ΙΙΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ

Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Ιατρική Σχολή, Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας ΙΙΚΟΙ ΦΟΡΕΙΣ & ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Δρ. ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΤΖΑΒΑΡΑΣ Καθηγητής, Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας 1

Ιϊκοί φορείς Ολοι οι ιοί μολύνουν τους ξενιστές τους και εισάγουν το γενετικό τους υλικό στα κύτταρα του ξενιστή στα πλαίσια του αναπαραγωγικού τους κύκλου. Το ιϊκό γενετικό υλικό περιέχει τις βασικές οδηγίες για να παράξει περαιτέρω αντίγραφα των αρχικών ιών χρησιμοποιώντας την κυτταρική αναπαραγωγική μηχανή για να εξυπηρετήσει τις ανάγκες του (Εικόνα 1). Το μολυσμένο κύτταρο-ξενιστής θα εκτελέσει αυτές τις οδηγίες και θα παράξει επιπρόσθετα αντίγραφα του ιού, μολύνοντας όλο και περισσότερα παρακείμενα κύτταρα. Μερικοί τύποι ιών εισάγουν τα γονίδιά τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, γεγονός που ουσιαστικά σημαίνει ότι τα ιικά γονίδια ενσωματώνονται ανάμεσα στα γονίδια του κυττάρουξενιστή για τον υπόλοιπο χρόνο της ζωής του (http://www.youtube.com/watch?v=0h5jd7sgqwy). Τέτοιοι ιοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως οχήματα μεταφοράς καλών γονιδίων στο ανθρώπινο κύτταρο. Πρώτα, όμως ο επιστήμονας θα πρέπει να απομακρύνει τα ιικά γονίδια που προκαλούν ασθένεια. Κατόπιν, θα πρέπει να αντικαταστήσει τα γονίδια αυτά με εκείνα που κωδικοποιούν την παραγωγή της θεραπευτικά επιθυμητής πρωτεϊνης, όπως για παράδειγμα την παραγωγή ινσουλίνης στη περίπτωση των διαβητικών (http://www.youtube.com/watch?v=x2jumg2eic). Σημειωτέον είναι ότι η εργαστηριακή διαδικασία θα πρέπει να γίνει με τέτοιο τρόπο, ώστε τα υπεύθυνα γονίδια ενσωμάτωσης του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή να παραμείνουν ανέπαφα. Εικόνα 1. Ο κύκλος ζωής των ιών: το παράδειγμα του βακτηριοφάγου. Πολλά πειράματα γονιδιακής μεταφοράς βασίζονται σε ρετροϊούς και αδενοϊούς για την μεταφορά του επιθυμητού γονιδίου. Άλλοι ιοί που χρησιμοποιήθηκαν σαν φορείς περιλαμβάνουν αδενοσχετιζόμενους ιούς, αργά πολλαπλασιαζόμενους ρετροϊούς (lentiviruses), αλφα-ιούς και ερπητοϊούς. Οι ιοί αυτοί διαφέρουν στο πόσο αποτελεσματικά μεταφέρουν γονίδια στα κύτταρα που αναγνωρίζουν, και στο αν μπορούν να μεταβάλλουν το DNA του κυττάρου μόνιμα ή παροδικά (Εικόνα 2). 2

Εικόνα 2. Σύγκριση διαφορερικών ιϊκών φορέων που χρησιμοποιούνται για γονιδιακή θεραπεία: σύνοψη πλεονεκτημάτων και μεινονεκτημάτων. Οι *Αδενο-σχετιζόμενοι ιοί είναι ικανοί να ενσωματώνονται με χαμηλή συχνότητα στο χρωμόσωμα 19. Οι αργά πολλαπλασιαζόμενοι ρετροϊοί (Lentiviruses) μολύνουν επίσης και μη-πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα. Ιϊκή ενθετική μεταλλαξιγένεση Ο όρος της ιικής ενθετικής μεταλλαξιγένεσης αναφέρεται στη μετάλλαξη που προκαλείται από την ένθεση/εισαγωγή επιπρόσθετων βάσεων DNA στο προϋπάρχον γονιδίωμα του κυττάρου. Επειδή πολλοί ιοί (όχι όλοι) ενσωματώνουν το γονιδίωμά τους στο γονιδίωμα των κυττάρων του ξενιστή τους με σκοπό την αναπαραγωγή τους, η μεταλλαξιγένεση είναι συχνό επακόλουθο της ιϊκής μόλυνσης. Όμως δεν προκαλούν όλοι οι ενσωματώσιμοι ιοί ενθετική μεταλαξιγένεση. Πρέπει να τονιστεί ότι δεν θα οδηγήσουν όλες οι ενθέσεις στο DNA του ξενιστή σε εμφανή μετάλλαξη. Στην πραγματικότητα, μόνο λίγες θα έχουν αυτό το αποτέλεσμα. Παρ όλα αυτά, αποτελεί κοινή πρακτική στους ερευνητές, που ασχολούνται με τη γονιδιακή θεραπεία, να αποφεύγουν την χρήση ιών που ενσωματώνουν το DNA τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, όταν αυτό δεν είναι απαραίτητο. Aντ αυτού επιλέγουν ιούς που εκφράζουν παροδικά το DNA τους (το DNA τους επιπλέει μέσα στο 3

κύτταρο αντί να ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή). Στην περίπτωση των ιών που ενσωματώνουν το DNA τους στο γονιδίωμα του ξενιστή, η βαρύτητα της προκαλούμενης μετάλλαξης εξαρτάται αποκλειστικά από την θέση ενσωμάτωσης του ιϊκού DNA μέσα στο γονιδίωμα. Εάν η ενσωμάτωση συμβεί στην κωδικοποιούσα περιοχή ενός απαραίτητου γονιδίου, τα αποτελέσματα για το κύτταρο θα είναι σοβαρά. Επίσης, η ενσωμάτωση στον υποκινητή (promoter) ενός γονιδίου μπορεί να προκαλέσει εξίσου σοβαρά επακόλουθα (Εικόνα 3). Για παράδειγμα, αν το ιϊκό DNA ενσωματωθεί σε ένα καταστολέα, το γονίδιο που επηρρεάζεται από αυτόν μπορεί να υπερεκφρασθεί οδηγώντας σε υπερπαραγωγή του πρωτεϊνικού προϊόντος του με συνέπεια την αλλαγή της λειτουργίας του κυττάρου. Εάν ενσωματωθεί στην περιοχή ενός επαυξηντή (enhancer), το γονίδιο μπορεί να υποεκφρασθεί οδηγώντας σε σχετική απουσία του προϊόντος του που μπορεί να επηρρεάσει σημαντικά τη λειτουργία του κυττάρου. Εικόνα 3. Ο ρετροϊός μολύνοντας τα κύτταρα του ξενιστή προκαλεί μεταλλάξεις με πολλαπλούς τρόπους μέσω ενσωμάτωσης του στο γονιδίωμα του ξενιστή (πράσινο πλαίσιο). Οι ενσωματώσεις προϊών μπορούν να επάγουν την υπερέκφραση ή μηέκφραση κυτταρικών γονιδίων μέσω επαυξηντών (ενσωματώσεις επαυξηντών) που βρίσκονται στις περιοχές των μακρών τελικών επαναλήψεων (LTR) ή μέσω ενσωματώσεων σε υποκινητές δημιουργώντας ένα συντετηγμένο μεταγράφημα ιού-ξενιστή. Κολοβώματα (απαλλείψεις) ή απενεργοποιούσες μεταλλάξεις μπορούν να προκληθούν από ιϊκή ενσωμάτωση σε γονίδιο του ξενιστή. Τα κύτταρα μπορούν να επαναμολυνθούν από τον ιό και έτσι να συσσωρευθούν πολλαπλές μεταλλάξεις, οδηγώντας σε ογκογένεση. Η μεταβολή της έκφρασης διαφορετικών γονιδίων θα έχει μία ποικιλία αποτελεσμάτων στο κύτταρο. Ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός δεν θα επηρρεασθεί σημαντικά από όλες τις μεταλλάξεις. Όμως, εάν η ενσωμάτωση συμβεί σε ένα απαραίτητο γονίδιο ή ένα γονίδιο που εμπλέκεται στον κυτταρικό 4

πολλαπλασιασμό (cellular replication) ή τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (programmed cell death), τότε η ενσωμάτωση αυτή μπορεί να εκθέσει σε κίνδυνο την βιωσιμότητα του κυττάρου ή ακόμη να προκαλέσει τον ατελεύτητο πολλαπλασιασμό του οδηγώντας στο σχηματισμό ενός όγκου που είναι δυνατό να γίνει καρκινικός (βλέπε Εικόνα 3). Ρετροϊικοί φορείς Ρετροϊός είναι κάθε ιός που ανήκει στην οικογένεια των Retroviridae. Το γενετικό υλικό των σωματιδίων των ρετροϊών βρίσκεται στη μορφή του RNA, ενώ το γενετικό υλικό των στο ξενιστή είναι στη μορφή του DNA. Όταν ο ρετροϊός μολύνει ένα κύτταρο-ξενιστή εισάγει στο κύτταρο το RNA του μαζί με μερικά ένζυμα. Το RNA αυτό θα πρέπει πρώτα να μετατραπεί σε ένα αντίγραφο DNA, πρίν θεωρηθεί μέρος του γονιδιώματος του ξενιστή-κυττάρου. Το γονιδίωμα των ρετροϊών συνήθως περιέχει τρία (3) ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης που κωδικοποιούν για πρωτεϊνες που απαντούν στον ώριμο ιό. Συγκεκριμένα, το gag κωδικοποιεί για ενδοκαψιδιακές δομικές πρωτεϊνες, το pol για τα ένζυμα της αντίστροφης μεταγραφάσης, πρωτεάσης και ιντεγκράσης ενώ το env για τις εξωτερικές πρωτεϊνες της ιικής κάψας (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Η οργάνωση του γονιδιώματος των ρετροϊών. LTR: μακρές τελικές επαναλήψεις. Η διαδικασία παραγωγής ενός αντιγράφου DNA από ένα μόριο RNA, ορίζεται ως αντίστροφη μεταγραφή και επιτελείται μέσω του ενζύμου της αντίστροφης μεταγραφάσης. Μετά την παραγωγή του αντιγράφου DNA, αυτό είναι ελεύθερο στον πυρήνα του κυττάρου-ξενιστή και πρέπει να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του κυττάρου. Δηλαδή θα πρέπει να ενσωματωθεί στα χρωμοσώματα. Αυτή η διαδικασία πραγματοποιείται από το ένζυμο της ιντεγκράσης όπως παρουσιάζεται στην Εικόνα 5 (http://www.youtube.com/watch?v=7clftrzoeeg&feature=related). Εικόνα 5. Η ρετροϊική ενσωμάτωση 5

Το γεγονός ότι το γενετικό υλικό του ιού ενσωματώνεται και αποτελεί πλέον μέρος του γονιδιώματος του ξενιστή κυττάρου, μας επιτρέπει να πούμε ότι το κύτταρο-ξενιστής έχει τροποιηθεί περιέχοντας ένα νέο γονίδιο. Εάν αργότερα το κύτταρο αυτό του ξενιστή πολλαπλασιασθεί, οι απόγονοί του θα περιέχουν το νέο γονίδιο. Μερικές φορές τα ιϊκά γονίδια δεν εκφράζουν αμέσως την πληροφορία τους. πλέον απλή υπόθεση την παρασκευή ρετροϊικών φορέων. Εικόνα 6. Η παραγωγή ανασυνδυασμένων ρετροϊικών φορέων Οι ρετροϊικοί φορείς δημιουργούνται με αφαίρεση των ρετροϊικών γονιδίων gag, pol και env. Τα γονίδια αυτά αντικαθίστανται από το «θεραπευτικό γονίδιο». Για να παραχθούν ιϊκά σωματίδια φορέα, απαιτείται μία κυτταρική σειρά πακεταρίσματος. Οι κυτταρικές σειρές πακεταρίσματος παρέχουν όλες τις ιϊκές πρωτεϊνες που απαιτούνται για την παραγωγή καψιδίων και την ωρίμανση των ιϊκών σωματιδίων του φορέα. Αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν δημιουργηθεί με τέτοιο τρόπο ώστε να περιέχουν τα γονίδια gag, pol και env. Η δυνατότητα εισαγωγής του επιθυμητού γονιδίου στο ρετροϊικό DNAφορέα και η διαθεσιμότητα των κατάλληλων κυτταρικών σειρών πακεταρίσματος καθιστούν Ένα από τα προβλήματα της γονιδιακής θεραπείας με ρετροϊικούς φορείς αποτελεί η αυθαίρετη ένθεση γονιδιακού υλικού του φορέα σε τυχαίες θέσεις στο γονιδίωμα του ξενιστή από το ένζυμο της ιντεγκράσης. Εάν συμβεί το γενετικό υλικό να ενσωματωθεί μέσα σε ένα γονίδιο του ξενιστή, τότε η λειτουργία του γονιδίου αυτού θα διαταραχθεί (ενθετική μεταλλαξιγένεση). Αν δε το γονίδιο αυτό 6

τυχαίνει να ρυθμίζει την κυτταρική διαίρεση, τότε μπορεί να συμβεί ανεξέλεκτη κυτταρική διαίρεση που να οδηγήσει σε δημιουργία καρκίνου. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, σήμερα γίνονται προσπάθειες χρησιμοποίησης εξειδικευμένων νουκλεασών (zinc finger nucleases) ή συγκεκριμένων αλληλουχιών της περιοχής ελέγχου του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης για να κατευθύνουν το σημείο της ενσωμάτωσης σε ειδικές χρωμοσωμικές περιοχές. ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Γονιδιακή θεραπεία Ως γονιδιακή θεραπεία ορίζεται εκείνος ο τρόπος θεραπείας που, βασιζόμενος σε Τεχνικές Μοριακής Βιολογίας, αποσκοπεί στην αποκατάσταση ενός παθολογικού φαινότυπου μέσω αλλαγής του γενετικού υλικού των κυττάρων του πάσχοντος ιστού ή οργανισμού. Οι μοριακές προσεγγίσεις για γονιδιακή θεραπεία μπορεί να περιλαμβάνουν: α) την αντικατάσταση ενός μεταλλαγμένου νοσογόνου γονιδίου με το φυσιολογικό, β) την απενεργοποίηση ή απάλλειψη (knock out) του μεταλλαγμένου γονιδίου που δεν λειτουργεί φυσιολογικά και γ) την εισαγωγή ενός νέου γονιδίου στον οργανισμό που καταπολεμά την ασθένεια. Γενικά, ένα γονίδιο δεν μπορεί να εισαχθεί απευθείας στο ανθρώπινο κύτταρο. Κατά συνέπεια θα πρέπει να εισαχθεί χρησιμοποιώντας ένα μεταφορέα ή φορέα. Οι φορείς μπορούν να διακριθούν σε ιικούς και μη-ιικούς. Σήμερα το πιο κοινό τύπο φορέων αποτελούν οι ιοί που έχουν τροποποιηθεί γενετικά ώστε να μεταφέρουν φυσιολογικό ανθρώπινο DNA (Wiley database on vectors used in gene therapy trials) (http://www.wiley.com/legacy/wileychi/genmed/clinical/). Οι ιοί έχουν εξελίξει τρόπους ενθυλάκωσης και μεταφοράς των γονιδίων τους στα κύτταρα του ξενιστή. Oι επιστήμονες προσπαθούν να τιθασσεύσουν την ικανότητά τους αυτή, χειριζόμενοι το ιϊκό γονιδίωμα απομακρύνοντας τα γονίδια που προκαλούν ασθένεια αντικαθιστώντας τα με αντίστοιχα θεραπευτικά. Κατά την διαδικασία της γονιδιακής θεραπείας, τα κύτταρα-στόχοι, όπως π.χ. τα ηπατικά κύτταρα ή τα κύτταρα του πνεύμονα, μολύνονται από τον ρετροϊικό φορέα. Κατόπιν, ο φορέας αδειάζει το γενετικό του υλικό, που περιέχει το θεραπευτικό γονίδιο, στο κύτταρο-στόχο. Έτσι, η παραγωγή του λειτουργικής πρωτεϊνης από το θεραπευτικό γονίδιο επαναφέρει το κύτταρο-στόχο στη φυσιολογική του κατάσταση. Σχεδόν όλα τα κύτταρα του ανθρώπινου σώματος αποτελούν δυνητικούς στόχους για γονιδιακή θεραπεία και μπορούν να διαιρεθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: τα σωματικά (τα περισσότερα κύτταρα του σώματος) και τα γαμετικά (ωάρια και σπερματοζωάρια). Α. Η γονιδιακή θεραπεία με χρήση γαμετικών κυττάρων επιφέρει μόνιμες αλλαγές που μεταφέρονται σε μεταγενέστερες γενεές. Αν γίνει πρώϊμα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, όπως π.χ. κατά το διάστημα της προεμφυτικής διάγνωσης και της in vitro γονιμοποίησης, η γονιδιακή μεταφορά μπορεί να συμβεί σε όλα τα κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Η ελκυστικότητα της θεραπείας σε γαμετικά κύτταρα βασίζεται στην δυνατότητα επίτευξης ενός μόνιμου θεραπευτικού αποτελέσματος για όλους εκείνους που θα κληρονομήσουν το γονίδιο-στόχο εξαλείφοντας για πάντα μερικές παθήσεις από 7

συγκεκριμένες οικογένειες (οικογενείς ασθένειες) και τελικά από το γενικό πληθυσμό. Όμως, αυτό εγείρει αντιπαραθέσεις. Μερικοί θεωρούν αυτό το τύπο θεραπείας ως αφύσικο, ενώ άλλοι ανησυχούν για τις τεχνικές της διαστάσεις. Ανησυχούν ότι η γενετική αλλαγή που θα μεταδοθεί από τη γονιδιακή θεραπεία σε γαμετικά κύτταρα μπορεί στην πραγματικότητα να είναι επιζήμια με απρόβλεπτα αρνητικά αποτελέσματα σε μελλοντικές γενεές. Β. Η γονιδιακή θεραπεία σε σωματικά κύτταρα θεωρείται ως πιο συντηρητική και ασφαλής, επειδή επηρρεάζει μόνο τα κύτταρα-στόχους του ασθενή και δεν μεταφέρεται σε μελλοντικές γενεές. Δηλαδή, το θεραπευτικό αποτέλεσμα περιορίζεται και τελειώνει με το άτομο που θα λάβει την θεραπεία. Όμως αυτός ο τύπος θεραπείας παρουσιάζει από μόνος του προβλήματα. Συχνά τα αποτελέσματα της σωματικής γονιδιακής θεραπείας είναι μικρής χρονικής διάρκειας, επειδή τα κύτταρα των περισσότερων ιστών τελικά πεθαίνουν και αντικαθίστανται από νέα. Έτσι η θεραπευτική διαδικασία απαιτεί την επανάληψή της κατά την διάρκεια ζωής του ασθενή για να διατηρηθεί το θεραπευτικό αποτέλεσμα. Η μεταφορά του γονιδίου στα κύτταρα-στόχους ή ιστούς είναι επίσης προβληματική. Παρά τις δυσκολίες αυτές, η σωματική γονιδιακή θεραπεία είναι κατάλληλη και αποδεκτή για πολλές διαταραχές που περιλαμβάνουν την κυστική ίνωση, την μυϊκή δυστροφία, τον καρκίνο και αρκετές μολυσματικές ασθένειες. Οι κλινικοί ιατροί μπορούν να πραγματοποιήσουν τη θεραπεία αυτή ακόμη και σε πρώϊμο εμβρυϊκό στάδιο ανάπτυξης (in utero), δυνητικά διορθώνοντας ή θεραπεύοντας μία απειλητική για τη ζωή διαταραχή που μπορεί να επηρεάσει αρνητικά την υγεία ή την ανάπτυξη του νεογένητου, εάν δεν αντιμετωπισθεί πρίν την γέννηση. Η σωματική γονιδιακή θεραπεία μπορεί να χωρισθεί σε δύο κατηγορίες: 1. Ex vivo, που σημαίνει εξωτερική (όπου τα κύτταρα τροποποιούνται εκτός σώματος και μετά εμφυτεύονται πάλι σε αυτό). Σε μερικές κλινικές δοκιμές, κύτταρα από το αίμα ή το μυελό οστού του ασθενούς αφαιρούνται και καλλιεργούνται στο εργαστήριο. Τα κύτταρα εκτίθενται στον ιϊκό φορέα που φέρει το επιθυμητό γονίδιο. Ο ιός εισερχόμενος στα κύτταρα εισάγει το επιθυμητό γονίδιο στο DNA των κυττάρων. Τα κύτταρα αναπτύσσονται περαιτέρω στο εργαστήριο και μετά επιστρέφονται στον ασθενή με ενδοφλέβια ένεση. Αυτός ο τύπος γονιδιακής θεραπείας ονομάσθηκε ex vivo γιατί τα κύτταρα υφίστανται τη διαδικασία της θεραπείας εκτός σώματος. 2. In vivo, που σημαίνει εσωτερική, όπου τα κύτταρα τροποποιούνται με το επιθυμητό γονίδιο ενώ είναι στο σώμα του ασθενούς. Αναγεννητική Ιατρική: Επαναπρογραμματισμένα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, ips cells Βασικός στόχος της αναγεννητικής ιατρικής είναι η επιδιόρθωση, η αντικατάσταση ή η αναγέννηση ιστών και οργάνων που δυσλειτουργούν ή έχουν καταστραφεί από τραυματισμό, μέσω κυτταρικής θεραπείας. Ετσι, χρησιμοποιεί τη γνώση αυτή για την πρόληψη και θεραπεία χρόνιων εκφυλιστικών νοσημάτων (π.χ. σακχαρώδης διαβήτης, οστεοαρθρίτιδα, εκφυλιστικά νοσήματα της καρδιάς και του νευρικού συστήματος) και την αποκατάσταση τραυματικών βλαβών. Τα βλαστικά κύτταρα είναι βασικό συστατικό της Αναγεννητικής ιατρικής. Πράγματι, τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα μπορούν πρακτικά να 8

αναγενήσουν όλους τους ιστούς του σώματος (Εικόνα 7), ενώ τα βλαστικά κύτταρα ενηλίκων έχουν ένα στενότερο εύρος διαφοροποίησης. Έχει προταθεί ότι η θεραπεία με βάση τα βλαστικά κύτταρα (stem cell-based therapy) πρόκειται να αποτελέσει στο μέλλον την τρίτη θεραπευτική αρχή, μετά τη χειρουργική και τη θεραπεία με φάρμακα. Η χρήση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (embryonic stem ES- cells) και βλαστικών κυττάρων ενηλίκου (adult stem cells) στη Θεραπευτική έχει συζητηθεί ευρύτατα και έχει πρόσφατα αρχίσει να δοκιμάζεται (ο αμερικανικός οργανισμός F.D.Α ενέκρινε τις πρώτες κλινικές δοκιμές με ανθρώπινα ES κύτταρα τον Ιανουάριο του 2009). Εικόνα 7. Τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα είναι πολυδύναμα και προέρχονται από τη εσωτερική κυτταρική στοιβάδα της βλαστοκύστης. Τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να γίνουν οποιοσδήποτε ιστός του σώματος, εκτός από πλακούντα. Η χρησιμοποίηση, όμως, των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων προσκρούει σε δύο προβλήματα. Συγκεκριμμένα, η δημιουργία των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων από ανθρώπινα έμβρυα ή υλικό της in vitro γονιμοποίησης δεν είναι ηθικά αποδεκτή. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση τέτοιων εμβρυικών βλαστικών κυτταρικών σειρών, σε κάποιους ασθενείς, δεν θα τελεσφορήσει λόγω ανοσολογικής απόρριψης. Όμως και όπως προκύπτει από μια σειρά πρωτοποριακών μελετών, αυτά τα προβλήματα παρακάμπτονται με τη χρήση των επαναπρογραμματισμένων βλαστικών κυττάρων (induced pluripotent stem cells or ips cells). Πιό αναλυτικά: όπως είναι γνωστό τα σωματικά κύτταρα προήλθαν ουσιαστικά από εμβρυϊκά βλαστικά αλλά είναι πλέον τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα, που σημαίνει ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες δεν μπορούν να «επιστρέψουν» στην αρχική πολυδύναμη κυτταρική των κατάσταση. Έτσι, στην λογική της γονιδιακής θεραπείας εάν ένα σωματικό κύτταρο μπορούσε να «επαναπρογραμματισθεί» πρός βλαστικό, θα αποτελούσε ένα σημαντικό θεραπευτικό εργαλείο. Αυτό σήμερα έχει επιτευχθεί μετά το εκπληκτικό βιοτεχνολογικό επίτευγμα της κλωνοποίησης του προβάτου Dolly, πείραμα που απέδειξε ότι ο πυρήνας ενός σωματικού κυττάρου μπορεί να επαπρογραμματισθεί 9

προς ένα πολυδύναμο κύτταρο και μάλιστα να παράξει ένα νέο πλήρη οργανισμό. Στην λογική του επαναπρογραμματισμού τα τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα (π.χ. ινοβλάστες, κερατινοκύτταρα) από κάποιο ασθενή μπορούν να μετατραπούν ex vivo σε βλαστικά κύτταρα με παροδική έκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων (πχ., Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 (Εικόνα 8). Σειρά μελετών απέδειξε ότι αυτά τα ips κύτταρα έχουν τις ιδιότητες των εμβρυικών βλαστικών κυττάρων διαφοροποιούμενα προς όλους τους ιστούς του σώματος, αν και το σημείο αυτό ακόμα εξετάζεται. Ετσι, μπορούν να αντικαταστήσουν τα εμβρυικά βλαστικά κύτταρα στις θεραπευτικές προσεγγίσεις της αναγεννητικής ιατρικής. Το σύστημα αυτό, που ανακαλύφθηκε από τον Yamanaka και τους συνεργάτες του και αναπτύχθηκε αλματωδώς τα τελευταία χρόνια (Takahashi and Yamanaka, 2006), είναι απαλλαγμένο από τους συνήθεις περιορισμούς που συνοδεύουν τη χρήση εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (ανοσολογική απόρριψη, προβλήματα βιοηθικής). Έχει δε πολύ καλές προοπτικές σε ό,τι αφορά την ανάπτυξη κυτταρικών προτύπων που αναπαράγουν την παθογένεια συγκεκριμένων νόσων (disease-specific models), διευκολύνουν τον έλεγχο νέων φαρμάκων και υποβοηθούν την επινόηση σχημάτων εξατομικευμένης κυτταρικής θεραπείας. Εικόνα 8. Διαγραμματικό σχέδιο (flowchart) της δημιουργίας κυττάρων ips με τον επαναπρογραμματισμό διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων. Τα κύτταρα αυτά μπορουν να επαναχορηγηθούν στο άτομο από το οποίο ελήφθη αρχικά το υλικο ή να χρησιμοποιηθούν για πειραματικούς σκοπούς. 10

Ο Δρ. Shinya Yamanaka (http://www.youtube.com/watch?v=hxvrbffahn8) επέτυχε το γενετικό επαναπρογραματισμό διαφοροποιημένων κυττάρων ανθρώπινου ιστού δέρματος χρησιμοποιώντας ένα ρετροϊικό φορέα που έφερε τα γονίδια των τεσσάρων (4) μεταγραφικών παραγόντων: Oct3/4, Sox2, c- Myc και Klf4 (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Σχηματική απεικόνιση του ανασυνδυασμένου Λεντιϊικού (ρετροϊικού) φορέα που φέρει τα γονίδια των μεταγραφικών παραγόντων: Klf4, Oct 3/4, Sox2 και c-myc (κόκκινα βέλη) μεταξύ των 5 LTR & 3 LTR, μακρών τελικών ακολουθιών. Το ανοικτό μπλέ-βέλος (CMV) αντιπροσωπεύει ένα εσωτερικό υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού. Η εκθετική πρόοδος που έχει γίνει τα δύο τελευταία χρόνια σε ότι αφορά φορείς (vectors) και καλλιεργητικά μέσα επιτρέπει τώρα τον μετασχηματισμό διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων σε «πολυδύναμα» βλαστικά κύτταρα σε αρκετά υψηλό ποσοστό και χωρίς τη χρήση ιϊκών στοιχείων. Η σχετική σταδιακή πειραματική διαδικασία μεταφοράς των μεταγραφικών παραγόντων σε σωματικά κύτταρα, μέσω ρετροϊών, για τη λήψη ips απεικονίζεται συνοπτικά στην Εικόνα 10 Εικόνα 10. Σχηματική απεικόνιση των σταδίων γένεσης επαναπρογραμματισμένων πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων. (1) απομόνωση και καλλιέργεια κυττάρων δότη. (2) μεταφορά γονιδίων που επαναπρογραμματίζουν τα κύτταρα του δότη μέσω ιϊκών φορέων. Τα κόκκινα κύτταρα δείχνουν τα κύτταρα εκείνα που εκφράζουν τα εξωγενή γονίδια. (3) απομόνωση και καλλιέργεια των κυττάρων αυτών. (4) μία μικρή ομάδα από τα κύτταρα που 11

εκφράζουν τα μεταφερθέντα γονίδια γίνονται πολυδύναμα βλαστικά ips και παράγουν αποικίες κυττάρων που ομοιάζουν με εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Παραδείγματα video σε πραγματικό χρόνο επαναπρογραμματισμού σωματικών κυττάρων προς ips σε συνθήκες κυτταροκαλλιέργειας μπορεί κανείς να παρακολουθήσει σε ινοβλάστες ποντικού (http://www.youtube.com/watch?v=vdhhq2zrsra) ή της διαφοροποίησης των προς νευρικά κύτταρα (http://www.youtube.com/watch?v=qfnonftpwu0) ή και προς παραγωγή καρδιομυοκυττάρων (http://www.youtube.com/watch?v=b7vwpiilcmc). Η χρησιμοποίηση, όμως, των ips κυττάρων ενέχει τον κίνδυνο της ενθετικής μεταλλαξιγένεσης από τους ιικούς φορείς. Ετσι, η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου στο σημείο που ενοφθαλμίζονται τα κύτταρα αυτά δεν είναι αμελητέα αποτρέποντας την χρήση τους στον άνθρωπο. Τα τελευταία χρόνια γίνεται μεγάλη προσπάθεια δημιουργίας ips κυττάρων με μεθόδους που δεν επιτρέπουν την δημιουργία ενθετικής μεταλλαξιγένεσης. ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Hybrid lentiviral vectors. Qasim W., Vink CA, Thraser AJ. Mol Ther. 2010 18(7): 1263-7 Review. 2. Gene therapy strategies for hemophilia: benefits versus risks. Petrus I, Chuah M, Vander-Driessche T. J Gene Med 2010 12(10): 797-809. 3. Possible applications for replicating HIV 1 vectors. Das A., Jeeninga R., Berkhout B. HIV Ther. 2010 4(3): 361-369. 4. An introduction to induced pluripotent stem cells. Hanley J., Rastergarlari G., Nathwani AC. Br J Haematol. 2010, 151(1): 16-24 Review. 5. Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. Yamanaka S., Blau HM. Nature 2010, 465 (7299): 704-12 Review. 12