φυτά, για ανθεκτικότητα σε φυτοπαθογόνους μύκητες

Χιτοζανάσες - Έκφραση Χιτοζανασών σε trans-γενικά φυτά, για ανθεκτικότητα σε φυτοπαθογόνους μύκητες Παρουσίαση Σαρρής Φ. Παναγιώτης 1 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη Δομή και φυσικοχημικές ιδιότητες Μερικοί από τους πιο διαδεδομένους δομικούς πολυσακχαρίτες στην φύση είναι: Κυτταρίνη που συµµ µµετέχει στη κατασκευή των κυτταρικών τοιχωµάτων των ανώτερων φυτών, Χιτίνη στο σκελετικό υλικό των οστρακόδερµων Πεπτιδογλυκάνες στα βακτηριακά κύτταρα και τους συνδετικούς ιστούς των ζώων 2 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη Δομή και φυσικοχημικές ιδιότητες Η Χιτίνη αποτελεί το κυριότερο συστατικό : Του τοιχώµατος των μυκήτων (ισχυρά ισχυρά προσδεδεμένη με γλυκάνες), Της εφυµενίδας ενίδας των αρθρόποδων (σταθεροποιείται μέσω διαμοριακών συνδέσεων με πρωτεΐνες και υδροξυφαινόλες), Του εξωσκελετού στα έντομα (βρίσκεται μαζί με καροτενοειδή), Συναντάται επίσης στα αρχαίζωα, Στα πρωτόζωα, Στα φύκη, Δεν συντίθεται από ανώτερα φυτά και ζώα. 3 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη Δομή και φυσικοχημικές ιδιότητες Η χιτίνη είναι ένα πολυμερές αποτελούμενο από ολιγομερή Ν-ακέτυλ- γλυκοζαμίνης, τα οποία είναι συνδεδεμένα με β- 1,4-γλυκοσιδικούς δεσμούς. Είναι το δεύτερο σε αφθονία βιολογικό µόριο μετά την κυτταρίνη. Η βιοσύνθεση χιτίνης έχει υπολογιστεί στους 10 9 µε 10 11 τόνους ετησίως. Χιτίνη Χιτοζάνη, όπου R=H 4 of 33 http://www.agrool.gr

Ένζυμα κατεργασίας της Χιτίνης Εξoχιτινάσες Ενδοχιτινάσες Χιτίνη Απακετυλάση της Χιτίνης Χιτινινο- ολιγοσακχαρήτες Εξωχιτινάση Ν,Ν -δυακέτυλχιτοβιόζη Χιτοζάνη Χιτοβιόζη Χιτοζανάση Ν ακέτυλγλυκοζαμίνηδάση Ν-ακέτυλ-γλυκοζαμίνη Γλυκοζανινηδάση Απακετυλάση Γλυκοζαμίνη 5 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτοζάνη Η Χιτοζάνη παρουσιάζει διαφορετικό βαθμό απακετυλίωσης π.χ.: Στην Χιτοζάνη του εμπορείου οι ακετυλ-ομάδες διανέμονται ομοιόμορφα κατά μήκος της πολυμερούς αλυσίδας. Χιτοζάνη απομονωμένη από μυκητιακά κυτταρικά τοιχώματα, παρουσιάζει τα ακετυλικά υπολείμματα ομαδοποιημένα σε clusters. GlcN (b-d-glucosamine) Χιτίνη GlcNAc (N-acetyl-b-D-glucosamine) Χιτοζάνη, 100% απακετυλιωμένη Χιτοζάνη, εν μέρει ακετυλιωμένη (αποκτηθείσα με τις χημικές μεθόδους) Χιτοζάνη, εν μέρει ακετυλιωμένη (απομονωμένη από το μυκητιακό κυτταρικό τοίχωμα) 6 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτοζανάσες Μέχρι τώρα, η πλειοψηφία των Χιτοζανασών που έχουν αλληλουχιθεί, προέρχεται από Gram (+) μικροοργανισμούς. Οι Χιτοζανάσες κατατάσσονται σε πέντε glycoside hydrolase οικογένειες: 5, 8, 46, 75 και 80. Chitosanase from Streptomyces sp. N174 7 of 33 http://www.agrool.gr

Οικογένεια Χιτοζανασών 46 Οι περισσότερες από τις μελετημένες έως σήμερα Χιτοζανάσες ανήκουν στην οικογένεια 46 των glycoside hydrolases: STR_N174, Streptomyces sp. strain N174 NOC_N106, Nocardioides sp. strain N106 AMY_CS02, Amycolatopsis sp. strain CsO-2 STR_CoelA, Streptomyces coelicolor A3(2), SCO0677 or SCF91.37, STR_CoelB, Streptomyces coelicolor A3(2),SCO2024 or SC3A3.02, BAC_SUBT, Bacillus subtilis BAC_AMYL, Bacillus amyloliquefaciens BAC_KFB, Bacillus KFB-C04, thermostable chitosanase, alias Bacillus sp. strain CK4 PBCV-1, Chlorella virus PBCV-1 CVK2, Chlorella virus CVK2 BAC_EHIM, Bacillus ehimensis BAC_COA, Bacillus coagulans BUR_GLAD, Burkholderia gladioli BAC_CIRC, Bacillus circulans MH-K1 8 of 33 http://www.agrool.gr

Οικογένεια Χιτοζανασών 75 Μια άλλη ακολουθία Χιτοζανάσης απομονώθηκε το 1996 από τον μικροοργανισμό Nectria haematococca var. brevicona (Shimosaka et al) η οποία δεν έχει καμία ανιχνεύσιμη ομολογία με τα ένζυμα της οικογένεια 46. 9 of 33 http://www.agrool.gr

Οικογένεια Χιτοζανασών 80 Μία νέα Χιτοζανάση έχει χαρακτηριστεί από το Matsuebacter chitosanotabidus, η ακολουθία της οποίας είναι ιδιαίτερα παρόμοια με αυτήν της Χιτοζανάσης από το Sphingobacterium multivorum. Αυτά τα δύο ένζυμα έχουν ταξινομηθεί στην οικογένεια 80 των glycoside hydrolases. Alignment I Alignment II 10 of 33 http://www.agrool.gr

Οικογένεια Χιτοζανασών 8 Αυτή η οικογένεια περιλαμβάνει ένζυμα με τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις όσων αφορά τα υποστρώματα, από οποιαδήποτε άλλη οικογένεια. Εκτός από Χιτοζανάσες, η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει cellulases, licheninases και endo- xylanases. Η καλύτερα χαρακτηρισμένη Χιτοζανάση αυτής την οικογένεια είναι το ένζυμο από το Bacillus sp. No.7M, (η( μόνη γνωστή Χιτοζανάση που η ικανότητα υδρόλησης είναι περιορισμένη μόνο στο δεσμό GlcN-GlcN GlcN). 11 of 33 http://www.agrool.gr

Οικογένεια Χιτοζανασών 5 Το 2003, ο Tanabe et. al. χαρακτήρισαν δύο χιτοζανάσες από το Streptomyces griseus HUT 6037. Αυτές οι χιτοζανάσες (ChoI και ChoII) υδρολύουν όχι μόνο την Χιτοζάνη αλλά και την carboxy-methyl methyl-cellulose. Επίσης και οι δύο αυτές χιτοζανάσες κατέλυσαν μια αντίδραση trans- glycosylation. 12 of 33 http://www.agrool.gr

Εξειδίκευση δράσης των Χιτοζανασών Η ιδιομορφία στην αναγνώριση των δεσμών για τα διάφορα χιτινολυτικά και χιτοζανολυτικά ένζυμα ερευνάτε συνήθως χρησιμοποιώντας 20-30%-ακετυλιωμένη Χιτοζάνη ως υπόστρωμα. * Αυτό το ένζυμο έχει αναφερθεί προηγουμένως ως b -1,3-1,4-glucanase. 13 of 33 http://www.agrool.gr

Μηχανισμός κατάλυσης της Χιτοζανάσης Περίληψη του καταλυτικού μηχανισμού της χιτοζανάσης 14 of 33 http://www.agrool.gr

Αναγνώριση υποστρωμάτων Έχουν βρεθεί έξι περιοχές δέσμευσης του υποστρώματος, κάθε μία από τις οποίες μπορεί να προσαρμόσει ένα υπόλειμμα D- glucosamine. Περιοχή A Arg-120 και Glu-60 Περιοχή B Pro-152 Περιοχή C Asp-57 και Gly-50 Περιοχή D Ile-49 και Glu-197 Περιοχή E Tyr-34* Περιοχή F Asp-201 * Tyr- 34 είναι το καλύτερο υποψήφιο αμινοξύ της περιοχής Ε για αλληλεπίδραση. 15 of 33 http://www.agrool.gr

Αναγνώριση υποστρώματος 16 of 33 http://www.agrool.gr

Αναγνώριση υποστρώματος Μέχρι τώρα,, 16 αμινοξέα έχουν μελετηθεί με την μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγέννεσης. Glu6, Glu22, Trp28, Glu36, Asp37, Asp40, Thr45, Asp57, His90, Trp101, Asp145, Val148, Arg190, Glu197, Arg205, και Trp227. 17 of 33 http://www.agrool.gr

Δομική σταθερότητα Μελέτες για τρεις τριπτοφάνες, στην χιτοζανάση από το Streptomyces sp. N174 (Trp- 28 Trp- 101 και Trp- 227) έδειξαν ότι καμία από αυτές δεν συμμετείχε άμεσα στη σύνδεση υποστρωμάτων, αλλά μάλλον σταθεροποιούν την πρωτεϊνική δομή με την δημιουργία διάφορων αλληλεπιδράσεων με τις υδροφοβικές πλευρικές αλυσίδες αλυσίδες. 18 of 33 http://www.agrool.gr

Δράση των φυτοπαθογόνων μυκήτων 19 of 33 http://www.agrool.gr

Δράση των φυτοπαθογόνων μυκήτων Η μοριακή αναγνώριση τμημάτων του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων μπορεί στη συνέχεια να προκαλέσει την επαγωγή των αμυντικών μηχανισμών των φυτών. Τα πιο ακραία στρώματα του μυκητιακού κυτταρικού τοιχώματος είναι οι αρχικοί στόχοι για τις αντιμικροβιακές υδρολάσες που συντίθενται συχνά από τα φυτά σε απάντηση στην επίθεση των παθογόνων. 20 of 33 http://www.agrool.gr

Δράση των φυτοπαθογόνων μυκήτων Μια από τις πιο αξιοπρόσεκτες αλλαγές στις ιδιότητες της επιφάνειας που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης των δομών μόλυνσης, αποκαλύφθηκε με τη σήμανση της χιτίνης με τη συγκολλητίνη του καρπού του σίτου (wheat germ agglutinin -WGA). Η χιτίνη βρέθηκε γενικά στην επιφάνεια των κυτταρικών τοιχωμάτων στα σπόρια και τα appressoria, αλλά δομές που υπό φυσικές συνθήκες εισχωρούν μέσα στον ιστό των φύλλων,(,(μολυσματική υφή και μυζητήρας), δεν σημάνθηκαν. 21 of 33 http://www.agrool.gr

Δράση των φυτοπαθογόνων μυκήτων Δεδομένου ότι η χιτοζάνη είναι ένα μη συμβατό υπόστρωμα για τις χιτινάσες, η μετατροπή της χιτίνης σε χιτοζάνη κατά τη διάρκεια της μεσοκυττάριας αύξησης μπορεί να προστατεύσει τις υφές των παθογόνων μυκήτων από την δράση Χιτινασών των φυτών. 22 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη σε Χιτοζάνη Αποτελέσματα από μικροσκοπικές αναλύσεις, με τη χρησιμοποίηση φθορίζοντος WGA και του αντιορό για την χιτοζάνη, δείχνουν ότι: a) H χιτίνη είναι παρούσα στην επιφάνεια των δομών μόλυνσης που διαφοροποιούνται στην επιδερμίδα του ξενιστή, b) Η χιτίνη μετατρέπεται σε χιτοζάνη στις επιφάνειες των κυτταρικών τοιχωμάτων των δομών που εισβάλλουν στον ιστό του ξενιστή. 23 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη σε Χιτοζάνη 24 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη σε Χιτοζάνη 25 of 33 http://www.agrool.gr

Χιτίνη σε Χιτοζάνη 26 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Το αμυντικό σύστημα των φυτών ενάντια στα μικροβιακά παθογόνα μπορεί να τροποποιηθεί ώστε να παραγάγει υψηλότερα επίπεδα αντιμικροβιακών ουσιών. Γονίδια που κωδικοποιούν για ένζυμα διάσπασης των κυτταρικών τοιχωμάτων (π.χ. χιτινάσες), έχουν χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν με σκοπό να αυξήσουν την αντοχή των φυτών σε φυτοπαθογόνους μύκητες 27 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά 28 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Επομένως, αναμένεται ότι η διαγονιδιακή χρήση των Χιτοζανασών μπορεί να παρέχει ένα επίπεδο αντίστασης στα καλλιεργούμενα φυτικά είδη, ενάντια σε μια ποικιλία μυκητιακών παθογόνων. Η δημιουργία μετασχηματισμένων φυτών που να εκφράζουν Χιτοζανάσες, και ο έλεγχος της αντοχής των φυτών αυτών σε φυτοπαθογόνους μύκητες, ακολουθεί (εν συντομία) τα παρακάτω βήματα: 29 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Γονίδιο στόχος Ενίσχυση με PCR 2 Κλωνοποίηση σε αγροβακτηριακό φορέα 1 T L aphiv PromX 35S χιτοζανάση NOS T R T-DNA Άκρο Ανθεκτικότητα Υγρομυκίνης T-DNA Border Ακολουθία Ένθεσης Marker Επιλογής Γονίδιο Χιτοζανάσης Ακολουθία λήξης Μεταγραφής Ακολουθία Ένθεσης 3 30 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Βοηθητικό στέλεχος με το πλασμίδιο-prk 2013 E. coli E. coli Στέλεχος με τον φορέα κλωνοποίησης Στάδιο 1 ο A. tumefaciens Μέθοδος της Τριγονικής Σύζευξης 4 Στάδιο 2 ο A. tumefaciens 31 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Ανάμειξη (συγκαλλιέργεια) Αγροβακτηρίου με πληγωμένο φυτικό ιστό Καλλιέργεια του φυτικού ιστού σε Θρεπτικά επιλογής (με αντιβιοτικά) 5 6 8 7 Ριζογένεση και Επιλογή των φυτών που παράγουν Χιτοζανάση. ΈΛΕΓΧΟΣ ΑΝΘΕΚΤΗΚΟΤΗΤΑΣ Δημιουργία κάλου και αναγέννηση, από τα τροποποιημένα κύτταρα 32 of 33 http://www.agrool.gr

Έκφραση Χιτοζανασών σε Φυτά Εναλλακτικές στρατηγικές υπερέκφρασης των Χιτοζανασών: α) Υπό τον έλεγχο υποκινητή που ενεργοποιείται μετά από επαφή με παθογόνα (π.χ. υποκινητές γονιδίων των PR πρωτεϊνών), τέλος β) Υπό τον έλεγχο υποκινητών ιστοειδικής έκφρασης (για την αποφυγή ανεπιθύμητης ανεπιθύμητης δράσης με συμβιωτικούς μικροοργανισμούς), γ) Έκφραση σε χλωροπλαστικό DNA DNA (για την αποφυγή διασποράς του διαγονιδίου σε μη τροποποιημένα φυτά). δ) Συνδυασμένη έκφραση Χιτοζανασών, των δύο ή και των τριών ομάδων. 33 of 33 http://www.agrool.gr