COPASI - Complex Pathway Simulator

Username: biotech Password: applbiot1 COPASI - Complex Pathway Simulator Λογισμικό για την προσομείωση και ανάλυση βιοχημικών δικτύων Ελεύθερη χρήση Χαρακτηριστικά Προσομείωση χρονικής μεταβολής σε στοχαστικά (stochastic) και ντετερμινιστικά δεδομένα (deterministic) Ανάλυση μόνιμης κατάστασης Ανάλυση μεταβολικού ελέγχου/ ανάλυση ευαισθησίας Εκτίμηση παραμέτρων χρησιμοποιώντας δεδομένα χρονικής μεταβολής (time course) και/ή μόνιμης κατάστασης (steady state) http://www.copasi.org e-mail απαντήσεων: applbiotlabntua@gmail.com

1 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΒΙΟΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΑΠΟ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ (Mετατροπή του υποστρώματος Α στο προϊόν Β) Αex R1 Αin Κύτταρο (Cell) R2 Bin R3 Bex όπου Α και Β υπόστρωμα και προϊόν, ενώ οι ενδείξεις in και ex αντιστοιχούν σε εσωκυτταρική και εξωκυτταρική συγκέντρωση, αντίστοιχα Περιβάλλον (Environment) Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι ακόλουθες: Αex Ain Είσοδος του υποστρώματος στο εσωτερικό του κυττάρου (αντίδραση R1, κινητική 1 ης τάξης, Mass action irreversible) Αin Bin Ενζυμική μετατροπή του υποστρώματος σε προϊόν (R2, κινητική Michaelis-Menten) Bin Bex Έξοδος του προϊόντος από το κύτταρο (αντίδραση R3, κινητική 1 ης τάξης, Mass action irreversible)

Οι παραμέτροι προς παρακολούθηση για το συγκεκριμένο μοντέλο είναι (a) ο χρόνος (Time) συναρτήσει των μεταβατικών συγκεντρώσεων (Transient Concentrations) [Ain]t, [Aex]t, [Βin]t και [Βex]t (b) ο χρόνος (Time) συναρτήσει των ροών των αντιδράσεων (Reaction Fluxes) (R1).Flux, (R2).Flux και (R3).Flux

Προσδιορισμός του μοντέλου (1/7) 1. Καθορισμός των διαμερισμάτων (Compartments) του μοντέλου (Αριθμός διαμερισμάτων: 2, Κύτταρο-Περιβάλλον) Model -> Biochemical-> Compartments Οι α/α εισάγονται αυτόματα διευκρινίζει πως καθορίζεται ο όγκος ενός διαμερίσματος Όγκος του διαμερίσματος πριν (initial volume) και μετά (volume) τους υπολογισμούς που πραγματοποιεί το πρόγραμμα κάθε φορά # Name Type Initial volume (ml) Volume (ml) Rate (ml/s) 1 Cell fixed 1 nan 0 2 Environment fixed 1 nan 0 Initial expression (ml) Expression (ml or ml/s) Η συγκέντρωση/ποσότητα ενός είδους έχει μία σταθερή τιμή (η οποία αντιστοιχεί στην αρχική τιμή) δείχνει το ρυθμό μεταβολής του διαμερίσματος (έχει οριστεί από έναν μαθηματικό υπολογισμό) μαθηματικές εκφράσεις που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του αρχικού όγκου του διαμερίσματος και του μεταβλητού αντίστοιχα

2. Ορισμός των αντιδράσεων (Reactions) του μοντέλου Model -> Biochemical-> Reactions Προσδιορισμός του μοντέλου (2/7) Aμφίδρομη αντίδραση προσδιορίζεται με το = Μονόδρομη αντίδραση προσδιορίζεται με τη βοήθεια των συμβόλων και > σε σειρά -> ΠΡΟΣΟΧΗ : τα ονόματα των ειδών (αντιδρώντα-προϊόντα) πρέπει να διαχωρίζονται με κενά από τα σύμβολα αντίδρασης (+, =, και ->) # Name Reaction Rate Law Flux (mmol/s) 1 R1 Aex -> Ain Mass action (irreversible) 0 2 R2 Ain -> Bin Henri-Michaelis-Menten (irreversible) 3 R3 Bin -> Bex Mass action (irreversible) 0 0 Οι σταθερές πρέπει να λάβουν τις ακόλουθες τιμές: R1: k1=0.1 (Mass action irreversible) R2: Km=1, V=1 (Henri Michaelis-Menten) R3: k1=0.1 (Mass action irreversible)

Προσδιορισμός του μοντέλου (3/7) 2. Ορισμός των αντιδράσεων (Reactions) του μοντέλου Οι 3 αντιδράσεις Κινητική αντίδρασης Κινητικές παράμετροι

Προσδιορισμός του μοντέλου (4/7) 3. Ορισμός των «ειδών» (Species) του μοντέλου Model -> Biochemical-> Species Αφού οριστούν οι αντιδράσεις, στο μενού Species έχουν καθοριστεί αυτομάτως και οι εμπλεκόμενοι μεταβολίτες. Οι 4 μεταβολίτες του μοντέλου Προσοχή στην επιλογή διαμερίσματος για κάθε μεταβολίτη Αρχική συγκέντρωση του μεταβολίτη Επιλογή reactions: η συγκέντρωση/ποσότητα του είδους προσδιορίζεται από την κινητική έκφραση των αντιδράσεων

Προσδιορισμός του μοντέλου (5/7) 3. Ορισμός των «ειδών» (Species) του μοντέλου Simulation Type (τύπος προσομοίωσης) Simulation Type Reactions (Αντιδράσεις) Fixed (Σταθερά) Assignment (Ανάθεση) Ode (Οrdinary differential equation) (Συνήθης διαφορική εξίσωση) Περιγραφή Η συγκέντρωση/ποσότητα του είδους προσδιορίζεται από τους κινητικούς νόμους των αντιδράσεων Η συγκέντρωση/ποσότητα ενός είδους έχει μία σταθερή τιμή (η οποία αντιστοιχεί στην αρχική τιμή) Η συγκέντρωση/ποσότητα ενός είδους προσδιορίζεται από δοθείσα μαθηματική έκφραση Ο ρυθμός μεταβολής της συγκέντρωσης/ποσότητας ενός είδους προσδιορίζεται από μία συνήθη διαφορική εξίσωση

Προσδιορισμός του μοντέλου (6/7) 3. Ορισμός των «ειδών» (Species) του μοντέλου Ορίζονται οι αρχικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών καθώς και το διαμέρισμα στο οποίο εντοπίζονται με βάση τα δεδομένα του παρακάτω πίνακα: Name Compartment Type Initial Concentration (mmol/ml) Aex Environment reactions 10 Ain Cell reactions 0 Bin Cell reactions 0 Bex Environment reactions 0

Προσδιορισμός του μοντέλου (7/7) 4. Tελικός έλεγχος του μοντέλου Model -> Biochemical-> Parameter Overview Από την επιλογή Model -> Biochemical -> Parameter Overview πραγματοποιείται ο τελικός έλεγχος του μοντέλου που δημιουργήθηκε. 5. Αποθήκευση μοντέλου (File -> Save as)

Επιλογή προσομοίωσης (1/3) 1. Δημιουργία διαγραμμάτων (Plots) των μεταβατικών συγκεντρώσεων και των ροών σε συνάρτηση με το χρόνο Output Specifications -> Plots # Name 1 Plot 1 2 Plot 2 Plot 1: Time (Model Time) vs Transient Concentrations των [Ain]t, [Aex]t, [Βin]t και [Βex]t Number of curves Active 2 1 4 3 5

Επιλογή προσομοίωσης (2/3) Plot 2: Time vs Reaction Fluxes (R1).Flux, (R2).Flux και (R3).Flux 1 2 4 3 5

Επιλογή προσομοίωσης (3/3) 2. Επιλογή τρόπου προσομοίωσης Τasks -> Time Course Χρόνος προσομοίωσης (10 s) Διαστήματα δειγματοληψίας (50)

Αποτελέσματα ΕΡΩΤΗΣH Ποια η συγκέντρωση των μεταβολιτών σε χρόνο 10 sec; (δείτε Τime course - >Result) Έχει καταναλωθεί το υπόστρωμα (Aex) στο χρονικό διάστημα που διαρκεί η προσομοίωση; (δείτε Τime course ->Result ή Plot 1) # Time Aex Αin Bin Bex 10 s 3.67879 1.03225 3.42477 1.86419 Αρχική συγκέντρωση Αex: 10 mmol/ml

Αποτελέσματα ΕΡΩΤΗΣH Αυξήστε το χρόνο της προσομοίωσης τόσο ώστε το σύστημα να βρεθεί σε σταθερή κατάσταση και καταγράψτε τις τιμές των συγκεντρώσεων των μεταβολιτών. # Time (s) Aex Αin Bin 60 s 0.0247874 0.00272369 0.167858 Bex 9.80459 Χρόνος προσομοίωσης (10 s) Χρόνος προσομοίωσης (60 s) # Time 10 s Aex 3.67879 Ain 1.03225 Bin 3.42477 Bex 1.86419

Αποτελέσματα ΕΡΩΤΗΣH Mελετήστε τις μεταβατικές συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Ain, Aex, Bin, και τη ροή (R1).Flux. Παρουσιάζει ομοιότητες η καμπύλη της μεταβολής του (R1).Flux με την καμπύλη κάποιου μεταβολίτη και γιατί; Υπάρχει αντίστοιχη ομοιότητα για τις ροές (R2).Flux και (R3).Flux με κάποιον από τους μεταβολίτες Ain, Aex, Bin και Bex; Aex (R1).Flux Bin (R3).Flux

Αποτελέσματα ΕΡΩΤΗΣH Πώς μπορεί να προσομοιωθεί η συνθήκη στην οποία για κάποιο λόγο το προϊόν σταματά να εξέρχεται από το κύτταρο; Στην περίπτωση αυτή ποιές οι τελικές συγκεντρώσεις του προϊόντος Β στο κύτταρο (Βin) και στο περιβάλλον (Bex); Model -> Biochemical-> Species -> Bex -> ki = 0 Bin: 0.167858 mmol/l Bex: 9.80459 mmol/l Bin: 9.97245mmol/L Bex: 0 mmol/l

Αποτελέσματα ΕΡΩΤΗΣH Επαναφέρατε τις τιμές των μεταβλητών και τις παραμέτρους που ίσχυαν πριν την τελευταία δραστηριότητα. Ενεργοποιείστε την προσομοίωση για χρόνο 60 sec. Ποιες οι μέγιστες συγκεντρώσεις των μεταβολιτών Α και Β που παρατηρήθηκαν κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης στο εσωτερικό του κυττάρου; Συγκρίνετε τις προηγούμενες τιμές με τις αντίστοιχες τιμές που προκύπτουν αν η αντίδραση εξόδου του Β από το κύτταρο είναι διεκολυνόμενη από διαμεμβρανικό ένζυμο που ακολουθεί κινητική Henri Michaelis- Menten με τιμές σταθερών Km=1, V=10. Σχολιάστε. # Time Ain (mmol/l) 4.8 s 1.47741 # Time Bin (mmol/l) 13.2 s 3.69959 # Time Ain (mmol/l) 4.8 s 1.47741 # Time Bin (mmol/l) 4.8 s 0.0633492 όταν η R3 ακολουθεί κινητική 1 ης τάξης όταν η R3 ακολουθεί κινητική Henri Michaelis- Menten

Username: biotech Password: applbiot1 2 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS- MENTEN e-mail απαντήσεων: applbiotlabntua@gmail.com

Επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος Υπόστρωμα Ελεύθερες θέσεις Ένζυμο Υπόστρωμα προσδεδεμένο στο ενεργό κέντρο του ενζύμου Περίσσεια υποστρώματος Χαμηλή συγκέντρωση υποστρώματος Μικρός αριθμός μορίων υποστρώματος, ελεύθερα ενεργά κέντρα για πρόσδεση υποστρώματος. Η ταχύτητα είναι το ήμισυ της μέγιστης Μέση συγκέντρωση υποστρώματος Το σύνολο των ενεργών κέντρων των ενζυμικών μορίων έχει καταληφθεί. Η ταχύτητα είναι η μέγιστη δυνατή. Υψηλή συγκέντρωση υποστρώματος Η αύξηση της συγκέντρωσης του υποστρώματος δεν επιφέρει αλλαγή στην ταχύτητα εφόσον το σύνολο των ενεργών κέντρων των ενζυμικών μορίων έχει καταληφθεί. 20

Kινητική ενζυμικής δράσης Tο 1902, οι Βrown και Ηenri1 πρότειναν ότι το ένζυμο δημιουργεί αρχικά ένα σύμπλοκο (ES) με το υπόστρωμα (S), το οποίο διασπάται στη συνέχεια σε ένζυμο (E) και στα προϊόντα της αντίδρασης (Ρ) E+ S k1 ES ES k2 E+P k-1 Πρόσδεση Κατάλυση όπου k1 (M-1 sec-1) k-1 (sec-1) k2 (sec-1) Σταθερές ταχύτητας των αντιδράσεων Tο 1913, οι Μichaelis Μenten2 απέδωσαν με μαθηματικό τρόπο το μηχανισμό δράσης των ενζύμων, στηριζόμενοι στην ιδέα της δημιουργίας του ενδιάμεσου συμπλόκου ενζύμουυποστρώματος. 1 Henri, Victor (1903). Lois Générales de l Action des Diastases. Paris: Hermann 2 Michaelis, L.; Menten, M.L. (1913). "Die Kinetik der Invertinwirkung". Biochem Z. 49: 333 369

Θεωρία των Μichaelis - Μenten (αποκατάσταση ισορροπίας) (1/3) E+ S k1 ES (1) ES k2 E+P (2) k-1 Παραδοχές η αντίδραση μεταξύ του Ε και του S (Αντίδραση 1), παραμένει σε ισορροπία οποιαδήποτε επίδραση της αντίδρασης (2) στην (1), θεωρείται αμελητέα Οι συνθήκες αυτές επιτυγχάνονται όταν ο ρυθμός διάσπασης του συμπλόκου ΕS προς Ε και S είναι πολύ μεγαλύτερος από το ρυθμό διάσπασής του σε Ε και Ρ (δηλαδή k-1 >>k2) Η συγκέντρωση του ελεύθερου S παραμένει σχεδόν αμετάβλητη κατά την αρχική περίοδο της αντίδρασης, και ισούται με τη συγκέντρωση του ολικού S, δηλαδή [S] = [SΤ]

Θεωρία των Μichaelis - Μenten (αποκατάσταση ισορροπίας) (2/3) Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης δίνεται από τον τύπο P d v k2 dt ES Η σταθερά διάστασης (Κ s ) του συμπλόκου ΕS ορίζεται ως E E ES E E ES T K S Η συνολική ποσότητα του ενζύμου E S k ES k1 T 1 (Εξ. 1) (Εξ. 2) (Εξ. 3) Aντικαθιστώντας την (3) στην (2) K S E T ES S ES (Εξ. 4)

Θεωρία των Μichaelis - Μenten (αποκατάσταση ισορροπίας) (3/3) Eπιλύοντας την (4) ως προς [ES] και αντικαθιστώντας την στην (1) v P ET S k S K d dt 2 Όταν η [S] είναι πολύ μεγάλη σε σύγκριση με την Κ S (δηλαδή Κ S /S τείνει στο 0), τότε η v ισούται με το γινόμενο k 2 [Ε T ] και ορίζεται ως v max Aντικαθιστώντας την (6) στην (5) v k 2 E T S (Εξ. 5) max (Εξ. 6) v v max S S K Η σταθερά διάστασης του συμπλόκου (Κ S ) ονομάζεται σταθερά Μichaelis - Μenten (Κ m ) και η εξίσωση (7) v v max K m S S S (Εξ. 7) Eξίσωση Μichaelis- Menten

Θεωρία Briggs-Haldane (μόνιμη κατάσταση) (1/4) Μία διαφορετική μαθηματική προσέγγιση για τον τρόπο δράσης των ενζύμων, προτάθηκε το 1925 από τους Βriggs και Ηaldane 1. Στη μόνιμη κατάσταση (steady state) η συγκέντρωση του συμπλόκου ES παραμένει πρακτικά σταθερή δηλ. ο ρυθμός σχηματισμού του συμπλόκου ΕS είναι σχεδόν ίσος με το ρυθμό διάσπασης του Όσο περισσότερο ES υπάρχει στην αντίδραση τόσο ταχύτερα θα οδηγηθεί σε E + P ή E + S. Συνεπώς όταν αναμιγνύεται το ένζυμο με το υπόστρωμα και ξεκινά η αντίδραση αυξάνεται η συγκέντρωση του [ES], αλλά ταχύτατα φτάνει σε μόνιμη κατάσταση όπου η συγκέντρωσή του παραμένει σταθερή. Το φαινόμενο αυτό διατηρείται μέχρι εξαντλήσεως του υποστρώματος. 1 Briggs, G.E.; Haldane, J.B.S. (1925). "A note on the kinematics of enzyme action". Biochem J. 19 (2): 338 339.

Θεωρία Briggs-Haldane (μόνιμη κατάσταση) (2/4) E+ S k1 ES k2 E+P k-1 Η ταχύτητα της συνολικής αντίδρασης δίνεται από τον τύπο d P v k 2 ES dt (Εξ. 1) Yπόθεση Briggs-Haldane d ES 0 dt και (Εξ. 2) d ES k1 E S k 1 ES k 2 ES (Εξ. 3) dt

Από τις (2) και (3) 0 k E S k ES k ES 1 1 2 k2 k 1 ES E k1 S ES E K m S όπου K m k 2 k k 1 1 Σταθερά Μichaelis-Menten Θεωρία Briggs-Haldane (μόνιμη κατάσταση) (3/4) E ES E T (4) (5) επιλύοντας ως προς [Ε] E Aντικαθιστώντας την (4) στην (5) T ES S K Km T 1 S m ES E ES ES E K m T S S (6)

Θεωρία Briggs-Haldane (μόνιμη κατάσταση) (4/4) Από τις (1) και (6) όπου v k K 2 m E v max k2 T S S E T v v K max m S S Eξίσωση Μichaelis-Menten

Σημασία των κινητικών σταθερών Km και vmax (1/2) Κm έχει μονάδες συγκέντρωσης είναι η συγκέντρωση [S] για την οποία η ταχύτητα είναι vmax/2 (έχουν καταληφθεί τα τα μισά από τα ενεργά κέντρα) όταν η Km είναι γνωστή, το κλάσμα των κέντρων που έχουν καταληφθεί, fes, σε οποιαδήποτε συγκέντρωση υποστρώματος μπορεί να υπολογιστεί από τον τύπο S v f ES vmax S K m η Km αποτελεί χαρακτηριστικά σταθερά ενός ενζύμου για δεδομένο υπόστρωμα και εξαρτάται επίσης από περιβαλλοντικές συνθήκες όπως π.χ. το ph, η θερμοκρασία και η ιοντική ισχύ 29

Σημασία των κινητικών σταθερών Km και vmax (2/2) Κm η Km παρέχει ένα μέτρο της δύναμης του συμπλόκου ES E+ S k1 ES k2 E+P k-1 k 2 k 1 Km k1 όταν k-1 >>k2 (το σύμπλοκο ES διασπάται σε E και S πολύ πιο γρήγορα από ό,τι σχηματίζεται το προϊόν) Km k 1 k1 όμως K ES E S k 1 ES k1 άρα K ES K m όσο μεγαλύτερη είναι η τιμή της Km, (δηλαδή όσο περισσότερο υποστρώμα απαιτείται για να αποκτήσει η αντίδραση v = vmax/2) τόσο μικρότερη είναι η τάση σύνδεσης (χημική συγγένεια) μεταξύ Ε και S και αντίστροφα. vmax η vmax είναι ο θεωρητικά μέγιστος ρυθμός της αντίδρασης όπου το σύνολο του ενζύμου βρίσκεται με τη μορφή συμπλόκου ενζύμου-υποστρώματος ποσοτική έκφραση της αντίδρασης διάσπασης του [ΕS], εξαρτάται από τη [Ε] 30

2η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN Ορισμός των αντιδράσεων (Reactions) του μοντέλου Model -> Biochemical-> Reactions Aμφίδρομη αντίδραση προσδιορίζεται με το = Μονόδρομη αντίδραση προσδιορίζεται με τη βοήθεια των συμβόλων και > σε σειρά -> ΠΡΟΣΟΧΗ : τα ονόματα των ειδών (αντιδρώντα-προϊόντα) πρέπει να διαχωρίζονται με κενά από τα σύμβολα αντίδρασης (+, =, και ->) Ορισμός των «ειδών» (Species) του μοντέλου Model -> Biochemical-> Species Αφού οριστούν οι αντιδράσεις, στο μενού Species έχουν καθοριστεί αυτομάτως και οι εμπλεκόμενοι μεταβολίτες.

2 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN Ορισμός της συνάρτησης Km Model -> Biochemical -> Global Quantities 2 1

2 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN ({(R1).k2} + {(R2).k1}) / {(R1).k1} Εισαγωγή από το χρήστη των (...+...)/ 1 2 Όμοια εισάγονται και οι άλλες σταθερές Ορισμός των Plots Output Specifications -> Plots

Σάρωση παραμέτρων 2 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN Tasks->Parameter Scan 3 1 4 2 5

2 η ΑΣΚΗΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΜΕ ΚΙΝΗΤΙΚΗ MICHAELIS-MENTEN