ELISA ή EIA Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Ίρις Σπηλιοπούλου Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

Transcript

1 ELISA ή EIA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Ίρις Σπηλιοπούλου Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών

2 1966: Αβραμέας κ συν 1971: Engvall κ Perlmann Δείκτης της αντίδρασης Ag:Ab είναι ένζυμο Υπόστρωμα Χρώμα

3 Αντιδράσεις Ag/Ab Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000

4 Επίτοπος και αντίσωμα

5 Μη ανταγωνιστική ELISA Ab στον ορό ασθενών σταθερό Ag σεσημασμένο Anti-Ig Ag στον ορό ασθενών σταθερό σεσημασμένο Ab Ag Στερεή φάση Στερεή φάση

6 Στοιχεία της δοκιμασίας Στερεή φάση Πλαστικό, νιτροκυτταρίνη, αγαρόζη, γυαλί, κυτταρίνη, πολυακριλαμίδιο, δεξτράνη Πλαστικό: polystyrene ή polyvinyl chloride * σε πλάκες 96 θέσεων ή σφαιρίδια * προσροφά καλύτερα την πρωτεΐνη Η προσρόφηση εξαρτάται από : Ag(c), πλαστικό, χρόνο, Θ 0.

7 Στερεή φάση = 96 / -υποδοχέων πλάκα μικροτιτλοποίησης

8 Τ Α CO Θ U1 U2 U3 U4 U = standard = άγνωστο δείγμα = τυφλό

9 Στερεή φάση με Ag αν ψάχνουμε Ab Ab αν ψάχνουμε Ag Analyte = antibody Analyte = antigen Επώαση-πλύσιμο

10 Σύνδεση στη στερεή φάση σε μικροπλάκα 96-well buffer = 0.1M Na 2 CO 3 /NaHCO 3 ph M tris-hcl ph M PBS ph 7.3 antigen / antibody σε συγκέντρωση µg/ml 100 µl/υποδοχή, 4 o C overnight

11 Προσθήκη δείγματος. Επώαση-πλύσιμο Analyte = antibody Analyte = antigen

12 Πλύσιμο buffer + (0.05% Tween 20) ~200 µl/υποδοχή 3-6 πλυσίματα με 1 min παραμονή αυτόματο ή πολυκάναλη πιπέττα και αντλία κενού

13 Σεσημασμένο με Ε Ag ή Ab Ιδιότητες ενζύμου: γρήγορος ρυθμός δράσης, σταθερότητα, χαμηλό κόστος, εύκολη σύνδεση, απουσία από το κλινικό δείγμα, εύκολος προσδιορισμός, συμβατότητα με ELISA. συχνά: αλκαλική φωσφατάση (AP) υπεροξειδάση της αγριοραπανίδος (HRPO) σπάνια : β-γαλακτοσιδάση, οξειδάση της γλυκόζης, ουρεάση, καρβονική ανυδράση Αντίσωμα (Ab) : ολικά πολυκλωνικά Abs, IgG, F (ab) 2 τμήματα Κεκαθαρμένα πολυκλωνικά, μονοκλωνικά *

14 Πολυκλωνικό αντίσωμα Ενδοφλέβια χορήγηση σε ζώο ενός Ag Παράγονται Abs έναντι διαφόρων επιτόπων Antigen Επαναχορήγηση Ag Συλλογή ορού

15 Μονοκλωνικά Abs Χορήγηση Ag Παραγωγή Abs έναντι διαφορετικών επιτόπων Απομόνωση Β-λεμφοκ από το σπλήνα Υβρίδια Β-λεμφοκ/καρκινικών κ. (immortal B cells) Έλεγχος σύνθεσης Abs από τα υβρίδια Κ/α υβριδίων/ απομόνωση Abs

16 Υποστρώματα Ιδιότητες: να φωτομετρείται, να είναι σταθερό, χαμηλού κόστους και τοξικότητας. HRP H2O2 οξείδωση 2ου υποστρώματος χρώμα 2ο υπόστρωμα: OPD* ( O-phenylenediamine), 5-aminosalicylic acid, 2, 2-azinodi- (3-ethylenbenz-o-thiazoline-6-sulf), 3,3, 5,5 -tetramethylbenzidine (TMB). AP p-nitrophenyl phosphate (PNPP) 405nm.

17 Προσθήκη Ε. επώαση-πλύσιμο E E E E Analyte = antibody Analyte = antigen

18 Υποστρώματα Orthophenylene diamine hydrochloride (OPD) Tetramethyl benzidine (TMΒ) Horse radish peroxidase (HRP) πορτοκαλί, 490 nm κίτρινο, 450 nm Φωτομέτρηση

19 Προσθήκη υποστρώματος Επώαση, stop, μέτρηση OD άχρωμο ένζυμο OD συγκέντρωση

20 Χρωματική αντίδραση Φωτομέτρηση (O.D.) και ποσοτικός προσδιορισμός Τυφλό: αέρας ή υπόστρωμα με conjugate. Αποτελέσματα σε O.D., μg/ml, ng/ml ή IU/ml (Abs) παθολογικό : 2-3 x Μ.Ο. τιμής φυσιολογικών ατόμων

21 Έλεγχος αποτελεσμάτων Χρήση Controls: low, high, negative, PBS 2 σειρές υποδοχών: μία με ορό η άλλη χωρίς Αλλαγές στη θερμοκρασία δωματίου ή στο νερό ποικιλία στις O.D. < 10% είναι αποδεκτό.

22 Δομή ερπητοϊών Ελυτροφόροι διπλής έλικας DNAιοί Το έλυτρο περιέχει τουλάχιστον 9 γλυκοπρωτεΐνες Το γονιδίωμα είναι γραμμικό, διπλής έλικας DNA Το γονιδίωμα είναι μεγάλο (240kb) και κωδικοποιεί 75 πρωτεΐνες Το DNA περιβάλλεται από ένα εικοσάεδρο καψίδιο με 162 καψομερίδια

23 Ιδιότητες ερπητοιών Τρείς υποοικογένειες: Ερπητοϊοί άλφα : HSV-1, HSV-2, VZV Ερπητοϊοί βήτα : CMV, HHV-6, HHV-7 Ερπητοϊοί γάμμα : EBV, HHV-8

24 Ιδιότητες ερπητοϊών Εγκαθιστούν λανθάνουσα ή επιμένουσα λοίμωξη μετά από πρωτοπαθή λοίμωξη Η επανενεργοποίηση της λανθάνουσας λοίμωξης είναι πιο πιθανή κατά τη διάρκεια περιόδων ανοσοκαταστολής Τόσο η πρωτοπαθής λοίμωξη όσο και η επανενεργοποίηση είναι πιθανό να είναι πιο σοβαρές σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς

25 Herpesviruses Herpes simplex I & II Varicella zoster Cytomegalovirus Epstein-Barr virus Human herpesvirus 6 & 7 Human herpesvirus 8

26 Εργαστηριακή διάγνωση Ορολογικός έλεγχος Όχι τόσο χρήσιμος στην οξεία φάση γιατί χρειάζονται 1-2 εβδομάδες για την εμφάνιση των αντισωμάτων Χρησιμοποιείται για επιβεβαίωση πρόσφατης λοίμωξης

27 ELISA : έλεγχος Abs (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

28 ±10% Όριο ΕΙΑ

29 Affinity Low Affinity Ab High Affinity Ab Ag Ag

30 >25-35%

31 Διασταυρούμενες αντιδράσεις Cross reactions Anti-A Ab Anti-A Ab Anti-A Ab Ag A Ag B Shared epitope Ag C Similar epitope

32 SANDWICH ELISA για ανίχνευση Ags 1. Ab

33 SANDWICH ELISA για ανίχνευση Ags 2. Δείγμα 1. Ab

34 SANDWICH ELISA για ανίχνευση Ags 3. Ab-E 2. Δείγμα 1. Ab E E

35

36 SANDWICH ELISA για ανίχνευση Ags 3. Ή Ab-Β+S-E 2. Δείγμα 1. Ab E S E-S B S-E E S E-S B S-E

37 SANDWICH ELISA για ανίχνευση Ags 4. Υπόστρωμα 3. Ή Ab-Β+S-E 2. Δείγμα 1. Ab

38

39 Sandwich ELISA για ανίχνευση Ag (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

40 Παραλλαγές : - Χρήση 2 διαφορετικών Abs έναντι διαφορετικών Ag επιτόπων του ίδιου λοιμογόνου παράγοντα Προσθήκη anti Igs : E χρήση anti IgG : E anti IgM : E anti IgA : E Σύστημα Avidin Biotin Peroxidase complex (ABC) Χρήση Ab: Avidin + biotin peroxidase 1 Μόριο biotin συνδέει 4 μόρια avidin

41 E Ενίσχυση

42 Ενίσχυση με: E E Μη σεσημασμένο (rabbit) anti-(human) Ig Ακολουθούμενο από anti-(rabbit) Ig-ένζυμο

43 ή E S E-S B S-E Biotin-σεσημασμένο anti-ig Ακολουθούμενο από streptavidin-ένζυμο

44 Μέτρηση IgM Συχνά ψευδώς (+) από RF Συχνά ψευδώς (-) από IgG για τους ίδιους Ag επιτόπους - Ag + ορός (IgM) + anti IgM : E Λύσεις: Απομόνωση IgM ορού προσδιορισμός ειδικών IgM Απομάκρυνση IgG Έλεγχος για RF και απομάκρυνση Τροποποίηση ELISA: -anti IgM + ορός (IgM) + ειδικό Ag + Ab : E

45 RF στον ορό των ασθενών Anti IgM-E RF IgG

46 Προβλήματα στην εκτέλεση της ELISA Υψηλό background O.D. σε αρνητικά Δ < 0,1 ή < 0,05 Ανεπαρκείς πλύσεις ή ανεπάρκεια του conjugate. Προσθήκη BSA ή Φ.Ο. ανθρώπων 1-5%

47 Ανταγωνιστική ELISA για Ag Prior to Test Test + Labeled Ag + + Labeled Ag Patient s sample +

48 Ανταγωνιστική ELISA για ανίχνευση Ags 1. Ag

49 Ανταγωνιστική ELISA για ανίχνευση Ags E E E E E E E 2. Ab-E + δείγμα E E E 1. Ag

50 Ανταγωνιστική ELISA για ανίχνευση Ags 3. πλύσιμο E E E 2. Ab-E + δείγμα E 1. Ag

51 Ανταγωνιστική ELISA για ανίχνευση Ags 4. υπόστρωμα 3. πλύσιμο 2. Ab-E + δείγμα 1. Ag

52 Sample Standard Curve Aborbance (490 nm) absorbance y = Ln(x) Log. (absorbance) R 2 = Concentration (ug/ml)

53

54 Ανίχνευση Ag σε κύτταρα

55 Άμεση μέθοδος Labeled Ab Ag Tissue Section

56 Έμμεση μέθοδος Unlabeled Ab Labeled Anti-Ig Ag Tissue Section

57

58

59 Ερωτήσεις?