9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ ΠρΩτη προσεγγιση για την ανιχνευση οκαδαϊκου οξεος με αμπερομετρικο ανοσοαισθητηρα: ΕφαρμογΗ σε δειγματα καλλιεργειων Γιαννούδη Λ. 1, Βαρκιτζή Ι. 1, Πέτρου Π. 2, Πυργάκη Χ. 1, Ανθούλα Μ. 1, Παυλίδου Α. 1, Χατζηανέστης Γ. 1, Κακαμπάκος Σ. 2, Πάγκου Κ. 1 1 Ινστιτούτο Ωκεανογραφίας, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών, lgiannoudi@ath.hcmr.gr 2 Ινστιτούτο Ραδιοϊσότοπων και Ραδιογνωστικών προϊόντων, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος, ypetrou@rrp.demokritos.gr Περίληψη Η παρούσα ερευνητική εργασία έχει ως στόχο την ανάπτυξη ενός βιοαισθητήρα για την άμεση μέτρηση φυκοτοξινών και την πιθανή χρησιμοποίηση του σαν συσκευή πολλαπλής ανάλυσης. Οι τοξίνες αυτές έχουν βρεθεί παγκοσμίως σε υδατικά οικοσυστήματα κατά την διάρκεια Επιβλαβών Φυτοπλαγκτονικών Εξάρσεων που προκαλούνται από ορισμένα είδη φυτοπλαγκτού και αποτελούν απειλή για την ανθρώπινη υγεία λόγω της μεταφοράς τους μέσα στα τροφικά πλέγματα.. Για την εργασία αυτή χρησιμοποιήθηκε ένας αμπερομετρικός αισθητήρας μαζί με ηλεκτρόδια εκτυπωμένα σε οθόνη, ο οποίος είχε προηγουμένως δοκιμαστεί με ανοσοδοκιμές για την ανίχνευση φυτοπλαγκτονικών τοξινών, όπως το οκαδαϊκό και το δομοϊκό οξύ. Η μέχρι τώρα χημική ανίχνευση των τοξινών γίνεται με υγρή χρωματογραφία, τεχνική που είναι ανεπαρκής για δείγματα πεδίου, λόγω μειωμένης ευαισθησίας σε περιβαλλοντικά δείγματα. Οι εργαστηριακές δοκιμές με την Τεχνική Ενζυμικού Ανοσοπροσδιορισμού (ELISA) έδωσαν όριο ανίχνευσης για το οκαδαϊκό οξύ τα 0.1 ng/ml στις μετρήσεις σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης. Τα πειράματα αυτά μεταφέρθηκαν στα εκτυπωμένα σε οθόνη ηλεκτρόδια, για μια απλουστευμένη ανίχνευση των τοξινών σε πειραματικές καλλιέργειες τοξικών ειδών, αλλά και σε δείγματα πεδίου. Λέξεις κλειδιά: βιοαισθητήρες, τοξίνες, φυτοπλαγκτόν, αντισώματα. first approach to an okadaic amperometric immunosensor: application to culture samples. Giannoudi L. 1, Varkitzi I. 1, Petrou P. 2, Pyrgaki C. 1, Anthoula M. 1, Paulidou A. 1, Chatzianestis G. 1, Kakabakos S. 2, Pagou K. 1 1 Institute of Oceanography, Hellenic Centre for Marine Research, lgiannoudi@ath.hcmr.gr 2 Institute of Radioisotope and Radiognostic Products, EKEFE Demokritos, ypetrou@rrp.demokritos.gr Abstract A biosensor is being developed for the rapid detection of toxins and its potential use as a multianalyte device. These seafood toxins pose a threat to human health as they are currently found worldwide during Harmful Algal Blooms (HABs) of certain phytoplankton species and they can accumulate in the food web. For this study, an amperometric sensor using screen-printed electrodes has been coupled with antibodies that have been previously tested with an immunoassay procedure, in order to detect HAB toxins, such as okadaic acid (OA) and domoic acid (DA). Currently their detection is performed mainly through HPLC/LCMS, which is an inappropriate procedure for on-site testing, as it is not sensitive enough for environmental samples. ELISA experiments performed in the laboratory have shown a detection limit of OA 0.1 ng/ml in a microtitre plate format. These experiments have been transferred to the screen printed electrodes for a simplistic detection of the toxins both in laboratory cultures of toxic species and in field samples. Keywords: biosensors, toxins, phytoplankton, antibodies. 1. Εισαγωγή Οι βιοαισθητήρες (biosensors) είναι ισχυρά εργαλεία που στοχεύουν στην ανίχνευση και τον επιλεκτικό προσδιορισμό τοξικών χημικών ενώσεων, οι οποίες περιέχονται σε ελάχιστες ποσότητες σε βιομηχανικά προϊόντα, χημικές ουσίες, περιβαλλοντικά δείγματα (π.χ. αέρας, χώμα, και ύδατα) ή οργανισμούς. Κύριος στόχος της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση των αναλώσιμων μικρογραφημένων αισθητήρων (βιοαισθητήρες) για τη μέτρηση φυτοπλαγκτονικών -1279-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ τοξινών, όπως το οκαδαϊκό οξύ. Απώτερος σκοπός είναι οι βιοαισθητήρες να μπορούν να χρησιμοποιηθούν από βιομηχανικούς φορείς μαζικής παραγωγής για την ανίχνευση των φυτοπλαγκτονικών τοξινών, που παράγονται κατά τη διάρκεια εμφάνισης των Επιβλαβών Φυτοπλαγκτονικών Εξάρσεων (ΕΦΕ). Μέχρι τώρα, η ύπαρξη των τοξινών ελέγχεται έμμεσα με τη χρήση εργαστηριακών αναλύσεων, όπως είναι: α) η μικροσκοπική ανάλυση γιά την ποσοτική και ποιοτική αναγνώριση δυνητικά τοξικών ειδών (χρονοβόρα μέθοδος που απαιτεί υψηλή εξειδίκευση), ή β) πρόσφατα η χρήση μοριακών τεχνικών για τη γρήγορη αναγνώριση δυνητικά τοξικών ειδών με αντισώματα ή μοριακους δείκτες (molecular probes), η οποία ωστόσο δεν τυγχάνει ακόμη εκτεταμένης χρήσης, αν και είναι πολλά υποσχόμενη μέθοδος. Άμεσα οι τοξίνες ανιχνεύονται α) με χημικές αναλύσεις (πχ: HPLC - Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης, LC/MS - Υγρή Χρωματογραφία/Φασματογραφία Μάζας), οι οποίες ωστόσο εμφανίζουν προβλήματα μεθοδολογικά, όπως εκχύλιση και «παραγοντοποίηση», είναι μέθοδοι χρονοβόρες, αν και ποιοτικά-ποσοτικά ακριβείς, απαιτούν υψηλή εξειδίκευση, β) με τη χρήση βιοδοκιμών σε ποντίκια (όχι εξειδικευμένη μέθοδος, έλλειψη επαναληψιμότητας, προβλήματα ηθικής). Οι αναλύσεις αυτές, με την εξαίρεση των μοριακών τεχνικών (molecular probes), παράγουν μια καθυστερημένη απάντηση στην ανίχνευση φυτοπλαγκτονικών τοξινών στο θαλασσινό νερό. Έτσι καθορίστηκε ως στόχος στην παρούσα ερευνητική εργασία η ανάπτυξη του βιοαισθητήρα, που συνδυάζει την εφαρμογή αμπερομετρικών ηλεκτροδίων ενός ποτενσιοστάτη με ακινητοποιημένο υλικό που προκύπτει από πειράματα ανοσοδοκιμών (ELISA) και δοκιμάστηκε σε δείγματα φυκοτοξινών από πειραματικές καλλιέργειες. Μέχρι τώρα υπάρχουν διεθνώς δύο αναφορές σε ανοσοβιολογικούς αμπερομετρικούς αισθητήρες, χωρίς όμως ουσιαστικά να έχουν γίνει μετρήσεις σε δείγματα ή πειραματικές καλλιέργειες (Kreuzer et al., 2002; Campàs et al., 2008). Ο ιδανικός αισθητήρας για τις φυκοτοξίνες πρέπει να είναι απλός, οικονομικά αποδοτικός, ιδιαίτερα ευαίσθητος και εξειδικευμένος, ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί γιά προειδοποίηση πιθανού κινδύνου τοξικού επεισοδίου σε πραγματικό χρόνο (real time warning). Επίσης, ο αισθητήρας πρέπει να βελτιστοποιηθεί σε πραγματικές περιβαλλοντικές συνθήκες (κατά την διάρκεια εμφάνισης ΕΦΕ στο πεδίο) και να δοκιμαστεί στα θαλάσσια παράκτια περιβάλλοντα που θα χρησιμοποιηθεί, γιατί είναι απαραίτητο να ανταποκρίνεται στα χαρακτηριστικά τους, όπως είναι τα φορτία των θρεπτικών αλάτων, το κλίμα, η κυκλοφορία, κ.λπ. Τέτοιος αισθητήρας θα μπορούσε να εφαρμοστεί αργότερα ως σύστημα έγκαιρης προειδοποίησης, ειδικά σε περιοχές υδατοκαλλιεργειών (π.χ. στο Θερμαϊκό κόλπο). Οι σημαντικότερης έκτασης ΕΦΕ στην Ελλάδα παρατηρούνται στο Θερμαϊκό Κόλπο, αρκετές φορές ετησίως εξαιτίας κυρίως του τοξικού είδους Dinophysis acuminatα, που παράγει οκαδαϊκό οξύ, και μάλιστα με τεράστιες οικονομικές επιπτώσεις. Δυστυχώς όμως γνωρίζουμε σχετικά λίγα για τις ΕΦΕ της D. acuminata, καθώς είναι είδος που δεν καλλιεργείται στις συνήθεις εργαστηριακές συνθήκες και επομένως μπορεί να μελετηθεί μόνο in situ. To δινομαστιγωτό Prorocentrum lima (Ehrenberg) Dodge, παραγωγός οκαδαϊκού οξέος επίσης, χρησιμοποιήθηκε για την εργασία αυτή ως είδος που έχει ενοχοποιηθεί για την εμφάνιση ΕΦΕ σε διάφορες παράκτιες περιοχές παγκοσμίως. Σε ελληνικές παράκτιες περιοχές, το P. lima έχει βρεθεί σε συνάφεια με μυδοκαλλιέργειες, χωρίς όμως να έχει συνδεθεί με κάποιο περιστατικό ΕΦΕ μέχρι στιγμής (Βαρκιτζή και συν., 2006). -1280-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ 2. Μεθοδολογία 2.1 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ ΕΝΖΥΜΙΚΟΥ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ (ELISA) Τα αντισώματα για τα πειράματα ανοσοδοκιμών αγοράσθηκαν από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ιρλανδίας (National University of Ireland, Galway), το οποίο αναπτύσσει μονόκλωνα αντισώματα για φυτοπλαγκτονικές τοξίνες σε πειραματικό στάδιο και σε συνεργασία με το τομέα βιοτεχνολογίας της Ιρλανδίας. Τα ανωτέρω αναφέρονται στην ιστοσελίδα τους (http://www.biotechnologyireland. com), καθώς επίσης ότι επέτυχαν την ανίχνευση του οκαδαϊκού οξέος σε μικρές συγκεντρώσεις, που δεν είναι ανιχνεύσιμες μέσω των γνωστών κυτίων βιοδοκιμών ELISA (assay kits). Τα αντισώματα αυτά έχουν επιδείξει και σύμπλοκη αντίδραση (cross-reactivity) σε ποσοστό 80% με το ανάλογο του οκαδαϊκού οξέος, που είναι η ένωση DTX1 (Δινοφυσιτοξίνη-1). Σύμφωνα με τα δεδομένα που στάλθηκαν (Εικ. 1), πραγματοποιήθηκε η αγορά του αντισώματος 14G4, που έδειξε μία ικανοποιητική καμπύλη απορρόφησης (%Β/Β 0 ) στα πειράματα ELISA. 140 120 100 80 2G6 3D2 5H4 7G4 9A3 13C2 14G4 19G8 %B/Bo 60 40 20 0 0.01 0.1 1 10 100 OA concentration (ng/ml) Εικ. 1: Καμπύλη απορρόφησης 8 διαφορετικών αντισωμάτων του οκαδαϊκού οξέος. Οι 8 διαφορετικοί κωδικοί των αντισωμάτων αντιστοιχούν σε 8 διαφορετικά αντισώματα της τοξίνης. 2.2 ΗΛΕΚΤΡΟΔΙΑ ΚΑΙ ΠΟΤΕΝΣΙΟΣΤΑΤΗΣ Ο ποτενσιοστάτης αναπτύχθηκε από την εταιρία Link Lab Ε.Π.Ε και είναι ικανός για μετρήσεις αμπερομετρίας και κυκλικής βολταμετρίας. Τα ηλεκτρόδια παρασκευάστηκαν στο Πανεπιστήμιο του Κράνφιελντ (University of Cranfield) της Αγγλίας χρησιμοποιώντας το μηχάνημα εκτύπωσης DEK 248. Τα εκτυπωμένα σε οθόνη ηλεκτρόδια (screen-printed electrodes) τυπώθηκαν επάνω σε φύλλα πολυεστέρα Melines πυκνότητας 250 μm (229 mm X 305 mm), που επιτρέπουν παραγωγή 60 έως 100 ηλεκτροδίων ανά φύλλο. Τα ηλεκτρόδια που είναι βασισμένα σε πολυμερή μελάνια (polymer based inks) μαζί με το πλαστικό υπόστρωμα απαιτούν ξήρανση σε θερμοκρασίες από 120 C έως 300 C. 2.3 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΦΥΤΟΠΛΑΓΚΤΟΝΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ Καλλιέργειες του δινομαστιγωτού Prorocentrum lima υπήρχαν ήδη διαθέσιμες στο εργαστήριο βιολογικών αναλύσεων φυτοπλαγκτού του Βιογεωχημικού εργαστηρίου του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας. Το γένος Prorocentrum περιλαμβάνει πολλά δυνητικά τοξικά είδη, τα οποία συνθέτουν τις εξής τοξίνες: οκαδαϊκό οξύ (okadaic acid, OA), δινοφυσιτοξίνες 1 και 2 (dinophysistoxin 1 και 2, -1281-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ DTX1 και DTX2) και τις ομόλογες ενώσεις τους. Το στέλεχος του P. Lima με κωδικό CCAP 1136/11 απομονώθηκε από τον κόλπο του Vigo, Ισπανία, Ατλαντικός Ωκεανός. Οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο f/2 σύμφωνα με τους Guillard & Ryther 1962, Guillard 1975, τροποποιημένο κατά Anderson et al., 1996. 3. Αποτελέσματα-Συζήτηση Πριν από τις δοκιμές των ηλεκτροδίων του βιοαισθητήρα για την άμεση ανίχνευση των τοξινών σε δείγματα πειραματικών καλλιεργειών και ακολούθως σε δείγματα πεδίου, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε πλακίδια μικροτιτλοδότησης (microtitre plates) με την τεχνική του ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Τα ELISA είναι πειράματα που αφορούν στην ανίχνευση ενός αντισώματος ή ενός αντιγόνου σε ένα δείγμα. Στη παρούσα εργασία, το πείραμα αφορά στην ανταγωνιστική ανοσοδοκιμή (competitive immunoassay) μεταξύ του αντιγόνου (οκαδαϊκού οξέος) που είναι ακινητοποιημένο μαζί με το μη ανοσοποιημένο αντίσωμα και της ελεύθερης ρίζας του οκαδαϊκού, η οποία προστίθεται, και που συναγωνίζονται για το μονοκλωνικό αντίσωμα (mab). Συγκεκριμένα, στα πειράματα αυτά ένα υπόστρωμα αντιγόνου και μη ανοσοποιημένου αντισώματος ακινητοποιείται σε στερεά υποστήριξη (πλακίδια μικροτιτλοδότησης: microtiter plate) μέσω της προσρόφησης στην επιφάνεια, με την βοήθεια διαλύματος EDC (1-αίθυλο-3-(διμεθυλαμίνοπροπύλιο) υδροχλωρικό καρβοδιϊμίδιο= 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), που χρησιμοποιείται στην ένωση πρωτογενών αμινών (primary amines) για την δημιουργία δεσμών αμινών (amide bonds), και Sulfo-NHS (Σούλφο-Ν-υδροξυηλεκτριμίδιο = Sulfo-N-hydroxysuccinimide). Αυτά τα δύο μαζί χρησιμοποιούνται για την δημιουργία ανοσοσύζευξης (immunoconjugate), επειδή αυξάνουν την αποδοτικότητα της ή δημιουργούν ένα σταθερό προϊόν ελεύθερης αμινομάδας. Από τα πειράματα αυτά η ανίχνευση του οκαδαϊκού οξέος έφτασε τα 0.1 ng/ml. Τέτοιες συγκεντρώσεις ανιχνεύονται οριακά με υγρή χρωματογραφία/φασματοσκοπία μάζας (LC/MS) (Εικ. 2). Το σύμπλοκο του αντισώματος με το αντιγόνο ακινητοποιήθηκε στα ηλεκτρόδια, ακριβώς με την ίδια τεχνική που ακινητοποιήθηκε στα πλακίδια μικροτιτλοδότησης, δηλαδή με την χρησιμοποίηση της προσρόφησης στην επιφάνεια των ηλεκτροδίων με EDC/Sulfo-NHS. Η διαφορά με τα πειράματα ELISA είναι πως δεν μετρήθηκε στον ποτενσιοστάτη η απορρόφηση του ABTS (Εικ. 2), που θα χρειαζόταν την χρησιμοποίηση ειδικών LED (Light Emitting Diodes), αλλά μετρήθηκε η οξειδοαναγωγική αντίδραση που παράγεται μέσω του ενζύμου HRP, της ύπαρξης υπεροξειδίου του υδρογόνου και του οξειδοαναγωγικού μέσου TMB (tetramethylbenzidine). 120 OA 100 OA+DTX1 80 B/BO % at 405 nm 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 Conc. (ng/ml) Εικ. 2: Καμπύλη απορρόφησης προτύπου οξέος OA και OA + DTX1. Δείχνει την απορρόφηση (Abs) του ABTS στα 405 nm ανά την συγκέντρωση της τοξίνης σε ng/ml. -1282-
9 ο Πανελλήνιο Συμπόσιο Ωκεανογραφίας & Αλιείας 2009 - Πρακτικά, Τόμος ΙΙ Το ένζυμο υπεροξειδάση είναι ιδανικό από πολλές απόψεις για τις παραπάνω εφαρμογές, επειδή είναι μικρότερο, σταθερότερο και λιγότερο ακριβό από άλλες δημοφιλείς εναλλακτικές λύσεις, όπως η αλκαλική φωσφατάση (alkaline phosphatase). Στην περίπτωση του ELISA, αλλά και της αμπερομετρίας, το αντίσωμα παρέχει την εξειδίκευση για να εντοπίσει την υπό εξέταση πρωτεΐνη, και το ένζυμο HRP παρουσία ενός κατάλληλου υποστρώματος (Η 2 Ο 2 ) θα δώσει το σήμα. 2.0E-01 1.8E-01 1.6E-01 1.4E-01 1.2E-01 I (A) 1.0E-01 8.0E-02 6.0E-02 4.0E-02 2.0E-02 0.0E+00 0 2 4 6 8 10 12 OA+DTX1 ng/ml Εικ. 3: Αμπερομετρική μέτρηση ΟΑ + DTX1 στο δυναμικό οξειδοαναγωγής του TMB, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις τοξίνης σε ηλεκτρολυτικό διάλυμα 100 mm PBS με αλάτι 0.1 M KCl. Με τη χρήση του οξειδοαναγωγικού μέσου TMB, το δυναμικό της αντίδρασης μειώθηκε στα 100 mv, τιμή η οποία αποτρέπει τη παρεμπόδιση των μετρήσεων από ουσίες που οξειδοανάγωνται σε δυναμικά μεγαλύτερα της προαναφερθείσας τιμής. Οι μετρήσεις στον ηλεκτροχημικό ανοσοβιολογικό αισθητήρα (βιοαισθητήρα) σε πρότυπα οκαδαϊκού οξέος και DTX1, έδειξαν επίσης ευαισθησία της τάξεως 0.1 ng/ml (Εικ. 3). Στο Θερμαϊκό κόλπο, οι τιμές της τοξίνης του οκαδαϊκού οξέος σε δείγματα φυτοπλαγκτού με χαμηλές συγκεντρώσεις πληθυσμών του είδους Dinophysis acuminata (2003: 500 2200 κυτ./l, 2004: 600 10700 κυτ./l) ευρέθησαν κατά την περίοδο 2003 από 2.5 17.2 pg/ml και την περίοδο 2004 από 8.4 pg/ml 0.14 ng/ml (Reizopoulou et al., 2008). Συνεπώς το όργανο μπορεί ήδη να ανιχνεύσει άμεσα τιμές της τοξίνης σε φυσικά δείγματα ή κατόπιν μικρής προσυγκέντρωσης. Από τις μετρήσεις στα ηλεκτρόδια, οι τιμές των τοξινών βρέθηκαν να είναι στα ίδια επίπεδα με τις μετρήσεις στο ELISA. Έτσι τα δείγματα των καλλιεργειών των τοξικών φυτοπλαγκτονικών ειδών δοκιμάστηκαν κατευθειάν στον ποτενσιοστάτη. 4. Συμπεράσματα Τα μέχρι τώρα αποτελέσματα δείχνουν τιμές μετρήσιμες και μέσα στα όρια των πρότυπων καμπυλών των οξέων. Αυτό αποδεικνύει τη πιθανή εκμετάλλευση του τελικού προϊόντος σε δείγματα πεδίου. Επομένως το τελικό προϊόν θα μπορούσε να αποτελέσει έναν αισθητήρα έγκαιρης πρόγνωσης για την εμφάνιση φυτοπλαγκτονικών τοξινών, σε θαλάσσια οικοσυστήματα κατά την διάρκεια Ε.Φ.Ε., σε δείγματα φυτοπλαγκτού, αλλά κα σε δείγματα μυδιών ή άλλων διθύρων. 5. Ευχαριστίες Η παρούσα μελέτη συγχρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση, στα πλαίσια του προγράμματος με τίτλο «ΕΝΤΕΡ-2004» (επιστ. υπεύθυνος Κ. Πάγκου) και το οποίο αποτελεί δράση του Επιχειρησιακού Προγράμματος για την Ανταγωνιστικότητα (ΕΠΑν), με χρηματοδότηση κατά 25% από εθνικούς πόρους και κατά 75% από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ). Οι συγγρα- -1283-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ φείς θα ήθελαν ακόμα να ευχαριστήσουν ιδιαιτέρως τον Δρα Ε. Παπαθανασίου, διευθυντή ερευνών του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας του ΕΛ.ΚΕ.Θ.Ε., για την συνεχή υποστήριξη του. 6. Βιβλιογραφικές Αναφορές Anderson, D.M., Kullis, D.M., Qi, Yu-Zao; Zheng, Lei; Lu, Songhui & Lin, Yan-Tang, 1996. Paralytic Shellfish Poisoning in Southern China. Toxicon, 34: 579-590. Βαρκιτζή, Ι., Πάγκου, Κ., Χατζηανέστης, Ι., Πυργάκη, Χ., Παυλίδου, Α., Ασημακοπούλου, Γ., Μοντεσάντου, Β., Οικονόμου- Αμίλλη, Α. & Graneli, E., 2006. Αύξηση και τοξικότητα του Prorocentrum lima (Ehrenberg) Dodge σε καλλιέργειες: επίδραση του αζώτου. Πρακτικά 8ου Πανελλήνιου Συμπόσιου Ωκεανογραφίας και Αλιείας, Θεσσαλονίκη 4-8 Ιουνίου. Campàs, M., De la Iglesia, P., Le Berre, M., Kane, M., Diogène. J. & Marty, J.L., 2008. Enzymatic recycling-based amperometric immunosensor for the ultrasensitive detection of okadaic acid in shellfish. Biosensors and Bioelectronics, 24: 716-722. Guillard, R.R.L., 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. p. 26-60. In: Culture of Marine Invertebrate Animals, Smith W.L. & Chanley M.H (Eds). Plenum Press, New York, USA. Guillard, R.R.L.& Ryther, J.H., 1962. Studies on marine planktonic diatoms 1. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology, 8: 229 239. Kreuzer, M.P., Pravda, M., O Sullivan, C.K. & Guilbault, G.G., 2002. Novel electrochemical immunosensors for seafood toxin analysis. Toxicon, 40: 1267-1274. Reizopoulou, S., Strogyloudi, E., Giannakourou, A., Pagou, K., Hatzianestis, G., Pyrgaki., C. & Granéli., E., 2008. Okadaic acid accumulation in macrofilter feeders subjected to natural blooms of Dinophysis acuminata. Harmful Algae, 7: 228-234. -1284-