Τα φυτά του γένους Sideritis «τσάι του βουνού» στην ελληνική αγορά βοτάνων: Ταξινομικός προσδιορισμός και αντιοξειδωτική ικανότητα εκχυλισμάτων

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Διατήρηση της Βιοποικιλότητας και Αειφορική Εκμετάλλευση Αυτοφυών Φυτών (ΒΑΦ)» Τα φυτά του γένους Sideritis «τσάι του βουνού» στην ελληνική αγορά βοτάνων: Ταξινομικός προσδιορισμός και αντιοξειδωτική ικανότητα εκχυλισμάτων Ελένη Σπανίδη Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία Επιβλέπουσα: Στέλλα Κοκκίνη, καθηγήτρια Θεσσαλονίκη 2014

ARISTOTLE UNIVERSITY OF THESSALONIKI FACULTY OF SCIENCE SCHOOL OF BIOLOGY Postgraduate Studies Program Conservation of Biodiversity and Sustainable Exploitation of Native Plants (BNP) Sideritis plants mountain tea in the Greek herbal market: Taxonomic identification and antioxidant activity of their herbal Eleni Spanidi Master Thesis Supervisor: Stella Kokkini, professor Thessaloniki 2014

Εξεταστική Επιτροπή: Κοκκίνη Σ. 1,2, Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Α.Π.Θ. Αρσενάκης Μ. 2, Καθηγητής, Τμήματος Βιολογίας, Α.Π.Θ. Λαναράς Θ. 2, Καθηγητής, Τμήματος Βιολογίας, Α.Π.Θ. 1 Επιβλέπουσα Καθηγήτρια 2 Μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής «Η έγκριση της παρούσας Διπλωματικής Εργασίας από το Τμήμα Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών της συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202 2). i

Ευχαριστίες Η παρούσα Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Διατήρηση Βιοποικιλότητας και Αειφορικής Εκμετάλλευσης Αυτοφυών Φυτών» του τμήματος Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης κατά το χρονικό διάστημα 2013-2014. Κατ αρχάς, θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα μου Σ. Κοκκίνη, Καθηγήτρια του τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ., για την καθοδήγηση και τις συμβουλές της κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διπλωματικής εργασίας. Επίσης, να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στα μέλη της εξεταστικής επιτροπής τους Καθηγητές του Τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ., Μ. Αρσενάκη και Θ. Λαναρά, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και συμβουλές τους. Επιθυμώ να ευχαριστήσω το Διευθύνοντα Σύμβουλο της εταιρείας APIVITA κ. Ν. Κουτσιανά, για την παραχώρηση των εργαστηρίων της ως άνω εταιρίας για την τέλεση των πειραμάτων αλλά κυρίως που από την πρώτη στιγμή με έκανε να νιώσω ότι αποτελώ μέλος της «κυψέλης». Ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Διευθυντή Επιστημονικών Υποθέσεων της APIVITA, Δρ. Κ. Γαρδίκη, για τη συνεχή υποστήριξη, την πολύτιμη καθοδήγηση και τις συμβουλές του στο πειραματικό μέρος, η βοήθειά του ήταν πραγματικά πολύτιμη. Ευχαριστώ θερμά το Διευθυντή Ανάπτυξης Νέων Δραστηριοτήτων APIVITA, Υπεύθυνο Εταιρικής Κοινωνικής Ευθύνης APIVITA & Διευθύνοντα Σύμβουλο ΑPIGEA, κ. Α. Τσουκαλά, για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονηθεί η εργασία μου στην ως άνω εταιρεία και για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Δεν θα παραλείψω να ευχαριστήσω θερμά τους Π. Δραγάνη και Δρ. Ι. Μουρτζίνο, διευθυντές των τμημάτων Έρευνας & Ανάπτυξης και Ποιοτικού Ελέγχου, όπως και όλα τα μέλη των παραπάνω εργαστηρίων, ιδιαίτερα τους Ε. Κυραμάριου, Ν. Βαρδουλάλη, Δρ. Ε. Κούρτογλου, Ε. Μαργαρίτη, Γ. Ζορζοβίλη, Γ. Σουλτάνη & Γ. Κουτουλά, Ε. Κουβελάκη για το ευχάριστο περιβάλλον και τη βοήθεια που μου προσέφεραν κατά το διάστημα της παραμονής μου στo εργαστήριo Έρευνας και Ανάπτυξης. Ευχαριστώ τους κκ. Σ. Μπαμπάκο και Κ. Γάκη, καλλιεργητές για την παραχώρηση φυτικού υλικού, που χρησιμοποιήθηκαν για την τέλεση των πειραμάτων. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω μέσα από την καρδία μου, τους «δασκάλους» και τους φίλους που ήταν πάντα εκεί σε κάθε μου επιλογή και με στήριξαν με αγάπη. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την Αρίστη και την Όλια, με τις οποίες μοιραστήκαμε ανησυχίες, άγχη, χαρές και γέλια αυτά τα χρόνια. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου, την Σταυρούλα, τον Νίκο και την οικογένεια Κουρτίδη για την υλική στήριξη, αλλά κυρίως για την αγάπη τους όλα αυτά τα χρόνια. ii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Συντμήσεις και ορολογία που χρησιμοποιούνται στο κείμενο 1 Ευρετήριο Πινάκων 2 Ευρετήριο Γραφημάτων 3 Ευρετήριο Εικόνων 4 Περίληψη 5 Abstract 6 1. Εισαγωγή 7 1.1 Τα βότανα από την αρχαιότητα μέχρι την σύγχρονη αγορά βοτάνων 7 1.2 Γένος Sideritis «τσάι του βουνού» 8 1.3 Αντιοξειδωτική ικανότητα 10 1.4 Οι κύριες ομάδες φαινολικών ενώσεων στα φυτά 12 1.5 Τεχνικές εκχύλισης 13 Σκοπός 15 2. Υλικά και Μέθοδοι 16 2.1 Φυτικό Υλικό 16 2.1.1 Προέλευση 16 2.1.2 Ταξινομικός Προσδιορισμός 19 2.2 Υλικά 20 2.3 Όργανα 20 2.4 Προετοιμασία Εκχυλισμάτων 20 2.4.1. Υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion) 20 2.4.2Υδατική εκχύλιση Αφέψημα (Decoction) 20 2.4.3 Υδρο-γλυκερινικά εκχυλίσματα με υγρό υπό πίεση (PLE) 21 2.5 Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας (μέθοδος DPPH ) 22 2.6 Προσδιορισμός φαινολικού περιεχομένου (μέθοδος Folin-Ciocalteu) 23 2.7 Στατιστική Ανάλυση 24 3. Αποτελέσματα Συζήτηση 25 3.1 Φυτικό Υλικό Ταξινομικός Προσδιορισμός 25 3.1.1 Δείγματα εμπορίου 32 3.1.2 Δείγματα καλλιέργειας 36 3.2 Αντιοξειδωτική ικανότητα και φαινολικό περιεχόμενο εκχυλισμάτων 38 3.2.1 S. perfoliata subsp. perfoliata 39 3.2.2 S.raeseri subsp. raeseri 44 3.2.3 S. scardica 49 3.2.4 Συσχέτιση Αντιοξειδωτικής ικανότητας και φαινολικού περιεχομένου 54 4. Συμπεράσματα 56 Βιβλιογραφία 58 iii

Ηλεκτρονικές πηγές 63 Παραρτήματα 64 Παράρτημα 1. Εμπορικά Δείγματα 64 Παράρτημα 2. Καλλιεργούμενα Δείγματα 82 iv

Συντμήσεις και ορολογία που χρησιμοποιούνται στο κείμενο Control Δείγμα ελέγχου Blank Κενό δείγμα DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (1,1 διφαινυλο-2-πικρυλυδραζυλίνη) FCPr Folin Ciocalteu s Phenol reagent (Αντιδραστήριο Folin Ciocalteu) GA Gallic Acid (Γαλλικό οξύ) Gly Glycerin (Γλυκερίνη) MeOH Methanol (Μεθανόλη) Microcare SB Sodium benzoate and potassium sorbate in water (Βενζοϊκό νάτριο και σορβικό κάλιο σε νερό) PLE Pressurized Liquid Extraction (Εκχύλιση με υγρό υπό πίεση) RI Refraction Index (Δείκτης Διάθλασης) ROS Reactive Oxygen Species (Ενεργές Μορφές Οξυγόνου) SD Standard Deviation (Τυπική Απόκλιση) TAU Thessaloniki Aristotle University Trolox C18H12N5O6 (Ανάλογο Βιταμίνης Ε) UV-Vis Ultraviolet-Visible (Υπεριώδης Ορατό) ΑΦΦ Αρωματικά Φαρμακευτικά Φυτά (Medical Aromatic Plants - MAPs) 1

Ευρετήριο Πινάκων Πίνακας 2.1.1. Προέλευση, έτος αγοράς ή συγκομιδής και κωδικός αριθμός εμπορικών και καλλιεργούμενων δειγμάτων του γένους Sideritis ( Μ = Market Αγορά, C = Cultivation Καλλιέργεια) Πίνακας 3.1.1. Taxa του γένους Sideritis στα οποία ανήκουν τα δείγματα που μελετήθηκαν και διαστάσεις των βρακτίων φύλλων (μέγιστο μήκος x πλάτος) από το μέσο της ταξιανθίας (n=3). Πίνακας 3.1.2. Εύρος διαστάσεων βρακτίων φύλλων (μέγιστο μήκος x πλάτος σε mm) από το μέσο της ταξιανθίας των έξι υπό μελέτη taxa του γένους Sideritis & οι διαστάσεις των βρακτίων φύλλων όπως δίνονται από Baden (1991). Πίνακας 3.2.1. Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) και φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του Sideritis perfoliata subsp. perfoliata. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος τριών εκχυλίσεων±sd. Τιμές στην ίδια στήλη με τον ίδιο εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05) Πίνακας 3.2.2. Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) και φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του Sideritis raeseri subsp. raeseri. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Οι τιμές στην αντιοξειδωτική ικανότητα παρουσιάζουν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ τους και οι τιμές με τον ίδιο εκθέτη στο φαινολικό περιεχόμενο παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05). Πίνακας 3.2.3.Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) και φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του S.scardica. Οι τιμές είναι εκφρασμένες ως μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Τιμές στην ίδια στήλη με τον ίδιο εκθέτη παρουσιάζουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0.05). 16 25 29 39 44 49 2

Ευρετήριο Γραφημάτων Γράφημα 3.2.1 Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) εκχυλισμάτων του Sideritis perfoliata subsp. perfoliata για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.2 Αντιοξειδωτική ικανότητα υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis perfoliata subsp. perfoliata, για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.3 Φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του Sideritis perfoliata subsp. perfoliata για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.4 Φαινολικό περιεχόμενο υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis perfoliata subsp. perfoliata, για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.5 Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) εκχυλισμάτων του Sideritis raeseri subsp. raeseri για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.6 Αντιοξειδωτική ικανότητα υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis raeseri subsp. raeseri, για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.7 Φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του Sideritis raeseri subsp. raeseri για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.8 Φαινολικό περιεχόμενο υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis raeseri subsp. raeseri, για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.9 Αντιοξειδωτική ικανότητα (mm Trolox) εκχυλισμάτων του Sideritis scardica για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.10 Αντιοξειδωτική ικανότητα υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis scardica για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.11 Φαινολικό περιεχόμενο (mg GA/L) εκχυλισμάτων του Sideritis scardica για υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion), αφέψημα (Decoction) και υγρό υπό πίεση PLE. Για χρόνους εκχύλισης (2, 10, 15, 20 και 363) min, σε μορφή σκόνη (P) και τεμαχισμένο με το χέρι (A). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. Γράφημα 3.2.12 Φαινολικό περιεχόμενο υδατικών εκχυλισμάτων αφεψημάτων του Sideritis scardica για χρόνο εκχύλισης (2, 10, 15 και 20) min, σε μορφή σκόνη ( ) και τεμαχισμένο με το χέρι ( ). Τα δεδομένα είναι εκφρασμένα ως ο μέσος όρος τριών εκχυλίσεων ± SD. 40 41 42 43 45 46 47 48 50 51 52 53 Γράφημα 3.2.12 Συσχέτιση αντιοξειδωτικής ικανότητας και φαινολικού περιεχομένου. 55 3

Ευρετήριο Εικόνων Εικόνα 1.2.1. Γεωγραφική εξάπλωση του γένος Sideritis (Barber et al., 2002). 8 Εικόνα 2.4.1. Εκχυλιστήρας τύπου Timatic. Α: Θάλαμος εκχύλισης Β: Έμβολο πίεσης Ε: Πνευματική βαλβίδα. Εικόνα 2.5.2. Ελεύθερη ρίζα 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH ) (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/d9132?lang=en&region=gr) 21 22 Εικόνα 3.1.1. Βράκτια φύλλα a. Sideritis clandestina subsp. clandestina, b. Sideritis perfoliata subsp. perfoliata, c. Sideritis syriaca subsp. syriaca και d. Sideritis scardica. 29 Εικόνα 3.1.2. Βράκτια φύλλα από το Sideritis euboea. 29 Εικόνα 3.1.3. Βράκτια φύλλα από το μέσο της ταξιανθίας του Sideritis raeseri subsp. raeseri. 30 Εικόνα 3.1.4. a. Φυτικό δείγμα του Sideritis clandestina subsp. clandestina και b. ετικέτα του ίδιου δείγματος που αναγράφει «Sideritis euboea», είδος που δε φύεται στην «κορυφή του Ταϋγέτου». 34 Εικόνα 3.1.5. Ετικέτα δείγματος από Sideritis raeseri subsp. raeseri (M_SRr_15) που η ετικέτα αναγράφει «Sideritis raeseri». Εικόνα 3.1.6. Ετικέτα δείγματος Sideritis euboea (M_SE_10), με αναγραφόμενη κοινή ονομασία «μαλοτήρα». Με το κοινό όνομα «μαλοτήρας» συνήθως γίνεται αναφορά σε ενδημικά είδη της Κρήτης (Sideritis syriaca subsp. syriaca). 34 35 Εικόνα 3.1.7. Ετικέτα δείγματος Sideritis scardica (C_SS_19). 35 4

Περίληψη Τα είδη του γένους Sideritis «τσάι του βουνού» της οικογένειας Lamiaceae (Labiatae) χρησιμοποιούνται ιδιαίτερα από την ελληνική παραδοσιακή ιατρική ως αφεψήματα για αρκετές ασθένειες. Η παρούσα εργασία στοχεύει στην καταγραφή και στον ταξινομικό προσδιορισμό των βοτάνων που διακινούνται στην ελληνική αγορά ως «τσάι του βουνού» και στη διερεύνηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας και του φαινολικού περιεχομένου των εκχυλισμάτων τους. Ταξινομήθηκαν 60 φυτικά δείγματα που προέρχονται από τέσσερις καλλιέργειες και από 40 σημεία πώλησης σε έξι περιοχές της Ελλάδας. Ο ταξινομικός προσδιορισμός υπέδειξε ότι αυτά ανήκουν σε έξι taxa του γένους Sideritis. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν εκχυλίσματα με διαφορετικές συνθήκες και μελετήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους ικανότητα και το φαινολικό τους περιεχόμενο. Παρασκευάστηκαν υδατικά εκχυλίσματα με την παραδοσιακή μέθοδο της εμβάπτισης (infusion). Ακόμα, παρασκευάστηκαν υδατικά εκχυλίσματα - αφεψήματα (decoction) και μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου εκχύλισης και της μορφής του φυτικού υλικού (σκόνη και ολόκληρο το φυτικό υλικό). Τέλος, τα ίδια taxa εκχυλίστηκαν, με την τεχνική της εκχύλισης με υγρό υπό πίεση (PLE) χρησιμοποιώντας τη διπλή επίδραση της πίεσης και της αποσυμπίεσης. Ως διαλύτες χρησιμοποιήθηκαν νερό και υδατικό μείγμα γλυκερίνης. Τέλος, τα διαφορετικά εκχυλίσματα συγκρίθηκαν ως προς την παρασκευή τους. Για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος DPPH (εκφρασμένο σε mm Trolox) και για το φαινολικό περιεχόμενο η μέθοδος Folin - Ciocalteau (εκφρασμένο σε mg GA/L). Ο ταξινομικός προσδιορισμός των φυτικών δειγμάτων υπέδειξε ότι αυτά ανήκουν σε έξι taxa του γένους Sideritis που αυτοφύονται στην Ελλάδα και το πιο κοινά διακινούμενο στην ελληνική αγορά είναι το S. raeseri subsp. raeseri. Οι τιμές της αντιοξειδωτικής ικανότητας των εκχυλισμάτων του S.perfoliata subsp. perfoliata κυμαίνονται από 1.40±0.21 έως 10.62±1.18 mm Trolox και του φαινολικό περιεχομένου από 251,80±14 έως 2200,40±236 mg GA/L, παρουσιάζοντας το υψηλότερες συγκεντρώσεις με τα υπόλοιπα taxa. Οι τιμές των εκχυλισμάτων του S. raeseri subsp. raeseri κυμαίνονται από 0.49±0.07 έως 4,72±0,46 mm Trolox για την αντιοξειδωτική ικανότητα και από 99,90±23 έως 868,39±55 mgga/l για το φαινολικό περιεχόμενο. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των εκχυλισμάτων του S. scardica κυμαίεται από 0.82±0.51 έως 4,98±0,05 mm Trolox και το φαινολικό περιεχόμενο από 101,28±39 έως 1057,02±125 mgga/l. Για όλα τα εκχυλίσματα φάνηκε ότι όσο αυξάνεται ο χρόνος εκχύλιση, αυξάνεται και η αντιοξειδωτική ικανότητα και το φαινολικό περιεχόμενο. Ακόμα, παρατηρήθηκε ότι όταν το φυτικό υλικό που εκχυλιζόταν ήταν σε σκόνη παρουσιάζε υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα και φαινολικό περιεχόμενο. Η μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα και το φαινολικό περειχόμενο παρουσιάζεται στα εκχυλίσματα που δημιουργήθηκαν με υγρό υπό πίεση (PLE). Όταν χρησιμοποιείται υδατικό μείγμα γλυκερίνης ως διαλύτης εκχυλίζει περισσότερα φαινολικά συστατικά αυξάνοντας την αντιοξειδωτική ικανότητα των εκχυλισμάτων. Η αντιοξειδωτική ικανότητα των εκχυλισμάτων φαίνεται να οφείλεται στο φαινολικό περιεχόμενό τους, καθώς υπάρχει συσχέτιση μεταξύ τους. Παρ όλο που η ανιοξειδωτική ικανότητα και το φαινολικό περιεχόμενο των εκχυλισμάτων του Sideritis διαφοροποιείται ανάλογα με το taxon, το διαλύτη, την τεχνική και το χρόνο εκχύλισης μπορεί να θεωρηθεί φυσική πηγή αντιοξειδωτικών. 5

Abstract The extracts of several species of the genus Sideritis mountain tea (Lamiaceae), are widely used by greek folk medicine for several diseases. The aim of this study is to record and taxonomically identify the herbs sold as mountain tea in the greek market and to investigate the antioxidant activity and the phenolic content of their extracts. 60 samples of herbs were collected from 40 market spots and three cultivars in six locations. The samples were taxonomically identified and belonged to six taxa of genus Sideritis. Aqueous extract from three taxa was prepared using the traditional method of infusion. Furthermore, the aqueous extract from the same taxa was prepared using the method of decoction. The effects of extraction time and plant material form (aerial part and powder) were studied. Last, the extract of same taxa was prepared using the technique of Pressurized Liquid Extraction (PLE) for the first time for the genus Sideritis using the double effect of pressure/decompression and forced percolation of the plant, with water and an aqueous mixture of glycerol used as solvents. The antioxidant activity of the extracts was determined using the DPPH method (mm Trolox), as well as their phenolic content using the Folin-Ciocalteau method (mg GA/L). The six collected Sideritis taxa are all native in Greece and the most common taxon sold in the greek market is S. raeseri subsp. raeseri. The values of the antioxidant activity of the S. perfoliata subsp. perfoliata extracts varied from 11.40±0.21 to 10.62±1.18 mm Trolox and the values of the phenolic content varied from 251,80±14 to 2200,40±236 mg GA/L. The values of the antioxidant activity of the S. raeseri subsp. raeseri extracts varied from 0.49±0.07 to 4,72±0,46 mm Trolox and the values of the phenolic content varied from 99,90±23 to 868,39±55 mg GA/L. The values of the antioxidant activity of the S. scardica extracts varied from 0.82 ± 0.51 to 4,98 ± 0,05 mm Trolox and values of the phenolic content varied from 101,28±39 to 1057,02±125 mgga / L. The extraction time and the form of the plant material appeared to be associated with antioxidant capacity and phenolic content. From the above, was found that the highest antioxidant capacity and the highest phenolic content were in extract from S.perfoliata subps. perfoliata. In all cases, the extract from derived from PLE, it was observed that the values of the antioxidant activity and the phenolic content of the hydro-glycerin extracts were higher. 6

1. Εισαγωγή 1.1 Τα βότανα από την αρχαιότητα μέχρι την σύγχρονη αγορά βοτάνων Η χρήση των βοτάνων βασίζεται σε εμπειρία χιλιάδων χρόνων και αναπτύχθηκε μέσω της «δοκιμής και λάθους» ( trial and error ) (Camejo-Rodrigues et al., 2003). Οι φαρμακευτικές ιδιότητες των φυτών ήταν γνωστές στους Έλληνες από την αρχαιότητα. Ο Ιπποκράτης (460 377 π. Χ.), ο Αριστοτέλης (384-322 π. Χ.) ο Θεόφραστος (~ 300 π. Χ.) και ο Διοσκουρίδης (100 μ. Χ.) συνέβαλλαν σημαντικά στην ορθολογική χρήση των φυτικών φαρμάκων (Hanlidou et al., 2004, Gurib-Fakim, 2006). Τα βότανα ήταν η κύρια θεραπευτική μέθοδος μέχρι τα μέσα του 19 ου αιώνα και ακόμη και σήμερα, σε πολλές χώρες της Ευρώπης η χρήση τους ως αφεψήματα είναι πολύ δημοφιλής, αποτελώντας εναλλακτική λύση σε φάρμακα που προέρχονται από συνθετικές χημικές ουσίες (Camejo-Rodrigues et al., 2003, Gurib-Fakim, 2006). Η γνώση για την χρήση των βοτάνων επιβίωσε μέχρι τις μέρες μας μέσω της παράδοσης. Στις Ελληνικές πόλεις έχουν καταγραφεί καταστήματα που διακινούν βότανα και κατατάσσονται κυρίως σε τρεις κατηγορίες, αυτές των παραδοσιακών και σύγχρονων καταστήματα και τους πάγκους λαϊκής αγοράς (Hanlidou et al., 2004). Έχουν δημοσιευτεί έρευνες για την αγορά της Θεσσαλονίκης (Hanlidou et al., 2004, Karousou et al., 2007), της Κύπρου (Karousou & Deirmentzoglou, 2011) και της Ξάνθης (Αδαμίδου, 2012). Οι πιο ευρέως εμπορικά διακινούμενες οικογένειες φυτών στην Ελλάδα είναι αυτές των Lamiaceae (Labiatae), Compositae και Umbelliferae (Hanlidou et al., 2004). Από τις παραπάνω οικογένειες τον μεγαλύτερο αριθμό taxa εμφανίζει αυτή των Lamiaceae και θεωρείται η σημαντικότερη στην Ελλάδα, καθώς τα περισσότερα taxa της παράγουν αιθέρια έλαια, συμμετέχουν σε όλους τους τύπους βλάστησης και πολλά από αυτά είναι ενδημικά (Kokkini et al., 1988). Τα περισσότερα taxa της οικογένειας Lamiaceae που διακινούνται εμπορικά στην Ελλάδα, ανήκουν στα γένη Mentha και Sideritis, ενώ ακολουθούν τα γένη Origanum, Salvia, Acinos, Thumys και Teucrium (Hanlidou et al., 2004, Karousou et al., 2007, 2011). 7

1.2 Γένος Sideritis «τσάι του βουνού» Το γένος Sideritis περιλαμβάνει περισσότερα από 150 είδη τα οποία απαντώνται σε εύκρατα και τροπικά κλίματα του Βορείου Ημισφαιρίου από τις Μπαχάμες προς τη Δυτική Κίνα και από τη Γερμανία στο Μαρόκο. Τα περισσότερα είδη απαντώνται στη Μεσόγειο, από τα Κανάρια νησιά έως τη Μαδέρα και τον Καύκασο, την Ισπανία και την Τουρκία (Εικόνα 1.2.1) (González-Burgos et al., 2011). Εικόνα 1.2.1. Γεωγραφική εξάπλωση του γένος Sideritis (Barber et al., 2002). Σύμφωνα με Dimopoulos et al. (2013) στην Ελλάδα απαντώνται 16 taxa που ανήκουν σε 12 είδη του γένους: Sideritis albiflora Hub.- Mor. (Ανατολική Μεσόγειο) Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek subsp. clandestina (Ενδημικό της Ελλάδας) Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek subsp. peloponnesiaca (Boiss & Heldr.) Baden in Strid & Tan (Ενδημικό της Ελλάδας) Sideritis curvidens Stapf (Ανατολική Μεσόγειο) Sideritis euboea Heldr. (Ενδημικό της Ελλάδας) Sideritis lanata L. (Βαλκάνια Ανατολία) Sideritis montana L. subsp. montana (Μεσόγειο - Νοτιοδυτική Ασία) Sideritis montana subsp. remota (d Urv) P. W. Ball (Μεσόγειο - Νοτιοδυτική Ασία) 8

Sideritis perfoliata L. subsp. athoa (Papan. & Kokkini) Baden in Strid & Tan (Βαλκάνια - Ανατολία) Sideritis perfoliata L. subsp. perfoliata (Ανατολική Μεσόγειο) Sideritis purpurea Talbot ex Benth (Βαλκάνια) Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. in Boiss. subsp. attica (Heldr.) Papan. & Kokkini (Ενδημικό της Ελλάδας) Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. in Boiss subsp. raeseri (Βαλκάνια) Sideritis scardica Griseb. (Βαλκάνια) Sideritis sipylea Boiss. (Ανατολική Μεσόγειο) Sideritis syriaca L. subsp. syriaca (Ενδημικό της Ελλάδας) Σύμφωνα με τον Baden (1991) τα είδη που απαντώνται στην περιοχή της Ελλάδας ανήκουν σε δύσκολη ταξινομική ομάδα. Τα taxa του γένους Sideritis είναι πόες με ελαφρώς ξυλώδη βλαστό και συχνά με πυκνό τρίχωμα. Τα φύλλα τους είναι ακέραια ή οδοντωτά και οι σπόνδυλοι είναι απομακρυσμένοι ή συναθροίζονται σε σταχυόμορφη ταξιανθία. Ο κάλυκας είναι αρχικά σωληνοειδής που καταλήγει οδοντωτός. Η στεφάνη έχει κίτρινο χρώμα (Baden, 1991). Τα είδη του γένους Sideritis «τσάι του βουνού» χρησιμοποιούνται παραδοσιακά σε Ισπανία, Τουρκία και Ελλάδα ως αφεψήματα (González-Burgos et al., 2011, Baden, 1991) για τις ευεργετικές του ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια παρατηρείται αύξηση της ζήτησης του, καθώς αυξάνεται ο αριθμός των δημοσιευμάτων για τις θεραπευτικές του δράσεις (González-Burgos et al., 2011). Η χρήση του ως παραδοσιακό φάρμακο είναι γνωστή από την αρχαιότητα, ο Διοσκουρίδης το περιγράφει τον 1 ο αιώνα. Το όνομα του γένους προέρχεται από την ελληνική λέξη «Σίδερος», λόγο της χρήσης του, κατά την αρχαιότητα, να γιατρεύει πληγές που προέρχονταν από μέταλλο (Font Quer, 2000 cited in González-Burgos et al., 2011). Σύμφωνα με μελέτες τα φυτά του γένους Sideritis χρησιμοποιούνται στην παραδοσιακή ιατρική για ασθένειες που αφορούν: Γαστρεντερικές παθήσεις: κατά της δυσπεψίας (Hanlidou et al., 2004) και του έλκους, Παθήσεις του αιμοποιητικού συστήματος: κατά της αναιμίας (Hanlidou et al., 2004), Μολύνσεις ασθένειες: γρίπη (Hanlidou et al., 2004) αναπνευστικού, αντιμικροβιακό, Νευρολογικά: αναλγητικό, ηρεμιστικό (Hanlidou et al., 2004) & αντισπασμωδικό, Παθήσεις αναπνευστικού: κατά του κοινού κρυολογήματος (Hanlidou et al., 2004), 9

Παθήσεις του ουροποιητικού συστήματος: διουρητικό (Hanlidou et al., 2004), λοιμώξεις του ουροποιητικού, Άλλα: αντιπυρετικό, τονωτικό, αντιφλεγμονώδες & επουλωτικό (González-Burgos et al., 2011, Kokkini et al., 2003, Hanlidou et al., 2004). Σύγχρονες μελέτες επιβεβαιώνουν την παραδοσιακή χρήση των φυτών του γένους καθώς βρέθηκε ότι τα εκχυλίσματα και τα αιθέρια έλαια έχουν: Αντιοξειδωτική δράση (Armata et al., 2008, Charami et al., 2008, Ertas et al., 2009, Gabrieli et al., 2005, González-Burgos et al., 2011, Güvenç et al., 2010, Linardaki et al., 2011, Skouroliakou et al., 2009, Tekeli, 2012), Αντιφλεγμονώδη δράση (Charami et al., 2008, González-Burgos et al., 2011, Güvenç et al., 2010, Tadicnja et al., 2012), Αντιμικροβιακή δραστικότητα (Aligiannis et al., 2001, González-Burgos et al., 2011), Μεταξύ αυτών αναφέρονται και δράσεις κατά του HIV, αναλγητικές, ανασταλτικές κα (Ertas et al., 2009, González-Burgos et al., 2011, Güvenç et al., 2010, Tadicnja et al., 2012). Η φαρμακευτική δράση των ειδών του γένους Sideritis οφείλεται κυρίως σε χημικά συστατικά, όπως τερπένια, φλαβονοειδή, κουμαρίνες, στερόλες, ιριδοειδή, λιγνάνες και αιθέρια έλαια. Τα διτερπένια, τα φλαβανοειδή καθώς και τα αιθέρια έλαια απαντώνται σχεδόν σε κάθε είδος του γένους (González-Burgos et al., 2011). 1.3 Αντιοξειδωτική ικανότητα Πολλές βιολογικές δράσεις των φυτών (όπως μείωση της αρτηριακής πίεσης, πρόληψη καρδιαγγειακών ασθενειών, μείωση της εμφάνισης καρκίνου κ.ά.) είναι πιθανό να οφείλονται στην αντιοξειδωτική τους δράση (Škrovánková et al., 2012). Στην ίδια δράση φαίνεται να οφείλονται και αρκετές φαρμακευτικές ιδιότητες που εμφανίζουν τα είδη του γένους Sideritis (González-Burgos et al., 2011). Πολλά προϊόντα οξείδωσης φαίνεται να προκαλούν κυτταρικές βλάβες στο σώμα και έτσι η οξείδωση έχει συσχετιστεί με χρόνιες ασθένειες, όπως για παράδειγμα ο καρκίνος. Συστήνεται η κατανάλωση τροφίμων (φρούτα, λαχανικά, Αρωματικά Φαρμακευτικά Φυτά - ΑΦΦ κ.ά.) που περιέχουν αντιοξειδωτικά για την ενίσχυση του οργανισμού. Οι περισσότερες μελέτες βασίζονται κυρίως στην in vitro μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας των ΑΦΦ (Škrovánková et al., 2012). Παρόλο που δεν υπάρχει κάποιος διεθνώς αποδεκτός όρος για τα αντιοξειδωτικά, μπορούν να θεωρηθούν οι ουσίες που είναι δότες υδρογόνου ή ηλεκτρονίου (Miguel, 2010) και εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες (Škrovánková et al., 2012). 10

Στη βιομηχανία τροφίμων, αντιοξειδωτικό θεωρείται κάθε ουσία η οποία αποτρέπει ή καθυστερεί σημαντικά την οξείδωση του υποστρώματος (ουσιών που είναι ευαίσθητες ως προς την διαδικασία της οξείδωσης) όταν βρίσκεται σε μικρότερες συγκεντρώσεις από αυτές του υποστρώματος (Becker et al., 2004). Η δημιουργία των ελεύθερων ριζών οφείλεται σε εξωγενείς πηγές (καπνό, ατμοσφαιρική ρύπανση, όζον, μονοξείδιο και διοξείδιο του αζώτου, ρίζες υδροξυλίου, ιονίζουσα ακτινοβολία κ.ά.) καθώς και από ενδογενείς πηγές. Οι διεργασίες οξείδωσης στον άνθρωπο (κυρίως ενζυμικές) είναι υπεύθυνες για το σχηματισμό Ενεργών Μορφών Οξυγόνου (Reactive Oxygen Species ROS), που είναι απαραίτητες για διεργασίες του οργανισμού (πχ. συντήρηση της ενέργειας, αντιδράσεις του ανοσοποιητικού κ.ά.) (Škrovánková et al., 2012). Οι ελεύθερες ρίζες (όπως το υδροξύλιο (ΟΗ ), υπεροξείδιο (Ο2 - ), αλκοξύλιο (RO ) και υπεροξύλιο (RO2 )) είναι μόρια ή άτομα που στην εξωτερική τους στιβάδα έχουν ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια (Škrovánková et al., 2012, Schlesier et al., 2002). Είναι γενικά ασταθή μόρια (Škrovánková et al., 2012) και συμμετέχουν εύκολα σε αντιδράσεις οξειδοαναγωγής με γειτονικά μόρια (Schlesier et al., 2002). Το ανθρώπινο σώμα διαθέτει μηχανισμούς άμυνας έναντι των ROS (προληπτικούς μηχανισμούς, μηχανισμούς επιδιόρθωσης, αντιοξειδωτικές άμυνες). Ως αντιοξειδωτικά για το ανθρώπινο σώμα μπορούν να ενεργούν και ορισμένες ουσίες χαμηλού μοριακού βάρους (πχ. ουρικό οξύ, ασκορβικό - βιταμίνη C, τοκοφερόλες - βιταμίνη E). Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ του σχηματισμού και της απομάκρυνσης ROS, με συνέπεια την αύξηση των οξειδώσεων από ROS, ονομάζεται «οξειδωτικό στρες» (oxidative stress) και είναι παράγοντας πρόκλησης ασθενειών. Δυνητικά μπορεί να προκαλέσει αυτοάνοσα νοσήματα, καρδιαγγειακές παθήσεις, καρκίνο, αθηροσκλήρωση, ρευματοειδή αρθρίτιδα, νευροεκφυλιστικές ασθένειες (όπως η νόσος του Alzheimer) και έχει προταθεί ως η αιτία της γήρανσης (Davies, 2000, Tiwari, 2001, Katalinic et al., 2006, Aruoma, 1994). Ως αντιοξειδωτικές ουσίες, έχουν προταθεί τα φλαβονοειδή, οι φυτικές φαινόλες, οι βιταμίνες Ε και C (Škrovánková et al., 2012). Η οξείδωση, πέρα από τον άνθρωπο, έχει επιπτώσεις και στα τρόφιμα που περιέχουν ουσίες (λιπίδια, πρωτεΐνες, σάκχαρα και βιταμίνες), που μπορεί να αντιδράσουν με ελεύθερες ρίζες προκαλώντας έτσι την οξείδωσή τους, με αποτέλεσμα την αλλοίωση της ποιότητάς τους. Ως αντιοξειδωτικά στα τρόφιμα χρησιμοποιούνται πολλές φορές χημικές ενώσεις οι οποίες έχουν την ικανότητα να δίνουν ρίζες υδρογόνου, ώστε να ελαχιστοποιήσουν την οξείδωση των λιπιδίων αυξάνοντας έτσι το χρόνο ημιζωής του προϊόντος. 11

Έχει παρατηρηθεί από μελέτες ότι η λήψη μεγάλων ποσοτήτων οξειδωμένων τροφίμων μπορεί να αυξήσει την συχνότητα εμφάνισης καρκίνου, αθηροσκλήρωσης και να προκαλέσει βλάβες στην δομή των κυττάρων, των πρωτεϊνών, των λιπιδίων και του DNA (Škrovánková et al., 2012). 1.4 Οι κύριες ομάδες φαινολικών ενώσεων στα φυτά Χαρακτηριστικό συστατικό των φυτών είναι οι φαινόλες (Khoddami et al., 2013, Scalbert & Williamson, 2000), μια από τις μεγαλύτερες ομάδες δευτερογενών μεταβολιτών (Gurib-Fakim, 2006). Ο όρος αναφέρεται στις ουσίες που στο μόριο τους διαθέτουν έναν τουλάχιστον αρωματικό δακτύλιο υποκατεστημένο με ένα ή περισσότερα υδροξύλια (Khoddami et al., 2013, Morton et al., 2000). Έχει αναφερθεί ότι πολλά φαινολικά συστατικά έχουν πιθανή αντιοξειδωτική δράση (Khoddami et al., 2013, Stagos et al., 2012) και μαζί με άλλες ουσίες προστατεύουν τους ιστούς του σώματος από το οξειδωτικό στρες (Scalbert & Williamson, 2000). Οι φαινολικές ενώσεις, πολύ συχνά εμφανίζονται ως γλυκοζίτες (είναι συνδεδεμένες με σάκχαρα), τείνοντας έτσι να είναι υδατοδιαλυτές (Morton et al., 2000). Οι κατηγορίες των φαινολών καθορίζονται από τη δομή τους που κυμαίνεται από απλή έως σύνθετη (Gurib-Fakim, 2006, Khoddami et al., 2013, Scalbert & Williamson, 2000). Σύμφωνα με Gurib-Fakim (2006) ιδιαίτερο φαρμακευτικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι: 1. Απλές φαινολικές ενώσεις και τα φαινολικά οξέα (ή πολυφαινόλες με βάση τον αριθμό των μονάδων φαινόλης στο μόριο): Οι ενώσεις αυτές έχουν ένα αρωματικό μονοκυκλικό δακτύλιο συνδεδεμένο με μια αλκοολική, αλδεϋδική ή καρβοξυλική ομάδα (Gurib-Fakim, 2006). Τα φύλλα, τα σπέρματα και οι βλαστοί των φυτών είναι πλούσιες πηγές φαινολικών οξέων καθώς εμπλέκονται στο σχηματισμό λιγνίνης, πολυμερούς που υπάρχει στο κυτταρικό τους τοίχωμα (Morton et al., 2000). Η αντιοξειδωτική τους ικανότητα εξαρτάται από τον αριθμό των υδροξυλίων που έχουν στο μόριό τους (Škrovánková et al., 2012). 2. Ταννίνες: Είναι ενώσεις που συναντώνται πολύ συχνά σε φυτά αλλά ο ρόλος τους είναι ακόμα ασαφής (Gurib-Fakim, 2006). 3. Κουμαρίνες και γλυκοζίτες: Είναι περιορισμένες στα φυτά και χρησιμοποιούνται στην χημειοταξινόμηση ταξινομικών ομάδων. Συναντώνται στις οικογένειες Apiaceae, Rutaceae, Asteraceae και Leguminosae (Gurib-Fakim, 2006). 4. Φλαβονοειδή: Οι φλαβονοειδείς ενώσεις, είναι υπεύθυνες για το χρώμα των φρούτων, των ανθέων και μερικές φορές ακόμα και των φύλλων στα φυτά (Gurib-Fakim, 2006) και ίσως να είναι από τις πιο σημαντικές ομάδες φαινολικών ενώσεων στα τρόφιμα (Mushtaq & Wani, 2013). Η βασική δομή της φλαβάνης αποτελείται από 15 άτομα άνθρακα διατεταγμένα σε τρεις δακτυλίους (C6- C3-C6) (Škrovánková et al., 2012). Οι φλαβονοειδείς ενώσεις, προστατεύουν τα φυτά από τη UV-ακτινοβολία και βοηθούν ώστε να προσελκυστούν επικονιαστές με τα χρώματα. Θεωρούνται ιδιαίτερα σημαντικές 12

καθώς παρουσιάζουν μια σειρά από φαρμακευτικές δράσεις (αντιφλεγμονώδη, αναλγητική, αντικαρκινική, αντιοξειδωτική, αντιβακτηριακή, αγγειοδιασταλτική, κατά του HIV κ.ά.). Οι βασικές κατηγορίες των φλαβονοειδών είναι οι φλαβόνες, φλαβονόλες, ισοφλαβόνες, ανθοκυανίνες, φλαβανόλες, προανθοκυανιδίνες και φλαβανόνες (Scalbert & Williamson, 2000, Škrovánková et al., 2012). Τα είδη του γένους Sideritis είναι πλούσια σε φλαβονοειδή και από μελέτες φαίνεται ότι υπάρχει συσχέτιση της γεωγραφικής κατανομής του γένους με διαφορετικές ενώσεις φλαβονοειδών (González-Burgos et al., 2011). Μελέτες έδειξαν ότι φλαβονοειδείς αγλυκόνες συσσωρεύονται στα φύλλα και στους βλαστούς των φυτών και ίσως να έχουν σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή των φυτών σε ημι-άνυδρες περιοχές (Tomás-Lorente et al., 1988). 5. Λιγνάνες και συναφείς ενώσεις: Παρουσιάζουν αντικαρκινικές και αντιαλλεργικές ιδιότητες (Gurib-Fakim, 2006). Οι λιγνάνες έχουν εντοπιστεί στο ανθρώπινο πλάσμα και στα ούρα (Scalbert & Williamson, 2000). 1.5 Τεχνικές εκχύλισης Η εκχύλιση των φυτικών προϊόντων χρησιμοποιείται από την αρχαιότητα μέχρι σήμερα με διάφορες τεχνικές. Οι παραδοσιακές τεχνικές εκχύλισης (όπως η διαβροχή, η υδροαπόσταξη, αφεψήματα, εκχύλιση Soxhlet, εκχύλιση στερεού υγρού ή υγρού υγρού) είναι πολλές φορές χρονοβόρες, απαιτούν μεγάλες ποσότητες δειγμάτων και διαλυτών που συχνά έχουν αρνητικές επιπτώσεις στον άνθρωπο και στο περιβάλλον. Ακόμα ένα μειονέκτημα των παραδοσιακών τεχνικών εκχύλισης είναι ότι το προϊόν που λαμβάνεται απαιτεί συχνά επεξεργασία πριν την ανάλυσή του (Chemat et al., 2012, Mustafa & Turner, 2011). είναι: Κάποιες από τις νέες τεχνικές για την εκχύλιση βιοδραστικών ενώσεων από τρόφιμα και φυτά Εκχύλιση με υπερκρίσιμα ρευστά (Super Fluid Extraction) Μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Microextraction) Εκχύλιση με υπερήχους (Ultrasonic Extraction ή Sonication) Εκχύλιση με μικροκύματα (Microwave assisted extraction) Εκχύλιση με υγρό υπό πίεση (Pressurized Liquid Extraction PLE). Η εκχύλιση PLE έχει την δυνατότητα να λειτουργεί σε υψηλές πιέσεις και σε θερμοκρασίες πάνω από το σημείο βρασμού του διαλύτη. Είναι μια τεχνική φιλική προς το περιβάλλον και θεωρείται «πράσινη εκχύλιση». Χρησιμοποιείται για την εκχύλιση φαινολικών ενώσεων, αιθερίων ελαίων και 13

άλλων φαρμακευτικών προϊόντων. Σύμφωνα με Mustafa & Turner (2011) τα κύρια πλεονεκτήματά της μεθόδου PLE είναι: βελτίωση της απόδοσης μείωση του χρόνου εκχύλισης μείωση της ποσότητας διαλυτών προστασία ευαίσθητων ενώσεων χρήση μειγμάτων διαλυτών (πολικών και μη πολικών). 14

Σκοπός Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας είναι Α. Η καταγραφή και ο ταξινομικός προσδιορισμός βοτάνων που διακινούνται εμπορικά σε έξι ελληνικές πόλεις ως «τσάι του βουνού». Η καταγραφή της συχνότητας πώλησής τους, των συνιστώμενων θεραπευτικών δράσεων, την συνέπεια της πληροφορίας (προφορική ή γραπτή) και την δημιουργία κλείδας προσδιορισμού για τους εμπόρους και το κοινό. Β. Η μελέτη της αντιοξειδωτικής ικανότητας και του φαινολικού περιεχομένου: εγχυμάτων που προέρχονται από εκχύλιση με εμβάπτιση (infusion) αφεψημάτων που προέκυψαν από εκχύλιση με βρασμό (decoction) εκχυλισμάτων που προέκυψαν από εκχύλιση με υγρό υπό πίεση (PLE) ανάλογα με το χρόνο εκχύλισης και της μορφής του φυτικού υλικού και τη μελέτη επίδρασης του διαλύτη. 15

2. Υλικά και Μέθοδοι 2.1 Φυτικό Υλικό 2.1.1 Προέλευση Τα δείγματα προέρχονται από το εμπόριο και από καλλιέργειες, 49 δείγματα από Αθήνα, Βέροια, Εύβοια, Θεσσαλονίκη, Μάνη και Σέρρες κατά τα έτη 2012 2014. Τα καλλιεργούμενα δείγματα προέρχονται από Δομοκός Φθιώτιδας, Λιτόχωρο Πιερίας, Καρυά Ολύμπου και Πλαγίες Τρικλάριου Όρους, συγκομιδής του 2012 και του 2013 (Πίνακας 2.1.1). Τα δείγματα που προέρχονταν από super markets ήταν όλα συσκευασμένα, τα δείγματα που προέρχονταν από πάγκους λαϊκής αγοράς πωλούνταν χύμα και τα δείγματα που προέρχονταν από καταστήματα πωλούνταν συσκευασμένα ή/και χύμα. Πίνακας 2.1.1. Προέλευση, έτος αγοράς ή συγκομιδής και κωδικός αριθμός εμπορικών και καλλιεργούμενων δειγμάτων του γένους Sideritis ( Μ = Market Αγορά, C = Cultivation Καλλιέργεια). α/α Δείγματος Τόπος αγοράς ή καλλιέργειας Έτος Κωδικός δείγματος 1 Αρεόπολη, Λακωνίας Μάνη, πάγκος λαϊκής αγοράς 2012 M_SCc_02 2 Πειραιάς, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Μανδραγόρας» 2013 M_SCc_14 3 Μάνη, super market «Νιάρχος» - TAYGETOS 2014 M_SCc_51 4 Αρεόπολη, Λακωνίας Μάνη, πάγκος λαϊκής αγοράς 2014 M_SCc_52 5 Αθήνα, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Elixir» 2012 M_SE_06 6 Αθήνα, κατάστημα μπαχαρικών «Το Βάλσαμο» 2013 M_SE_07 7 Αθήνα, κατάστημα κρητικών προϊόντων «Οι Μέλαμπες» 2013 M_SE_10 8 Αθήνα, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Fotsi» 2013 M_SE_12 9 Αθήνα, φαρμακείο Καλογερογιάννη από πάγκο λαϊκής, Αγορά Χαλκίδας, Εύβοιας 2013 M_SE_13 10 Βέροια, κατάστημα «Ζαμάνης» 2014 M_SE_32 11 Βέροια, κατάστημα «Ζαμάνης» 2014 M_SE_33 12 Θεσσαλονίκη, κατάστημα μπαχαρικών «Λιανός» 2014 M_SE_47 (συνεχίζεται) 16

Πίνακας 2.1.1. (συνέχεια) α/α Δείγματος Τόπος αγοράς ή καλλιέργειας Έτος Κωδικός δείγματος 13 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SPp_22 14 15 Θεσσαλονίκη, super market «Εστία»- «Βότανα Ταϋγέτου» Αθήνα, super market «Α-Β Βασιλόπουλος» - «ΑΝΕΜΩΝΑ ΓΑΡΔΙΚΙΟΥ» 2013 M_SRr_04 2013 M_SRr_08 16 Πλαγιές Τρικλάριου Όρους, καλλιεργούμενο 2012 C_SRr_09 17 18 Αθήνα, κατάστημα κρητικών προϊόντων «Οι Μέλαμπες» Πειραιάς, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Μανδραγόρας» 2013 M_SRr_11 2013 M_SRr_15 19 Μάνη, super market «Νιάρχος» - TAYGETOS 2013 M_SRr_16 20 Αθήνα, πάγκος λαϊκής αγοράς Ελληνικού 2013 M_SRr_17 21 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2012 C_SRr_18 22 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SRr_20 23 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SRr_23 24 Βέροια, super market «Metro» 2014 M_SRr_26 25 Βέροια, καφεκοπτείο 2014 M_SRr_27 26 Βέροια, καφεκοπτείο 2014 M_SRr_28 27 Βέροια, καφεκοπτείο «Ηλιάδη» 2014 M_SRr_29 28 Βέροια, κατάστημα ξηρών καρπών και βοτάνων, «Καρπών Γεύσεις» 2014 M_SRr_30 29 Βέροια, κατάστημα μπαχαρικών 2014 M_SRr_31 30 Βέροια, κατάστημα βοτάνων «Βοτανοπωλείο η Δύναμη της Φύσης» 2014 M_SRr_34 31 Βέροια, παντοπωλείο 2014 M_SRr_35 32 Βέροια, super market «Τερτιβανίδης» 2014 M_SRr_36 33 Βέροια, κατάστημα delicatessen 2014 M_SRr_37 (συνεχίζεται) 17

Πίνακας 2.1.1. (συνέχεια) α/α Δείγματος Τόπος αγοράς ή καλλιέργειας Έτος Κωδικός δείγματος 34 Θεσσαλονίκη, πάγκος λαϊκής αγοράς 2014 M_SRr_40 35 Θεσσαλονίκη, κατάστημα μπαχαρικών «Ελληνικόν» 2014 M_SRr_42 36 37 Θεσσαλονίκη, κατάστημα τοπικών προϊόντων «Μπέλα Βίγλα» Θεσσαλονίκη, κατάστημα μπαχαρικών «Βάλσαμο, ένα παράθυρο στη φύση» 2014 M_SRr_43 2014 M_SRr_44 38 Θεσσαλονίκη, κατάστημα delicatessen 2014 M_SRr_45 39 Θεσσαλονίκη, κατάστημα μπαχαρικών «Κυριάκος Λιανός» 2014 M_SRr_46 40 Θεσσαλονίκη, παντοπωλείο 2014 M_SRr_48 41 Θεσσαλονίκη, super market «Μασούτης» 2014 M_SRr_49 42 Θεσσαλονίκη, κατάστημα μπαχαρικών και βοτάνων «Προϊόντα από τη Φύση» 2014 M_SRr_50 43 Αθήνα, παντοπωλείο " περί Λέσβου" 2014 M_SRr_53 44 Αθήνα, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Elixir» 2012 M_SRr_54 45 Αθήνα, κατάστημα μπαχαρικών & βοτάνων «Το μπαχαράκι» (Ελληνικό) 2014 M_SRr_55 46 Αθήνα, πάγκος λαϊκής αγοράς (Αργυρούπολη) 2014 M_SRr_56 47 Θεσσαλονίκη, Super Market "Εστία" 2014 M_SRr_57 48 Αθήνα, πάγκος λαϊκής αγοράς, (Ελληνικό) 2014 M_SRr_58 49 Θεσσαλονίκη, κατάστημα βιολογικών προϊόντων& παραδοσιακών εδεσμάτων - CasaNATURA 2014 M_SRr_59 50 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SS_01 51 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2012 C_SS_05 52 Λιτόχωρο Πιερίας, καλλιεργούμενο 2012 C_SS_19 53 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SS_21 54 Δομοκός, καλλιεργούμενο 2013 C_SS_24 55 Καρυά Ολύμπου, Καλλιεργούμενο 2013 C_SS_25 (συνεχίζεται) 18

Πίνακας 2.1.1. (συνέχεια) α/α Δείγματος Τόπος αγοράς ή καλλιέργειας Έτος Κωδικός δείγματος 56 Βέροια, κατάστημα μπαχαρικών και αρωματικών φυτών 2014 M_SS_38 57 Θεσσαλονίκη, πάγκος λαϊκής αγοράς 2014 M_SS_39 58 59 60 Σέρρες, κατάστημα παραδοσιακών προϊόντων «παραδοσιακά προϊόντα» Θεσσαλονίκη, κατάστημα βοτάνων και βιολογικών τροφίμων «Ευζωία» Θεσσαλονίκη, κατάστημα «Βιολογικών» Προϊόντων «CasaNATURA» 2014 M_SS_41 2014 M_SS_60 2013 M_SSs_03 2.1.2 Ταξινομικός Προσδιορισμός Ο ταξινομικός προσδιορισμός των δειγμάτων έγινε με βάση την πρόσφατη ταξινομική αναθεώρηση του γένους Sideritis που αυτοφύεται στα ελληνικά βουνά (Baden, 1991). Έγινε σύγκριση των δειγμάτων με: -ψηφιοποιημένα δείγματα του Βοτανικού Μουσείου του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (TAU) (Constantinou, 2012). -ψηφιοποιημένα δείγματα του Βοτανικού Κήπου του Βερολίνου (Röpert, 2000). Ο βασικός διαγνωστικός χαρακτήρας που χρησιμοποιήθηκε για τον ταξινομικό της προσδιορισμό ήταν το σχήμα και οι διαστάσεις των βρακτίων φύλλων. Τα δείγματα μετά τον ταξινομικό προσδιορισμό κατατέθηκαν στο Εργαστήριο Συστηματικής Βοτανικής και Φυτογεωγραφίας του Τμήματος Βιολογίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης (TAU). Για κάθε ένα από τα εμπορικά δείγματα καταγράφηκαν, το σημείο, η ημερομηνία αγοράς και πληροφορίες, όπως της δίνονταν από της πωλητές ή/και της ετικέτες (εμπορικό ή/και λατινικό όνομα, συνιστώμενες θεραπευτικές δράσεις) (Παράρτημα 1). Για τα δείγματα που προέρχονται από καλλιέργειες καταγράφηκαν πληροφορίες, όπως δόθηκαν από τον καλλιεργητή, για την περιοχή καλλιέργειας, το υψόμετρο, το έτος συγκομιδής, το εμπορικό ή/και το λατινικό όνομα και την αρχική προέλευση του φυτού (Παράρτημα 2). Η ονοματολογία ακολουθεί τους Dimopoulos et al. (2013). 19

2.2 Υλικά Για την εκχύλιση χρησιμοποιήθηκαν σακούλες φιλτραρίσματος μεγέθους πόρων 50 microns (Tecnolab, Italy), διηθητικό χαρτί Whatman, γλυκερίνη (Organic Glycerin, Laboratoires Prod Hyg), κιτρικό οξύ (Citric acid, Jungbunzlauer, Austria), συντηρητικό Microcare SB (μείγμα βενζοϊκού νατρίου και σορβικού καλίου, Thor Personal Care SAS), απιονισμένο νερό. Το φυτικό υλικό που εξετάστηκε ανήκει σε τρία taxa του γένους Sideritis που προέρχονται από καλλιέργειες (Δομοκό, APIVITA Farm), συγκομιδής του 2013. Για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας και του φαινολικού περιεχομένου χρησιμοποιήθηκε Folin Ciocalteu s Phenol reagent (Merck) (FCPr), διάλυμα ανθρακικού νατρίου (Na2Co3 20% w/v), γαλλικό οξύ (98% καθαρότητα, Alfa Aesar 3,4,5-τριυδροξυβενζοϊκό οξύ), μεθανόλη MeOH (HPLC grade, Fisher Chemical, Loughborough, UK), αιθανόλη (Fisher Chemical, Loughborough, UK), DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), Trolox (C18H12N5O6, ισοδύναμο Βιταμίνης Ε, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany). 2.3 Όργανα Για την εκχύλιση χρησιμοποιήθηκε εκχυλιστήρας τύπου Timatic (Tecnolab, Italy), για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας και του φαινολικού περιεχομένου χρησιμοποιήθηκε φασματοφωτόμετρο UV-VIS διπλής δέσμης τύπου UV-1800 (Shimadzu Europa), ζυγός ακριβείας (KERN 770), ψηφιακό διαθλασίμετρο (RX-α series, ATAGO) και αναδευτήρας (Vortex, VELD Scientifica). 2.4 Προετοιμασία Εκχυλισμάτων 2.4.1. Υδατική εκχύλιση με εμβάπτιση (Infusion) Για τις υδατικές εκχυλίσεις ακολουθήθηκε ο παραδοσιακός τρόπος παρασκευής που περιγράφεται από Liolios et al. (2010), 20 με 30g φυτικού υλικού σε 0,5-1L ζεστού νερού. Συγκριμένα, αποξηραμένο και κονιορτοποιημένο φυτικό υλικό (2g) εμβαπτίζεται σε απιονισμένο νερό (200 ml) θερμοκρασίας 80 ο C, για 15 min. 2.4.2Υδατική εκχύλιση Αφέψημα (Decoction) Για τις υδατικές εκχυλίσεις ακολουθήθηκε ο παραδοσιακός τρόπος παρασκευής που περιγράφεται από Liolios et al. (2010), 1.5 με 5g από αποξηραμένο ή/και φρέσκο φυτικό υλικό σε 20

250mL (περίπου ένα ποτήρι) βραστού νερού. Συγκεκριμένα, αποξηραμένο φυτικό υλικό (2.5g) σε διαφορετική μορφή (τεμαχισμένο με το χέρι και σε σκόνη) εκχυλίστηκε σε απιονισμένο νερό (250 ml) και για 2, 10, 15 και 20 min. Η θερμοκρασία παρέμενε σταθερή με την βοήθεια θερμαινόμενου μαγνητικού αναδευτήρα, μέχρι το πέρας της διαδικασίας ενώ αναδεύεται. 2.4.3 Υδρο-γλυκερινικά εκχυλίσματα με υγρό υπό πίεση (PLE) Τα τελευταία χρόνια αναπτύσσονται νέες τεχνικές για την εκχύλιση των βιοδραστικών συστατικών των αρωματικών και φαρμακευτικών φυτών. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε η τεχνική εκχύλισης με υγρό υπό πίεση (PLE) που συμβαδίζει με τις αρχές τις «πράσινης εκχύλισης» και έγινε η χρήση μείγματος εναλλακτικών διαλυτών (νερού και γλυκερίνης), φιλικότερη προς το περιβάλλον και τον άνθρωπο. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ημιαυτόματης συσκευής εκχύλισης τύπου Timatic (Tecnolab, Italy), που λειτουργεί υπό πίεση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Χρησιμοποιώντας τη διπλή επίδραση της πίεσης/αποσυμπίεσης ο διαλύτης (δυναμική φάση), περνάει από το φυτικό υλικό (στατική φάση) και εκχυλίζεται για 6 ώρες, με διαλύτη νερό και σύστημα διαλυτών γλυκερίνη/νερό 40/60 w/w. Αναλυτικότερα: Διαλύτη: διαλύθηκε συντηρητικό μείγμα βενζοϊκού νατρίου και σορβικού καλίου (Microcare SB) 9.8g σε απιονισμένο νερό. Προστέθηκε κιτρικό οξύ (3.7g) για την ρύθμιση του ph του διαλύτη. Τέλος, προστέθηκε η απαιτούμενη ποσότητα γλυκερίνης. Φυτικό υλικό: το δείγμα σε μορφή σκόνης τοποθετήθηκε σε σακούλες φιλτραρίσματος μεγέθους πόρων 50 microns (Tecnolab, Italy), σε ποσοστό 24.4g/1000g διαλύτη. Τοποθετήθηκε στο θάλαμο εκχύλισης (Εικόνα 2.4.1) και προστέθηκε ο διαλύτης. Παράμετροι εκχύλισης: συνολικός χρόνος διαδικασίας: 363 min, αριθμός κύκλων: 33, χρόνος συμπίεσης: 5 min, χρόνος αποσυμπίεσης: 6 min, ελάχιστη πίεση: 6 bar, μέγιστη πίεση: 9 bar (Mourtzinos et al., 2011). Εικόνα 2.4.1. Εκχυλιστήρας τύπου Timatic. Α: Θάλαμος εκχύλισης Β: Έμβολο πίεσης Ε: Πνευματική βαλβίδα. 21

Τα υδατικά και υδρο-γλυκερινικά εκχυλίσματα διηθήθηκαν με χαρτί Whatman και αποθηκεύονται σε σκουρόχρωμα μπουκάλια. 2.5 Προσδιορισμός αντιοξειδωτικής ικανότητας (μέθοδος DPPH ) Για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας in vitro χρησιμοποιείται η ελεύθερη ρίζα 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH ) (Εικόνα 2.5.2.) που ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά το 1958 από τον Blois (και τροποποιήθηκε ελαφρώς από άλλους ερευνητές). Είναι η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας για φυτικά δείγματα. Ο μηχανισμός της μεθόδου στηρίζεται στη μεταφορά ηλεκτρονίων και ατόμων υδρογόνου από το αντιοξειδωτικό στη σταθερή ελεύθερη ρίζα DPPH (Krishnaiah et al., 2011). Το μωβ χρώμα της αδέσμευτης ρίζας DPPH μετατρέπεται σε κίτρινο όταν τα αντιοξειδωτικά δεσμεύσουν όλη την ποσότητά της και απορροφάται στα 515nm (Miguel, 2010, Krishnaiah et al., 2011). Εικόνα 2.5.2. Ελεύθερη ρίζα 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine (DPPH ) http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/d9132?lang=en&region=gr) Η διαδικασία προσδιορισμού που ακολουθήθηκε περιγράφεται από τους Brand-Williams et al. (1995). Συγκεκριμένα, 25μL εκχυλίσματος προστέθηκαν σε 975μL διαλύματος DPPH (100 μm), ακολούθησε καλή ανάδευση και παρέμεινε στο σκοτάδι για 30 min. Το προϊόν της αντίδρασης φωτομετρήθηκε σε μήκος κύματος 515 nm. Πριν τη φωτομέτρηση για το σταντάρισμα του οργάνου χρησιμοποιήθηκε διαλύτης MeOH. Στη συνέχεια φωτομετρήθηκε το δείγμα ελέγχου (control), που στη θέση του δείγματος τοποθετήθηκαν 25μL MeOH (Abs515nm(t=0)). Η συγκέντρωση της αντιοξειδωτικής ικανότητας εκφράζεται ως mm Trolox (ισοδύναμο βιταμίνης Ε), που υπολογίστηκε με τη χρήση πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης καλύπτοντας το εύρος τιμών από 0,1 mm έως 1,2 mm (Παράρτημα 3). Αναλυτικότερα, ζυγίστηκαν αρχικά 0.04g Trolox και στη συνέχεια διαλύθηκαν σε 100mL MeOH, δημιουργώντας μητρικό διάλυμα συγκέντρωσης 1.6mM. Από το μητρικό διάλυμα με διαδοχικές αραιώσει δημιουργήθηκαν διαλύματα συγκεντρώσεων 1.2, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2 και 0.1mM. Η συγκέντρωση δίνεται με αναγωγή της απορρόφησης που λαμβάνεται από την φωτομέτρηση των δειγμάτων σε συγκέντρωση Trolox. Η 22

πρότυπη καμπύλη έχει μορφή Απορρόφησης προς συγκέντρωση mm Trolox και κατασκευάζεται κάθε φορά που παρασκευάζεται διαλύματος DPPH 100 μm. Από την συνάρτηση (1) που εκφράζει την πρότυπη καμπύλη απορρόφησης πραγματοποιείται ο υπολογισμός της τιμής της αντιοξειδωτικής ικανότητας. Συνάρτηση (1) mm Trolox= 0,0177 % ΔA515nm +0,081 με R 2 =0,9998 Όπου % ΔA515nm = Abs515nm(t=0) Abs515nm(t=30) / Abs515nm(t=0) *100 2.6 Προσδιορισμός φαινολικού περιεχομένου (μέθοδος Folin-Ciocalteu) Η μέθοδος Folin-Ciocalteu χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του φαινολικού περιεχομένου φυτικής προέλευσης (Prior et al., 2005, Everette et al., 2010). Το αντιδραστήριο της μεθόδου Folin-Ciocalteu προτάθηκε αρχικά (1927) για τον προσδιορισμό πρωτεϊνών και αρκετά χρόνια αργότερα η μέθοδος τροποποιήθηκε για την ανάλυση του φαινολικού περιεχομένου στο κρασί (Singleton et al., 1998, Prior et al., 2005, Everette et al., 2010). Η μέθοδος είναι απλή, ακριβής και απαιτεί απλό εξοπλισμό (Singleton et al., 1998, Prior et al., 2005). Είναι μια φωτομετρική μέθοδος που ο βασικός της μηχανισμός είναι η αντίδραση οξειδωαναγωγής, χωρίς να διαχωρίζει τα φαινολικά συστατικά (μονομερή, διμερή) (Prior et al., 2005). Σύμφωνα με τους Prior et al. (2005) για την απόκτηση αξιόπιστων αποτελεσμάτων πρέπει να ακολουθηθούν συγκεκριμένα βήματα προϋποθέσεις: Κατάλληλη αναλογία αλκαλίων και αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu (Folin Ciocalteau s Phenol reagent -FCPr). Κατάλληλος χρόνος και θερμοκρασία αντίδρασης. Οπτική ανίχνευση στα 750 765 nm. Χρήση πρότυπου αναφοράς (συνήθως γαλλικό οξύ GA). Το αντιδραστήριο FCPr αποτελείται από ένα μείγμα φωσφορομολυβδαινικού οξέος (H3PMo12O40) και φωσφοροβολφραμικού οξέος (H3PW12O40). Η χημική αντίδραση της μεθόδου στηρίζεται στην οξείδωση των φαινολικών ενώσεων σε αλκαλικό περιβάλλον σχηματίζοντας οξείδια βολφραμίου (W8O23) και μολυβδαινίου (Μο8Ο23), μπλε χρώματος που ανιχνεύεται φασματοφωτομετρικά στα 750-765 nm (Magalhães et al., 2008, Prior et al., 2005). Σύμφωνα με Everette et al. (2010) το μπλε χρώμα οφείλεται στο σύμπλεγμα μολυβδαινίου-βολφραιμίου που δημιουργείται ως προϊόν της αντίδρασης του FCPr με τα φαινολικά συστατικά. Το φαινολικό περιεχόμενο προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu όπως αυτή περιγράφεται από τους Arnous et al. (2002). Συγκεκριμένα, 10μL εκχυλίσματος προστέθηκαν σε 23

790μL αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια προστέθηκαν 50μL FCPr και ακολούθησε καλή ανάδευση. Προστέθηκαν 150μL διαλύματος ανθρακικού νατρίου (Na2Co3 20% w/v). Παρέμεινε στο σκοτάδι και σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 120min. Το προϊόν της αντίδρασης φωτομετρήθηκε σε μήκος κύματος 750 nm. Για την παρασκευή δείγματος ελέγχου τοποθετούνται 10 μl MeoH στη θέση του δείγματος. Η συγκέντρωση του φαινολικού περιεχομένου υπολογίζεται με τη χρήση πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης γαλλικού οξέος και εκφράζεται ως ισοδύναμο γαλλικού οξέος (GA) ανά L (το γαλλικό οξύ διαλύεται σε EtOH). Δημιουργείται με τη φωτομέτρηση γνωστών συγκεντρώσεων καλύπτοντας γαλλικού οξέος που καλύπτουν το εύρος τιμών από 100 έως 1200 mg/l (Παράρτημα 4). Αναλυτικότερα, ζυγίστηκαν 0.08g γαλλικού οξέος και στη συνέχεια διαλύθηκαν σε 50mL EtOH, δημιουργώντας μητρικό διάλυμα συγκέντρωσης 1600mg/L. Από το μητρικό διάλυμα με διαδοχικές αραιώσει δημιουργούνται διαλύματα συγκεντρώσεων 1200, 800, 600, 400,200 και 100 mg/l. Η συγκέντρωση δίνεται με αναγωγή της απορρόφησης που λαμβάνεται από την φωτομέτρηση των δειγμάτων σε συγκέντρωση mgga/l. Η πρότυπης καμπύλης αναφοράς έχει μορφή Απορρόφησης προς συγκέντρωση mgga/l. Από την συνάρτηση (2) που εκφράζει την πρότυπη καμπύλη απορρόφησης πραγματοποιείται ο υπολογισμός της τιμής του φαινολικού περιεχομένου. Συνάρτηση (2) mg/l = 828,53 Abs 1,1779 με R 2 = 0,9973 2.7 Στατιστική Ανάλυση Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Για την στατιστική ανάλυση εφαρμόστηκε η ανάλυση one-way analysis ANOVA με τη χρήση του αλγορίθμου Tukey, με επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας p<0.05. Για τον προσδιορισμό της συσχέτισης της αντιοξειδωτικής ικανότητας και του φαινολικού περιεχομένου, χρησιμοποιήθηκε ο συντελεστής συσχέτισης Pearson. Για την στατιστική επεξεργασία και την κατασκευή των γραφημάτων έγινε η χρήση του λογισμικού SigmaPlot TM (Systat Software, Version 11.0, USA). 24