ΒΙΟΑΝΑΓΩΓΗ Cr(VI) ΣΕ Cr(ΙΙI) ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΑΚΙΝΗΤΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥ Αrthrobacter sp. Sphe3 ΣΕ ΣΦΑΙΡΙΔΙΑ ΑΛΓΙΝΙΚΟΥ ΑΣΒΕΣΤΙΟΥ Μ.Γ. Ζιαγκοβά και Μ. Λιακοπούλου-Κυριακίδου Τομέας Χημείας, Τμ. Χημικών Μηχανικών, ΑΠΘ, 54124, Θεσσαλονίκη Α. Κούκου Τμ. Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, 45110, Ιωάννινα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στην εργασία αυτή, η οποία αποτελεί συνέχεια προηγούμενης ερευνητικής δουλειάς, μελετήθηκε η βιοαναγωγή του εξασθενούς χρωμίου σε τρισθενές σε ακινητοποιημένα κύτταρα του βακτηρίου Αrthrobacter sp. Sphe3. Έγινε εγκλωβισμός του μικροοργανισμού σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου και μελετήθηκε η διατήρηση της σταθερότητας αυτών με σκοπό την επαναχρησιμοποίησή τους. Παράμετροι, όπως η φυσιολογική κατάσταση του βακτηρίου, η ποσότητα παγιδευμένης βιομάζας (αριθμός κυττάρων) και o παράλληλος εγκλωβισμός ορισμένων προσθέτων εξετάστηκαν με σκοπό τη βελτιστοποίηση του ακινητοποιημένου συστήματος κυττάρων. Για το σχηματισμό των σφαιριδίων εξετάστηκαν δύο συγκεντρώσεις αλγινικού νατρίου 2% και 4%. Τα αποτελέσματα έδειξαν πλήρη αποικοδόμηση των σφαιριδίων μετά από 15 h όταν χρησιμοποιήθηκε 2% αλγινικό νάτριο παρουσία 20 mg/l Cr(VI). Το ποσοστό βιοαναγωγής στην περίπτωση αυτή ήταν 36%. Αντίθετα όταν χρησιμοποιήθηκε 4% αλγινικό νάτριο σε συνθήκες μη-ανάδευσης η μηχανική αντοχή των σφαιριδίων διατηρήθηκε πλήρως, ενώ το αντίστοιχο ποσοστό βιοαναγωγής αυξήθηκε στο 60%. Η βιομετατροπή 10 mg/l Cr(VI) ήταν πλήρης όταν 50 mg κυττάρων/ml αλγινικού νατρίου συλλέχθηκαν κατά την εκθετική φάση ανάπτυξης και εγκλωβίστηκαν παράλληλα είτε με 1% γλυκόζη και 0.5% (ΝΗ 4 ) 2 SO 4, ή με 1% θρεπτικό μέσο Luria Bertani. Το ακινητοποιημένο βακτήριο διατήρησε την ικανότητα αναγωγής του Cr(VI) μέχρι 6 συνεχείς κύκλους (στον 6ο κύκλο το ποσοστό αναγωγής 10 mg/l Cr(VI) μειώθηκε στο 84%). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ακινητοποίηση των κυττάρων Αrthrobacter sp. Sphe3 σε σφαιρίδια μπορεί να χρησιμοποιηθεί επιτυχώς σε διεργασίες βιοαποκατάστασης επιρυπασμένων με Cr(VI) υδάτων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το χρώμιο χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανία βαφής και επεξεργασίας δέρματος, παραγωγής χρωμάτων κ.α. Οι δύο επικρατέστερες μορφές χρωμίου είναι το εξασθενές και το τρισθενές χρώμιο, εκ των οποίων το Cr(VI) λόγω της εύκολης μεταφοράς του στο εσωτερικό των κυττάρων έχει χαρακτηριστεί ως καρκινογόνο και μεταλλαξιογόνο, ενώ το Cr(ΙΙI) λόγω της χαμηλής του βιοδιαθεσιμότητας θεωρείται μη τοξικό (Garg et al.2012). Οι συμβατικές μέθοδοι αποκατάστασης επιρυπασμένων εδαφών και νερών με Cr(VI) περιλαμβάνουν διάφορες φυσικοχημικές μεθόδους. Ωστόσο οι μέθοδοι αυτές αν και είναι αποτελεσματικές έχουν υψηλό κόστος και οδηγούν στη δημιουργία δευτερογενών αποβλήτων που απαιτούν περαιτέρω επεξεργασία. Η βιολογική αναγωγή του Cr(VI) σε Cr(ΙΙI) χρησιμοποιώντας μικροοργανισμούς αποτελεί μια νέα τεχνολογία οικονομικά ελκυστική, αποδοτική και φιλική προς το περιβάλλον (Dermou and Vayenas, 2007). Για τη βιολογική επεξεργασία υγρών αποβλήτων έχουν χρησιμοποιηθεί τόσο ελεύθερα κύτταρα όσο και κύτταρα ακινητοποιημένα σε διάφορους φορείς. Το πλεονέκτημα των ελεύθερων κυττάρων είναι η απλή λειτουργία και ο έλεγχος του συστήματος. Επίσης η χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων έχει αποκτήσει ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της ανθεκτικότητας σε υψηλά ρυπαντικά φορτία, ενώ δεν υπάρχει αναγκαιότητα για επιπλέον μονάδα διαχωρισμού ιλύος (Shetty et al. 2012). Σε προηγούμενη ερευνητική δουλειά μελετήθηκε η βιοαναγωγή Cr(VI) με το μικροοργανισμό Arthrobacter sp. Sphe3, καθώς και όλοι οι παράγοντες που την επηρεάζουν
(ph, θερμοκρασία, συγκέντρωση γλυκόζης) (Zιαγκοβά και Λιακοπούλου-Κυριακίδου, 2012). Η παρούσα εργασία έχει σκοπό την επαναχρησιμοποίηση της βιομάζας. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε εγκλωβισμός των κυττάρων σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου. Στο ακινητοποιημένο σύστημα μελετήθηκε η επίδραση διαφόρων παραμέτρων, όπως η φυσιολογική κατάσταση των κυττάρων, η ποσότητα της παγιδευμένης βιομάζας, η αντοχή των σφαιριδίων, καθώς και η επίδραση συν-εγκλωβισμού ορισμένων πρόσθετων ουσιών στην απόδοση του συστήματος. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το βακτηριακό στέλεχος Arthrobacter sp. Sphe3 που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή παραχωρήθηκε από το Τμήμα Χημείας, Παν. Ιωαννίνων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια σε θρεπτικό μέσο αλάτων (6 g/l Na 2 HPO 4, 3 g/l KH 2 PO 4, 0.5 g/l NaCl, 1.0 g/l NH 4 Cl, 1 ml/l 1 M MgSO 4 7H 2 O, 1 ml/l 0.1 M CaCl 2, 0.1% γλυκόζη) στους 30 0 C. Ακολούθησε συλλογή των κυττάρων, πλύση με 0.9% NaCl και επαναιώρηση σε 10 ml διαλύματος αλγινικού νατρίου. Στη συνέχεια το αιώρημα κυττάρων-αλγινικού νατρίου προστέθηκε με τη χρήση σύριγγας ινσουλίνης σε ένα ήπια αναδευόμενο διάλυμα 3.5% CaCl 2 σε αναλογία 1:5, σχηματίζοντας σφαιρικές κάψουλες αλγινικού ασβεστίου. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με 0,9% v/v NaCl (δύο φορές) και μεταφέρθηκαν σε Tris-HCl ρυθμιστικό διάλυμα (ρη 7.0) που περιείχε Cr(VI). Η αποτελεσματικότητα της ακινητοποίησης εξετάστηκε ως προς τη σταθερότητα των σφαιριδίων και την απόδοση όσον αφορά στη βιοαναγωγή του συστήματος. Μελετήθηκαν διάφορες συγκεντρώσεων αλγινικού νατρίου από 1 έως 4%, ενώ οι κωνικές φιάλες που έφεραν τα σφαιρίδια ήταν είτε ακίνητες ή σε αργή κυκλική κίνηση στον επωαστήρα (50 rpm). Για την ενίσχυση του μεταβολισμού των κυττάρων διάφορες ουσίες συν-εγκλωβίστηκαν με το βακτήριο Arthrobacter sp. Sphe3 (α) 1% γλυκόζη, (β) 1% γλυκόζη και 0.5% (NH 4 ) 2 SO 4, (γ) 1% τρυπτόνη, 0.5% εκχύλισμα ζύμης και 0.5% NaCl. Παράλληλα μελετήθηκε η επίδραση της φάσης ανάπτυξης των κυττάρων στον εγκλωβισμό. Για το λόγο αυτό, έγινε συλλογή των κυττάρων Arthrobacter sp. Sphe3 κατά την εκθετική (6 ώρες) και τη στατική φάση ανάπτυξης (15 ώρες), αιώρηση σε 0.9% NaCl και ακινητοποίηση σε κάψουλες αλγινικού-ca. Τέλος εξετάστηκε η επίδραση της ποσότητας της βιομάζας στο εσωτερικό των σφαιριδίων (10, 25 και 50 mg κυττάρων/ml Na-αλγινικού) στην απόδοση βιομετατροπής του Cr(VI) σε Cr(ΙΙI). Αφού προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες ακινητοποίησης του μικροοργανισμού, τα επικαλυμμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με διήθηση, ξεπλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-HCI (ph 7.0), και στη συνέχεια προστέθηκαν στον επόμενο κύκλο βιοαναγωγής. H συγκέντρωση του Cr(VI) προσδιορίσθηκε φωτομετρικά με τη μέθοδο του 1,5-διφαινυλοκαρβαζιδίου, χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο UV-Vis (Shimadzu, Bestech, Irvine, CA) στα 540 nm. Το ολικό χρώμιο προσδιορίστηκε με οξείδωση του Cr(III) με υπερμαγγανικό κάλιο. Το Cr(III) προσδιορίστηκε με αφαίρεση του Cr(VI) από το ολικό χρώμιο (Snell and Snell, 1959). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Όταν χρησιμοποιήθηκε 1% αλγινικό νάτριο, τα σφαιρίδια που σχηματίστηκαν ήταν τόσο μαλακά με αποτέλεσμα την άμεση αποικοδόμηση αυτών λόγω της χαμηλής μηχανικής αντοχής τους. Υψηλότερες συγκεντρώσεις αλγινικού νατρίου 2-4% σταθεροποίησαν τις σχηματιζόμενες κάψουλες ενώ παράληλα αύξησαν το χρόνο που απαιτείται για τη βιοαναγωγή του Cr(VI) (Σχήμα 1).
110 100 90 % Cr(VI) 80 70 60 50 40 (α) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 % Cr(VI) 100 90 80 70 60 50 40 30 (β) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 Σχήμα 1. Επίδραση της συγκέντρωσης του αλγινικού νατρίου (2% - - και 4% - -) στην απομάκρυνση του Cr(VI) στα (α)10 mg/l και (β) 20 mg/l Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι όταν χρησιμοποιούνται υψηλές συγκεντρώσεις Cr(VI), το πλέγμα αλγινικού ασβεστίου δρά προστατευτικά διατηρώντας τα κύτταρα στο εσωτερικό του. Ωστόσο, η χαμηλότερη απόδοση του συστήματος είναι αναπόφευκτη λόγω σχηματισμού ενός «σφιχτού» περιβλήματος με αποτέλεσμα τη μείωση της διάχυσης των ιόντων Cr(VI) στο εσωτερικό της κάψουλας (Chen et al. 2008). Δεδομένου ότι η απελευθέρωση των κυττάρων από το εσωτερικό των σφαιριδίων χρησιμοποιώντας 4% αλγινικό νάτριο ήταν χαμηλή, μελετήθηκε η προστατευτική δράση του συν-εγκλωβισμού διαφόρων πηγών άνθρακα και αζώτου ταυτόχρονα με το στέλεχος Αrthrobacter sp. Sphe3. Διαπιστώθηκε ότι η γλυκόζη από μόνη της δε βελτιώνει τη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων, ενώ η προσθήκη (NH 4 ) 2 SO 4 ως πηγή αζώτου προκάλεσε την άμεση αναγωγή του Cr(VI) μειώνοντας τη διάρκεια αυτής στις 72 ώρες. Το ίδιο παρατηρήθηκε με το συνεγκλωβισμό 1% θρεπτικού μέσου LB. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τη μελέτη των Alvarez et al. (2009) οι οποίοι βρήκαν ότι ο συνεγκλωβισμός του θρεπτικού μέσου LB ενίσχυσε την ανάπτυξη του βακτηρίου E. coli σε
αντίθεση με την περίπτωση όπου χρησιμοποιήθηκε μόνο γλυκόζη ως πηγή άνθρακα, όπου ο αριθμός των βακτηρίων μειώθηκε δραστικά. Σε μια προσπάθεια να μειωθεί περισσότερο η απελευθέρωση του Arthrobacter sp. Sphe3 στο ρυθμιστικό διάλυμα, μελετήθηκε η επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στη μηχανική αντοχή των σφαιριδίων σε συνθήκες χαμηλής (50 rpm) και καθόλου ανάδευσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, κατά τη χρήση μη ανακινούμενων φιαλών η βιοαναγωγή 10 mg/l Cr(VI) ήταν πλήρης σε 24 ώρες, ενώ η αντίστοιχη απελευθέρωση των κυττάρων ήταν αμελητέα. Αντιθέτως, σε συνθήκες χαμηλής ανάδευσης (50 rpm), η απελευθέρωση των κυττάρων ήταν εμφανής μετά από 24 ώρες ενώ το ποσοστό βιοαναγωγής ήταν χαμηλότερο. Cr(VI), mg/l 10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Σχήμα 2. Επίδραση της ταχύτητας ανάδευσης στη βιοαναγωγή 10 mg/l Cr(VI) (0 rpm - -, 50 rpm - -) χρησιμοποιώντας 4% αλγινικό νάτριο. Η επίδραση της φυσιολογικής κατάστασης των παγιδευμένων κυττάρων εξετάσθηκε επίσης. Για το λόγο αυτό, συλλέχθηκαν βακτήρια στην αρχή και στο τέλος της εκθετικής φάσης καθώς και κατά τη διάρκεια της στατικής φάσης. Τα κύτταρα ακινητοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 4% αλγινικό νάτριο με την εσωτερική προσθήκη 1% LB υπό συνθήκες μη ανάδευσης παρουσία 10 mg/l Cr(VI). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα βακτήρια που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης παρουσίασαν σημαντική μεταβολική δραστηριότητα (95%), ακολούθησαν τα κύτταρα που συλλέχθηκαν στη στατική φάση (68%), ενώ τα κύτταρα που συλλέχθηκαν στην αρχή της εκθετικής φάσης παρουσίασαν το χαμηλότερο ποσοστό (40%). Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των κυττάρων στο εσωτερικό της μήτρας του αλγινικού ασβεστίου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, κατά τον εγκλωβισμό 25 και 50 mg κυττάρων/ml αλγινικού νατρίου η βιοαναγωγή 10 mg/l Cr(VI) ήταν πλήρης σε 24 ώρες. Υψηλότερες τιμές κυτταρικής πυκνότητας οδήγησαν σε διάρρηξη των σφαιριδίων και απελευθέρωση των κυττάρων εξαιτίας του περιορισμένου χώρου στο εσωτερικό της μήτρας. Χαμηλότερες τιμές συγκέντρωσης κυττάρων στα 10 mg/ml αλγινικού νατρίου μείωσε την απόδοση του συστήματος και παράτεινε τον απαιτούμενο χρόνο στις 72 h, δείχνοντας ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μέσα στην κάψουλα ήταν αρκετά δύσκολος. Η επίδραση
της συγκέντρωσης της βιομάζας στην απόδοση του συστήματος μελετήθηκε από τους Shugaba et al. (2010) όπου η αύξηση του αριθμού των σφαιριδίων των Aspergillus niger και Aspergillus parasiticus από 10 σε 100 παρουσία 7 mg/l Cr(VI) οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση του ποσοστού της βιοαναγωγής από 47.9 σε 98.6% αντίστοιχα. Cr(VI), mg/l 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Σχήμα 3. Επίδραση της συγκέντρωσης της βιομάζας στο εσωτερικό των σφαιριδίων παρουσία 10 mg/l Cr(VI) (- -10 mg/ml αλγινικού νατρίου, - - 25 mg/ml αλγινικού νατρίου και - -50 mg/ml αλγινικού νατρίου) Αφού καθορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες λειτουργίας του ακινητοποιημένου συστήματος εξετάστηκε η δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των σχηματιζόμενων σφαιριδίων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η συνεχής χρήση των ακινητοποιημένων κυττάρων ήταν αποδοτική μέχρι τους 5 πρώτους κύκλους, ενώ στον 6ο κύκλο το ποσοστό βιοαναγωγής μειώθηκε στο 84%. Περαιτέρω αύξηση του αριθμού των κύκλων οδήγησε σε αυξημένη μείωση της απόδοσης του συστήματος, λόγω συνεχούς απώλειας των κυττάρων στο ρυθμιστικό διάλυμα στο τέλος του κάθε κύκλου (Pang et al. 2011). Ωστόσο, η επιτυχής χρήση των σφαιριδίων έως 6 κύκλους είναι σημαντική δεδομένου ότι θα μπορούσε να μειώσει σημαντικά το κόστος λειτουργίας σε βιομηχανικές εφαρμογές του συστήματος της ακινητοποιημένης βιομάζας.
100 Αναγωγή Cr(VI) (%) 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Αριθμός επαναλήψεων Σχήμα 4. Η επίδραση της ανακύκλωσης των σφαιριδίων του αλγινικού ασβεστίου στη βιοαναγωγή 10 mg/l Cr(VI) Για την ακινητοποίηση και την περαιτέρω εφαρμογή των βιοκαταλυτών έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες τεχνικές. Σε ορισμένες μελέτες κύτταρα έχουν προσροφηθεί σε πορώδεις επιφάνειες, ενώ σε άλλες έχουν παγιδευτεί σε διάφορους φορείς (Cassidy et al. 1996). Η χρήση πολυμερών ενώσεων του αλγινικού οξέος έχει μελετηθεί αρκετά και για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκε και εδώ (Power et al. 2011). Λόγω της μεγάλης ποικιλίας διαφορετικών συνθηκών και υλικών που έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εγκλεισμό κυττάρων η απευθείας σύγκριση αυτής της μελέτης με άλλες είναι δύσκολο να γίνει. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι τα ελεύθερα κύτταρα του βακτηρίου Arthrobacter sp. Sphe3 που χρησιμοποιήθηκαν σε προηγούμενη μελέτη υπερτερούν όσον αφορά στην απόδοση και στην ανθεκτικότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις σε σχέση με τα ακινητοποιημένα (Ziagova and Liakopoulou-Kyriakides, 2010). Ωστόσο η πλήρης αποτοξικοποίηση του Cr(VI) που επιτυγχάνεται με το ακινητοποιημένο σύστημα βιομάζας, είναι ιδιαίτερα ενθαρρυντική μιας και σε αρκετές περιπτώσεις επιρυπασμένων υδατικών φορέων, οι συγκεντρώσεις Cr(VI) είναι ιδιαίτερα χαμηλές. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο εγκλωβισμός των κυττάρων Arthrobacter sp. Sphe3 σε κάψουλες αλγινικού ασβεστίου είχε ως αποτέλεσμα τη πλήρη βιοαναγωγή του Cr(VI) σε Cr(III) Η αποτελεσματικότητα του συστήματος βελτιώθηκε σημαντικά, όταν γλυκόζη και θειικό αμμώνιο, ή 1% θρεπτικού μέσου LB συν-ακινητοποιήθηκαν βελτιώνοντας τη μεταβολική δράση των κυττάρων. Παράλληλα η αναγωγική δράση των κυττάρων βελτιώθηκε με την αύξηση της κυτταρικής πυκνότητας στο εσωτερικό των σφαιριδίων και τον εγκλωβισμό κυττάρων που συλλέχθηκαν στο μέγιστο της εκθετικής φάσης ανάπτυξης. Η μηχανική σταθερότητα των σφαιριδίων εξασφαλίστηκε σε συνθήκες μη ανάδευσης, οι οποίες επιπλέον δεν ελάττωσαν το ρυθμό βιοαναγωγής του Cr(VI). ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ
Οι συγγραφείς επιθυμούν να ευχαριστήσουν το Ελληνικό Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών για τη χρηματοδότηση της μεταδιδακτορικής ερευνήτριας Μ. Γ. Ζιαγκοβά ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1] Alvarez G.S., Foglia M.L., Copello G.J., Desimone M.F. and Diaz L.E., Appl Microbiol Biotechnol 82:639 (2009) [2] Cassidy M.B., Lee H. and Trevors J.T., J Ind Microbiol 16:79 (1996) [3] Chen J., Zheng Y.-G. and Shen Y.-C., Proc Biochem 43:978 (2008) [4] Dermou E. and Vayenas D.V., J Hazard Mater 145:256 (2007) [5] Garg S.K., Tripathi M. and Srinath T., Rev Environ Contam Toxicol 217:75 (2012) [6] Pang Y., Zeng G.-M., Tang L., Zhang Y., Liu Y.-Y., Lei X.-X., Wu M.-S., Li Z. and Liu C., Bioresour. Technol. 102:10733 (2011) [7] Power B., Liu X., Germaine K.J., Ryan D., Brazil D. and Dowling D.N., J Appl Microbiol 110:1351 (2011) [8] Shetty V.K., Namitha L., Rao S.N. and Narayani M., Water Air Soil Pollut 223:1877 (2012) [9] Shugaba A., Wuyep P.A., Nok A.J., Ameh D.A. and Lori J.A., Bioremed J 14:142 (2010) [10] Snell F.D. and Snell C.T Colorimetric Methods of Analysis. Van Nostrand Company, Toronto, Canada. (1959) [11] Ziagova M. and Liakopoulou-Kyriakides M., 1st International Conference on Advances in Biotechnology-Industrial Microbial Biotechnology, Thessaloniki, (2010), p. 66 [12] Ζιαγκοβά M. Γ. και Λιακοπούλου-Κυριακίδου Μ. 1ο Περιβαλλoντικό Συνέδριο Θεσσαλίας, Σκιάθος, (2012), σελ. 47