλη, αλλά και από την τεχνική της απόσταξης [5]. v. Ανώτερες Αλκοόλες Οι ανώτερες αλκοόλες παρουσιάζουν σημαντικό ενδιαφέρον στα αποστάγματα και οι συγκεντρώσεις τους σ αυτά έχουν μεγάλη σημασία, διότι κυρίως τα οργανοληπτικά τους χαρακτηριστικά, θετικά ή αρνητικά, επηρεάζουν κατά πολύ την ποιότητα των αποσταγμάτων. Με τον όρο ανώτερες αλκοόλες, αναφερόμαστε στις μονοαλκοόλες που περιέχουν περισσότερα από δύο άτομα άνθρακα. Αποτελούν γενικά άχρωμα υγρά με περιορισμένη διαλυτότητα στο νερό. Μίγμα ανώτερων αλκοολών αποτελούν τα ζυμέλαια ή αμυλέλαια εξαιτίας της μεγάλης περιεκτικότητάς τους σε 22

40 αμυλικές αλκοόλες. Μαζί με τους εστέρες αποτελούν τους βασικούς παράγοντες διαμόρφωσης του αρώματος και του μπουκέτου του αποστάγματος. Παρόλα αυτά, οι ανώτερες αλκοόλες σε μεγάλες ποσότητες πάνω από mg/l, είναι ανεπιθύμητες. Είναι συστατικά ελαφρώς τοξικά αλλά οι περιεκτικότητες στις οποίες απαντούν στα αποστάγματα είναι μικρές και ακίνδυνες [5,27]. Πίνακας 1.4.1: Περιεκτικότητα σε ανώτερες αλκοόλες (g/hl ΑΑ) σε δείγματα ούζου. Χημικές Ενώσεις Συγκεντρώσεις στο ούζο 1-προπανόλη Ίχνη έως 38,9 2-μεθυλο-1-προπανόλη - 2-μεθυλο-1-βουτανόλη - 3-μεθυλο-1-βουτανόλη 1-εξανόλη Ίχνη Ίχνη 2-φαινυλο-αιθανόλη Ίχνη έως 0,5 vi. Εστέρες Οι εστέρες ανήκουν στην ομάδα των πτητικών συστατικών στα οποία οφείλεται το ευχάριστο και ιδιαίτερο άρωμα τόσο των οίνων όσο και των αποσταγμάτων. Παράγονται κατά την αλκοολική ζύμωση ως δευτερογενή προϊόντα του μεταβολισμού των σακχάρων. Οι εστέρες που υπάρχουν στο ούζο και συμβάλλουν σημαντικά στο άρωμά του είναι οι αιθυλεστέρες των οξέων: βαλεριανικό, καπροϊκό, οινανθικό, καπρυλικό, καπρικό, λαυρικό, παλμιτικό, οι αμυλεστέρες των οξέων: οξικό, βαλεριανικό και οι ισοαμυλεστέρες των οξέων: οξικό και καπρικό. Η τεχνική της απόσταξης διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην παρουσία των εστέρων στο απόσταγμα. Ο οξικός αιθυλεστέρας έχει δυσάρεστη οσμή, ενώ ο γαλακτικός έχει ουδέτερη γεύση σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Οι αιθυλεστέρες των οξέων καπρονικού, 23

41 καπρυλικού, καπρινικού και λαυρικού δίνουν ευχάριστο άρωμα και συντελούν στην αναβάθμιση της ποιότητας του αποστάγματος [5]. vii. Αλδεΰδες Οι αλδεΰδες είναι καρβονυλικές ενώσεις, που παρουσιάζονται ως δευτερογενή προϊόντα της αλκοολικής ζύμωσης. Σχηματίζονται κατά τη διάρκεια της απόσταξης και περνούν στο απόσταγμα, κυρίως ως προϊόντα «κεφαλής» λόγω των χαμηλών σημείων ζέσης τους [5]. Η φουρφουράλη Η φουρφουράλη είναι μια αλδεΰδη με δακτύλιο φουρανίου και σχηματίζεται κυρίως κατά τη διάρκεια της απόσταξης (καθ όλη τη διάρκεια) από την αφυδάτωση ορισμένων μη ζυμώσιμων σακχάρων, των πεντοζών, που προκαλείται από τη θέρμανση σε όξινο περιβάλλον. Μάλιστα επειδή μεγάλο ποσοστό από μη ζυμώσιμες πεντόζες περιέχεται στο εσωτερικό των ραγών είναι γεγονός πως η φουρφουράλη απαντά σε πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις στα αποστάγματα στεμφύλων συγκριτικά με τα αποστάγματα οίνου ή μελάσσας. Σχήμα 1.4.2: Μηχανισμός αφυδάτωση ξυλόζης μέσω ενολοποίησης προς παραγωγή φουρφουράλης. 24

42 Η φουρφουράλη είναι υγρή και άχρωμη και μετατρέπεται σε καστανή όταν έρχεται σε επαφή με τον ατμοσφαιρικό αέρα. Η οσμή της θυμίζει πικραμύγδαλο και κανέλλα αλλά σε υψηλές συγκεντρώσεις πέραν της τοξικότητάς της, έχει δυσμενή επίδραση στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του αποστάγματος. Η υψηλή συγκέντρωση της αποτελεί ακόμη, δείκτη υπερθέρμανσης της πρώτης ύλης κατά την απόσταξη [5,28,29]. Η ακεταλδεΰδη Από τις αλδεΰδες σε μεγαλύτερη αναλογία στα αποστάγματα βρίσκεται η ακεταλδεΰδη, που αποστάζει στα πρώτα λεπτά της απόσταξης. Έτσι, λογίζεται ως ουσία «κεφαλής» πράγμα που οφείλεται στο πολύ χαμηλό σημείο ζέσεως που παρουσιάζει, προσδίδοντας μια γεύση κομμένης άψητης πατάτας. Λόγω της δριμείας γεύσης της, η ακεταλδεΰδη δίνει στο ποτό οξύ άρωμα, αν και συνήθως η οσμή της καλύπτεται από αυτή των αμυλικών αλκοολών. Η ύπαρξη μεγάλων συγκεντρώσεων αλδεϋδών στα αποστάγματα θεωρείται ως ένδειξη οξείδωσης ή ανεπιθύμητης μόλυνσης από βακτήρια [5]. Η ακεταλδεΰδη έχει χαρακτηρισθεί ως "πιθανώς καρκινογόνος ουσία" για τους ανθρώπους. H Διεθνής Υπηρεσία Ερευνών για τον Καρκίνο (IARC: International Agency for Research on Cancer) ταξινομεί την ακεταλδεΰδη στην ομάδα 2B: "Ανεπαρκείς ενδείξεις για την καρκινογένεση από ακεταλδεΰδη στους ανθρώπους, αλλά αρκετές ενδείξεις για καρκινογένεση σε πειραματόζωα" [30]. Ο Ε.Κ. 110/2008 αναφέρει πως τα όρια της ακεταλδεΰδης στην αλκοόλη γεωργικής προέλευσης είναι 0,5 g/hl άνυδρης αλκοόλης. Είναι εξαιρετικά δραστική και λόγω των ισχυρών ηλεκτρονιόφιλων ιδιοτήτων της, συνδέεται άμεσα με πρωτεΐνες και μεμονωμένα πεπτίδια αμινοξέων με αποτέλεσμα την ανώμαλη μυική ανάπτυξη, αλλά και με το DNA. Έχει αναφερθεί ότι η ακεταλδεΰδη σε πειράματα που έγιναν σε ποντίκια, μπορεί να αντιδράσει με το DNA και να προκαλέσει περαιτέρω βιολογικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της μεταλλαξογένεσης και της καρκινογένεσης. Σε μελέτες εισπνοής που χρησιμοποιήθηκαν πειραματόζωα έδειξε ότι είναι ικανή να επάγει καρκινώματα. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι είναι αναγκαία η γνώση των επιπτώσεων της χρόνιας έκθεσης σε ακεταλδεΰδη μέσω της κατάποσης, επειδή υπάρχει σε ένα μεγάλο αριθμό τροφίμων και ποτών [3,5,22,30,31]. 25

43 Η ακεταλδεΰδη αποτελεί το πρώτο προϊόν του καταβολισμού της αιθανόλης και είναι η ουσία στην οποία οφείλονται όλα τα δυσμενή παροδικά και χρόνια προβλήματα της κατανάλωσης αλκοολούχων ποτών. Στο επόμενο σχήμα συνοψίζεται η μεταβολική πορεία της αλκοόλης, όπως και οι παράπλευρες βλάβες που μπορεί να προκληθούν. Σχήμα 1.4.3: Συνοπτικό διάγραμμα του μεταβολισμού (καταβολισμού) της αιθανόλης στον οργανισμό του ανθρώπου. Αν οι δύο προηγούμενοι μηχανισμοί δεν επαρκούν για την απομάκρυνση της ακεταλδεΰδης από τον οργανισμό, τότε εμφανίζονται όλα τα γνωστά δυσάρεστα αποτελέσματα που ακολουθούν μια υπερβολική κατανάλωση αλκοολούχων ποτών, που γενικά χαρακτηρίζονται ως hangover. Τα κύρια χαρακτηριστικά του hangover είναι γενική αδυναμία, κόπωση, πονοκέφαλοι, ναυτία, οξυθυμία, κακή διάθεση, διαταραχές ύπνου. Το hangover θα πρέπει να μην συγχέεται με την ίδια τη μέθη, τα συμπτώματα της οποίας οφείλονται στη δράση της ίδιας της αιθανόλης στο κεντρικό νευρικό σύστημα [30]. Οι ακετάλες Προέρχονται από την αντίδραση της ακεταλδεΰδης με την αιθανόλη. Ο σχηματισμός τους γίνεται σε δύο διαδοχικά στάδια. Στο πρώτο, η αλδεΰδη αντιδρά με ένα μόριο αλκοόλης και σχηματίζει μια ημιακετάλη. Στο δεύτερο, η ημιακετάλη αντιδρά με ένα επιπλέον μόριο αλκοόλης και σχηματίζει την ακετάλη. Ο σχηματισμός των ακετάλων μειώνει το ποσοστό των ελευθέρων αλδεϋδών στο απόσταγμα. Ταυτόχρονα με το σχηματισμό των ακετάλων βελτιώνεται και η δριμεία γεύση που προκαλείται από τις αλδεΰδες. Ο σχηματισμός των ακετάλων λαμβάνει χώρα στα αποστάγματα με μεγάλη ταχύτητα λόγω του υψηλού αλκοολικού βαθμού, αλλά επηρεάζεται επίσης και 26

44 από το ph, όπου το χαμηλό ph ευνοεί το σχηματισμό με μεγαλύτερη ταχύτητα [5,28]. Σχήμα 1.4.4: Σχηµατισµός 1,1-διαιθόξυ-αιθανίου (ακετάλης) µέσω αντίδρασης της ακεταλδεΰδης και της αιθυλικής αλκοόλης. viii. Αρωματικά συστατικά Η ανηθόλη, η ανισαλδεΰδη, η εστραγόλη, η ευγενόλη, οι ισοαμυλικές αλκοόλες, το λιμονένιο και η λιναλόλη, έχουν ταυτοποιηθεί σε αρκετές έρευνες ως σημαντικά συστατικά του αρώματος σε αποστάγματα με γλυκάνισο. Αναλυτική αναφορά θα γίνει στο υποκεφάλαιο Το άρωμα στα ανισούχα αποστάγματα Αρωματισμός Αποσταγμάτων Οι μεγάλες διαφορές στα ανισούχα ποτά οφείλονται κυρίως στην ποιότητα των αρωματικών φυτών και στο νερό. Η διαδικασία (απόσταξη, ανάμιξη, προσθήκη νερού) είναι μάλλον απλή χωρίς την προσθήκη διαφορετικών παραμέτρων που επηρεάζουν την ποιότητα (flavor ή γευσάρωμα) του τελικού προϊόντος. Η διαφοροποίηση προέρχεται κυρίως από τις διαφορές στην ποιότητα (γεύση, ωριμότητα, συνολικό γευσάρωμα) των αρωματικών βοτάνων και του γλυκάνισου που χρησιμοποιείται. Μια άλλη διαφοροποίηση είναι ότι για τα pastis χρησιμοποιείται αστεροειδής γλυκάνισος (Illicium verum), ενώ στο ούζο και στο τσίπουρο πράσινος γλυκάνισος (Pimpinella anisum). Η περιοχή καλλιέργειας και το κλίμα είναι επίσης παράμετροι που επηρεάζουν το γευσάρωμα που παράγεται από αυτά τα δύο φυτά, δηλαδή το μικροκλίμα της Γαλλίας ή του Λισβορίου της Λέσβου θα πρέπει να δώσουν διαφορετικά αποτυπώματα στα φάσματα και διαφορετικά επίπεδα αρωματικών μορίων που βιοσυντίθονται από τα φυτά. Σε γενικές γραμμές, 27

45 στην Ελλάδα, λόγω του ξηρού και θερμού κλίματος, ο δευτερογενής μεταβολισμός του φυτού (δηλαδή η βιοσύνθεση των αρωματικών ενώσεων) ευνοείται και αυτό οδηγεί σε φυτικά εκχυλίσματα (σε αυτή την περίπτωση των σπόρων) με πλουσιότερα και πιο σύνθετα γευσαρώματα. Στην περίπτωση του ούζου και του τσίπουρου, ο γλυκάνισος αποστάζεται με το μείγμα του αλκοόλ και τα άλλα συστατικά, ενώ στα παστίς, το απόσταγμα του γλυκάνισου αναμιγνύεται με τα υπόλοιπα συστατικά. Αυτό είναι μια άλλη τεχνική λεπτομέρεια που θα πρέπει, ως εκ τούτου, να θεωρηθεί ως μια σημαντική διαφοροποίηση [1]. Ένα από τα κριτήρια διαφοροποίησης των αποσταγμάτων αποτελεί η προέλευση των αρωματικών συστατικών τους και η τεχνική αρωματισμού τους, που διαχωρίζονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες τα αρωματισμένα αποστάγματα και τα μη αρωματισμένα αποστάγματα. I. Αρωματισμένα αποστάγματα Τα αρωματισμένα αποστάγματα καλούνται διαφορετικά και εξωγενώς αρωματισμένα, δεδομένου ότι ο αρωματισμός τους προέρχεται από την προσθήκη εξωγενών αρωματικών υλών. Ανάλογα με την τεχνική αρωματισμού διακρίνουμε τις ακόλουθες τρεις περιπτώσεις: 1) Στην πρώτη περίπτωση οι αρωματικές ύλες προστίθενται πριν την απόσταξη και συναποστάζουν μαζί με την αλκοόλη ή/και τα συναπόστακτα της πρώτης ύλης. Μερικές φορές, μάλιστα, για την απόκτηση περισσότερου αρώματος προηγείται και διαβροχή των σπόρων ή τμημάτων αρωματικών φυτών σε αλκοόλη. Με την τεχνική αυτή παράγονται τα αρωματισμένα με ανισούχα φυτά αποστάγματα,όπως είναι το τσίπουρο με γλύκανισο, το ούζο εξ ολοκλήρου από απόσταγμα, κ.ά. 2) Στη δεύτερη περίπτωση οι αρωματικές ύλες προστίθενται μετά από την απόσταξη υπό μορφή σπόρων και άλλων τμήματων του αρωματικού φυτού, οπότε το άρωμα τους παραλαμβάνεται από το απόσταγμα με εκχύλιση, είτε υπό μορφή αιθερίου ελαίου, του οποίου τα αρωματικά συστατικά διαλύονται στο απόσταγμα. Με τον τρόπο αυτό παρασκευάζονται τα διάφορα λικέρ, το pastis, κ.ά. 28

46 3) Η τρίτη περίπτωση αποτελεί συνδυασμό των δυο προηγούμενων περιπτώσεων. Οι πρωτογενείς αρωματικές ύλες προστίθενται πριν την απόσταξη για να συναποστάξουν μαζί με την αλκοόλη, ενώ τα συμπυκωμένα αρώματα προστίθενται μετά την απόσταξη. Με την τεχνική αυτή παράγεται το ούζο στις περιπτώσεις εκείνες όπου ένα μέρος, τουλάχιστον το 20%, της περιεχόμενης αλκοόλης αρωματίζεται με απόσταξη, ενώ το υπόλοιπο με διάλυση του αιθερίου ελαίου (essens) σ αυτή [5]. II. Μη αρωματισμένα αποστάγματα Στα μη αρωματισμένα αποστάγματα δεν προστίθεται καμμία αρωματική ουσία. Ο αρωματικός χαρακτήρας των αποσταγμάτων αυτών οφείλεται αποκλειστικά στο άρωμα των συναπόστακτων ουσιών που προέρχονται από την πρώτη ύλη και για το λόγο αυτό καλούνται «μη αρωματισμένα ή ενδογενώς αρωματισμένα» αποστάγματα. Τέτοια αλκοολούχα ποτά είναι το απόσταγμα οίνου και σταφύλης, η γκράππα, το τσίπουρο χωρίς γλυκάνισο, η τσικουδιά και άλλα αντίστοιχα αυτών [5] Αρωματικά συστατικά Η ανηθόλη, η ανισαλδεΰδη, η εστραγόλη και η ευγενόλη αποτελούν το μεγαλύτερο ποσοστό των αρωματικών συστατικών που προέρχονται από τον γλυκάνισο ή/και τα άλλα αρωματικά μέσα φυτικής προέλευσης (μάραθος, μοσχοκάρυδο, μαστίχα, γαρύφαλλο, κανέλλα, κ.ά.). Ανηθόλη Η ανηθόλη ή μεθυλαιθέρας της π-προπενυλο-φαινόλης αποτελεί την κυριότερη ουσία του αιθέριου ελαίου που προέρχεται από τους προστιθέμενους σπόρους του άνισου του κοινού ή κοινώς γλυκάνισου (Pimpinellaanisum), του μάραθου (Foeniculumvulgare) και του άνισου του αστεροειδούς (Illiciumverum). Βρίσκεται σε δυο γεωμετρικά ισομερείς μορφές τη cis και τη trans. Η trans-ανηθόλη καλύπτει το μεγαλύτερο ποσοστό των αρωματικών στοιχείων των κύριων φυσικών πηγών της ανηθόλης που αναφέρθηκαν και είναι τελείως αβλαβής για τον καταναλωτή. Αντίθετα, η cisανηθόλη περιέχεται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις και είναι σπάνιο να τη συναντήσουμε σε κάποια φυσική πηγή σε ποσοστό μεγαλύτερο από 0.5%. Η 29

47 cis-ανηθόλη παρουσιάζει μέχρι και 20 φορές μεγαλύτερη τοξικότητα από εκείνη της trans-ανηθόλης, για το λόγο αυτό απαγορεύεται η χρηση συνθετικής ανηθόλης στα ποτά [5,32]. Ανισαλδεΰδη Η ανισαλδεΰδη ή π-ανισαλδεΰδη αποτελεί το δεύτερο σε ποσότητα συστατικό μετά την trans-ανηθόλη, των ανισούχων εκχυλισμάτων και παράγεται σαν προϊόν οξείδωσης της ανηθόλης. Αποτελεί προϊόν κεφαλής στην απόσταξη [5]. Πίνακας : Το χαρακτηριστικό άρωμα διαφόρων ενώσεων. Ένωση Συντακτικός τύπος Άρωμα Λιναλόλη C10H18Ο λουλουδιού Λιμονένιο C10H16 λεμονιού Εστραγόλη C10H12O γλυκάνισου trans-ανηθόλη C10H12O γλυκάνισου π-ανισαλδεΰδη C8H8Ο2 Γλυκό/μιμόζα Ευγενόλη C10H12O2 Πικάντικο/γαρύφαλλο Εστραγόλη & Ευγενόλη Αποτέλεσμα της προσθήκης των ανισούχων φυτών ή των εκχυλισμάτων τους είναι και η παρουσία των συστατικών εστραγόλης και ευγενόλης. Τα δυο αυτά αρωματικά συστατικά μπορούν να προέρχονται επίσης από την κανέλλα και τα γαρύφαλλα αντίστοιχα, που μερικές φορές προστίθενται κατά την απόσταξη. Η ευγενόλη και η εστραγόλη αποτελούν ενώσεις ουράς του αποστάγματος [5]. Άλλες ενώσεις Στο ανισούχο εκχύλισμα, ανάλογα με το φυτό από το οποίο προέρχεται, περιλαμβάνονται και συστατικά σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις, όπως είναι το cis και trans α-περγαμοντένιο, μάλιστα το συστατικό αυτό χρησιμοποιείται ως 30

48 μάρτυρας για τη διάκριση της φυσικής ανηθόλης από την ημισυνθετική [5]. Επιπλέον έχουν βρεθεί χαμηλές συγκεντρώσεις από τις ακόλουθες ουσίες: λιμονένιο, λιναλόλη, α-πινένιο, β-πινένιο [1,32] Μέθοδοι ανάλυσεις του αρώματος Οι αρωματικές ενώσεις μπορούν να ανηκούν σε διαφορετικές χημικές ομάδες και να συναντόνται σε μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων. Οι δυσκολίες που συνήθως απαντούν κατά την ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των αρωματικών ενώσεων βασίζονται σ αυτές τις ιδιότητες. Άλλες δυσκολίες συνδέονται με την ταυτοποίηση των αρωματικών ενώσεων, την αποσαφήνιση της χημικής τους δομής και το χαρακτηρισμό των αισθητηριακών ιδιοτήτων τους. Για να προσδώσει άρωμα μια ουσία θα πρέπει να είναι αρκετά πτητική ώστε να ερεθίσει το οσφρητικό επιθήλιο. Οι κύριες παράμετροι, με βάση τις οποίες κατηγοριοποιούνται οι αρωματικές ενώσεις, είναι το σημείο βρασμού, η τάση ατμών, οι διαστάσεις, το σχήμα καθώς και η παρουσία τους στις λειτουργικές ομάδες. Τα περισσότερα μόρια με αρωματική σημαντικότητα έχουν μοριακό βάρος μικρότερο από 300. Ενώσεις μεγαλύτερου μοριακού βάρους, με δεδομένο ότι έχουν χαμηλή πτητικότητα και απουσιάζουν για αυτές υποδοχείς, αποκλείονται από το αντιληπτό οσφρητικό φάσμα. Οι πτητικές ενώσεις μπορούν να απομονώνονται από τα τρόφιμα με τη χρήση πολλών διαφορετικών μεθόδων διότι η κάθε μέθοδος έχει τα δικά της μειονεκτήματα, τα οποία μπορεί να καταλήξουν σε ποσοτικές αλλαγές στα φάσματα των αρωματικών ενώσεων. Οι αρωματικές ενώσεις που βρίσκονται στους ατμούς, στο χώρο πάνω από το τρόφιμο θα πρέπει να ανιχνεύονται με πολύ μεγάλη προσοχή με την ανάλυση υπερκείμενου χώρου (headspace analysis). Οι ποσότητες των ενώσεων που απομονώνονται με τη διαδικασία αυτή είναι τόσο μικρές που ακόμα και σημαντικές αρωματικές ενώσεις, που βρίσκονται στα τρόφιμα σε μικρές συγκεντρώσεις, δεν έχουν σήμα ανίχνευσης μετά το διαχωρισμό του δείγματος με αέρια χρωματογραφία. Συνήθως για τις μικροποσότητες αυτές χρειάζεται και συμπύκνωση. Οι διάφορες μέθοδοι απομόνωσης των πτητικών είναι οι ακόλουθες: Απόσταξη/Εκχύλιση (Distillation/extraction) 31

49 Εκχύλιση με αέριο (Gas extraction) Ανάλυση υπερκείμενου χώρου (Headspace analysis) Όσον αφορά τη δομή των αρωματικών συστατικών, η αποσαφήνισή τους έχει βρει στη φασματομετρία μαζών το απολύτως αναγκαίο εργαλείο. Οι ουσίες που εκλούονται από τον αέριο χρωματογράφο δίνουν ικανοποιητικά φάσματα. Εάν ωστόσο η βιβλιοθήκη έχει διαθέσιμο ένα συγκρίσιμο φάσμα, τότε η ταυτοποίησή τους βασίζεται στην αντιστοιχία της ένωσης με το φάσμα [33]. Στη συνέχεια θα γίνει ανάφορα σε κάποιες από τις εφαρμογές της αέριας χρωματογραφίας στη μελέτη του άρωματος των ανισούχων αλκοολούχων ποτών. Λόγω των πολυάριθμων πλεονεκτημάτων, όπως καλή διάκριση και υψηλή ευαισθησία, η GC γίνεται ολοένα και πιο δημοφιλής στην ανάλυση των δειγμάτων με σύνθετες μήτρες. Παρά το υψηλό κόστος και την ανάγκη να υπάρχει καλά Ε.Κ.Π.Α.ιδευμένο προσωπικό, η ανάπτυξη της αέριας χρωματογραφίας είναι ταχεία, όπως επιβεβαιώνεται και από πολυάριθμες δημοσιεύσεις. Προς το παρόν, οι επιστήμονες χρησιμοποιούν συχνότερα 2D αέρια χρωματογραφία, η οποία επιτρέπει την ταυτοποίηση εκατοντάδων ενώσεων. Με GC έχουν αναλύθεί τα ακόλουθα αλκοολούχα ποτά: βότκα, ουίσκι, κασάσα, τεκίλα, μεσκάλ, κονιάκ, μπράντυ, μηλίτης, ποτά από φυτά και φρούτα, ποτά με γλυκάνισο, τζιν, καλβάντος και λικέρ. Η πιο δημοφιλής μέθοδος εκχύλισης είναι η SPME λόγω της υψηλής ευαισθησίας της και του μικρού μεγέθους του εξοπλισμού, αλλά κυρίως λόγω του μικρού χρόνου που απαιτείται για την προετοιμασία του δείγματος πριν από την ανάλυση. Οι τεχνικές GC-MS και GC-FID είναι αυτές που εφαρμόζονται συχνότερα στην ανάλυση αλκοολούχων ποτών [34]. 32

50 Πίνακας : Έρευνες που έχουν πραγματοποιηθεί για την Ταυτοποίηση του αρωματικού προφίλ του ούζου με GC- MS ταυτοποίηση του αρώματος του ούζου. Έρευνα Μέθοδος Αποτελέσματα Πηγή Το κύριο αρωματικό 13 δείγματα ούζου συστατικό αναλύθηκαν και το βρέθηκε να είναι αρωματικό προφίλ τους trans-ανηθόλη, ταυτοποιήθηκε με τη ενώ οι τοξικές χρήση της βιβλιοθήκης ουσίες μεθανόλη NIST. και cis-ανηθόλη [35] ήταν απούσες Μελέτη των ελληνικών ανισούχων ποτών ούζο & τσίπουρο με GC-MS, οργανοληπτική εξέταση και επεξεργασία των αποτελεσμάτων με Χημειομετρία Χαρακτηρισμός ανισούχων ποτών με HS-SPME, GC- MS και Χημειομετρία Μελετήθηκαν 6 δείγματα ούζου και 3 δείγματα τσίπουρου (1 χωρίς γλυκάνισο) με GC αλλά και οργανοληπτικά (γεύση & άρωμα) από μια ομάδα 11 δοκιμάστών. Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν χημειομετρικά με PCA. 76 δείγματα διαφορετικών ανισούχων ποτών, 46 ανίς, 12 παστίς, 6 σαμπούκες και 12 ρακί, προετοιμάστηκαν με HS- SPME και αναλύθηκαν με GC MS για τον προσδιορισμό των πτητικών ενώσεων. Τα δεδομένα επεξεργάστηκαν χημειομετρικά με MLP. PCA: ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis) MLP: Πολυπαραγοντική Ανάλυση (multi-layer perception) Ικανοποιητική διάκριση και ταξινόμηση των δειγμάτων Βρέθηκαν περισσότερες από 40 πτητικές ενώσεις. Η transανηθόλη ( %), η cisανηθόλη ( %) και η εστραγόλη ( %) ήταν από τις κυριότερες ενώσεις. [36] [37] 33

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΑΥΘΕΝΤΙΚΟΤΗΤΑ 2.1 Η αυθεντικότητα στα αλκοολούχα ποτά Από τη στιγμή που ο άνθρωπος ξεκίνησε να πειραματίζεται με την καλλιέργεια φυτών αλλά και με την ανάπτυξη των τεχνικών της γενετικής μηχανικής, χιλιάδες είδη που προορίζονται για κατανάλωση έχουν εντατικά και εκτενώς αναπτυχθεί, μελετηθεί, μεταλλαχτεί, υβριδοποιηθεί, μπολιαστεί με στόχο την παραγωγή ενός εμπορικού προϊόντος με την επιθυμητή γεύση, εμφάνιση, άρωμα, λειτουργικότητα, σύσταση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή εκατοντάδων ποικιλιών για κάθε είδος ανά τον κόσμο. Αυτή η κατάσταση όμως επιφέρει ένα ευρύ φάσμα συνθέσεων και χαρακτηριστικών, τόσο ευρύ το οποίο είναι δύσκολο να καθοριστούν πρότυπα (standars) για την ποιότητα [38]. Το ζήτημα της αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών δεν είναι κάτι νέο. Για αιώνες, επιτήδιοι αγρότες και έμποροι προσπαθούσαν να ξεγελάσουν τους καταναλωτές με στόχο φυσικά το μεγαλύτερο κέρδος [39]. Τα υγρά τρόφιμα (συμπεριλαμβανομένων και των αλκοολούχων ποτών) διαδραματίζουν σηματικό ρόλο στην ανθρώπινη διατροφή. Ως εκ τούτου, έχει δοθεί μεγάλη προσοχή για την πιστοποίηση της ποιότητας και της ασφάλειας των υγρών τροφίμων. Επίσης, η ταξινόμηση των υγρών τροφίμων είναι πολύ σημαντική, για παράδειγμα, τα αλκοολούχα ποτά είναι συνήθως διαφορετικής ηλικίας και προέλευσης, και διάφορα γαλακτοκομικά προϊόντα και λάδια είναι από διαφορετικές πρώτες ύλες. Η νοθεία είναι άλλο ένα κύριο μέλημα στην παραγωγή και στο εμπόριο των υγρών τροφίμων, η οποία απαιτεί τη λήψη κατάλληλων ανιχνευτικών και αναλυτικών εργαλείων κατά τη διάρκεια της παραγωγής και της εμπορίας [40]. Η αυθεντικότητα ενός προϊόντος είναι συνυφασμένη με τη συμμόρφωση του προϊόντος ως προς ορισμένες προδιαγραφές, που προέρχονται κυρίως από τις ισχύουσες νομοθεσίες, τις ισχύουσες προδιαγραφές ποιότητας, τα χαρακτηριστικά παραγωγής του κ.ά. χαρακτηρίζοντας έτσι το προϊόν ως προς τη γεωγραφική του προέλευση, τις χρησιμοποιούμενες πρώτες ύλες, τη διαδικασία παραγωγής, κ.λπ. Ένα μη αυθεντικό προϊόν συνήθως περιέχει 34

52 διάφορα συστατικά ξένα ή συστατικά κατώτερης ποιότητας ή σε διαφορετικές αναλογίες [41]. Η προστασία των δικαιωμάτων των καταναλωτών και η πρόληψη της απάτης ή των δόλιων πρακτικών, όπως η νοθεία τροφίμων και ποτών, είναι από τα πιο δύσκολα θέματα που αντιμετωπίζει η βιομηχανία τροφίμων [42]. Η αυθεντικότητα των απεσταγμένων οινοπνευματωδών ποτών είναι ένας ιδιαίτερος τομέας, επειδή η σύνθεση των αποσταγμάτων έχει μια σημαντικά υψηλότερη διακύμανση από εκείνο της μπύρας ή κρασιού, αφού πολυάριθμες πρώτες ύλες επιτρέπονται για την παραγωγή αποσταγμάτων. Ως εκ τούτου, οι περισσότερες μέθοδοι επικύρωσης της αυθεντικότητας που έχουν διεξαχθεί αφορούν ορισμένους τύπους αλκοολούχων ποτών (όπως κονιάκ, ουίσκι,ή τεκίλα). Επιπλέον, πρέπει να αναφερθεί ότι οι περισσότερες από τις διαδικασίες για τα αποστάγματα είναι επιστημονικές μελέτες που διεξάγονται συνήθως με έναν περιορισμένο αριθμό δειγμάτων, και πέρα από την απόδειξη της αυθεντικότητας, δεν μελετάται κατά πόσο η συγκεκριμένη μέθοδος μπορεί να αποτελέσει ανάλυση ρουτίνας για την απόδειξη της αυθεντικότητας. Τέλος, για τα αποστάγματα δεν υπάρχουν τόσο ενημερωμένες βάσεις δεδομένων όσο υπάρχουν για το κρασί. Ακόμη ένα πρόβλημα στο εμπόριο των αλκοολούχων ποτών είναι το μη καταγεγραμμένο αλκοόλ (παράνομο), που μπορεί να είναι οποιοδήποτε αλκοολούχο ποτό όπως κρασί, μπύρα και αποστάγματα, με τη διαφορά ότι η παραγωγή τους δεν έχει καταγραφεί επισήμως ως αλκοόλη που προορίζεται για κατανάλωση, και είτε παράγεται παράνομα με οικιακή παραγωγή (που μπορεί να επιτρέπεται από κάποια νομοθεσία με περιορισμό στα λίτρα όμως), ή προέρχεται από διασυνοριακό εμπόριο. Εκτός από το μη επίσημα καταγεγραμμένο αλκοόλ, υπάρχουν και άλλες μορφές αλκοόλ που μπορούν παράνομα να εισαχθούν στην τροφική αλυσίδα (υποκατάστατα αλκοόλης), οι οποίες δεν ακολούθησαν την διαδικασία παραγωγής για αλκοόλη που προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση (όπως καλλυντική αλκοόλη, ιατρικό οινόπνευμα, απολυμαντικό αλκοόλ, μετουσιωμένη αλκοόλη, συνθετική αλκοόλη, ή άλλες μορφές βιομηχανικής αλκοόλης). Εκτός της στοχευμένης ανάλυσης τοξικών συστατικών και προσμίξεων, το μείζον ζήτημα είναι η επικύρωση της ταυτότητας των μη καταγεγραμμένων αλκοολούχων ποτών, 35

53 επομένως, η διαφοροποίηση από τους καταγεγραμμένους τύπους αλκοόλης. Αυτό μπορεί να είναι δύσκολο, όταν οι νόμιμοι παραγωγοί αλκοόλ μπορεί παράνομα να πωλούν μέρος του οινοπνεύματος τους, χωρίς καταβολή φόρων, ή όταν το αλκοόλ μετακινείται λαθραία από μια χώρα με χαμηλή φορολογία σε μια με υψηλή φορολογία [43]. Σχήμα 2.1.1: Κριτήρια αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών. 2.2 Σήματα ποιότητας Οι κανόνες της Ε.Ε για την επισήμανση των τροφίμων επιδιώκουν την παροχή λεπτομερών και ακριβών πληροφοριών προς τους καταναλωτές σχετικά με το περιεχόμενο και τη σύνθεση των τροφίμων, οι οποίες τους βοηθούν να επιλέγουν συνειδητά τα τρόφιμα που καταναλώνουν. Εικόνα 2.2.1:Σύμβολα για σήματα ποιότητας προϊόντων στην Ευρωπαϊκή Κοινότητα. 36

54 Για προϊόντα συγκεκριμένης γεωγραφικής προέλευσης χρησιμοποιούνται ειδικοί λογότυποι της Ε.Ε: Προστατευόμενη Ονομασία Προέλευσης (ΠΟΠ) και Προστατευόμενη Γεωγραφική Ένδειξη (ΠΓΕ), ενώ για όσα προϊόντα παρασκευάζονται ή παράγονται με παραδοσιακό τρόπο: Εγγυημένο Παραδοσιακό Ιδιότυπο Προϊόν (ΕΠΙΠ). Στα τέλη του 2012, είχαν καταχωρισθεί ως ΠΟΠ, ΠΓΕ ή ΕΠΙΠ προϊόντα, μεταξύ των οποίων, για παράδειγμα, η σαμπάνια (ΠΟΠ), το «ζαμπόν Πάρμας» (ΠΓΕ) και ο ζύθος Gueuze (ΕΠΙΠ) [44]. Το 1992 με τον κανονισμό 2081/92 η Ευρωπαϊκή Ένωση θέσπισε για πρώτη φορά το καθεστώς, για την προστασία των γεωγραφικών ενδείξεων και των ονομασιών προέλευσης των γεωργικών προϊόντων και των τροφίμων και με τον κανονισμό 2082/92 το καθεστώς, για τις βεβαιώσεις ιδιοτυπίας των γεωργικών προϊόντων και τροφίμων. Το 2006 με στόχο τη βελτίωση του συστήματος, οι παραπάνω κανονισμοί αντικαταστάθηκαν από τους 510/06 και 509/06 αντίστοιχα, χωρίς ωστόσο να μεταβληθεί το πεδίο εφαρμογής τους και η σκοπιμότητά τους. ΟΡΙΣΜΟΙ Ονομασία Προέλευσης (Π.Ο.Π) Ως «ονομασία προέλευσης» νοείται η ονομασία που ταυτοποιεί ένα προϊόν: α) το οποίο κατάγεται από συγκεκριμένο τόπο, περιοχή ή, σε εξαιρετικές περιπτώσεις, χώρα β) του οποίου η ποιότητα ή τα χαρακτηριστικά οφείλονται κυρίως ή αποκλειστικά στο ιδιαίτερο γεωγραφικό περιβάλλον που συμπεριλαμβάνει τους εγγενείς φυσικούς και ανθρώπινους παράγοντες και γ) του οποίου όλα τα στάδια της παραγωγής εκτελούνται εντός της οριοθετημένης γεωγραφικής περιοχής. Γεωγραφική Ένδειξη (Π.Γ.Ε) Ως «γεωγραφική ένδειξη» νοείται η ονομασία που ταυτοποιεί ένα προϊόν: α) το οποίο κατάγεται από συγκεκριμένο τόπο, περιοχή ή χώρα 37

55 β) του οποίου ένα συγκεκριμένο ποιοτικό χαρακτηριστικό, η φήμη ή άλλο χαρακτηριστικό μπορεί να αποδοθεί κυρίως στη γεωγραφική του προέλευση και γ) του οποίου ένα τουλάχιστον από τα στάδια της παραγωγής εκτελείται εντός της οριοθετημένης γεωγραφικής περιοχής. Πίνακας 2.2.1: Σύμφωνα με τον ΕΚ 110/2008, στην κατηγορία «Αποσταγμένο anis», υπάρχουν έξι γεωγραφικές ενδείξεις ούζου με καταγωγή από την Ελλάδα. Ούζο Ούζο Μυτιλήνης Ούζο Πλωμαρίου Ούζο Καλαμάτας Ούζο Θράκης Ούζο Μακεδονίας Κύπρος, Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Πίνακας 2.2.2: Σύμφωνα με τον ΕΚ 110/2008, στην κατηγορία «Απόσταγμα στεμφύλων σταφύλης», υπάρχουν πέντε γεωγραφικές ενδείξεις τσίπουρου και μια τσικουδιάς με καταγωγή από την Ελλάδα. Τσίπουρο Τσικουδιά Τσικουδιά Κρήτης Τσίπουρο Μακεδονίας Τσίπουρο Θεσσαλίας Τσίπουρο Τυρνάβου Ζιβανία/Τζιβανία/Ζιβάνα/Zivania Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Ελλάδα Κύπρος 38

56 Εγγυημένα Παραδοσιακά Ιδιότυπα Προϊόντα (Ε.Π.Ι.Π) Ως εγγυημένο παραδοσιακό ιδιότυπο προϊόν νοείται ένα ιδιότυπο προϊόν ή τρόφιμο το οποίο: α) παρασκευάζεται με τρόπο παραγωγής, μεταποίησης ή σύνθεσης που αντιστοιχεί στην παραδοσιακή πρακτική για το εν λόγω προϊόν ή τρόφιμο ή β) παράγεται από πρώτες ύλες ή συστατικά που είναι τα χρησιμοποιούμενα παραδοσιακά. Για να μπορεί να καταχωρηθεί μια ονομασία ως ονομασία εγγυημένου παραδοσιακού ιδιότυπου προϊόντος, πρέπει: α) να χρησιμοποιείται κατά παράδοση για την περιγραφή του ιδιότυπου προϊόντος ή β) να προσδιορίζει τον παραδοσιακό χαρακτήρα ή τον ιδιότυπο χαρακτήρα του προϊόντος [45]. Πίνακας 2.2.3: Γεωγραφικές ενδείξεις αλκοολούχων ποτών αναγνωρισμένες σε εθνικό επίπεδο. Αποσταγμένο Anis Απόσταγμα Στεμφύλων Σταφυλής Ούζο Καβάλας Ούζο Βόλου Ούζο Νάουσας Ούζο Τυρνάβου Ούζο Λήμνου Ούζο Σάμου Ούζο Χίου Τσίπουρο Νάουσας Τσίπουρο Μουζακίου Τσίπουρο Ηπείρου 2.3 Μεθοδολογία για τον καθορισμό της αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών Ένας συνηθισμένος τρόπος εφαρμογής της διαδικασίας ελέγχου ταυτότητας είναι ο προσδιορισμός διαφόρων χαρακτηριστικών όπως ομάδες χημικών ενώσεων σε δείγματα τροφίμων/ποτών και στη συνέχεια με βάση αυτά τα δεδομένα να γίνει η ταξινόμησή τους. Στις περισσότερες εφαρμογές 39

57 ταξινόμησης/αυθεντικότητας τροφίμων και ποτών υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί παράμετροι που έχουν προσδιοριστεί. Έτσι ένα σημαντικό πρόβλημα συνίσταται στον καθορισμό των παραμέτρων οι οποίες θα παρέχουν τις ουσιαστικότερες πληροφορίες, υπό την έννοια της επίτευξης της υψηλότερης δυνατής ακρίβειας ταξινόμησης και με το χαμηλότερο κόστος [46]. Η ανάπτυξη νέων και πιο εξελιγμένων τεχνικών για την εξακρίβωση της γνησιότητας των προϊόντων διατροφής συνεχίζεται με γοργούς ρυθμούς με την αυξανόμενη ευαισθητοποίηση των καταναλωτών σε θέματα ασφάλειας και αυθεντικότητας/γνησιότητας τροφίμων. Η αυθεντικότητα των τροφίμων προκαλεί επίσης, ανησυχία και στους παραγωγούς τροφίμων που δεν επιθυμούν να υποβληθούν σε αθέμιτο ανταγωνισμό με αδίστακτους παραγωγούς, οι οποίοι θα αποκτήσουν οικονομικό πλεονέκτημα από την παραπλανητική παρουσίαση των τροφίμων που πωλούν [42]. Έχουν υπάρξει πολλές παραδοσιακές μέθοδοι διαθέσιμες για την ανάλυση υγρών τροφών όπως η μέθοδος υψηλής απόδοσης υγρής χρωματογραφίας (HPLS), αέριας χρωματογραφίας (GC), κλασσικής ανάλυσης και οργανοληπτικής ανάλυσης. Για παράδειγμα, HPLS χρησιμοποιείται συνήθως για την ηλικιακή διάκριση στο κρασί βάσει διαφόρων χημικών χαρακτηριστικών, συμπεριλαμβανομένων τη σύνθεση χρωστικών και φλαβονοειδών. Εκτός από αυτό, η αέρια χρωματογραφία χρησιμοποιείται ευρέως για την επαλήθευση της αυθεντικότητας των υγρών τροφίμων. Ωστόσο, αυτές οι παραδοσιακές μέθοδοι είναι χρονοβόρες και συνήθως αν εφαρμοστούν μόνο αυτές, δεν δίνουν ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ταξινόμηση/διάκριση των δειγμάτων [40]. Για να εξασφαλιστεί η αυθεντικότητα/γνησιότητα των τροφίμων και ποτών, απαιτείται η χρήση πιο εξελιγμένων τεχνικών ανάλυσης, καθώς οι δράστες αυτής της απάτης χρησιμοποιούν μεθόδους νοθείας και ψευδείς δηλώσεις, που είναι όλο και πιο δύσκολο να ανιχνευθούν. Οι κυριότερες τεχνικές, που έχουν εφαρμοστεί επιτυχώς στον έλεγχο ταυτότητας των τροφίμων καταγράφονται στο επόμενο σχήμα. Στη χημειομετρική επεξεργασία των αναλυτικών δεδομένων υπάρχει δυνατότητα να προσδιοριστούν περισσότερα από ένα στοιχεία για ένα δείγμα και έτσι μπορεί να ενισχυθεί η προέλευση του δείγματος, και να αποτελέσουν 40

58 ένα δακτυλικό αποτύπωμα σχετικά με τη γεωγραφική προέλευση του δείγματος (τροφίμου ή ποτού). Στην επιλογή της τεχνικής πρέπει συμπεριληφθεί η προετοιμασία του δείγματος, η απόδοση της μεθόδου, τα όρια ανίχνευσής της. Ταυτόχρονα η ανάλυση πρέπει να είναι γρήγορη, μη καταστροφική αλλά και όσο γίνεται, πιο ανέξοδη [42]. Σχήμα 2.3.1: Τεχνικές που μπορούν να εφαρμοστούν στον καθορισμό της αυθεντικότητας των τροφίμων και ποτών. 41

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΧΗΜΕΙΟΜΕΤΡΙΑ 3.1 Χημειομετρία Τα αναλυτικά πειράματα συνήθως περιλαμβάνουν μετρήσεις που διεξάγονται για να εξαχθούν πληροφορίες για φυσικά συστήματα. Όπου περιλαμβάνονται ποσοτικά δεδομένα (quantitative data), οι αριθμοί, όπως παρέχονται από το αναλυτικό σύστημα είναι συχνά δυσνόητοι, δίνονται σε διάφορες μονάδες (π.χ. vol.ts, amperes, απορρόφηση) και/ή είναι μεγάλου πλήθους, για να συσχετισθούν άμεσα με ένα επιστημονικό πρόβλημα [47]. Οι μετρήσεις όμως χρειάζεται να επεξεργαστούν, να απεικονιστούν και να ερμηνευτούν. Η στατιστική ανάλυση προσφέρει πολυάριθμους τρόπους για την αξιολόγηση των αναλυτικών δεδομένων, έτσι ώστε αυτά να οδηγούν σε έγκυρα επιστημονικά συμπεράσματα [48]. Πιο συγκεκριμένα, είναι η Χημειομετρία που έχει τη μέγιστη απήχηση στη Χημεία. Υπάρχουν πολλοί διαφορετικοί ορισμοί της Χημειομετρίας, αλλά αυτός που προτάθηκε από το Massart είναι ο πλέον δηλωτικός: Χημειομετρία (Chemometrics) είναι ο κλάδος της Χημείας, που ασχολείται με την εφαρμογή μεθοδολογιών της στατιστικής, των μαθηματικών, και της τυπικής λογικής (formal logic) στη Χημεία με στόχο [47]: 1. Την Επεξεργασία Δεδομένων, με στόχο την εξαγωγή όσο το δυνατόν περισσότερων πληροφοριών από αυτά. 2. Τον Πειραματικό Σχεδιασμό και τη Βελτιστοποίηση, με στόχο την κατάστρωση πειραμάτων από τα οποία μπορούν να ληφθούν πληροφορίες με τη μικρότερη προσπάθεια. 3. Την Ανάπτυξη Μοντέλων, με στόχο την περιγραφή σύνθετων χημικών συστημάτων ή φαινομένων [49]. Η λέξη Χημειομετρία εισήχθη από το Σουηδό φυσικό-οργανικό χημικό, S. Wold το Ο τελευταίος μαζί με τον Αμερικανό αναλυτικό χημικό B.R.Kowalski, ίδρυσαν τη Διεθνή Κοινότητα Χημειομετρίας το Η Χημειομετρία ορίστηκε τότε ως ο κλάδος της Χημείας που ασχολείται με το "πώς να ληφθούν πληροφορίες που αφορούν τη Χημεία από τα δεδομένα 42

60 χημικών μετρήσεων, πώς να παρασταθούν και να παρουσιαστούν αυτές οι πληροφορίες και πώς να αποκτήσουν τα δεδομένα αυτές τις πληροφορίες. Η ίδρυση της Διεθνούς Κοινότητας Χημειομετρίας θεωρείται ό,τι αποτελεί τυπικά τη γέννηση της Χημειομετρίας. Όμως, οι στατιστικές και μαθηματικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στην ερμηνεία των χημικών δεδομένων είχαν ήδη αναπτυχθεί από καιρό. Σήμερα, ο ίδιος ο ιδρυτής της Χημειομετρίας διαπιστώνει ότι είναι δύσκολο να δοθεί ένας ακριβής ορισμός σε ένα τόσο δυναμικό και εξελισσόμενο τομέα, όπως η Χημειομετρία και θεωρεί πιο κατάλληλη τη γενική έκφραση: Χημειομετρία είναι ο κλάδος της Χημείας που ασχολείται με θέματα πληροφοριών [49]. Οι χημειομετρικές μέθοδοι είναι συνήθως πολυπαραμετρικές δηλαδή επεξεργάζονται περισσότερες από μια παραμέτρους για κάθε δείγμα. Διακρίνονται σε μεθόδους αναγνώρισης προτύπων (pattern recognition) για ταξινόμηση των δεδομένων και σε μεθόδους βαθμονόμησης (calibration) για εξαγωγή μοντέλου. Για την αναγνώριση προτύπων χρησιμοποιούνται οι κάτωθι μέθοδοι: ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis, PCA) ανάλυση κατά συστάδες (cluster analysis, CA) γραμμική διαχωριστική ανάλυση (linear discriminant analysis, LDA) κ-πλησιέστερου γείτονα (k-nearst neighbor, KNN), όπου κ θετικός ακέραιος αριθμός κυρίως περιττός soft independent modeling of class analogy, SIMCA Για τη βαθμονόμηση χρησιμοποιούνται οι κάτωθι μέθοδοι: μερικών ελαχίστων τετραγώνων (partial least square, PLS) πολλαπλή γραμμική παλινδρόμηση (multiple linear regression, MLR) παλινδρόμηση κύριων συνιστωσών (principal component regression, PCR) [50]. 43

61 Με τη χρήση Χημειομετρίας στην αυθεντικότητα τροφίμων και ποτών εξάγονται χρήσιμες πληροφορίες από τα δεδομένα αναλύσεων που αφορούν: Την ταυτοποίηση Τη γεωγραφική προέλευση των πρώτων υλών ή του τελικού προϊόντος Το είδος του ζώου ή του φυτού Τη νοθεία με συστατικά κατώτερης ποιότητας [51]. Επιπλέον οι χημειομετρικές μέθοδοι μπορούν ταξινομηθούν σε δύο κύριες ομάδες: α) τη Δομική Ανάλυση Δεδομένων στην οποία περιλαμβάνονται η Ανάλυση Κύριας Συνιστώσας και η Ανάλυση Συστάδων και β) στην ταξινόμηση αγνώστων δειγμάτων και Διακριτική (Διαχωριστική) Ανάλυση στην οποία περιλαμβάνονται τεχνικές όπως η Κανονική Ανάλυση, η Γραμμική Διακριτική (Διαχωριστική) Ανάλυση, η Ομαλοποιημένη Διακριτική (Διαχωριστική) Ανάλυση και τα Δέντρα Κατάταξης και Παλινδρόμησης. Σχήμα 3.1.1: Χημειομετρικές Μέθοδοι. 3.2 Επεξεργασία δεδομένων Δημιουργία περιγραφικών μεταβλητών Πριν την εφαρμογή των πολυπαραμετρικών μεθόδων απαιτείται η μετατροπή των φασμάτων (FT-IR, NMR.) σε περιγραφικές μεταβλητές, έτσι ώστε να είναι δυνατή η ταξινόμησή τους. Η μετατροπή του φάσματος σε μια σειρά από μεταβλητές ώστε να είναι δυνατή η εξαγωγή κύριων συνιστωσών μπορεί να γίνει με χρήση: 44

62 α) της έντασης κορυφής κάθε σημείου του φάσματος και β) της έντασης μιας κορυφής αναφοράς. Η διαδικασία μπορεί να γίνει με τη χρήση κάποιου λογισμικού προγράμματος. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκαν το SIMCA και το SCAN. Η βάση των δεδομένων μεταφέρεται αρχικά στο πρόγραμμα Excel για να πάρει την κατάλληλη μορφή ώστε να εισαχθεί στο λογισμικό. Κάθε φάσμα χωρίζεται σε υποπεριοχές με συγκεκριμένο εύρος. Το εύρος κάθε υποπεριοχής επιλέγεται έτσι ώστε να μην είναι πολύ μεγάλο ούτε ευαίσθητο σε μικρές αλλαγές ούτε πολύ μικρό. Αποκλείεται η ευρεία κορυφή που αντιστοιχεί στην απορρόφηση δόνησης τάσης του -ΟΗ νερού στα φάσματα FT-IR ( cm -1 ). Ακολούθως γίνεται κανονικοποίηση και διόρθωση της βασικής γραμμής έτσι ώστε τα φάσματα να είναι συγκρίσιμα μεταξύ τους. Κατά τη διαδικασία αυτή, όλες οι τιμές των εντάσεων κάθε κορυφής διαιρούνται είτε με την ολική ένταση του φάσματος είτε με την ένταση μιας κορυφής αναφοράς. Μετά το τέλος της επεξεργασίας δημιουργείται πίνακας Χ (mxn) όπου m ο αριθμός των φασμάτων-δειγμάτων (παρατηρήσεις) και Ν οι περιγραφικές μεταβλητές, δηλαδή οι τιμές ολοκλήρωσης των κορυφών που αντιστοιχούν στις υποπεριοχές [42]. Σχήμα : Πίνακας Χ, αρχικών δεδομένων: Μ γραμμές (παρατηρήσεις), Ν στήλες (μεταβλητές). 45

63 3.2.2 Προ-επεξεργασία των περιγραφικών μεταβλητών για ανάλυση Ο πίνακας Χ (mxn) αποτελεί τη βάση δεδομένων και γεωμετρικά απεικονίζεται με ένα πολυδιάστατο χώρο όπου οι μεταβλητές προσδιορίζουν τους άξονες και οι παρατηρήσεις παρουσιάζονται ως σημεία (ανύσματα, vectors). Πριν την εφαρμογή της μεθόδου ταξινόμησης στη βάση δεδομένων εφαρμόζεται προεπεξεργασία με σκοπό τη μετατροπή της βάσης δεδομένων σε κατάλληλη μορφή για ανάλυση. Γίνεται κανονικοποίηση, έτσι ώστε όλες οι μεταβλητές να θεωρούνται ίσης σημασίας. Στη συνέχεια υπολογίζεται η μέση τιμή κάθε μεταβλητής και αφαιρείται από τις τιμές της βάσης δεδομένων, επιτυγχάνοντας με τον τρόπο αυτό την επικέντρωση (mean centering) στο μέσο της βάσης δεδομένων. Η ακριβής αφαίρεση του μέσου όρου από τις τιμές της βάσης δεδομένων έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή στη θέση του συστήματος των συντεταγμένων έτσι ώστε η αρχή των αξόνων των συντεταγμένων να περνά από το σημείο των μέσων όρων των μεταβλητών, των οποίων το άνυσμα αποτελεί ένα σημείο στο χώρο. Μ αυτή τη διαδικασία όλες οι μεταβλητές γίνονται ισοδύναμες, έτσι ώστε και αυτές που προέρχονται από κορυφές μικρής και μεγάλης έντασης να τυγχάνουν επεξεργασίας κατά τον ίδιο τρόπο. Η βαθμονόμηση των μεταβλητών καθορίζει το μήκος των αξόνων στο χώρο. Κατά τη μέθοδο της κανονικοποίησης γίνεται διαίρεση των τιμών μιας μεταβλητής με την τυπική απόκλιση των τιμών της ίδιας μεταβλητής. Βρίσκει εφαρμογή, όταν υπάρχει μεγάλη διαφορά στην περιοχή των τιμών ορισμένων μεταβλητών και θεωρεί ότι όλα τα ανύσματα σημεία έχουν το ίδιο μήκος, την ίδια βαρύτητα (Unit Variance scaling, UV ή autoscaling). Μπορεί επίσης, να γίνει και ταυτόχρονη εφαρμογή των πιο πάνω με αποτέλεσμα οι τιμές κάθε μεταβλητής να έχουν μέσο όρο 0 και τυπική απόκλιση 1. Η μέθοδος αυτή ονομάζεται τυποποίηση (standardization). Στην περίπτωση που ο πίνακας Χ περιλαμβάνει φασματικά δεδομένα -οι περιγραφικές μεταβλητές είναι η ένταση των κορυφών από φάσματα FTIR ή NMR- είναι δυνατό να μετασχηματιστεί. Ο μετασχηματισμός αυτός πραγματοποιείται στη βάση κυματοειδών συναρτήσεων και προκύπτει μια νέα 46

64 βάση δεδομένων, που κανονικοποιείται στη συνέχεια είτε με επικέντρωση στο μέσο (Σχήμα ) είτε με συνδιακύμανση [42]. Σχήμα : α) Το άνυσμα του μέσου όρου παρίσταται με ένα σημείο (μαυρισμένο) στο μέσο του πλήθους των δεδομένων β) Νέο σύστημα συντεταγμένων, με κέντρο το σημείο των μέσων όρων. 3.3 Έννοια των πολυμεταβλητών τεχνικών Η πολυμεταβλητή ανάλυση με την ευρεία έννοια αναφέρεται σε όλες τις στατιστικές μεθόδους οι οποίες ταυτόχρονα χειρίζονται πολλαπλές μετρήσεις σε κάθε άτομο ή αντικείμενο υπό μελέτη. Ουσιαστικά, η πολυμεταβλητή ανάλυση αποτελεί προέκταση στατιστικής ανάλυσης που επεξεργάζεται μία μόνο μεταβλητή όπως η ανάλυση της διακύμανσης (Analysis of Variance - ANOVA) ή δύο μεταβλητές όπως η παλινδρόμηση (ή και συσχέτιση). Η πολυμεταβλητή ανάλυση μπορεί να εφαρμοστεί και αυτούσια, όπως συμβαίνει στην ανάλυση των κύριων συνιστωσών με την οποία επιδιώκει να ανασύρει από ένα πλήθος μεταβλητών εκείνες που προσδίδουν τη σημαντικότερη πληροφόρηση ή στην πολλαπλή διακριτική ανάλυση (discriminant analysis) μέσω της οποίας προσπαθεί να ανιχνεύσει ομάδες στοιχείων που διαφοροποιούνται άριστα ως αποτέλεσμα της δράσης διαφορετικών ομάδων μεταβλητών. O βασικός σχεδιασμός των πολυμεταβλητών αναλύσεων αφορά τη δημιουργία ειδικών μεταβλητών (variates) καθεμία των οποίων αποτελεί γραμμικό συνδυασμό των αρχικών μεταβλητών και υπολογίζεται με ειδικές τεχνικές. Οι πολυμεταβλητές μπορεί να αφορούν ποικίλο θεματικό 47

65 περιεχόμενο άριστα προσαρμοζόμενο στις απαιτήσεις μίας στατιστικής ή γραφικής ανάλυσης. Τα ποσοτικά στοιχεία είναι περισσότερο ακριβή επειδή αποδίδονται αριθμητικά (ποσοτικά), π.χ. πυκνότητα ενός πληθυσμού, ή μετρώνται σε συγκεκριμένη κλίμακα που υπαγορεύεται από τη χρήση κάποιας συσκευής π.χ. διαθλασίμετρο, φασματοφωτόμετρο, και γι αυτό τυγχάνουν πιο ακριβούς στατιστικής επεξεργασίας και περισσότερων δυνατοτήτων επιλογής από τις διαθέσιμες πολυμεταβλητές τεχνικές [52]. Κάθε πολυμεταβλητή τεχνική παρουσιάζει ιδιαίτερα χαρακτηριστικά εφαρμογής στις μεταβλητές της και άρα αποτελεί συγκεκριμένη επιλογή ανάλογα με την κλίμακα μέτρησης των στοιχείων, το εξειδικευμένο υπόβαθρο του ερευνητή, το μέγεθος της πολυπλοκότητας των αναλύσεων, την προσαρμοστικότητα των αποτελεσμάτων σε διαγράμματα και πίνακες και το βάθος κατανόησης των ευρημάτων. Παρακάτω αναφέρονται τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα ερευνητική εργασία συνοδεία ορισμένων χαρακτηριστικών τους [52] Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) Στην τεχνική αυτή ακολουθείται μία συγκεκριμένη στατιστική διαδικασία στην οποία γίνεται προσπάθεια να αναλυθούν οι σχέσεις που αναπτύσσονται μεταξύ ενός μεγάλου αριθμού μεταβλητών και να τις ερμηνευθούν επιλέγοντας τελικά ένα μικρότερο αριθμό νέων μεταβλητών (συνιστωσών ή παραγόντων), στις οποίες ενσωματώνεται η συλλογή όλης της δυνατής πληροφορίας με τις ελάχιστες δυνατές απώλειες. Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis) επινοήθηκε για να μειώσει τον αριθμό των μεταβλητών σε ένα μικρότερο αριθμό νέων μεταβλητών, γνωστών και ως κύριων συνιστωσών PC1, PC2 κ.λπ., οι οποίες αποτελούν γραμμικούς συνδυασμούς των αρχικών μεταβλητών με στόχο να συσσωρεύσουν όσο το δυνατό περισσότερη πληροφόρηση και παράλληλα να ενσωματώσουν σημαντικό μέρος της ολικής μεταβλητότητας (διακύμανσης) της ανάλυσης. Η πρώτη κύρια συνιστώσα είναι αυτή που χαρακτηρίζεται από τη μεγαλύτερη διακύμανση, η δεύτερη αυτή που χαρακτηρίζεται από τη δεύτερη μεγαλύτερη διακύμανση κ.ο.κ. 48

66 Με απλούστερα λόγια, η τεχνική απλοποιεί την πολυπλοκότητα της πληροφόρησης που πηγάζει από μεγάλο αριθμό μεταβλητών μειώνοντας τον αριθμό αυτών σε λίγες, νέες και ουσιαστικές [52,48]. Αρχικά σχηματίζεται ένας πίνακας X με ανεξάρτητες μεταβλητές που αποτελείται από i-σειρές, τα αντικείμενα (δείγματα) και j-στήλες, τις μεταβλητές (π.χ. εντάσεις φθορισμού). Ο αριθμός των κύριων συνιστωσών (PC) που σχηματίζονται δεν υπερβαίνει τη μικρότερη διάσταση του αρχικού πίνακα, π.χ. σε πίνακα με διαστάσεις 140*350 ο αριθμός των PC που σχηματίζονται είναι μικρότερος από 140. Η PCA γίνεται με παραγοντοποίηση του αρχικού πίνακα X ως γινόμενο μικρότερων πινάκων που περιλαμβάνουν τις συντεταγμένεςscores Τ των αντικειμένων (δείγματα) και τα φορτία-loadings Ρ των μεταβλητών. X=T*P + Ε (Εξίσωση ) Ο πίνακας Τ αποτελείται από i-σειρές και a-στήλες και ο πίνακας Ρ από a- σειρές και j- στήλες. Το a αντιστοιχεί στον αριθμό των κύριων συνιστωσών. Το Ε είναι ο πίνακας των υπολοίπων μεταξύ των αρχικών τιμών και των προβολών και έχει ίδιες διαστάσεις με τον αρχικό πίνακα, όπως φαίνεται πιο πάνω [50]. Σχήμα : Πίνακες που προκύπτου από την PCA Διακριτική Ανάλυση (DA) Η Διακριτική Ανάλυση (Discriminant Analysis) εφαρμόζεται στην περίπτωση που θέλουμε να προβλέψουμε την ομάδα ή την τάξη στην οποία ανήκει ένα σύνολο δειγμάτων, με βάση ορισμένες πειραματικές μεταβλητές διαχωρισμού ή πρόγνωσης (predictors). Οι ομάδες είναι γνωστές από πριν (αναγνώριση με επιτήρηση) και έχουν δημιουργηθεί με κριτήριο τις μεταβλητές ομαδοποίησης (grouping variables). Στο σύνολο των παρατηρήσεων έχει εφαρμοστεί η 49

67 Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών και η Διακριτική Ανάλυση περιγράφει την κατάταξη σε συγκεκριμένη ομάδα, ώστε οι μελλοντικές παρατηρήσεις άγνωστων δειγμάτων να ενταχθούν στην ομάδα με μεγαλύτερη πιθανότητα [42]. Με τη DA είναι δυνατόν: 1. Να ελεγχθεί η ύπαρξη στατιστικά σημαντικών διαφορών μεταξύ δύο ή περισσότερων προκαθορισμένων κατηγοριών. 2. Να προσδιοριστούν οι ανεξάρτητες μεταβλητές που είναι κατά κύριο λόγο υπεύθυνες για τις διαφορές. 3. Να αναπτυχθούν κανόνες ταξινόμησης αντικειμένων σε μια από τις κατηγορίες με βάση τις τιμές που εμφανίζουν στις ανεξάρτητες μεταβλητές [49] Ιεραρχική Ανάλυση συστάδων (HCA) Η Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες (Hierarchical Cluster Analysis) είναι η δομική ανάλυση των δεδομένων με σκοπό τον εντοπισμό των τάξεων/συστάδων (clusters) ανάμεσα στα δεδομένα, χωρίς να απαιτείται οποιαδήποτε προηγούμενη πληροφορία σχετικά με τις πιθανές τάξεις [42]. Σε αντίθεση με τη διακριτική ανάλυση (Discriminant Analysis) η οποία ασχολείται με προκαθορισμένο αριθμό ομάδων (κατηγοριών), η ανάλυση συστάδων χρησιμοποιείται χωρίς προηγούμενη γνώση για την ταυτοποίηση των παρατηρήσεων σε ομάδες και εκτελείται σε τρία βήματα (εξαιρείται η ανάλυση των k-μέσων) [52]. Η Ιεραρχική Ανάλυση κατά Συστάδες στηρίζεται μόνο στην απόσταση μεταξύ των δειγμάτων, που αποτελεί και κριτήριο αξιολόγησης των τάξεων, σχετικά με το διαχωρισμό τους. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιαδήποτε απόσταση, συνήθως όμως χρησιμοποιείται η Ευκλείδεια [42]. d ij NV k 1 2 ( xik x jk) (Εξίσωση ) όπου NV είναι ο αριθμός των μεταβλητών (ίσος με n σε n-διάστατο χώρο) [53] 50

68 Στην περίπτωση των φασματοσκοπικών δεδομένων -όπου τα φάσματα είναι πανομοιότυπα- εφαρμόζεται στις κύριες συνιστώσες που προκύπτουν από την Ανάλυση των Κύριων Συνιστωσών. Αρχίζοντας με ένα πίνακα που περιλαμβάνει τις αποστάσεις όλων των δειγμάτων και Ν τάξεις και με τη χρήση αλγόριθμου δημιουργείται μια ξεχωριστή τάξη για εκείνα τα δείγματα που έχουν τις πιο κοντινές αποστάσεις. Προκύπτει τώρα ένας νέος πίνακας όπου δίνονται οι αποστάσεις των δειγμάτων από τα δείγματα στη νέα τάξη. Στη συνέχεια εντοπίζονται τα δείγματα με τις μικρότερες αποστάσεις και που θα αποτελέσουν τη νέα τάξη. Γίνεται γραφική απεικόνιση της σχέσης μεταξύ των μεταβλητών και των δειγμάτων και των μεταβλητών μεταξύ τους. Τα αποτελέσματα παριστάνονται με δενδρόγραμμα στο οποίο φαίνεται δομή των τάξεων [42]. Σχήμα : Εφαρμογή HCA Δένδρα Ταξινόμησης και Παλινδρόμησης (CARΤ) Στα Δέντρα Ταξινόμησης και Παλινδρόμησης (Classification and Regression Trees), πρέπει να οριστεί πως ακριβώς θα γίνεται ο διαχωρισμός και τα κριτήρια για την επιλογή ενός βέλτιστου ή ενός τελικού δέντρου για ανάλυση σε αντίθεση με την Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών που η εφαρμογή της δεν μπορεί να παρέχει συγκεκριμένες πληροφορίες όταν υπάρχουν πολλές μεταβλητές πρόβλεψης [42]. Επιλέγονται ειδικοί αλγόριθμοι επιλέγονται, η λειτουργία των οποίων στηρίζεται στην υπόθεση αν ισχύει μία συνθήκη, τότε εκτελείται αναλόγως, π.χ. αν η μεταβλητή Χ3 προσεγγίσει την τιμή 2,4 τότε οι παρατηρήσεις διακρίνονται σε δύο υποομάδες και παρατάσσονται κάτω αριστερά και δεξιά της συνθήκης. Οι αλγόριθμοι τελικά συγκροτούν μία 51

69 δενδρική κατάταξη των μεταβλητών και παρατηρήσεων, τέτοια ώστε να προβλέπεται άριστα η τοποθέτηση των παρατηρήσεων των ομάδων των εξαρτημένων μεταβλητών [52]. Συνήθως τα δενδρογράμματα παριστάνονται ορθογώνια και άνισα μεταξύ τους στα οποία ο κάθετος άξονας αντιπροσωπεύει την απόσταση dij μεταξύ δύο σημείων i και j όταν αυτά ενώνονται ή την ομοιότητα sij, η οποία δίνεται από τη σχέση [42]: sij=100 (1- dij / dmax). (Εξίσωση ) dmax είναι ο μεγαλύτερος διαχωρισμός μεταξύ δύο σημείων Ταξιδόμηση k μέσων Η ανάλυση σε συστάδες μπορεί να γίνει είτε με την τεχνική της ιεραρχικής ανάλυσης σε συστάδες είτε με την τεχνική της ανάλυσης σε συστάδες Κ μέσων (k-means Cluster Analysis). Η δεύτερη συνιστάται στην περίπτωση μεγάλου αριθμού παρατηρήσεων και απαντά κυρίως στο ποια αντικείμενα ανήκουν σε καθορισμένο αριθμό συστάδων. Σχηματίζονται αρχικά k τυχαίες συστάδες, και μετά τα αντικείμενα μετακινούνται μεταξύ αυτών των συστάδων μέχρις ότου η συμμεταβολή εντός της ίδιας συστάδας να ελαχιστοποιηθεί, ενώ η συμμεταβολή μεταξύ δύο διαφορετικών συστάδων να μεγιστοποιηθεί [53]. Η εκτέλεση πραγματοποιείται με τον αλγόριθμο του Lloyd με μείζον μειονέκτημα της μεθόδου τον ορισμό εξαρχής συγκεκριμένων ομάδων στα στοιχεία, καθότι ο αλγόριθμος προτιμώνται να δημιουργηθούν ισομεγέθεις συστάδες (με ίδιο περίπου αριθμό στοιχείων) οδηγώντας έτσι στη λανθασμένη οριοθέτηση μεταξύ των ομάδων αφού βελτιστοποιούνται τα κέντρα των ομάδων και όχι τα όρια αυτών. Διαθέτει όμως σοβαρά πλεονεκτήματα: α) Όταν οι μεταβλητές είναι πολυπληθείς, η συσταδοποίηση k μέσων αποδεικνύεται υπολογιστικά πολύ ταχύτερη των ιεραρχικών με την προϋπόθεση ότι απαιτείται μικρός αριθμός ομάδων. β) Παράγει συστάδες πιο ομοιογενείς (συμπαγείς) συγκριτικά με αυτές των ιεραρχικών μεθόδων Σύμφωνα με την συσταδοποίηση των k μέσων όλα τα στοιχεία (παρατηρήσεις) τοποθετούνται σε μία αρχική συστάδα και ο αλγόριθμος θα 52

70 μετακινήσει τα στοιχεία σε διάφορες συστάδες με στόχο την ελαχιστοποίηση των αποστάσεων μέσα σε κάθε συστάδα και τη μεγιστοποίηση αυτών μεταξύ των συστάδων [52] SIMCA Η μέθοδος SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogies) επιτρέπει τον διαχωρισμό των μελών και των μη μελών μιας κατηγορίας με βάση έναν κανόνα/όριο που ορίζεται. Για κάθε κατηγορία δημιουργείται ένα διαφορετικό μοντέλο το οποίο χρησιμοποιείται για να δοκιμάσει εάν το άγνωστο αντικείμενο, δηλαδή το μέλος κάποιας άλλης κατηγορίας, μπορεί να αποτελέσει μέλος της κατηγορίας. Η διαδικασία αυτή καλείται Ασυνεχές Μοντέλο Κατηγορίας (Disjoint Class Modelling). Στην περίπτωση πολλών μεταβλητών προηγείται η PCA ανάλυση ώστε να μειωθούν τα δεδομένα. Έτσι, με το SIMCA δημιουργείται ένα μοντέλο για κάθε εξεταζόμενη κατηγορία όσο αφορά τις πρώτες κύριες συνιστώσες αυτής της κατηγορίας [54] Μερικά Ελάχιστα Τετράγωνα (Partial Least Square, PLS) H μέθοδος των Μερικών Ελαχίστων Τετραγώνων είναι μια ευρέως χρησιμοποιούμενη στατιστική μέθοδος με μεγάλο φάσμα εφαρμογών σε πολλές επιστήμες. Η ανάλυση μερικών ελάχιστων τετραγώνων (Partial Least Square, PLS) αποτελεί μέθοδο συσχέτισης εξαρτημένων (π.χ. κυματάριθμοι FTIR) με ανεξάρτητες (π.χ. τύπος αποστάγματος) μεταβλητές. Σε αντίθεση με τις δύο πιο πάνω μεθόδους η PLS αποτελεί μέθοδο βαθμονόμησης.αρχικά, όπως και στην PCA, γίνεται παραγοντοποίηση του αρχικού εξαρτημένου πίνακα X σε γινόμενο μικρότερων πινάκων. Στην PLS γίνεται επίσης παραγοντοποίηση και της εξαρτημένης μεταβλητής (c) σύμφωνα με τα πιο κάτω: Χ=ΤxP+E (Εξίσωση ) C=Txq+f (Εξίσωση ) Στο Σχήμα το a αντιστοιχεί στον αριθμό των κύριων συνιστωσών PC. Τα ανύσματα των συντεταγμένων ta είναι ορθογωνικά όπως και στην PCA σε αντίθεση με τα ανύσματα φορτίων pa που στην PLS δεν είναι ορθοκανονικά. Στόχος της μεθόδου είναι να συσχετίσει τους δύο πίνακες. Αρχικά 53

71 υπολογίζονται οι μέσοι όροι κάθε μεταβλητής και στους δύο πίνακες. Από το σημείο των μέσων όρων διέρχονται οι δύο πρώτες κύριες συνιστώσες που προσεγγίζουν όσο το δυνατό καλύτερα τα δεδομένα. Οι διαστάσεις του κάθε πίνακα φαίνονται παρακάτω: Σχήμα :Παραγοντοποίηση πίνακα με PLS Αύξηση του αριθμού των κύριων συνιστωσών βελτιώνει περισσότερο τη συσχέτιση. Η πρώτη λανθάνουσα συνιστώσα καλύπτει το μεγαλύτερο μέρος της διακύμανσης των δεδομένων, η δεύτερη καλύπτει όσο περισσότερο από το υπόλοιπο της διακύμανσης, και ούτω καθεξής. Η μέθοδος αξιολογείται με βάση το συντελεστή συσχετίσεως R 2 της καμπύλης αναφοράς προβλεπόμενης συναρτήσει πραγματικής συγκέντρωσης και την τετραγωνική ρίζα του μέσου των τετραγώνων των υπολοίπων (root mean square error, RMSE) [50]. 54

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Υπέρυθρη φασματοσκοπία μετασχηματισμών Fourier (FT-IR) H υπέρυθρη περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος εκτείνεται από το τέλος του ορατού φάσματος έως την περιοχή των μικροκυμάτων, δηλαδή μεταξύ 0,7 μm έως 300 μm, και διακρίνεται σε τρεις περιοχές: i. Το εγγύς υπέρυθρο (NIR) φάσμα που κυμαίνεται μεταξύ 0,8 μm έως 2,5 μm και αντιστοιχεί στους κυματαριθμούς cm -1, επιτρέπει τη μελέτη των υπερτονικών (overtones) και των αρμονικών δονήσεων ή δονήσεων συνδυασμού (harmonic or combination vibrations) ii. Το μέσο υπέρυθρο (ΜIR) φάσμα που κυμαίνεται μεταξύ 2,5 μm έως 25 μm και αντιστοιχεί στους κυματαριθμούς cm -1, παρατηρούνται οι βασικές μεταβολές στη δόνηση των μορίων λόγω απορρόφησης ακτινοβολίας iii. Το άπω υπέρυθρο (FIR) φάσμα που κυμαίνεται μεταξύ 25 μm έως 300 μm και αντιστοιχεί στους κυματαριθμούς cm -1, παρέχει πληροφορίες για τις μοριακές περιστροφές και τις δονήσεις βαρέων ατόμων και κρυσταλλικού πλέγματος (δονήσεις υποκαταστάτη-μετάλλου) Σχήμα 4.1.1:Διαχωρισμός του IR φάσματος σε επιμέρους περιοχές, όπου εμφανίζονται οιχαρακτηριστικές ομάδες των οργανικών ενώσεων. 55

73 Η μέθοδος της υπέρυθρης φασματοσκοπίας βασίζεται στην απορρόφηση υπέρυθρης ακτινοβολίας από τα μόρια μιας ένωσης, τα οποία διεγείρονται σε υψηλότερες στάθμες δόνησης ή περιστροφής. Η προέλευση των απορροφήσεων στο IR φάσμα είναι αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με το ηλεκτρικό δίπολο ενός μορίου. Τα φασματοφωτόμετρα υπέρυθρης ακτινοβολίας χωρίζονται σε δύο βασικές κατηγορίες που περιλαμβάνουν : i. τα συμβατικά φασματοφωτόμετρα διασποράς (classical dispersive IR Spectrometers), ii. τα φασματοφωτόμετρα υπέρυθρου μετασχηματισμού Fourier με συμβολόμετρο (Fourier Transform IR Spectrometers). Το βασικό πλεονέκτημα της FT-IR φασματοσκοπίας έγκειται στη χρήση συμβολόμετρου αντί μονοχρωμάτορα, το οποίο επιτρέπει να κατευθύνονται στον ανιχνευτή όλες οι συχνότητες ταυτόχρονα και όχι διαδοχικά, μόνο μία τη φορά, υπερνικώντας κατ αυτόν τον τρόπο τις αδυναμίες και τους περιορισμούς των συμβατικών φασματοφωτόμετρων διασποράς. To σχηματικό διάγραμμα ενός τυπικού φασματοφωτομέτρου FTIR με συμβολόμετρο Michelson (Michelson interferometer) παρουσιάζεται στο Σχήμα Σχήμα 4.1.2: Σχηματική αναπαράσταση φασματοφωτομέτρου FT-IR με συμβολόμετρο. 56

74 H φασματοσκοπία διαπερατότητας βασίζεται στην απορρόφηση υπέρυθρης ακτινοβολίας σε συγκεκριμένα μήκη κύματος καθώς αυτή διέρχεται μέσα από ένα δείγμα. Το IR φάσμα που προκύπτει αναπαριστά στην ουσία το ποσοστό της ακτινοβολίας που απορροφάται (ή διαπερνά) από το δείγμα σε μία συγκεκριμένη ενέργεια (η ενέργεια στην οποία εμφανίζεται κάθε κορυφή σε ένα φάσμα απορρόφησης αντιστοιχεί στη συχνότητα μίας μοριακής δόνησης), όπου στον άξονα x εμφανίζονται οι συχνότητες σε μονάδες κυματαριθμών (cm -1 ), και ο άξονας y εκφράζει την ένταση της απορρόφησης (ή διαπερατότητας) σε ποσοστό επί τοις εκατό (%). Τα φάσματα διαπερατότητας (transmission spectra) χρησιμοποιούνται συνήθως για την ερμηνεία των φασματικών χαρακτηριστικών, ενώ τα φάσματα απορρόφησης (absorption spectra) ενδείκνυνται για ποσοτική ανάλυση. Μία από τις σημαντικότερες τεχνικές ανάκλασης που έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιείται ευρέως από τα φασματοφωτόμετρα FTIR είναι η τεχνική της αποσβένουσας ολικής ανάκλασης (attenuated total reflectance, ATR). Η λειτουργία της τεχνικής ATR βασίζεται στο φαινόμενο της ολικής εσωτερικής ανάκλασης (total internal reflection) το οποίο συμβαίνει όταν μία δέσμη ακτινοβολίας εισάγεται από ένα μέσο υψηλής πυκνότητας σε ένα μέσο χαμηλότερης πυκνότητας. Στα ATR εξαρτήματα χρησιμοποιείται ως στοιχείο εσωτερικής ανάκλασης (internal reflection element, IRE) ένας διαφανής κρύσταλλος στην υπέρυθρη ακτινοβολία με υψηλό δείκτη διάθλασης πάνω στον οποίο τοποθετείται το δείγμα. Η δέσμη της υπέρυθρης ακτινοβολίας που προσπίπτει στον κρύσταλλο υφίσταται πολλαπλές ολικές ανακλάσεις στον κρύσταλλο, με αποτέλεσμα να διέρχεται από το δείγμα πολλές φορές, από το οποίο και απορροφάται. Η εσωτερική ολική ανάκλαση της ακτινοβολίας στη διεπιφάνεια μεταξύ των δύο μέσων με διαφορετικούς δείκτες διάθλασης έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός φθίνοντος κύματος (evanescent wave), το οποίο διεισδύει κι εκτείνεται στο μέσο με τον χαμηλότερο δείκτη διάθλασης (δείγμα) και εξασθενεί (attenuates) στις περιοχές του υπέρυθρου ηλεκτρομαγνητικού φάσματος όπου το δείγμα απορροφά ενέργεια. Η μέτρηση και καταγραφή της προκύπτουσας αποσβένουσας ακτινοβολίας συναρτήσει του μήκους κύματος παράγει ένα IR φάσμα που παρουσιάζει 57

75 ομοιότητα με ένα συμβατικό φάσμα απορρόφησης, ωστόσο διαφοροποιείται ως προς την ένταση των ταινιών απορρόφησης σε υψηλότερα μήκη κύματος [51]. Η υπέρυθρη φασματοσκοπία που χρησιμοποιεί μετασχηματισμούς Fourier (FT-IR) σε συνδυασμό με την ανάλυση πολυμεταβλητών δεδομένων (multi variate data analysis) αποτελεί μια αξιόπιστη μέθοδο για τον έλεγχο της ποιότητας και την αξιολόγηση της αυθεντικότητας των αλκοολούχων ποτών. Κάποια από τα πλεονεκτήματα της μεθόδου ATR-FTIR είναι: δεν απαιτείται κάποια προκατεργασία των δειγμάτων, όσο αφορά τα αλκοολούχα ποτά, εκτός κι αν περιέχουν διοξείδιο του άνθρακα (μπύρα, αφρώδεις οίνοι), στην περίπτωση αυτή απαιτείται πρώτα απαέρωση αρκετά πιο οικονομική μέθοδος αν συγκριθεί με άλλες μεθόδους πιστοποίησης της αυθεντικότητας όπως το SNIF-NMR απαιτείται μικρός όγκος δείγματος απλότητα της λειτουργίας των οργάνων επαναληψιμότητα των δεδομένων ταχύτητα της ανάλυσης [55,56] Παρά το αυξανόμενο ενδιαφέρον και τις πρόσφατες εξελίξεις, λίγες μελέτες επικεντρώνονται στη χρήση των FTIR-ATR για τον έλεγχο της ποιότητας των αποσταγμάτων σταφυλιού (αποστάγματα στεμφύλων σταφυλιού, απόσταγμα οίνου και μπράντι) [56]. Σε πολλές έρευνες επίσης έχει χρησιμοποιηθεί και η φασματοσκοπία μέσου υπερύθρου με τη χρήση μετασχηματισμών Fourier που έχει ακριβώς τα ίδια πλεονεκτήματα που αναφέρθηκαν. Παρακάτω ακολουθεί πίνακας με διάφορες εφαρμογές της φασματοσκοπίας FTIR στην αυθεντικότητα τροφίμων και ποτών. Σε όλες τις εφαρμογές χρησιμοποιήθηκαν κρύσταλλοι ATR. 58

76 Πίνακας 4.1.1: Εφαρμογές της φασματοσκοπίας FT-IR- ATR στην αυθεντικότητα ποτών. Προϊόν Σκοπός Μέθοδος Πηγή Ρουμάνικα κρασιά Κυπριακό κρασί Κουμανδαρία Απεσταγμένα ποτά Tουρκικό παραδοσιακό ανισούχου απόσταγμα ρακί Αποστάγματα στεμφύλων Ποιότητα και αυθεντικότητα Αυθεντικότητα Διάκριση αλκοολούχων ποτών και εύρεση νοθείας Αυθεντικότητα (νοθεία με μεθανόλη) PCA: ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis) CA: ανάλυση κατά συστάδες (clusteranalysis) LDA: γραμμική διακριτική/διαχωριστική ανάλυση (lineardiscriminantanalysis) CART:Δένδρα κατάταξης και παλινδρόμησης (Classification and Regression Trees) RDA: Ομαλοποιημένη ανάλυση διακριτότητας (Regularised Discriminant Analysis) PLS: μερικών ελάχιστων τετραγώνων (partial least square) SIMCA: soft independent modeling of class analogy FT-MIR σε συνδυασμό με πολυμεταβλητή ανάλυση δεδομένων FT-MIR με PCA, CA, LDA, CART, RDA FT-NIR με χρήση PCA και SIMCA FT-MIR με PCA και PLS Roxana Bancet. al. [57] Elena Ioannou-Papayianni et. al. [58] M.J.C. Pontes et.al. [59] Dila Yucesoy, Banu Ozen [60] Ποιοτικός έλεγχος FT-IR και GC-FID με PLS Ofélia Anjos et. al. [56] 59

77 4.2 Αναλύσεις λόγου σταθερών ισοτόπων (SIRA) Η απαίτηση για αναλυτικές μεθόδους που μπορούν να επαληθεύσουν σωστά την αυθεντικότητα των προϊόντων διατροφής είναι πιο έντονη από ποτέ. Η ανάλυση του λόγου σταθερών ισοτόπων (Stable isotope ratio analysis-sira) αντιπροσωπεύει κάποιες από τις πιο καθιερωμένες και αναγνωρισμένες μεθόδους για τον έλεγχο της αυθεντικότητας. Το σημαντικότερο πλεονέκτημα της μεθοδολογίας αυτής είναι η ικανότητά της να διαφοροποιεί ουσίες που είναι χημικά όμοιες. Σήμερα, η SIRA, αποτελέι έλεγχο ρουτίνας για την επαλήθευση της αυθεντικότητας σε προϊόντα όπως το κρασί, οι χυμοί φρούτων, το ελαιόλαδο, το μέλι, κ.λπ. Η πλειοψηφία των μεθόδων για την αυθεντικότητα τροφίμων και ποτών με τεχνικές SIRA εστιάζουν στα ισότοπα των στοιχείων:υδρογόνου (Η), οξυγόνου (Ο), αζώτου, άνθρακα (Ν), θείου (S). Το δ είναι ο ισοτοπικός λόγος ενός συστατικού (μορίου, αερίου) σε σχέση με μια πρότυπη τιμή (standard) επί Το δέλτα, είναι η «ταυτότητα» του κάθε υλικού και δίνεται από την παρακάτω εξίσωση: RS R R std std *1000, όπου R ο λόγος του βαρύτερου προς το ελαφρύτερο ισότοπο Η χρήση της ανάλυσης σταθερών ισοτόπων για έλεγχο ταυτότητας τροφίμων βασίζεται στο γεγονός ότι οι διάφορες μέθοδοι και αντιδράσεις (βιολογικές, βιοχημικές, φυσικές, χημικές, κ.λπ.) προκαλούν ισοτοπική κλασμάτωση και, κατά συνέπεια, δημιουργούν μοναδικές ισοτοπικές ταυτότητες. Τα σταθερά ισότοπα ενός στοιχείου έχουν ελαφρώς διαφορετικές χημικές και φυσικές ιδιότητες λόγω των διαφορών τους στην ατομική μάζα [61,62]. Σχήμα 4.2.1:Διάγραμμα ροής ανάλυσης δείγματος με μεθόδους SIRA. 60

78 Πίνακας 4.2.1: Τα στοιχεία, τα σταθερά ισότοπά τους και οι πληροφορίες που δίνουν κατά τον έλεγχο της αυθεντικότητας. Στοιχείο Ισότοπα Φυσική αφθονία Συμβολισμός δ Διαδικασίες κλασματοποίησης Πληροφορίες Υγρογόνο 1 Η 2 Η δ 2 Η εξάτμιση, συμπύκνωση, κατακρημνίσεις, διαπνοή γεωγραφικός τόπος, είδος νερού, ποσοστό λίπανσης Άνθρακας 12 C 13 C δ 13 C αφομοίωση CO2, στοματική αγωγιμότητα είδος νερού, ποσοστό λίπανσης Άζωτο 14 N 15 N δ 15 Ν διαδικασία μετατροπής Ν, ατμοσφαρική απώλεια είδος και ποσοστό λίπανσης Οξυγόνο 16 O 17 O 18 O δ 18 Ο εξάτμιση, συμπύκνωση, κατακρημνίσεις, διαπνοή γεωγραφικός τόπος, είδος νερού, ποσοστό λίπανσης Θείο 32 S 33 S 34 S 36 S δ 34 S διαδικασία μετετροπής S, σταγονίδια πλούσια σε άλατα (sea spray) γεωγραγικός τόπος, είδος λιπάσματος Φασματομετρία Μάζας Λόγου Ισοτόπων (IR-MS) Επείδη, όπως έχει αναφερθεί, ένα προϊόν για να θεωρείται αυθεντικό/γνήσιο θα πρέπει να συνάδει και με την περιγραφή της επισήμανσης του, η τεχνική της Φασματοσκοπίας Μάζας Λόγου Ισοτόπων αποτέλει μια από τις μεθόδους που έχουν ευρεία χρήση σε αυτόν τον τομέα τόσο για τη διερεύνηση της βοτανικής αλλά και της γεωγραφικής προέλευσης των δειγμάτων. Κάποιες από τις εφαρμογές της είναι: Η ανίχνευση τεχνητών γλυκαντικών σε τρόφιμα που υποτίθενται πως είχαν φυσικά γλυκαντικά 61

79 Η ανίχνευση νοθείας μελιού με σιρόπια άλλων φυτών (καλαμπόκι, ζαχαροκάλαμο) Αυθεντικότητα αρώματος μήλου στους χυμούς μήλου Προσθήκη τεχνητού κιτρικού οξέος σε φυσικούς χυμούς πορτοκαλιού Η αυθεντικότητα τροφίμων που πωλούνται ως βιολογικά Η αυθεντικότητα κρεάτων που πωλούνται ως βιολογικά [62]. Όπως φαίνεται και στο Σχήμα ένα φασματόμετρο Μάζας Λόγου Ισοτόπων αποτελείται από τα εξής μέρη: το φασματόμετρο μάζας, ένα στοιχειακό αναλυτή με ροή ηλίου και οξυγόνου, για καύση της αιθανόλης και μετατροπή της σε διοξείδιο του άνθρακα με ταυτόχρονη απομάκρυνση των υπόλοιπων προϊόντων καύσεως. Επίσης, από ένα θερμοστατικό σύστημα για την υλοποίηση ισορροπίας μεταξύ του νερού του δείγματος και του διοξειδίου του άνθρακα, αυτόματους δειγματολήπτες και τέλος έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή. Σχήμα :Οργανολογία IR-MS Κατά τη φωτοσύνθεση, η αφομοίωση του διοξειδίου του άνθρακα από τα φυτά γίνεται με δύο βασικούς τύπους μεταβολισμού α) τον C3 β) τον C4 κύκλο. Τα προϊόντα που προέρχονται από τα φυτά του C4 κύκλου (ζαχαροκάλαμο, καλαμπόκι) παρουσιάζουν υψήλοτερες περιεκτικότητες σε 13 C από εκείνες των ομολόγων τους που προέρχονται από τα φυτά του C3 κύκλου (σταφύλι, σακχαρότευτλο). 62

80 Η περιεκτικότητα ενός δείγματος σε 13 C προσδιορίζεται από το διοξείδιο του άνθρακα που προκύπτει από από την πλήρη καύση του δείγματος. Οι συγκεντρώσεις των κύριων ισοτοπομερών με μάζες 44 ( 12 C 16 O 16 O), 45 ( 13 C 16 O 16 O, 12 C 17 O 16 O) και 46 ( 12 C 16 O 18 O), που προκύπτουν από τους διάφορους δυνατούς συνδυασμούς των ισοτόπων 16 O, 17 O, 18 O, 12 C, και 13 C προσδιορίζονται από τα ιονικά ρεύματα m/z που μετρώνται σε τρεις διαφορετικούς ανιχνευτές φασματομέτρου ισοτοπικής μάζας. Οι συνεισφορές των ισοτοπομερών 13 C 17 O 16 O και 12 C 17 O 17 O μπορούν να αγνοηθούν λόγω της πολύ χαμηλής συγκέντρωσής τους. Σχήμα : Μεταβολικοί κύκλοι Η κύρια πηγή οξυγόνου στα φυτά είναι το ατμοσφαιρικό οξυγόνο που αφομοιώνεται κατά τη φωτοσύνθεση και το νερό του εδάφους ως αποτέλεσμα των κλιματολογικών συνθηκών (βροχή, χιόνι, κ.λπ.). Η ισοτοπική τιμή του νερού του εδάφους επηρεάζεται άμεσα από τις καιρικές συνθήκες και τη γεωγραφική θεση (γεωγραφικό πλάτος, γεωγραφικό μήκος και απόσταση από τη θαλάσσια ακτή). Επιπλέον, κατά τη διαδικασία της διαπνοής και της φωτοσύνθεσης που γίνεται την περίοδο της ωρίμανσης των καρπών, εμπλουτίζεται ο ισοτοπικός διαχωρισμός τόσο του οξυγόνου όσο και του υδρογόνου στα φυτά και στα φρούτα. Ως αποτέλεσμα των πιο πάνω, η τιμή δ 18 Ο του νερού επηρεάζεται από τις γεωκλιματικές συνθήκες.ο ισοτοπικός λόγος 18 Ο/ 16 Ο στο νερό προσδιορίζεται με βάση τα ιονικά ρεύματα m/z 46 63

81 ( 12 C 16 O 18 O) και m/z 44 ( 12 C 16 O 16 O) που παράγονται μετά από την ανταλλαγή διοξειδίου του άνθρακα με το νερό του δείγματος, σύμφωνα με την αντίδραση: C 16 O2 +H2 18 O C 16 O 18 O + H2 16 O Ο προσδιορισμός του λόγου ισοτόπων 13 C/ 12 C γίνεται στο απόσταγμα αιθανόλης που παραλαμβάνεται από τα δείγματα ενώ ο προσδιορισμός του λόγου ισοτόπων 18 Ο/ 16 Ο γίνεται απευθείας σε ποσότητα του δείγματος που έχει παραληφθεί αμέσως μόλις ανοίξει το μπουκάλι. Τα δείγματα εισάγονται διαδοχικά στο σύστημα και το διοξείδιο του άνθρακα κάθε καύσης δείγματος εκλούζεται στο φασματόμετρο μάζας, το οποίο μετρά τα ιονικά ρεύματα. Οι εντάσεις των ρευμάτων καταγράφονται στον υπολογιστή που είναι συνδεδεμένος με το όργανο και με χρήση του εξειδικευμένου λογισμικού υπολογίζονται οι τιμές δ για κάθε δείγμα. Κύκλοι 13 C ( ) C4-16 to -10 CAM -20 to -10 C3-33 to -24 Ο ισοτοπικός λόγος 13 C/ 12 C αιθανόλης του δείγματος, εκφράζεται από την απόκλισή του σε σχέση με το πρότυπο αέριο διοξείδιο του άνθρακα. Στη συνέχεια, υπολογίζεται η απόκλιση του ισοτόπου 13 C σε κλίμακα δ ανά από τους ισοτοπικούς λόγους του δείγματος 13 C/ 12 Csample και του πρότυπου αερίου 13 C/ 12 Cref σύμφωνα με τον τύπο: δ 13 C( )=1000* ( 13 C/ 12 Csample- 13 C/ 12 Cref)/ 13 C/ 12 Cref Ο ισοτοπικός λόγος 18 Ο/ 16 Ο μπορεί να εκφραστεί από την απόκλιση του δ σε σχέση με την τιμή ενός πιστοποιημένου υλικού αναφοράς όπου το δ 18 Ο=0. Στη συνέχεια, υπολογίζεται η απόκλιση του ισοτόπου 18 Ο σε κλίμακα δ ανά από τους ισοτοπικούς λόγους του δείγματος 18 Ο/ 16 Οsample και ενός δείγματος αναφοράς 18 Ο/ 16 Οref, σύμφωνα με τον τύπο: δ 18 Οcorrectedn=(δ 18 Οmesearedn-ΔWCtop)+[(ΔWCtop-ΔWCbottom)/m+1]*n 64

82 Όπου δ 18 Οcorrectedn είναι ο μέσος όρος των τιμών του λόγου των ισοτόπων του κάθε δείγματος, n είναι η θέση του δείγματος στη σειρά μετρήσεων, m είναι ο ολικός αριθμός των δειγμάτων στην κάθε παρτίδα και ΔWCtop/ΔWCbottom είναι η διαφορά των τιμών δ 18 Ο μεταξύ της αποδεκτής τιμής του υλικού αναφοράς από την ευρεθείσα τιμή του που μετριέται κάθε φορά στην αρχή και στο τέλος των αναλύσεων [63,64] SNIF-NMR Ο καθηγητής Gerard Martin ανακάλυψε τη μέθοδο που βασίζεται στην παρατήρηση του δευτερίου χωρίς να αποκλείεται στο μέλλον η ανάπτυξη παρόμοιας μεθοδολογίας για την παρατήρηση άλλων πυρήνων. Χρησιμοποιείται για τον έλεγχο αυθεντικότητας μεγάλου αριθμού προϊόντων ή ενώσεων όπως: Οίνοι και αλκοολούχα ποτά Χυμοί φρούτων Αρωματικές και άλλες ουσίες (βανιλλίνη, ανιθόλη, βενζαλδεΰδη, οξικό οξύ, α-πινένιο, καφεΐνη, ευγενόλη, λεμονένιο, μενθόλη) [65-67]. Η μέθοδος SNIF-NMR (Natural Isotope Fractionation -Nuclear Magnetic Resonance) ή φυσικός ισοτοπικός διαχωρισμός ειδικής θέσης μελετώμενος με πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό ή πυρηνικός μαγνητικός συντονισμού δευτερίου βασίζεται στην παρατήρηση του δευτερίου λόγω του φυσικού ισοτοπικού διαχωρισμού του, σαν συνάρτηση του μεταβολισμού των φυτών και του γεωκλιματικού περιβάλλοντός του. Τα άτομα δευτερίου που περιέχονται στα σάκχαρα και το νερό ανακατανέμονται μετά τη ζύμωση στο μεθύλιο (Ι), το μεθυλένιο (ΙΙ) και το υδροξύλιο (ΙΙΙ) της αιθανόλης που λαμβάνεται μετά από απόσταξη του δείγματος: CH2DCH2OH CH3CHDOH CH3CH2OD Ι II IΙΙ H προσθήκη εξωγενών σακχάρων (chaptalisation) ή νερού πριν από τη ζύμωση του γλεύκους έχει αντίκτυπο στην ανακατανομή του δευτερίου. 65

83 Η ισοτοπική αναλογία του δευτερίου ως προς το πρωτόνιο στη θέση Ι της αιθανόλης (D/H)ι, αντιπροσωπεύει κυρίως το φυτικό είδος που έχει συνθέσει το σάκχαρο και σε μικρότερο βαθμό τη γεωγραφική θέση του τόπου συγκομιδής (φύση νερού που χρησιμοποιήθηκε κατά την φωτοσύνθεση). Το (D/H)ιι, αντιπροσωπεύει τη γεωγραφική θέση του τόπου συγκομιδής (φύση νερού που χρησιμοποιήθηκε κατά την φωτοσύνθεση και μετεωρολογικές συνθήκες) και, σε μικρότερο βαθμό, τη συγκέντρωση του σακχάρου στο δείγμα. Πίνακας : Εφαρμογές ισοτοπικών αναλύσεων στην αυθεντικότητα ποτών. Προϊόν Σκοπός Μέθοδος Πηγή Αφρώδεις οίνοι Αυθεντικότητα, έλεγχος εξωγενούς προσθήκης CO 2 Εφαρμογή IR-MS σε συνδυασμό με ANOVA [68] Βραζιλιάνικο μπράντι Αυθεντικότητα Εφαρμογή SNIF-NMR με PCA [69] ANOVA: Ανάλυση διακύμανσης (Analysis of variance) PCA: Ανάλυση κύριων συνιστωσών (principal component analysis) Η αρχή της μεθόδου βασίζεται στον υπολογισμό λόγων (D/H)I, (D/H)II και R=2(D/H)II/(D/H)I, που εκφράζει τη σχετική κατανομή του δευτερίου στις θέσεις Ι και ΙΙ, στις δύο θέσεις του μορίου της αιθανόλης μέσω της παραλαβής του φάσματος NMR με τη χρήση εσωτερικού προτύπου γνωστού ισοτοπικού λόγου. Ως εσωτερικό πρότυπο για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιείται το TMU (Ν,Ν-τετραμεθυλουρία) και ως σταθεροποιητής του πεδίου συχνότητας (lock) το εξαφθοροβενζόλιο. Επίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί και τριφθορικό οξύ το οποίο ελαττώνει το πλάτος του σήματος του ΟΗ και το σταθεροποιεί στα 5.5 ppm περίπου [70,71]. 66

84 Σχήμα : Φάσμα 2 Η-NMR της αιθανόλης. 4.3 Τεχνικές προκατεργασίας δειγμάτων Περιστροφικός συμπυκνωτής (rotary evaporator) Το σημείο ζέσεως των ουσιών εξαρτάται από την εξωτερική πίεση, όπως περιγράφεται μαθηματικά από την εξίσωση Clausius Clapeyron: Όπου P = Τάση ατμών της ένωσης ΔΗ = Μοριακή ενθαλπία εξαέρωσης Τ = Απόλυτη θερμοκρασία R = Σταθερά των αερίων Σύμφωνα λοιπόν με την παραπάνω εξίσωση το Σ.Ζ. των ουσιών ελαττώνεται με μείωση της πίεσης. Ο περιστροφικός συμπυκνωτής είναι μία συσκευή, η οποία έχει σχεδιασθεί για τη γρήγορη απομάκρυνση μεγάλης ποσότητας πτητικών ενώσεων από διαλύματα σε μειωμένη πίεση. Αυτό που κάνει την περιστροφική εξάτμιση να ξεχωρίζει από τις άλλες μεθόδους απόσταξης υπό μειωμένη πίεση, είναι το γεγονός ότι η αποστακτική φιάλη περιστρέφεται κατά τη διάρκεια της απόσταξης. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου οφείλονται στην περιστροφή της φιάλης, όπου από τη μία πλευρά το διάλυμα θερμαίνεται σε μεγάλη επιφάνεια καθιστώντας την απόσταξη γρήγορη και από την άλλη 67

85 αποφεύγονται οι εκτινάξεις κατά τη συμπύκνωση διαλυμάτων στερεών ουσιών, κάτι που έχει ως αποτέλεσμα τον περιορισμό του κινδύνου ατυχήματος. Στο παρακάτω σχήμα απεικονίζεται, ένας βασικός τύπος συσκευής περιστροφικού συμπυκνωτή [72,73] Τεχνική Διασποράς σε παστίλιες KBr Η τεχνική που εφαρμόζεται για τη μέτρηση του φάσματος υπερύθρου ενός υλικού εξαρτάται από τη φυσική κατάσταση του δείγματος, η οποία και καθορίζει τον τρόπο αλληλεπίδρασης της δέσμης υπερύθρου με το δείγμα. Η πλέον διαδεδομένη και εύχρηστη τεχνική είναι η τεχνική της διαπερατότητας η οποία χρησιμοποιείται όταν το δείγμα μπορεί να παρασκευαστεί υπό μορφή λεπτού φίλμ (π.χ. πολυμερή υλικά), ή να διασπαρεί υπό μορφή κόνεως ή σταγονιδίων σε ένα αδρανές μέσο. Στην φασματική περιοχή του μέσου υπερύθρου (400 cm -1 έως 5,000 cm -1 ) κατάλληλα υλικά διασποράς είναι τα αλογονούχα άλατα των αλκαλίων (π.χ. KBr, NaCl, CsI), τα οποία δεν απορροφούν στην περιοχή αυτή, είναι σχετικά αδρανή και παρουσιάζουν μικρή υγροσκοπικότητα [74]. Στην περίπτωση του παρόντος ερευνητικού η τεχνική χρησιμοποιήθηκε αφού πρώτα τα δείγματα είχαν συμπυκνωθεί μέχρι σταγόνας με τον περιστροφικό συμπυκνωτή και η ποσότητα ήταν πολύ μικρή για να πραγματοποιηθεί λήψη φάσματος με ATR. 68

86 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 FTIR: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5.1 Δειγματοληψία Η παρούσα ερευνητική μελέτη περιλαμβάνει πενήντα τρία (53) δείγματα, από τα οποία τα είκοσι δύο (22) ήταν ούζα και τα τριάντα ένα (31) ήταν διάφορα άλλα αποστάγματα. Η ομάδα των ούζων περιελάμβανε δείγματα 100% από απόσταξη αλλά και με ανάμιξη, από διάφορους παραγωγούς και και διαφορετικές περιοχές. Τα δείγματα αγοράστηκαν από την αγορά και ήταν όλα τυποποιημένα. Έγινε προσπάθεια συλλογής ποτών που έχουν αρωματιστεί με γλυκάνισο και από άλλες χώρες που να έχουν παρόμοια διαδικασία παραγωγής με το ούζο. Οι κατηγορίες ανισούχων περιελάμβαναν: Το αράκ (arak): Το εθνικό ποτό της Ιορδανίας, του Λιβάνου και της Συρίας. Προέρχεται από τη ζύμωση των σταφυλιών και ενίοτε του καλαμοσάκχαρου, των σύκων και των χουρμάδων. Πρόκειται για απόσταγμα άγλυκο, στο οποίο προστίθεται εκχύλισμα γλυκάνισου. Η κατ όγκον περιεκρικότητά του σε αλκοόλ συνήθως κυμαίνεται 40-55%. Τη λευκή σαμπούκα (sambuca): λικέρ με βάση την ανηθόλη αλλά και την κουφοξυλιά με αλκοολικό τίτλο 38-42%. Είναι γλυκό ποτό με έντονο άρωμα του γλυκάνισου που προέρχεται από την Ιταλία. Το τσίπουρο: απόσταγμα στεμφύλων που πολλές φορές έχει αρωματιστεί με γλυκάνισο και παράγεται στην Ελλάδα. Επίσης μελετήθηκαν και άλλα αποστάγματα όπως βότκα, ουίσκι, ζιβανία, ρούμι, γκράπα. Στον επόμενο πίνακα φαίνονται τα δείγματα του ούζο, η περιοχή προέλευσης καθώς και η κατηγορία. Όπου αναγράφεται «ΟΥΖΟ» σημαίνει πως έχει προκύψει από ανάμιξη ενώ «ΟΥΖΟ-100%» σημαίνει πως έχει προκύψει 100% από απόσταξη. 69

87 Πίνακας 5.1.1: Δείγματα ούζου που μελετήθηκαν. α/α Εμπορική Ονομασία Κατηγορία Προέλευση Αλκοολικός Τίτλος S1 Ούζο Χατζηπαύλου OYZO Κύπρος 43,0 S2 Ούζο ΚΕΟ OYZO Κύπρος 45,0 S3 Ούζο Γαλαξία Μυτιλίνης OYZO Μυτιλίνη-Λέσβος 38,0 S4 Ούζο Γαλαξία OYZO Άρτα 38,0 S5 Ούζο ΑΒ OYZO Καρλόβασι- Σάμος 40,0 S6 Ούζο ECONOMY OYZO Σάμος 37,5 S7 Πιτσιλαδί OYZO-100% Πλωμάρι-Λέσβος 40,0 S8 Καρδάση OYZO Τύρναβος- Λάρισα 40,0 S9 Ούζο ΜΙΝΙ OYZO Μυτιλίνη-Λέσμος 40,0 S10 Ούζο Ματαρέλλη OYZO-100% Λισβόρι-Λέσβος 40,0 S11 Κορυφαίος OYZO Κομοτηνή 40,0 S12 Χατζόπουλος OYZO Αλεξανδρούπολη 40,0 S13 Καζανιστό Στουπάκη OYZO-100% Χίος 40,0 S14 Τσάνταλη OYZO Χαλκιδική 38,0 S15 Ηδωνικό OYZO-100% Ανδριανή-Δράμα 40,0 S16 Ούζο 12 OYZO Βόλος 40,0 S17 Ούζο Πλωμαρίου OYZO-100% Πλωμάρι-Λέσβος 40,0 S18 Τζιβαέρι OYZO-100% Τύρναβος- Λάρισα 40,0 S19 Ούζο Κωστέας Κλασικό OYZO Kαλαμάτα 40,0 S20 Ούζο Κωστέας OYZO Kαλαμάτα 37,5 S21 Ούζο Κωστέας SPECIAL OYZO Kαλαμάτα 37,5 S22 Ούζο Γνήσιον OYZO Κύπρος 40,0 5.2 Λήψη φάσματος σε πλάκες ATR Η λήψη των απευθείας φασμάτων χωρίς να προηγηθεί κάποια κατεργασία έγινε με την τοποθέτηση μικρής ποσότητας, περίπου 0,7 ml στον υποδοχέα του δείγματος, φροντίζοντας το υγρό να δημιουργήσει μια στοιβάδα ομοιόμορφου πάχους σε όλη την επιφάνεια του ZnSe του υποδοχέα. Μετά από κάθε λήψη φάσματος οι πλάκες καθαρίζονταν με χαρτί και νερό πριν τοποθετηθεί το επόμενο δείγμα και μετά από κάθε δέκα δείγματα οι πλάκες καθαρίζονταν και με ακετόνη. 70

88 Εικόνα 5.2.1: Κρύσταλλος ZnSe για λήψη φάσματος με ATR 5.3 Συμπύκνωση δειγμάτων σε περιστροφικό συμπυκνωτή Για τη συμπύκνωση των δειγμάτων σε περιστροφικό συμπυκνωτή χρησιμοποιήθηκε συσκευή εξάτμισης Rotary Evaporator R-124, εταιρείας Buchi (Εικόνα 5.3.1). Τοποθετήθηκαν 40ml δείγματος σε σφαιρική φιάλη, σε θερμοκρασία 80 ºC και ταχύτητα 200 rpm (rounds per minute). Τα δείγματα συμπυκνώθηκαν μέχρις ελαίου. 5.4 Παρασκευή δισκίων KBr Για την παρασκευή των δισκίων KBr χρησιμοποιήθηκαν περίπου 100mg KBr, που κονιορτοποιήθηκαν πολύ καλά με τη βοήθεια μικρού γουδιού. Το μίγμα συμπιέστηκε σε περίπου psi, με ταυτόχρονη εφαρμογή κενού για την παραλαβή ιχνών υγρασίας. Κάθε δισκίο είχε, περίπου, διάμετρο 13mm και πάχος 1mm. Στη συνέχεια σε κάθε δισκίο με πιπέτα Pasteur εκχύθηκε μια σταγόνα από το δείγμα που είχε προκύψει από την συμπύκνωση. Τα δισκία με το δείγμα παρασκευάστηκαν την ίδια μέρα που έγινε η συμπύκνωση και έπειτα φυλάχθηκαν σε ξηραντήρα. Τα φάσματα λήφθηκαν την επόμενη ημέρα. Λόγω του ότι η απόσταξη των δειγμάτων είναι απαραίτητη για τη λήψη φασμάτων με την τεχνική του SNIF-NMR το υπόλειμμα της απόσταξης συλλέχθηκε και φάσματά του λήφθηκαν με κρύσταλλο ATR. 71

89 Εικόνα 5.4.1: Υδραυλική πρέσσα. 5.6 Λήψη φασμάτων με χρήση Φασματοσκοπίας Υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier, FTIR Τα φάσματα λήφθηκαν σε φασματοφωτόμετρο Jasco 6100, συνδεδεμένο με ηλεκτρονικό υπολογιστή με λογισμικό Spectra Manager II Software. Όλα τα φάσματα με ή χωρίς προκατεργασία λήφθηκαν στα cm -1, με 124 σαρώσεις (scans) και διακριτική ικανότητα (Resolution) 16 cm -1 (Εικόνα 5.6.1). Κάθε δείγμα αντιπροσωπεύεται από φάσμα 936 σημείων. Εικόνα 5.6.1: Φασματοφωτόμετρο υπερύθρου. 5.7 Μελέτη φασμάτων FTIR Στην παράγραφο αυτή θα μελετηθούν τα φάσματα που έχουν προκύψει από το FTIR. Θα γίνει σύγκριση τόσο διαφορετικών δειγμάτων αλλά και διαφορετικών προκατεργασιών. Θα πρέπει εξ αρχής να τονιστεί το γεγονός πως με καμία προκατεργασία δεν επιτεύχθηκε η διάκριση των δειγμάτων ούζο 100% από τα δείγματα ούζου με πρόσθηκη αιθέριων ελαίων. 72

90 %T Wavenumber [cm-1] Σχήμα 5.7.1: Σύγκριση φάσματος FTIR ούζου 100%, χωρίς προκατεργασία σε ATR, σε δισκίο έπειτα από συμπύκνωση και υπόλειμμα απόσταξης σε ATR. Η κορυφή που εμφανίζεται στα cm -1 (τάση C H) και στα cm -1 (τάση C O) οφείλεται στην αιθανόλη καθώς άλλες ομάδες όπως οργανικά οξέα, υδατάνθρακες και φαινόλες εμφανίζονται στην περιοχή των 1500 cm -1 και χαμηλότερα. Στο Σχήμα στο φάσμα του απευθείας δείγματος υπάρχει μία πιο έντονη κορυφή και στις δυο περιοχές σε σχέση με φάσμα του χαπιού. Το υπόλειμμα της απόσταξης δεν εμφανίζει κορυφή σε καμία από τις δυο περιοχές αφού έχει αποσταχθεί πλήρως όλη η ποσότητα της αιθανόλης. Στην περιοχή των cm -1 (τάση C O) και cm -1 (κάμψη O H) εμφανίζουν κορυφές τα οργανικά οξέα στα ενώ κορυφές στα cm -1 ανήκουν σε ανάγοντα σάκχαρα όπως γλυκόζη και φρουκτόζη [41, 42, 75-78]. Γι αυτό το λόγο είναι και πιο έντονη η κορυφή στην περιοχή των cm -1 στο φάσμα του χαπιού. Η περιοχή από τα 4000 έως τα 3600 cm -1 και οι κορυφές στα cm -1 μας παρέχουν ελάχιστες χρήσιμες πληροφορίες καθώς ένα μεγάλο εύρος 73

91 ομάδων απορροφά σε αυτή την περιοχή άρα δεν μπορούμε με ακρίβεια να γνωρίζουμε ποιες ακριβώς είναι [55]. Η ανάλυση των φασμάτων FTIR ούζου δείχνει δονήσεις τάσης στην περιοχή cm -1 και cm -1 που οφείλονται στο δεσμό Ο-Η (Σχήμα 5.7.1). Οι κορυφές μεταξύ των 1565 και 965 cm -1 είναι στην περιοχή του δακτυλικού αποτυπώματος όπου περιλαμβάνονται πολλές διαφορετικές ζώνες στο υπέρυθρο, συμπεριλαμβανομένων των δονήσεων πο προκαλούνται από τους δεσμούς C O, C C, C OH, C H, και C=N. Επίσης λόγω του γλυκάνισου αλλά και των άλλων αρωματικών φυτών που χρησιμοποιούνται στο ούζο παρατηρούνται ενώσεις της κατηγορίας των φαινυλοπροπανοειδών που περιέχουν βενζολικό δακτύλιο. Κύριοι εκπρόσωποι της κατηγορίας είναι η ανηθόλη η μέθυλο-χαβικόλη (ή εστραγόλη), η ευγενόλη, η κινναμωμική αλδεΰδη και η βανιλλίνη. Δικαιολογούνται έτσι οι έντονες απορροφήσεις στα 1700 cm -1 που οφείλονται στις δονήσεις των ανθράκων του αρωματικού δακτυλίου [79]. Από τη νομοθεσία επιτρέπεται η προσθήκη ζάχαρης κατά την παραγωγική διαδικασία του ούζου ενώ στα τσίπουρα απαγορεύεταιι. Στο σχήμα συγκρίνονται τα φάσματα ούζου, τσίπουρου με γλυκάνισο και τσίπουρου χωρίς γλυκάνισο αφού έχουν υποστεί συμπύκνωση μέχρις ελαίου και έχουν εκχυθεί σε δισκίο KBr. Αναμένουμε το συμπύκνωμα του ούζου να έχει μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε σάκχαρα, το οποίο επιβεβαιώνεται καθώς στην περιοχή των σακχάρων, cm -1,το ούζο εμφανίζει περισσότερες κορυφές. Στα φάσματα, στο Σχήμα 5.7.2, παρατηρείται πως χωρίς την προκατεργασία της συμπύκνωσης και της έκχυσης σε δισκίο δεν επιτυγχάνεται κάποια ικανοποιητική διάκριση. Ειδικότερα τα δυο τσίπουρα έχουν σχεδόν πανομοιότυπα φάσματα. Με τη συμπύκνωση έχει απομακρυνθεί τόσο το νερό όσο και η αιθανόλη και έτσι επιτυγχάνεται μεγαλύτερη διάκριση που μπορεί να οφείλεται τόσο στην ύπαρξη περισσότερων σακχάρων στο ούζο αλλά και της ύπαρξης ενώσεων που προέρχονται από την προσθήκη διαφόρων αρωματικών φυτών. 74

92 Σχήμα 5.7.2: Σύγκριση φάσματος FTIR ούζου 100%, τσίπουρου χωρίς γλυκάνισο και τσίπουρο με γλυκάνισο σε δισκίο έπειτα από συμπύκνωση (πάνω) αλλά και απευθείας σε ATR (κάτω). 75

93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 FTIR: ΧΗΜΕΙΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΣΜΑΤΩΝ Στην παρούσα ενότητα θα γίνει ανάλυση όσων χημειομετρικών τεχνικών έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. Το ενδιαφέρον θα επικεντρωθεί τόσο στην επεξήγηση των διακρίσεων των ομάδων αλλά και στην κατανόηση αυτών των διακρίσεων. Επεξεργάστηκαν στατιστικά τα φασματοσκοπικά δεδομένα που προέκυψαν από τη λήψη φασμάτων FT-IR σε όλα τα δείγματα, ανεξαρτήτως προκατεργασίας και τεχνικής λήψης. Η χημειομετρική ανάλυση των φασματοσκοπικών δεδομένων στα δείγματα έγινε με τη χρήση των λογισμικών προγραμμάτων SCAN και SIMCA. Το λογισμικό SIMCA έχει τη δυνατότητα εισαγωγής μεγάλου αριθμού παραμέτρων, 936 σημεία (variants) για τα φάσματα FTIR ενώ το λογισμικό SCAN μπορεί να επεξεργαστεί μικρότερο αριθμό παραμέτρων αλλά είναι πιο εύκολο στη χρήση του. Σε όλα τα φασματοσκοπικά δεδομένα που προέκυψαν από όλους τους τρόπους λήψης και προκατεργασίας εφαρμόστηκαν οι χημειομετρικές τεχνικές PCA, CART, SIMCA, LDA, HCA, CART, RDA. Οι μέθοδοι αυτές μπορούν να εφαρμοστούν στις κύριες συνιστώσες που προέκυψαν από την PCA και όχι στα αρχικά δεδομένα [52]. Ικανοποιητικά αποτελέσματα επιτεύχθηκαν μόνο με την απευθείας λήψη φασμάτων και με το δισκίο KBr, ενώ το υπόλειμμα της απόσταξης δεν έδωσε κάποια επιτυχή διάκριση καθώς ήταν υψηλό το ποσοστό σφάλματος (>30%). Στη συνέχεια θα παρατεθούν οι χημειομετρικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν ανά είδος προκατεργασίας. Τα φασματοσκοπικά δεδομένα που προέκυψαν από την απευθείας λήψη φασμάτων FTIR δίνουν πολύ καλή διάκριση της ομάδας των ούζων από άλλα αποστάγματα αλλά και τη διάκριση των ελληνικών αποσταγμάτων. Επίσης, τα φασματοσκοπικά δεδομένα που προέκυψαν από τη χρήση χαπιών KBr οδήγησαν στη διάκριση των ελληνικών ούζων από κυπριακά ή άλλα ανισούχα αποστάγματα και τέλος τη διάκριση αποσταγμάτων με ή χωρίς γλυκάνισο. Στο επόμενο κεφάλαιο θα 76

94 διερευνηθεί αν ισχύει η διάκριση αυτή και στα δεδομένα που προέκυψαν από τις μεθόδους SNIF-NMR και IR-MS. 6.1 Χημειομετρική Ανάλυση Φασμασματοσκοπικών Δεδομένων FTIR απευθείας σε ATR H χημειομετρική ανάλυση εφαρμόστηκε στα φάσματα FTIR των 53 δειγμάτων (Παράρτημα Πίνακας 1) τα οποία δεν υποβλήθηκαν σε καμία προκατεργασία πριν εκχυθούν στις πλάκες ATR. Η ανάλυση των φασμάτων αφορούσε όλη την περιοχή από έως 400 cm -1. και πραγματοποιήθηκε με το στατιστικό πακέτο SIMCA στα φάσματα απορρόφησης. Οι κύριες συνιστώσες υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της συνδιακύμανσης (Unit Variance). Σε κάθε φάσμα δείγματος αντιστοιχούν 940 μεταβλητές/σημεία. Αρχικά τα δείγματα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: 1η ομάδα : Τσίπουρα με και χωρίς γλυκάνισο (α/α 1-21) 2η ομάδα : Ούζα (α/α 22-43) 3η ομάδα : Διάφορα αποστάγματα (α/α 44-53) Το ποσοστό διακύμανσης της πρώτης κύριας συνιστώσας με τη μέθοδο της συνδιακύμανσης, ανέρχεται στο 83.9%, ενώ μαζί με τη δεύτερη κύρια συνιστώσα το αθροιστικό ποσοστό διακύμανσης φτάνει το 90,26% και με την τρίτη στο 91,69%. Με χρήση της Ανάλυση της Κύριας Συνιστώσας επιτεύχθηκε η διάκριση στα δείγματα ούζου από όλα τα υπόλοιπα αποστάγματα όπως φαίνεται στο Σχήμα Επιπλέον διακρίθηκαν τα ελλαδικά δείγματα απ όλα τα υπόλοιπα όπως φαίνεται στο Σχήμα

95 Πρώτη Κύρια Συνιστώσα Σχήμα 6.1.1: Διάκριση δειγμάτων ούζου με PCA στα φασματικά δεδομένα FTIR απευθείας σε ATR. Πρώτη Κύρια Συνιστώσα Σχήμα Διάκριση ελλαδικών δειγμάτων με PCA στα φασματικά δεδομένα FTIR απευθείας σε ATR. 78

96 6.2 Χημειομετρική Ανάλυση Φασμασματοσκοπικών Δεδομένων FTIR από δισκία KBr Μετά από την Ανάλυση Κύριων Συνιστωσών η οποία δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα όταν εφαρμόστηκε στα φασματοσκοπικά δεδομένα των χαπιών KBr, τα δείγματα ταξινομήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SCAN και της τεχνικής των Δένδρων Ταξινόμησης και Παλινδρόμησης (CARΤ). Πραγματοποιήθηκε λήψη φασμάτων τόσο στο IR ( cm -1 ) όσο και στο NIR ( cm -1 ) CART στα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-NIR από δισκία KBr Συγκρίθηκαν δείγματα ούζου κυπριακά και ελλαδικά αλλά και διάφορα ανισούχα ποτά άλλων χωρών (Παράρτημα Πίνακας 2). Συνολικά μελετήθηκαν 24 δείγματα στη φασματική περιοχή cm -1. Αρχικά τα δείγματα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: 1η ομάδα : Ελλαδικά ούζα (α/α 3-14 και 16-21) 2η ομάδα : Κυπριακά ούζα (α/α 1,2,15) 3η ομάδα : Διάφορα αποστάγματα (α/α 22-24) Τα αποτελέσματα που προκύπτουν βάση αλγόριθμων που εφαρμόστηκαν στη πρώτη παράγωγο δίνονται παρακάτω: Παράγοντας ταξινόμησης Fk για 24 δείγματα Τάξη Πιθανότητα Αρ. Δειγμάτων Αποστάσεις κέντρων τάξεων Συχνότητα σφάλματος δόμησης (No-model Error Rate): Επικινδυνότητα (No-model Risk): Η ικανότητα ταξινόμησης των ελλαδικών δειγμάτων ούζου στην ίδια ομάδα ήταν αρκετά υψηλή, αφού ταξινομήθηκαν 17 από τα 18 δείγματα στην ίδια ομάδα με ποσοστό ορθής πρόβλεψης 94.4% (Πίνακας 6.2.1) αλλά και η διασταυρωτική επιβεβαίωση της ίδιας ομάδας έχει ορθή πρόβλεψη 94.4%. 79

97 Πίνακας Ταξινόμηση σε τρεις ομάδες με CART Προκαθορισμένη τάξη Πραγματική Αρ. % ορθής Τάξη Δειγμάτων πρόβλεψης Ελλαδικά ούζα Κυπριακά ούζα Ξένα ανισούχα % Ποσοστό σφάλματος=16.7 Cross-validation Ελλαδικά ούζα Κυπριακά ούζα Ξένα ανισούχα % Ποσοστό σφάλματος=20.3 Τα κυπριακά ούζα δεν ταξινομήθηκαν ως ξεχωριστή ομάδα αλλά δύο από αυτά ταξινομήθηκαν στα ελλαδικά ούζα (α/α 1 και 2) και ένα στα ξένα ανισούχα (α/α 15). Τα ξένα ανισούχα αποτελούν ξεχωριστή ομάδα και κατά τη διασταυρωτική επιβεβαίωση (cross-validation) των τάξεων με ποσοστό ορθής πρόβλεψης 66.7 %. Από τα ελλαδικά ούζα μόνο ένα ταξινομήθηκε στα ξένα ανισούχα (α/α 13). Στο Σχήμα φαίνεται η αξιοπιστία της ταξινόμησης. Σχήμα : Επιτυχία ταξινόμησης σε συστάδες 24 δειγμάτων ούζων και άλλων ανισούχων ποτών. 80

98 Η χημειομετρική τεχνική CARΤ επιτρέπει στο χρήστη να διακρίνει μια λογική ομαδοποίηση των μεταβλητών και ένα διαφαινόμενο διαχωρισμό της ομάδας των ελλαδικών ούζων. Ο διαχωρισμός έγινε βάση κριτηρίου Gini. Η δομή της ταξινόμησης δίνεται στον πίνακα και στο δενδρόγραμμα του Σχήματος και περιέχει δυο τερματικούς κόμβους. Η ταξινόμηση της 1ης ομάδας έγινε με πιθανότητα 89.5 %. Πίνακας : Στοιχεία δόμησης του μοντέλου με CARΤ Προκαθορισμένη τιμή assigned class 3 Σχήμα : Δένδρο ταξινόμησης των 24 δειγμάτων σε 3 τάξεις. Η επιτυχία της δόμησης του μοντέλου δίνεται και στο Σχήμα σύμφωνα με τη μέθοδο Leave one out, δηλαδή ένα-ένα τα δείγματα ξεχωρίζουν από το σύνολο των 24 δειγμάτων, που αποτελούν το «Training set», στο οποίο στηρίζεται η δόμηση του μοντέλου και χρησιμοποιείται ως «Test set» για έλεγχο/ εξακρίβωση της ταξινόμησής τους. Αυτό επαναλαμβάνεται για όλα τα 81

99 δείγματα μέχρι τη δόμηση του μοντέλου και την ταξινόμηση των δειγμάτων σε αυτό. Παρατηρείται συσσώρευση των δειγμάτων στην 1η και 3η ομάδα τόσο κατά τη δόμηση του μοντέλου όσο και κατά την εξακρίβωσή του. Σχήμα : Σχηματική συμπεριφορά των 24 δειγμάτων με CARΤ CART στα φασματοσκοπικά δεδομένα FT-IR από δισκία KBr Συγκρίθηκαν δείγματα ούζου κυπριακά και ελλαδικά με δείγματα τσίπουρου με και χωρίς γλυκάνισο (Παράρτημα Πίνακας 3). Συνολικά μελετήθηκαν 43 δείγματα στη φασματική περιοχή cm -1. Αρχικά τα δείγματα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες: 1η ομάδα : Αποστάγματα χωρίς γλυκάνισο, δηλαδή 13 τσίπουρα, 1 τσικουδιά, 1 ζιβανία, 1 χαρουπόρακο (α/α 1-16) 2η ομάδα : Αποστάγματα με γλυκάνισο, 20 ούζα και 7 τσίπουρα με γλυκάνισο (α/α 17-43) Τα αποτελέσματα που προκύπτουν βάση αλγόριθμων που εφαρμόστηκαν στη πρώτη παράγωγο δίνονται παρακάτω: 82

100 Παράγοντας ταξινόμησης Fk για 43 δείγματα Τάξη Πιθανότητα Αρ. Δειγμάτων Αποστάσεις κέντρων τάξεων Συχνότητα σφάλματος δόμησης (No-model Error Rate): Επικινδυνότητα (No-model Risk): Η ικανότητα ταξινόμησης των δειγμάτων με γλυκάνισο στην ίδια ομάδα ήταν αρκετά υψηλή, αφού ταξινομήθηκαν 27 από τα 27 δείγματα στην ίδια ομάδα με ποσοστό ορθής πρόβλεψης 100% (Πίνακας ) αλλά και η διασταυρωτική επιβεβαίωση της ίδιας ομάδας έχει ορθή πρόβλεψη 100%. Πίνακας Ταξινόμηση σε δυο ομάδες με CART Πραγματική Τάξη Προκαθορισμένη τάξη Αρ. 1 2 Δειγμάτων % ορθής πρόβλεψης Χωρίς γλυκάνισο Με γλυκάνισο % Ποσοστό σφάλματος=0.00 Cross-validation Χωρίς γλυκάνισο Με γλυκάνισο % Ποσοστό σφάλματος=2.33 Τα αποστάγματα που έχουν αρωματιστεί με γλυκάνισο, είτε 100% μέσω απόσταξης είτε με την προσθήκη αιθέριων ελαίων ταξινομήθηκαν όλα σε μια ομάδα. Τα αποστάγματα που δεν έχουν αρωματιστεί με γλυκάνισο αποτελούν ξεχωριστή ομάδα και κατά τη διασταυρωτική επιβεβαίωση (cross-validation) των τάξεων με ποσοστό ορθής πρόβλεψης 93.7 %. Από αυτή την ομάδα μόνο η τσικουδιά κατατάχθηκε στα αποστάγματα με γλυκάνισο (α/α 16). Στο Σχήμα φαίνεται η αξιοπιστία της ταξινόμησης. 83

101 Σχήμα : Επιτυχία ταξινόμησης σε συστάδες 43 δειγμάτων με ή χωρίς γλυκάνισο αποσταγμάτων. Η χημειομετρική τεχνική CARΤ επιτρέπει στο χρήστη να διακρίνει μια λογική ομαδοποίηση των μεταβλητών και ένα διαφαινόμενο διαχωρισμό της ομάδας των αποσταγμάτων που περιέχουν γλυκάνισο. Ο διαχωρισμός έγινε βάση κριτηρίου Gini. Η επιτυχία της δόμησης του μοντέλου δίνεται και στο Σχήμα σύμφωνα με τη μέθοδο Leave one out, δηλαδή ένα-ένα τα δείγματα ξεχωρίζουν από το σύνολο των 43 δειγμάτων, που αποτελούν το «Training set», στο οποίο στηρίζεται η δόμηση του μοντέλου και χρησιμοποιείται ως «Test set» για έλεγχο/ εξακρίβωση της ταξινόμησής τους. Αυτό επαναλαμβάνεται για όλα τα δείγματα μέχρι τη δόμηση του μοντέλου και την ταξινόμηση των δειγμάτων σε αυτό. Παρατηρείται συσσώρευση των δειγμάτων στην 1η και 2η ομάδα τόσο κατά τη δόμηση του μοντέλου όσο και κατά την εξακρίβωσή του. 84

102 Σχήμα : Σχηματική συμπεριφορά των 43 δειγμάτων με CARΤ. 85

103 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 ΙΣΟΤΟΠΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ: ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7.1 Δειγματοληψία Η ισοτοπική μελέτη περιλαμβάνει σαράντα τρία (43) δείγματα, από τα οποία τα είκοσι δύο (22) είναι ούζα και τα είκοσι ένα (21) διάφορα άλλα αποστάγματα τα οποία είχαν μελετηθεί και με την τεχνική της φασματοσκοπίας FTIR. Η ομάδα των ούζων περιλάμβανει δείγματα 100% από απόσταξη αλλά και με ανάμιξη, από διάφορους παραγωγούς και διαφορετικές περιοχές. Στα υπόλοιπα δείγματα περιλαμβάνονται τσίπουρα με και χωρίς γλυκάνισο καθώς και τσικουδιά. Όλα τα δείγματα είναι ελλαδικά εκτός από τρία κυπριακά ούζα. Επίσης, είναι σημαντικό να τονιστεί πως η αλκοόλη στα τσίπουρα και στη τσικουδιά είναι πάντα οινικής προέλευσης ενώ στα ούζα μπορεί να είναι μελασσική (κυρίως) ή οινική. Στον Πίνακα 4 στο Παράρτημα φαίνονται τα δείγματα, η περιοχή προέλευσης καθώς και η κατηγορία. Όπου αναγράφεται «Ούζο» σημαίνει πως έχει προκύψει από ανάμιξη ενώ «Ούζο-100%» σημαίνει πως έχει προκύψει 100% από απόσταξη. Επιπλέον «Τσίπουρο Μ» σημαίνει τσίπουρο με γλυκάνισο ενώ «Τσίπουρο Χ» σημαίνει τσίπουρο χωρίς γλυκάνισο. 7.2 Προετοιμασία δειγμάτων για την τεχνική του SNIF-NMR Τα δείγματα προετοιμάστηκαν και αναλύθηκαν με χρήση του ολοκληρωμένου συστήματος εργαστηριακών αναλύσεων SNIF-NMR της Eurofins. Κάθε ενότητα του SNIF-NMR Concept ανταποκρίνεται στις απαιτήσεις του προτύπου EN ISO Τα συστήματα καθιστούν δυνατή την πλήρη ιχνηλασιμότητα των αναλύσεων SNIF-NMR, από το δείγμα μέχρι την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αναλυτικά η μέθοδος στην οποία βασίζεται ο προσδιορισμός των λόγων δευτερίου περιγράφεται στην υποενότητα Ο φασματογράφος που χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση για τον προσδιορισμό των λόγων δευτερίου (D/H)I, (D/H)II της αιθανόλης των δειγμάτων του πίνακα ήταν το μοντέλο N.M.R. Bruker Snif- Ultrashield 400 MHz (Σχήμα 7.2.1). 86

104 Για την προετοιμασία των δειγμάτων απαιτείται απόσταξη 50 ml δείγματος στους 78 C, λήψη αποστάγματος ικανοποιητικής απόδοσης απόσταξης, μέτρηση της υγρασίας στο απόσταγμα μέσω της τιτλομετρικής μεθόδου Karl Fischer και τέλος την προετοιμασία του σωλήνα, που θα τοποθετηθεί στο φασματογράφο. Εικόνα 7.2.1: Πορεία προσδιορισμού λόγων δευτερίου. Ιδιάιτερη προσοχή θα πρέπει να δίνεται κατά την προετοιμασία του σωλήνα SNIF-NMR. Αρχικά σε προζυγισμένο φιαλίδιο προστίθενται 1,3 ml από το πρότυπο TMU (N,N-τετραμεθυλουρία 99,9% καθαρότητας), 3,2 ml της αιθανόλης από την απόσταξη 95% v/v και ομογενοποιούνται. Έπειτα, γίνεται προσθήκη 150 μl C6F6 με στόχο τη σταθεροποίηση του πεδίου συχνότητας (μείωση πλάτους του σήματος ΟΗ). Τέλος, το μίγμα μεταγγίζεται σε προζυγισμένο σωλήνα SNIF-NMR 10mm, με σύριγγα και καπάκι φιλτραρίσματος όπου επαναζυγίζεται πριν την εφαρμογή του μαγνητικού πεδίου για να ελεγχθούν τυχόν απώλειες [80-84]. 7.3 Προετοιμασία δειγμάτων για την τεχνική του IR-MS Η ανάλυση των δειγμάτων για τον προσδιορισμό των ισοτοπικών λόγων C 13 /C 12, O 18 /O 16 πραγματοποιήθηκε σε φασματόμετρο μάζας ισοτοπικών λόγων Eurovector IR-MS Euro EA Elemental Analyser (Εικόνα 7.3.1). Η τεχνική προσδιορισμού των δ 18 Ο και δ 13 C επεξηγήθηκε αναλυτικά στο υποκεφάλαιο

105 Εικόνα 7.3.1: Πορεία προσδιορισμού ισοτόπων C 13 /C 12 και O 18 /O 16. Όσο αφορά την προετοιμασία των δειγμάτων για τον προσδιορισμό του δ 18 Ο, αμέσως μόλις ανοιγόταν το κάθε δείγμα και προτού λάβει χώρα οποιαδήποτε άλλη διαδικασία, έγινε λήψη με πιπέτα Pasteur ποσότητας ~2 ml. Η ποσότητα αυτή τοποθετήθηκε σε φιαλίδιο όπου σφραγίστηκε ερμητικά με parafilm μέχρι την ανάλυση. Είναι σημαντικό η λήψης της ποσότητας αμέσως μετά το άνοιγμα καθώς η έκθεση στο οξυγόνο της ατμόσφαιρας πιθανόν να επηρεάσει τον ισοτοπικό λόγο του οξυγόνου του δείγματος. Επιπλέον, για τον προσδιορισμό του δ 13 C 50 ml από το κάθε δείγμα οδηγούνται σε σφαιρική φιάλη των 200 ml και αποστάζονται στους 78 C. Σκοπός είναι η συλλογή αποστάγματος καθαρότητας >95% σε αιθανόλη, μέρος του οποίου συλλέγεται σε φιαλίδιο, κλείνεται ερμητικά και οδηγείται για ανάλυση. Όλα τα προπαρασκευαστικά στάδια πρέπει να εκτελούνται χωρίς καμία σημαντική απώλεια αιθανόλης από εξάτμιση που θα άλλαζε την ισοτοπική σύσταση του δείγματος. Σε κάθε περίπτωση ο αναγκαίος όγκος υγρού τοποθετούνταν σε κάψα με τη βοήθεια μικροσιφωνίου η οποία κλεινόταν απολύτως στεγανά με τη βοήθεια λαβίδας. Για κάθε δείγμα, ετοιμάζονταν δύο κάψες, οι οποίες τοποθετούνταν στον αυτόματο δειγματολήπτη του στοιχειακού αναλυτή [84-86]. 88

106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 ΙΣΟΤΟΠΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ: ΧΗΜΕΙΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Στο κεφάλαιο αυτό θα μελετηθεί η χρήση των σταθερών ισοτόπων, δηλαδή της φασματοσκοπίας SNIF-NMR και IRMS σε συνδυασμό με τις χημειομετρικές τεχνικές PCA και PLS-DA για να διαπιστωθεί εάν μπορεί να επιτευχθεί διάκριση των ούζων τόσο μεταξύ τους όσο και από τα τσίπουρα. Για τη χημειομετρική επεξεργασία των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πακέτο SIMCA. Οι μεταβλητές που χρησιμοποιήθηκαν, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 8.1, βάσει των οποίων επιτεύχθηκε διάκριση είναι οι τιμές των λόγων ισοτόπων του άνθρακα 13 C/ 12 C, του οξυγόνου 18 O/ 16 O, του δευτερίου (D/H)I, (D/H)II και η αναλογία R αλλά και ο αλκοολικός βαθμός. Πίνακας 8.1.: Τιμές των σταθερών ισοτοπικών λόγων των δειγμάτων της μελέτης. α/α Είδος Προέλευση Αλκ. Βαθμός (%v/v) (D/H)I (ppm) (D/H)II T1 Τσίπουρο Χ Άρτα 40,00 105,44 129,46 2,456-26,20-5,46 T2 Τσίπουρο Χ Τύρναβος-Λάρισα 40,00 104,80 130,41 2,489-27,21-8,46 T3 Τσίπουρο Χ Καρδίτσα 40,00 103,39 132,37 2,561-27,18-6,10 T4 Τσίπουρο Μ Καρδίτσα 44,00 104,12 133,00 2,555-27,34-6,37 T5 Τσίπουρο Χ Καλαμάτα 38,00 104,86 131,07 2,500-25,13-5,85 T6 Τσίπουρο Χ Καλαμάτα 41,00 102,40 130,85 2,556-26,67-4,40 T7 Τσίπουρο Χ Κομοτηνή 40,00 103,70 130,27 2,512-27,54-8,49 T8 Τσίπουρο Μ Κομοτηνή 40,00 103,47 131,26 2,537-27,87-9,11 T9 Τσίπουρο Χ Κέδρος-Καρδίτσα 42,00 103,05 131,43 2,551-26,75-7,76 T10 Τσίπουρο Μ Κέδρος-Καρδίτσα 42,00 103,65 132,88 2,564-26,34-6,87 T11 Τσίπουρο Μ Ραξά-Καρδίτσα 42,00 104,32 129,58 2,484-27,75-8,47 T12 Τσίπουρο Χ Ραξά-Καρδίτσα 41,00 104,35 129,56 2,483-27,71-8,62 T13 Τσίπουρο Μ Κρόκιο-Θεσσαλία 42,50 103,92 129,21 2,487-27,34-5,46 T14 Τσίπουρο Χ Κρόκιο-Θεσσαλία 40,00 104,25 129,45 2,484-27,84-8,11 T15 Τσίπουρο Χ Αλεξανδρούπολη 40,00 102,53 130,33 2,542-27,19-8,45 T16 Τσίπουρο Χ Τύρναβος-Λάρισα 40,00 105,09 130,69 2,487-28,01-5,42 T17 Τσίπουρο Μ Χαλκιδική 42,00 103,73 131,00 2,526-25,83-10,39 T18 Τσίπουρο Μ Άρτα 40,00 104,10 130,71 2,511-26,48-6,67 T19 Τσίπουρο Χ Αθήνα 40,00 105,30 133,45 2,535-22,59-3,40 K1 Τσικουδιά Ηράκλειο-Κρήτη 40,00 105,59 135,71 2,570-25,14-0,77 O1 Ούζο Κύπρος 43,00 112,69 130,96 2,324-13,01-5,95 (ppm) R 13 C ( ) 18 O ( ) 89

107 O2 Ούζο Κύπρος 45,00 108,96 124,54 2,286-14,98-5,93 O3 Ούζο Μυτιλήνη-Λέσβος 38,00 115,88 133,03 2,296-15,67-7,24 O4 Ούζο Άρτα 38,00 108,74 122,56 2,254-13,38-8,22 O5 Ούζο Καρλόβασι-Σάμος 40,00 97,28 125,43 2,579-26,14-0,97 O6 Ούζο Σάμος 37,50 106,62 125,51 2,354-15,22-6,82 O7 Ούζο-100% Πλωμάρι-Λέσβος 40,00 100,75 127,94 2,540-26,20-8,43 O8 Ούζο Τύρναβος-Λάρισα 40,00 105,84 126,00 2,381-15,73-9,13 O9 Ούζο Μυτιλήνη-Λέσβος 40,00 105,61 121,60 2,303-16,27-7,57 O10 Ούζο-100% Λισβόρι-Λέσβος 40,00 96,07 120,72 2,513-24,49-8,62 O11 Ούζο Κομοτηνή 40,00 108,12 125,97 2,330-14,03-8,36 O12 Ούζο Αλεξανδρούπολη 40,00 96,28 122,56 2,546-23,88-7,26 O13 Ούζο-100% Χίος 40,00 101,31 122,60 2,420-19,86-7,70 O14 Ούζο Χαλκιδική 38,00 107,68 120,67 2,241-13,86-9,29 O15 Ούζο-100% Αδριανή-Δράμα 40,00 116,69 132,53 2,271-14,79-8,72 O16 Ούζο Βόλος 40,00 110,11 129,41 2,351-13,88-10,05 O17 Ούζο-100% Πλωμάρι-Λέσβος 40,00 95,34 120,21 2,522-24,90-8,59 O18 Ούζο-100% Τύρναβος-Λάρισα 40,00 97,38 126,43 2,597-26,63-9,42 O19 Ούζο Καλαμάτα 40,00 93,42 123,35 2,641-26,53-8,33 O20 Ούζο Καλαμάτα 37,50 93,26 124,00 2,659-26,47-8,25 O21 Ούζο Καλαμάτα 37,50 100,97 126,11 2,498-25,73-8,13 O22 Ούζο Κύπρος 40,00 108,56 125,11 2,305-14,71-7, Σύγκριση ούζων μεταξύ τους Συγκρίθηκαν δείγματα ούζου κυπριακά και ελλαδικά με σκοπό τη διάκριση των δειγμάτων που έχουν αρωματιστεί 100% με απόσταξη από αυτά που έχουν αρωματιστεί με προσθήκη ελαίων (Παράρτημα Πίνακας 4). Χρησιμοποιήθηκε η διακριτική ανάλυση μερικών ελαχίστων τετραγώνων (PLS-DA). Συνολικά μελετήθηκαν 22 δείγματα και λήφθηκαν υπόψη τα δεδομένα από τις ισοτοπικές αναλύσεις καθώς και ο αλκοολικός βαθμός. Αρχικά τα δείγματα χωρίστηκαν σε δυο ομάδες: 1η ομάδα : Ούζα 100%, δηλαδή 6 δείγματα (α/α 7, 10, 13, 15, 17, 18) 2η ομάδα : Ούζα, δηλαδή 16 δείγματα (α/α 1-6,8-9,11-12,14,16,19-22) Η ανάλυση κατέταξε και τα 6 δείγματα ούζων 100% στην 1η ομάδα και αντίστοιχα τα 16 δείγματα ούζων στη 2η ομάδα, δηλαδή δεν παρατηρήθηκε κανένα σφάλμα κατάταξης (100% ορθή). 90

108 Αριθμός δειγμάτων Ορθή κατάταξη Ομάδα % Ομάδα % Μη ταξινομημένα Μη ταξινομημένα Συνολικά % Πιθανότητα Fisher 1.3e-005 Το διάγραμμα διασποράς των φορτίων (loadings scatter plot) X και Y (Σχήμα 8.1.1) δείχνει τη σχέση μεταξύ των μεταβλητών Χ (ανεξάρτητες μεταβλητές, στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τα δεδομένα από τις ισοτοπικές αναλύσεις και ο αλκοολικός βαθμός) και Υ (εξαρτημένες μεταβλητές, στη συγκεκριμένη μελέτη τα ούζα και τα ούζα 100%) καθώς και τη σχέση εντός των Χ και των Υ. Τα σημεία που βρίσκονται μακριά από το κέντρο των αξόνων έχουν ισχυρή επίδραση στο μοντέλο, ενώ τα σημεία που βρίσκονται πιο κοντά έχουν ασθενέστερη επιρροή. Σχήμα 8.1.1: Διάγραμμα διασποράς φορτίων R1 vs. R2 για το μοντέλο PLS-DA (X: group, R, 13 C, 18 O, (D/H)I, (D/H)II, αλκοολικός βαθμός, Υ: ομάδα 1 και ομάδα 2). 91

109 Οι συσχετίσεις μεταξύ των αρχικών μεταβλητών και των κύριων συνιστωσών ονομάζονται φορτία (loadings) και δείχνουν την ένταση της δράσης που αναπτύσσουν οι αρχικές μεταβλητές για τη δημιουργία των συνιστωσών, σε πόσο βαθμό είναι, δηλαδή, υπεύθυνες γι αυτές. Η ένταση της σχέσης είναι εξαιρετικά ισχυρή σε τιμές κοντά στο ±1,00 (ισχυρή θετική ή αρνητική συσχέτιση) και ασήμαντη σε τιμές κοντά στο μηδέν. Έτσι, όσο υψηλότερα είναι τα φορτία τόσο σημαντικότερες είναι οι υποψήφιες μεταβλητές για το σχηματισμό των κύριων συνιστωσών. Μεταβλητές που είναι κοντά συσχετίζονται θετικά ενώ μεταβλητές που βρίσκονται σε αντίθετες πλευρές συσχετίζονται αρνητικά. Όπως φαίνεται και από τα Σχήματα και ο αλκοολικός βαθμός και το R συμμετέχουν περισσότερο στη διάκριση των ούζων 100%. Eνώ οι λόγοι (D/H)I, (D/H)II και 13 C ευθύνονται για την κατάταξη των ούζων. Επίσης και ο λόγος 18 Ο συμμετέχει, απλά έχει λιγότερη διακριτική ικανότητα από μόνος του. Η γραφική παράσταση VIP (Variable importance plot) αντικατοπτρίζει τη σημασία των παραμέτρων στο μοντέλο τόσο σε σχέση με το Υ, όσο και ως προς το Χ. Το VIP είναι κανονικοποιημένο δηλαδή η μέση τετραγωνική τιμή VIP είναι 1. Έτσι, οι όροι στο μοντέλο με VIP> 1 είναι οι σημαντικότεροι. Σχήμα 8.1.2: Διάγραμμα σημαντικότητας μεταβλητών (VIP) για το μοντέλο PLS-DA. 92