ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ ΣΧΟΛΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΙΓΑΙΟΥ ΣΧΟΛΗ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΗΣ ΘΑΛΑΣΣΑΣ Αντοχή Escherichia coli από πόσιµο νερό σε δύο κατηγορίες αντιβιοτικών: α) κινολόνες & β) κεφαλοσπορίνες β γενιάς ΜΠΟΥΝΤΟΥΝΗ ΜΑΡΙΝΑ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ : Ευστρατίου Μ.Α.

Ευχαριστίες Θα ήθελα να ευχαριστήσω την Τριµελή Επιτροπή, κ. Ευστρατίου, κ. Καραντανέλλη και κ. Μπατζάκα για την καθοδήγησή τους στην ολοκλήρωση της πτυχιακής µου εργασίας αλλά και για την εµπιστοσύνη που µου επέδειξαν καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών µου. Όπως επίσης και για τον πολύτιµο χρόνο που αφιέρωσαν αλλά και για τις γνώσεις που µου µετέδωσαν συνολικά. Θερµές ευχαριστίες θέλω να απευθύνω και στον κ. Κόκκορη για την πολύτιµη συµβολή του στον τοµέα της Στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσµάτων αυτής της εργασίας. Αισθάνοµαι επίσης την ανάγκη να επισηµάνω την απέραντη ευγνωµοσύνη στην οικογένεια µου, για όλα όσα µου έχουν προσφέρει στη διάρκεια τόσο των µαθητικών µου όσο και των φοιτητικών µου χρόνων καθώς και την αµέριστη υποστήριξή τους σε κάθε µου επιλογή. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ελέγχου Νερών της Περιφερειακής Εταιρείας Ανάπτυξης Βορείου Αιγαίου Α.Ε. για τη συνδροµή του, τόσο σε εργασιακό χώρο όσο και σε εργαστηριακό εξοπλισµό και συγκεκριµένα τον κ. Κεφαλά Ευθύµιο υπεύθυνο του εργαστηρίου. 2

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Κατά τη διάρκεια της περιόδου Φεβρουάριος Αύγουστος 2016 έγιναν δειγµατοληψίες νερών από 3 µµεγάλα νησιά του Βόρειο ανατολικού Αιγαίου, τη Λέσβο, τη Λήµνο και τη Χίο. Τα δείγµατα του νερού προέρχονται από γεωτρήσεις πηγές πηγάδια, από µµικρές αγροτικές κοινωνίες και από το αρδευτικό υδρευτικό δίκτυο των νησιών. Αποµονώθηκαν 133 στελέχη Escherichia coli τα οποία εξετάστηκαν ως προς την ανθεκτικότητά τους σε 5 αντιβιοτικά, 3 κινολόνες ( α) σιπροφλοξασίνη (ciproxin) (CIP), β) λεβοφλοξασίνη (tavanik) (LVX) και γ) νορφλοξασίνη (norosin) (NXN)) και 2 κεφαλοσπορίνες 2 ης γενιάς ( α) κεφακλόρη (ceclor) (CEC) και β) αµοξικιλλίνη (augmentin) (AMX)). Ο προσδιορισµός της αντοχής στα αντιβιοτικά πραγµατοποιήθηκε µε βάση το Πρωτόκολλο Kirby Bauer disk diffusion susceptibility test. Το 30% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην αµοξικιλλίνη και το 11% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην κεφακλόρη. Στις κινολόνες βρέθηκε µικρή αντοχή. Στη νορφλοξασίνη κανένα στέλεχος δεν ήταν ανθεκτικό, στη σιπροφλοξασίνη ήταν ανθεκτικά 0,8% των στελεχών και τέλος στη λεβοφλοξασίνη το 30% των στελεχών ήταν µµετρίως ευαίσθητα και 12% ανθεκτικά. Συνολικά παρατηρήθηκε αυξηµένη αντοχή στις κεφαλοσπορίνες, σε στελέχη E.coli που αποµονώθηκαν από νερό που χρησιµοποιείται ως πόσιµο. Η αντοχή στις κινολόνες ήταν µικρότερη, σε µία από αυτές, την νορφλοξασίνη, δεν βρέθηκε αντοχή σε κανένα από τα ελεγχθέντα στελέχη. 3

ABSTRACT During the period February - August 2016 water samples were taken from 3 major islands of the North east Aegean Sea, Lesvos, Lemnos and Chios. Isolating 133 confirmed Escherichia coli strains, from potable water samples, water wells, small rural communities and spring waters, we measured the resistant ray for the 5 antibiotics used at this experiment. For the quinolones, the following antibiotics were used: a) ciprofloxacin (ciproxin) (CIP), b) levofloxacin (tavanik) (LVX) and c) norfloxacin (norosin) (NXN) and for 2 nd generation cephalosporins, the following antibiotics were used: a) cefaclor (ceclor) (CEC) and b) amoxicyllin (augmentin) (AMX). The antibiotic resistance designation was based on the Kirby Bauer disk diffusion susceptibility test. For cephalosporins the results showed that in amoxicillin 30% of the strains were resistant and in cephaloride 11% of the strains were resistant. In quinolones the results were completely different with minimum resistant strains. In norfloxacin none of the strains were resistant, in ciprofloxacin 0,8% of the strains were resistant and in levofloxacin 30% of the strains were moderately susceptible and 12% resistant. Finally, increased resistance to cephalosporins was observed, in E.coli strains isolated from potable water. Resistance in quinolones was lower, in one of these, norfloxacin resistance was not found in any of the tested strains. 4

ΛΕΞΕΙΣ - ΚΛΕΙΔΙΑ 1) Escherichia coli 2) Αντοχή σε αντιβιοτικά 3) Δηµόσια Υγεία 4) Νερό 5

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1) Εισαγωγή 1.1 Σηµασία του νερού...7 1.2 Νερό ανθρώπινης κατανάλωσης...8 1.3 Μόλυνση Νερού Ασθένειες & Επιδηµίες...8-10 1.4Escherichia coli...10 1.5 Καταπολέµηση ασθενειών Αντιβιοτικά...10-11 1.6 Ιστορική ανασκόπηση...11-12 1.7 Η έννοια της αντοχής...12 1.8 Προφύλαξη από τη συχνή λήψη αντιβιοτικών...12 1.9 Έρευνες που έχουν διεξαχθεί στο αντικείµενο αυτό έως σήµερα...13-15 2) Σκοπός της εργασίας...15-16 3) Υλικά & Μέθοδοι 3.1 Περιοχές δειγµατοληψίας & Περίοδος δειγµατοληψίας...16 3.2 Μέθοδοι δειγµατοληψίας...16-17 3.3 Καλλιέργεια...17-21 3.4 Στατιστική ανάλυση...21-22 4) Αποτελέσµατα 4.1 Αποτελέσµατα...22-27 4.2 T- tests...27-31 4.3 Δοκιµή ANOVA...32-33 4.4 Διαγράµµατα ευαισθησίας αντιβιοτικών...34-35 5) Συζήτηση...35-38 5.1 Γενικά συµπεράσµατα...38 6) Βιβλιογραφία...39-43 6

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Σηµασία του νερού Τα κύτταρα των περισσότερων ζώντων οργανισµών ζουν και αναπαράγονται χάρη στην παρουσία αλλά και τις ιδιότητες του νερού. Τα δυο τρίτα του σώµατος του ανθρώπινου οργανισµού αποτελούνται από νερό. Το προσλαµβάνει από τα υγρά-ποτά, τις τροφές που καταναλώνει αλλά και από την οξείδωση του υδρογόνου µέσα στο ίδιο του το σώµα. Θεωρείται πηγή ζωής, δηµιουργίας και αναψυχής για αυτό και αποτελεί αναντικατάστατο αγαθό για τη ζωή του ανθρώπου. Άλλωστε η ζωή των ανθρώπων ξεκινά µέσα από το νερό από την κοιλιά της µητέρας. Η έννοια της ζωής µε την έννοια του νερού συνδέονται άρρηκτα καθώς χωρίς νερό ο άνθρωπος δεν είναι σε θέση να επιβιώσει παρά το πολύ 2-3 µέρες. Από την αρχαιότητα µέχρι και σήµερα το νερό αποτελεί βασική προϋπόθεση για καλή υγεία και σωµατική καθαριότητα. Για αυτό το λόγο σε παλαιότερες εποχές το πόσιµο νερό οι άνθρωποι το κουβαλούσαν από πηγές, πηγάδια και για πολλά χιλιόµετρα. Κάτι παρόµοιο συµβαίνει και σήµερα καθώς το νερό φθάνει στα σπίτια µας από λίµνες και ποτάµια που απέχουν αρκετά χιλιόµετρα. Το νερό όµως δεν είναι εύκολα διαθέσιµο σε αρκετές περιοχές της χώρας µας και καθ όλη τη διάρκεια ενός έτους. Για παράδειγµα σε πολλά νησιά ή βιοµηχανικές περιοχές όπου η ποιότητα του νερού δεν είναι καλή οι άνθρωποι αναγκάζονται να καταναλώνουν εµφιαλωµένο νερό. Κάθε χρόνο πάνω από 6.000 παιδία παγκοσµίως πεθαίνουν από ασθένειες λόγω έλλειψης πόσιµου νερού. Η υπερβολική του χρήση από το δυτικό κόσµο το στερεί από τις άλλες περιοχές του πλανήτη, βλάπτει τα ευαίσθητα οικοσυστήµατα και απειλεί τα φυτά και τα ζώα. Κάθε άνθρωπος υποχρεούται να διασφαλίζει τη σωστή διαχείρισή του, να το προστατεύει από µολύνσεις και να το καταναλώνει µε σύνεση. Σε περίπτωση που το νερό µολυνθεί ή ρυπανθεί κλονίζεται η Δηµόσια Υγεία. Για αυτό το λόγο το νερό που προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση θα πρέπει να ελέγχεται σωστά ώστε να µην περιέχει παθογόνα µικρόβια αλλά και επικίνδυνες χηµικές ουσίες. Με τους εργαστηριακούς ελέγχους διασφαλίζεται η κατανάλωση ασφαλούς 7

πόσιµου νερού και έτσι θεωρείται ακίνδυνο, µη µολυσµένο και µη ρυπασµένο. 1.2 Νερό ανθρώπινης κατανάλωσης Ο έλεγχος του νερού ανθρώπινης κατανάλωσης γίνεται µε βάση τις απαιτήσεις της Ευρωπαϊκής Οδηγίας 98/83/ΕΚ για την ποιότητα του νερού ανθρώπινης κατανάλωσης όπως εναρµονίστηκε στην εθνική νοµοθεσία µε την ΚΥΑ Υ2/2600/2001 (ΦΕΚ 892Β/11-07-2001). Σύµφωνα µε αυτήν το νερό ανθρώπινης κατανάλωσης ορίζεται ως : Α) το νερό, είτε στη φυσική του κατάσταση είτε µετά από επεξεργασία που προορίζεται για πόση, µαγείρεµα, προπαρασκευή τροφής ή άλλες οικιακές χρήσεις, ανεξάρτητα από την προέλευσή του και από το εάν παρέχεται από δίκτυο διανοµής, από βυτίο ή σε φιάλες ή δοχεία. Β) το νερό που χρησιµοποιείται στις επιχειρήσεις παραγωγής τροφίµων για την παρασκευή, επεξεργασία, συντήρηση ή εµπορία προϊόντων ή ουσιών που προορίζονται για ανθρώπινη κατανάλωση. Το νερό ανθρώπινης κατανάλωσης είναι υγιεινό και καθαρό εφόσον : α) είναι απαλλαγµένο µικροοργανισµών και παρασίτων και οποιωνδήποτε ουσιών, σε αριθµούς και συγκεντρώσεις που αποτελούν ενδεχόµενο κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία και β) πληροί συγκεκριµένες µικροβιολογικές, χηµικές και ενδεικτικές παραµετρικές τιµές όπως αυτές καθορίζονται στο παράρτηµα Ι της Υγ. Διάταξης. Πίνακας 1 : Μικροβιολογικές Παράµετροι Παράµετρος Παραµετρική τιµή (αριθµός / 100ml) Escherichia coli 0 Εντερόκοκκοι 0 Clostridium perfringens 0 Κολοβακτηριοειδή 0 Αριθµός αποικιών σε 22οC και Άνευ ασυνήθους µεταβολής 37oC 8

1.3 Μόλυνση Νερού Ασθένειες & Επιδηµίες Οι κίνδυνοι που ενέχουν για την υγεία των ανθρώπων προκύπτουν πολλές φορές από την κατανάλωση µολυσµένου νερού µε λοιµώδεις παράγοντες, τοξικά, χηµικά και ραδιενεργά στοιχεία. Τα χηµικά πλην των νιτρικών είναι σε θέση να προκαλέσουν προβλήµατα στην υγεία των ανθρώπων έπειτα από συνεχή έκθεση για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Με τον όρο παθογόνοι µικροοργανισµοί εννοούνται τα µικρόβια, τα βακτήρια και τα παράσιτα που είναι σε θέση να θέσουν σε κίνδυνο την υγεία των πολιτών. Παθογόνοι µικροοργανισµοί µπορεί να υπάρχουν και στο νερό ανθρώπινης κατανάλωσης και λόγω της επικινδυνότητάς τους για τη Δηµόσια Υγεία ερευνώνται. Συνήθως προέρχονται από κόπρανα τόσο ζωικής όσο και ανθρώπινης προέλευσης. Τέτοιου είδους παθογόνοι µικροοργανισµοί µολύνουν µεγάλο αριθµό ανθρώπων λόγω του ότι βρίσκονται στα συστήµατα ύδρευσης µέσω των οποίων στις µέρες µας το µεγαλύτερο µέρος του πληθυσµού εξυπηρετεί τις καθηµερινές του ανάγκες. Κάθε µικρόβιο όµως ασκεί και διαφορετικό βαθµό επίδρασης στη δηµόσια υγεία και αυτό εξαρτάται από τη σύσταση των παθογόνων µικροβίων αλλά και από τις εκάστοτε συνθήκες διαβίωσης του πληθυσµού. Βασικός παράγοντας είναι επίσης και ο πληθυσµός δηλαδή εάν το νερό θα καταναλωθεί από βρέφη, ηλικιωµένους και άτοµα που ανήκουν σε ευπαθής οµάδες όπου ουσιαστικά είναι πιο ευαίσθητα στην εκδήλωση ασθενειών ή εάν το νερό απευθύνεται σε µεσήλικες. Τέλος οι ανθυγιεινές συνθήκες διαβίωσης συµβάλλουν θετικά στην εκδήλωση ασθενειών. Οι εργαστηριακοί έλεγχοι για τη διασφάλιση της ποιότητας του νερού είναι υποχρέωση της πολιτείας καθώς οι πολίτες πρέπει να καταναλώνουν ακίνδυνο για την υγεία τους νερό. Στη χώρα µας ο έλεγχος αυτός πραγµατοποιείται σε δηµόσια εργαστήρια ελέγχου υδάτων. Τα εργαστήρια αυτά αναλαµβάνουν τακτικούς ελέγχους υδάτων ώστε να αποδειχθεί εάν το νερό είναι κατάλληλο ή όχι για ανθρώπινη κατανάλωση. Τα δείγµατα που αναλαµβάνουν τέτοιου είδους εργαστήρια προέρχονται από γεωτρήσεις, πηγές, υδρευτικό και αρδευτικό δίκτυο, δηµόσιες υγειονοµικές υπηρεσίες και από αγροτικές κατοικίες. Είναι δείγµατα για προσωπικό έλεγχο και χρήση ή για µαζικό όταν αφορά ένα δήµο. Κάθε εργαστήριο ακολουθεί πιστά κάποια πρότυπα όπως είναι για παράδειγµα το πρότυπο ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 9.308-1 Ε2_2014 για την ποιότητα νερού και την καταµέτρηση κολοβακτηριοειδών και Escherichia coli. 9

Το µολυσµένο νερό µπορεί να προκαλέσει αρκετά σοβαρές ασθένειες στους ανθρώπους και είναι ακόµα και σε θέση να προκαλέσει επιδηµίες. Οι επιδηµίες αφορούν λοιµώδη νοσήµατα που προσβάλλουν ένα µεγάλο τµήµα του πληθυσµού ταυτόχρονα. Η χολέρα είναι από τα πιο γνωστά νοσήµατα που προκαλούνται από το βακτήριο Δονάκιο της Χολέρας (Vibrio cholerae) και οφείλεται στην κατανάλωση µολυσµένου νερού λόγω των ανθυγιεινών τρόπων λειτουργίας των συστηµάτων ύδρευσης και αποχέτευσης. Τα συµπτώµατα αυτής της ασθένειας είναι σοβαρά και εάν δεν αντιµετωπισθούν άµεσα µπορεί να επέλθει θάνατος. Ο τυφοειδής πυρετός είναι άλλη µία ασθένεια που εµφανίστηκε σε προηγούµενες δεκαετίες και µεταδίδεται µε την κατανάλωση µολυσµένου νερού που περιέχει το βακτήριο Salmonella typhi. Η κύρια αιτία του τυφοειδούς πυρετού είναι η σαλµονέλα του τύφου. Η πιο συνηθισµένη ασθένεια που οφείλεται στην κατανάλωση µολυσµένου νερού είναι η γαστρεντερίτιδα δηλαδή µία νόσος που χαρακτηρίζεται από φλεγµονή του γαστρεντερικού συστήµατος. Πίνακας 2 : Ασθένειες από βακτήρια νερού Salmonella typhi Τυφοειδής πυρετός Shigella spp Μικροβιακή δυσεντερία Escherichia coli O 157: H 7 Μικροβιακή γαστρεντερίτιδα Vibrio cholerae Χολέρα Legionella pneumophila Πνευµονία Pseudomonas aeruginosa Πνευµονία, ωτίτιδες, δερµατίτιδες Staphylococcus spp Δερµατίτιδες 1.4 Escherichia coli Η Escherichia coli είναι ένα αρνητικό κατά Gram, ραβδοειδούς σχήµατος κολοβακτηρίδιο. Υπό φυσιολογικές συνθήκες βρίσκεται στο έντερο των ανθρώπων και των ζώων. Ορισµένα από τα στελέχη της τα οποία είναι και αβλαβή αποτελούν µέρος της φυσικής χλωρίδας του εντέρου, παράγουν τη βιταµίνη Κ2 και εµποδίζουν την εγκατάσταση άλλων παθογόνων βακτηρίων στην ευρύτερη περιοχή. Ορισµένα στελέχη της Escherichia coli παράγουν επικίνδυνες τοξίνες ικανές να προκαλέσουν σοβαρές λοιµώξεις τόσο σε ανθρώπους όσο και σε ζώα. Ένα στέλεχος το οποίο είναι επικίνδυνο για τον άνθρωπο δεν είναι απαραίτητα επικίνδυνο και για τα ζώα. Ισχύει και το αντίστροφο. 10

1.5 Καταπολέµηση ασθενειών Αντιβιοτικά Τα αντιβιοτικά είναι χηµειοθεραπευτικά φάρµακα που χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία ή και την πρόληψη ορισµένων βακτηριακών λοιµώξεων. Χωρίζονται σε 2 κατηγορίες: α)στα αντιβιοτικά στενού φάσµατος που στοχεύουν σε ιδιαίτερους τύπους βακτηρίων όπως είναι τα θετικά ή τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια και β) στα ευρέος φάσµατος αντιβιοτικά που στοχεύουν σε ένα ευρύ φάσµα βακτηρίων. Για να καταπολεµηθεί µία ασθένεια µε τη χρήση αντιβιοτικών θα πρέπει να υπάρχει πάντα η σύµφωνη γνώµη του ειδικού ώστε να µην γίνεται άσκοπη χρήση της από τους ανθρώπους. Στη σηµερινή εποχή η λήψη αντιβιοτικών για κάθε πιθανή και απίθανη λοίµωξη αποτελεί µία συνήθεια των λαών παγκοσµίως. Τα αντιβιοτικά όµως µπορούν να σκοτώσουν βακτήρια και όχι ιούς. Εποµένως αν και σώζουν ζωές δεν είναι πανάκεια. Τα αντιβιοτικά συµβάλλουν στην άµβλυνση των συµπτωµάτων που οφείλονται σε βακτηριακές λοιµώξεις αλλά όχι και σε ιογενείς. Αν λοιπόν η λήψη τους δεν είναι αναγκαία, µπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αυτά γεγονός που αποτελεί µία από τις σοβαρότερες απειλές για τη Δηµόσια Υγεία. Το πρώτο αντιβιοτικό που χρησιµοποιήθηκε στις αρχές του 40 ήταν η πενικιλίνη. Έκτοτε όµως λόγω της εξέλιξης της επιστήµης αλλά και της ραγδαίας αύξησης του πληθυσµού της Γης, έχουν επινοηθεί περισσότερα από 150 διαφορετικά αντιβιοτικά τα οποία ουσιαστικά συµβάλλουν στην παρεµπόδιση της εξάπλωσης πολλών λοιµωδών νοσηµάτων. Μολονότι τα αντιβιοτικά έχουν σώσει εκατοµµύρια ζωές, η αναίτια χρήση τους οδηγεί στην έννοια της αντοχής που θα αναλυθεί παρακάτω. Η αντοχή στα αντιβιοτικά απασχολεί όλο και περισσότερους επιστήµονες τις τελευταίες δεκαετίες. 1.6 Ιστορική ανασκόπηση Η σηµασία της υγιεινής ύδρευσης όπως αποδεικνύεται από τους αρχαιολόγους ήταν ήδη γνωστή από τα αρχαία χρόνια. Πρώτα οι κάτοικοι της Κνωσσού, της Φαιστού και της Ζάκρου ανακάλυψαν πρωτοποριακά για την εποχή (1600 π.χ.) συστήµατα ύδρευσης. Πολλοί αρχαιολόγοι υποστηρίζουν πως για εκείνη την εποχή οι άνθρωποι είχαν τέλειες γνώσεις υγιεινής και µάλιστα τέθηκαν και σε εφαρµογή στα 11

µετέπειτα χρόνια από τους κατοίκους της Τίρυνθας αλλά και των Μυκηνών. H πρώτη δηµοσίευση που αφορούσε τα αντιβιοτικά έγινε το 1928 από τον Αλέξανδρο Φλέµινγκ για την πενικιλίνη, δηµoσίευση που αποτέλεσε ορόσηµο για την ιστορία της ιατρικής. Εκείνη την εποχή υπήρχε η πεποίθηση πως τα αντιβιοτικά είναι σε θέση να αντιµετωπίσουν κάθε µολυσµατική ασθένεια κάτι το οποίο όµως γρήγορα αποδείχθηκε λάθος. Η αρχική µέθοδος προσδιορισµού ευαισθησίας στις αντιµικροβιακές ουσίες βασίστηκε στις µεθόδους αραίωσης ζωµού. Αν και αποτελεί το χρυσό πρότυπο, εντούτοις αποδείχθηκε πολύ χρονοβόρα και για αυτό προωθήθηκε η διαδικασία διάχυσης δίσκου για τον προσδιορισµό της ευαισθησίας των βακτηρίων σε αντιβιοτικά. Η µέθοδος διάχυσης δίσκων υιοθετήθηκε αρχικά από τα κλινικά εργαστήρια µικροβιολογίας στις Ηνωµένες Πολιτείες της Αµερικής στις αρχές του 1950. Η ερµηνεία της αντίστασης και της ευαισθησίας όµως βασίστηκε στην απουσία ή την παρουσία αντίστοιχα της ζώνης αναστολής που περιβάλλει το δίσκο του αντιβιοτικού. Πολλά πειράµατα πραγµατοποιήθηκαν και πολλές έρευνες δηµοσιεύθηκαν από τους επιστήµονες τις εποχής. Το πρωτόκολλο όµως που ακολουθείται έως και σήµερα προήλθε από έρευνες του Kirby και του Bauer για αυτό και είναι γνωστό ως Πρωτόκολλο Kirby Bauer disk diffusion susceptibility test (ASM MicrobeLibrary, American Society For Microbiology). Ο σκοπός ανάπτυξης ενός ενιαίου πρωτοκόλλου ήταν ο προσδιορισµός της ευαισθησίας ή της αντίστασης των παθογόνων αερόβιων και προαιρετικά αναερόβιων βακτηρίων σε διάφορες αντιµικροβιακές ενώσεις ώστε ένας γιατρός να είναι σε θέση να δώσει την κατάλληλη θεραπευτική αγωγή σε έναν ασθενή. 1.7 Η έννοια της αντοχής Ανθεκτικά µικρόβια αναπτύσσονται όταν τα αντιβιοτικά που χορηγούνται δεν σκοτώνουν όλα τα βακτήρια. Όσα από αυτά είναι πιο ισχυρά και επιζήσουν µετατρέπονται σε ανθεκτικές µορφές µικροβίων δηλαδή µικρόβια µε ισχυρή αντοχή σε συγκεκριµένα αντιβιοτικά µε αποτέλεσµα να µην δρουν κατασταλτικά. Για να αντιµετωπισθεί σωστά η λοίµωξη χορηγούνται διαρκώς όλο και πιο ισχυρά αντιβιοτικά. Ένα βασικό πρόβληµα που απασχολεί τα τελευταία χρόνια τους επιστήµονες είναι ότι τα ανθεκτικά βακτήρια έχουν την δυνατότητα ανταλλαγής πληροφοριών επιβίωσης µε άλλα βακτήρια διαφορετικού γένους. Έτσι διαιωνίζεται η αντοχή και εµφανίζονται ακόµα πιο ανθεκτικά βακτήρια. 12

Έτσι οι αντιβιοτικές θεραπείες δεν είναι σε θέση να αντιµετωπίσουν τα ανθεκτικά βακτήρια εποµένως οι συνέπειες είναι πολύ σοβαρές για τη δηµόσια υγεία. Οι ασθένειες διαρκούν περισσότερο χρονικό διάστηµα και ο κίνδυνος εµφάνισης σοβαρών επιπλοκών αυξάνεται. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελούν οι ενδονοσοκοµειακές λοιµώξεις όπου τα βακτήρια είναι πολύ ανθεκτικά στα αντιβιοτικά και οι ασθενείς οι οποίοι µολύνονται από αυτά έχουν υψηλότερο κίνδυνο κατάληξης. 1.8 Προφύλαξη από τη συχνή λήψη αντιβιοτικών Τα αντιβιοτικά πρέπει να χρησιµοποιούνται µόνο σε περίπτωση έκτακτης ανάγκης έτσι ώστε να αποφεύγεται η κατάχρηση. Με τον τρόπο αυτό θα εξαλειφθεί σιγά σιγά και το πρόβληµα της ανθεκτικότητας των βακτηρίων. Για να επιτευχθεί όµως κάτι τέτοιο θα πρέπει αρχικά να γίνει κατανοητό ότι τα αντιβιοτικά καταπολεµούν βακτηριακές λοιµώξεις και όχι το κρυολόγηµα, την εποχιακή γρίπη και τις ιώσεις. Σε ορισµένες δε βακτηριακές λοιµώξεις όπως είναι η βρογχίτιδα, τα αντιβιοτικά δεν έχουν και µεγάλη επιτυχία στην αντιµετώπισή της και για αυτό το λόγο πρέπει ο καθένας να συµβουλεύεται τους ειδικούς. Οι γιατροί γνωρίζουν εάν κρίνεται απαραίτητη η λήψη αντιβιοτικών καθώς επίσης και όλες τις οδηγίες για την καταπολέµηση των βακτηρίων. Η πρόωρη διακοπή λήψης των αντιβιοτικών επειδή τα συµπτώµατα δεν υφίστανται πλέον δεν οδηγεί παρά στη λανθασµένη εντύπωση πως τα ανθεκτικά βακτήρια πλέον δεν επιζούν. 1.9 Έρευνες που έχουν διεξαχθεί στο αντικείµενο αυτό έως σήµερα Τα αντιβιοτικά αποτελούν αντικείµενο µελέτης για πολλούς ερευνητές τα τελευταία χρόνια. Κάτι τέτοιο συµβαίνει διότι όλο και περισσότερα περιβαλλοντικά στελέχη µικροβίων προκαλούν ασθένειες στους ανθρώπους. Άλλα στελέχη είναι αρκετά επικίνδυνα και δεν αντιµετωπίζονται µε κοινά αντιβιοτικά, ενώ άλλα αντιµετωπίζονται µε ιδιαίτερη ευκολία. Οι έρευνες στοχεύουν κυρίως στην αντιµετώπιση των στελεχών µε τα αντιβιοτικά που αυτή τη στιγµή είναι διαθέσιµα στη φαρµακοβιοµηχανία. Συγκεκριµένα είναι διαθέσιµες περίπου 250 διαφορετικές χηµικές οντότητες για χρήση στην ιατρική και στην 13

κτηνιατρική (Kümmerer & Henninger, 2003). Τα πρώτα αντιβιοτικά που χρησιµοποιήθηκαν ήταν φυσικής προέλευσης λόγου χάρη η πενικιλίνη που η παραγωγή της προερχόταν από µύκητες του γένους Penicillium. Πλέον τα αντιβιοτικά που χρησιµοποιούνται προέρχονται από χηµική επεξεργασία ή χηµική τροποποίηση διάφορων ενώσεων φυσικής προέλευσης. Έρευνες δείχνουν ότι τα αντιβιοτικά ανιχνεύονται στο νερό, στα νοσοκοµειακά λύµατα, στα αστικά λύµατα, στα επιφανειακά ύδατα, στα λιµάνια (Xu et al., 2007) µε τις µεγαλύτερες ποσότητες να βρίσκονται στα νοσοκοµειακά λύµατα. Η σιπροφλοξασίνη που ανήκει στις κινολόνες ερευνάται διαρκώς και ανιχνεύεται σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις τόσο στα νοσοκοµειακά λύµατα όσο και στα αστικά λύµατα (Hartmann et al., 1998, Lindberg et al., 2004, Martins et al., 2008). Οι κεφαλοσπορίνες αν και χρησιµοποιούνται πιο πολύ από κάθε άλλο αντιβιοτικό έχουν ανιχνευθεί στο πόσιµο νερό, σε πολύ µικρές συγκεντρώσεις όµως (Ye et al., 2007). Η ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά είναι σήµερα ένα από τα πιο βασικά προβλήµατα τόσο της Κλινικής όσο και της Δηµόσιας Υγείας σε όλο τον κόσµο όπως υποδεικνύεται από την Πρώτη Παγκόσµια Έκθεση Οργανισµού Υγείας (ΠΟΥ) για τη µικροβιακή αντοχή του 2014 (WHO,2014). Μέχρι και σήµερα οι έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην αντοχή των αντιβιοτικών που προέρχονται από αποµονώσεις ζώων, τροφίµων και ανθρώπων σύµφωνα µε τους Levy & Marshall, 2004. Η µεταφορά των ανθεκτικών βακτηρίων στον άνθρωπο πραγµατοποιείται µε 2 τρόπους : α) µέσω του νερού της τροφής εάν τα φυτά για παράδειγµα ποτίζονται µε επιφανειακά ύδατα και β) µέσω της κατανάλωσης κρέατος το οποίο περιέχει ανθεκτικά βακτήρια (Perretin et al., 1997, Salyers 2002, Dolliver & Gupta 2008). Την προσοχή της επιστηµονικής κοινότητας έχει κερδίσει και η µεταφορά αυτής της αντοχής από τους ζωικούς οργανισµούς στο περιβάλλον την τελευταία δεκαετία σύµφωνα µε τους ( Silbergeld et al., 2008, Storteboom et al., 2010 και Wright, 2010). Για αυτό το λόγο υπάρχουν ερευνητές που θεωρούν τα αντιβιοτικά περιβαλλοντικούς ρύπους (Pruden et al., 2006). Τα αντιβιοτικά χρησιµοποιούνται ευρέως στο τοµέα της κτηνοτροφίας ως αυξητικοί παράγοντες στην εκτροφή αρκετών ζώων όπως των χοίρων ( Zhou et al., 2013 και Durso & Cook, 2014). Έτσι οι βιοµηχανίες εκτροφής χοίρων για παράδειγµα αποτελούν πιθανά µέρη διάδοσης της ανθεκτικότητας των αντιβιοτικών (Gotz & Smalla, 1997, Cole et al., 2000 και Binh et al., 2008). 14

Τα κόπρανα που αποβάλλονται από τους χοίρους περιέχουν µεγάλες συγκεντρώσεις σε αντιβιοτικά κυρίως σε τετρακυκλίνες (θεωρούνται κτηνιατρικά αντιβιοτικά, και έχουν θεραπευτικό προφυλακτικό σκοπό αλλά είναι και πρόσθετες ύλες ζωοτροφών) και συνήθως καταλήγουν σε γεωργικές εκτάσεις. Λόγω βροχοπτώσεων περνούν στον υδροφόρο ορίζοντα και επηρεάζουν τελικά το δίκτυο πόσιµου νερού. Ακόµη ένας λόγος που τα αντιβιοτικά καταλήγουν στο νερό είναι και το γεγονός πως η κοπριά χρησιµοποιείται σαν λίπασµα σε γεωργικές εκτάσεις (Binh et al., 2008). Επιπλέον κατά τη συγκοµιδή οπωροκηπευτικών ( Μarti et al., 2013) εγκυµονούν κίνδυνοι για την ασφάλεια των τροφίµων και την υγεία των ανθρώπων ( Becerra Castro et al., 2015). Μία διαφορετικού τύπου έρευνα έδειξε τις σχέσεις µεταξύ αντιβιοτικών και απολυµαντικών και το προφίλ αντοχής τους σε βακτήρια που συλλέγονται από το νερό της βρύσης. Κοινό αποτέλεσµα µε την προηγούµενη έρευνα είναι ότι τα αντιβιοτικά αποτελούν περιβαλλοντικούς ρύπους και συµβάλλουν στη διασπορά ανθεκτικών στελεχών στο περιβάλλον (Allen et al., 2010; Gaze et al., 2011; Wellington et al., 2013). Πλέον η ζήτηση για ασφαλές νερό σε όλο το κόσµο αποτελεί ένα από τα µεγαλύτερα παγκόσµια προβλήµατα (Brettar and Hofle, 2008). Για το λόγο αυτό διαρκώς πραγµατοποιούνται έλεγχοι των πόσιµων υδάτων αλλά και θεσπίζονται νέες τεχνικές για την απολύµανσή τους. Πολλά απολυµαντικά όµως δεν είναι και τόσο αποτελεσµατικά εναντίον όλων των βακτηριακών πληθυσµών (Scully et al., 1999; Cherchi and Gu, 2011; Jaglic et al., 2012; Bessa et al., 2014). Η χλωρίωση είναι µία διαδικασία που πραγµατοποιείται για τον έλεγχο των επιπέδων των βακτηρίων στο πόσιµο νερό. Μετά τη διαδικασία αυτή παρατηρούνται βιώσιµα βακτήρια που παραµένουν λόγω της αντίστασής τους στο χλώριο. Πραγµατοποιήθηκε έρευνα µε τίτλο : Relationship between antibiotic- and disinfectant resistance profiles in bacteria harvested from tap water, και απέδειξε ότι τα χλωρο-ανθεκτικά βακτήρια είναι πιθανόν να είναι ανθεκτικά και σε αντιβιοτικά όπως η Σιπροφλοξασίνη. Για την Αµοξικιλλίνη η αντοχή στα δείγµατα ήταν η πιο διαδεδοµένη (98 στα 148 δείγµατα) ενώ στη Σιπροφλοξασίνη η αντοχή ήταν πολύ µικρή (13 στα 148 δείγµατα) και αφορούσε δείγµατα από κλειστού τύπου δεξαµενές. Οι µηχανισµοί που εµπλέκονται στην ανάπτυξη της αντοχής στα αντιβιοτικά είναι 2 : α) η µετάλλαξη (Martinez and Baquero, 2000) και β) η απόκτηση των γονιδίων ανθεκτικότητας από µεταφορά γονιδίων δηλαδή µεταφορά µέσω πλασµιδίων (Davies,1994). Οι κινολόνες τις 15

τελευταίες δεκαετίες χρησιµοποιούνται ευρέως. Η Σιπροφλοξασίνη χρησιµοποιείται στην Ισπανία για παράδειγµα για την αντιµετώπιση πάνω από το 50 % των βακτηριακών λοιµώξεων τόσο των ζώων όσο και των ανθρώπων (http://www.aemps.gob.es). 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στην εργασία αυτή διερευνήθηκε η ανθεκτικότητα στελεχών Escherichia coli προερχόµενα από πόσιµο νερό, νερά γεωτρήσεων, πηγάδια, πηγές και νερά µικρών αγροτικών κοινωνιών από 3 νησιά του Β.Α Αιγαίου, τη Λέσβο, τη Λήµνο και τη Χίο. Συγκεκριµένα έγινε : 1) αποµόνωση των στελεχών της Escherichia coli από τα νερά, 2) επιβεβαιωτική δοκιµασία στελεχών Escherichia coli και 3) έλεγχος αντιβιοτικών µε βάση το Πρωτόκολλο Kirby Bauer disk diffusion susceptibility test. Η µελέτη έγινε για λόγους Δηµόσιας Υγείας στα 3 αυτά νησιά του Β.Α Αιγαίου αφού έχει αναφερθεί και σε προηγούµενες έρευνες η παρουσία ανθεκτικών στελέχων από πόσιµο νερό (Stange et al 2016). Επιχειρήθηκε η διερεύνηση πιθανών συσχετίσεων στις ανθεκτικότητες των στελεχών µεταξύ των κινολονών και των κεφαλοσπορίνων. Ελέγχθηκε το κατά πόσο επηρεάζει τα στελέχη η προέλευσή τους δηλαδή αν τα περισσότερα ανθεκτικά στελέχη αποµονώθηκαν από πόσιµο νερό ή από µικρές αγροτικές κοινωνίες. Τέλος εξετάστηκαν οι κατανοµές των στελεχών για τις κινολόνες και τις κεφαλοσπορίνες ξεχωριστά ώστε να αποδειχθεί εάν : 1) τα ανθεκτικά στελέχη ήταν και στις 3 κινολόνες ανθεκτικά και 2) τα ανθεκτικά στελέχη ήταν και στις 2 κεφαλοσπορίνες ανθεκτικά 3. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Περιοχές δειγµατοληψίας & Περίοδος δειγµατοληψίας Ελέγχθηκαν 133 στελέχη E.coli. Τα δείγµατα προέρχονται από γεωτρήσεις πηγές πηγάδια,από µικρές αγροτικές κοινωνίες και από τους τακτικούς ελέγχους για το αρδευτικό και το υδρευτικό δίκτυο των νησιών. Οι περιοχές δειγµατοληψίας είναι µερικά νησιά του Βόρειου Ανατολικού Αιγαίου και συγκεκριµένα η Λέσβος, η Χίος και η Λήµνος. Τα δείγµατα που χρησιµοποιήθηκαν για τη διεκπεραίωση αυτής της Πτυχιακής Εργασίας προέρχονται από δειγµατοληψίες που 16

πραγµατοποιήθηκαν κατά τους µήνες Φεβρουάριο 2016 Αύγουστο 2016. Από τη Χίο ελέγχθηκαν συνολικά 6 στελέχη εκ των οποίων τα 2 προέρχονται από µικρές αγροτικές κοινωνίες και τα 4 από πόσιµο νερό. Από τη Λήµνο χρησιµοποιήθηκαν συνολικά 24 στελέχη εκ των οποίων 16 προέρχονται από µικρές αγροτικές κοινωνίες και τα 8 από πόσιµο νερό. Από τη Λέσβο ελέγχθηκαν συνολικά 103 στελέχη εκ των οποίων τα 30 προέρχονται από γεωτρήσεις πηγές πηγάδια, τα 53 από το υδρευτικό δίκτυο και τα 21 από µικρές αγροτικές κοινωνίες. 3.2 Μέθοδοι δειγµατοληψίας Η δειγµατοληψία των νερών έγινε σύµφωνα µε το ISO 19458 2006. Χρησιµοποιήθηκαν αποστειρωµένες φιάλες, οινόπνευµα, καµινέτο, αναπτήρας και φορητό ψυγείο. Για την πραγµατοποίηση δειγµατοληψίας για µικροβιολογικές αναλύσεις πρέπει να τηρούνται αυστηρά οι παρακάτω οδηγίες : 1) Η δειγµατοληψία έγινε µε αποστειρωµένες φιάλες των 500 ml γυάλινες, 2) Οι φιάλες µεταφέρθηκαν το ταχύτερο δυνατόν στο Εργαστήριο, σε θερµοκρασία 2-8 C, 3) Κατά τη διαδροµή φυλάσσονται σε φορητά ψυγεία. 17

3.3 Καλλιέργεια Α) Μέθοδος διήθησης µε µεµβράνες, µε βάση το ISO 9308-1 E2_2014 (ΕΛΟΤ). Με τη µέθοδο του φιλτραρίσµατος µε µικροβιακές µεµβράνες γίνεται η εξέταση του νερού που προορίζεται για ανθρώπινη κατανάλωση [ΔΥΓ2/Γ.Π οικ. 38295 Υ2/2600/2001], ή ακόµα και ανθρώπινη χρήση δηλαδή για νερά δεξαµενών κολύµβησης (πισίνες) [Περί κολυµβητικών δεξαµενών µετά οδηγιών κατασκευής και λειτουργίας αυτών ΦΕΚ 87/Β/24-1-73 & ΥΠΟΥΡΓΙΚΗ ΑΠΟΦΑΣΗ : Γ1/443/1973]. Η µέθοδος αυτή αποσκοπεί στο καθορισµό και την αρίθµηση στο νερό των οργανισµών της οµάδας που συνολικά ονοµάζονται ολικά κολοβακτηριοειδή όπως είναι η Escherichia coli. Πραγµατοποιήθηκε φιλτράρισµα ορισµένου όγκου νερού, µέσω µικροβιοκρατών µεµβρανών (Whatman, diameter 47mm, Lot G5879137) µε διάµετρο πόρου 0,45µm (τα φίλτρα αυτά διαθέτουν τυπωµένο πλέγµα ώστε να διευκολύνεται η καταµέτρηση των αποικιών) και τοποθετήθηκαν σε χρωµογόνο άγαρ (Cromogeneric Coliform Agar, Merck, Lot.1.10426). Ακολούθησε επώαση της µικροβιοκρατούς µεµβράνης στους 36+ 2 ) C για 21+ 3 ώρες. Οι αποικίες β-d-galactosidase θετικές (χρώµατος ροζ) καταµετρήθηκαν και υπολογίστηκαν σαν Κολοβακτηριοειδή βακτήρια τα οποία δεν είναι Escherichia coli., επιβεβαιωµένα από οξειδάση αρνητική (-) αντίδραση. Οι αποικίες β- D-galactosidase και β- D-glucuronidase θετικές µε σκούρο µπλε χρώµα υπολογίστηκαν σαν Escherichia coli. Το σύνολο των οξειδάση αρνητικών βακτηρίων που παρουσίασαν ροζ χρώµα και όλες οι σκούρες µπλε χρωµατισµένες αποικίες καταµετρήθηκαν ως Ολικά Κολοβακτηριοειδή Βακτήρια. Β) Επιβεβαιωτική δοκιµασία παραγωγής ινδόλης, µε βάση το ISO 8199:2005. Οι ύποπτες αποικίες δηλαδή οι αποικίες µε χρώµα σκούρο µπλε ανακαλλιεργήθηκαν µε βάση το ISO 8199:2005 για παραγωγή ινδόλης 18

ώστε να επιβεβαιωθούν ως Escherichia coli. Το θρεπτικό υπόστρωµα που χρησιµοποιήθηκε για αυτή τη διαδικασία ήταν το Dev Tryptophan broth (Tryptone Water) (Merck, Lot VM 610494,346). Ακολούθησε επώαση στους (44,0 + 0,5) C για 21+3 ώρες. Η παραγωγή ινδόλης έγινε µε την προσθήκη του αντιδραστηρίου Kovacs (Kovac s reagent, pronadisa, Lot 624) (ανάπτυξη σε 30 κόκκινου κερασί χρώµατος στην επιφάνεια του ζωµού). Τέλος καταµετρήθηκαν όλες οι αποικίες µε θετική παραγωγή ινδόλης και παρουσία β-glucuronidase ως Escherichia coli. Γ) Ανακαλλιέργεια Escherichia coli σε Water Plate Count Agar. Οι επιβεβαιωµένες αποικίες E.coli ανακαλλιεργήθηκαν εκ νέου σε Water Plate Count Agar (WPA) (OXOID, Lot 687750), επωάστηκαν σε κλίβανο (36,0 +0,5) C για 21+3 ώρες και παρατηρήθηκαν µεµονωµένες αποικίες χωρίς επιµολύνσεις, έτοιµες για τη δοκιµασία των αντιβιογραµµάτων. 19

Δ) Έλεγχος αντοχής αντιβιοτικών, µε βάση το Πρωτόκολλο Kirby Bauer disk diffusion susceptibility test. Σε 2 ml φυσιολογικού ορού διαλύθηκαν µε τη χρήση κρικοφόρου στυλεού µίας χρήσης (1µl) µερικές αποικίες Escherichia coli. Αναδεύτηκαν µε το µηχάνηµα Vortex έως ότου η θολερότητα ήταν περίπου 0.5 µε βάση το πρότυπο McFarland. Ακολούθησε εµβάπτιση ενός στείρου βαµβακοφόρου στυλεού (cotton applicator, size: 150mm * 2,2mm *5mm) στο µικροβιακό εναιώρηµα και αποµάκρυνση της περίσσειας µε πίεση στα τοιχώµατα. Πραγµατοποιήθηκε επίστρωση σε όλη την επιφάνεια του υλικού που βρισκόταν σε τρυβλίο petri µεγέθους (1,2 cm) και περιείχε ως θρεπτικό υπόστρωµα Mueller Hinton Agar (Bioprepare Αρ.ΑΔ.ΕΟΦ 22145/26032012, Lot 897m118). Στην επιφάνεια του τρυβλίου petri τοποθετήθηκαν 5 αντιβιοτικοί δίσκοι µε αποστειρωµένη λαβίδα µε έντονη πίεση ώστε να επιτευχθεί πλήρης επαφή τους µε το άγαρ. Τα δισκία έπρεπε να βρίσκονται σε θερµοκρασία δωµατίου. 20

Η απώλεια της δραστικότητας των αντιβιοτικών µπορεί να οδηγήσει σε µειωµένες ζώνες αναστολής και είναι συχνή πηγή λάθους. Για το λόγο αυτό ακολουθήθηκαν οι παρακάτω οδηγίες: o Οι δίσκοι έπρεπε να φυλάσσονται µέσα σε περιέκτες µε καπάκι µε την παρουσία αφυγραντικού υλικού και να µην εκτίθενται στον ήλιο, o Οι δίσκοι έπρεπε να φυλάσσονται στους 20 C, o Για να αποφευχθεί η συµπύκνωση της δραστικής ουσίας του αντιβιοτικού, έπρεπε οι περιέκτες των δίσκων να έρχονται σε θερµοκρασία δωµατίου πριν τη χρήση τους, o Δίσκοι των οποίων η ηµεροµηνία λήξης είχε παρέλθει έπρεπε να απορριφθούν. Έπειτα τα τρυβλία petri τοποθετήθηκαν ανεστραµµένα για επώαση στους (35 +1) C για 16 20 ώρες. Μετά το πέρας της επώασης εάν παρατηρούσαµε µεµονωµένες αποικίες θα σήµαινε ότι θα υπήρχε αραιό µικροβιακό εναιώρηµα και η εξέταση του δείγµατος θα έπρεπε να επαναληφθεί. Η τελική ανάγνωση των τρυβλίων petri έγινε µε τη µέτρηση των ζωνών αναστολής. Για όλα τα αντιβιοτικά ως όριο ζώνης αναστολής ορίζεται το σηµείο όπου παρατηρείται πλήρης αναστολή της µικροβιακής ανάπτυξης µε γυµνό µάτι, κρατώντας το τρυβλίο σε απόσταση 30 εκατοστών από το µάτι. Εποµένως µε χάρακα ακριβείας µετρήθηκε η διάµετρος του κύκλου που είχε σχηµατίσει το κάθε στέλεχος. Η ερµηνεία των αποτελεσµάτων και η αναφορά του υπό εξέταση στελέχους ως ευαίσθητο, µετρίως ευαίσθητο ή ανθεκτικό στα αντιβιοτικά έγινε σύµφωνα µε τα όρια ευαισθησίας του ιστότοπου http://www.eucast.org. 21

Πίνακας 3 : Όρια τιµών αντιβιοτικών Αντιβιοτικά Ευαισθησία (mm) Μέτρια Ευαισθησία (mm) Amoxicillin 1,7 1,4 1,6 1,3 (AMX25µg) Cefaclor 1,8 1,3 1,7 1,4 (CEC30µg) Norfloxacin 2,5 3,1 2,1 2,4 2,0 (NXN10µg) Ciprofloxacin 2,8 3,5 2,5 2,7 2,4 (CIP5µg) Levofloxacin (LVX5µg) 2,9 3,6 2,6 2,8 2,5 Όλα τα αντιβιοτικά προµηθεύτηκαν από την εταιρεία bio-rad. Ανθεκτικότητα (mm) 3.4 Στατιστική ανάλυση Για την εξαγωγή συµπερασµάτων σχετικά µε τις ανθεκτικότητες των στελεχών της Escherichia coli στα 5 αντιβιοτικά του πειράµατος, πραγµατοποιήθηκε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων µε βάση το στατιστικό πρόγραµµα R (ver 3.3.1). H στατιστική ανάλυση δίνει την δυνατότητα απόδειξης όµοιας ή διαφορετικής συµπεριφοράς στα 5 αντιβιοτικά του πειράµατος µε µεγάλη ακρίβεια. Τα αντιβιοτικά NXN, CIP, LVX ανήκουν στις κινολόνες ενώ τα αντιβιοτικά AMC, CEC ανήκουν στις κεφαλοσπορίνες. Τα αποτελέσµατα από τα 133 συνολικά στελέχη ερµηνεύουν τις τιµές της ανθεκτικότητας και ευαισθησίας τους µε βάση : Α) την γεωγραφική περιοχή ( Λήµνος, Χίος, Λέσβος) και Β) τους διαφορετικούς τύπους δειγµάτων ( Αγροτικές κοινωνίες, αρδευτικό υδρευτικό σύστηµα, πηγάδια - πηγές, γεωτρήσεις). Έγιναν δύο είδη στατιστικού ελέγχου : A) (t-test), B) ANOVA, για τον έλεγχο των παρακάτω µηδενικών υποθέσεων : Ø Ho: µ1=µ2, δηλαδή οι µέσες τιµές των ακτινών ευαισθησίας των στελεχών να είναι ίσες, εποµένως δέχοµαι ότι υπάρχουν οι ίδιες ανθεκτικότητες από τα στελέχη στα αντιβιοτικά Ø Η1: µ1 µ2, δηλαδή οι µέσες τιµές των ακτινών ευαισθησίας των στελεχών να είναι διαφορετικές, εποµένως δέχοµαι ότι υπάρχουν διαφορετικές ανθεκτικότητες από τα στελέχη στα αντιβιοτικά. 22

4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1 Αποτελέσµατα Η αντοχή των 133 στελεχών στα αντιβιοτικά δίνεται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 4 : Αποτελέσµατα αντιβιοτικών Antibiotic Cephalosporins Quinolones Isolates (R: 1,3, 1,6, S: 1,7)* (R: 1,4, 1,7, S: 1,8)* (R: 2,0, M:2,1 3,1)* (R: 2,4, 2,7 S:2,8 3,5)*, LVX (R: 2,5, 8, S:2,9 3,6)* (mm) 2, Resistant (R ) 40, 41, 46, 52, 55, 60, 68, 69, 70, 71, 73, 74, 79, 80, 81, 83, 86, 87, 20, 55, 60, 69, 70, 71, 73, 80, 83, 91, 92, 113, 121, 122, 75, 85 45, 46, 52, 55, 60, 65, 75, 77, 80, 83, 85, 107, 110, 89, 91, 92, 93, 107, 108, 109, 110, 113, 116, 117, 119, 120, 23

121, 122, 124, 126, 127, 128, Medium sensivity (M) 17, 49, 53, 95, 112 14, 23, 79, 81, 107, 110, 116, 119, 120 23, 79, 80, 85, 113, 115 65, 76, 77, 79, 80, 110, 115 9, 23, 38, 42, 44, 48, 49, 50, 51, 53, 54, 56, 57, 58, 59, 61, 63, 66, 67, 74, 76, 79, 81, 82, 91, 109, 111, 112, 115, 116, 24

118, 119, 120, 122, 124, 125, 126 25

Sensitive (S) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 42, 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 39, 40, 41, 43, 47, 62, 64, 68, 69, 70, 26

54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 72, 75, 76, 77, 78, 82, 84, 85, 88, 90, 94, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 111, 114, 115, 49, 50, 51, 52, 53,54, 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 67, 68, 69, 70, 71, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 78, 81, 82, 83, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 71, 72, 73, 78, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 114, 117, 123, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 27

118, 123, 125, 130, 132, 133 101, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 117, 118, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 109, 111, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 28

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130 131, 132, Sum (R:39, M:5, S:89) = 133 * : Range Sensivity of the 5 antibiotics (R:14, M:9, S:110) = 133 (R:0, M:6, S:127) = 133 133 (R:2, M:7, S:124) = 133 (R:15, M:37, S:81) 3 =13 Τα χρώµατα του παραπάνω πίνακα ερµηνεύονται ως εξής : Κόκκινο χρώµα à ανθεκτικά στελέχη Escherichia coli, Πορτοκαλί χρώµα à µέτρια ευαίσθητα στελέχη Escherichia coli και Μπλέ χρώµα à ευαίσθητα στελέχη Escherichia coli Στην Amoxil (AMC) 39 στελέχη Escherichia coli ήταν ανθεκτικά ενώ 89 στελέχη ήταν ευαίσθητα. Τα ανθεκτικά στελέχη προέρχονται από νερά µικρών αγροτικών κοινωνιών της Λέσβου και της Λήµνου. Σε σχέση µε τα υπόλοιπα αντιβιοτικά στην AMC πολλά από τα στελέχη είναι ανθεκτικά ποσοστό όµως που θα αναλυθεί στο στατιστικό µέρος της εργασίας αυτής. Στη Ceclor (CEC), 14 στελέχη είναι ανθεκτικά ενώ τα περισσότερα είναι ευαίσθητα, 110 στελέχη. Τα ανθεκτικά στελέχη προέρχονται από νερά που δεν καταναλώνουν µεγάλες οµάδες του πληθυσµού. Στο πείραµα χρησιµοποιήθηκαν επίσης 3 Κινολόνες. Στη Norosin (NXN) τα 127 από τα 133 στελέχη είναι ευαίσθητα ενώ κανένα στέλεχος δεν είναι ανθεκτικό. Στη Ciprosin (CIP) τα περισσότερα στελέχη είναι ευαίσθητα ενώ 2 είναι ανθεκτικά και προέρχονται από δείγµα γεώτρησης 29

αγροτικής κατοικίας. Τέλος, στο Levofloxin (LVX) τα 15 στελέχη είναι ανθεκτικά, τα 81 ευαίσθητα και τα 37 µετρίως ευαίσθητα. Η ανθεκτικότητα των στελεχών στα αντιβιοτικά που αποµονώθηκαν από δείγµατα νερών, αποδεικνύει ότι η συχνή χρήση τους σκόπιµη ή µη, από τους ανθρώπους αλλά και από τα ζώα για την αντιµετώπιση όλων των παθήσεων οδηγεί µέσω των απεκκρίσεων τους αυτές τις χηµικές ουσίες κυρίως στο περιβάλλον. Εποµένως ακόµα και στο νερό είναι δυνατόν να εµφανιστούν στελέχη κοινών µικροβίων µε µεγάλες ανθεκτικότητες και άρα στην πόση τους να είναι σε θέση να προκαλέσουν πολύ σοβαρά προβλήµατα υγείας. Κατανοµή ευαισθησίας σε Κινολόνες (1:NXN, 2:CIP, 3:LVX) (κατανοµή αποτελεσµάτων) Τα Boxplot ή θηκογράµµατα απεικονίζουν την κατανοµή του δείγµατος Σχή µ α 1 : Boxplot για τις κινολόνες Σε αυτό το διάγραµµα απεικονίζονται οι 3 κινολόνες που χρησιµοποιήθηκαν για το πείραµα αυτό. Στον άξονα χ αναπαριστάται ο αριθµός των αντιβιοτικών(3 κινολόνες) και στον άξονα ψ οι ακτίνες ευαισθησίας. Με τη µαύρη σκούρα γραµµή (ενδιάµεσος) απεικονίζεται η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας του κάθε αντιβιοτικού η οποία είναι πανοµοιότυπη και στις 3 κινολόνες. Στην κινολόνη NXN δεν υπάρχουν στελέχη που να είναι ανθεκτικά. Στην κινολόνη CIP υπάρχουν ακραίες τιµές ανθεκτικότητας και απεικονίζονται µε τους κύκλους. Τέλος, στην κινολόνη LVX πολλά στελέχη είναι ανθεκτικά. 30

Οι αποστάσεις µεταξύ των γραµµών είναι ισαπέχουσες εποµένως όλα τα στελέχη ακολουθούν κανονική κατανοµή. Τα στελέχη της Escherichia coli δεν επέδειξαν ίδια συµπεριφορά στις 3 κινολόνες. Κατανοµή ευαισθησίας σε Κεφαλοσπορίνες (1:AMC, 2:CEC) (κατανοµή αποτελεσµάτων) Σχήµα 2 : Boxplot για τις κεφαλοσπορίνες Σε αυτό το διάγραµµα απεικονίζονται οι 2 κεφαλοσπορίνες που χρησιµοποιήθηκαν για το πείραµα αυτό. Στον άξονα χ αναπαριστάται ο αριθµός των αντιβιοτικών και στον άξονα ψ οι τιµές των ακτίνων ευαισθησίας. Με τη µαύρη σκούρα γραµµή απεικονίζεται η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας του κάθε αντιβιοτικού η οποία είναι πανοµοιότυπη και στις 2 κεφαλοσπορίνες. Στην κεφαλοσπορίνη AMC τα στελέχη είναι περισσότερο ανθεκτικά από κάθε άλλο αντιβιοτικό. Στην κεφαλοσπορίνη CEC πολύ λιγότερα στελέχη είναι ανθεκτικά. Τα 31

στελέχη της Escherichia coli δεν επέδειξαν ίδια συµπεριφορά στις 2 κεφαλοσπορίνες. Ευαισθησία στα αντιβιοτικά Πίνακας 5: Επί τοις εκατό ευαισθησία στα αντιβιοτικά Σύνολο στελεχώ ν 133 Ευαίσθη τα Μετρίως Ευαίσθη τα Ανθεκτι κά AMC (Amoxil) (cephalospori ns) 89 (66,9%) 5 (3,8%) 39 (29,3%) CEC (Ceclor) (cephalospori ns) 110 (82,7%) 9 (6,8%) 14 (10,5%) NXN (Norosin) (quinolon es) 127 (95,5%) 6 (4,5%) 0 (0%) CIP (Ciprosin) (quinolon es) 124 (94,7%) 7 (4,5%) 2 (0,8%) LVX (Levofloxi n) (quinolon es) 81 (60,9%) 37 (27,8%) 15 (11,3%) Από τον πίνακα αυτό γίνεται αντιληπτό ότι το 30% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην κεφαλοσπορίνη (ΑΜC). Ακολουθεί η κινολόνη (LVX) µε ποσοστό ανθεκτικότητας 11,3 % και η κεφαλοσπορίνη (CEC) µε ελάχιστη µείωση σε ποσοστό 10,5%. Στη κινολόνη (NXN) και στη κινολόνη (CIP) παρουσιάστηκαν ανθεκτικότητες από τα στελέχη σε ποσοστά από 0 1% άρα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα σε αυτά τα αντιβιοτικά. 4.2 Τ tests Ο σκοπός της δοκιµής t-test είναι η σύγκριση των µέσων τιµών των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών ώστε να αποδειχθεί εάν τα στελέχη είναι ευαίσθητα στα αντιβιοτικά του πειράµατος. Ισχύουν 2 υποθέσεις : Ηο: µ1=µ2 H1: µ1 µ2 Εάν tπαρατηρούµενο > tκρίσιµο απορρίπτεται η υπόθεση Ho. Εάν tπαρατηρούµενο < tκρίσιµο δεχόµαστε την υπόθεση Ho. Ως επίπεδο σηµαντικότητας α ορίζεται η τιµή 0,05 και αυτό διότι αφορά ένα βιολογικό πείραµα και εποµένως χρειάζεται µεγάλη ακρίβεια και ορθότητα στα αποτελέσµατα. 32

Στο συγκεκριµένο πείραµα πραγµατοποιήθηκαν 10 δοκιµές t- tests ανά 2 αντιβιοτικά. Το πρώτο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά AMC CEC. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC είναι 1.81 mm και στο αντιβιοτικό CEC είναι 2.22 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση στελεχών στα αντιβιοτικά AMC ΝΧΝ. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC είναι 1.81 mm και στο αντιβιοτικό ΝΧΝ είναι 3.16 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό ΝΧΝ. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το τρίτο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά AMC CIP. 33

Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC είναι 1.81 mm και στο αντιβιοτικό CIP είναι 3.27 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CIP. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το τέταρτο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά AMC LVX. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC είναι 1.81 mm και στο αντιβιοτικό LVX είναι 2.95 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό AMC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό LVX. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το πέµπτο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά CEC NXN. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC είναι 2.22 mm και στο αντιβιοτικό NXNείναι 3.16 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό NXN. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p 34

µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το έκτο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά CEC CIP. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC είναι 2.22 mm και στο αντιβιοτικό CIP είναι 3.27 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CIP. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equalvariances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το έβδοµο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά CEC LVX. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC είναι 2.22 mm και στο αντιβιοτικό LVX είναι 2.95 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CEC δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό LVX. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν 35

στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το όγδοο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά NXN CIP. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό NXN είναι 3.16 mm και στο αντιβιοτικό CIP είναι 3.27 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό NXN δεν είναι σηµαντικά χαµηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CIP. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p µεγαλύτερη από 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p δεν ήταν στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση απορρίφθηκε. Τα στελέχη δηλαδή παρουσίασαν εντελώς διαφορετική συµπεριφορά στα αντιβιοτικά. Το ένατο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά NXN - LVX. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό ΝΧΝ είναι 3.16 mm και στο αντιβιοτικό LVX είναι 2.95 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : Ο µέσος όρος (Mean) των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό NXN δεν είναι σηµαντικά υψηλότερος από τον µέσο όρο ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό LVX. Ο έλεγχος t- test για την ισότητα των διακυµάνσεων έδωσε τιµή πιθανότητας p = 0,05 (Sig.>0,05) που σηµαίνει ότι οι διακυµάνσεις των 2-οµάδων θεωρούνται ίσες. Λήφθηκε υπόψιν ο έλεγχος t για διακυµάνσεις (equal variances assumed) µε 264 βαθµούς ελευθερίας (df=264), σύµφωνα µε τον οποίο η τιµή της πιθανότητας p είναι στατιστικώς σηµαντική µε βάση το προεπιλεγµένο επίπεδο σηµαντικότητας 0,05 (Sig. > 0.05). Εποµένως η µηδενική υπόθεση γίνεται αποδεκτή. Το δέκατο t-test πραγµατοποιήθηκε για τις ακτίνες ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά CIP - LVX. Η µέση τιµή των ακτίνων ευαισθησίας των στελεχών στο αντιβιοτικό CIP είναι 3.27 mm και στο αντιβιοτικό LVX είναι 2.95 mm. Τα αποτελέσµατα αυτά µεταφράζονται ως εξής : 36