ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ- ΑΜΠΕΛΟΥΡΓΙΑΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ- ΑΜΠΕΛΟΥΡΓΙΑΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΜΕΡΙΚΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΤΗΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΣΕΡΕΤΗ ΒΑΪΑ- ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ κ. ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 1

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΟΙΝΟΛΟΓΙΑΣ- ΑΜΠΕΛΟΥΡΓΙΑΣ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΣΤΗΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΚΡΙΣΗ ΜΕΡΙΚΩΝ ΠΟΙΚΙΛΙΩΝ ΤΗΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΣΕΡΕΤΗ ΒΑΪΑ- ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΓΕΩΠΟΝΟΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ κ. ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΝΙΚΟΛΑΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Καθηγητής Αμπελουργίας ΖΙΩΖΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΙΑ Επίκουρη Καθηγήτρια ΚΟΥΝΔΟΥΡΑΣ ΣΤΕΦΑΝΟΣ Επίκουρος Καθηγητής ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Πριν προχωρήσω στην έκθεση της παρούσας πτυχιακής μελέτης, νιώθω την ανάγκη να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όσους συνέβαλαν στην διεκπεραίωση αυτής της μελέτης. Ιδιαίτερα, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα της πτυχιακής μου διατριβής, Καθηγητή κ. Ν. Νικολάου της Γεωπονικής Σχολής Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και για τις εποικοδομητικές υποδείξεις και συμβουλές που μου προσέφερε. Ευχαριστώ επίσης την κ. Ε. Ζιώζου Επίκουρη Καθηγήτρια της Γεωπονικής Σχολής Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης και τον κ. Σ. Κουνδουρά Επίκουρο Καθηγητή της Γεωπονικής Σχολής Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης για την συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή και για την κριτική ανάγνωση των κειμένων της μεταπτυχιακής μου μελέτης καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά τους σε όλη τη διάρκεια το μεταπτυχιακού προγράμματος. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον καθηγητή Οινολογίας της Γεωπονικής σχολής του Α.Π.Θ. κ. Ε, Σουφλερό για τις επιστημονικές γνώσεις που πρόσφερε απλόχερα καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών σπουδών. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ομότιμο καθηγητή της Αμπελουργίας κ. Δ. Σταύρακα καθώς και όλους τους καθηγητές που συμμετείχαν σε αυτό το μεταπτυχιακό πρόγραμμα. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Ν. Αργυρίου και τον κ. Γ. Μερκουρόπουλο με την βοήθεια των οποίων πραγματοποιήθηκαν οι αναλύσεις με μοριακούς δείκτες στο Ινστιτούτο Αγροβιοτεχνολογίας Θεσσαλονίκης. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την μητέρα μου για την ηθική συμπαράστασή της, χωρίς την οποία δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί το μεταπτυχιακό πρόγραμμα. 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 6 SUMMARY 7 1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 8 1.1 Ιστορικά δεδομένα 8 1.2 Αμπελογραφικά χαρακτηριστικά 10 1.2.1 Κορυφή του βλαστού 11 1.2.2 Νέα φύλλα 11 1.2.3 Αναπτυγμένα φύλλα 12 1.2.4 Ποώδης βλαστός 15 1.2.5 Κληματίδα 15 1.2.6 Ταξιανθία και Άνθος 16 1.2.7 Καρπός και Ράγα 16 1.2.8 Γίγαρτα 17 1.3 Φαινολογικά χαρακτηριστικά 18 1.4 Χημική ταξινόμηση Μοριακοί δείκτες 19 1.4.1 Ισοένζυμα 21 1.4.2 Πολυμορφισμός Μεγέθους Περιοριστικών Τμημάτων DNA (RFLP- Restriction Fregment Length Polymorphism) 23 1.4.3 Τυχαίο Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA) 24 1.4.4 Πολυμορφισμός Μήκους Ενισχυμένων Τμημάτων (AFLP Amlified Fragment Length Polymorphism) 25 1.4.5 Μικροδορυφόροι (microsatellites) ή Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR) και Απλές Γραμμικές Επαναλήψεις (STR) 27 1.5 Σκοπός της εργασίας 28 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 29 2.1 Φαινοτυπικές αναλύσεις των χαρακτηριστικών της σταφυλής 29 2.1.1. Δειγματοληψία και αναλύσεις κατά την ωρίμανση 29 2.2 Στατιστική ανάλυση 31 2.3 Φυτικό υλικό για την απομόνωση του DNA 31 2.4 Απομόνωση DNA 31 2.5 Προσθήκη εκκινητών και PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) 32 2.6 Ηλεκτροφόρηση αντίδρασης PCR σε gel αγαρόζης 33 3.ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 35 3.1 Αμπελογραφικά χαρακτηριστικά 35 3.2 Φαινολογικές αναλύσεις 54 3.3 Αποτελέσματα ανάλυσης με μοριακούς δείκτες 57 3.4 Αποτελέσματα σύγκρισης αμπελογραφικών και φαινολογικών χαρακτηριστικών 58 4. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 62 5. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 63 6. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 72 4

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η εφαρμογή της μεθόδου των μοριακών δεικτών SSR ή μικροδορυφόρων εφαρμόστηκε σε φυτικούς ιστούς (φύλλα) 20 ερυθρών ποικιλιών της αμπέλου (Vitis vinifera L.).Το φυτικό υλικό προερχόταν από την Αμπελογραφική Συλλογή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Τα φυτά της αμπέλου ήταν εμβολιασμένα στο υποκείμενο 110R. Χρησιμοποιήθηκαν φύλλα της κορυφής του βλαστού τα οποία συλλέχτηκαν την άνοιξη. Η ανάλυση με μοριακούς δείκτες περιελάμβανε την απομόνωση του DNA από τους φυτικούς ιστούς χρησιμοποιώντας την μέθοδο CTAB, την προσθήκη 10 ζευγών εκκινητών και την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα της ανάλυσης δημιουργήθηκε ένα δενδρόγραμμα το οποίο απεικονίζει τη γενετική συγγένεια και την ομαδοποίηση των ποικιλιών με την χρήση των κωδικών του OIV. Η παρατήρηση και η καταγραφή των αμπελογραφικών χαρακτηριστικών έγινε σε όλη την διάρκεια ανάπτυξης της αμπέλου. Ακόμα, έγινε προσδιορισμός των φαινολογικών χαρακτηριστικών. Η συγκομιδή των δειγμάτων έγινε στο στάδιο της ωρίμανσης στις συνθήκες που αναπτύσσονται τα αμπέλια της συλλογής. Επιπλέον, έγινε καθορισμός της εποχής ωρίμανσης, προσδιορίστηκε το βάρος της σταφυλής, το μέγεθος και το βάρος της ράγας, το βάρος των φλοιών, το βάρος και ο αριθμός των γιγάρτων. Τέλος, έγινε προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε σάκχαρα, της τιτλοδοτούμενης (ολικής) οξύτητας, της συγκέντρωσης των φλοιών σε ανθοκυάνες και της συγκέντρωσης των φαινολικών συστατικών σε φλοιούς και γίγαρτα. Το δενδρόγραμμα που προέκυψε από την γενετική ανάλυση έδειξε ότι υπάρχουν κάποιες ομάδες ποικιλιών με παρόμοια γενετικά προφίλ. Επιπλέον η καταγραφή των αμπελογραφικών και φαινολογικών χαρακτηριστικών έδειξε ότι διαφέρουν τα χαρακτηριστικά των ποικιλιών. Με όλες τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν αποδείχθηκε ότι δεν ταυτίζονται οι ποικιλίες μεταξύ τους. 5

SUMMARY The method of molecular markers SSR or microsatellites was applied on plant tissues (leaves) of 20 varieties of red grape (Vitis vinifera L.).The plant material came from the Ampelografic Collection of Aristotle University of Thessaloniki. The vine plants were grafted onto 110R rootstock. Leaves of the top of the stem were used, which were collected during spring. The analysis with molecular markers included the isolation of DNA from plant issues using the CTAB method, the addition of 10 pairs of primers and the chain reaction of PCR polymerase. Using the data analysis a dendrogram was created that illustrates the genetic resemblance and the grouping of varieties with the use of OIV codes. Both the observation and the recording of the characteristics took place throughout the development of the vine. Besides, there was a determination of the phenological characteristics. The gathering of the samples was done during the maturation stage in growing conditions of the collected vines. Furthermore, the maturation season was specified, the weight of the grape was defined as well as the size and the weight of the grape seed, the weight of the skins, the weight and the number of pips. Finally, the sugar content, the acidity, the concentration of anthocyanins and the concentration of phenolic compounds in skins and seeds were defined, too. The dendrogram that resulted from the genetic analysis showed that there are some groups of varieties with similar genetic profiles. Furthermore, the recording of ampelografic and phenological characteristics showed that the characteristics of the varieties vary. All the methods used proved that the varieties are not identical. 6

1.ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Ιστορικά δεδομένα Η Αμπελογραφία είναι ο κλάδος της Αμπελουργίας που έχει ως αντικείμενο τη μελέτη και την περιγραφή των χαρακτηριστικών και των ιδιοτήτων των ειδών, ποικιλιών ή κλώνων της αμπέλου (Σταύρακας, 2010). Ο κύριος όμως σκοπός της Αμπελογραφίας είναι η διάκριση των διαφόρων ποικιλιών. Η καλλιεργούμενη άμπελος (Vitis vinifera L.) είναι είδος του γένους Vitis το οποίο ανήκει στην οικογένεια Vitaceae. Με τον όρο ποικιλία, αναφερόμαστε στην περιγραφή συγκεκριμένων φαινολογικών χαρακτηριστικών, τα οποία όμως έχουν συγκεκριμένη γενετική σύσταση. Όμως, μέσα σε μια ποικιλία μπορούμε να συναντήσουμε άτομα που να διαφέρουν ως προς τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά, τα οποία μπορούν να αναπαραχθούν με τον αγενή πολλαπλασιασμό και για τον λόγο αυτό όταν αναφερόμαστε στον όρο ποικιλία εννοούμε ένα σύνολο κλώνων. Ως κλώνος θεωρείται το σύνολο των απογόνων που αποκτάται αγενώς από ένα φυτό (Νικολάου, 2011). Οι προσπάθειες μελέτης και καταγραφής των μορφολογικών χαρακτηριστικών της αμπέλου άρχισαν από πάρα πολύ παλιά. Τον 18 ο αιώνα λοιπόν, τέθηκαν οι βάσεις για τη βοτανική κατάταξη της αμπέλου με τις μελέτες του Tourneford (1700) σχετικά με το γένος Vitis και του Linne (1753) σχετικά με την οικογένεια Vitaceae. Αργότερα, στις αρχές του 19ου αιώνα δημιουργήθηκε το σύστημα κατάταξης του Frege (1804) σύμφωνα με το οποίο ο διαχωρισμός των ποικιλιών γινόταν με βάση το σχήμα (σφαιρικές, ωοειδείς) και το χρώμα (λευκές, κίτρινες, ροζέ, ερυθρές) των ραγών. Ο Don Simon Rohas Clemente (1807) διαχώρισε τις ποικιλίες με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των τριχιδίων και την πυκνότητά τους (βαμβακώδη, βελουδοϋφή, λεία). Το 1841 ο Trummer ταξινόμησε τις ποικιλίες ανάλογα με το μήκος και το πλάτος των ραγών. Παράλληλα όμως, έγιναν προσπάθειες κατάταξης των καλλιεργούμενων ποικιλιών και από άλλους συγγραφείς (Odart 1840, Negroul 1940, Pirovano 1943) με βάση τις καλλιεργητικές ιδιότητες, τη γεωγραφική κατανομή και τα αμπελογραφικά χαρακτηριστικά. Αργότερα ο Odart 7

(1874) χρησιμοποίησε για την ταξινόμηση το μήκος των μεσογονατίων διαστημάτων. Ο Goethe (1876) χρησιμοποίησε ως αμπελογραφικό στοιχείο ταξινόμησης τη μορφή των φύλλων και συγκεκριμένα τη μορφή των λοβών, των οδόντων και της γωνίας που σχηματίζεται από το κεντρικό και τα δύο παράπλευρα νεύρα. Επιπλέον, έγιναν προσπάθειες κατάταξης με βάση τον χαρακτηρισμό ορισμένων οργάνων του φυτού όπως ο τύπος των ανθέων και η μορφολογία των καρπών. Με τον τρόπο όμως αυτό η πιθανότητα σφαλμάτων ήταν πολύ μεγάλη γιατί οι παρατηρήσεις έπρεπε να γίνουν σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή και σε συγκεκριμένο φαινολογικό στάδιο. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως κριτήριο και τα φαινολογικά στάδια, όμως τα στοιχεία αυτά χρησιμεύουν περισσότερο ως συμπληρωματικά στοιχεία ταξινόμησης. Αργότερα, αποφασίστηκε από τον Διεθνή Οργανισμό Αμπέλου και Οίνου (OIV) ότι πρέπει να υπάρχει ένα διεθνές σύστημα κατάταξης το οποίο να βασίζεται στα χαρακτηριστικά όλων των μερών του φυτού και όλων των οργάνων τα οποία είναι προσιτά σε συστηματικές παρατηρήσεις. Το σύστημα αυτό κατάταξης της αμπέλου χρησιμοποιείται μέχρι και σήμερα (OIV, 1983). Με βάση λοιπόν τις μελέτες της βοτανικής που ξεκίνησαν από τον 18 ο αιώνα και συνεχίζονται μέχρι και σήμερα έχουν περιγραφεί περίπου 1000 είδη τα οποία ανήκουν σε 18 γένη από τα οποία τα 2 είναι απολιθώματα. Από τα γένη αυτά όμως η Αμπελογραφία ασχολείται με το γένος Vitis το οποίο περιλαμβάνει 60 είδη και έναν εξαιρετικά μεγάλο αριθμό ποικιλιών. 8

1.2 Αμπελογραφικά χαρακτηριστικά Η καταγραφή των αμπελογραφικών χαρακτηριστικών των οργάνων του φυτού αποτελεί τη βάση για την ταξινόμηση της αμπέλου. Ένα από τα πρώτα χαρακτηριστικά που εξετάζουμε είναι τα τριχίδια των ποωδών οργάνων. Ανάλογα λοιπόν με τα μορφολογικά τους χαρακτηριστικά και την πυκνότητά τους τα τριχίδια διακρίνονται σε: α) εριώδη ή έρποντα : αυτά ανάλογα με την πυκνότητά τους διακρίνονται σε βαμβακώδη, χνοώδη, αραχνοϋφή β) βελουδοϋφή : αν έχουν μεγάλη πυκνότητα χρησιμοποιείται ο όρος βελούδο Με βάση τους κώδικες περιγραφής του OIV, η πυκνότητα των ερπόντων τριχιδίων αντιστοιχεί στον κωδικό 004 και διακρίνεται σε : 1=απουσία ή πολύ αραιά 3=αραιά 5=μέση 7=πυκνή 9=πολύ πυκνή Στη συνέχεια ακολουθεί ο προσδιορισμός των μορφολογικών χαρακτηριστικών των εξής οργάνων : α) κορυφή του βλαστού β) νέα φύλλα γ) αναπτυγμένα φύλλα δ) ποώδης βλαστός ε) κληματίδα στ) ταξιανθία και άνθος ζ) καρπός και άνθος η) γίγαρτα Επιπλέον προσδιορίζουμε και τα εξής φαινολογικά χαρακτηριστικά: εποχή εκβλάστησης, εποχή ανθοφορίας, έναρξη ωρίμανσης, βάρος σταφυλής, βάρος ράγας, στρεμματική απόδοση, περιεκτικότητα του γλεύκους σε σάκχαρα και η ολική οξύτητα εκφρασμένη σε γραμμάρια τρυγικού οξέος ανά λίτρο γλεύκους. 9

1.2.1 Κορυφή του βλαστού Το χαρακτηριστικό αυτό εξετάζεται κατά την έναρξη της εκβλάστησης και την πρώτη περίοδο μετά την εκβλάστηση, όταν δηλαδή οι βλαστοί έχουν μήκος 10-30cm. Μορφή : (κωδικός OIV 001) 3=κλειστή 5=μέση 7=ανοιχτή Χνούδι : (κωδικός OIV 004) και τριχίδια όπως έχουν αναφερθεί και προηγουμένως (κωδικός OIV 005) ανορθωμένα τριχίδια 1=καθόλου ή πολύ αραιό 3=αραιό 5=μέσης πυκνότητας 7=μεσαίο 9=πολύ πυκνό Ένταση του ανθοκυανικού χρωματισμού : (κωδικός OIV 003) 1=απουσία ή πολύ ασθενής 3=ασθενής 5=μέσης έντασης 7=ισχυρή 9=πολύ ισχυρή Ανάλογα βέβαια και με το χνούδι μπορεί το χρώμα να είναι : λευκό, ερυθρό, πράσινο, ωχρό πράσινο, απόχρωση του ορείχαλκου, ωχρό κίτρινο ή υποκίτρινο. 1.2.2 Νέα φύλλα Η παρατήρηση γίνεται πριν από την άνθηση. Χρώμα της πάνω επιφάνειας : (κωδικός OIV 051) 1= πράσινο 2=χαλκοπράσινο 3=κίτρινο 4=κίτρινο με χάλκινες κηλίδες 5=χαλκοκίτρινο 6=χάλκινο 7=ερυθρωπό Ένταση του ανθοκυανικού χρωματισμού : (κωδικός OIV 052) 1=απουσία ή πολύ ασθενής 2=ασθενής ένταση 5=μέση 7=υψηλή 9=πολύ υψηλή Πυκνότητα ερπόντων τριχιδίων μεταξύ των νευρώσεων στην κάτω επιφάνεια από το τέταρτο φύλλο της κορυφής : (κωδικός OIV 053) 10

3= καθόλου ή πολύ αραιά 5=μέσης πυκνότητας 7=πυκνά 9=πολύ πυκνά Πυκνότητα ανορθωμένων τριχιδίων : (κωδικός OIV 054) Έχει 5 διαβαθμίσεις όμοιες με αυτές του κωδικού OIV 053 1.2.3 Αναπτυγμένα φύλλα Το χαρακτηριστικό αυτό εξετάζεται στα φύλλα τα οποία βρίσκονται πάνω από τους βότρεις στο μεσαίο τμήμα του βλαστού. Η παρατήρηση γίνεται στο στάδιο μεταξύ δεσίματος και περκασμού. Μήκος νευρώσεων : μετριούνται οι αποστάσεις μεταξύ του μισχικού σημείου και της απόληξης των νευρώσεων στην άκρη των λοβών Γωνίες μεταξύ των νευρώσεων : μετριούνται σε μοίρες Μέγεθος φύλλων: (κωδικός OIV 065) 1=φύλλα πολύ μικρά 3=μικρά 5=μέσου μεγέθους 7=μεγάλα 9=πολύ μεγάλα ή μπορεί να γίνει η μέτρηση του μήκους της κεντρικής νεύρωσης (κωδικός OIV 066) ο οποίος έχει 5 διαβαθμίσεις όμοιες με τον κωδικό OIV 065 Σχήμα του ελάσματος του φύλλου : (κωδικός OIV 067) 1=σφηνοειδές 2=καρδιόσχημο 3=πενταγωνικό 4=κυκλικό 5=νεφρόσχημο Αριθμός λοβών : (κωδικός OIV 068) 1=κανένας 2=τρεις 3=πέντε 4=επτά 5=περισσότεροι από επτά Σχήμα μισχικού κόλπου: (κωδικός OIV 079) 1=πάρα πολύ ανοιχτός 2=πολύ ανοιχτός 3=ανοιχτός 4=ελαφρά ανοιχτός 5=κλειστός 6=πλευρές ελαφρά επικαλυπτόμενες 7-πλευρές επικαλυπτόμενες 8=πλευρές πολύ επικαλυπτόμενες Σχήμα βάσης μισχικού κόλπου : (κωδικός OIV 080) 1=σχήμα U 2=σχήμα V 11

Δόντια μισχικού κόλπου : (κωδικός OIV 081) 1=απουσία 2= ο μισχικός κόλπος ορίζεται από τις νευρώσεις παρουσία δοντιού στο μισχικό κόλπο 3=συχνή Σχήμα ανώτερων πλάγιων κόλπων: (κωδικός OIV 082) 1=ανοιχτοί 2= κλειστοί 3= ελαφρά επικαλυπτόμενοι 4= πολύ επικαλυπτόμενοι Χρώμα της πάνω επιφάνειας του ελάσματος : (κωδικός OIV 069) 1=πολύ ανοιχτό πράσινο 3=ανοιχτό πράσινο 5=ενδιάμεσης έντασης πράσινο 7=σκούρο πράσινο 9=πολύ σκούρο πράσινο Χρωματισμός κύριων νευρώσεων στην άνω επιφάνεια του ελάσματος : (κωδικός OIV 070) 1=απουσία ή πολύ ασθενής 3=ασθενής 5=μέσης έντασης 7=έντονος 9=πολύ έντονος Χρωματισμός κύριων νευρώσεων στην κάτω επιφάνεια του ελάσματος : (κωδικός OIV 071) με 5 διαβαθμίσεις όμοιες με του κωδικού OIV 070 Προφίλ ελάσματος : (κωδικός OIV 074) 1=επίπεδη επιφάνεια 2=σχήμα V 3=οι παρυφές του ελάσματος κάμπτονται προς τα επάνω 4=οι παρυφές του ελάσματος κάμπτονται προς τα κάτω 5=επιφάνεια με πολλές κοιλότητες Κυματισμός ελάσματος μεταξύ των κυρίων ή δευτερευουσών νευρώσεων : (κωδικός OIV 073) 1=απουσία 2=παρουσία μόνο στο μισχικό σημείο 3=παρουσία σε όλη την επιφάνεια του ελάσματος. Φλυκταινώδεις εξογκώσεις στην πάνω επιφάνεια του ελάσματος : (κωδικός OIV 072) 1=απουσία 9=παρουσία 12

Πυκνότητα ερπόντων τριχιδίων στην κάτω επιφάνεια των φύλλων : (κωδικός OIV 084) 1=απουσία ή πολύ αραιά τριχίδια 3= μικρή πυκνότητα 5=μεση 7= τριχίδια πυκνά 9=τριχίδια πολύ πυκνά Πυκνότητα όρθιων τριχιδίων στην κάτω επιφάνεια των φύλλων:(κωδικός OIV 085) Με 5 διαβαθμίσεις όμοιες με τον κωδικό OIV 084 Πυκνότητα ορθίων τριχιδίων στις κύριες νευρώσεις της κάτω επιφάνειας: (κωδικός OIV 087) Με 5 διαβαθμίσεις όμοιες με τον κωδικό OIV 084 Μήκος μίσχου : (κωδικός OIV 092) 1=πολύ κοντός 3=κοντός 5=μέσου μήκους 7=μακρύς 9=πολύ μακρύς Μήκος μίσχου σε σχέση με το μήκος ελάσματος : (κωδικός OIV 093) 1=πολύ πιο κοντός 3=πιο κοντός 5=ίσος 7=μακρύτερος 9=πολύ πιο μακρύς Σχήμα δοντιών : (κωδικός OIV 076) 1=και οι δύο πλευρές κοίλες 2=και οι δύο πλευρές ευθείες 3=και οι δύο πλευρές κυρτές 4=μια πλευρά κοίλη και μια κυρτή Μήκος δοντιών : (κωδικός OIV 077) 1=πολύ μικρό 3=μικρό 5-μεσαίο 7=μεγάλο 9=πολύ μεγάλο Μήκος δοντιών σε σχέση με το πλάτος τους : (κωδικός OIV 078) 1=πολύ κοντό 3=κοντό 5=μεσαίο 7=μακρύ 9=πολύ μακρύ 13

1.2.4 Ποώδης βλαστός Κατεύθυνση : (κωδικός OIV 006) 1=ανερχόμενη 3=ημιανερχόμενη 5=οριζόντια 7=ημιπίπτουσα 9=πίπτουσα Το χαρακτηριστικό αυτό εξετάζεται κατά την περίοδο της ανθοφορίας σε μη υποστηριγμένους βλαστούς. Χνούδι : χρησιμοποιούμε τους κωδικούς OIV που αναφέρθηκαν και προηγουμένως. Χρώμα στη ραχιαία πλευρά : (κωδικός OIV 007) 1=πράσινο 2=πράσινο με κόκκινες ραβδώσεις 3=κόκκινο Χρώμα στη νωτιαία πλευρά : (κωδικός OIV 008) με τρεις διαβαθμίσεις όμοιες με τον κωδικό OIV 007 Χρώμα στη ραχιαία πλευρά των οφθαλμών : (κωδικός OIV 009) με τρεις διαβαθμίσεις όμοιες με τον κωδικό OIV 007 Χρώμα στη νωτιαία πλευρά των οφθαλμών : (κωδικός OIV 010) Κατανομή των ελίκων: (κωδικός OIV 016) 1=δύο ή λιγότεροι συνεχόμενοι κόμποι φέρουν έλικα 2=τρείς ή περισσότεροι συνεχόμενοι κόμποι φέρουν έλικα. 1.2.5 Κληματίδα Εγκάρσια διατομή : (κωδικός OIV 101) 1=κυκλική 2=ελλειπτική 3=πεπλατισμένη Δομή της επιφάνειας : (κωδικός OIV 102) 1=ομαλή 2=γωνιώδης 3=με αυλακώσεις πυκνές 4=με αυλακώσεις πλευρικές. 14

1.2.6 Ταξιανθία και Άνθος Τύπος ανθέων : (κωδικός OIV 151) 1=άνθη άρρενα με ωοθήκη τελείως ατροφική 2=άνθη ερμαφρόδιτα με στήμονες κανονικούς με γύρη γόνιμη αλλά ατροφική και ωοθήκη περισσότερο ή λιγότερο ατροφική 3=άνθη ερμαφρόδιτα με γυναικείο και ανδρείο, με φυσιολογική επάρκεια και μορφολογικώς λειτουργικά 4=άνθη ερμαφρόδιτα με ωοθήκη κανονική, γύρη γόνιμη αλλά με στήμονες μικρού μήκους ή που κάμπτονται προς τα κάτω 5=άνθη φυσιολογικώς θηλυκά με κανονικό γυναικείο, αλλά με στήμονες που κάμπτονται προς τα κάτω και έχουν γύρη άγονη. 1.2.7 Καρπός και Ράγα Μήκος σταφυλής : (κωδικός OIV 203) 1=πολύ μικρές (<10cm) 3=μικρές(~15cm) 5=μέτριες(~20cm) 7=μεγάλες(~25cm) 9=πολύ μεγάλες(>30cm) Σχήμα σταφυλής : (κωδικός OIV 208) 1=κυλινδρικό 2=κωνικό 3=κλαδωτή Πυκνότητα ραγών : (κωδικός OIV 204) Οι βότρεις διακρίνονται στις εξής κλάσεις: 1=πολύ χαλαροί 3=χαλαροί 5=μέσης πυκνότητας 7=συμπαγείς 9=πολύ συμπαγείς Μέγεθος ράγας ανάλογα με το μήκος και το πλάτος της ράγας : (κωδικοί OIV 220 και 221) 1= πολύ μικρές(<10mm) 3=μικρές(10-17mm) 5=μεσαίες(17-24mm) 7=μεγάλες(24-31mm) 9= πολύ μεγάλες (31mm) 15

Σχήμα ράγας : (κωδικός OIV 223) 1=πεπλατυσμένο 2=ελαφρώς πεπλατυσμένο 3=σφαιρικό 4=ελλειπτικό 5=ωοειδές 6=αμβλύ-ωοειδές 7=αντωοειδές 8=κυλινδρικό 9=μακρό ελλειπτικό 10=γαμψό Χρώμα ράγας : (κωδικός OIV 225) 1=πράσινο-κίτρινο 2=ροζέ 3=κόκκινο 4=γκρι 5=έντονο κόκκινο- βιολετί 6=κυανομελανό Γευστικός χαρακτήρας : (κωδικός OIV 236) 1= καμία 2= μοσχάτη 3=κορεώδης(foxy) 4=χορτώδης 5=άλλη γεύση Εποχή ωρίμανσης : (κωδικός OIV 304) Η εποχή ωρίμανσης καθορίζεται πάντα σε σύγκριση με την εποχή ωρίμανσης της ποικιλίας Chasselas. 1=πολύ πρώιμες (όταν ωριμάζουν 8-15 ημέρες πριν από την ωρίμανση της ποικιλίας Chasselas) 3=πρώιμες ( 5 ημέρες πριν έως 5 ημέρες μετά) 5=μέσης εποχής (10-20 ημέρες μετά) 7=όψιμες (25-35 ημέρες μετά) 9=πολύ όψιμες (40 ημέρες και πάνω) 1.2.8 Γίγαρτα Εξετάζουμε τα μορφολογικά χαρακτηριστικά (ραφή, αύλακες, ράμφος, χάλαζα) Βάρος γιγάρτου : (κωδικός OIV 243) 1=<10mg 3=~25mg 5=~40mg 7=~55mg 9=>65mg 16

1.3 Φαινολογικά χαρακτηριστικά Εποχή εκβλάστησης : (κωδικός OIV 301) 1=πολύ πρώιμη 3=πρώιμη 5=μέση 7=όψιμη 9=πολύ όψιμη Εποχή ανθοφορίας : (κωδικός OIV 302) 1=πολύ πρώιμη 3=πρώιμη 5=μέση 7=όψιμη 9=πολύ όψιμη Έναρξη ωρίμανσης (γυάλισμα ή περκασμός) : (κωδικός OIV 303) 1=πολύ πρώιμη 3=πρώιμη 5=μέση 7=όψιμη 9=πολύ όψιμη Βάρος σταφυλής : (κωδικός OIV 502) 1=πολύ μικρό(<100g) 3=μικρό(150-250g) 5=μέσο(350-450g) 7=μεγάλο(650-950g) 9=πολύ μεγάλο(>1200g) Βάρος ράγας : (κωδικός OIV 503) 1=πολύ μικρό(<1g) 3=μικρό( 1,7-2,3g) 5=μέσο(3-5g) 7=μεγάλο(7-9g) 9=πολύ μεγάλο(>12g) Στρεμματική απόδοση : (κωδικός OIV 504) 1=πολύ μικρή 3=μικρή 5=μέση 7=υψηλή 9=πολύ υψηλή Περιεκτικότητα γλεύκους σε σάκχαρα : (κωδικός OIV 505) 1=πολύ χαμηλή(<13%) 3=χαμηλή(15-16%) 5=μέση(18-19%) 7=υψηλή(21-22%) 9=πολύ υψηλή(>24%) Ολική οξύτητα εκφρασμένη σε γραμμάρια τρυγικού οξέος ανά λίτρο γλεύκους : (κωδικός OIV 506) 1=πολύ χαμηλή(<3) 3=χαμηλή(6) 5=μέση(9) 7=υψηλή(12) 9=πολύ υψηλή(15) 17

1.4 Χημική ταξινόμηση Μοριακοί δείκτες Η άμπελος (Vitis vinifera L.) όπως αναφέραμε και προηγουμένως είναι ένα είδος με μια πολύπλοκη ταξινομική δομή. Διαθέτει έναν υπερβολικά μεγάλο αριθμό ποικιλιών λόγω της μεγάλης γεωγραφικής εξάπλωσης και της έντονης ετεροζυγωτίας που το χαρακτηρίζει (This et al., 2006). Για τον λόγο αυτό, η διάκριση των ποικιλιών αποτελεί μια αναγκαιότητα. Η Αμπελογραφία είναι μια παραδοσιακή βοτανική μέθοδος για την κατάταξη της αμπέλου, η οποία βασίζεται σε μορφολογικά χαρακτηριστικά. Η αμπελογραφική περιγραφή είναι απαραίτητη για την καταγραφή των ποικιλιών στο μητρώο των εμπορικών ποικιλιών ή στον κατάλογο των ποικιλιών (Chome et al., 2003, UPOV 2007). Την ίδια στιγμή η τεχνική της αμπελογραφίας είναι η πιο προσιτή μέθοδος γιατί δεν απαιτεί εξειδικευμένο εργαστηριακό εξοπλισμό όπως απαιτούν οι μέθοδοι με τους μοριακούς δείκτες. Όμως η παραδοσιακή αμπελογραφία συχνά είναι ανακριβής στη διάκριση στενά συνδεδεμένων ποικιλιών του είδους Vitis vinifera L. (Bowers et al.,1993) καθώς επίσης είναι και μια χρονοβόρος διαδικασία (Sefc et al., 2001). Κάποιοι συγγραφείς αναφέρουν ότι οι συνθήκες του περιβάλλοντος επηρεάζουν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά (Alleweldt and Dettweiller 1989, Cunha et al., 2009, Lamboy et al., 1998, Sefc et al., 1998,1999). Τα αμπελογραφικά χαρακτηριστικά επηρεάζονται επίσης από περιστασιακά κλιματικά φαινόμενα (Dettweiller 1993), τα οποία κυρίως επηρεάζουν τους βλαστούς, τα αγρονομικά χαρακτηριστικά και τη σύσταση των ραγών (Calo et al., 1996). Ακόμα, η διαχείριση του αμπελώνα δημιουργεί διαφορές στις αμπελογραφικές περιγραφές (Bowers et al., 1993). Επιπλέον, η εμπειρία των αμπελογράφων επηρεάζει τις αμπελογραφικές περιγραφές. Πράγματι η υποκειμενική εκτίμηση ορισμένων χαρακτηριστικών Cervera et al., 2001) καθώς και η έλλειψη εμπειρίας είναι παράγοντες που περιπλέκουν τη σωστή περιγραφή του φυτικού υλικού (Ortiz et al., 2004). Όμως η ακρίβεια ως προς την ποικιλία είναι απαραίτητη για την εγκατάσταση νέου αμπελώνα για την παραγωγή οίνων ποιότητας, για τη διαχείριση συλλογών γενετικού υλικού, για την εκλογή γονέων στις διασταυρώσεις και για τη νομική προστασία νέων ποικιλιών (Thomas et al., 1994). Ο μεγάλος αριθμός 18

ποικιλιών της αμπέλου και των κλώνων καθιστούν την σωστή ταυτοποίηση και τον χαρακτηρισμό μια πρόκληση. Για πιο αξιόπιστα και αντικειμενικά αποτελέσματα στην ταυτοποίηση των ποικιλιών της αμπέλου αναπτύχθηκαν νέες μέθοδοι. Αρχικά αναπτύχθηκαν βιοχημικές μέθοδοι, οι οποίες περιλαμβάνουν αναλύσεις φαινολικών (Ribereau- Gayon 1953, Boubals et al., 1968) ή αρωματικών συστατικών (Rapp et al., 1977,1980) καθώς και ορολογικές αναλύσεις πρωτεϊνών γύρης (Samann and Wallace 1981). Στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν τα ισοένζυμα για την ταυτοποίηση (Wolfe 1976, Stavrakakis and Loukas 1983, Subden et al.,1987, Bachmann and Blaich 1988, Benin et al., 1988, Parfitt and Arulsekar 1989, Walters et al., 1989) όμως λόγω αρκετών προβλημάτων η τεχνική αυτή δεν είχε μεγάλη εφαρμογή. Αργότερα, άρχισε η χρήση των μοριακών δεικτών, οι οποίοι σχετίζονται με τα νουκλεϊκά οξέα (τμήματα DNA), για την αναγνώριση της ταυτότητας των ποικιλιών. Η μέθοδος αυτή είναι εναλλακτική ή συμπληρωματική της αμπελογραφίας (Thomas et al., 1993). Οι μοριακοί δείκτες είναι μια συγκεκριμένη περιοχή του DNA ανεξάρτητα με το αν κωδικοποιεί ή όχι κάποιο προϊόν, όπου τα διαφορετικά άτομα έχουν διαφορές στην αλληλουχία τους. Μοριακός δείκτης μπορεί να είναι ένα ολόκληρο γονίδιο ή μια μικρή αλληλουχία, ή τόσο μικρός όσο ένα μόνο νουκλεοτίδιο που διαφέρει ανάμεσα σε δύο αλληλόμορφα γονίδια σε μια αντίστοιχη περιοχή (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Οι Μοριακοί δείκτες για να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση διαφορετικών γενοτύπων πρέπει να ικανοποιούν τα εξής κριτήρια : α) να είναι πολυμορφικοί, β) να κληρονομούνται συγκυρίαρχα (ώστε τα ετερόζυγα άτομα να ξεχωρίζουν από τα ομοζύγωτα), γ) τα χαρακτηριστικά του κάθε αλληλομόρφου να είναι ευδιάκριτα (ώστε τα διαφορετικά αλληλόμορφα να αναγνωρίζονται εύκολα), δ) να είναι ουδέτεροι, ε) να ανιχνεύονται εύκολα (ώστε η διαδικασία ανάλυσης να μπορεί να αυτοματοποιηθεί, στ) το κόστος ανάπτυξης και ανάλυσης να είναι χαμηλό, ζ) να παρουσιάζουν καλή επαναληψιμότητα (ώστε τα δεδομένα της ανάλυσης σε διαφορετικά εργαστήρια να ταυτίζονται) (Τσαυτάρης, 2012). Αρχικά οι μοριακοί δείκτες βασίστηκαν στον υβριδισμό, όπως οι RFLPs (Πολυμορφισμός Μεγέθους Περιοριστικών Τμημάτων DNA) (Bourquin et al., 1993, Bowers et al., 1993, Gogorcena et al., 1993, Bowers and Meredith 1996). Οι DNA 19

δείκτες που βασίζονται στην PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) μικροδορυφόροι, RAPD-Τυχαίο Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA, AFLP- Πολυμορφισμός Μήκους Ενισχυμένων Τμημάτων αποδείχθηκαν ισχυρά εργαλεία για γενετική ανάλυση κυρίως εξαιτίας της απλότητας τους και της ευκολίας στη μεταχείριση και είναι ανεξάρτητοι από τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά. Δεν επηρεάζονται από περιβαλλοντικούς παράγοντες και από την εποχή και το DNA μπορεί να απομονωθεί από ξυλώδη μέρη (Bourquin et al., 1992). Η χρήση των μικροδορυφόρων διαδόθηκε κυρίως για την χαρτογράφηση των κλώνων και των ποικιλιών καθώς και για την μελέτη των γονέων (Sefc et al., 2001), ενώ τα συστήματα των πολυθεσικών (multilocus) δεικτών όπως RAPDs, AFLPs, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση γενετικών σχέσεων (Gogorcena et al., 1993, Grando et al., 1995, This et al., 1997, Cervera et al., 1998, Ye et al., 1998, Vidal et al., 1999, Tamhankar et al., 2001). Όμως, η πιο χρήσιμη τεχνολογία για τη γενετική ταυτοποίηση των ποικιλιών της αμπέλου έχει αποδειχθεί ότι είναι οι μικροδορυφόροι (Thomas and Scott 1993, Sefc et al., 2001, This et al., 2004). Η μέθοδος αυτή έχει το πλεονέκτημα ότι δεν επηρεάζεται από το περιβάλλον ή από υποκειμενικές περιγραφές και διευκολύνεται και η ανταλλαγή αποτελεσμάτων ανάμεσα σε εργαστήρια με τη σύγκριση των γενετικών προφίλ. Τελικά όμως, έχει αποδειχθεί ότι ο συνδυασμός των μοριακών δεικτών και των αμπελογραφικών περιγραφών καθορίζει την ταυτότητα της ποικιλίας με έναν πιο ακριβή τρόπο και οδηγεί σε πιο αξιόπιστα και αντικειμενικά αποτελέσματα (Hinrichsen et al., 2001, Santiago et al., 2005, Crespanet et al., 2008, Cunha et al., 2009, Garcia-Munoz et al., 2011). 1.4.1 Ισοένζυμα Τα ισοένζυμα είναι δομικές παραλλαγές ενός ενζύμου που ενώ διαφέρουν στην σύσταση τους σε αμινοξέα με αποτέλεσμα να έχουν διαφορετικές ιδιότητες (μοριακό βάρος, μετακίνηση σε ένα ηλεκτρικό πεδίο) έχουν την ίδια καταλυτική δραστηριότητα. Η ισοενζυματική ανάλυση μπορεί να διαχωρίσει σε ηλεκτροφόρηση τις διαφορετικές μορφές ενός ενζύμου που κωδικοποιούνται τόσο από αλληλόμορφα 20

γονίδια (αλλοένζυμα) όσο και από μη αλληλόμορφα γονίδια (ισοένζυμα). Όμως για ευκολία ο όρος ισοένζυμα χρησιμοποιείται και για τις δύο κατηγορίες (Τσαυτάρης κ. συν.2012, Τριανταφυλλίδης, 2006). Άτομα ενός πληθυσμού που φέρουν διαφορετικά αλληλόμορφα που κωδικοποιούν ένα ενζυμικό σύστημα θα παράγουν πολυπεπτίδια με διαφορές στη σύστασή τους σε αμινοξέα και οι διαφορές αυτές θα είναι ανιχνεύσιμες στο ηλεκτροφορητικό πρότυπο σαν διαφορετικές ζώνες που μεταναστεύει κάθε ισοένζυμο. Η χρήση των ισοενζύμων σαν δείκτες είναι περιορισμένη κυρίως επειδή ο αριθμός των ισοενζυμικών συστημάτων που μπορεί να διακρίνουμε στα φυτά είναι μικρός και περιορίζεται από τον αριθμό των ενζύμων που μπορεί να βαφούν για αναγνώριση σε πηκτή αμύλου ή ακρυλαμίδης (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Η ανάλυση με ισοένζυμα είναι μια από τις πρώτες μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν για την ταυτοποίηση των ποικιλιών της αμπέλου (Wolfe et al., 1976, Subden et al., 1987, Weeden et al., 1988, Parfitt and Arulsekar 1989, Benin et al., 1998, Weeden et al., 1998). Η χρήση σχεδίων ισοενζύμων σε διαφορετικά όργανα (Tanskley and Orton 1983) έδωσε πληροφορίες σχετικές με την ταξινόμηση και την εκτίμηση της μεταβλητότητας (Harborne 1984) καθώς και για τον έλεγχο για ιεραρχικές σχέσεις (Gottlieb et al., 1985, Olmstead 1989, Crawford 1985, Cronqoist 1987). Επίσης, τα ισοένζυμα συχνά αποκαλύπτουν μικρή γενετική παραλλαγή (Soulemezoglou et al., 2001). Γενικά, η τεχνολογία με τα ισοένζυμα ενώ είναι ικανή να διαχωρίσει ποικιλίες που προερχόταν από συγγενείς διασταυρώσεις, αδυνατούσε να δείξει διαφορές σε αυτά που προερχόταν από αγενή αναπαραγωγή ή μεταλλάξεις. Επιπλέον, ο αριθμός των συστημάτων ισοενζύμων που ήταν διαθέσιμα ήταν περιορισμένος και οι αναλύσεις συχνά απαιτούσαν τη χρήση φρέσκων νεαρών ιστών από φύλλα (G.N. Ye et al., 1998). Τα προβλήματα αυτά λοιπόν καθώς και η δυσκολία εξαγωγής των ενζύμων παρεμπόδισαν τη διάδοση της τεχνικής. 21

1.4.2 Πολυμορφισμός Μεγέθους Περιοριστικών Τμημάτων DNA (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism) Το πρώτο σύστημα μοριακών δεικτών που αναπτύχθηκε τη δεκαετία του 1970, οι δείκτες RFLP βασίστηκε στην κατεργασία με περιοριστικά ένζυμα και τον υβριδισμό. Οι δείκτες αυτοί ανιχνεύουν κυρίως μεταλλάξεις σε θέσεις κοπής περιοριστικών ενζύμων και ένθεση ή απαλοιφή μιας αλληλουχίας μεταξύ δύο θέσεων κοπής περιοριστικών ενζύμων. Συνοπτικά η μεθοδολογία περιλαμβάνει την κοπή του συνολικού μεγαλομοριακού DNA των κυττάρων ενός ιστού (π.χ. φύλλο) με ένα ή περισσότερα περιοριστικά ένζυμα με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός πληθυσμού μικρότερων μορίων DNA που διαχωρίζονται σύμφωνα με το μήκος τους με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Παρά το γεγονός ότι τα μόρια αυτά είναι ορατά αν βαφούν με βρωμιούχο αιθίδιο, δεν είναι ευδιάκριτες οι διαφορές τους καθώς υπάρχει μεγάλος αριθμός μορίων με συνεχή κατανομή μήκους, από λίγες δεκάδες μέχρι και πάνω από 10000 βάσεις, που εμφανίζονται σαν συνεχόμενη φωτεινή περιοχή (smear) στην πηκτή, που ενδεχομένως να περιέχει και κάποιες ευδιάκριτες ζώνες συγκεκριμένων μεγεθών που παράγονται από την πέψη επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών. Αυτή η πληροφορία δεν επαρκεί για την διαπίστωση αν δύο διαφορετικά άτομα ενός πληθυσμού παρουσιάζουν πολυμορφισμό στην κοπή του συνόλου του DNA τους με ένα ένζυμο. Έτσι επινοήθηκε μια τεχνική ανίχνευσης διαφορών συγκεκριμένων αλληλουχιών που προέρχονται από την κατεργασία με περιοριστικά ένζυμα. Για την ανίχνευση τέτοιων διαφορών χρησιμοποιούμε την τεχνική του υβριδισμού με έναν ιχνηλάτη που δεν είναι τίποτα άλλο παρά ένα κλωνοποιημένο κομμάτι DNA του ίδιου οργανισμού και διαπιστώνεται αν υπάρχει πολυμορφισμός για το συγκεκριμένο κομμάτι που είναι ομόλογο με τον ιχνηλάτη. Τα διαχωρισμένα τμήματα DNA της ηλεκτροφόρησης μεταφέρονται με νότια μεταφορά σε μια μεμβράνη όπου μετουσιώνονται και σταθεροποιούνται. Ο ιχνηλάτης επισημαίνεται με φθορίζουσες ή ραδιενεργές ουσίες, μετουσιώνεται και αυτός και υβριδίζει με τις συμπληρωματικές του αλυσίδες που είναι σταθεροποιημένες με μεμβράνη. Ανάλογα με την παρουσία ή απουσία αντίστοιχων θέσεων κοπής με το περιοριστικό ένζυμο που χρησιμοποιήσαμε θα δούμε τα ίδια ή διαφορετικά επισημασμένα μόρια στα διάφορα γενετικά υλικά που εξετάζουμε. Επίσης, διαφορές μπορεί να οφείλονται σε προσθήκη/ απαλοιφή βάσεων μεταξύ αλληλόμορφων διαφορετικών γενοτύπων. Οι δείκτες RFLP κληρονομούνται με συγκυρίαρχο τρόπο 22

και μπορεί να είναι απεριόριστοι σε αριθμό. Επίσης η αλληλουχία του κάθε ιχνηλάτηδείκτη δεν χρειάζεται να είναι γνωστή (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Οι δείκτες RFLP έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση DNA πολυμορφισμού στην άμπελο χρησιμοποιώντας ετερόλογους ανιχνευτές (Striem et al., 1990, Yamamoto et al., 1991) και ομόλογους ανιχνευτές (Bourquin et al., 1992,1993, Mauro et al., 1992, Bowers et al., 1993). Όμως η χρήση των δεικτών RFLP είναι περιορισμένη κυρίως εξαιτίας της μεγάλης ποσότητας συνολικού DNA που απαιτείται για κοπή με περιοριστικά ένζυμα, της δυσκολίας στην εφαρμογή των τεχνικών ανίχνευσής τους και του σημαντικού κόστους τους (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). 1.4.3 Τυχαίο Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD- Random Amplified Polymorphic DNA) Η ανίχνευση δεικτών RAPD ήταν η πρώτη εφαρμογή αξιοποίησης της PCR για την ανίχνευση γενετικής παραλλακτικότητας σε επίπεδο DNA. Το σύστημα αυτό βασίζεται στην χρήση ενός μόνο μικρού εκκινητή (συνήθως 10 νουκλεοτιδίων) με τυχαία αλληλουχία, για την ενίσχυση με PCR τυχαίων τμημάτων του DNA των ατόμων ενός πληθυσμού. Για να πολλαπλασιαστεί ένα τμήμα με έναν εκκινητή, θα πρέπει ο εκκινητής αυτός να βρει μια συμπληρωματική αλληλουχία και στα δύο άκρα του τμήματος αυτού αλλά με αντίθετες κατευθύνσεις (δηλαδή στο ένα άκρο στη μια αλυσίδα του DNA και στο άλλο άκρο την άλλη). Όταν η περιοχή ανάμεσα στα σημεία υβριδισμού πρόσδεσης του εκκινητή είναι από 100-3000 βάσεις παράγονται μόρια πολλαπλασιασμένου DNA που εμφανίζονται στις διακριτές ζώνες της ηλεκτροφόρησης. Ο πολυμορφισμός μεταξύ των διαφορετικών ατόμων που εμφανίζεται σαν διαφορά στο πρότυπο ζωνών της ηλεκτροφόρησης μπορεί να οφείλεται σε αλλαγές στη θέση πρόσδεσης του εκκινητή, με αποτέλεσμα αποτυχία πολλαπλασιασμού του τμήματος και εμφάνιση της ζώνης, και σε προσθήκη/ απαλοιφή βάσεων στο ενδιάμεσο των πολλαπλασιασμένων τμημάτων, που οδηγεί στη διαφοροποίηση του μήκους της αλληλουχίας που ενισχύεται. Σε κάθε αντίδραση μπορεί να ενισχύονται περισσότερες από μια ζώνες γεγονός που δηλώνει ότι μπορεί να αναλύονται περισσότερα του ενός αλληλόμορφα. Οι δείκτες RAPD συμπεριφέρονται σαν κυρίαρχοι χαρακτήρες που σημαίνει ότι ένα αλληλόμορφο που 23

ενισχύεται εμφανίζεται σαν μια ζώνη τόσο σε ομόζυγη όσο και σε ετερόζυγη κατάσταση, ενώ το αλληλόμορφο που δεν ενισχύεται δεν μπορεί να ανιχνευθεί (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Οι δείκτες RAPD έχουν χρησιμοποιηθεί σε αρκετές έρευνες για την ταυτοποίηση ποικιλιών της αμπέλου (Collins and Symons 1993, Jean-Jaques et al., 1993, Grando et al., 1995, Moreno et al., 1995). Ο DNA πολυμορφισμός που παράγεται με την τεχνική RAPD (Wllians et al., 1990, Welsh and McClelland 1990) έχει σπουδαίο ενδιαφέρον γιατί η τεχνική απαιτεί ελάχιστες ποσότητες DNA, είναι εύκολη, γρήγορη και ικανή να ανιχνεύει υψηλό βαθμό γενετικών διαφορών. Επιπλέον, με τους δείκτες RAPD μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε DNA χαμηλότερης ποιότητας (Gogorcena et al., 1993). Επομένως, μπορεί να εφαρμοστεί στην ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων δίνοντας σημαντική πληροφορία για πολυμορφισμούς χωρίς να χρειάζεται προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας των διαφορετικών αλληλόμορφων (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Παρ όλα αυτά, η δυσκολία στην τυποποίηση της διαδικασίας RAPD εξαιτίας της διαφοράς στην ποιότητα DNA, στην συγκέντρωση των εκκινητών, στις DNA πολυμεράσες και στον θερμοκυκλωτή (Buscher et al., 1993, McPearson et al., 1993) παρεμποδίσουν την σύγκριση των αποτελεσμάτων μεταξύ των εργαστηρίων, 1.4.4 Πολυμορφισμός Μήκους Ενισχυμένων Τμημάτων (AFLP Amlified Fragment Length Polymorphism) Οι Vos et al. (1995), εισήγαγαν ένα νέο εργαλείο στη μοριακή ανάλυση, τους δείκτες AFLP που χρησιμοποιούνται ευρέως για τη γενετική χαρτογράφηση και για την ανάλυση των γενετικών σχέσεων ανάμεσα σε διαφορετικά δείγματα (Lambra et al., 1999) και την μεταβλητότητα μέσα σε μια ποικιλία. Το σύστημα δεικτών AFLP βασίζεται στον πολυμορφισμό των τμημάτων κοπής του συνολικού DNA με περιοριστικά ένζυμα, όπως και οι δείκτες RFLP, με τη διαφορά ότι η αναγνώριση των τμημάτων αυτών δεν γίνεται με υβριδισμό αλλά με PCR. Η τεχνική χρησιμοποιεί προσαρμοστές που συνδέονται με τη βοήθεια του ενζύμου λιγάση με τα άκρα των τμημάτων που προκύπτουν από κατεργασία με δύο συνήθως περιοριστικά ένζυμα, που το ένα αναγνωρίζει θέσεις τεσσάρων και το άλλο θέσεις έξι βάσεων. Στη συνέχεια γίνεται αντίδραση PCR με μήτρα τα τμήματα αυτά και εκκινητές που είναι συμπληρωματικοί με την αλληλουχία των προσαρμοστών. Τα προϊόντα την 24

αντίδρασης επισημαίνονται με ραδιενεργά ή φθορίζοντα νουκλεοτίδια και οπτικοποιούνται με ηλεκτροφόρηση πηκτής ακριλαμίδης. Η τεχνική παράγει μεγάλη πυκνότητα δεικτών αφού στην ηλεκτροφόρηση ξεχωρίζουν 50-100 ζώνες που κάθε μια αντιστοιχεί σε έναν AFLP δείκτη (που επισημαίνει τη θέση ενός αλληλόμορφου). Έτσι η τεχνική έχει το πλεονέκτημα να ανιχνεύει μεγάλο αριθμό δεικτών σε μια αντίδραση χωρίς προαπαιτούμενη γνώση της αλληλουχίας ή τη χρήση ιχνηλάτη (Τσαυτάρης κ αλ., 2012). Επιπλέον ενισχύει την πιθανότητα αναγνώρισης σημειακών μεταλλάξεων και αυτό μπορεί να βοηθήσει στον κλωνικό διαχωρισμό μέσα σε μια ποικιλία (Cervera et al., 2000). Επίσης είναι λιγότερο ευαίσθητη από τα RAPDs σε διακυμάνσεις των συνθηκών της PCR με αποτέλεσμα να έχει καλύτερη επαναληψιμότητα, είναι όμως τεχνικά πιο απαιτητική. Οι δείκτες που ανιχνεύονται είναι όπως και οι RAPDs κυρίαρχοι και μονοαλληλικοί (το ένα αλληλόμορφο ανιχνεύεται ενώ το άλλο όχι) (Τσαυτάρης κ. συν., 2012). Όμως η ποιότητα από το εξαγόμενο DNA και η μέθοδος εξαγωγής μπορούν να επηρεάσουν το προφίλ που θα αποκτήσουμε (Jones et al., 1997, Reineke et al., 1998, Boiteux et al., 1999) επειδή ορισμένα είδη προσμίξεων στο DNA μπορούν να μειώσουν την δραστηριότητα του περιορισμού από τις ενδονουκλεάσες, πολυμεράσες και λιγάσες (Shioda and Marakami Muofushi 1987, Do and Adams 1991). Έτσι λοιπόν, μπορεί να δούμε για τον ίδιο γενότυπο τα προφίλ AFLP να είναι διαφορετικά εξαιτίας της μεθόδου εξαγωγής DNA που χρησιμοποιήθηκε (Benjak et al., 2006). Επιπλέον, διαφορετικοί τύποι ιστών μπορεί να δώσουν διαφορετικά AFLP προφίλ (Boiteux et al., 1999, Aranzana et al., 2001, Arnav et al., 2002). Για τους λόγους αυτούς, η τεχνική με δείκτες AFLP απαιτεί υψηλή ποιότητα DNA( π.χ. μόρια με μεγάλο μοριακό βάρος και απουσία μολυσματικών συστατικών) η οποία βέβαια στο αμπέλι είναι πολύ δύσκολο να αποκτηθεί εξαιτίας της παρουσίας σημαντικών ποσοτήτων πολυσακχαριτών και / ή πολυφαινολικών συστατικών (Steenkamp et al., 1994). Παρ όλα αυτά, η τεχνική αυτή όπως είπαμε και προηγουμένως έχει χρησιμοποιηθεί για προσδιορισμό κλώνων αλλά και ποικιλιών (Cervera et al., 1998,2000, Vignani et al., 2002, Popescu et al., 2002). 25

1.4.5 Μικροδορυφόροι (microsatellites) ή Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR) και Απλές Γραμμικές Επαναλήψεις (STR) Οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν πολλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες στο DNA τους. Τέτοιες μικρές επαναλήψεις αλληλουχιών 2-5 νουκλεοτιδίων που επαναλαμβάνονται 5-100 φορές έχουν ονομαστεί με πολλά διαφορετικά ονόματα όπως μικροδορυφόροι, απλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Simple Sequence Repeats, SSR), απλές γραμμικές επαναλήψεις (Simple Tandem Repeats, STR), γραμμικές επαναλήψεις ποικίλων νουκλεοτιδίων (Variable Nucleotide Tandem Repeats, VNTR), και αποτελούν εξαιρετική πηγή γενετικών δεικτών καθώς παρουσιάζουν υψηλή παραλλακτικότητα ως προς τον αριθμό επαναλήψεων σε πολλούς οργανισμούς. Έτσι, για παράδειγμα, μια αλληλουχία ενός δινουκλεοτιδίου AG μπορεί να επαναλαμβάνεται 20 φορές σε συγκεκριμένη θέση στο DNA ενός αλληλόμορφου και στο άλλο αλληλόμορφο 30 φορές. Η ανίχνευση αυτών των διαφορών μπορεί να γίνει εύκολα με PCR αν ενισχύσουμε την περιοχή των επαναλήψεων χρησιμοποιώντας διαφορετικούς εκκινητές ομόλογους με αλληλουχίες εκατέρωθεν της επανάληψης. Τότε, υποθέτοντας ότι η αλληλουχία της περιοχής είναι η ίδια στα δύο αλληλόμορφα και ότι η μόνη διαφορά οφείλεται στον αριθμό επαναλήψεων του δινουκλεοτιδίου, τα ενισχυμένα τμήματα θα έχουν διαφορά μήκους 20 νουκλεοτίδια που είναι εύκολο να ανιχνευτεί σε μια ειδική πηκτή αγαρόζης υψηλής διαχωριστικής ικανότητας. Βέβαια η κάθε προσθήκη/ απαλοιφή νουκλεοτιδίων που μπορεί να έχει συμβεί ανάμεσα στις θέσεις εκκινητών μπορεί να ανιχνευτεί σαν παραλλακτικότητα. Η τεχνική δίνει απλούς συγκυρίαρχους δείκτες, μιας γονιδιακής θέσης, με μεγάλη παραλλακτικότητα, και υψηλή επαναληψιμότητα, αλλά απαιτεί προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας της περιοχής για σχεδιασμό των εκκινητών. Αυτό είναι σημαντικό εγχείρημα και αποτελεί μειονέκτημα της τεχνικής όταν εμφανίζεται σε οργανισμούς που δεν έχουν αλληλουχηθεί. Η ανάπτυξη των μικροδορυφόρων στο γονιδίωμα του αμπελιού αναφέρθηκε πρώτα από τους Thomas and Scott (1993) και Bowerset al. (1996). Οι μελέτες αυτές περιγράφουν ένα μεγάλο αριθμό αλληλόμορφων καθώς και έναν υψηλό βαθμό ετεροζυγωτίας στο αμπέλι και έτσι παρέχεται μια αξιόλογη δύναμη για τον ακριβή διαχωρισμό των ποικιλιών. Η άφθονη και τυχαία κατανομή των μικροδορυφόρων, ο υψηλός πολυμορφισμός, η συγκυρίαρχη Μενδελική κληρονόμηση, η επαναληψιμότητα (που 26

επιτρέπει την ανταλλαγή δεδομένων ανάμεσα σε εργαστήρια ανά τον κόσμο) και η ευκολία της βαθμολόγησης τους καθιστούν ιδανικούς δείκτες για πολλές εφαρμογές. Επιπλέον, επιδέχονται και αυτοματισμό (Thomas and Scott 1993, Thomas et al., 1994). Έχουν χρησιμοποιηθεί πολύ στην χαρτογράφηση των ποικιλιών της αμπέλου (Doligez et al., 2006, Di Gaspero et al., 2007) και στην γενετική ανάλυση (Thomas and Scott 1993, Cipriani et al. 1994, Bowers et al. 1996, Maletic et al. 1999, Sefc et al. 2000, Crespan and Milani 2001, Pellerone et al. 2001, Rosseto et al. 2002 Zulini et al. 2002, Hvarleva et al. 2004), στην αξιολόγηση των γενετικών σχέσεων ανάμεσα σε άτομα και την καταγωγή τους (Sefc et al., 1997, Bowers et al., 1999, Vouillamoz et al., 2003, Tapia et al., 2007), για την ταυτοποίηση ποικιλιών και για την διασαφήνιση συνωνύμων και ομωνύμων (Regner et al., 2000, Fossati et al., 2001, Labra et al., 2001, Imazio et al., 2002, This et al., 2004, Maletic et al., 2004), για την διάκριση των κλώνων (Cabezas et al., 2003), για τον χαρακτηρισμό ποικιλιών της αμπέλου στις συλλογές (Dangl et al., 2001, Ibanez et al., 2003, Lopes et al., 1999, Martin et al., 2003, Ortiz et al., 2004). Τέλος έχει μελετηθεί και η γεωγραφική κατανομή των γενοτύπων (Arroyo Garcia et al., 2002,2006, Grassi et al., 2003,2006, Imazio et al., 2005). Όμως οι μικροδορυφόροι δεν είναι ισχυρά εργαλεία για την ανίχνευση των σωμακλωνικών διαφορών στο Vitis vinifera (Schellenbaum et al., 2008). 1.5 Σκοπός της εργασίας Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι να ταξινομηθούν και να διερευνηθούν μερικές ελληνικές ποικιλίες της καλλιεργούμενης αμπέλου (Vitis vinifera L.). Η μελέτη και η σύγκριση των ποικιλιών αυτών έγινε με βάση τόσο την κλασσική αμπελογραφία (καταγραφή των αμπελογραφικών και φαινολογικών χαρακτηριστικών), όσο και με την χρήση μοριακών δεικτών, συγκεκριμένα με την χρήση μικροδορυφόρων (microsatellites) ή Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR). 27

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Φαινοτυπικές αναλύσεις των χαρακτηριστικών της σταφυλής Για τον προσδιορισμό των χαρακτηριστικών της σταφυλής έγινε προεπιλογή των σταφυλιών. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε από την Αμπελογραφική Συλλογή του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης το έτος 2012. Όλες οι ποικιλίες ήταν εμβολιασμένες στο υποκείμενο 110R. Για τον καθορισμό της εποχής ωρίμανσης, κάθε εβδομάδα ελήφθησαν δείγματα (50-100 ράγες) και αναλύθηκαν ως προς τους βαθμούς Brix και την ολική οξύτητα. Η πλήρης ωρίμανση διαπιστώθηκε όταν η περιεκτικότητα των ζαχάρων σταθεροποιήθηκε και όταν οι πρώτες ράγες παρουσιάσαν συμπτώματα αφυδάτωσης. 2.1.1. Δειγματοληψία και αναλύσεις κατά την ωρίμανση Συλλέχθηκαν 6-9 αντιπροσωπευτικές σταφυλές και χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες των δύο- τριών σταφυλών. Στη συνέχεια από κάθε ομάδα ελήφθησαν 10 ράγες από το μέσον της σταφυλής κανονικού μεγέθους για τις φαινολικές αναλύσεις (τρεις επαναλήψεις των 10 ραγών). Από το υπόλοιπο των τριών ομάδων σταφυλιών ελήφθησαν δείγματα για αναλύσεις σακχάρων ( ο Brix) και ολικής οξύτητας. Οι αναλύσεις που έγιναν είναι οι εξής: 1. Βάρος σταφυλής: Τα σταφύλια που συλλέχθηκαν, ζυγίστηκαν και μετρήθηκε το μήκος και το πλάτος τους. 2. Brix: Μετρήθηκε με παρατήρηση στο σακχαροδιαθλασίμετρο. 3. Τιτλοδοτούμενη (ολική) οξύτητα: Τοποθετήθηκαν 7,5ml γλεύκους σε ένα κατάλληλο σκεύος πορσελάνης και προστέθηκαν 5-7ml νερού αποσταγμένου. Προστέθηκανι μερικές σταγόνες δείκτη βρωμοθυμόλης και έγινε εξουδετέρωση σε ph 7 (πράσινο χρώμα) (κίτρινο σε ph όξινο και μπλε σε ph βασικό). Η εξουδετέρωση έγινε με 0,1N Na(OH). Ο όγκος του 0,1N Na(OH) έδωσε και την ολική οξύτητα εκφρασμένη σε ισοδύναμα τρυγικού οξέος. 4. Μέγεθος και βάρος ράγας: Ζυγίστηκαν 10 ράγες και με το παχύμετρο μετρήθηκε το μήκος και το πλάτος των ραγών. 5. Βάρος φλοιών: Ξεχωρίστηκε ο φλοιός από τις δέκα ράγες συμπιέζοντας τη ράγα μεταξύ του αντίχειρα και του δείκτη. Αποξηράθηκαν για λίγο οι φλοιοί 28

σε μαλακό χαρτί χωρίς να χαθούν οι ανθοκυάνες και στη συνέχεια ζυγίστηκαν. 6. Αριθμός και βάρος γιγάρτων: Από τις ίδιες 10 ράγες ξεχωρίστηκαν τα γίγαρτα, μετρήθηκε ο αριθμό τους και μετά ζυγίστηκαν. 7. Περιεκτικότητα των φλοιών σε ανθοκυάνες: Αφού ζυγίστηκαν οι φλοιοί τοποθετήθηκαν σε 20ml υδραλκοολικού διαλύματος αιθανόλης και υδροχλωρικού (70% αιθανόλη, 29% νερό, 1% πυκνό HCI 37%) και αφέθηκαν για μια νύχτα. Την επόμενη μέρα ξεχωρίστηκαν τα στερεά συστατικά από το υδραλκοολικό διάλυμα των φλοιών και μετρήθηκαν οι ανθοκυάνες. ( Μετά το ζύγισμα οι φλοιοί τοποθετήθηκαν αμέσως στο υδραλκοολικό διάλυμα για να αποφευχθούν οι οξειδώσεις). Η μέτρηση των ανθοκυανών έγινε σε φασματοφωτόμετρο στα 540nm και χρησιμοποιήθηκαν πλαστικές κυψελίδες. Μια τιμή στη μέτρηση μέχρι 1 είναι αποδεκτή εάν όμως είναι υψηλότερη του 1 τότε πρέπει να γίνει αραίωση με υδραλκοολούχο διάλυμα (70%αιθανόλη, 29% νερό, 1% πυκνό HCI 37%). Υπολογίστηκε η περιεκτικότητα χρησιμοποιώντας την εξίσωση: Ολικές ανθοκυάνες(mg/l)= E5401cm X 16,7 X d (d=αραίωση). 8. Περιεκτικότητα των φλοιών και των γιγάρτων σε φαινολικά συστατικά: Αφού ζυγίστηκαν οι φλοιοί και τα γίγαρτα τοποθετήθηκαν σε 20ml υδραλκοολικού διαλύματος αιθανόλης και υδροχλωρικού (70% αιθανόλη, 29% νερό, 1% πυκνό HCI 37%) και αφήθηκαν για μια νύχτα. Την επόμενη μέρα ξεχωρίστηκαν τα στερεά συστατικά από το υδραλκοολικό διάλυμα των φλοιών και των γιγάρτων και μετρήθηκαν τα φαινολικά συστατικά. ( Μετά το ζύγισμα οι φλοιοί και τα γίγαρτα τοποθετήθηκαν αμέσως στο υδραλκοολικό διάλυμα για να αποφευχθούν οι οξειδώσεις). Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε έναν ογκομετρικό κύλινδρο των 10ml περίπου 2,5ml νερό και προστέθηκε 0,5ml αραιωμένο εκχύλισμα (εάν η τελική μέτρηση της απορρόφησης είναι πάνω από 1 γίνεται μεγαλύτερη αραίωση με υδραλκοολούχο διάλυμα (70%αιθανόλη, 29% νερό, 1% πυκνό HCI 37%) και 0,5ml αντιδραστήριο Folin Ciocalteu. Μετά από 3-5 λεπτά προστέθηκανι 2ml διαλύματος 10% Na2CO3. Ο ογκομετρικός κύλινδρος συμπληρώθηκε μέχρι τα 10ml με νερό. Μετά από 90 λεπτά μετρήθηκε στα 700nm (σύγκριση με ένα άχρωμο χωρίς όμως το εκχύλισμα). Οι ολικές φαινόλες εκφράζονται σε mg/l κατεχίνης από τη εξίσωση: Catechin (mg/l)= 186,5 X E700 X d (d=αραίωση). 29

2.2 Στατιστική ανάλυση Με τη βοήθεια του στατιστικού προγράμματος SPSS software (version 14.0, SPSS Inc., IL, USA) πραγματοποιήθηκε η ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) των παραμέτρων που μετρήθηκαν. Επίσης μελετήθηκε η συσχέτιση των παραμέτρων που μετρήθηκαν. 2.3 Φυτικό υλικό για την απομόνωση του DNA Η εφαρμογή μοριακών δεικτών απαιτεί το DNA που θα απομονώσουμε από τα φυτά να είναι όσο το δυνατόν πιο καθαρό έτσι ώστε να έχουμε σωστά αποτελέσματα. Σε ορισμένα όμως φυτά, ανάμεσα στα οποία και στην άμπελο, η παρουσία πολυφαινολών και πολυσακχαριτών (Steenkamp et al., 1994) καθιστούν την απομόνωση του DNA και την PCR προβληματικές (Bryant, 1997). Επιπλέον τα χημικά συστατικά ποικίλουν ανάμεσα στις ποικιλίες, στους ιστούς ακόμα και ανάμεσα στις εποχές και γιαυτό πρέπει από όλα τα υπό εξέταση φυτά να παίρνουμε το ίδιο δείγμα ιστού και να εφαρμόζουμε την ίδια μέθοδο εξαγωγής του DNA. Για τους λόγους αυτούς, η συλλογή των φυτικών ιστών (φύλλα της κορυφής του βλαστού) έγινε την άνοιξη του έτους 2011 από ποικιλίες της Αμπελογραφικής Συλλογής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Από τα νεαρά αυτά φύλλα είναι ευκολότερο να πάρουμε καλύτερη ποιότητα DNA γιατί τα χημικά συστατικά είναι ακόμα σε πολύ μικρές ποσότητες. Μετά τη συλλογή τα δείγματα διατηρήθηκαν σε κατάψυξη στους -80 ο C. 2.4 Απομόνωση DNA Αρχικά έγινε λειοτρίβιση των φύλλων σε μικρό πορσελάνινο γουδί (Εικόνα 1) έτσι ώστε να έχουν πλέον την μορφή σκόνης με τη χρήση υγρού αζώτου. Η σκόνη αυτή των φύλλων τοποθετήθηκε σε ειδικά φιαλίδια (tubes)( Εικόνα 2). CTAB: Στη συνέχεια η απομόνωση του DNA έγινε με την εφαρμογή της μεθόδου Προστέθηκαν στο φιαλίδιο 800μl διάλυμα εκχύλισης CTAB και 10 μl β- μερκαπτοαιθανόλη. Ακλούθησε έντονη ανάμιξη. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν τα φιαλίδια σε υδατόλουτρο στους 65 ο C για 30 λεπτά. Αφού βγήκαν τα φιαλίδια από το υδατόλουτρο τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο στις 14000rpm για 10 λεπτά. Από εκεί διαχωρίστηκε η υπερκείμενη φάση και τοποθετήθηκε σε καινούργιο φιαλίδιο. Στη συνέχεια στα αρχικά φιαλίδια προστέθηκαν 800μl χλωροφόρμιο (ποσότητα ίση με το διάλυμα εκχύλισης CTAB) και ακολούθησε έντονη ανάμιξη. Τοποθετήθηκαν τα φιαλίδια ξανά στην φυγόκεντρο στις 7000rpm για 20 λεπτά και διαχωρίστηκε πάλι η υπερκείμενη φάση σε νέο φιαλίδιο. 30

Έπειτα, στα αρχικά πάλι φιαλίδια προστέθηκε ισοπροπανόλη, έγινε ανάμιξη και αφέθηκαν στους -20 ο C για 30 λεπτά έτσι ώστε να κατακρημνιστεί το DNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση και δημιουργήθηκε DNA pellet. Προστέθηκε 1ml καθαρής αιθανόλης, ακολούθησε έντονη ανάμιξη και τοποθετήθηκαν στη φυγόκεντρο στις 10.000rpm για 15 λεπτά. Επαναλήφθηκε το βήμα αυτό αλλά με 70% αιθανόλη. Μετά αφέθηκαν τα φιαλίδια ανοιχτά σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά έτσι ώστε να εξατμιστεί όλη η αιθανόλη. Τέλος, προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) ελαφρώς αλκαλικό ph περίπου 8 για να διαλυθεί το DNA και αποθηκεύθηκαν τα φιαλίδια στους -20 ο C - -80 o C. Την επόμενη μέρα, τα φιαλίδια τοποθετήθηκαν στην φυγόκεντρο στις 10.000rpm για 30 δευτερόλεπτα έτσι ώστε τα στερεά υπολείμματα να δημιουργήσουν ένα pellet στη βάση του φιαλιδίου. Το υπερκείμενο υγρό περιέχει το DNA και είναι αυτό που χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια. 2.5 Προσθήκη εκκινητών και PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) Η PCR πραγματοποιείται έτσι ώστε να γίνει πολλαπλασιασμός του επιλεγμένου τμήματος DNA. Έτσι, σε μικρά φιαλίδια (eppenderf) (Εικόνα 3) κατάλληλα για την PCR τοποθετούμε: 1μl DNA από το δείγμα που θέλουμε 1,5μl buffer το οποίο είναι ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο δημιουργεί το κατάλληλο περιβάλλον για να δράσει το ένζυμο 0,2μl dntps το οποίο είναι νουκλεοτίδια που δρουν ως δομικά στοιχεία 0,2μl από τον εκκινητή που θα χρησιμοποιήσουμε 0,2μl ένζυμο Taq πολυμεράση το οποίο επεκτείνει τις συμπληρωματικές αλυσίδες 11,9μl H2O Στην συνέχεια τα φιαλίδια τα βάζουμε σε θερμοκυκλωτή (Εικόνα 4). Οι εκκινητές που χρησιμοποιήσαμε είναι οι εξής: VVS2 F cagcccgtaaatgtatccatc R aaattcaaaattctaattcaactgg 52 0 C VrZAG62 F ggtgaaatgggcaccgaacacacgc R ccatgtctctcctcagcttctcagc 50 0 C VrZAG67 F acctggcccgactcctcttgtatgc R tcctgccggcgataaccaagctatg 52 0 C VrSZAG79 F agattgtggaggagggaacaaaccg R tgcccccattttcaaactcccttcc 52 0 C VVMD5 F ctagagctacgccaatccaa R tataccaaaaatcatattcctaaa 52 0 C VVMD7 F agagttgcggagaacaggat R cgaaccttcacacgcttgat 52 0 C VVMD27 F gtaccagatctgaatacatccgtaagt R acgggtatagagcaaacggtgt 52 0 C VVMD28 F aacaattcaatgaaaagagagagagaga R tcatcaatttcgtatctctatttgctg 54 0 C VVMD32 F tatgattttttaggggggtgagg R ggaaagatgggatgactcgc 52 0 C 31