Το κύτταρο και ο κυτταρικός μεταβολισμός Αναπλ. Καθηγητής Δημοσθένης Σαρηγιάννης 1
E + S ES E + P Αντιστρεπτότητα v = - d[s] = d[p] dt dt = vmf K [S]-v mp K [P] S 1+ [S] K +[P] K S P P από τα ισοζύγια μάζας και χρησιμοποιώντας την υπόθεση ψευδομόνιμης κατάστασης για το ενδιάμεσο σύμπλοκο 6
v = - d[s] = d[p] dt dt = vmf K [S]-v mp K [P] S 1+ [S] K +[P] K S P P Η εξίσωση ανάγεται στην έκφραση Michaelis-Menten για [S]=0 ή για [P]=0. Οι κινητικές σταθερές v mf,k S και v mp,κ P δεν είναι παρά ο μέγιστος ρυθμός αντίδρασης και η σταθερά κορεσμού των δύο μεταξύ τους αντίστροφων ενζυματικών αντιδράσεων S P και P S αντίστοιχα. Για τον προσδιορισμό των κινητικών παραμέτρων διεξάγουμε δύο σετ από πειράματα προσδιορισμού του αρχικού ρυθμού, αρχίζοντας με [P]=0 για το ένα σετ και με [S]=0 για το άλλο. 7
Δράση πολλών Υποστρωμάτων σε ένα Ένζυμο Όταν στο διάλυμα περιέχονται περισσότερα από ένα υποστρώματα συνήθως παρατηρείται ανταγωνισμός για τα μόρια του ενζύμου. Στην πιο απλή περίπτωση ας θεωρήσουμε την ύπαρξη δύο υποστρωμάτων τα οποία αντιδρούν σύμφωνα με τις αντιδράσεις: E + S 1 ( ES 1) ( ES 1) E + P1 E + S 2 ( ES 2 ) ( ES 2 ) E + P2 8
9
T v T = ds dt = 1 2 ( k [ S ] 1 2 K + k [ S ] 1 2 1 2 1+ [ S ] 1 K )E K + [ S ] K 2 o v max m S T K + S T Δεν μπορούμε να θεωρήσουμε το άθροισμα των δύο υποστρωμάτων ως ένα μοναδικό υπόστρωμα. Κλασσικό παράδειγμα οι αντιδράσεις αποπολυμερισμού (αποδόμησης πολυμερών) 10
Παρεμπόδιση Ενζυμικών Αντιδράσεων Παρεμποδιστής: ένωση που επηρεάζει είτε παροδικά είτε μόνιμα την ενεργότητα των ενζύμων Η αντιστρεπτή παρεμπόδιση αποτελεί και τον βασικό μηχανισμό ρύθμισης της ενζυμικής ενεργότητας των μεταβολικών αντιδράσεων παρεμπόδιση μη ομοιοπολική ομοιοπολική ανταγωνιστική μη ανταγωνιστική ανανταγωνιστική 11
Μη Ομοιοπολική Παρεμπόδιση Το είδος μπορούμε να το προσδιορίσουμε από διάγραμμα Lineweaver-Burk. Ανάλογα με την συγκέντρωση του παρεμποδιστή: ανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζεται μόνο η κλίση της ευθείας μη ανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζεται μόνο η διατομή ανανταγωνιστική παρεμπόδιση: επηρεάζονται και η κλίση και η διατομή 12
Aνταγωνιστική παρεμπόδιση Ο παρεμποδιστής αντιδρά μόνο με το ελεύθερο ένζυμο E + S ES E + P E + I EI Θεωρώντας [ΕΙ] << ολική συγκέντρωση παρεμποδιστή Ι ο, και γρήγορη ισορροπία για την αντίδραση συμπλοκοποίησης του παρεμποδιστή: v = K I = v [E]I [EI] max o [S] [S] + K (1+ I K ) m o I 13
Aνταγωνιστική παρεμπόδιση Αυξανόμενη συγκέντρωση παρεμποδιστή v = v max [S] [S] + K (1+ I K ) m o I 14
Mη ανταγωνιστική παρεμπόδιση Ο παρεμποδιστής αντιδρά μόνο με το σύμπλοκο ενζύμουυποστρώματος και μόνο, καθιστώντας το ανενεργό σύμφωνα με τον μηχανισμό: E + S ES E + P ES + I ESI Αν οι σταθερές ισορροπίας για τις αντιδράσεις είναι Κ m και Κ I αντίστοιχα: v = vmax 1+ I K [S] o I Km 1+ I K +[S] o I 15
Mη ανταγωνιστική παρεμπόδιση v = vmax 1+ I K [S] o I Km 1+ I K +[S] o I αυξανόμενη συγκέντρωση παρεμποδιστή 16
Ανανταγωνιστική παρεμπόδιση τόσο το Ε όσο και το ES αντιδρούν με τον παρεμποδιστή I με την ίδια ευχέρεια το E και το EI αντιδρούν με το υπόστρωμα S με την ίδια ευχέρεια To EIS είναι ανενεργό E + S ES E + P E + I EI EI + S ESI ES + I ESI v = v max 1+ I K o I [S] [S]+ K m 17
Ανανταγωνιστική παρεμπόδιση αυξανόμενη συγκέντρωση παρεμποδιστή v = v max 1+ I K o I [S] [S]+ K m 18
Επίδραση του ph ενεργότητα ευστάθεια ph 19
ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph P το ένζυμο (ανάλογα με το ph) μπορεί να βρίσκεται σε τρεις καταστάσεις ιοντισμού (Η 2 Ε, ΗΕ - και Ε 2- ) από τις οποίες μόνο η ενδιάμεση ΗΕ - θωρείται ενεργή 20
φαιν. v max = Environmental ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ ph 1+ K v max + 2,ES + [ H ] + [ H ] K1,ES (ph ) = K K βελτ. log 10 1, ES 2, ES φαιν. K m =K m 1+ K 1+ K + 2,E + [ H ] +[ H ] K1,E + 2,ES + [ H ] +[ H ] K1,ES K φαιν. m K m 21
Ισοζύγια μάζας και ενέργειας στα κύτταρα Αναπλ. Καθηγητής Δημοσθένης Σαρηγιάννης 22
Ισοζύγια Η μελέτη των ισοζυγίων μάζας προσφέρει απαντήσεις αναφορικά με λειτουργικά δεδομένα βιο-αντιδραστήρων και βιολογικών διεργασιών Ποια είναι η ποσότητα υποστρώματος που καταναλώθηκε και δε μετατράπηκε σε προϊόν; Ποια είναι η ποσότητα υποστρώματος που απαιτείται για να παραχθεί X ποσότητα βιομάζας Ποια είναι η ποσότητα οξυγόνου που πρέπει να διοχετευθεί σε ένα βιοαντιδραστήρα έτσι ώστε να συνεχιστεί η ζύμωση; 23
Σύστημα και διεργασίες Σύστημα το επιλεγμένο προς εξέταση τμήμα μιας διεργασίας (ή ολόκληρη η διεργασία) Κλειστό σύστημα, αυτό που δεν επιτρέπει το πέρασμα μάζας από το σύστημα προς το περιβάλλον και αντίστροφα και χαρακτηρίζεται από σταθερή ποσότητα μάζας. Ανοικτό, εάν επιτρέπεται η ανταλλαγή μάζας με το περιβάλλον Διεργασία είναι μια σειρά φυσικών επεμβάσεων οι οποίες προκαλούν φυσικές ή χημικές αλλαγές σε κάποιο σύστημα ή στο περιβάλλον Διεργασία διαλείποντος έργου κλειστό σύστημα Διεργασία ημιδιαλείποντος έργου υπάρχει είσοδος υλικών αλλά όχι έξοδος Διεργασία συνεχούς έργου επιτρέπει την είσοδο και έξοδο υλικών. 24
Σταθερή κατάσταση και ισορροπία Όταν όλες οι μεταβλητές ενός συστήματος (θερμοκρασία, πίεση, όγκος, μάζα κλπ) δε μεταβάλλονται με το χρόνο, το σύστημα βρίσκεται σε σταθερή κατάσταση. Οι διεργασίες διαλείποντος και ημι-διαλείποντος έργου δε μπορούν να βρεθούν σε τέτοια κατάσταση Στις ημι-διαλείποντος η μάζα αυξάνεται με το χρόνο Στις διαλείποντος παρότι η μάζα παραμένει σταθερή, η φυσικοχημική κατάσταση μεταβάλετε με την πάροδο του χρόνου Οι συνεχούς λειτουργίας-έργου μπορούν να είναι είτε σταθερής κατάστασης είτε μεταβαλλόμενες 25
Ισοζύγιο μάζας Η αρχή διατήρησης της μάζας εκφράζεται με τη θεώρηση της ροής ενός υλικού μέσα και έξω από ένα σύστημα με τη μορφή του ισοζυγίου μάζας Δεν είναι τίποτε περισσότερο από έναν ισολογισμό των ποσοτήτων μάζας που ρέουν μέσα στα όρια του συστήματος ή της μάζας που υφίσταται αλλαγές στο εσωτερικό του συστήματος, και παίρνει τη μορφή Ένα ισοζύγιο μάζας μπορεί να εφαρμοστεί για τη συνολική μάζα ενός συστήματος, για ένα συγκεκριμένο είδος ατόμων ή μορίων ή για τη βιομάζα. Ο όρος της συσσώρευσης στο σύστημα μπορεί να είναι θετικός, ή αρνητικός. Το αρνητικό πρόσημο αντιπροσωπεύει την εξάντληση ήδη υπαρχόντων αποθεμάτων 26
Διαδικασία εφαρμογής Η χρήση τυποποιημένης πορείας έχει ως αποτέλεσμα τη διευκόλυνση της παρακολούθησης και της πορείας επίλυσης. Με τα στάδια να μπορούν να ομαδοποιηθούν σε τέσσερα στάδια: συγκρότηση, ανάλυση, υπολογισμός και ολοκλήρωση. Α) σχεδιασμός ενός σαφούς διαγράμματος ροής με αποτύπωση όλων των διαθέσιμων πληροφοριών Β) επιλογή των μονάδων μέτρησης για τις μεταβλητές του συστήματος Γ) επιλογή και σαφής διατύπωση της βάσης επίλυσης του συστήματος Δ) διατύπωση των παραδοχών που έχουν υιοθετηθεί Ε) Εντοπισμός εφόσον υπάρχουν των συστατικών που συμμετέχουν σε αντιδράσεις 27
Βιοδιεργασία - βιοαντιδραστήρας Ένα δοχείο στο οποίο λαμβάνει χώρα κάποια αντίδραση Καταναλώνει αντιδρώντα με κάποιο ρυθμό Παράγει προϊόντα με κάποιο ρυθμό Για την έκφραση των ρυθμών απαιτείται ο καθορισμός της κινητικής των αντιδράσεων στο εσωτερικό 28
Κινητική Η μελέτη της εξάρτησης ενός ρυθμού αντίδρασης από: Θερμοκρασία Πίεση ph Συγκέντρωση προϊόντων Συγκέντρωση αντιδρώντων ανάδευση 29
Στοιχειώδεις αντιδράσεις Παρουσιάζουν απλά γεγονότα όπως η συμπλοκοποίηση του υποστρώματος με το ένζυμο Ε+S = ES Στις αντιδράσεις αυτές μόνο οι ρυθμοί κατανάλωσης είναι ανάλογοι των ρυθμών δημιουργίας και κατ' επέκταση για την παραπάνω αντίδραση ισχύει ότι d[e] dt = d[s] d[ ΕS] = - dt dt 30
Συνολικές αντιδράσεις Βιοχημικές αντιδράσεις σε ολόκληρα μεταβολικά δίκτυα όπως η περίπτωση της Γλυκόζη 2 πυροσταφυλικά οξέα, ονομάζονται συνολικές αντιδράσεις και προκύπτουν από το άθροισμα πολλών επιμέρους απλών αντιδράσεων Οι ρυθμοί των επί μέρους απλών αντιδράσεων καθορίζουν και τη σχέση ανάμεσα στους ρυθμούς μεταβολής των συγκεντρώσεων των αντιδρώντων και των προϊόντων. Θεωρώντας ότι υπάρχουν παράλληλες αντιδράσεις πρώτης τάξης Α B και Α C οι οποίες λαμβάνουν χώρα σε κλειστό χώρο υπό ικανοποιητική ανάδευση. Αρχικά υπάρχει μόνο Α σε συγκέντρωση C A0, με τους ρυθμούς των επιμέρους αντιδράσεων να είναι K 1CA και K 2C2. H συγκέντρωση του Α μπορεί να υπολογιστεί με ολοκλήρωση της κανονικής διαφορικής εξίσωσης του ισοζυγίου. Κατ επέκταση η συγκέντρωση του Α = 31
Συνολικές αντιδράσεις Από τα ισοζύγια για Β και C Αντικαθιστώντας για τη συγκέντρωση C A k +k 1 Επομένως cb(t)= c A(t) 1 2 c C (t)= k k 1 k 2 +k 2 c A (t) 32
Επομένως Συνολικές αντιδράσεις c c B C (t)= (t)= k k 1 1 k 1 +k k 2 +k 2 2 c c A A (t) (t) Από τις σχέσεις αυτές για κάθε mole του A που καταναλώνεται οι ποσότητες του B και C που παράγονται δεν είναι σταθερές αλλά εξαρτώμενες από την κινητική των επιμέρους αντιδράσεων. Γενικά οι καθαροί ρυθμοί κατανάλωσης και παραγωγής δεν είναι ανεξάρτητοι αλλά υπόκεινται σε περιορισμούς. Έτσι μπορεί οι ποσότητες των προϊόντων στις παράλληλες αντιδράσεις να εξαρτώνται από την επιμέρους κινητική, το άθροισμα τους ωστόσο είναι σταθερό και ίσο με την ποσότητα του Α που καταναλώθηκε. Αυτοί οι περιορισμοί πηγάζουν από το νόμο διατήρησης της μάζας 33
Στοιχειακά ισοζύγια Το ισοζύγιο μάζας βιολογικών αντιδράσεων μπορεί να καταγραφεί ευκολά όταν είναι γνωστή η σύσταση των υποστρωμάτων, των προϊόντων και του κυτταρικού υλικού. Σημαντικό πρόβλημα όμως αποτελεί ο ακριβής προσδιορισμός της σύστασης του κυτταρικού υλικού. Η τυπική σύσταση του κυτταρικού υλικού αντιστοιχεί στον τύπο CH 1.8 O 0.5 N 0.2 34
ΣΤΟΙΧΕΙΟΜΕΤΡΙΑ ΒΙΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ Γενικά ένα σύστημα m αντιδράσεων (r 1,...,r m ) μεταξύ Ν διαφορετικών ουσιών Α 1,...,Α Ν (αντιδρώντα και προϊόντα). Μπορούμε να παρουσιαστεί κάθε αντίδραση j με τη μορφή: Ν ν i=1 ij A = 0 i ν ij <0 εάν το A i είναι αντιδρών, ν ij >0 εάν είναι προϊόν της j αντίδρασης ν ij =0 εάν δεν παίρνει μέρος στην αντίδραση j 35
Στοιχειακά ισοζύγια Παίρνοντας την βιολογική μετατροπή χωρίς εξωκυτταρικά προϊόντα εκτός του H 2 O και CO 2 CH m O n + a O 2 +bnh 3 cch α O β N δ +dh 2 O+eCO 2 Όπου CH m O n αντιστοιχεί σε 1 mole υδατανθράκων και το CH α O β N δ αντιστοιχεί σε 1 mole κυτταρικού υλικού. Ισοζύγια για το C, H, O και Ν οδηγούν στις παρακάτω εξισώσεις: C:1=c+e H:m+3b=ca+2b O:n+2a=cβ+d+2e N:b=cδ Με το αναπνευστικό πηλίκο (RQ) (δηλαδή ο λόγος του παραγόμενου CO 2 ως προς το καταναλωθέν Ο 2 ) να δίδεται από τη σχέση RQ=e/a 36
Βαθμός αναγωγής Σε πολύπλοκες αντιδράσεις, όπως στην περίπτωση της παραγωγής εξωκυτταρικών προϊόντων, υφίσταται ένας επιπλέον στοιχειομετρικός συντελεστής ο οποίος είναι ο βαθμός αναγωγής Χρησιμοποιείται για την κατάστρωση ισοζυγίων πρωτονίων και ηλεκτρονίων στις βιοαντιδράσεις. Ορίζεται ως ο αριθμός ισοδύναμων διαθέσιμων ηλεκτρονίων ανά γραμμοάτομο C. Διαθέσιμα ηλεκτρόνια είναι αυτά τα οποία μεταφέρονται στο οξυγόνο κατά την οξείδωση μιας χημικής ένωσης προς CO 2, H 2 O και NH 3 Οι βαθμοί αναγωγής κάποιων κοινών στοιχείων είναι C=4, H=1, N=-3, O =-2, P=5 και S= 6. ο βαθμός αναγωγής οποιουδήποτε στοιχείου σε χημική ένωση είναι ίσος με το σθένος του συγκεκριμένου στοιχείου. 37
Βαθμός αναγωγής Η αερόβια παραγωγή ενός εξωκυτταρικού προϊόντος παριστάνεται από την εξίσωση: CH m O n +ao 2 +bnh 3 cch α O β N δ +dch x O y N z +eh 2 O+fCO 2 Υπόστρωμα Βιομάζα Προϊόν Οι βαθμοί αναγωγής του υποστρώματος, της κυτταρικής μάζας και του προϊόντος είναι: γ s =4+m-2n, γ b =4+α-2β-3δ, γ p = 4+χ-2y-3z 38
Συντελεστής απόδοσης Ο συντελεστής απόδοσης εκφράζεται συνήθως σε g κυτταρικής μάζας ανά g υποστρώματος. Ως υπόστρωμα θεωρούμε το περιοριστικό θρεπτικό συστατικό, το οποίο ορίζεται ως το συστατικό που θα εκλείψει πρώτο αν η αντίδραση (η ανάπτυξη) προχωρήσει μέχρι τέλους. Εν γένει διαφοροποιείται αυτό το στοιχειομετρικά περιοριστικό θρεπτικό συστατικό από το θρεπτικό συστατικό που καθορίζει (περιορίζει) και τον ρυθμό ανάπτυξης. 39
Συντελεστής απόδοσης O συντελεστής απόδοσης εξαρτάται από : Το ρυθμό ανάπτυξης Τη θερμοκρασία Το είδος του οργανισμού Το λόγο άνθρακα/αζώτου Την ύπαρξη οξυγόνου Το ph Κατ επέκταση η μικροβιακή ανάπτυξη δεν παρουσιάζει σταθερή στοιχειομετρία 40
Απόδοση r X Χ Y X / S = = X - X S S - S t 0 0 t = r r X S Y X/S r S r X και r S οι ρυθμοί παραγωγής βιομάζας και κατανάλωσης υποστρώματος αντίστοιχα, Χ t και Χ 0 η βιομάζα σε χρόνους t και 0 αντίστοιχα S t και S 0 το θρεπτικό υπόστρωμα σε χρόνους t και 0 αντίστοιχα πρόκειται για μακροσκοπική ποσότητα που προσδιορίζεται πειραματικά από την κλίση της καμπύλης του r X ως προς r S 41
Πρόβλεψη συντελεστών απόδοσης Στις αερόβιες ζυμώσεις ο συντελεστής απόδοσης σε κυτταρική μάζα ανά διαθέσιμο ηλεκτρόνιο στα μόρια του οξυγόνου και με την αμμωνία ως πηγή αζώτου είναι περίπου 3.14g ξηρού βάρους κυττάρων. Όταν ο αριθμός των μορίων οξυγόνου ανά mole καταναλωθέντος υποστρώματος είναι γνωστός, μπορεί να υπολογισθεί ο συντελεστής απόδοσης σε κυτταρική μάζα, Υ x/s. O αερόβιος καταβολισμός της γλυκόζης παριστάνεται από την ακόλουθη εξίσωση. C 6 H 12 O 6 +6O 2 6CO 2 +6H 2 O O συνολικός αριθμός διαθέσιμων ηλεκτρονίων σε 1 mole γλυκόζης είναι 24. ο συντελεστής απόδοσης σε κυτταρική μάζα ανά διαθέσιμο ηλεκτρόνιο είναι Υ x/s =24(3.14) = 76 g ξηρού βάρους κυττάρων ανά/mole O συντελεστής απόδοσης σε κυτταρική μάζα που προβλέπεται από την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθοδολογίας είναι Y xs =76/180 =0.4 g ξηρού βάρους κυττάρων ανά g/γλυκόζης 42
Thank you for your kind attention www.enve-lab.eu A connectivity perspective to environmental health 43
Coupled EWAS-GWAS methodology The HEALS paradigm 44
Gene A R Gene A HO R R HO Gene B Gene A R R Gene B Gene X HO R Gene B Gene X Gene X 45
p53 Pathway: differential modulation of gene expression in A549 cells by Indoor Air Mix and components IAM: red Aromatics: green Aldehydes: orange Terpens: blue Yellow: components in more than one treatment 46
Oxidative stress pathway MKK3/6 eef2k = Indoor Air Mix MKP5 = Formaldheyde = Terpenes = Aromatics MEF-2 c-jun 47
Protein modification Environmental Multi-omics responses and associations Identification of differentially expressed proteins Protein metabolism Protein biosynthesis mrna transcription regulation mrna transcription Hematopoiesis Cytokine and chemokine mediated signaling Cell proliferation and differentiation 10ug/l 100ng/l 10ng/l 0 20 40 60 80 100 Apoptosis Signaling Pathway Transcriptomics responses to chemical BTEX mixtures Extracellular perturbations on metabolic states Identification of AML metabolomic fingerprint 48
49