Προσδιορισµός συντηρητικών σε οίνους παλαιωµένους µέσα σε βαρέλια από ξύλο δρυός, µε χρήση υγρής χρωµατογραφίας. Κωνσταντίνος Κακάβας 1, ηµήτρης Μπιρµπίλης 1, ηµήτρης Τσίποτας 1. 1 Τµήµα Σχεδιασµού & Τεχνολογίας Ξύλου Επίπλου, Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυµα Θεσσαλίας. Email addresses: kakavas@teilar.gr, dmbirmbi@teilar.gr, dtsipotas@yahoo.gr Περίληψη Το βενζοϊκό, το σορβικό και το ασκορβικό οξύ, είναι τα συντηρητικά που χρησιµοποιούνται πιο συχνά στην παλαίωση του οίνου και των τροφίµων. Συνήθως, προσδιορίζονται µε υγρή χρωµατογραφία αντίστροφης όσµωσης. Κάποιες εξειδικευµένες όµως διαδικασίες, που υπεισέρχονται στη χηµική ανάλυση του οίνου και άλλων ποτών (αλκοολούχων ή µη), µπορούν να βελτιστοποιηθούν. Ο διαχωρισµός των οξέων µε τη χρήση χρωµατογράφου, επιτεύχθηκε αξιοποιώντας µια στήλη C18 Varian και ρυθµιστικό διάλυµα οξικού αµµωνίου (ph 4.4) / µεθανόλης σε αναλογία 65/35, ως κινητή φάση. Η ταχύτητα ροής έφτασε το 1.0 ml/min και έγινε χρήση ανιχνευτή UV στα 245 nm. Αποτελεσµατικός διαχωρισµός και ποσοτικοποίηση των οξέων επιτεύχθηκε σε λιγότερο από 8 λεπτά. Η εκχύλιση ουσιών από το ξύλο δρυός (ο οίνος παλαιώθηκε σε δρύινα βαρέλια) δεν επηρέασε την καθαρότητα του χρωµατογραφήµατος. Λέξεις κλειδιά: οίνος, δρυς, οργανικά οξέα Εισαγωγή Ο οίνος (κρασί) και άλλα αλκοολούχα αποστάγµατα που παράγονται κάθε χρόνο σε µεγάλες ποσότητες στην Ελληνική επικράτεια, είναι πολύ δηµοφιλή σε όλο τον κόσµο και αποτελούν εξαγώγιµο προϊόν καθώς και πόλο έλξης για πολλούς ανθρώπους. Το βενζοϊκό, το σορβικό και το ασκορβικό οξύ, θεωρούνται σηµαντικές συντηρητικές ουσίες για τις τροφές. Επίσης, θεωρούνται σηµαντικές αντιοξειδωτικές ουσίες για τα ποτά, συµπεριλαµβανοµένου και του οίνου. Επιπλέον, παράγωγα του βενζοϊκού οξέος αποτελούν τα κύρια φαινολικά συστατικά που προσδίδουν ένα χαρακτηριστικό άρωµα σε πολλές ποικιλίες κρασιού (Matejicek et al 2005). Παρόλα αυτά όµως, η συγκέντρωσή τέτοιων ουσιών στα ποτά θα πρέπει να ελέγχεται και να ρυθµίζεται. Υπερβολικά µεγάλες συγκεντρώσεις των παραπάνω οξέων συνιστούν σοβαρές πηγές κινδύνου για τους καταναλωτές και γι αυτό πρέπει να ελέγχονται αυστηρά. Η µέθοδος HPLC (High- Performance Liquid Chromatography: υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης) είναι ευρέως διαδεδοµένη στις αναλύσεις που γίνονται µε σκοπό τον προσδιορισµό των οξέων σε τρόφιµα και ποτά (Mihyar et al 1999, Ferreira 2000, Bahruddin et al 2005, Ittipon et al 2007). Υπάρχουν δηµοσιευµένες και αρκετές άλλες µέθοδοι χηµικής ανάλυσης (Dong 1998, Castiñeira et al 2000, Tfuni and Toledo 2002, Christian 2007) στις οποίες περιλαµβάνονται µέθοδοι φασµατοφωτοµετρίας και αέριας χρωµατογραφίας (Pan et al 2005). Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν να δηµιουργηθεί µια εργαστηριακή µέθοδος ρουτίνας για την ανάλυση των συντηρητικών του οίνου και άλλων ποτών, µε στόχο τον 1
γρήγορο και αποτελεσµατικό προσδιορισµό του βενζοϊκού, του σορβικού και του ασκορβικού οξέος. Υλικά και Μέθοδοι Η έρευνα πραγµατοποιήθηκε σε δέκα ποικιλίες οίνου που παράγονται στην Ελλάδα και αποτελούν πιστοποιηµένο εµπορικό προϊόν. Οι ποικιλίες αυτές παλαιώθηκαν σε βαρέλια από ξύλο δρυός τουλάχιστον για 12 µήνες. Μία από αυτές τις ποικιλίες παρήχθη κατ οίκον χωρίς την προσθήκη συντηρητικών. Τα δείγµατα στα οποία έγινε ανάλυση, παρασκευάστηκαν µε την ιζηµατοποίηση των πρωτεϊνών και των λιπαρών ύστερα από προσθήκη µεθανόλης την οποία ακολούθησε φυγοκέντριση και εκχύλιση ώστε να παραχθούν εκχυλίσµατα κατάλληλα για χρωµατογραφική ανάλυση. Ο διαχωρισµός έγινε µε συσκευή τύπου Perkin Elmer, χρησιµοποιώντας ανιχνευτή UV (µοντέλο 785A) σε µήκος κύµατος 245nm και C18 Varian τύπου XRs 5 - C18 S 250 x 4.6 Col. Αυτή η ισοκρατική µέθοδος λειτούργησε χρησιµοποιώντας ως κινητή φάση ρυθµιστικό διάλυµα οξικού αµµωνίου (ph 4.4) / µεθανόλης µε αναλογία 65/35 και ταχύτητα ροής 1.0 ml/min. Η ποσότητα έγχυσης κάθε διαλύµατος ήταν 20µl και η διάρκεια της διαδικασίας, µετά την έγχυση του προς ανάλυση διαλύµατος, ήταν περίπου 8 λεπτά. Η πίεση καθορίστηκε στα 214 Bar. Αποτελέσµατα Η νέα µέθοδος HPLC συγκρίθηκε µε µια µέθοδο αναφοράς η οποία καθορίζεται από την AOAC (Association of Official Analytical Chemists) σύµφωνα µε τις διαδικασίες 963.19 και 971.15. Τα αποτελέσµατα που έδωσαν οι δύο αυτές χηµικές αναλύσεις ήταν ισοδύναµα (πίν.1). Πίνακας 1. Βενζοϊκό, σορβικό και ασκορβικό οξύ σε οίνους, διαθέσιµους στο εµπόριο, παλαιωµένους σε βαρέλια από ξύλο δρυός, µε βάση τη µέθοδο HPLC (HPLC method) και µια µέθοδο αναφοράς (Reference method). Table 1. Benzoic, sorbic and ascorbic acids in commercial available wines, aged in oak wood barrels, based on HPLC method and a reference method. Benzoic acid (mg/kg) Sorbic Acid (mg/kg) Ascorbic acid (mg/kg) Βενζοϊκό οξύ (mg/kg) Σορβικό οξύ (mg/kg) Ασκορβικό οξύ (mg/kg) HPLC Reference HPLC Reference HPLC Reference method method method method method method 1. 455.9 457.0 310.2 312.8 410.5 415.5 2. 1294 1281.0 n.d n.d n.d n.d 3. 413.9 411.8 n.d n.d n.d n.d 4. 439.3 432.1 n.d n.d n.d n.d 5. 750.5 760.5 n.d n.d n.d n.d 6. 489.7 481.3 n.d n.d 489.7 481.3 7. 509.1 506.2 400.5 405.5 310.1 315.5 8. n.d n.d 290.8 295.6 n.d n.d 9. n.d n.d n.d n.d n.d n.d 10. 650.5 660.4 250.5 260.6 n.d n.d Samples είγµατα 2
Ανάµεσα στις δύο µεθόδους που χρησιµοποιήθηκαν για τον προσδιορισµό των συντηρητικών (οξέων) στους οίνους φαίνεται να υπάρχει πολύ ισχυρή συσχέτιση, γεγονός που φαίνεται χαρακτηριστικά από τη στατιστική ανάλυση που έγινε για την περίπτωση του βενζοϊκού οξέος, του συντηρητικού που ταυτοποιήθηκε στα περισσότερα δείγµατα. Συγκρίνοντας τα ζεύγη τιµών µε το µη παραµετρικό (λόγω µικρού µεγέθους δείγµατος) τεστ του Wilcoxon για εξαρτηµένα δείγµατα, παρατηρούµε ότι στατιστικά δεν αποδεικνύεται καµιά διαφορά στην ποσότητα του βενζοϊκού οξέος µε όποια από τις δυο µεθόδους χρησιµοποιηθεί (πίν. 2). Το διάστηµα εµπιστοσύνης είναι πολύ µεγαλύτερο του 0,05 (p-value=0,575>0,050). Πίνακας 2. Αποτέλεσµα του στατιστικού πακέτου SPSS από την εφαρµογή του Wilcoxon-test για τη σύγκριση των τιµών του βενζοϊκού οξέος όπως υπολογίστηκαν από τις δύο διαφορετικές µεθόδους (νέα HPLC, µέθοδος αναφοράς) Table 2. SPSS output from the comparison (Wilcoxon-test) between new HPLC and a reference method for the determination of beznzoic acid in wines. Test Statistics a Benzoic Acid 2 - Benzoic Acid 1 Z -,560 b Asymp. Sig. (2-tailed),575 a. Wilcoxon Signed Ranks Test. b. Based on positive ranks. Η γραµµική συσχέτιση των δύο µεθόδων µε εξίσωση y=0,993x + 2,693 (y=νέα HPLC, x=µέθοδος αναφοράς) παρουσιάζει συντελεστή συσχέτισης r 2 =0,999, δηλαδή σχεδόν απόλυτη ταύτιση των δύο µεθόδων, µια τάση που διακρίνεται ξεκάθαρα στο σχήµα 1. Σχήµα 1. ιάγραµµα µε τις τιµές του βενζοϊκού οξέος σε κάθε δείγµα όπως υπολογίστηκαν από τις δύο µεθόδους (benzoic acid 1=µέθοδος HPLC, benzoic acid 2=µέθοδος αναφοράς). 3
Figure 1. Benzoic acid graph with the values determined of the two methods (benzoic acid 1 by HPLC and benzoic acid 2 by reference method). Το χρωµατογράφηµα του οίνου όπως προέκυψε από την εφαρµογή της νέας µεθόδου HPLC φαίνεται στο σχήµα 2. Στο γράφηµα αυτό (χρωµατογράφηµα) διακρίνονται καθαρά η κορυφή της γραµµής για το βενζοϊκό οξύ στα 5,664 λεπτά, η κορυφή της γραµµής για το σορβικό οξύ στα 7,862 λεπτά και η κορυφή της γραµµής για το ασκορβικό οξύ στα 2,62 λεπτά. Επίσης, γίνεται αντιληπτό ότι η εκχύλιση φαινολικών οξέων, τανινών και πτητικών ουσιών από το ξύλο δρυός (ο οίνος παλαιώθηκε σε δρύινα βαρέλια) δεν επηρέασε την καθαρότητα του χρωµατογραφήµατος. [µv] V o l t a g e 250 200 150 100 2. 6 1 5 P e a k 2. 6 2 5. 6 6 4 P e a k 5. 7 1 7. 8 6 2 P e a k 7. 8 7 4431 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Time Σχήµα 2. Χρωµατόγραµµα ασκορβικού, βενζοϊκού και σορβικού οξέος. Figure 2. Ascorbic, benzoic and sorbic acids chromatogram. [min.] Συζήτηση Συµπεράσµατα Υπολογίζοντας τις τιµές των οργανικών οξέων που περιέχονται στους οίνους µε τη νέα µέθοδο HPLC, παρατηρήθηκε ότι δεν υπάρχει µια συγκεκριµένη και σαφής τάση είτε αύξησης είτε ελάττωσης των τιµών των οργανικών οξέων σε σχέση µε αυτές που υπολογίστηκαν µε τη µέθοδο αναφοράς. Είναι µάλιστα προφανές ότι οι τιµές που υπολογίστηκαν µε τις δύο διαφορετικές µεθόδους είναι τόσο κοντά η µία στην άλλη που µπορεί να θεωρηθεί ότι η προτεινόµενη, εύκολη και γρήγορη ως προς τη χρήση της, µέθοδος αποτελεί αξιόπιστη επιλογή και είναι σε θέση να εφαρµοστεί άµεσα στη διεξαγωγή χηµικών αναλύσεων. Η εργασία αυτή αποτελεί το πρώτο βήµα για µια εκτεταµένη έρευνα πάνω στην επίδραση διαφόρων ειδών ξύλου που δύνανται να χρησιµοποιηθούν στην παλαίωση του οίνου. Ήδη βέβαια διεξάγονται στην Ελλάδα παρόµοιες έρευνες, στις οποίες επιθυµούµε να συνδράµουµε, µε πολύ αξιόλογα αποτελέσµατα όπως η µελέτη των Gortzi κ.α. 4
(2013) στα πλαίσια της οποίας αποδείχθηκε ότι η ελεγχόµενη προσθήκη ξυλοτεµαχιδίων (κύβων) µουριάς, ακακίας και βερικοκιάς προσδίδει στους οίνους υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση, εύρηµα που σχετίζεται µε την υψηλή συγκέντρωση πολυφαινολών (ενώσεις µε αποδεδειγµένη καρδιοπροστατευτική, αντικαρκινική και αντιφλεγµονώδη δράση) (Gortzi et al. 2013). Παρότι η παρούσα εργασία δεν αξιοποιεί σ αυτό το στάδιο έλεγχο µεταβλητών που θα έδιναν συµπεράσµατα για την επίδραση του ξύλου στη χηµική σύσταση του οίνου, εισάγει µια νέα εργαστηριακή µέθοδο ρουτίνας για την ανάλυση των συντηρητικών του οίνου και άλλων ποτών για την οποία διαπιστώνεται ότι: α) η εκχύλιση φαινολικών οξέων, τανινών και πτητικών ουσιών από το ξύλο δρυός (ο οίνος παλαιώθηκε σε δρύινα βαρέλια) δεν επηρέασε την καθαρότητα του χρωµατογραφήµατος β) αποτελεί µια εύκολη, γρήγορη και αξιόπιστη ως προς τη χρήση της µέθοδο η οποία είναι σε θέση να εφαρµοστεί άµεσα στη διεξαγωγή χηµικών αναλύσεων και να διευκολύνει την έρευνα πάνω στις επιδράσεις διαφορετικών ξύλων κατά την παλαίωση του οίνου. Simultaneous determination of organic acids in wines aged in oak wood (Quercus spp) barrels by HPLC. Konstantinos V. Kakavas 1, Dimirtios Birbilis 1, Dimitrios Tsipotas 1 1 Department of Wood and furniture Technology and Design, Wood biotechnology, and chemical technology laboratory, Technological Educational Institution of Thessaly. Email addresses: kakavas@teilar.gr, dmbirmbi@teilar.gr, dtsipotas@yahoo.gr ABSTRACT Benzoic, sorbic and ascorbic acid are the most commonly used preservatives in wine and foodstuffs. They are usually analyzed by reverse phase - HPLC. However specific procedures for analysis of wines and beverages (with or without alcohol) were optimized. Chromatographic separation was achieved using a C18 varian column and ammonium acetate buffer (ph 4.4) methanol (65:35) as a mobile phase, 1.0 ml/min flow rate and UV detector at 245 nm. Effective separation and quantification was achieved in less than 8 min. Keywords: Organic acids, wine, oak wood barrels Βιβλιογραφία Bahruddin, S., Fazlul B., Muhammad, I.S., 2005. Simultaneous determination of preservatives (benzoic acid, sorbic acid, methylparaben and propylparaben) in food stuffs using high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, Volume 1073, Issues 1-2, pp. 393-397. 5
Castiñeira, A., Peña, R.M., Herrero, C., García-Martín,, S., 2000. Simultaneous determination of organic acids in wine samples by capillary electrophoresis and UV detection: Optimization with five different background electrolytes HRC. Journal of High Resolution Chromatography, Volume 23, Issue 11, pp 647-652. Christian, W.K., 2007. Determination of organic acids by CE and CEC methods. Electrophoresis, Volume 28, pp. 3362 3378. Dong, M.W., 1998. HPLC analysis of organic acids in juice and wine using resin and reversed-phase columns LC GC: Liquid Chromatography. Gas Chromatography, Volume 16, Issue 12, pp. 1092-1097. Ferreira, I.M.P.L.V.O., 2000. Simultaneous determination of sorbic and benzoic acids in quince jam by HPLC. Food research international 33: 113-117. Gortzi, O., Metaxa, X., Mantanis, G, Lalas, S. 2013. Effect of artificial ageing using different wood chips on the antioxidant activity, resveratrol and catechin concentration, sensory properties and colour of two Greek red wines. Food Chemistry 141(3): 2887 2895. Ittipon, Techakriengkrai, Rance, Surakarnkul, 2007. Analysis of benzoic acid and sorbic acid in Thai rice wines and distillates by solid-phase sorbent extraction and highperformance liquid chromatography. Journal of food composition and analysis, Volume 20, pp. 220-225. Matejicek, D., Mikes, O., Klejdus, B., Sterbova, D., Kuban, V., 2005. Changes in contents of phenolic compounds during maturing of barrique red wines. Food chemistry 90: 791-800. Mihyar, G.F., Yousif, A.K., Yamani, M.I., 1999. Determination of benzoic and sorbic acids in labanch by HPLC. Journal of food composition and analysis 12: 53-61. Pan, Z., Wang, I., Mo, W., Wang, C., Hu, W., Zhang, J., 2005. Determination of benzoic acid in soft drinks by gas chromatography with on-line pyrolytic methylation teqnique. Analytica Chimica Acta. 545: 218-223. Tfuni, S.A.V., Toledo, C.F.T., 2002. Determination of benzoic and sorbic acids in Brazilian food. Food Control, Volume 13, Issue 2, pp. 117-123. 6