ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΗΜΗΤΡΑ ΚΟΤΣΙΡΙΛΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Α.Μ. 297

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΗΜΗΤΡΑ ΚΟΤΣΙΡΙΛΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ Α.Μ. 297 ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΟΥ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΤΟΥ ΕΠΙΔΕΡΜΙΚΟΥ ΑΥΞΗΤΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΚΑΙ ΤΟΥ NOTCH ΣΤΟ ΜΗ ΜΙΚΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ Μέλη επιτροπής: Χαράλαμπος Καλόφωνος, Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας Θωμάς Μακατσώρης, Λέκτορας Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας ΠΑΤΡΑ 2013

2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στην επιβλέπουσα μου, κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μοριακής Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την αμέριστη υποστήριξη της, τις υποδείξεις της και την υπομονή της. Πολλές ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στην τριμελή μου επιτροπή, στον κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, Καθηγητή Παθολογίας-Ογκολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την επιμέλεια της ερευνητικής εργασίας, τις υποδείξεις του και τη φιλοξενία του στο Εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας και τον κ. Θωμά Μακατσώρη, Επίκουρο Καθηγητή Παθολογίας-Ογκολογίας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την επιμέλεια της ερευνητικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την κ. Έφη Γιαννοπούλου για την επιστημονική της υποστήριξη αλλά και την ψυχολογική και για την αγάπη που με περιέβαλε. Η βοήθεια της ανεκτίμητη και πολύτιμη. Τέλος ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς μου για όλα όσα μου έδωσαν και μου δίνουν. 3

4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περιεχόμενα Εισαγωγή Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του EGFR Καρκίνος του πνεύμονα και EGFR. Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του Notch Καρκίνος του πνεύμονα και Notch. Σκοπός της εργασίας Υλικά και Μέθοδοι. Κυτταρικές καλλιέργειες Διαδικασία split και ανακαλλιέργεια κυττάρων.. Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer.. Έλεγχος της επίδρασης ουσιών στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.. Ηλεκτροφόρηση. Συλλογή δειγμάτων... Λύση κυττάρων και προετοιμασία για ηλεκτροφόρηση... SDS page ηλεκτροφόρηση.. Western blotting Μέθοδος ανοσοαποτύπωσης Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF Προσδιορισμός της απόπτωσης/νέκρωσης με τη μέθοδο της Annexin V/Ιωδιούχου προπιδίου Αποτελέσματα. Συμπεράσματα Βιβλιογραφία... Περίληψη. 5 σελ.5 σελ.9 σελ.17 σελ.20 σελ.28 σελ.36 σελ.41 σελ.47 σελ.49 σελ.49 σελ.51 σελ.53 σελ.55 σελ.55 σελ.55 σελ.57 σελ.60 σελ.63 σελ.63 σελ.65 σελ.81 σελ.89 σελ.101

6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

8

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο σε άνδρες και γυναίκες στις αναπτυσσόμενες χώρες. Ο αριθμός των ασθενών που διαγιγνώσκονται με καρκίνο του πνεύμονα ετησίως ανέρχεται σε 1,3 με 1,5 εκατομμύρια, παγκοσμίως. Η κύρια αιτία του καρκίνου του πνεύμονα είναι το κάπνισμα. Άλλοι παράγοντες που μπορεί να προκαλούν καρκίνο του πνεύμονα είναι η έκθεση σε άσβεστο, νικέλιο, πολυκυκλικούς υδρογονάνθρακες, αρσενικό, ενώσεις χρωμίου, ραδόνιο και ουράνιο. Έχει υπολογιστεί ότι 9% - 15% των καρκινωμάτων του πνεύμονα παγκοσμίως έχει αίτια διαφορετικά από το κάπνισμα. Η δημιουργία του καρκίνου του πνεύμονα πιθανότατα ξεκινάει χρόνια ή και δεκαετίες πριν την εμφάνιση του. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, τα κύτταρα υπόκεινται σε αναρίθμητες αλλαγές σε μοριακό επίπεδο, οι οποίες τελικά οδηγούν σε ένα επιθετικό καρκίνωμα. Υπάρχουν δύο τύποι καρκίνου του πνεύμονα: ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (ΜΜΚΠ) που αποτελεί το 85% των περιπτώσεων και ο μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (ΜΚΠ) που αποτελεί το 15% των περιπτώσεων. Ο ΜΜΚΠ ταξινομείται σε τρεις υποκατηγορίες: πλακώδες καρκίνωμα, αδενοκαρκίνωμα και καρκίνος του πνεύμονα από μεγάλα κύτταρα. Το κάπνισμα, αν και προκαλεί όλους τους τύπους καρκίνου, εντούτοις σχετίζεται περισσότερο με τον ΜΚΠ και το πλακώδες καρκίνωμα. Το αδενοκαρκίνωμα εμφανίζεται κυρίως σε μη καπνιστές. Καρκίνος του πνεύμονα και καπνός του τσιγάρου Ο καρκίνος του πνεύμονα κατά 85% προκαλείται από τον καπνό του τσιγάρου ο οποίος προκαλεί μια σταδιακή συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών ανωμαλιών που οδηγούν σε βλάβες και σε μεταστατικές διαδικασίες. Όμως μία άλλη κατηγορία καρκίνου του πνεύμονα που συμπεριλαμβάνει το 20% των αδενοκαρκινωμάτων, εμφανίζεται σε μη καπνίζοντες ασθενείς και χρησιμοποιεί 9

διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια για την ανάπτυξη των όγκων. Η πλειονότητα των καρκίνων του πνεύμονα, 85% του ΜΜΚΠ και 98% του ΜΚΠ, προκύπτουν στους καπνιστές. Ανάμεσα από τα είκοσι καρκινογόνα που υπάρχουν στον καπνό του τσιγάρου και που σχετίζονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα τα πιο γνωστά είναι οι πολυκυκλικοί αρωματικοί υδρογονάνθρακες και οι νιτροζοαμινο κετόνες τα οποία οδηγούν σε γενετικές μεταλλάξεις μέσω του σχηματισμού συμπλόκου με το DNA. Ο σχηματισμός συμπλόκου προκαλείται από ενεργοποίηση του μεταβολισμού των παραπάνω καρκινογόνων από το κυτόχρωμα Ρ450, τα ένζυμα της οικογένειας CYP και τις γλουταθειόνες S τρανσφεράσες (GSTs). Ανωμαλίες στα σηματοδοτικά μονοπάτια που προκαλούν ογκογένεση. Σε πολλά μονοπάτια στον καρκίνο του πνεύμονα έχουν μεταβληθεί οι λειτουργίες τους και αυτά τα μονοπάτια αναδεικνύονται, αφού είναι πολύ σημαντικά σε σχέση με τη στοχευμένη θεραπεία. Τα πιο πολλά μονοπάτια καθοδηγούνται από ογκογονίδια, τα οποία οδηγούν τα κύτταρα σε κακοήθη φαινότυπο, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και αποφυγή της απόπτωσης. Όταν αυτή η ανώμαλη λειτουργία καταστέλλεται ή απομακρύνεται από ένα στοχευμένο φάρμακο, το κύτταρο πεθαίνει και αυτό παρέχει μία φαρμακευτική ευαισθησία, δηλαδή τα κύτταρα θα εμφανίζουν μειωμένη αντοχή στη φαρμακευτική αγωγή. Παρακάτω αναφέρονται πιο αναλυτικά τα σηματοδοτικά μονοπάτια που είναι γνωστό ότι δυσλειτουργούν στον καρκίνο του πνεύμονα. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR: Η απορρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR παρατηρείται σε πολλά είδη καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του ΜΜΚΠ. Παρατηρείται υπερέκφραση του EGFR σε περίπου το 62% των περιπτώσεων του ΜΜΚΠ και συχνά σχετίζεται με κακή πρόγνωση. Ως συνέπεια της συχνής απορρύθμισης του μονοπατιού του EGFR που παρατηρείται στον ΜΜΚΠ, ο EGFR είναι από τα πρώτα μόρια που επιλέχθηκαν για στοχευμένη θεραπεία. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά αντισώματα τα οποία σταματούν την αλληλεπίδραση προσδέτη-υποδοχέα. Οι τελευταίες προσεγγίσεις χρησιμοποιούν μικρά μόρια όπως τους αντιστρεπτούς αναστολείς κινάσης τυροσίνης (TKIs) όπως η γκεφιτινίμπη (gefitinib, Iressa) και 10

την ερλοτινίμπη (erlotinib, Tarceva) Το μονοπάτι της κινάσης ALK (anaplastic lymphoma kinase fusion proteins): Μία επαναλαμβανόμενη σύντηξη μεταξύ του γονιδίου EML4 (echinoderm microtubule associated protein like 4) και του γονιδίου ALK εμφανίζεται στο 7% των περιπτώσεων του ΜΜΚΠ κι αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης σύντηξης ALK. Συνήθως συναντάται σε ασθενείς που δεν έχουν καπνίσει ποτέ και ίσως παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση της RAS. Το μονοπάτι του παράγοντα TITF1 (thyroid transcription factor 1): Ο TITF1 είναι ένας σημαντικός μεταγραφικός παράγοντας απαραίτητος για την ανάπτυξη των περιφεριακών αεραγωγών. Πολύ συχνά υπερεκφράζεται σε όγκους του τελικού τμήματος του αναπνευστικού. Αναστολή του απο RNA παρεμβολής (interference) προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης και απόπτωση. Οικογένεια MYC: Η οικογένεια γονιδίων MYC κωδικοποιεί πυρηνικές φωσφοπρωτείνες που ελέγχουν την κυτταρική αύξηση και απόπτωση. Τα γονίδια MYC είναι ενισχυμένα σε 15 30 % των περιπτώσεων του ΜΚΠ και λιγότερο στον ΜΜΚΠ. Ανωμαλίες στα ογκοκατασταλτικά γονίδια Το γονίδιο p53: Το μονοπάτι p53 είναι περίπλοκο και συμπεριλαμβάνει πολλά γονίδια (Σχήμα 1) Το γονίδιο p53 είναι ο ''κυτταρικός φύλακας'', εμποδίζει τη γενετική αστάθεια και τις γενετικές ανωμαλίες. Λειτουργεί ως δέκτης πολλαπλών στρεσσογόνων σημάτων συμπεριλαμβανομένων της καταστροφής του DNA, της ενεργοποίησης των ογκογονιδίων και της υποξίας. Αυτός ο μεταγραφικός παράγοντας έχει γονίδια στόχους, τα οποία εμπλέκονται στην αναστολή του κυτταρικού κύκλου (G1, G2 φάση), στην επιδιόρθωση του DNA και στην απόπτωση. Το γονίδιο p53 είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο στον καρκίνο του πνεύμονα. Η μετάλλαξη του p53 συνδέεται άμεσα με την έκθεση σε καρκινογόνα και ιδιαίτερα στον καπνό του τσιγάρου. Άλλα ογκοκατασταλτικά γονίδια που παίζουν ρόλο είναι τα: p16ink4/cyclind1/rb και Serine/Theonine kinase 11. 11

Σχήμα 1 Το μονοπάτι p53 και τα γονίδια που συμπεριλαμβάνει. Επιγενετικές αλλαγές στον καρκίνο του πνεύμονα Ο όρος επιγενετικές μετατροπές αναφέρεται σε έναν αριθμό μοριακών μηχανισμών οι οποίοι ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων, χωρίς να αλλάζουν την αλληλουχία του DNA και είναι οι εξής: 1) Μεθυλίωση του DNA: Ο πιο γνωστός επιγενετικός δείκτης είναι η μεθυλίωση του DNA. Η μεθυλίωση είναι μία φυσιολογική λειτουργία και είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Τρεις μορφές ανώμαλης μεθυλίωσης μπορεί να παίζουν ρόλο στην παθογένεση των όγκων. Αυτές οι μορφές μπορεί να είναι: α) η υπερμεθυλίωση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, β) η υπομεθυλίωση και γ) το πιο πρόσφατο εύρημα είναι ότι η μεθυλίωση μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση κάποιων micrornas (mirnas). Στον καρκίνο του πνεύμονα, πολλά γονίδια βρέθηκαν να μην εκφράζονται λόγω μεθυλίωσης του εκκινητή. Η μεθυλίωση ξεκινάει νωρίς, κατά τη διάρκεια της παθογένεσης του καρκίνου του πνεύμονα και η ανίχνευσή της στα πτύελα καπνιστών με δυσπλασία μπορεί να είναι δείκτης μεγάλου κινδύνου. Επίσης ανίχνευση μεθυλίωσης του DNA μπορεί να προβλέψει πρώιμη υποτροπή στο στάδιο 1 του ΜΜΚΠ. Η αποκατάσταση της έκφρασης των επιγενετικά 12

αποσιωπημένων γονιδίων είναι ένας νέος στόχος για την θεραπευτική προσέγγιση. 2) mirna: Το mirna είναι μία ομάδα μικρών (περίπου 22 νουκλεοτιδίων) μη πρωτεϊνικών κωδικοποιημένων μορίων τα οποία ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων ρυθμίζοντας την ενεργότητα των ειδικών στόχων του mirna μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ των βάσεων. Πολλά mirnas έχουν ειδική έκφραση ανάλογα με τον ιστό. Η έκφραση του mirna είναι πολύ συχνά δυσλειτουργική σε πληθώρα καρκίνων συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του πνεύμονα. Τα mirnas μπορούν να παίζουν ρόλο βιοδείκτη γιατί απελευθερώνονται στην κυκλοφορία του αίματος από τα καρκινικά κύτταρα. Περίπου 500 είδη ανθρώπινου mirna έχουν ήδη ταυτοποιηθεί. Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι τα mirnas μπορούν να λειτουργούν παράλληλα ως ογκογονίδια και ως ογκοκατασταλτικά γονίδια. 3) Μιτοχονδριακές μεταλλάξεις: Μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό DNA έχουν παρατηρηθεί σε πρωτογενείς όγκους. Το μιτοχονδριακό DNA παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και στην εξέλιξη της νόσου. Οι μεταλλάξεις στο μιτοχονδριακό DNA λαμβάνουν χώρα νωρίς κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και ίσως να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες. Ο καρκίνος του πνεύμονα σε μη καπνίζοντες: Μία διαφορετική ασθένεια Ενώ το κάπνισμα είναι η πιο σημαντική περιβαλλοντολογική και επακόλουθη του τρόπου ζωής αιτία για τους περισσότερους καρκίνους του πνεύμονα, περίπου το 25% των περιπτώσεων του καρκίνου του πνεύμονα παγκοσμίως δεν οφείλεται στο κάπνισμα. Ο καρκίνος του πνεύμονα σε μη καπνίζοντες κατατάσσεται στην έβδομη θέση για τον θάνατο από καρκίνο παγκοσμίως. Ο καρκίνος του πνεύμονα σε μη καπνίζοντες είναι πιο συχνός σε γυναίκες και ιδιαίτερα στις ασιατικές χώρες. Η πρώτη σκέψη ήταν ότι μπορεί να οφείλεται στην εισπνοή καπνού από περιβάλλον με καπνιστές, αλλά αποδεικνύεται ότι αυτό το είδος καπνού έχει μικρή καρκινογόνο δράση. Η αιτία του καρκίνου του πνεύμονα σε μη καπνίζοντες είναι αμφιλεγόμενη και δεν έχει υπάρξει ακόμα κάποιο τελικό συμπέρασμα. Μελέτες 13

μοριακής επιδημιολογίας και ιδιαίτερα για τα γονίδια TP53, KRAS και EGFR δείχνουν πολύ διαφορετικά μοντέλα μεταλλάξεων μεταξύ καπνιστών και μη καπνιζόντων. Επίσης ασθενείς μη καπνίζοντες αντιδρούν πολύ διαφορετικά από τους καπνιστές στις στοχευμένες θεραπείες. Όλα αυτά αποδεικνύουν ότι ο καρκίνος του πνεύμονα σε μη καπνίζοντες είναι μια διαφορετική ασθένεια από τον καρκίνο του πνεύμονα των καπνιστών. Συμπτωματολογία: Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα εμφανίζουν συμπτώματα όταν έχουν πια διαγνωσθεί. Ωστόσο, δεν υπάρχουν κάποια πρώιμα εξειδικευμένα συμπτώματα. Τα συμπτώματα μπορεί να οφείλονται στην ενδοβρογχιακή αύξηση ή την ενδοθωρακική διάταση λόγω της αύξησης του μεγέθους του όγκου. Επίσης σημάδια κακουχίας στον οργανισμό είναι από τα πιο συχνά συμπτώματα που εμφανίζονται. Διάγνωση: Κατά τη διαδικασία της διάγνωσης του καρκίνου του πνεύμονα είναι πολύ σημαντικό να συμπεριλαμβάνεται ιστολογική επιβεβαίωση της διάγνωσης, το επίπεδο του όγκου (δηλαδή πόσο έχει επεκταθεί) και μια ανάλυση της γενικής λειτουργικής κατάστασης του ασθενούς. Η προοπτική της διάγνωσης πάντα εξαρτάται από την ολική εικόνα του ασθενούς για την καλύτερη πρόγνωση της εξέλιξης της ασθένειας που μπορεί να επιτευχθεί. Για την επιλογή της θεραπείας είναι πολύ σημαντικό να διακριθεί ο τύπος του καρκίνου: ΜΚΠ με ΜΜΚΠ. Επίσης, είναι πολύ σημαντικό να διακριθεί σε ποιον υπότυπο ΜΜΚΠ ανήκει ο όγκος για το καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Όλα τα παραπάνω διασαφηνίζονται με ιστολογική εξέταση. Θεραπεία: Η χειρουργική αφαίρεση και η ακτινοθεραπεία ανήκουν στις τοπικές μορφές θεραπείας. Για τη συστημική θεραπεία, χρησιμοποιείται η συμβατική χημειοθεραπεία και οι στοχευμένες θεραπείες όπου αυτό είναι εφικτό και επιτρέπεται. Συνήθως η αντιμετώπιση του καρκίνου του πνεύμονα γίνεται και με τις τρεις παραπάνω μορφές. Η χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία μπορούν να γίνουν ταυτόχρονα ή να ακολουθούν μία χειρουργική αφαίρεση όγκου. 14

Αντιμετώπιση ΜΜΚΠ Στάδιο 1 και 2: Είναι το 25% - 30% των περιπτώσεων με ΜΜΚΠ όταν η διάγνωση γίνεται σε αρχικό στάδιο. Η χειρουργική αφαίρεση του όγκου είναι η πρώτη επιλογή όπου αυτό είναι επιτρεπτό και ακολουθείται από χημειοθεραπεία. Η ακτινοθεραπεία δε συστήνεται, παρά μόνο σε όγκους που δεν μπορούν να αφαιρεθούν χειρουργικά. Στάδιο 3Α: Είναι το 15% - 20% των περιπτώσεων με ΜΜΚΠ. Συνήθως αφαιρούνται χειρουργικά και ακολουθεί χημειοθεραπεία. Στάδιο 3Β: Είναι το 10%-15% των περιπτώσεων με ΜΜΚΠ. Αυτό το στάδιο του καρκίνου αντιμετωπίζεται με ακτινοχημειοθεραπεία. Στάδιο 4: Στις περισσότερες περιπτώσεις σε αυτό το στάδιο του ΜΜΚΠ χορηγείται μόνο παρηγορητική αγωγή. Δεύτερη γραμμή αντιμετώπισης του ΜΜΚΠ Παρά τη μεγάλη εξέλιξη που υπάρχει στην αντιμετώπιση του ΜΜΚΠ, το μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών με προχωρημένο ΜΜΚΠ παρουσιάζει εξέλιξη του όγκου μέσα σε 3-6 μήνες μετά την έναρξη της χημειοθεραπείας και περίπου το 40% παρουσιάζει εξέλιξη του όγκου κατά τη διάρκεια της αγωγής πρώτης γραμμής. Είναι αξιοσημείωτο ότι το 30-40% των ασθενών με εξέλιξη της νόσου μετά τη χορήγηση της δεύτερης γραμμής αγωγής, έχουν μια ικανοποιητική εξέλιξη της νόσου. Οι φαρμακευτικοί παράγοντες της δεύτερης γραμμής αντιμετώπισης του ΜΜΚΠ είναι οι παρακάτω: Συμβατικοί χημειοθεραπευτικοί παράγοντες: 1) Δοσεταξέλη (Taxotere), 2) Ανάλογα του φυλλικού οξέος, όπως η πεμετρεξίδη (pemetrexed, Alimta) και η πραλατρεξάτη (pralatrexate, Folotyn) που αναστέλλουν τα ένζυμα που εξαρτώνται από το φυλλικό οξύ, όπως η θυμιδιλική συνθετάση (TS) και η δευδροφυλική ρεδουκτάση (DHFR). Στοχευμένοι παράγοντες: Αναστολείς κινάσης τυροσίνης (TKIs), όπως η γκεφιτινίμπη (Iressa) που είναι ένας αντιστρεπτός αναστολέας του HER1/EGFR υποδοχέα και η ερλοτινίμπη (Tarceva) που ομοίως είναι αναστολέας του EGFR. 15

Στοχευμένοι παράγοντες στη θεραπεία δεύτερης και τρίτης γραμμής: 1) Μπεβασιζουμάμπη (Bevacizumab, Avastin) που είναι ένα ανασυνδιασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF, 2) Σετουξιμάμπη (Cetuximab, Erbitux) που είναι ένα ανσυνδιασμένο χιμαιρικό μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του EGFR, 3) Σοραφενίμπη (Sorafenib, Nexavar) που στοχεύει τους VEGFR2, VEGFR3 και τα craf και braf, 4) Σουνιτινίμπη (Sunitinib, Sutent) που είναι αναστολέας πολλών κινασών όπως των PDGFRa και b, VEGFR κ.α., 5) Βαντετανίμπη (Vandetanib, Caprelsa) αναστέλλει ταυτόχρονα τη δράση του EGFR και του VEGFR2, 6) Λαπατινίμπη (Lapatinib, Tykerb/Tyverb) που είναι αντιστρεπτός αναστολέας κινάσης τυροσίνης και αναστέλλει ταυτόχρονα τους υποδοχείς ErbB1 και ErbB2. Αντιμετώπιση ΜΚΠ Στάδιο 1-3: Σε αυτό το στάδιο χορηγείται χημειοθεραπεία που βασίζεται κυρίως σε πλατίνες και ακτινοθεραπεία. Στάδιο 4: Σε αυτό το στάδιο ακολουθείται μόνο παρηγορητική αγωγή. Πρόγνωση: Πενταετής επιβίωση στον καρκίνο του πνεύμονα παρατηρείται στο 15% των περιπτώσεων. Τα έτη επιβίωσης εξαρτώνται από το στάδιο και το είδος του καρκίνου. Ο παρακάτω πίνακας δείχνει την πρόγνωση για τα διάφορα στάδια του ΜΜΚΠ. Για τον ΜΚΠ, η πρόγνωση μπορεί να είναι από εβδομάδες έως μήνες χωρίς αγωγή και με αγωγή, μπορεί το προσδόκιμο επιβίωσης να φτάσει στους 16 με 22 μήνες στη λιγότερο επιθετική μορφή και τους 10 μήνες για την επιθετική μορφή του καρκίνου. Το γεγονός ότι η διάγνωση του καρκίνου του πνεύμονα γίνεται σε προχωρημένα στάδια, καθώς επίσης και το ότι πολλοί ασθενείς εμφανίζουν αντίσταση στη χημειοθεραπεία, καταδεικνύει την ανάγκη για ανεύρεση νέων θεραπειών. Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η πλήρης κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα. 16

Πίνακας 1: Πρόγνωση για τον ΜΜΚΠ Κλινικό στάδιο Παθολογικό στάδιο 5 έτη επιβίωσης Μέσος όρος χρόνου επιβίωσης (σε μήνες) 5 έτη επιβίωσης Μέσος όρος χρόνου επιβίωσης (σε μήνες) 1Α 50% 60 73% 119 1Β 40% 37 54% 70 2Α 24% 38 48% 54 2Β 25% 18 38% 33 3Α 18% 14 25% 23 3Β 8% 10 19% 16 4 2% 6 21% 18 Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του EGFR Ο EGFR ανήκει στην οικογένεια υποδοχέων με δράση κινάσης τυροσίνης (receptor tyrosine kinases RTKs) που είναι γνωστή ως οικογένεια HER ή ErbB και αποτελείται από τέσσερις γνωστούς ως τώρα υποδοχείς: α) EGFR ή HER1/ErbB1, β) HER2/ErbB2, γ) HER3/ErbB3, δ) HER4/ErbB4. Το σηματοδοτικό μονοπάτι που ρυθμίζεται από αυτή την οικογένεια υποδοχέων κινάσης τυροσίνης είναι πολύπλοκο και πολύπλευρο. Μια παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση του μονοπατιού οδηγεί σε δράσεις που διεγείρουν διεργασίες που οδηγούν σε καρκίνο, όπως η αναστολή της απόπτωσης, ανεξέλεγκτη κυτταρική ανάπτυξη, απευαισθητοποίηση σε σήματα για την αναστολή της ανάπτυξης, αγγειογένεση, διήθηση ιστών και μετάσταση (Σχήμα 2Α και Σχήμα 2Β). Ο EGFR υπερεκφράζεται σε πολλούς επιθηλιακούς καρκίνους όπως ο ΜΜΚΠ, ενώ ο ΜΚΠ είναι ένας από τους ελάχιστους συμπαγείς υπερεκφράζεται ο EGFR. 17 όγκους στον οποίο δεν

Α Β Σχήμα 2: Α) Το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR και Β) Η ενεργοποίηση του και οι επιδράσεις αυτής στο κύτταρο, που σχετίζονται με καρκινογένεση. Η ρύθμιση του μονοπατιού του EGFR είναι πολύπλοκη και όπως τα άλλα μέλη της οικογένειας HER, ο EGFR είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας και οι προσδέτες του προσδένονται στο εξωκυττάριο τμήμα. Ο EGFR αποτελείται από τρία τμήματα: το εξωκυττάριο τμήμα το οποίο αποτελείται από περίπου 620 αμινοξέα, ένα μικρό υδρόφοβο διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δράση τυροσινικής κινάσης (ΤΚ) (Σχήμα 3). 18

Σχήμα 3 Η δομή του EGFR: ΝΗ2-τελικό άκρο (μπλε), HOOC-τελικό άκρο (κόκκινο) σε σύμπλοκο με τον EGF (ροζ). Όταν κατάλληλος προσδέτης (EGF, TGF, amphiregulin, heparin-binding EGF κ.α.) δεσμευτεί στον υποδοχέα EGFR, ακολουθεί ομο/ετεροδιμερισμός του και ενεργοποίηση του κυτταροπλασματικού τμήματος ΤΚ με αποτέλεσμα την έναρξη ενός καταρράκτη αντιδράσεων. Η πρόσδεση του προσδέτη στον υποδοχέα επιφέρει διαμορφωτικές αλλαγές, οι οποίες επιτρέπουν τον σχηματισμό των διμερών του υποδοχέα. Η ενεργοποίηση του τμήματος της κινάσης του υποδοχέα οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση και την ενεργοποίηση πρόσληψης πρωτεϊνών για την διαμεσολάβηση της σηματοδότησης. Η ενεργοποίηση του EGFR διεγείρει τη μεταγωγή ενδοκυττάριων σημάτων, τα οποία ελέγχουν λειτουργίες όπως ο πολλαπλασιασμός, ο κυτταρικός θάνατος και η διαφοροποίηση (Σχήμα 4). Πιο αναλυτικά, ο EGFR ενεργοποιεί σημαντικά ενδοκυττάρια σηματοδοτικά μονοπάτια όπως: την Ras-Raf κινάση (ΜΕΚ), την ΜΑΡΚ κινάση, την Akt-RT3k κινάση και την mtor πρωτεΐνη. Το Ras-Raf-MEK-MAPK μονοπάτι ρυθμίζει πολλές κυτταρικές διεργασίες όπως η μεταγραφή, η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε G2/S φάση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός. Το PI3K μονοπάτι ρυθμίζει τους αντι αποπτωτικούς μηχανισμούς. Άλλα μονοπάτια που μπορεί να ενεργοποιήσει ο EGFR μπορεί να είναι η κινάση της φωσφολιπάσης C (PKC) και το μονοπάτι των STAT πρωτεϊνών. Όπως είναι κατανοητό από τα παραπάνω, οι κυτταρικές διεργασίες που επηρεάζονται από τον EGFR είναι πολλές και πολύπλοκες και η επίδραση του EGFR σε μοριακό επίπεδο δεν έχει ακόμα πλήρως διαλευκανθεί. 19

Σχήμα 4: Η ενεργοποίηση του EGFR πυροδοτεί την περαιτέρω ενεργοποίηση τεσσάρων διαφορετικών μονοπατιών επηρεάζοντας διάφορες λειτουργίες των κυττάρων. Ο EGFR υπερεκφράζεται σε αρκετούς τύπους καρκίνου, όπως στα γλοιοβλαστώματα, στο ΜΜΚΠ, στους καρκίνους παχέος εντέρου, μαστού, προστάτη και ωοθηκών. Μπορεί να προάγει την ανάπτυξη των όγκων επάγοντας τη μεταστατική ικανότητα των κυττάρων, την προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό. Καρκίνος του πνεύμονα και EGFR Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του EGFR είναι πολύ σημαντικό για την ανάπτυξη και εξέλιξη του ΜΜΚΠ. Περίπου στο 50-80% των περιπτώσεων του ΜΜΚΠ έχει βρεθεί ότι είτε υπερεκφράζεται ο EGFR ή/και έχει αυξημένη 20

ενεργότητα. Λόγω της πληθώρας των κυτταρικών διεργασιών που ρυθμίζονται από το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR η απορρύθμιση του μονοπατιού αυτού σχετίζεται με την καρκινογένεση. Παρεκκλίνουσα ενεργοποίηση του μονοπατιού του EGFR μπορεί να οφείλεται σε τουλάχιστον τρεις μηχανισμούς : Αυξημένα πρωτεϊνικά επίπεδα του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων με ή χωρίς αντίστοιχη αύξηση στα επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου, Μεταλλάξεις του EGFR που έχουν ως αποτέλεσμα τη συνεχή ενεργοποίηση του χωρίς την παρουσία κατάλληλου προσδέτη Αυξημένα επίπεδα κατάλληλων προσδετών όπως EGF ή TGF-α. Πολλές στρατηγικές για αναστολή του EGFR έχουν αναπτυχθεί για την αντιμετώπιση του καρκίνου συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του πνεύμονα. Ο EGFR πολύ συχνά υπερεκφράζεται στον ΜΜΚΠ και αυτή η υπερέκφραση σχετίζεται με κακή πρόγνωση της εξέλιξης της ασθένειας. Έχουν αρχίσει οι μελέτες για την χρήση αναστολέων του EGFR όπως μονοκλωνικά αντισώματα (σετουξιμάμπη) και μικρά μόρια (ερλοτινίμπη, γκεφιτινίμπη) και βρίσκονται σε κλινική φάση για την αντιμετώπιση του ΜΜΚΠ. Τα μονοκλωνικά αντισώματα προσδένονται στο εξωκυττάριο τμήμα του EGFR και εμποδίζουν την ενεργοποίηση του υποδοχέα ενώ τα μικρά μόρια ανταγωνίζονται αντιστρεπτά το ΑΤΡ στην πρόσδεση με το καταλυτικό τμήμα του υποδοχέα και αναστέλλουν την ενεργοποίηση του. Τα πρώτα δεδομένα από τις κλινικές μελέτες έδειξαν ότι περίπου 10% των ασθενών με ΜΜΚΠ ανταποκρίνονται στην γκεφιτινίμπη η στην ερλοτινίμπη. Η σημασία των μεταλλάξεων του EGFR στο ΜΜΚΠ Οι αναστολείς κινάσης τυροσίνης (TKIs) που στοχεύουν στον EGFR συμπεριλαμβάνουν τη γκεφιτινίμπη και την ερλοτινίμπη, που συναγωνίζονται το ΑΤΡ για τη θέση πρόσδεσης στον υποδοχέα. Οι δυο TKIs έχουν μελετηθεί εκτεταμένα όσον αφορά στην εφαρμογή τους στην αντιμετώπιση του ΜΜΚΠ. Παρά το θεραπευτικό όφελος των TKIs, η αποτελεσματικότητα τους είναι συχνά περιορισμένη λόγω της αντοχής που αναπτύσσεται εναντίον των TKIs και οφείλεται στις δευτερογενείς μεταλλάξεις 21 του EGFR. Η παρουσία των

μεταλλάξεων του EGFR ενεργοποιεί τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης, διαταράσσοντας τις ''αυτο-ανασταλτικές'' αλληλεπιδράσεις και επάγοντας τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα. Επιπλέον, κύτταρα ΜΜΚΠ με μετάλλαξη EGFR ενεργοποιούν ιδιοσυστατικά τον υποδοχέα του EGFR, με διμερισμό ανεξάρτητο από την παρουσία προσδέτη. Οι μεταλλάξεις του EGFR επιτρέπουν στη γκεφιτινίμπη να προσδένεται με μεγαλύτερη συγγένεια στον υποδοχέα σε σχέση με την αγρίου τύπου (wild type, wt) μορφή του EGFR. Παρακάτω, αναπτύσσονται λίγο πιο αναλυτικά δύο μεταλλάξεις που επηρεάζουν τον EGFR: α) Η δευτερογενής μετάλλαξη του γονιδίου του EGFR Τ790Μ ως μηχανισμός αντίστασης για τους αναστολείς κινάσης τυροσίνης: Μολονότι οι ασθενείς με μετάλλαξη του EGFR δείχνουν αρχικά μια δραματική ανταπόκριση στους αναστολείς κινάσης τυροσίνης, όπως η γκεφιτινίμπη ή η ερλοτινίμπη, σχεδόν όλοι αποκτούν αντίσταση σε αυτά τα φάρμακα μέσα σε ένα χρόνο. Ένα δευτερογενές σημείο μετάλλαξης στο εξώνιο 20 του γονιδίου του EGFR, στο οποίο υποκαθίστανται μια μεθειονίνη με μια θρεονίνη στη θέση 790 (Τ790Μ), αναγνωρίσθηκε στους ασθενείς με ΜΜΚΠ που εμφάνισαν αντοχή στην ερλοτινίμπη ή στη γκεφιτινίμπη. Αυτό το αποτέλεσμα καταδεικνύει ότι η μετάλλαξη του EGFR σχετίζεται όχι μόνο με την ευαισθησία, αλλά και με την αντοχή για τους αναστολείς κινάσης τυροσίνης Η μετάλλαξη Τ790Μ ανιχνεύθηκε επίσης σε ασθενείς με ΜΜΚΠ, οι οποίοι δεν ανταποκρίθηκαν από την αρχή στην αγωγή με γκεφιτινίμπη. Επί πρόσθετα οι ασθενείς με ΜΜΚΠ με χαμηλά επίπεδα Τ790Μ πριν την αγωγή με αναστολείς κινάσης τυροσίνης είχαν μικρότερο PFS (progression free survival) σε σχέση με αυτούς που είχαν μηδενικά επίπεδα Τ790Μ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ίσως ότι το ποσοστό μετάλλαξης Τ790Μ μπορεί να λειτουργήσει και ως βιοδείκτης για την αναγνώριση ασθενών που δε θα έχουν καλή ανταπόκριση στην αγωγή με αναστολείς κινάσης τυροσίνης. Η μετάλλαξη Τ790Μ εντοπίζεται στο σημείο που δεσμεύεται το ΑΤΡ στη δομή του EGFR και πιστεύεται ότι αυτό εμποδίζει τη δέσμευση των αναστολέων κινάσης τυροσίνης στον EGFR λόγω της μεταβολής της τοπολογίας. Η παρουσία της μετάλλαξης Τ790Μ παρέχει πλεονέκτημα αύξησης στα κύτταρα in vitro και in vivo, υποδηλώνοντας ότι η μετάλλαξη Τ790Μ από μόνη της έχει ογκογονική δράση. Τελευταίες μελέτες δείχνουν ότι η συγγένεια πρόσδεσης ΑΤΡ και υποδοχέα είναι αυξημένη στην περίπτωση της μετάλλαξης Τ790Μ κι αυτό ίσως εξηγεί γιατί οι μη 22

αντιστρεπτοί αναστολείς κινάσης τυροσίνης θεωρούνται πιθανή λύση για να ξεπεραστεί το πρόβλημα της αντοχής. Κάποιοι ερευνητές επισήμαναν την πιθανότητα ότι η αγωγή με μη αντιστρεπτούς αναστολείς κινάσης τυροσίνης σε κύτταρα με μετάλλαξη Τ790Μ μπορεί να επάγει αντίσταση στους ίδιους τους αναστολείς. Αυτό ίσως να μπορεί να ξεπεραστεί όταν χορηγηθούν σε συνδυασμό με άλλους παράγοντες, όπως μονοκλωνικά αντισώματα (σετουξιμάμπη και μπεβασιζουμάμπη), αναστολείς του mtor, αναστολείς του EGFR και του VEGFR, όπως η βαντετανίμπη. β) Ενίσχυση του γονιδίου ΜΕΤ - ένας άλλος μηχανισμός αντίστασης για τους αναστολείς κινάσης τυροσίνης: Η ενίσχυση του γονιδίου ΜΕΤ έχει πρόσφατα αναγνωρισθεί ως ένας μηχανισμός αντίστασης στη γκεφιτινίμπη. Έχει ανιχνευθεί στο 22% δειγμάτων από ασθενείς με ΜΜΚΠ με μεταλλάξεις στον EGFR που εμφάνισαν αντίσταση στη γκεφιτινίμπη. Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης ΜΕΤ (με φωσφορυλίωση) σχετίζεται με την κακή εξέλιξη της ασθένειας και με μικρότερο προσδόκιμο επιβίωσης σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που τους έχει χορηγηθεί γκεφιτινίμπη ή ερλοτινίμπη. Το σηματοδοτικό μονοπάτι της πρωτεΐνης ΜΕΤ μαζί με αυτό του EGFR ενεργοποιούν την ΡΙ3Κ μέσω του HER3, στα κύτταρα με αντίσταση στην γκεφιτινίμπη με ενίσχυση του γονιδίου ΜΕΤ. Σε αυτήν την περίπτωση, ο συνδυασμός γκεφιτινίμπης και ενός αναστολέα της πρωτεΐνης ΜΕΤ μπορεί να επάγει την απόπτωση αυτών των κυττάρων. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η ενίσχυση της πρωτεΐνης ΜΕΤ ή η ενεργοποίηση της χωρίς ενίσχυση του γονιδίου της μπορεί να συνυπάρξει με τη μετάλλαξη Τ790Μ και η ταυτόχρονη αναστολή των σηματοδοτικών μονοπατιών του EFGr και της πρωτεΐνης ΜΕΤ ίσως να είναι μια πιθανή λύση. Μονοκλωνικά αντισώματα και EGFR στο ΜΜΚΠ Τα μονοκλωνικά αντισώματα (mabs) θεωρούνται μια άλλη αντιμετώπιση του ΜΜΚΠ στοχεύοντας τον EGFR, δεσμευόμενα στο εξωκυττάριο τμήμα του υποδοχέα. Υπάρχουν αρκετά mabs εναντίον του EGFR που έχουν μελετηθεί σε βασικές και κλινικές έρευνες όπως τα: σετουξιμάμπη, ματουζουμάμπη, νιμοτουζουμάμπη και πανιτουμουμάμπη. Δομικές μελέτες εξηγούν πως αυτά τα mabs αναστέλλουν το σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR. Η νιμοτουζουμάμπη 23

εμποδίζει άμεσα τον προσδέτη να προσδεθεί στην περιοχή 3 του υποδοχέα ενώ η ματουζουμάμπη εμποδίζει τις διαμορφωτικές αλλαγές του EGFR που απαιτούνται για τον διμερισμό του υποδοχέα. Η σετουξιμάμπη κάνει και τα δύο παραπάνω. Παρατηρείται όμως αντίσταση στις θεραπείες με μονοκλωνικά αντισώματα που μπορεί να είναι είτε εγγενής είτε επίκτητη. Η αντίσταση που παρατηρείται είναι λιγότερο κατανοητή σε σχέση με την αντίσταση που παρατηρείται στους TKIs και αυτό καταδεικνύει ένα σημαντικό εμπόδιο για την περαιτέρω χρήση αυτών των παραγόντων στην κλινική πράξη. Μερικοί από τους προτεινόμενους μηχανισμούς αντίστασης στα mabs εναντίον του EGFR είναι οι εξής: α) Υπερέκφραση του προσδέτη του EGFR, TGFa, β) Υπερέκφραση του ίδιου του EGFR, γ) Αλλαγές στην ουβικιτινιλίωση του EGFR, δ) Αυξημένη ενεργότητα των Src κινασών (SFKs) οι οποίες σχετίζονται με την διαμόρφωση του EGFR, ε) Μετατόπιση του EGFR στον πυρήνα, στ) Αυξημένη παραγωγή του VEGF, ζ) Μεταλλαγμένη, ιδιοσυστατική, ενεργή μορφή του EGFR (Σχήμα 5). Σχήμα 5: Προτεινόμενοι μηχανισμοί αντίστασης εναντίον των mabs του EGFR. Φάρμακα του μέλλοντος στοχεύοντας πολλαπλά σημεία στο μονοπάτι του EGFR 24

Πολλές στρατηγικές για αναστολή του μονοπατιού του EGFR υπάρχουν εκτός από την άμεση αναστολή του υποδοχέα και είναι οι παρακάτω: α) Μη αντιστρεπτοί ''επόμενης γενιάς'' αναστολείς κινάσης τυροσίνης για τον EGFR. Έχει προταθεί ότι ταυτόχρονη αναστολή του EGFR/HER2 μπορεί να διακόψει τη συνεργασία μεταξύ των μονοπατιών των δύο οικογενειών, το οποίο μπορεί να οδηγήσει σε βελτιωμένη αποτελεσματικότητα. Αυτό έχει αποδειχθεί σε προκλινικές μελέτες με παράλληλο αποκλεισμό του EGFR και του HER2 σε καρκινικά κύτταρα. Πρώιμα κλινικά δεδομένα δείχνουν επίσης ότι η αναστολή παραπάνω του ενός μελών της οικογένειας EGFR που στοχεύουν τον ίδιο υποδοχέα, οδηγούν σε προηγμένη αντικαρκινική δράση. Πολλοί παράγοντες οι οποίοι στοχεύουν πολλαπλά μέλη της οικογένειας EGFR είναι σε διάφορες φάσεις ανάπτυξης, ο BIBW 2992 είναι αυτή τη στιγμή η πιο προηγμένη ένωση αυτής της τάξης. Ο BIBW 2992 είναι ένας μικρού μοριακού βάρους μη αντιστρεπτός αναστολέας των EGFR/HER1 και HER2. Σε μια συνεχιζόμενη μελέτη φάσης 2 σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που εμφανίζουν μεταλλάξεις του EGFR ο BIBW 2992 εμφανίζει μία πρώιμη δράση στους ασθενείς όπου η ασθένεια εξελίχθηκε και μετά την θεραπεία πρώτης γραμμής και στους ασθενείς που επανεμφανίσθηκε η ασθένεια μετά από ανοσοενισχυτική χημειοθεραπεία. Τα πρώτα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη έδειξαν ποσοστό ελέγχου της νόσου κατά 97% σε 38 ασθενείς πρώτης γραμμής που αξιολογήθηκαν. Ανάμεσα στους ασθενείς δεύτερης γραμμής που αξιολογήθηκαν το ποσοστό ελέγχου της νόσου ήταν επίσης 97%. Παρόμοιες με τους άλλους αναστολείς κινάσης τυροσίνης ήταν οι ανεπιθύμητες ενέργειες όπως διάρροια και δερματικά εξανθήματα. Μια άλλη δοκιμή φάσης 3 του BIBW 2992 διεξάγεται σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που εξελίχθηκαν μετά από ένα ή δύο κύκλους χημειοθεραπείας και για τουλάχιστον δώδεκα εβδομάδες έλαβαν θεραπεία με ερλοτινίμπη ή γκεφιτινίμπη. Αυτή η μελέτη είναι σε εξέλιξη και όπως ήταν αναμενόμενο, οι ασθενείς εμφάνισαν διάρροια και δερματικά εξανθήματα. Ένας άλλος μη αντιστρεπτός αναστολέας των EGFR/HER1, HER2 και HER4 είναι ο PF00299804 και έχει δείξει μια πρώιμη αντικαρκινική δράση και ένα προβλέψιμο προφίλ ασφαλείας σε μια συνεχιζόμενη μελέτη φάσης 2 σε ασθενείς με ΜΜΚΠ μετά από αποτυχία χημειοθεραπείας με ερλοτινίμπη. Σε αυτήν τη μελέτη υπάρχουν κάποιες περιπτώσεις ασθενών που σταθεροποίησαν τη νόσο για παραπάνω από 6 μήνες. Εμφανίστηκαν βέβαια και 25

ανεπιθύμητες ενέργειες όπως διάρροια, κόπωση, δερματικά εξανθήματα και έμετος. β) Αναστολείς των EGFR και VEGFR Πολλοί αναστολείς κινάσης τυροσίνης που στοχεύουν ταυτόχρονα το μονοπάτι του EGFR και το μονοπάτι του VEGFR είναι σε ανάπτυξη. Ταυτόχρονη αναστολή πολλαπλών ογκογονικών μονοπατιών (πολλαπλασιασμού, αγγειογένεσης, κλπ) παρέχει κλινικό όφελος και μειώνει τον κίνδυνο αντοχής. Η πιο προχωρημένη από αυτές ένωση είναι η ένωση βαντετανίμπη, ένας αναστολέας του EGFR και του VEGFR. Τρεις μελέτες φάσης τρία αξιολόγησαν την βαντετανίμπη σε συνδυασμό με δοσεταξέλη ή πρεμετεξίδη και μια άλλη σύγκρινε τη βαντετανίμπη με την ερλοτινίμπη σε ασθενείς με προχωρημένο ΜΜΚΠ που εξελίχθηκε μετά από τουλάχιστον μια χημειοθεραπεία. Μια από αυτές τις μελέτες, αυτή του συνδυασμού της πρεμετεξίδης και βαντετανίμπης σε σχέση με την πρεμετεξίδη μόνη της, δεν έφτασε το αρχικό καταληκτικό σημείο, δηλαδή το σημαντικά βελτιωμένο δείκτη PFS (prolonged free survival). Η μελέτη του συνδιασμού βαντετανίμπης και δοσεταξέλης έδειξε βελτιωμένο PFS, αλλά όχι βελτίωση της συνολικής επιβίωσης, συγκρινόμενη με την δοσεταξέλης μόνη της. Η τρίτη μελέτη που σύγκρινε τη βαντετανίμπη με την ερλοτινίμπη δεν έδειξε τα επιθυμητά αποτελέσματα για τον PFS, αλλά έδειξε μια ισοδύναμη αποτελεσματικότητα. Οι ανεπιθύμητες ενέργειες που σχετίζονται με τη βαντετανίμπη είναι διάρροια, δερματικό ερύθημα, ουδετεροπενία και υπέρταση. γ) Αναστολείς στόχων στο σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR Μεσολαβητές του σηματοδοτικού μονοπατιού του EGFR επίσης εκτιμώνται σαν πιθανοί στόχοι για την θεραπεία του ΜΜΚΠ. Μερικοί από αυτούς είναι τα μονοπάτια: Ras-Raf-MEK-MAPK, PI3K-Akt-mTor, φωσφολιπάση C PKC. Ένας αναστολέας του μονοπατιού Ras-Raf-MEK-MAPK είναι σε ανάπτυξη για την θεραπεία του ΜΜΚΠ είναι ο AZD6244 και είναι αναστολέας της ΜΕΚ1/2. Μελέτες φάσης 2 συνεχίζονται για την αξιολόγηση του AZD6244 σε ασθενείς με ΜΜΚΠ με την ειδική μετάλλαξη του γονιδίου B-raf, η οποία ευαισθητοποιεί τα καρκινικά κύτταρα στην αναστολή της ΜΕΚ. Άλλη μελέτη ελέγχει τον AZD6244 σε σχέση με την πρεμετεξίδη σε ασθενέις με ΜΜΚΠ που έχει εξελιχθεί μετά την πρώτη ή και τη δεύτερη γραμμή χημειοθεραπείας. 26

Οι αναστολείς του μονοπατιού PI3K-Akt-mTor αξιολογούνται μόνοι ή και σε συνδυασμό με παράγοντες που έχουν ως στόχο τον EGFR για το ΜΜΚΠ. Ο XL765, ένας αναστολέας της ΡΙ3Κ και του mtor, αξιολογείται σε συνδυασμό με την ερλοτινίμπη σε μια συνεχιζόμενη μελέτη φάσης 2. Πολλοι αναστολείς του mtor (π.χ. η τεμσιρολίμη ή η εβερολίμη) έχουν δείξει δράση στο ΜΜΚΠ. Επίσης, έχουν μελετηθεί και σε συνδυασμό με αναστολείς κινάσης τυροσίνης του EGFR σε κλινικές μελέτες φάσης 2 για το ΜΜΚΠ. Μέσω της αναστολής της PKC, η ενζασταυρίνη (αναστολέας κινάσης τυροσίνης) καταργεί το μονοπάτι της φωσφολιπάσης C PKC. Σε κλινική μελέτη φάσης 2 για την ενζασταυρίνη σε ασθενείς με προχωρημένο ΜΜΚΠ, 35% των ασθενών παρουσίασαν μια σταθεροποίηση της ασθένειας. Πολλές μελέτες φάσης 2 της ενζασταυρίνης σε συνδυασμό με κυτταροτοξικούς παράγοντες για τη θεραπεία του ΜΜΚΠ συνεχίζονται. Ο ISIS 352, ένας αντινοηματικός παράγοντας που στοχεύει την PKC, είναι σε κλινική μελέτη φάσης δύο και τρία για το ΜΜΚΠ σε συνδυασμό με κυτταροτοξικούς παράγοντες Συνοψίζοντας, στοχεύοντας το μονοπάτι του EGFR εμφανίζεται κλινικό όφελος για μια επιλεγμένη ομάδα ανθρώπων με ΜΜΚΠ. Όμως, το πλήθος των πραγματικών πιθανών στόχων για μια εξατομικευμένη θεραπεία προσφέρει την προοπτική ότι οι περισσότεροι, αν όχι όλοι οι ασθενείς, τελικά θα επωφεληθούν από μια προσεκτικά επιλεγμένη θεραπεία που στοχεύει το μονοπάτι του EGFR ή κάποιο άλλο σημαντικό μονοπάτι. Εάν μια τέτοια θεραπεία στοχεύει ένα μοναδικό μονοπάτι ή γονίδιο ή ένα συνδυασμό μονοπατιών ή γονιδίων απομένει να καθοριστεί. Μια τέτοια εξατομικευμένη προσέγγιση απαιτεί λήψη και έλεγχο του καρκινικού ιστού λίγο πριν την επιλογή της θεραπείας. Η ετερογένεια των όγκων, η αστάθεια του γονιδιώματος και η ανάπτυξη αντοχής κάνει υποχρεωτική τη λήψη του ιστού λίγο πριν την επιλογή της φαρμακευτικής αγωγής της εξατομικευμένης θεραπείας. Για παράδειγμα, μια διάγνωση αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα συνδυασμένο με ένα ή παραπάνω χαρακτηριστικά όγκων με EGFR μετάλλαξη (πχ θηλυκού γένους, μη καπνίστρια, εθνικότητα από ανατολική Ασία) θα προκαλέσει τον έλεγχο και για άλλες μεταλλάξεις. Ίσως να είναι αναγκαίο να γίνονται περεταίρω βιοψίες όταν οι ασθενείς υποτροπιάζουν ή ξεκινούν νέες θεραπείες. Σε μια προσπάθεια να ξεπερασθεί ή να προληφθεί η αντοχή στους 27

τρέχοντες παράγοντες που στοχεύουν τον EGFR συνεχιζόμενες μελέτες αξιολογούν νέους παράγοντες όπως τους μη αντιστρεπτούς αναστολείς των EGFR/HER2 και τους αναστολείς των EGFR/VEGFR. Το μονοπάτι μεταγωγής σήματος του Notch Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch είναι ένα πολύ συντηρημένο αναπτυξιακά μονοπάτι το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στο σχηματισμό των ιστών και τη μορφογένεση. Υπάρχουν αρκετές ενδείξεις ότι αυτό το μονοπάτι παίζει ρόλο σε αρκετές κακοήθειες και μπορεί να συμπεριφέρεται ως ογκογονίδο ή ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ανάλογα με το πλαίσιο των κυττάρων. Το μονοπάτι σηματοδότησης του Notch είναι πολύ σημαντικό για κυτταρικές λειτουργίες σε διαφορετικούς ιστούς, όπως το δέρμα και το πάγκρεας, αλλά και σε συστήματα όπως το κεντρικό νευρικό, ο αγγειακό, το αιμοποιητικό και το μυϊκό. Στις περισσότερες περιπτώσεις το Notch αναστέλλει την αρχική διαφοροποίηση του κυττάρου προκαλώντας μια δεύτερη διαφορετική διαφοροποίηση ή διατηρώντας το κύτταρο σε μια μη αδιαφοροποίητη κατάσταση. Το μονοπάτι του Notch θεωρείται ως «ο φύλακας» έναντι της διαφοροποίησης. Η οικογένεια του Notch είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που έχουν διπλή λειτουργία ως μεμβρανικοί υποδοχείς, αλλά και ως μεταγραφικοί παράγοντες. Ο Notch αρχικά πρωτοβρέθηκε ότι είναι υπεύθυνος για το φαινότυπο στα πτερύγια της Drosophila melanogaster. Το γονίδιο κλωνοποιήθηκε το 1985. Στα θηλαστικά, η οικογένεια του Notch έχει 4 υποδοχείς: Notch 1, 2, 3 και 4. Κάθε υποδοχέας συντίθεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο ως μία πρόδρομη πρωτεΐνη (300-350 kda) που περιέχει ένα εξωκυττάριο, ένα διαμεμβρανικό και ένα ενδοκυττάριο τμήμα. Η πρόδρομη μορφή του υποδοχέα διασπάται στην περιοχή S1 με μία πρωτεάση της φουρίνης στο σύμπλεγμα Golgi. Μετά την πρώτη τροποποίηση (S1 cleavage) εμφανίζεται ως ετεροδιμερές στην κυτταρική μεμβράνη, όπου και αλληλεπιδρά με κατάλληλους προσδέτες που εκφράζονται από γειτονικά κύτταρα ή από τα ίδια κύτταρα. Και οι τέσσερις υποδοχείς του Notch δομικά είναι παρόμοιοι, εκτός από κάποιες 28

μικρές διαφορές στο εξωκυττάριο και το κυτταροπλασματικό τους τμήμα. Το εξωκυττάριο τμήμα αποτελείται από επαναλαμβανόμενες περιοχές με δομή ανάλογη του EGF, οι οποίες παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση πρόσδεσης υποδοχέα με προσδέτη. Οι πρωτεΐνες Notch1 και Notch2 έχουν 36 επαναλαμβανόμενες τέτοιες περιοχές, ενώ οι Notch3 και Notch4 έχουν 34 και 29 αντίστοιχα. Η κυτταροπλασματική περιοχή του Notch αποτελείται από το τμήμα RAM (recombination signal binding protein 1 for J kappa:rbp-j association molecule), επαναλαμβανόμενες περιοχές ανκυρίνης (ΑΝΚ), οι οποίες είναι απαραίτητες για την ενεργότητα του Notch, περιοχές με αλληλουχίες πλούσιες σε προλίνη, γλουταμίνη, σερίνη και θρεονίνη (PEST) (Σχήμα 6). Σχήμα 6: Σχηματική απεικόνιση των περιοχών του υποδοχέα του Notch. Μέχρι τώρα έχουν αναγνωριστεί πέντε προσδέτες για τον υποδοχέα Notch: οι Delta 1, 3 και 4 (DLL1, 3 και 4) και οι Jagged 1 και 2 (JAG1 και 2), που είναι επίσης διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Το σηματοδοτικό μονοπάτι ενεργοποιείται όταν 29

δεσμεύεται ο προσδέτης στον υποδοχέα ενός γειτονικού κύτταρου. Μέτα την ενεργοποίηση, οι υποδοχείς υπόκεινται σε μία σειρά από πρωτεολυτικές διασπάσεις (S2 and S3 cleavages) από την μεταλλοπρωτεάση TACE (tumor necrosis factor a converting enzyme) και το σύμπλοκο γ-σεκρετάσης (αποτελούμενο από: presenilin-1/2, nicastrin, Pen2, Aph1). Το ένζυμο TACE κόβει ένα τμήμα του υποδοχέα από το εξωκυττάριο τμήμα του, το οποίο ενδοκυτταρώνεται από το γειτονικό κύτταρο που έχει εκφράσει τον προσδέτη. Το δεύτερο τμήμα που προέρχεται από τη δράση της γ-σεκρετάσης απελευθερώνει το ενδοκυττάριο τμήμα του Notch (Notch intracellular domain, NICD) στο κυτταρόπλασμα το οποίο ακολούθως μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου εκεί ενεργοποιεί την μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Το NICD τμήμα αφού μετατοπιστεί στον πυρήνα προσδένεται στον μεταγραφικό κατασταλτικό παράγοντα CLS και τον ενεργοποιεί (Σχήμα 7). Αυτός τότε μετατρέπεται σε ενεργό μεταγραφικό παράγοντα και επιτρέπει την έναρξη της μεταγραφής των γονιδίων στόχων. Τα κυριότερα γονίδια στόχοι του Notch αποτελούνται από δύο οικογένειες μεταγραφικών παραγόντων: Hes και Herp. Άλλα γονίδια στόχοι του Notch είναι:οι κυκλίνες D1, p21, NFκB, preta, GATA3, NRARP, c-myc, Deltex1. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch μπορεί να παίζει ρόλο σε άλλα μονοπάτια ανεξάρτητα του CSL. Για παράδειγμα μπορεί να προάγει την ωρίμανση των CD4 και CD8 θετικών θυμοκυττάρων. Το τελικό στάδιο του μηχανισμού του Notch ICD μπορεί να περιλαμβάνει μηχανισμό, ο οποίος: i) εξαρτάται από την πρωτεΐνη CSL και εμπλέκει τις πρωτεΐνες Hes/Herp, ii) εξαρτάται από την πρωτεΐνη CSL αλλά δεν εμπλέκει τις πρωτεΐνες Hes/Herp, iii) είναι ανεξάρτητος της πρωτεΐνης CSL. 30

Σχήμα 7: Το πολύπλοκο σύστημα του μονοπατιού σηματοδότησης του Notch. Το Notch ICD είναι δυνατόν να επηρεάζει συγκεκριμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας τους παραπάνω μηχανισμούς. Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι τα επίπεδα του Notch ICD ελέγχουν το μονοπάτι του Notch. Δεδομένου ότι το Notch ελέγχει αρκετά στάδια της διαφοροποίησης των κυττάρων σε διαφορετικούς ιστούς, είναι δυνατόν να εμπλέκεται στη δημιουργία διαφορετικών τύπων όγκων. Πράγματι, υπάρχουν δεδομένα που δείχνουν ότι το μονοπάτι σηματοδότησης του Notch σχετίζεται με καρκίνο του πνεύμονα, ωοθηκών, μαστού καθώς και με λευχαιμίες. Ενζυματική ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch Ένα χαρακτηριστικό του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch είναι η συμμετοχή πολλών ενζυμικών αντιδράσεων για τη ρύθμιση της μεταγωγής σήματος του Notch. Εκτός από τη δράση της γ- σεκρετάσης για την απελευθέρωση της 31

δραστικής μορφής NICD και την ωρίμανση της πρόδρομης πρωτεΐνης του Notch μέσω της πρωτεάσης της φουρίνης, το σηματοδοτικό μονοπάτι ρυθμίζεται απο 4 λιγάσες Ε3 για να επιτευχθεί ουβικιτινίωση και η υποκείμενη πρωτεόλυση. Η ενδοκυττάρωση του Notch απο μία διαφορετική ομάδα λιγασών επάγει την αποδόμηση του Notch. Επιπλέον, οι υποδοχείς του Notch τροποποιούνται μεταμεταφραστικά με γλυκοζυλίωση ή φωσφορυλίωση, κάνοντας πιο περίπλοκη τη ρύθμιση της σηματοδότησης του Notch (Σχήμα 8). Σχήμα 8: Ενζυματική ρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch. 32

Η αλληλεπίδραση του Notch με άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch συνδέεται στενά με το σηματοδοτικό μονοπάτι ras. Η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch είναι πιθανά αποτέλεσμα της ογκογένεσης που διαμεσολαβείται απο το σηματοδοτικό μονοπάτι ras. Σε ινοβλάστες με μετάλλαξη του ras, η αναστολή του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch από αναστολείς γ-σεκρετάσης οδήγησε σε μια αναστολή της αύξησης του όγκου κατά 80%. Στα αντίστοιχα κύτταραμάρτυρες, η αναστολή της γ-σεκρετάσης δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου. Σε παγκρεατικά κύτταρα, η ενεργοποίηση του μονοπατιού του ras από τον παράγοντα TGFα οδηγεί σε ενεργοποίηση του μονοπατιού του Notch και εμφανίζεται ένας προκαρκινικός φαινότυπος. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch φαίνεται να είναι απαραίτητο γι' αυτόν το φαινότυπο. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch αφού έχει ενεργοποιηθεί από το ras μονοπάτι μπορεί αντιστρόφως να πυροδοτήσει το τμήμα ras-raf-mek-mapk που είναι κλάδος του ras μονοπατιού. Σε κυτταροκαλλιέργειες ΜΚΠ (με έλλειψη μεταλλάξεων του ras) όπου η ενεργότητα της MAPK είναι γενικά χαμηλή και σε κυτταροκαλλιέργειες ΜΜΚΠ (που έχουν υψηλή ενεργότητα ΜΑΡΚ και μεταλλάξεις ras) η ενεργοποίηση του Notch1 οδηγεί σε υψηλά επίπεδα perk1 και perk2. Έτσι μπορεί να βγει το συμπέρασμα ότι σε μερικές περιπτώσεις η ενεργοποίηση του Notch μπορεί να έχει συνεργιστική δράση με το ras. Είναι προφανές ότι η αλληλεπίδραση του Notch και του ras σηματοδοτικού μονοπατιού μπορεί να αποτελέσει σημαντικό πεδίο διερεύνησης στο ΜΜΚΠ όπου υπάρχουν μεταλλάξεις του ras, ενισχυμένη δράση του EGFR και ενεργοποιημένη δράση προσδετών του ras σηματοδοτικού μονοπατιού. Άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια με τα οποία αλληλεπιδρά το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch είναι αυτά των: NFκB, Akt, Sonic hedghog, mtor, Wnt, estrogen receptor, androgen receptor, PDGF. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch στον καρκίνο και την αγγειογένεση Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch είναι ένα από τα πιο σημαντικά μονοπάτια στην εμβρυική ανάπτυξη. Δεδομένου ότι η ογκογένεση και η ανάπτυξη των οργάνων μοιράζονται ίδιους μηχανισμούς δεν είναι παράξενο ότι τα μονοπάτια που σχετίζονται με την ανάπτυξη όπως του Notch, Wnt και του Hedgehog 33

παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Πολύ επιθετικά καρκινικά κύτταρα έχουν δείξει ότι έχουν πολλά χαρακτηριστικά των εμβρυϊκών προγονικών κυττάρων και χρησιμοποιούν το μονοπάτι του Notch για την επιβίωση τους. Η δυσλειτουργία του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch σχετίζεται με πολλά είδη καρκίνου. Το μονοπάτι του Notch μπορεί να έχει ογκογονική δράση ή ογκοκατασταλτική ανάλογα με τον ιστό ή την θέση του οργάνου που εκφράζεται (Πίνακας 2). Πίνακας 2: Notch και τα είδη καρκίνου που σχετίζεται Όμως, το πως η ενεργοποίηση του ίδιου του μονοπατιού οδηγεί σε δύο αντίθετες 34

δράσεις σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων παραμένει ακόμα ένα μυστήριο. Μία εξήγηση γι'αυτή την παράδοξη συμπεριφορά είναι ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch ενεργοποιεί / απενεργοποιεί ειδικά γονίδια ανάλογα με το κύτταρο ή τα σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία είναι και αυτά που καθορίζουν την τελική επίδραση του Notch στο κύτταρο. Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ισορροπίας στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στην επιβίωση, στην απόπτωση και στη διαφοροποίηση τα οποία επηρεάζουν την ανάπτυξη και την λειτουργία πολλών οργάνων. Η δυσλειτουργία του μονοπατιού του Notch εμποδίζει την διαφοροποίηση οδηγώντας τα αδιαφοροποίητα κύτταρα σε κακοήθη κύτταρα. Πράγματι υπάρχουν παρατηρήσεις που υποδηλώνουν ότι οι αλλαγές στο σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch σχετίζονται με πολλούς καρκίνους. Επιπλέον οι υποδοχείς και οι προσδέτες του Notch μπορεί να είναι προγνωστικοί ή διαγνωστικοί δείκτες για τον καρκίνο. Ο Notch ως διαγνωστικός δείκτης στον καρκίνο: Το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch φαίνεται να παίζει ρόλο στην επιβίωση των καρκινοπαθών. Ασθενείς με όγκους που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του Jagged1 ή του Notch1 έχουν μικρότερο προσδόκιμο επιβίωσης σε σχέση με αυτούς που δεν εκφράζουν. Η υψηλή έκφραση του Jagged1 στον καρκίνο του προστάτη σχετίζεται πάρα πολύ με την υποτροπή και την μετάσταση του όγκου υποδηλώνοντας ότι ίσως ο Jagged1 μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης στο διαχωρισμό μεταξύ επιθετικών και μη επιθετικών όγκων στον καρκίνο του προστάτη. Υψηλά επίπεδα συνέκφρασης Jagged1 και Notch1 παρατηρήθηκαν στον καρκίνο του μαστού και βρέθηκε ότι αυτά σχετίζονται με μικρό προσδόκιμο επιβίωσης. Ως εκ τούτοι η έκφραση του Notch1 και Jagged1 μπορεί να είναι δείκτες για την επιβίωση των ασθενών. Ένα άλλο παράδειγμα σε ασθενείς με καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που εμφανίζουν έκφραση του Notch3 είχαν σημαντικά μικρότερο προσδόκιμο επιβίωσης σε σχέση με αυτούς που δεν εμφάνισαν έκφραση του Notch3. Δεδομένου αυτού ο Notch3 μπορεί να αποτελέσει προγνωστικό δείκτη σε αυτό το είδος του καρκίνου. 35

Καρκίνος του πνεύμονα και Notch Ο ρόλος του Notch στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και στη διαφοροποίηση των κυττάρων είναι περίπλοκος και καλά τεκμηριωμένος. Η συμμετοχή όμως του Notch στην ανάπτυξη των όγκων είναι υπό διερεύνηση τα τελευταία χρόνια. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του Notch στη βιολογία του καρκίνου πρέπει η προσέγγιση να είναι ολοκληρωμένη και να περιλαμβάνει τους δύο τρόπους δράσης του συστήματος του Notch. Η λειτουργία του μονοπατιού του Notch μπορεί να ακολουθεί δύο μοντέλα, το ένα σχετίζεται με την επικοινωνία δύο γειτονικών κυττάρων και τη διαφορετική «μοίρα» που αυτά έχουν και το άλλο μοντέλο σχετίζεται με αυτόνομη δράση των υποδοχέων του Notch. Ασύμμετρη επικοινωνία των γειτονικών κυττάρων: το μοντέλο i. αυτό περιλαμβάνει την επικοινωνία δύο κυττάρων όπου το ένα κύτταρο αναφέρεται ως «δέκτης» (receiving cell) και το άλλο ως «πομπός» (sending cell) (βλ. Σχήμα 7). Στο μοντέλο αυτό κατάλληλοι προσδέτες από το κύτταρο «πομπός» εκκρίνονται και παραμένοντας δεσμευμένοι στην επιφάνεια αυτού του κυττάρου, δεσμεύονται στους υποδοχείς Notch του κυττάρου «δέκτης». Στην περίπτωση ενός όγκου τα δύο κύτταρα, «δέκτης» και «πομπός» μπορεί είτε να είναι του ίδιου τύπου καρκινικά κύτταρα που βρίσκονται σε διαφορετική κατάσταση διαφοροποίησης ή να είναι κύτταρα διαφορετικού τύπου, π.χ. καρκινικό κύτταρο και ενδοθηλιακό κύτταρο. Η ασύμμετρη επικοινωνία των δύο γειτονικών κυττάρων έγκειται στο γεγονός ότι το κύτταρο «πομπός» που έχει αυξημένη έκφραση των προσδετών παρουσιάζει μειωμένη έκφραση του υποδοχέα Notch ενώ το γειτονικό κύτταρο «δέκτης» εμφανίζει ενεργοποιημένο το μονοπάτι του Notch. Αυτόνομη δράση των υποδοχέων του Notch: το μοντέλο αυτό ii. περιλαμβάνει την μεταγωγή σήματος του Notch όταν ο προσδέτης και ο υποδοχέας εκφράζονται από τα ίδια τα κύτταρα. Το μοντέλο αυτό μέχρι σήμερα δεν έχει αποδειχτεί ότι ισχύει στους όγκους. Έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι το Notch μπορεί να δρα σαν ογκογονίδιο ή σαν ογκοκατασταλτικό ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου. Στον καρκίνο του πνεύμονα έχουν περιγραφεί και οι δύο περιπτώσεις. Στον ΜΜΚΠ υπάρχουν έρευνες που δείχνουν ότι ο Notch3 προάγει την αύξηση του όγκου στον πνεύμονα 36

. Στην πραγματικότητα η αναστολή του Notch 3 από το μόριο ΜRK 003, αναστολέας γ σεκρετάσης, μειώνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επάγει την απόπτωση στον ΜΜΚΠ. Εν τούτοις, οι Chen και συνεργάτες αναφέρουν ότι ο Notch1 υποεκφράζεται στον ΜΜΚΠ και η έκφραση του ιδιοσυστατικά ενεργού Notch1 στα κύτταρα του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα (ACL) προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Ενδιαφέρον έχει η παρατήρηση ότι ο Notch1 κάτω από συνθήκες υποξίας υπερεκφράζεται το οποίο φαίνεται οτί είναι σημαντικό για την επιβίωση των κυττάρων στο αδενοκαρκίνωμα. Αυτό δείχνει ότι η συγκέντρωση του οξυγόνου καθορίζει τη βιολογική δράση του Notch1 στο αδενοκαρκίνωμα. Παρόμοια παρατήρηση έγινε για την έκφραση των Notch 1-3 στην κυτταρική σειρά Α549 και SPC-1 του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Υπερέκφραση του NICD αναστέλλει την αύξηση των κυττάρων Α549 in vitro με επαγωγή της διακοπής του κυτταρικού κύκλου και αυτό έχει σαν συνέπεια την καταστολή της αύξησης του όγκου. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch μπορεί να έχει ογκοκατασταλτική δράση στα κύτταρα του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Συγκριτικά στον ΜΚΠ ο Notch1 και ο Notch2 υποεκφράζονται στα καρκινικά κύτταρα ενώ υπερέκφραση αυτών προκαλεί την αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Αντιμετώπιση του καρκίνου στοχεύοντας το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch Πολύ έρευνα λαμβάνει χώρα και σε κλινικό επίπεδο στοχεύοντας την ογκογονική ή ογκοκατασταλτική δράση του Notch σε διάφορα είδη καρκίνου. Αυτό το γεγονός τοποθετεί το σηματοδοτικό μονοπάτι του Notch ως ένα πιθανό στόχο για την αντιμετώπιση του καρκίνου. Η κατανόηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του Notch και η αλληλεπίδραση του με άλλα μονοπάτια παρέχουν στην επιστημονική κοινότητα πληροφορία για την αναγνώριση πιθανών μοριακών στόχων για το σχεδιασμό επιτυχημένων θεραπευτικών μορίων (σχήμα 9). Οι προσεγγίσεις για πιθανά μόρια στόχους περιλαμβάνουν μονοκλωνικά αντισώματα, antisense RNA, interference RNA, Notch decoys και αναστολείς γ-σεκρετάσης. 37