ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΥΠΕΡΙΩΔΟΥΣ- ΟΡΑΤΟΥ, UV-Vis (ULTRAVIOLET- VISIBLE SPECTROMETRY) ΑΘΗΝΑ, ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2015
ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η Φασματομετρία UV-Vis στηρίζεται στην μέτρηση της απορρόφησης ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας (~190-800 nm) από τα μόρια των διαφόρων χημικών ενώσεων, τα οποία υφίστανται ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις. Η απορρόφηση στο UV-Vis δεν χαρακτηρίζει το μόριο ως σύνολο (όπως συμβαίνει με την φασματομετρία υπερύθρου, IR), αλλά δίνει πληροφορίες για ομάδες ατόμων στο μόριο. Το τμήμα του μορίου που είναι υπεύθυνο για την απορρόφηση ονομάζεται χρωμοφόρο και η απεικόνιση της απορρόφησης σε συνάρτηση με το μήκος κύματος παρέχει το φάσμα απορρόφησης της υπό προσδιορισμό ουσίας.
ΚΑΤΑΤΑΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΚΠΟΜΠΗΣ Η συνήθης οργανολογία και εφαρμογές της Φασματομετρίας UV- Vis περιορίζονται από το εγγύς υπεριώδες (190-400 nm) έως και το ορατό (400-800 nm), καθώς σε λ < 190 nm απορροφούν: Ο ατμοσφαιρικός αέρας οι μετρήσεις θα έπρεπε να πραγματοποιούνταν στο κενό. Ο χαλαζίας από τον οποίο κατασκευάζονται οι κυψελίδες και τα υπόλοιπα οπτικά εξαρτήματα των οργάνων.
ΤΟ ΟΡΑΤΟ ΦΑΣΜΑ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ Παρατήρηση: Ο οφθαλμός διακρίνει μόνο το συμπληρωματικό χρώμα της ένωσης που απορροφά, δηλαδή την ακτινοβολία που ανακλάται και όχι αυτή που απορροφάται.
ΧΡΩΜΑΤΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΚΑΙ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΑ Μήκος Κύματος Χρώμα (απορρόφησης) 400-435 Μπλε Κίτρινο 435-480 Μπλε Κίτρινο 480-490 Πράσινο/ Μπλε Πορτοκαλί 490-500 Μπλε/ Πράσινο Κόκκινο Συμπληρωματικό χρώμα (αντιληπτό από το μάτι) 500-560 Πράσινο Κόκκινο/ Ιώδες 560-580 Κίτρινο/ Πράσινο Ιώδες 595-610 Πορτοκαλί Πράσινο/ Μπλε 610-680 Κόκκινο Μπλε/ Πράσινο 680-700 Κόκκινο/ ιώδες Πράσινο
ΘΕΩΡΙΑ ΤΗΣ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ UV-Vis Σχηματισμός χημικού δεσμού: Τα ηλεκτρόνια από τα δυο άτομα συμμετέχουν στον δεσμό καταλαμβάνουν ένα νέο τροχιακό (μοριακό τροχιακό). Τα ατομικά τροχιακά των δυο συνδεόμενων ατόμων σχηματίζουν ένα δεσμικό τροχιακό (χαμηλής ενέργειας) και ένα αντιδεσμικό τροχιακό (υψηλής ενέργειας). Ατομικά τροχιακά s σχηματίζουν ένα δεσμικό μοριακό τροχιακό σ και ένα αντιδεσμικό σ*. Ατομικά τροχιακά p σχηματίζουν ένα δεσμικό μοριακό τροχιακό π και ένα αντιδεσμικό π*. Ηλεκτρόνια σθένους που δεν συμμετέχουν σε χημικούς δεσμούς (π.χ. Ν, Ο, S, αλογόνα) αναφέρονται ως μη δεσμικά n ηλεκτρόνια.
ΔΕΣΜΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΕΣΜΙΚΑ ΤΡΟΧΙΑΚΑ σ-δεσμικά τροχιακά R2 R1 C 2 O αδεσμικό τροχιακό π-δεσμικό τροχιακό
ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΟ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΡΟΧΙΑΚΩΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑΠΤΩΣΕΩΝ ΤΟΥΣ UV/VIS (λ<190 nm ) h c ΔΕ λ
ΕΙΔΗ ΜΕΤΑΠΤΩΣΕΩΝ ΚΑΙ ΜΗΚΟΣ ΚΥΜΑΤΟΣ ΑΠΟΡΡΟΦΟΥΜΕΝΗΣ ΑΚΤΙΝΟΒΟΛΙΑΣ Πολύ μεγάλη απαιτούμενη ενέργεια για σ σ* μετάπτωση Ενώσεις που έχουν μόνο σ δεσμούς (π.χ. αλκάνια) δεν αφορούν την Φασματομετρία UV-Vis.
ΒΑΣΙΚΗ ΟΡΟΛΟΓΙΑ ΣΤΗΝ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ UV-Vis Αυξόχρωμες ομάδες: Δραστικές ομάδες, όπως ΟΗ, -OR, - NHR, -SH, -ΝΗ 2 και Cl που περιέχουν μη δεσμικά ηλεκτρόνια σθένους και απορροφούν κοντά στα 200 nm, που αντιστοιχεί σε n σ* μεταπτώσεις. Ωστόσο μπορούν να αυξάνουν το μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης (λ max ) προς την κατεύθυνση του ορατού. Οι ομάδες αυτές φέρουν αδεσμικό ή αδεσμικά τροχιακά. Χρωμοφόρες ομάδες: Δραστικές ομάδες (π.χ. ακόρεστοι δεσμοί) που προκαλούν ηλεκτρονιακές μεταπτώσεις και είναι υπεύθυνες για την απορρόφηση του μορίου στο εγγύς υπεριώδες ή ορατό. Παραδείγματα: N=N, C=N, C C, C=C, N=O, C=O. Βαθυχρωμία: Μετατόπιση μήκους κύματος μέγιστης απορρόφησης (λ max ) προς μεγαλύτερη τιμή (προς το ορατό). Υψοχρωμία: Μετατόπιση λ max προς μικρότερη τιμή.
ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ ΟΜΑΔΩΝ
ΥΨΟΧΡΩΜΙΑ ΚΑΙ ΒΑΘΥΧΡΩΜΙΑ Βαθυχρωμία: Προκαλείται συνήθως από εισαγωγή στο μόριο αυξόχρωμων ομάδων. Παράδειγμα: Βενζόλιο: λ max = 255 nm, Φαινόλη: λ max : 270 nm, Ανιλίνη: λ max : 280 nm. Υψοχρωμία: Προκαλείται από αύξηση της πολικότητας του διαλύτη ή εισαγωγή θετικού φορτίου στο μόριο.
ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ UV-Vis
ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ UV-Vis Πηγή ακτινοβολίας: α) Υπεριώδη περιοχή: Λυχνίες υδρογόνου ή δευτερίου. Αποτελούνται από ζεύγος ηλεκτροδίων μέσα σε υάλινο σωλήνα με παράθυρα χαλαζία γεμάτο από αέριο υδρογόνο ή δευτέριο σε χαμηλή πίεση. Εφαρμογή υψηλής τάσης διέγερση ηλεκτρονίων αερίου εκπομπή ακτινοβολίας (180-350 nm). β) Ορατή περιοχή: Λυχνία βολφραμίου. Θέρμανση νήματος βολφραμίου με συνεχή πηγή ρεύματος εκπομπή ακτινοβολίας (350-2500 nm). Μονοχρωμάτορας: Φράγματα αλλά μικρότερης διαχωριστικής ικανότητας σε σχέση με φασματομετρία εκπομπής. Κυψελίδες: Περιοχή UV: Κυψελίδες από χαλαζία. Περιοχή Vis: Κυψελίδες από κοινό γυαλί ή πλαστικό. (Κυψελίδες από χαλαζία είναι ακριβότερες). Ανιχνευτής: Φωτολυχνίες, φωτοπολλαπλασιαστές, πολυδιαυλικοί ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων.
ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΑ ΑΠΛΗΣ ΚΑΙ ΔΙΠΛΗΣ ΔΕΣΜΗΣ Φασματόμετρα απλής δέσμης: Από τον μονοχρωμάτορα του οργάνου εξέρχεται μια και μόνη δέσμη. Για την αφαίρεση της παράσιτης ακτινοβολίας υπάρχουν δυο επιλογές: 1) Εισαγωγή του τυφλού διαλύματος (blank) στην κυψελίδα και ρύθμιση της κλίμακα ανάγνωσης του οργάνου, ώστε να δείχνει απορρόφηση Α=0 και, ακολούθως, τοποθέτηση του δείγματος της προσδιοριζόμενης ουσίας και μέτρηση της απορρόφησης, 2) Πραγματοποίηση δυο μετρήσεων απορρόφησης, τυφλού και δείγματος και αφαίρεση του σήματος του τυφλού από το δείγμα. Φασματόμετρα διπλής δέσμης: Η μονοχρωματική δέσμη που παράγεται από τον μονοχρωμάτορα χωρίζεται σε δυο παράλληλες δέσμες της ίδιας ισχύος. Η μια προσπίπτει στην κυψελίδα με το τυφλό διάλυμα και η άλλη στην κυψελίδα με το διάλυμα του δείγματος. Η δέσμη που προσπίπτει στο τυφλό διάλυμα παίζει ρόλο αφαιρετικής δέσμης και στον ανιχνευτή του φασματομέτρου μετριέται ο λόγος σήμα τυφλού/ σήμα δείγματος.
ΑΝΙΧΝΕΥΤΕΣ ΣΥΣΤΟΙΧΙΑΣ ΦΩΤΟΔΙΟΔΩΝ (PHOTODIODE ARRAY) Πολλές μικρές φωτοδίοδοι από ημιαγωγούς. Πλεονεκτήματα: Ταχύτητα, Ευαισθησία. Μικρότερη διαχωριστική ικανότητα (1 nm έναντι 0.1 nm του συμβατικού τύπου).
UV-Vis ΦΑΣΜΑΤΑ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Τα UV-Vis φάσματα δεν είναι εκλεκτικά. Δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως απόδειξη δομής (όπως τα φάσματα IR). Παρέχουν μόνο μια ταχεία ένδειξη. Κάθε ταινία απορρόφησης αντιστοιχεί σε αρκετές μεταπτώσεις.
ΦΑΣΜΑ ΜΙΓΜΑΤΩΝ ΔΥΟ ΟΥΣΙΩΝ
ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΖΟΜΕΝΗΣ ΟΥΣΙΑΣ ΣΕ ΠΑΡΑΓΩΓΟ Η υπό προσδιορισμό ουσία μετατρέπεται με κατάλληλη αντίδραση σε παράγωγο με χαρακτηριστική απορρόφηση στο UV-Vis. Εκλεκτική τροποποίηση ένωσης εκλεκτικός προσδιορισμός. ΠΡΟΫΠΟΘΕΣΕΙΣ: Ποσοτική χημική αντίδραση. Ταχεία χημική αντίδραση. Παράγωγο διαλυτό στον διαλύτη της αντίδρασης ή δυνατότητα ποσοτικής του εκχύλισης από το μίγμα της αντίδρασης.
ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΣΕ ΠΑΡΑΓΩΓΟ: ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ 1. ΕΝΩΣΕΙΣ ΜΕ ΑΡΩΜΑΤΙΚΗ ΑΜΙΝΟ-ΟΜΑΔΑ (π.χ. διάφορες φαρμακευτικές ενώσεις όπως σουλφοναμίδια, τοπικά αναισθητικά). 1 ο στάδιο: Διαζώτωση με NaNO 2 σε όξινο περιβάλλον: Ar-NH 2 + 2 HCl + NaNO 2 Ar-N + N, Cl - + NaCl + 2 H 2 O 2 ο στάδιο: Σύζευξη με Ν-(α-νάφθυλο)-αιθυλενοδιαμίνη σχηματισμός υδατοδιαλυτού ερυθρού αζωχρώματος με λ max στο ορατό: NH(CH 2 ) 2 NH 3 Cl NH(CH 2 ) 2 NH 3 Cl + Ar-N N, Cl - + + HCl N=N-Ar 2. ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΝΙΤΡΟΠΑΡΑΓΩΓΑ (μετά την αναγωγή της νιτροομάδας σε αμινο-ομάδα με κατεργασία με Zn και HCl).
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 1: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΑΡΑΘΕΙΟΥ 1 ο στάδιο: Αναγωγή νιτρο-ομάδας παραθείου σε αμινο-ομάδα (σχηματισμός άλατος). O-Et NO 2 O P S + 3 Zn + 7 HCl O-Et O-Et ClNH 3 O P S + 3 ZnCl 2 + 2 H 2 O O-Et 2 ο στάδιο: Επίδραση NaNO 2 / HCl σχηματισμός διαζωνιακού άλατος. 3 ο στάδιο: Επίδραση Ν-(α-νάφθυλο)-αιθυλενοδιαμίνης σχηματισμός αζωχρώματος.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ 2: ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΦΑΙΝΟΛΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΩΓΩΝ 1 ο στάδιο: Επίδραση FeCl 3 στο φαινολικό παράγωγο. Σχηματισμός ιώδους παραγώγου:
ΠΟΣΟΤΙΚΕΣ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ UV-Vis Διαπερατότητα (Transmittance, T): Το κλάσμα της εισερχόμενης ακτινοβολίας που εξέρχεται από το δείγμα Τ = Ι/ Ι 0, %Τ= 100 Τ. Απορρόφηση (Absorbance, A): Ο αρνητικός δεκαδικός λογάριθμος της διαπερατότητας Α: A = log(ι 0 /Ι). Προσοχή: Λογαριθμική κλίμακα.
ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΤΩΝ LAMBERT- BEER Η ακτινοβολία να είναι μονοχρωματική. Μοναδικό φαινόμενο η απορρόφηση. Ομοιόμορφος όγκος του δείγματος. Κάθε χημικό είδος (άτομο, μόριο, ιόν) να απορροφά ξεχωριστά και να μην αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Ο νόμος Lambert- Beer ισχύει για αραιά διαλύματα (< 0.01 Μ): Σε πυκνά διαλύματα οι αποστάσεις μεταξύ των χημικών ειδών είναι μικρές και αλληλεπιδρούν μετξαύ τους. Αποκλίσεις από τον νόμο Lambert- Beer μπορεί να οφείλονται στις συνθήκες μέτρησης (π.χ. σκέδαση της ακτινοβολίας λόγω ύπαρξης μεγάλων μορίων στο διάλυμα, απώλεια ακτινοβολίας λόγω ανάκλασης στις επιφάνειες της κυψελίδας, κ.λ.π.) ή και σε οργανολογική αστάθεια.
ΑΣΚΗΣΗ Δείγμα 0.3421 g μαγγανιούχου χάλυβα διαλύονται σε οξύ και μετά την κατάλληλη επεξεργασία και την μετατροπή του Mn σε MnO 4-, το διάλυμα που προκύπτει αραιώνεται μέχρι τα 1000 ml (διάλυμα Β). Η διαπερατότητα του διαλύματος Β βρίσκεται ίση προς 21.5%, ενώ η διαπερατότητα διαλύματος KMnO 4 4 10-5 Μ που μετρείται στις ίδιες συνθήκες βρίσκεται ίση με 46.0% σε μήκος κύματος που απορροφούν τα ιόντα ΜnO 4-. Να υπολογιστεί η εκατοστιαία περιεκτικότητα του χάλυβα σε μαγγάνιο (Δίνεται το ΑΒ του Mn, ίσο με 54.94).
ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ Στηρίζεται στην εκλεκτική τροποποίηση μιας χρωμοφόρου ομάδας του μορίου παρουσία άλλων χρωμοφόρων του ίδιου μορίου ή χρωμοφόρων άλλων ενώσεων που παραμένουν ατροποποίητα. Στην πράξη ως παράγοντας τροποποίησης χρωμοφόρων ομάδων χρησιμοποιείται- σχεδόν κατ αποκλειστικότητα το ph. Ισοσβεστικό σημείο
ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ UV- Vis: ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ 1. Παρασκευή προτύπου διαλύματος της ουσίας. 2. Μεταφορά ίσης ποσότητας διαλύματος της ουσίας σε δυο όμοιες ογκομετρικές φιάλες. 3. Αραίωση έως την χαραγή των δυο διαλυμάτων με ρυθμιστικά διαλύματα διαφορετικών τιμών ph. 4. Φασματομέτρηση των δυο διαλυμάτων στο ίδιο μήκος κύματος. Η διαφορά απορρόφησης μεταξύ των δυο διαλυμάτων οφείλεται στην τροποποίηση της χρωμοφόρου ομάδας. Α 1 = ε 1 b C, A 2 = ε 2 b C (A 2 -A 1 ) = (ε 2 -ε 1 ) b C ΔΑ= Δε b C 5. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται με διάλυμα του υπό εξέταση δείγματος. Ο προσδιορισμός γίνεται με βάση την σχέση: x Cx Cs s
ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ- ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ Α. ΚΥΨΕΛΙΔΕΣ Απαιτείται διαύγεια των παραθύρων της κυψελίδας προκειμένου να μην υπεισέρχονται σφάλματα στις μετρήσεις απορρόφησης. Β. ΔΙΑΛΥΤΕΣ- ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Διαλύτες κατάλληλης καθαρότητας (UV grade) ελεύθεροι προσμίξεων που απορροφούν στην περιοχή μηκών κύματος της ανάλυσης. Σχετικά αραιά διαλύματα. Βέλτιστη περιοχή διαπερατότητας 15-65%.
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ UV-Vis Ευρύτατη χρήση φασματομέτρων UV ως ανιχνευτών σε συστήματα υγροχρωματογραφίας. Ο ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων επιτρέπει τον έλεγχο για τυχόν μη διαχωρισμένες κορυφές. Ποσοτικός προσδιορισμός οργανικών ενώσεων σε σχετικά απλά μητρικά υλικά. Ποσοτικός προσδιορισμός ανοργάνων ιόντων μετά από συμπλοκοποίηση. Διαλεύκανση αριθμού υποκαταστατών σε σύμπλοκες ενώσεις. Παρακολούθηση κινητικής βιοχημικών αντιδράσεων. Συμβολή στην ταυτοποίηση χημικών ουσιών.
ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΑ ΥΓΡΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤΑ ΜΕ PDA ΩΣ ΑΝΙΧΝΕΥΤΗ
ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΑΝΟΡΓΑΝΩΝ ΙΟΝΤΩΝ Επιλογή κατάλληλου συμπλοκοποιητικού μέσου- Βελτιστοποίηση συνθηκών (χρόνος αντίδρασης, θερμοκρασία, διαλύτης, σειρά προσθήκης αντιδραστηρίων). Λήψη φάσματος απορρόφησης. Επιλογή κατάλληλου μήκους κύματος. Κατασκευή καμπύλης αναφοράς. Μέτρηση απορρόφησης άγνωστου διαλύματος και υπολογισμός της συγκέντρωσης του με βάση την καμπύλη αναφοράς.
ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ SCATCHARD Μέτρηση της σταθεράς ισορροπίας Κ βιοχημικών αντιδράσεων (π.χ. αντιγόνου- αντισώματος).
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΥΠΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ Μεταβάλλεται ο λόγος [Μέταλλο]/[Υποκαταστάτης] και μετράται η απορρόφηση. Ο λόγος [Μέταλλο]/[Υποκαταστάτης] στο μέγιστο της απορρόφησης αντιστοιχεί στον ζητούμενο αριθμό υποκαταστατών του μετάλλου. Απορρόφηση Me n m X - MeX m m-n Μεταλλο Υποκαταστατης
ΑΣΚΗΣΗ II Δυο άχρωμες ενώσεις Α και Β αντιδρούν προς σχηματισμό συμπλόκου ΑΒ, το οποίο απορροφά στα 550 nm με μοριακή απορροφητικότητα 450 cm -1 /M. Η σταθερά διάστασης του συμπλόκου είναι 6.00 10-4. Ποια θα είναι η απορρόφηση στα 550 nm ενός διαλύματος που παρασκευάζεται με ανάμειξη ίσων όγκων 0.0100 Μ διαλυμάτων των Α και Β σε κυψελίδα 1 cm (Απ: 1.59 3 ); Οι αμίνες RNH 2 αντιδρούν με το πικρικό οξύ και σχηματίζουν άλατα, τα οποία απορροφούν ισχυρά στα 359 nm (ε= 1.25 10 4 cm -1 / M). Ποσότητα 0.1155 g άγνωστης αμίνης διαλύεται σε νερό και αραιώνεται έως όγκου 100 ml. Κλάσμα 1.00 ml αραιώνεται στα 250 ml. Αν το τελικό διάλυμα παρουσιάζει απορρόφηση Α= 0.454 στα 359 nm σε κυψελίδα 1.00 cm ποιό το ΜΒ της αμίνης; (Απ: 127, 2 ).