ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990

Sanquin Reagents Plesmanlaan 125 1066 CX Amsterdam The Netherlands Phone: +31.20.512.3599 Fax: +31.20.512.3570 E-mail: reagents@sanquin.nl Website: www.sanquinreagents.com M1990 / January 2011 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit REF M1990 - Κιτ ELISA για in vitro ποσοτική ανάλυση της λεκτίνης που δεσμεύει τη μαννόζη σε ανθρώπινο ορό (ή πλάσμα) (el) Ab BLANC BUF CAL COAT CONJ el Αντισώματα για κενό Ρυθμιστικό διάλυμα Βαθμονομητής επικάλυψη Σύζευγμα CONTROL DIL HUM MANNAN MOU SPE STOCK el Μάρτυρας Αραίωση Ανθρώπινος μαννάνη Ποντικιού Δείγμα Μητρικό WASH el Πλύση Εύρος - 1

I. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η λεκτίνη που δεσμεύει τη μαννόζη (MBL), που επίσης ονομάζεται πρωτεΐνη πρόσδεσης μαννόζης- ή μαννάνης, είναι ένας σημαντικός παράγοντας καθορισμού της εγγενούς ανοσίας. Η MBL ανήκει στην τάξη των κολλεκτινών της υπεροικογένειας των λεκτινών τύπου C, των οποίων η λειτουργία φαίνεται να είναι η αναγνώριση σχηματισμών στην πρώτη γραμμή άμυνας του προ-άνοσου ξενιστή. Η MBL αναγνωρίζει τους σχηματισμούς υδατανθράκων, που βρίσκονται στην επιφάνεια ενός μεγάλου αριθμού παθογόνων μικροοργανισμών, μεταξύ των οποίων βακτήρια, ιοί, πρωτόζωα και μύκητες (1,2,3). Η δέσμευση της MBL από ένα μικροοργανισμό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της κλασσικής διαδρομής συμπληρώματος, πολύ πριν σχηματιστούν συγκεκριμένα αντισώματα. Η MBL έχει μια ολιγομερή δομή (400-700 kda), φτιαγμένη από υπομονάδες που περιέχουν τρεις όμοιες αλυσίδες πεπτιδίων από 32 kda η κάθε μια. Παρόλο που η MBL μπορεί να σχηματίσει διαφορετικά ολιγομερή, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα διμερή και τριμερή δεν είναι βιολογικώς ενεργά και απαιτείται τουλάχιστον ένας τετραμερής σχηματισμός για την ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Οι αλυσίδες πεπτιδίων αποτελούνται από ένα μέρος τύπου κολλαγόνου κι ένα μέρος λεκτίνης. Το μέρος της λεκτίνης προσδένεται μέσω "πεδίων αναγνώρισης υδατανθράκων" (carbohydrate recognition domains-crd) σε διαφορετικές ομάδες σακχάρων όπως η μαννόζη, η μαλτόζη, η Ν- ακετυλογλυκοζαμίνη, η Ν-ακετυλογαλακτοζαμίνη, η φουκόζη και η γλυκόζη. Η δέσμευση έχει χαμηλή συγγένεια (Kd 10-3 ) και είναι απαραίτητο να προσδεθούν ταυτόχρονα περισσότερα μέρη λεκτίνης ενός μορίου MBL για την επίτευξη μιας λειτουργικής δέσμευσης (4). Στην κυκλοφορία, η MBL σχηματίζει ένα λειτουργικό σύμπλοκο με τις MASPs (προτεάση σερίνης σχετιζόμενη με MBL) 1, 2, και 3, που ενεργοποιείται ενζυματικά, μετά τη δέσμευση με κάποιον μικροοργανισμό. Η MASP-2 είναι όμοια με την C1-εστεράση στην κλασσική διαδρομή συμπληρώματος και είναι ικανή να διαχωρίσει τα C4 και C2, οπότε και παράγεται C4b2a. Η C4b2a λειτουργεί σαν C3-κονβερτάση και διαχωρίζει την C3, οπότε και παράγεται C3b, που προκαλεί οψωνοποίηση του μικροβίου (2). Εξάλλου, υπάρχουν ενδείξεις ότι η MBL προσδένεται απευθείας σε υποδοχείς κολλεκτίνης στην επιφάνεια των φαγοκυττάρων. Τούτο αφήνει να εννοηθεί ότι η MBL προσδένεται στον υποδοχέα C1q σε ουδετερόφιλα κοκκιοκύτταρα, μονοκύτταρα και μακροφάγα. Δέσμευση σε κύτταρα-τελεστές μπορεί να διεγείρει την παραγωγή προ-φλεγμονωδών κυτοκινών. Η MBL είναι μια πρωτεΐνη οξείας φάσης και συντίθεται στα ηπατοκύτταρα. Αμέσως μετά τον τοκετό και εντός ολίγων εβδομάδων, η συγκέντρωση της MBL στο πλάσμα αυξάνεται από 1000 ng/ml έως το μέγιστο των 2500 ng/ml, και κατόπιν μειώνεται στα 1700 ng/ml στις ενήλικες. Ατομικές συγκεντρώσεις MBL ποικίλουν σημαντικά και μπορεί να εικοσαπλασιαστούν κατά τη διάρκεια της αντίδρασης οξείας φάσης. Ως μέρος του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος, η MBL είναι σημαντική στην περίοδο που ακολουθεί τον τοκετό, όταν οι συγκεντρώσεις του μητρικού αντισώματος μειώνονται και πρέπει να ξεκινήσει η παραγωγή ιδίας IgG. Επιπλέον, η MBL παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε οποιαδήποτε ηλικία στην αρχική επαφή με μικροοργανισμούς, πριν αυξηθούν οι συγκεντρώσεις IgM. el Η κλινική σχετικότητα της MBL Ο επιπολασμός της ανεπάρκειας της MBL είναι σχετικά υψηλός, συγκριτικά με άλλες ανεπάρκειες του συστήματος του συμπληρώματος, και ανέρχεται στο περίπου 20-25% του συνολικού πληθυσμού. Η ανεπάρκεια της MBL συνδέεται με αυξημένη ευαισθησία σε λοιμώξεις, όπως μέση ωτίτιδα, πνευμονίτιδα, γαστρεντερίτιδα, μηνιγγίτιδα, οστεομυελίτιδα και σηψαιμία. Παιδιά με ετερόζυγη μετάλλαξη του γονιδίου MBL διατρέχουν διπλάσιο κίνδυνο εισαγωγής στο νοσοκομείο λόγω λοιμώδους νόσου, σε σχέση με παιδιά με κανονικά επίπεδα MBL. Σε περίπτωση ομόζυγης μετάλλαξης του γονιδίου, ο κίνδυνος λοιμώξεων είναι ακόμη μεγαλύτερος και η πορεία της νόσου είναι χειρότερη από ό,τι σε ασθενείς με κανονικά επίπεδα MBL. Ασθενείς κυστικής ίνωσης με μετάλλαξη γονιδίου MBL είναι πιο επιδεκτικοί σε λοιμώξεις από Pseudomonas aeruginosa ή Burkholderia cepacia και έχουν χαμηλότερο προσδόκιμο επιβίωσης από ό,τι ασθενείς με κυστική ίνωση χωρίς τη μετάλλαξη (5). Ογκολογικοί ασθενείς, που λαμβάνουν χημειοθεραπευτική αγωγή κατά του καρκίνου και οι οποίοι κατά συνέπεια αναπτύσσουν ουδετεροπενία, είναι πιο ευάλωτοι σε μακρές περιόδους πυρετού εφόσον έχουν χαμηλές συγκεντρώσεις MBL στο πλάσμα. Σε παιδιά μικρότερα του ενός έτους, με τη νόσο Kawasaki, η ανεπάρκεια MBL είναι παράγοντας κινδύνου για ανευρύσματα στεφανιαίων φλεβών. Σε ασθενείς θετικούς σε HIV, η πορεία προς το AIDS εξελίσσεται ταχύτερα εάν παρουσιάζουν ανεπάρκεια σε MBL. Η ανεπάρκεια MBL συνδέεται με επαναλαμβανόμενες αυτόματες αποβολές, πιθανόν λόγω ενδομητριακών λοιμώξεων. Η ανεπάρκεια MBL συνδέεται με αυτοάνοσα νοσήματα, όπως συστημικός ερυθηματώδης λύκος (Systemic Lupus Erythematosus - SLE) και ρευματοειδής αρθρίτιδα (RA). Συσχέτιση μεταξύ ανεπάρκειας MBL και της επίπτωσης τόσο λοιμώξεων όσο και αυτοάνοσων νοσημάτων δεν έχει οδηγήσει μόνο σε αύξηση των διαγνωστικών μεθόδων για MBL, αλλά έχει καταδείξει την ανάγκη θεραπευτικών εφαρμογών σε απομονωμένη MBL. II. Αρχή της τεχνικής Η εξέταση είναι μια μορφή ELISA, που πραγματοποιείται σε μικροκοιλότητες επικαλυμμένες με μαννάνη. Η MBL που είναι παρούσα σε ένα μετρημένο όγκο δείγματος ή βαθμονομητή προσδένεται στην επικάλυψη μαννάνης στην πλάκα μικροτιτλοδότησης. Όσο υλικό δεν δεσμευτεί αφαιρείται με έκπλυση. Κατόπιν, προστίθεται ένα σύζευγμα αντισώματος έναντι MBL με υπεροξειδάση του χρένου (HRP) (αντι-ανθρώπινο-mbl/1-hrp). Μετά την αφαίρεση του μη δεσμευμένου συζεύγματος HRP με έκπλυση, στις κοιλότητες προστίθεται διάλυμα υποστρώματος. Το χρώμα που αναπτύσσεται είναι ανάλογο της ποσότητας MBL που υπάρχει στο δείγμα ή στο βαθμονομητή. Η ενζυματική αντίδραση σταματά με χημικό τρόπο και η ένταση του χρώματος διαβάζεται στα 450nm σε μια συσκευή ανάγνωσης ELISA. Από την απορρόφηση των δειγμάτων, η συγκέντρωση της MBL προσδιορίζεται δια παρεμβολής σε μια καμπύλη βαθμονόμησης. III. Αποθήκευση και σταθερότητα Το κιτ MBL ELISA πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία μεταξύ -18 C και -32 C. Η απόδοση του κιτ είναι εγγυημένη μέχρι την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα της συσκευασίας. Οι συνθήκες μεταφοράς μπορεί να διαφέρουν από τις συνθήκες αποθήκευσης. Μην καταψύχετε-αποψύχετε περισσότερες από τρεις φορές. IV. Περιεχόμενα του κιτ Το κιτ MBL ELISA περιέχει υλικό που επαρκεί για 288 εξετάσεις (τρεις πλάκες μικροτιτλοδότησης), μεταξύ των οποίων βαθμονομητές, μάρτυρες και τυφλά. Δείτε τον Πίνακα στο τέλος του ένθετου της συσκευασίας αυτής. Η μαννάνη που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως επικάλυψη έχει απομονωθεί από Saccharomyces cerevisiae. Το μονοκλωνικό αντίσωμα απομονώθηκε από μέσο ιστοκαλλιέργειας, χρησιμοποιώντας χρωματογραφία στήλης (ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία και χρωματογραφία συγγένειας). Ο βαθμονομητής και ο μάρτυρας είναι ανθρώπινοι οροί. 2

V. Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά Πρόσθετα υλικά: Απεσταγμένο νερό για αραίωση των ρυθμιστικών διαλυμάτων πλύσης, αραίωσης και υποστρώματος. Δοκιμαστικοί σωλήνες, φιάλες, κύλινδροι απαραίτητοι για την προετοιμασία των αντιδραστηρίων. Πιπέτες για την ακριβή μεταφορά όγκων. Μια πρότυπη συσκευή έκπλυσης ELISA ή ένας πλαστικός υδροβολέας 500 ml για αυτόματη ή χειροκίνητη έκπλυση των σειρών. Μια πρότυπη συσκευή ανάγνωσης ELISA για τον υπολογισμό της απορρόφησης στα 450 nm. Χαρτί με λογαριθμικό και γραμμικό άξονα. Πρόσθετα ρυθμιστικά διαλύματα και διαλύματα: Ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης: Ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικών/διττανθρακικών 0,1 M με ph 9,6 Ρυθμιστικά διαλύματα και διαλύματα για ενζυματική εμφάνιση χρώματος: Ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος: Ρυθμιστικό διάλυμα οξικών 0,11 M με ph 5,5 Διαλύστε 15,0 g οξικό νάτριο ( CH 3 COONa.3H 2 O ) σε 800 ml αποσταγμένου νερού. Ρυθμίστε το ph στο 5,5 με κρυσταλλικό οξικό οξύ, προσθέστε αποσταγμένο νερό σε όγκο 1lt. Μην προσθέσετε κανένα συντηρητικό (π.χ. merthiolate, νατραζίδιο) διότι μπορεί να επηρεάσουν την ποιότητα της ενζυματικής εμφάνισης χρώματος. Μητρικό διάλυμα 3,5,3',5'-τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) : 6 mg/ml TMB σε DMSO. Διαλύστε 30 mg 3,5,3',5'-τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB) σε 5 ml διμεθυλοσουλφοξειδίου (DMSO). Μητρικό διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου: Διάλυμα H 2 O 2 3% σε απεσταγμένο νερό. Διάλυμα παύσης: Διάλυμα H 2 SO 4 1,8 M σε απεσταγμένο νερό. Για μια πλάκα μικροτιτλοδότησης ετοιμάστε 12 ml διαλύματος υποστρώματος προσθέτοντας 12 ml ρυθμιστικό διάλυμα υποστρώματος 200 μl TMB μητρικό διάλυμα 12 μl H 2 O 2 μητρικό διάλυμα. VI. Χειρισμός δειγμάτων εξέτασης Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται ασηπτικά. Ο ορός είναι το δείγμα που προτιμάται, αλλά η ηπαρίνη ή πλάσματα με EDTA ως αντιπηκτικό είναι επίσης κατάλληλα για χρήση στην ανάλυση. Στην περίπτωση πλασμάτων, στο ρυθμιστικό διάλυμα μπορούν να προστεθούν 10 U/mL ηπαρίνης. Τα δείγματα θα πρέπει να είναι όσο το δυνατόν πιο πρόσφατα ή να έχουν φυλαχτεί στην κατάψυξη. VII. Πρωτόκολλο ανάλυσης Τη μέρα της εξέτασης, αποψύξτε όλα τα αντιδραστήρια, αφήστε τα σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) και αναμίξτε ελαφρά. Αποφύγετε το σχηματισμό φυσαλίδων ή αφρού. Το 5 φορές συμπυκνωμένο ρυθμιστικό διάλυμα μπορεί να τοποθετηθεί σε λουτρό 37 C και να αναμιγνύεται τακτικά.ο βαθμονομητής και ο μάρτυρας μπορεί να αποψυχθούν με το χέρι. Φυγοκεντρήστε όλα τα φιαλίδια πριν από τη χρήση (1 λεπτό στα 3000g.) Συνιστάται ο έλεγχος όλων των δειγμάτων, μαρτύρων και των αραιώσεων βαθμονόμησης εις διπλούν. Βλ. πίνακα 4 από τα φυλλάδια που εσωκλείονται για το προτεινόμενο πλάνο πλάκας Πλάκα μικροτιτλοδότησης Το κιτ περιέχει τρεις πλάκες μικροτιτλοδότησης. Ανάλογα με τον αριθμό των εξεταζομένων δειγμάτων, μια η περισσότερες πλάκες πρέπει να καλυφθούν με μαννάνη, την προτεραία της εξέτασης. Στο κιτ αυτό, η μαννάνη παρέχεται ως διάλυμα συμπυκνωμένο 100 φορές. Το ρυθμιστικό διάλυμα επικάλυψης πρέπει να έχει ετοιμαστεί προσφάτως. Για κάθε πλάκα μικροτιτλοδότησης, προσθέστε 120 μl μαννάνης σε 12 ml ρυθμιστικού διαλύματος επικάλυψης. Προσθέστε 100μL σε όλες τις κοιλότητες, καλύψτε την/ις πλάκα/ες μικροτιτλοδότησης με το καπάκι και επωάστε αποβραδίς σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C). Ρυθμιστικά διαλύματα Υπολογίστε την ποσότητα του απαιτούμενου ρυθμιστικού διαλύματος πλύσης και προετοιμάστε ένα διάλυμα κανονικής περιεκτικότητας, αραιώνοντας το ρυθμιστικό διάλυμα σε αναλογία 1:20 σε απεσταγμένο νερό (μια πλάκα απαιτεί περίπου 300 ml). Το αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία 2-8 C και παραμένει σταθερό επί μία εβδομάδα. Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης: Υπολογίστε την ποσότητα του απαιτούμενου ρυθμιστικού διαλύματος για την αραίωση και προετοιμάστε ένα διάλυμα κανονικής περιεκτικότητας, αραιώνοντας το ρυθμιστικό διάλυμα σε αναλογία 1:5 με απεσταγμένο νερό. Προετοιμασία του βαθμονομητή και του μάρτυρα (in duplo) Για συγκεντρώσεις, βλ. Πίνακες 2 και 3 του ενημερωτικού φυλλαδίου που περιέχεται στη συσκευασία. Αποψύξτε το βαθμονομητή και το μάρτυρα κρατώντας τους στο χέρι και αναμίξτε ελαφρά. Τοποθετήστε ετικέτες σε τέσσερις σωλήνες, δύο για τον μάρτυρα (in duplo) και δύο για το υψηλότερο (350 ng/ml) σημείο βαθμονόμησης (in duplo). Βαθμονομητής: Βλ. πίνακα 1 των πληροφοριών που εσωκλείονται για την προετοιμασία του υψηλότερου σημείου βαθμονόμησης. Τοποθετήστε ετικέτες σε οκτώ (8) σωλήνες, έναν σωλήνα για κάθε αραίωση της καμπύλης βαθμονομητή (in duplo): 140, 56, 22,4 και 9,0 ng/ml. Στη συνέχεια, μεταφέρετε με πιπέτα 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος στους τρεις αυτούς σωλήνες. Μεταφέρετε 100μL από το δοκιμαστικό σωλήνα του υψηλότερου σημείου βαθμονόμησης στο δεύτερο σωλήνα των 140 ng/ml και ανακατέψτε καλά. Επαναλάβετε τη διαδοχική αραίωση τρεις ακόμα φορές προσθέτοντας 100μL από το σωλήνα του προηγουμένως αραιωμένου βαθμονομητή στα 150μL του διαλύτη στους σωλήνες που έχετε επικολλήσει τις ετικέτες.. Η καμπύλη του βαθμονομητή θα περιλαμβάνει 350, 140, 56, 22.4, και 9,0 ng/ml (in duplo). Χρησιμοποιήστε το ρυθμιστικό διάλυμα ως τυφλό (0 ng/ml). Μάρτυρας: Μεταφέρετε με πιπέτα 380 μl ρυθμιστικό διάλυμα κανονικής περιεκτικότητας σε σωλήνες για το μάρτυρα (in duplo), προσθέστε 20 μl του μάρτυρα και αναμίξτε καλά. 3

Προετοιμασία δειγμάτων Αραιώστε τα δείγματα προς εξέταση σε αναλογία 1:20 σε ρυθμιστικό διάλυμα παρόμοιο με τον ορό του μάρτυρα Για αποτελέσματα που βρίσκονται εκτός των δοθέντων ορίων (βλ. Πίνακα 1 του εσώκλειστου φυλλαδίου πληροφοριών), η εξέταση πρέπει να επαναληφθεί με διαφορετική αραίωση δείγματος. 1. Πρώτο βήμα πλύσης Αναρροφήστε το διάλυμα μαννάνης από κοιλότητες των πλακών μικροτιτλοδότησης. και γεμίστε πλήρως τις κοιλότητες (> 300 µl) με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης και στη συνέχεια απορρίψτε το. Επαναλάβετε τη διαδικασία αυτή τρεις φορές. Στο τέλος, οι κοιλότητες θα είναι εντελώς άδειες. Στη συνέχεια, θα πρέπει να προστεθεί άμεσα αντιδραστήριο. Μην αφήνετε τις κοιλότητες να στεγνώσουν για μεγάλο χρονικό διάστημα. 2. Πρώτο βήμα επώασης Προσθέστε 100 µl αραιωμένου βαθμονομητή, μάρτυρα, και δειγμάτων στις κατάλληλες κοιλότητες. Καλύψτε την πλάκα μικροτιτλοδότησης με αυτοκόλλητη ταινία ασφαλείας, και ανακινήστε απαλά χτυπώντας ελαφρά την άκρη της πλάκας για λίγα δευτερόλεπτα, προκειμένου να αναμίξετε τα περιεχόμενα κάθε κοιλότητας. Επωάστε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C). Λίγο πριν από την έκπλυση, προετοιμάστε το επόμενο αντιδραστήριο επώασης, όπως περιγράφεται στο σημείο 4. 3. Δεύτερο βήμα έκπλυσης Αναρροφήστε υπερκείμενο από τις κοιλότητες και ξεπλύνετε την πλάκα, όπως περιγράφεται στο σημείο 1. 4. Επώαση με αντι-ανθρώπινη MBL-HRP. Αραιώστε το σύζευγμα 1:100. Για κάθε πλάκα μικροτιτλοδότησης, προσθέστε 120 μl HRP συζεύγματος σε 12 ml ρυθμιστικό διάλυμα. Προσθέστε 100μl σε κάθε κοιλότητα. Καλύψτε την πλάκα με αυτοκόλλητη ταινία ασφαλείας, και ανακινείστε απαλά χτυπώντας ελαφρά την άκρη για λίγα δευτερόλεπτα, προκειμένου να αναμίξετε τα περιεχόμενα κάθε κοιλότητας. Επωάστε επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C). Λίγο πριν την έκπλυση, προετοιμάστε το επόμενο αντιδραστήριο επώασης TMB-υπόστρωμα, όπως περιγράφεται στο V (Πρόσθετα απαιτούμενα υλικά). 5. Τρίτο βήμα έκπλυσης Αναρροφήστε υπερκείμενο από τις κοιλότητες και ξεπλύνετε την πλάκα, όπως περιγράφεται στο σημείο 1. 6. Επώαση με υπόστρωμα ΤΜΒ Προσθέστε 100 µl διαλύματος υποστρώματος ΤΜΒ σε όλες τις κοιλότητες. Ανακινήστε απαλά χτυπώντας ελαφρά την άκρη της πλάκας μικροτιτλοδότησης για λίγα δευτερόλεπτα προκειμένου να αναμίξετε τα περιεχόμενα κάθε κοιλότητας. Επωάστε έως 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C) σε σκοτεινό μέρος. Σημείωση: Η ταχύτητα της ενζυματικής ανάπτυξης χρώματος επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, όπως η θερμοκρασία και η ποιότητα του χρησιμοποιημένου ΤΜΒ. 7. Παύση της ενζυματικής αντίδρασης Προσθέστε 100 µl ρυθμιστικού διαλύματος παύσης σε όλες τις κοιλότητες. 8. Ανάγνωση πλάκας Διαβάστε εντός 30 λεπτών στα 450 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης ELISA. VIII. Αποτελέσματα και ερμηνεία δεδομένων Καταγράψτε την απορρόφηση στα 450 nm για κάθε κοιλότητα και βρείτε το μέσο όρο των τιμών εις διπλούν. Για κάθε δείγμα, τα αντίγραφα δεν θα πρέπει να διαφέρουν περισσότερο από 15% της μέσης τιμής. Αν τα αντίγραφα εμφανίζουν μεγαλύτερη διαφορά, η ανάλυση θα πρέπει να επαναληφθεί. Σχηματίστε τη γραφική παράσταση της μέσης απορρόφησης των βαθμονομητών (άξονας y) έναντι της αντίστοιχης MBL σε ng/ml (άξονας x) σε χαρτί με ένα λογαριθμικό και ένα γραμμικό άξονα και χαράξτε την καμπύλη βέλτιστης προσέγγισης (best fit). Τα επίπεδα MBL στους μάρτυρες θα πρέπει να βρίσκονται εντός των ορίων που αναγράφονται στον Πίνακα 3 του εσώκλειστου φυλλαδίου πληροφοριών. Παρεμβάλλετε τη μέση τιμή απορρόφησης του κάθε δείγματος πάνω στην καμπύλη αναφοράς. Τα δείγματα προς εξέταση που εμφανίζουν μέση απορρόφηση εκτός των ορίων αραίωσης της καμπύλης αναφοράς θα πρέπει να αραιώνονται κατάλληλα. IX. Όρια ανάλυσης Συμβουλευτείτε τον Πίνακα 1 του εσώκλειστου φυλλαδίου πληροφοριών για τα όρια ανάλυσης του συγκεκριμένου κιτ. X. Όρια αναφοράς Μετρήσεις σε μια ομάδα φυσιολογικών υγιών δωρητών αίματος στην Ολλανδία (n=244), απέδωσαν τις ακόλουθες τιμές MBL. 10% εκατοστημόριο <0,04 μg/ml 25% εκατοστημόριο 0,4 μg/ml 50% εκατοστημόριο 1,1 μg/ml 75% εκατοστημόριο 2,0 μg/ml 90% εκατοστημόριο 3,3 μg/ml Καθώς τα όρια αναφοράς επηρεάζονται από πολλές παραμέτρους που μπορεί να διαφέρουν για κάθε πληθυσμό που εξετάζεται, κάθε εργαστήριο θα πρέπει να εδραιώσει τα δικά του όρια αναφοράς. XI. Ειδικά χαρακτηριστικά επιδόσεων Επαναληψιμότητα Διακύμανση εντός αναλύσεων: Δυο διαφορετικές αραιώσεις ενός ορού δείγματος έχουν μετρηθεί έντεκα φορές το καθένα σε μια δοκιμή. Διακύμανση μεταξύ αναλύσεων: Σε έξι έως δέκα διαφορετικές αναλύσεις, η ποσότητα της MBL μετρήθηκε σε τρία διαφορετικά δείγματα ορού. 4

Εντός της ίδιας ανάλυσης Μέσος όρος Διακύμανση Αραίωση 1 (1:10) 1,46 μg/ml 6,0% Αραίωση 2 (1:50) 1,53 μg/ml 6,1% Εντός ανάλυσης Μέσος όρος Διακύμανση Δείγμα 1 1,52 μg/ml 7,9% Δείγμα 2 1,49 μg/ml 4,8% Δείγμα 3 1,60 μg/ml 11,2% Σημείωση: Οι αναφερόμενες τιμές για τα ειδικά χαρακτηριστικά επιδόσεων της εξέτασης αντιπροσωπεύουν χαρακτηριστικά αποτελέσματα και δεν πρέπει να θεωρούνται ως προδιαγραφές για το παρόν κιτ. Ευαισθησία Το κιτ έχει ένα ελάχιστο επίπεδο ανίχνευσης 9,0 ng/ml και ένα μετρήσιμο εύρος συγκέντρωσης από 9,0 έως 350 ng/ml. Σημείωση: Οι αναφερόμενες τιμές ευαισθησίας της εξέτασης αντιπροσωπεύουν χαρακτηριστικά αποτελέσματα και δεν πρέπει να θεωρούνται ως ειδικές για το παρόν κιτ. Ειδικότητα Η απουσία διασταυρωτής αντίδρασης με άλλα συστατικά πλάσματος ή ορού υποστηρίζεται από το γεγονός ότι οι τιμές που μετρήθηκαν σε δότες σχετικά ανεπαρκείς σε MBL, αλλά κατά τα άλλα φυσιολογικούς, δε διαφέρουν από το μηδέν. Αναμενόμενες τιμές Βλ. Χ (Όρια αναφοράς) XII. Περιορισμοί 1. Ο χρήστης θα πρέπει να είναι εκπαιδευμένος και εξοικειωμένος με την ανάλυση ELISA και τη διαδικασία εξέτασης. 2. Δε πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα που έχουν αιμολυθεί εμφανώς ή υπερλιπιδαιμικά δείγματα. Μπορεί να ληφθούν μη αναμενόμενα αποτελέσματα για δείγματα που περιέχουν ρευματοειδή παράγοντα, υψηλά επίπεδα χολερυθρίνης ή άλλα κυκλοφορούντα ανοσοσύμπλοκα. Αυτά τα δείγματα θα πρέπει να αναλύονται με άλλη μέθοδο. 3. Τα εκτός ορίων δείγματα πρέπει να επαναλαμβάνονται χρησιμοποιώντας διαφορετικές αραιώσεις. 4. Η εύρεση μειωμένου επιπέδου σε ένα από τα επίπεδα MBL δεν μπορεί ποτέ να αποτελεί οριστική διάγνωση αλλά θα πρέπει μάλλον να θεωρείται ως ένδειξη διαταραχής του ανοσοποιητικού συστήματος που απαιτεί περαιτέρω διαγνωστική διερεύνηση. 5. Ο ορός μάρτυρας θα πρέπει πάντα να χρησιμοποιείται για τον έλεγχο της εγκυρότητας της καμπύλης βαθμονόμησης. Όταν ο ορός μάρτυρας βρίσκεται εκτός εύρους, τα αποτελέσματα των εξεταστικών δειγμάτων δεν είναι αξιόπιστα. Ο έλεγχος θα πρέπει να επαναληφθεί. 6. Τα αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες δεν είναι ανταλλάξιμα. 7. Το υπολείμματα αντιδραστηρίων (π.χ. νεκρός όγκος) δεν θα πρέπει να αναμιγνύονται με τα περιεχόμενα φιαλιδίων που ανοίχθηκαν πρόσφατα. 8. Τα πώματα και τα φιαλίδια δεν είναι ανταλλάξιμα. Τα πώματα θα πρέπει να επανατοποθετούνται στα αντίστοιχα φιαλίδια. 9. Αν και ο ανθρώπινος βαθμονομητής και οι οροί-μάρτυρες έχουν ελεγχθεί για δείκτες συγκεκριμένων παραγόντων μετάδοσης νόσων σύμφωνα με τις τρέχουσες οδηγίες της Ευρωπαϊκής Ένωσης για GMP και έχουν βρεθεί μη δραστικοί, όλα τα συστατικά ανθρώπινης προέλευσης θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικώς λοιμώδη. 10. Συντηρητικό: merthiolate 0,001%. 11. Χρησιμοποιήστε νέες σφραγίδες για τις πλάκες για κάθε βήμα επώασης/σταθεροποίησης με το πείραμα ELISA, για να αποφύγετε τη μόλυνση. Μη χρησιμοποιείτε αλουμινόχαρτο. 12. Χρησιμοποιήστε αναλώσιμα άκρα πιπετών για κάθε μεταφορά για να αποφύγετε τη μόλυνση. 13. Κάθε φορά που χρησιμοποιείται το κιτ, θα πρέπει να γίνονται καινούριες αραιώσεις βαθμονομητών, συζευγμάτων και ρυθμιστικών διαλυμάτων. 14. Μη χρησιμοποιείτε αντιδραστήρια και πλάκες μικροτιτλοδότησης, εκτός από εκείνα που σας παρέχονται με το κιτ. 15. Το νατραζίδιο απενεργοποιεί το HRP, μη χρησιμοποιείτε διαλύματα που περιέχουν νατραζίδιο και μην προσθέτετε νατραζίδιο στα παρεχόμενα ρυθμιστικά διαλύματα. Μη χρησιμοποιείτε merthiolate γιατί μπορεί να επηρεάσει την ποιότητα ενζυματικής εμφάνισης χρώματος. 16. Η απόρριψη των αποβλήτων πρέπει να διεξάγεται σύμφωνα με τους κανονισμούς του εργαστηρίου σας. 17. Μην αφήσετε ακάλυπτες ή στεγνές τις κοιλότητες για μακρές περιόδους μεταξύ των βημάτων επώασης. XIII. Βιβλιογραφία 1. Turner, M.W. (1996) Immunol Today 17:532-540 2. Gadjeva, M. Thiel, S. Jensius, J.C. (2001) Curr Opin Immunol 13:74-78 3. Klabunde, J. et al (2002) Parasitol Res 88(2):113-117 4. Thielens, N.M. et al (2001) J Immunol 166:5068-5077 5. Garred, P. (1999) J Clin Invest 104:431-437 ELISA Human Mannose Binding Lectin ELISA kit 1 375 μl COAT MANNAN STOCK 1:100 1 500 μl CAL 1 200 μl CONTROL 1 375 μl HRP MOU Ab HUM MBL CONJ 1:100 1 50 ml BUF DIL STOCK 1:5 1 60 ml BUF WASH STOCK 1:20 3 12x8 WELL 10 SEALS 5